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TWI384989B - 氨基磷酸化物烷化劑前藥 - Google Patents

氨基磷酸化物烷化劑前藥 Download PDF

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TWI384989B
TWI384989B TW095123590A TW95123590A TWI384989B TW I384989 B TWI384989 B TW I384989B TW 095123590 A TW095123590 A TW 095123590A TW 95123590 A TW95123590 A TW 95123590A TW I384989 B TWI384989 B TW I384989B
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TW
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alkylating agent
aminophosphate
cancer
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prodrug
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TW095123590A
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English (en)
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TW200800228A (en
Inventor
Mark Matteucci
Jian-Xin Duan
Hailong Jiao
Jacob Kaizerman
Steve Ammons
Original Assignee
Threshold Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Publication of TW200800228A publication Critical patent/TW200800228A/zh
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Description

氨基磷酸化物烷化劑前藥 相關申請案之交互參考資料
本申請案係申明補充美國暫時專利申請案號60/695,755，於2005年6月29日提申，在此併入本案以作為參考資料。
發明領域
本發明係提供數種組成物與方法，以氨基磷酸化物烷化劑前藥治療癌症與其他過度增生疾病。本發明一般相關於化學、生物、分子生物、藥理學與藥物領域。
 發明背景
使用於癌症化療之烷基化試劑(“烷化劑”或“芥(mustard)”)包含一分散族群之化學物質，其具有在生理條件下烷基化生物性必需之巨分子如DNA之能力(請見Hardmanet al.,The Pharmacological Basis of Therapeutics, 2001,1389－1399,McGraw－Hill,New York,USA)。DNA烷基化被認定為在烷化劑抗腫瘤活性之機制上扮演一種要角色。化療用烷化劑係作為一強親電子基，例如，經由鄰近－雜原子－穩定化陽離子中間產物，如氮丙啶(aziridine)或吖丙啶(aziridinium)陽離子。
使用於癌症治療之含氨基磷酸化物之烷化劑，如環磷醯胺與異環磷醯胺，為化療烷化劑之一重要亞群。環磷醯胺與異環磷醯胺皆在肝臟中被活化，而所釋放之活化烷化劑則會在腫瘤細胞中烷基化親核片段，如DNA，而作為化療試劑。若活性烷化劑自腫瘤中釋放出，DNA與其他親核片段如健康、非癌性細胞中生物分子之磷酸鹽、胺基、硫氫基、羥基、羧基與咪唑基，皆可被烷基化。此種健康細胞之烷基化可能會導致病患不希望之毒性反應(請見Hardmanet al.,supra) 。
目前仍需要新的含氨基磷酸化物烷化劑，其可用於治療癌症或其他過度增生之疾病，較佳該化合物對於正常細胞較不具毒性。本發明則迎合此種需求，提供新穎之氨基磷酸化物烷化劑前藥，以及使用它們之治療方法，如下段所摘述。
 發明概要
本發明之一觀點係提供一種化合物，其為缺氧活化之氨基磷酸化物烷化劑前藥，及其合成方法。本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥可具有式Alk－T，其中Alk為氨基磷酸化物烷化劑，T為L－Z3 ，其中L為聯結基，Z3 為生物還原基團。
在一觀點中，本發明係提供如式(I)之氨基磷酸化物烷化劑前藥： 其中Y1 為O、S、NR6 或NSO2 R6 Y2 為O、S、NR6 、NCOR6 或NSO2 R6 ；R1 －R5 每一者皆獨立地為氫、羥基、胺基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基胺基、C1 －C6 二烷基胺基、芳基、雜芳基、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基、芳醯基或雜芳醯基；或是R1 －R5 任二者共同形成一C3 －C1 0 雜環；或R1 －R5 每一者皆獨立地為一Trigger T，具式L－Z3 ；L係選自於由－[C(Z1 )2 －Y3 ]v －[C(＝O)－O]q －[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]u －C(Z1 )2 [－C(Z1 )＝C(Z1 )]g ；以及－[C(Z1 )2 －Y3 ]v －(S(＝O)2 )q －[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]u －C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]g 組成之族群；其中v、q、u與g每一者皆獨立地為0或1；Y3 為S、O或NR7 ，其中每一R7 皆獨立地為氫、羥基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基胺基、C1 －C6 二烷基胺基、芳基、雜芳基、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基、芳醯基，或雜芳醯基；Y4 為O、S或－NR7 －C(＝O)－O－；Z1 與Z1 每一者皆獨立地為氫、鹵素、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、芳基、雜芳基、C3 －C8 環烷基、雜環基、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基、芳醯基，或雜芳醯基；Z2 為C1 －C6 烯基、C1 －C6 雜烯基、
其中每一X1 皆獨立地為N或CR8 ，其中R8 獨立地為氫、鹵素、硝基、氰基、CHF2 、CF3 、CO2 H、胺基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C1 －C6 環烷基、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基胺基、C1 －C6 二烷基胺基、芳基、CON(R7 )2 、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基、芳醯基或雜芳醯基；X2 為NR7 、S或O；以及Z3 為生物還原基團，具有化學式選自於由：,,,,,,,以及；組成之族群；但書為式(I)中：(i)R1 －R5 之至少二者選自於由2－鹵化烷基、烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；(ii)R1 －R5 之至少一者選自於由2－鹵化烷基、2－C1 －C6 烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；且NR2 R3 或NR4 R5 之至少一者為；或(iii)NR2 R3 與NR4 R5 為；以及其單獨異構物或異構物之消旋物或非消旋物混合物、生物空間異構物、藥效集團，或藥學上可接受之鹽類、媒合物、水合物或前藥。
在一實施例中，Z3 為一生物還原基團，在氧化還原反應中可接受一或多個電子。
在一相關實施例中，本發明係提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，在缺氧細胞中具有IC5 0 或GI5 0 為50 μM至0.01 nM。在一相關實施例中，本發明係提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，具缺氧細胞毒性IC5 0 為50 μM至0.01 nM，在相對應之常氧細胞中至多數百萬倍、至多10,000倍，以及至多1000倍較小毒性。在一相關實施例中，該細胞毒性係以抗增生試驗測量，並使用化合物在缺氧與常氧細胞中之相對IC5 0 值。在一相關實施例中，該細胞毒性係選植生殖試驗測量，並使用缺氧與常氧細胞中之相對C1 0 、C5 0 ，或C9 0 值。
在另一相關實施例中，本發明係提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，具IC5 0 值，在缺氧細胞中，為50 μM至0.01 nM。在另一相關實施例中，本發明係提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，其在相對應之常氧細胞中毒性低5000倍，藉由測量缺氧與常氧細胞中之相對IC5 0 值。在另一相關實施例中，本發明係提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，在缺氧細胞中具IC5 0 值為50 μM至0.01 nM，其在相對應之常氧細胞中毒性低1000倍，藉由測量缺氧與常氧細胞中之相對IC5 0 值。
在一相關實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥具有一缺氧毒性0.1 nM至50 μM，以及一缺氧毒性比例，HCR，藉由測量常氧與缺氧細胞毒性之比例，並於本說明書之後有更詳盡之定義，為10至100,000。在一相關實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥具一缺氧細胞毒性，為0.1 nM至50 μM，以及HCR為25至100,000。在另一相關實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥具有一缺氧細胞毒性0.1 nM至5 μM，以及HCR為50至10,000。
本發明之一觀點為提供一種新穎之氨基磷酸化物烷化劑，用以治療癌症與其他過度增生疾病。
在一觀點中，本發明係提供一種醫藥配方，包含本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥，與一藥學上可接受之賦形劑、載體或稀釋劑。
在一觀點中，本發明提供一種治療癌症與其他過度增生疾病之方法，包含投以醫療有效劑量之本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥，或已知者，至需要此種治療之病患。在一實施例中，待治療之癌症係抵抗第一線、第二線或第三線治療，或是一復發癌症。在一實施例中，待治療之癌症為轉移性癌症。在一實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥，或已知者，係與至少另一抗癌試劑組合投藥。
圖式簡單說明
第1圖顯示化合物25(50 mg/kg)對於腫瘤生長之作用，在H460體外移殖小鼠模式中。
第2圖顯示化合物25(100 mg/kg)對於腫瘤生長之作用，在H460體外移殖小鼠模式中。
第3圖顯示化合物25(150 mg/kg)與CDDP組合劑量對於腫瘤生長之作用，在H460體外移殖小鼠模式中。
第4圖顯示化合物25與CDDP組合劑量對於腫瘤生長之作用，在H460體外移殖小鼠模式中。
第5、6、7圖顯示化合物25與吉西他賓(Gemcitabine)組合對於腫瘤生長之作用，在H460體外移殖小鼠模式中。
 較佳實施例之詳細說明
本發明各種不同觀點與實施例之詳細說明係組織如下：第I部分係提供使用之定義；第II部份係描述本發明化合物與製造它們之方法；第III部分描述使用本發明化合物，單獨或組合，之治療、療法、投藥與配方；以及第IV部分則提供本發明化合物合成方法與生物試驗之範例。此詳細敘述係組織為數個部份，以方便讀者，所揭示之任何一部分皆可應用於本發明觀點中。
I.定義
下列定義係提供以輔助讀者。除非另有定義，於此所使用之所有術語、注釋與其科學性與醫藥性術語或專門用語，係與一般熟習此技術領域者所知者通用。在某些情況下，具有共通意義之術語皆於此定義，以釐清及/或作為參考資料，且此種定義之內涵不應建構為與此技術一般認知之術語實質上定義不同。
於此所使用之“一”係指“至少一”或“一或多種”。
“烷基”係指一直線形單價烴基自由基，或分支飽和單價烴基自由基，具如字首所指出之碳原子數目。如此所揭示，字首(C1 －Cq q )、C1 － q q 或C1 －Cq q ，其中qq為2－20之整數，具相同意義。例如，(C1 －C8 )烷基、C1 － 8 烷基或C1 －C8 烷基，包括甲基、乙基、正丙基、2－丙基、正丁基、2－丁基、第三－丁基、戊基及其類似物。就於此使用之每一定義而言(如烷基、烯基、烷氧基、芳烷基氧基)，當字首並不包含於內指示烷基部分主要碳鏈上之碳原子數目時，該自由基或其部份將具有六個或更少個主鏈碳原子。(C1 －C6 )烷基可進一步選擇性地經取代基取代，包括，例如，氘(“D”)、羥基、胺基、單或二(C1 －C6 )烷基胺基、鹵素、C2 －C6 烯基醚、氰基、硝基、乙烯、乙炔、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基硫基、－COOH、－CONH2 、單－或二(C1－C6 )烷基－羧醯胺基、－SO2 NH2 、－OSO2 －(C1 －C6 )烷基、單或二(C1 －C6 )烷基磺醯胺基、芳基、雜芳基、烷基磺醯氧基、雜烷基磺醯氧基、芳基磺醯氧基或雜芳基磺醯氧基。
“烯基”係指一直線形單價烴基自由基或分支單價烴基自由基，具如字首所指出之碳原子數目，並包含至少一雙鍵，但不大於三個雙鍵。例如(C1 －C6 )烯基包括乙烯、丙烯、1,3－丁二烯，及其類似物。烯基可更進一步經取代基取代，包括，例如，氘(“D”)、羥基、胺基、單或二(C1 －C6 )烷基胺基、鹵素、C2 －C6 烯基醚、氰基、硝基、乙烯、乙炔、C1－C6 烷氧基、C1 －C6 烷基硫基、－COOH、－CONH2 、單－或二(C1－C6 )烷基－羧醯胺基、－SO2 NH2 、－OSO2 －(C1 －C6 )烷基、單或二(C1 －C6 )烷基磺醯胺基、芳基、雜芳基、烷基磺醯氧基、雜烷基磺醯氧基，以及芳基或雜芳基磺醯氧基。
“烷化劑”係指一反應性片段，可形成一共價烷基聯結至巨分子上，經由與巨分子上之親核基之親電子性反應。“氨基磷酸化物烷化劑”係指一烷化劑，其中氮丙啶(aziridine)或吖丙啶(aziridinium)親電子基出現於或由分子內環化反應產生。
“烯類”係指一直線形飽和雙鍵烴基自由基，具有1至12個碳原子或分支飽合二價烴基自由基，具有1至12個碳原子，選擇性地經取代基取代，包括如氘(“D”)、羥基、胺基、單或二(C1 －C6 )烷基胺基、鹵素、C2 －C6 烯基醚、氰基、硝基、乙烯、乙炔、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基硫基、－COOH、－CONH2 、單－或二(C1 －C6 )烷基－羧醯胺基、－SO2 NH2 、－OsO2 －(C1 －C6 )烷基、單或二(C1 －C6 )烷基磺醯胺基、芳基、雜芳基、烷基磺醯氧基、雜烷基磺醯氧基，以及芳基或雜芳基磺醯氧基。例如，烯基包括甲烯基、乙烯基、丙烯基、2－甲基－丙烯基、戊烯基、己烯基，及其類似物。
“雜烯基”實質上具有上述foran烯基之意義，除了具有一或多個雜原子之外(即氧、硫、氮及/或磷)，以烯基雙自由基形式呈現。例如，雜烯基包括，－CH2 OCH2 O－、－2 CH2 OCH2 CH2 －、－CH2 CH2 N(CH3 )CH2 CH2 －、－CH2 CH2 SCH2 CH2 －，及其類似物。
“芳基”係指一單價單環或雙環芳香族烴基自由基，具6至10個環原子，其獨立地經1至8個取代基取代，較佳為1、2、3、4或5個取代基，選自於氘(“D”)、烷基、烷基、環烷基烷基、鹵素、硝基、氰基、羥基、烷氧基、胺基、醯基胺基、單－烷基胺基、二－烷基胺基、鹵素烷基、鹵素烷氧基、雜烷基、COR(其中R為氫、烷基、環烷基、環烷基－烷基、苯基或苯基烷基)、－(CR’R”)n －COOR(其中n為0至5之整數，R’與R”係獨立地為氫或烷基，R為氫、烷基、烷基、環烷基烷基、苯基或苯基烷基)，或－(CR’R”)n －CONRx Ry (其中n為0至5之整數，R’與R”係獨立地為氫或烷基，以及Rx 與Ry 係獨立地選自氫、烷基、環烷基、環烷基烷基、苯基或苯基烷基)。在一實施例中，Rx 與Ry 一同為環烷基或雜環基。更特別的是，術語芳基包括，但不侷限於，苯基、雙苯基、1－萘基與2－萘基，及其取代形式。
“環烷基”係指一單價環狀烴基自由基，具3至7個環狀碳。該環烷基可具有一或多個雙鍵，亦可選擇性地、獨立地經1、2、3或4個取代基取代，選自烷基，選擇性地經苯基或－C(O)Rz 取代(其中Rz 為氫、烷基、鹵素烷基、胺基、單－烷基胺基、二－烷基胺基、羥基、烷氧基或選擇性經取代之苯基)。更特別的是，術語環烷基包括，例如環丙基、環己基、環己烯基、苯基環己基、4－羧基環己基、2－羧基醯胺環己烯基、2－二甲基胺基羰基－環己基，及其類似物。
“雜烷基”係指一烷基自由基，如此所定義，具1、2或3個取代基，獨立地選自氰基、－ORw 、－NRx Ry ，以及－S(O)p Rz (其中p為0至2之整數)，應了解到，雜烷自由基之連接點係透過雜烷自由基上之一碳原子。Rw 為氫、烷基、環烷基、環烷基－烷基、芳基、芳烷基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、羧醯胺基，或單－或二烷基胺基甲醯基。Rx 為氫、烷基、環烷基、環烷基－烷基、芳基或芳烷基。Ry 為氫、烷基、環烷基、環烷基－烷基、芳基、芳烷基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、羧醯胺基、單－或二－烷基胺基甲醯基或烷基磺基。Rz 為氫(其中n為0)、烷基、環烷基、環烷基－烷基、芳基、芳烷基、胺基、單－烷基胺基、二－烷基胺基，或羥基烷基。代表性範例包括，例如，羥基乙基、2,3－羥基丙基、2－甲氧基乙基、芐基氧基甲基、2－氰基乙基，以及甲基磺基－乙基。就上述每一例而言，Rw 、Rx 、Ry 與Rz 可更進一步地經胺基、鹵素、氟、烷基胺基、二－烷基胺基、OH或烷氧基取代。此外，字首之碳原子數目(如C1 －C1 0 )係指雜烷基部份之碳原子總數，氰基、－ORw 、－NRx Ry 或S(O)p Rz 部分除外。
在一實施例中，Rx 與Ry 一同為環烷基或雜環基。
“雜芳基”係指一單價單環、雙環或三環自由基，具5至12個環原子，具有至少一芳香環，含有2或3個環雜原子，選自N、O或S，其餘之環原子為C，雜芳基自由基之連接點位於一芳香基上。該雜芳環係選擇性地、獨立地經1至8個取代基取代，較佳為一、二、三或四個取代基，選自烷基、環烷基、環烷基－烷基、鹵素、硝基、氰基、羥基、烷氧基、胺基、醯基胺基、單－烷基胺基、二－烷基胺基、鹵素烷基、鹵素烷氧基、雜烷基、－COR(其中R為氫、烷基、苯基或苯基烷基、－(CR’R”)n －COOR(其中n為0至5之整數，R’與R”係獨立地為氫或烷基，以及R為氫、烷基、環烷基、環烷基－烷基、苯基或苯基烷基)，或－(CR’R”)n －CONRx Ry (其中n為0至5之整數，R’與R”係獨立地為氫或烷基，以及Rx 與Ry 每一者皆獨立地為氫、烷基、烷基、環烷基－烷基、苯基或苯基烷基)。在一實施例中，Rx 與Ry 一同為環烷基或雜環基。更特別的是術語雜芳基包括，但不侷限於，吡啶基、呋喃基、噻嗯基、噻唑基、異噻唑基、三唑基、咪唑基、異噁唑基、吡咯、吡唑基、噠嗪酮基、嘧啶基、苯並呋喃基、四氫苯並呋喃基、異苯並呋喃基、苯並噻唑基、苯並異噻唑基、苯並三唑基、吲哚基、異吲哚基、苯並噁唑基、喹啉基、四氫喹啉基、異喹啉基、苯並咪唑基、苯並異噁唑基或苯並噻嗯基、吲唑基、吡咯嘧啶基、吲哚啉基、吡嗪並吡啶基、偶氮吡啶基、吡嗪嘧啶基、三唑嘧啶基、吡咯三嗪基、吡唑三嗪基、三唑三嗪基、吡唑四嗪基、六吖－茚基，以及七吖－茚基，及其衍生物。除非另有指出，該環上雜原子之排列可依據組成環原子鍵結特性可允許之方式排列。
“雜環基”或“環雜烷基”係指一3至8個碳原子之飽和或未飽和非芳香環狀自由基，其中一至四個環原子為雜原子，選自於O、NR(其中R為氫、烷基、環烷基、環烷基烷基、苯基或苯基烷基)、P(＝O)ORw ，或S(O)p (其中p為一0至2之整數)，其餘之環原子為C，其中一或二個C原子可選擇性地經一羰基取代。雜環基係選擇性地、獨立地經一、二、三或四個取代基取代，選自於烷基、芳基、芳基烷基、雜芳基、雜芳基烷基、環烷基、環烷基烷基、鹵素、硝基、氰基、羥基、烷氧基、胺基、單－烷基胺基、二－烷基胺基、鹵素烷基、鹵素烷氧基、－COR(其中R為氫、烷基、環烷基、環烷基烷基、苯基或苯基烷基)、－(CR’R’)n －COOR(n為0至5之整數，R’與R”係獨立地為氫或烷基，以及R為氫、烷基、環烷基、環烷基烷基、苯基或苯基烷基)，或－(CR’R”)n －CONRx Ry (其中n為0至5之整數，R’與R”係獨立地為氫或烷基，Rx 與Ry 每一者係獨立地為氫、烷基、烷基、環烷基烷基、苯基或苯基烷基)。更特別的是術語雜環基包括，但不侷限於，吡啶基、四氫吡喃基、N－甲基哌啶－3－基、N－甲基吡咯烷－3－基、2－吡咯酮－1－基、呋喃基、喹啉基、噻嗯基、苯並噻嗯基、吡咯烷基、哌啶基、嗎啉基、吡咯烷基、四氫呋喃基、四氫硫基呋喃基、1,1－二氧－六氫－1△6 －硫基吡喃－4－基、四氫咪唑[4、5－c]吡啶、咪唑啉基、哌嗪基，以及哌啶－2－酮基，及其衍生物。字首指示碳原子數目(如C3 －C1 0 )係指環雜烷基或雜環基部份之碳原子總數，除了雜原子數目之外。
“C1 －C6 醯基”係指－CO－(C1 －C6 烷基)，其中術語烷基係如上述定義。
“C1 －C6 雜醯基”係指－CO－(C1 －C6 雜烷基)，其中術語雜烷基汐如上述定義。
“芳醯基”係指－CO－芳基，其中術語芳基係如上述定義。
“雜芳醯基”係指－CO－雜芳基，其中術語雜芳基係如上述定義。
“Rs u l 磺醯氧基”係指Rs u l －S(＝O)2 －O－，包括烷基磺醯氧基、雜烷基磺醯氧基、環烷基磺醯氧基、雜環基磺醯氧基、芳基磺醯氧基，以及雜芳基磺醯氧基，其中Rs u l 分別為烷基、雜烷基、環烷基、雜環基、芳基與雜芳基，其中烷基、雜烷基、環烷基、雜環基、芳基與雜芳基係如上述定義。烷基磺醯氧基之範例包括Me－S(＝O)2 －O－、Et－S(＝O)2 －O－、CF3 －S(＝O)2 －O－，及其類似物，芳基磺醯氧基之範例包括及其類似物。
烷基磺醯氧基、雜烷基磺醯氧基、環烷基磺醯氧基、雜環基磺醯氧基、芳基磺醯氧基，以及雜芳基磺醯氧基，可為氨基磷酸化物烷化劑之離去基，且可在細胞中被核酸如DNA或RNA，以及蛋白質之咪唑、羧酸酯或硫基取代，導致烷基化與細胞死亡。各種Rs u l 磺醯氧基與核酸、蛋白質或水之反應速率可經調節，取決於如Rs u l 片段之電子吸引特性與空間佔據性，並可提供氨基磷酸化物烷化劑與其前藥，其在一般腫瘤中具毒性，尤其是在腫瘤缺氧區域，而非在健康細胞中。
“取代基”係隨著特別描述於上述每一基團之定義，選自於：氘、－鹵素、－OR’、－NR’R”、－SR’、SiR’R”R”、－OC(O)R、－C(O)R、－CO2 R、－CONR’R”、－OC(O)NR’R”、－NR”C(O)R、－NR’－C(O)NR”R'''、－NR”C(O)2 R、－NH－C(NH2 )＝NH、－NR’C(NH2 )＝NH、－NH－C(NH2 )＝NR’、－S(O)R、－S(O)2 R、－S(O)2 NR’R”、－NR’S(O)2 R”、－CN與－NO2 、－R’、－N3 、過氟(C1 －C4 )烷氧基，以及過氟(C1 －C4 )烷基，數字自0至自由基開放價之總數；其中R’、R”與R皆獨立地選自氫、C1 － 8 烷基、C3 － 6 環烷基、C2 － 8 烯基、C2 － 8 炔基、未經取代之芳基與雜芳基、(未經取代之芳基)－C1 － 4 烷基，以及未經取代之芳基氧基－C1 － 4 烷基、具1－3個鹵素取代基之芳基、未經取代之C1 － 8 烷基、C1 － 8 烷氧基或C1 － 8 硫基烷氧基，或未經取代之芳基－C1 － 4 烷基。當R’與R”聯結至同一氮原子上時，他們可與氮原子結合形成3－、4－、5－、6－或7－元環。例如，－NR’R”包括1－吡咯烷基與4－嗎啉基。其他適當之取代基包括每一上述芳基取代基，連接至一環原子上，藉由烯基聯結形成1－4碳原子。在芳基或雜芳基鄰近原子上之取代基可選擇性地經取代基式－T2 －C(O)－(CH2 )q －U3 －取代，其中T2 與U3 獨立地為－NH－、－O－、－CH2 －或單鍵，以及q為0至2之整數。此外，在芳基或雜芳基鄰近原子上之取代基，可選擇性地經取代基，式－A－(CH2 )r －B－，取代，其中A與B獨立地為－CH2 －、－O－、－NH－、－S－、－S(O)－、－S(O)2 －、－S(O)NR’－或一單鍵，以及r為1至3之整數。新環之一單鍵可選擇性地經一雙鍵取代。此外，在芳基或雜芳基鄰近原子上之取代基可選擇性地經取代基，式－(CH2 )s －X5 －(CH2 )t －，取代，其中s與t係獨立地為整數0至3，以及X5 為－O－、－NR’－、－S－、－S(O)－、－S(O)2 －，或－S(O)2 NR’－。－NR’－與－S(O)2 NR’－中之取代基R’係選自氫或未經取代之C1 － 6 烷基。
本發明某些化合物具有不對稱碳原子(光學中心)或雙鍵；消旋物、非鏡像物、幾何異構物、空間異構物與單獨異構物(如分離之鏡像物)，皆包含於本發明範疇中。本發明化合物亦可包含原子同位素之非天然部分，在建構此化合物之一或多個原子上。例如，該化合物可經放射性同位素標記，如氚(3 H)、碘－125(1 2 5 I)或碳－14(1 4 C)。本發明化合物之所有同位素變異物，不論是否為放射性，係包含於本發明之範疇中。
術語“藥學上可接受之鹽類”包括活性化合物之鹽類，其以相對非毒性酸或鹼製備，取決於於此所述化合物上之特定取代基。當本發明化合物含有相對酸性功能時，鹼添加鹽類便可藉由將此化合物之天然形式，與足量之希望鹼接觸，不論是單純或於適當之惰性溶劑中。衍生自藥學上可接受之無機鹼之鹽類範例包括鋁、銨、鈣、銅、鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳、亞錳、鉀、鈉、鋅，及其類似物。衍生自藥學上可接受之有機鹼之鹽類包括一級、二級與三級胺，包括經取代之胺、環狀胺、天然發生之胺及其類似物，如精胺酸、甜菜鹼、咖啡因、膽鹼、N,N’－二苄基乙二胺、二乙胺、2－二乙基胺基乙醇、2－二甲基胺基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N－乙基嗎啉、N－乙基哌啶、還原葡醣胺、葡醣胺、組胺酸、海巴青黴素、異丙基胺、離胺酸、甲基還原葡醣胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、多胺樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可鹼(theobromine)、三乙胺、三甲胺、三丙胺、胺基丁三醇，及其類似物。當本發明化合物含有相對鹼性之功能時，酸添加鹽類便可藉由將此化合物之天然形式，與足量之希望酸接觸，不論是單純或於適當之惰性溶劑中。藥學上可接受之酸添加鹽類之範例包括衍生自無機酸，如氫氯酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、單氫碳酸、磷酸、單氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、單氫硫酸、氫碘酸或硫酸，及其類似物，以及衍生自非毒性有機酸之鹽類，如醋酸、丙酸、異丁酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、軟木酸、富馬酸、苦杏仁酸、酞酸、苯磺酸、p－甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸，及其類似物。亦包括胺基酸鹽類如精胺酸鹽及其類似物，以及有機酸鹽，如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸及其類似物(請見，如Berge,S.M.,et al,“Pharmaceutical ts”,Journal of Pharmaceutical Science,1977,66,1－19)。本發明某些特定化合物同時含有鹼性與酸性官能基，可使化合物轉換為鹼或酸添加鹽類。
該化合物之中性形式可藉由將該鹽類與鹼或酸接觸，並以傳統方式分離出原化合物而產生。該化合物之原形式不同於各種鹽類形式，在某些物理特性方面，如在極性溶劑中之溶解度，否則該鹽類與本發明原化合物等效，用於本發明目的。
本發明某些化合物具有未媒合之形式，以及媒合形式，包括水合形式。一般而言，該媒合形式與未媒合形式等效，且可包含於本發明範疇中。本發明某些化合物可具有多種結晶或非晶型形式。一般而言，所有物理形式在本發明用途中皆為等效，並包含於本發明範疇中。
於此所使用，“葡萄糖類似物”包括單－、二－與三糖。葡萄糖類似物包括葡醣胺、N－乙醯基－葡醣胺；果糖；甘露醣與甘露醣衍生物；葡萄糖與葡萄糖衍生物，包括，但不侷限於，2－去氧葡萄糖(2－DG)、N－乙醯基－2－胺基－2－去氧葡萄糖、3－胺基－3－去氧－葡萄糖、2－胺基－2－去氧－葡萄糖；以及半乳糖與半乳糖衍生物，包括，但不侷限於，2－去氧－D－半乳糖、D－4－胺基－4－去氧－半乳糖與D－2－胺基－2－去氧－半乳糖。因此，葡萄糖類似物可不同於葡萄糖或衍生物，如DG與葡醣胺，為其差位異構物(epimer)。此外，葡萄糖類似物可為前述任一化合物之氟化衍生物。此外，任一前述化合物中環上之氧可經空間等效物(isostere)取代，選自於由S、碸，及其類似物組成之族群。例如，葡萄糖類似物可為5－硫基－D－葡萄糖或其衍生物。
波浪線“”係指一基團或片段與另一者之連接點。例如，與二者皆代表與另一基團或片段之連接點為硫基。
術語CO、C(O)、C(＝O)、－CO－於此可交換使用。術語CO2 與COO於此可交換使用。術語SO2 、S(O)2 於此可交換使用。術語SO與S(＝O)於此可交換使用。術語PO與P(＝O)於此可交換使用。
於此所使用，一化合物片段如一分子、基團或原子之“生物空間等效物”係指另一化合物片段，具有類似之大小與電子對空間位置。生物空間等效物與生物空間等效化為預測化合物邏輯性活性之已知工具，以具有類似大小、形狀與電子密度之化合物具有類似之生物活性之假設為基礎。已知之生物空間等效替換包括，如，－F、－OH、－NH2 、－Cl與－CH3 可互相交換；－Br與－i －C3 H7 可互相交換；－I與－t －C4 H9 可互相交換；－O－、－S－、－NH－、－CH2 與－Se－可互相交換；－N＝、－CH＝與P＝(環狀或非環狀片段)可互相交換；苯基與吡啶基可互相交換；－C＝C－與－S－(例如，苯與噻吩)可互相交換；芳香族氮(Ra r －N(Ra r )－Ra r )與未飽和碳(Ra r －C(＝Ra r )－Ra r )可互相交換；以及－CO－、－SO－與－SO2 －可互相交換。這些範例並非限制生物空間等效物之範圍，且熟習此領域者應可辨識其它技術上已知之生物空間等效物取代。請見，如，Pataniet al., 1996,Chem.Rev. 96：3147－76；以及Burger,1991,A.Prog.Drug Res. 37：287－371。
已知分子之結合能力或功能之合理定量預測，可以分子中一小群原子或官能基之空間排列為基礎。於此所使用，如排列之一稱之為“藥效集團(phamarcophore)”，一旦分子中之藥效集團被辨識出，此資訊便可用於辨識其他含有相同或類似藥效集團之分子。此方法為熟習藥物化學領域者已知，且如此申請案所描述之結構資訊學，可辨識氨基磷酸化物烷化劑前藥與氨基磷酸化物烷化劑。可獲得呈現藥效集團相關搜尋之程式為3D phamarcophore search，得自Chemical Computing Group(see http：//www.chemcomp.com/fdept/prodinfo.htm)。
“選擇性”或“選擇性地”係指後續所描述之事件或環境可發生，但不一定要發生，且該敘述包括該事件或環境發生之案例，以及未發生之案例。例如，“雜環基，選擇性地經烷基單－或二取代”，係指該烷基可，但未必要，存在，且該描述包括其中雜環基為經烷基無－或二－取代之情況，以及其中雜環基不經烷基取代之情況。
取代物或變異物之組合僅於此組合導致一穩定或化學性適當之化合物時可使用。一穩定之化合物或化學性適當之化合物為其中化學結構實質上未改變者，當維持於4℃或更低，在無溼氣或其他化學反應條件下，至少一周。
於此所使用，“前藥”係指一化合物，在投藥後，其被代謝，否則被轉換為一具活性或更具活性形式，相對於本身之至少一生物特性。為了製備一前藥，一醫藥化合物(或其適當之前驅物)係經化學修飾，使得該經修飾形式較不具活性或失去活性，但該化學修飾仍可有效地逆轉，在某些生理條件下，使得該化合物之醫藥活化形式可藉由代謝或其他生物過程產生。前藥可具有，相對於藥物，經改變之代謝穩定性或傳送特性，較小之副作用或較低之活性，或增進之香味，如(請見參考資料Nogrady,1985,Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press,New York,pages 388－392)。該前藥亦可使用並非藥物，但可在某些生物條件下活化而產生具醫藥活性之化合物製備。於此所使用之氨基磷酸化物烷化劑前藥，為活化後會釋放活性氨基磷酸化物烷化劑之前藥。
於此所使用之“細胞毒性試劑”為一試劑或化合物，其可對於細胞產生一毒性作用。如此所使用“細胞穩定試劑”係指一試劑，其可抑制或壓抑細胞生長與複製。
於此所使用之“缺氧細胞”為處於體內或體外缺氧環境之細胞，如缺氧腫瘤區域。於此所使用之“常氧細胞”為處於體內或體外常氧環境之細胞。於此所使用之一化合物或試劑之“缺氧毒性”為其於缺氧細胞中之細胞毒性。於此使用之該化合物或試劑之“常氧細胞毒性”為其於常氧細胞中之細胞毒性。
於此所使用之“生物還原性基團”係指一基團，其接受氧化還原反應之電子。該生物還原性基團為(1)可還原，即，可接受電子、氫，及/或氫化物離子；(2)可體內或體外還原；(3)在缺氧下可體內及/或體外還原；(4)可體內及/或體外，藉由DT－黃遞酶(diaphorase)、硫基，或藉由光化學或電子化學之方法；或(5)可經由生物過程消除及/或切割，如酵素性水解、代謝等。
例如，如下述細節，一生物還原性基團為硝基咪唑，其可經各種基團取代。生物還原性基團之範例包括，但不侷限於，以電子缺乏性硝基苯、電子缺乏硝基苯甲酸醯胺、硝基唑、硝基咪唑、硝基噻嗯基、硝基噻唑基、硝基噁唑基、硝基呋喃基，以及硝基吡咯為基礎，其中這些片段之每一組皆經選擇性取代，如有生物還原基團之氧化還原電位，取決於可於腫瘤缺氧組織進行還原反應之基團範圍中，藉由DT－黃遞酶(diaphorase)，及/或藉由硫基。熟習此技術領域者應瞭解，就於此揭示之觀點，如何建構這些與其它生物還原基團，以提供一具有氧化還原電位之生物還原基團，取決於上述範圍。
一般而言，熟習此技術領域者可“微調”生物還原基團之氧化還原電位，藉由修飾該基團至含有電子吸引基團、電子提供基團或某些此類基團之組合。例如，硝基噻嗯、硝基呋喃，以及硝基噻唑基團，可經由一或多個電子提供基團取代，包括，但不侷限於，甲基、甲氧基，或胺基，以達成所希望之氧化還原電位。在另一範例中，該硝基吡咯片段可經電子吸引基團取代，包括，但不侷限於，氰基、羧醯胺、－CF3 ，以及磺醯胺，以達成所希望之氧化還原電位。就此目的而言，強電子吸引基，如氰基、碸基、磺醯胺、羧醯胺，或－CF3 。以及可使用較弱之電子吸引基，如－CH2 －鹵素，其中鹵素為－F、－Cl，或－Br。
於此所使用之“抗新生癌劑”、“抗腫瘤劑”，或“抗癌劑”，係指任一用於治療癌症之試劑。此種試劑可單獨使用或與其他化合物組合，並可減輕、降低、緩和、預防，或持續或維持臨床症狀，或與新生瘤、腫瘤與癌相關之診斷標記之緩和狀態。抗－新生瘤試劑包括，但不侷限於，抗血管新生劑、烷化劑，或烷化劑、抗代謝物、某些天然產物、鉑配位錯合物、蒽二酮、經取代之尿素、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、某些賀爾蒙與拮抗劑、抗癌多醣、化學保護劑，與某些草藥或其他植物萃取物。
於此所使用之“癌症”係指一群大於100種由於細胞不受控制之生長與不正常散播導致之疾病，其可為固體腫瘤、淋巴瘤，以及非固體癌症，如白血病。
於此所使用之“噁性癌”係指癌症細胞或癌，其具有轉移之能力，且失去生長與位置之控制。
於此所使用，“新生瘤”或“腫瘤”係指不正常之新生細胞或組織成長，其可為良性或噁性。
於此所使用，一症狀或病患之“治療”，係指採取步驟以獲得助益或希望之結果，包括臨床結果。就本發明之目的而言，助益或希望之臨床結果包括，但不侷限於，一或多種癌症或其他過度增生疾病症狀之減輕或緩和、疾病程度削減、延遲或減緩疾病進程、緩和、減輕或穩定疾病狀態，以及其他如下所述之有益結果。
於此所使用之症狀之“減輕”(或此片語之文法上等效用語)係指降低症狀之嚴重度或頻率，或消除此症狀。
於此所使用之“投藥”或“投予”一藥物至個體(及其文法上之等效用語)，包括直接投藥包括自我投藥，以及間接投藥，包括處方藥物之動作。例如，於此所使用，醫師指導病患自我投藥一藥物，及/或提供病患一處方，用以將藥物投予病患。
於此所使用之藥物“醫療有效劑量”係指一藥物量，當投予一患有癌症之個體時，可具有預定之醫療效果，如減輕、緩和、減緩或消除一或多種個體之癌症形式。並不一定要在一次投藥劑量中發揮完全的效果，可在投以一系列劑量後發揮效果。因此，醫療有效劑量可投以一或多次。
於此所使用之一藥物“預防有效劑量”，當投予個體時，可具有預定之預防效果，如預防或延遲疾病或症狀之發生(或復發)，或降低類似疾病或症狀之發生(或復發)。並不一定要在一次投藥劑量中發揮完全的效果，可在投以一系列劑量後發揮效果。因此，預防有效劑量可投以一或多次。
於此所使用之“第二線”療法係指在第一次化療處方或“第一線”化療反應無效之後，所給予之治療。“第三線”治療係指在初期治療，第一線治療，以及後續治療，第二線治療，無效，或停止效用之後，所給予之治療。
於此使用之“LogP”係指一種測量一物質之親脂性之方法，以該物質於辛烷與水中之分布決定。
IIa.化合物
大部份藥物媒介之癌症療法，包括氨基磷酸化物烷化劑－基礎之療法，係取決於毒性，稱之為細胞毒殺劑，用於分裂中之細胞，目標為，如，其複製中之DNA、微管，以及各種生長因子與生長因子受器。這些藥物相當有效，由於癌細胞一般會較正常細胞分裂地更頻繁。然而，此類藥物大部份不會毒殺病患身上的所有癌細胞。其中一個理由為癌細胞會突變，並發展為具藥物抵抗性。另一個理由為並非所有的癌細胞都會比正常細胞分裂地更頻繁，而緩慢分裂之癌細胞便可，甚至較正常細胞對於此種毒殺劑更不敏感。
某些在較少血管化之固體腫瘤中之癌細胞，無法產生細胞分裂所需之能量，因而分裂緩慢。隨著腫瘤成長，需要血流供應以及之後新血管之成長。支撐或成長之新血管通常為不規則；使得低血管化之明顯區域，甚至血管化之區域呈間歇性的阻斷。這些腫瘤之低血管化與阻斷區域會變得缺氧－－它們具有較低之氧濃度，或較低之氧分壓，與相對應之正常組織相較，且其內之細胞具有較低之分裂速率。因此，僅有10%之固體腫瘤氧濃度中間數值落於正常範圍40至60 mm Hg，而有50%之固體腫瘤具有氧濃度中間值小於10 mm Hg。
腫瘤之缺氧區域代表了明顯的轉移來源，以及癌細胞抵抗該治療(請見，如De Jaegeret al., Br J Cancer.2001,84(9)：1280－5，以及Rofstadetal., Br J Cancer.1999,80(11)：1697－707)。不令人意外地，低腫瘤含氧量與該療法之不良反應、轉移增加以及低存活率有關。環磷醯胺與異環磷醯胺之活化與作用，可說明這些試劑並不會特異性地攻擊難以毒殺之腫瘤缺氧區域。
環磷醯胺與異環磷醯胺二者皆為前藥，可在肝臟中氧化性地被活化，經由中間產物產生活化氨基磷酸化物烷化劑，分別為烷化劑1(環磷醯胺芥)與2(異環磷醯胺芥)(請見下述)。電荷中性之半縮醛1與2，可具有數分鐘之半生期，可滲入與滲出細胞。相反地，陰離子烷化劑1與2較無法通過細胞膜，且一旦於細胞外形成，便無法有效藉由烷化細胞內DNA毒殺細胞。
當氨基磷酸化物烷化劑到達腫瘤時，它們一般會毒殺腫瘤中快速成長、良好血管化、常壓之外部區域細胞。然而，這些氨基磷酸化物烷化劑無法有效地滲入腫瘤中較低血管化、成長較緩慢、進展中之缺氧內部區域，進而毒殺內部腫瘤。在這些活性烷化劑到達腫瘤之前，他們會與健康細胞作用，而導致毒性，及/或細胞死亡。
當缺氧腫瘤難以治療時，該缺氧腫瘤區便會產生各種化學基團之還原衍生物(請見參考資料Workmanet al., 1993,Cancer and Metast.Rev.12： 73－82)，且細胞毒殺劑之前藥便會發展為在此種生物還原環境下被剝除之情形(PCT申請案號US 04/009667與US 05/08161；PCT/US2005/041959與PCT/US2005/042095，皆為Matteucciet al. )。此種缺氧性可還原(或缺氧性活化)之前藥可藉由使用一生物還原基團(Z3 )與烷化劑而建構。該生物還原基團可使用作為Trigger片段之一部份，共價性地鍵結或連接至氨基磷酸化物烷化劑。
本發明之化合物一般可描述為氨基磷酸化物烷化劑前藥。一般而言，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥具有下列結構Alk－Trigger其中Alk為氨基磷酸化物烷化劑，Trigger T具結構式L－Z3 ，其中連接基L係鍵結至一生物還原基團Z3 。在一實施例中，Trigger T為一經缺氧活化之trigger。
氨基磷酸化物烷化劑衍生物係於參考文獻中報導，Borchet al.,J.Med.Chem. 2000,43： 2258－65；2001,44：69－73；2001,44：74－7；Hernicket al.J.Med.Chem. 2002,45：3540－8；Hernicket al.,J.Med.Chem. 2003,46：148－54；US專利號4,908,356；5,306,727；5,403,932；5,190,929；5,472,956；與6,656,926；US專利申請案號US 2003/0008850；以及Papotet al.,Curr.Med.Chem., 2002,2, －85，個別之化合物皆於此揭示，且並非本發明之主旨。在某些實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥俱有一或多種下列特徵：(i)一較高之缺氧度，或較低之IC5 0 或IC9 0 值，在缺氧組織中，(ii)較低之常氧細胞毒性，以及iii)較低之毒性副作用，或這些特徵之某些組合。在某些實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥不同於已知之氨基磷酸化物烷化劑衍生物：(i)所釋放之氨基磷酸化物烷化劑本質，(ii)連結基(L)，及/或生物還原基Z3 之本質，(iii)大於一種生物還原基團片段之存在，或這些特徵之某些組合，(iv)增加之缺氧選擇性細胞毒性，由較大HCR值測量，(v)增加之水溶性，(vi)增加之肝臟微粒體分解穩定性，及/或(vii)提供有效之氨基磷酸化物烷化劑前藥，其為非不對稱性，並預防體內代謝之鏡像物特異性。
為了瞭解為何本發明之前藥化合物具有明顯超越現有之抗癌氨基磷酸化物烷化劑衍生物之優點，應了解在缺氧環境下之腫瘤生物學，以及於此提供之前藥之藥物動力與藥物動態學。
就有效之腫瘤治療而言，缺氧活化之前藥對於健康常氧細胞較不具毒性，與缺氧腫瘤細胞相較。在某些實施例中，本發明之缺氧活化前藥對於常氧細胞較不具活性，且較不具毒性，與缺氧細胞相較。當本發明此類前藥遭遇缺氧狀態，固體腫瘤組織之還原環境時，生物還原基團之還原會導致氨基磷酸化物烷化劑或活性毒殺劑之解離。該氨基磷酸化物烷化劑便會被釋放至腫瘤區，且可更輕易地通過固體腫瘤之缺氧區域。這些氨基磷酸化物烷化劑可毒殺固體腫瘤中難以毒殺之缺氧區域之細胞，而將非癌性健康細胞之死亡與病患之毒性副作用降至最低。因此，本發明係提供缺氧活化之前藥，其對於健康、常氧細胞較不具毒性，與缺氧、腫瘤細胞相較。
在某些實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥使用含硝基之芳香族或吲哚喹啉片段作為Trigger T之生物還原基團。在缺氧腫瘤中，硝基係還原成羥基胺基或胺基，並由胺基或羥基胺基流出電子對，經由Trigger T之共軛π電子系統，而釋放該氨基磷酸化物烷化劑。在另一實施例中，在缺氧腫瘤中，吲哚喹啉係還原成吲哚氫化喹啉，且電子對由氫化喹啉流經Trigger T，而釋放氨基磷酸化物烷化劑。經釋放之氨基磷酸化物烷化劑會毒殺缺氧腫瘤中及/或附近之細胞。
數種酵素可負責還原Trigger之生物還原基團Z3 。例如，細胞色素P450還原酶酵素可還原生物還原基之硝基或喹啉片段，第一步為NO2 (． － )或半喹啉自由基陰離子。缺氧腫瘤區具有較高濃度之還原酶，與常氧組織相較。在常氧下，以及氧存在之血管化健康組織中，所形成之NO2 (． － )或半喹啉自由基陰離子可與氧反應，轉換回生物還原基，最終不會釋放該氨基磷酸化物烷化劑。共價性地鍵結至NO2(． － )或半喹啉自由基陰離子之芳基或雜芳基片段，可調節自由基陰離子之氧敏感度。
生物還原基之氧敏感度可變化，部份取決於生物還原基之還原電位。因此，例如，一生物還原基可在具1%氧之缺氧腫瘤區中還原，另一者則可在具0.1%氧之缺氧腫瘤區中還原，又一者可在具0.01%氧之缺氧腫瘤區中還原。
生物還原基會損失某些或全部缺氧特異性，由於其如此容易地被還原，使得健康常氧組織中之細胞色素P450還原酶其他還原試劑(“還原劑”)，可在氧存在下還原它。若NO2 (． － )或半喹啉自由基陰離子生物還原基不會與氧反應或反應緩慢，則自由基陰離子本身便可釋放該氨基磷酸化物烷化劑，或可更進一步還原並釋放該氨基磷酸化物烷化劑，導致對於健康常氧細胞與組織之毒性。本發明之新穎氨基磷酸化物烷化劑前藥，對於缺氧之癌細胞或組織更具毒性，與健康常氧細胞與組織相較。
還原生物還原基團Z3 之容易或困難，可由生物還原基團之還原電位測量，並會受到聯結基(L)與氨基磷酸化物烷化劑(Alk－H)影響。例如，生物還原基聯結至電子吸引聯結基或電子吸引氨基磷酸化物烷化劑，可產生更容易還原之生物還原基團，與其共價性地鍵結至富含電子聯結基或富含電子氨基磷酸化物烷化劑相較。
Trigger T可被氧化、水解或硫化，而可以缺氧無選擇性情況釋放出氨基磷酸化物烷化劑。TelcytaT M，一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，在臨床上，可釋放出活性毒性，在無缺氧情況下，藉由穀胱甘肽轉移酶之作用(請見，如氨基磷酸化物烷化劑1f，“治療方法”一節)。聯結基及/或氨基磷酸化物烷化劑之化學特性會影響前藥之氧化、水解或硫化穩定性，就氨基磷酸化物烷化劑釋放觀點而言。在本發明之一實施例中，一缺氧活化氨基磷酸化物烷化劑前藥不會釋放出氨基磷酸化物烷化劑，於非缺氧特異性之氧化、水解或硫化反應下。
依據本發明，氨基磷酸化物烷化劑前藥中適當使用之Trigger，可用於“微調”該前要之藥物動力學特性，而不會改變其細胞毒性。例如，高分體積分佈之抗癌試劑可確保前藥可於組織中快速吸收。依據本發明之一實施例，氨基磷酸化物烷化劑前藥之體積分布可藉由使用含Trigger T之胺基而調節，其可在生理條件下形成一銨鹽。在一實施例中，Trigger T含有四級銨基團，可產生本發明之前藥化合物，具有高體積分布，而防止可能的內涵體(endosomal)捕捉。在另一實施例中，Trigger T包含羧基官能基，以陰離子羧酸鹽形式CO2 (－ )存在於正常健康組織之細胞外空間，而不會輕易地通過正常細胞膜。腫瘤細胞外空間的低pH值可轉換CO2 (－ )為不帶電之“CO2 H”形式，而允許前藥通過腫瘤細胞膜。
氨基磷酸化物烷化劑含有羥基、胺基、巰基，及/或羧基，可轉換為前藥，藉由連結Trigger T至一或多個此類官能基上。由氨基磷酸化物烷化劑轉換為前藥期間，氨基磷酸化物烷化劑之羥基可轉換為，如，醚類或縮酮；胺基轉換為烷基胺基、胺基甲酸酯或醯胺；羧基轉換為酯基；巰基轉換為硫基醚或硫基醯基，如下節合成方法與實驗部分所述細節。這些轉換可產生一前藥，其具有較小之極性與較大之親脂性，與相對應之氨基磷酸化物烷化劑相較。非極性氨基磷酸化物烷化劑前藥並非於水性醫藥載體或稀釋劑中立即可溶。溶解度增進基團如CO2 H、胺基、烷基胺基、二烷基胺基，以及羥基可使用於Trigger T中，以調節前藥之溶解度，並克服在製備氨基磷酸化物烷化劑前藥水性配方時所面臨之問題。
本發明之氨基磷酸化物烷化劑具有一或多種N－(2－鹵素烷基)或N－(2－鹵素乙基)及/或一或多個氮丙啶()片段，共價性地鍵結至P＝O片段，如下所示。由於釋放出陰離子性氨基磷酸化物烷化劑片段，氮丙啶(aziridine)或吖丙啶(aziridinium)會形成可烷基化DNA之形式(請見範例部分，範例36)。基於R2 與R3 取代基之電子吸引特性，吖丙啶形成之動力學可變化。例如，如反應順序所示，烷基化之速率可增加，當NR2 R3 片段由NH2 轉換為(請見Engleet al.,J.Med.Chem., 1987,25： 1347－57)。氮原子上之取代基可改變氨基磷酸化物烷化劑之空間、P＝O片段中此氮原子上之孤對電子去區域化(delocalization)、吖丙啶或之後氮丙啶形成所需之氮孤對電子，以及氨基磷酸化物烷化劑前藥與氨基磷酸化物烷化劑之水性溶解度。
本發明之產生起源於發現使用具2－硝基咪唑－生物還原基團之氨基磷酸化物烷化劑前藥，顯示未預期之高缺氧細胞毒性、低常氧毒性、高HCR，以及增進之溶解度。例如，化合物24與25，在缺氧細胞中之毒性為常氧細胞之分別400至1000倍毒性，在抗增生細胞毒性試驗中，具缺氧細胞中IC5 0 為0.05μM。(請見範例一節)。含有異環磷醯胺芥或異環磷醯胺芥類似物之氨基磷酸化物烷化劑前藥具有下式：CH2 －O－P(＝O)(NHCH2 CH2 X4 )2 、Z3 －CH2 －O－P(＝O)(NHCH(R9 )CH2 X4 )2 ，以及CH(Z2 )－O－P(＝O)(NHCH(R9 )CH2 X4 )2 ；其中Z2 為甲基；R9 為氫、甲基或異丙基；Z3 為1－N－甲基－2－硝基咪唑－5－基)、2－硝基硫基苯－5－基，或2－硝基呋喃－5－基；以及每一X4 為Cl或Br，未預期地在缺氧細胞中更具毒性，與常氧細胞相較，及/或具有未預期之高HCR值，於抗增生細胞細胞毒性試驗中，相對於目前已知之氨基磷酸化物烷化劑衍生物，具有2－硝基硫基苯－5－基、硝基呋喃－5－基，或5－硝基咪唑基、生物還原基團(Z3 )，以及N,N’(四－2－氯乙基)氨基磷酸化物芥或環異磷醯胺芥；或請見如化合物P4、P14－17、P19與P21－22，Borchet al.,J.Med.Chem..andUS Patent No. 6,656,926二者皆如上述) 。
在一觀點中，本發明係提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，如式(I)： 其中Y1 為O、S、NR6 或NSO2 R6 Y2 為O、S、NR6 、NCOR6 或NSO2 R6 ，其中每一R6 係獨立地為(C1 －C6 )烷基、C1 －C6 雜烷基、芳基，或雜芳基；R1 －R5 每一者皆獨立地為氫、羥基、胺基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基胺基、C1 －C6 二烷基胺基、芳基、雜芳基、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基、芳醯基或雜芳醯基；或是R1 －R5 任二者共同形成一C3 －C1 0 雜環；或R1 －R5 每一者皆獨立地為一Trigger T，具式L－Z3 ；L係選自於由－[C(Z1 )2 －Y3 ]v －[C(＝O)－O]q －[C(Z1)2 －Z2 －Y4 ]u －C(Z1 )2 [－C(Z1 )＝C(Z1 )]g ；以及－[C(Z1 )2 －Y3 ]v －(S(＝O)2 )q －[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]u －C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]g 組成之族群；其中v、q、u與g每一者皆獨立地為0或1；Y3 為S、O或NR7 ，其中每一R7 皆獨立地為氫、羥基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基胺基、C1 －C6 二烷基胺基、芳基、雜芳基、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基、芳醯基，或雜芳醯基；Y4 為O、S或－NR7 －C(＝O)－O－；Z1 與Z1 每一者皆獨立地為氫、鹵素、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、芳基、雜芳基、C3 －C8 環烷基、雜環基、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基、芳醯基，或雜芳醯基；Z2 為C1 －C6 烯基、C1 －C6 雜烯基、
其中每一X1 皆獨立地為N或CR8 ，其中R8 獨立地為氫、鹵素、硝基、氰基、CHF2 、CF3 、CO2 H、胺基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C1 －C6 環烷基、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基胺基、C1 －C6 二烷基胺基、芳基、CON(R7 )2 、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基、芳醯基或雜芳醯基；X2 為NR7 、S或O；以及Z3 為生物還原基團，具有化學式選自於由 組成之族群；但書為式(I)中：(i)R1 －R5 之至少二者選自於由2－鹵化烷基、烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；(ii)R1 －R5 之至少一者選自於由2－鹵化烷基、2－C1 －C6 烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；且NR2 R3 或NR4 R5 之至少一者為；或(iii)NR2 R3 與NR4 R5 為；以及其單獨異構物或異構物之消旋物或非消旋物混合物、生物空間異構物、藥效集團，或藥學上可接受之鹽類、媒合物、水合物或前藥。
在一實施例中，R2 －R5 之至少一者為
在一實施例中，本發明提供缺氧活化之氨基磷酸化物烷化劑前藥，每一者皆使用二氨基磷酸化物烷化劑。在一實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥使用1－N－烷基－2－硝基咪唑－5－基片段或1－N－甲基－2－硝基咪唑－5－基片段為生物還原基團Z3 。在一實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥使用2－硝基呋喃片段為生物還原基團或Z3 。
在一實施例中，本發明排除下列化合物
其中Ra 為H、Br(P14)、NMe2 (P15)、CN(P16)或CONH2 (P17)，,,,,,,以及 其中R為H、Me或烯丙基；3－(5－甲氧基－1－甲基－4,7－吲哚喹啉)－甲基雙[N－甲基－N－(2－溴化乙基)]磷酸二醯胺酯(P27)、3－(5－甲氧基－1－甲基－4,7－吲哚喹啉)－甲基N,N－雙(2－溴化乙基)]磷酸二醯胺酯(P28)、2－(5－甲氧基－1－甲基－4,7－吲哚喹啉)－甲基雙[N－甲基－N－(2－溴化乙基)]磷酸二醯胺酯(P29)、2－(5－甲氧基－1－甲基－4,7－吲哚喹啉)－甲基N,N－雙(2－氯化乙基)磷酸二醯胺酯(P30)、2－(5－甲氧基－1－甲基－4,7－吲哚喹啉)－甲基N,N－雙(2－溴化乙基)磷酸二醯胺酯(P31)、3－(5－甲氧基－1－甲基－4,7－吲哚喹啉)－甲基N,N－雙(2－溴化乙基)]磷酸二醯胺酯(P32)、2－(5－甲氧基－1－甲基－4,7－吲哚喹啉)－甲基雙[N－甲基－N－(2－溴化乙基)]磷酸二醯胺酯(P33)、2－(5－甲氧基－1－甲基－4,7－吲哚喹啉)－甲基N,N－雙(2－氯化乙基)磷酸二醯胺酯(P34)，以及2－(5－甲氧基－1－甲基－4,7－吲哚喹啉)－甲基N,N－雙(2－溴化乙基)磷酸二醯胺酯(P35)，組成之族群。
在一相關實施例中，本發明係提供式(I)化合物，但書為(i)R1 －R5 之至少二者選自於由2－鹵化烷基、烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；(ii)R1 －R5 之至少一者選自於由2－鹵化烷基、2－C1 －C6 烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；且NR2 R3 或NR4 R5 之至少一者為；或(iii)NR2 R3 與NR4 R5 為。
在另一相關實施例中，本發明係提供如式(I)之化合物，但書為式(I)排除了R2 與R3 共同形成嗎啉環，或R4 與R5 共同形成嗎啉環。
在一實施例中，本發明排除具下式之化合物：
其中，Z1 為氫或C1 －C6 烷基。
在一實施例中，本發明係提供化合物，其中Trigger T為：[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－[C(Z1)2 －Z2 －Y4 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－[C(Z1)2 －Z2 －Y4 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－C(Z1 )2 －Z3 ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－C(Z1)2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－C(Z1 )2 －Z3 ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 ；[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 ；C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 ；
在另一實施例中，Z3 為：
在一實施例中，每一C(Z1 )2 －為：－CH2 －、－CHMe－、－CH(CN)－、－CH(CO2 H)－、－CH(CONH2 )－、－CH(CF3 )－、－CH(CHF2 )－、－C(Me)2 －、－C(Et)2 －、－CH(CH2 NMe2 )－、－CH(CH2 NMe2 )－、－C(CH2 NMe2 )2 －，或－C(CH2 CO2 H)2 －。
在一實施例中，－C(Zl)2 －Y3 －為：－CH2 －O－、－CH2 －S－、－CH2 －NMe、－CH2 －NH－、H(Me)－O－、CH(Me)－S－、－CH(Me)－NMe－、－CH(Me)－NH－、－CMe2 －NMe－、－CMe2 －NMe－，或CMe2 －NMe－。
在一實施例中，－Z2 －Y4 －一同為：
在一實施例中，－[C(Z1 )＝C(Z1 )]－為：－CH＝CH－、－C(CN)＝CH－、－CH＝C(CN)－、－C(Ar)＝CH－、－CH＝CAr－、－C(COAr)＝CH－、CH＝C(COAr)－、－C(COR1 2 )＝CH－或－CH＝C(COR1 2 )－，其中Ar為芳基選擇性地經至多5個取代基取代，選自於由OH、OMe、CF3 、O－CHF2 、OCF3 、NO2 、CN、鹵素、鹵素甲基、二鹵素甲基、三鹵素甲基、羥基甲基、CO2 H、CONH2 、CONMe2 ，以及CONHMe組成之族群；以及R1 2 係獨立地為氫、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基，或雜環基。
在另一實施例中，Trigger為：
在另一實施例中，Trigger為 其中每一Z1 係獨立地為H或C1 －C6 烷基。
在另一實施例中，Trigger為：
其中每一Z1 為氫或C1 －C6 烷基，以及R8 為H、OH或－OP(＝O)(OH)2 。
在一實施例中，本發明係提供式(II)與(III)化合物：
其中R2 －R5 每一者皆獨立地為氫、羥基、胺基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基胺基、C1 －C6 烷基胺基、芳基、雜芳基、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基、芳醯基，或雜芳醯基；或，R2 －R5 之任二者共同形成一C3 －C1 0 雜環；每一Y1皆獨立地為S或O；但書為式(II)或(III)：(i)R2 －R5 之至少二者選自於由2－鹵化烷基、2－烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；(ii)R2 －R5 之至少一者選自於由2－鹵化烷基、2－C1 －C6 烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；且NR2 R3 或NR4 R5 之一者為；或(iii)NR2 R3 與NR4 R5 為；以及其單獨異構物或異構物之消旋物或非消旋物混合物、生物空間異構物、藥效集團、藥學上可接受之鹽類、媒合物、水合物或前藥。
在一實施例中，本發明係提供一種式(II)化合物，其中Trigger T為－CH2 －Z3 、－CH(Z1 )－Z3 或－C(Z1 )2 －Z3 ，其中Z1 為C1 －烷基，以及Z3 為： 但書為，式(II)：(i)R2 與R3 之一為H，以及R4 與R5 之一為H；(ii)R2 與R3 之一為C1 －烷基，以及R4 與R5 之一為C1 －烷基；或(iii)R2 －R5 至少一者為羥基、胺基、C3 －C8 環烷基、雜環基、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基胺基、C1 －C6 二烷基胺基、芳基、雜芳基、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基，或芳醯基或雜芳醯基。
在一實施例中，本發明係提供式(II)化合物，其中Z3 為一生物還原基團，選自於： 但書為式(I)：(i)R1 －R5 之至少一者係選自於由2－烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群，以及R1 －R5 之至少一者係選自於由2－鹵素烷基、2－烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；或(ii)R1 －R5 之至少一者係選自於由2－鹵素烷基、2－C1 －C6 烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；以及NR2 R3 與NR4 R5 之至少一者為；或(iii)每一NR2 R3 與NR4 R5 為。
在一觀點中，本發明係提供式(I)之氨基磷酸化物烷化劑前藥： 其中R1 為－[C(Z1 )2 －Y3 ]v －[C(＝O)－O]q －[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]u －Z3 或[C(Z1 )2 －Y3 ]v －(S(＝O)2 )q －[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]u －Z3 ，其中每一v、q，與u係獨立地為0或1；以及Z3 為葡萄糖或其類似物，但書為排除氨基磷酸化物烷化劑之葡萄糖共軛物，描述於參考文獻Wiessleret al., US專利號5,622,936；R2 －R5 每一者皆獨立地為氫、羥基、胺基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基胺基、C1 －C6 二烷基胺基、芳基與雜芳基、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基、芳醯基或雜芳醯基，或R1 －R5 任二者共同形成一C3 －C1 0 雜環；但書為式(I)：(i)R2 －R5 之至少二者選自於由2－鹵化烷基、2－烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；(ii)R2 －R5 之至少一者選自於由2－鹵化烷基、2－C1 －C6 烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；且NR2 R3 或NR4 R5 之至少一者為；或(iii)NR2 R3 與NR4 R5 為；以及其單獨異構物或異構物之消旋物或非消旋物混合物、生物空間異構物、藥效集團、藥學上可接受之鹽類、媒合物、水合物或前藥。
在另一實施例中，本發明係提供化合物：
在另一實施例中，本發明提供化合物：以及其中X4 與Z3 係如上述定義。
在另一實施例中，本發明係提供化合物：
在一實施例中，R6 為－(N－CH2 CH2 X4 )2 。
在另一實施例中，本發明係提供化合物：，，，以及其中R2 －R5 係如式(II)所定義。
下列流程示範了氨基磷酸化物烷化劑前藥之缺氧性還原，產生相對應之氨基磷酸化物烷化劑。
在另一實施例中，本發明係提供化合物：，，以及，其中R2 －R5 係如式(II)所定義。
下列流程示範了氨基磷酸化物烷化劑前藥之缺氧性還原，產生相對應之氨基磷酸化物烷化劑。
在另一實施例中，本發明係提供化合物： 以及其中每一R9 獨立地為氫、氘、芳基、雜芳基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基、C3 －C8 環烷基、雜環基、C1 －C6 醯基、C1 －C6 雜醯基、芳醯基或雜芳醯基、C1 －C6 烷氧基羰基、C1 －C6 烷基胺基羰基、二C1 －C6 烷基胺基羰基或C1 －C6 烷氧基；每一R1 0 皆為氫、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基芳氧基或雜芳氧基，或二R1 0 共同形成一雜環；每一R1 1 皆獨立地為氫、芳基、雜芳基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基，或C1 －C6 烷氧基；或二R1 1 共同形成一雜環；但書為每一R1 1 皆獨立地為C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基，且R1 1 不包括；或二R1 1 形成一雜環；X4 為Cl、Br、烷基磺醯氧基、雜烷基磺醯氧基、芳基磺醯氧基，或雜烷基磺醯氧基；以及Trigger T為[C(Z1 )2 －Y3 ]v －(C(＝O)－O)q －[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]u －C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]g －Z3 。
在一相關實施例中，式(IV)－(VII)，每一R9 獨立地為氫、氘、C1 －C3 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C6 環烷基、雜環基、芳基或雜芳基。在另一實施例中，每一R9 獨立地為氫、氘或C1 －C6 烷基。在另一相關實施例中，每一R9 皆獨立地為氫、甲基、乙基、丙基、異丙基，或環丙基。
在一相關實施例中，本發明係提供式(IV)化合物，其中R1 0 之一為－(CH2 )c －嵌入劑，其中嵌入劑為芳香族或雜芳族片段，可嵌入核酸鹼基對。
在另一實施例中，本發明提供化合物：
其中X4 與R1 0 係如上述式(IV)所定義。
在另一實施例中，本發明係提供化合物：
在一實施例中，本發明係提供式(VIII)化合物：
其中每一R9 皆獨立地為氫、甲基、乙基、丙基、異丙基，或環丙基；以及N(R1 0 )2 係選自於NH2 、NHMe、NMe2 、NEt2 、，，，，、NHOMe與NHOH。
在一實施例中，本發明係提供式(IX)化合物： 其中每一R9 皆獨立地為氫、甲基、乙基、丙基、異丙基，或環丙基。
在一實施例中，本發明係提供式(X)化合物：
其中每一R9 皆獨立地為氫、甲基、乙基、丙基、異丙基，或環丙基；以及每一R1 1 皆獨立地為氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、苯基、經取代之甲基、環丙基、甲氧基與羥基；或二R1 1 一同形成一雜環基。
在一實施例中，本發明係提供式(X－A)、(X－B)與(X－C)之化合物： ,以及
其中X2 與X4 如式(I)所定義，以及R1 0 與R1 1 係如式(IV)、(VI)與(VII)所定義。
在一實施例中，本發明係提供式(XI)－(XV)化合物： 其中以及每一R1 1 皆獨立地為氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、苯基、經取代之甲基、環丙基、甲氧基與羥基；以及X1 、X2 ，與Z3 係如上述定義；以及X4 為Cl、Br、烷基磺醯氧基、雜烷基磺醯氧基、環烷基磺醯氧基、雜環烷基磺醯氧基、芳基磺醯氧基，或雜芳基磺醯氧基。在一實施例中，式(XII)、(XIV)與(XV)化合物中，當X4 為Cl或Br時，R1 1 則排除為異丙基。在一實施例中，式(X)化合物則排除一化合物，其中Z3 為 在一實施例中，本發明係提供式(XII)、(XIV)或(XV)之化合物，其中每一R1 1 為氫。式XII、XIV或XV化合物之範例包括化合物5、7、8、9、10、13、14、15、19、23、24、25、26、32、34與36。在一實施例中，本發明係提供式XII、XIV或XV之氨基磷酸化物烷化劑前藥，其中R1 1 排除丙基或異丙基。在另一實施例中，本發明排除下列化合物：
在一實施例中，本發明提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，其中R1 1 為C3 －C8 環烷基。在另一實施例中，環烷基為環丙基。一般而言，環丙基可較烷基更穩定，在細胞中氧化性代謝蛋白質方面，尤其是在肝臟，本發明之前藥化合物提供藥物動力學增進之氨基磷酸化物烷化劑前藥，與已知之氨基磷酸化物烷化劑前藥相較。
在一實施例中，本發明係提供式(XVI)化合物
其中K為C1 －C6 烯基或C1 －C6 雜烯基。在一實施例中，K為(C(R1 2 )2 )e 、CH2 CH2 (－X6 －CH2 CH2 )f ，或CH2 (－X6 －CH2 )f ，其中e為1－10，f為0－3，以及X6 為O、S或NR1 2 ，其中每一R1 2 皆如上述定義。
在一實施例中，本發明係提供式(XVII)－(XVIII)化合物：
其中e為0－4，X4 為Cl或Br、烷基磺醯氧基、雜烷基磺醯氧基、芳基磺醯氧基，或雜芳基磺醯氧基；X6 為O、S或NR1 2 ，其中R1 2 係如上述所定義。
在一實施例中，本發明係提供式(XIX)化合物：
其中e為0－4，以及X4 為Cl、Br、烷基磺醯氧基、雜烷基磺醯氧基、芳基磺醯氧基，或雜芳基磺醯氧基。在一相關實施例中，本發明係提供式(XIX)化合物，其中e為1。請見範例一節，於下所述之各式化合物範例。
在一實施例中，本發明係提供式(XX)化合物：
其中Rg 為葡萄糖或葡萄糖類似物；e為0－4，以及X4 為Cl、Br、烷基磺醯氧基、雜烷基磺醯氧基、芳基磺醯氧基，或雜芳基磺醯氧基。如此所述，葡萄糖類似物包括單、二或三糖。在一相關實施例中，本發明係提供式XX化合物，其中e為1。
在一實施例中，本發明係提供下列化合物：
其中X4 為Cl、Br或烷基磺醯氧基。
在一實施例中，本發明係提供下列化合物：
其中R9 與X4 係如式VI所定義。
在一實施例中，本發明係提供式(XXI)化合物：
其中Y1 為S或O；以及Trigger T係如式(I)所定義。
在另一實施例中，本發明係提供肟－氨基磷酸化物烷化劑共軛物：
在另一實施例中，此種肟－氨基磷酸化物烷化劑共軛物可酵素性水解產生
在另一觀點中，本發明係提供式(XXII)化合物： 其中R1 －R5 ，Y1 與Y2 皆如式(I)所定義；每一R1 －R5 與R1 ＊ －R5 ＊ 獨立地選自於由氫、羥基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基胺基、C1 －C6 二烷基胺基、芳基、雜芳基組成的族群；或R2 與R2 ＊ 共同形成一雜環；或每一R1 －R5 與R1 ＊ －R5 ＊ 獨立地為Trigger T，選自於由[C(Z1 )2 －Y3 ]v －[C(＝O)－O]q －[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]u －C(Z1 )2 [－C(Z1 )＝C(Z1 )]g －Z3 ，以及[C(Z1 )2 －Y3 ]v －(S(＝O)2 )q －[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]u －C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]g －Z3 －，組成之族群；但書為式(XXII)：(i)R1 －R5 與R1 ＊ －R5 ＊ 之至少二者為2－鹵素烷基、2－烷基磺醯氧基烷基、2雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，或2雜烷基磺醯氧基烷基；或(ii)R1 －R5 與R1 ＊ －R5 ＊ 之至少一者為2－鹵素烷基、2－C1 －C6 烷基磺醯氧基烷基、雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，或2－雜烷基磺醯氧基烷基；以及NR2 R3 與NR2 ＊ R3 ＊ 之至少一者為；或(iii)每一NR2 R3 與NR2 ＊ R3 ＊ 二者皆為；以及其單獨異構物或異構物之消旋物或非消旋物混合物、生物空間異構物、藥效集團、藥學上可接受之鹽類、媒合物、水合物或前藥。
每一Z獨立地為C、S或P；每一t獨立地為1或2；每一r獨立地為0或1；K選自於由C1 －C6 烯基、C1 －C6 雜烯基、芳烯基或雜芳烯基、(C(R9 )2 )n ；與(Y5 －(C(R9 )2 )m －Y4 －(C(R9 )2 )m －Y6 )n ，其中n為1－8；每一m獨立地為1－4；每一R9 獨立地為C1 －C6 烷基或雜烷基，或一同為，當共價性地鍵結至同一碳原子或鄰近碳原子，環烷基或雜環基；以及每一Y4 、Y5 與Y6 係獨立地為O、S、NR7 ，或一鍵結；但書為Y4 、Y5 與Y6 之一必須為O、S或NR7 。
在另一觀點中，本發明係提供式(XXIII)之化合物：
其中R1 －R5 ，Y1 與Y2 皆如式(I)所定義；每一R1 －R5 與R1 ＊ －R5 ＊ 獨立地選自於由氫、羥基、C1 －C6 烷基、C1 －C6 烷氧基、C1 －C6 烷基胺基、C1 －C6 二烷基胺基、芳基、雜芳基組成的族群；或R2 與R2 ＊ 共同形成一雜環；或每一R1 －R5 與R1 ＊ －R5 ＊ 獨立地為Trigger T，選自於由[C(Z1 )2 －Y3 ]v －[C(＝O)－O]q －[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]u －C(Z1 )2 [－C(Z1 )＝C(Z1 )]g －Z3 ，以及[C(Z1 )2 －Y3 ]v －(S(＝O)2 )q －[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]u －C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]g －Z3 －，組成之族群；但書為式(XXIII)：(i)R2 －R5 與R2 ＊ －R5 ＊ 之至少二者為2－鹵素烷基、2－烷基磺醯氧基烷基、2雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，或2雜烷基磺醯氧基烷基；或(ii)R2 －R5 與R2 ＊ －R5 ＊ 之至少一者為2－鹵素烷基、2－C1 －C6 烷基磺醯氧基烷基、雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，或2－雜烷基磺醯氧基烷基；以及NR2 R3 與NR2 ＊ R3 ＊ 之至少一者為；或(iii)NR2 R3 與NR2 ＊ R3 ＊ 二者皆為；或NR4 R5 與NR4 ＊ R5 ＊ 二者皆為；以及其單獨異構物或異構物之消旋物或非消旋物混合物、生物空間異構物、藥效集團、藥學上可接受之鹽類、媒合物、水合物或前藥。
L2 為
其中X如上述定義。
在另一實施例中，本發明提供式(XXIV)化合物：
其中R2 、R3 、R4 、R2 ＊ 、R3 ＊ 、R4 ＊ 、Z、K與Trigger係如式(XXII)所定義。
在另一實施例中，本發明係提供式(XXIV)化合物，具式(XXV)或(XXVI)結構式：以及在另一實施例中，本發明係提供式(XXVI)化合物： 其中X1 、X2 、X4 與e如式(XXV)所定義。
在另一觀點中，本發明係提供式(XXVII)化合物：
其中R2 －R5 、r、k、Y1與Trigger T如式(XXIV)所定義。
在一實施例中，本發明係提供下式化合物：
其中T為L－Z3 ；L1 為CH2 、CHMe、C(Me)2 、CH2 OCH2 、(CH2 )3 、CH2 S(CH2 )2 、CH2 S(CH2 )3 、
在另一實施例中，本發明係提供Z3 ，選自於由：,,,,,,,,,,,,,,與組成之族群。
在另一實施例中，本發明係提供一片段具有下式：
選自於由：,, ,,,,,,,,或組成之族群。
在另一實施例中，本發明係提供T，選自於由,,,與組成之族群，其中每一Z1 、R7 與R8 係如上述定義。在此實施例中，Z1 為氫、甲基，或乙基；R7 為甲基、三氟乙基、乙基、丙基與環己基；以及R8 為OH或OP(＝O)(OH)2 。在此實施例中，
其中每一R9 為氫或C1 －C6 烷基，以及每一X4 為鹵素或Rs u l S(＝O)2 O－。在另一實施例中，R9 為氫、甲基、乙基、異丙基，或異丁基；以及X4 為氯、溴，或甲烷磺醯氧基。
在另一實施例中，本發明係提供下式化合物：
其中T如上述定義，更特別的是T為L－Z3 ，其中L為CH2 、CHMe、CMe2 、 以及Z3 為
在一觀點中，本發明係提供下式之氘化氨基磷酸化物烷化劑，以及氘化氨基磷酸化物烷化劑前藥
其中X4 為鹵素或Rs u l S(＝O)2 O。在另一實施例中，X4 為Cl或Br。此種氘化氨基磷酸化物烷化劑及其前藥，對於缺氧腫瘤組織具等效毒性，如同其未氘化或氫化類似物，如化合物25、36及其類似物。然而，體內此種氘化類似物之存在，如在血漿中，可更有效地決定，相較於其相對應之氨基磷酸化物烷化劑，及/或氨基磷酸化物烷化劑前藥，藉由核磁共振方法，且此種氘化類似物可用於決定氨基磷酸化物烷化劑，及/或氨基磷酸化物烷化劑前藥之藥物動力學或藥物動態學特性。氨基磷酸化物烷化劑，及/或氨基磷酸化物烷化劑前藥之藥物動力學或藥物動態學特性可用於決定藥劑、投藥頻率，以及類似之投藥相關參數。八氘化－化合物25與八氘化－異環磷醯胺烷化劑之合成係描述於範例一節。
在另一實施例中，本發明係提供範例化合物之個別與選擇性群組。本發明之化合物範例包括：
在一實施例中，該氨基磷酸化物烷化劑前藥包含
如同Z3 ，並顯示缺氧腫瘤特異性之毒性，而在健康、常氧組織中具較小毒性。
在一實施例中，本發明係提供一種新穎之氨基磷酸化物烷化劑前藥，其基於生物還原而釋放出相對應之新穎或已知之氨基磷酸化物烷化劑
其中X4 係如式(I)所定義，R9 、R1 0 與R1 1 如式(IV)－(VII)與其離子化形式所定義。在一相關實施例中，X4 為Cl、Br、甲烷磺醯氧基、苯磺醯氧基，或對－甲苯磺醯氧基。
在一實施例中，本發明係提供一種新穎之氨基磷酸化物烷化劑前藥，其基於生物還原而釋放出相對應之新穎或已知之氨基磷酸化物烷化劑
及其離子化形式；其中N(R1 0 )2 係選自於由NH2 、NHMe、NMe2 、NEt2 、,,,,、NHOMe與NHOH組成之族群；每一R1 1 獨立地為氫、Me、乙基、環丙基、異丙基、丙基、苄基、經取代之甲基、環丙基、甲氧基與羥基；或二R1 1 共同形成一雜環。
抗癌試劑環磷醯胺代謝為1d(R1 0 為氫)且異環磷醯胺代謝為1e(每一R1 1 為氫)，當使用於癌症治療時。葡環磷醯胺，其已進行臨床癌症治療評估，會釋放出式1e之烷化劑(每一R1 1 為氫，請見Wiessleret al., 美國專利號5,622,936；PCT申請號US05/03370，標題為“Anti Cancer Therapies”，美國專利申請號60/638995，標題為“Glufosf醯胺Combination Therapy”，以及Attorney docket No.021305－005900US，於2005年5月11日提申，標題為“Glufosfamide Combination Therapy”)。TelcytaT M，其已進行臨床癌症治療評估，會釋放出1f(Rosenet al.,Clin Cancer Res. 2004,10(11)：3689－98)。
已知之氨基磷酸化物烷化劑前藥，如異環磷醯胺與環磷醯胺，會被如丙烯醛與氯縮醛代謝產生毒性產物，其會導致不希望之病患副作用，如出血性膀胱炎、昏迷或死亡。在一實施例中，本發明係提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，其基於每次治療代謝產生較小毒性產物，與異環磷醯胺及/或環磷醯胺代謝之產物相較。在一實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥並不會因體內代謝產生丙烯醛。由於本發明前藥代謝產生之產物毒性包括氯、溴、烷基磺醯氧基、雜烷基磺醯氧基、芳基磺醯氧基，或雜芳基磺醯氧基－乙醛(由異環磷醯胺代謝產生之氯化乙醛，請見參考資料Hardmanet al,supra, 1396頁)。在另一實施例中，本發明係提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，其基於氧化代謝產生5－95%之氯化乙醛，或等效物，如上所述，每次治療，如同異環磷醯胺代謝所產生。
由Z3 還原形成之氨基磷酸化物烷化劑衍生物，不同於經保護之氨基磷酸化物烷化劑，以及氨基磷酸化物烷化劑前藥，可稱之為經修飾之氨基磷酸化物烷化劑前藥。例如，氨基磷酸化物烷化劑前藥可產生經修飾之氨基磷酸化物烷化劑前藥－Triggerm o d ，基於生物還原基團(Z3 )之還原。當生物還原基團之還原形成經修飾之氨基磷酸化物烷化劑前藥時，鍵結至氨基磷酸化物烷化劑之聯結基(L)可進行降解作用，產生氨基磷酸化物烷化劑，或某些其他經修飾之氨基磷酸化物烷化劑前藥。
在一實施例中，本發明係提供一種化合物，其顯示加入聯結基(L)對於缺氧組織活化之旁觀者效應，如上所述。在一實施例中，該旁觀者效應允許本發明經修飾之氨基磷酸化物烷化劑可擴散或通過腫瘤區，其缺氧性不足以活化本發明前藥化合物，但可停留在缺氧腫瘤區附近，其可活化這些前藥。
基於Trigger T中生物還原基團(Z3 )之還原，可產生經修飾之氨基磷酸化物烷化劑前藥，如氨基磷酸化物烷化劑－TM 或Alk－TM 共軛物。在一實施例中，TM 係選自於：[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 － m o d ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 － m o d ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 － m o d ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－C(Z1 )2 －Z3 － m o d ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 － m o d ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－C(Z1 )2 －Z3 － m o d ；[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 － m o d ；[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 － m o d ；以及C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－Z3 － m o d ，其中Z3 － m o d 為經生物還原，否則為經還原或經修飾之Z3 。
在另一實施例中，TM 選自於：[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]－H；[C(Z1 )2 －Y3 ]－[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]－H；以及[C(Z1)2 －Y3 ]－H。
在一實施例中，Trigger T包括具下式之聯結基(L)：[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－；[C(Z1 )2 －Y3 ]－[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－；[C(Z1 )2 －Y3 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－；－[C(Z1 )2 －Y3 ]－C(Z1 )2 －；[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－；－[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－C(Z1 )2 －；[C(Z1 )2 －Y3 ]－(C(＝O)－O)－C(Z1)2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－；以及[C(Z1 )2 －Z2 －Y4 ]－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－；－C(Z1 )2 －[C(Z1 )＝C(Z1 )]－以及－C(Z1 )2 －。
在一實施例中，本發明係提供Trigger T，其基於生物還原修飾為TriggerM o d 或TM ，且氨基磷酸化物烷化劑由TM 中分離出，小於0.1秒。在另一實施例中，該氨基磷酸化物烷化劑由TM 中分離出，介於0.01至0.10秒。在另一實施例中，該氨基磷酸化物烷化劑由TM 中分離出，介於0.1至1.0秒。在另一實施例中，該活性氨基磷酸化物由TM 中分離出，介於1.0至10秒。在另一實施例中，該氨基磷酸化物烷化劑由TM 中分離出，介於10.0至100.0秒。
在相關實施例中，基於活化或還原，氨基磷酸化物烷化劑前藥會產生具有經修飾Trigger T(TM )之前藥，其之後會釋放出氨基磷酸化物烷化劑，離活化或還原處20至500 μm；或離活化或還原處20至100 μm。本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥之旁觀者效應可使用細胞球體與多層細胞試驗測量(例如Kyleet al., Cancer Res.2004,64(17)：6304－9 and Westetal., Cancer Chemother.Pharmacol.,1987,20(2)：109－14所述之此種試驗)；更詳細之描述列於範例35與37。腫瘤細胞可成長於培養液中，形成多細胞球體，產生包含缺氧區域之固體腫瘤之腫瘤微環境體外模式，以及反應有限營養與增加廢物產生之環境壓力之靜止細胞分佈。這些球體具有獨特之特性，可發展出氧與養分梯度，且細胞聚集物會持續分裂並向外生長。在可存活邊緣到達約150 μm大小時，會發展出缺氧區域，其驅動此區域細胞進入不活動狀態，甚至是細胞死亡。壞死核心之發展為細胞死亡之結果。該球體可分裂成4個分隔部份，以模擬缺氧活化前藥之效用：1)外層常氧性與活化分隔區域；2)中度缺氧區域；3)缺氧區域，該處細胞不進行細胞週期；4)壞死核心，含有死亡之細胞與細胞殘骸。藥物反應取決於數種因素；化合物通過球體最深層之能力。缺氧活化前藥(HAP)被硝基還原酶活化；經活化藥物在活化處細胞中之反應性；以及活化藥物離開活化處並殺死鄰近細胞之能力(旁觀者效應)。因此，化合物效用之評估可評估為數種不同層級。單一化合物之效用可以單層培養物與完整球體比較而得。HAP可使用做為單一療法。球體之缺氧部分可由變化平衡氣體中之O2 濃度而調整，因而改變常氧與缺氧部份之比例。HAP可與其他化學試劑結合，不論目標僅為外層常氧細胞，或可穩定攻擊整個球體。預期之細胞毒殺可以已知之缺氧部份與每一單一療法中預期之細胞毒殺預測。
在一實施例中，本發明係提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，其以氨基磷酸化物烷化劑之生物還原性釋放為基礎，半生期小於0.1秒；介於0.01至0.10秒間、介於0.1至1.0秒間、介於1.0至10.0秒間，以及介於10.0至100.0秒間。
抗癌藥物可結合至環繞於血管化及/或高分子量阻礙擴散之組織，無法以醫療有效劑量之濃度到達缺氧腫瘤區域，其離血管化處150－200 μM遠。在一實施例中，本發明提供氨基磷酸化物烷化劑前藥，其可到達遠離血管化之缺氧癌細胞。決定旁觀者效應之某些方法更詳細地描述於範例35與37。使用於缺氧活化前藥之氨基磷酸化物烷化劑，在有效毒殺腫瘤細胞中扮演一重要角色。例如，就缺氧活化氨基磷酸化物烷化劑前藥而言，氨基磷酸化物烷化劑之細胞毒性，以及其細胞烷化速率、氨基磷酸化物烷化劑，與前藥之細胞膜通透度，會衝擊氨基磷酸化物烷化劑前藥之缺氧選擇性與缺氧細胞毒性。
在一實施例中，本發明提供氨基磷酸化物烷化劑前藥，其較體內形成相對應之氨基磷酸化物烷化劑安全(至少10倍至100萬倍安全)。在一實施例中，增進之安全度來自於Trigger T連結位置之修飾(氨基磷酸化物烷化劑前藥之活化會釋放烷化劑及/或/細胞毒性試劑)。在二情況下，該氨基磷酸化物烷化劑前藥可於缺氧組織轉換為相對應之烷化劑，經由生物還原基團(Z3 )之活化或還原，導致移除與伴隨反應，或後續氨基磷酸化物烷化劑之釋放或降解。
在一實施例中，Trigger T係共價性地結合至氨基磷酸化物烷化劑，以遮蔽或降低氨基磷酸化物烷化劑之細胞毒殺活性。此遮蔽效應可變化，且可取決於氨基磷酸化物烷化劑之細胞毒殺活性。一般而言，該氨基磷酸化物烷化劑前藥可顯示至少低約10倍之細胞毒殺活性，相較於相對應之氨基磷酸化物烷化劑，且可顯示至多約100倍或更少之細胞毒殺活性。在一情況下，該氨基磷酸化物烷化劑前藥之細胞毒殺活性為約100倍至約10,000倍低於相對應氨基磷酸化物烷化劑之細胞毒殺活性。作為一範例，氨基磷酸化物烷化劑具IC5 0 、IC9 0 或LC5 0 為1 nM,，相對應之氨基磷酸化物烷化劑前藥之IC5 0 、IC9 0 或LC5 0 可為1 μM或更大。
在一情況下，於此提供之化合物包括作為氨基磷酸化物烷化劑前藥、可聯結至Trigger T之氨基磷酸化物烷化劑，以可產生氨基磷酸化物烷化劑前藥之方式，其至少約10倍至約1,000,000－倍，且一般約100至約10,000－倍低之細胞毒性試劑活性，與相對應之氨基磷酸化物烷化劑，或經修飾之氨基磷酸化物烷化劑相較，並在缺氧條件下釋放出化合物。
為了決定是否氨基磷酸化物烷化劑前藥在無氧或缺氧條件下具選擇性活性，暴露於藥物之細胞，不論是在空氣(常氧)或無氧氣(無氧)或非常少氧氣(缺氧)條件下。熟習此技術領域者應了解到，氨基磷酸化物烷化劑前藥之細胞毒性，可於抗增生試驗中測量，以IC5 0 表達；且氨基磷酸化物烷化劑前藥之細胞毒性可於細胞株存活試驗中測量，以IC1 0 或LC1 0 、IC9 0 或LC9 0 ，或IC9 9 或LC9 9 表達。細胞毒性之比例，如IC5 0 、IC9 0 、LC5 0 、LC9 0 或LC9 9 可於常氧與缺氧條件下決定，稱之為缺氧細胞毒性比例(HCR)，並可測量本發明前藥之缺氧選擇性細胞毒性。氨基磷酸化物烷化劑前藥之HCR愈大，其缺氧細胞選擇毒性愈高，且前藥之缺氧腫瘤毒殺能力愈大，相較於健康常氧細胞。基於IC9 9 或LC9 9 決定之HCR，較基於IC9 0 或LC9 0 決定之HCR大。
在相關實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥具有缺氧細胞毒性為0.1 nM至50 μM，以及HCR為10至100,000。在一相關實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥具有缺氧細胞毒性為0.1 nM至50 μM，以及HCR為25至100,000(請見範例一節)。在另一相關實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥具有缺氧細胞毒性為0.1 nM至5 μM，HCR為50至10,000，如範例29、30與31中所述之化合物。
在一實施例中，本發明提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，具有缺氧毒性，為相對應常氧毒性之5至1,000,000倍。在另一實施例中，本發明提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，具有缺氧毒性，為相對應常氧毒性之10至10,000倍。在另一實施例中，本發明提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，具有缺氧毒性，為相對應常氧毒性之25至5,000倍。
腫瘤具有氧濃度梯度，可由10%，於鄰近於血管化之組織，至0.5%，於遠離約150 μM之組織，且在更遠離血管化與接近壞死核心處更低。在一實施例中，本發明提供氨基磷酸化物烷化劑前藥，其可產生氨基磷酸化物烷化劑，較相對應之前藥更毒5－1,000,00；10－10,00；以及25－5,000倍，在各種氧濃度下。在一實施例中，本發明係提供氨基磷酸化物烷化劑前藥，其可產生氨基磷酸化物烷化劑，較相對應之前藥更毒5－1,000,00；10－10,00；以及25－5,000倍，在0.5－0.6%之氧濃度下。
本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥之logP，可測量前藥之親脂性或親水性。在一實施例中，本發明係提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，具有小於0之logP。此種氨基磷酸化物烷化劑前藥可為親水性，此種前藥具式XV，其中每一R1 1 為H，且可輕易地配製為i.v.或i.p.注射用水性配方。此種前藥之另一範例為化合物24、25與36。
在一實施例中，本發明提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，具有大於0之logP。在一實施例中，本發明提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，具有介於0與4之間之logP，如同式XIV；XX與XV所示範，其中每一R1 1 為甲基或環丙基，投予病患可通過細胞膜，並穿透至癌細胞內部。前藥之另一範例具有介於0與5、6、7或16之logP(關於測量本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥之logP，請見範例一節)。
IIb.合成方法
本發明係由於發現化合物36而產生，其可不經分離，藉由反應 1－甲基－2－硝基咪唑－5－甲醇，與n－丁基鋰，於適當溶劑中，可立即使用Mitsunobu－型反應製備，其中1－N－甲基－2－硝基咪唑－5－甲醇可藉由加入三苯基膦與二異丙基偶氮二羧酸酯而活化，並與反應產生化合物36。
因此，本發明之一觀點為提供一種合成氨基磷酸化物之方法，包含將氨基磷酸或二氨基磷酸與一醇類反應，產生氨基磷酸化物。在另一觀點中，本發明係提供一種合成本發明新穎之氨基磷酸化物烷化劑前藥或其他已知者之方法。在一實施例中，本發明係提供一種合成氨基磷酸化物烷化劑前藥之方法，包含反應新穎或已知之氨基磷酸化物烷化劑、Trigger－OH、經三取代之膦，以及二烷基偶氮羧酸酯，產生一新穎或已知之氨基磷酸化物烷化劑前藥。在該方法之一實施例中，第一步驟為Trigger－OH與經三取代之膦，以及二烷基偶氮羧酸酯反應，產生一中間產物，在第二步驟中，加入氨基磷酸化物烷化劑於該第一步驟產生之中間產物中，產生一產物。此Mitsunobu型反應特別適用於合成新穎或已知之氨基磷酸化物烷化劑前藥或衍生物，Alk－Trigger，其中Trigger為L－Z3 ，其中Z3 為：,,,,,或，：以及Alk為
其中R9 如上述定義。
在一實施例中，本發明提供一種合成氨基磷酸化物烷化劑前藥之方法，包含反應每一新穎或已知之氨基磷酸化物烷化劑：
與Trigger－OH、經三取代之膦，以及二烷基偶氮羧酸酯，分別產生
其中X4 、R5、R7與R8，如式(I)所示。
在一實施例中，本發明係提供一種合成下式化合物之方法：
包含反應(a)一新穎或已知之氨基磷酸化物烷化劑，具下式：
其中R2 －R5 如式(I)所定義，但書為(i)R1 －R5 之至少二者選自於由2－鹵素烷基、2－烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，與2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；(ii)R2 －R5 之至少一者係選自於由2－鹵素烷基、2－C1 －C6 烷基磺醯氧基烷基、2－雜烷基磺醯氧基烷基、2－芳基磺醯氧基烷基，以及2－雜烷基磺醯氧基烷基組成之族群；以及NR2 R3 與NR4 R5 之至少一者為；或是(iii)NR2 R3 與NR4 R5 二者共同為；(b)Trigger－OH，其中Trigger如式(I)所定義，經三取代之膦，以及(c)二烷基偶氮羧酸酯，產生下式之化合物：
在一實施例中，下式之化合物：
係選自於由：,,與組成之族群。
在另一實施例中，具下式之族群：
係選自於由：,, ,,,,,,,或組成之族群。
在另一實施例中，該反應包括一溶劑，如THF、二噁烷、C1 －C6 烷基醋酸酯、氯仿、二氯甲烷、乙腈，及其類似物。在另一實施例中，三取代膦中之每一取代基係獨立地選自於C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基、芳基、雜芳基，以及C1 －C6 烷氧基取代基。在另一實施例中，Trigger T－為
其中X1 、X2 、Z1 與Z2 係如式(I)所定義。
在另一實施例中，本發明係提供一種合成氨基磷酸化物烷化劑前藥之方法，包含(i)反應一溶劑，選自於THF、二噁烷、二氯甲烷、氯仿、乙基醋酸酯、丙基醋酸酯、丁基醋酸酯，或乙腈，具下式：
其中每一R1 1 係獨立地為氫、環丙基、甲基、乙基、苄基或甲氧基；每一R9 係獨立地為氫、甲基、乙基、丙基，或環丙基；以及X4 為鹵素、甲基磺醯氧基、苯基磺醯氧基、4－甲基苯基磺醯氧基，以及4－鹵素苯基磺醯氧基；(ii)經三取代之膦，選自於三苯基膦、三丁基膦、丁基膦；以及(iii)二乙基或二異丙基偶氮羧酸酯；產生如下式之化合物：
在另一實施例中，本發明係提供一種合成下式化合物之方法：
包含步驟：(i)反應一非質子溶劑、Trigger－OH，其中Trigger如式(I)所定義；三取代基膦；以及二乙基或二異丙基偶氮羧酸酯，產生中間產物(i)；(ii)反應由步驟(i)所得之中間產物(i)與具下式之化合物：
其中每一R9 、R1 1 與X4 如式(I)所定義，產生如下式之化合物：
在另一實施例中，該三取代基膦為P(R1 2 )3 ，其中每一R1 2 為H、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基、芳基，或雜芳基。在另一實施例中，該三取代基膦為經聚合物支撐之三取代基膦。在另一實施例中，該三取代基膦為三苯基膦、三丁基膦、三丙基膦、三乙基膦或三甲基膦。另一實施例中，該三取代基膦為經聚合物支撐之三苯基膦。經聚合物支撐之三取代基膦為商業上可獲得，如得自Varian Inc.of Palo Alto,California。在另一實施例中，本發明係提供一種合成化合物之方法，其中每一R1 1 為氫。在另一實施例中，本發明係提供一種合成下列化合物之方法
在另一實施例中，本發明係提供一種製備一化合物之方法，其中Trigger選自於由：,,以及以及Z3 為
在一實施例中，本發明係提供一種合成氨基磷酸化物烷化劑前藥之方法，包含下列步驟：(a)回流POCl3 與N－2－鹵素乙基－N－(R1 3 )銨鹽，其中R1 3 為氫、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基雜環基、芳基、雜芳基，產生二氯氨基磷酸化物中間產物；(b)反應該步驟(a)中之二氯氨基磷酸化物中間產物與N－2－鹵素乙基－N－(R1 3 )銨鹽，其中R1 3 為氫、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基、芳基、雜芳基，與一鹼基，於溶劑中，產生單氯化氨基磷酸化物中間產物；以及(c)反應該由步驟(b)所得之單氯化氨基磷酸化物中間產物，與Trigger－OH與一鹼基，於一溶劑中，產生該氨基磷酸化物烷化劑前藥。
在一實施例中，該步驟(a)之二氯化氨基磷酸化物中間產物由其餘反應混合物中分離出，在置入步驟(b)之反應前。在另一實施例中，該分離首先真空移除過量之POCl3 ，之後減壓蒸餾出該二氯氨基磷酸化物。
在一實施例中，步驟(c)之氨基磷酸化物烷化劑前藥係由其餘反應混合物中分離出，以快速矽膠管柱層析法。在一實施例中，步驟(b)中所使用之鹼為三級胺。使用於步驟(b)之適當三級胺包括三烷基胺，如，三乙基胺或二異丙基乙胺。在一實施例中，步驟(b)所使用之溶劑為四氫呋喃(THF)或二噁烷。
在一實施例中，該步驟(b)之單氯化氨基磷酸化物中間產物由其餘反應混合物中分離出，以快速矽膠管柱層析法，在將其置入步驟(c)之前。在一實施例中，使用於步驟(c)之鹼基為鋰、鈉或鉀六烷基二矽疊氮；鈉或鉀氫化物；或二異丙基醯胺鋰。在一實施例中，步驟(c)所使用之溶劑為二甲氧基乙烷、甘醇二甲醚、二乙基醚或THF。
在一實施例中，本發明提供一種合成氨基磷酸化物烷化劑前藥之方法，包含下列步驟：(a)於一溶劑中反應約1當量之POCl3 、Trigger－OH與鹼，產生二氯磷酸酯中間產物；(b)反應該步驟(a)之二氯磷酸酯中間產物與N－2－鹵素乙基－N－13)－銨鹽，其中R1 3 為氫、C1 －C6 烷基、C1 －C6 雜烷基、C3 －C8 環烷基、雜環基、芳基、雜芳基，以及鹼於溶劑中，產生氨基磷酸化物烷化劑前藥。
在一實施例中，步驟(a)與(b)係於低於0℃進行。在另一實施例中，步驟(b)係於高於步驟(a)20－100℃進行。
在另一實施例中，本發明係提供一種合成雜環氨基磷酸化物烷化劑前藥之方法，如下所示：
其中X4 ＝Br或Cl；e＝1－3。
在一實施例中，本發明係提供一種合成氨基磷酸化物烷化劑前藥之方法，包含下列步驟：(a)反應PCl3 與N,N－二(2－鹵素乙基)銨鹽與鹼於溶劑中，產生單氯磷醯胺衍生物；(b)反應該單氯磷醯胺衍生物與Trigger－OH，產生一中間產物；以及(c)氧化步驟(b)之中間產物，產生氨基磷酸化物烷化劑前藥。
在一實施例中，使用於步驟(b)之鹼基為三乙基胺。在另一實施例中，使用於步驟(c)之溶劑為二甲氧基乙烷、二甘醇二甲醚或C1 －C6 烷基醋酸酯。在另一實施例中，步驟(c)之Trigger－OH為
各種1－N－烷基－2－胺基咪唑－5－羧酸酯可以下列流程合成：
該1－N－烷基－2－胺基咪唑－5－羧酸酯可經還原，產生各種1－烷基－2－胺基－5－羥基甲基咪唑衍生物，使用於本發明作為生物還原基團Z3 。
該合成方法係於下列範例一節提供更詳細之說明。
生物還原基團與氨基磷酸化物烷化劑前藥之合成，以及本發明之方法係採用參考文獻Matteucciet al., PCT申請公開案號WO 04/009667，與缺氧活化前藥US專利申請案，標題為“Hypoxia Activated anti－Cancer Agents”；deGrootet al., 2001,Current Med.Chem. 8：1093－1122；Dennyetal., US專利號5,750,782；5,780,585；5,872,129；以及6,251,933；Daviset., PCT專利申請公開案號WO 04/85421與WO 04/85361；以及Linet al., US專利申請公開案號2004/254103與2005/043244,and Borchetal.,(supra)。
合成本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥之方法範例係於下列“範例”一節提供更詳細之說明。
IIIa.治療方法
在一實施例中，本發明係提供一種治療有需要病患之癌症之方法，藉由投予該病患本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥，或已知藥物。已知之氨基磷酸化物烷化劑係提供於參考資料Borchet al.,supra。 在一實施例中，依據本發明方法使用於治療癌症之氨基磷酸化物烷化劑前藥，具有選自式(I)－(XXVII)之化學式。在一實施例中，依據本發明方法使用於治療癌症之氨基磷酸化物烷化劑前藥，係選自於範例一節中所示之化合物。
以烷化劑治療癌症會導致可對抗這些烷化劑之癌症之發展。烷化劑可殺死快速分裂或較高含氧癌症區域之癌細胞，與較低成長之缺氧癌症區域相較。後者之細胞可在烷化劑治療後存活，且可產生抵抗此種烷化劑之細胞。胍－O6 －烷基轉移酶、穀胱甘肽、穀胱甘肽轉移酶、核苷酸切除修復路徑，及/或錯位修復蛋白活性之增加，以及降低活性傳輸藥物，如甲基氯乙胺與美法崙(melphalan)之通透度，皆被認為是癌症抵抗烷化劑之因素(例如，請見Hardmanet al., 1393與1433頁，supra )。
本發明前藥可有效治療抵抗其他療法之癌症。在缺氧癌區域之緩慢分裂癌細胞，可作為抵抗性癌症細胞與細胞株之來源，可被本發明前藥毒殺。在一實施例中，本發明提供一種治療抵抗一或多種烷化劑之癌症之方法，藉由投以本發明單一化合物與另一抗癌試劑之組合。在一實施例中，本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥係與一實質上無腎毒性之藥物組合投藥。在一實施例中，該氨基磷酸化物烷化劑前藥係與卡鉑一同投藥。
在一實施例中，本發明係提供一種氨基磷酸化物烷化劑前藥，其不會與已知之烷化劑有交叉抵抗性。在另一實施例中，本發明係提供氨基磷酸化物烷化劑前藥，其不會與烷化劑環磷醯胺、異環磷醯胺、葡環磷醯胺、甲基氯乙胺、美法崙(melphalan)、苯丁酸氯芥(chlorambucil)、氮烯唑胺、替莫唑胺(temozolomide)、亞硝脲氮芥、鏈脲菌素、bendamustin、白消安(busulfan)、噻歐替帕、順鉑、卡鉑與奧沙地鉑有交叉抵抗性。
在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，以本發明化合物作為第一線療法投藥，單獨或與其他抗癌試劑組合。在另一實施例中，本發明係提供一種治療轉移性癌症之方法，以本發明化合物作為第一線療法投藥，單獨或與其他抗癌試劑組合。在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症的方法，以本發明化合物作為第二線療法投藥，單獨或與其他抗癌試劑組合。在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症的方法，以本發明化合物作為第三線療法投藥，單獨或與其他抗癌試劑組合。在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症的方法，在以手術及/或放射線治療之後，投以本發明化合物，單獨或與其他抗癌試劑組合。在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症的方法，該癌症在化療、手術、放射線或任一組合治療後復發，藉由投以本發明化合物，單獨或與其他抗癌試劑組合。
在以本發明提供之治療癌症之方法中，有效量之氨基磷酸化物烷化劑前藥係投予個體。一般而言，該個體可為人體或非人類哺乳動物。較佳之個體為人類。其他特定個體包括，但不侷限於，非人類靈長類、狗、貓、農場動物與馬匹。在一觀點中，該氨基磷酸化物烷化劑前藥係單獨投藥。在一觀點中，該氨基磷酸化物烷化劑前藥係與一或多種額外之抗癌試劑組合投藥。在一觀點中，該氨基磷酸化物烷化劑前藥係與癌症治療方法結合，包括，但不侷限於，手術與放射線治療。該氨基磷酸化物烷化劑前藥一般係以醫藥組成物投藥。各種醫藥組成物描述於下列配方一節。
該氨基磷酸化物烷化劑前藥與其醫藥組成物可用於治療個體中任一形式之癌症，特別是人類個體。可被治療之癌症包括，但不侷限於，血癌、乳癌、皮膚癌、骨癌、肝炎、腦癌、喉頭癌、膽囊癌、胰臟癌、直腸癌、副甲狀腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、神經組織、頭頸癌、胃癌、支氣管癌、腎臟癌、基底細胞癌、潰瘍型與乳突型鱗狀細胞癌、轉移性皮膚癌、骨癌、Ewing’s癌、veticulum細胞癌、骨髓瘤、巨細胞或小細胞肺癌、膽結石、島細胞瘤、原發性腦瘤、急性與慢性淋巴與顆粒細胞腫瘤、毛細胞腫瘤、腺瘤、增生、髓樣腺管炎、嗜鉻細胞瘤、黏膜神經瘤、小腸神經節細胞瘤、過度增生角膜神經腫瘤、類瑪凡氏習慣性腫瘤、Wilm’s腫瘤、精母細胞瘤、leiomyomater腫瘤、子宮頸表皮增生不良、以及原位癌、神經母細胞瘤、視網膜細胞瘤、軟組織瘤、惡性類癌、局部皮膚傷口、蕈樣肉芽腫(mycosis fungoide)、橫紋肌肉瘤、Kaposi’s瘤、骨性與其他瘤、惡性高血鈣症、腎細胞腫瘤、真性紅細胞增多症、腺瘤、多型性膠母細胞瘤、白血病、淋巴瘤、惡性黑色素細胞瘤，以及皮膚瘤。
該氨基磷酸化物烷化劑前藥可特別用於治療含明顯缺氧組織區域之癌症。此種癌症包括，但不侷限於，肺癌，尤其是非小細胞肺癌、乳癌、大腸癌、頭頸癌、卵巢癌、胰臟癌與前列腺癌。可以本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥治療之癌症類型範例，係包含於下列參考資料終，每一者在此併入本案以作為參考資料Tidmarshet al., PCT專利申請案號PCT/US2005/047314，提申於2005年12月22日，與PCT專利申請案，標題為“Glufosfamide combination therapy”,torney Docket No.021305－005900PC；以及US專利申請案號60/760,599與60/719,787與PCT專利申請案號WO 2005/076888。數種這類癌症係於下述進行更詳盡之討論。熟習此技術領域者應可暸解到癌症化學療法涉及同時或連續性投以各種抗癌藥物，如下列討論，氨基磷酸化物烷化劑前藥可用於組合療法，如方法中所提供者。因此，亦於此討論可以氨基磷酸化物烷化劑前藥治療之含缺氧區域癌症之組合療法範例。
肺癌已影響美國超過100,000位男性與50,000位女性，大部份在診斷後一年會死亡，為癌症死亡之主因。目前用於治療肺癌之流程涉及整合化療，以及搭配或未撘配放射線療法與手術。氨基磷酸化物烷化劑前藥可使用作為單一試劑或與現存之組合療法結合。各種化療處方之組合以報導用於小細胞肺癌，包括環磷醯胺、多柔比星(doxorubicin)與長春新鹼(vincristine)(CAV)；依托鉑苷(etoposide)與順鉑(VP－16)；以及環磷醯胺、多柔比星(doxorubicin)與VP－16(CAVP－16)之組合。組合式化療(依托鉑苷(etoposide)加順鉑)之中度存活獲益已報導於非小細胞肺癌中。
同樣地，目前已製造出數種不同之藥物，可使卵巢癌至少暫時退化。治療卵巢癌最具活性之藥物為烷化試劑，包括環磷醯胺、異環磷醯胺、美法崙(melphalan)、苯丁酸氯芥(chlorambucil)、歐替帕(otepa)、順鉑與卡鉑。目前用於卵巢炎之組合療法包括順鉑或卡鉑與環磷醯胺之組合，投藥間隔為3－至4－周，6－8次循環。於此所述之化合物與方法係提供前藥形式與治療卵巢癌之方法，其中於此所述之氨基磷酸化物烷化劑前藥可以單一試劑或現存之組合療法使用，不論是取代目前所使用之一試劑或加入一試劑。
前列腺癌為美國男性最常見之惡性腫瘤，且為55歲以上男性第二常見癌症死亡因素，此癌症已被報導主要係由缺氧組織組成。數種化學療法流程已被報導用於賀爾蒙療法後復發之晚期疾病。用於治療前列腺癌之試劑包括烷化劑雌氮芥磷酸鹽、潑尼莫斯汀(predimustine)，以及順鉑。化療組合亦可用於治療前列腺癌，包括以雌氮芥磷酸鹽加潑尼莫斯汀(predimustine)與順鉑，以及5－氟嘧啶二酮(fluorouracil)、美法崙(melphalan)，與羥基尿素。本發明提供治療前列腺癌之方法，其中本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥可用於此種組合，不論是取代一試劑或加入目前使用之試劑。
大腸癌為美國癌症第二大死亡原因，同樣地，亦為特徵為缺氧區域之癌症。罹患大腸直腸癌之病患進行化療，已證實僅具有些許助益，5－氟嘧啶二酮為此疾病最有效之治療。5－氟嘧啶二酮可單獨使用或與其他藥物結合，但僅有15至20百分比之腫瘤降低50%或更多質量。使用5－FU並結合於此所述之化合物與方法，以及使用前藥治療癌症之方法，可提供明顯的醫療助益與潛力，以符合此疾病較佳療法之需要。
在該治療方法之一觀點中，氨基磷酸化物烷化劑前藥可使用各種已知之癌症治療方法，包括，但不侷限於，“抗體導向酵素前藥療法”(ADEPT)、“病毒導向酵素前藥療髮”(VDEPT)、“基因導向酵素前藥療法”(GDEPT)，以及“細菌導向酵素前藥療法”(BDEPT)。氨基磷酸化物烷化劑前藥之一般用途並不侷限於前述之治療方法。
在另一觀點中，本發明係提供一種治療非癌症過度增生疾病之方法，特徵為細胞性過度增生(如細胞增生速率或量不正常增加)。在一實施例中，以本發明方法治療之過度增生疾病選自於由過敏性血管炎與肉芽腫(Churg－Strauss症)、石棉沉著病、氣喘、萎縮性胃炎、良性前列腺肥大、大水皰性類天皰瘡、乳糜瀉、慢性支氣管炎與慢性呼吸道阻塞疾病、慢性鼻竇炎、Crohn’s症、脫髓鞘性周邊神經病變、皮肌炎、濕疹包括異位性皮膚炎、eustachean tube症、巨細胞動脈炎、移植排斥、過敏性肺炎、過敏性血管炎(Henoch－Schonlein紫斑症)、刺激性皮膚炎、發炎性溶血性貧血、發炎性低嗜中性球、發炎性腸症、Kawasaki’s症、多發性硬化症、心肌炎、肌炎、鼻息肉、鼻淚管症、新生瘤血管炎、胰臟炎、尋常型天皰瘡、原發性腎絲球腎炎、牛皮癬、牙病、多囊腎疾病、結節性多動脈炎、多血管性重疊症、原發性硬化性膽管炎、風濕性關節炎、血清症、手術沾黏、狹窄或再狹窄、鞏膜炎、硬皮病、膽管狹窄、狹窄(十二指腸、小腸與大腸)、矽肺與其他形式之塵肺、第I型糖尿病、潰瘍性結腸炎、潰瘍性直腸炎、與結締組織失調相關之血管炎、與補體系統先天缺陷相關之血管炎、中樞神經系統之血管炎，以及Wegener’s肉芽腫組成之族群。
在本發明之某些實施例中，本發明化合物係投予治療過度增生疾病，選自於由牛皮癬、多發性硬化症、風濕性關節炎、再狹窄，以及良性前列腺肥大組成之族群。在一實施例中，待治療之過度增生疾病為牛皮癬，一種特徵為角質細胞之細胞過度增生疾病，其建構皮膚生成增多、鱗片狀傷口。在另一實施例中，待治療之過度增生疾病為多發性硬化症，一種特徵為大腦漸進式脫髓鞘化之疾病。在另一實施例中，待治療之過度增生疾病為風濕性關節炎，一種多重系統、慢性、復發性發炎疾病，或導致受影響之關節損傷與關節僵硬。在另一實施例中，本發明之化合物係投予，以預防過度增生疾病，為細胞增生於個體殖入之義肢上，藉由以含有本發明化合物之組成物塗佈於義肢上。在另一實施例中，待治療之過度增生疾病為惡性前列腺肥大，一種前列腺上皮細胞不正常生長，且因此阻擋尿液流動之疾病。
IIIb.配方、投藥模式、劑量
氨基磷酸化物烷化劑前藥一般係配製為適用於投予個體之醫藥配方。描述於此節者為投藥模式、配方與劑量，可用於使用此述之氨基磷酸化物烷化劑前藥治療癌症時。
投以氨基磷酸化物烷化劑前藥治療癌症，可被任一可傳送該前藥於作用處，腫瘤缺氧區域之方法影響。許多癌症藥物係以靜脈注射投藥，該氨基磷酸化物烷化劑前藥便可配製為用於此種投藥之形式，包括立即可用於注射，以及冷凍乾燥或濃縮配方，其必須在注射前分別再水合或稀釋。除了這些配方之外，氨基磷酸化物烷化劑前藥可配製為口服路徑、十二指腸內路徑、非經腸胃注射(包括靜脈內、皮下、肌內、血管內或灌注)、局部與直腸路徑。熟習此技術領者應了解到氨基磷酸化物烷化劑前藥可被腸道中的細菌活化。若此種活化不希望，醫師可使用在進入大腸或直腸前之氨基磷酸化物烷化劑前藥吸收路徑。氨基磷酸化物烷化劑前藥實際投藥路徑與相對應之配方，將取決於待治療之癌症形式、選用投藥之氨基磷酸化物烷化劑前藥、癌症嚴重度、年紀、體重與病患症狀，在其他因素中。
氨基磷酸化物烷化劑前藥之投藥劑量，以及包含於該藥劑中之氨基磷酸化物烷化劑前藥劑量，與包含該藥劑之產品，將取決於待治療之個體、癌症嚴重度、癌症位置、投藥速率、前藥之傾向(如分子量、溶解度與缺氧與常氧細胞毒性)、氨基磷酸化物烷化劑前藥釋放之細胞毒性試劑，以及處方醫師之考量。
在一實施例中，本發明係提供一種治療病患癌症之方法，其中有效劑量一般範圍為約0.001至約0.1g每公斤體重，或約0.1至約35 mg/kg/日，單一或多次劑次。就70 kg人類而言，此劑量可為約0.05至約7 g/日，約0.2至約2.5 g/日。在某些範例中，低於前述範圍下限之之劑量可大於適當量，而其他情況下可使用更大劑量而不會引起任何傷害性副作用；較大劑量可分為數個較小劑量，於一天內投藥，藉由灌注一小時或連續式使用周邊插入中央導管(PICC線)與可攜式靜脈袋與幫浦。
在一實施例中，本發明化合物用於治療癌症與其他過度增生疾病之有效劑量範圍為約0.1至約35 mg/kg/日；約0.5至約20 mg/kg/日；約0.5至約15 mg/kg/日；約0.5至約10 mg/kg/日；約0.5至約8 mg/kg/日；以及約1至約5 mg/kg/日，單一或分次劑量。在一實施例中，本發明化合物用於治療癌症與其他過度增生疾病之有效劑量範圍為約約2至約8 mg/kg/日；約2至約4 mg/kg/日；以及約2 mg/kg/日單一或分次劑量。在一實施例中，本發明化合物用於治療癌症與其他過度增生疾病之有效劑量範圍為約0.25至約2.5 mg/kg/日；約0.25至約1 mg/kg/日；以及約0.25至約0.5 mg/kg/日單一或分次劑量。在一實施例中，該劑量係每日以靜脈投藥，不論是單一療法(單獨本發明化合物)，或與標準照護療法結合(組合)。在一實施例中，治療癌症與其他過度增生疾病之有效劑量範圍如上所述，每週投藥一次。
在一實施例中，較大劑量可間歇性(較少頻率)投藥；劑量範圍為約3至約20 mg/kg；約6至約10 mg/kg；或8 mg/kg，每三日投藥一次，持續二周。在另一實施例中，劑量範圍為約5至約30 mg/kg；約10至約15 mg/kg；或12.5 mg/kg之氨基磷酸化物烷化劑前藥每週投藥一次，持續四周。在一實施例中，劑量範圍為約0.5至約8 mg/kg/日，投藥5日，二周循環。
在另一實施例中，治療人類病患，氨基磷酸化物烷化劑前藥之每日最大劑量不大於500 mg/kg病患體重，因此，氨基磷酸化物烷化劑前藥之每日投藥劑量範圍為約1 mg之氨基磷酸化物烷化劑前藥/kg病患體重至約500 mg之氨基磷酸化物烷化劑前藥/kg病患體重。在一實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥之每日投藥劑量範圍為約5 mg/kg至約500 mg/kg待治療病患體重。在另一實施例中，醫療有效劑量為氨基磷酸化物烷化劑前藥之每日劑量為約10 mg/kg至約250 mg/kg待治療病患體重。在另一實施例中，該氨基磷酸化物烷化劑前藥之醫療有效劑量為約25 mg/kg至約150 mg/kg待治療病患體重。在另一實施例中，該氨基磷酸化物烷化劑前藥之醫療有效劑量為約25 mg/kg至約50 mg/kg待治療病患體重。在另一實施例中，該氨基磷酸化物烷化劑前藥之醫療有效劑量為約1.25 mg/kg至約12.5 mg/kg待治療病患體重。
有關投藥之指導亦可由人類與其他哺乳動物之研究提供。動物之醫療有效劑量投藥可轉換為相對應之人類等效劑量(HED)，如下表所描述： a 為了轉換動物劑量mg/kg為HED(假設為60 kg人類)mg/kg，將動物劑量除以HED轉換因數。就未列出或體重落於標準範圍外之動物，人類等效劑量(HED)可以下列公式計算：HED＝動物劑量mg/kg x(動物體重kg/人類體重kg)0 . 3 3 。b 例如，食蟹猴(cynomolgus)、恆河猴(rhesus)或彌猴(stumptail)。
為了達到醫療有效性，氨基磷酸化物烷化劑前藥之每日醫療有效劑量通常多次投予病患。在一實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥每日投藥，持續一段時間。一般而言，可使用每日投藥，至少連續三日。在一相關實施例中，該投藥為至少連續5日、至少連續7日或至少連續10日。取決於醫師選擇之劑量、配方與投藥路徑與病患方便度，總每日劑量可每日投藥一次，或每日投藥劑量可以多次小量投藥，全程為一日(包括以幫浦灌注或靜脈投藥)。例如，該劑量可分為二較小劑量，每日投藥二次，或分為三較小劑量，每日投藥三次。熟習癌症治療技術領域者應了解到，使用於此，“每日”投藥並不限制於每日一次投藥，亦可包括多次投藥。
亦可使用除了每日連續式投藥之外之投藥時程。每二日投藥一次(qod)為特別方便，每三日投藥一次、每週投藥一次，在某些情況下皆適當，但在任何情況下，氨基磷酸化物烷化劑前藥係重複性投藥一段時間。例如，當每日(包括，如注釋，一日多次劑量)、每二日或更少頻率投藥時，在一實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥係每週投藥至少2日，持續至少連續2、3、4、5或至少連續6周，或者，在六個月內持續2、3、4、5或至少6周，或者，在12個月內持續至少2、3、4、5或至少6周。在一實施例中，該氨基磷酸化物烷化劑前藥係每週投藥至少3日，持續連續2、3、4、5或至少連續6周，或者，在六個月內持續2、3、4、5或至少連續6周，或者，在12個月內持續至少2、3、4、5或至少連續6周。在一實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥係每月投以至少10日，選擇性地每個月至少20日，至少一個月或至少2、3、4、5或至少連續6個月，或者，在六個月內持續2、3、4、5或至少6周。
在一實施例中，醫療有效劑量之投藥可連續數日，一般為至少連續三日，通常持續至少連續5至10日，或一周，或數周或更久。因此，病患可投以本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥數日、一周、一個月、六個月或一年或更久。
與其他抗癌藥物之投藥處方一致，氨基磷酸化物烷化劑前藥可投以多次投藥“回合”。例如，在某些實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥可每日投藥，至少連續三至十，或至少五至十日，且此三至十或五至十日治療可重覆一次、二次或三次或更多次，有時無治療(以氨基磷酸化物烷化劑前藥)期間範圍為一至數週，在每數日治療之間。類似地，在某些實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥係每二日投藥，持續2至10日，或5至10日，且此2、3或5至10日投藥期間可重複一次、二次、三次或更多無治療期間(以氨基磷酸化物烷化劑前藥)，期間範圍為一至數周，在每數日治療之間。其他複數回合之投藥時程為此技術領域者依據本份揭示而明白。
在一觀點中，“投以氨基磷酸化物烷化劑前藥之醫療有效劑量或處方”係指(i)投以如上所述範圍之氨基磷酸化物烷化劑前藥(如1 mg至1 g之氨基磷酸化物烷化劑前藥每公斤病患體重，一般為25至150 mg之氨基磷酸化物烷化劑前藥每公斤病患體重)，在一段特定期間內投藥最小數目日，其中氨基磷酸化物烷化劑前藥之投藥對於癌症病患具有醫療效用。氨基磷酸化物烷化劑前藥之實際醫療有效劑量處方包括於此所述者，如氨基磷酸化物烷化劑前藥連續投藥3天、連續5天、連續7天、連續10天，每週持續至少3天、連續5天、連續7天、連續10天每個月，以及至少20日每個月。
在最佳化氨基磷酸化物烷化劑前藥治療處方中，氨基磷酸化物烷化劑前藥之投藥頻率可經選擇，到達血漿濃度曲線(AUC)對應治療期間之最大維持區域。理論最佳劑量處方會產生最大量腫瘤細胞暴露於氨基磷酸化物烷化劑前藥，如同AUC所測量，而使單次投藥之最大血漿濃度(Cm a x )最小化。較高之Cm a x 會加強毒性，而AUC將決定效用。如同對於其他癌症治療藥物技術之了解，氨基磷酸化物烷化劑前藥之治療可暫時中止，若觀察有毒性現象或為了病患之方便，而不脫離本發明範疇，之後恢復。
在一實施例中，本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥用於治療癌症之藥物動力學可決定該劑次、投藥方法，以及以該氨基磷酸化物烷化劑前藥治療之癌症種類。在一實施例中，本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥具有體內半生期1至300分鐘間。在一實施例中，本發明化合物可具有體內半生期3至10分鐘間。在一實施例中，本發明化合物可具有體內半生期10至30分鐘間。較短半生期之氨基磷酸化物烷化劑前藥需要較長之灌入時間，與具較長半生期之氨基磷酸化物烷化劑前藥相較。氨基磷酸化物烷化劑前藥之短半生期可增加前藥之最大耐受劑量(MTD)。
在另一實施例中，本發明係提供氨基磷酸化物烷化劑前藥，維持至多20%未改變，當與小鼠肝臟微粒體(可更新為人類範例與資料，若可獲得)蛋白質靜置30分鐘後。在另一實施例中，本發明係提供氨基磷酸化物烷化劑前藥，維持20－80%未改變，當與小鼠肝臟微粒體蛋白質靜置30分鐘後。在另一實施例中，本發明係提供氨基磷酸化物烷化劑前藥，維持大於80%未改變，當與小鼠肝臟微粒體蛋白質靜置30分鐘後。在另一實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥之範例，當與小鼠肝臟微粒體蛋白質靜置30分鐘後，可維持大於80%未改變者包括範例1、25與36。本發明前藥之MLM穩定度愈高，其醫療有效劑量與不希望之病患副作用將愈低。
在一相關實施例中，本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥之生物還原基團，在缺氧腫瘤區域還原/活化，會形成氨基磷酸化物烷化劑－TM共軛物。該氨基磷酸化物烷化劑－TM共軛物可擴散到達腫瘤之其他部份或其他腫瘤，在轉移疾病之情況下。各種藥物動力學參數，如穩定態下之體積分布(Vss)、清除期之體積分佈(CL)、曲線下面積(AUC)、小鼠肝臟微粒體穩定度(MLM穩定度)、血漿穩定度，以及本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥之Cm a x ，係經測量，並列於範例一節(亦請見Hardmanet al.,supra )。
在重複治療處方中，該藥劑可調整至反應病患對於先前治療之耐受性。在任一情況下，由於在重複投藥期間觀察到之毒性，劑量可暫時停止，隨著觀察到的嚴重度。暫時中止投藥期間(藥物假日)，可在第一次毒性器官不再含有明顯的氨基磷酸化物烷化劑前藥或其釋放之氨基磷酸化物烷化劑濃度時停止(可經測量，或由症狀中止之間接決定)。因此，劑量期間之中止可定義為不僅為特定日數，更可為藥物假日之個人化，以症狀與氨基磷酸化物烷化劑前藥或其釋放之氨基磷酸化物烷化劑之一般器官清除期為基礎。
氨基磷酸化物烷化劑前藥配方可，例如，為適用於口服投藥之形式，如藥錠、膠囊、藥丸、粉末、持續釋放配方、溶液與懸浮液；就非經腸胃注射而言，為無菌溶液、懸浮液與乳液；就局部投藥而言，為藥膏或乳霜；以及就直腸投藥而言，為栓劑。氨基磷酸化物烷化劑前藥之配方可為單一藥劑形式，適用於精確劑量之單次投藥，且一般包括一般醫藥載體或賦形劑。
適當之醫藥用載體包括惰性稀釋劑或填充劑、水與各種有機溶劑。醫藥組成物可，若希望，包含額外之成份，如香味劑、黏著劑、賦形劑及其類似物。因此用於口服投藥，含有各種賦形劑之藥錠，如檸檬酸，可與各種分解劑如澱粉、海藻酸與某些複合矽膠，以及某些黏著劑，如蔗糖、明膠與刺槐膠一起使用。此外，潤滑劑如硬脂酸鎂、月桂硫酸鈉以及滑石，可用於製備此述氨基磷酸化物烷化劑前藥配方之藥錠形式。類似型態之固體組成物可使用於軟與硬填充明膠膠囊中。較佳之材料，因此，包括乳醣或乳糖，以及高分子量之聚乙二烯。當水性懸浮液或酏劑希望用於口服投藥時，所含之前藥可與各種甜味劑或香味劑、增色劑或染料，以及，若希望，乳化劑或懸浮劑結合，以及稀釋劑如水、乙醇、丙二醇、甘油或其結合物。
示範性非經腸胃之投藥形式包括氨基磷酸化物烷化劑前藥於無菌水性溶液中之溶液或懸浮液，例如，水性聚乙二醇、丙二醇或葡萄糖溶液。此種藥劑形式可為穩定緩衝，若希望。
製備各種具特定活性藥物量之醫藥組成物之方法為已知，或為熟習此技術領域者依據本份揭示可知。例如，請見Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,17t h Edition(1984)。
使用本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥之方法可有效毒殺成長於腫瘤缺氧區域之最難毒殺之癌細胞。一但於缺氧區域釋放，氨基磷酸化物前藥可由缺氧細胞擴散出，並殺死鄰近區域具有快速分裂細胞增加族群之癌細胞。該缺氧區域之作用為藥物－加工廠(drug－factory)，以於腫瘤內產生烷化劑，毒殺鄰近之常氧癌細胞，在腫瘤中產生更高濃度之氨基磷酸化物烷化劑，相對於一般組織。使用該前藥在腫瘤中產生氨基磷酸化物烷化劑可降低由於正常細胞毒性引起之毒性副作用。在腫瘤常氧區域之癌細胞被破壞之後，缺氧區域可變為常氧而開始分裂。此時，此種細胞可被本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥或其他已知者產生之氨基磷酸化物烷化劑毒殺，或被其他抗癌試劑或細胞毒素，與氨基磷酸化物烷化劑前藥結合者，毒殺，如下節所述。
IIIc.組合療法
依據本發明方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥可與其他抗癌試劑(“抗癌劑”)共同投藥。不受特定機制或效用束縛，此種共投藥在某些情況下可提供一或多種優於已知癌症療法之優點，如，氨基磷酸化物烷化劑前藥與抗癌藥物共投藥，對於誘發細胞死亡具協同效應。共投藥提供更佳之醫療結果，與單獨投以抗癌試劑相較，如一或多種癌症症狀較佳之減輕或改善、疾病之消除、延遲，或延緩疾病進程、改善、減輕或穩定疾病狀態、部份或完全減輕、延長存活或其他有益之醫療結果。
氨基磷酸化物烷化劑前藥之共投藥可增加癌細胞對於抗癌試劑之敏感度，允許較低劑量之抗癌藥物投予病患，或允許抗癌試劑用於治療抵抗抗癌試劑或抵抗治療之細胞。我們知道一般抗癌藥物之標靶為常氧區域之快速分裂細胞，而本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥標靶為腫瘤缺氧區域之細胞，其無法單以抗癌試劑有效毒殺。
於此所使用，氨基磷酸化物烷化劑前藥為與另一試劑(之後稱之為“試劑”)“共投藥”，當氨基磷酸化物烷化劑前藥與試劑可以相同時程療法投藥時。在一實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥首先於投以該試劑前投藥(即其他癌症治療初始)，而氨基磷酸化物烷化劑前藥之治療係持續整個試劑投藥期間(即其他療法時程)。在另一實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥係於其他癌症療法初始或完成之後投藥。在其他實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥在其他癌症療法初始時同時投藥。請參照範例一節中所述之組合療法。
在一實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥首先於投以該試劑前投藥，而氨基磷酸化物烷化劑前藥之治療係持續整個試劑投藥期間。在一實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥首先於投以該試劑前投藥，而氨基磷酸化物烷化劑前藥之治療係持續部分試劑投藥期間。就某些藥物，如拓墣異構酶抑制劑而言，氨基磷酸化物烷化劑前藥之投藥可在投以第二藥物前初始或完全。
在氧存在下，由Z3 還原形成之自由基陰離子會與氧反應，產生過氧化物與Z3 。過氧化物為細胞毒素，且於常氧細胞中產生之過氧化物會導致不希望之副作用。在一實施例中，本發明係提供氨基磷酸化物烷化劑前藥與化學保護劑組合投藥。化學保護劑保護健康組織遠離抗癌藥物之毒性作用。在一實施例中，該化學保護試劑為硫基或二硫化物。在一實施例中，該化學保護劑可還原過氧化物。在另一實施例中，該化學保護劑可與產生自氨基磷酸化物烷化劑前藥之“Michael－受器”作用，預防“Michael－受器”與蛋白質或核酸作用(請見下述)。
今日之抗癌藥物療法一般涉及多回合或“循環”抗癌試劑之投藥。在氨基磷酸化物烷化劑前藥投藥內容中，每一投藥循環(以及循環之完整設定)可視為第二藥物之投藥。氨基磷酸化物烷化劑前藥可投於複數治療循環之任一次或全部，與其他試劑；一般而言，氨基磷酸化物烷化劑前藥以一日為基礎投藥，至少二或更多日每一循環。在本發明之一觀點中，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與試劑共投藥，依據時程於每次循環中重複。
在使用氨基磷酸化物烷化劑前藥治療癌症之方法之一觀點中，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與有效劑量之一或多種化療試劑組合投藥，有效劑量之放射線治療、適當之手術程序，或此額外治療之任一組合。
當氨基磷酸化物烷化劑前藥用於與一或多種額外療法組合，氨基磷酸化物烷化劑前藥與其他療法可同時投藥，或可分開投藥。例如，若氨基磷酸化物烷化劑前藥與其他化療試劑投藥，該二試劑便可同時投藥或可依序投藥，在投藥期間。熟習此技術領域者應了解到同時或依序投以試劑之方法，以及可能之投藥時程。請參照範例一節中所述之組合療法。
該試劑可投以相同或不同配方，且可經由相同或不同路徑投藥。
可用於與本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥組合之化療試劑包括，但不侷限於，白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)、苯佐替派(benzodepa)、卡巴醌(carboquone)、2－去氧基－D－葡萄醣、氯尼達明(lonidamine)及其類似物(refrence apps)、glufosfamide、gemcitibine、埃羅替尼(erlotinb)、美妥替哌(meturedepa)、烏瑞替派(uredepa)、六甲蜜胺、依麥替尼布(imatinib)、三乙基蜜胺、三乙烯基磷醯胺、乙烯基硫基磷醯胺、三甲基蜜胺、苯丁酸氯芥(chlorambucil)、萘氮芥、雌氮芥、異環磷醯胺、gefitinib、氮芥氣、氮芥氣氧化物氯化氫、美法崙(melphalan)、novembichin、phenesterine、潑尼莫斯汀(predimustine)、曲磷醯胺、尿嘧啶芥、亞硝脲氮芥、氯脲黴素、福莫司汀(fotemustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、達卡巴仁(dacarbazine)、甘露醇芥、二溴甘露醇、二溴衛矛醇、哌泊溴烷、阿克拉辛黴素、放線菌素F(1)、安曲黴素、重氮乙酰絲胺酸、博來霉素、放線菌素C、卡米諾黴素、carzinophilin、色黴素、更生黴素、柔紅柔比星、柔紅黴素、6－二偶氮－5－氧－1－正亮胺酸、黴酚酸、諾家黴素、橄欖黴素、博來黴素、普卡黴素、紫菜黴素、嘌呤黴素、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結核菌素、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、denopterin、蝶羅呤、三甲曲沙(trimetrexate)、氟達拉濱(fludarabine)、巰基嘌呤、thiamiprine、硫基胍、安西他賓(ancitabine)、阿扎胞苷、6－氮雜尿苷、卡莫氟(carmofur)、塔拉賓(tarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5－氟嘧啶二酮、替加氟(tegafur)、L－天門東醯胺酶、阿法鏈道酶(pulmozyme)、乙醯葡萄內酸二酯、醛縮醯胺醣苷、胺基果糖酸、氨苯哌啶酮、bestrabucil、比生群(bisantrene)、卡鉑、得福法米(defofamide)、地美可辛(demecolcine)、二吖醌、elfornithine、伊利醋銨、依托格魯、氟他胺、硝酸鎵、羥基尿素、干擾素－α、干擾素－β、干擾素－γ、介白素－2、香菇多醣、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌達醇、nitracrine、噴司他丁(pentostatin)、phenamet、吡柔比星(pirarubicin)、足葉草酸、乙基肼、丙卡巴肼、丙亞胺、西佐喃、螺鍺、紫杉醇、泰莫西芬(tamoxifen)、otonib、替尼泊甙(teniposide)、細交鏈孢菌酮酸、三亞胺醌、2,2’,2”－三氯三乙基胺、胺酯、長春鹼(vinblastine)、環磷醯胺，以及長春新鹼(vincristine)。其他可使用之化療試劑包括鉑衍生物，包括但不侷限於，順鉑、卡鉑與氧鉑。
在一觀點中，此述之氨基磷酸化物烷化劑前藥可與抗血管新生抑制劑，包括但不侷限於癌思停(Avastin)，以及類似療法組合。在一觀點中，治療方法之組合，個體以抗血管新生抑制劑治療，之後以氨基磷酸化物烷化劑前藥處理。在組合治療方法之一觀點中，個體係以抗血管新生抑制劑治療，之後以氨基磷酸化物烷化劑前藥與另一化療試劑治療，包括，但不侷限於，順鉑與卡鉑。這些抗血管新生抑制劑之組合治療方法之一觀點中，該方法係用於治療乳癌。
在另一實施例中，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與一抗癌試劑一同投藥，不論是直接或間接，以抑制表皮生長因子或EGFR受器。使用於與本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥共投藥之EGFR抑制劑包括吉非替尼(gefitinib)與erlotonib。
在另一觀點中，該氨基磷酸化物烷化劑前藥係與一抗癌試劑一同投藥，不論是直接或間接，以抑制缺氧誘發因子1α(HTF1α)，或抑制蛋白質或酵素，如葡萄糖運輸子或VEGF，其表現或活性會隨著HTF1α量增加而增加。使用於本方法與組成物之HIF1α抑制劑包括P13激酶抑制劑；LY294002；雷帕黴素；組蛋白去醯酶抑制劑，如[(E)－(1S,4S,10S,21R)－7－[(Z)－乙二烯]－4,21－二異丙基－2－噁－12,13－二噻－5,8,20,23－四吖雙環－[8,7,6]－二十三－16－烯－3,6,9,19,22－戊酮(FR901228,depsipeptide)；熱休克蛋白90(Hsp90)抑制劑，如膠達納黴素、17－烯丙基胺基－膠達納黴素(17－AAG)，以及其他膠達納黴素類似物，以及根赤殼黴素(radicicol)與根赤殼黴素衍生物，如KF58333；金雀異黃酮；茚酮；十字胞鹼；蛋白激酶－1(MEK－1)抑制劑，如PD98059(2’－胺基－3’－甲氧基類黃酮)；PX－12(1－甲基丙基2－咪唑基二硫化物)；eurotin PX－478；喹噁啉1,4－二氧化物；丁酸鈉(NaB)；sodium nitropurruside(SNP)與其他NO提供者；微管抑制劑，如新生黴素、panzem(2－甲氧基雌二醇或2－ME2)、長春新鹼(vincristine)、紫杉類、艾普西隆(epothilones)、discodermolide，以及前述任一衍生物；巴比妥酸與硫基巴比妥酸類似物；喜樹鹼；以及YC－1，描述於Biochem.Pharmacol., 15 Apr 2001,(8)：947－954，之化合物，在此併入本案以作為參考資料，與其衍生物。
在另一觀點中，氨基磷酸化物烷化劑前藥係以抗血管新生抑制劑一同投藥，包括但不侷限於抗血管新生劑，選自於由血管收縮素，或抑制或拮抗VEGF作用之試劑、巴馬司他(batimastat)、卡托普利(captopril)、軟骨衍生抑制劑、金雀異黃酮、血管內皮抑素、介白素、薰草菌素A、甲基乙醯氧孕前酮乙酸鹽、重組性人類血小板因子4、太平洋紫杉醇、tecogalan、沙利竇邁(thalidomide)、凝血因子、TNP－470，以及癌思停(Avastin)。本發明方法與組成物所使用之其他可使用之血管新生抑制劑包括Cox－2抑制劑，如希樂葆(希樂葆)(Celebrex)、雙氯芬酸(Voltaren)、伊托多雷(Lodine)、非諾洛芬(Nalfon)、吲哚美洒辛(Indocin)、酮基布洛芬(Orudis、Oruvail)、酮咯酸(Toradol)、奧沙普秦(Daypro)、nabumetone(Relafen)、sulindac(Clinoril)、托麥汀(Tolectin)、羅非考昔(Vioxx)、布洛芬(Advil)、納普新(Aleve、Naprosyn)、阿斯匹靈與乙醯胺酚(Tylenol)。
此外，由於丙酮酸在血管新生中扮演重要角色，丙酮酸模擬物與糖解作用抑制劑，如鹵素丙酮酸，包括溴化丙酮酸，可使用於與抗血管新生化合物與氨基磷酸化物烷化劑前藥一同治療癌症。在另一觀點中，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與抗血管新生試劑與另一抗癌藥物一同投藥，包括但不侷限於，細胞毒性劑，選自於由烷化劑、順鉑、卡鉑與微管組裝抑制劑，以治療癌症。
除了與氨基磷酸化物烷化劑前藥與上述試劑結合之外，此述本發明方法與組成物係提供各種氨基磷酸化物烷化劑前藥與其他抗癌試劑之協同組合物。熟習此技術領域者可立即決定與氨基磷酸化物烷化劑前藥協同作用之抗癌藥物。例如，參考文獻Vendetti,“Relevance of Transplantable Animal－Tumor Systems to the ection of New Agents for Clinical Trial,”Pharmacological Basis of Cancer Chemotherapy,Williams and Wilkins,Baltimore,1975,and Simpson Herrenetal., 1985,“Evaluation ofIn Vivo Tumor Models for Predicting Clinical Activity for Anticancer Drugs,”Proc.Am.Assoc.Cancer Res.26： 330，在此併入本案以作為參考資料，描述之方法可幫助決定二藥物是否有協同作用。
當協同作用並非此述方法醫療上助益所必須，在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，其中在氨基磷酸化物烷化劑前藥與另一抗癌試劑間具協同作用。二藥物被認定為具有醫療協同作用，若該二藥物之劑量處方組合，可產生明顯較佳之腫瘤細胞毒殺，與最佳或最大耐受度之單一試劑相較。“協同程度”可定義為最佳組合處方毒殺之腫瘤細胞數淨對數，減去最具活性單一藥劑之最佳劑量毒殺之細胞數淨對數而得。大於10倍(一個對數)之細胞毒殺差異被認為是治療協同作用之指標。
當氨基磷酸化物烷化劑前藥與另一抗癌藥物一同使用時，氨基磷酸化物烷化劑前藥將，至少在某些實施例中，可在以其他藥物或藥物與投藥初始之前投藥，一般可於其他藥物或藥物整個療程中持續。在某些實施例中，可與氨基磷酸化物烷化劑前藥共投藥之藥物會於較低劑量傳送，且選擇性地於較低劑量傳送，且選擇性地傳送更長期間，與缺乏氨基磷酸化物烷化劑前藥投藥之情況相較。此種“低劑量”療法可涉及，如，投以抗癌藥物，包括，但不侷限於，紫杉醇、多西紫杉醇、多柔比星(doxorubicin)、順鉑，或卡鉑，於低於核准劑量，以及更長期間，與氨基磷酸化物烷化劑前藥一同投藥，依據此述之方法。
這些方法可用於增進病患對於目前實施之療法之結果，可更有效地毒殺癌症細胞，或終止癌細胞生長，以及消除其他療法不希望之副作用。當與氨基磷酸化物烷化劑前藥組合使用時，額外之抗癌試劑可使用這些試劑之標準劑次(即，當不與氨基磷酸化物烷化劑前藥使用)，或小於這些標準劑量時投藥。
因此，依據此述方法投藥氨基磷酸化物烷化劑前藥，可允許醫師以現有(或之後核准)藥物治療癌症，以較低劑量(較目前使用者)，因此可減輕此種藥物之某些或全部毒性副作用。特定病患之精確劑量隨著病患而不同，取決於數種因素包括所使用之藥物組合、待治療之特定疾病，以及病症與病患之病史，但可僅使用此技術領域者所知之技術，就於此揭示之觀點決定。
已知與核准之化療試劑或抗新生瘤試劑之特定劑量處方(即，建議之有效劑量)為醫師已知，並，如，提供於產品說明中，請見Physician’s Desk Reference 2003,(Physicians’ Desk Reference,57th Ed)Medical Economics Company,Inc.,Oradell,N.J，及/或可得自Federal Drug Administration。某些抗癌藥物之詳細藥劑處方亦提供於下。
癌症藥物一般可分類為烷化劑、氨茴環黴素、抗生素、芳香酶抑制劑、雙磷酸鹽類、環－氧酶抑制劑、雌激素受器調節劑、葉酸拮抗劑、無機砷酸鹽、微管抑制劑修飾劑、亞硝酸尿素、核苷酸類似物、蝕骨細胞抑制劑、含鉑化合物、視黃素、拓墣異構酶1抑制劑、拓墣異構酶2抑制劑，以及酪胺酸激酶抑制劑。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥可與這類抗癌藥物任一者共投藥，或可於任一此種藥物或此種藥物之組合投藥前或後投藥。此外，氨基磷酸化物烷化劑前藥可與邏輯性療法組合(如以干擾素、介白素、群落刺激因子與單株抗體)。用於治療癌症之生物療法包括，如，曲妥珠單抗(Herceptin)、托西莫單抗與1 3 1 I托西莫單抗(Bexxar)、tuximab(Rituxan)。
用於實施此述方法之烷化劑包括，但不侷限於，白消安(Myleran、Busulfex)、苯丁酸氯芥(Leukeran)、異環磷醯胺(具或不具MESNA)、環磷醯胺(Cytoxan、Neosar)、葡環磷醯胺(glufosfamide)、美法崙(melphalan)、L－PAM(Alkeran)、氮烯唑胺(DTIC－Dome)，以及替莫唑胺(Temodar)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥可與烷化劑共投藥，以治療癌症。在一觀點中，該癌症為慢性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤，或退行性星狀細胞瘤。
在一實施例中，本發明係提供一種治療可投以烷化劑治療癌症之方法，藉由投以本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥，單獨或與至少一另一烷化劑或其前藥結合。烷化劑，如，環磷醯胺、異環磷醯胺、葡環磷醯胺、甲基氯乙胺、美法崙(melphalan)、苯丁酸氯芥(chlorambucil)、氮烯唑胺、ozolomide、亞硝脲氮芥、鏈脲菌素、bendamustin、白消安(busulfan)、塞替派(thiotepa)、順鉑、卡鉑與奧沙利鉑，以及使用任一此種烷化劑治療之癌症類型，單獨或與其他抗癌或化學保護劑結合，係描述於參考文獻Hardmanet al., (supra)。
在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，藉由共投藥該氨基磷酸化物烷化劑前藥與至少一烷化劑環磷醯胺，在惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、白血病、蕈狀肉芽腫、神經母細胞瘤、卵巢腺瘤、視網膜細胞瘤，以及乳癌第III與IV治療期。環磷醯胺係投藥於誘發治療中，劑量為1500－1800 mg/m2 ，其以靜脈投藥，分次投藥，期間為3至5天；為了維持治療，每7－10 days投以350－550 mg/m2 或110－185 mg/m2 ，靜脈投藥，一周二次。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與環磷醯胺共投藥，於此劑量或更低劑量，及/和維持一段長時間，與單獨投以環磷醯胺相較。
在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，投以本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥，與至少使用烷化劑甲基氯化乙胺之癌症治療處方。例如，甲基氯乙胺係用於與化療處方MOPP(甲基氯乙胺、Oncovin(長春新鹼)、丙卡巴肼，以及強的松)結合，用於Hodgkin’s症之病患，以靜脈藥丸投藥，劑量為6 mg/m2 於28天循環之第1日與第8日，每次療程。
在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，藉由投以本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥與至少使用烷化劑異環磷醯胺之癌症治療處方，用於治療小兒與成人癌、子宮頸與肺癌，與其他用於生殖細胞睪丸癌之藥物結合。異環磷醯胺係用於作為ICE(異環磷醯胺、卡鉑與依托鉑苷(etoposide))與RICE(Rituxan and ICE)療法之一部分，用於治療淋巴癌(請見Hardmanet al,supra )。
在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，藉由投以本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥與一至少使用烷化劑葡環磷醯胺之癌症治療處方。葡環磷醯胺在臨床上係用於治療胰臟癌或抗Gemzar胰臟癌。葡環磷醯胺可用於治療乳癌、Morbus Hodgkin、胃腸道癌，或作為GCE(葡環磷醯胺、卡鉑與依托鉑苷)或RGCE(Rituxan and GCE)處方之一部份，用於治療淋巴癌。(Tidmarshet al., PCT專利申請案號PCT/US 2005/047314，2005年12月22日提申，與PCT專利申請案，標題為“Glufosfamide combination therapy”,attorney Docket No.021305－005900PC；與Us專利申請案號60/760,599與60/719,787，以及PCT專利申請案號WO 2005/076888，在此併入本案以作為參考資料)。
在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，藉由投以本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥與一至少使用烷化劑，選自於由乙胺與甲胺組成之族群，之癌症治療處方。在另一實施例中，該乙胺為三亞乙基密胺或噻歐替帕(otepa)。
噻歐替帕(otepa)可用於治療乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、惡性淋巴瘤、支氣管炎，以及Wilms’腫瘤。噻歐替帕(otepa)可使用高劑量，與化療結合，與環磷醯胺，一同使用於具有自體骨移植復發性惡性腫瘤之病患，並可治療各種癌症，包括膀胱癌、卵巢癌、乳癌、肺癌、腦癌與淋巴癌(請見International Agency for Research on Cancer Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans, 1975,9 ：286,Lyon,France；International Agency for Research on Cancer Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans, 1990,50：415,Lyon,France；andMEDLINEplus, 2003,Drug Information：Thiotepa(otepa),National Library of Medicine)。亞甲基密胺Altretamine係用於治療末期卵巢癌，在第一回合治療失效後。
在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，藉由投以本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥與一至少使用烷化劑美法崙(melphalan),苯丁酸氯芥(chlorambucil)，或苯達莫司汀(Bendamustine)之癌症治療處方。美法崙(melphalan)係用於治療多發性骨髓癌，並可口服投藥。苯丁酸氯芥(chlorambucil)可用於治療慢性淋巴性白血病與原發性巨球蛋白血症。苯達莫司汀，由Salmedix Inc.發展，可用於治療惡性血液病，如，非－Hodgkin’s淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病，與多發性骨髓癌。
在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，藉由投以本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥與一至少使用烷化劑白消安(busulfan)之癌症治療處方。白消安(busulfan)係用於治療慢性顆粒細胞白血病與慢性粒骨髓性白血病。高劑量之白消安(busulfan)可用於與環磷醯胺結合治療罹患急性骨髓性白血病，在骨髓移植之前。
在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，藉由投以本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥與一至少使用硝基尿素烷化劑之癌症治療處方。在另一實施例中，該硝基尿素烷化劑為亞硝脲氮芥(Carmustine)。亞硝脲氮芥可用於治療Hodgkin’s症、淋巴瘤、骨髓瘤、惡性星狀細胞瘤、轉移性腦瘤、黑色素細胞瘤與胃腸腫瘤。在另一實施例中，該硝基尿素為鏈脲菌素(Streptozocin)，其可用於治療胰島細胞癌。
在另一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，藉由投以本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥與一至少使用三氮烯烷化劑之癌症治療處方，該三氮烯烷化劑為氮烯唑胺(Dacarbazine)。氮烯唑胺係用於治療惡性黑色素細胞瘤、Hodgkin’s症與成人癌。在另一實施例中，該三氮烯烷化劑為替莫唑胺(temozolomide)。替莫唑胺(temozolomide)可用於治療惡性膠質瘤。
在一實施例中，本發明係提供一種治療癌症之方法，藉由投以本發明之氨基磷酸化物烷化劑前藥與一至少使用烷化劑鉑配位錯合物之癌症治療處方。在一實施例中，該鉑配位錯合物烷化劑為順鉑。順鉑可用於治療膀胱癌、頭頸癌、子宮內膜癌、小細胞肺癌，以及某些孩童之新生瘤。順鉑，單獨或與環磷醯胺結合，可用於治療末期卵巢癌。順鉑與博來黴素、依托鉑苷(etoposide)與長春鹼之組合化療係用於治療晚期睪丸癌；與紫杉醇、環磷醯胺或多柔比星(doxorubicin)之一組合係用於治療卵巢癌。
可用於此述方法之氨茴環黴素(Anthracyclines)，包括，但不侷限於多柔比星(Adriamycin、Doxil、Rubex)、米托蒽醌(Novantrone)、伊達比星(Idamycin)、戊柔比星(Valstar)，以及表柔比星(Ellence)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與氨茴環黴素共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為急性非淋巴性白血病、Kaposi’s瘤、前列腺癌、膀胱癌、轉移性卵巢癌，以及乳癌。
化合物(8S,10S)－10－[(3－胺基－2,3,6－三去氧基－α－L－基氧基－己吡喃糖基)氧基]－8－羥基乙醯基－7,8,9,10－四氫－6,8,11－三羥基－1－甲氧基－5,12－萘二酮，更常用之名稱為多柔比星(doxorubicin)，為細胞毒素氨茴環黴素抗生素，分離自Streptomyces peucetius var.caesius 培養液。多柔比星(doxorubicin)已成功用於使散播型新生瘤病症，如急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓母細胞白血病、Wilm’s腫瘤、神經母細胞瘤、軟組織與骨瘤、乳癌、卵巢癌、移行細胞膀胱癌、甲狀腺癌、Hodgkin與非Hodgkin型淋巴瘤、支氣管瘤，以及胃瘤。多柔比星(doxorubicin)一般之投藥劑量範圍為30－75 mg/m2 ，為單一靜脈注射，21－日間隔投藥；每周靜脈投藥劑量為20 mg/m2 ；或每3天投藥劑量為30 mg/m2 ，每4周重複一次。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係於多柔比星(doxorubicin)投藥前或後共投藥，於此劑量(或更低劑量)。可用於實施此述方法之環氨茴環黴素細胞毒素前藥，係提供於參考文獻Matteuciet al., PCT申請案號US05/008161中。
可用於實施此述方法之抗生素包括，但不侷限於，更生黴素、放線菌素D(Cosmegen)、平陽黴素(Blenoxane)、柔紅黴素與daunomycin(Cerubidine,Danuoxome)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與抗生素共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症係選自於由急性淋巴性白血病、其他白血病與Kaposi’s瘤組成之族群。
可用於實施此述方法之芳香酶抑制劑包括，但不侷限於，阿那曲唑(Arimidex)與letroazole(Femara)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與一芳香酶抑制劑共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為乳癌。
可用於實施此述方法之雙磷酸鹽抑制劑包括，但不侷限於，唑來磷酸鹽(Zometa)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與雙磷酸鹽抑制劑共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症係選自於由多發性骨髓癌、固體腫瘤之骨轉移或前列腺癌組成之族群。
可用於實施此述方法之環氧酶抑制劑包括，但不侷限於，希樂葆(Celebrex)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與環氧酶抑制劑共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為大腸癌或癌症前病症，已知為家族性大腸息肉症。
可用於實施此述方法之雌激素受調節劑抑制劑包括，但不侷限於，三苯氧胺(Nolvadex)與氟維司群(Faslodex)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與雌激素受調節劑共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為乳癌，或該治療係投予以預防乳癌之發生或復發。
可用於實施此述方法之葉酸拮抗劑包括，但不侷限於，甲氨喋呤(methotrexate)與tremetrexate。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與葉酸拮抗劑共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為骨瘤。
作為一範例，化合物N－[4－[[(2,4－二胺基－6－蝶啶基)甲基甲基胺基]苯甲醯基]－L－穀氨酸，一般稱之為甲氨喋呤，為抗葉酸藥物，已用於治療滋養層細胞腫瘤，並用於患有絨毛膜腺瘤與水泡樣胎塊之病患。亦可使用於治療晚期之惡性淋巴瘤，並治療晚期之蕈狀肉芽腫。甲氨喋呤係如下投藥。就絨毛膜腺瘤而言，肌內注射劑量為15至30 mg，每日投藥，持續五日療程，此種療程可依需要重複，可置入一或數週休止期間於療程中。就白血病而言，二周肌內注射之劑量為30 mg/m2 。就蕈狀肉芽腫而言，每週肌內注射劑量為50 mg，或25 mg每週二次。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥可與甲氨喋呤共投藥，於此劑量(或更低劑量)。5－甲基－6－[[(3,4,5－三甲氧基苯基)－胺基]甲基]－2,4－喹唑啉二胺(一般稱之為trimetrexate)為另一可與氨基磷酸化物烷化劑前藥共投藥之抗葉酸藥物。
可用於實施此述方法之無機砷酸鹽包括，但不侷限於，三氧化砷(Trisenox)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與無機砷酸鹽共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為急性早幼粒細胞白血病(APL)。
可用於實施此述方法之微管抑制劑(使用於此，“微管抑制劑”為任一可干擾微管組裝或卸裝之試劑)包括，但不侷限於，長春新鹼(Oncovin)、長春鹼(Velban)、紫杉醇(Taxol,Paxene)、長春瑞濱(Navelbine)、多西紫杉醇(Taxotere)、埃坡黴素B或D或其衍生物，以及discodermolide或其衍生物。微管素結合抗癌藥物與其前藥，可用於實施本發明方法，係提供於參考文獻Matteucciet al., PCT專利申請案號PCT/US2005/042095；US專利申請案，標題為“Tubulin Binding Anti Cancer Agents and Prodrug Thereof”(Attorney Ref Nos.021305－008500US,021305－008400US與021305－004520US)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與微管抑制劑共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為卵巢癌、乳癌、非小細胞肺癌、Kaposi’s瘤、乳房或卵巢源之轉移癌。作為一範例，化合物22－氧－長春花鹼，亦稱之為長春新鹼(vincristine)，為得自一般長春花植物Vinca rosea,Linn.)之生物鹼(且可用於治療急性白血病。亦已知可用於與其他治療Hodgkin’s症、淋巴瘤、網狀細胞瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤與Wilm’s腫瘤之腫瘤試劑結合。長春新鹼(vincristine)可每週靜脈投藥，劑量為孩童2 mg/m2 ，成人1.4 mg/m2 。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與長春新鹼(vincristine)共投藥以治療癌症，於此劑量。在一觀點中，該氨基磷酸化物烷化劑前藥並非於投以微管抑制劑如紫杉烷(taxane)前投藥，而是該氨基磷酸化物烷化劑前藥與微管抑制劑治療初始期同時或或數天或數週後投藥。
可用於實施此述方法之修飾劑包括，但不侷限於，Leucovorin(Wellcovorin)，其可用於與其他藥物如5－氟嘧啶二酮結合以治療大腸直腸癌。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與修飾劑共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為大腸癌。在一觀點中，該修飾劑為一化合物，其可增加細胞吸收葡萄糖之能力，包括，但不侷限於，化合物N－羥基尿素。N－羥基尿素已被報導可增進細胞吸收2－去氧基葡萄糖之能力(請見參考文獻Smithet al., 1999,Cancer Letters141： 85,incorporated herein by reference)，且於報導可增進2－去氧基葡萄糖吸收，或可與2－去氧基葡萄糖與氨基磷酸化物烷化劑前藥共投藥治療白血病之N－羥基尿素投藥劑量，為此提供治療方法之一觀點。在另一觀點中，氨基磷酸化物烷化劑前藥可與氧化氮或氧化氮前驅物共投藥，如無機硝酸鹽或spermineNONOate，以治療癌症，如後者化合物可治療葡萄糖之吸收。
可用於實施此述方法之硝基尿素包括，但不侷限於，丙卡巴肼(Matulane)、環己亞硝脲、CCNU(CeeBU)、亞硝脲氮芥(BCNU、BiCNU、Gliadel Wafer)與雌氮芥(Emcyt)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與硝基尿素共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為前列腺癌或膠狀母細胞瘤，包括復發性多型膠狀母細胞瘤。
可用於實施此述方法之核苷酸類似物包括，但不侷限於，巰基嘌呤、6－MP(Purinethol)、氟嘧啶二酮、5－FU(Adrucil)、胍、6－TG(硫基胍)、羥基尿素(Hydrea)、阿糖胞苷(Cytosar－U、DepoCyt)、脲嘧啶(FUDR)、氟達拉濱(Fludara)、氮雜胞嘧啶核苷(Vidaza)、噴司他丁(Nipent)、adribine(Leustatin、2－CdA)、吉西他汀(Gemzar)，以及截瘤達(Xeloda)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與核苷酸類似物共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為B－細胞淋巴性白血病(CLL)、毛細胞白血病、胰腺癌、轉移性乳癌、轉移性乳癌、非小細胞肺癌，或轉移性直腸大腸癌。作為一範例，化合物5－氟－2,4(1H,3H)－嘧啶二酮，一般稱之為氟嘧啶二酮，為一抗代謝核苷酸類似物，可有效減輕大腸癌、直腸癌、乳癌、胃癌與胰臟癌之惡化程度，患者被認為無法以手術或其他方法治癒者。5－氟嘧啶二酮係於治療初期投藥，劑量為12 mg/m2 ，每日靜脈內投藥一次，連續4日，每日劑量不超過800 mg。若無毒性於任一時間觀察到，6 mg/kg係於第6、8、10、與12日投藥。在第5、7、9或11日不給予治療。在治癒率低或未處於適當營養狀態之病患身上，每日劑量6 mg/kg係投藥3日。，每日劑量不超過400 mg。若無毒性於任一時間觀察到，可於第5、7、9日投予3 mg/kg。在第4、6或8日不給予治療。注射順序或時程組成療程。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與5－FU於此劑量共投藥，或與Xeloda前藥形式，具相對應之可調整劑量共投藥，以治療癌症。另一範例中，化合物2－胺基－1,7－二氫－嘌呤－6－硫，亦稱之為6－硫基胍，為核苷酸類似物，可有效治療急性非淋巴性白血病。6－硫基胍可口服投藥，劑量為約2 mg/kg體重每日。每日總劑量為可一次給予。若投藥一週後無改善，該劑量可謹慎地提高至3 mg/kg/日。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與6－TG於此劑量(或更低劑量)共投藥。
可用於實施此述方法之蝕骨細胞抑制劑包括，但不侷限於，帕米膦酸鹽(Aredia)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與蝕骨細胞抑制劑共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為溶解性骨轉移乳癌，且一或多種抗癌試劑亦可與氨基磷酸化物烷化劑前藥共投藥。
可用於實施此述方法之鉑化合物包括，但不侷限於，順鉑(Platinol)與卡鉑(Paraplatin)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與鉑化合物共投藥以治療癌症。該癌症為轉移性睪丸癌、轉移性卵巢癌、卵巢癌，以及移行性細胞膀胱癌。作為一範例，化合物順－二胺二氯鉑(II)，亦稱之為順鉑，可用於減輕轉移性睪丸與卵巢腫瘤，用於治療移行性細胞膀胱癌，其無法以手術或放射線治療治癒。順鉑，當用於膀胱癌晚期時，係以靜脈注射投藥，劑量為50－70 mg/m2 ，每日一次，三至四周。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與順鉑於此劑量(或更低劑量)共投藥以治療癌症。一或更多額外之抗癌試劑可與鉑化合物與氨基磷酸化物烷化劑前藥共投藥。作為一範例，Platinol、博來黴素與Velbam可與氨基磷酸化物烷化劑前藥共投藥。作為另一範例，Platinol與阿黴素可與氨基磷酸化物烷化劑前藥共投藥。
可用於實施此述方法之類黃酮包括，但不侷限於，tretinoin、ATRA(Vesanoid)、9－順式視黃酸(Panretin)與bexarotene(Targretin)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與類黃酮共投藥以治療癌症。該癌症為選自於由APL、Kaposi’s瘤與T－細胞淋巴瘤。
可用於實施此述方法之拓墣異構酶1抑制劑包括，但不侷限於，托鉑替康(Hycamtin)與萊諾迪肯(Camptostar)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與拓墣異構酶1共投藥以治療癌症。可用於實施本發明方法之拓墣異構酶抑制劑與其前藥，係提供於參考文獻Matteucci et al.,PCT專利申請案號PCT/US2005/041959。在一觀點中，該癌症為轉移性卵巢癌、大腸或直腸癌，或小細胞肺癌。然而，如上所述，在此述方法之一觀點中，氨基磷酸化物烷化劑前藥之投藥可於拓墣異構酶1投藥前或後投藥，但不同時投藥。
可用於實施此述方法之拓墣異構酶2抑制劑包括，但不侷限於，依托鉑苷(etoposide)、VP－16(Vepesid)、替尼鉑苷、VM－26(Vumon)，以及依托鉑苷磷酸鹽(Etopophos)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與拓墣異構酶2共投藥以治療癌症。在一觀點中，該癌症為選自於由復發性睪丸瘤、復發性急性淋巴性白血病(ALL)，以及小細胞肺癌。然而，如上所述，在此述方法之一觀點中，氨基磷酸化物烷化劑前藥之投藥可於拓墣異構酶2投藥前或後投藥，但不同時投藥。
可用於實施此述方法之酪胺酸激酶抑制劑包括，但不侷限於，伊馬替尼(Gleevec)。依據此述之方法，氨基磷酸化物烷化劑前藥係與酪胺酸激酶抑制劑以治療癌症。在一觀點中，該癌症為CML或轉移性或無法切除惡性胃腸基底瘤。
可用於實施此述方法之氯尼達明(Lonidamine)類似物係提供於Matteucci et al.U.S.Pat.Appl.Nos.11/346632；60/764,427；60/764,438；and applications itled“Heterocyclic Lonidamine analogues”(Attorney Docket No.021305－007220US；021305－007900US)，以及PCT公開號WO 2006/015191,WO 2006/015263與WO 2006/01007 A2。
因此，於此所述之治療癌症之方法，其中氨基磷酸化物烷化劑前藥或其醫藥上可接受鹽類與一或更多額外之抗癌試劑，係投予病患。此種其他抗癌試劑之特定觀點包括，但不侷限於，5－甲基－6－[[(3,4,5－三甲氧基苯基)胺基]－甲基]－2,4－喹唑啉二胺或其醫藥上可接受之鹽類、(8S,10S)－10－(3－胺基－2,3,6－三去氧基－α－L－基氧基－己吡喃糖基)氧基]－8－羥基乙醯基－7,8,9,10－四氫－6,8,11－羥基－1－甲氧基－5,12－萘二酮或其醫藥上可接受之鹽類；5－氟－2,4(1H,3H)－嘧啶二酮或其醫藥上可接受之鹽類；2－胺基－二氫－6H－嘌呤－6－硫或其醫藥上可接受之鹽類；22－氧－長春花鹼或其醫藥上可接受之鹽類；2－雙[(2－氯乙基)胺基]四氫－2H－1,3,2－噁吖膦、2－氧化物或其醫藥上可接受之鹽類；N－[4－[[(2,4－二胺基－6－蝶啶)甲基]－甲基胺基]苯甲醯基]－L－穀胺酸或其醫藥上可接受之鹽類；或順二胺二氯－鉑(II)。
IV.範例
在下列範例中，任一化合物所標明之字母係與相對應之反應流程緊鄰處或上方所標示之字母相參照。
合成
合成本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥之方法係提供於節IIb。使用於合成本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥之起始材料係購自，當可獲得時，工業製造商，如Simga－Aldrich Co。1－N－甲基－硝基咪唑－5－甲醇係購自Syngene，India。非商業上可購得之起使材料可經由標準文獻流程合成。此種流程可由文獻搜尋工具定義，如SciFinder，得自American Chemical Society，或Beilstein，得自MDL Software。
以濕度敏感性化合物反應，如POCl3 與PCl3 ，與其單或二氯衍生物，係使用無水溶劑，在氮氣或氬氣下進行。由反應混合物中單離出產物係使用work－up進行，於需要處，之後真空蒸餾、滅菌、管柱層析，或製備級厚層層析。化合物管柱層析之適當沖提液可由本份揭示決定，及/或藉由薄層層析法決定化合物之Rf ，並選擇可將希望之產物與不希望產物分開之溶劑。特定沖提液之選擇取決於，在數種因素中，化合物之極性特質、是否有其他接近衝提出之化合物存在、所使用之靜相類型，如矽膠或氧化鋁，以及用於沖提通過靜相之溶劑之壓力值。實際上，溶劑之不同組成物可用於分離相同之化合物。
分離出之化合物係以標準分析技術分析其純度，如TLC、NMR光譜與LC－MS，並儲存於冷凍庫或冰箱，預防溼氣、光線或空氣。氨基磷酸化物烷化劑前藥化合物之儲存溶液係製備於DMSO，並儲存於冷凍庫。
範例1 化合物23之合成
在5－硝基喃甲醇(200 mg,1.4 mmol)之THF(10 ml)溶液中，於－78℃，逐次加入POCl3 ，之後滴加入三乙基胺(TEA,0.22 ml,1.54 mmol)。溫度予1小時內增加至－30℃，之後加入2－氯乙胺氯化氫，之後為TEA(1 ml,7 mmol)。當溫度升至室溫(rt)後，反應持續1小時，反應混合物以水終止，有機層分離出。水層以DCM萃取，並將結合之有機溶液乾燥並濃縮。化合物23 以快速管柱層析法分離出，並以LC/MS與NMR光譜分析，確認純度。
範例2 化合物5之合成
N－甲基－2－氯乙基氯化銨(10 mg)之POCl3 (40 ml)懸浮液係回流加熱(135℃)至隔日。真空移除過量之POCl3 後，產物5i於真空下蒸餾出，為淡黃色，經 1 H 與3 1 P NMR光譜分析確認純度。
5i (1 mg,4.75 mmol)與N－甲基－2－氯乙基氯化銨(0.62 mg，4.75 mmol)之THF溶液於－78℃緩慢加入二異丙基乙胺(DIEA,1.65 ml,9.5 mmol)，反應混合物回溫至室溫。於室溫下攪拌1小時後，反應混合物以乙酸乙酯稀釋，並以濃鹽水清洗。有機層以MgSO4乾燥並濃縮，得殘餘物，以快速管柱層析法分離出，得化合物5ii ，為油狀物。
N－甲基2－硝基咪唑－5－甲醇(0.5 g,3.2 mmol)之二甲氧基乙烷(DME)溶液中，雙(三甲基矽烷基)醯胺鋰(3.2 mmol,3.2 ml,1 M於THF中)，係於－78℃加入。5分鐘後，係加入5ii (2.9 mmol,770 mg)，反應混合物回溫至－20℃，以乙酸乙酯稀釋，並以濃鹽水清洗。有機層以MgSO4乾燥並濃縮。以溶於DCM中之6－12%甲醇進行快速層析，得5 。
化合物8與16係使用製備化合物5之流程合成。
範例3 化合物35之合成
於乙醇胺(6.03 mL,100 mmol)與K2 CO3 (13.8 g,100 mmol)之DMF(38 mL)溶液中加入對甲苯磺醯氯(19 g,100 mmol)係於室溫滴加入，反應混合物加熱至120℃(水浴溫度)。K2 CO3 (27.6 g.200 mmol)係加入反應混合物中，之後滴加入1,3－二溴丙烷(10 g,50 mmol)。加熱2小時後，反應冷卻至室溫，倒入水中(250 mL)，並以乙酸乙酯萃取。有機層加入Na2 SO4 並濃縮產生化合物35a，為黃色油狀物，其於下一反應中使用。
化合物35a(5 g)之HBr(48%,50 ml)水溶液係蒸餾移除水部份(約20 ml)，反應混合物回流40 h。額外之水部份(5 ml)係蒸餾移除，反應混合物回流(4 h)。反應混合物冷卻至室溫，以水(20 mL)稀釋，並以celite pad過濾。濾液濃縮至乾燥，殘餘物與乙醇共蒸發三次，之後加入大體積之丙酮，過濾出白色固體產物35b，並以丙酮清洗二次，使用於下面提供之磷酸化過程。
化合物35b(1 g)之POCl3 (14 mL)懸浮液係於130℃加熱約14小時，過量之POCl3 於130℃(水浴溫度)真空移除。殘餘物以矽膠管柱層析純化，使用10－80% ETOAc/己烷，得產物35c ，其轉換為本發明化合物35 ，使用如範例2所提供之相同流程，使用矽膠管柱層析，10－80%丙酮/甲苯作為沖提液。
範例4 化合物7之合成
化合物7係使用下述提供之N－環丙基－2－氯乙基氯化銨製備
在環丙基胺(25g)之無水THF(30 ml)溶液中，2－溴化乙烷(17.6g,0.141 mol)之30 ml THF溶液係於35分鐘內滴加入。反應混合物於室溫下攪拌1小時，並於50℃加熱75分鐘。冷卻後，反應混合物濃縮，得橘色油狀物，其中加入氫氧化鈉(7g)之水溶液(50 ml)。反應混合物攪拌10分鐘，並以乙酸乙酯(75 ml)萃取四次。結合之有機層係經乾燥(MgSO4 )並蒸發，得有機油狀殘餘物。殘餘物於53－56℃真空蒸餾(1 mm Hg)，得中間產物醇類(5.94g,42%產率)，為澄清、無色液體，其經LC/MS與1 H NMR分析確認純度。
在中間產物醇類(3.7 g,36.6 mmol)之無水THF(30 ml)溶液中，加入HCl之二噁烷溶液(4.0M,18.3 ml,73.2 mmol)。反應混合物冷卻至0℃，SOCl2 (6.50g,54.9 mmol)以針筒加入。反應混合物係回流(6 h)、冷卻並濃縮得殘餘物。殘餘物以無水醚類(100 ml)研磨、過慮，殘餘物真空移除，得7i(5.42g,95%產率)，其可經1 H NMR確認純度。
7i(3.00 g,19.2 mmol)係加入POCl3 (15 ml)，並於氮氣下回流7.5小時。反應混合物濃縮，所得之油狀物真空蒸餾，通過短路徑蒸餾裝置，得7ii為澄清、淡黃色油狀物(3.6g,79%產率)，其經1 H NMR分析確認純度。
7ii(0.50 g,2.11 mmol)與N－環丙基－2－氯乙基胺氯化氫(0.33 g,2.11 mmol)係於無水THF中，在氬氣環境下結合。反應混合物冷卻至－78℃，並以針筒緩慢加入DIEA(0.545 g,4.22 mmol)，緩慢回溫至室溫，攪拌1.5小時，並濃縮，得橘色油狀殘餘物。殘餘物以矽膠快速層析法分離，使用0－50%己烷於乙酸乙酯中，得315 mg(47%理論產率)之淡黃色油狀物，以MS分析7ii。
N－甲基－2－硝基咪唑－5－甲醇(76.8 mg,0.489 mmol)部份溶於無水THF(2 ml)中，於氬氣環境下。反應混合物冷卻至－78℃，係加入雙(三甲基矽烷基)醯胺鋰之THF(1.6M,0.306 ml,0.489 mmol)溶液。15分鐘後，係加入7iii(172 mg,0.538 mmol)之2 ml THF溶液。15分鐘後，反應混合物緩慢回溫至室溫，攪拌2小時，倒入25 ml水中，並以乙酸乙酯(30 ml)萃取3次。結合之有機層以MgSO4 乾燥並濃縮，得黃色油狀殘餘物。殘餘物以快速層析法分離，使用0－10%甲醇於DCM中，得化合物7(110 mg，51%產率)，為黃色油狀物，其以LC－MS與1 H NMR確認純度。
範例5 化合物6與15之合成
在雙(2－氯乙基)氯化銨(1.43 g,8.01 mmol)之氯化甲烷(DCM)溶液中，三氯磷酸(0.32 ml,3.64 mmol)係於室溫下加入，之後加入TEA(3.05 ml,21.84 mmol)。反應混合物於室溫下攪拌30分鐘，之後加入N－甲基－2－硝基咪唑甲醇(0.474 g,3.31 mmol)之DME溶液。攪拌0.5小時後，反應混合物冷卻至－20℃，係加入第三 －丁基過氧化氫(0.7 ml,3.82 mmol,5.5 M於癸烷中)。反應混合物回溫至室溫，歷時1小時，並倒入10% HCl水溶液中。有機層分離出，水層以DCM萃取。結合之有機溶液以MgSO4 乾燥並濃縮，得殘餘物，其經快速層析法純化，使用6－12%甲醇於DCM中，得6 。
化合物15係使用如同上述化合物6 所述之方法合成。
範例6 化合物23、26與36之合成
在N－甲基－2－硝基咪唑－5－甲醇(180 mg,1.14 mmol)、苯基膦(300 mg,1.14mmol)，以及異磷醯胺芥(1c,127 mg,0.57 mmol)之THF(10 ml)溶液中，二異丙基偶氮羧酸酯(DIAD,0.22 ml,1.14 mmol)係於室溫下滴加入。2小時後，反應混合物濃縮，殘餘物以快速層析法分離，使用30－100%丙酮於甲苯中，得化合物36。
化合物23與26係使用前述化範例6之流程合成。
範例7 化合物1之合成
N－甲基－2－硝基咪唑－5－甲醇(50 mg,0.318 mmol)係於氮氣環境下溶於無水THF(2 ml)中。溶液冷卻至－78℃，雙(三甲基矽烷基)醯胺鋰溶液(1M於甲苯中,0.35 ml,0.35 mmol)係以針筒加入。5分鐘後，雙(氯乙基)磷醯胺二氯化物(91 mg,0.35 mmol)之THF(2 ml)溶液係加入。於78℃攪拌30分鐘後，溫度降至－20℃，使用NaCl/冰浴，無水氨氣灌入反應混合物產生氣泡5分鐘。反應混合物以氮氣清洗，回溫至室溫，倒入25 ml水中，並以乙酸乙酯(4 x 25 ml)萃取。結合之有機層係乾燥(MgSO4 )並濃縮，得淡黃色油狀物，以矽膠快速層析法分離，使用0－10%甲醇於二氯甲烷中，得油狀化合物 1(32 mg,28%產率)，其可靜置固化，並以LC/MS與1 H NMR確認純度。
範例8 化合物25、26之合成
在2－溴化乙基溴化銨(19.4 g)之DCM(90 mL)於－10℃加入POCl3 (2.3 mL)之DCM(4 mL)溶液，之後加入TEA(14.1 mL)之DCM(25 mL)溶液。反應混合物係經過濾，濾液濃縮至原體積之ca.30%並過濾。殘餘物以DCM(3 x 25 mL)清洗，結合之DCM部份係濃縮，得一固體，加入THF(6 mL)與水(8 mL)之混合物中。THF係以迴旋濃縮儀移除，所得之溶液於冰箱中冷卻至隔日。所得之沉澱物經過濾，以水(10 mL)與醚(30 mL)清洗，並真空乾燥，得2.1 g之：
異磷醯胺芥
可使用範例8提供之方法合成，以2－氯乙基氯化銨取代2－溴化乙基溴化銨。異磷醯胺芥之合成已描述(請見如Wiessleret al.,supra )。
氨基磷酸化物烷化劑毒素： 係轉換為化合物24與25，使用範例6提供之方法，與適當之Trigger－OH。
範例9 化合物37－105之合成
下列化合物37－105係使用描述於上述化合物25或36使用之Mitsunobu型耦合法合成，以Trigger－OH適當之取代與所使用之異環磷醯胺芥類似物為基礎。例如，就化合物40、81、83、87、89、95、96、100與104之合成而言，所使用之異環磷醯胺芥為HOP(＝O)(NHCH2 CH2 Cl)2 ；在化合物50、53、55、56、58－65、68－71、73－75、77－80、82、、84－86、88、90－92、94、97－99、101－103與105，所使用之異環磷醯胺芥類似物為HOP(＝O)(NHCH2 CH2 Br)2 ；在化合物37、39、52、54與93中，所使用之異環磷醯胺芥類似物為HOP(＝O)(NHCHMeCH2 Cl)2 之R鏡相物；在化合物38、41、51與57中，所使用之異環磷醯胺芥類似物為HOP(＝O)(NHCHMeCH2 Cl)2 之S鏡相物；在化合物43－45與49中，所使用之異環磷醯胺芥類似物為HOP(＝O)(NHCH(CHMe2 )CH2 Cl)2 之R鏡相物；以及在化合物46－48中，所使用之異環磷醯胺芥類似物為HOP(＝O)(NHCH(CHMe2 )CH2 Cl)2 之S鏡相物。
各種用於合成化合物37－105之Trigger－OH化合物，包括下列Trigger－OH化合物：1－N－甲基－2－硝基咪唑－5－甲醇、1－N－甲基－5－硝基咪唑－2－甲醇、5－硝基呋喃－2－甲醇、5－硝基噻吩－2－甲醇；
下列化合物係依據上述範例6所述之方法合成。
範例10－26描述使用於合成本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥之各種Trigger－OH化合物。
範例10 化合物52i之合成
化合物52ii(100 mg,0.48 mmol)、52iii(73 mg,0.48 mmol)與KOAc(190 mg,1.92 mmol)之DMF(5 ml)溶液係除氣三次，並於室溫加入PdCl2 (dppf)(36 mg,0.048 mmol)，在氬氣環境下。反應混合物於60℃加熱2小時，以乙酸乙酯(EA)稀釋，並以濃鹽水清洗。有機層經乾燥、濃縮，殘餘物以矽膠管柱層析分離，使用沖提液EA/Hex(0－80%)，得52i。
化合物55i、63i、59i、65i與68i係以下列類似方法製備：
範例11
化合物68ii(100 mg,0.31 mmol)與3－胺基－1－丙醇(0.047 ml,0.62 mmol)之THF(2.5 ml)溶液中，係於室溫加入DIEA(0.162 ml,0.93 mmol)。反應混合物攪拌至隔日並濃縮，得殘餘物，其可以矽膠管柱層析分離，使用沖提液EA/Hex(0－80%)，得化合物68i。
化合物69i係以下列流程所示之類似方式製造。
範例12
化合物70ii(100 mg,0.87 mmol)與化合物70iii(112 mg,0.87 mmol)之丙酮(8 ml)溶液中，係於室溫加入K2 CO3 (78.6 mg,0.87 mmol)。反應混合物加熱至60℃，並攪伴1小時，經過濾並濃縮，得殘餘物，經矽膠管柱層析分離，使用(EA\Hex)0－60%，得化合物70i。
化合物51i係以類似下流程之方式製備。
範例13
(HAP triggers－check#s)
化合物59ii(200 mg,0.96 mmol)與59iii(127 mg,0.96 mmol)之DMF(3 ml)溶液係除氣三次，並加入PdCl2 (dppf)(50 mg,0.07 mmol)，之後於室溫加入CuI(8.5 mg,0.043 mmol)與TEA(0.27 ml,1.92 mmol)，在氬氣環境下，反應混合物於60℃加熱2小時。反應混合物係以EA稀釋，以濃鹽水清洗，有機層分離出、乾燥並濃縮，得殘餘物，續以矽膠管柱層析分離，沖提液為EA\Hex(0－70%)，得化合物58i。
範例14
67i(472 mg,2.69 mmol)之DCM(20 ml)懸浮液中係於－20℃加入苯基二氯磷酸鹽(0.2 m1,1.34 mmol)，之後滴加入TEA(0.75 ml,5.38 mmol)並攪拌。反應混合物回溫至室溫，於室溫攪拌1小時，倒入濃食鹽水中，有機層分離出，水層以DCM萃取。合併之有機層係以MgSO4乾燥並濃縮。殘餘物以矽膠管柱層析分離，使用沖提液EA/己烷(10－100%)，得化合物67ii。在化合物67ii(42 mg)之EtOH(5 ml)溶液中加入氧化鉑(IV)(20 mg)，反應混合物除氣，並於氫氣下劇烈攪拌0.5小時。反應混合物以MeOH稀釋、經針筒過濾器過濾，濾液真空濃縮，並與甲苯共蒸發，得化合物67iii。化合物67iii係與1－N－甲基2－硝基咪唑－5－甲醇反應，使用Mitsunobu型反應，如化合物36合成所述之反應。
範例15 化合物106與107
5－硝基呋喃甲醇(200 mg,1.4 mmol)之THF(10 ml)溶液係於－78℃加入POCl3 (0.13 ml,1.4 mmol)，之後滴加入TEA(0.216 ml,1.54 mmol)。反應溫度於1時內0℃，加入2－(苯基磺基)乙胺氯化氫(832 mg,3.5 mmol)，之後加入TEA(1 ml,7 mmol)。反應回溫至室溫，攪拌1 h，以水終止，有機層分離出。水層以DCM萃取二次，合併之有機層係經乾燥，得殘餘物，以矽膠管物層析分離，沖提液為丙酮\甲苯(30至100%)，得產物106。化合物107： 係使用類似方法合成。
化合物108－112，如下所示：
係使用如範例3化合物35之合成流程合成，並將範例3中之取代為。
範例16 化合物113－117之合成
化合物113係使用範例7之流程合成。113ii(181 mg,1.16 mmol)之THF(8 mL)溶液係於－78℃滴加入LiN(TMS)2 (1.2 mL,1 M THF溶液,1.2 mmol)，之後加入1i。反應混合物回溫至－20℃，通入NH3 於反應混合物中產生氣泡5分鐘。水(20 mL)加入反應混合物中，反應混合物以EA(30mL)萃取三次。合併之有機層係乾燥並濃縮，得殘餘物，其經矽膠管柱層析分離，使用丙酮\甲苯(30－100%)，得化合物113。
化合物114－117係依據化合物13之方法合成，並將以適當Trigger－OH取代作為起始材料。
範例17 八氘化異環磷醯胺與化合物64(八氘化－化合物25)之合成
48% HBr(60 mL)係於0℃滴加入d4 －乙醇胺。反應混合物係於室溫攪拌1小時，溫和回流並緩慢蒸餾，16 mL之液體係於2小時內收集，直至155℃(油浴)。此以60 mL之48% HBr置換二次，蒸餾持續額外之5 hr。90 mL液體係經收集。所得溶液係於165℃加熱2小時，並真空蒸發。殘餘物自絕對酒精(10 mL)－乙酸乙酯(30 mL)，至11.3gd 4 －2 －溴化乙胺溴化氫(化合物64i)中再結晶。化合物64i(19.5 mmol,1.0 eq.)係於－20℃滴加入d4 －2－溴化乙胺溴化氫(40.0 mmol,2.05 eq.)之無水DCM(100 mL)懸浮液，在氬氣環境下，之後於－20℃滴加入TEA(81.9 mmol,4.2 eq.)。反應混合物係於－20℃攪拌0.5 h，並於室溫下攪拌2小時，在加水之前，並以DCM(30 mL)萃取二次。合併之有機層係以濃鹽水清洗，以Na2 So4 乾燥，並減壓濃縮，得殘餘物，其經矽膠管柱層析分離，使用己烷/EA(100：70(v/v))，得7.0 g化合物64ii。PtO2 (0.7 g)加入化合物64ii(7.0 g)之MeoH(160 mL)溶液中，反應混合物除氣並與H2 交換三次，在室溫H2 下攪拌3小時，並以MeOH稀釋至反應混合物中之白色固體溶解。經稀釋之反應混合物係經過濾，濾液減壓濃縮，得殘餘物，以無水醚清洗二次，得2.9 g化合物64iii。化合物64iii(1.92 g 1.0 eq.)、1－N－甲基－2－硝基咪唑甲醇(1.01 g,1.1 eq.)與PPh3 (2.39 g,1.5 eq.)之THF(20 mL)懸浮液係於0℃加入DIAD(1.76 ml,1.5 eq.)，在氬氣環境下。反應混合物攪拌2小時，由0℃回溫至室溫，之後真空移除揮發物。殘餘物以矽膠快速層析法分離，使用沖提液丙酮/甲苯(100：70(v/v))，得1.35 g化合物64。
範例18 化合物2i之合成
乙烯基衍生物，2iii，係依據參考文獻Cavalleri et al,J.Het.Chem., 1972,9：979合成，並如下進行氧汞化。Hg(OAc)2 (208 mg,0.653 mmol)溶於水(0.7 mL)與THF(0.7 mL)中，之後加入化合物2iii(100 mg,0.653 mmol)。反應混合物於室溫攪拌1.5小時，逐次加入NaBH4 (25 mg)，攪拌15分鐘後反應倒入水中，以EA萃取，EA層乾燥並濃縮，得殘餘物，以矽膠快速層析法分離，使用沖提液EA/己烷(0－100%)，得化合物2i(16 mg)。
範例19 化合物94i之合成
94iii(7.1 g)之Ac2 O(9.7 mL)溶液係滴加入發煙硝酸溶液中(1.5 mL)，AcOH(12 mL)於0℃加入。反應混合物回溫至室溫，攪拌1小時，滴加入發煙硝酸(1 mL)，攪拌1.5 h。反應混合物倒入水中，以EA萃取，EA層乾燥並濃縮，得殘餘物，以矽膠管柱層析分離，使用沖提液EA/己烷(0－100%)，得化合物94ii。化合物94ii(600 mg,1.77 mmol)係於0℃懸浮於甲醇(10 mL)中，之後逐次加入NaBH4 (141 mg)至反應混合物中，歷時5分鐘。NaBH4 (100mg)每小時加入一次，重複三次，反應混合物攪拌3.5 h，倒入水中，以EA萃取，EA層乾燥並濃縮，得殘餘物，經矽膠管柱層析分離，使用沖提液EA/己烷(0－100%)，得化合物94i(289 mg)，為黃色固體。
範例20 化合物96i之合成
A(1.4 g)、CuCN(0.56g)與DMF(25 mL)之混合物係於140℃攪拌35分鐘，並置於300 mL碎冰上，攪拌10分鐘。反應混合物之後過濾，殘餘物經矽膠管柱層析分離，使用沖提液己烷：EA(1：0 to 2：3)，得化合物96iii，為黃色油狀物(617 mg)。化合物96iii係轉換為醇類96i，並以管柱層析分離，之後類似方式係使用於化合物94iii，並使用THF取代MeOH，作為反應溶劑。
範例21 化合物99i之合成
99ii(500 mg)、PdCl2 (PPh3 )2 (208 mg)與CuI(56.4 mg)之混合物係懸浮於TEA(15 mL)中，反應混合物係除氣並以Ar沖洗6次。丙炔通入反應混合物中產生氣泡15分鐘，反應於丙炔環境下，50℃浴中繼續2小時。反應混合物倒入EA中，經過濾，濾液濃縮產生殘餘物，其經矽膠管柱層析分離，使用沖提液EA/己烷(0－100%)，得化合物99i(286 mg)。
範例22 1－N－甲基－2－胺基咪唑－5－羧酸乙酯之合成
甲酸乙酯(500 mL)係加入肌胺酸甲酯氯化氫(82 g,585.7 mmol,在反應前研磨成粉末)，於1－L圓底瓶中。反應混合物以冰水浴冷卻、攪拌，一氣體出口係連接於瓶上，NaH(60%油狀懸浮液，54 g，1.35 mol)緩慢加入，期間為2h，並於室溫攪拌約14小時。揮發物使用迴旋濃縮儀移除，得殘餘物，其以己烷(500 mL)研磨三次，得黏稠淡棕色糊狀物，其溶於乙醇(400 mL)與濃HCl(50 mL)中，於110℃攪拌1.5 h。反應混合物冷卻後，白色沉澱物過濾，殘餘物以2 x 25 mL乙醇清洗。濾液蒸發，得深棕色油狀物，加入10%水性HOAc、H2 NCN(45 g,1.07 mol)，與醋酸鈉(88 g,1.07 mol)。反應混合物於90－100℃攪拌1.5小時，得澄清溶液，之後冷卻，其pH調整至1，使用濃HCl，所得溶液使用迴旋濃縮儀濃縮成1/5原始體積，溫度不大於45℃。濃縮之反應混合物仔細以加入CO3 中和至pH 8－9，並以EA萃取(5 x 200 mL，之後為3 x 50 mL)。合併之乙酸乙酯層係以MgSO4 乾燥、過濾，揮發物移除，得48 g之1－N－甲基－2－胺基咪唑－5－羧酸乙酯。
範例23 1－N－甲基－2－胺基咪唑－5－羧酸乙酯之合成
甲酸乙酯(850 mL)係加入肌胺酸甲酯HCl鹽(205 g,1.46 mmol,在使用前研磨成粉末)，碳酸鉀(205 g,1.48 mol)與EtOH(800 mL)，於室溫下攪拌至隔日並過濾。濾液以迴旋濃縮儀濃縮，期間殘餘物分離為二層。上層分離出，下層以EA清洗。合併之EA層與上層以MgSO4 乾燥、過濾並濃縮，得185 g(81%)之N－甲醯基肌胺酸甲酯，用於下列反應。NaH(60%油狀懸浮液，16.0 g,0.4 mol)於1小時間逐次加入N－甲醯基肌胺酸甲酯(50 g,0.34 mol)與甲酸乙酯(160 mL)之混合物中，以冰水浴冷卻。攪拌反應，溫度升至室溫，攪拌持續至隔日。反應混合物以己烷(100 mL每次)研磨二次，殘餘物溶於乙醇(100 mL)與濃HCl(60 mL)中，反應混合物於110℃攪拌。1小時後，反應混合物冷卻，過濾，殘餘物以乙醇清洗，濾液濃縮，得深棕色油狀物。該油狀物加入10%水性HOAc(200 mL)、NH2 CN(35 g)，與醋酸鈉(90 g)，並於95℃攪拌。1小時後，反應混合物使用迴旋濃縮儀濃縮成1/3原始體積，加入碳酸鈉中和至pH約9，並以EA萃取(8 x 100 mL)，合併之乙酸乙酯層係乾燥、過濾並濃縮，得殘餘物，經再結晶純化，得1－N－甲基－2－胺基咪唑－5－羧酸乙酯(胺基酯)。
範例24 1－N－甲基－2－硝基咪唑－5－羧酸乙酯之合成
胺基酯(36.94 g,0.218 mol)之200 ml醋酸溶液係滴加入硝酸鈉(100 g,1.449 mol)與水(300 ml)之溶液中，以冰水浴冷卻並攪拌。反應混合物之溫度，經測量為約5－10℃，升高至室溫，反應混合物攪拌至隔日。反應混合物以DCM(3 x 150 mL)萃取。合併之DCM層係乾燥並揮發，得淡紅色殘餘物，經矽膠管柱層析分離，使用沖提液EA/己烷(30%)，得1－N－甲基－2－硝基咪唑－5－羧酸乙酯(“硝基酯”)，為淡棕色固體(27 g,產率62%)。
描述於範例24之方法以及使用水性醋酸，為該方法之改進，使用約7%硫酸(v/v)由胺基酯形成二偶氮化離子。使用水性硫酸，反應體積變大，導致較難有效攪拌反應混合物。例如，涉及150 g胺基酯之反應，需要反應混合物體積約12 L。黏稠之硝基酯產物形成於水性硫酸中，並阻礙反應混合物之攪拌。
範例25 1－N－甲基－2－硝基咪唑－5－羧酸之合成
硝基酯(39.2 g,196.9 mmol)之1N NaOH(600 mL)與水(200 mL)之溶液，係於室溫下攪拌約20小時，得澄清之淡棕色溶液。反應混合物之pH值係調整至約1，藉由加入濃HCl，反應混合物以EA(5 x 150 mL)萃取。合併之乙酸乙酯層係以MgSO4 乾燥，並濃縮，得1－N－甲基－2－硝基咪唑－5－羧酸(“硝酸”)，為淡棕色固體(32.2 g,95%)。
範例26 1－N－甲基－2－硝基咪唑－5－羧酸之合成
硝酸(30.82 g,180.23 mmol)與三乙基胺(140 mL,2855 mmol)之無水THF(360 mL)溶液係攪拌，反應混合物於無水冰乙腈浴中冷卻(溫度<－20℃)。甲氯化酸異丁酯(37.8 mL,288 mmol)係滴加入此經冷卻之反應混合物，歷時10分鐘，並攪拌1小時，之後加入硼氫化鈉(36 g,947 mmol)，並滴加入水，歷時1小時，維持溫度於0℃或更低。反應混合物回溫至0℃。固體經過濾並以THF清洗。合併之THF部份係揮發，得1－N－甲基－2－硝基咪唑－5－甲醇，為橘色固體(25 g)，其再結晶自乙酸乙酯。
範例27 化合物119之合成
1－N－甲基－2－硝基咪唑－5－甲醇(50 mg,0.32 mmol)之DME懸浮液中，LiN(TMS)2 係於－78℃加入，並劇烈攪拌。10分鐘後，化合物119i(67 mg,0.32 mmol)係加入，反應混合物回溫至室溫。1小時後，反應混合物濃縮，殘餘物以矽膠管柱層析分離(0－100%丙酮\甲苯)，得化合物119。
範例28A－28V
化合物134至155係使用相對應經取代之磷酸醯胺酯與經羥基取代之Trigger(Trigger－OH)，依據上述範例1－27所述之流程。
範例29A
下列化合物之溶解度係如下表：
範例29B 抗增生分析
欲決定氨基磷酸化物烷化劑前藥對於細胞增生的影響，這些化合物的抗增生活性係以一多孔Alamar Blue分析法進行檢測。比較有無處理檢測化合物之細胞生長情形，並以螢光讀盤儀於激發光550 nm與散射光590 nm下測量(請見Biosource International Inc.,Tech Application Notes,Use of Alamar Blue in the measurement of Cell Viability and Toxicity, Determing IC5 0 )。下列細胞株以20,000細胞/孔/500 μL培養基進行檢測：NCI－H460細胞(ATCC HTB－177，RPMI培養基(Gibco Products,Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA))、HT29細胞(ATCC HTB－38，RPMI培養基(Gibco))、MES－SA細胞(ATCC CRL－1976，McCoy’s 5a培養基(ATCC))、MES－SA/Dx5細胞((ATCC CRL－1977)、McCoy’s 5a培養基(ATCC))、ACHN細胞(ATCCCRL－1611，最低需求培養基，Eagle(ATCC))、PC3細胞(ATCC CRL－1435，Ham’s F12K培養基(ATCC))。在化合物檢測前一天，將細胞種植於每孔放置玻璃插管(inserts)的24－孔培養盤內並以上述特定培養基培養。在24小時後，將這些培養盤分成兩組－缺氧症組與含氧組。處理組每孔加入欲檢測化合物(200 μL體積)，濃度範圍由100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03至0.01 μM。所有檢測化合物均嚴格稀釋於完整之培養基內，且最終DMSO濃度低於或等於每孔體積之1%。缺氧處理組細胞於Bactron II厭氧箱內培養2小時。含氧處理組細胞則於標準組織培養箱內培養2小時。處理檢測化合物2小時後，移去各孔之檢測化合物，細胞以500 μL培養基清洗，並以500 μL新鮮培養基培養3天。在3天後，細胞以10% Alamar Blue染色2小時，之後觀察細胞增生情況(如前所述)，並可計算檢測化合物的50%生長抑制濃度(GI5 0 (在此亦指IC5 0 ))如下表X所示。
範例30 抗增生分析－氧依賴性
欲決定氨基磷酸化物烷化劑前藥的氧依賴性，這些化合物的抗增生活性係以一多孔Alamar Blue分析法進行檢測，如前所述(請見範例29)。NCI－H460細胞(ATCC HTB－177，RPMI培養基(Gibco))或HT29(ATCC HTB－38，RPMI培養基(Gibco))在檢測前一天，以20,000細胞/孔/500 μL培養基種植於每孔放置玻璃插管的24－孔培養盤內。細胞於Bactron II厭氧箱內培養2小時，並以玻璃管流入不同濃度氧氣進行缺氧處理，如0.1%、0.3%、0.6%、1%、10%氧氣以及空氣。經計算之IC5 0 值(μM)如下表Y1(H460細胞)或表Y2(HT29細胞)所示。
範例31 選植生殖(Clonogenic)分析－氧依賴性
欲決定氨基磷酸化物烷化劑前藥的氧依賴性，進行選植生殖存活分析。化合物檢測前2天，將細胞種植於60 mm玻璃培養盤(每盤5 x 105 細胞，5 mL培養基)。以下列細胞株進行檢測：NCI－H460細胞(ATCC HTB－177，RPMI培養基(Gibco))、HT29細胞(ATCC HTB－38，RPMI培養基(Gibco))、PC3細胞(ATCC CRL－1435，Ham’s F12K培養基(ATCC))。檢測前，受測化合物溶液以完整培養基進行調配並直接加入細胞培養基(2 mL體積)。無氧(anoxia)或缺氧(hypoxia)(O2 低於200 ppm)之進行係將玻璃培養盤置於Bactron II厭氧箱或鋁製容器內(請見範例33)2小時。在厭氧箱方面，實驗前，介於200 ppm與空氣間之所需氧氣濃度，於校正後導入厭氧箱內。在鋁製容器方面，缺氧或缺氧之進行，係將加溫過、經氣密式鋁夾固定的玻璃培養皿連接於一系列的五個快速排放孔並注入95%氮氣與5%二氧化碳，於37℃下以搖晃平台水浴(對照組亦注入相同氣體)。在第五次排放與注氣後，平台(以鋁夾固定並水浴)經搖晃5分鐘，之後再進行一次排放與注氣後，將固定夾移至37℃培養箱內搖晃1至2小時以進行藥物暴露。介於200 ppm與空氣之間的供氧濃度，係以改變排放量及數目而定。培養基與氣相內氧氣濃度之測定係利用一含氧氣電極(Anima,Phoenixville,PA)之鋁夾，其可偵測氣相與液相。在藥物暴露之後，玻璃培養皿由培養箱或鋁製容器內移出，並潤濕培養基以洗去細胞周圍之多餘藥物。細胞隨後以胰蛋白酶化(胰蛋白酶ized)脫附並分裝於塑膠培養皿以進行選植生殖存活分析。經過10至14天後，培養皿以結晶紫染色(0.25%溶於95%乙醇)，並計數含群落數大於50的細胞(請見範例33)。計算受測化合物的90%生長抑制濃度(IC90，90%死亡，10%存活)並列於下表Y3。
範例32 電化學分析
欲決定氨基磷酸化物烷化劑前藥之電化學特性與還原電位，透過Bioanalytical Systems,Inc.進行這些化合物的循環狀伏安計量法(cyclic voltammograms)分析。所有實驗以玻璃碳(直徑3.0 mm)工作電極、Ag/AgCl參考電極及白金細絲輔助電極進行。化合物溶於1 mL甲醇並於加入9 mL磷酸鹽緩衝溶液(PBS)後使最終藥物濃度介於0.5與1.5 mM之間。將溶液倒入一電化學細胞小瓶並導入氬氣5分鐘以排除大部分氧氣。循環狀伏安法(cyclic voltammetry)以100 mV/sec進行，其玻璃碳工作電極掃描速率為10,000 mV/sec。一次試驗回合係於一CGME汞電極進行(SMDE模式中之CGME，150 μm口徑毛細管，8液滴大小)，但汞與玻璃碳之間伏安計量有些許差異，故不再使用汞電極。化合物單電子或多電子還原電位於每次掃描時產生，並列於下表。
範例33 選植生殖存活分析
本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥以下列分析進行檢測。以指數方式成長的人類H460細胞(購自ATCC)係種植於60 mm的玻璃培養皿上，其每盤之密度介於2.5與5 x 105 細胞之間，並於藥物處理前培養於添加10%胎牛血清之RPMI培養基2天。於檢測當天，配製所需之各藥物濃度於完全培養基中，並於每盤內加入2 ml所欲藥物。欲達到周圍氣相與液相間之完全平衡，移去玻璃培養皿上蓋並利用迴轉式振盪器搖晃5分鐘。隨後將培養皿加蓋並置於手套箱(glove－box)內。手套箱可排放與注入經驗證之缺氧氣體混合物(95%氮氣與5%二氧化碳)或好氧(常氧灌注)氣體混合物(95%空氣與5%二氧化碳)。細胞隨即於37℃下培養於藥物達2小時。
前藥處理完後，培養皿由容器內移出，並迅速將前藥移出細胞。培養皿以磷酸鹽緩衝溶液清洗，並隨即於37℃下以胰蛋白酶－EDTA溶液進行5分鐘胰蛋白酶化脫附。剝離的細胞以培養基加上血清中和之，並以100 xg離心5 min收集。細胞以大約1 x 106 細胞/ml濃度再懸浮並以稀釋10倍的濃度進行分盤。每一管的細胞濃度以Coulter Z2顆粒計數器定量。將所欲細胞數目分盤，並將培養皿置於培養箱內7至10天。將細胞群落固定並以含95%乙醇與0.25%結晶紫之溶液染色。計數細胞數目大於50之群落，並測定其存活狀況。
HT29之細胞選植生殖分析係以上述及範例31之方法進行。
缺氧與常氧條件下化合物(表1A與1B)細胞毒性之測定，係利用H460與HT29細胞株進行的選植生殖分析，其如範例31與33所示並以IC90(μM)表示，以及利用H460、HT29、HCT116與DX－5細胞株進行的抗增生分析，其改良自Hay等人，J.Med.Chem., 2003,46：169－82的多孔式細胞分析法並以IC5 0 (μM)表示(請見範例29)。組織常氧與缺氧時之IC5 0 或IC9 0 值稱為缺氧型細胞毒殺量(HCR)，可作為本發明前藥於缺氧時選擇性細胞毒殺作用之測定。
範例34 化合物25對細胞週期分佈之影響
細胞(H60、PC3與HT29)以密度1.0 x 106 細胞/3ml培養基種植於60 mm培養皿。在貼附24 h之後，細胞於常氧(空氣)或缺氧(氮氣)環境下暴露於所欲濃度之化合物25達2 h。細胞經兩次洗滌，並以新鮮培養基繼續培養22 h。細胞經胰蛋白酶化脫附、離心並於－20℃下以75%乙醇固定至少24 h。細胞週期分佈之測定係利用Guava細胞週期試劑(Guava,Hayward,CA)於流式細胞儀(Guava,Hayward,CA)進行。數據顯示化合物25可誘發多種人類癌症細胞株之細胞週期終止，並具有氧氣與濃度依賴效應。
範例35 細胞球體模式
利用兩人類癌症細胞株進行細胞球體研究以測定缺氧活化氨基磷酸化物烷化劑前藥之功效。HT29大腸直腸腺癌(直腸癌)細胞以濃度10,000細胞/mL直接種植於125 ml旋轉角瓶內並培養於含10% FBS與抗生素的RPMI培養基。當細胞分裂後，會相互黏著並形成細胞球體。將H460肺癌細胞種植於塗佈非黏著表層的角瓶內以形成細胞小球，其隨後可種植於旋轉角瓶內。欲進行H460細胞接種，利用塗佈1%凝膠之150 cm2 組織培養瓶種植10,000個細胞，並於後續種植於旋轉培養基之前，先行以含10% FBS與抗生素的RPMI培養基培養3至5天。此二細胞株在形成肉眼可見的細胞球體後，即每日更換培養基。
欲決定細胞球體內缺氧區域的型態與位置，以整個細胞球體進行組織學分析。進行冷凍切片時，完整細胞球體以磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌並包埋於OCT，並於－80℃保存前迅速以乾冰/2－甲基丁烷溶液冷凍。進行石臘包埋切片時，完整細胞球體以新鮮配製含4%三聚甲醛之PBS溶液固定並隨即包埋與切片。
欲評估氨基磷酸化物烷化劑前藥通透缺氧癌症細胞內部、產生活化狀態、釋放氨基磷酸化物烷化劑並毒殺內部癌症細胞之能力，進行細胞球體2h藥物暴露後之選植生殖存活測定。將細胞球體置於新生培養基內並於實驗開始前先行培養至少1h。分離大小介於500與600 μm之間的細胞球體，係利用一系列大小固定之無菌篩網進行過濾。將10至20個細胞球體置於經矽膠刻痕的60 mm Pyrex培養盤內，並加入3 mL培養基含所欲濃度之檢測化合物。將培養盤置於鋁製容器內，並連接一系列可排放與注入經驗證含有5% CO2 與一定量的O2 (0% O2 、3% O2 、10% O2 或空氣)等氣體之孔道。細胞球體以水浴搖晃培養，以確保溶液內的溶氧與細胞球體完整性能維持2小時衡定。在以胰蛋白酶完全脫附之前，移去檢測化合物並洗滌細胞球體。由於壞死核含有細胞碎片，故需處理DNase I以產生單獨一致的細胞懸液。細胞以106 /mL濃度再懸浮並種植以進行選植生殖存活分析。
以單層細胞進行初始劑量反應實驗，係於氮氣、0.6% O2 或空氣條件下，建立由氨基磷酸化物烷化劑前藥所釋放氨基磷酸化物烷化劑之適當劑量範圍與氧氣依賴狀況。以選植生殖存活率為反應終點，其數據以IC90或C90值(殺死90%細胞並有10%存活所需之抑制濃度)表示。紅保黴素(Daunorubicin)與順鉑(cisplatin)，可不同程度地通透細胞球體，故用於毒殺細胞球體之外層好氧型癌細胞。使用紅保黴素通透多細胞球體外層係因其細胞高親和性，而使用適當劑量的順鉑可僅僅毒殺外層好氧型癌細胞。作為一控制組，其生物還原藥物可於缺氧下毒殺單層細胞，卻因其高反應力與低穿透力而無法作用於多層細胞而言，替拉扎明(Tirapazamine)僅適用於以單層細胞為主及下表所示H460細胞球體2小時暴露的實驗。
以細胞球體檢測一系列氨基磷酸化物烷化劑前藥以決定其通透缺氧癌症細胞內層、產生活化狀態並毒殺缺氧細胞之能力。結果如下所示。
H460細胞以單層細胞或細胞球體形式投予氨基磷酸化物前藥2 h之IC90值。
化合物25功效之類似結果亦可以HT29細胞球體證實，其如下表所示：
以氨基磷酸化物烷化劑前藥同時結合順鉑或紅保黴素，並投予細胞球體2 h，隨後測定選植生殖存活率。結果如下表所示：
氨基磷酸化物烷化劑前藥證實具備通透細胞球體內部的能力並可單獨毒殺缺氧癌症細胞及配合其他好氧癌症細胞標的藥劑使用。
範例36 抗增生分析－DNA突變修補細胞
中國倉鼠卵巢細胞之特殊DNA突變修補途徑細胞係購自ATCC。下列受測細胞株係以濃度2,500或3,000細胞/孔培養於500 μL含10%胎牛血清與抗生素之杜氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(Gibco)：AA8細胞(ATCCCRL－1859)、EM9細胞(ATCCCRL－1861)、UV41細胞(ATCC CRL－1860)、UV135細胞(ATCC CRL－1867)、IRS1SF細胞。所有細胞株初步以抗增生分析法篩檢，其中具備敏感性者再以選植生殖分析檢測(如前面所述)以確認增生結果。於缺氧或好氧條件下，將細胞暴露於本發明氨基磷酸化物烷化劑前藥之經選定劑量下2 h，隨後移去檢測化合物並進行細胞分析。下表列出細胞株、突變途徑與特定基因缺失情形：
下表顯示在缺氧或好氧條件下，以各細胞株暴露於化合物25與36之影響，係進行增生分析並測定IC5 0 。
下表顯示在缺氧或好氧條件下，經選取細胞暴露於化合物25之選植生殖存活IC9 0 值。
在缺氧條件下，僅有同源重組缺失之細胞株對化合物25具備敏感性。由於UV41同時參與核苷酸切除修補途徑及同源重組修補途徑，故化合物25可產生顯著量的單鍵結物(monoadducts)。然而，UV135雖涉及核苷酸切除修，卻不具備化合物25敏感性。化合物25產生的主要損害係DNA股間交聯作用。這些結果可由UV41與irslSF細胞之選植生殖分析證實。於好氧條件下投藥所產生的敏感性程度與缺氧時相同，顯示好氧毒性亦可因形成DNA股間交聯作用而造成。化合物36於突變細胞株具有類似敏感性，顯示化合物36亦產生DNA股間交聯作用。
範例37 多層細胞培養分析
本範例證實化合物25的組織通透效用，係利用多層細胞培養(MCC)並評估任何的旁觀者效應。以MCCs培養於有氧培養基(20% O2 & 5% O2 )或缺氧培養基(大約0% O2)，受測化合物由一邊進行投藥(暴露表面，常氧面)而另一邊則暫不給藥(遠端，缺氧端)。當MCC培養於含20% O2 或5% O2 培養基時，係以氧氣梯度方式由培養基暴露表面朝向遠端。最遠處的50 μm組織則缺乏氧氣。5% O2 充氣培養基之缺失程度大於20%培養基；5% O2 培養條件較能反應活體內的情形。以MCCs培養於含0% O2 灌流之培養基模式限制了缺氧情況，其中腫瘤血管變得完全缺氧，而受測化合物必須穿越更大距離始能到達所有細胞。若活化藥物結合後限制其穿透作用，則藥物的通透會產生更大的屏障。
MCC實驗於培養基內進行，係於受測化合物投藥前與期間注入0、5或20% O2 達45分鐘。HCT116細胞於一固體支撐物上生長至厚度150 μm，並鉗緊培養皿之一端以形成限制擴散型缺氧。在0% O2 、5% O2 或20% O2 條件下，培養基暴露於受測化合物達1 hr，並利用BrdU混合抑制作用之測定評估其效用。培養物於含20% O2 新鮮培養基內進行第二個小時的培養並移至正常生長培養箱，其中培養基可完全披覆MCC。於BrdUrd標記前，培養基繼續培養24小時，接著進行冷凍切片。MCC暴露端與遠端BrdUrd標記之分析係利用免疫組織化學染色法、顯微攝影與電腦影像分析進行，以評估化合物25對於細胞增生之效用。
當培養基於20% O2 條件下暴露於階梯劑量之化合物25時，相較於暴露端(常氧)，遠端(缺氧)僅需低於5倍量之化合物即可產生類似結果，證實了化合物25之通透與缺氧活化。當MCC於生理5% O2 條件下暴露於受測化合物時，相較於常氧端，化合物25於缺氧端之BrdU混合抑制效用高於10倍以上。5%與20% O2 培養基之常氧端受化合物25暴露之影響結果相同。
化合物25在5% O2 培養基缺氧端之效用較0% O2 大。比較5% O2 培養基之常氧與缺氧端，顯示化合物25可有效通透含氧組織。化合物25可毒殺功能血管上約150 μm厚之缺氧細胞。相對於5% O2 條件下之暴露狀況，0% O2 下缺氧端化合物25之暴露功效減少大約3倍。僅於最高濃度時有旁觀效應。
下表顯示暴露於階梯劑量化合物25之效用並以IC5 0 表示(抑制50% BrdU混合之濃度)。
範例38 化合物25於人類與小鼠微粒體蛋白之代謝作用
以活體外方式評估氨基磷酸化物烷化劑前藥(化合物25)之代謝穩定性，係利用含細胞色素P450酵素之人類(HLM)、大鼠(RLM)與小鼠(MLM)肝臟微粒體蛋白進行。化合物25(500 μL，5 μM)溶液之製備，係以水：甲醇混合溶液100倍稀釋其DMSO原液，將微粒體蛋白(1 mg/mL)加入PBS/MgCl2 ，而酵素反應始於加入NADPH溶液。在加入NADPH溶液後的0、10、20與30分鐘終止此50 μl反應，蛋白以乙腈沉澱，且澄清之上清液以逆相LC－MS/MS分析其化合物25含量。以硝苯地平(Nifedipine)與睪固酮(testosterone)作為陽性對照組。第一項研究係比較RLM與MLM(表1)，而第二項研究則比較HLM與RLM(表2)。
範例39 氨基磷酸化物烷化劑前藥之活體內藥物動力學
氨基磷酸化物烷化劑前藥之各種血清藥物動力學參數係以CD－1小鼠進行，除了下表3加註部分以外。
範例40 化合物25之活體外藥物動力學
化合物25之各種血清或腫瘤藥物動力學參數係以CD－1小鼠進行，除了下表4加註部分以外。
範例41 化合物25代謝之細胞色素P450抑制作用
製備八個反應孔，每孔係100 μL溶液，含有50 mM磷酸鉀，pH 7.4、2.6 mM NADP＋ 、6.6 mM葡萄糖－6－磷酸鹽、0.8 U/mL葡萄糖－6－磷酸鹽脫氫酶與1：3連續稀釋之受測化合物(例如化合物25)，並同時以1：3連續稀釋方式製備八孔之適用陽性控制組抑制劑(例如，以呋拉茶鹼(furafylline)抑制CYP1A2、以磺胺苯唑(sulfaphenazole)抑制CYP2C9、以N－benzylnirvanol抑制CYPC219、以奎尼丁(quinidine)抑制CYP2D6，及以酮康唑(ketoconazole)抑制CYP3A4)。受測化合物濃度範圍由0.0229 μM至200 μM。反應始於加入100 μL經預熱之酵素/受質溶液。準備一零時間點之反應控制組，係加入50 mL溶於水之10%甲酸(2C19則加入400 mL的乙腈)於100 mL輔因子溶液內去活化酵素，隨後加入100 mL酵素/受質溶液。同時準備一不具備抑制劑之反應控制組。在37℃下反應後，加入50 mL溶於水之10%甲酸(2C19則加入400 mL的乙腈)終止反應。反應經製備並以HPLC/MS/MS分析探針受質之代謝物形式(CYP1A2為非那西丁(phenacetin)、CYP2C9為雙氯芬酸鉀(diclofenac)、CYPC219為美芬妥英(S)－mephenytoin、CYP2D6為右甲嗎喃(dextromethorphan)與咪達唑侖(midazolam)、CYP3A4為睪固酮(testosterone)與硝苯地平(nifedipine))。每組分析係二重複進行。其IC50值摘錄於下表。
範例42 決定小鼠、大鼠、狗與人類肝細胞所形成化合物25之可能代謝物
將濃度10 μM的化合物25培養於小鼠、大鼠、狗、猴與人類肝細胞。反應於0(預培養)、30、60與120分鐘時終止，係於離心前加入乙腈，並以高效能液態層析儀(HPLC)結合串聯式質譜儀(LC/MS/MS)進行分析。可能代謝物之確認係進行100至520 amu之全掃描。隨後收集可能代謝物之產物離子光譜並相較於原化合物之離子光譜，以決定每一可能代謝物是否與化合物25有關。一段時間後，原化合物(化合物25)的消失與可能代謝物的出現，可由比較每一時間點尖峰高度而測得。
範例43 決定化合物25及其代謝物對於大鼠、狗與猴之活體內藥物動力學
化合物25及其代謝物藥物動力學參數之測定係利用Sprague Dawley大鼠靜脈注射投予5、20、50 and 100 mg/kg之單劑量化合物25。化合物25及其代謝物藥物動力學亦利用米格魯犬與獼猴之靜脈注射，投予20 mg/kg之單劑量化合物25而測定。血清中化合物25及其代謝物濃度之測定係利用LC/MS/MS方法，並計算平均藥物動力學參數。
範例44 大鼠質量平衡研究
正常與膽汁插管Sprague－Dawley大鼠，以靜脈注射方式投予單一劑量1 4 C－化合物25。於特定時間點採集血清、尿液與糞便，並以液態閃爍攝影法(LSC)測定總放射活性濃度。
範例45 全身放射自顯影定量法
Sprague－Dawley大鼠以靜脈注射投予單一劑量1 4 C－化合物25。在特定時間點，逐一麻醉大鼠。採血離心以取得血清，並分析血液與血清中放射活性濃度。將冷凍之大鼠屍體包埋於2% CMC、使成塊狀並以Leica CM 3600冷凍切片機進行40 μm厚度之切片。收集切片進行冷凍乾燥、載片並於磷光攝影板上曝光，配合1 4 C放射自顯影標準品以進行影像分析軟體校正。曝光銀幕以Molecular Dynamics Storm 820或860進行掃描。所選取之組織，包括脂肪組織(棕色與白色)、腎上腺、血液、腦部(大腦、小腦、延髓)、骨骼、骨髓、盲腸、副睪、食管、眼球(葡萄膜、水樣液、晶體)、哈氏腺、心臟、腎臟(皮質、髓質、乳突及整體部位)、大腸、肝臟、肺臟、頜下淋巴結)、胰臟、腦垂腺、前列腺、唾腺、儲精囊、骨骼肌、皮膚、胃臟、小腸、脾臟、脊髓、氣管、甲狀腺與尿道膀胱，其放射活性濃度係利用影像分析法測定。每一動物產生放射放光自顯影圖與數位影像。
範例46 化合物25之血清蛋白結合作用
化合物25於小鼠、大鼠、狗、猴與人類血清中蛋白之結合測定係利用超濾濃縮法。超濾濃縮之進行，係將分別加入三種濃度化合物25之血清分裝至Centrifree設備並重複三次。所有血清樣本隨後平衡至37℃。Centrifree設備以2500 xg於37℃離心30分鐘。以I.S.(重氫化合物25)加入75 μL超濾濃縮物分裝品，並利用LC/MS/MS分析。利用人類超濾濃縮物標準品校正曲線進行超濾濃縮物之分析與量化。
範例47
範例47證實了本發明化合物之癌症治療用途，係採用HT－29之人類結腸癌異種小鼠模式。
雌性CB17/SCID小鼠(購自Charles River,Cambridge,MA)、7－8週大，係調適至少三天，並放置於無病原體環境。人類結腸癌細胞株HT－29購自American Type Culture Collection。將細胞株培養於含10%胎牛血清之RPMI 1640 培養基。細胞培養於維持5% CO2 之37℃培養箱。收取HT－29細胞並以3 x 106 細胞/動物接種於腹膜皮下空腔處。當腫瘤成長至平均體積100 mm3 (第8天)時，每組10小鼠進行三週餵食，包括單獨載劑(生理食鹽水與PEG(每隻10 mL/kg)，第1組)、單獨化合物36(溶於含30%環糊精之PBS)且每日劑量為20、60或200 mg/kg(分別為第2、第3與第4組)、在10 mg/kg劑量之5FU(溶於生理食鹽水)後的化合物36每日劑量20、60與200 mg/kg達2－3小時(分別為第5、第6與第7組)，以及僅10 mg/kg劑量之5FU(第8組)，其比較結果如下表。
每隻小鼠體重每二週紀錄一次。每一異種生長之偵測，係利用數位卡尺每週二次量測腫瘤外圍面積。腫瘤體積(V)以下式決定：V＝(L x W2 )/2，其中L為異種長度且W為異種寬度。腫瘤體積每週量測二次。
相較於單獨投予載劑，以20、60與200 mg/kg/天投予化合物36均可減少腫瘤生長。相較於載劑，混合投予化合物36與5FU可大量且劑量相關地抑制腫瘤生長。此外，與60、200 mg/kg化合物36之混合，相較於單獨投予5FU，可大大地減少腫瘤生長。
伴隨這些抗腫瘤效應的，係體重下降與偶發性死亡，尤其是處理高劑量化合物36組別，但其他組別亦發生。整體而言，化合物36可抑制腫瘤生長。
範例48
範例48證實了本發明化合物之癌症治療用途，係採用NCI H460之人類結腸癌異種小鼠模式。
雌性CB17/SCID小鼠(購自Charles River,Cambridge,MA)、7－8週大，係調適至少三天，並放置於無病原體環境。人類結腸癌細胞株NCI H460係購自American Type Culture Collection。細胞株依據範例47所述方法培養與收集，並以1 x 106 細胞/動物接種於腹膜皮下空腔處。當腫瘤成長至平均體積100 mm3 (第8天)時，每組10小鼠進行三週餵食，如下表所示：化合物25(2.5 mg/ml溶於10% PEG；投藥途徑－i.p.)及紫杉醇(1 mg/ml溶於5% EtOH、5% Cremophor與90%生理食鹽水；投藥途徑－i.v.，係於化合物25投藥後2 h進行)。測量體重與腫瘤體積，如範例47所述。
結果證實所有三種化合物25投藥之處方具備類似程度的腫瘤生長抑制作用，而混合治療，尤其是每日投藥者，則具備額外功效。每種混合治療均產生某種程度的體重下降，但不足以造成任何死亡情形。整體而言，結果顯示化合物25對於肺癌有其功效，且具備如標準化療試劑，紫杉醇，所具備之功效。
利用小鼠與HED的轉換，可知化合物25的給藥有效治療劑量約為2至約8 mg/kg/天，以治療癌症，尤其是肺癌，無論是單獨或配合TaxolT M ，其中每日投藥劑量，在較高劑量組的投藥頻率相較於較低劑量組，有減少趨勢。
範例49
範例49敘述了本發明化合物之癌症治療用途，係採用H460之非小細胞肺癌異種小鼠模式。雌性CB17/SCID小鼠(購自Charles River,Cambridge,MA)、7－8週大，係調適至少三天，並放置於無病原體環境。人類非小細胞肺癌細胞株NCI H460係購自American Type Culture Collection。細胞株依據範例47所述方法培養與收集，並以3 x 106 細胞/動物接種於腹膜皮下空腔處。當腫瘤成長至平均體積100 mm3 (第8天)時，每組小鼠(每組十隻)進行三週餵食，如下表所示：化合物25(2.5mg/ml溶於10% PEG；投藥途徑－i.p.)；化合物24(0.3、0.1 mg/ml溶於10%PEG，投藥途徑－i.p.)及紫杉醇(1 mg/ml溶於5% EtOH、5% Cremophor與90%生理食鹽水；投藥途徑－i.v.，係於受測化合物投藥後2 h進行)。
體重與腫瘤體積之測定如範例47所述。第27天所測腫瘤生長抑制作用結果列於下表。
於第天27進行比較，因其為載劑組測量的最後一天，並且犧牲動物。
這些結果證實每日投藥3 mg/kg化合物24與25 mg/kg化合物25之抑制腫瘤生長，以及化合物25無論是單一治療或配合紫杉醇均有不錯的療效。而這些功效會伴隨些許體重下降，尤其是化合物25＋紫杉醇組。
利用小鼠與HED的轉換，可知化合物25的給藥有效治療劑量約為2 mg/kg/天，以治療癌症，尤其是肺癌，無論是單獨或配合紫杉醇T M ，而化合物24的給藥有效治療劑量約為0.25 mg/kg/天，以治療癌症，尤其是肺癌，無論是單獨或配合紫杉醇T M 。
範例50
範例50敘述了本發明化合物之癌症治療用途，係採用HT－29之人類結腸癌異種小鼠模式。雌性CB17/SCID小鼠(購自Charles River,Cambridge,MA)、7－8週大，係調適至少三天，並放置於無病原體環境。人類結腸癌細胞株HT－29係購自American Type Culture Collection。細胞株依據範例47所述方法培養與收集，並以3 x 106 細胞/動物接種於腹膜皮下空腔處。當腫瘤成長至平均體積100 mm3 (第8天)時，每組小鼠(每組十隻)進行三週餵食，如下表所示：化合物24(溶於10% PEG)，投藥途徑－i.p.，於處理5－FU或順鉑(CDDP；溶於生理食鹽水)前2 h投藥；單獨5FU(溶於生理食鹽水)，或單獨CDDP。
在控制組部分，將腫瘤植入兩部位，以個別研究部位差異對控制組腫瘤生長的影響。這些結果不會影響研究的詮釋，並以所有處理組對照於載劑組身體上相同腫瘤區域。體重與腫瘤體積之測定如範例47所描述。於第25天測定腫瘤生長抑制作用，其中載劑組腫瘤到達最大尺寸，並犧牲該組動物且結果列於下表。
結果證實化合物24之單一治療腫瘤生長抑制作用大於40%，而結合化合物24與CDDP或5FU則提供50－70%的生長抑制。依據本範例，最佳的治療組合係化合物24與5FU。治療期間，小鼠腫瘤生長效用伴隨著輕微體重喪失；然而在治療結束後小鼠體重則恢復。
利用小鼠與HED的轉換，可知化合物24的給藥有效治療劑量約為0.25至約0.50 mg/kg/天，以治療癌症，尤其是結腸癌，無論是單獨或配合5FU或CDDP。
範例51
範例51敘述了本發明化合物之癌症治療用途，係採用H460之非小細胞肺癌異種小鼠模式。雌性CB17/SCID小鼠(購自Charles River,Cambridge,MA)、7－8週大，係調適至少三天，並放置於無病原體環境。人類非小細胞肺癌細胞株NCI H460係購自American Type Culture Collection。細胞株依據範例47所述方法培養與收集，並以3 x 106 細胞/動物接種於腹膜皮下空腔處。當腫瘤成長至平均體積100 mm3 (第8天)時，開始處理每組10隻之小鼠，係投予載劑(第1組)、3或6 mg/kg CDDP(分別為第2與第3組，IV一次)、溶於生理食鹽水之50 mg/kg化合物25，每週5次進行二週(第4組)、100 mg/kg之化合物25，每隔三天進行5次(第5組)或以3或6 mg/kg CDDP結合每一劑量之化合物25(分別為第6與第7組)。投予50 mg/kg化合物25之各組結果如第1圖所示。第2圖顯示100 mg/kg化合物25之類似結果。
這些結果配合化合物25之生理食鹽水配方，證實了腫瘤體積的減少具有明顯劑量相關性，且腫瘤生長因50 mg/kg之每日劑量而延遲，並比較投藥頻率低之100 mg/kg與50 mg/kg之每日投藥。這些數據亦證實，此二投藥處方可增加本模式中CDDP之功效。
利用小鼠與HED的轉換，可知化合物25的給藥有效治療劑量約為4至約8 mg/kg/天，以治療癌症，尤其是肺癌，無論是單獨或配合5FU或CDDP，其中每日投藥劑量，在較高劑量組的投藥頻率相較於較低劑量組，有減少趨勢。
範例52
範例52敘述了本發明化合物之癌症治療用途，係採用HT－29之人類結腸癌異種小鼠模式。雌性CB17/SCID小鼠(購自Charles River,Cambridge,MA)、7－8週大，係調適至少三天，並放置於無病原體環境。人類結腸癌細胞株HT－29係購自American Type Culture Collection。細胞株依據範例47所述方法培養與收集，並以3 x 106 細胞/動物接種於腹膜皮下空腔處。當腫瘤成長至平均體積100 mm3 (第8天)時，每組小鼠(每組十隻)進行三週投藥，如下表所示：化合物25溶於生理食鹽水，給藥途徑－i.p.，於處理CDDP前2 h投藥，及CDDP(溶於生理食鹽水，IV)。
體重與腫瘤體積之測定如範例47所述。數據係第25天腫瘤體積，其中載劑組腫瘤達到足夠並犧牲小鼠。腫瘤生長抑制作用之結果如下表所示。
結果證實單一治療投予化合物25，生理食鹽水配方，結合50mg/kg/天與100 mg/kg/天之各種劑量處方，可抑制本結腸癌模式之腫瘤生長，而結合化合物25與CDDP之治療則增進了化合物25對於本結腸癌模式之效用。這些效用會伴隨適度的體重喪失，而結合組則減少較多；小鼠則於治療結束後恢復體重。
利用小鼠與HED的轉換，可知化合物25的給藥有效治療劑量約為4至約8 mg/kg/天，以治療癌症，尤其是非小細胞肺癌，無論是單獨或配合CDDP，其中每日投藥劑量，在較高劑量組的投藥頻率相較於較低劑量組，有減少趨勢。
範例53
範例53敘述了本發明化合物之癌症治療用途，係採用H460之非小細胞肺癌異種小鼠模式。雌性CB17/SCID小鼠(購自Charles River,Cambridge,MA)、7－8週大，係調適至少三天，並放置於無病原體環境。人類非小細胞肺癌細胞株NCI H460係購自American Type Culture Collection。細胞株依據範例47所述方法培養與收集，並以3 x 106 細胞/動物接種於腹膜皮下空腔處。當腫瘤成長至平均體積100 mm3 (第8天)時，開始處理每組10隻之小鼠，係投予載劑(第1組)、6 mg/kg CDDP(IV一次，第2組)、溶於生理食鹽水之150 mg/kg化合物25，每週一次進行二週(i.p.，第3組)或結合兩試劑(第4組)。
結果顯示於第3圖，證實每週投予150 mg/kg化合物25比單獨投予CDDP更能有效降低腫瘤生長，而結合兩種試劑則功效增加。這些結果亦指出，在兩週的投藥期間，平均腫瘤體積並未改變，顯示完全抑制腫瘤的生長。這些數據顯示，每週一次150 mg/kg/天之化合物25單一治療，係先前所述範例(範例47－52)中最有效的投藥處方。可觀察到體重小量改變，顯示此投藥處方毒性較低。
利用小鼠與HED的轉換，可知化合物25的給藥有效治療劑量約為12 mg/kg/天，以治療癌症，或者以每週一次的頻率，尤其是非小細胞肺癌，單獨或配合CDDP。
範例54
範例54描述了以化合物25的ip 大丸注射或ip 單獨灌注或結合順鉑等方式，對於H460異種小鼠模式之功效。雌性－Foxnln u 同型結合nu/nu小鼠(購自from Charles River,Cambridge,MA)、6週大，係調適至少三天，並放置於無病原體環境。人類結腸癌細胞株HT29係購自American Type Culture Collection。細胞株依據範例47所述方法培養與收集，並以3 x 106 細胞/動物接種於腹膜皮下空腔處。當腫瘤成長至平均體積100 mm3 (第8天)時，每組小鼠(每組十隻)投藥三週，如下表所示：化合物25(配製成15 mg/ml生理食鹽水，投藥途徑－i.p.，於結合治療之處理CDDP前2 h投藥，且CDDP係溶於生理食鹽水，IV。
體重與腫瘤體積之測定如範例47所述。結果顯示於第4圖。數據顯示，當連續之單獨投予化合物25或結合CDDP時具備間歇性效用，例如一週一次的投藥對於某些癌症之治療，例如非小細胞肺癌，有較大的效果。
範例55 化合物25與吉西他濱(Gemcitabine)結合治療
結合化合物25與吉西他濱並投予裸鼠，其具備源自人類胰臟癌細胞MiPaca2型腫瘤。MiaPaca－2腫瘤具備高度侵入性與快速生長特性，可於20－30天導致未處理動物之死亡。腫瘤細胞係轉染紅色螢光蛋白之基因。小鼠係投予控制組載劑、吉西他濱、化合物25、化合物24或吉西他濱/化合物25結合物或吉西他濱/化合物24，並以i.p.方式投藥，如下表所示(8小鼠/組)。化合物24與25以生理食鹽水調配，係以乾燥粉末形式購自Threshold Pharmaceuticals,Inc.。吉西他濱為商業上可獲得，並依據製造說明新鮮配製。
腫瘤係每週攝影直到研究結束，屆時並解剖攝影以確認其功效。在第1組中，腫瘤生長迅速(第5圖)，並於第30天造成100%死亡(第6圖)。
第3與第4組的腫瘤體積具有輕微變化，並影響存活率。第2組明顯減少腫瘤體積且延長壽命。第6組的腫瘤大小有適當減少，但不影響存活率。相較於第2組，第5組證實明顯減少腫瘤生長且壽命明顯延長。第5組中，8個腫瘤中有5個在治療後恢復快速，且短時間內無法散射螢光(第7圖)。
這些腫瘤有4個仍不具螢光直到實驗終止，因此這些腫瘤被視為治癒。第2組不產生腫瘤並被視為治癒。這些結果證實，此癌症模式中，相較於吉西他濱之單一治療，化合物25與吉西他濱之結合治療效用較大。這些結果證實，處理30 mg/kg/天化合物25與吉西他濱之動物腫瘤減少情況，明顯大於處理單一劑量之吉西他濱動物。
利用小鼠與HED的轉換，可知化合物25的給藥有效治療劑量約為2.5 mg/kg/天，以治療癌症，尤其是胰臟癌，並結合吉西他濱。
範例56
已知治療人類疾病包括癌症之有效分子，為了達到功效，其接近劑量或更高劑量可能具有毒性。欲決定此一化合物之適當劑量與投藥途徑，必須了解其毒性。一般而言，初步會先決定所採用囓齒類動物例如小鼠的有毒劑量，所提供之初步數據可作為大型動物與人類類似研究設計上的參考。受測化合物(化合物24、25與36)以小鼠進行試驗作為初步實驗以決定大型動物可使用之劑量。化合物25之測試劑量為300 mg/kg之單一劑量，發現會造成腎臟毒性，例如腎小管壞死及蛋白溢出至尿液中。亦可觀察到白血球細胞暫時減少。然而，較低劑量(100與200 mg/kg)則毒性甚低。所採用的這些劑量代表可用於大型動物例如大鼠與犬的大概劑量，以確定此毒性的存在並預測人類可能的腎功能影響。
雖然本發明已以特定實施例作為參考進行詳細說明，熟習此技術領域者應可了解在本發明範疇中之修飾與改進，皆以後續申請專利範圍中所準。在此引用之所有文獻與專利文件(專利案、公開專利申請案與未公開之專利申請案)皆在此併入本案以作為參考資料，如同每一文獻與文件特定並單獨引用，皆併入本案以作為參考資料。文獻或專利文件之引用並非用於核准，任一此種文件皆為相關前案，亦不組成任一核准要件，即使內容與日期相同。本發明已以各種文字描述與範例方式說明，熟習此技術領域者應可了解本發明可實施各種實施例，前述說明與範例僅用於說明，並非限制下列申請專利範圍。
第1圖顯示化合物25(50 mg/kg)對於腫瘤生長之作用，在H460體外移殖小鼠模式中。
第2圖顯示化合物25(100 mg/kg)對於腫瘤生長之作用，在H460體外移殖小鼠模式中。
第3圖顯示化合物25(150 mg/kg)與CDDP組合劑量對於腫瘤生長之作用，在H460體外移殖小鼠模式中。
第4圖顯示化合物25與CDDP組合劑量對於腫瘤生長之作用，在H460體外移殖小鼠模式中。
第5、6、7圖顯示化合物25與吉西他賓(Gemcitabine)組合對於腫瘤生長之作用，在H460體外移殖小鼠模式中。

Claims (9)

  1. 一種如下式之化合物： 其中各X4 皆為Cl或Br。
  2. 如申請專利範圍第1項之化合物，具有下式：
  3. 如申請專利範圍第1項之化合物，具有下式：
  4. 一種醫藥調配物，包含如申請專利範圍第1項之化合物，與一藥學上可接受之賦形劑、載體或稀釋劑。
  5. 一種如申請專利範圍第1項之化合物於製造一藥劑之用途，該藥劑係用於治療癌症。
  6. 一種醫藥調配物，包含如申請專利範圍第2項之化合物，與一藥學上可接受之賦形劑、載體或稀釋劑。
  7. 一種醫藥調配物，包含如申請專利範圍第3項之化合物，與一藥學上可接受之賦形劑、載體或稀釋劑。
  8. 一種如申請專利範圍第2項之化合物於製造一藥劑之用途，該藥劑係用於治療癌症。
  9. 一種如申請專利範圍第3項之化合物於製造一藥劑之用途，該藥劑係用於治療癌症。
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