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TWI444478B - 儲存穩定性之中性金屬蛋白酶的用途與製造 - Google Patents

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TWI444478B
TWI444478B TW095137496A TW95137496A TWI444478B TW I444478 B TWI444478 B TW I444478B TW 095137496 A TW095137496 A TW 095137496A TW 95137496 A TW95137496 A TW 95137496A TW I444478 B TWI444478 B TW I444478B
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Louise Wallace
David A Estell
Ronald Hommes
Sang-Kyu Lee
Hiroshi Oh
Eugene Steven Sadlowski
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Genencor Int
Procter & Gamble
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Description

儲存穩定性之中性金屬蛋白酶的用途與製造
本申請案主張申請中的美國臨時專利申請案序號60/726,448號(申請日2006年10月12日)之優先權。
本發明提供包括至少一種具有改善的儲存穩定性之中性金屬蛋白酶的方法及組成物。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶是有用於清潔及其他的應用。在部分特定較佳具體實例中，本發明提供包括得自桿菌屬(Bacillus sp. )之中性金屬蛋白酶的方法及組成物。在部分特別更佳具體實例中，中性金屬蛋白酶是得自解澱粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens )。在其他較佳具體實例中，中性金屬蛋白酶是解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的變異物。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶是解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的同源物。本發明特別有用於包括但並不限於清潔、漂白及消毒的應用。
洗滌劑及其他清潔組成物通常包括活性成分的複雜組合。例如，大部分的清潔產品包括界面活性劑系統、清潔用酵素、漂白劑、加強劑、肥皂水抑制劑、塵粒懸浮劑、塵粒脫落劑、螢光增白劑、柔軟劑、分散劑、染劑轉移抑制化合物、研磨劑、殺菌劑及香料。儘管現有洗滌劑的複雜性，但仍有許多難以完全移除的污斑。此外，也常有殘留的積聚，其可能由於不完全的清潔導致變色(例如，變黃)以及減少的美感。這些問題是由增加使用低的(例如，冷水)清洗溫度及較短的清洗循環而惡化。此外，許多的污斑是由複雜的纖維材料混合物所組成，主要係併入碳水化合物及碳水化合物衍生物、纖維及細胞壁成分(例如，植物物質、木材、泥漿/黏土為基底的塵粒及果實)。這些污斑對於清潔組成物的調配及使用，呈現困難的挑戰。
此外，彩色的服裝有穿戴及展示外觀損耗的傾向。部分色彩的損耗是由於在洗滌過程中的磨損所致，特別是在自動化的清洗及乾燥機器中。此外，織物的伸展強度損耗也似乎是機器及化學作用之不可避免的結果，這是由於使用、穿戴、及/或清洗及乾燥所致。因此，高效率及有效清洗彩色服裝使得這些外觀損耗減到最小的方法是有需要的。
簡言之，儘管有改善清潔組成物的能力，在此技藝中對於可移除污斑、維持織物色彩及外觀、以及避免染劑轉移的洗滌劑，仍有需求。此外，對於可提供及/或恢復伸展強度，以及提供織物抗皺、抗起毛球及/或抗收縮性質，以及提供靜電控制、織物柔軟性、維持所要色彩外觀及織物抗磨損性質及利益之洗滌劑及/或織物照護組成物，也仍有需求。特別地，對於納入可移除洗滌後通常仍保留附著在織物的污斑之色彩成分的組成物，仍有需求。此外，對於適合紡織品漂白的改善方法及組成物，也仍有需求。
本發明提供包括至少一種具有改善的儲存穩定性之中性金屬蛋白酶的方法及組成物。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶是有用於清潔及其他應用。在部分特定較佳具體實例中，本發明提供包括得自桿菌屬之中性金屬蛋白酶的方法及組成物。在部分特別更佳具體實例中，中性金屬蛋白酶是得自解澱粉芽孢桿菌。在其他較佳具體實例中，中性金屬蛋白酶是解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的變異物。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶是解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的同源物。本發明特別有用於包括但並不限於清潔、漂白及消毒的應用。
本發明提供新穎的中性金屬蛋白酶、編碼中性金屬蛋白酶酵素的新穎遺傳物質、以及得自桿菌屬(特別是解澱粉芽孢桿菌)的中性金屬蛋白酶蛋白質以及從其開發的變異蛋白質。特別地，本發明提供得自桿菌屬(特別是解澱粉芽孢桿菌)的中性金屬蛋白酶組成物、編碼該蛋白酶的DNA、包括編碼中性金屬蛋白酶的DNA之載體、以該載體DNA轉形的宿主細胞、以及由該宿主細胞所製造的酵素。本發明也提供清潔組成物(例如，洗滌劑組成物)、動物飼料組成物、以及紡織品及皮革加工組成物，其包括得自桿菌屬(特別是解澱粉芽孢桿菌)的中性金屬蛋白酶。在其他具體實例中，本發明提供衍生自此處所說明野生型中性金屬蛋白酶之突變(也就是變異)的中性金屬蛋白酶。這些突變的中性金屬蛋白酶也有用於許多的應用。
本發明提供得自桿菌屬(特別是解澱粉芽孢桿菌)之分離的中性金屬蛋白酶。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶包括列於序列識別號3的胺基酸序列。在其他具體實例中，本發明提供分離的中性金屬蛋白酶，其與包括序列識別號3的中性金屬蛋白酶包括至少45%胺基酸同一性。在部分具體實例中，分離的中性金屬蛋白酶與包括序列識別號3的中性金屬蛋白酶包括至少50%同一性、較佳至少55%、更佳至少60%、還要更佳至少65%、還要更佳至少70%、更佳至少75%、還要更佳至少80%、更佳85%、還要更佳90%、還要更佳至少95%以及最佳99%的同一性。
本發明也提供分離的中性金屬蛋白酶，其與得自解澱粉芽孢桿菌的中性金屬蛋白酶具有免疫交叉反應性，以及包括這些中性金屬蛋白酶的組成物。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶與包括列於序列識別號3的胺基酸序列之中性金屬蛋白酶具有免疫交叉反應性。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶與解澱粉芽孢桿菌的中性金屬蛋白酶及/或包括列於序列識別號3的胺基酸序列之中性金屬蛋白酶之片段(也就是，部分)，具有免疫交叉反應性。事實上，發明人希望本發明涵蓋可在動物(包括，但並不限於人類)中刺激免疫反應及/或被任何類型抗體所辨認的解澱粉芽孢桿菌金屬蛋白酶之片段(例如，抗原決定部位)。本發明更涵蓋在金屬蛋白酶上的抗原決定部位，其與解澱粉芽孢桿菌金屬蛋白酶的抗原決定部位具有交叉反應性。在部分具體實例中，金屬蛋白酶的抗原決定部位會被抗體所辨認，但不會在動物(包括，但並不限於人類)中刺激免疫反應，然而在其他具體實例中，金屬蛋白酶的抗原決定部位可在至少一種動物物種(包括，但並不限於人類)中刺激免疫反應，並且被任何類型的抗體所辨認。本發明也提供鑑定及評估交叉反應的抗原決定部位之方法及組成物。
在部分具體實例中，本發明提供列於序列識別號3及/或序列識別號4的胺基酸序列。在其他具體實例中，序列包括在序列識別號3及/或序列識別號4中的至少一個胺基酸位置的取代。在部分較佳具體實例中，本發明提供具有一胺基酸序列的中性金屬蛋白酶變異物，該胺基酸序列包括在等同於包含列於序列識別號3及/或序列識別號4的胺基酸序列之解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶位置處進行的至少一個胺基酸取代。在其他具體實例中，本發明提供具有一胺基酸序列的中性金屬蛋白酶變異物，該胺基酸序列包括在等同於包含至少一部分的序列識別號3及/或序列識別號4之解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶位置處進行的至少一個胺基酸取代。在部分其他較佳具體實例中，中性金屬蛋白酶包括在至少一部分的序列識別號3及/或序列識別號4中之多重突變。
在其他具體實例中，本發明提供列於序列識別號13的胺基酸序列。在其他具體實例中，序列包括在序列識別號13中的至少一個胺基酸位置的取代。在部分較佳具體實例中，本發明提供具有一胺基酸序列的中性金屬蛋白酶變異物，該胺基酸序列包括在等同於包含列於序列識別號13的胺基酸序列之解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶位置處進行的至少一個胺基酸取代。在其他具體實例中，本發明提供具有一胺基酸序列的中性金屬蛋白酶變異物，該胺基酸序列包括在等同於包含至少一部分的序列識別號13之解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶位置處進行的至少一個胺基酸取代。在部分其他較佳具體實例中，中性金屬蛋白酶包括在至少一部分的序列識別號13中之多重突變。
在部分特定較佳具體實例中，相較於野生型的解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶，這些變異物具有改善的表現。本發明也提供相較於野生型中性金屬蛋白酶具有至少一種改善性質的中性金屬蛋白酶變異物。在部分其他特定較佳具體實例中，相較於野生型的解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶，這些變異物具有改善的穩定性。在部分其他較佳具體實例中，相較於野生型的解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶，這些變異物具有改善的熱穩定性。在其他較佳具體實例中，相較於野生型的解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶，這些變異物在較低或較高的pH條件下具有改善的表現。
本發明也提供中性金屬蛋白酶，其包括列於序列識別號3及/或序列識別號4的胺基酸序列的至少一部份。在部分具體實例中，編碼這些中性金屬蛋白酶的核苷酸序列包括選自序列識別號1、2、12及/或13的核苷酸序列。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶是具有類似列於序列識別號3及/或序列識別號4的胺基酸序列之變異物。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶是變異物及/或同源物。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶是列於第3至5圖中任一圖的中性金屬蛋白酶。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶是列於第3、4及/或5圖的中性金屬蛋白酶之變異物。
本發明也提供表現載體，其包括編碼列於序列識別號3的中性金屬蛋白酶的至少一部份之多核苷酸序列。本發明更提供表現載體，其包括編碼至少一個中性金屬蛋白酶變異物之多核苷酸序列，該變異物具有包括在等同於包含列於序列識別號3的胺基酸序列之桿菌屬中性金屬蛋白酶位置處進行的至少一個胺基酸取代的胺基酸序列。在其他具體實例中，本發明提供宿主細胞，其包括這些表現載體。在部分特定較佳具體實例中，宿主細胞是選自桿菌屬所組成的族群中。本發明也提供由該宿主細胞所製造的中性金屬蛋白酶。
本發明也提供組成物，其包括得自桿菌屬(特別是解澱粉芽孢桿菌)之分離的中性金屬蛋白酶的至少一部份，其中中性金屬蛋白酶的至少一部份是由選自序列識別號1、2、12及/或13的多核苷酸序列所編碼。在其他具體實例中，本發明提供宿主細胞，其包括這些表現載體。在部分特定較佳具體實例中，宿主細胞是桿菌屬。本發明也提供由該宿主細胞所製造的中性金屬蛋白酶。
本發明也提供變異的中性金屬蛋白酶，其中中性金屬蛋白酶包括對應於序列識別號3中的胺基酸位置之至少一個取代，以及其中相較於野生型的解澱粉芽孢桿菌金屬蛋白酶，變異的中性金屬蛋白酶在至少一種性質中具有較佳的表現。
本發明也提供變異的胺基酸，其中變異物包括在等同於包含列於序列識別號3的胺基酸序列之中性金屬蛋白酶位置處進行的至少一個胺基酸取代，其中該等位置是選自由位置1、3、4、5、6、11、12、13、14、16、21、23、24、25、31、32、33、35、36、38、44、45、46、47、48、49、50、51、54、55、58、59、60、61、62、63、65、66、69、70、76、85、86、87、88、90、91、92、96、97、98、99、100、102、109、110、111、112、113、115、117、119、127、128、129、130、132、135、136、137、138、139、140、146、148、151、152、153、154、155、157、158、159、161、162、169、173、178、179、180、181、183、184、186、190、191、192、196、198、199、200、202、203、204、205、210、211、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、228、229、237、239、240、243、244、245、248、252、253、260、261、263、264、265、267、269、270、273、277、280、282、283、284、285、286、288、289、290、292、293、296、297、與299。
本發明也提供分離的中性金屬蛋白酶變異物，其具有在等同於包含列於序列識別號3的胺基酸序列之中性金屬蛋白酶位置處進行的包括至少一個胺基酸取代的胺基酸序列。在部分具體實例中，分離的中性金屬蛋白酶變異物具有在等同於包含列於序列識別號3的胺基酸序列之中性金屬蛋白酶位置1、3、4、5、6、11、12、13、14、16、21、23、24、25、31、32、33、35、36、38、44、45、46、47、48、49、50、51、54、55、58、59、60、61、62、63、65、66、69、70、76、85、86、87、88、90、91、92、96、97、98、99、100、102、109、110、111、112、113、115、117、119、127、128、129、130、132、135、136、137、138、139、140、146、148、151、152、153、154、155、157、158、159、161、162、169、173、178、179、180、181、183、184、186、190、191、192、196、198、199、200、202、203、204、205、210、211、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、228、229、237、239、240、243、244、245、248、252、253、260、261、263、264、265、267、269、270、273、277、280、282、283、284、285、286、288、289、290、292、293、296、297、及299處所進行的取代。
在其他具體實例中，分離的中性金屬蛋白酶變異物包括至少一種突變，係選自由T004C、T004E、T004H、T004I、T004K、T004L、T004M、T004N、T004P、T004R、T004S、T004V、T004W、T004Y、G012D、G012E、G012I、G012K、G012L、G012M、G012Q、G012R、G012T、G012V、G012W、K013A、K013C、K013D、K013E、K013F、K013G、K013H、K013I、K013L、K013M、K013N、K013Q、K013S、K013T、K013V、K013Y,T014F、T014G、T014H、T014I、T014K,T014L、T014M、T014P、T014Q、T014R、T014S、T014V、T014W、T014Y、S023A、S023D、S023F、S023G、S023I、S023K、S023L、S023M、S023N、S023P、S023Q、S023R、S023S、S023T、S023V、S023W、S023Y、G024A、G024D、G024F、G024G、G024H、G024I、G024K、G024L、G024M、G024N、G024P、G024R、G024S、G024T、G024V、G024W、G024Y、K033H、Q045C、Q045D、Q045E、Q045F、Q045H、Q045I、Q045K、Q045L、Q045M、Q045N、Q045P、Q045R、Q045T、Q045W、N046A、N046C、N046E、N046F、N046G、N046H、N046I、N046K、N046L、N046M、N046P、N046Q、N046R、N046S、N046T、N046V、N046W、N046Y、R047E、R047K、R047L、R047M、R47Q、R047S、R047T、Y049A、Y049C、Y049D、Y049E、Y049F、Y049H、Y049I、Y049K、Y049L、Y049N、Y049R、Y049S、Y049T、Y049V、Y049W、N050D、N050F、N050G、N050H、N050I、N050K、N050L、N050M、N050P、N050Q、N050R、N050W、N050Y、T054C、T054D、T054E、T054F、T054G、T054H、T054I、T054K、T054L、T054M、T054N、T054P、T054Q、T054R、T054S、T054V、T054W、T054Y、S058D、S058H、S058I、S058L、S058N、S058P、S058Q、T059A、T059C、T059E、T059G、T059H、T059I、T059K、T059L、T059M、T059N、T059P、T059Q、T059R、T059S、T059V，T059W、T060D、T060F、T060I、T060K、T060L、T060N、T060Q、T060R、T060V、T060W、T060Y、T065C、T065E，T065F、T065H、T065I、T065K、T065L、T065M、T065P、T065Q、T065R、T065V、T065Y、S066C、S066D、S066E、S066F、S066H、S066I、S066K、S066L,S066N、S066P、S066Q、S066R、S066T、S066V、S066W、S066Y、Q087A、Q087D、Q087E、Q087H、Q087I、Q087K、Q087L、Q087M、Q087N、Q087R、Q087S、Q087T、Q087V、Q087W、N090C、N090D、N090E、N090F、N090G、N090H、N090K、N090L、N090R、N090T、N096G、N096H、N096K、N096R、K097H、K097Q、K097W、K100A、K100D、K100E、K100F、K100H、K100N、K100P、K100Q、K100R、K100S、K100V、K100Y、R110A、R110C、R110E、R110H、R110K、R110L、R110M、R110N、R110Q、R110S、R110Y、D119E、D119H、D119I、D119L、D119Q、D119R、D119S、D119T、D119V、D119W、G128C、G128F、G128H、G128K、G128L、G128M、G128N、G128Q、G128R、G128W、G128Y、S129A、S129C、S129D、S129F、S129G、S129H、S129I、S129K、S129L、S129M、S129Q、S129R、S129T、S129V、S129W、S129Y、F130I、F130K、F130L、F130M、F130Q、F130R、F130T、F130V、F130Y、S135P、G136I、G136L、G136P、G136V、G136W、G136Y、S137A、M138I、M138K、M138L、M138Q、M138V、D139A、D139C、D139E、D139G、D139H、D139I、D139K、D139L、D139M、D139P、D139R、D139S、D139V、D139W、D139Y、V140C、Q151I、E152A、E152C、E152D、E152F、E152G、E152H、E152L、E152M、E152N、E152R、E152S、E152W、N155D、N155K、N155Q、N155R、D178A、D178C、D178G、D178H、D178K、D178L、D178M、D178N、D178P、D178Q、D178R、D178S、D178T、D178V、D178W、D178Y、T179A、T179F、T179H、T179I、T179K、T179L、T179M、T179N、T179P、T179Q、T179R、T179S、T179V、T179W、T179Y、E186A、E186C、E186D、E186G、E186H、E186K、E186L、E186M、E186N、E186P、E186Q、E186R、E186S、E186T、E186V、E186W、E186Y、V190H、V190I、V190K、190L、V190Q、V190R、S191F、S191G、S191H、S191I、S191K、S191L、S191N、S191Q、S191R、S191W、L198M、L198V、S199C、S199D、S199E、S199F、S199I、S199K、S199L、S199N、S199Q、S199R、S199V、Y204H、Y204T、G205F、G205H、G205L、G205M、G205N、G205R、G205S、G205Y、K211A、K211C、K211D、K211G、K211M、K211N、K211Q、K211R、K211S、K211T、K211V、K214A、K214C、K214E、K214I、K214L、K214M、K214N、K214Q、K214R、K214S、K214V、L216A、L216C、L216F、L216H、L216Q、L216R、L216S、L216Y、N218K、N218P、T219D、D220A，D220E、D220H、D220K、D220N、D220P、A221D、A221E、A221F、A221I、A221K、A221L、A221M、A221N、A221S、A221V、A221Y、G222C、G222H、G222N、G222R、Y224F、Y224H、Y224N、Y224R、T243C、T243G、T243H、T243I、T243K、T243L、T243Q、T243R、T243W、T243Y、K244A、K244C、K244D、K244E、K244F、K244G、K244L、K244M、K244N、K244Q、K244S、K244T、K244V、K244W、K244Y、V260A、V260D、V260E、V260G、V260H、V260I、V260K、V260L，V260M、V260P、V260Q、V260R、V260S、V260T、V260W、V260Y、Y261C、Y261F、Y261I、Y261L、T263E、T263F、T263H、T263I、T263L、T263M、T263Q、T263V、T263W、T263Y、S265A、S265C、S265D、S265E、S265K、S265N、S265P、S265Q、S265R，S265T、S265V、S265W、K269E、K269F、K269G、K269H、K269I、K269L、K269M、K269N、K269P、K269Q、K269S、K269T、K269V、K269W、K269Y、A273C、A273D、A273H、A273I、A273K、A273L、A273N、A273Q、A273R、A273Y、R280A、R280C、R280D、R280E、R280F、R280G、R280H、R280K、R280L、R280M、R280S、R280T、R280V、R280W、R280Y、L282F、L282G、L282H、L282I、L282K、L282M、L282N、L282Q、L282R、L282V、L282Y、S285A、S285C、S285D、S285E、S285K、S285P、S285Q、S285R、S285W、Q286A、Q286D、Q286E、Q286K、 Q286P、 Q286R、A289C、A289D、A289E、A289K、A289L、A289R、A293C、A293R、N296C、N296D、N296E、N296K、N296R、N296V、A297C、A297K、A297N、A297Q、A297R、及G299N。
在其他具體實例中，本發明提供分離的變異中性金屬蛋白酶，其中金屬蛋白酶包括多種突變，係選自由S023W/G024M、T004V/S023W/G024W、S023W/G024Y/A288V、T004L/S023W/G024Y、N046Q/N050F/T054L、N050Y/T059R/S129Q、S023W/G024W、A273H/S285P/E292G、S023Y/G024Y、S023Y/G024W、T004S/S023Y/G024W、N046Q/T054K、S023W/G024Y、T004V/S023W、T059K/S066N、N046Q/N050W/T054H/T153A、T004V/S023W/G024Y、L282M/Q286P/A289R、N046Q/R047K/N050Y/T054K、L044Q/T263W/S285R、T004L/S023W/G024W、R047K/N050F/T054K、A273H/S285R、N050Y/T059K/S066Q、T054K/Q192K、N046Q/N050W、L282M/Q286K、T059K/S066Q、T004S/S023W、L282M/Q286R/A289R/K011N、L282M/A289R、N046Q/N050W/T054H、T059K/S129Q、T004S/S023N/G024Y/F210L、T004V/S023W/G024M/A289V、L282M/Q286K/A289R/S132T、N050W/T054H、L282M/Q286R、L282F/Q286K/A289R、T059R/S066Q、R047K/N050W/T054H、S265P/L282M/Q286K/A289R、L282M/Q286R/T229S、L282F/Q286K、T263W/S285R、S265P/L282M/Q286K、T263H/A273H/S285R、T059R/S129V、S032T/T263H/A273H/S285R、T059R/S066Q/S129Q、T004S/G024W、T004V/S023W/G024M、T059K/S066Q/S129Q、L282M/Q286K/A289R/I253V、T004V/S023Y/G024W、T059R/S066N/S129Q、N050F/T054L、T004S/S023N/G024W、T059R/S066N、T059R/S066N/S129V、Q286R/A289R、N046Q/R047K/N050F/T054K、S265P/L282M/Q286P/A289R、S265P/L282M/Q286R/A289R Q062K/S066Q/S129I、S023N/G024W、N046Q/R047K/N050W/T054H、R047K/T054K、T004L/G024W、T014M/T059R/S129V、T059R/S066Q/N092S/S129I、R047K/N050W/T054K、T004V/G024W、N047K/N050F/T054K、S265P/L282F/Q286K/N061Y、L282F/Q286K/E159V、T004V/S023Y/G024M、S265P/L282F/A289R/T065S、T059K/F063L/S066N/S129V、T004L/S023W、N050F/T054H、T059R/S066Q/S129V、V190I/D220E/S265W/L282F、T004S/S023Y/G024M、T004L/S023N/G024Y、T059K/S066N/S129I、T059R/S066N/S129I、L282M/Q286R/A289R/P162S、N046Q/N050F/T179N、T059K/Y082C/S129V、T059K/S129I、N050Y/T054K、T059K/S066Q/V102A/S129Q、T059R/S066Q/S129I、T059W/S066N/S129V/S290R、T059R/S129I、T059K/S066Q/S129I、T059K/S066Q/S129V、S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N、T004V/S023N/G024W、S265P/Q286K、S265P/L282F/A289R、D220P/S265W、L055F/T059W/S129V、T059R/S129Q/S191R、N050W/T054K、T004S/S023W/G024M、R047K/N050F/T054H、T059K/S066N/K088E、T059K/S066Q/S129I/V291L、L282M/Q286R/A289R、T059R/S066N/F085S/S129I、L282F/Q286P/A289R、L282F/Q286R/A289R、G099D/S265P/L282F/Q286K/A289R、N046Q/N050F、N050Y/T059W/S066N/S129V、T009I/D220P/S265N、V190F/D220P/S265W、N157Y/T263W/A273H/S285R、T263W/A273H/S285R、T263W/S285W、T004V/S023Y、N046Q/R047K/N050W、N050W/T054L、N200Y/S265P/L282F/Q286P/A289R、T059R/S066Q/P264Q、T004V/G024Y、T004L/G024Y、N050Y/S191I、N050Y/T054L、T004L/S023W/G024Y/N155K、F169I/L282F/Q286R/A289R、L282M/Q286K/A289R、F130L/M138L/E152W/D183N、N046Q/R047K/N050Y/T054H、T004V/G024M、N050Y/T059W/S066Q/S129V、S023N/G024Y、T054H/P162Q、T004S/S023W/G024Y、N050Y/T054H、L282F/Q286R/A289R/F169I、R047K/N050W、V190F/D220P、L282M/F173Y、T004L/S023Y、N050W/A288D、V190I/D220P/S265Q、S265P/L282F/Q286P/A289R、S265P/L282F/Q286R/A289R、N046Q/N050Y/T054K、T059W/S066Q、T263W/A273H/S285WT263W/A273H/S285P、S023Y/G024M、T004L/S023N/G024W、T004V/S023N/G024Y、T059W/S066N/S129Q、T004S/S023Y、T004S/S023N/G024M、T059W/S066N/A070T、T059W/S066Q/S129Q、T263W/A273H、A273H/285P、N046Q/R047K/N050Y/T054L、N046Q/R047K/N050Y、R047K/N050Y、T263H/S285W、R047K/N050F、N046Q/R047K/N050F/T054H、S023N/G024M、T004S/G024Y、R047K/N050Y/T054H、T059W/S066N/S129I、R047K/T054L、T004S/S023W/G024W、M138L/E152F/T146S、D220P/S265N、T004S/G024M、T004V/S023N、N046Q/N050F/T054K、N046Q/N050Y/T054H、Q062H/S066Q/S129Q、T059W/S129Q、T059W/S129V、N050F/T054K、R047K/N050F/T054L、V190I/D220P/S265W、N112I/T263H/A273H/S285R、T059W/S066N/S129V、T059W/S066Q/S129I、T059W/S129I、T263W/S285P、V190I/D220P、A289V/T263H/A273H、T263H/A273H/S285P、N90S/A273H/S285P、R047K/N050Y/T054L、T004S/S023N、T059R/S129Q、N046Q/R047K/T054H、T059W/S066Q/S129V、E152W/T179P、N050Y/S066Q/S129V、T202S/T263W/A273H、T263W/A273H/S285P、M138L/E152W/T179P、N046Q/R047K、N046Q/T054H/F176L、T004L/G024M、T004S/L282M、T263H/A273H、T263H/A273H/S285W、T004L/S023Y/G024M、L282F/Q286P、T004V/S023Y/G024Y、V190F/S265W、M138L/E152F、V190F/D220E/S265W、N046Q/N050F/T054H、N157Y/S285W、T004F/S023Y/G024M、T004V/S023N/G024M、L198I/D220E/S265Q、N046Q/N050Y/T054K/A154T、S016L/D220E/S265W、D220E/S265W、D220E/A237S/S265W、S066Q/S129Q、V190F/D220E/S265Q/T267I、L282M/F173Y/T219S、E152F/T179P、V190I/S265W、M138L/S066Q、M138L/E152W、T059W/S066Q/A070T/S129I、V190F/D220E/S265N、V190F/S265N、N046Q/N050Y、及M138L/E152F/T179P。
在其他具體實例中，在發明提供分離的變異中性金屬蛋白酶，其中金屬蛋白酶包括多種突變，係選自由V190I/D220P、V190I/D220P/S265Q、V190L/D220E、V190I/D220E/S265Q、V190I/D220E/S265W/L282F、V190L/D220E/S265Q、V190I/D220E/S265W、V190L/D220E/S265N、T059R/S066Q/S129I、V190I/D220E/S265N、V190L/D220E/S265W、V190I/D220E、T059W/S066N/S129V、T059K/S066Q/S129V、T059K/Y082C/S129V、T059R/S066N/S129I、S066Q/S129V、T059R/S066Q/S129V、T059R/S129I、N050Y/T059W/S066N/S129V、D220P/S265N、S066Q/S129I、T059W/S066Q/S129V、T059K/S066Q/S129I、T059R/S129V、N050Y/S066Q/S129V、T059W/S066Q/S129I、N050Y/T059W/S066Q/S129V、T059K/S129I、D220P/S265W、F130L/M138L/T179P、S066N/S129I、T059R/S066N/S129V、F130I/M138L/T179P、T059R/S066Q/N092S/S129I、S066N/S129V、D220E/S265Q、F130L/M138L/E152W/T179P、T059W/S129V、S265P/L282M/Q286R/A289R、S265P/L282F/Q286R/A289R、T059W/S066N/S129I、V190I/D220P/S265W、F130L/E152W/T179P、F130L/M138L/E152F/T179P、Q062K/S066Q/S129I、T059K/S066N/S129I、E152H/T179P、S265P/L282M/Q286K/A289R、F130L/M138L/E152H/T179P、T263W/A273H/S285R、D220E/S265N、F130I/M138L/E152H/T179P、F130V/M138L/E152W/T179P、F130I/M138L/E152W/T179P、T059W/S129I、D220E/S265W、F130V/M138L/T179P、F130L/E152V/T179P、T059R/S129Q、T263W/S285P、F130I/M138L/E152F/T179P、E152W/T179P、V190L/S265Q、F130L/E152F/T179P、L282M/Q286R/A289R/P162S、D220P/S265Q、M138L/E152F/T179P、F130I/E152H/T179P、M138L/E152W/T179P、F130L/T179P、F130L/M138L/E152W/T179P/Q286H、F130L/M138L/E152H、T263W/A273H/S285W、S265P/Q286K、T059W/S066Q/S129Q、T263W/S285R、T059W/S066N/S129Q、T263W/S285W、T059R/S066N/S129Q、S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N、T059W/S129Q、Q062H/S066Q/S129Q、L282M/Q286R/A289R、V190L/D220E/S265N/V291I、V190L/S265N、F130L/M138L/E152W、N050Y/T059R/S129Q、F130I/T179P、T059K/S066Q/S129Q、T059K/S129Q、S265P/L282M/Q286P/A289R、S265P/L282F/Q286P/A289R、T263W/A273H/S285P、S265P/L282M/Q286K、S016L/D220E/S265W、S066Q/S129Q、S265P/L282M/Q286P、L282F/Q286R/A289R、F130V/E152W/T179P、L044Q/T263W/S285R L055F/T059W/S129V、V190L/S265W、Q286R/A289R、G99D/S265P/L282F/Q286K/A289R、F130L/M138L/E152F、T059R/S066Q/S129Q、F130L/E152H、S066N/S129Q、T004S/S023N/G024M/K269N、S265P/L282M、E152F/T179P、T059W/S066N/S129V/S290R、L282F/Q286K/A289R、F130L/M138L、F130I/M138L/E152W、S265P/L282F、F130I/M138L/E152H、F130V/M138L/E152H、V190I/S265Q、M138L/E152M、S265P/L282F/Q286P、M138L/E152H、T059K/S066N/K088E、V190I/S265W、F130L/E152W、L282M/Q286K/A289R、L282M/Q286K/A289R/I253V、T263W/A273H、V190I/S265N、M138L/E152W、A273H/S285R、F130I/M138L、F130L/E152F、F130V/M138L/E152W、T059K/S066Q/V102A/S129Q、F130V/E152H/T179P、F130I/M138L/E152F、F130V/M138L/E152F、M138L/E152F、L282M/Q286R、F130I/E152H、S265P/L282F/A289R/T065S、T263H/A273H/S285R、F130V/M138L、T014M/T059R/S129V、L282M/Q286R/A289R/K11N、A273H/S285P、L282M/Q286K/A289R/S132T、T263H/A273H/S285W、F130V/E152W、S265P/L282F/Q286K/N061Y、F130I/E152W、L198I/D220E/S265Q、V190I/S265L、T263H/S285W、S265P/L282F/A289R、M138L/S066Q、F130I/E152F、N90S/A273H/S285P、S032T/T263H/A273H/S285R、L282F/Q286P/A289R、N157Y/T263W/A273H/S285R、V105A/S129V、T263H/A273H/S285P、S129Q/L282H、T059W/S066Q、F130v/E152H、S023W/G024Y、T004V/S023N、T059R/S066Q、N050W/T054L、L282M/Q286P/A289R、A115V/V190L/S265W、L282M/Q286K、T059R/S066N、L282F/Q286P、T004V/S023W/G024M、S265P/L282F/Q286R/L78H、L282F/Q286K、T004V/S023W/G024Y、S023W/G024M、T059R/R256S、F130V/E152F、T004V/G024W、N050W/T054K、S023Y/G024M、T004V/S023Y、T004V/S023Y/G024M、N050Y/T054H、S023W/G024W、T004V/S023Y/G024Y、T004V/S023N/G024W、F130L/M138L/E152F/T179P/V291I、N050Y/T059K/S066Q、T004V/S023Y/G024W、T059K/S066N、T004V/S023N/G024Y、S023Y/G024W、N050F/T054L、R047K/T054K、S023N/G024W、L282M/A289R、S023Y/G024Y、T004V/G024M、R047K/N050F/T054K、N050F/T054K、T059K/S066Q、S023N/G024M、S023N/G024Y、T004L/S023N、R047K/N050W/T054H、T004L/S023W/G024Y、T004S/S023W、N046Q/N050W/T054H/A142T、T004L/S023Y、T004V/S023W、N050W/T054H、T004S/S023N、T004S/L282M、T004L/S023W、N050F/T054H、N050Y/T054L、及R047K/N050W/T054K。
在其他具體實例中，本發明提供分離的中性金屬蛋白酶，其包括多種突變，係選自由S066Q/S129V、S066Q/S1291、N050Y/S066Q/S129V、S066N/S129I、T059K/S066Q/S129V、S066N/S129V、F130L/E152W/T179P、S265P/L282M/Q286R/A289R、F130L/E152V/T179P、T059K/S066Q/S129I、T263W/S285P、T059K/S066N/S129I、T263W/A273H/S285P、S265P/L282F/Q286R/A289R、F130V/E152W/T179P、T263W/A273H/S285R、V190I/D220P/S265W、F130L/E152H、S066N/S129Q、S265P/L282M/Q286K/A289R、V190I/D220E、T059R/S066N/S129I、V190I/D220E/S265W、T059K/S129I、T059R/S066Q/S129I、F130I/M138L/E152H/T179P、F130I/T179P、T263W/A273H/S285W、S016L/D220E/S265W、S066Q/S129Q、V190I/D220E/S265Q、T059R/S066Q/S129V、D220E/S265N、V190L/D220E、D220E/S265W、V190I/D220P、V190L/D220E/S265N、L044Q/T263W/S285R、S265P/L282M/Q286P/A289R、F130L/M138L/E152H/T179P、T263W/S285R、L282M/Q286R/A289R、T263W/S285W、F130I/E152H/T179P、V190I/D220E/S265N、V190L/D220E/S265W、V190I/D220P/S265Q、T059R/S066N/S129V、V190L/D220E/S265Q、E152H/T179P、F130L/M138L/E152F/T179P、Q062H/S066Q/S129Q、T059R/S129V、V190I/D220E/S265W/L282F、V190I/S265Q、F130L/E152F/T179P、D220E/S265Q、E152W/T179P、T059K/S066Q/S129Q、F130L/M138L/T179P、F130I/M138L/E152F/T179P、F130L/M138L/E152W/T179P、N050Y/T059W/S066Q/S129V、S265P/L282M/Q286K、T059R/S1291、F130V/E152H/T179P、D220P/S265N、S265P/L282M/Q286P、F130I/E152H、T059R/S066Q/N092S/S129I、F130L/T179P、G99D/S265P/L282F/Q286K/A289R、T263W/A273H、V190I/S265N、D220P/S265W、F130L/E152W、F130L/M138L/E152H、S265P/L282M、V190I/S265Q、F130L/E152F、T059K/S129Q、Q286R/A289R、M138L/E152W/T179P、F130I/M138L/E152H、D220P/S265Q、V190L/S265N、F130I/M138L/E152W、S265P/Q286K、V190L/S265Q、V190I/S265W、F130L/M138L/E152F、F130V/E152H、E152F/T179P、N050Y/T059W/S066N/S129V、T059R/S066N/S129Q、F130I/E152W、F130V/E152W、T059R/S066Q/S129Q、T263H/A273H/S285P、N90S/A273H/S285P、V190L/D220E/S265N/V291I、T059R/S129Q、A273H/S285P、F130I/M138L/E152W/T179P、F130V/M138L/E152F、N050Y/T059R/S129Q、T059W/S066Q/S129I、F130V/M138L/T179P、F130V/M138L/E152W/T179P、V190L/S265W、F130V/M138L/E152W、T059W/S066Q/S129V、V190I/S265Q、F130V/M138L/E152H、F130I/E152F、N157Y/T263W/A273H/S285R、T263H/S285W、M138L/E152F/T179P、A115V/V190L/S265W、M138L/E152M、T263H/A273H/S285W、F130L/M138L/E152W、T059K/S066N/K088E、F1301/M138L/E152F、F130I/M138L/T179P、T004V/S023N、T059K/S066Q/V102A/S129Q、F130L/M138L、N047K/N050F/T054K、T263H/A273H/S285R、F130L/M138L/E152W/T179P/Q286H、M138L/E152H、M138L/S066Q、L282M/Q286R/A289R/P162S、L282F/Q286R/A289R、Q062K/S066Q/S129I、A273H/S285R、S265P/L282F/Q286P、S265P/L282F/Q286P/A289R、S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N、T059W/S066N/S129I、V190I/S265L、T059W/S066N/S129V、F130I/M138L、L282M/Q286K/A289R/I253V、R047K/N050F/T054K、M138L/E152F、N050W/T054K、L198I/D220E/S265Q、L282F/Q286K/A289R、N050F/T054K、L282M/Q286R、M138L/E152W、S265P/L282F、F130V/E152F、T059W/S066N/S129Q、F130V/M138L、T263H/A273H、L282M/Q286K/A289R、N046Q/N050W/T054H/A142T、T059W/S066Q/S129Q、S265P/L282F/A289R/T065S、N050F/T054H、S129Q/L282H、L282M/Q286K/A289R/S132T、L282M/Q286R/A289R/K11N、T059K/S066N、R047K/N050W/T054K、T059K/S066Q、T004V/S023Y、T059W/S066N/S129V/S290R、N050Y/T059K/S066Q、及R047K/N050Y。
本發明也提供分離的多核苷酸，其包括一核苷酸序列：(i)與序列識別號1、2、12及/或13具有至少70%同一性，或(ii)在中度至高度嚴格條件下，可雜合至衍生自列於此處的任何核苷酸序列之探針，包括實施例中所提供引子序列，或(iii)與列於序列識別號1、2、12及/或13的核苷酸序列互補。在部分具體實例中，本發明提供編碼至少一種該等多核苷酸的表現載體。在其他具體實例中，本發明提供宿主細胞，其包括這些表現載體。在部分特定較佳具體實例中，宿主細胞是桿菌屬。本發明也提供由該宿主細胞所製造的中性金屬蛋白酶。在其他具體實例中，本發明提供與列於序列識別號1、2、12及/或13的至少一部份序列互補的多核苷酸。
本發明也提供製造具有中性金屬蛋白酶活性的酵素之方法，其包括：將宿主細胞以包括與序列識別號1、2、12及/或13具有至少70%序列同一性的多核苷酸之表現載體而轉形；在適合於宿主細胞的條件下培養轉形的宿主細胞。在部分較佳具體實例中，宿主細胞是桿菌屬。
本發明也提供探針，其包括與序列識別號1、2、12及/或13的對應片段實質上同一的4至150個核苷酸序列，其中探針係用於偵測編碼具有金屬蛋白分解活性的酵素之核酸序列。在部分具體實例中，核酸序列是得自桿菌屬。
本發明也提供清潔組成物，其包括得自桿菌屬的至少一種中性金屬蛋白酶。在部分具體實例中，至少一種中性金屬蛋白酶是得自解澱粉芽孢桿菌。在部分特定較佳具體實例中，至少一種中性金屬蛋白酶包括列於序列識別號3及/或序列識別號4的胺基酸序列。在部分其他具體實例中，本發明提供分離的中性金屬蛋白酶，其與包括序列識別號3及/或序列識別號4的中性金屬蛋白酶包括至少45%胺基酸同一性。在部分具體實例中，分離的中性金屬蛋白酶與序列識別號3及/或序列識別號4包括至少50%的同一性、較佳至少55%、更佳至少60%、還要更佳至少65%、還要更佳至少70%、更佳至少75%、還要更佳至少80%、更佳85%、還要更佳90%、還要更佳至少95%以及最佳99%的同一性。
本發明更提供清潔組成物，其包括至少一種中性金屬蛋白酶，其中至少一種的中性金屬蛋白酶與得自桿菌屬的中性金屬蛋白酶具有免疫交叉反應性。在部分較佳具體實例中，中性金屬蛋白酶與得自解澱粉芽孢桿菌的中性金屬蛋白酶具有免疫交叉反應性。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶與包括列於序列識別號3的胺基酸序列之中性金屬蛋白酶具有免疫交叉反應性。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶與桿菌屬中性金屬蛋白酶及/或包括列於序列識別號3的胺基酸序列之中性金屬蛋白酶的片段(也就是，部分)，具有免疫交叉反應性。
本發明更提供清潔組成物，其包括至少一種中性金屬蛋白酶，其中中性金屬蛋白酶是具有一胺基酸序列的變異中性金屬蛋白酶，該胺基酸序列包括在等同於具有列於序列識別號3的胺基酸序列之桿菌屬中性金屬蛋白酶(特別是解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶)位置處進行的至少一個胺基酸取代。
在其他具體實例中，清潔組成物包含至少一種中性金屬蛋白酶，其包括在序列識別號3中的一組突變。在部分特定較佳具體實例中，變異的中性金屬蛋白酶包括對應於序列識別號3中的胺基酸位置之至少一個取代，以及其中相較於野生型的解澱粉芽孢桿菌金屬蛋白酶，變異的中性金屬蛋白酶在至少一種性質中具有較佳的表現。
本發明也提供清潔組成物，其包括清潔有效量的金屬蛋白分解酵素，該酵素包括與序列識別號3具有至少70%序列同一性的胺基酸序列，以及適合的清潔調配物。在部分較佳具體實例中，清潔組成物更包括一種或多種其他的酵素或酵素衍生物，係選自由蛋白酶、澱粉酶、脂酶、甘露聚醣酶、果膠酶、角質酶、氧化還原酶、半纖維素酶以及纖維素酶所組成的族群中。
本發明也提供組成物，其包括得自桿菌屬(特別是解澱粉芽孢桿菌)的至少一種中性金屬蛋白酶，其中組成物更包括至少一種穩定劑。在部分具體實例中，穩定劑係選自硼砂、甘油、鋅離子、鈣離子以及甲酸鈣。在部分具體實例中，本發明提供競爭型抑制劑，其適合於將本發明的酵素穩定至陰離子界面活性劑。在部分具體實例中，至少一種中性金屬蛋白酶是得自桿菌屬。在部分特定較佳具體實例中，至少一種中性金屬蛋白酶是得自解澱粉芽孢桿菌。在部分特定較佳具體實例中，至少一種中性金屬蛋白酶包括列於序列識別號3的胺基酸序列。
本發明更提供組成物，其包括得自桿菌屬的至少一種中性金屬蛋白酶，其中中性金屬蛋白酶是自溶穩定的變異物。在部分具體實例中，至少一種變異的中性金屬蛋白酶是得自解澱粉芽孢桿菌。在部分特定較佳具體實例中，至少一種變異的中性金屬蛋白酶包括列於序列識別號3的胺基酸序列。
本發明也提供清潔組成物，其包括至少0.0001重量%之本發明的中性金屬蛋白酶，以及視需要的附屬成分。在部分具體實例中，組成物包括附屬成分。在部分較佳具體實例中，組成物包括足夠量的pH修飾劑，以提供組成物從約3至約5的淨pH，該組成物基本上是不含在從約3至約5的pH時可水解的物質。在部分特定較佳具體實例中，可水解的物質包括界面活性劑物質。在其他具體實例中，清潔組成物是液體組成物，而在其他具體實例中，清潔組成物是固體組成物，以及在其他具體實例中，清潔組成物是膠體。更確切地說，發明人並不希望本發明被限制在任何特定的調配物及/或組成物，因為本發明在各種調配物及/或組成物中皆有用。在其他具體實例中，界面活性劑物質包括含有氧化乙烯分子部分的烷基硫酸鈉界面活性劑。
本發明也提供清潔組成物，除了本發明的至少一種中性金屬蛋白酶之外，其更包括至少一種酸穩定酵素，該清潔組成物包括足夠量的pH修飾劑，以提供組成物從約3至約5的淨pH，該組成物基本上是不含在從約3至約5的pH時可水解的物質。在部分特定較佳具體實例中，可水解的物質包括界面活性劑物質。在部分較佳具體實例中，清潔組成物是液體組成物。在其他具體實例中，界面活性劑物質烷基硫酸鈉界面活性劑，其包括氧化乙烯分子部分。在部分具體實例中，清潔組成物包括適合的附屬成分。在部分其他具體實例中，組成物包括適合的附屬成分。在部分較佳具體實例中，組成物包括從約0.001至約0.5重量%的中性金屬蛋白酶。
在部分其他較佳具體實例中，組成物包括從約0.01至約0.1重量%的中性金屬蛋白酶。
本發明也提供清潔方法，其包括以下步驟：a)將包括織物的表面及/或物體與包括適當濃度的本發明中性金屬蛋白酶之清潔組成物接觸；以及b)視需要清洗及/或潤洗表面或物質。在其他具體實例中，此處所提供的任何適合組成物都可有用於這些方法。在部分具體實例中，織物包括至少一個草汁污斑。在部分特定較佳具體實例中，本發明的清潔組成物是有用於從織物中移除草汁及其他污斑。
本發明也提供動物飼料，其包括得自桿菌屬的至少一種中性金屬蛋白酶。在部分具體實例中，至少一種中性金屬蛋白酶是得自解澱粉芽孢桿菌。在部分特定較佳具體實例中，至少一種中性金屬蛋白酶包括列於序列識別號3的胺基酸序列。
本發明提供具有金屬蛋白分解活性之分離的多肽(例如，中性金屬蛋白酶)，其具有列於序列識別號3的胺基酸序列。在部分具體實例中，本發明提供分離的多肽，其與列於序列識別號3的序列具有約40%至98%的同一性。在部分較佳具體實例中，多肽與列於序列識別號3的序列具有約50%至95%的同一性。在部分其他較佳具體實例中，多肽與列於序列識別號3的序列具有約60%至90%的同一性。在其他具體實例中，多肽與列於序列識別號3的序列具有約65%至85%的同一性。在部分特定較佳具體實例中，多肽與列於序列識別號3的序列具有約90%至95%的同一性。
本發明更提供分離的多核苷酸，其編碼包含一胺基酸序列的中性金屬蛋白酶，該胺基酸序列與序列識別號3包括至少40%的胺基酸序列同一性。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶與序列識別號3具有至少50%的胺基酸序列同一性。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶與序列識別號3具有至少60%的胺基酸序列同一性。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶與序列識別號3具有至少70%的胺基酸序列同一性。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶與序列識別號3具有至少80%的胺基酸序列同一性。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶與序列識別號3具有至少90%的胺基酸序列同一性。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶與序列識別號3具有至少95%的胺基酸序列同一性。本發明也提供表現載體，其包括以上所提供的任何多核苷酸。
本發明更提供以本發明表現載體所轉形的宿主細胞，使得至少一種中性金屬蛋白酶是由該宿主細胞所表現。在部分具體實例中，宿主細胞是細菌，而在其他具體實例中，宿主細胞是真菌。
本發明也提供分離的多核苷酸，其包括一核苷酸序列：(i)與序列識別號1、2、12及/或13具有至少70%同一性，或(ii)在中度至高度嚴格條件下，可雜合至衍生自序列識別號1、2、12及/或13的核苷酸序列之探針，或(iii)與列於序列識別號1、2、12及/或13的核苷酸序列互補。在部分具體實例中，本發明提供包括如此多核苷酸的載體。在其他具體實例中，本發明提供以該等載體所轉形的宿主細胞。
本發明更提供製造具有中性金屬蛋白酶活性的至少一種酵素之方法，其包括下列步驟：將宿主細胞以包括與序列識別號1、2、12及/或13具有至少70%序列同一性的多核苷酸之表現載體而轉形；在適合於宿主細胞製造中性金屬蛋白酶的條件下培養轉形的宿主細胞；以及回收中性金屬蛋白酶。在部分較佳具體實例中，宿主細胞是桿菌屬，而在部分其他具體實例中，宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌。
本發明也提供編碼此處所提供的中性金屬蛋白酶之DNA的片段(也就是，部分)。這些片段可有用於獲得部分長度的DNA片段，該等片段可用於從解澱粉芽孢桿菌中分離或鑑定編碼此處所說明的成熟中性金屬蛋白酶酵素之多核苷酸，或其具有蛋白分解活性的部分。在部分具體實例中，在序列識別號2中提供的DNA之部分，可有用於從其他物種中獲得同源DNA片段，該等片段可編碼中性金屬蛋白酶或其具有金屬蛋白分解活性的部分。
本發明更提供至少一種探針，其包括與序列識別號1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15的片段及/或列於此處的任何引子序列實質上同一的多核苷酸，其中探針是用於偵測編碼具有金屬蛋白分解活性的酵素之核酸序列，以及其中核酸序列是得自細菌來源。在部分具體實例中，細菌來源是桿菌屬。在部分較佳具體實例中，細菌來源是解澱粉芽孢桿菌。
本發明更提供組成物，其包括此處所提供的至少一種中性金屬蛋白酶。在部分較佳具體實例中，組成物是清潔組成物。在部分具體實例中，本發明提供清潔組成物，其包括清潔有效量的的至少一種中性金屬蛋白酶，其包括與序列識別號3具有至少40%序列同一性、與序列識別號3具有至少90%序列同一性及/或具有序列識別號3的胺基酸序列之胺基酸序列。在部分具體實例中，清潔組成物更包括至少一種適合的清潔附屬物。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶是衍生自桿菌屬。在部分較佳具體實例中，桿菌屬是解澱粉芽孢桿菌。在其他具體實例中，清潔組成物更包括至少一種其他的酵素或酵素衍生物，係選自由蛋白酶、澱粉酶、脂酶、甘露聚醣酶、以及纖維素酶所組成的族群中。
本發明也提供分離之天然存在的中性金屬蛋白酶，其包括與序列識別號3具有至少45%序列同一性、與序列識別號3具有至少60%序列同一性、與序列識別號3具有至少75%序列同一性、與序列識別號3具有至少90%序列同一性、與序列識別號3具有至少95%序列同一性及/或具有序列識別號3的序列同一性之胺基酸序列，中性金屬蛋白酶是從桿菌屬中分離出來。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶是從解澱粉芽孢桿菌中分離出來。
在其他具體實例中，本發明提供本發明的中性金屬蛋白酶之經設計變異物。在部分具體實例中，經設計的變異物是利用重組DNA技術而基因修改，而在其他具體實例中，變異物則是天然存在的。本發明更包括同源酵素的經設計變異物以及分離的酵素同源物。在部分具體實例中，經設計的變異物同源中性金屬蛋白酶是利用重組DNA技術而基因修改，而在其他具體實例中，變異物同源中性金屬蛋白酶則是天然存在的。
本發明也提供製造中性金屬蛋白酶之方法，其包括：(a)將宿主細胞以包括與序列識別號2具有至少70%序列同一性、與序列識別號2具有至少95%序列同一性及/或具有序列識別號2的多核苷酸序列之表現載體而轉形；(b)在適合於宿主細胞製造中性金屬蛋白酶的條件下培養轉形的宿主細胞；以及(c)回收中性金屬蛋白酶。在部分具體實例中，宿主細胞是桿菌屬(例如，枯草桿菌(B.subtilis )、克勞氏桿菌(B.clausii )、苔蘚桿菌(B.licheniformis ))。在其他具體實例中，宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌。
在其他具體實例中，本發明提供產生宿主細胞的方法，該等宿主細胞可相當大量地製造本發明的中性金屬蛋白酶。在特定較佳具體實例中，本發明提供製造具有各種商業應用的中性金屬蛋白酶之方法，在該等應用中多肽的降解或合成是想要的，其包括清潔組成物以及食品及/或飼料成分、織物加工、皮革加工、穀物加工、肉品加工、清潔、蛋白質水解產物的製備、消化輔助物、殺微生物組成物、抑制細菌組成物、抑制真菌組成物、個人照護產品(例如，口腔照護、頭髮照護及/或皮膚照護)。
本發明也提供具有改善表現之變異的中性金屬蛋白酶，其係相較於野生型的解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶。在部分較佳具體實例中，改善的表現包括改善的溫度穩定性，其係相較於野生型的解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶。在其他較佳具體實例中，改善的表現包括在較低或較高pH條件下之改善的表現，其係相較於野生型的解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶。在其他較佳具體實例中，改善的表現包括改善的自溶穩定性，其係相較於野生型的解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶。在部分特定較佳具體實例中，本發明的酵素組成物具有比得上或改善的清洗表現，其係相較於目前使用的中性金屬蛋白酶。本發明的其他目標及優點在此處是顯而易見的。
本發明提供包括至少一種具有改善的儲存穩定性之中性金屬蛋白酶的方法及組成物。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶是有用於清潔及其他的應用。在部分特定較佳具體實例中，本發明提供包括得自桿菌屬之中性金屬蛋白酶的方法及組成物。在部分特別更佳具體實例中，中性金屬蛋白酶是得自解澱粉芽孢桿菌。在其他較佳具體實例中，中性金屬蛋白酶是解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的變異物。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶是解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的同源物。本發明特別有用於包括但並不限於清潔、漂白及消毒的應用。
除非有其他不同的指明，否則本發明的實施係涉及常用於分子生物學、微生物學、蛋白質純化、蛋白質工程、蛋白質及DNA定序以及重組DNA領域的慣用技術，這些都是在此技藝者的能力內。該等技術對於熟悉於此技藝者是已知的，並且是說明於許多正文及參考著作中(例如，參見Sambrook等人，“分子選殖：實驗室手冊”，第二版(冷泉港)[1987]；以及Ausubel等人“現代分子生物學法”[1987])。此處以上及以下所指的所有專利、專利申請案、文章及刊物，特此明確地以引用方式納入本文中。
此外，此處所提供的標題並非本發明各種形態或具體實例的限制，本發明的各種形態或具體實例可參照整份說明書。因此，以下即將定義的術語可參照整份說明書而更完整地定義。但是，為了加速本發明的理解，許多的術語是定義如下。
定義：
除非此處有不同的定義，否則所此處使用的所有技術及科學術語都具有一般熟悉於本發明所屬技藝者所通常理解的意義。例如，Singleton及Sainsbury，微生物學及分子生物學字典，第二版，John Wiley & Sons，紐約(1994)；以及Hale及Marham，哈波柯林斯氏(Harper Collins)生物學字典，Harper Perennial，紐約(1991)，提供熟悉於此技藝者許多此處所使用的術語之一般性字典。雖然類似或等同於此處所說明的任何方法及材料，都可有用於本發明的實施，但較佳的方法及材料是此處所說明的。因此，以下即將定義的術語是參照整份說明書而更完整地定義。此外，此處所使用的單數術語“a”、“an”及“the”包括複數關係，除非內文有明確不同的指示。除非有其他不同的指示，否則分別是核酸從左到右以5’到3’的方向而寫下；胺基酸序列從左到右以胺基到羧基的方向而寫下。應理解本發明並不限於所說明的特定方法學、方法及試劑，因為它們會取決於熟悉於此技藝者所使用的內文而改變。
發明人希望在整篇說明書中提供的每個最大數字限制都包括每個較低的數字限制，如同在此處明確寫下該等較低的數字限制。在整篇說明書中提供的每個最小數字限制將包括每個較高的數字限制，如同在此處明確寫下該等較高的數字限制。在整篇說明書中提供的每個數字範圍，將包括落在該等較廣數字範圍內的每個較窄的數字範圍，如同在此處明確寫下該等較窄的數字範圍。
所有引註的文件，其相關部分都以引用方式納入本文中；任何文件的引用都不被解釋為承認它是關於本發明的先前技藝。
此處所使用的術語“漂白”是指在適當的pH及溫度條件下，將物質(例如，織物、送洗的衣服、紙漿等)或表面處理一段足夠長的時間，以使物質變亮(也就是，變白)及/或清潔。適合於漂白的化學物質的例子包括，但並不限於ClO2 、H2 O2 、過酸、NO2 等。
此處所使用的術語“消毒”是指從表面移除污染物，以及抑制或殺死物品表面上的微生物。發明人不希望本發明被限制在任何特定的表面、物品或要被移除的污染物或微生物。
此處所使用的術語“多聚體”是指兩個或多個蛋白質或肽，其為共價或非共價結合並且以複合物存在於溶液中。“二聚體”係包含兩個蛋白質或肽的多聚體；“三聚體”包含三個蛋白質或肽等等。此處所使用的“八聚體”是指八個蛋白質或肽的多聚體。
此處所使用的“個人照護產品”是指用於清潔、漂白及/或消毒頭髮、皮膚、頭皮及牙齒的產品，包括但並不限於洗髮精、身體沐浴乳、淋浴凝膠、局部潤膚霜、牙膏及/或其他局部清潔劑。在部分特定較佳具體實例中，這些產品是用於人類，而在其他具體實例中，這些產品是用於非人類的動物(例如，在獸醫的應用)。
除非有其他不同的指明，否則此處所使用的“清潔組成物”及“清潔調配物”是指從要被清潔的物品中用於移除不想要的化合物之組成物，物品例如織物、餐具、隱形眼鏡、其他固體基質、頭髮(洗髮精)、皮膚(香皂及乳霜)、牙齒(漱口水及牙膏)等等。這個術語涵蓋被選擇想要的清潔組成物之特定類型及產品形式(例如，液體、凝膠、細粒或噴劑組成物)之任何物質/化合物，只要組成物可與在組成物中使用的中性金屬蛋白酶及其他酵素相容即可。特別的清潔組成物材料之選擇，可藉由考量要被清潔的表面、物品或織物，以及在使用期間用於清潔條件之想要的組成物形式而易於決定。
該等術語更指適合於清潔、漂白、消毒及/或滅菌任何物體及/或表面的任何組成物。發明人希望該等術語包括，但並不限於，洗滌組成物(例如，液體及/或固體洗衣洗滌劑及精細纖維洗滌劑；硬表面清潔調配物，例如，用於玻璃、木材、陶器及金屬櫃臺頂部及窗戶；地毯清潔劑；烘箱清潔劑；織物清新劑；織物柔軟劑；以及紡織品及洗衣預點器以及餐具洗滌劑)。
更確切地說，此處所使用的術語“清潔組成物”，除非有不同的指明，包括細粒或粉末形式之多用途或重負荷的清洗劑，特別是清潔洗滌劑；液體、凝膠或糊狀形式之多用途的清洗劑，特別是所謂重負荷的液體(HDL)類型；液體精細織物的洗滌劑；手洗洗碗精或輕負荷的洗碗精，特別是高起泡類型的洗碗精；機器洗碗精，包括家用及機構用的各種片狀、細粒、液體及輔助潤洗類型；液體清潔及消毒作用劑，包括抗菌手洗類型、清潔皂、漱口水、假牙清潔劑、車子或地毯洗潔劑、浴室清潔劑；洗髮精及潤絲精；淋浴凝膠及泡沫洗滌液及金屬清潔劑；以及清潔輔助劑，例如，漂白添加物及“去污棒”或前處理的類型。
此處所使用的術語“洗滌劑組成物”及“洗滌劑調配物”是用於有關希望在清潔弄髒的物體之清洗媒介中使用的混合物。在部分較佳具體實例中，該術語是用於有關洗滌的織物及/或衣服(例如，“洗衣洗滌劑”)。在其他具體實例中，該術語是指其他洗滌劑，例如，用於清潔盤碟、餐具等(例如，“洗碗洗滌劑”)。發明人不希望本發明被限制在任何特定的洗滌調配物或組成物。更確切地說，除了中性金屬蛋白酶之外，希望該術語涵蓋包含界面活性劑、移轉酶、水解酵素、氧化還原酶、加強劑、漂白劑、漂白活化劑、靛青漂白劑及螢光染劑、結塊抑制劑、遮蔽劑、酵素活化劑、抗氧化劑以及溶解劑的洗滌劑。
此處所使用的“申請人酵素”是指本發明的中性金屬蛋白酶。
此處所使用在洗滌劑中“增強的表現”是定義為增加清潔漂白敏感性的污斑(例如，草汁、茶、酒、血、骯髒等)，係在標準的清洗循環之後藉由通常的評估而測定。在特定具體實例中，本發明的中性金屬蛋白酶在彩色污斑及污物的移除中提供增強的表現。在其他具體實例中，本發明的酵素在污斑的移除及/或脫色中提供增強的表現。
此處所使用的術語“硬表面清潔組成物”是指用於清潔硬表面(例如，地板、牆壁、磁磚、浴室及廚房固定設備等)的洗滌劑組成物。該等組成物是以任何的形式而提供，包括但並不限於固體、液體、乳液等等。
此處所使用的“洗碗組成物”是指用於清潔餐具的所有形式的組成物，包括但並不限於細粒及液體形式。
此處所使用的“織物清潔組成物”是指用於清潔織物的所有形式的洗滌組成物，包括但並不限於細粒、液體及條狀形式。
此處所使用的“紡織品”是指編織物，以及適合於轉換成或使用作為紡紗、織布、針織及不織布的短纖維及細絲。該術語涵蓋由天然及合成(例如，製造的)纖維所製得的紡紗。
此處所使用的“紡織品材料”是纖維、紡紗中間產物、紡紗、織物以及由織物製得的產物(例如，衣服及其他物件)的一般術語。
此處所使用的“織物”涵蓋任何的紡織品材料。因此，希望該術語涵蓋衣服以及織物、紡紗、纖維、不織材料、天然材料、合成材料以及任何其他的紡織品材料。
此處所使用的術語“可相容”是指清潔組成物材料不會將中性金屬蛋白酶的酵素活性減少到中性金屬蛋白酶在正常使用狀況期間不能如所要的效果之程度。特別的清潔組成物材料是在之後詳細列舉。
此處所使用的“酵素的有效量”是指需要達到特定應用(例如，個人照護產品、清潔組成物等)所需的酵素活性之酵素量。該等有效量是易於由一般熟悉於此技藝者確定，並且是取決於許多因素，例如，所使用的特定酵素變異物、清潔應用、清潔組成物的特定組成、以及是否需要液體或乾燥(例如，細粒、條狀物)組成物等等。
此處所使用的“非織物清潔組成物”涵蓋硬表面清潔組成物、洗碗組成物、個人照護清潔組成物(例如，口腔清潔組成物、假牙清潔組成物、個人清潔組成物等)以及適合用於紙漿及造紙工業的組成物。
此處所使用的“口腔清潔組成物”是指牙粉、牙膏、牙膠、牙粉末、漱口水、口腔噴劑、口腔凝膠、口香糖、嚼錠、小袋、錠劑、生物膠、預防糊劑、牙齒治療溶液等。
此處所使用的術語“移轉酶”是指可催化官能化合物移轉到一系列基質的酵素。
此處所使用的“離基”是指在藉由另一個親核基的取代下從醯基供體中切割出來的親核基。
此處所使用的術語“酵素轉換”是指藉由將基質或中間產物與酵素接觸，而將基質修飾成中間產物或將中間產物修飾成最終產物。在部分具體實例中，接觸是藉由直接將基質或中間產物暴露至適當的酵素而進行。在其他具體實例中，接觸分別包括將基質或中間產物暴露至可表現及/或分泌酵素的生物體，及/或將所要的基質及/或中間產物代謝成所要的中間產物及/或最終產物的生物體。
此處所使用的片語“洗滌劑穩定性”是指洗滌劑組成物的穩定性。在部分具體實例中，穩定性是在洗滌劑的使用期間評估，而在其他具體實例中，該術語是指洗滌劑組成物在儲存期間的穩定性。
此處所使用的片語“對蛋白分解的穩定性”是指蛋白質(例如，酵素)可抵抗蛋白分解的能力。發明人不希望該術語被限制在使用任何特定的蛋白酶以評估蛋白質的穩定性。
此處所使用的“氧化穩定性”是指在氧化條件下蛋白質可發揮功能的能力。特別地，該術語是指在各種濃度的H2 O2 及/或過酸的存在下，蛋白質可發揮功能的能力。在各種氧化條件下的穩定性，可藉由熟悉於此技藝者已知的標準方法及/或藉由此處所說明的方法而測量。氧化穩定性的實質改變是由酵素活性半生期的至少約5%或更大的增加或減少(在大部分具體實例中，較佳是增加)而證明，其相較於不含氧化化合物時所存在的酵素活性。
此處所使用的“pH穩定性”是指在特定pH時蛋白質可發揮功能的能力。一般而言，大部分的酵素都具有有限可發揮功能的pH範圍。除了可在中等範圍的pH(也就是，約pH 7)發揮功能的酵素之外，也有可在非常高或非常低pH條件下作用的酵素。在各種pH時的穩定性，可藉由熟悉於此技藝者已知的標準方法及/或藉由此處所說明的方法而測量。pH穩定性的實質改變是由酵素活性半生期的至少約5%或更大的增加或減少(在大部分具體實例中，較佳是增加)而證明，其相較於在酵素的最適pH時的酵素活性。然而，發明人不希望本發明被限制在任何的pH穩定性水平以及pH範圍。
此處所使用的“熱穩定性”是指在特定溫度時蛋白質可發揮功能的能力。一般而言，大部分的酵素都具有有限可發揮功能的溫度範圍。除了可在中等範圍的溫度(例如，室溫)作用的酵素之外，也有可在非常高或非常低溫度作用的酵素。熱穩定性可藉由熟悉於此技藝者已知的標準方法及/或藉由此處所說明的方法而測量。熱穩定性的實質改變，是當暴露至不同於酵素活性的最適溫度之溫度時(也就是，更高或更低)，藉由突變株的催化活性之半生期的至少約5%或更大的增加或減少(在大部分具體實例中，較佳是增加)而證明。然而，發明人不希望本發明被限制在任何的溫度穩定性水平以及溫度範圍。
此處所使用的“化學穩定性”是指蛋白質(例如，酵素)對於可不利影響其活性的化學物質之穩定性。在部分具體實例中，該等化學物質包括，但並不限於，過氧化氫、過酸、陰離子性洗滌劑、陽離子性洗滌劑、非離子性洗滌劑、螯合劑等。然而，發明人不希望本發明被限制在任何的化學穩定性水平以及化學穩定性範圍。
此處所使用的片語“中性金屬蛋白酶活性改善”是指中性金屬蛋白酶活性相較於標準酵素的相對改善。在部分具體實例中，該術語是指改善的產品形成率，而在其他具體實例中，該術語涵蓋可製造較少水解產品的組成物。在其他具體實例中，該術語是指具有改變的基質專一性之中性金屬蛋白酶組成物。
此處所使用的片語“基質專一性的改變”是指酵素的基質專一性之改變。在部分具體實例中，基質專一性的改變是定義為以酵素所觀察到的Kc a t /Km 比率之間的差異，相較於酵素變異物或其他酵素組成物。酵素基質專一性是根據所測試的基質而改變。酵素的基質專一性是藉由將其顯示的催化效率與不同基質比較而測定。這些測定可特別有用於評估突變酵素的效率，因為一般希望對於特定有興趣的基質製造可顯示較大比率的變異酵素。然而，發明人不希望本發明被限制在任何特定的基質組成物以及任何特定的基質專一性。
此處所使用的“表面性質”是以有關於蛋白質表面所顯示的靜電荷以及例如厭水性及/或親水性的性質而使用。
此處所使用的片語“獨立選自由...所組成的族群中”是指選自由參考的馬庫西(Markush )族群中之分子部分或元素可以是相同的、可以是不同的或元素的任何混合，如同以下的例子所示：具有3個R基的分子，其中每個R基是獨立選自由A、B及C所組成的族群中。此處3個R基可以是：AAA、BBB、CCC、AAB、AAC、BBA、BBC、CCA、CCB或ABC。
關於化學組成物，此處所使用的術語“取代的”是指該術語所應用的有機組成物或基團係：(a).藉由除去至少一個元素或基團而變得不飽和；或(b).在組成物或基團中的至少一個氫是以包含一個或多個(i)碳、(ii)氧、(iii)硫、(iv)氮或(v)鹵原子的分子部分所取代；或(c).(a)及(b)兩者。
僅包含碳及氫原子，如上述(b)中說明可取代氫的分子部分，是碳氫化合物分子部分，其包括但並不限於，烷基、烯基、炔基、烷二烯基、環烷基、苯基、烷苯基、萘基、蒽基、菲基、氟基、類固醇基，以及這些基團與彼此以及與多價烴基(例如，伸烷基、亞烷基、次烷基)的組合。包含氧原子如上述(b)中說明可取代氫的分子部分，包括但並不限於，包含羥基、醯基或酮基、醚、環氧基、羧基以及酯的基團。包含硫原子如上述(b)中說明可取代氫的分子部分，包括但並不限於，包含硫的酸以及酸酯基、硫醚基、巰基以及硫酮基。包含氮原子如上述(b)中說明可取代氫的分子部分，包括但並不限於，胺基、硝基、偶氮基、銨基、醯胺基、疊氮基、異氰酸基、氰酸基以及腈基。包含鹵素原子如上述(b)中說明可取代氫的分子部分，包括氯、溴、氟、碘基以及任何先前說明的分子部分，其中氫或側烷基是被鹵素基團所取代，以形成穩定取代的分子。
應瞭解任何上述的分子部分(b)(i)到(b)(v)都可以單價取代的方式，或藉由在多價取代中失去氫而彼此取代，以形成可在有機化合物或基團中取代氫的另一單價分子部分。
此處所使用的術語“純化的”及“分離的”是指污染物從樣品中的移除。例如，中性金屬蛋白酶是藉由在不是中性金屬蛋白酶的溶液或製劑內移除污染的蛋白質及其他化合物而純化。在部分具體實例中，重組的中性金屬蛋白酶是在細菌或真菌宿主細胞中表現，以及這些重組的中性金屬蛋白酶是藉由移除其他宿主細胞的組成分而純化；重組的中性金屬蛋白酶多肽之百分比因此在樣品中是增加的。在特定較佳具體實例中，本發明的金屬蛋白酶是實質純化到至少約99%蛋白質成分的水平，係藉由SDS－PAGE或其他在此技藝中已知的標準方法而測定。在其他較佳具體實例中，本發明的金屬蛋白酶包括至少約99%組成物的蛋酶成分。在其他具體實例中，金屬蛋白酶是以約至少90－95%總蛋白質及/或蛋白酶的範圍而存在。
此處所使用“有興趣的蛋白質”是指要進行分析、鑑定及/或修改的蛋白質(例如，酵素或“有興趣的酵素”)。天然存在以及重組的蛋白質都有用於本發明。
此處所使用的“蛋白質”是指由胺基酸所組成以及被熟悉於此技藝者辨認為蛋白質的任何組成物。術語“蛋白質”、“肽”以及“多肽”在此處是交換地使用。其中，肽是蛋白質的一部份，熟悉於此技藝者可理解該術語在內文中的使用。
如此處所使用，功能及/或結構上類似的蛋白質視為是“相關蛋白質”。在部分具體實例中，這些蛋白質是衍生自不同屬及/或種，包括在生物體類別之間的差異(例如，細菌蛋白質及真菌蛋白質)。在部分具體實例中，這些蛋白質是衍生自不同屬及/或種，包括在生物體類別之間的差異(例如，細菌酵素及真菌酵素)。在其他具體實例中，相關蛋白質是從相同物種中提供。更確切地說，發明人不希望本發明被限制在從任何特定來源的相關蛋白質。此外，術語“相關蛋白質”也涵蓋三級結構同源物及初級序列同源物(例如，本發明的中性金屬蛋白酶)。例如，本發明涵蓋例如第3－5圖所提供的同源物。其他的同源物也被涵蓋，其包括但並不限於，得自仙人掌桿菌(B.cereus )、仙人掌桿菌E33L、熱容桿菌(B.caldolyticus )、短小桿菌(B.pumulis )、巨大桿菌(B.megaterium )、枯草澱粉多醣桿菌(B.subtilis amylosacchariticus )、短小短芽胞桿菌(Brevibacillus brevis )、多黏芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa (Bacillus polymyxa ))、嗜熱脂肪桿菌(B.stearothermophilus )、蘇力菌(B.thuringiensis )、枯草桿菌及金黃色葡萄球菌(S.aureus )的金屬蛋白酶酵素，以及金黃色溶菌素(aureolysin)、細胞外彈性蛋白酶及中性蛋白酶B。在其他具體實例中，該術語涵蓋免疫交叉反應性的蛋白質。
此處所使用的術語“衍生物”是指衍生自蛋白質的蛋白質，其藉由將一個或多個胺基酸加到羧基端或胺基端之一或兩者、在胺基酸序列中的一個或數個不同位置取代一個或多個胺基酸、及/或在蛋白質的一端或兩端或在胺基酸序列中的一個或多個位置刪除一個或多個胺基酸、及/或在胺基酸序列中的一個或多個位置插入一個或多個胺基酸。蛋白質衍生物的製備較佳是藉由以下方法而達成：修改編碼天然蛋白質的DNA序列、將該DNA序列轉形到適當的宿主以及表現該修改的DNA序列，以形成衍生的蛋白質。
相關(以及衍生性)蛋白質包括“變異蛋白質”。在部分較佳具體實例中，變異蛋白質與母體蛋白質彼此不同處，在於少數的胺基酸殘基。不同的胺基酸殘基數目可以是一個或多個，較佳是1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50個或更多個胺基酸殘基。在部分較佳具體實例中，在變異物之間不同的胺基酸數目是在1到10之間。在部分特定較佳具體實例中，相關蛋白質及特定變異蛋白質包括至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的胺基酸序列同一性。此外，此處所使用的相關蛋白質或變異蛋白質也指與另一相關蛋白質或母體蛋白質在重要區域數目上不同的蛋白質。例如，在部分具體實例中，變異蛋白質具有1、2、3、4、5或10個不同於母體蛋白質之對應的重要區域。
在此技藝中許多適合於產生本發明酵素的變異物之方法是已知的，其包括但並不限於，點飽和致突變法、掃瞄致突變法、插入致突變法、隨機致突變法、定點致突變法及導向演化，以及各種其他的重組方法。
野生型及突變蛋白質的定性是藉由任何適合的方法而達成，以及較佳是取決於有興趣的性質之評估。例如，pH及/或溫度以及洗滌劑及/或氧化穩定性是在本發明的部分具體實例中被測定。更確切地說，其涵蓋具有各種程度的穩定性之酵素，該穩定性在一個或多個這些特性(pH、溫度、蛋白分解穩定性、洗滌劑穩定性及/或氧化穩定性)中有用。
此處所使用的“表現載體”是指包含可操作連結到適合的控制序列之DNA序列的DNA構築，該控制序列可使DNA在適合的宿主中表現。這樣的控制序列包括可產生轉錄的啟動子、可控制該轉錄之選擇的操縱子序列、編碼適合的mRNA核糖體結合位置之序列、以及可控制轉錄及轉譯的終止之序列。載體可以是質體、噬菌體顆粒，或簡單地是有潛力的基因體插入物。一旦轉形到適合的宿主內，載體可不受宿主基因體的支配而複製並且發揮功能，或在部分的例子中，可嵌入到基因體本身內。在本說明書中，“質體”、“表現質體”及“載體”通常是交換地使用，因為質體目前最常使用的載體形式。然而，本發明希望納入該等其他形式的表現載體，其可發揮等同的功能，以及其為在此技藝中已知或變得已知。
在部分較佳具體實例中，中性金屬蛋白酶基因是黏接到適合的表現質體內。接著將選殖的中性金屬蛋白酶基因用於轉形或轉染宿主細胞，以表現中性金屬蛋白酶基因。這個質體可在宿主中中複製(若其包含質體複製所需的熟知元素)，或質體可被設計成嵌入到宿主染色體內。提供必要的元素以用於有效的基因表現(例如，可操作連結到有興趣的基因之啟動子)。在部分具體實例中，這些必要的元素是提供為基因本身的同源啟動子，如果它被辨識(也就是，被宿主，轉錄)的話、為外源性或是藉由中性金屬蛋白酶基因的內源性終止子區域而提供之轉錄終止子(聚腺苷酸區域以用於真核宿主細胞)。在部分具體實例中，篩選基因也被納入，例如，抗生素抗性基因，其可藉由生長在包含抗微生物劑的培養基而使質體感染的宿主細胞能夠連續培養的維持。
以下的卡匣致突變方法可用於促進本發明的中性金屬蛋白酶變異物之建構，但其他方法也可使用。首先，如此處之說明，獲得編碼中性金屬蛋白酶之天然存在的基因，並且全部或部分地定序。接著，將序列對於在編碼的中性金屬蛋白酶中希望產生一個或多個胺基酸突變(刪除、插入或取代)的點進行掃瞄。對於這個點兩側的序列，評估限切位置的存在，以用於將短的基因片段以表現時會編碼各種突變物的寡核苷酸群取代。該等限切位置較佳是在蛋白質基因內的獨特位置，以便促進基因片段的取代。然而，也可使用任何在中性金屬蛋白酶內沒有過度冗餘之方便的限切位置，限制條件是由限切消化所產生的基因片段可再次組裝成適當的序列。如果限切位置不是出現在離選擇點方便的距離內(10到15個核苷酸)的位置的話，該等位置是以在最終構築中譯讀架構或所編碼的胺基酸不被改變的方式，藉由取代在基因中的核苷酸而產生。為了改變其序列以符合所要序列的基因突變，是根據一般已知的方法藉由M13引子延伸而達成。定位適合的兩側區域以及評估所需的改變以到達兩個方便的限切位置序列之任務，是藉由基因密碼的簡併性、基因的限切酵素圖譜以及許多不同的限切酵素而例行性地進行。注意到如果可獲得方便的兩側限切位置的話，則上述方法僅需配合連結不包含位置的兩側區域使用。
一旦選殖了天然存在的DNA及/或合成的DNA，將突變位置兩側的限切位置以同源限切酵素消化，並將複數末端終點互補的寡核苷酸卡匣黏接到基因內。致突變法是藉由這個方法而簡化，因為所有的寡核苷酸都可被合成以便具有相同的限切位置，並且不需要合成的連接子以產生限切位置。
此處所使用的“對應於”是指在蛋白質或肽中的編號位置處之殘基，或類似、同源或等同於在蛋白質或肽中的編號殘基之殘基。
此處所使用的“對應區域”一般是指順著相關蛋白質或母體蛋白質的類似位置。
術語“編碼...的核酸分子”、“編碼...的核酸序列”、““編碼...的DNA序列”及“編碼...的DNA”是指沿著去氧核糖核酸的一股之去氧核糖核苷酸的順序或序列。這些去氧核糖核苷酸的順序決定了沿著多肽(蛋白質)鏈的胺基酸順序。DNA序列因此編碼胺基酸序列。
此處所使用的術語“類似序列”是指在可提供類似於有興趣的蛋白質(也就是，典型原始的有興趣的蛋白質)的功能、三級結構及/或保守性殘基之蛋白質內的序列。例如，在包含α螺旋或β片層結構的抗原決定部位區域中，在類似序列中的取代的胺基酸較佳係維持相同的專一性結構。該術語也指核苷酸序列以及胺基酸序列。在部分具體實例中，類似序列被開發，使得取代的胺基酸序列可導致顯示類似或改善功能的變異酵素。在部分較佳具體實例中，在有興趣的蛋白質之胺基酸中的三級結構及/或保守性殘基，是位於或接近有興趣的部分或片段。因此，當有興趣的部分或片段包含例如α螺旋或β片層結構時，取代的胺基酸較佳係維持該專一性結構。
此處所使用的“同源蛋白質”是指具有類似於有興趣的蛋白質(例如，來自另一來源的中性金屬蛋白酶)的作用及/或結構之蛋白質(例如，中性金屬蛋白酶)。申請人不希望同源物(此處也稱為“同系物”)必然是演化相關的。因此，申請人希望該術語涵蓋得自不同物種之相同或類似的酵素(也就是，在結構及功能方面)。在部分較佳具體實例中，鑑定具有類似於有興趣的蛋白質的四級、三級及/或初級結構之同源物係系所欲的，因為以來自同源物之類似部分取代有興趣的蛋白質中之部分或片段，將減少改變的分裂性。
此處所使用的“同源基因”是指不同物種中的至少一對基因，該等基因係彼此對應並且是彼此相同或非常類似。該術語涵蓋被物種形成(也就是，新物種的發育)所分隔的基因(例如，垂直同源基因)以及已被基因複製所分隔的基因(例如，平行同源基因)。這些基因編碼“同源蛋白質”。
此處所使用的“垂直同源物”及“垂直同源基因”是指在不同物種中已從共同祖先基因(也就是，同源基因)中藉由物種形成而演化的基因。通常，垂直同源物在演化的期間保留相同的功能。垂直同源物的鑑定在最近定序的基因體中係用於可信賴的預測基因功能。
此處所使用的“平行同源物”及“平行同源基因”是指在基因體內藉由複製而相關的基因。雖然平行同源物在演化的期間保留相同的功能，但平行同源物演化出新的功能，即使部分的功能通常是與原始的功能有關。平行同源基因的例子包括，但並不限於編碼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶及凝血酶的基因，這些都是絲胺酸蛋白酶，並且都在相同的物種內產生。
此處所使用的“野生型”及“天然”蛋白質是在自然界中發現的蛋白質。術語“野生型序列”及“野生型基因”在此處交換地使用，是指天然或自然存在於宿主細胞中的序列。在部分具體實例中，野生型序列是指蛋白質工程計畫起點之有興趣的序列。編碼天然存在的蛋白質之基因，可根據在此技藝中已知的一般方法而獲得。該等方法一般包括合成具有有興趣蛋白質的推測序列編碼區域之標示探針、從表現該蛋白質的生物體中製備基因體資料庫、以及藉由雜合至探針而篩選有興趣基因的資料庫。接著將陽性雜合的選殖株繪製圖譜以及定序。
此處所使用的術語“重組DNA分子”是指藉由分子生物技術將DNA片段連結在一起所組成的DNA分子。
術語“重組寡核苷酸”是指利用分子生物操作而產生的寡核苷酸，其包括但並不限於，黏接兩個或多個由限切酵素消化多核苷酸序列所產生的寡核苷酸序列、合成寡核苷酸(例如，合成引子或寡核苷酸)等等。
在序列間的同源性程度，可利用在此技藝中已知的任何適合方法而測定(例如，參見Smith與Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482[1981]；Needleman及Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443[1970]；Pearson及Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444[1988]；於威斯康辛遺傳學套裝軟體中(遺傳學電腦組，麥迪遜，威斯康辛)之程式例如GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA；以及Devereux等人，Nucl.Acid Res.，12：387－395[1984])。
例如，PILEUP是可測定序列同源性水平的有用程式。PILEUP利用漸進式配對的校準而從一群相關序列中產生多種序列校準。它也可繪製顯示叢集關係的樹狀圖，以用於產生校準。PILEUP係使用Feng及Doolittle的漸進式校準方法之簡化(Feng及Doolittle，J.Mol.Evol.，35：351－360[1987])。這個方法是類似於Higgins及Sharp所說明者(Higgins及Sharp，CABIOS5：151－153[1989])。有用的PILEUP參數包括3.00的預設間隙加權值、0.10的預設間隙長度加權值以及加權末端間隙。另一個有用的演算法的例子是由Altschul等人所說明的BLAST演算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403－410[1990]；以及Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873－5787[1993])。一個特別有用的BLAST程式是WU－BLAST－2程式(參見Altschul等人，Meth.Enzymol.，266：460－480[1996])。參數“W”、“T”及“X”決定了校準的靈敏度及速度。BLAST程式係使用11的字元長度(W)、50的BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff及Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915[1989])校準(B)、10的期望值(E)、M’5、N’－4以及兩股的比較作為預設值。
此處所使用的“核酸序列同一性百分比(%)”是定義為在候選序列中的核苷酸殘基相同於本發明序列的核苷酸殘基之百分比。
此處所使用的術語“雜合”是指在此技藝中已知的核酸股經由鹼基配對而會合到互補股的方法。
此處所使用的片語“雜合條件”是指進行雜合反應的條件。這些條件通常是藉由測量雜合的條件之“嚴格”程度而分類。嚴格程度可例如以核酸結合複合物或探針的解鏈溫度(Tm)為基礎。例如，“最大嚴格”通常發生在約Tm－5℃(比探針的Tm低5℃)；“高度嚴格”是比Tm低約5－10℃；“中度嚴格”是比探針的Tm低約10－20℃；以及“低度嚴格”是比Tm低約20－25℃。可選擇地或除此之外，雜合條件也可以雜合及/或一種或多種嚴格清洗的鹽或離子強度條件為基礎。例如，6xSSC＝非常低度嚴格；3xSSC＝低度到中度嚴格；1xSSC＝中度嚴格；以及0.5xSSC＝高度嚴格。功能上，最大嚴格條件可用於以雜合探針鑑定具有嚴謹同一性或接近嚴謹同一性的核酸序列；而高度嚴格條件可用於以探針鑑定具有約80%或更多序列同一性的核酸序列。
對於需要高度選擇性的應用，通常要使用相當嚴格的條件以形成雜合物(例如，使用相當低的鹽及/或高的溫度)。
在至少兩個核酸或多肽的內文中，片語“實質上類似”及“實質上同一”，通常是指多核苷酸或多肽包括具有至少約40%同一性、更佳至少約50%同一性、還要更佳至少約60%同一性、較佳至少約75%同一性、更佳至少約80%同一性、還要更佳至少約90%同一性、還要更佳約95%同一性、最佳約97%同一性、有時多達約98%以及約99%序列同一性的序列，其係相較於參考(也就是，野生型)序列。序列同一性可利用已知的程式而測定，例如，利用標準參數的BLAST、ALIGN及CLUSTAL(例如，參見Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403－410[1990]；Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915[1989]；Karin等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，90：5873[1993]；以及Higgins等人，Gene，73：237－244[1988])。用於進行BLAST分析的軟體，可經由國家生物技術資訊中心而公開獲得。此外，資料庫也可利用FASTA而檢索(Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444－2448[1988])。兩個多肽是實質上同一的一項指標是第一多肽與第二多肽係免疫交叉反應性的。通常，不同處在於保守性取代的多肽是免疫交叉反應性的。因此，例如，當兩個肽僅不同於保守性取代時，多肽是與第二多肽實質上同一的。兩個核酸序列是實質上同一的另一項指標是兩個分子在嚴格條件下彼此雜合(例如，在中度到高度嚴格的範圍內)。
此處所使用的“等同的殘基”是指共享特定胺基酸殘基的蛋白質。例如，等同的殘基可藉由測定蛋白質(例如，中性金屬蛋白酶)三級結構的水平之同源性而鑑定，其三級結構已藉由X－射線結晶學而測定。等同的殘基是定義為對具有推測等同的殘基及有興趣蛋白質的蛋白質之特定胺基酸殘基的兩個或多個主鏈原子之原子座標(N上的N、CA上的CA、C上的C及O上的O)而言，在校準之後是在0.13 nm內，較佳是在0.1 nm內者。校準是在最佳模式已被定向及定位之後達成，以提供被分析的蛋白質之非－氫蛋白質原子的原子座標之最大重疊。較佳的模式是結晶學模式，其提供在可獲得的最高解像力時的實驗繞射數據之最低的R因子，其係利用熟悉於結晶學及蛋白質定性/分析技藝者已知的方法而測定。
此處所使用的術語“雜合中性金屬蛋白酶”及“融合中性金屬蛋白酶”是指從至少兩個不同或“母體”蛋白質中設計的蛋白質。在較佳具體實例中，這些母體蛋白質彼此是同源物。例如，在部分具體實例中，較佳的雜合中性金屬蛋白酶或融合中性金屬蛋白酶包含一蛋白質的胺基端以及該蛋白質之同源物的羧基端。在部分較佳具體實例中，兩個末端是結合在一起，以對應於全長的活性蛋白質。
此處所使用的術語“調控元素”是指可控制核酸序列表現的部分形態之基因元素。例如，啟動子是促進可操作連結的編碼區域之轉錄啟動的調控元素。其他的調控元素包括剪接信號、聚腺苷酸化信號以及終止信號。
此處所使用的“宿主細胞”一般是原核或真核宿主，其係以在此技藝中已知的重組DNA技術所建構的載體而轉形或轉染。轉染的宿主細胞可複製編碼蛋白質變異物的載體，或可表現所要的蛋白質變異物。在可編碼蛋白質變異物的前－或前原－形式之載體的例子中，當表現時，該等變異物通常是從宿主細胞中分泌到宿主細胞培養液中。
在將核酸序列插入到細胞的內文中之術語“導入”是指轉形、轉導或轉染。轉形的方法包括在此技藝中已知的原生質體轉形、氯化鈣沈澱、電穿孔、裸露DNA等(參見，Chang及Cohen，Mol.Gen.Genet.，168：111－115[1979]；Smith等人，Appl.Env.Microbiol.，51：634[1986]；以及Ferrari等人的回顧文章，於Harwood“桿菌”中，Plenum出版公司，第57－72頁[1989])。
術語“啟動子/增強子”代表包含可提供啟動子及增強子功能的序列之DNA部分(例如，反轉錄病毒的長端重複包含啟動子及增強子功能)。增強子/啟動子可以是“內源性”或“外源性”或“異質性”的。內源性的增強子/啟動子是與基因體中的指定基因天然連結的增強子/啟動子。外源性(異質性)的增強子/啟動子是藉由基因操作(也就是，分子生物學技術)而與基因並列放置的增強子/啟動子。
在表現載體上的“剪接信號”之存在，通常導致重組轉錄物之較高水平的表現。剪接信號介導內含子(intron)從初級RNA轉錄物中的移除，並且是由剪接供體及受體位置所組成(Sambrook等人，“分子選殖：實驗室手冊”，第二版，冷泉港出版，紐約[1989]，第16.7－16.8頁)。常用的剪接供體及受體位置是SV40的16S RNA之剪接接合點。
術語“穩定的轉染”或“穩定地轉染”是指將外來的DNA導入及嵌入至轉染細胞的基因體內。術語“穩定的轉染株”是指已將外來或外源性DNA穩定嵌入至轉染細胞的基因體DNA之細胞。
此處所使用的術語“可篩選的標記”或“可篩選的基因產物”是指使用可編碼酵素活性的基因，而在可篩選的標記表現的細胞中，該活性提供細胞對於抗生素或藥物的抗性。
此處所使用的術語“擴增”及“基因擴增”是指特定DNA序列不成比例地複製的方法，使得擴增的基因變成以高於在基因體中原始存在的複製數目而存在。在部分具體實例中，將細胞藉由生長在藥物(例如，可抑制酵素的抑制劑)存在時之篩選，會導致編碼生長在藥物存在時所需基因產物的內源性基因之擴增，或藉由編碼這個基因產物的外源性(也就是，輸入)序列之擴增，或是兩者。將細胞藉由生長在藥物(例如，可抑制酵素的抑制劑)存在時之篩選，可導致編碼生長在藥物存在時所需基因產物的內源性基因之擴增，或藉由編碼這個基因產物的外源性(也就是，輸入)序列之擴增，或是兩者。
“擴增”是涉及模板專一性的核酸複製之特例。它與非－專一性的模板複製(也就是，模板依賴性但不依賴專一性模板的複製)成為對比。模板專一性在此是與複製的精確性(也就是，適當的多核苷酸之合成)及核苷酸(核糖－或去氧核糖－)專一性區別。模板專一性通常是以“目標”專一性的方式而說明。目標序列是它們試圖從其他核酸中被挑出的意義之“目標”。擴增技術主要被設計用於這個挑出作用。
此處所使用的術語“共同擴增”是指將可擴增的標記連同其他基因序列(也就是，包括一個或多個不可篩選的基因，例如，包含在表現載體內的基因序列)導入到單一細胞內，以及施加適當的篩選壓力，使得細胞同時擴增可擴增的標記及其他不可篩選的基因序列。可擴增的標記可物理上連結到其他的基因序列，或可選擇地，兩個不同的DNA片段，一個包含可擴增的標記以及另一個包含不可篩選的標記，可導入至相同的細胞內。
此處所使用的術語“可擴增的標記”、“可擴增的基因”及“擴增載體”是指標記、基因或編碼基因的載體，其可在適當生長條件下使該基因擴增。
此處所使用的術語“可擴增的核酸”是指可藉由任何擴增方法擴增的核酸。發明人預期“可擴增的核酸”通常將包括“樣品模板”。
此處所使用的術語“樣品模板”是指起源於一樣品的核酸，該樣品是要被分析“目標”的存在(定義如下)。相對地，“背景模板”是以關於樣品模板外的核酸使用時，其可以或可不存在於樣品中。背景模板通常是最不被注意的。它可能是殘餘的結果，或它可能是由於試圖從樣品中純化出的核酸污染物所致。例如，從不同於欲偵測的生物體中之核酸，可在測試樣品中以背景而存在。
“模板專一性”在大部分擴增技術中是藉由酵素的選擇而達成。擴增酵素是在它們被使用的條件下，在異質性核酸混合物中將僅處理核酸的專一性序列的酵素。例如，在Q β複製酶的例子中，MDV－1 RNA是複製酶的專一性模板(例如，參見Kacian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69：3038[1972])。其他的核酸不會藉由這個擴增酵素而複製。同樣地，在T7 RNA聚合酶的例子中，這個擴增酵素對它本身的啟動子具有嚴格的專一性(參見，Chamberlin等人，Nature，228：227[1970])。在T4 DNA黏接酶的例子中，當在黏接接合處的寡核苷酸或多核苷酸基質及模板間有錯配的話，酵素將不會黏接兩個寡核苷酸或多核苷酸(參見，Wu及Wallace，Genomics，4：560[1989])。最後，Taq 及Pfu 聚合酶，藉由它們可在高溫時發揮功能的能力，被發現可對於所結合的序列顯示高度專一性，因此是藉由引子而定義；高溫可導致有利於引子與目標序列雜合以及不與非目標序列雜合的熱動力條件。
此處所使用的術語“引子”是指寡核苷酸，無論在純化的限切消化物中天然地存在或合成地製造，當放置在與核酸股互補的引子會延伸產物之合成被誘發的條件下時(也就是，在核苷酸及誘發作用劑(例如，DNA聚合酶)的存在下，以及在適合的溫度及pH時)，其可扮演合成的起點。引子較佳是單股的，以用於在擴增中的最大效率，但可選擇地是雙股的。如果是雙股的話，先將引子處理以分開其股，然後再用於製備延伸產物。較佳地，引子是寡去氧核糖核苷酸。引子必需是足夠的長以在誘發劑的存在下啟動延伸產物的合成。引子的確實長度將取決於許多因素，包括溫度、引子的來源以及方法的使用。
此處所使用的術語“探針”是指寡核苷酸(也就是，核苷酸序列)，無論在純化的限切消化物中天然地存在或合成、重組地製造或藉由PCR擴增，其可雜合至另一有興趣的寡核苷酸。探針可以是單股或雙股的。探針是有效於偵測、鑑定及分離特定的基因序列。發明人預期在本發明中所使用的任何探針都將以任何“報導子分子”標示，使得可在任何偵測系統中偵測，其包括但並不限於，酵素(例如，ELISA以及酵素為基礎的組織化學分析)、螢光、放射活性以及冷光系統。發明人不希望本發明被限制在任何特定的偵測系統或標示。
此處所使用的術語“目標”，當以關於擴增方法而使用時(例如，聚合酶鏈鎖反應)，是指被用於聚合酶鏈鎖反應引子結合的核酸區域。因此，“目標”是試圖從其他核酸序列中被挑出。“部分”是定義為在目標序列內的核酸之一個區域。
此處所使用的術語“聚合酶鏈鎖反應”(“PCR”)是指美國專利第4,683,195、4,683,202及4,965,188號的方法，特此以引用方式納入本文中，其包括在基因體DNA的混合物中增加目標序列部分的濃度之方法，而不需要選殖或純化。這個擴增目標序列的方法，包括將大量超過的兩個寡核苷酸引子導入到含有所要目標序列的DNA混合物，然後在DNA聚合酶的存在下進行準確順序的熱循環。兩個引子是與雙股目標序列的個別股互補。為了達成擴增，將混合物變性，然後將引子煉回至它們在目標分子內的互補序列。在煉回之後，將引子以聚合酶延伸，以便形成新的一對互補股。變性、引子煉回及聚合酶延伸的步驟可重複許多次(也就是，變性、煉回及延伸構成一個“循環”；可以有許多的“循環”)，以獲得高濃度所要目標序列的擴增部分。所要目標序列的擴增部分之長度，是藉由引子彼此間的相對位置而決定，因此，這個長度是可控制的參數。由於這個方法的重複外觀，這個方法稱為“聚合酶鏈鎖反應”(此後稱為“PCR”)。因為目標序列之所要擴增的部分變成在混合物中的主要序列(以濃度方面而言)，因此，它們被稱為是“PCR擴增的”。
此處所使用的術語“擴增試劑”是指除了引子、核酸模板及擴增酵素以外的擴增所需之試劑(去氧核糖核苷酸三磷酸、緩衝溶液等)。通常，擴增試劑連同其他的反應成分是放置及包含在反應容器中(試管、微管等)。
關於PCR，可將基因體DNA中單一複製的特定目標序列，擴增到可被許多不同方法偵測的水平(例如，以標示的探針雜合；併入生物素基化的引子，然後以抗生物素蛋白－酵素結合偵測；將3 2 P－標示的去氧核苷酸三磷酸，例如，dCTP或dATP，併入到擴增的部分中)。除了基因體DNA之外，任何的寡核苷酸或多核苷酸序列也都可以適當的引子分子組而擴增。特別地，由PCR方法本身所產生的擴增部分，它們自己是後續PCR擴增的有效模板。
此處所使用的術語“PCR產物”、“PCR片段”及“擴增產物”是指在變性、煉回及延伸的PCR步驟之兩個或多個循環完成之後所得到的化合物之混合物。這些術語涵蓋一個或多個目標序列的一個或多個部分已被擴增的例子。
此處所使用的術語“限切核酸內切酶”及“限切酵素”是指細菌酵素，其每一個都可在專一性核苷酸序列處或附近切割雙股DNA。
發明詳述：
本發明提供包括至少一種具有改善的儲存穩定性之中性金屬蛋白酶的方法及組成物。在部分具體實例中，中性金屬蛋白酶是有用於清潔及其他的應用。在部分特定較佳具體實例中，本發明提供包括得自桿菌屬之中性金屬蛋白酶的方法及組成物。在部分特別更佳具體實例中，中性金屬蛋白酶是得自解澱粉芽孢桿菌。在其他較佳具體實例中，中性金屬蛋白酶是解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的變異物。在其他具體實例中，中性金屬蛋白酶是解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶的同源物。本發明特別有用於包括但並不限於清潔、漂白及消毒的應用。
也如同在以下實施例中更詳細說明的，本發明提供用於清潔廣泛物體的許多優點，其包括但並不限於衣服、織物、醫藥裝置等。此外，本發明也提供在一清洗溫度及pH範圍下有效於清潔、漂白及消毒的組成物。
一般而言，蛋白酶是經由將水分子加到肽鍵而水解蛋白質的醯胺連結。切割是發生在肽鍵的羰基處。在細菌物種中(例如，桿菌)，有兩種主要類型的細胞外蛋白酶，即，鹼性或絲胺酸蛋白酶以及中性金屬蛋白酶。
中性金屬肽內切酶(也就是，中性金屬蛋白酶)(EC 3.4.24.4)屬於具有絕對需要鋅離子用於催化活性的蛋白酶類型。這些酵素在中性pH時具有最適活性，並且是在30到40 kDa大小的範圍。中性金屬蛋白酶會結合有助於蛋白質的結構穩定性的2到4個鈣離子。在金屬蛋白酶的活性部位之結合的金屬離子，是水分子活化的必要特徵。水分子接著扮演親核子的角色，並且切割肽鍵的羰基。
中性結合鋅的金屬蛋白酶家族包括細菌酵素嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)，以及類似嗜熱菌蛋白酶的蛋白酶(“TLP”)、以及羧基肽酶(一種消化酵素)，以及可催化組織重塑及降解反應的基質金屬蛋白酶。有關於穩定性及功能，唯一被完整定性的這些蛋白酶是嗜熱菌蛋白酶及其變異物(TLP)。更確切地說，更多的研究已聚焦於設計枯草桿菌的中性蛋白酶，以增加酵素的熱穩定性(例如，參見Vriend等人，於Tweel等人(編輯)“酵素的穩定性及穩定化作用”，Elsevier，第93－99頁[1993])。
最大的努力已聚焦於藉由改變結構決定部位而增加蛋白酶的穩定性，其係經由使用建議的分子模擬而鑑定，以預防會導致蛋白質自溶及引起中性蛋白酶在高溫變性的局部展開過程(例如，參見vanden Burg等人，於Hopsu－Havu等人(編輯)“在細胞功能中的蛋白分解：操作桿菌蛋白酶的自溶途徑”，生物醫學及健康研究，第13卷，IOS出版[1997]，第576頁)。
此處提供設計具有改善特性的中性金屬蛋白酶之組成物及方法。如此處所示，鈣離子已在其他蛋白酶(例如，嗜熱菌蛋白酶)被報導可預防自溶作用。嗜熱脂肪桿菌中性蛋白酶已藉由添加鈣而穩定化，以對抗自溶作用及蛋白分解的降解(參見Drrschmidt等人，FEBS J.，272：1523－1534[2005])。
更確切地說，本發明提供適合於設計不受鈣離子支配的中性金屬蛋白酶之組成物及方法，以維持它們的結構穩定性。在部分具體實例中，設計可預防特定二級結構元素的局部展開，其可預防蛋白分解作用。
天然及經設計的蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶)通常是表現在枯草桿菌中，以及許多已應用在洗滌劑調配物中以移除蛋白質的污斑。其他已應用在例如烘焙業(例如，來自熱蛋白分解桿菌(B.thermoproteolyticus )的嗜熱菌蛋白酶；例如，參見Galante及Formantici，Curr.Organic Chem.，7：1399－1422[2003])。一般而言，絲胺酸蛋白酶已更廣泛地用於洗滌劑中，至少部分是由於這些蛋白酶可相對容易穩定化所致。
更確切地說，由於許多因素，金屬蛋白酶是較不常用於工業中，特別是在洗滌劑工業中。這些酵素涉及更複雜的蛋白質系統，因為酵素具有絕對需要鈣及鋅離子以分別用於穩定性及功能。此外，用於洗衣過程的洗滌劑溶液以及水通常包含經常干擾離子被酵素結合的成分或螯合這些離子的成分，導致減少或損耗蛋白酶的蛋白分解功能以及不穩定化。
相對於目前使用的金屬蛋白酶酵素系統，本發明提供足夠穩定化的中性金屬蛋白酶，以促進在液體洗衣洗滌劑組成物中的長期架儲穩定性。在特定較佳具體實例中，金屬蛋白酶的穩定性及活性是經由將酵素與其必要的活性部位鋅分子錯合而保留。重要地，鈣及鋅離子的組合對於酵素的功能不會具有有害的影響。在部分具體實例中，穩定的中性金屬蛋白酶是來自解澱粉芽孢桿菌的野生型金屬蛋白酶(例如，純化的MULTIFECT中性；“PMN”)。在其他較佳具體實例中，重組的中性金屬蛋白酶(例如，將解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶選殖到枯草桿菌中(“nprE”))。在其他具體實例中，具有改善穩定性的金屬蛋白酶涵蓋對於酵素的一個或多個鈣結合部位具有增加親和力的酵素。在較佳具體實例中，本發明的中性金屬蛋白酶是有用於一般的洗滌劑應用，其包括但並不限於，冷水溫度、草汁污斑及/或低pH條件。
本發明提供可將結合鋅的中性金屬蛋白酶穩定化之條件，以用於增加洗滌劑基底及/或組成物的儲存穩定性。在較佳具體實例中，洗滌劑組成物包括至少一種穩定化對抗自溶作用及展開的金屬蛋白酶(例如，桿菌的中性金屬蛋白酶)，係將必要的鋅及/或鈣離子納入至洗滌劑調配物內。在部分特定較佳具體實例中，來自解澱粉芽孢桿菌的金屬蛋白酶(PMN)以及在枯草桿菌中表現的重組物(nprE)，其比結合鈣離子大10倍親和力結合鋅離子，是有用於本發明。當與不含離子的相同蛋白酶比較時，在必要的鋅離子存在下之穩定化的蛋白酶，具有改善的穩定性對抗蛋白分解。
雖然部分的實驗結果顯示在加入洗滌劑基底1小時之後，nprE喪失部分的蛋白分解活性(約20%)，但在鋅離子存在下於32℃培養nprE，卻顯示優於沒有額外的鹽或鈣離子之測試條件的明顯穩定性。鈣及鋅離子的同時存在並沒有顯示加成的效果。在鋅離子濃度低於15 mM時，中性金屬蛋白酶在約4週的期間是足夠穩定的。因此，本發明提供包括添加鋅的組成物，以增加在洗滌劑成分存在時的中性金屬蛋白酶之儲存期。
此外，在其他具體實例中，鋅陽離子是以Co2 ＋ 、Mn2 ＋ 或Fe2 ＋ 取代，因為所有的這些離子都已顯示可結合及恢復中性金屬蛋白酶的蛋白酶活性。然而，已經測得Mn2 ＋ 及Fe2 ＋ 並不會恢復所有的天然活性。雖然Co2 ＋ 可恢復最高的活性百分比，但比Zn2 ＋ 明顯較不穩固地結合。鋅陽離子是所有中性金屬蛋白酶的活性部位之必要特徵，因為它已知在基質結合及酵素催化中扮演重要角色(例如，參見Holmquist及Vallee，J.Biol.Chem.，249：4601－4607[1974])。中性金屬蛋白酶對於鋅陽離子之相對緊密的親和力(約μ M的範圍)，以及對於這個離子比鈣大10倍的親和力，顯示鋅是扮演穩定劑的功能，藉此預防自溶、蛋白分解以及展開。然而，發明人不希望本發明被限制在任何特定的機轉。
本發明提供非常有利的機會以應用於工業洗滌劑的生產及開發。許多具有高度專一性移除蛋白質、澱粉及油脂污斑的洗滌劑是可得的。特別地，解澱粉芽孢桿菌的PMN或中性金屬蛋白酶對於Equest草(Equest Grass；瓦維克)之較佳的清洗表現，顯示在也包含鋅的洗滌劑基底中之本發明的中性金屬蛋白酶，可有用於改善的洗滌劑組成物。
本發明的清潔及洗滌劑調配物之詳細說明：
除非有不同的註記，否則此處提供的所有成分或組成物水平都是指該成分或組成物的活性水平，並且排除，可能在市售來源中存在的雜質，例如，殘留的溶劑或副產物。
酵素成分重量是以總活性蛋白質為基準。
所有的百分比及比例都是以重量計，除非有其他不同的指明。所有的百分比及比例都是以總組成物為基準而計算，除非有其他不同的指明。
在例示的洗滌劑組成物中，酵素水平是以佔總組成物重量的純酵素而表示，以及除非有其他不同的指明，否則洗滌劑成分是以佔總組成物的重量而表示。
包括中性金屬蛋白酶的清潔組成物：
本發明之穩定化的中性金屬蛋白酶是有效於調配各種洗滌劑組成物。本發明的清潔組成物可有利地用於，例如，洗衣應用、硬表面清潔、自動洗碗應用以及化妝應用，例如，假牙、牙齒、頭髮及皮膚。然而，由於在較低溫度溶液中增加的有效性及較好的顏色安全紀錄之獨特優點，因此，本發明的中性金屬蛋白酶是理想地適合於洗衣應用，例如，織物的漂白。此外，本發明的酵素也有用於細粒及液體組成物。
本發明的酵素也有用於清潔添加物產品。當想要額外的漂白有效性時，包括至少一種本發明酵素的清潔添加物產品，是理想上適合於納入到洗衣方法中。這樣的例子包括，但並不限於，低溫溶液清潔應用。添加物產品，以其最簡單的形式，可以是如本發明所提供的一種或多種中性金屬蛋白酶酵素。在部分具體實例中，添加物是以劑型而包裝以加到清潔方法中，在該清潔方法中係使用過氧化物的來源以及想要增加的漂白有效性。在部分具體實例中，單一的劑型包括片、錠、膠囊錠或其他包括預先測量的粉末及/或液體之單一劑量單位。在部分具體實例中，填充物及/或載體材料是納入的，以增加該組成物的體積。適合的填充物或載體材料包括，但並不限於，各種硫酸鹽、碳酸鹽及矽酸鹽以及滑石、黏土等等。在部分具體實例中，用於液體組成物的填充物及/或載體材料包括水及/或低分子量的一級醇及二級醇，包括多元醇及二元醇。該等醇的例子包括但並不限於，甲醇、乙醇、丙醇及異丙醇。在部分具體實例中，組成物包括從約35%至約90%的該等材料。在其他具體實例中，酸性填充物是用於降低組成物的pH。在部分其他具體實例中，清潔添加物包括至少一種如下所述之活化的過氧化物來源及/或如下更完整說明的附屬成分。
本發明的清潔組成物及清潔添加物需要有效量之本發明提供的中性金屬蛋白酶酵素。在部分具體實例中，所需的酵素水平是藉由添加一種或多種本發明提供的中性金屬蛋白酶物種而達成。通常，本發明的清潔組成物包括至少0.0001重量%、從約0.0001至約1、從約0.001至約0.5、或甚至從約0.01至約0.1重量%的至少一種本發明提供之中性金屬蛋白酶。
在部分較佳具體實例中，通常將此處所提供的清潔組成物加以調配，使得在用於水溶性清潔操作期間，清洗的水具有從約5.0至約11.5的pH，或在其他具體實例中，甚至從約6.0至約10.5。在部分較佳具體實例中，液體產品調配物通常是調配成具有從約3.0至約9.0的淨pH，而在部分其他具體實例中，調配物具有從約3至約5的淨pH。在部分較佳具體實例中，細粒洗衣產品通常是調配成具有從約8至約11的pH。在建議使用水平處控制pH的技術，包括使用緩衝劑、鹼、酸等，並且是在此技藝中之人士所熟知的。
在部分特定較佳具體實例中，當至少一種中性金屬蛋白酶用於細粒組成物或液體時，中性金屬蛋白酶是在包膠顆粒的形式中，以在儲存期間保護酵素避免與細粒組成物的其他成分接觸。此外，包膠也在清潔方法期間提供控制中性金屬蛋白酶的可利用率之方法，並且可增強中性金屬蛋白酶的表現。發明人預期本發明之包膠的中性金屬蛋白酶將有用於各種環境。也希望中性金屬蛋白酶是利用在此技藝中已知的任何適合包膠材料及方法而包膠。
在部分較佳具體實例中，包膠材料通常將至少部分的中性金屬蛋白酶催化劑包膠。在部分具體實例中，包膠材料是水溶性及/或水分散性的。在部分其他具體實例中，包膠材料具有0℃或更高的玻璃轉換溫度(Tg)(有關玻璃轉換溫度的更多資訊，例如，參見WO 97/11151，特別從第6頁第25行到第7頁第2行，)。
在部分具體實例中，包膠材料是選自由碳水化合物、天然或合成膠、幾丁質及幾丁聚醣、纖維素及纖維素衍生物、矽酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、聚乙烯基醇、聚乙二醇、石蠟及其組合所組成的族群中。在包膠材料是碳水化合物的部分具體實例中，其係選自由單糖、寡糖、多醣及其組合所組成的族群中。在部分較佳具體實例中，包膠材料是澱粉(對一些例示性適合的澱粉之說明，例如，參見歐洲專利0922499號；美國專利第4,977,252、5,354,559及5,935,826號，)。
在其他具體實例中，包膠材料包括由塑膠製成的微球(例如，熱塑性塑膠、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物；有用的市售微球包括，但並不限於，EXPANCEL[Casco產品，斯德哥爾摩，瑞典]、PM 6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228、EXTENDOSPHERES及Q－CEL[PQ公司，福吉谷，賓州]、LUXSIL及SPHERICELl[Potters工業公司，卡爾斯達，紐澤西州及福吉谷，賓州])。
製造及使用申請人的清潔組成物之方法：
在部分較佳具體實例中，本發明的清潔組成物是調配成任何適合的形式，並且是由調配者所選擇的方法而製備(對一些非限定的例子，例如，參見美國專利第5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392及5,486,303號，)。在想要低pH清潔組成物的部分具體實例中，該等組成物的pH是經由添加酸性物質(例如，HCl)而調整。
附屬物質：
雖然不是本發明目的所必要的，但在部分具體實例中，此處所說明的附屬物之非限定列舉是適合用於本發明的清潔組成物中。更確切地說，在部分具體實例中，附屬物是併入到本發明的清潔組成物中。在部分具體實例中，附屬物質可協助及/或增強清潔表現、處理欲清潔的基質、及/或修飾清潔組成物的美觀(例如，香料、顏色劑、染料等)。應理解的是，該等附屬物是本發明中性金屬蛋白酶以外的物質。這些額外成分的確實性質及其併入的水平，是取決於組成物的物理形式及要使用的清潔操作之性質而定。適合的附屬物質包括，但並不限於，界面活性劑、加強劑、螯合劑、染劑轉移抑制劑、沈澱輔助劑、分散劑、額外的酵素及酵素穩定劑、催化物質、漂白活化劑、漂白強化劑、過氧化氫、過氧化氫的來源、預先形成的過酸、聚合的分散劑、黏土移除/抗－再沈澱劑、增白劑、肥皂水抑制劑、染劑、香料、結構彈性化作用劑、織物柔軟劑、載劑、水溶助長劑、加工輔助劑及/或色素。除了此處明確提供的物質之外，其他的例子也是在此技藝中熟知的(例如，參見美國專利第5,576,282、6,306,812 B1及6,326,348 B1號)。在部分具體實例中，上述的附屬成分構成本發明清潔組成物的剩餘部分。
界面活性劑 ：在部分具體實例中，本發明的清潔組成物包括至少一種界面活性劑或界面活性劑系統，其中界面活性劑是選自非離子界面活性劑、陰離子界面活性劑、陽離子界面活性劑、兩性離子界面活性劑、雙極性離子界面活性劑、半極性非離子界面活性劑及其混合物。在部分低pH清潔組成物的具體實例中(例如，具有從約3至約5的淨pH之組成物)，組成物通常不包含烷基乙氧基化硫酸鹽，因為咸信該等界面活性劑可被酸性內容的組成物水解。
在部分具體實例中，界面活性劑是佔清潔組成物重量之約0.1%至約60%的水平存在，而在其他具體實例中，是從約1%至約50%的水平，而在其他具體實例中，是從約5%至約40%的水平。
加強劑 ：在部分具體實例中，本發明的清潔組成物包括一種或多種洗滌加強劑或加強劑系統。在併入至少一種加強劑的部分具體實例中，清潔組成物包括佔清潔組成物重量至少約1%、從約3%至約60%、或甚至從約5%至約40%的加強劑。
加強劑包括，但並不限於，鹼金屬、聚磷酸的銨或烷醇銨鹽、鹼金屬矽酸鹽、鹼土金屬及鹼金屬碳酸鹽、鋁矽酸鹽加強劑聚羧酸鹽化合物、醚羥基聚羧酸鹽、馬來酸酐及乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物、1,3,5－三羥基苯－2,4,6－三磺酸、及羧甲氧基琥珀酸、各種鹼金屬、聚乙酸的氨鹽及取代的氨鹽(例如，乙二胺四乙酸及三乙酸氨)、以及聚羧酸，例如，苯六甲酸、琥珀酸、檸檬酸、氧二基琥珀酸、聚馬來酸、苯1,3,5－三羧酸、羧甲氧基琥珀酸及其可溶性鹽。更確切地說，發明人預期任何適合的加強劑將有用於本發明的各種具體實例。
螯合劑 ：在部分具體實例中，本發明的清潔組成物包含至少一種螯合劑。適合的螯合劑包括，但並不限於，銅、鐵及/或錳螯合劑及其混合物。在使用至少一種螯合劑的具體實例中，本發明的清潔組成物包括佔清潔組成物重量之約0.1%至約15%，或甚至從約3.0%至約10%的螯合劑。
沈澱輔助劑 ：在部分具體實例中，本發明的清潔組成物包含至少一種沈澱輔助劑。適合的沈澱輔助劑包括，但並不限於，聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸鹽、去污聚合物(例如，聚對苯二甲酸)、黏土(例如，高嶺石、膠嶺石、凹凸棒石、伊利石、膠狀黏土、和樂石)及其混合物。
染劑轉移抑制劑 ：在部分具體實例中，本發明的清潔組成物包括一種或多種染劑轉移抑制劑。適合的聚合型染劑轉移抑制劑包括，但並不限於，聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚合胺N－氧化物聚合物、N－乙烯吡咯烷酮及N－乙烯咪唑的共聚合物、聚乙烯唑烷酮及聚乙烯咪唑或其混合物。
在使用至少一種染劑轉移抑制劑的具體實例中，本發明的清潔組成物構成佔清潔組成物重量的約0.0001%至約10%、從約0.01%至約5%、或甚至從約0.1%至約3%。
分散劑 ：在部分具體實例中，本發明的清潔組成物包含至少一種分散劑。適合的水溶性有機材料包括，但並不限於，均聚合酸或共聚合酸或其鹽，其中聚羧酸包括藉由不超過2個碳原子而彼此分開的至少2個羧基。
酵素 ：在部分具體實例中，本發明的清潔組成物包括一種或多種洗滌酵素，其可提供清潔表現及/或織物照護的優點。適合的酵素的例子包括，但並不限於，半纖維素酶、過氧化酶、蛋白酶、纖維素酶、聚木糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質素酶、果膠酶、角質酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧化酶、木質素酶、支鏈澱粉酶、單寧酶、戊聚醣酶、馬蘭酶、β－葡聚醣酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶及澱粉酶或其混合物。在部分具體實例中，係使用酵素的組合(也就是“混合物”)，其包括傳統可應用的酵素，像是使用蛋白酶、脂肪酶、角質素酶及/或纖維酶結合澱粉酶。
酵素穩定劑 ：在本發明的部分具體實例中，在本發明的洗滌劑調配物中所使用的酵素是穩定化的。發明人預期用於酵素穩定化的各種技術都將有用於本發明。例如，在部分具體實例中，此處所使用的酵素是藉由在最終組成物中鋅(II)、鈣(II)及/或鎂(II)離子的水溶性來源之存在而穩定化，其可提供酵素該等離子以及其他金屬離子(例如，鋇(II)、鈧(II)、鐵(II)、錳(II)、鋁(III)、錫(II)、鈷(II)、銅(II)、鎳(II)以及氧釩(IV))。
觸媒金屬錯合物 ：在部分具體實例中，本發明的清潔組成物包括一種或多種觸媒金屬錯合物。在部分具體實例中，包含金屬的漂白觸媒是有用的。在部分較佳具體實例中，金屬漂白觸媒包括一觸媒系統，其包括具有定義的漂白觸媒活性之過渡金屬陽離子(例如，銅、鐵、鈦、釕、鎢、鉬或錳陽離子)、具有幾乎沒有或沒有漂白觸媒活性的輔助金屬陽離子(例如，鋅或鋁陽離子)以及對於觸媒及輔助金屬陽離子具有定義的穩定常數之隔離物，特別是使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亞甲基膦酸)及其水溶性鹽(例如，參見美國專利第4,430,243號)。
在部分具體實例中，本發明的清潔組成物是藉由錳化合物而催化。該等化合物及使用的水平是在此技藝中熟知的(例如，參見美國專利第5,576,282號)。
在其他具體實例中，鈷漂白觸媒是有用於本發明的清潔組成物。各種鈷漂白觸媒是在此技藝中已知的(例如，參見美國專利第5,597,936及5,595,967號)。該等鈷觸媒可藉由已知的方法而易於製備(例如，參見美國專利第5,597,936及5,595,967號)。
在其他具體實例中，本發明的清潔組成物包括巨多環堅固配體(“MRL”)的過渡金屬錯合物。作為實用的事物而非藉以限制，在部分具體實例中，本發明所提供的組成物及清潔方法被調整，以在水溶性清洗媒介中提供至少億分之一等級的活性MRL物種，以及在部分較佳具體實例中，是在清洗液中提供約0.005 ppm至約25 ppm，更佳是從約0.05 ppm至約10 ppm，以及最佳是從約0.1 ppm至約5 ppm的MRL。
在本發明的過渡金屬漂白觸媒中之較佳的過渡金屬包括，但並不限於，錳、鐵及鉻。較佳的MRL也包括，但並不限於，交叉橋接的特殊超堅固配體(例如，5,12－二乙基－1,5,8,12－四偶氮二環[6.6.2]十六烷)。適合的過渡金屬MRL可藉由已知的方法而易於製備(例如，參見WO 00/32601及美國專利第6,225,464號)。
製造及使用清潔組成物的方法：
本發明的清潔組成物是調配成任何適合的形式，並且是由調配者所選擇的方法而製備(例如，參見美國專利第5,879,584、255,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392、5,486,303、4,515,705、4,537,706、4,515,707、4,550,862、4,561,998、4,597,898、4,968,451、5,565,145、5,929,022、6,294,514、與6,376,445號，其全部都以引用方式納入本文中用於部分非限定的例子)。
使用方法：
在較佳具體實例中，本發明的清潔組成物是有用於清潔表面及/或織物。在部分具體實例中，至少一部份的表面及/或織物是與本發明清潔組成物的至少一種具體實例接觸(以淨形式或稀釋在清洗液中)，然後視需要將表面及/或織物清洗及/或潤洗。為了本發明之目的，“清洗”包括但並不限於擦洗以及機械攪動。在部分具體實例中，織物包括任何可在正常消費者使用條件中被洗滌的織物。在較佳具體實例中，本發明的清潔組成物是以在溶液中從約500 ppm至約15,000 ppm的濃度而使用。在清洗溶劑是水的部分具體實例中，水溫通常是在約5℃至約90℃的範圍。在用於織物清潔的部分較佳具體實例中，水與織物質量的比例通常是從約1：1至約30：1。
實驗：
提供以下的實施例以證明及進一步說明本發明的特定較佳具體實例及形態，這些實施例不被解釋為限制本發明的範疇。
在以下的實驗揭露中，使用以下的簡寫：℃(攝氏溫度)；rpm(每分鐘的圈數)；H2 O(水)；HCl(氫氯酸)；aa及AA(胺基酸)；bp(鹼基對)；kb(仟鹼基對)；kD(仟道耳吞)；gm(公克)；μg及ug(微克)；mg(毫克)；ng(奈克)；μl及ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(奈米)；μm及um(微米)；M(莫耳濃度)；mM(毫莫耳濃度)；μM及uM(微莫耳濃度)；U(單位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘)；hr(s)(小時)；MgCl2 (氯化鎂)；NaCl(氯化鈉)；OD280(在280 nm的光學密度)；OD405(在405nm的光學密度)；OD600(在600 nm的光學密度)；PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸鹽緩衝溶液[150 mM NaCl、10 mM磷酸鈉緩衝溶液，pH 7.2])；LAS(十二烷基磺酸鈉)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥甲基)胺基甲烷)；TAED(N,N,N’N’－四乙醯基乙二胺)；PES(聚酯碸)；MES(2－嗎啉基乙烷磺酸．單水合物；式量195.24；Sigma編號M－3671)；CaCl2 (氯化鈣．無水；式量110.9；Sigma編號C－4901)；DMF(N,N－二甲基甲醯胺；式量73.09，d＝0.95)；Abz－AGLA－Nba(2－胺基苯甲醯基－L－丙胺醯甘胺醯－L－白胺醯－L－丙胺酸基－4－硝基苯甲醯胺；式量583.65；Bachem編號H－6675，VWR目錄編號100040－598)；SBG1%(“含葡萄糖的特級培養液”；6 g大豆蛋白腖[Difco]、3 g酵母萃取物、6 g NaCl、6 g葡萄糖)；利用在此技藝中已知的方法，在滅菌之前以NaOH將pH調整至7.1；w/v(重量對體積)；v/v(體積對體積)；Npr及npr(中性金屬蛋白酶)；SEQUEST(SEQUEST資料庫檢索程式，華盛頓大學)；Npr及npr(中性金屬蛋白酶基因)；nprE及NprE(解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶)；PMN(純化的MULTIFECT金屬蛋白酶)；MS(質譜)；SRI(污斑除去指數)；TIGR(基因體研究所，洛克斐勒，馬里蘭州)；AATCC(美國織物及著色化學師協會)；Amersham(Amersham生命科技公司，阿靈頓高地，伊利諾州)；Corning(康寧國際，康寧，紐約州)；ICN(ICN製藥公司，柯斯塔梅莎，加州)；Pierce(Pierce生物科技，洛克福特，伊利諾州)；Equest(Equest，Warwick國際集團公司，福林特夏，英國)；EMPA(Eidgenossische Material Prufungs und versuch Anstalt，聖蓋倫，瑞士)；CFT(測試材料中心，弗拉爾丁恩，荷蘭)；Amicon(Amicon公司，貝爾利，麻州)；ATCC(美國標準菌種中心，馬納薩斯，維吉尼亞州)；Becton Dickinson(Becton Dickinson實驗試用品，林肯公園，紐澤西州)；Perkin－Elmer(Perkin－Elmer，衛斯理，麻州)；Rainin(Rainin儀器有限公司，屋朋，麻州)；Eppendorf(Eppendorf AG，漢堡，德國)；Waters(Waters公司，密福特，麻州)；Geneart(Geneart GmbH，雷根斯堡，德國)；Perseptive Biosystems(Perseptive Biosystems，拉姆西，明尼蘇達州)；Molecular Probes(分子探針，尤金，奧立岡州)；BioRad(BioRad，瑞奇蒙，加州)；Clontech(CLONTECH實驗室，帕拉阿圖，加州)；Cargill(Cargill公司，明尼波里斯，明尼蘇達州)；Difco(Difco實驗室，底特律，密西根州)；GIBCO BRL或Gibco BRL(Life科技公司，蓋德堡，馬里蘭州)；New Brunswick(New Brunswick科學公司，艾迪遜，紐澤西州)；Thermoelectron(Thermoelectron公司，華生，麻州)；BMG(BMG實驗科技公司，奧芬堡，德國)；Greiner(Greiner Bio－One，克雷費爾德，奧地利)；Novagen(Novagen公司，麥迪遜，威斯康新州)；Novex(Novex，聖地牙哥，加州)；Finnzymes(Finnzymes OY，芬蘭)；Qiagen(Qiagen公司，華倫西亞，加州)；Invitrogen (Invitrogen公司，卡爾斯貝，加州)；Sigma(Sigma化學公司，聖路易，密蘇里州)；DuPont儀器(阿什維爾，紐約州)；Global Medical Instrumentation或GMI(環球醫療儀器設備，拉姆西，明尼蘇達州)；MJ Research(MJ Research，華生，麻州)；Infors(Infors AG，布明根，瑞士)；Stratagene(Stratagene選殖系統，拉荷拉，加州)；Roche(Hoffmann La Roche公司，奴特力，紐澤西州)；Agilent(Agilent科技，帕拉阿圖，加州)；S－Matrix(S－Matrix公司，尤瑞卡，加州)；US Testing(美國測試公司，胡布根，紐約州)；West Coast Analytical Services(西岸分析服務公司，聖菲泉，加州)；Ion Beam Analysis Laboratory(離子束分析實驗室，薩瑞大學離子束中心(蓋德福特，英國)；TOM(Terg－o－Meter)；BMI(血液、牛奶、油墨)；BaChem(BaChem AG，巴本朵夫，瑞士)；Molecular Devices(分子裝置公司，桑尼谷，加州)；Corning(康寧國際，康寧，紐約州)；MicroCal(Microcal公司，北漢普頓，麻州)；Chemical Computing(化學計算公司，蒙特婁，加拿大)；NCBI(國家生物科技資訊中心)；Argo Bioanalytica(Argo Bioanalytica公司，紐澤西州)；Vydac(Grace Vydac，海斯普利亞，加州)；Minolta(Konica Minolta，拉姆西，紐澤西州)；以及Zeiss(Carl Zeiss公司，斯龍伍德，紐約州)。
在這些實驗中，光譜儀是用於測量反應完成之後所形成的產物之吸光值。反射計是用於測量樣本的反射係數。除非有不同的指明，否則蛋白質濃度是以Coomassie Plus(Pierce)，利用牛血清白蛋白作為標準品而估計。
以下的分析是用於以下所說明的實施例中。
A.在96槽孔微滴定盤(MTP)中用於蛋白質含量測定的Bradford分析：
在這些分析中，Bradford染料試劑(Quick Start)分析是用於在MTP規模中測定NprE蛋白酶樣品中的蛋白質濃度。
在這個分析系統中，所使用的化學品及試劑溶液是：Quick Start Bradford染料試劑：BIO－RAD，編號500－0205稀釋緩衝溶液：10 mM NaCl、0.1 mM CaCl2 、0.005% Tween－80
所使用的儀器是Biomek FX Robot(Beckman)以及SpectraMAX(型號340)MTP判讀器；MTP是來自Costar(型號9017)。
在測試中，將200 μl的Bradford染料試劑移到每個槽孔內，然後再加15 μl的稀釋緩衝溶液。最後，將10 μl過濾的培養液加到槽孔中。在徹底混合之後，將MTP在室溫中培養至少10分鐘。將可能的氣泡吹走，並且在595 nm讀取槽孔的OD。
為了測定蛋白質濃度，因此將背景讀值(也就是，來自未接種槽孔的讀值)從樣品讀值中扣除。所得到的OD5 9 5 數值提供在樣品中的蛋白質含量之相對測量。在0至5 μg的NprE校正線之線性，使得可以使用OD5 9 5 nm數值作為蛋白質含量的相對測量。由於預期在上清液中的NprE含量是200－300 μg/ml，因此，用於測試中的10 μl樣品體積包含少於5 μg的蛋白質，其提供在線性範圍內的數值。
B.測試蛋白酶表現的微樣本分析：
用於這個分析的洗滌劑並不包含酵素。所使用的儀器是Biomek FX Robot(Beckman)以及SpectraMAX(型號340)MTP判讀器；MTP是來自Costar(型號9017)。
洗滌劑製備 (冷水液體洗滌劑；美國條件)：
將Milli－Q水調整到6 gpg的水硬度(Ca/Mg＝3/1)，並且加入0.78 g/l TIDE2007－2×洗滌劑。將洗滌劑溶液劇烈攪拌至少15分鐘。接著加入5 mM HEPES(游離酸)，並將pH調整至8.2。
微樣本：
圓形直徑的微樣本是得自CFT。在樣本切割之前，先將織物(EMPA 116)以水清洗。將兩個微樣本垂直置於96槽孔微滴定盤的每個槽孔內，以暴露整個表面積(也就是，不是平放在槽孔的底部)。
測試方法：
將培養箱設定在20℃。將過濾的培養液樣品藉由以10 mM NaCl、0.1 mM CaCl2 、0.005% Tween－80溶液的混合物稀釋，而在適當的濃度測試。所要的洗滌劑溶液是如上述而製備。接著，將190 μl的洗滌劑溶液加到包含微樣本的MTP之每個槽孔。將10 μl稀釋的酵素溶液加到這個混合物(以提供200 μl/槽孔的總體積)。將MTP以膠帶密封，並且置於培養箱中30分鐘，同時以1400 rpm攪動。在適當條件下培養之後，從每個槽孔移出100 μl的溶液，並且置入新的MTP內。將包含100 μl溶液/槽孔的新MTP，在MTP判讀器中以405 nm讀取。空白對照組以及包含兩個微量樣本及洗滌劑但無酵素的對照組也包括在內。
BMI表現的計算：
將所得的吸收值對空白值(也就是，不含酵素的微樣本培養後所得的數值)校正。所得的吸收值是對水解活性的測量。對於每個樣品(例如，nprE或變異物)計算表現指數。將表現指數比較相同蛋白質濃度時的變異物(實際值)及標準酵素(理論值)之表現進行。此外，也利用標準酵素的Langmuir方程式之參數計算理論值。表現指數(PI)大於1(PI>1)確認較佳的變異物(相較於標準品[例如，野生型])，而PI值1(PI＝1)則確認表現相同於標準品的變異物，以及PI小於1(PI<1)確認表現比標準品差的變異物。因此，PI可鑑定優勝者以及在特定條件下不希望使用的變異物。
C.用於NprE蛋白酶的檸檬酸鹽穩定性分析：
檸檬酸鹽穩定性是在50 mM檸檬酸鹽的存在下，將野生型NprE及變異物培養之後而測量。一開始及殘留的活性是利用DMC水解分析而測定。在這個分析系統中，所使用的化學品及試劑溶液是：檸檬酸單水合物：Merck 1.00244 PipeS(游離酸)：Sigma P－1851 Tris(游離酸)：Sigma T－1378 HEPES(超過99.5%)：Sigma H－7523 Tween－80：Sigma P－8074二甲基酪蛋白(DMC)：Sigma C－9801 Tris緩衝溶液(游離酸)：6.04 g溶解於1000 ml的水(＝50 mM)HEPES緩衝溶液：11.9 g溶解於1000 ml的水(＝50 mM)檸檬酸鹽緩衝溶液(游離酸)：21.0 g溶解於1000 ml的水(＝100 mM)PIPES緩衝溶液(游離酸)：3.32 g溶解於約960 ml的水DMC溶液：1%重量/體積於55 mM PIPES緩衝溶液中，最終pH＝6.0稀釋緩衝溶液1：0.1 mM CaCl2 /25 mM Tris；pH 8.2稀釋緩衝溶液2：0.1 mM CaCl2 /50 mM檸檬酸鹽/25 mM Tris；pH 8.2
這些稀釋緩衝溶液的濃度是以最終濃度顯示。一開始的濃度是成比例較高的，並且是取決於稀釋比例而定。一開始的濃度是成比例較高的，並且是取決於稀釋比例而定。在其他實驗中，HEPES是有用於交換Tris。所使用的儀器是Biomek FX Robot(Beckman)以及培養箱/搖晃器(Innova，型號4230；New Brunswick)。將PIPES緩衝溶液以4 N HCl調整至pH 5.8(最終濃度55 mM)。將Tris緩衝溶液以4 N HCl調整至pH 8.2(最終濃度25 mM)。將50 mM檸檬酸鹽/25 mM Tris緩衝溶液以4N NaOH調整至pH 8.2。將HEPES緩衝溶液以4 N NaOH調整至pH 8.2(最終濃度25 mM)。將50 mM檸檬酸鹽/25 mM HEPES緩衝溶液以4 N NaOH調整至pH 8.2。
蛋白質測定：
為了在檸檬酸鹽穩定性分析中建立所要的稀釋比例，因此將每個培養盤的野生型NprE對照組之蛋白酶濃度以TCA分析而測定。在這個方法中，將25 μl過濾的培養液加到200 μl的16.875%(重量/體積)TCA。在室溫下培養10到15分鐘之後，測定在405 nm的光散射/吸收值。蛋白質濃度是利用以純化的NprE建構的校正線而測定。
測試方法：
過濾的培養液之稀釋比例是利用如上所述的TCA分析而測定。
應激條件： 將過濾的培養液以稀釋緩衝溶液2稀釋。將MTP以膠帶覆蓋、搖晃數秒，並且在25℃、200 rpm的培養箱中放置60分鐘。在培養之後，從每個槽孔中取出20 μl的混合物並且移轉到新的MTP內，其包含180 μl之1% DMC預熱的基質溶液(將基質在25℃預熱)。將MTP直接放置在培養箱/搖晃器，並且在25℃以200 rpm的攪動培養30分鐘。殘留的蛋白酶活性是利用以下說明的二甲基酪蛋白分解分析而測定。
未應激條件： 將過濾的培養液以稀釋緩衝溶液1稀釋。從每個槽孔中立即取出20 μl的混合物並且移轉到新的MTP內，其包含180 μl預熱的1% DMC基質溶液(將基質在25℃預熱)。將MTP直接放置在培養箱/搖晃器，並且在25℃以200 rpm的攪動培養30分鐘。一開始的蛋白酶活性是利用以下說明的二甲基酪蛋白分解分析以TNBS而測定。
所有的殘留活性數值(以二甲基酪蛋白分解分析測定)都是利用以下的方程式而計算：%殘留活性＝OD6 0 m i n 數值×100/OD0 0 m i n 數值
D.二甲基酪蛋白分解分析：
在這個分析系統中，所使用的化學品及試劑溶液是：二甲基酪蛋白(DMC)：Sigma C－9801 Tween－80：Sigma P－8074 PIPES緩衝溶液(游離酸)：Sigma P－1851；15.1 g溶解於約960 ml的水；以4 N NaOH將pH調整至6.0，加入1 ml的5% Tween－80，並將體積加到1000 ml。PIPES及Tween－80的最終濃度分別是50 mM及0.005%。苦基磺酸(TNBS)：Sigma P－2297(5%溶液於水中)試劑A：將45.4 g Na2 B4 O7 .10 H2 O(Merck 6308)及15 ml的4 N NaOH一起溶解，以形成1000 ml的最終體積(藉由加熱，如果需要的話)。試劑B：將35.2 g NaH2 PO4 .1 H2 O(Merck 6346)及0.6 g Na2 SO3 (Merck 6657)一起溶解，以形成1000 ml的最終體積。
方法：
為了製備基質，將4 g的二甲基酪蛋白溶解在400 ml PIPES緩衝溶液中。將過濾的培養上清液以PIPES緩衝溶液稀釋。接著，將10 μl各自稀釋的上清液加到在MTP槽孔中的200 μl基質中。將MTP以膠帶覆蓋、搖晃數秒，並且在25℃的烘箱中放置30分鐘不要搖動。在從烘箱中移出第一個培養盤之前約15分鐘，藉由將每50 ml的試劑A混合1 ml TNBS溶液而製備TNBS試劑。將MTP的每個槽孔裝填60 μl的TNBS試劑A。將培養的培養盤搖晃數秒，之後將10 μl移轉到含有TNBS試劑A的MTP。將培養盤以膠帶覆蓋，並且在桌上型搖晃器(BMG Thermostar)中，於室溫及500 rpm搖晃20分鐘。最後，將200 μl的試劑B加到槽孔中，在搖晃器上混合1分鐘，並且利用MTP判讀器測定405 nm的吸收值。
將所得的吸收值對空白值(也就是，無酵素的基質)校正。所得的吸收值是對水解活性的測量。樣品的(獨斷)比活性是藉由將吸收值除以測定的蛋白質濃度而計算。
E. TIDE 穩定性分析：
NprE及變異物的穩定性是在含有25% TIDE濃縮洗滌劑的培養步驟後而測量。一開始及殘留的活性是利用以下說明的AGLA－分析而測定。所使用的儀器是Biomek FX Robot(Beckman)、螢光計(FLUOstar Optima；BMG)、培養箱/搖晃器(iEMS；Thermoelectron)以及培養箱/搖晃器(Innova；New Brunswick(型號4230))；MTP是來自Costar(型號9017)及Greiner(黑盤，型號655076)。
化學品及試劑：
在這個分析中系統，所使用的化學品及試劑溶液是：TIDE濃縮洗滌劑：含有或不含DTPA TIDE濃縮洗滌劑溶液：將125 g的TIDE濃縮洗滌劑溶解於50 g的50 mM HEPES(pH 8.2)及275 ml水的混合物中；TIDE的濃度是27.7%，在以上清液稀釋之後是25%。MES稀釋緩衝溶液：52.6 mM MES/NaOH、2.6 mM CaCl2 、0.005% Tween－80(pH 6.5)AGLA基質：BaChem目錄編號H－6675或美國肽公司目錄編號81－0－31 AGLA基質溶液：將451 mg的AGLA溶解於16 ml的N,N－二甲基甲醯胺；將這個溶液倒在304 ml的MES－緩衝溶液中(52.6 mM MES/NaOH、2.6 mM CaCl2 、0.005% Tween－80(pH 6.5))，同時攪拌。
測試方法：
未應激條件： 首先，將20 μl過濾的培養液以180 μl的MES稀釋緩衝溶液稀釋。接著，將20 μl的這個稀釋培養液以180 μl的MES稀釋緩衝溶液稀釋。然後，將10 μl的這個稀釋液以190 μl的AGLA－基質溶液，在25℃預熱的培養盤中稀釋。將任何存在的氣泡吹走，並且根據AGLS蛋白酶分析方法而測量培養盤。
應激條件： 首先，將20 μl過濾的培養液以180 μl不含DTPA的TIDE濃縮洗滌劑溶液稀釋，以及iEMS搖晃器中預先混合5分鐘之後，於Innova搖晃器中進一步培養。將培養盤於32℃、200 rpm培養總共60分鐘。此外，將20 μl過濾的培養液以180 μl含有DTPA的TIDE濃縮洗滌劑溶液稀釋，以及iEMS搖晃器中預先混合5分鐘之後，於Innova搖晃器中進一步培養。將培養盤於20℃、200 rpm培養總共40分鐘。接著，將20 μl的這兩種溶液之一都以180 μl的MES稀釋緩衝溶液稀釋，以及將10 μl的這個稀釋液以190 μl的AGLA－基質溶液，在25℃預熱的培養盤中稀釋。將任何存在的氣泡吹走，並且根據AGLS蛋白酶分析方法而測量培養盤。
計算： 螢光測量是在350 nm的激發及415 nm的發射處進行。螢光光譜儀軟體計算每個槽孔的螢光增加之反應速率至毫RFU/min的線性迴歸線：
F. 2－胺基苯甲醯基－L－丙胺醯甘胺醯－L－白胺醯－L－丙胺酸基－4－硝基苯甲醯胺蛋白酶分析(Abz－AGLA－Nba)
以下的方法提供可產生不受時間及地點支配之可再現的蛋白酶分析數據之技術細節程度。雖然分析可適應指定的實驗室條件，但經由修飾方法所獲得的任何數據，都必需由原始方法所產生的結果而調和。中性金屬蛋白酶切割2－胺基苯甲醯基－L－丙胺醯甘胺醯－L－白胺醯－L－丙胺酸基－4－硝基苯甲醯胺蛋白酶(Abz－AGLA－Nba)的甘胺酸及白胺酸間之肽鍵。在溶液中游離的2－胺基苯甲醯基－L－丙胺醯甘胺酸(Abz－AG)具有415 nm的螢光發射最大值以及340 nm的激發最大值。Abz－AG的螢光是在完整的Abz－AGLA－Nba分子中藉由硝基苯甲醯胺而猝滅。
在這些實驗中，Abz－AG藉由蛋白酶切割Abz－AGLA－Nba的釋放，是由螢光光譜而監測(Ex.340/Em.415)。Abz－AG的出現率是蛋白分解活性的測量。分析是在無基質限制的初始速率條件下進行。
具有溫度控制的微量盤混合器(例如，Eppendorf Thermomixer)是可再現性分析結果所必需的。在加入酵素之前，將分析溶液在微量盤混合器中培養至所要的溫度(例如，25℃)。將酵素溶液加到在混合器中的培養盤、劇烈混合並且快速移轉到培養盤判讀器。
具有連續數據紀錄能力、線性迴歸分析以及溫度控制的螢光光譜儀是需要的(例如，SpectraMax M5，Gemini EM，Molecular Devices)。將判讀器一直維持在想要的溫度(例如，25℃)。將判讀器設定用於上讀式螢光偵測，以及激發是設定在350 nm，發射是設定在415 nm，不使用自動開關(cut－off)過濾器。將PMT設定在培養液敏感性，以及每個槽孔5個讀值。啟動自動校正，但僅在第一次讀取之前校正。根據選擇被監測的槽孔數目，以讀取間格最小化將分析測量3分鐘。將判讀器設定以計算毫RFU/min(千分之相對螢光單位/分鐘)的速率。用於計算速率的讀值數目(Vmax點)是設定在等同於2分鐘的數目，係由讀值間格所決定(例如，每10秒一個讀值將使用12點以計算速率)。最大RFU是設定在50,000。
所有酵素及基質母液的移液都是由主動置換型移液器而進行(Rainin Microman)。緩衝溶液、分析及酵素工作溶液是藉由單一管道或多管道的空氣置換型移液器(Rainin LTS)，而從試管、試劑槽或母液微量盤中移液。當使用少數槽孔時，重複型移液器(Eppendorf)是有用於將分析溶液轉移至微量盤的槽孔，以減少試劑的損耗。自動化的移液儀器(例如，Beckman FX或Cybio Cybi－well)也有用於從工作母液微量盤中將酵素溶液轉移至分析微量盤，以立刻啟動完整的微量盤。
試劑及溶液：
52.6 mM MES/NaOH、2.6 mM CaCl 2 (pH 6.5)：MES緩衝溶液 將MES酸(10.28 g)及292 mg無水CaCl2 溶解在約900 ml的純水中。將這個溶液以NaOH滴定至pH 6.5(於25℃或以溫度調整型pH探針)。將經pH－調整的緩衝溶液補到1 L的總體積。將最終溶液經由0.22 μm無菌過濾器而過濾，並且保持在室溫。
48 mM Abz－AGLA－Nba於DMF中：Abz－AGLA－Nba母液 將大約28 mg的Abz－AGLA－Nba置於小管中。將其溶解於ml的DMF中(體積將根據Abz－AGLA－Nba的聚集而改變)，並且漩渦震盪數分鐘。將溶液儲存在室溫中避光。
50 mM MES、2.5 mM CaCl 2 、5% DMF、2.4 mM Abz－AGLA－Nba(pH 6.5)：分析溶液 將1 ml的Abz－AGLA－Nba母液加到19 ml MES緩衝溶液中並且漩渦震盪。將溶液儲存在室溫中避光。
50 mM MES、2.5 mM CaCl 2 (pH 6.5)：酵素稀釋緩衝溶液 這個緩衝溶液是藉由將5 ml的純水加到95 ml的MES緩衝溶液中而製得。
50 mM MES、2.5 mM CaCl 2 、5% DMF(pH 6.5)：基質稀釋緩衝溶液 將5 ml的純DMF加到95 ml的MES緩衝溶液。這個緩衝溶液是用於測定動力學參數。
酵素溶液：
將酵素母液以酵素稀釋緩衝溶液稀釋至大約1 ppm的濃度(1 μg/ml)。將MULTIFECT中性蛋白酶(野生型NprE)稀釋至低於6 ppm的濃度(6 μg/ml)。連續稀釋係較佳的。溶液在室溫中是穩定達1小時，但對於更長期間的儲存，將溶液維持在冰上。
方法：
首先，將所有的緩衝溶液、母液及工作溶液都製備好。將每個酵素稀釋都以三重複分析，除非有其他不同的指明。當沒有完全充滿時，將酵素工作溶液母液微量盤從培養盤的左邊開始以完全垂直管柱而排列(以符合培養盤判讀器)。對應的分析盤也同樣地設置。微量盤螢光光譜儀是如先前說明而設定。
首先，將200 μl分析溶液的分裝物置於96槽孔微量盤的槽孔中。在溫度控制的避光微量盤混合器中，將培養盤於25℃培養10分鐘。分析是藉由將10 μl的工作酵素溶液從母液微量盤中轉移至混合器中的分析微量盤而啟動。最適地係使用96槽孔的移液頭，或使用8槽孔多管道的移液器，以從最左邊的管柱開始轉移。將溶液劇烈混合15秒(9000 rpm於Eppendorf Thermomixer)。之後將分析微量盤立即轉移至微量盤螢光光譜儀，並且開始紀錄在350 nm的激發及415 nm的發射處之螢光測量。螢光光譜儀軟體計算每個槽孔的螢光增加之反應速率至毫RFU/min的線性迴歸線。在部分實驗中，將第二培養盤置於微量盤混合器中溫度平衡，同時讀取第一培養盤。
速率初始速度對於產物濃度(也就是，釋放的2－胺基苯甲醯基螢光)是線性的，至多達0.3 mM的產物，其對應到開始於具有約22,000 RFU背景螢光的2.3 mM Abz－AGLA－Nba之溶液中大約50,000 RFU。Abz－AGLA－Nba是溶解於DMF，並且在製備當日使用。
洗滌劑組成物：
在例示的洗滌劑組成物中，酵素水平是以佔總組成物重量的純酵素而表示，以及除非有其他不同的指明，否則洗滌劑成分是以佔總組成物的重量而表示。在其中，簡寫的成分識別具有以下意義：
實施例1：從解澱粉芽孢桿菌中選殖中性金屬蛋白酶基因
在這個實施例中說明用於選殖解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶基因的方法。編碼中性金屬蛋白酶的基因是利用在此技藝中已完善建立的方法，而從解澱粉芽孢桿菌中選殖。非免除(也就是，菌株攜帶基因外DNA(除了氯黴素篩選標記之外，其可容許在免除的菌株中)，特別是質體pJM102序列)菌株BC91504(aprE/nprE －pJM102於BG3594：：comK )在嵌合質體pJM102中攜帶融合至的解澱粉芽孢桿菌nprE原肽/成熟基因之枯草桿菌aprE啟動子及訊息序列。
以下兩個枯草桿菌及解澱粉芽孢桿菌的序列(序列識別號1及序列識別號2)，是經由PCR使用對應到畫底線序列的寡核苷酸引子而產生。
枯草桿菌的染色體Eco RI限切位置(GAATTC)及aprE 起始密碼子(GTG)以及解澱粉芽孢桿菌的nprE 終止密碼子，是在以下的序列中以粗體顯示，以及合成導入的Hind III限切位置(AAGCTT)是設計到引子編號4中。
解澱粉芽孢桿菌aprE 5’上游序列、啟動子及訊息序列編碼區域，是顯示在以下的序列中(序列識別號1)。引子1(apr－f；GAGCTGGGTAAAGCCTATGAAT；序列識別號5)是在序列的開始處以畫底線顯示，而引子2及3的aprE部分(npr－f及npr－r；GTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCT；序列識別號6)則是在序列的末端以雙底線顯示。
GAGCTGGGTAAAGCCTAT GAA TTC TCCATTTTCTTCTGCTATCAAAATAACAGACTCGTGATTTTCCAAACGAGCTTTCAAAAAAGCCTCTGCCCCTTGCAAATCGGATGCCTGTCTATAAAATTCCCGATATTGGTTAAACAGCGGCGCAATGGCGGCCGCATCTGATGTCTTTGCTTGGCGAATGTTCATCTTATTTCTTCCTCCCTCTCAATAATTTTTTCATTCTATCCCTTTTCTGTAAAGTTTATTTTTCAGAATACTTTTATCATCATGCTTTGAAAAAATATCACGATAATATCCATTGTTCTCACGGAAGCACACGCAGGTCATTTGAACGAATTTTTTCGACAGGAATTTGCCGGGACTCAGGAGCATTTAACCTAAAAAAGCATGACATTTCAGCATAATGAACATTTACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTGTATGAAAATAGTTATTTCGAGTCTCTACGGAAATAGCGAGAGATGATATACCTAAATAGAGATAAAATCATCTCAAAAAAATGGGTCTACTAAAATATTATTCCATCTATTACAATAAATTCACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTG AGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGC (序列識別號1)
解澱粉芽孢桿菌原肽/成熟nprE 編碼序列及轉錄終止子的序列是提供在以下的序列中。在這個序列中，引子2及3的nprE部分以畫底線表示(GCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTG；序列識別號7)，而引子4的npr－r部分(GGCTTCACCATGATCATATATGTCAAGCTTGGGGGG；序列識別號8)則是以雙底線顯示。
GCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTG ACGAATTTTGTACCGAAGCATTCTTTGGTGCAATCAGAATTGCCTTCTGTCAGTGACAAAGCTATCAAGCAATACTTGAAACAAAACGGCAAAGTCTTTAAAGGCAATCCTTCTGAAAGATTGAAGCTGATTGACCAAACGACCGATGATCTCGGCTACAAGCACTTCCGTTATGTGCCTGTCGTAAACGGTGTGCCTGTGAAAGACTCTCAAGTCATTATTCACGTCGATAAATCCAACAACGTCTATGCGATTAACGGTGAATTAAACAACGATGTTTCCGCCAAAACGGCAAACAGCAAAAAATTATCTGCAAATCAGGCGCTGGATCATGCTTATAAAGCGATCGGCAAATCACCTGAAGCCGTTTCTAACGGAACCGTTGCAAACAAAAACAAAGCCGAGCTGAAAGCAGCAGCCACAAAAGACGGCAAATACCGCCTCGCCTATGATGTAACCATCCGCTACATCGAACCGGAACCTGCAAACTGGGAAGTAACCGTTGATGCGGAAACAGGAAAAATCCTGAAAAAGCAAAACAAAGTGGAGCATGCCGCCACAACCGGAACAGGTACGACTCTTAAAGGAAAAACGGTCTCATTAAATATTTCTTCTGAAAGCGGCAAATATGTGCTGCGCGATCTTTCTAAACCTACCGGAACACAAATTATTACGTACGATCTGCAAAACCGCGAGTATAACCTGCCGGGCACACTCGTATCCAGCACCACAAACCAGTTTACAACTTCTTCTCAGCGCGCTGCCGTTGATGCGCATTACAACCTCGGCAAAGTGTATGATTATTTCTATCAGAAGTTTAATCGCAACAGCTACGACAATAAAGGCGGCAAGATCGTATCCTCCGTTCATTACGGCAGCAGATACAATAACGCAGCCTGGATCGGCGACCAAATGATTTACGGTGACGGCGACGGTTCATTCTTCTCACCTCTTTCCGGTTCAATGGACGTAACCGCTCATGAAATGACACATGGCGTTACACAGGAAACAGCCAACCTGAACTACGAAAATCAGCCGGGCGCTTTAAACGAATCCTTCTCTGATGTATTCGGGTACTTCAACGATACTGAGGACTGGGATATCGGTGAAGATATTACGGTCAGCCAGCCGGCTCTCCGCAGCTTATCCAATCCGACAAAATACGGACAGCCTGATAATTTCAAAAATTACAAAAACCTTCCGAACACTGATGCCGGCGACTACGGCGGCGTGCATACAAACAGCGGAATCCCGAACAAAGCCGCTTACAATACGATTACAAAAATCGGCGTGAACAAAGCGGAGCAGATTTACTATCGTGCTCTGACGGTATACCTCACTCCGTCATCAACTTTTAAAGATGCAAAAGCCGCTTTGATTCAATCTGCGCGGGACCTTTACGGCTCTCAAGATGCTGCAAGCGTAGAAGCTGCCTGGAATGCAGTCGGATTGTAAACAAGAAAAGAGACCGGAAATCCGGTCTCTTTTTTATATCTAAAAACATTTCACAGT (序列識別號2)
全長NprE的胺基酸序列(前－、原－及成熟序列)是在以下提供：MGLGKKLSVAVAASFMSLTISLPGVQAAENPQLKENLTNFVPKHSLVQSELPSVSDKAIKQYLKQNGKVKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPVVNGVPVKDSQVIIHVDKSNNVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQALDHAYKAIGKSPEAVSNGTVANKNKAELKAAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANWEVTVDAETGKILKKQNKVEHAATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGL(序列識別號3)
在部分其他具體實例中，以下的NprE序列是有用於本發明。
VRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSAQAAENPQLKENLTNFVPKHSLVQSELPSVSDKAIKQYLKQNGKVFKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPVVNGVPVKDSQVIIHVDKSNNVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQALDHAYKAIGKSPEAVSNGTVANKNKAELKAAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANWEVTVDAETGKILKKQNKVEHAATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGL(序列識別號4)
用於這些PCR實驗中的引子序列是在以下提供：
引子2及3是彼此反向互補的，並且對應到染色體DNA的非編碼(# 2)及編碼(# 3)股。對於編碼股，它們對應到aprE 訊息序列的最後25個鹼基對以及nprE 原肽的最前30個鹼基對。引子# 4是與畫底線的序列反向互補，其包括nprE 終止密碼子及終止子的3’端24個鹼基對，連同導入的Hind III位置，前面有6個dCTP殘基，以提供所謂的“鉗子”，使得Hind III限切核酸內切酶更有效率的切割，因為如果它們的辨識序列是位於DNA片段的非常末端的話，部分的限切酵素會沒有效率地切割。
兩個PCR片段是以Applied Biosystems’rTTH DNA聚合酶XL套組中的以下方法及試劑(除了DNA模板及寡核苷酸引子之外)產生：4.6 μl H2 O 30 μl 3.3x rTth PCR緩衝溶液10 μl 2 mM dNTP混合物4.4 μl 25 mM醋酸鎂5 μl 50 μM引子# 1或# 3(正向引子)5 μl 50 μM引子# 2或# 4(反向引子)2 μl枯草桿菌或解澱粉芽孢桿菌染色體DNA 2 μl rTth 聚合酶
1 μl Pfu Turbo聚合酶 100 μl總反應體積在這些實驗中所使用的PCR條件是(95℃、30秒/58℃、30秒/68℃、1分鐘)×30個循環，然後快速冷卻至4℃。反應產物係在1.2%瓊脂糖/TBE製備級膠體上跑膠，切下適當大小的片段，並且利用QIAGEN膠體萃取套組而純化。在第二次的融合中，進行PCR反應，其中染色體DNA是被1 μl兩個分離片段的每一個所取代，並且僅使用外部引子# s1及# 2。使用相同於上述的PCR條件。由於在第一次PCR中使用互補引子2及3的兩個片段上所形成之互補性末端，因此，兩個片段是精確地融合。
將融合片段以Eco RI及Hind III消化，並以上述方法將膠體純化。嵌入的質體pJM102也以Eco RI及Hind III消化，然後將線形的質體以膠體純化，並藉由標準技術而黏接至消化的apr/npr融合片段。這個黏接反應之後是用於直接轉形木糖誘發的枯草桿菌菌株。
在純化之後，藉由PCR使用引子1及2從野生型枯草桿菌染色體DNA，以及使用引子3及4從解澱粉芽孢桿菌染色體DNA產生兩個片段。將這個片段再次以上述之說明而純化，然後以Eco RI及Hind III切割，如同在嵌入的質體pJM102及後續融合片段黏接到質體的相同消化。將許多具有從融合物的轉形株被從染色體定序，以核對沒有任何PCR－衍生的突變。接著將這些中的一個從5－25 mg/ml的氯黴素(在pJM102上的篩選標記)逐步擴增，以共同擴增連結的表現卡匣。
所選擇之序列經核對的轉形株是藉由在含有5 mg/ml氯黴素的LB/瓊脂培養盤上篩選pJM102的氯黴素(CMP)抗性標記而獲得。接著將其接種到10 mg/ml氯黴素的LB培養液，於37℃隔夜，並以250 rpm搖晃。接著將這個培養物在10 mg/ml氯黴素的LB/瓊脂培養盤上畫線，以分離單一的菌落。然後將一個菌落接種到25 mg/ml氯黴素的LB培養液，於37℃隔夜，並以250 rpm搖晃。接著將這個培養物在25 mg/ml氯黴素的LB/瓊脂培養盤上畫線，以分離單一的菌落。將這些菌落回收，並且在甘油中以－70℃儲存直到使用為止，如在此技藝中已知的方法。
刪除存在於枯草桿菌中的兩個非必要蛋白酶(aprE及nprE)以及澱粉酶，可在金屬蛋白酶的製造期間減少總細胞外的蛋白酶水平。將編碼中性金屬蛋白酶的DNA選殖到澱粉酶被刪除的宿主中。將用於勝任發展的可誘發comK插入到澱粉酶基因座的中間，使得菌株變成“amy－ ”。表現的蛋白質之分泌是藉由將編碼訊息序列的核苷酸插入到基因的編碼序列之前而確保。
實施例2：純化的MULTIFECT 中性及重組的中性金屬蛋白酶(nprE)之表現及發酵
將實施例1中所說明而製造的重組枯草桿菌，在以下說明的營養培養液中藉由傳統的批次發酵而培養。將1個甘油小瓶(如實施例1中所說明而製備)的枯草桿菌，其包含解澱粉芽孢桿菌的中性金屬蛋白酶，用於接種包含200 mg/L氯黴素之600 ml的SBG 1%培養液。使培養物在37℃生長48小時，之後，將培養液體藉由在此技藝中已知的12,000 rpm離心而回收。將這個方法進行兩次。所得到的最終酵素濃度是在約1.4至2 g/L的範圍內。
實施例3：中性金屬蛋白酶的純化及定性
這個實施例說明用於純化在實施例2中說明的生物體所表現的中性金屬蛋白酶之方法。在37℃培養36小時之後，將發酵液回收並且在12,000 rpm離心(SORVALL離心機型號RC5B)。分泌的中性金屬蛋白酶是從培養液體中分離，並且利用Amicon過濾系統8400使用BES(聚醚碸)10 kDa直徑而濃縮大約10倍。
將濃縮的上清液以對抗含有10 mM NaCl的25 mM MES緩衝溶液(pH 5.4)，於4℃透析隔夜。接著將透析液裝載到陽離子交換管柱Porous HS20(總體積約83 mL；結合能力約4.5 g蛋白質/mL管柱；Waters)，如以下所述。將管柱以含有10 mM NaCl的25 mM MES緩衝溶液(pH 5.4)預先平衡。接著，將大約200－300 mL的樣品裝載到管柱上。結合的蛋白質是利用5.4至6.2的pH梯度，以10倍管柱體積的MES緩衝溶液沖提。蛋白質的沖提是在pH 5.82及6.0之間，並且是利用此處所說明的蛋白分解活性以及10%(重量/體積)NUPAGESDS－PAGE(Novex)而評估。接著將含有中性蛋白酶的流份收集在一起。將氯化鈣及氯化鋅鹽以3：1的比例加入，然後將pH調整至8.5。使用Perceptive Biosystems BIOCADVision(GMI)以純化蛋白質。
利用10%(重量/體積)NUPAGESDS－PAGE評估之純化的蛋白質經測定是均質的，具有大於95%的純度。通常，當利用標準蛋白酶分析使用小基質suc－p－AAPF－pNA(N－琥珀醯基－L－Ala－L－Ala－L－Pro－L－Phe－p －硝基苯胺)(Sigma)評估時，少於1%經純化的製備物會顯示絲胺酸蛋白酶活性。這個分析是在微滴定盤中格式中(96槽孔)，利用含有10 mM CaCl2 及0.005% Tween－80的100 mM Tris－HCl緩衝溶液(pH 8.5)而進行。基質(p－AAPF NA)是藉由製備160 mM的母液於DMSO中(二甲基亞碸)(100 mg/ml)以及將這個母液以含有10 mM CaCl2 及0.005% Tween－80的100 mM Tris－HCl緩衝溶液稀釋100倍而製備。接著，將10 μl經稀釋的蛋白酶溶液(稀釋是利用含有10 mM CaCl2 及0.005% Tween－80的100 mM Tris－HCl緩衝溶液(pH 8.5)而製備)加到190 μl的1 mg/ml p－AAPF溶液。將分析物混合5分鐘，並且在410 nm讀取動力學改變2－5分鐘。測量反應的斜率，並且使用作為絲胺酸蛋白酶活性的量之指標。蛋白質是利用含有1 mM氯化鋅、4 mM氯化鈣及40%丙二醇的25 mM MES緩衝溶液(pH 5.8)而調配，以用於儲存。
實施例4：純化的MULTIFECT 中性金屬蛋白酶(PMN)對於鈣及鋅陽離子的親和力
在這個實施例中說明用於測定如上述實施例說明所製備的中性金屬蛋白酶(PMN)的親和力之方法。PMN對於鈣及鋅離子的親和力是分別利用得自Molecular Probes的螢光指示劑Fluo－3及FluoZin－3而進行。所有的螢光測量都紀錄在LS50B冷光光譜儀上(Perkin－Elmer)。Fluo－3的結合是藉由在500 nm的激發而監測，以及發射光譜是從505至550 nm紀錄。同樣地，FluoZin－3的結合是藉由在495 nm的激發而監測，以及發射光譜是從500至550 nm收集。激發及發散隙縫寬度都設定在2.5 nm。
在這些測定中，將100 μM中性金屬蛋白酶於50 mM Tris－HCl緩衝溶液中(pH 8.4)以增加數量的相關指示劑而滴定。滴定曲線是顯示在第1圖。在這個圖示中，三角形代表對於Zn2 ＋ 利用FluoZin－3染劑在516 nm監測所獲得的曲線結合數據，而圓形代表對於Ca2 ＋ 利用Fluo－3染劑在522 nm監測所獲得的數據。對於鋅及鈣(假設係單一結合位置)的結合常數(Ka)，經測定分別是0.401 nM及0.037 nM。這些結果顯示純化的MULTIFECT中性金屬蛋白酶以比結合鈣離子約10倍大的親和力結合鋅離子。根據鈣的較弱結合，設計一開始的蛋白質設計實驗以包含到(i)設計較緊密的鈣結合位置及/或(ii)除去對於鈣之結構穩定性的要求(例如，將蛋白質穩定化至大於80%)。
實施例5：儲存穩定性
在這個實驗中，說明用於評估PMN以及在枯草桿菌中表現的重組解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶之儲存穩定性所進行的實驗。這些中性金屬蛋白酶製備物的蛋白分解，是在增加的LAS(十二烷基磺酸鈉；Sigma)溶液(0%至多達包括10%)的存在下而評估。從純化的MULTIFECT中性金屬蛋白酶(PMN)中所產生的蛋白分解片段，是利用10%(重量/體積)NUPAGESDS－PAGE而觀察。
如上述說明所製造的在枯草桿菌中表現的解澱粉芽孢桿菌之重組中性金屬蛋白酶的儲存穩定性，是在單獨的緩衝溶液中(50 mM Tris－HCl緩衝溶液，pH 8.4)以及在得自Procter & Gamble的洗滌劑基底的存在下而測定。緩衝溶液及/或洗滌劑基底包含鋅離子、鈣離子或其組合。鋅及鈣離子兩者的濃度是從0至25 mM改變。將這些結果一直與在單獨的緩衝溶液中培養的中性金屬蛋白酶之結果進行比較。
蛋白酶分析：偶氮－酪蛋白分析： 偶氮－酪蛋白指標分析是用於評估在特定條件下發生的蛋白分解的量。在這些分析中，將75 μl的酵素與加到250 μl的1%(重量/體積)偶氮－酪蛋白(Sigma)之過量的鈣或鋅或兩者培養。反應是在30℃持續15分鐘，之後加入10%(重量/體積)的三氯醋酸以終止反應。將沈澱的蛋白質及未反應的偶氮－酪蛋白藉由以14,000 rpm離心10分鐘而移除。偶氮基的顏色是藉由加入750 μl的1 M氫氧化鈉而顯影。使顏色的顯影持續5分鐘，之後將反應終止，並且在440 nm測量吸收值。
琥珀醯基化的酪蛋白及TNBSA分析： 中性金屬蛋白酶的活性是利用QuantiCleave蛋白酶分析套組T M (Pierce)而測定。這個分析是以琥珀醯基化的酪蛋白被酵素消化為基礎。接著將所形成的一級胺基與三硝基苯磺酸(TNBSA)反應，並且形成在450 nm具有最大吸收值的有色複合物。分析是在96槽孔微滴定形式中進行。分析需要15分鐘與琥珀醯基化的酪蛋白的培養，以及15分鐘與三硝基苯磺酸的反應。在兩個培養期間，將樣品都放置在搖晃器上。TRCK－胰蛋白酶(Pierce)是用於整體蛋白酶活性測定的一般標準品。然而，對於特定蛋白酶的活性之最適條件，則需要使用有興趣的蛋白酶。在這些實驗所進行的分析的例子中，胰蛋白酶及有興趣的蛋白酶都使用，以用於校正分析。分析的精確性需要由0.5 mg/mL胰蛋白酶所製得的標準稀釋一直產生低於0.5吸收值(在450 nm)。
將每個樣品都以相對於不含酪蛋白的對照組而測量。報導的吸收值之改變(△Abs(450 nm))說明來自酪蛋白的胺基之干擾。此外，來自緩衝溶液及/或洗滌劑其他成分的一級胺基之任何可能的干擾，也都以這個方式而校正。所有樣品的活性都是以相對於無添加中性金屬蛋白酶以及在套組所提供的BupHT M 硼酸鹽緩衝溶液中培養的酵素之洗滌劑，以相同的時間長度及相同溫度而測定。
這個試驗是一種指標分析，其中50 mM的硼酸鹽緩衝溶液(pH 8.5)是在32℃使用。蛋白酶分析通常是以二重複進行。在大部分測定穩定性測量的實驗中，蛋白質及洗滌劑是利用上述緩衝溶液以1：1000稀釋，但在部分的實驗中也用1：500或1：200稀釋，以得到空白吸收值小於0.5的讀值。用於這些實驗中的微滴定光譜儀是SpectraMAX250(Molecular Devices)以及所有的分析都是在中度蛋白質結合的96槽孔培養盤(Corning)中進行。
在這些分析中獲得的標準蛋白質樣品(例如，胰蛋白酶及純化的金屬蛋白酶)之結果，顯示有非線性的反應(線性規模可能僅在窄的分析範圍中是適當的)。因此，使曲線擬合二次函數，其中f＝y0 ＋ax2 ＋bx；f是與y擬合(SigmaPlotv.9；SPSS公司)。因此，如果線性方程式是用於定量蛋白質量的話，則會得到不精確的數據；發現二次函數是必要的以獲得正確的結果。應注意的是，製造商(Pierce)的套組插入物顯示結果可能與對數等級的“x”相擬合。
實施例6：pH及LAS對於中性金屬蛋白酶活性的影響
對於0.36 mg/mL調配的nprE的活性之pH最適性也加以測定。在這個研究中所探討的緩衝溶液是pH範圍在3.5－5.5之間的50 mM醋酸鈉(pKa＝4.76)、pH範圍在5.5－7.0之間的50 mM MES緩衝溶液(pKa＝6.10)以及pH 8.4的50 mM Tris－HCl緩衝溶液。對於調配的nprE之pH最適性經測定是在5.5至6.0之間。
洗滌劑成分LAS對於0.36 mg/mL調配的nprE之活性的影響，是藉由與0至1%(重量/體積)的LAS培養而探討。結果是顯示在第2圖所提供的圖形中。如這些結果所示，蛋白酶是被洗滌劑成分而明顯不活化，因此需要一種可使蛋白酶穩定化以對抗這個有害影響的方法。
在部分實驗中，使用由Procter & Gamble所提供命名為“TIDE2005”的高密度液體洗滌劑(HDL)組成物。如所提供者，這個洗滌劑包含除了本發明中性金屬蛋白酶以外的所有必要成分。
在液體洗滌劑基底中的儲存穩定性為時間函數： 穩定性試驗是以微型－儲存的方式進行。要改變的條件以及要加入的各種濃度的氯化鈣及氯化鋅鹽，是利用FusionProT M (S－Matrix)軟體設計的矩陣而評估。下表摘述測試的條件，以確認解澱粉芽孢桿菌的中性金屬蛋白酶之長期儲存穩定性。
每個試驗條件的最終體積都是1 mL。將TIDE2005以0.36 mg酵素/mL而給予。將調配的培養物液體及純化的重組金屬蛋白酶在TIDE2005基底中以32℃培養約4週的期間。在洗滌劑中的金屬蛋白酶之儲存穩定性是與在50 mM MES緩衝溶液(pH 5.8)中的中性金屬蛋白酶之穩定性進行比較。
在試驗之前，利用分析緩衝溶液(50 mM硼酸鹽緩衝溶液，pH 8.5)將樣品以5：1000稀釋。測定殘留的活性，並且與相對於在分析緩衝溶液中的中性金屬蛋白酶進行比較。所有的測量都是以二重複測定。每個樣品都與適當的對照空白組(也就是，洗滌劑、緩衝溶液及要測試的任何必要添加物)平行測試。然後將樣品如QuantiCleaveT M 蛋白酶分析套組(Pierce)所提供的指示之說明而分析。
在3－4週期間所進行的這些穩定性測試之結果，是顯示在第22圖。在TIDE2005中，不含離子(也就是沒有添加鹽)的中性金屬蛋白酶快速喪失其對抗酪蛋白的所有蛋白分解/水解活性。更確切地說，經測定在少於1小時的培養之後保留少於20%的活性。相反地，在含有鋅離子(至多達以及包括15 mM)的TIDE2005中培養nprE使蛋白酶穩定化，並且在7天的期間避免蛋白分解。因此，鋅離子在這個調配物中的存在，完善地發揮了維持至少60%的蛋白酶活性。同樣地，7.5 mM的鋅離子濃度也產生類似的穩定化效果。這個鋅離子濃度是非常低的，並且被預期會有用於各種的洗滌劑調配物。在這些實驗中，納入鈣離子並沒有提供附加的效果。此外，當加入到TIDE2005時，加入鈣離子超過15 mM，以及至多達以及包括25 mM，會導致沈澱。雖然並不希望本發明受限於任何特定的機轉，但發明人預期在這些實驗中添加鈣離子對於蛋白酶穩定化的缺乏影響是洗滌劑組成物的結果。
對於嗜熱菌蛋白酶，其與解澱粉芽孢桿菌的中性金屬蛋白酶顯示55%的胺基酸序列同一性(利用CLUSTAL W v.1.82進行的序列校準)，已清楚顯示鋅離子對於活性是必要的，而鈣離子及鈣結合部位的設計則已顯示扮演穩定化作用的角色(例如，參見Mansfield等人，J.Biol.Chem.272：11152－11156[1997]；以及Van den Berg等人，Biotechnol.Appl.Biochem.30：35－40[1999])。
在其他具體實例中，其他的陽離子(例如，Co2 ＋ 、Mn2 ＋ 及Fe2 ＋ )是有用於本發明以使解澱粉芽孢桿菌的中性金屬蛋白酶穩定化。這與先前的數據是相反的，其顯示這些離子沒有一個會導致100%恢復比活性(Holmquist及Vallee，J.Biol.Chem.249：4601－4607[1974])。發明人預期這些離子將會藉由避免中性金屬蛋白酶的展開及後續蛋白分解的降解而影響穩定性。然而，不希望本發明受限於任何特定的作用機轉。
實施例7：在枯草桿菌中利用nprE表現載體pUBnprE製造NprE蛋白酶
在這個實施例中說明在枯草桿菌中製造NprE蛋白酶所進行的實驗，特別是，用於將質體pUBnprE轉形至枯草桿菌的方法。轉形是如在此技藝中已知的方式進行(例如，參見WO 02/14490，其以引用方式納入本文中)。以下所提供的DNA序列(解澱粉芽孢桿菌的nprE前導子、nprE原及nprE成熟DNA序列)編碼NprE前驅蛋白質：GTGGGTTTAGGTAAGAAATTGTCTGTTGCTGTCGCCGCTTCCTTTATGAGTTTAACCATCAGTCTGCCGGGTGTTCAGGCCGCTGAGAATCCTCAGCTTAAAGAAAACCTGACGAATTTTGTACCGAAGCATTCTTTGGTGCAATCAGAATTGCCTTCTGTCAGTGACAAAGCTATCAAGCAATACTTGAAACAAAACGGCAAAGTCTTTAAAGGCAATCCTTCTGAAAGATTGAAGCTGATTGACCAAACGACCGATGATCTCGGCTACAAGCACTTCCGTTATGTGCCTGTCGTAAACGGTGTGCCTGTGAAAGACTCTCAAGTCATTATTCACGTCGATAAATCCAACAACGTCTATGCGATTAACGGTGAATTAAACAACGATGTTTCCGCCAAAACGGCAAACAGCAAAAAATTATCTGCAAATCAGGCGCTGGATCATGCTTATAAAGCGATCGGCAAATCACCTGAAGCCGTTTCTAACGGAACCGTTGCAAACAAAAACAAAGCCGAGCTGAAAGCAGCAGCCACAAAAGACGGCAAATACCGCCTCGCCTATGATGTAACCATCCGCTACATCGAACCGGAACCTGCAAACTGGGAAGTAACCGTTGATGCGGAAACAGGAAAAATCCTGAAAAAGCAAAACAAAGTGGAGCAT GCCGCCACAACCGGAACAGGTACGACTCTTAAAGGAAAAACGGTCTCATTAAATATTTCTTCTGAAAGCGGCAAATATGTGCTGCGCGATCTTTCTAAACCTACCGGAACACAAATTATTACGTACGATCTGCAAAACCGCGAGTATAACCTGCCGGGCACACTCGTATCCAGCACCACAAACCAGTTTACAACTTCTTCTCAGCGCGCTGCCGTTGATGCGCATTACAACCTCGGCAAAGTGTATGATTATTTCTATCAGAAGTTTAATCGCAACAGCTACGACAATAAAGGCGGCAAGATCGTATCCTCCGTTCATTACGGCAGCAGATACAATAACGCAGCCTGGATCGGCGACCAAATGATTTACGGTGACGGCGACGGTTCATTCTTCTCACCTCTTTCCGGTTCAATGGACGTAACCGCTCATGAAATGACACATGGCGTTACACAGGAAACAGCCAACCTGAACTACGAAAATCAGCCGGGCGCTTTAAACGAATCCTTCTCTGATGTATTCGGGTACTTCAACGATACTGAGGACTGGGATATCGGTGAAGATATTACGGTCAGCCAGCCGGCTCTCCGCAGCTTATCCAATCCGACAAAATACGGACAGCCTGATAATTTCAAAAATTACAAAAACCTTCCGAACACTGATGCCGGCGACTACGGCGGCGTGCATACAAACAGCGGAATCCCGAACAAAGCCGCTTACAATACGATTACAAAAATCGGCGTGAACAAAGCGGAGCAGATTTACTATCGTGCTCTGACGGTATACCTCACTCCGTCATCAACTTTTAAAGATGCAAAAGCCGCTTTGATTCAATCTGCGCGGGACCTTTACGGCTCTCAAGATGCTGCAAGCGTAGAAGCTGCCTGGAATGCAGTCGGATTG TAA(序列識別號12)
在上述序列中，粗體代表編碼成熟NprE蛋白酶的DNA，標準字體代表前導子序列(nprE前導子)，以及底線代表原序列(nprE原)。以下所提供的胺基酸序列(nprE前導子、nprE原及nprE成熟DNA序列)(序列識別號13)編碼NprE前驅蛋白質。在這個序列中，底線代表原序列，以及粗體代表成熟的NprE蛋白酶。序列識別號17提供分離自成熟的NprE序列之NprE原－序列，以及序列識別號18提供成熟的NprE序列。這個序列是使用作為製造此處所說明變異物資料庫之基礎。
MGLGKKLSVAVAASFMSLTISLPGVOAAENPOLKENLTNFVPKHSIVOSELPSVSDKAIKQYLKQNGKVFKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPVVNGVPVKDSQVIIHVDKSNNVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQALDHAYKAIGKSPEAVSNGTVANKNKAELKAAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANWEVTVDAETGKILKKONKVEH AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGL (序列識別號13)
AENPQLKENLTNFVPKHSLVQSELPSVSDKAIKQYLKQNGKVFKGNPSERLKLIDQTTDDLGYKHFRYVPVVNGVPVKDSQVIIHVDKSNNVYAINGELNNDVSAKTANSKKLSANQALDHAYKAIGKSPEAVSNGTVANKNKAELKAAATKDGKYRLAYDVTIRYIEPEPANWEVTVDAETGKILKKQNKVEH(序列識別號17)
AATTGTGTTLKGKTVSLNISSESGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNREYNLPGTLVSSTTNQFTTSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYQKFNRNSYDNKGGKIVSSVHYGSRYNNAAWIGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSMDVTAHEMTHGVTQETANLNYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYGQPDNFKNYKNLPNTDAGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKIGVNKAEQIYYRALTVYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSQDAASVEAAWNAVGL(序列識別號18)
pUBnprE表現載體是藉由利用兩個專一性引子的PCR，從解澱粉芽孢桿菌的染色體DNA中擴增nprE基因而建構：寡AB1740：CTGCAGGAATTCAGATCTTAACATTTTTCCCCTATCATTTTTCCCG(序列識別號19)寡AB1741：GGATCCAAGCTTCCCGGGAAAAGACATATATGATCATGGTGAAGCC(序列識別號20)
PCR是在熱循環儀上以Phusion高精確度DNA聚合酶(Finnzymes)進行。PCR混合物包含10 μl的5×緩衝溶液(Finnzymes Phusion)、1 μl的10 mM dNTP、1.5 μl的DMSO、1 μl的每個引子、1 μl的Finnzymes Phusion DNA聚合酶、1 μl的染色體DNA溶液50 ng/μl、34.5 μl的MilliQ水。使用以下的方法：PCR方法：1)30秒98℃；2)10秒98℃；3)20秒55℃；4)1分鐘72℃；5)25個循環的步驟2到4；以及6)5分鐘72℃。
這會產生1.9 kb DNA片段，將其利用Bgl II及Bcl I DNA限切酵素而消化。多複製的桿菌載體pUB110(例如，參見Cryczan，J.Bacteriol.134：318－329[1978])是以Bam HI消化。接著將PCR片段×Bgl II×Bcl I黏接到pUB110×Bam HI載體中，以形成pUBnprE表現載體(參見第14圖)。
將pUBnprE轉形至枯草桿菌(△aprE 、△nprE 、oppA 、△spoIIE 、degUHy32 、△amyE：： (xylR 、pxylA－comK ))菌株。轉形至枯草桿菌是如WO 02/14490中之說明而進行，其以引用方式納入本文中。帶有pUBnprE載體的枯草桿菌轉形株之選擇性生長，是在含有25 ml MBD培養液(一種MOPS為基礎之定義培養液)連同20 mg/L新黴素的搖晃錐形瓶中進行。MBD培養液基本上是如在此技藝中已知的方法而製備(參見Neidhardt等人，J.Bacteriol.，119：736－747[1974])，除了使NH4 Cl2 、FeSO4 及CaCl2 脫離基礎培養液、使用3 mM K2 HPO4 以及將基礎培養液補充60 mM尿素、75 g/L葡萄糖及1%大豆蛋白腖之外。此外，微量養分也以100×母液補足，其在1公升中包含400 mg FeSO4 .7H2 O、100 mg MnSO4 .H2 O、100 mg ZnSO4 .7H2 O、50 mg CuCl2 .2H2 O、100 mg CoCl2 .6H2 O、100 mg NaMoO4 .2 H2 O、100 mg Na2 B4 O7 .10H2 O、10 ml的1M CaCl2 及10 ml的0.5 M醋酸鈉。將培養物在培養箱/搖晃器(Infors)於37℃培養3天。這個培養物會導致具有蛋白分解活性之分泌的NprE蛋白酶之製造，如同由蛋白酶分析所證實。膠體分析是利用NuPage Novex 10% Bis－Tris膠體(Invitrogen，目錄編號NP0301BOX)而進行。為了製備分析用的樣品，將2倍體積的上清液混合1倍體積的1M HCl、1倍體積的4×LDS樣品緩衝溶液(Invitrogen，目錄編號NP0007)以及1% PMSF(20 mg/ml)，之後在70℃加熱l0分鐘。接著，將25 μL的每個樣品都裝載到膠體上，連同10 μL的SeeBlue加上2個預先染色的蛋白質標準品(Invitrogen，目錄編號LC5925)。結果清楚地證實了在這個實施例中說明的nprE選殖策略會產生由枯草桿菌所製造的活性NprE。
實施例8：nprE位置評估資料庫(SLE)的產生
在這個實施例中說明用於建構nprESEL的方法。包含上述nprE表現卡匣的pUBnprE載體扮演模板DNA的角色。這個載體包含獨特的Bgl II限切位置，其可用於位置評估資料庫的建構。
將pUBnprE表現載體、Invitrogen合成的引子(去鹽，50 nmol的等級)用於產生資料庫。引子序列是提供於表8－1中。
為了建構nprE位置評估資料庫，因此進行三個PCR反應，包括兩個致突變PCR以將有興趣的突變密碼子導入至成熟的nprE DNA序列中，以及第三個PCR係用於融合兩個致突變PCR，以建構pUBnprE表現載體，其包括在成熟的nprE序列中之所要的突變密碼子。
致突變的方法是以密碼子專一性的突變方法為基礎，其中在特定DNA三股中一次產生全部可能的突變，是利用正向及反向寡核苷酸引子而進行，該引子具有25至45個核苷酸的長度且圍住特別設計的三股DNA序列NNS((A、C、T或G)、(A、C、T或G)、(C或G))，其對應於要被突變的密碼子序列，並且保證在該特定nprE成熟密碼子處隨機併入核苷酸。列於引子名稱中的數字(參見表8－1)對應於特定nprE成熟密碼子的位置。
用於建構位置評估資料庫的兩個額外的引子，包含Bgl II限切位置連同包圍Bgl II限切位置的pUBnprE DNA序列。這些引子是由Invitrogen所製造(50 nmol的等級，去鹽)，並且列於表8－1中。
每個位置評估資料庫的建構，都以利用pUB－BglII－FW引子及專一性nprE反向致突變引子的兩個初級PCR擴增而開始。對於第二個PCR，係使用pUB－BglII－RV引子及專一性nprE正向致突變引子(對於正向及反向致突變引子係相同的nprE成熟密碼子位置)。
將突變導入至成熟的nprE序列，是利用Phusion高精確度DNA聚合酶(Finnzymes；目錄編號F－530L)進行。所有的PCR都是根據與聚合酶一起供應的Finnzymes方法而進行。初級PCR的PCR條件是：初級PCR1：pUB－BglII－FW引子及專一性NPRE反向致突變引子－都是1 μL(10 μM)；初級PCR2：pUB－BglII－RV引子及專一性NPRE正向致突變引子－都是1 μL(10 μM)；連同5×Phusion HF緩衝溶液 10 μL 10 mM dNTP混合物 1 μL Phusion DNA聚合酶 0.75 μL(2單位/μL)DMSO(100%) 1 μL pUBnprE模板DNA 1 μL(0.1－1 ng/μL)蒸餾的滅菌水 加到50 μL
PCR程式是：30秒98℃，30×(10秒98℃；20秒55℃；1.5分鐘72℃)以及5分鐘72℃，在PTC－200 Peltier熱循環儀(MJ Research)中進行。PCR實驗產生兩個約2至3 kB的片段，其在有興趣的NPRE成熟密碼子周圍具有約30個核苷酸鹼基的重疊。利用這兩個上述片段以及正向及反向Bgl II引子，而將片段融合至第三個PCR反應中。融合PCR反應是在以下溶液中進行：pUB－BglII－FW引子及pUB－BglII－RV引子－都是1 μL(10 μM)5×Phusion HF緩衝溶液 10 μL 10 mM dNTP混合物 1 μL Phusion DNA聚合酶 0.75 μL(2單位/μL)DMSO(100%) 1 μL初級PCR1反應混合物 1 μL初級PCR2反應混合物 1 μL蒸餾的滅菌水 加到50 μL
PCR融合程式如下：30秒98℃，30×(10秒98℃；20秒55℃；2分40秒72℃)以及5分鐘72℃，在PTC－200 Peltier熱循環儀(MJ Research)中進行。
擴增的線性6.5 kb片段是利用Qiaquick PCR純化套組(Qiagen目錄編號28106)而純化，並以Bgl II限切酵素消化，以在融合片段的兩側產生黏端：－35 μL純化的線形DNA片段－4 μL REACT3緩衝溶液(Invitrogen)－4 μL BglII，10單位/ml(Invitrogen)反應條件：1小時，30℃。
黏接經Bgl II消化物並利用Qiaquick PCR純化套組(Qiagen目錄編號28106)純化產生含有所要突變的環狀及多聚體DNA：－30 μL純化的Bgl II消化之DNA片段－8 μL T4 DNA黏接酶緩衝溶液(Invitrogen目錄編號46300－018)－1 μL T4 DNA黏接酶，1單位/μL(Invitrogen目錄編號15224－017)反應條件：16－20小時，16℃。
之後，將黏接混合物轉形至枯草桿菌(△aprE 、△nprE 、oppA 、△spoIIE 、degUHy32 、△amyE：： (xylR 、pxylA－comK ))菌株。轉形至枯草桿菌是如WO 02/14490中之說明而進行，其以引用方式納入本文中。對於每個資料庫，挑出96個單一菌落，並使其生長在含有新黴素及1.25 g/L酵母菌萃取物的MOPS培養液，以用於後續分析(BaseClear)以及篩選之目的。每個資料庫都包括最大19個nprE位置專一性的變異物。
變異物是藉由使枯草桿菌SEL轉形株在96槽孔的MTP，在含有20 mg/L新黴素及1.25 g/L酵母菌萃取物的MBD培養液中以37℃生長68小時而製造(參見上述)。
實施例9：nprE組合資料庫(RCL)的產生
在這個實施例中說明用於產生nprE組合資料庫的方法。對於這個酵素，選擇一種特性作為最需要被改變的特性。這個特性在此定義為“主要特性”。所有其他的特性對於組合資料庫設計的目的而言都是“次要特性”。改善此處所使用的蛋白質之基本策略，是組合可改善主要特性並且也可維持或改善次要特性的突變。位置評估數據是用於鑑定可改善主要特性同時維持或改善次要特性的突變。要被組合的突變是由表現指數(PI或Pi)以及相關的△△Ga p p 數值而鑑定。
此處所使用的“外觀自由能改變”(△△Ga p p )是定義為：△△Ga p p ＝－RT Ln(P變 異 物 /P母 體 )其中P變 異 物 是變異物的表現數值，以及P母 體 是母體酵素在相同條件下的表現數值。比例P變 異 物 /P母 體 是定義為該特性的表現指數(Pi)。△△Ga p p 數值預期可以類似於實質△△G的方式表現於數據分佈及附加。然而，由於△△G代表相較於母體酵素，可由變異物進行的最大工作量，因此，數量△△Ga p p 一般是低估了△△G，並且可能產生顯示出協同作用的結果，其中兩個附加位置的特性可能大於將它們的△△Ga p p 數值加在一起所預測的數值。
例如，當TIDE穩定性是主要特性以及BMI活性是次要特性時，具有△△Ga p p 數值<0(Pi>1)以及BMI△△Ga p p 數值<0.06(Pi>0.9)可選擇用於組合。更確切地說，這些關聯性是在這些實驗中被探究。
為了產生用於這些實驗中的變異物，因此藉由GeneArt(Geneart)製造合成的nprE資料庫片段，其在多個nprE成熟DNA位置處包含多個突變。將這些1.5 kb的nprE資料庫片段以DNA限切酵素Pvu I及Ava I消化、純化，並且藉由黏接反應利用T4 DNA黏接酶(Invitrogen目錄編號15224－017)而黏接至5 kb的pUB載體片段(也以DNA限切酵素Pvu I及Ava I消化)。
為了將黏接反應混合物直接轉形至桿菌細胞中，因此將資料庫DNA(黏接到pUB載體片段中的nprE資料庫片段混合物)利用TempliPhi套組(Amersham目錄編號25－6400)而擴增。為了這個目的，將1 μL的黏接反應混合物與5 μL來自TempliPhi套組的樣品緩衝溶液混合，並且在95℃加熱3分鐘以使DNA變性。將這個反應置於冰上冷卻2分鐘，然後短暫離心。接著，加入5 μL的反應緩衝溶液及0.2 μL來自TempliPhi套組的phi29聚合酶’並將反應在MJ Research PCR機器中以30℃培養4小時。藉由在PCR機器中以65℃培養10分鐘而將反應物中的phi29酵素熱失活。
對於將資料庫轉形至桿菌中，將0.1 μL的TempliPhi擴增反應產物與500 μL的勝任枯草桿菌細胞(△aprE 、△nprE 、oppA 、△spoIIE 、degUHy32 、△amyE：： (xylR 、pxylA－comK ))混合，然後在37℃劇烈搖晃1小時。接著，將100及500 μL鋪在含有20 mg/L新黴素及0.5%脫脂牛奶的HI－瓊脂盤上。一般而言，轉形至枯草桿菌是如WO 02/14490中之說明而進行，其以引用方式納入本文中。由這個方法所建構的枯草桿菌nprE組合資料庫被預期在一個或多個靶定用於致突變的位置處包含野生型胺基酸。
接著將這些資料庫中所獲得的變異物，如此處之說明測試它們在TIDE中的穩定性以及它們在BMI清洗表現試驗中的表現。表9提供在BMI分析中測試的變異物之表現指數。在這個表中，“Pos.”代表在NpreE胺基酸序列中被改變的位置，以及“AA”代表對每個變異物進行的胺基酸取代。
實施例10：經由QuikChange 致突變產生nprE位置評估資料庫(SEL)的另一種方法
在這個實施例中說明產生nprE SEL的另一種方法。如同上述實施例8，pUBnprE載體扮演產生nprE SEL的模板DNA來源。兩種方法間的主要差異在於這個方法需要利用互補性位置專一性致突變引子擴增完整的載體。
材料： 含有pUBnprE載體的桿菌菌株Qiagen質體Midi套組(Qiagen目錄編號12143)Ready－Lyse溶菌酶(Epicentre目錄編號R1802M)dam甲基酶套組(New England Biolabs目錄編號M0222L)Zymoclean膠體DNA回收套組(Zymo Research目錄編號D4001)nprE位置專一性致突變引子，100 nmole的等級，5’磷酸化，經PAGE純化(Integrated DNA科技公司)QuikChange多位置專一性致突變套組(Stratagene目錄編號200514)MJ Research PTC－200 Pe1tier熱循環儀(Bio－Rad實驗室)1.2%瓊脂糖E－膠體(Invitrogen目錄編號G5018－01)TempliPhi擴增套組(GE Healthcare目錄編號25－6400－10)勝任枯草桿菌細胞(△aprE 、△nprE 、oppA 、△spoIIE 、degUHy32 、△amyE：： (xylR 、pxylA－comK ))
方法： 為了獲得pUBnprE載體，將含有pUBnprE載體的桿菌菌株之單一菌落用於接種5 ml的LB＋10 ppm新黴素試管。這是用於這些方法中的起使培養物。使培養物以225 rpm搖晃，在37℃生長6小時。接著，將100 ml的LB＋10 ppm新黴素以1 ml的起使培養物接種。使這個培養物以225 rpm搖晃，在37℃生長過夜。在這個接種之後，將細胞沈澱物藉由充分的離心，以提供細胞沈澱物。將細胞沈澱物再懸浮於10 ml的緩衝溶液P1中(Qiagen質體Midi套組)。然後將10 μl的Ready－Lyse溶菌酶加到再懸浮的細胞沈澱物，並且在37℃培養30分鐘。接著，持續Qiagen質體Midi套組的方法(使用10 ml的緩衝溶液P2及P3以負責增加的細胞培養物之體積)。在從桿菌中分離pUBnprE載體之後，將pUBnprE載體的濃度加以定量。接著將載體利用dam 甲基酶套組(New England Biolabs)，利用在套組中所列的方法而dam 甲基化，以將約2 μg的pUBnprE載體/試管予以甲基化。Zymoclean膠體DNA回收套組是用於純化及濃縮dam －甲基化的pUBnprE載體。將dam －甲基化的pUBnprE載體定量，然後稀釋至50 ng/μl的工作濃度。互補性位置專一性致突變引子(1 μl的每個引子，10 μM)(參見表10－1)是用於在QuikChange多位置專一性致突變套組(Stratagene)中的PCR反應，係遵循製造商的方法(例如，1 μldam －甲基化的pUBnprE載體(50 ng/μl)、1 μl的nprE位置專一性正向致突變引子(10 μM)、1 μl的nprE位置專一性正向致突變引子(10 μM)、2.5 μl的10×QuikChange多種反應緩衝溶液、1 μl的dNTP混合物、1 μl的QuikChange多種酵素混合物(2.5 U/μl)及17.5 μl的蒸餾滅菌水，以提供25 μl的總反應混合物)。nprE位置評估資料庫是利用以下條件而擴增：95℃、1分鐘(僅第一次循環)，之後是95℃、1分鐘，55℃、1分鐘、65℃、13分鐘，並且重複循環23次。將反應產物儲存在4℃隔夜。接著，將反應混合物進行Dpn I消化處理(QuikChange多位置專一性致突變套組所提供)，利用製造商的方法以消化母體的pUBnprE載體(也就是，將1.5 μl的Dpn I限切酵素加到每個試管中，並且在37℃培養3小時；接著將2 μlDpn I消化的PCR反應物在1.2% E－膠體上分析每個nprE SEL，以確認PCR反應物是可行的以及母體模板是被降解的)。接著將TempliPhi轉動循環擴增用於產生大量的DNA，利用製造商的方法以增加每個nprE SEL的資料庫大小(也就是，1μlDpn I處理的QuikChange多位置專一性致突變PCR、5 μl的TempliPhi樣品緩衝溶液；5 μl的TempliPhi反應緩衝溶液；以及0.2 μl的TempliPhi酵素混合物，用於約11 μl的總反應物；在30℃培養3小時；TempliPhi反應物是藉由加入200 μl的蒸餾滅菌水而稀釋，並且短暫地漩渦震盪)。接著，將1.5 μl稀釋的TempliPhi材料轉形至勝任枯草桿菌細胞，以及nprE SEL是利用LA＋10 ppm新黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤而篩選。表10－1提供用於這些實驗中的引子之名稱、序列以及序列識別號。所有的引子都是由Integrated DNA科技公司以100 nmole的等級、5’磷酸化以及經PAGE純化而合成。
實施例11：鑑定nprE同源物
在這個實施例中說明鑑定npr同源物所進行的實驗。特別地，在這個實施例中進行實驗，以從不同及緊密關連的桿菌菌株中選殖中性蛋白酶(npr)同源物。選擇不同的菌株以從這些被分離的菌株中探測多樣性及特性。
所探測的各種npr同源物包括：熱容桿菌npr(P23384)仙人掌桿菌nprC(P05806)仙人掌桿菌E33L npr(AAY60523)嗜熱脂肪桿菌nprT枯草桿菌nprB枯草桿菌nprE蘇力菌nprB(AAK00602)金黃色葡萄球菌aur(P81177)
第3圖提供這些同源物的序列校準(序列識別號173－181)，以及第4圖(序列識別號182－191)提供各種其他同源物的另一序列校準。
在這些實驗中，材料包括：枯草桿菌菌株I168的染色體DNA以下的DNA質體是在DNA2.0使用枯草桿菌密碼子最適化而合成：pJ4：G01905(蘇力菌nprB)(參見第6圖)pJ4：G01906(仙人掌桿菌E33L npr)(參見第7圖)pJ4：G01907(仙人掌桿菌nprC)(參見第8圖)pJ4：G019o8(熱容桿菌npr)(參見第9圖)pJ4：G01909(金黃色葡萄球菌aur)(參見第10圖)pJ4：G01938(嗜熱脂肪桿菌nprT)(參見第11圖)pJHT載體(參見第12圖)pAC載體(參見第13圖)MJ Research PTC－200 Peltier熱循環儀(Bio－Rad實驗室)引子(Operon公司)PfuUltra II融合HS DNA聚合酶(Stratagene)限切核酸內切酶(Roche)TOP10化學性勝任大腸桿菌細胞(Invitrogen)枯草桿菌勝任細胞(△aprE 、△nprE 、oppA 、△spoIIE 、degUHy32 、△amyE：： (xylR 、pxylA－comK ))
A.枯草桿菌nprE的選殖： 為了建構枯草桿菌nprE質體，將擴增的aprE啟動子片段(來自pJHT載體)以及具有終止子片段的枯草桿菌nprE基因(來自枯草桿菌菌株I168)，予以分別製備。第15圖提供概要圖，說明個別DNA片段的擴增。
PCR剪接重疊延伸(SOE)反應是用於將兩個不同的DNA片段連結在一起。在這個反應中，結合以下的反應試劑：1 μl的aprE啟動子DNA片段、1 μl的枯草桿菌nprE基因＋終止子片段、1 μl的引子EL－689(25 μM)、1 μl的引子EL－695(25 μM)、5 μl的10×PfuUltra II融合HS DNA聚合酶緩衝溶液、1 μl的dNTP(10 mM)、1 μl的PfuUltra II融合HS DNA聚合酶以及39 μl的蒸餾滅菌水，以提供50 μl的總反應體積。PCR循環是：95℃、2分鐘(僅第一次循環)，之後是28個循環的95℃、30秒，54℃、30秒及72℃、45秒。
aprE啟動子－枯草桿菌nprE基因＋終止子的PCR融合片段是以Mfe I及Bam HI限切核酸內切酶而消化。pJHT載體是以Eco RI及Bam HI限切核酸內切酶而消化。接著將限切核酸內切酶消化的aprE啟動子－枯草桿菌nprE基因＋終止子DNA片段與限切核酸內切酶消化的pJHT載體黏接。然後將黏接混合物轉形至TOP10化學性勝任大腸桿菌細胞，以用於在LA＋50 ppm羧苄青黴素上篩選。在鑑定出具有對質體pEL501之正確DNA構築序列的質體之後(參見第16圖)，將其轉形至勝任枯草桿菌細胞內，以嵌合到aprE啟動子的基因座。在LA＋5 ppm氯黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤上對轉形株篩選蛋白酶活性(也就是，脫脂牛奶的清除)。然後將擴增的菌株轉移到LA＋25 ppm氯黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤。接著將菌株轉移到LA＋25 ppm氯黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤以用於擴增。
B.枯草桿菌nprB的選殖： 為了建構枯草桿菌nprB質體，將擴增的aprE啟動子片段(來自pJHT載體)、枯草桿菌nprB基因片段(來自枯草桿菌菌株I168)以及終止子片段(來自pJHT載體)，予以分別製備。第17圖提供個別DNA片段的擴增之概要圖。
PCR剪接重疊延伸(SOE)反應是用於將兩個不同的DNA片段連結在一起。在這個反應中，結合以下的反應試劑：1 μl的aprE啟動子DNA片段、1 μl的枯草桿菌nprB基因＋終止子片段、1 μl的終止子DNA片段、1 μl的引子EL－689(25 μM)、1 μl的引子EL－700(25 μM)、5 μl的10×PfuUltra II融合HS DNA聚合酶緩衝溶液、1 μl的dNTP(10 mM)、1 μl的PfuUltra II融合HSDNA聚合酶以及38 μl的蒸餾滅菌水，總共50 μl的反應體積。PCR循環是：95℃、2分鐘(僅第一次循環)，之後是28個循環的95℃、30秒，54℃、30秒及72℃、45秒。
aprE啟動子－枯草桿菌nprB基因＋終止子的PCR融合片段是以Mfe I及Sph I限切核酸內切酶而消化。pJHT載體是以Eco RI及Sph I限切核酸內切酶而消化。接著將限切核酸內切酶消化的aprE啟動子－枯草桿菌nprB基因＋終止子DNA片段與限切核酸內切酶消化的pJHT載體黏接。然後將黏接混合物轉形至TOP10化學性勝任大腸桿菌細胞，以用於在LA＋50 ppm羧苄青黴素上篩選。在鑑定出具有對質體pEL508之正確DNA構築序列的質體之後(參見第18圖)，將其轉形至勝任枯草桿菌細胞內，以嵌合到aprE啟動子的基因座。在LA＋5 ppm氯黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤上對轉形株篩選蛋白酶活性(也就是，脫脂牛奶的清除)。然後將擴增的菌株轉移到LA＋25 ppm氯黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤。接著將菌株轉移到LA＋25 ppm氯黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤以用於擴增。
C.嗜熱脂肪桿菌nprT的選殖： 為了建構嗜熱脂肪桿菌nprT質體，將擴增的aprE啟動子片段(來自pJHT載體)及嗜熱脂肪桿菌nprT片段(來自質體pJ4：G01938)，予以分別製備。第19圖提供個別DNA片段的擴增之概要圖。
PCR剪接重疊延伸(SOE)反應是用於將兩個不同的DNA片段連結在一起。在這個反應中，結合以下的反應試劑：1 μl的aprE啟動子DNA片段、1 μl的嗜熱脂肪桿菌nprT基因片段、1 μl的引子EL－755(25 μM)、1 μl的引子EL－735(25 μM)、5 μl的10×PfuUltra II融合HS DNA聚合酶緩衝溶液、1 μl的dNTP(10 mM)、1 μl的PfuUltra II融合HS DNA聚合酶以及39 μl的蒸餾滅菌水，以提供50 μl的總反應體積。PCR循環是：95℃、2分鐘(僅第一次循環)，之後是28個循環的95℃、30秒，54℃、30秒及72℃、45秒。
aprE啟動子－嗜熱脂肪桿菌nprT基因＋終止子的PCR融合片段是以Eco RI及Hind III限切核酸內切酶而消化。pAC載體是以Eco RI及Hind III限切核酸內切酶而消化。接著將限切核酸內切酶消化的aprE啟動子－嗜熱脂肪桿菌nprT DNA片段與限切核酸內切酶消化的pAC載體黏接。接著使用TempliPhi旋轉循環擴增以產生大量黏接的aprE啟動子－嗜熱脂肪桿菌nprTpACDNA分子，係使用製造商的方法(也就是，1 μl的aprE啟動子－嗜熱脂肪桿菌nprT pAC黏接反應物、5 μl的TempliPhi樣品緩衝溶液、5 μl的TempliPhi反應緩衝溶液及0.2 μl的TempliPhi酵素混合物，用於約11 μl的總反應物；在30℃培養3小時)。接著將TempliPhi反應物直接轉形至勝任枯草桿菌細胞，以嵌入到aprE啟動子的基因座，藉此產生枯草桿菌菌株EL560(參見第20圖)，係藉由DNA定序分析而確認。在LA＋5 ppm氯黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤上對轉形株篩選蛋白酶活性(也就是，脫脂牛奶的清除)。然後將菌株轉移到LA＋25 ppm氯黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤以用於擴增。
D.熱容桿菌npr的選殖： 為了建構熱容桿菌npr質體，將擴增的aprE啟動子片段(來自pJHT載體)及熱容桿菌npr片段(來自質體pJ4：G01908)，予以分別製備。第21圖提供個別DNA片段的擴增之概要圖。
PCR剪接重疊延伸(SOE)反應是用於將兩個不同的DNA片段連結在一起。在這個反應中，結合以下的反應試劑：1 μl的aprE啟動子DNA片段、1 μl的熱容桿菌npr基因片段、1 μl的引子EL－755(25 μM)、1 μl的引子EL－741(25 μM)、5 μl的10×PfuUltra II融合HS DNA聚合酶緩衝溶液、1 μl的dNTP(10 mM)、1 μl的PfuUltra II融合HS DNA聚合酶以及39 μl的蒸餾滅菌水，以提供50 μl的總反應體積。PCR循環是：95℃、2分鐘(僅第一次循環)，之後是28個循環的95℃、30秒，54℃、30秒及72℃、45秒。
aprE啟動子－熱容桿菌npr基因＋終止子的PCR融合片段是以Eco RI及Hind III限切核酸內切酶而消化。pAC載體是以Eco RI及Hind III限切核酸內切酶而消化。接著將限切核酸內切酶消化的aprE啟動子－熱容桿菌npr DNA片段與限切核酸內切酶消化的pAC載體黏接。接著使用TempliPhi旋轉循環擴增以產生大量黏接的aprE啟動子－熱容桿菌npr pAC DNA分子，係使用製造商的方法(也就是，1 μl的aprE啟動子－熱容桿菌npr pAC黏接反應物、5 μl的TempliPhi樣品緩衝溶液、5 μl的TempliPhi反應緩衝溶液及0.2 μl的TempliPhi酵素混合物，用於約11 μl的總反應物；在30℃培養3小時)。接著將TempliPhi反應物直接轉形至勝任枯草桿菌細胞，以嵌入到aprE啟動子的基因座，藉此產生枯草桿菌菌株EL561(參見第22圖)，係藉由DNA定序分析而確認。在LA＋5 ppm氯黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤上對轉形株篩選蛋白酶活性(也就是，脫脂牛奶的清除)。然後將菌株轉移到LA＋25 ppm氯黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤以用於擴增。
E.蘇力菌nprB的選殖： 為了建構蘇力菌nprB質體，將擴增的aprE啟動子片段(來自pJHT載體)及蘇力菌nprB片段(來自質體pJ4：G01905)，予以分別製備。第23圖提供概要圖，顯示個別DNA片段的擴增。
PCR剪接重疊延伸(SOE)反應是用於將兩個不同的DNA片段連結在一起。在這個反應中，結合以下的反應試劑：1 μl的aprE啟動子DNA片段、1 μl的蘇力菌nprB基因片段、1 μl的引子EL－755(25 μM)、1 μl的引子EL－744(25 μM)、5 μl的10×PfuUltra II融合HS DNA聚合酶緩衝溶液、1 μl的dNTP(10 mM)、1 μl的PfuUltra II融合HS DNA聚合酶以及38 μl的蒸餾滅菌水，總共50 μl的反應體積。PCR循環是：95℃、2分鐘(僅第一次循環)，之後是28個循環的95℃、30秒，54℃、30秒及72℃、45秒。
aprE啟動子－蘇力菌nprB基因＋終止子的PCR融合片段是以Eco RI及Hind III限切核酸內切酶而消化。pAC載體是以Eco RI及Hind III限切核酸內切酶而消化。接著將限切核酸內切酶消化的aprE啟動子－蘇力菌nprB DNA片段與限切核酸內切酶消化的pAC載體黏接。然後將黏接混合物轉形至TOP10化學性勝任大腸桿菌細胞。在鑑定出含有對質體pEL568之正確DNA構築序列的質體之後，將其轉形至勝任枯草桿菌細胞內。在LA＋5 ppm氯黴素＋1.6%脫脂牛奶的培養盤上對轉形株篩選蛋白酶活性(也就是，脫脂牛奶的清除)。DNA質體製備物顯示質體pEL568在枯草桿菌中是穩定的，並且不會嵌入至aprE啟動子的基因座。第24圖提供質體pEL568的圖譜。
E.同源性模擬： 在其他具體實例中提供來自解澱粉芽孢桿菌的NprE成熟功能域之同源性模型。在這些實驗中，NprE序列的成熟功能域之蛋白質序列(序列識別號192)是經由程序BlastP而進行(NCBI)。這個程式將序列與各種序列同一性的其他已知序列進行配對。從輸出訊息中，鑑定了X－光結晶結構是已知的序列。這些序列包括金黃色葡萄球菌Npr(pdb id 1BQB)、綠膿假單胞菌(P.aeruginosa )Npr(pdb id 1EZM)、熱分解桿菌(B.thermolyticus )的嗜熱菌蛋白酶(pdb id 1KEI)以及仙人掌桿菌Npr(pdb id 1NPC)。第5圖提供被分析的各種序列之序列校準(序列識別號192－195)。
仙人掌桿菌Npr的序列經發現是最相同於NprE。熱分解桿菌的嗜熱菌蛋白酶(pdb id 1KEI)被排除在後續的步驟中，因為它非常類似於仙人掌桿菌Npr。接著如以下之詳細說明而製備同源性模型，以及所有的計算都是利用程式MOE而進行(Chemical Computing)。
首先，將金黃色葡萄球菌Npr(pdb id 1BQB)(序列識別號193)、綠膿假單胞菌Npr(pdb id 1EZM)(序列識別號194)以及仙人掌桿菌Npr(pdb id 1NPC)(序列識別號195)序列利用已知的結構而校準，以得到最精確的序列校準(也就是，產生以結構為基準的序列校準)。其次，將NprE成熟序列校準到這個以結構為基準的序列校準。接著，利用仙人掌桿菌Npr(pdb id 1NPC)結構作為模板以及利用NprE與上述產生的仙人掌桿菌Npr之序列校準，而產生NprE的初步同源性模型。從這個校準的檢視中明顯的是，仙人掌桿菌Npr包含四個Ca2 ＋ 離子結合位置，但NprE卻僅包含兩個Ca2 ＋ 離子結合位置。
最後，在建立初步同源性模型之後，將金屬離子(也就是，Zn2 ＋ 以及兩個Ca2 ＋ )以及它們各自的蛋白質配體計算地固定。模型結構的其餘部分是利用CHARMM22參數設定而計算地最小化，因而產生最終的同源性模型。
實施例12：清洗表現測試
在這個實例中說明測定本發明的金屬蛋白酶之清洗表現所進行的實驗。所有的清洗表現測試都是在美國清洗條件下進行，如以下之說明：洗滌清洗表現測試： 儀器：Terg－O－Tometer(US Testing)6鍋工作檯上型溫度：15℃/60℉清洗時間：12分鐘攪動：100 rpm潤洗時間：3分鐘水硬度：每加侖6細粒/105 ppm以CaCO3 計(3/1 Ca＋ 2 /Mg＋ 2 )肥皂水濃度：1.6 g/L TIDE2005液體洗滌基底酵素劑量：0.00－0.55－2.75－5.50 mg的活性蛋白質/L清洗溶液樣本：EMPA 116固定的，在20℃固定：在棉上的血液、牛奶、油墨(10×7.5cm)EMPA 116未固定的：在棉上的血液、牛奶、油墨(10×7.5 cm)Equest草：擦在棉上的草汁培養液(10×7.5 cm)CFT C－10：在棉上的色素、油脂、牛奶(10×7.5 cm)EMPA 221：未弄髒的棉作為壓載物(10×10 cm)將6個EPMA 116固定的＋2個EPMA 221放在一個容器中將6個EPMA 116未固定的＋2個EPMA 221放在一個容器中將6個Equest草＋2個EPMA 221放在一個容器中將6個CFT C－10＋2個EPMA 221放在一個容器中乾燥條件：旋轉乾燥器，草汁污斑風乾，以深色布料覆蓋。將其他的污斑熨燙。測量樣本：Tristimilus Minolta Meter CR－300連同方程式L(L*a*b)，D65 Std。在白色的背景上照光。以△%污斑移除上表示。每個樣本3個讀值(清洗之前及之後)。
%污斑移除＝(清洗後的L數值－清洗前的L數值)/(L0 白 色 棉 －清洗前的L數值)×100%
所有的實驗都以四重複進行。
蛋白酶是在特別開發的清洗試驗中測試，利用三種不同的棉樣本，以下列方式弄髒：(a)牛奶、血液及油墨(10.0×7.5 cm；EMPA)，以數字116未固定及固定而命名(污斑在20℃固定)；(b)草汁培養液(10.0×7.5 cm；Equest草)；以及(c)色素、油脂及牛奶(10.0×7.5 cm；以數字C－10 CFT命名)。
這些實驗是在以下更詳盡地說明。清洗試驗是在配備6個不銹鋼測試容器的工作檯上型Terg－O－Tometer(US Testing)之中進行。不銹鋼測試容器每個都包含1.6 g的TIDE2005液體洗滌基底，溶解於1000 ml的105 ppm/每加侖6細粒的水中，並將每個都裝載6個相同弄髒的棉樣本以及2個額外壓載物棉樣本(EMPA 221)。將選擇的蛋白酶(例如，中性金屬蛋白酶或其他蛋白酶)以每公升肥皂水0.00至5.50 mg活性蛋白質的濃度加到每個容器中。
試驗是在15℃/60℉中進行12分鐘，伴隨100 rpm的攪動。在清洗之後，將樣本在冷自來水下潤洗3分鐘，並且放置在旋轉乾燥器中。將草汁樣本風乾，並以深色布料覆蓋，以限制草汁污斑對光的敏感性。所有其他的樣本都經熨燙。所有的實驗都以四重複進行。
測試樣本的反射係數是以Tristimilus Minolta Meter CR－300，利用方程式L(L*a*b)而測量。清洗表現數值是利用以下關聯性而計算：%污斑移除＝(清洗後的L數值－清洗前的L數值)/(L0 白 色 棉 －清洗前的L數值)×100%
對於純化的MULTIFECT之Terg－O－Tometer(TOM)分析結果是顯示於第26圖，並且與枯草桿菌蛋白酶(BPN，Y217L)(一種絲胺酸鹼性蛋白酶)進行比較。TOM提供完全可行及有效的方法，以區別各種蛋白酶間的不同清洗表現(例如，絲胺酸蛋白酶、中性金屬蛋白酶及其變異物)。TOM試驗是對BMI及Equest草培中度－弄髒的草汁表面上，以TIDE2005基底洗滌劑而進行。
如第26圖所示，顯而易見地，經純化的中性金屬蛋白酶在清洗試驗中是明顯表現優於絲胺酸蛋白酶(BPN’Y217L)。特別地，2.75 ppm純化的中性金屬蛋白酶是必要的，以顯示約10%的△污斑移除，相較於僅0.55 ppm的絲胺酸蛋白酶(BPN’Y217L)對Equest草污斑。也在低溫時測試中性金屬蛋白酶的清洗表現，並且發現對中度固體Equest草污斑織物進行得非常好。類似的結果也在經純化的市售MULTIFECT中性蛋白酶及以上說明製造的重組nprE獲得。
實施例13：nprE變異物在BMI－TIDE 2X表現分析中的表現
在這個實施例中說明評估各種nprE變異物在以上概述的BMI分析中表現所進行的實驗。係使用在實施例1之前所提供的方法(參見，“測試蛋白酶表現的微樣本分析”)。具有表現指數大於1(PI>1)的多樣取代變異物以及具有表現指數小於1(PI<1)的多樣取代變異物之結果，是提供於下表中。
在表13.1中提供對於經篩選的單一取代變異物在BMI－TIDE2X表現分析中所得到的數據。該表提供對於變異物如上述計算的表現指數，相較於WT酵素，其顯示改善的表現。該等具有表現指數大於1的變異物具有改善的表現。
在表13.2中提供對於經篩選的多重取代變異物在BMI－TIDE2X表現分析中所得到的數據。該表提供對於變異物如上述計算的表現指數，相較於WT酵素，其顯示改善的表現。該等具有表現指數大於1的變異物具有改善的表現。
實施例14：nprE變異物的穩定性
在這個實施例中說明測定nprE變異物的穩定性所進行的實驗。在這些實驗中，在實施例1之前所說明的方法是用於測定表現指數(參見上述“在洗滌劑存在下的nprE穩定性分析”)。下表提供含有及不含DTPA測試之具有表現指數大於1(PI>1)的該等變異物之結果。
穩定性是藉由在高溫培養之前及之後測定AGLA活性而測量。下表包含在這些條件下相較於WT的相對穩定性數值。它是(變異物殘留活性/WT殘留活性)的商數。數值大於1代表在洗滌劑存在時較高的穩定性。在表14.1及14.2中，提供的數據顯示在這些條件下，含有及不含DTPA時，相對於WT NprE穩定性之NprE的單一取代變異物之相對穩定性數據。
在表14.3及14.4中，提供的數據顯示在這些條件下，含有及不含DTPA時，相對於WT NprE穩定性之NprE的多重取代變異物之相對穩定性數據。
在下表(表14.5)中的數據代表在檸檬酸鹽穩定性分析中，相對於WT NprE穩定性之NprE的變異物之相對穩定性數據。穩定性是藉由在高溫培養之前及之後測定AGLA活性藉由測定酪蛋白活性而測量(參見上述“檸檬酸鹽穩定性分析”)。下表包含在這些條件下相較於WT的相對穩定性數值。它是以(變異物殘留活性/WT殘留活性)的商數而表示。數值大於1代表在洗滌劑存在時較高的穩定性。
實施例15：nprE相較於BPN’217L的pH表現特徵
在這個實施例中說明評估nprE及BPN’Y217L的比較表現所進行的實驗。在這些實驗中係使用EMPA 116(BMI)及Equest草污斑。
材料： NprE，8 mg/mL BPN，Y217L，25.6 mg/mL EMPA 116髒布，3" ×4.5" (試驗織物)Equest草(med.)，3" ×4" (Warwick Equest)EMPA 221白棉樣本，3" ×4.5" Minolta色度計CR200TIDE2005(Procter & Gamble所提供)水硬度濃縮液：每加侖15,000細粒(gpg)，3：1 Ca：Mg 1 M Bis－TRIS－丙烷緩衝溶液濃硫酸具有水龍頭及攪拌器的50 L混合槽Terg－O－Tometer去離子水
將樣本予以製備以用於處理。每個處理進行三重複，每個處理使用18個樣本。將草汁樣本在暗室中製備以避免褪色。約18個弄髒樣本的反射係數值是利用Minolta色度計而獲得。每個樣本得到3個讀值。將L數值、平均L數值及標準偏差予以紀錄。這是L初 始 數值。
洗滌劑溶液是以下述方法製備(總共40 L)。較佳是在測試前的夜晚製備這個溶液。將溶液在寒冷中儲存隔夜。溶液是藉由將39.724 kg的去離子水加到50 L的混合槽中、啟動攪拌器、混入60克的TIDE液體洗滌劑、混入16 mL的水硬度溶液及200 mL的1 M Bis－TRIS－丙烷。pH是利用濃硫酸而調整(調整到低於所要pH的0.2 pH單位，如果溶液是儲存隔夜的話，因為隔夜pH會緩慢上升)。最終濃度是：TIDE＝1.5 g/L；水硬度＝6 gpg；以及Bis－TRIS－丙烷＝5 mM。
對於在Terg－O－Tometer中的測試，將1 L的洗滌劑溶液加到每個Terg鍋中，並使其回溫。將酵素以各種濃度加到鍋中。對於BMI試驗，所使用的酵素濃度是0 mg/L、0.275 mg/L、0.55 mg/L、1.65 mg/L、2.65 mg/L及5.50 mg/L。對於草汁污斑，所使用的nprE濃度是0 mg/L、0.1925 mg/L、0.385 mg/L、1.155 mg/L、1.925 mg/L及3.85 mg/L(BPN’Y217L的濃度是相同於在BMI試驗中所使用的濃度)。啟動攪拌並且加入樣本。所有的重複都一起在相同的Terg－O－Tometer中進行(例如，0X &X在第一次進行，1 X & 3X在第二次進行，以及5 X & 10X在第三次進行)。溫度是15℃，攪動速度是100 cpm，以及清洗時間是12分鐘。將處理的樣本在4 L自來水(約6 pgp)中潤洗三次。將樣本在在紙巾上風乾隔夜。將草汁樣本以紙巾覆蓋，並使其在暗室中乾燥。乾燥的樣本之反射係數是如上述而測定。每個樣本得到3個讀值。將L數值、平均L數值及標準偏差予以紀錄。這是L最 終 數值。
污斑移除的百分比(%SR)是對於每個測試條件及兩種酵素，利用以下的方程式而測定： 其中：L0 ＝未弄髒樣本的反射係數L初 始 ＝經弄髒樣本的反射係數L最 終 ＝經清洗樣本的反射係數
相對於無酵素控制的△% SR是利用下式而測定：△% SR＝% SR處 理 －% SR無 酵 素 控 制
將BPN’Y217L與nprE在EMPA116(BMI)上，於pH值6.7、7.5、8.5及9.5時比較。nprE在EMPA 116上的表現似乎在約pH 8達到高峰，而BPN’Y217L則在約pH 8.8達到高峰。結果顯示在pH 7.5及8.5時，nprE表現比BPN’Y217L更佳，但它在pH6.7時表現不及BPN’Y217L。這些酵素的表現在pH9.5時是相等的。此外，這些酵素在Equest草(med)上的表現，於pH 7.8－8.4時沒有差異。
實施例16：PMN及nprE酵素在液體洗滌劑中之比較
這個實施例說明清潔實驗，以測定PMN及nprE的清潔表現。PMN及nprE酵素的清潔表現是在液體TIDE洗滌劑中測試，以與基準絲胺酸蛋白酶(蛋白酶A)在蛋白酶敏感性污斑上比較。如下表所示，PMN及nprE比蛋白酶A更能移除污斑，即使在低酵素水平時亦然。在下表中，較高的SRI數值代表較佳的清潔表現。
實施例17：NprE及NprE變異物的熱穩定性
在這個實施例中說明測定NprE及NprE變異物的熱穩定性所進行的實驗。酵素是如以上說明而製造及純化。純化的蛋白質經判斷是足夠均質的，利用10% SDS－PAGE測定具有大於95%的純度，因為在膠體中僅觀察到一個主要的蛋白質。這個蛋白質是約32 kDa，其為成熟nprE序列的分子量。利用含有1 mM氯化鋅、4 mM氯化鈣及40%丙二醇的25 mM MES緩衝溶液(pH 5.8)而調配蛋白質，以用於儲存。用於這個實驗中的分析是利用上述螢光AGLA活性以及下述差別掃瞄熱量法(DSC)的蛋白酶分析。
差別掃瞄熱量法(DSC)： 過量的熱容量曲線是利用超靈敏性掃瞄高產率微熱量計VP－Cap DSC(Microcal)而測量。DSC測量的標準方法及技術的理論，是在此技藝中之人士所熟知的(例如，參見Freire，Meth.Mol.Biol.，41：191－218[1995])。簡言之，需要大約500 μL的200－400 ppm純的或超過濾濃縮(UFC)蛋白質樣品。通常，將400 ppm的NprE及變異蛋白質(在缺少及含有130 mM檸檬酸鹽的情形下)在20－100℃溫度間，利用200℃/小時的掃瞄率，在5 mM HEPES(pH 8.0)的緩衝溶液中掃瞄。接著再次掃瞄相同的樣品，以檢視方法的可逆性。對於NprE，熱展開的方法是不可逆的。NprE的熱解鏈之掃瞄率依賴性數據，是在25至200℃/小時的掃瞄率間評估。各種添加物(例如，一級及二級醇、鹽、環糊精、PEG、山梨糖醇、甘醇)對於NprE的熱解鏈溫度之影響也被評估。
結果： 野生型NprE的熱穩定性是在兩個不同的濃度測定，以顯示蛋白質濃度對於熱解鏈點的影響。對於220 ppm及440 ppm的Tm數值，經測定分別是67.6±0.5及69.2±0.5℃。蛋白質濃度的影響凸顯了二階事件。發明人預期這是聚集或自溶。然而，並不希望本發明受限於任何特定的機轉。但是，這些結果顯示，對於NprE的熱解鏈點之精確測定及任何比較，都需要蛋白質濃度是充分配合的。掃瞄率對於熱解鏈點的影響，也顯示Tm是取決於高達150℃/小時的，接著在150－200℃/小時之間變平的掃瞄率。根據這些結果，選擇200℃/小時作為所有研究的最高掃瞄率，以將Tm對於掃瞄率的依賴性減到最小。
對於NprE及變異物收集的所有數據，都顯示在表4中。表4也包括在130 mM檸檬酸鹽的存在下，對於NprE及變異物所獲得的DSC熱解鏈點。在大部分的例子中是掃瞄兩個蛋白質濃度。如這個表所示，在130 mM檸檬酸鹽的存在下之掃瞄中，並不是所有的蛋白質都顯示熱展開紀錄。
對於NprE的野生型及各種突變株，熱展開特徵(DSC掃瞄)的代表圖是顯示於第27圖。展開特徵代表野生型的中間點並且顯示可展現比野生型增加的熱解鏈點之選擇性突變株，以及可展現比野生型減少的熱解鏈點之選擇性突變株。這個圖示明顯地凸顯出，DSC可區別穩定及較不穩定的NprE變異物，並且是有效於作為二次篩選。在變異物的熱解鏈點及它們在洗滌劑中的穩定性之間觀察到一個一般的趨勢。例如，變異物S66E、S199E、D220P/E、S129I/V是在TIDE中的所有優勝者，並且顯示比野生型NprE的熱解鏈點增加約1℃。這個熱解鏈點增加約1℃是小的但卻是明顯的，因為熱穩定性通常需要多個胺基酸的取代。
第28圖顯示NprE變異物的熱展開，其可展現在130 mM檸檬酸鹽存在下之熱展開特徵。檸檬酸鹽是一種洗滌劑的成分，其可在缺少鈣的情形下快速引起NprE的自溶。對於野生型的NprE，在檸檬酸鹽存在時沒有熱展開特徵，其與已展開或缺少完全形成的疏水性核心之蛋白質是一致的。可在檸檬酸鹽存在下展現熱展開特徵的突變株是包括在表17中。這些變異物具有範圍在47－56℃的熱熔點。在130 mM檸檬酸鹽存在下的DSC掃瞄，顯示變異物變異物比野生型NprE對於檸檬酸鹽是更穩定的。例如，檸檬酸鹽穩定的變異物經顯示係包含S129I或S129V，以及含有任一這些取代的組合物顯示熱解鏈點增加＋5℃。
添加物對於NprE熱解鏈點的影響： 第29圖顯示包括各種添加物的實驗之結果。緩衝溶液是5 mM HEPES(pH 8.0)。樣品是利用200℃/小時的掃瞄率從20－100℃而掃瞄。在這個圖示中，水平線代表野生型NprE不含添加物的Tm。在這些實驗中，數據顯示在這些試劑的存在下，對於NprE的熱解鏈點(Tm)幾乎沒有或沒有影響。納入NprE活性的抑制劑(例如，磷阿米酮(phosphoramidon))顯示可增加Tm約1℃，顯示抑制劑可將一些穩定性提供給NprE以對抗熱展開程序。沒有一種上述條件可協助使熱展開程序變得可逆。然而，並不希望本發明受限於任何特定的機轉。
實施例18：NprE同源物在TIDE 中的穩定性及同源物BMI清洗表現
在這個實施例中說明評估nprE同源物在TIDE中的穩定性及這些同源物的清洗表現所進行之實驗。將純化的NprE(“NprE”)、枯草桿菌nprE(B.S.NprE)、蘇力菌nprB(B.T.NprB)及熱蛋白分解桿菌的嗜熱菌蛋白酶(TLN)在200 μl的25% TIDE於10 mM HEPES中(pH 8，10 μg/ml)的10 g/ml溶液，在25℃培養90分鐘。初始活性及剩餘活性是利用上述AGLA分析而測量。簡言之，將10 μl的樣品加到200μ l的AGLA緩衝溶液(50 mM MES，pH 6.5，0.005% Tween－80，2.5 mM CaCl2 )，接著將10 μl經稀釋的樣品加到200 μl的AGLA基質(2.4 mM Abz－AGLA－Nba於AGLA緩衝溶液中)。在350 nm的激發及415 nm的發射處監測前100秒，一開始的斜率記錄為酵素活性。剩餘活性的百分比是藉由將剩餘活性除以初始活性而計算。第30圖提供顯示90分鐘後的剩餘活性之圖形。
為了測定這些同源物在TIDE中的清洗表現，將一個已預先清洗的BMI微樣本先加到96槽孔培養盤中的每個槽孔。接著加入190 μl的1×濃縮TIDE(780 μg/ml的濃縮TIDE，5 mM HEPES，pH 8，6 gpg水硬度)。然後，將10 μl經純化的NprE、枯草桿菌nprE、蘇力菌nprB及熱蛋白分解桿菌的嗜熱菌蛋白酶加到槽孔中，以產生最終酵素濃度為0.25 μg/ml。將培養盤於25℃培養30分鐘，同時在熱混合器上以1400 rpm搖晃。在培養結束時，將100 μl的上清液轉移到新的96槽孔培養盤中。接著測量上清液在405 nm的OD。將上清液的OD扣除沒有加入酵素的空白對照組之OD。表現指數是將每個同源物的OD除以NprE的OD而計算。第31圖提供顯示NprE及此處說明的nprE同源物之BMI清洗表現的圖形。
實施例19：野生型nprE及變異物的金屬分析
在這個實施例中說明測定nprE及nprE變異物的鋅及鈣含量所進行的實驗。在這些實驗中，藉由感應耦合電漿質譜儀(ICPMS)及具有微聚焦束的粒子誘發X射線發射(微－PIXE)進行所有的微量金屬分析，以確認NprE的鋅及鈣含量。整體而言，一個鋅及兩個鈣離子是緊密地結合的。
所有的ICPMS及微－PIXE樣品都在無金屬的緩衝溶液中製備，以除去任何外源性的金屬污染物。通常，將250 μL的40 mg/mL NprE樣品以20 mM HEPES(pH 8.2)，利用YM－10微透析裝置而進行緩衝溶液交換三次。無金屬的緩衝溶液是藉由使緩衝溶液通過堆集Chelax 100樹脂的管柱而產生。最終的蛋白質濃度是利用得自Sigma的二喹啉甲酸蛋白質測定分析套組(BCA分析)而測定。ICPMS樣品是在WestCoast分析服務公司分析。微－PIXE是在離子束分析實驗室分析。
表19－1顯示對於野生型NprE的鈣及鋅離子之ICPMA金屬分析結果。相對於蛋白質濃度，發現兩個鈣離子及兩個鋅離子是存在於樣品中。
微－PIXE元素組成分析圖測量相對於蛋白質內部標準品的金屬含量。利用微－PIXE偵測到的所有波峰，都以相對於在NprE例子中由三個甲硫胺酸所引起的硫波峰而計算。觀察到一個大的氯離子波峰是由於在緩衝溶液中存在的鹽所致。
表18－2顯示由微－PIXE測定的金屬含量，其顯示NprE每個蛋白質分子一般包含兩個緊密結合的鈣及鋅離子。野生型NprE顯示一個鋅離子與兩個鈣離子。發明人預期到鈣離子可能由於樣品的製備所致而顯示低的佔用率。S58D及T60D顯示每個蛋白質接近兩個鋅離子，代表一個可能的額外鋅離子結合到這個位置。雙重變異物具有兩個附加的半胱胺酸，其增加了技術的精確性。然而，並不希望本發明受限於任何具有特定離子數目的特定具體實例。
與其他已經定性的鈣及鋅依賴型中性蛋白酶(例如，嗜熱菌蛋白酶或類－嗜熱菌蛋白酶的蛋白酶(TLP))一致(例如，參見Dahlquist等人，Biochem.15：1103－1111[1976]；Srpingman等人，Biochem.34：15713－15720[1995]；及Willenbrock等人，FEBS Lett.358：189－192[1995])，經發現NprE每個分子包含至少兩個緊密結合的鈣離子及一個鋅離子。可能的第三個鈣結合位置被提出，但預期是非常弱的。由於所有的樣品都被去鹽以除去任何外源性金屬，因此，這些弱結合的鈣位置預期是未被佔用的。
實施例20：以甲酸鈣使NprE在TIDE 濃縮HDL洗滌劑中穩定化
在這個實施例中說明開發使NprE在TIDE濃縮HDL洗滌劑中穩定化的方法所進行的實驗。在這些實驗中，探究藉由在固定的檸檬酸鹽濃度時增加甲酸鈣水平同時減少在實驗性TIDE濃縮調配物(“TIDE2×”)中的DTPA含量，而使NprE穩定化的方法。使用統計學的實驗設計(DOE)方法以簡化實驗以及數據分析。經顯示，存在於TIDE中的DTPA會不利地影響NprE穩定性，而加入甲酸鈣則可協助克服在全效力TIDE濃縮調配物中的有害作用。
具有’雙重中心點的全中心組成反應表面模式，係使用作為DOE方法。改變四種成分的總共16個獨特調配物，是根據列於表19.1的組成變化而預先製備。LAS是從0－6%(重量/重量)變化，伴隨DTPA(0－0.25%)及甲酸鈣(0－0.2%)，於固定濃度的檸檬酸(1.9%)。TIDE洗滌劑的所有其他成分都保持固定。成分濃度的範圍條件是根據各種混合物的相穩定性而決定。蛋白質穩定性試驗是以780 ppm nprE於全效力(約100%)的調配混合物中進行，並且在32℃培養。失活化是在達24小時測量。所有的分析都是利用紅色螢光標示的酪蛋白分析套組(Invitrogen)以0.5 ppm的蛋白質濃度而進行。NprE的失活化速率是在三個獨立的實驗中測量。DOE的數據是利用DOE Fusion Pro(S－Matrix)而分析。
表20.2及第31圖顯示在各種調配混合物中的NprE穩定性測量之結果。平均速率及標準差是來自三個獨立測定中的平均NprE失活化速率(小時－ 1 )。定量地，具有低DTPA含量及高鈣負載的調配物，在全效力濃縮TIDE中具有更穩定的傾向。例如，無添加DTPA及高甲酸鈣水平的調配物編號5顯示最低的失活化速率，代表高的NprE穩定性。相反地，具有高DTPA濃度及無添加甲酸鈣的調配物# 9則顯示最低的穩定性。在表20.2中，排序是取決於測量的穩定性(也就是，平均速率)。各輪從三個獨立的穩定性實驗中得到。
第33圖顯示在各種水平的固定甲酸鈣濃度時，NprE藉由DTPA的失活化影響。A組顯示在沒有任何添加的甲酸鈣時，NprE藉由DTPA的失活化之速率。關聯性顯示DTPA具有明顯的有害影響。B組顯示DTPA與0.1%甲酸鈣之部分減少的影響。C組顯示DTPA與0.2%甲酸鈣之明顯減少的影響。
第34圖顯示DOE分析軟體(Fusion Pro)根據少於0.5 hr－ 1 (A組)、0.25 hr－ 1 (B組)及0.05hr－ 1 (C組)的反應目標(衰退速率)，而產生DTPA及甲酸鈣組成物的預測特徵。陰影區域代表經預測可顯示具有低於設定目標的衰退速率的穩定性之DTPA及甲酸鈣組成物的比例。例如，在0.04%的DTPA存在時，0.16%的甲酸鈣將提供NprE具有少於0.25小時－ 1 的衰退速率之穩定性，如第34圖B組所示。另一方面，在0.16%的DTPA存在時，0.08%的甲酸鈣無法維持NprE具有至少0.25小時－ 1 的衰退速率之穩定性。
實施例21：解澱粉芽孢桿菌中性金屬蛋白酶NprE之檸檬酸鹽誘發的自溶位置之鑑定
在這個實施例中說明評估野生型及重組變異nprE(例如，枯草桿菌變異物)之檸檬酸鹽誘發的自溶作用之方法。在這些實驗中，解澱粉芽孢桿菌的中性金屬蛋白酶(天然及表現在枯草桿菌中的重組變異物)之自溶作用，是利用檸檬酸鈉(Sigma)而誘發。自溶作用的過程是藉由在4℃於25 mM MES(pH 6.5)緩衝溶液中進行反應而控制。在這些實驗中，0.4 mg/ml NprE的自溶作用是藉由改變以下而最適化：(a)在10 mM檸檬酸鹽中的培養時間(10－100分鐘)；或(b)在100分鐘期間的檸檬酸鹽濃度(10－100 mM)。單獨稀釋於緩衝溶液(也就是，無檸檬酸鹽)中的中性金屬蛋白酶之對照組，是在類似的條件下培養。自溶反應是藉由加入等體積的1 N HCl而終止，將樣品利用TCA而沈澱，並將沈澱物利用丙酮而清洗及乾燥。將所得的沈澱物再懸浮於20 μL的緩衝溶液(pH 6.5)及4X LDS樣品緩衝溶液中(Nupage，Invitrogen)。
將自溶片段藉由10%(重量/重量)SDS－PAGE而解析，並且電墨漬到PVDF膜上。前10個胺基酸殘基是利用Edman降解而定序(Argo Bioanalytica)。自溶片段的部分胺基酸序列是利用在膠體內的胰蛋白酶消化而決定，並且利用LCQ－MS(Agilent)而分析。膠體內的消化方法涉及到將含有蛋白質的膠體片浸軟、除去考瑪斯(Coomassie)藍染色，然後使膠體片在含有2 M尿素的25 mM碳酸銨中再水合。將胰蛋白酶加到再水合的膠體片在37℃約6小時。在消化之後，將肽利用乙腈及TCA而萃取。將肽在C4－疏水性管柱(Vydac)上利用乙腈－水梯度而分離。將所得的肽圖譜以SEQUEST資料庫檢索程式，對含有Genencor酵素的資料庫而檢索。
將每個片段的前10個胺基酸之胺基酸序列與已知的解澱粉芽孢桿菌NprE之胺基酸序列進行比較。這可鑑定在胺基端處(並且因此切割位置)的胺基酸。
檸檬酸鹽誘導的片段之產生及它們的解析，是顯示於10%的SDS－PAGE上。片段的大小是利用來自InVitrogen的標準分子量標記而鑑定。在10 mM檸檬酸鹽的存在下，除了剩下的完整NprE外的兩個片段，是在100分鐘的時間範圍被觀察到。在低檸檬酸鹽濃度形成的兩個片段經發現是24 kDa及9 kDa的大小。完整的nprE是32 kDa。100分鐘的時間範圍產生切割蛋白質的好的部分(也就是，初級自溶片段)。在這些條件下，沒有其他的片段被觀察或偵測到。在增加的檸檬酸鹽存在下，進行一項100分鐘期間的研究，以獲得二級自溶片段。在這個實驗中，當使用10－30 mM檸檬酸鹽之間的濃度時，觀察到上述的兩個片段。在40 mM檸檬酸鹽時，少數較大的24 kDa片段是明顯的，但15 kDa的片段也是明顯的。在50－100 mM檸檬酸鹽之間，24 kDa的片段及9 kDa的片段不再被偵測到，但卻觀察到大小21 kDa、15 kDa及11 kDa的三個其他片段。
24 kDa、9 kDa(前兩個片段)及21 kDa、15 kDa及11 kDa(接著的自溶片段)之胺基端特性，是利用Edman降解而決定(Argo Bioanalytica)。
條帶A1、A3及A4具有天然的N－ 端序列，其符合完整NprE的N－ 端。條帶A2的定序報告顯示三個片段，其中最不強的序列似乎是相同於較強的序列，除了它比較強的序列分別短兩個殘基以及一個殘基之外。這與特定蛋白質片段的磨損(fray)一致。膠體片段的模式及大小顯示出，15 kDa(條帶A4)可能衍生自21 kDa的片段(條帶A3)，因此C－端推論是在或接近位置198。然而，並不希望本發明受限於這個特定的具體實例。
第35圖提供各種片段的胺基酸序列(1－5或A1－5，用於N－端定序之目的)。片段1(A1)具有等同於完整天然蛋白質(序列識別號222)的胺基端殘基，片段2(Ad2)的N－端開始於或接近D220(序列識別號223)。之後兩個胺基酸殘基(A221及G222)也被凸顯，因為這個片段經鑑定是磨損的。片段3(A3)(序列識別號224)及片段4(A4)(序列識別號225)具有完整蛋白質的N－端，以及片段5(A5)(序列識別號226)開始於L198。片段4的C－端可能是在或接近M138(根據A3及A4間的大小差異)。A3的對應片段並未被偵測到。
對於片段1至5的胰蛋白酶消化後之肽圖譜的LCQ－MS，明確地鑑定在個別片段內的數個胺基酸肽。這些在第35圖中被凸顯。LCQ－MS提供一個片段身分的陽性對照組。
根據切割片段的N－端及LCQ－MS分析，主要切割位置經鑑定是在胺基酸位置D220、A221、G222、M138及L198。這些位置是利用定點致突變法而靶定，並且建立D220、A221、G222、L198及M138、D139的位置評估資料庫。突變的蛋白質是如此處所示，對於在洗滌劑中增加的穩定性及對於BMI－清洗表現而篩選。在部分例子中，也挑選在這些位置旁邊的胺基酸用於蛋白質設計，以便確保修剪位置確實被靶定。
蛋白質設計的結果明確地指出，在D220以Pro或Glu進行之胺基酸取代會產生在洗滌劑中更穩定的NprE分子。此外，額外的穩定性也藉由以Cys取代G222及以Ile或Leu取代M138而提供給NprE分子。一般而言，這些特定的胺基酸取代提供NprE洗滌劑穩定性的優點，但卻沒有危及BMI－清洗表現。因此，這些實驗提供檸檬酸鹽誘發的自溶位置之重要的圖譜數據，促進可改變及影響NprE整體穩定性的關鍵胺基酸殘基之鑑定。檸檬酸鹽(一種加入洗滌劑基質中的加強劑)會使NprE不穩定並且自溶，且被指出是因為可螯合必要之結合鈣的原子而如此。將NprE應用到極端洗滌條件中，需要更穩定的NprE分子使用在這些環境中。在這些實驗中，NprE的一個或多個自溶位置之取代，已導致更洗滌劑穩定的nprE分子以用於這些極端的洗滌劑中。
實施例22：液體洗衣洗滌劑組成物
在這個實施例中提供用於液體洗衣洗滌劑組成物的各種調配物。以下提供本發明的液體洗衣洗滌劑組成物： # 1：加入1 N HCl水溶液以將調配物的淨pH調整在約3至約5的範圍內。
上述實施例22(I)－(II)的pH是約5至約7，以及22(III)－(IV)的pH是約7.5至約8.5。
實施例23：手用餐具液體洗滌劑組成物
在這個實施例中提供各種手用餐具液體洗滌劑調配物。以下是本發明的手用餐具液體洗滌劑組成物：
實施例23(I)－(VI)的pH是約8至約11。
實施例24：液體芳香洗碗劑組成物
在這個實施例中提供各種液體芳香洗碗劑調配物。以下是本發明的手用液體洗滌劑組成物：
實施例25：顆粒及/或片狀洗衣組成物
這個實施例提供用於顆粒及/或片狀洗衣洗滌劑的各種調配物。以下製備本發明的洗衣組成物，其可以是顆粒或片狀的形式。
實施例26：液體洗衣洗滌劑
這個實施例提供用於液體洗衣洗滌劑的各種調配物。以下製備本發明的液體洗衣洗滌劑組成物：
實施例27：高密度洗碗洗滌劑
這個實施例提供用於高密度洗碗洗滌劑的各種調配物。以下製備本發明的濃縮高密度洗碗洗滌劑：
實施例27(I)至(VI)的pH是從約9.6至約11.3。
實施例28：片狀洗滌劑組成物
這個實施例提供各種片狀洗滌劑調配物。以下本發明的片狀洗滌劑組成物是利用標準的12頭旋轉式壓製機，藉由13 KN/cm2 的壓力將顆粒洗碗洗滌劑組成物壓縮而製備。
實施例28(I)至(VII)的pH是從約10至約11.5；15(VIII)的pH是從8－10。實施例28(I)至(VII)的片狀物重量是從約20克至約30克。
實施例29：液體硬表面清潔洗滌劑
這個實施例提供用於液體硬表面清潔洗滌劑的各種調配物。以下製備本發明的液體硬表面清潔洗滌劑組成物：
實施例29(I)至(VIi)的pH是從約7.4至約9.5。
雖然本發明的特定具體實例已被解釋及說明，但對於熟悉於此技藝者顯而易見的是，在不脫離本發明的精神及範疇之外，可進行各種其他的更動及修改。因此希望在附屬的申請專利範圍內涵蓋在本發明範疇內的所有該等更動及修改。
所有在說明書中提及的的專利及公告都象徵本發明所屬技藝人士的水平。所有的專利及公告都以猶如個別公告係特定及各自以引用方式納入的相同程度，而以引用方式納入本文中。
由於已說明本發明的較佳具體實例，因此，對於熟悉於此技藝者將顯示可對所揭露的具體實例進行各種修改，以及該等修改希望是在本發明的範疇內。
熟悉於此技藝者已理解到，本發明可完全適合於完成目標，並且獲得所提及以及內含的目的及優點。此處所說明的組成物及方法代表較佳具體實例及範例，並且不希望作為本發明範疇的限制。對於熟悉於此技藝者顯而易見的是，在不脫離本發明的範疇及精神之外，可對本發明此處的揭露進行各種其他的取代及修改。
本發明此處解釋性地說明，可適合地在缺少非此處特別揭露的任何元素、限制下實施。已經使用的術語及表現是作為說明的術語而非限制，並且不希望該等術語及表現的使用排除任何所示及說明的特徵或其部分之等同物，但應理解的是，在本發明申請專利範圍的範疇內，各種的修改是有可能的。因此，應理解的是，雖然本發明已藉由較佳具體實例及可選擇的特徵而特定地揭露，但此處所揭露的概念之修改及變異可被熟悉於此技藝者重新整理，以及該等修改及變異視為是在如附屬申請專利範圍所定義的本發明之範疇內。本發明已以在此廣泛及一般地說明。落入一般揭露內的每個較窄的物種及次屬群集，也形成本發明的一部份。這包括本發明的一般揭露，前提或負面限制為從種類中除去任何的主題，不管所切除的材料是否為此處所特定列舉者。
第1圖提供顯示來自純化的MULTIFECT中性結合蛋白質對於鋅及鈣陽離子的親和力常數之測定(其分別利用螢光染劑FluoZin－3及Fluo－3)的結果之圖形。
第2圖提供顯示顯示0.36 mg/ml調配的重組解澱粉芽孢桿菌nprE的蛋白酶活性受線性烷基苯磺酸鹽(LAS)之抑制(其利用QuantiCleaveT M 蛋白酶分析)的圖形。
第3圖提供有用於本發明的各種金屬蛋白酶同源物(序列識別號173－181)之序列校準。
第4圖提供有用於本發明的各種金屬蛋白酶同源物(序列識別號182－191)之序列校準。在這個圖示中，編碼是對於嗜熱菌蛋白酶(熱蛋白分解桿菌)。如同在第3圖中，“＊”代表保守的殘基，“：”代表保守性取代的殘基。以及“．”代表類似的殘基。
第5圖提供經同源性模擬而鑑定的各種金屬蛋白酶同源物(序列識別號192－195)之序列校準。
第6圖提供質體pJ4：G01905的圖譜。
第7圖提供質體pJ4：G01906的圖譜。
第8圖提供質體pJ4：G01907的圖譜。
第9圖提供質體pJ4：G01908的圖譜。
第10圖提供質體pJ4：G01909的圖譜。
第11圖提供質體pJ4：G01938的圖譜。
第12圖提供質體pJHT的圖譜。
第13圖提供質體pAC的圖譜。
第14圖提供pUBnprE的圖譜。
第15圖提供顯示aprE啟動子及枯草桿菌nprE基因片段的擴增之概要圖。
第16圖提供質體pEL501的圖譜。
第17圖提供顯示aprE啟動子及枯草桿菌nprB基因片段的擴增之概要圖。
第18圖提供質體pEL508的圖譜。
第19圖提供顯示aprE啟動子及嗜熱脂肪桿菌nprT基因片段的擴增之概要圖，其用於產生菌株EL560。
第20圖提供顯示建構菌株EL560的圖示。
第21圖提供顯示aprE啟動子及熱容桿菌npr基因片段的擴增之概要圖，其用於產生菌株EL561。
第22圖提供顯示建構菌株EL561的圖示。
第23圖提供顯示aprE啟動子及蘇力菌nprB基因片段的擴增之概要圖。
第24圖提供質體pEL568的圖譜。
第25圖提供顯示設計用於測定0.36mg/ml中性金屬蛋白酶(nprE)的UF濃縮物於含有鈣及鋅離子的TIDE® 2005基底中，在32℃長期儲存的實驗結果之圖形。為了比較之目的，因此提供無鹽及過量鈣測試所獲得的結果。
第26圖提供利用Terg-O-Tometer(TOM)及各種弄髒基質的清洗表現測試數據。A組提供顯示在15℃於TIDE® 2005洗滌劑液體中清洗之後，枯草桿菌蛋白酶(BPN’Y217L)及純化的MULTIFECT®中性對於EMPA 116(固定及未固定於棉上)的△污斑移除(%)之結果(n=24)。B組提供顯示在15℃於TIDE® 2005洗滌劑液體中清洗之後，枯草桿菌蛋白酶(BPN’Y217L)及純化的MULTIFECT®中性對於在棉上的Equest®草中度弄髒的△污斑移除(%)之結果(n=24)。C組提供顯示在15℃於TIDE® 2005洗滌劑液體中清洗之後，枯草桿菌蛋白酶(BPN’Y217L)及純化的MULTIFECT®中性對於CFT C-10(在棉上的色素、油脂、牛奶)的△污斑移除(%)之結果(n=24)。
第27圖提供顯示利用VP-Cap DSC(MicroCalTM )對於440ppm NprE及變異物所獲得的DSC掃瞄結果之圖形。
第28圖提供顯示利用VP-Cap DSC(MicroCalTM )對於440ppm NprE及變異物在130mM檸檬酸鹽存在下所獲得的DSC掃瞄結果之圖形。
第29圖提供顯示利用VP-Cap DSC(MicroCalTM )對於440ppm NprE在各種添加物存在下所獲得的熱熔點之圖 形。在這個圖示中，水平線代表沒有添加物的野生型NprE之Tm。
第30圖提供顯示在25% TIDE®於25℃經90分鐘之後，nprE及nprE同源物的剩餘活性之圖形。
第31圖提供顯示nprE及nprE同源物的BMI清洗表現之圖形(n=8)。
第32圖提供顯示在各種調配混合物中NprE穩定性測量的結果之圖形。
第33圖提供顯示在固定甲酸鈣濃度時，具有不同% DTPA濃度的NprE失活化速率之圖形(A、B及C組)。A組顯示速率vs.具有0%甲酸鈣的DTPA，B組顯示速率vs.具有0.1%甲酸鈣的DTPA，C組顯示速率vs.具有0.2%甲酸鈣的DTPA。
第34圖提供顯示根據反應目標(衰退速率)由DOE分析軟體產生之DTPA及甲酸鈣組成物的預測紀錄之圖形(A、B及C組)。
第35圖提供凸顯自溶位置的NprE之檸檬酸鹽誘發的自溶片段之胺基酸序列(序列識別號222-226)。片段1及2是第一修剪，片段3-5代表第二修剪。斜體字母代表定序的胺基端，以及粗體字母凸顯從個別片段的膠體內消化所鑑定的肽。
<110> 杰能科國際有限公司寶橋公司<120> 儲存穩定性之中性金屬蛋白酶的用途與製造<130> GC889－2－TW <140> 尚未受讓<141> 2006－10－12 <150> US60/726,448 <151> 2005－10－12 <160> 226 <170> PatentIn第3.3版<210> 1 <211> 713 <212> DNA <213> 枯草桿菌<400> 1<210> 2 <211> 1578 <212> DNA <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 2 <210> 3 <211> 520 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 3 <210> 4 <211> 523 <212> PRT <213> 未知<220> <223> NpreE同源物<400> 4 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 5<210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 6<210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 7<210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 8<210> 9 <211> 55 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 9<210> 10 <211> 55 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 10<210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 11<210> 12 <211> 1566 <212> DNA <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 12<210> 13 <211> 521 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 13 <210> 14 <400> 14 000 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <400> 16 000 <210> 17 <211> 194 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 17<210> 18 <211> 300 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 18<210> 19 <211> 46 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 19<210> 20 <211> 46 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 20<210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 21<210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 22<210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (19)..(20) <223> n是a、c、g或t <400> 23<210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (18)..(19) <223> n是a、c、g或t <400> 24<210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (18)..(19) <223> n是a、c、g或t <400> 25<210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (18)..(19) <223> n是a、c、g或t <400> 26<210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 27<210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 28<210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 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(18)..(19) <223> n是a、c、g或t <400> 38<210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (18)..(19) <223> n是a、c、g或t <400> 39<210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (18)..(19) <223> n是a、c、g或t <400> 40<210> 41 <211> 38 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (19)..(20) <223> n是a、c、g或t <400> 41<210> 42 <211> 43 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 42<210> 43 <211> 43 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 43<210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (18)..(19) <223> n是a、c、g或t <400> 44<210> 45 <211> 42 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 45<210> 46 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (19)..(20) <223> n是a、c、g或t <400> 46<210> 47 <211> 38 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (19)..(20) <223> 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人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 75<210> 76 <211> 38 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (19)..(20) <223> n是a、c、g或t <400> 76<210> 77 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (19)..(20) <223> n是a、c、g或t <400> 77<210> 78 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 78<210> 79 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (19)..(20) <223> n是a、c、g或t <400> 79<210> 80 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 80<210> 81 <211> 44 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (19)..(20) <223> n是a、c、g或t <400> 81<210> 82 <211> 59 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (24)..(25) <223> n是a、c、g或t <400> 82<210> 83 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (29)..(30) <223> n是a、c、g或t <400> 83<210> 84 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (23)..(24) <223> n是a、c、g或t <400> 84<210> 85 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (26)..(27) <223> n是a、c、g或t <400> 85<210> 86 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (24)..(25) <223> n是a、c、g或t <400> 86<210> 87 <211> 56 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (30)..(31) <223> n是a、c、g或t <400> 87<210> 88 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (26)..(27) <223> n是a、c、g或t <400> 88<210> 89 <211> 41 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (19)..(20) <223> n是a、c、g或t <400> 89<210> 90 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (25)..(26) <223> n是a、c、g或t <400> 90<210> 91 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (28)..(29) <223> n是a、c、g或t <400> 91<210> 92 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (25)..(26) <223> n是a、c、g或t <400> 92<210> 93 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (27)..(28) <223> n是a、c、g或t <400> 93<210> 94 <211> 53 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (24)..(25) <223> n是a、c、g或t <400> 94<210> 95 <211> 60 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (27)..(28) <223> n是a、c、g或t <400> 95<210> 96 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 96<210> 97 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (26)..(27) <223> n是a、c、g或t <400> 97<210> 98 <211> 56 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (26)..(27) <223> n是a、c、g或t <400> 98<210> 99 <211> 53 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (26)..(27) <223> n是a、c、g或t <400> 99<210> 100 <211> 46 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 100<210> 101 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (28)..(29) <223> n是a、c、g或t <400> 101<210> 102 <211> 42 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 102<210> 103 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (18)..(19) <223> n是a、c、g或t <400> 103<210> 104 <211> 47 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (23)..(24) <223> n是a、c、g或t <400> 104<210> 105 <211> 47 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (24)..(25) <223> n是a、c、g或t <400> 105<210> 106 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (22)..(23) <223> n是a、c、g或t <400> 106<210> 107 <211> 53 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (22)..(23) <223> n是a、c、g或t <400> 107<210> 108 <211> 46 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 108<210> 109 <211> 43 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 109<210> 110 <211> 47 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (23)..(24) <223> n是a、c、g或t <400> 110<210> 111 <211> 44 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (25)..(26) <223> n是a、c、g或t <400> 111<210> 112 <211> 59 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (35)..(36) <223> n是a、c、g或t <400> 112<210> 113 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (22)..(23) <223> n是a、c、g或t <400> 113<210> 114 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (26)..(27) <223> n是a、c、g或t <400> 114<210> 115 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (25)..(26) <223> n是a、c、g或t <400> 115<210> 116 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (24)..(25) <223> n是a、c、g或t <400> 116<210> 117 <211> 56 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (26)..(27) <223> n是a、c、g或t <400> 117<210> 118 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (28)..(29) <223> n是a、c、g或t <400> 118<210> 119 <211> 41 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (22)..(23) <223> n是a、c、g或t <400> 119<210> 120 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (23)..(24) <223> n是a、c、g或t <400> 120<210> 121 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 121<210> 122 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (23)..(24) <223> n是a、c、g或t <400> 122<210> 123 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 123<210> 124 <211> 53 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (29)..(30) <223> n是a、c、g或t <400> 124<210> 125 <211> 60 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (33)..(34) <223> n是a、c、g或t <400> 125<210> 126 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 126<210> 127 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (23)..(24) <223> n是a、c、g或t <400> 127<210> 128 <211> 56 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (30)..(31) <223> n是a、c、g或t <400> 128<210> 129 <211> 53 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (27)..(28) <223> n是a、c、g或t <400> 129<210> 130 <211> 46 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (25)..(26) <223> n是a、c、g或t <400> 130<210> 131 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (23)..(24) <223> n是a、c、g或t <400> 131<210> 132 <211> 42 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (22)..(23) <223> n是a、c、g或t <400> 132<210> 133 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 133<210> 134 <211> 47 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (24)..(25) <223> n是a、c、g或t <400> 134<210> 135 <211> 47 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (23)..(24) <223> n是a、c、g或t <400> 135<210> 136 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (27)..(28) <223> n是a、c、g或t <400> 136<210> 137 <211> 53 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (31)..(32) <223> n是a、c、g或t <400> 137<210> 138 <211> 46 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (26)..(27) <223> n是a、c、g或t <400> 138<210> 139 <211> 43 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (23)..(24) <223> n是a、c、g或t <400> 139<210> 140 <211> 47 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (24)..(25) <223> n是a、c、g或t <400> 140<210> 141 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (27)..(28) <223> n是a、c、g或t <400> 141<210> 142 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (30)..(31) <223> n是a、c、g或t <400> 142<210> 143 <211> 41 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 143<210> 144 <211> 43 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (22)..(23) <223> n是a、c、g或t <400> 144<210> 145 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 145<210> 146 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (23)..(24) <223> n是a、c、g或t <400> 146<210> 147 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (26)..(27) <223> n是a、c、g或t <400> 147<210> 148 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (31)..(32) <223> n是a、c、g或t <400> 148<210> 149 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (34)..(35) <223> n是a、c、g或t <400> 149<210> 150 <211> 57 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (37)..(38) <223> n是a、c、g或t <400> 150<210> 151 <211> 59 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (40)..(41) <223> n是a、c、g或t <400> 151<210> 152 <211> 64 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (43)..(44) <223> n是a、c、g或t <400> 152<210> 153 <211> 66 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (46)..(47) <223> n是a、c、g或t <400> 153<210> 154 <211> 42 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 154<210> 155 <211> 43 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (19)..(20) <223> n是a、c、g或t <400> 155<210> 156 <211> 52 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 156<210> 157 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (24)..(25) <223> n是a、c、g或t <400> 157<210> 158 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (24)..(25) <223> n是a、c、g或t <400> 158<210> 159 <211> 41 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 159<210> 160 <211> 43 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 160<210> 161 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (29)..(30) <223> n是a、c、g或t <400> 161<210> 162 <211> 49 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (26)..(27) <223> n是a、c、g或t <400> 162<210> 163 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (25)..(26) <223> n是a、c、g或t <400> 163<210> 164 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (23)..(24) <223> n是a、c、g或t <400> 164<210> 165 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 165<210> 166 <211> 57 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 166<210> 167 <211> 59 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (19)..(20) <223> n是a、c、g或t <400> 167<210> 168 <211> 64 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (21)..(22) <223> n是a、c、g或t <400> 168<210> 169 <211> 66 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (20)..(21) <223> n是a、c、g或t <400> 169<210> 170 <211> 42 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (22)..(23) <223> n是a、c、g或t <400> 170<210> 171 <211> 43 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (24)..(25) <223> n是a、c、g或t <400> 171<210> 172 <211> 52 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<220> <221> 雜項特徵<222> (31)..(32) <223> n是a、c、g或t <400> 172<210> 173 <211> 521 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 173 <210> 174 <211> 521 <212> PRT <213> 枯草桿菌<400> 174 <210> 175 <211> 509 <212> PRT <213> 金黃色葡萄球菌<400> 175 <210> 176 <211> 548 <212> PRT <213> 嗜熱脂肪桿菌<400> 176 <210> 177 <211> 544 <212> PRT <213> 熱容桿菌<400> 177 <210> 178 <211> 566 <212> PRT <213> 蘇力菌<400> 178 <210> 179 <211> 566 <212> PRT <213> 仙人掌桿菌<400> 179 <210> 180 <211> 538 <212> PRT <213> 枯草桿菌<400> 180 <210> 181 <211> 568 <212> PRT <213> 仙人掌桿菌<400> 181 <210> 182 <211> 316 <212> PRT <213> 熱蛋白分解桿菌<400> 182 <210> 183 <211> 316 <212> PRT <213> 嗜熱脂肪桿菌<400> 183 <210> 184 <211> 319 <212> PRT <213> 熱容桿菌<400> 184<210> 185 <211> 317 <212> PRT <213> 仙人掌桿菌<400> 185<210> 186 <211> 304 <212> PRT <213> 短小短芽胞桿菌<400> 186 <210> 187 <211> 302 <212> PRT <213> 多黏芽胞桿菌<400> 187 <210> 188 <211> 300 <212> PRT <213> 短小桿菌<400> 188 <210> 189 <211> 300 <212> PRT <213> 枯草桿菌變種<400> 189<210> 190 <211> 230 <212> PRT <213> 枯草桿菌<400> 190<210> 191 <211> 300 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 191 <210> 192 <211> 300 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 192 <210> 193 <211> 301 <212> PRT <213> 金黃色葡萄球菌<400> 193<210> 194 <211> 298 <212> PRT <213> 綠膿假單胞菌<400> 194<210> 195 <211> 317 <212> PRT <213> 仙人掌桿菌<400> 195 <210> 196 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 196<210> 197 <211> 53 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 197<210> 198 <211> 53 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 198<210> 199 <211> 32 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 199<210> 200 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 200<210> 201 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 201<210> 202 <211> 50 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 202<210> 203 <211> 50 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 203<210> 204 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 204<210> 205 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 205<210> 206 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 206<210> 207 <211> 54 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 207<210> 208 <211> 32 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 208<210> 209 <211> 50 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 209<210> 210 <211> 50 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 210<210> 211 <211> 38 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 211<210> 212 <211> 58 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 212<210> 213 <211> 58 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 213<210> 214 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子<400> 214<210> 215 <211> 10 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 215<210> 216 <211> 10 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 216<210> 217 <211> 10 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 217<210> 218 <211> 9 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 218<210> 219 <211> 10 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 219<210> 220 <211> 10 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 220<210> 221 <211> 10 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 221<210> 222 <211> 219 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 222 <210> 223 <211> 81 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 223<210> 224 <211> 197 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 224 <210> 225 <211> 140 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 225<210> 226 <211> 103 <212> PRT <213> 解澱粉芽孢桿菌<400> 226

Claims (32)

  1. 一種分離的中性金屬蛋白酶變異物，其具有與包括序列識別號3或序列識別號18的中性金屬蛋白酶至少95%的胺基酸同一性，且具有在等同於包含列於序列識別號18的胺基酸序列之中性金屬蛋白酶之位置的位置處進行的包括至少一個胺基酸取代的胺基酸序列，其中該位置係選自於14、45、46、47、54、58、59、60、66、96、97、100、119、128、129、130、135、136、137、139、140、151、152、155、178、179、186、190、191、198、199、204、216、218、219、220、222、224、243、244、260、261、263、265、269、273、280、282、285、289、293、296、297、及299的位置，其中該中性金屬蛋白酶變異物具有中性金屬蛋白酶活性；其中該中性金屬蛋白酶變異物具有相較於野生型解澱粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens )的中性金屬蛋白酶改善的熱穩定性，相較於野生型解澱粉芽孢桿菌的中性金屬蛋白酶，在較低或較高pH條件下之改善的表現，或相較於野生型解澱粉芽孢桿菌的中性金屬蛋白酶之改善的自溶穩定性。
  2. 如申請專利範圍第1項之分離的中性金屬蛋白酶變異物，其中該蛋白酶包括至少一種突變，其係選自T004C、T004E、T004H、T004I、T004K、T004L、T004M、T004N、T004P、T004R、T004S、T004V、T004W、T004Y、G012D、G012E、G012I、G012K、G012L、G012M、G012Q、G012T、G012V、G012W、K013C、K013D、K013E、K013F、K013G、K013H、K013I、K013L、K013M、K013N、K013Q、K013S、K013T、K013V、K013Y、T014F、T014G、T014H、T014I、T014K、T014L、T014M、T014P、 T014Q、T014R、T014S、T014V、T014W、T014Y、S023A、S023D、S023F、S023I、S023K、S023L、S023M、S023N、S023P、S023Q、S023R、S023S、S023T、S023V、S023W、S023Y、G024A、G024D、G024F、G024G、G024H、G024I、G024K、G024L、G024M、G024N、G024P、G024R、G024S、G024T、G024V、G024W、G024Y、K033H、Q045C、Q045D、Q045E、Q045F、Q045H、Q045I、Q045K、Q045L、Q045M、Q045N、Q045P、Q045R、Q045T、Q045W、N046A、N046C、N046E、N046F、N046G、N046H、N046I、N046K、N046L、N046M、N046P、N046Q、N046R、N046S、N046T、N046V、N046W、N046Y、R047E、R047K、R047L、R047M、R47Q、R047S、R047T、Y049A、Y049C、Y049D、Y049E、Y049F、Y049H、Y049I、Y049K、Y049L、Y049N、Y049R、Y049T、Y049V、Y049W、N050D、N050F、N050G、N050H、N050I、N050K、N050L、N050M、N050P、N050Q、N050W、N050Y、T054C、T054D、T054E、T054F、T054G、T054H、T054I、T054K、T054L、T054M、T054N、T054P、T054Q、T054R、T054S、T054V、T054W、T054Y、S058D、S058H、S058I、S058L、S058N、S058P、S058Q、T059A、T059C、T059E、T059G、T059H、T059I、T059K、T059L、T059M、T059N、T059P、T059Q、T059R、T059S、T059V、T059W、T060D、T060F、T060I、T060K、T060L、T060N、T060Q、T060R、T060V、T060W、T060Y、T065C、T065E、T065F、T065H、T065I、T065K、T065L、T065M、T065P、T065Q、T065R、T065V、T065Y、S066C、S066D、S066E、S066F、S066H、S066I、S066K、S066L、S066N、S066P、S066Q、 S066R、S066T、S066V、S066W、S066Y、Q087A、Q087D、Q087E、Q087H、Q087I、Q087K、Q087L、Q087M、Q087N、Q087R、Q087T、Q087V、Q087W、N090C、N090D、N090E、N090F、N090G、N090H、N090L、N090R、N090T、N096G、N096H、N096K、N096R、K097H、K097Q、K097W、K100A、K100D、K100E、K100F、K100H、K100N、K100P、K100Q、K100R、K100S、K100V、K100Y、R110A、R110C、R110E、R110H、R110K、R110L、R110M、R110N、R110S、R110Y、D119E、D119H、D119I、D119L、D119Q、D119R、D119S、D119T、D119V、D119W、G128C、G128F、G128H、G128K、G128L、G128M、G128N、G128Q、G128R、G128W、G128Y、S129A、S129C、S129D、S129F、S129G、S129H、S129I、S129K、S129L、S129M、S129Q、S129R、S129T、S129V、S129W、S129Y、F130I、F130K、F130L、F130M、F130Q、F130R、F130T、F130V、F130Y、S135P、G136I、G136L、G136P、G136V、G136W、G136Y、S137A、M138I、M138K、M138Q、M138V、D139A、D139C、D139E、D139G、D139H、D139I、D139K、D139L、D139M、D139P、D139R、D139S、D139V、D139W、D139Y、V140C、Q151I、E152A、E152C、E152D、E152F、E152G、E152H、E152L、E152M、E152N、E152R、E152S、E152W、N155D、N155K、N155Q、N155R、D178A、D178C、D178G、D178H、D178K、D178L、D178M、D178N、D178P、D178Q、D178R、D178S、D178T、D178V、D178W、D178Y、T179A、T179F、T179H、T179I、T179K、T179L、T179M、T179N、T179P、T179Q、T179R、T179S、T179V、 T179W、T179Y、E186A、E186C、E186D、E186G、E186H、E186K、E186L、E186M、E186N、E186P、E186Q、E186R、E186S、E186T、E186V、E186W、E186Y、V190H、V190I、V190K、V190L、V190Q、V190R、S191F、S191G、S191H、S191I、S191K、S191L、S191N、S191Q、S191R、S191W、L198M、L198V、S199C、S199D、S199E、S199F、S199I、S199K、S199L、S199N、S199Q、S199R、S199V、Y204H、Y204T、G205F、G205H、G205L、G205M、G205R、G205S、G205Y、K211C、K211D、K211G、K211M、K211N、K211Q、K211R、K211S、K211T、K211V、K214A、K214C、K214E、K214I、K214L、K214M、K214N、K214Q、K214S、K214V、L216A、L216C、L216F、L216H、L216Q、L216R、L216S、L216Y、N218K、N218P、T219D、D220A、D220E、D220H、D220K、D220N、D220P、A221D、A221F、A221I、A221K、A221L、A221M、A221N、A221S、A221V、A221Y、G222C、G222H、G222N、G222R、Y224F、Y224H、Y224N、Y224R、T243C、T243G、T243H、T243I、T243K、T243L、T243Q、T243R、T243W、T243Y、K244A、K244C、K244D、K244E、K244F、K244G、K244L、K244M、K244N、K244Q、K244S、K244T、K244V、K244W、K244Y、V260A、V260D、V260E、V260G、V260H、V260I、V260K、V260L、V260M、V260P、V260Q、V260R、V260S、V260T、V260W、V260Y、Y261C、Y261F、Y261I、Y261L、T263E、T263F、T263H、T263I、T263L、T263M、T263Q、T263V、T263W、T263Y、S265A、S265C、S265D、S265E、S265K、S265N、S265P、S265Q、S265R、S265T、 S265V、S265W、K269E、K269F、K269G、K269H、K269I、K269L、K269M、K269N、K269P、K269Q、K269S、K269T、K269V、K269W、K269Y、A273C、A273D、A273H、A273I、A273K、A273L、A273N、A273Q、A273R、A273Y、R280A、R280C、R280D、R280E、R280F、R280G、R280H、R280K、R280L、R280M、R280S、R280T、R280V、R280W、R280Y、L282F、L282G、L282H、L282I、L282K、L282M、L282N、L282Q、L282R、L282V、L282Y、S285A、S285C、S285D、S285E、S285K、S285P、S285Q、S285R、S285W、Q286A、Q286D、Q286E、Q286K、Q286P、Q286R、A289C、A289D、A289E、A289K、A289L、A289R、A293C、A293R、N296C、N296D、N296E、N296K、N296R、N296V、A297C、A297K、A297N、A297Q、A297R、以及G299N。
  3. 如申請專利範圍第1項之分離的中性金屬蛋白酶變異物，其中該蛋白酶包括多重突變，其係選自S023W/G024M、T004V/S023W/G024W、S023W/G024Y/A288V、T004L/S023W/G024Y、N046Q/N050F/T054L、N050Y/T059R/S129Q、S023W/G024W、A273H/S285P/E292G、S023Y/G024Y、S023Y/G024W、T004S/S023Y/G024W、N046Q/T054K、S023W/G024Y、T004V/S023W、T059K/S066N、N046Q/N050W/T054H/T153A、T004V/S023W/G024Y、L282M/Q286P/A289R、N046Q/R047K/N050Y/T054K、L044Q/T263W/S285R、T004L/S023W/G024W、R047K/N050F/T054K、A273H/S285R、N050Y/T059K/S066Q、 T054K/Q192K、N046Q/N050W、L282M/Q286K、T059K/S066Q、T004S/S023W、L282M/Q286R/A289R/K011N、L282M/A289R、N046Q/N050W/T054H、T059K/S129Q、T004S/S023N/G024Y/F210L、T004V/S023W/G024M/A289V、L282M/Q286K/A289R/S132T、N050W/T054H、L282M/Q286R、L282F/Q286K/A289R、T059R/S066Q、R047K/N050W/T054H、S265P/L282M/Q286K/A289R、L282M/Q286R/T229S、L282F/Q286K、T263W/S285R、S265P/L282M/Q286K、T263H/A273H/S285R、T059R/S129V、S032T/T263H/A273H/S285R、T059R/S066Q/S129Q、T004S/G024W、T004V/S023W/G024M、T059K/S066Q/S129Q、L282M/Q286K/A289R/I253V、T004V/S023Y/G024W、T059R/S066N/S129Q、N050F/T054L、T004S/S023N/G024W、T059R/S066N、T059R/S066N/S129V、Q286R/A289R、N046Q/R047K/N050F/T054K、S265P/L282M/Q286P/A289R、S265P/L282M/Q286R/A289R、Q062K/S066Q/S129I、S023N/G024W、N046Q/R047K/N050W/T054H、R047K/T054K、T004L/G024W、T014M/T059R/S129V、T059R/S066Q/N092S/S129I、R047K/N050W/T054K、T004V/G024W、N047K/N050F/T054K、S265P/L282F/Q286K/N061Y、L282F/Q286K/E159V、T004V/S023Y/G024M、S265P/L282F/A289R/T065S、T059K/F063L/S066N/S129V、T004L/S023W、N050F/T054H、T059R/S066Q/S129V、V190I/D220E/S265W/L282F、 T004S/S023Y/G024M、T004L/S023N/G024Y、T059K/S066N/S129I、T059R/S066N/S129I、L282M/Q286R/A289R/P162S、N046Q/N050F/T179N、T059K/Y082C/S129V、T059K/S129I、N050Y/T054K、T059K/S066Q/V102A/S129Q、T059R/S066Q/S129I、T059W/S066N/S129V/S290R、T059R/S129I、T059K/S066Q/S129I、T059K/S066Q/S129V、S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N、T004V/S023N/G024W、S265P/Q286K、S265P/L282F/A289R、D220P/S265W、L055F/T059W/S129V、T059R/S129Q/S191R、N050W/T054K、T004S/S023W/G024M、R047K/N050F/T054H、T059K/S066N/K088E、T059K/S066Q/S129I/V291L、L282M/Q286R/A289R、T059R/S066N/F085S/S129I、L282F/Q286P/A289R、L282F/Q286R/A289R、G099D/S265P/L282F/Q286K/A289R、N046Q/N050F、N050Y/T059W/S066N/S129V、T009I/D220P/S265N、V190F/D220P/S265W、N157Y/T263W/A273H/S285R、T263W/A273H/S285R、T263W/S285W、T004V/S023Y、N046Q/R047K/N050W、N050W/T054L、N200Y/S265P/L282F/Q286P/A289R、T059R/S066Q/P264Q、T004V/G024Y、T004L/G024Y、N050Y/S191I、N050Y/T054L、T004L/S023W/G024Y/N155K、F169I/L282F/Q286R/A289R、L282M/Q286K/A289R、F130L/M138L/E152W/D183N、N046Q/R047K/N050Y/T054H、T004V/G024M、 N050Y/T059W/S066Q/S129V、S023N/G024Y、T054H/P162Q、T004S/S023W/G024Y、N050Y/T054H、L282F/Q286R/A289R/F169I、R047K/N050W、V190F/D220P、L282M/F173Y、T004L/S023Y、N050W/A288D、V190I/D220P/S265Q、S265P/L282F/Q286P/A289R、S265P/L282F/Q286R/A289R、N046Q/N050Y/T054K、T059W/S066Q、T263W/A273H/S285W、T263W/A273H/S285P、S023Y/G024M、T004L/S023N/G024W、T004V/S023N/G024Y、T059W/S066N/S129Q、T004S/S023Y、T004S/S023N/G024M、T059W/S066N/A070T、T059W/S066Q/S129Q、T263W/A273H、A273H/285P、N046Q/R047K/N050Y/T054L、N046Q/R047K/N050Y、R047K/N050Y、T263H/S285W、R047K/N050F、N046Q/R047K/N050F/T054H、S023N/G024M、T004S/G024Y、R047K/N050Y/T054H、T059W/S066N/S129I、R047K/T054L、T004S/S023W/G024W、M138L/E152F/T146S、D220P/S265N、T004S/G024M、T004V/S023N、N046Q/N050F/T054K、N046Q/N050Y/T054H、Q062H/S066Q/S129Q、T059W/S129Q、T059W/S129V、N050F/T054K、R047K/N050F/T054L、V190I/D220P/S265W、N112I/T263H/A273H/S285R、T059W/S066N/S129V、T059W/S066Q/S129I、T059W/S129I、T263W/S285P、V190I/D220P、A289V/T263H/A273H、T263H/A273H/S285P、N90S/A273H/S285P、R047K/N050Y/T054L、T004S/S023N、T059R/S129Q、N046Q/R047K/T054H、T059W/S066Q/S129V、 E152W/T179P、N050Y/S066Q/S129V、T202S/T263W/A273H、T263W/A273H/S285P、M138L/E152W/T179P、N046Q/R047K、N046Q/T054H/F176L、T004L/G024M、T004S/L282M、T263H/A273H、T263H/A273H/S285W、T004L/S023Y/G024M、L282F/Q286P、T004V/S023Y/G024Y、V190F/S265W、M138L/E152F、V190F/D220E/S265W、N046Q/N050F/T054H、N157Y/S285W、T004F/S023Y/G024M、T004V/S023N/G024M、L198I/D220E/S265Q、N046Q/N050Y/T054K/A154T、S016L/D220E/S265W、D220E/S265W、D220E/A237S/S265W、S066Q/S129Q、V190F/D220E/S265Q/T267I、L282M/F173Y/T219S、E152F/T179P、V190I/S265W、M138L/S066Q、M138L/E152W、T059W/S066Q/A070T/S129I、V190F/D220E/S265N、V190F/S265N、N046Q/N050Y、以及M138L/E152F/T179P。
  4. 如申請專利範圍第1項之分離的中性金屬蛋白酶變異物，其中該蛋白酶包括多重突變，其係選自V190I/D220P、V190I/D220P/S265Q、V190L/D220E、V190I/D220E/S265Q、V190I/D220E/S265W/L282F、V190L/D220E/S265Q、V190I/D220E/S265W、V190L/D220E/S265N、T059R/S066Q/S129I、V190I/D220E/S265N、V190L/D220E/S265W、V190I/D220E、T059W/S066N/S129V、T059K/S066Q/S129V、T059K/Y082C/S129V、T059R/S066N/S129I、S066Q/S129V、T059R/S066Q/S129V、T059R/S129I、N050Y/T059W/S066N/S129V、D220P/S265N、 S066Q/S129I、T059W/S066Q/S129V、T059K/S066Q/S129I、T059R/S129V、N050Y/S066Q/S129V、T059W/S066Q/S129I、N050Y/T059W/S066Q/S129V、T059K/S129I、D220P/S265W、F130L/M138L/T179P、S066N/S129I、T059R/S066N/S129V、F130I/M138L/T179P、T059R/S066Q/N092S/S129I、S066N/S129V、D220E/S265Q、F130L/M138L/E152W/T179P、T059W/S129V、S265P/L282M/Q286R/A289R、S265P/L282F/Q286R/A289R、T059W/S066N/S129I、V190I/D220P/S265W、F130L/E152W/T179P、F130L/M138L/E152F/T179P、Q062K/S066Q/S129I、T059K/S066N/S129I、E152H/T179P、S265P/L282M/Q286K/A289R、F130L/M138L/E152H/T179P、T263W/A273H/S285R、D220E/S265N、F130I/M138L/E152H/T179P、F130V/M138L/E152W/T179P、F130I/M138L/E152W/T179P、T059W/S129I、D220E/S265W、F130V/M138L/T179P、F130L/E152V/T179P、T059R/S129Q、T263W/S285P、F130I/M138L/E152F/T179P、E152W/T179P、V190L/S265Q、F130L/E152F/T179P、L282M/Q286R/A289R/P162S、D220P/S265Q、M138L/E152F/T179P、F130I/E152H/T179P、M138L/E152W/T179P、F130L/T179P、F130L/M138L/E152W/T179P/Q286H、F130L/M138L/E152H、T263W/A273H/S285W、S265P/Q286K、T059W/S066Q/S129Q、T263W/S285R、T059W/S066N/S129Q、T263W/S285W、 T059R/S066N/S129Q、S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N、T059W/S129Q、Q062H/S066Q/S129Q、L282M/Q286R/A289R、V190L/D220E/S265N/V291I、V190L/S265N、F130L/M138L/E152W、N050Y/T059R/S129Q、F130I/T179P、T059K/S066Q/S129Q、T059K/S129Q、S265P/L282M/Q286P/A289R、S265P/L282F/Q286P/A289R、T263W/A273H/S285P、S265P/L282M/Q286K、S016L/D220E/S265W、S066Q/S129Q、S265P/L282M/Q286P、L282F/Q286R/A289R、F130V/E152W/T179P、L044Q/T263W/S285R、L055F/T059W/S129V、V190L/S265W、Q286R/A289R、G99D/S265P/L282F/Q286K/A289R、F130L/M138L/E152F、T059R/S066Q/S129Q、F130L/E152H、S066N/S129Q、T004S/S023N/G024M/K269N、S265P/L282M、E152F/T179P、T059W/S066N/S129V/S290R、L282F/Q286K/A289R、F130L/M138L、F130I/M138L/E152W、S265P/L282F、F130I/M138L/E152H、F130V/M138L/E152H、V190I/S265Q、M138L/E152M、S265P/L282F/Q286P、M138L/E152H、T059K/S066N/K088E、V190I/S265W、F130L/E152W、L282M/Q286K/A289R、L282M/Q286K/A289R/I253V、T263W/A273H、V190I/S265N、M138L/E152W、A273H/S285R、F130I/M138L、F130L/E152F、F130V/M138L/E152W、T059K/S066Q/V102A/S129Q、F130V/E152H/T179P、F130I/M138L/E152F、 F130V/M138L/E152F、M138L/E152F、L282M/Q286R、F130I/E152H、S265P/L282F/A289R/T065S、T263H/A273H/S285R、F130V/M138L、T014M/T059R/S129V、L282M/Q286R/A289R/K11N、A273H/S285P、L282M/Q286K/A289R/S132T、T263H/A273H/S285W、F130V/E152W、S265P/L282F/Q286K/N061Y、F130I/E152W、L198I/D220E/S265Q、V190I/S265L、T263H/S285W、S265P/L282F/A289R、M138L/S066Q、F130I/E152F、N90S/A273H/S285P、S032T/T263H/A273H/S285R、L282F/Q286P/A289R、N157Y/T263W/A273H/S285R、V105A/S129V、T263H/A273H/S285P、S129Q/L282H、T059W/S066Q、F130V/E152H、S023W/G024Y、T004V/S023N、T059R/S066Q、N050W/T054L、L282M/Q286P/A289R、A115V/V190L/S265W、L282M/Q286K、T059R/S066N、L282F/Q286P、T004V/S023W/G024M、S265P/L282F/Q286R/L78H、L282F/Q286K、T004V/S023W/G024Y、S023W/G024M、T059R/R256S、F130V/E152F、T004V/G024W、N050W/T054K、S023Y/G024M、T004V/S023Y、T004V/S023Y/G024M、N050Y/T054H、S023W/G024W、T004V/S023Y/G024Y、T004V/S023N/G024W、F130L/M138L/E152F/T179P/V291I、N050Y/T059K/S066Q、T004V/S023Y/G024W、T059K/S066N、T004V/S023N/G024Y、S023Y/G024W、N050F/T054L、R047K/T054K、S023N/G024W、L282M/A289R、S023Y/G024Y、T004V/G024M、 R047K/N050F/T054K、N050F/T054K、T059K/S066Q、S023N/G024M、S023N/G024Y、T004L/S023N、R047K/N050W/T054H、T004L/S023W/G024Y、T004S/S023W、N046Q/N050W/T054H/A142T、T004L/S023Y、T004V/S023W、N050W/T054H、T004S/S023N、T004S/L282M、T004L/S023W、N050F/T054H、N050Y/T054L、及R047K/N050W/T054K。
  5. 如申請專利範圍第1項之分離的中性金屬蛋白酶變異物，其中該蛋白酶包括多重突變，其係選自S066Q/S129V、S066Q/S129I、N050Y/S066Q/S129V、S066N/S129I、T059K/S066Q/S129V、S066N/S129V、F130L/E152W/T179P、S265P/L282M/Q286R/A289R、F130L/E152V/T179P、T059K/S066Q/S129I、T263W/S285P、T059K/S066N/S129I、T263W/A273H/S285P、S265P/L282F/Q286R/A289R、F130V/E152W/T179P、T263W/A273H/S285R、V190I/D220P/S265W、F130L/E152H、S066N/S129Q、S265P/L282M/Q286K/A289R、V190I/D220E、T059R/S066N/S129I、V190I/D220E/S265W、T059K/S129I、T059R/S066Q/S129I、F130I/M138L/E152H/T179P、F130I/T179P、T263W/A273H/S285W、S016L/D220E/S265W、S066Q/S129Q、V190I/D220E/S265Q、T059R/S066Q/S129V、D220E/S265N、V190L/D220E、D220E/S265W、V190I/D220P、V190L/D220E/S265N、L044Q/T263W/S285R、S265P/L282M/Q286P/A289R、F130L/M138L/E152H/T179P、T263W/S285R、L282M/Q286R/A289R、T263W/S285W、 F130I/E152H/T179P、V190I/D220E/S265N、V190L/D220E/S265W、V190I/D220P/S265Q、T059R/S066N/S129V、V190L/D220E/S265Q、E152H/T179P、F130L/M138L/E152F/T179P、Q062H/S066Q/S129Q、T059R/S129V、V190I/D220E/S265W/L282F、V190I/S265Q、F130L/E152F/T179P、D220E/S265Q、E152W/T179P、T059K/S066Q/S129Q、F130L/M138L/T179P、F130I/M138L/E152F/T179P、F130L/M138L/E152W/T179P、N050Y/T059W/S066Q/S129V、S265P/L282M/Q286K、T059R/S129I、F130V/E152H/T179P、D220P/S265N、S265P/L282M/Q286P、F130I/E152H、T059R/S066Q/N092S/S129I、F130L/T179P、G99D/S265P/L282F/Q286K/A289R、T263W/A273H、V190I/S265N、D220P/S265W、F130L/E152W、F130L/M138L/E152H、S265P/L282M、V190I/S265Q、F130L/E152F、T059K/S129Q、Q286R/A289R、M138L/E152W/T179P、F130I/M138L/E152H、D220P/S265Q、V190L/S265N、F130I/M138L/E152W、S265P/Q286K、V190L/S265Q、V190I/S265W、F130L/M138L/E152F、F130V/E152H、E152F/T179P、N050Y/T059W/S066N/S129V、T059R/S066N/S129Q、F130I/E152W、F130V/E152W、T059R/S066Q/S129Q、T263H/A273H/S285P、N90S/A273H/S285P、V190L/D220E/S265N/V291I、T059R/S129Q、A273H/S285P、F130I/M138L/E152W/T179P、 F130V/M138L/E152F、N050Y/T059R/S129Q、T059W/S066Q/S129I、F130V/M138L/T179P、F130V/M138L/E152W/T179P、V190L/S265W、F130V/M138L/E152W、T059W/S066Q/S129V、V190I/S265Q、F130V/M138L/E152H、F130I/E152F、N157Y/T263W/A273H/S285R、T263H/S285W、M138L/E152F/T179P、A115V/V190L/S265W、M138L/E152M、T263H/A273H/S285W、F130L/M138L/E152W、T059K/S066N/K088E、F130I/M138L/E152F、F130I/M138L/T179P、T004V/S023N、T059K/S066Q/V102A/S129Q、F130L/M138L、N047K/N050F/T054K、T263H/A273H/S285R、F130L/M138L/E152W/T179P/Q286H、M138L/E152H、M138L/S066Q、L282M/Q286R/A289R/P162S、L282F/Q286R/A289R、Q062K/S066Q/S129I、A273H/S285R、S265P/L282F/Q286P、S265P/L282F/Q286P/A289R、S265P/L282M/Q286R/A289R/T202S/K203N、T059W/S066N/S129I、V190I/S265L、T059W/S066N/S129V、F130I/M138L、L282M/Q286K/A289R/I253V、R047K/N050F/T054K、M138L/E152F、N050W/T054K、L198I/D220E/S265Q、L282F/Q286K/A289R、N050F/T054K、L282M/Q286R、M138L/E152W、S265P/L282F、F130V/E152F、T059W/S066N/S129Q、F130V/M138L、T263H/A273H、L282M/Q286K/A289R、N046Q/N050W/T054H/A142T、 T059W/S066Q/S129Q、S265P/L282F/A289R/T065S、N050F/T054H、S129Q/L282H、L282M/Q286K/A289R/S132T、L282M/Q286R/A289R/K11N、T059K/S066N、R047K/N050W/T054K、T059K/S066Q、T004V/S023Y、T059W/S066N/S129V/S290R、N050Y/T059K/S066Q、以及R047K/N050Y。
  6. 一種核苷酸序列，其編碼如申請專利範圍第1至5項中任一項的分離的中性金屬蛋白酶變異物。
  7. 一種表現載體，其包括如申請專利範圍第6項之核苷酸序列。
  8. 一種宿主細胞，其包括如申請專利範圍第7項的表現載體。
  9. 一種製造具有中性金屬蛋白酶活性之酵素的方法，其包括將如申請專利範圍第8項的宿主細胞在適合於製造該中性金屬蛋白酶變異物的條件下培養。
  10. 如申請專利範圍第9項之方法，其更包括回收所製造的中性金屬蛋白酶變異物之步驟。
  11. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該宿主細胞是桿菌屬物種。
  12. 一種包括如申請專利範圍第1至5項中任一項的中性金屬蛋白酶變異物之組成物，其中該組成物更包括至少一種鈣及/或鋅離子。
  13. 一種包括如申請專利範圍第1至5項中任一項的中性金屬蛋白酶變異物之組成物，其中該組成物更包括至少一種穩 定劑。
  14. 如申請專利範圍第13項之組成物，其中該穩定劑係選自由硼砂、甘油、鋅離子、鈣離子以及甲酸鈣所組成的族群中。
  15. 如申請專利範圍第13項之組成物，其中該穩定劑是至少一種競爭型抑制劑，其可在陰離子界面活性劑的存在下穩定該至少一種中性金屬蛋白酶變異物。
  16. 一種清潔組成物，其包括如申請專利範圍第1至5項中任一項之中性金屬蛋白酶變異物。
  17. 如申請專利範圍第16項之清潔組成物，其中該清潔組成物是洗滌劑。
  18. 如申請專利範圍第16項之清潔組成物，其更包括至少一種其他的酵素或酵素衍生物，其係選自蛋白酶、澱粉酶、脂酶、甘露聚醣酶、果膠酶、角質酶、氧化還原酶、半纖維素酶以及纖維素酶。
  19. 如申請專利範圍第17項之清潔組成物，其中該組成物包括至少約0.0001重量%的該中性金屬蛋白酶變異物。
  20. 如申請專利範圍第19項之清潔組成物，其中該組成物包括約0.001至約0.5重量%的該中性金屬蛋白酶變異物。
  21. 如申請專利範圍第19項之清潔組成物，其中該組成物更包括至少一種附屬成分。
  22. 如申請專利範圍第16項之清潔組成物，其更包括足夠量的pH修飾劑，以提供該組成物從約3至約5的pH，該組成物基本上是不含在從約pH 3至約pH 5的pH下可水解的物質。
  23. 如申請專利範圍第22項之清潔組成物，其中該在從約 pH 3至約pH 5的pH下可水解的物質包括至少一種界面活性劑。
  24. 如申請專利範圍第23項之清潔組成物，其中該界面活性劑為含有氧化乙烯分子部分的烷基硫酸鈉界面活性劑。
  25. 如申請專利範圍第16項之清潔組成物，其中該組成物是液體。
  26. 如申請專利範圍第16項之清潔組成物，其更包括至少一種酸穩定的酵素。
  27. 一種清潔方法，其包括將含有織物的表面及/或物體與如申請專利範圍第16項之清潔組成物接觸的步驟。
  28. 如申請專利範圍第27項之方法，其更包括在該表面或物質與該清潔組成物接觸之後潤洗該表面及/或物質的步驟。
  29. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該含有織物的表面及/或物體包括草汁污斑，以及該接觸的步驟包括該草汁污斑與該清潔組成物接觸。
  30. 一種動物飼料組成物，其包括如申請專利範圍第1至5項中任一項之分離的中性金屬蛋白酶變異物。
  31. 一種紡織品加工組成物，其包括如申請專利範圍第1至5項中任一項之分離的中性金屬蛋白酶變異物。
  32. 一種皮革加工組成物，其包括如申請專利範圍第1至5項中任一項之分離的中性金屬蛋白酶變異物。
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