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CN107075489A - 脂环酸芽孢杆菌变体以及编码它们的多核苷酸 - Google Patents

脂环酸芽孢杆菌变体以及编码它们的多核苷酸 Download PDF

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CN107075489A
CN107075489A CN201580059787.1A CN201580059787A CN107075489A CN 107075489 A CN107075489 A CN 107075489A CN 201580059787 A CN201580059787 A CN 201580059787A CN 107075489 A CN107075489 A CN 107075489A
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CN
China
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seq
amylase
variant
alpha
polypeptide
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Application number
CN201580059787.1A
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C.安德森
I.达玛格
A.芒克
T.霍夫
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Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
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Publication date
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Abstract

本发明涉及α‑淀粉酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

脂环酸芽孢杆菌变体以及编码它们的多核苷酸
序列表的引用
本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及脂环酸芽孢杆菌变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。
相关技术描述
α-淀粉酶多年来一直用于衣物洗涤，其中熟知的是α-淀粉酶在去除含淀粉污渍中具有有益的效果。
WO 95/26397披露了在30℃-60℃范围内的温度下测量时具有良好洗涤性能的碱性芽孢杆菌淀粉酶。
WO 00/60060和WO 00/60058披露了具有良好洗涤性能的另外的细菌α-淀粉酶。
在最近几年一直存在降低衣物洗涤温度以便减少能量消耗的需求。降低衣物洗涤温度常常意味着洗涤剂组合物和酶的性能被降低，并且因此在低温获得较低的洗涤性能。因此希望发现在低温具有良好洗涤性能的新的α-淀粉酶。因此，本发明的一个目的是提供在低温，例如在15℃具有良好洗涤性能的α-淀粉酶。另一个目的是提供与上述已知α-淀粉酶(例如，披露为WO00/60060中的SEQ ID NO:2的α-淀粉酶)相比，在标准洗涤剂J(参见下文)中具有改进的洗涤性能的α-淀粉酶。
发明内容
本发明提供了具有α-淀粉酶活性的变体和编码这些多肽的多核苷酸。还提供了获得它们的方法。
因此，本发明涉及α-淀粉酶变体，其包含在对应于根据SEQ ID NO:3的多肽的位置109、51、201、269、294、297、298、193和314的一个或多个位置的取代，其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中所述亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少89％，例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％序列一致性。
本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
本发明还涉及包括这些变体的组合物。特别地，在此披露了洗涤剂组合物。
本发明还涉及根据本发明的变体在清洁过程，例如衣物洗涤和硬表面清洁中的用途。
本发明还提供了获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，其中该方法包括以下步骤：在对应于根据SEQ ID NO:3的多肽的位置109、51、201、269、294、297、298、193和314的一个或多个位置引入取代，其中该变体与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少99％、但小于100％序列一致性，其中该变体具有α-淀粉酶活性；并且回收所述变体。
附图简述
图1示出了SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:11的氨基酸序列的序列的比对。
定义
α-淀粉酶：如在此使用的术语“α-淀粉酶”是指具有α-淀粉酶活性的酶(EC3.2.1.1)，其水解大的α连接的多糖(如淀粉和糖原)的α键，产生葡萄糖和麦芽糖。术语“α-淀粉酶”和“淀粉酶”可以互换地使用并且构成本发明范围内的相同含义和目的。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序测定α-淀粉酶活性。在一方面，本发明的变体具有SEQ IDNO:3的多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。该α-淀粉酶活性可以根据使用淀粉酶底物的方法确定，其描述在“Amylazyme活性测定”一节中。
等位变体(allelic variant)：如在此使用的术语“等位变体”是指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽方面无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：如在此使用的术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺少可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：如在此使用的术语“编码序列”是指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：如在此使用的术语“控制序列”是指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这些调控序列包括但不局限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：如在此使用的术语“表达”是指涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：如在此使用的术语“表达载体”是指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
片段：如在此使用的术语“片段”是指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，一个片段包含SEQ ID NO:3的至少85％的氨基酸残基，SEQ ID NO:3的至少90％的氨基酸残基，或SEQID NO:3的至少95％的氨基酸残基。
高严格条件：如在此使用的术语“高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：如在此使用的术语“宿主细胞”，是指对于用包括本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
改进的特性：如在此使用的术语“改进的特性”是指与变体相关的与亲本相比得到改进的特征。这种改进的特性包括但不限于性能，例如洗涤性能、稳定性，例如在储存条件下的稳定性。
分离的：如在此使用的术语“分离的”是指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
低严格条件：如在此使用的术语“低严格条件”是指探针长度为至少100个核苷酸，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：如在此使用的术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。还考虑在术语“成熟多肽”内的是多肽的信号肽已被切除，例如在表达多肽的细胞内的自然成熟过程期间。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:3的氨基酸序列。本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
多核苷酸编码序列：如在此使用的术语“多核苷酸编码序列”是指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，该多核苷酸编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸。
中严格条件：如在此使用的术语“中严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
中高严格条件：如在此使用的术语“中高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
突变体：如在此使用的术语“突变体”是指编码变体的多核苷酸。因此，术语“突变体”和“变体”可以互换地使用并且构成本发明内的相同含义和目的。
核酸构建体：如在此使用的术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
可操作地连接：如在此使用的术语“可操作地连接”是指以下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”可以在本文中互换地使用，两者是指进行改变以产生本发明的酶变体的α-淀粉酶。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
出于本发明的目的，可以使用本领域熟知的程序Vector确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。另一个熟知的程序是ClustalW程序。因此，可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic Acids Research)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
还可以使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔(Needle)输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
还可以使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔(Needle)输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列：如在此使用的术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。
酶洗涤益处：在此使用的术语“酶洗涤益处”是指将一种酶添加至洗涤剂中与不具有该酶的同一洗涤剂相比的有利效果。可能由酶提供的重要去污益处是污渍去除伴随在洗涤和/或清洁之后无可见污物或污物非常少、阻止或减少在洗涤过程中释放的污物再沉积(一种又称作抗再沉积的作用)、完全或部分地恢复纺织品的白度(一种又称作增白的作用)，其中所述纺织品最初是白色的，但是在反复使用和洗涤后获得淡灰或淡黄色外观。不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一织物转移至另一个织物或同一织物的另一个部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改善织物柔软性，织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。
纺织品护理益处：如在此使用的术语“纺织品护理益处”被定义为不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的，“纺织品护理益处”对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一纺织品转移至另一个纺织品或同一纺织品的另一个部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改善纺织品柔软性，纺织品的颜色澄清以及去除陷在纺织品的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白种类)的形成。
餐具洗涤组合物：如在此使用的术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。因此，在一个实施例中，餐具洗涤组合物是液体餐具洗涤组合物，粉末餐具洗涤组合物，其中组合物可任选地是单位剂量的形式。
硬表面清洁：如在此使用的术语“硬表面清洁”是指清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、用餐工具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
改进的洗涤性能：如在此使用的术语“改进的洗涤性能”是指相对于本领域已知的α-淀粉酶的洗涤性能，本发明的α-淀粉酶的洗涤性能的改进。改进的洗涤性能可以通过比较所谓的强度值来测量。该改进的洗涤性能是根据“使用自动机械应力测定的α-淀粉酶的洗涤性能”部分中并且使用标准洗涤剂J在15℃下确定的。可以使用其他标准洗涤剂，例如标准洗涤剂A、标准洗涤剂X或标准洗涤剂T。
洗涤性能：如在此使用的术语“洗涤性能”是指，在例如衣物或硬表面清洁(如餐具洗涤)期间去除存在于待清洁的物体上的淀粉或含淀粉污渍的酶的能力。术语“洗涤性能”包括通常清洁例如硬表面清洁，如在餐具洗涤中，但还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括工业清洁和机构清洁。该洗涤性能可以通过计算所谓的强度值来量化。可以如在在此的方法部分中所描述的来确定洗涤性能。
低温：如在此使用的术语“低温”是指5℃-40℃，例如5℃-35℃，优选5℃-30℃，更优选5℃-25℃，更优选5℃-20℃，最优选5℃-15℃，并且特别是5℃-10℃的温度。在一个优选实施例中，“低温”是10℃-35℃，优选10℃-30℃，更优选10℃-25℃，最优选10℃-20℃，并且特别是10℃-15℃的温度。最优选的，低温意指15℃。
强度值：洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能，其中更高的强度值与更高的洗涤性能相关。使用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart，柯达(Kodak))进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：
变体：术语“变体”意指与“亲本”相比，在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸置换占用一个位置的氨基酸。缺失意指去除占据位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1至5个氨基酸)。氨基酸取代可以把天然氨基酸换成另一种天然存在的氨基酸，或换成非天然存在的氨基酸衍生物。本发明的变体具有SEQ ID NO:3的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。
野生型α-淀粉酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物，如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌来表达的α-淀粉酶。
变体命名规则
出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:3中披露的多肽来确定另一种α-淀粉酶中的相应氨基酸残基。另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:3中披露的多肽比对，并且基于该比对，确定对应于SEQ ID NO:3中披露的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号。特别地，图1示出了在此包括的SEQID NO:3和SEQ ID NO:11的比对。因此，除非另有明确说明，在此所述的氨基酸位置根据SEQ ID NO:3编号，并且可能需要比对以确定其他多肽中相应的氨基酸位置。
因此，另一种α-淀粉酶中相对应的氨基酸残基的鉴别可以通过使用若干计算机程序使用其对应的缺省参数比对多个多肽序列来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多序列比较；3.5版或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic Acids Research)32:1792-1797)；MAFFT(6.857版或更新版本；加藤(Katoh)和库玛(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和朝都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和朝都，2010，生物信息学26:_1899-1900)；以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83版或更新版本；汤普森等人，1994，核酸研究22:4673-4680)。
当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，可获取若干工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(Protein Engineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于引用方便。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。可替代地，可以用“/”、“，”或“”(即空格)分开多个取代，并且构成相同含义和目的。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。可替代地，可以用“/”、“，”或“”(即空格)分开多个缺失，并且构成相同含义和目的。
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入氨基酸#1、插入氨基酸#2；等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变。包括多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变。可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
可以用“/”、“，”或“”(即空格)分开不同改变，并且构成相同含义和目的。因此，在位置226的苏氨酸被丙氨酸或赖氨酸或缬氨酸取代表示为“Thr226Ala/Lys/Val”或者“T226A/K/V”。
发明详述
在一方面，与亲本α-淀粉酶的多肽相比，本发明涉及具有改进的性能，特别是衣物洗涤和/或餐具洗涤中改进的洗涤性能的变体。因此，在一个实施例中，与亲本α-淀粉酶的多肽相比，该α-淀粉酶变体具有改进的性能，特别是衣物洗涤和/或餐具洗涤中改进的洗涤性能。
因此，在一方面，本发明涉及α-淀粉酶变体，其包含在对应于根据SEQ ID NO:3的多肽的位置109、51、201、269、294、297、298、193和314的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有α-淀粉酶活性，并且其中所述亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少89％，例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％序列一致性。
如在此使用的术语“变体”是指在特定氨基酸位置处已经改变的多肽，因此其包括与亲本多肽不同的氨基酸序列。
如在此使用的术语“亲本多肽”或“亲本α-淀粉酶”是指与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。因此，在一个实施例中，该亲本多肽与SEQ ID NO:3的多肽具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。因此，在一个实施例中，该亲本多肽与SEQ ID NO:13的多肽具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。当涉及SEQ ID NO:3时，根据SEQ ID NO:3或13的亲本多肽可以包括不是位置51、109、193、201、269、294、298和314的位置的改变。即当亲本α-淀粉酶是与SEQ ID NO:13具有至少89％序列一致性并且是根据SEQ ID NO:13编号的多肽时，该亲本α-淀粉酶可以包括不是位置51、109、195、203、271、296和316的位置的改变。在一个实施例中，该亲本多肽是如下述的多肽，当涉及SEQ ID NO:3时，该多肽在至少氨基酸位置51、109、193、201、269、294、297、289和314分别具有氨基酸Q、M、N、G、T、M、Q、A、和N。因此，如涉及本发明使用的亲本多肽的氨基酸位置至少具有以下氨基酸；Q51、M109、N193、G201、T269、M294、Q297、A298、和N314。在另一个实施例中，该亲本多肽与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，但其中当涉及SEQ ID NO:3时，在位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314的氨基酸分别是氨基酸Q、M、N、G、T、M、Q、A、和N。
本发明的亲本多肽不限于SEQ ID NO:3的多肽，而是也可以指其他已知的α-淀粉酶序列，例如SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12或13陈述的序列。技术人员知道如何将SEQ IDNO:6、7、8、9、10、11、12或13中的任何一个与在此所述的SEQ ID NO:3进行比对，以确定根据本发明的变体的哪个位置对应于比对的序列。
术语“α-淀粉酶”意指如在此所述的具有α-淀粉酶活性的酶(EC3.2.1.1)，其有助于除去含淀粉的污渍，例如来自面食和马铃薯的那些。本发明的α-淀粉酶变体通常由具有结构域A和B之间的催化位点的三个结构域(A，B和C)组成。
如在此使用的术语“多肽”是指经由肽(酰胺)键即长的、连续的和未分支的肽链彼此连接的氨基酸的序列。定义一个多肽在技术人员的知识范围内。
如在此使用的术语“具有α-淀粉酶活性”是指在用于α-淀粉酶活性的测定测试中可以示出具有活性的多肽。例如测定可以是Amylazyme活性测定。因此，在一个实施例中，通过以下方法确定α-淀粉酶活性，该方法包括以下步骤：(i)将多肽与染色的直链淀粉底物一起孵育，并且(ii)测量多肽的淀粉酶活性。在另外的实施例中，通过以下方法确定α-淀粉酶活性，该方法包括以下步骤：(i)添加待测试的多肽至包含AZCL-直链淀粉、乳糖、硬脂酸镁和组合物中共价结合的蓝色染料的组合物；并且(ii)测量在590nm处降解时释放的染料的浓度。除非另有明确说明，术语“本发明的多肽”或仅是“多肽”应理解为“根据本发明的具有α-淀粉酶活性的多肽”。
当与亲本α-淀粉酶相比时，根据本发明的变体具有改进的性能，例如洗涤性能。此外，当与亲本α-淀粉酶相比时，变体还可以具有改进的稳定性，例如储存稳定性。在具体实施例中，这些变体与亲本α-淀粉酶相比具有相似的稳定性，但具有改进的性能。
在一个实施例中，该变体是一种亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：
a.与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少89％序列一致性的一种多肽；
b.由在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多核苷酸编码序列、或者(ii)(i)的全长补体杂交的多核苷酸编码的一种多肽；
c.一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1的成熟多核苷酸编码序列具有至少89％序列一致性的多核苷酸编码；以及
d.SEQ ID NO:3或13的多肽的一个片段，该片段具有α-淀粉酶活性。
如在此使用的术语“序列一致性”与如本文别处所述的具有相同的含义和目的。此外，确定多肽连同多核苷酸的序列一致性在技术人员的知识范围内。
如在此使用的术语“杂交”是指在核酸的两个或多个互补链之间建立中非共价的序列特异性相互作用成为复合物的过程。技术人员会知道如何识别互补序列的杂交。
如在此使用的术语“低严格条件”具有与本文别处所述的相同的含义和目的。
如在此使用的术语“全长”是指在序列表中随附的任何序列中提供的多肽的序列的完整序列。也可以考虑其他全长序列作为这种定义的一部分。确定例如核苷酸序列的全长在技术人员的知识范围内。
在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1的多核苷酸具有至少67％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
在另一个实施例中，由以下多核苷酸编码亲本α-淀粉酶，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的多核苷酸编码序列、或(ii)(i)的全长补体杂交。
在又另一个实施例中，亲本α-淀粉酶由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的多肽编码序列具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
在又另一个实施例中，亲本α-淀粉酶由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:13的多肽编码序列具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
在又另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:1的成熟多核苷酸或由其组成。
在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:3的多肽的片段，其中该片段具有α-淀粉酶活性。
在一个实施例中，亲本α-淀粉酶中改变的总数在3和40之间，优选在3和30之间，更优选在3和20之间，甚至更优选在3和15之间，最优选在3和10个改变之间，例如取代。在一个实施例中，亲本α-淀粉酶中的总改变数为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个改变，例如取代。
变体
在本发明的一方面，根据本发明的变体与根据SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少67％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性的序列一致性。
在一个实施例中，该变体与根据SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少67％、例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性的序列一致性。
在一个实施例中，该变体由400至490，如410至490，如420至490，如440至486个氨基酸组成。
在一个实施例中，本发明的这些变体中的取代的数目是1至40个，例如1至30、例如1至20、例如1至10和1至5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个取代。在一个具体实施例中，根据前述的权利要求的任一项的变体，其中取代的数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个改变。
在另一个实施例中，本发明的变体包括另外的改变。这种改变可能是插入或缺失。插入意指与占据一个位置的氨基酸相邻来添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸，例如1至5个氨基酸。缺失意指在一个多肽中缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸，例如，1至5个氨基酸。术语“改变”与如本文别处所述的具有相同的含义和目的。
在一个实施例中，与SEQ ID NO:2的多肽或SEQ ID NO:3或13的多肽相比，α-淀粉酶变体具有改进的性能，特别是衣物洗涤和/或餐具洗涤中的改进的洗涤性能。
因此，在一个实施例中，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置109、51、201、269、294、297、298、193和314的任意一个的一个位置处的取代。
在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ IDNO:3或13的氨基酸序列的α-淀粉酶。
在一个实施例中，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51的位置处的取代。在一个实施例中，该取代是Q51X，其中X可以是选自下组的任一种氨基酸，该组由以下各项组成：T、A、R、N、D、C、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y、和V。因此，在一个实施例中，该取代是Q51T、Q51A、Q51R、Q51N、Q51D、Q51C、Q51E、Q51E、Q51H、Q51I、Q51L、Q51L、Q51K、Q51M、Q51F、Q51P、Q51S、Q51W、Q51Y、或Q51V。在一个具体实施例中，该取代是Q51T。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代Q51T或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是Q51D。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代Q51D或由其组成。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代Q51T或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是Q51D。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代Q51D或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置109的位置处的取代。在一个实施例中，该取代是M109X，其中X可以是选自下组的任一种氨基酸，该组由以下各项组成：G、A、R、N、D、C、E、Q、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、和V。因此，在一个实施例中，该取代是M109G、M109A、M109R、M109N、M109D、M109C、M109E、M109Q、M109H、M109I、M109L、M109K、M109F、M109P、M109S、M109T、M109Y、或M109V。在一个具体实施例中，该取代是M109G。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代M109G或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是M109A。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代M109A或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是M109G。因此，在一个实施例中，该变体包括取代M109H或由其组成。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代M109H或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是M109L。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代M109L或由其组成。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQID NO:13的多肽的取代M109G或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是M109A。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代M109A或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是M109G。因此，在一个实施例中，该变体包括取代M109H或由其组成。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代M109H或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是M109L。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代M109L或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置193的位置处的取代。在一个实施例中，该取代是N193X，其中X可以是选自下组的任何氨基酸，该组由以下各项组成：F、A、R、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、Y、和V。因此，在一个实施例中，该取代是N193F、N193A、N193R、N193D、N193C、N193E、N193Q、N193G、N193H、N193I、N193L、N193K、N193M、N193P、N193S、N193T、N193W、N193Y、或N193V。在另一个具体实施例中，该取代是N193F。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N193F或由其组成。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代N193F或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置201的位置处的取代。在一个实施例中，该取代是G201X，其中X可以是选自下组的任何氨基酸，该组由以下各项组成：Y、A、R、D、C、E、Q、H、I、L、K、M、N、P、S、T、W、Y、和V。因此，在一个实施例中，该取代是G201Y、G201A、G201R、G201D、G201C、G201E、G201Q、G201H、G201I、G201L、G201K、G201M、G201N、G201P、G201S、G201T、G201W、G201Y、或G201V。在另一个具体实施例中，该取代是G201Y。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代G201Y或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是G201F。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代G201F或由其组成。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代G201Y或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是G201F。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代G201F或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置269的位置处的取代。在一个实施例中，该取代是T269X，其中X可以是选自下组的任何氨基酸，该组由以下各项组成：N、A、R、D、C、E、G、F、Q、H、I、L、K、M、P、S、W、Y、和V。因此，在一个实施例中，该取代是T269N、T269A、T269R、T269D、T269C、T269E、T269G、T269F、T269Q、T269H、T269I、T269L、T269K、T269M、T269P、T269S、T269W、T269Y、或T269V。另一个具体实施例中，该取代是T269N。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代T269N或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是T269Y。因此，在一个实施例中，变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代T269Y或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是T269G。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代T269G或由其组成。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQID NO:13的多肽的取代T269N或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是T269Y。因此，在一个实施例中，变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代T269Y或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是T269G。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代T269G或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置294的位置处的取代。在一个实施例中，该取代是M294X，其中X可以是选自下组的任何氨基酸，该组由以下各项组成：Y、A、R、D、C、E、Q、G、F、H、I、L、K、N、P、S、T、W、和V。因此，在一个实施例中，该取代为M294G、M294A、M294R、M294N、M294D、M294C、M294E、M294Q、M294H、M294I、M294L、M294K、M294F、M294P、M294S、M294T、M294Y、或M294V。在另一个具体实施例中，该取代是M294Y。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代M294Y或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是M294N。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代M294N或由其组成。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代M294Y或由其组成。在另一个具体实施例中，该取代是M294N。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ IDNO:13的多肽的取代M294N或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置297的位置处的取代。在一个实施例中，该取代是Q297X，其中X可以是选自下组的任何氨基酸，该组由以下各项组成：Y、A、R、N、D、C、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、和V。因此，在一个实施例中，该取代是Q297T、Q297A、Q297R、Q297N、Q297D、Q297C、Q297E、Q297E、Q297H、Q297I、Q297L、Q297L、Q297K、Q297M、Q297F、Q297P、Q297S、Q297W、Q297Y、或Q297V。在一个具体实施例中，该取代是Q297Y。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代Q297Y或由其组成。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代Q297Y或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置298的位置处的取代。在一个实施例中，该取代是A298X，其中X可以是选自下组的任何氨基酸，该组由以下各项组成：N、R、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、和V。因此，在一个实施例中，该取代是A298N、A298R、A298D、A298C、A298E、A298Q、A298G、A298H、A298I、A298L、A298K、A298M、A298F、A298P、A298S、A298T、A298W、A298Y、或A298V。在另一个具体实施例中，该取代是A298N。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代A298N或由其组成。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代A298N或由其组成。
在一个实施例中，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置314的位置处的取代。在一个实施例中，该取代是N314X，其中X可以是选自下组的任何氨基酸，该组由以下各项组成：G、A、R、D、C、E、Q、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、和V。因此，在一个实施例中，该取代是N314F、N314A、N314R、N314D、N314C、N314E、N314Q、N314G、N314H、N314I、N314L、N314K、N314M、N314P、N314S、N314T、N314W、N314Y、或N314V。在另一个具体实施例中，该取代是N314G。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:3的多肽的取代N314G或由其组成。因此，在一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:13的多肽的取代N314G或由其组成。
在一个实施例中，该α-淀粉酶变体包括表1中的这些取代中的一个或多个或由其组成，其中每个位置都对应于SEQ ID NO:3的多肽的相应位置。
表1：α-淀粉酶变体
Q51T
M109G
N193F
G201Y
T269N
M294Y
Q297Y
A298N
N314G
在本发明的一个优选的实施例中，该变体是一种多肽，该多肽具有根据本发明的所述取代，并且具有与SEQ ID NO:3至少67％的一致的氨基酸序列。因此，在一个实施例中，α-淀粉酶变体包括取代Q51T或由其组成，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性的多肽。
在一个实施例中，α-淀粉酶变体包括取代M109G或由其组成，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性的多肽。
在一个实施例中，α-淀粉酶变体包括取代N193F或由其组成，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性的多肽。
在一个实施例中，α-淀粉酶变体包括取代G201Y或由其组成，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性的多肽。
在一个实施例中，α-淀粉酶变体包括取代T269N或由其组成，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性的多肽。
在一个实施例中，α-淀粉酶变体包括取代M294Y或由其组成，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性的多肽。
在一个实施例中，α-淀粉酶变体包括取代Q297Y或由其组成，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性的多肽。
在一个实施例中，α-淀粉酶变体包括取代A298N或由其组成，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性的多肽。
在一个实施例中，α-淀粉酶变体包括取代N314G或由其组成，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％序列一致性的多肽。
因此，在一个实施例中，该取代选自以下列表，该列表由以下各项组成：
i.Q51T、Q51A、Q51R、Q51N、Q51D、Q51C、Q51E、Q51G、Q51H、Q51I、Q51L、Q51K、Q51M、Q51F、Q51P、Q51S、Q51W、Q51Y或Q51V；
ii.M109G、M109A、M109H、M109L、M109R、M109N、M109D、M109C、M109E、M109Q、M109I、M109K、M109F、M109P、M109S、M109T、M109W、M109Y、或M109V；
iii.N193F、N193A、N193R、N193D、N193C、N915E、N193Q、N193G、N193H、N193I、N193L、N193K、N193M、N193P、N193S、N193T、N193W、N193Y、或N193V；
iv.G201Y、G201A、G201R、G201D、G201C、G201E、G201Q、G201H、G201I、G201L、G201K、G201M、G201N、G201P、G201S、G201T、G201W、G201Y、或G201V；
v.T269N、T269Y、T269G、T269A、T269R、T269D、T269C、T269E、T269F、T269Q、T269H、T269I、T269L、T269K、T269M、T269P、T269S、T269W、或T269V；
vi.M294Y、M294N、M294A、M294R、M294D、M294C、M294E、M294Q、M294G、M294F、M294H、M294I、M294L、M294K、M294P、M294S、M294T、M294W、或M294V；
vii.Q297Y、Q297A、Q297R、Q297N、Q297D、Q297C、Q297E、Q297G、Q297H、Q297I、Q297L、Q297K、Q297M、Q297F、Q297P、Q297S、Q297T、Q297W、或Q297V；
viii.A298N、A298R、A298D、A298C、A298E、A298Q、A298G、A298H、A298I、A298L、A298K、A298M、A298F、A298P、A298S、A298T、A298W、A298Y、或A298V；或
ix.N314G、N314A、N314R、N314D、N314C、N314E、N314Q、N314H、N314I、N314L、N314K、N314M、N314F、N314P、N314S、N314T、N314W、N314Y或N314V，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽中的相应位置。
在另一方面，本发明涉及包括在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置109、51、201、269、294、297、298、193和314中的任一位置的两个位置处的取代的变体。每个氨基酸位置的取代被认为是本文别处描述的那些中的任一个。
因此，本发明还涉及包括对应于表2中成对列出的成对的那些的两个位置的取代的α-淀粉酶变体，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽或SEQ ID NO:3或13的多肽的相应位置。
表2：α-淀粉酶变体
Q51+M109 Q51+N193 Q51+G201
Q51+T269 Q51+M294 Q51+Q297
Q51+A298 Q51+N314 M109+N193
M109+G201 M109+T269 M109+M294
M109+Q297 M109+A298 M109+N314
N193+G201 N193+T269 N193+M294
N193+Q297 N193+A298 N193+N314
T269+M294 T269+Q297 T269+A298
T269+N314 M294+Q297 M294+A298
M294+N314 Q297+A298 Q297+N314
A298+N314
组合两个位置可进一步增强变体的改进性能。因此，在一个实施例中，本发明的α-淀粉酶变体包括表3中列出的特定成对氨基酸取代，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽或SEQ ID NO:3的多肽的位置。
表3：α-淀粉酶变体
Q51T+M109G Q51T+N193F Q51T+G201Y
Q51T+T269N Q51T+M294Y Q51T+Q297Y
Q51T+A298N Q51T+N314G M109G+N193F
M109G+G201Y M109G+T269N M109G+M294Y
M109G+Q297Y M109G+A298N M109G+N314G
N193F+G201Y N193F+T269N N193F+M294Y
N193F+Q297Y N193F+A298N N193F+N314G
T269N+M294Y T269N+Q297Y T269N+A298N
T269N+N314G M294Y+Q297Y M294Y+A298N
M294Y+N314G Q297Y+A298N Q297Y+N314G
A298N+N314G
在一个具体实施例中，该变体包括选自以下列表的取代，所述列表由以下各项组成：Q51T、Q51D、M109G、M109G、M109H、M109L、N193F、G201Y、G201F、T269N、T269Y、T269G、M294Y、M294N、Q297Y、A298N、和N314G，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽的相应位置。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置51和109的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置51和193的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置51和269的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置51和294的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置51和297的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置51和298的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置51和314的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置109和193的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置109和269的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置109和294的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置109和297的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置109和298的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置109和314的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置193和269的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置193和294的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置193和297的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置193和298的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置193和314的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置269和294的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置269和297的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在相应位置269和298的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置269和314的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置294和297的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置294和298的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置294和314的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置297和298的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置297和314的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该变体包括在对应于位置298和314的位置处的取代或由其组成，例如上文描述的那些，其中该位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在另一个实施例中，该α-淀粉酶变体包括对应于表4中列出的那些的三个位置的氨基酸取代，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽的相应位置。因此，在一个实施例中，该α-淀粉酶变体包括每个都选自以下列表的三个位置的取代或由其组成，该列表由以下各项组成：51、109、193、201、269、294、297、298、和314，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽的相应位置。在一个实施例中，该α-淀粉酶变体包括每个都选自以下列表的三个位置的取代或由其组成，该列表由以下各项组成：51、109、193、201、269、294、297、298、和314，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ IDNO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在一个具体实施例中，该变体在与以下位置相对应的每个位置处包括取代；
(i)51和109；
(ii)109和201；
(iii)269和294；或
(iv)294和297；
其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽中的相应位置。
在一个具体实施例中，所述变体包括以下取代；
(i)Q51T和M109G；
(ii)M109G和G201Y；
(iii)M109G和G201F
(iv)T269N和M294Y；
(v)T269N和M294F；
(vi)T269Y和M294N；或
(vii)M294Y和Q297Y；
其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽中的相应位置。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置109、51、201、269、294、297、298、193、和314中的任一个的三个位置处包括取代。在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:13的多肽的位置109、51、203、271、296、299、300、195、和316中的任一个的三个位置处包括取代。
表4：α-淀粉酶变体
在一个实施例中，本发明的α-淀粉酶变体包括表5中列出的氨基酸取代或由其组成。因此，在一个实施例中，该α-淀粉酶变体包括以下氨基酸取代中的三个或由其组成，这些取代独立地选自以下列表，该列表由以下各项组成：Q51T、Q51D、M109G、M109G、M109H、M109L、N193F、G201Y、G201F、T269N、T269Y、T269G、M294Y、M294N、Q297Y、A298N、和N314G，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置。在一个实施例中，该α-淀粉酶变体包括以下氨基酸取代中的三个或由其组成，这些取代独立地选自以下列表，该列表由以下各项组成：Q51T、Q51D、M109G、M109G、M109H、M109L、N193F、G201Y、G201F、T269N、T269Y、T269G、M294Y、M294N、Q297Y、A298N、和N314G，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
表5：α-淀粉酶变体
在另一个实施例中，本发明的α-淀粉酶变体在选自以下列表的位置中的四个或五个或六个或七个或八个包括氨基酸取代，该列表由以下各项组成：Q51T、M109G、N193F、G201Y、T269N、M294Y、Q297Y、A298N、和N314G，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置。在一个实施例中，本发明的α-淀粉酶变体在选自以下列表的位置中的四个或五个或六个或七个或八个包括氨基酸取代，该列表由以下各项组成：Q51T、M109G、N193F、G201Y、T269N、M294Y、Q297Y、A298N、和N314G，其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的相应位置，并且其中该α-淀粉酶变体是与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性的多肽。
在一个具体实施例中，该变体在与以下位置相对应的每个位置处包括取代；
(i)51、109、193、和201；
(ii)109、201、269、和294；
(iii)201、269、294和297；或
(iv)51、109、193、201、269、294、297、298、和314；
其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽中的相应位置。
在一个具体实施例中，该变体在与以下位置相对应的每个位置处包括取代；
(i)Q51T，M109G，N193F、和G201Y；
(ii)M109G，G201Y，T269N、和M294Y；
(iii)G201Y，T269N，M294Y、和Q297Y；或
(ii)Q51T，M109G，N193F，G201Y，T269N，M294Y，Q297Y，A298N、和N314G；
其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽中的相应位置。
与SEQ ID NO:3或13的亲本多肽相比，预期在此所述的每种α-淀粉酶变体可以进一步具有改进的性能，例如衣物洗涤或自动化餐具洗涤中改进的洗涤性能。
这些变体可以进一步包括在一个或多个(例如若干个)其他位置的一个或多个另外的取代。
因此，在一个实施例中，该变体进一步包括在对应于以下位置的位置处的改变：
105L、I、F+206Y；105L、I+206Y+217I；105F+206Y+208Y+217V+246V；105L+206F；105I+206Y+208Y+217I+246V；195F+213S+214T；195F+206Y+208Y+213T+214T+217M、V；195F+206Y+208F，L+213T+214T+217V；195F+206Y+213S+214T；195F+206Y+208Y+213S+214T+217M；195F+206Y+208F+213T+214T+217M；195F+206Y+208Y+213T+214T+217Q；195F+206Y+213G+214T；195F+206Y+213S；195F+206Y+208Y+213T+214T+217M；195F+213S；195F+206Y+208L+213T+214T+217M；195F+213G+214T；206Y、F+208Y+217Q；206Y+208Y+217I；206F+208Y+217M；206Y+208Y；206Y+217M；206Y+208Y+213A+217M；206Y+208Y+217V+246V；206Y+213G；206Y+208F+217V；206N+208Y+217M；206F+208Y+217V；206Y+246V；206Y+217I、V；206F+208F+217I；206Y+208L+213S；206F+217I；206Y+217I+246I；206L+217V；206Y+208F+217H；206L+208F+217I；206L+217V+246L；206F+246V；208Y+213S+217M；208Y+213A+217Q；63I+206Y；63I+206Y+241V；63V+206Y；63V+105L+206Y；63V+206Y+217I；63V+105F+206Y+208F+217I；63V+206Y+246V；63V+206F；63V+206L+217V；63V+105F+206Y；63V+206Y+241V+246L；195F+206Y+208Y+214T+217V；186E+195F+206Y；195F+206Y+208Y+213T+217V；186E+195F+202T+206Y+209S；63I+195F+206Y+210S；195F+206Y+213P+214T；195F+206Y+208Y+213T+214T+217I；186E+195F+206Y+210S；195F+213P；186E+195F+202T+206Y+210S；195F+206H；195F+208Y+213T+214T+217V；206Y+208Y+213T+214T+217V；195F+206Y+217V；195F+206Y+208Y+213S+214T；195F+206Y+208Y；195F+213I+214P；195F+206Y+208Y+213T+214T；195F+206Y；206Y+213S；182P+186E；182S+186E；182V+186K；179L+186H+190P；179L+186K、R、S+190P；179L+190P；179L+182C+186K+190P；179L+182P+186S、V+190P；179L+182S+186Q+190P；173F+174Q；173Y+174S；172K+173Y+174E；193A、D、N、S+195F；213A+214Q；213P+214L；213S+214R；48V+60V；213G+214T；213I+214P；213N+214I；213N+214Q；和213P、S+214T；其中编号是根据SEQ IDNO:11。
氨基酸改变可以具有次要性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列、抗原性表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(TheProteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定多肽中的必需氨基酸(康宁汉(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如德·沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；沃达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。
在一个实施例中，该变体包括选自以下列表中的成对缺失，该列表由以下各项组成：181和182；181和183；181和184；182和183；182和184；以及183和184；其中每个位置对应于SEQ ID NO:13的位置。
如在此使用的术语“成对缺失”是指彼此紧密邻近的两个氨基酸的双重缺失。彼此紧密接近可以是位于五个氨基酸内的两个氨基酸，例如在四个之内、例如在三个之内、例如两个，氨基酸序列中的彼此的距离。氨基酸也可以彼此相邻地定位。
在一个优选的实施例中，该多肽具有根据本发明的改变，并且具有与SEQ ID NO:13至少67％一致的氨基酸序列。因此，在一个实施例中，该多肽包括选自下组的氨基酸的成对缺失或由其组成，该组由以下各项组成：(a)181和183；(b)181和184；(c)182和183；(d)182和184；以及(e)183和184，其中该位置对应于SEQ ID NO:13的相应位置，并且其中该多肽与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体相对于SEQ ID NO:3或13的亲本α-淀粉酶具有洗涤剂组合物中的改进的稳定性。
如在此使用的术语“改进的稳定性”是指当多肽的稳定性，例如储存稳定性已经增强时。特别地，本领域熟知，多肽随时间降解。因此，稳定性的改进意味着多肽降解之前的时间，特别是直至由于降解导致多肽的活性丧失的时间延长。因此，预期与例如亲本多肽相比，本发明的多肽的改进的稳定性维持活性更长。
如在此使用的术语“洗涤剂组合物”是指本文中别处描述的定义。
在另一个实施例中，改进的稳定性是改进的储存稳定性。
在一个实施例中，通过以下方法确定改进的稳定性，该方法包括以下步骤；
a)分别在标准洗涤剂组合物(如标准A、标准J、标准T、或标准X)中孵育α-淀粉酶变体样品和亲本α-淀粉酶样品一段时间；
b)分别测量变体α-淀粉酶和亲本α-淀粉酶的活性；并且
c)计算样品的残留活性。
在另外的实施例中，通过以下方法确定改进的稳定性，该方法包括以下步骤；
a)分别在标准洗涤剂组合物(如标准A、标准J、标准T、或标准X)中，在40℃至60℃下孵育α-淀粉酶变体样品和亲本α-淀粉酶样品2至168hr；
b)分别测量变体α-淀粉酶和亲本α-淀粉酶的活性；并且
c)将样品的残留活性计算为相对于冷冻对照样品的活性平均值的样品中的活性平均值。
在另一个实施例中，本发明的变体相对于SEQ ID NO:3或13的亲本α-淀粉酶在洗涤剂组合物中具有改进的性能。
在另一个实施例中，改进的性能是改进的洗涤性能。
如在此使用的术语“改进的性能”是指当性能，例如洗涤性能已经增强时。性能可以通过从用白光照射的样品反射的光的强度来测量，即多肽去除或减少例如织物上的污渍的能力。然后可以通过技术人员的知识范围内熟知的“改进因子”量化性能。
在一个实施例中，根据方法部分中描述的AMSA来确定改进的性能。
因此，在一个实施例中，通过以下方法确定其改进的性能，该方法包括以下步骤；
a)分别添加α-淀粉酶变体和亲本α-淀粉酶样品至标准洗涤剂组合物，如标准A、标准J、标准T、或标准X，用上述组合物洗涤淀粉染色的织物；
b)测量当用白光照射时从样品反射的光的强度；并且
c)可选地，计算改进因子(IF)为α-淀粉酶样品的δ强度与亲本α-淀粉酶样品的δ强度的比率。
在一个实施例中，通过以下方法确定其改进的性能，该方法包括以下步骤：
a)分别添加α-淀粉酶变体和亲本α-淀粉酶样品至标准洗涤剂组合物，如标准A、标准J、标准T、或标准X，在15℃和30℃下用上述组合物洗涤淀粉染色的织物20分钟；
b)测量当用白光照射时从样品反射的光的强度；并且
c)可选地，计算改进因子(IF)为α-淀粉酶样品的δ强度与亲本α-淀粉酶样品的δ强度的比率。
在一个具体实施例中，本发明的变体相对于SEQ ID NO:3或13的亲本α-淀粉酶具有洗涤剂组合物中的改进的稳定性和改进的性能二者。
亲本α-淀粉酶
该亲本α-淀粉酶可以是(a)一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽或与SEQ IDNO:3或13的多肽具有至少67％序列一致性的多肽；(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多核苷酸编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；或(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少67％序列一致性的多核苷酸编码的多核苷酸。
在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少67％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，该亲本α-淀粉酶具有α-淀粉酶活性。在一个实施例中，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:3或13的多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，该亲本包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:3的多肽或由其组成。在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:13的多肽或由其组成。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶是多肽，当涉及SEQ ID NO:3时，该多肽至少在氨基酸位置51、109、193、201、269、294、297、289、和314分别具有氨基酸Q、M、N、G、T、M、Q、A、和N。因此，如涉及本发明使用的亲本多肽的氨基酸位置至少具有以下氨基酸；Q51、M109、N193、G201、T269、M294、Q297、A298、和N314。在另一个实施例中，该亲本多肽与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少67％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，但其中当涉及SEQ IDNO:3时，在位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314的氨基酸分别是氨基酸Q、M、N、G、T、M、Q、A、和N。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:3或13的多肽的片段，其包含至少430个氨基酸残基，例如至少440个、至少450个、至少460个、至少470个、至少480个氨基酸残基。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:3或13的多肽的一个等位基因变体。
在另一个实施例中，该亲本是由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与(i)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约)。
可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:3或13的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针具有至少100个核苷酸长度，例如至少200个核苷酸长度、至少300个核苷酸长度、至少400个核苷酸长度、至少500个核苷酸长度、至少600个核苷酸长度、至少700个核苷酸长度、至少800个核苷酸长度、或至少900个核苷酸长度。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其他适合的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1杂交的克隆或DNA或其子序列，在DNA印迹中使用载体材料。
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下项的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)其全长补体；或(iii)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
在一个实施例中，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个实施例中，核酸探针包括SEQ ID NO:1的至少50％的核苷酸。在另一个实施例中，核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其一个片段。
在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ IDNO:1的成熟多核苷酸编码序列具有至少60％，例如至少67％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明的多肽的N-末端或C-末端处融合。因此，该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合的多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在框内，并且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。也可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中以翻译后方式产生融合多肽(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以进一步包括两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；Svetina等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；Collins-Racie等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能和遗传学(Proteins:Structure,Function,andGenetics)6:240-248；和史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug DiscoveryWorld)4:35-48。
该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源所用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。本发明的亲本多肽已经从来自丹麦云杉和山毛榉森林的腐殖质中发现的脂环酸芽孢杆菌物种中获得。
该亲本可以是细菌α-淀粉酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)α-淀粉酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)、噬细胞菌属(cytophaga)或脲原体属(Ureaplasma)α-淀粉酶。
在一方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌α-淀粉酶。
在另一方面，该亲本是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)α-淀粉酶。
在另一方面，该亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)α-淀粉酶。
该亲本可以是真菌α-淀粉酶。例如，该亲本可以是酵母α-淀粉酶，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)α-淀粉酶；或丝状真菌α-淀粉酶，例如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属α-淀粉酶。
在另一方面，该亲本是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)α-淀粉酶。
在另一方面，该亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)α-淀粉酶。
在另一方面，该亲本是脂环酸芽孢杆菌α-淀粉酶，例如SEQ ID NO:2的α-淀粉酶或其成熟多肽。
将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用上述探针，鉴定亲本α-淀粉酶并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水，等等)分离的微生物获得该亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水，等等)直接获得DNA样品。直接从天然栖息地分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
变体的制备
本发明还涉及产生本发明的α-淀粉酶的方法，包括(a)在适合表达本发明变体的条件下培养宿主细胞，和(b)回收该变体。
本发明还涉及用于获得α-淀粉酶变体的方法，该方法包括将在一个或多个位置处的取代引入与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少67％序列一致性的亲本α-淀粉酶中，所述取代对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、298和314，其中该变体具有α-淀粉酶活性；并且回收所述变体。
在一个具体实施例中，本发明涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，该方法包括：(a)将在一个或多个位置处的取代引入与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少67％序列一致性的亲本α-淀粉酶中，所述取代对应于SEQ ID NO:3的位置109、51、201、269、294、297、298、193、和314，其中该变体与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少99％，但小于100％序列一致性，其中该变体具有α-淀粉酶活性；和(b)回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过使用涉及包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；和巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(NucleicAcids Res.)18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯托西(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；凯伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及卡里萨诺(Calissano)和曼奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学通讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。
在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可以用于制备变体的很多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，罗曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(德比舍尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
本发明还涉及产生α-淀粉酶变体的方法，这些方法包括：(a)在适合表达该α-淀粉酶变体的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收该α-淀粉酶变体。因此，一方面，本发明涉及产生α-淀粉酶变体的方法，该方法包括a)在适合表达该变体的条件下培养在此所述的宿主细胞，和b)回收该变体。在一个具体实施例中，产生α-淀粉酶变体的方法包括以下步骤：a)培养包含如在此所述的多核苷酸，核酸构建体或表达载体的宿主细胞；b)回收该变体。在一个实施例中，产生α-淀粉酶变体的方法包括以下步骤：a)培养宿主细胞，该宿主细胞包含编码α-淀粉酶变体的多核苷酸(该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代)，编码α-淀粉酶变体的核酸构建体(该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代)，或编码α-淀粉酶变体的表达载体(该变体包括在对应于SEQIDNO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代)；和b)回收该变体。
这些宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中进行培养。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。
可以使用特异性针对具有α-淀粉酶活性的变体的本领域已知的方法来检测该变体。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在可替代的方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。
在一方面，本发明涉及改进具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有至少67％序列一致性的亲本α-淀粉酶的稳定性，特别是洗涤剂稳定性，优选液体洗涤剂稳定性的方法，其中该方法包括以下步骤：
a)在一个或多个位置处的取代，当使用SEQ ID NO:3的成熟多肽编号时，所述取代对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314，其中所得变体与SEQID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少99％，但小于100％序列一致性，其中该变体具有α-淀粉酶活性；并且
b)向该亲本α-淀粉酶引入以下取代中的一个或多个；
105L、I、F+206Y；105L、I+206Y+217I；105F+206Y+208Y+217V+246V；105L+206F；105I+206Y+208Y+217I+246V；195F+213S+214T；195F+206Y+208Y+213T+214T+217M、V；195F+206Y+208F，L+213T+214T+217V；195F+206Y+213S+214T；195F+206Y+208Y+213S+214T+217M；195F+206Y+208F+213T+214T+217M；195F+206Y+208Y+213T+214T+217Q；195F+206Y+213G+214T；195F+206Y+213S；195F+206Y+208Y+213T+214T+217M；195F+213S；195F+206Y+208L+213T+214T+217M；195F+213G+214T；206Y、F+208Y+217Q；206Y+208Y+217I；206F+208Y+217M；206Y+208Y；206Y+217M；206Y+208Y+213A+217M；206Y+208Y+217V+246V；206Y+213G；206Y+208F+217V；206N+208Y+217M；206F+208Y+217V；206Y+246V；206Y+217I、V；206F+208F+217I；206Y+208L+213S；206F+217I；206Y+217I+246I；206L+217V；206Y+208F+217H；206L+208F+217I；206L+217V+246L；206F+246V；208Y+213S+217M；208Y+213A+217Q；63I+206Y；63I+206Y+241V；63V+206Y；63V+105L+206Y；63V+206Y+217I；63V+105F+206Y+208F+217I；63V+206Y+246V；63V+206F；63V+206L+217V；63V+105F+206Y；63V+206Y+241V+246L；195F+206Y+208Y+214T+217V；186E+195F+206Y；195F+206Y+208Y+213T+217V；186E+195F+202T+206Y+209S；63I+195F+206Y+210S；195F+206Y+213P+214T；195F+206Y+208Y+213T+214T+217I；186E+195F+206Y+210S；195F+213P；186E+195F+202T+206Y+210S；195F+206H；195F+208Y+213T+214T+217V；206Y+208Y+213T+214T+217V；195F+206Y+217V；195F+206Y+208Y+213S+214T；195F+206Y+208Y；195F+213I+214P；195F+206Y+208Y+213T+214T；195F+206Y；206Y+213S；182P+186E；182S+186E；182V+186K；179L+186H+190P；179L+186K、R、S+190P；179L+190P；179L+182C+186K+190P；179L+182P+186S、V+190P；179L+182S+186Q+190P；173F+174Q；173Y+174S；172K+173Y+174E；193A、D、N、S+195F；213A+214Q；213P+214L；213S+214R；48V+60V；213G+214T；213I+214P；213N+214I；213N+214Q和213P、S+214T，其中根据SEQ ID NO:11编号，并且其中所得变体与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少67％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性和与亲本α-淀粉酶相比的改进的洗涤剂稳定性和/或改进的性能。
在另一个实施例中，该变体具有以下亲本α-淀粉酶的至少50％，例如至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％的活性，该亲本α-淀粉酶具有SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列。
在另一个实施例中，根据如在此描述的Phadebas测定来确定活性。因此，在一个实施例中，通过以下方法确定活性，该方法包括以下步骤；
a)在37℃，用染色的直链淀粉底物孵育根据本发明所述的α-淀粉酶变体15分钟；并且
b)在OD 620nm处测量吸光度。
在另外的实施例中，通过以下方法确定其活性，该方法包括以下步骤；
a)在37℃，用染色的直链淀粉底物孵育根据本发明所述的α-淀粉酶变体15分钟；并且
b)离心该样品；
c)将上层清液转移至读取器板，并且
d)在OD 620nm处测量吸光度。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。因此，在一方面，本发明涉及编码如在此所述的变体的多核苷酸。在一个实施例中，该多核苷酸是分离的多核苷酸。
在一个具体实施例中，该多核苷酸编码包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314的一个或多个位置处的取代的α-淀粉酶变体。
核酸构建体
本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。因此，在一个实施例中，本发明涉及包含如在此所述的多核苷酸的核酸构建体。在一个具体实施例中，该核酸构建体包含编码如在此所述的α-淀粉酶变体的多核苷酸。因此，该核酸构建体包含编码变体的多核苷酸，该变体包括在对应于SEQID NO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314的一个或多个位置处的取代。
如在此使用的术语“核酸构建体”是指DNA构建体，它是待移植到靶组织或细胞(例如宿主细胞)中的核酸的人为构建的区段。核酸构建体包含编码多肽的至少一个基因序列。理解核酸构建体的含义和目的是在技术人员的技能范围内。
可以按多种方式操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下各项的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。
该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。该多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列5’-端可以包含对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌鈣-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌醹-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。其他信号序列由西莫宁(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物评论(MicrobiologicalReviews)57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。
从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得用于酵母宿主细胞的有用信号肽。其他的有用的信号肽编码序列由罗曼诺斯(Romanos)等人(1992，上文)描述。
该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他例子是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
如在此使用的术语“表达载体”是指可以包含复制起点、选择性标记、和用于插入基因的适合位点(如多克隆位点)的任何载体。尽管可能直接克隆到表达载体中，克隆的基因可以从专门的克隆载体转移到表达载体。确定表达载体的含义和目的是在技术人员的技能范围内。
因此，在一方面，本发明涉及包含如在此所述的多核苷酸的表达载体。因此，在一个具体实施例中，该表达载体包含编码α-淀粉酶变体的多核苷酸，该变体包括在对应于SEQID NO:3的位置51、109、193、211、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代。
重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不局限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。
载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。在另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
因此，在一方面，本发明涉及包含如在此所述的多核苷酸、核酸构建体或表达载体的宿主细胞。因此，在一个实施例中，该宿主细胞包含编码α-淀粉酶变体的多核苷酸(该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、211、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代)，编码α-淀粉酶变体的核酸构建体(该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、201、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代)，或编码α-淀粉酶变体的表达载体(该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、201、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代)。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核生物或真核生物。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌菌、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见，例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和卓林克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)或者共轭(参见，例如，克利威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如霍克斯沃思(Hawksworth)等人定义，引自：安斯沃斯(Ainsworth)和比斯比(Bisby)的真菌大词典(Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际CAB，大学出版社(University Press)，剑桥(Cambridge)，英国)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，为了本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)，帕斯莫尔(Passmore)和达文波特(Davenport)编著，应用细菌学学会专题论文集系列9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)所描述那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或耶罗维亚酵母属细胞、如乳酸克鲁维酵母细胞、卡氏酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂耶罗维亚酵母细胞。
该真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚类的所有丝状形式(如霍克斯沃思等人，1995，上文定义)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
真菌细胞可以通过下述过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述在EP 238023；约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474；和克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to YeastGenetics and Molecular Biology)，酶学方法(Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及亨内恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。因此，在一个实施例中，发酵液配制品或细胞组合物包括编码α-淀粉酶变体的多核苷酸(该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、289、和314的一个或多个位置的取代)，编码α-淀粉酶变体的核酸构建体(该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、211、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代)，或编码α-淀粉酶变体的表达载体(该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代)。该发酵液产物可以进一步包括用于发酵过程的另外的成分，例如像细胞(包括，包含用来产生感兴趣的多肽的编码本发明的多肽的基因的宿主细胞)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是包含一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养株在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞的酶表达)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳受限的条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物。
在一个实施例中，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀死全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包括防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以包含不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分，以提供一种澄清的液体组合物。
可以通过描述于WO 90/15861或WO 2010/096673中的方法生产本发明的全发酵液配制品和细胞组合物。
酶组合物
本发明还涉及包括本发明的α-淀粉酶变体的组合物。因此，在一方面，本发明涉及包括如在此所述的α-淀粉酶变体的组合物。在一个具体实施例中，该组合物包括变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代。优选地，这些组合物富含此种变体。术语“富含”指示该组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如，以至少1.1的富集因子。
这些组合物可以包括本发明的一种变体作为主要酶组分，例如一种单组分组合物。在另一个实施例中，该组合物包括至少一种另外的活性组分。
如在此使用的术语“活性组分”是指本身是活性的任何生物的或非生物的分子。例如，活性组分是酶。
因此，在一个实施例中，另外的活性组分是酶，例如蛋白酶、脂肪酶、纤维素、果胶酸裂合酶、和甘露聚糖酶。因此，这些组合物可以包含多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
在一个具体实施例中，另外的活性组分是一种酶，该酶选自下组，该组由以下各项组成；
i.与SEQ ID NO:4中的蛋白酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的蛋白酶：32、33、48-54、58-62、94-107、116、123-133、150、152-156、158-161、164、169、175-186、197、198、203-216；
ii.与SEQ ID NO:5中的脂肪酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的脂肪酶：1-5、27、33、38、57、91、94、96、97、111、163、210、225、231、233、249和254-256；
iii.与SEQ ID NO:6中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：9、118、149、182、186、195、202、257、295、299、320、323、339、345和458；
iv.与SEQ ID NO:7中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：140、195、和206、243、260和476；
v.与SEQ ID NO:8中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：180、181、243和475；
vi.与SEQ ID NO:9中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：178、179、187、203、458、459、460和476；
vii.与SEQ ID NO:10中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括修饰的α-淀粉酶：202；
viii.与SEQ ID NO:11中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：405、421、422和428；和/或
ix.根据SEQ ID NO:12的α-淀粉酶。
洗涤剂组合物可以包含一种或多种另外的酶，在此也称为“另外的活性组分”，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如一种虫漆酶)和/或过氧化酶。
一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
适合的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中描述的那些。
表现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的纤维素酶(EC 3.2.1.4)的实例是已经描述于WO 02/099091中的那些。
纤维素酶的其他实例包括描述于WO 96/29397中的家族45纤维素酶，并且特别是在对应于WO 02/099091的SEQ ID NO:8中的以下位置的一个或多个位置处具有取代、插入和/或缺失的其变体：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200、和/或20，优选选自P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。
可商购的纤维素酶包括Celluzyme、和Carezyme(诺维信公司(Novozymes A/S))、Clazinase、和Puradax HA(杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))、以及KAC-500(B)(花王株式会社(Kao Corporation))。
另外的酶(或另外的活性组分)可以是蛋白酶或蛋白酶变体。该蛋白酶可以是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的突变体。优选微生物来源。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶的蛋白酶可以例如是来自例如家族M4、M5、M7或M8的嗜热菌蛋白酶。
术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶(subtilase)可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(Lantibioticpeptidase)家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。在本发明的一个方面，该蛋白酶可以是一种枯草杆菌酶，例如枯草杆菌蛋白酶或其变体。另外，类枯草杆菌蛋白酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即一个组氨酸和一个天冬氨酸残基。
枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于芽孢杆菌的那些，如枯草杆菌蛋白酶lentus、芽孢杆菌lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279中)以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。另外的丝氨酸蛋白酶实例描述于WO 98/020115、WO 01/44452、WO 01/58275、WO 01/58276、WO 03/006602以及WO04/099401中。枯草杆菌酶变体的实例可以是在以下任意位置中具有突变的那些：3、4、9、15、27、36、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R、S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。另外的优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在(例如)WO 95/23221中所述)、以及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。
胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，以及在WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。有用的蛋白酶的实例为在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、以及WO 98/34946中描述的变体，尤其是在一个或多个以下位置中具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993中的中性金属蛋白酶。
优选的可商购的蛋白酶酶类包括AlcalaseTM、CoronaseTM、DuralaseTM、DurazymTM、EsperaseTM、EverlaseTM、KannaseTM、LiquanaseTM、Liquanase UltraTM、OvozymeTM、PolarzymeTM、PrimaseTM、RelaseTM、SavinaseTM和Savinase UltraTM(诺维信公司(Novozymes A/S))，AxapemTM(Gist-Brocases N.V.公司)，BLAP和BLAP X(Henkel AG&Co.KGaA)，ExcellaseTM、FN2TM、FN3TM、FN4TM、MaxacaTM、MaxapemTM、MaxataseTM、ProperaseTM、PurafastTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、Purafect PrimeTM和PuramaxTM(杰能科有限公司(Genencor int.))。
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌起源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变酶。实例包括如在EP 258068和EP 305216中所述的来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(以前命名为柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶、来自腐质霉(例如特异腐质霉(H.insolens)(WO 96/13580))的角质酶、来自假单胞菌属(Pseudomonas)(这些假单胞菌属中的一些现在重命名为伯克氏菌属)的脂肪酶(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligene)(EP 218272))、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)、GDSL型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)、来自稻瘟病菌(WO 10/107560)的角质酶、来自门多萨假多胞菌(US 5,389,536)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(WO 11/084412)的脂肪酶、嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)、来自枯草芽孢杆菌(WO 11/084599)的脂肪酶、以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)的脂肪酶和始旋链霉菌(WO 12/137147)。
另外的实例是有时被称为酰基转移酶或过水解酶(perhydrolase)的脂肪酶，例如与南极假丝酵母脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)、以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体，特别是用于在来自亨斯迈纺织染化私人有限公司(Huntsman TextileEffects PteLtd)的商业化产品Gentle Power Bleach(柔和漂白剂)中使用的S54V变体(WO10/100028)。
其他实例是脂肪酶变体，例如在EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508和WO 09/109500中所描述的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。
另外的活性组分不限于其他类别的酶。因此，另外的活性组分可以是额外的淀粉酶，例如α-淀粉酶或葡糖淀粉酶，并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如从在GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株获得的α淀粉酶。
淀粉酶的实例是WO 95/10603中描述的那些或其变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的一个或多个以下位置处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其变体以及包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶。
另外的淀粉酶实例是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其变体以及具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的淀粉酶或其变体。可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其变体。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其变体以及具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或其变体。
可商购的淀粉酶是Duramyl、Termamyl、Fungamyl、Stainzyme、Stainzyme Plus、Natalase、BAN、Everest和Amplify(诺维信公司)、Powerase、Preferenz S100、PreferenzS110、Preferenz S1000、Preferenz S2000、Excellenz S1000(来自杰能科国际有限公司(Genencor International Inc))。
适合的过氧物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化物酶包括Guardzyme(诺维信公司)。
可以通过添加包含一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而将洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等，优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16个到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚(ethoxylated nonylphenol)；具有15个至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇，其中醇包含12个至20个碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单-和双-和三甘油酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制品可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。
这些组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。
洗涤剂组合物
在一方面，本发明涉及包括如在此所述的α-淀粉酶变体的洗涤剂组合物。因此，在一方面，本发明涉及为洗涤剂组合物的组合物。在一个具体实施例中，该洗涤剂组合物是液体的或粉末状的组合物。在一个实施例中，该组合物包括α-淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代。在另一个实施例中，该组合物包括与一种或多种另外的清洁组合物组分组合的本发明的洗涤剂组合物。在一个实施例中，该洗涤剂是液体洗涤剂组合物。在另一个实施例中，该洗涤剂组合物是粉末状洗涤剂组合物。
该洗涤剂组合物可以是衣物洗涤剂组合物或餐具洗涤洗涤剂组合物。餐具洗涤洗涤剂组合物既可用于手动餐具洗涤，也可用于自动化餐具洗涤。
另外的组分的选择处于技术人员能力范围内并且包含常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的织物的类型、污渍的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至洗涤剂组合物中：每升的洗涤液体0.001-100mg的蛋白，例如0.01-100mg的蛋白，优选是0.005-50mg的蛋白，更优选是0.01-25mg的蛋白，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白，最优选是0.05-5mg的蛋白，并且甚至最优选是0.01-1mg的蛋白。考虑了该术语“蛋白质”在本文中应理解为包括根据本发明所述的α-淀粉酶变体。
用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05-5％的酶蛋白。
用于在洗衣造粒(laundry granulation)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。
用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。
可以使用常规稳定剂稳定本发明的这些α-淀粉酶变体以及另外的活性组分，例如另外的酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配置该组合物。
在某些市场中，不同洗涤条件并且就其本身而言，使用不同类型的洗涤剂。这披露于例如EP 1 025 240中。例如，在亚洲(日本)使用低的洗涤剂浓度体系，而美国使用中等洗涤剂浓度体系，并且欧洲使用高的洗涤剂浓度体系。
低的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。日本洗涤剂典型地被认为是低的洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约667ppm的洗涤剂组分。
中等洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洗涤剂通常被认为是中等洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约975ppm的洗涤剂组分。
高的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在多于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高的洗涤剂浓度体系，因为在洗涤水中它们具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。
拉丁美洲洗涤剂通常是高泡沫磷酸盐助洗剂洗涤剂并且在拉丁美洲使用的洗涤剂的范围可以落入中等和高的洗涤剂浓度两者中，因为在洗涤水中它们的洗涤剂组分的范围从1500ppm至6000ppm。此类洗涤剂组合物都是本发明的实施例。
本发明的α-淀粉酶变体还可以掺入WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，将该专利通过引用结合在此。
在此给出了本发明的组合物的优选用途的实例。该组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。典型地，表面活性剂按重量计以从大约0.1％至60％，如大约1％至大约40％、或大约3％至大约20％、或大约3％至大约10％的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当包含在其中时，所述去污剂通常将会包含按重量计约1％至约40％，例如约5％至约30％，包括约5％至约15％，或约20％至约25％的阴离子型表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES、也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约0％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲基氧化胺、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。
本发明的洗涤剂组合物还包括如在US 20130072416或US 20130072415中所披露的类异戊二烯表面活性剂中的一个或多个。
助水溶剂
助水溶剂是以下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。一般地，助水溶剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲性质，如由表面活性剂已知的)；然而，助水溶剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)，胶体&界面科学新见(Current Opinion inColloid&Interface Science)12:121-128的综述。助水溶剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶剂显示连续类型的聚集过程，其中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。
去污剂可以包含按重量计0-5％、例如0.5-约5％或约3％-约5％的助水溶物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以包含按重量计大约0-65％，如大约10％至大约40％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂，或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螯合剂(chelating agent)(即螯合剂(chelator))。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其组合。
洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-50％，例如约10％至约40％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或结合助洗剂，例如沸石助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二磷酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基磷酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基磷酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基磷酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基磷酸)(ATMP)及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
螯合剂(Chelating agent)或螯合剂(chelator)是可与特定的金属离子形成分子的化学物，从而使这些离子失活使其不能与其他元素进行反应，由此是通过形成螯合物而抑制化学活性的一种结合剂。螯合是在配体与单一中心原子之间形成或存在的两种或更多种单独的结合。配体可以是任何有机化合物、硅酸盐或磷酸盐。在本文上下文中，术语“螯合剂(chelating agent)”包括螯合剂(chelant)、螯合剂(chelating agent)、螯合剂(chelating agent)、络合剂(complexing agent)、或可与如钙和镁等金属离子形成水溶性复合物的螯合剂(sequestering agent)。螯合作用描述螯合配体对金属离子的亲和力相对于类似的一组非螯合配体对相同金属的亲和力的增强。螯合剂具有与金属离子特别是钙(Ca2+)离子的结合能力，并广泛应用于洗涤剂，和一般用于洗涤如洗衣或洗碟的组合物。然而，螯合剂自身呈现出抑制酶活性。在本申请中，术语螯合剂(chelating agent)与“络合剂(complexing agent)”或“螯合剂(chelating agent)”或“螯合剂(chelant)”互换使用。
由于大多数α-淀粉酶具有钙敏感性，螯合剂的存在可影响酶活性。α-淀粉酶的钙敏感性可通过将给定α-淀粉酶在强螯合剂的存在下孵育，并分析该孵育对所述α-淀粉酶的活性的影响来确定。钙敏感性α-淀粉酶会在孵育过程中丧失其活性的主要部分或全部。该螯合剂可以按一个量值存在于该组合物中，该量值为从0.0001wt％至20wt％、优选地从0.01wt％至10wt％、更优选地从0.1wt％至5wt％。
强螯合剂可以是但不限于以下各项：乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTMPA、DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺N,N'-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙烯二胺四乙酸(PDTA)、2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)和次氨基三乙酸(NTA)或其混合物。螯合剂可以按它们的酸形式或盐存在，优选地，螯合剂可以作为钠盐、铵盐或钾盐存在。
表征螯合剂：如所提及的，螯合效应(chelate effect或chelating effect)描述了与相似的非螯合配体对于金属离子的亲和力相比，螯合配体对于相同的金属离子具有增强的亲和力。然而，该螯合作用的强度可通过多种类型的测定或测量方法决定，由此根据其螯合作用(或强度)对螯合剂进行区分和排位。
在一个测定中，螯合剂可以通过它们在pH 8.0下将游离钙离子(Ca2+)的浓度从2.0mM降低至0.10mM或更少的能力来表征，例如通过使用基于由M.K.纳卡拉占(Nagarajan)等人，JAOCS，第61卷，第9期(1984年9月)，第1475-1478页描述的方法的测试。
供参考，一种螯合剂与以该螯合剂相等浓度的EDTA在pH下具有将游离钙离子(Ca2+)浓度从2.0mM降低至0.10mM相同能力，则该螯合剂被称为强螯合剂。
漂白系统
洗涤剂可以包含按重量计0-20％，如大约0％至大约10％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物+餐具洗涤+I&I洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预制的过酸和其混合物。适合的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))、及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如一种与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。因此形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。该漂白系统还可以包括过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。该漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R1独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
聚合物
洗涤剂可以包含按重量计0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与一种洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包括所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中(将其通过引用而特此结合)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是特别优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术范围内。
本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体而言，粉末状洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉末洗涤剂，表面活性剂科学系列(Surfactant ScienceSeries)，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker)。
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。
本发明的洗涤剂组合物还可以优选地包含额外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学(Paramount Minerals andChemicals)，孟买，印度供应。适合在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。适当的荧光增白剂水平包括从大约0.01wt％，从0.05wt％，从大约0.1wt％或甚至从大约0.2wt％至上限水平0.5wt％或甚至0.75wt％的较低水平。
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉布和基于聚酯的织物)移除污物，特别是从基于聚酯的织物移除疏水性污物。污垢释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉末状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包括核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物的功能还可以是抗再沉积剂。
其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何合宜的形式，例如，棒、均质片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个隔室的小袋、常规或压型粉末、颗粒、糊剂、凝胶或常规、压型或浓缩液体。存在多种洗涤剂配制品形式，例如层(相同或不同相)、袋以及用于机械给料装置的形式。
可以将小袋配置为单一隔室或多隔室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为具有袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少大约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Ind.，US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同。参考文献：(US 2009/0011970A1)。
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的储存相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
洗衣皂条
本发明的酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语“固体”被定义为不随时间显著变化的物理形式，即如果固体物体(如衣物肥皂棒)被放置在容器里，该固体物体不会为了填充其被放置的容器而发生改变。该棒是固体时典型地是棒的形式但也可能是其他的固体形状例如圆形或椭圆。
该衣物肥皂棒可以包含一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酸基本硼酸、一个或多个肥皂或合成的表面活性剂、多元醇例如甘油、pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，因此该一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
洗衣皂条还可以包括络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污物释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。
洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在工艺的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制剂、和一价阳离子和有机阴离子的盐的该预混料并且然后将该混合物出条。该酶和任选的另外的酶可以作为酶抑制剂(例如蛋白酶抑制剂)例如以固体的形式同时添加。除了混合步骤和出条步骤，该过程可以进一步包含以下步骤：研磨、挤出、切割、冲压、冷却和/或封装。
颗粒洗涤剂配制品
如描述于WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US 6472364、WO04/074419或WO 09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的去污剂配方描述于：WO09/124162、WO 09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO 09/072069、WO09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO 09/112296、WO 09/112298、WO 09/103822、WO09/087033、WO 09/050026、WO 09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO 09/047128、WO09/021784、WO 09/010375、WO 09/000605、WO 09/122125、WO 09/095645、WO 09/040544、WO09/040545、WO 09/024780、WO 09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO 09/115391、WO09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO 09/068501、WO 09/065770、WO 09/021813、WO09/030632、WO 09/015951、WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO2011005623、WO 2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO 2011005630、WO2011005830、WO 2011005912、WO 2011005905、WO 2011005910、WO 2011005813、WO2010135238、WO 2010120863、WO 2010108002、WO 2010111365、WO 2010108000、WO2010107635、WO 2010090915、WO 2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO2010033897、WO 2010033979、WO 2010030540、WO 2010030541、WO 2010030539、WO2010024467、WO 2010024469、WO 2010024470、WO 2010025161、WO 2010014395、WO2010044905、WO 2010145887、WO 2010142503、WO 2010122051、WO 2010102861、WO2010099997、WO 2010084039、WO 2010076292、WO 2010069742、WO 2010069718、WO2010069957、WO 2010057784、WO 2010054986、WO 2010018043、WO 2010003783、WO2010003792、WO 2011023716、WO 2010142539、WO 2010118959、WO 2010115813、WO2010105942、WO 2010105961、WO 2010105962、WO 2010094356、WO 2010084203、WO2010078979、WO 2010072456、WO 2010069905、WO 2010076165、WO 2010072603、WO2010066486、WO 2010066631、WO 2010066632、WO 2010063689、WO 2010060821、WO2010049187、WO 2010031607、和WO 2010000636中。
产生组合物的方法
本发明还涉及产生组合物的方法。该方法可以与洗涤剂组合物的(存储)稳定性相关：例如，肥皂条预混方法WO 2009155557。
用途
本发明针对用于使用α-淀粉酶变体或其组合物在清洁过程例如衣物洗涤或包括自动化餐具洗涤的硬表面清洁中的方法。对于清洁而言重要的污物和污渍由许多不同物质构成，并且已经开发全都具有不同底物特异性的一系列不同的酶用于在涉及衣物和硬表面清洁(例如餐具洗涤)两者中使用。这些酶被认为提供酶洗涤益处，因为与不具有酶的同一过程相比，它们在其应用的清洁过程中特异性地改进污渍去除。本领域已知的去污酶包括以下酶，例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶。
在一方面，本发明涉及本发明的α-淀粉酶变体在洗涤剂组合物中用于在清洁硬表面中使用(例如餐具洗涤)，或在洗衣中或用于去污的用途。在另一方面，本发明涉及根据本发明所述的α-淀粉酶变体在清洁过程(例如衣物洗涤或硬表面清洁，包括但不限于餐具洗涤和工业清洁)中的用途。因此，在一个实施例中，本发明涉及包括在对应于SEQ ID NO:3的位置51、109、193、201、269、294、297、298、和314的一个或多个位置的取代的α-淀粉酶变体在清洁过程(例如衣物洗涤或硬表面清洁，包括餐具洗涤和工业清洁)中的用途。
在本发明的一个实施例中涉及在洗涤剂组合物中和在洗涤剂应用中，包括本发明的α-淀粉酶变体连同一种或多种表面活性剂以及任选地选自以下列表的一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物的用途，该列表由助水溶剂、助洗剂和共助洗剂、漂白系统、聚合物、织物调色剂和辅料或其任何混合物。
另外的实施例是在洗涤剂组合物或洗涤剂应用中使用包括本发明的α-淀粉酶连同一种或多种表面活性剂以及一种或多种选自下组的另外的酶的洗涤剂组合物，该组包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶或其任何混合物。
在另一方面，本发明涉及洗衣方法，该方法可用于家用洗衣以及工业洗衣。此外，本发明涉及一种用于洗涤纺织品(例如织物、服装(garment)、衣服(cloth)等)的方法，其中该方法包括用一种洗涤溶液处理该纺织品，该洗涤溶液包含一种洗涤剂组合物以及一种本发明的α-淀粉酶。可以使用家用或工业洗衣机进行洗衣或可以使用一种洗涤剂组合物手动地进行洗衣，该洗涤剂组合物包含本发明的葡糖淀粉酶。
在另一方面，本发明涉及餐具洗涤方法，该方法可用于家用餐具洗涤以及工业餐具洗涤。如在此使用的术语“餐具洗涤”，是指手动餐具洗涤和自动化餐具洗涤两者。此外，本发明涉及用于洗涤硬表面(例如，用餐工具，如刀、叉、匙；陶器，如盘子、玻璃杯、碗；以及平底锅)的方法，其中该方法包括用洗涤溶液处理该硬表面，该洗涤溶液包含洗涤剂组合物以及本发明的α-淀粉酶变体。可以例如使用家用或工业洗碗机洗涤硬表面或使用一种洗涤剂组合物手动地洗涤硬表面，该洗涤剂组合物包含本发明的α-淀粉酶、任选地连同一种或多种选自下组的另外的酶，该组包括：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶、或其任何混合物。
在另外的方面，本发明涉及用于从表面去除污渍的方法，该方法包括使该表面与在洗涤剂组合物中和在洗涤剂应用中的包括本发明的α-淀粉酶连同一种或多种表面活性剂以及任选地一种或多种选自以下列表的洗涤剂组分的组合物接触，该列表包括助水溶剂、助洗剂和共助洗剂、漂白系统、聚合物、织物调色剂和辅料或其任何混合物。一个另外的方面是一种用于从表面去除污渍的方法，该方法包括使该表面与在洗涤剂组合物中和在洗涤剂应用中包括本发明的α-淀粉酶变体连同一种或多种表面活性剂、一种或多种选自下组的另外的酶的组合物接触，该组包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶或其任何混合物。
pNP-G7测定法-α-淀粉酶活性
可以通过使用G7-pNP底物的方法确定α-淀粉酶活性。缩写为4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽庚糖苷的G7-pNP是一种可以由内切淀粉酶如α-淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解底物以释放自由PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。包含G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。
试剂：
来自这个试剂盒的G7-pNP底物包含22mM 4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mMHEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0。
α-葡糖苷酶试剂包含52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl2、0.075mM CaCl2、>4kU/L的α-葡糖苷酶。
通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mL G7-pNP底物混合，产生底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。
稀释缓冲液：50mM MOPS，0.05％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10)))，1mMCaCl2，pH 8.0。
程序：
将有待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过将20μl稀释酶样品转移至96孔微量滴定板并且添加80μl底物工作溶液来执行测定。将溶液混合并且在室温下预孵育1分钟并且在OD 405nm下在5分钟内每20秒测量吸收。
在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。淀粉酶样品应稀释至其中斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。
Phadebas活性测定
α-淀粉酶活性还可通过使用Phadebas底物(例如来自麦戈尔生命科学(MagleLife Sciences)，隆德(Lund)，瑞典(Sweden))的方法来确定。Phadebas片剂包括互联淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将一种蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在620nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
将有待分析的α-淀粉酶样品稀释于具有所需pH的活性缓冲液中。将两个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)或PCR-MTP。将30μl稀释淀粉酶样品添加至150μl底物并且混合。37℃下孵育15分钟。通过添加30μl 1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg下离心MTP 5分钟。将100μl转移至新MTP并且测量620nm下的吸光度。
该α-淀粉酶样品应稀释成使得620nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
Amylazyme活性测定
α-淀粉酶活性还可以通过使用包括已经与乳糖和硬脂酸镁混合并且压片的AZCL-直链淀粉的淀粉酶底物(Amylazyme测试，由Megazyme公司提供的用于谷类和细菌淀粉酶的测定法)的方法来确定。将一种蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联直链淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了直链淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在590nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
将有待分析的α-淀粉酶样品稀释于具有所需pH的活性缓冲液中。将两个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)或PCR-MTP。接下来，将25μl稀释的淀粉酶样品添加到150μl底物中并混合。将混合物在37℃下孵育10分钟。通过添加25μl 1M NaOH并且混合来停止反应。将MTP在4000xg离心5分钟，随后将100μl转移至新的MTP，并在590nm处测量吸光度。
该α-淀粉酶样品可稀释成使得590nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
还原糖活性测定
α-淀粉酶活性还可通过使用例如玉米淀粉底物的还原糖测定来确定。通过与对-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)反应来确定用α-淀粉酶水解淀粉中的α-1,4-糖苷键所形成的多个还原端。与PHBAH反应之后，可通过405nm下的吸光度来测量还原端的数量并且还原端的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。
使玉米淀粉底物(3mg/mL)在milliQ水中蒸煮5分钟来溶解并且在测定之前冷却。关于终止液，制备Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液(K-Na-酒石酸盐(默克(Merck)8087)50g/l，NaOH 20g/l)并且通过将对-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH，西格玛(Sigma)H9882)添加至Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液至15mg/mL来新鲜制备终止液。
在PCR-MTP中，将50μl活性缓冲液与50μl底物混合。添加50μl稀释酶并且混合。在PCR机器中在所需温度孵育5分钟。通过添加75μl终止液(Ka-Na-酒石酸盐/NaOH/PHBAH)来停止反应。在PCR机器中在95℃孵育10分钟。将150μl转移至新MTP并且测量405nm下的吸光度。
该α-淀粉酶样品应稀释成使得405nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。
测定
为了确定残余淀粉酶活性，可以使用Ultra淀粉酶测定试剂盒(E33651，英杰公司(Invitrogen)，拉霍亚(La Jolla)，加州(CA)，美国(USA))。
底物是一种玉米淀粉衍生物DQTM淀粉，它是用FL染料标记以使得荧光被淬灭的玉米淀粉。包含大约1mg冻干底物的一个小瓶溶解于100微升50mM乙酸钠(pH 4.0)中。将小瓶涡旋20秒并且在室温下、黑暗中保持，并偶尔混合直到溶解为止。然后添加900微升100mM乙酸盐、0.01％(w/v)X100、0.125mM CaCl2，pH 5.5，充分涡旋并且在室温下、黑暗中储存直到准备使用为止。通过以10倍稀释于残余活性缓冲液(100mM乙酸盐、0.01％(w/v)X100、0.125mM CaCl2，pH 5.5)中来制备储备底物工作溶液。孵育之后立即将酶在100mM乙酸盐、0.01％(w/v)X100、0.125mM CaCl2，pH 5.5中稀释至10-20ng酶蛋白/ml的浓度。
为了测定，在黑色384孔微量滴定板中，将25微升底物工作溶液与25微升稀释酶混合10秒。在每个孔中在25℃于15分钟内每分钟测量荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)并且将Vmax计算作为荧光强度相对于时间的曲线的斜率。曲线应是线性的，并且调整了残余活性测定以使得稀释的参照酶溶液在活性测定的线性范围内。
使用自动机械应力测定的α-淀粉酶的洗涤性能(AMSA)
为了评定多肽在洗涤剂基础组合物中的洗涤性能，可以使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。使用AMSA测试，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子将待洗涤的纺织品小块布样对所有缝开口强力挤压。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。
衣物洗涤性能总体描述
制备测试溶液，该测试溶液包含水(6°dH)、0.79g/l洗涤剂(例如，如下文描述的标准洗涤剂J)和多肽，即处于浓度0或0.6mg酶蛋白/L的本发明的酶。添加带有淀粉污渍的织物(来自测试材料中心BV的CS-28，邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰)并且将它们在15℃和/或30℃洗涤20分钟，或可替代地在15℃和/或40℃洗涤20分钟，如在实例中详细说明的那样。在流动自来水下彻底漂洗并且在黑暗中干燥之后，随后测量带有污渍的织物的光强度值作为洗涤性能的量度。具有0mg酶蛋白/L的测试用作空白并且对应于来自洗涤剂的贡献。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与织物一起振摇、转动或搅拌的形式施加。AMSA洗涤性能实验在以下详细说明的实验条件下进行：
表A：实验条件
洗涤剂 液体标准洗涤剂J(参见表B)
洗涤剂剂量 0.79g/L
测试溶液体积 160μL
pH 按原来的情况
洗涤时间 20分钟
温度 15℃或30℃
水硬度 6°dH
测试中的酶浓度 0.6mg酶蛋白/L
测试材料 CS-28(大米淀粉棉)
表B：标准洗涤剂J
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至6°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
表C：实验条件
洗涤剂 液体标准洗涤剂A(参见表D)
洗涤剂剂量 3.33g/L
测试溶液体积 160μL
pH 按原来的情况
洗涤时间 20分钟
温度 15℃、30℃、或40℃
水硬度 15°dH
测试中的酶浓度 0.6mg酶蛋白/L
测试材料 CS-28(大米淀粉棉)
表D：标准洗涤剂A
通过将CaCl2、MgCl2、和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝4:1:7.5)添加至测试系统中，将水硬度调节至21°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
表E：实验条件
洗涤剂 粉末状状标准洗涤剂X(参见表F)
洗涤剂剂量 1.75g/L
测试溶液体积 160μL
pH 按原来的情况
洗涤时间 20分钟
温度 15℃、30℃、或40℃
水硬度 12°dH
测试中的酶浓度 0.6mg酶蛋白/L
测试材料 CS-28(大米淀粉棉)
表F：标准洗涤剂X
化合物 化合物的含量(％w/w) 活性组分％(％w/w)
LAS 16.50 15.00
AEO* 2.00 2.00
碳酸钠 20.00 20.00
硅酸二钠 12.00 9.90
沸石A 15.00 12.00
硫酸钠 33.50 33.50
PCA 1.00 1.00
*将标准洗涤剂X混合，不含AEO。在洗涤之前，将AEO单独地添加。
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
表G：实验条件
表H：标准洗涤剂T
化合物 化合物的含量(％w/w) 活性组分％(％w/w)
LAS，钠盐 11.00 10.00
LAS，钠盐 2.00 1.80
皂 2.00 2.00
AEO* 3.00 3.00
碳酸钠 15.15 14.90
硅酸二钠 3.00 2.50
沸石A 18.75 15.00
HEDP-Na4 0.15 0.13
柠檬酸钠 2.00 2.00
PCA 1.65 1.50
CMC 2.50 1.60
SRP 0.50 0.50
SPC 22.20 20.00
TAED 3.25 3.00
硫酸钠 10.85 10.70
硅酮 2.00 2.00
*将标准洗涤剂T混合，不含AEO。在洗涤之前，将AEO单独地添加。
通过将CaCl2、MgCl2、和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝4:1:7.5)添加至测试系统中，将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。
AMSA自动餐具洗涤性能总体描述
制备一种测试溶液，该测试溶液包含水(6°dH)、4.53g/L洗涤剂(例如，如下文描述的包含磷酸盐的液体标准洗涤剂)和处于浓度0或0.5mg酶蛋白/L的本发明的多肽。添加具有混合淀粉污渍的三聚氰胺板(来自测试材料中心BV的DM-177，邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰)并且将它们在15℃洗涤20分钟。在流动自来水下短时间漂洗并且在黑暗中干燥之后，随后测量带有污渍的板的光强度值作为洗涤性能的量度。具有0mg酶蛋白/L的测试用作空白并且对应于来自洗涤剂的贡献。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与板一起振摇、转动或搅拌的形式施加。AMSA自动餐具洗涤性能实验在以下详细说明的实验条件下实施。
表I：实验条件
洗涤剂 包含磷酸盐的液体标准洗涤剂(参见表J)
洗涤剂剂量 4.53g/L
测试溶液体积 160μL
pH 按原来的情况
洗涤时间 20分钟
温度 15℃、30℃、或40℃
水硬度 6°dH
测试中的酶浓度 0.5mg/L
测试材料 三聚氰胺板(混合淀粉)
表J：包含磷酸盐的液体标准自动餐具洗涤剂
化合物 化合物的含量(％w/w)
STPP 50.0
碳酸钠 20.0
过碳酸钠 10.0
二硅酸钠 5.0
TAED 2.0
Sokalan CP5(39,5％) 5.0
Surfac 23-6.5(100％) 2.0
硫酸钠 6.0
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至6°dH。在洗涤之后，将板用自来水沖洗并干燥。
表K：实验条件
表L：包含磷酸盐的粉末状自动餐具洗涤标准洗涤剂
化合物 化合物的含量(％w/w)
Na5P3O10 23.0
普流尼克(Pluronic)PE 6800 1.0
Sokalan PA 30 2.0
ACUSOL 805S 2.0
黄原胶 1.0
水 74.0
通过将CaCl2、MgCl2、和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝4:1:10)添加至测试系统中，将水硬度调节至21°dH。在洗涤之后，将板用自来水沖洗并干燥。
洗涤性能的评估
洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。
采用以下方式进行颜色测量：使用用于捕获所洗涤纺织品的图像的专业平板扫描仪(Kodak iQsmart，柯达(Kodak))，并且使用控制的数字成像系统(DigiEye)用于捕获所洗涤三聚氰胺板的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：
纺织品/三聚氰胺：
从荷兰弗拉尔丁恩试验材料中心BV(邮箱120，3133KT)获得纺织品样品CS-28(在棉花上的米淀粉)和具有混合淀粉污渍的三聚氰胺板(DM-177)。
参照α-淀粉酶
该参照α-淀粉酶可以是SEQ ID NO:3的α-淀粉酶。
通过以下实例进一步对本发明进行进一步描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实例
实例1使用Amylazyme测定的淀粉酶活性
通过如在在此所描述的Amylazyme测定确定本发明变体的淀粉酶活性。
淀粉酶由枯草芽孢杆菌宿主菌株表达，通过在每个孔中用1ml发酵培养基的深孔微量滴定板发酵。将它们在37℃以600rpm剧烈振荡孵育3天。
发酵培养基
在使用Amylazyme测定测量活性之前，在测定缓冲液(具有0,12mMCaCl2和0,01％brij的100mM B&R缓冲液(pH 7,3))中来自发酵的上清液稀释100倍。Amylazyme片剂也溶解在测定缓冲液中。
表1：本发明的变体的活性
淀粉酶 活性(平均)
SEQ ID NO:3 1,9
T269N 1,4
T269Y 1,8
T269G 1,8
M294Y 1,4
M109A 0,4
M109G 1,3
M109H 1,3
M109L 1,5
如从表1可以看出，所有测试的变体都维持淀粉酶活性。高于0的平均活性值表明该变体示出α-淀粉酶活性。在此所用的参考是根据SEQ ID NO:3的多肽。上清液的活性不反映分离的，即纯化的酶的洗涤性能。因此，这些数据不表明洗涤性能。此外，数据没有根据实验中使用的蛋白质浓度进行标准化。因此，该数据示出所有测试的变体维持淀粉酶活性。
实例2使用Phadebas测定的淀粉酶活性
通过如在在此所描述的Phadebas测定确定本发明变体的淀粉酶活性。
淀粉酶由枯草芽孢杆菌宿主菌株表达，通过在每个孔中用来自实例1的1ml发酵培养基的深孔微量滴定板发酵。将它们在37℃以600rpm剧烈振荡孵育3天。
在使用Phadebas测定测量活性之前，在测定缓冲液(具有0,12mM CaCl2和0,01％brij的100mM B&R缓冲液(pH 7,3))中将上清液稀释100×。Phadebas片剂也溶解在测定缓冲液中。
表2：本发明的变体的活性
如从表2可以看出，所有测试的变体都维持淀粉酶活性。高于0的平均活性值表明该变体示出α-淀粉酶活性。在此所用的参考是根据SEQ ID NO:3的多肽。上清液的活性不反映分离的，即纯化的酶的洗涤性能。因此，这些数据不表明洗涤性能。
在此描述并且要求保护的本发明不局限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
序列-粗体和下划线的部分的序列表明多肽的预测信号序列。
序列表
<110> 诺维信公司(Novozymes A/S)
<120> 脂环酸芽孢杆菌变体以及编码它们的多核苷酸
<130> 13073-WO-PCT
<160> 13
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1539
<212> DNA
<213> 脂环酸芽孢杆菌属
<400> 1
atgaaaatcc gcaacggttg gaaaaaaacc ttgacgctgt tatttgcgct catcttcttg 60
ctgcctcatt ctgcagccgc gacctttgcc ggggacaacg gcacgatgat gcaatacttt 120
gaatggtatc tgcccaacga cgggacgctt tggaccaaga tgggcagcga cgcgtcgcac 180
ctgaagtcga tcgggatcac cggcgtctgg ttcccgccgg cgtacaaagg ccaatcgcag 240
tcggacgtcg gctacggcgt atacgacatg tacgacctcg gcgaattcaa ccaaaaagga 300
accgtccgca ccaagtacgg caccaaagcc cagctccaat cggcgatcac ctccctgcac 360
aacaacggca tccaagccta cggggacgtc gtcctcaacc accgcatggg cgccgatgcg 420
acggagacga tctccgccgt ggaagtcaac ccgtccaacc gcaaccaagt cacctccggg 480
gcttacaaca tctccgcttg gaccgacttc gaattcccgg gccgcggcaa cacctactcc 540
tcgtttaagt ggcactccta ctactttgac ggcgtggact gggaccaatc ccgccagctg 600
agcggcaaga tctaccagat ccaaggcacc ggcaaagcgt gggactggga agtcgattcc 660
gaaaacggca actacgacta cctgatgggc gcggacatcg actacgacca cccggacgtg 720
caaacggaag tgaagaactg gggcaagtgg ttcgtcaaca ccctcaacct cgacggcgtg 780
cgcctcgacg cggtcaagca catcaagttc gactacatgt cttcctggct gtccagcgtc 840
aaatccacga ccggcaagtc caacctgttc gccgtcggcg aatactggaa cacctcgctc 900
ggagcgctgg agaactacga gaacaaaacc aactggagca tgtcgctgtt cgacgtgccg 960
ctgcacatga acttccaagc ggcagcgaac ggcggcggct actatgatat gcgcaacctg 1020
ctcaacaaca cgatgatgaa aaatcacccg atccaagcgg tcaccttcgt cgacaaccac 1080
gacaccgagc cgggccaagc cctgcaatcg tgggtatccg actggttcaa accgctggcc 1140
tacgcgacga tcctgacccg tcaagaaggc tacccgtgcg tgttctacgg cgactactac 1200
ggcatcccgt cgcaaagcgt ctccgcgaaa tccacctggt tggacaagca gctttccgca 1260
cgcaaatcct acgcgtacgg cacccagcac gactacttgg acaaccaaga cgtgatcggc 1320
tggacgcgcg aaggcgattc cgcgcacgcg ggctcgggtc ttgccaccgt catgtcggac 1380
ggccctggcg gctccaagac gatgtacgtc ggcaccgccc atgccggcca agtcttcaag 1440
gacatcaccg gcaaccgcac cgacaccgtc acgatcaact ccgcaggcaa cggcaccttc 1500
ccctgcaacg gcggctccgt ctcgatctgg gtcaaacaa 1539
<210> 2
<211> 511
<212> PRT
<213> 脂环酸芽孢杆菌属
<400> 2
Met Lys Ile Arg Asn Gly Trp Lys Lys Thr Leu Thr Leu Leu Phe Ala
1 5 10 15
Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Thr Phe Ala Gly Asp
20 25 30
Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Pro Asn Asp Gly
35 40 45
Thr Leu Trp Thr Lys Met Gly Ser Asp Ala Ser His Leu Lys Ser Ile
50 55 60
Gly Ile Thr Gly Val Trp Phe Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Gln Ser Gln
65 70 75 80
Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Met Tyr Asp Leu Gly Glu Phe
85 90 95
Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ala Gln Leu
100 105 110
Gln Ser Ala Ile Thr Ser Leu His Asn Asn Gly Ile Gln Ala Tyr Gly
115 120 125
Asp Val Val Leu Asn His Arg Met Gly Ala Asp Ala Thr Glu Thr Ile
130 135 140
Ser Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asn Arg Asn Gln Val Thr Ser Gly
145 150 155 160
Ala Tyr Asn Ile Ser Ala Trp Thr Asp Phe Glu Phe Pro Gly Arg Gly
165 170 175
Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp His Ser Tyr Tyr Phe Asp Gly Val
180 185 190
Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ser Gly Lys Ile Tyr Gln Ile Gln
195 200 205
Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp
210 215 220
Tyr Leu Met Gly Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Gln Thr
225 230 235 240
Glu Val Lys Asn Trp Gly Lys Trp Phe Val Asn Thr Leu Asn Leu Asp
245 250 255
Gly Val Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Asp Tyr Met Ser
260 265 270
Ser Trp Leu Ser Ser Val Lys Ser Thr Thr Gly Lys Ser Asn Leu Phe
275 280 285
Ala Val Gly Glu Tyr Trp Asn Thr Ser Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr
290 295 300
Glu Asn Lys Thr Asn Trp Ser Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu His
305 310 315 320
Met Asn Phe Gln Ala Ala Ala Asn Gly Gly Gly Tyr Tyr Asp Met Arg
325 330 335
Asn Leu Leu Asn Asn Thr Met Met Lys Asn His Pro Ile Gln Ala Val
340 345 350
Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu Gln Ser
355 360 365
Trp Val Ser Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu Thr
370 375 380
Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile
385 390 395 400
Pro Ser Gln Ser Val Ser Ala Lys Ser Thr Trp Leu Asp Lys Gln Leu
405 410 415
Ser Ala Arg Lys Ser Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Leu Asp
420 425 430
Asn Gln Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ala His Ala
435 440 445
Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Asp Gly Pro Gly Gly Ser Lys
450 455 460
Thr Met Tyr Val Gly Thr Ala His Ala Gly Gln Val Phe Lys Asp Ile
465 470 475 480
Thr Gly Asn Arg Thr Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Ala Gly Asn Gly
485 490 495
Thr Phe Pro Cys Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp Val Lys Gln
500 505 510
<210> 3
<211> 484
<212> PRT
<213> 脂环酸芽孢杆菌属
<400> 3
Thr Phe Ala Gly Asp Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Met Gly Ser Asp Ala Ser
20 25 30
His Leu Lys Ser Ile Gly Ile Thr Gly Val Trp Phe Pro Pro Ala Tyr
35 40 45
Lys Gly Gln Ser Gln Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Met Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Lys Ala Gln Leu Gln Ser Ala Ile Thr Ser Leu His Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Ala Tyr Gly Asp Val Val Leu Asn His Arg Met Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Thr Ile Ser Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Val Thr Ser Gly Ala Tyr Asn Ile Ser Ala Trp Thr Asp Phe Glu
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp His Ser Tyr
145 150 155 160
Tyr Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ser Gly Lys
165 170 175
Ile Tyr Gln Ile Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Ser Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Gly Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His
195 200 205
Pro Asp Val Gln Thr Glu Val Lys Asn Trp Gly Lys Trp Phe Val Asn
210 215 220
Thr Leu Asn Leu Asp Gly Val Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Phe Asp Tyr Met Ser Ser Trp Leu Ser Ser Val Lys Ser Thr Thr Gly
245 250 255
Lys Ser Asn Leu Phe Ala Val Gly Glu Tyr Trp Asn Thr Ser Leu Gly
260 265 270
Ala Leu Glu Asn Tyr Glu Asn Lys Thr Asn Trp Ser Met Ser Leu Phe
275 280 285
Asp Val Pro Leu His Met Asn Phe Gln Ala Ala Ala Asn Gly Gly Gly
290 295 300
Tyr Tyr Asp Met Arg Asn Leu Leu Asn Asn Thr Met Met Lys Asn His
305 310 315 320
Pro Ile Gln Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly
325 330 335
Gln Ala Leu Gln Ser Trp Val Ser Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr
340 345 350
Ala Thr Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly
355 360 365
Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Ser Gln Ser Val Ser Ala Lys Ser Thr Trp
370 375 380
Leu Asp Lys Gln Leu Ser Ala Arg Lys Ser Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln
385 390 395 400
His Asp Tyr Leu Asp Asn Gln Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly
405 410 415
Asp Ser Ala His Ala Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Asp Gly
420 425 430
Pro Gly Gly Ser Lys Thr Met Tyr Val Gly Thr Ala His Ala Gly Gln
435 440 445
Val Phe Lys Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Asp Thr Val Thr Ile Asn
450 455 460
Ser Ala Gly Asn Gly Thr Phe Pro Cys Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile
465 470 475 480
Trp Val Lys Gln
<210> 4
<211> 269
<212> PRT
<213> 迟缓芽孢杆菌
<400> 4
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 5
<211> 269
<212> PRT
<213> 疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)
<400> 5
Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr
20 25 30
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp
35 40 45
Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr
50 55 60
Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe
65 70 75 80
Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly
100 105 110
Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val
115 120 125
Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly
130 135 140
His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg
145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val
165 170 175
Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr
180 185 190
Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro
195 200 205
Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser
210 215 220
Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly
225 230 235 240
Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro
245 250 255
Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu
260 265
<210> 6
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属
<400> 6
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg
385 390 395 400
Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Asn Lys
485
<210> 7
<211> 485
<212> PRT
<213> 盐敏芽孢杆菌
<400> 7
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Lys Arg
485
<210> 8
<211> 484
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属
<400> 8
Asn Thr Ala Pro Ile Asn Glu Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asp
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Lys Asn Glu Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Lys Thr Gln Tyr Ile Gln Ala Ile Gln Ala Ala Lys Ala Ala Gly
85 90 95
Met Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asn His Lys Ala Gly Ala Asp
100 105 110
Gly Thr Glu Phe Val Asp Ala Val Glu Val Asp Pro Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Thr Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile
165 170 175
Tyr Lys Phe Arg Ser Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr
180 185 190
Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Phe Ala Asp Leu Asp Met Asp
195 200 205
His Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Thr Trp Tyr Val
210 215 220
Asn Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile
225 230 235 240
Lys Tyr Thr Phe Phe Pro Asp Trp Leu Thr Tyr Val Arg Asn Gln Thr
245 250 255
Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Gly Glu Phe Trp Ser Tyr Asp Val Asn
260 265 270
Lys Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Ser Met Ser Leu Phe
275 280 285
Asp Ala Pro Leu His Asn Asn Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Ser Gly
290 295 300
Tyr Phe Asp Met Arg Tyr Leu Leu Asn Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln
305 310 315 320
Pro Ser Leu Ala Val Thr Leu Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly
325 330 335
Gln Ser Leu Gln Ser Trp Val Glu Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr
340 345 350
Ala Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly
355 360 365
Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Lys Tyr Asn Ile Pro Gly Leu Lys Ser Lys
370 375 380
Ile Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln
385 390 395 400
Arg Asp Tyr Ile Asp His Gln Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly
405 410 415
Ile Asp Thr Lys Pro Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly
420 425 430
Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Lys His Ala Gly Lys
435 440 445
Val Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn
450 455 460
Ala Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile
465 470 475 480
Trp Val Ala Lys
<210> 9
<211> 485
<212> PRT
<213> 噬细胞菌属
<400> 9
Ala Ala Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Val Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln Gln Trp Asn Arg Leu Arg Thr Asp Ala Pro Tyr Leu
20 25 30
Ser Ser Val Gly Ile Thr Ala Val Trp Thr Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Lys Ser Ala Val Asn Thr Leu His Ser Asn Gly Ile Gln
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Tyr Thr
100 105 110
Glu Asn Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asn Arg Asn Gln Glu
115 120 125
Thr Ser Gly Glu Tyr Asn Ile Gln Ala Trp Thr Gly Phe Asn Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Thr Thr Tyr Ser Asn Phe Lys Trp Gln Trp Phe His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Ser Leu Ser Arg Ile Phe Lys
165 170 175
Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn
180 185 190
Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro
195 200 205
Asp Val Val Asn Glu Met Lys Lys Trp Gly Val Trp Tyr Ala Asn Glu
210 215 220
Val Gly Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe
225 230 235 240
Ser Phe Leu Lys Asp Trp Val Asp Asn Ala Arg Ala Ala Thr Gly Lys
245 250 255
Glu Met Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu
260 265 270
Asn Asn Tyr Leu Ala Lys Val Asn Tyr Asn Gln Ser Leu Phe Asp Ala
275 280 285
Pro Leu His Tyr Asn Phe Tyr Ala Ala Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Tyr
290 295 300
Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Asn Thr Leu Val Ala Ser Asn Pro Thr
305 310 315 320
Lys Ala Val Thr Leu Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser
325 330 335
Leu Glu Ser Thr Val Gln Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe
340 345 350
Ile Leu Thr Arg Ser Gly Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Met
355 360 365
Tyr Gly Thr Lys Gly Thr Thr Thr Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Glu Pro Leu Leu Lys Ala Arg Lys Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr
385 390 395 400
Gln Arg Asp Tyr Ile Asp Asn Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Thr Lys Ala Lys Ser Gly Leu Ala Thr Val Ile Thr Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Val Gly Thr Ser Asn Ala Gly
435 440 445
Glu Ile Trp Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Thr Asp Lys Ile Thr Ile
450 455 460
Gly Ser Asp Gly Tyr Ala Thr Phe Pro Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Val Trp Val Gln Gln
485
<210> 10
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属
<400> 10
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly His Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys
385 390 395 400
Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Ala Gly Gly Ser Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Ser Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Asn Lys
485
<210> 11
<211> 483
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属
<400> 11
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn
210 215 220
Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly
245 250 255
Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala
260 265 270
Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp
275 280 285
Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn
290 295 300
Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg His Pro
305 310 315 320
Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu
325 330 335
Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Pro Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser His Pro Lys Ser Gly Leu Ala Thr Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Lys
<210> 12
<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属
<400> 12
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ala Leu Lys Ser Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Trp Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Ile
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Arg Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Cys Ala Leu Thr Leu Thr Arg Asp Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys
385 390 395 400
Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Met Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Asn Asn
485
<210> 13
<211> 486
<212> PRT
<213> 脂环酸芽孢杆菌属
<400> 13
Thr Phe Ala Gly Asp Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Met Gly Ser Asp Ala Ser
20 25 30
His Leu Lys Ser Ile Gly Ile Thr Gly Val Trp Phe Pro Pro Ala Tyr
35 40 45
Lys Gly Gln Ser Gln Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Met Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Lys Ala Gln Leu Gln Ser Ala Ile Thr Ser Leu His Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Ala Tyr Gly Asp Val Val Leu Asn His Arg Met Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Thr Ile Ser Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Val Thr Ser Gly Ala Tyr Asn Ile Ser Ala Trp Thr Asp Phe Glu
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp His Ser Tyr
145 150 155 160
Tyr Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ser Gly Lys
165 170 175
Ile Tyr Gln Ile Gln Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Gly Ala Asp Ile Asp Tyr
195 200 205
Asp His Pro Asp Val Gln Thr Glu Val Lys Asn Trp Gly Lys Trp Phe
210 215 220
Val Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Val Arg Leu Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Phe Asp Tyr Met Ser Ser Trp Leu Ser Ser Val Lys Ser Thr
245 250 255
Thr Gly Lys Ser Asn Leu Phe Ala Val Gly Glu Tyr Trp Asn Thr Ser
260 265 270
Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Glu Asn Lys Thr Asn Trp Ser Met Ser
275 280 285
Leu Phe Asp Val Pro Leu His Met Asn Phe Gln Ala Ala Ala Asn Gly
290 295 300
Gly Gly Tyr Tyr Asp Met Arg Asn Leu Leu Asn Asn Thr Met Met Lys
305 310 315 320
Asn His Pro Ile Gln Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu
325 330 335
Pro Gly Gln Ala Leu Gln Ser Trp Val Ser Asp Trp Phe Lys Pro Leu
340 345 350
Ala Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe
355 360 365
Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Ser Gln Ser Val Ser Ala Lys Ser
370 375 380
Thr Trp Leu Asp Lys Gln Leu Ser Ala Arg Lys Ser Tyr Ala Tyr Gly
385 390 395 400
Thr Gln His Asp Tyr Leu Asp Asn Gln Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg
405 410 415
Glu Gly Asp Ser Ala His Ala Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val Met Ser
420 425 430
Asp Gly Pro Gly Gly Ser Lys Thr Met Tyr Val Gly Thr Ala His Ala
435 440 445
Gly Gln Val Phe Lys Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Asp Thr Val Thr
450 455 460
Ile Asn Ser Ala Gly Asn Gly Thr Phe Pro Cys Asn Gly Gly Ser Val
465 470 475 480
Ser Ile Trp Val Lys Gln
485

Claims (32)

1.亲本α-淀粉酶的一种α-淀粉酶变体，该变体包括在对应于根据SEQ ID NO:3的多肽的位置109、51、201、269、294、297、298、193、和314的一个或多个位置处的取代，其中所述变体具有α-淀粉酶活性，并且其中所述亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少89％，例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％序列一致性。
2.根据权利要求1所述的变体，该变体是选自下组的亲本α-淀粉酶的一种变体，该组由以下各项组成：
a.与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少89％序列一致性的一种多肽；
b.由在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多核苷酸编码序列、或者(ii)(i)的全长补体杂交的多核苷酸编码的一种多肽；
c.一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1的成熟多核苷酸编码序列具有至少89％序列一致性的多核苷酸编码；以及
d.SEQ ID NO:3或13的多肽的一个片段，该片段具有α-淀粉酶活性。
3.根据以上权利要求中任一项所述的变体，该变体与根据SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少67％、例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。
4.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中取代的数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个改变。
5.根据以上权利要求中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置109、51、201、269、294、297、298、193、和314中的任一个的一个位置处的取代。
6.根据权利要求5所述的变体，其中该取代是选自以下列表，该列表由以下各项组成；
i.Q51T、Q51A、Q51R、Q51N、Q51D、Q51C、Q51E、Q51G、Q51H、Q51I、Q51L、Q51K、Q51M、Q51F、Q51P、Q51S、Q51W、Q51Y、或Q51V；
ii.M109G、M109A、M109H、M109L、M109R、M109N、M109D、M109C、M109E、M109Q、M109I、M109K、M109F、M109P、M109S、M109T、M109W、M109Y、或M109V；
iii.N193F、N193A、N193R、N193D、N193C、N915E、N193Q、N193G、N193H、N193I、N193L、N193K、N193M、N193P、N193S、N193T、N193W、N193Y、或N193V；
iv.G201Y、G201A、G201R、G201D、G201C、G201E、G201Q、G201H、G201I、G201L、G201K、G201M、G201N、G201P、G201S、G201T、G201W、G201Y、或G201V；
v.T269N、T269Y、T269G、T269A、T269R、T269D、T269C、T269E、T269F、T269Q、T269H、T269I、T269L、T269K、T269M、T269P、T269S、T269W、或T269V；
vi.M294Y、M294N、M294A、M294R、M294D、M294C、M294E、M294Q、M294G、M294F、M294H、M294I、M294L、M294K、M294P、M294S、M294T、M294W、或M294V；
vii.Q297Y、Q297A、Q297R、Q297N、Q297D、Q297C、Q297E、Q297G、Q297H、Q297I、Q297L、Q297K、Q297M、Q297F、Q297P、Q297S、Q297T、Q297W、或Q297V；
viii.A298N、A298R、A298D、A298C、A298E、A298Q、A298G、A298H、A298I、A298L、A298K、A298M、A298F、A298P、A298S、A298T、A298W、A298Y、或A298V；或
ix.N314G、N314A、N314R、N314D、N314C、N314E、N314Q、N314H、N314I、N314L、N314K、N314M、N314F、N314P、N314S、N314T、N314W、N314Y、或N314V，
其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽中的相应位置。
7.根据以上权利要求中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置109、51、201、269、294、297、298、193、和314中的任一个的两个位置处的取代。
8.根据权利要求7所述的变体，其中所述变体包括在对应于以下位置的每个位置处的取代；
(i)51和109；
(ii)109和201；
(iii)269和294；或
(iv)294和297；
其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽中的相应位置。
9.根据以上权利要求中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:3的多肽的位置109、51、201、269、294、297、298、193、和314中的任一个的三个位置处的取代。
10.根据权利要求1至7和9中任一项所述的变体，其中该变体包括在对应于以下位置的每个位置处的取代；
(i)51、109、193和201；
(ii)109、201、269和294；
(iii)201、269、294和297；或
(iv)51、109、193、201、269、294、297、298、和314；
其中每个位置对应于SEQ ID NO:3的多肽中的相应位置。
11.根据以上权利要求中任一项所述的变体，该变体进一步包括在对应于以下位置的位置处的改变；
105L、I、F+206Y；105L、I+206Y+217I；105F+206Y+208Y+217V+246V；105L+206F；105I+206Y+208Y+217I+246V；195F+213S+214T；195F+206Y+208Y+213T+214T+217M、V；195F+206Y+208F，L+213T+214T+217V；195F+206Y+213S+214T；195F+206Y+208Y+213S+214T+217M；195F+206Y+208F+213T+214T+217M；195F+206Y+208Y+213T+214T+217Q；195F+206Y+213G+214T；195F+206Y+213S；195F+206Y+208Y+213T+214T+217M；195F+213S；195F+206Y+208L+213T+214T+217M；195F+213G+214T；206Y、F+208Y+217Q；206Y+208Y+217I；206F+208Y+217M；206Y+208Y；206Y+217M；206Y+208Y+213A+217M；206Y+208Y+217V+246V；206Y+213G；206Y+208F+217V；206N+208Y+217M；206F+208Y+217V；206Y+246V；206Y+217I、V；206F+208F+217I；206Y+208L+213S；206F+217I；206Y+217I+246I；206L+217V；206Y+208F+217H；206L+208F+217I；206L+217V+246L；206F+246V；208Y+213S+217M；208Y+213A+217Q；63I+206Y；63I+206Y+241V；63V+206Y；63V+105L+206Y；63V+206Y+217I；63V+105F+206Y+208F+217I；63V+206Y+246V；63V+206F；63V+206L+217V；63V+105F+206Y；63V+206Y+241V+246L；195F+206Y+208Y+214T+217V；186E+195F+206Y；195F+206Y+208Y+213T+217V；186E+195F+202T+206Y+209S；63I+195F+206Y+210S；195F+206Y+213P+214T；195F+206Y+208Y+213T+214T+217I；186E+195F+206Y+210S；195F+213P；186E+195F+202T+206Y+210S；195F+206H；195F+208Y+213T+214T+217V；206Y+208Y+213T+214T+217V；195F+206Y+217V；195F+206Y+208Y+213S+214T；195F+206Y+208Y；195F+213I+214P；195F+206Y+208Y+213T+214T；195F+206Y；206Y+213S；182P+186E；182S+186E；182V+186K；179L+186H+190P；179L+186K、R、S+190P；179L+190P；179L+182C+186K+190P；179L+182P+186S、V+190P；179L+182S+186Q+190P；173F+174Q；173Y+174S；172K+173Y+174E；193A、D、N、S+195F；213A+214Q；213P+214L；213S+214R；48V+60V；213G+214T；213I+214P；213N+214I；213N+214Q和213P、S+214T，其中根据SEQ ID NO:11进行编号。
12.根据以上权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体包括选自以下列表的成对缺失，该列表由以下各项组成：
181和182；
181和183；
181和184；
182和183；
182和184；以及
183和184；
其中每个位置对应于SEQ ID NO:13的位置。
13.根据以上权利要求中任一项所述的变体，在洗涤剂组合物中该变体相对于SEQ IDNO:3或13的亲本α-淀粉酶具有改进的稳定性。
14.根据以上权利要求中任一项所述的变体，在洗涤剂组合物中该变体相对于SEQ IDNO:3或13的亲本α-淀粉酶具有改进的性能。
15.根据权利要求14所述的变体，其中根据如方法部分中描述的AMSA来确定改进的性能。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的变体，其中该洗涤剂组合物是液体洗涤剂组合物、粉末状洗涤剂组合物、单位剂量洗涤剂组合物、或皂条洗涤剂组合物。
17.一种组合物，该组合物包括根据以上权利要求中任一项所述的α-淀粉酶变体。
18.根据权利要求17所述的组合物，进一步包括至少一种另外的活性组分。
19.根据权利要求16和17中任一项所述的组合物，其中所述另外的活性成分是酶，例如蛋白酶、脂肪酶、纤维素、果胶酸裂合酶和甘露聚糖酶。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中该酶是选自下组，该组由以下各项组成：
(i)与SEQ ID NO:4中的蛋白酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的蛋白酶：32、33、48-54、58-62、94-107、116、123-133、150、152-156、158-161、164、169、175-186、197、198、203-216；
(ii)与SEQ ID NO:5中的脂肪酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的脂肪酶：1-5、27、33、38、57、91、94、96、97、111、163、210、225、231、233、249和254-256；
(iii)与SEQ ID NO:6中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：9、118、149、182、186、195、202、257、295、299、320、323、A339、345和458；
(iv)与SEQ ID NO:7中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：140、195、206、243、260和476；
(v)与SEQ ID NO:8中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：180、181、243和475；
(vi)与SEQ ID NO:9中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：178、179、187、203、458、459、460和476；
(vii)与SEQ ID NO:10中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括修饰的α-淀粉酶：202；
(viii)与SEQ ID NO:11中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：405、421、422和428；和/或
(ix)根据SEQ ID NO:12的α-淀粉酶。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的组合物，该组合物是洗涤剂组合物，如液体洗涤剂组合物或粉末状洗涤剂组合物。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的组合物，该组合物是液体衣物或液体餐具洗涤组合物，例如自动餐具洗涤(ADW)液体洗涤剂组合物，或粉末衣物洗涤，例如皂条，或粉末状餐具洗涤组合物，例如ADW单位剂量洗涤剂组合物。
23.一种编码根据权利要求1至16中任一项所述的变体的多核苷酸。
24.一种包含根据权利要求23所述的多核苷酸的核酸构建体。
25.一种包含根据权利要求24所述的多核苷酸的表达载体。
26.一种宿主细胞，包含根据权利要求23所述的多核苷酸、根据权利要求24所述的核酸构建体、或根据权利要求25所述的所述表达载体。
27.一种产生α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：
a.在适合表达该变体的条件下培养如权利要求26所述的宿主细胞；并且b.回收所述变体。
28.一种获得α-淀粉酶变体的方法，包括将在一个或多个位置处的取代引入与SEQ IDNO:3或13的多肽具有至少89％序列一致性的亲本α-淀粉酶中，所述取代对应于SEQ ID NO:3位置的109、51、201、269、294、297、298、193、和314，其中该变体与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少99％、但小于100％序列一致性，其中该变体具有α-淀粉酶活性；并且回收所述变体。
29.一种改进具有SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列或与其具有至少89％序列一致性的亲本α-淀粉酶的稳定性、特别是洗涤剂稳定性、优选液体洗涤剂稳定性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在一个或多个位置处的取代，所述取代对应于SEQ ID NO:3的位置109、51、201、269、294、297、298、193、和314，其中该变体与SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少99％、但小于100％序列一致性，其中该变体具有α-淀粉酶活性；并且
b)向该亲本α-淀粉酶引入以下取代中的一个或多个；105L、I、F+206Y；105L、I+206Y+217I；105F+206Y+208Y+217V+246V；105L+206F；105I+206Y+208Y+217I+246V；195F+213S+214T；195F+206Y+208Y+213T+214T+217M、V；195F+206Y+208F，L+213T+214T+217V；195F+206Y+213S+214T；195F+206Y+208Y+213S+214T+217M；195F+206Y+208F+213T+214T+217M；195F+206Y+208Y+213T+214T+217Q；195F+206Y+213G+214T；195F+206Y+213S；195F+206Y+208Y+213T+214T+217M；195F+213S；195F+206Y+208L+213T+214T+217M；195F+213G+214T；206Y、F+208Y+217Q；206Y+208Y+217I；206F+208Y+217M；206Y+208Y；206Y+217M；206Y+208Y+213A+217M；206Y+208Y+217V+246V；206Y+213G；206Y+208F+217V；206N+208Y+217M；206F+208Y+217V；206Y+246V；206Y+217I、V；206F+208F+217I；206Y+208L+213S；206F+217I；206Y+217I+246I；206L+217V；206Y+208F+217H；206L+208F+217I；206L+217V+246L；206F+246V；208Y+213S+217M；208Y+213A+217Q；63I+206Y；63I+206Y+241V；63V+206Y；63V+105L+206Y；63V+206Y+217I；63V+105F+206Y+208F+217I；63V+206Y+246V；63V+206F；63V+206L+217V；63V+105F+206Y；63V+206Y+241V+246L；195F+206Y+208Y+214T+217V；186E+195F+206Y；195F+206Y+208Y+213T+217V；186E+195F+202T+206Y+209S；63I+195F+206Y+210S；195F+206Y+213P+214T；195F+206Y+208Y+213T+214T+217I；186E+195F+206Y+210S；195F+213P；186E+195F+202T+206Y+210S；195F+206H；195F+208Y+213T+214T+217V；206Y+208Y+213T+214T+217V；195F+206Y+217V；195F+206Y+208Y+213S+214T；195F+206Y+208Y；195F+213I+214P；195F+206Y+208Y+213T+214T；195F+206Y；206Y+213S；182P+186E；182S+186E；182V+186K；179L+186H+190P；179L+186K、R、S+190P；179L+190P；179L+182C+186K+190P；179L+182P+186S、V+190P；179L+182S+186Q+190P；173F+174Q；173Y+174S；172K+173Y+174E；193A、D、N、S+195F；213A+214Q；213P+214L；213S+214R；48V+60V；213G+214T；213I+214P；213N+214I；213N+214Q和213P、S+214T，其中根据SEQ ID NO:11进行编号，
其中该变体与SEQ ID NO:3或13的多肽具有至少67％，例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少99％、但小于100％序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性和与亲本α-淀粉酶相比的改进的洗涤剂稳定性和/或改进的性能。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中该变体具有以下亲本α-淀粉酶的至少50％、例如至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％的活性，该亲本α-淀粉酶具有SEQ ID NO:3或13的氨基酸序列。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中根据如在方法部分中描述的Phadebas测定来确定该活性。
32.根据权利要求1至16中任一项所述的变体在清洁过程，如衣物洗涤或包括餐具洗涤和工业清洁的硬表面清洁中的用途。
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