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TW200911832A - Polypeptides, antibody variable domains & antagonists - Google Patents

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TW200911832A
TW200911832A TW097121295A TW97121295A TW200911832A TW 200911832 A TW200911832 A TW 200911832A TW 097121295 A TW097121295 A TW 097121295A TW 97121295 A TW97121295 A TW 97121295A TW 200911832 A TW200911832 A TW 200911832A
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TW
Taiwan
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dom15
acid sequence
amino acid
variable region
sequence
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Application number
TW097121295A
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Inventor
Michael Steward
Thil Dinuk Batuwangala
Laurent Stephane Anne Therese Jespers
Malgorzata Pupecka
Ian Tomlinson
Carolyn Enever
Original Assignee
Domantis Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Application filed by Domantis Ltd filed Critical Domantis Ltd
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Description

200911832 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白（抗體）單一 可變區域及包含其之血管内皮生長因子（VEGF)拮抗劑。本 發明進一步係關於包含該等抗VEGF配位體之用途、調配 物、組合物及裝置。 【先前技術】 夕肽及肽已在多種應用中成為越來越 f
-一 ^ 〜7TT 月 v Ο 工業應用及作為醫藥劑、治療劑及診斷劑之用途。鈇而 在諸如癌症及發炎狀態(例如，c〇PD)之特定生理狀丨 中，組織、器官或動物中(例如，肺中、腫瘤中或請 近）所存在之蛋白酶量會增加。該蛋白酶增加會導致内沒 ^蛋白質及投與以治療疾病之治療肽、多肽及蛋白質加公 降解及失活。因此，一此且右、壬辦μ &扣 二八有活體内使用（例如，用於认 療、診斷或預防疾病）之潛力之藥 彳皇具有有限的功效， 因為其會被蛋白酶快速降解且失活。 蛋白酶抗性多肽提供數個優點 多肽在活體内保留活 幻而5，蛋㈣抗性 仵留功1主β _ 4比蛋白酶敏感劑長’且因此 保留功此歷時足以產生生物 酶降解且介η * 效應之時間。亦對選擇抗蛋白 酶降解且亦具有想要之生物活性 要。 夕肽的改良方法存在需 VEGF : V卿為歸因於初級轉錄物 垃 形式存在之分泌型肝素結合同元二接而以數種替 ^聽蛋白（Leung等人 131458.doc 200911832 19 89, Science 246: 1306)。歸因於VEGF誘導發炎中重要的 過程即血管滲漏之能力其亦稱為血管滲透因子（VPF)。 促使腫瘤形成、轉移及復發之重要生理病原性過程為腫 瘤血管生成。該過程藉由加工由腫瘤表現之血管生成因子 (諸如VEGF)來介導，該血管生成因子誘導向腫瘤傳遞營養 物之it管形成。因此，治療某些癌症之方法在於抑制由 VEGF介導之腫瘤血管生成，從而使腫瘤餓死。 AVASTIN(貝伐株單抗（bevacizumab) ; Genetech，Inc.)為已 獲批用於治療結腸直腸癌之結合人類VEGF之人化抗體。 據報導，稱為抗體2C3(ATCC寄存編號PTA 1595)之抗體結 合VEGF且抑制VEGF與表皮生長因子受體2之結合。 用當前可用之治療劑靶向VEGF並非在所有患者中或對 所有癌症均有效。因此，對治療癌症及由VEGF介導之其 他病理學病狀、例如血管增生性疾病（例如年齡相關黃斑 退化（AMD))之改良藥劑存在需要。 VEGF亦牽涉發炎病症及自體免疫疾病。舉例而言，在 RA患者之滑液組織中鑑別出VEGF突出VEGF在RA病理學 中之潛在作用（Fava等人，1994，J. Exp. Med. 180: 341: 346 ; Nagashima 等人，1995，J. Rheumatol. 22: 1624- 1630)。在鼠類膠原誘導之關節炎（CIA)模型中投與抗 VEGF抗體之研究後，VEGF在RA之病理學中之作用得到 確認。在該等研究中，關節中之VEGF表現在誘導疾病後 增加且投與抗VEGF抗血清可阻斷關節炎疾病之發展且改 善所建立之疾病（Sone等人，2001，Biochem. Biophys. Res, 131458.doc 200911832
Comm. 281: 562-568 ; Lu等人，2000, J. Immunol. 164: 5922-5927)。 因此’靶向VEGF亦可有益於治療及其他病狀，例如 與發炎及/或自體免疫疾病相關之病狀。 【發明内容】 在一態樣中’本發明提供一種多肽，其包含選自以下各 胺基酸序列之胺基酸序列：（i)為1 5-26品系之變異體的胺 基酸序列，其選自（a)與DOM15-26-595之胺基酸序列（展示 於圖5中）至少97%—致之胺基酸序列，（b)與DOM 15-26-591之胺基酸序列（展示於圖5中）至少98%—致之胺基酸序 列，（c)與DOM15-26-589之胺基酸序列（展示於圖5中）至少 98%—致之胺基酸序列，與D〇M15-26-588之胺基酸序 列（展示於圖5中）至少98% —致之胺基酸序列，（e)與 DOM15-26-555之胺基酸序列（展示於圖5中）至少99%—致 之胺基酸序列；以及（ii)與DOM15-10-11之胺基酸序列（展 示於圖6中）至少98%—致之胺基酸序列。 在一實施例中，該多肽係選自00^^15-26-595、001^15-26-591 > DOM15-26-589 ' DOM15-26-588 ' DOM15-26-555 及DOM1 5-10-11。本發明進一步提供一種（大體上）選自 DOM15-26-595 、 DOM15-26-591 、 DOM15-26-589 、 DOM1 5-26-588、DOM15-26-555 及 DOM1 5-10-11 之多肽之 純單體。在一實施例中，多肽為至少98、99、99.5%純或 1 0 0 %純之單體。 在一態樣中，本發明提供一種多肽（例如，具有蛋白酶 131458.doc 200911832 抗性）且該多肽係由與選自以下各胺基酸序列之胺基酸序 列至少80%—致之胺基酸序列編碼：⑴為15_26品系之變異 體的胺基酸序列，其選自（a)DOM15-26-595(展示於圖5 中），（b)D〇Ml5-26-591(展示於圖 5 中），（c)DOM15_26-589(展示於圖5中），（d)D〇Ml5-26-588(展示於圖5中）， (e)D〇M15-26-555(展示於圖 5 中）；以及（ii)DOM15-10- 11(展示於圖6中）。 在一實施例中，一致性％為至少7〇、8〇、85、90、91、 92、93、94、95、96、97、98 或 99°/。。在一實施例中，該 蛋白酶抗性多肽可由本文中關於分離蛋白酶抗性多肽所述 之方法獲得。 在一態樣中，本發明提供一種多肽，其係由與選自編碼 DOM15-26-595、DOM15-26-591 、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 及 DOM15-10-11 之核苷酸 序列至少55% —致的胺基酸序列編碼且其中該多肽包含與 相應胺基酸序列至少97% —致之胺基酸序列。在一實施例 中’核苷酸序列之一致性％為至少60、65、70、75、80、 85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。在一 實施例中，胺基酸序列之一致性。/。為至少98或99%或 100%。舉例而言，核苷酸序列可為編碼D〇M 15-26-595、 DOM15-26-591 、DOM15-26-589 、 DOM15-26-588 、 DOM1 5-26-555或DOM1 5-10-11之核苷酸序列之密碼子優 化形式。此項技術中已知序列之密碼子優化。在一實施例 中，核苷酸序列係經優化從而表現於細菌（例如，大腸桿 131458.doc 200911832 菌（E_ coli)或假單胞菌屬（Pseudomonas)，例如螢光假單胞 菌（P. fluorescens))、哺乳動物（例如，CHO)或酵母宿主細 胞（例如，酵母屬（Pichia)或植酵母屬（Saccharomyces)，例 如馬斯德畢赤酵母（P. pastoris)或釀酒酵母（s. cerevisiae)) 中〇 在一態樣中，本發明提供一種包含本發明之多肽之融合 蛋白。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單一 可變區域’其包含選自以下各胺基酸序列之胺基酸序列： ⑴為15-26品系之變異體的胺基酸序列，其選自（a)與 DOM15-26-595之胺基酸序列（展示於圖5中）至少97%—致 之胺基酸序列’（b)與DOM1 5-26-591之胺基酸序列（展示於 圖5中）至少98%—致之胺基酸序列，（c)與D〇M15_26_589之 胺基酸序列（展示於圖5中）至少98% —致之胺基酸序列，（d) 與00河15-26-588之胺基酸序列（展示於圖5中）至少98〇/〇一 致之胺基酸序列，（e)與DOM15-26-555之胺基酸序列（展示 於圖5中）至少99。/。一致之胺基酸序列；以及（丨丨）與d〇m 15-10-11之胺基酸序列（展示於圖6中）至少98% 一致之胺基酸 序列。 在一實施例中’免疫球蛋白單一可變區域在位置6處包 含顯胺酸’其中編號係根據Kabat(，，Sequences Pr〇teins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services 1991) ° 在一實施例中，免疫球蛋白單一可變區域在位置99處包 131458.doc •10· 200911832 含白胺酸，其中編號係根據Kabat。 在一實施例中，免疫球蛋白單一可變區域在位置30處包 含離胺酸，其中編號係根據Kabat。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單一 可變區域，其包含與選自001^15-26-595、001^15-26-591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 及 DOM 1 5-1 0-11之胺基酸序列一致之胺基酸序列。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單一 ( 可變區域，其係由與 DOM1 5-26-595、DOM15-26-591、 DOM15-26-589 > DOM15-26-588 、 DOM15-26-555 或 DOM1 5-10-11之核苷酸序列至少80%—致之核苷酸序列編 碼。在一實施例中，一致性％為至少70、80、85、90 ' 91、92、93、94、95、96、97' 98 或 99% ° 在一態樣中’本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單一 可變區域’其係由與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、 DOM15-26-589 、 DOM15-26-588 、 DOM15-26-555 或 ' 1 5_1 0-11之核苷酸序列至少55% —致之胺基酸序列編 碼且其中該可變區域包含與£)〇^115-26-595、〇01^15-26-591、DOM15-26-589、D〇M15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM 1 5-1 0-11之相應胺基酸序列至少97% 一致之胺基酸序 列。在一實施例中’核苷酸序列之一致性％為至少60、 65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、 97、98或99%。在一實施例中，胺基酸序列之一致性％為 至少98或99°/。或100%。舉例而言，核苷酸序列可為 131458.doc -11. 200911832 DOM15-26-595 > DOM15-26-591 . DOM15-26-589 > ^6-588、DOM1 5-26-555 或 D〇Ml5-10-11之核苷酸 进、馬子優化形式。此項技術巾已知序列之密碼子優 在實把例中，核苷酸序列係經優化從而表現於細菌 ('】如大腸杯菌或假單胞菌屬，例如螢光假單胞菌）、哺 乳動物（例如’ CH〇)或酵母宿主細胞（例如，酵母屬或植酵 母屬，例如馬斯德畢赤酵母或釀酒酵母）中。 在態樣中，本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單一 可變區域，其係由與選自D〇Ml5_26_595、 591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之核苷酸序列一致之序列編碼。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEgF拮抗劑，其包含 本發明之抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域。在一實施例 中，該拮抗劑包含第一及第二免疫球蛋白單一可變區域， 其中各可變區域係根據發明。舉例而言，其中該拮抗劑包
含該單一可變區域之單體或該單一可變區域之同元二聚 體。在一實施例中，該（或各）單一可變區域之胺基酸序列 與選自 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之胺基酸 序列之胺基酸序列一致。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單_ 可變區域，其包含與選自DOM15-26-595、DOM15-26. 591 ' DOM15-26-589 ' DOM15-26-588 ' DOM15-26-555 ^ DOM15-10-11之胺基酸序列一致或在不超過14個胺基酸位 13I458.doc -12· 200911832 置處與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之胺基酸 序列不同且具有與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、 DOM15-26-589 、 DOM1 5-26-588 、 DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之相應CDR1序列至少50%—致之CDR1序列 的胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超過13、12、 11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在 一實施例中，CDR序列一致性為至少55、60、65、70、 75、80、85、90、95、96、97、98 或 99% ° 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單一 可變區域，其包含與選自〇〇]\415-26-595、0〇]^15-26-591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之胺基酸序列一致或在不超過14個胺基酸位 置處與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM15-20-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之胺基酸 序列不同且具有與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、 DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之相應CDR2序列至少50%—致之CDR2序列 的胺基酸序列。在一實施例中，不同之處不超過13、12、 11、10、9、8、7、0、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在 一實施例中，CDR序列一致性為至少55、60、65、70、 75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。 、DOM15-26- 在一態樣中’本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單一 可變區域’其包含與選自DOM15-26-595 131458.doc -13- 200911832 591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM 15-10-11之胺基酸序列一致或在不超過丨4個胺基酸位 置處與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM 1 5-26-588、DOM 1 5-26-555 或 DOM 1 5-10-11 之胺基酸 序列不同且具有與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、 DOM15-26-589 、 DOM15-26-588 > DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之相應CDR3序列至少50°/。一致之CDR3序列 的胺基酸序列。在一實施例中，不同之處為不超過14、 13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或 1 個胺基酸 位置。在一實施例中，CDR序列一致性為至少55、60、 65、70、75、80 ' 85、90、95、96、97、98 或 99% ° 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單一 可變區域，其包含與選自00]^15-26-595、001^15-26-591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之胺基酸序列一致或在不超過14個胺基酸位 置處與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之胺基酸 序列不同且具有與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、 DOM15-26-589 、 DOM15-26-588 、 DOM1 5-26-555 或 DOM15-10-11之相應CDR1序列至少50%—致之CDR1序列 且具有與〇〇]^15-26-595、0〇]^15-26-591、001^15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之相 應CDR2序列至少50%—致之CDR2序列的胺基酸序列。在 一實施例中，不同之處不超過13、12、11、10、9、8、 131458.doc -14· 200911832 7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實施例中，一 或兩個CDR序列一致性分別為至少55、60、65、70、75、 80、85、90、95、96、97、98 或 99%。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單一 可變區域，其包含與選自00〜：15-26-595、0〇]^15-26-591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之胺基酸序列一致或在不超過14個胺基酸位 置處與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589 ' DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之胺基酸 序列不同且具有與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、 DOM15-26-589 、 DOM15-26-588 、 DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之相應CDR1序列至少50%—致之CDR1序列 且具有與〇01^15-26-595、00^115-26-591、001^15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之相 應CDR3序列至少50% —致之CDR3序列的胺基酸序列。在 一實施例中，不同之處不超過13、12、11、10、9、8、 7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實施例中，一 或兩個CDR序列一致性分別為至少55、60、65、70、75、 80、85、90、95、96、97、98 或 99% 〇 在一態樣中’本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單一 可變區域，其包含與選自〇〇]^115-26-595、001415-26-591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM1 5-10-11之胺基酸序列一致或在不超過14個胺基酸位 置處與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 131458.doc •15- 200911832 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之胺基酸 序列不同且具有與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、 DOM15-26-589 、 DOM15-26-588 、 DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之相應CDR2序列至少50%—致之CDR2序列 且具有與DOM15-26-595、DOM15-26591、DOM15-26-589、DOM1 5-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之相 應CDR3序列至少50°/。一致之CDR3序列的胺基酸序列。在 一實施例中，不同之處不超過13、12、11、10、9、8、 7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一實施例中，一 或兩個CDR序列一致性分別為至少55、60、65、70、75、 80、85、90、95、96、97、98 或 99%。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF免疫球蛋白單一 可變區域，其包含與選自〇〇]^15-26-595、0〇]^15-26-591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM1 5-1 0-11之胺基酸序列一致或在不超過14個胺基酸位 置處與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之胺基酸 序列不同且具有與 DOM15-26-595、DOM15-26-591、 DOM15-26-589 、 DOM15-26-588 、 DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之相應CDR1序列至少50%—致之CDR1序列 且具有與00^115-26-595、001^15-26-591、001^15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之相 應CDR2序列至少50%—致之CDR2序列且具有與〇01^15-26-595 、DOM15-26-591 、DOM15-26-589 、DOM15-26- 131458.doc •16- 200911832 588、DOM15-26-5 55或 DOM15-10-11之相應 CDR3序列至少 50%—致之CDR3序列的胺基酸序列。在一實施例中，不同 之處不超過 13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或 1個胺基酸位置。在一實施例中，一或兩個或各CDR序列 一致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、 96 ' 97、98 或 99% ° 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF拮抗劑，其具有 與來自 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之 CDR1 序 列至少50%—致之CDR1序列。在一實施例中，CDR序列一 致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、 97、98或99%。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所述之 條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白酶）具 有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF拮抗劑，其具有 與來自 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之 CDR1 序 列至少500/。一致之CDR2序列。在一實施例中，CDR序列一 致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95' 96、 97、98或99%。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所述之 條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白酶）具 有抗性。 在一態樣中’本發明提供一種抗VEGF拮抗劑，其具有 與來自 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 131458.doc •17· 200911832 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之 CDR1 序 列至少50%—致之CDR3序列。在一實施例中，CDR序列一 致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、 97、98或99%。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所述之 條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白酶）具 有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF拮抗劑，其具有 與來自 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之 CDR1 序 列至少50% —致之CDR1序列及與來自DOM1 5-26-595、 DOM15-26-591 、DOM15-26-589 、DOM15-26-588 ' DOM1 5-26-555 或 DOM1 5 -10-11 之 CDR2 序列至少 50% —致 之CDR2序列。在一實施例中，一或兩個CDR之CDR序列 一致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、 96、97 ' 98或99%。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所 述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白 酶）具有抗性。 在一態樣中’本發明提供一種抗VEGF拮抗劑，其具有 與來自 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM1 5-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之 CDR1 序 列至少50%—致之CDR1序列及與來自DOM1 5-26-595、 DOM15-26-591 、 DOM15-26-589 、 DOM15-26-588 、 DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之 CDR3 序列至少 50%—致 之CDR3序列。在一實施例中，一或兩個CDR之CDR序列 131458.doc -18- 200911832 一致性為至少 55、60、65、70、75、8〇、85、9〇95、 96、97、98或99%。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所 述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白 每）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種抗VE(}F拮抗劑，其具有 與來自 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之 CDR2序 列至少50。/。一致之CDR2序列及與來自d〇M1 5-26-595、 DOM15-26-591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、 DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之 CDR3 序列至少 50。/。一致 之CDR3序列。在一實施例中，一或兩個cdr之CDR序列 一致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、 96 9 7、9 8或9 9 %。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所 述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白 酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF拮抗劑，其具有 與來自 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之 CDR1 序 列至少50% —致之CDR1序列及與來自DOM15-26-595、 DOM15-26-591 、 DOM15-26-589 、 DOM15-26-588 > DOM15-26-5 55 或 DOM15-10-11 之 CDR2 序列至少 50%—致 之 CDR2 序列及與來自 DOM15-26-595、DOM15-26-591、 DOM15-26-589 、 DOM15-26-588 、 DOM15-26-555 或 001^15-10-11之〇0113序列至少50%—致之。0113序列。在 131458.doc •19- 200911832 一實施例中，一或兩個或各CDR之CDR序列一致性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所述之條件下對 蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF拮抗劑，其包含 免疫球蛋白單一可變區域，該免疫球蛋白單一可變區域包 含來自 DOM15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之相應 CDR 序歹ij 之 CDR1、CDR2 及 / 或 CDR3(例如，CDR1、 CDR2、CDR3、CDR1 及 CDR2、CDR1 及 CDR3、CDR2 及 CDR3或CDR1、CDR2及CDR3)序列。該拮抗劑可（例如）在 —組如本文中所述之條件下對蛋白酶（例如一或多種如本 文中所述之蛋白酶）具有抗性。 在一態樣中，本發明提供一種抗VEGF拮抗劑，其與選 自 DOM15-26-595、DOM15-26-591 、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 之拮抗劑 競爭以結合VEGF。因此，該拮抗劑可結合與001^15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、 DOM15-26-555或DOM 15-10-11相同之抗原決定基或其可 結合重疊抗原決定基。在一實施例中，拮抗劑包含免疫球 蛋白單一可變區域，該可變區域具有選自以下各胺基酸序 列之胺基酸序列：（i)為1 5-26品系之變異體的胺基酸序 列，其選自（a)與DOM15-26-595之胺基酸序列至少97°/〇 — 致之胺基酸序列，（b)與DOM15-26-591之胺基酸序列至少 131458.doc -20- 200911832 98%—致之胺基酸序列，（c)與d〇mi5-26-589之胺基酸序 列至少98。/〇—致之胺基酸序列，（d)與D〇Ml5-26-588之胺 基酸序列至少98%—致之胺基酸序列，（e)與d〇M15-26-555之胺基酸序列至少99%—致之胺基酸序列；以及（“）與 DOM 1 5-1 0-11之胺基酸序列至少98% 一致之胺基酸序列。 在一實施例中’一致性。/。為至少98或99%。在一實施例 中’該可變區域係選自DOM1 5-26-595、DOM1 5-26-591、 DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM1 5-10-11。該拮抗劑可（例如）在一組如本文中所述之 條件下對蛋白酶（例如一或多種如本文中所述之蛋白酶）具 有抗性。在一實施例中，拮抗劑為對VE(3F具有結合特異 性之抗體或其抗原結合片段，諸如單價抗原結合片段（例 如，scFv、Fab、Fab'、dAb)。拮抗劑之其他實例為本文中 所述之結合VEGF之配位體。配位體可包含合適格式之對 VEGF具有結合特異性之免疫球蛋白單一可變區域或區域 抗體（dAb)或該dAb之互補判定區。在一些實施例中，配位 體為基本上由對VEGF具有結合特異性之免疫球蛋白單一 可變區域或dAb組成或由其組成之dAb單體。在其他實施 例中，配位體為包含合適格式（諸如抗體格式）之dAb(或 dAb之CDR)的多肽。 該等VEGF配位體（例如dAb)可經編排格式以具有較大流 體動力學尺寸，例如藉由連接PEG基團、血清白蛋白、轉 鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少其轉鐵蛋白結合部分、抗體 Fc區或藉由接合抗體區域。舉例而言，⑴結合vegf，（⑴ 131458.doc -21 - 200911832 拮抗VEGF介導之信號轉導之激活及（iii)不抑制VEGF與其 受體（諸如dAb單體）之結合的藥劑（例如，多肽、可變區域 或拮抗劑）可編排格式為抗體之較大抗原結合片段（例如， 經編排格式為 Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’）2、IgG、scFv)。 亦可藉由使VEGF結合劑（拮抗劑、可變區域）與結合如本文 中所述之增加活體内半衰期之抗原或抗原決定基的結合區 域（例如，抗體或抗體片段）接合或連接來增加配位體之流 體動力學尺寸及其血清半衰期（參見，WO 200603 8027之附 錄1，其整體係以引用之方式併入本文中）。舉例而言，可 使VEGF結合劑（例如，多肽，例如dAb)與抗血清白蛋白或 抗新生兒Fc受體抗體或抗體片段（例如，抗S A或抗新生兒 Fc 受體 dAb、Fab、Fab，或 scFv)或抗 SA親和體（affibody)或 抗新生兒Fc受體親和體接合或連接。 用於本發明之VEGF結合配位體之合適白蛋白、白蛋白 片段或白蛋白變異體的實例係描述於WO 2005/077042A2 及WO 2006038027中，其整體係以引用之方式併入本文 中〇 在貫穿該揭示内容所述之本發明之其他實施例中，代替 在本發明之拮抗劑或配位體中使用”dAb”，涵蓋熟練的使 用者（addressee)可使用的區域包含結合VEGF之dAb之 CDR(例如，接枝於合適蛋白質骨架或骨幹上之CDR，該 骨架或骨幹例如親和體、SpA骨架、LDL受體A類區域或 EGF區域）或可為包含VEGF結合位點之蛋白質區域（例如其 中該區域係選自親和體、SpA區域、LDL受體A類區域或 131458.doc -22- 200911832 滞區域）。因此，揭示内容整體應解釋為提供使用 域代替dAb之拮抗劑、配位體及方法之揭示内容。…》 本發明之多肽、免疫球蛋白單一可變區域及拮 一或多種以下蛋白酶：絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶：
酶白酶、硫醇蛋白酶、基質金屬蛋白酶、緩肽酶 ⑽羧肽轉A、緩肽_)、騰蛋白酶、騰凝乳蛋白酶、田 蛋白酶、木瓜酶、彈性蛋白酶、白血球酶（ieuk〇zyme)、: 酶、凝血酶、纖溶酶、組織蛋白酶(例如組織蛋白酶⑺、 :白酶⑽如蛋白酶卜蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白 酶、凝乳酶、腸激酶、卡斯蛋白酶（easpase)(例如卡斯蛋白 酶1卡斯蛋白酶2、卡斯蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋 白_、卡斯蛋白酶12、卡斯蛋白酶13)、妈激活蛋白酶、 2果蛋白酶、梭菌蛋白酶、獼猴桃蛋白酶、鳳梨酶及分 轉在特疋實施例中，蛋白酶為胰蛋白酶、彈性蛋白酶 或白血球酶。蛋白酶亦可由生物提取物、生物 生物製劑提供。在—實施例中，蛋白酶為可見於一或多= 乂下各物中之蛋白酶：痰、黏液(例如胃黏液 '鼻黏液、 支氣管黏液）、支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻衆、肺提取 目=腺：取物、胃液、唾液。在-實施例中’蛋白酶為 或眼淚中可見之蛋白酶。眼睛中可見之該等蛋白 轉之實例包括卡斯蛋白酶、释激活蛋白酶、基質金屬蛋白 酶、去整合素、金屬蛋白酶（adam)及具有血小板反應蛋 > 土兀之ADAM、蛋白體、組織型纖溶酶原激活劑、分泌 酶、組織蛋白酿R J ^ , ' 酶及D、胱蛋白酶c、絲胺酸蛋白酶 131458.doc -23- 200911832 PRSSl、泛素蛋白體通路（upp)。在一實施例中，蛋白酶 為非細菌性蛋白酶。在一實施例中，蛋白酶為動物、例= 哺乳動物、例如人類蛋白酶。在一實施例中，蛋白酶為GI 道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如人類中可見之⑴道蛋白酶 或肺組織蛋白酶。此處所列之該蛋白酶亦可用於本文中所 述之包括將庫之譜系暴露於蛋白酶中之方法中。 在一態樣中，本發明提供一種包含VEGF結合位點之蛋 白酶抗性免疫球蛋白單一可變區域’其中該可變區域在以 下情況下對蛋白酶具有抗性： (I) 在37°c下與至少10微克/毫升之濃度（c)之蛋白酶一起 培養至少1小時之時間（t);或 (II) 在30°C下與至少40微克/毫升之濃度之蛋白酶一 起培養至少1小時之時間⑴。在一實施例中，蛋白酶(例如 胰蛋白酶）與可變區域之比率（以莫耳/莫耳計）為8,〇〇〇比 80,000蛋白酶：可變區域，例如當C為10微克/毫升時，比 率為800比80,000蛋白酶：可變區域；或當C4C，為1〇〇微 克/毫升時，比率為8,000比80,000蛋白酶：可變區域。在 一實施例中，蛋白酶（例如胰蛋白酶）與可變區域之比率（以 重重量、例如微克/微克計）為16,000比160,〇〇〇蛋白酶： 可變區域，例如當（：為10微克/毫升時，比率為比 16〇,〇〇〇蛋白酶：可變區域；或當esc，為1〇〇微克/毫升 時’比率為1，6000比160,000蛋白酶：可變區域。在一實施 例中’濃度（c或c，）為至少1〇〇或1〇〇〇微克/毫升蛋白酶。在 一實施例中’濃度(^或⑺為至少1〇〇或1〇〇〇微克/毫升蛋白 131458.doc -24· 200911832 酶。當與肽或多肽之譜系或庫一起作用時， 適於所使用之蛋白酶蛋白水解活性之條件的描述^如中之 Ww參數）。料料可供㈣料免 域之蛋白酶抗性之條件使用。在-實施例t，：：： 約為Η或24小時或隔夜(例如，約⑽小時)二= 7中，該可變區域在條件（i)T^性且濃 或-微克/毫升蛋白酶且時間⑴心、為二為 中，該可變區域在停件（ii) 實把例 微券/臺W 濃度（C,)為或約為4〇 微克宅升蛋白酶且時間⑴為或約為3小時。在 中，該蛋白酶伟潠自聴；ώ # 實施例 膜酿/ ^酶、彈性蛋白酶、白血球酶及 胰_。在一實施例中， 中，蛋白酶At目 ⑽為騰蛋白酶。在-實施例 中蛋白轉為可見於一或多種以下各物中之蛋白酶··瘦、 黏液（例如胃黏液、直袭汸 .^ ^ # 黏液）、支氣管肺泡灌 洗液、肺組織勾聚、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液 或眼淚或眼睛。力 A .,. V. 由1夕疋#在一實施例中，蛋白酶為眼睛及/或眼淚 蛋白酶。在-實施例中，蛋白酶為非細菌性蛋白 酶。在—實施例中’蛋白酶為動物、例如哺乳動物、例如 人類蛋白酶。在—眘& 在實施例中，蛋白酶為GI道蛋白酶或肺组 織蛋白酶’例如人類中可見之⑴道蛋白酶或肺組織蛋白 酶。此處所列之該蛋白酶亦可用於本文中所述之包括將庫 之譜系暴露於蛋白酶中之方法中。 ，在一實施例中，該可變區域對騰蛋白酶及/或至少-種 選自彈性蛋白酶、白血球酶及胰酶之其他蛋白酶具有抗 性。舉例而言，抗性係針對胰蛋白酶及彈性蛋白酶；胰蛋 131458.doc •25· 200911832 白酶及白血球酶；胰蛋白酶及胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白 酶及白a球酶；騰蛋白酶、彈性蛋白酶及騰酶；騰蛋白 酶、彈性蛋白酶、胰酶及白血球酶 畔驭胰蛋白酶、胰酶及 白血ί求酶。 在-實施例中’可《域當在條件⑴或（Η)下培養時（例 如）以…至！^、例如1〇8至1〇12個複製單位⑽染性病毒體） 之嗟菌體庫規模呈現於噬菌體上。
在一實施例中 異性結合VEGF， ，該可變區域在條件（i)或（ii)下培養後特 例如，使用BiaC〇re™4ELISA(例如，噬 菌體ELISA或單株噬菌體ELISA)評估。 在一實施例中，本發明之可變區域特異性結合蛋白質A 或蛋白質L。在-實施例中，在條件⑴或⑴）下培養後出 現與蛋白質A或L之特異性結合。 在一實施例中，本發明之可變區域（例如）在條件⑴或（Η) 下培養後在ELISA(例如噬菌體ELISA或單株噬菌體EUSA) 中可具有至少0.404之〇D450讀數。 在一實施例中，本發明之可變區域（例如）在條件⑴或（ii) 下培養後在凝膠電泳中展現（大體上）單一條帶。 在某些實施例中，本發明提供一種VEGF拮抗劑，其為 包含結合VEGF之本發明之第一 dAb及具有與第一 dAb相同 或不同結合特異性之第二dAb的雙特異性配位體。第二 dAb可結合選自以下各之靶：ap〇E、Apo_SAA、BDNF、 心營養素-1、CEA、CD40、CD40配位體、CD56、CD38、 CD138、EGF、EGF受體、ENA_78、嗜酸性粒細胞趨化因 131458.doc -26 - 200911832 子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、次級淋巴組織趨化因子 (Exodus)-2、FAPtx、FGF-酸性、FGF-鹼性、纖維母細胞生 長因子-10、FLT3配位體、弗拉塔凱（FractaikinexcX3C)、 GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βι、人類血清白蛋白、胰 島素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-la、IL-Ιβ、IL-1 受體、 IL-1 受體 1 S、IL-2、IL_3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72 a.a.)、IL-8(77 a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素 α、抑 制素β、IP-10、角化細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦體 素、LIF、淋巴細胞趨化因子、穆勒氏抑制物質（Mullerian inhibitory substance)、單核細胞集落抑制因子、單核細胞 引誘蛋白、M-CSF'MDC(67a.a.)、MDC(69a,a.)、；^lCP-l(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a)、 MDC(69 a.a.)、MIG、ΜΙΡ-1α、ΜΙΡ-1β、ΜΙΡ-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制劑因子-l(MPIF-l)、NAP-2、 神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制 瘤素 Μ、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、 RANTES ' SDFla、SDFip、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-cx、TGF-β、TGF-02、TGF-P3、腫瘤 壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、 GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、 HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、_ 131458.doc -27- 200911832 粉樣蛋白（例如，澱粉樣α)、MMP12、PDKl、IgE、IL-13Ral、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、 CD4、CDlltx、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、 CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、 TGFb 、 CCL2 、 CCL18 、 CEA 、 CR8 、 CTGF 、 CXCL12(SDF-1)、凝乳酶、FGF、弗林蛋白酶（Furin)、内 皮素-1、嗜酸性粒細胞趨化因子（例如，嗜酸性粒細胞趨化 因子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、嗜酸性粒細胞趨化因 子-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、 整合素、L-選擇素、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、 嗜中性彈性蛋白酶、骨橋蛋白、OX-40、PARC、PD-1、 RANTES、SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、凝血 酶、Tim-1、TNF、TRANCE、類肤蛋白酶、VEGF、VLA-4、 VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、 CCR8、ανβ6、ανβ8、cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例 如，澱粉樣a)、MMP12、PDK1及IgE。 在一實例中，雙特異性配位體包含結合VEGF上之第一 抗原決定基之第一 dAb及結合不同靶上之抗原決定基之第 二dAb。在另一實例中，第二dAb結合血清白蛋白上之抗 原決定基。 在其他實施例中，該配位體為多特異性配位體，其包含 對VEGF具有結合特異性之第一抗原決定基結合區域及具 有不同於第一抗原決定基結合區域之結合特異性之至少另 131458.doc -28- 200911832 一抗原決定基結合區域。舉例而言，第一抗原決定基結合 區域可為結合VEGF之dAb或可為包含結合VEGF之dAb之 CDR(例如，接枝於合適蛋白質骨架或骨幹之CDR，該骨 架或骨幹例如親和體、SpA骨架、LDL受體A類區域或EGF 區域）的區域或可為結合VEGF之區域，其中該區域係選自 親和體、SpA區域、LDL受體A類區域或EGF區域。 在某些實施例中，多肽、拮抗劑、配位體或抗VEGF dAb單體之特徵在於一或多個以下特徵：1)以如由表面電 漿共振所測定50 nM至20 pM之解離常數（Kd)及5X10·1至 lxlO、·1之Koff速率常數自人類VEGF解離；2)以500 nM至 50 pM之IC50抑制VEGF與VEGFR2之結合；3)在標準 HUVEC細胞檢定中以500 nM至50pM之ND50中和人類 VEGF ; 4)在標準細胞檢定中以S 100 nM之ND50拮抗VEGF 之活性；5)在小鼠異種移植模型中抑制或降低腫瘤生長； 6)抗聚集；7)當表現於大腸桿菌或畢赤酵母屬物種（例如， 馬斯德畢赤酵母）或諸如CHO之哺乳動物細胞表現系統中 時，以至少約0.5 mg/L之量分泌；8)顯露可逆性；或9)在 治療、抑止或預防發炎性疾病中具有功效。關於適用於條 件（1)至（9)之檢定及測試及參數之詳情，參考WO 2006038027 及 W0 2006059108 及 WO 2007049017，且該等 專利以引用之方式併入本文中。 在特定實施例中，多肽、拮抗劑、配位體或dAb單體以 如由表面電漿共振所測定50 nM至20 pM之解離常數（Kd)及 5χ10-1至lxl〇-7 s·1之Koff速率常數自人類VEGF解離；以500 131458.doc -29- 200911832 nM至50 PM之IC50抑制卿續VEGFR2(vegf受體2)之結 合’·在標準HUVEC細胞檢定中以5〇〇 nM^5〇pM之则时° 和人類VEGF。在其他特定實施例中，多&、拮抗劑、配 位體或⑽單體以如由表面電將共振所測定50囊至20 pM 之解離常數（KdR5xmlxlG—、·，之率常數自人類 VEGF解離；以500爾至5〇州之咖抑制ve_ VEGFR2之結合。 、 本發明之蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單—可變區域及 枯抗劑在治療、預防及診_如人類之哺乳動物之疾病或 病狀中具有效用。其尤其具有作為向諸如人類之患者投與 時很可能會遇到蛋白酶之藥物之基質的效用。舉例而古， 當向GI道投與(例如，經口、舌下、直腸投與)多肽、免疫 球蛋白早-可變區域及拮抗劑時，在此狀況下，其可能在 上胃腸道、下胃腸道、口腔、胃、小腸及大腸中之一或多 處受蛋白酶侵襲。因此，—個實施例提供—種待以經口、
舌下或直腸方式向患者之GI道投與以治療及/或預防患者 之疾病或病狀的蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單—可變區 :或拮抗劑。舉例而言，經口向患者(例如，人類患旬投 藥以治療及/或預防VEGF介導之病症或疾病，諸如癌症， 例如實體腫瘤、發炎及/或自體免疫疾病。 在另一實例中，當向肺組織（例如，肺或氣管）投與（例 如’藉由吸入或鼻内方 < )多狀、可變區域或括抗劑時其 很可能會遇到蛋白酶。因此，—個實施例提供藉由吸人或 鼻内向患者（例如人類）之肺組織投與之方式向該患者投與 131458.doc -30 - 200911832 蛋白酶抗性多月太、免疫球蛋白單一可變區域或拮抗劑以治 療及/或預防患者之疾病或病狀。該病狀可為哮喘（例如， 過敏性哮喘）、COPD、流感或w〇 2〇〇6〇38〇27中所揭示之 任何其他肺疾病或病狀，WO 2006038027係以引用之方弋 併入本文中。在另—實例中，當向患者之眼睛投與⑼ 如’以眼球内注射方式或以滴眼劑形式)多肽、可變區域 或拮抗劑時很可能會遇到蛋白酶。因…個實施例提供 以眼睛方式向患者（例如人類）投與蛋白酶抗性多肽、免疫 求蛋白單彳變區域或拮抗劑以治療及/或預防患者之疾 病或病狀(例如，眼睛之疾病或病狀)。投藥可為以滴眼劑 形式或藉由注射至眼睛、例如玻璃體液中而局部向眼睛投 與。 又 本發明之-實施例提供-種待（例如）以滴眼劑或凝膠形 式或（例如）以植入物之形式向眼睛投與（例如）以治療及/或 =防眼睛之VEGF介導之病症或疾病（諸如AMD(年齡相關 黃斑退化))的蛋白酶抗性多&、免疫球蛋白單一可變區域 或拮抗劑。 實例中，當向肺組織（例如，肺或氣管）投與 如，藉由明 λ JU、θ t , 或鼻内方式）多肽、可變區域或拮抗劑時很 可^ :遇到蛋白酶。因Λ，—個實施例提供藉由吸入或鼻 内向患者（例如人類）之肺組織投與之方式向患者投與本文 志W任何多肽、可變區域或拮抗劑以治療及/或預防 心者之疾病或病狀。該病狀可為癌症（例b，實體腫瘤， 例如肺癌、妹m古姐十, Μ °直腸癌、頭頸部癌、胰腺癌、乳癌、前列 131458.doc 200911832 腺癌或卵巢癌）、哮喘（例如，過敏性 2006038027中所揭示之任何 叩或卯
’、 肺疾病或病狀，wo 2006038027係以引用之方式併入 WO 本文中。本發明之枯拍· 劑、多肽及免疫球蛋白單一可變區域可展現升高或_較 =熔融溫度（Tm)，從而提供增強之穩定性 結合亦可為或另外為结抗劑、多肽及可變區域之特/ = / =㈣中之—或多個以及蛋白酶抗性使得拮抗劑、可變區 域及多狀可承擔作為諸如人類之哺乳動物之藥物的用途， (例如)對於⑽或肺組織投藥或向眼睛的投藥情況而言， 尤其可能會遇到蛋白酶。 因此，在-態樣中，本發明提供一種用於經口傳遞之 VEGF拮抗劑。在一態樣中，本發明提供一種用於向患者 之GI道傳遞之VEGF抬抗劑。在—態樣中，本發明提供一 種VEGF拮抗劑在製造用於經口傳遞之藥物中的用途。在 一態樣中，本發明提供一種抗劑在製造用於向患 者之Giif傳遞之藥物中的用途。在一實施例中，該可變區 域對胰蛋白酶及/或至少一種選自彈性蛋白酶、白血球酶 及胰酶之其他蛋白酶具有抗性。舉例而言，抗性係針對胰 蛋白酶及彈性蛋白酶；腴蛋白酶及白血球酶；騰蛋白酶及 胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶及白血球酶；胰蛋白酶、彈 性蛋白酶及胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰酶及白血球 酶’·或胰蛋白酶、胰酶及白企球酶。 在一態樣中，本發明提供一種用於肺傳遞之VE(}f拮抗 劑。在一態樣中，本發明提供一種VEGF拮抗劑在製造用 131458.doc -32- 200911832 於肺傳遞之藥物中的用途。在—態樣中 曰 VEGF拮抗劑在製造用 發明提供一種 途在-實IS 者之肺傳遞之藥物中的用 途。在實施例中，該可變區域對白血球酶具有抗性。 在L樣中，本發明提供—種經口傳遞藥物或向患者之 GI道或患者之肺或肺組織或眼睛傳遞藥物的方法，其中铁 方法包含向該患者投與醫藥學 、 ^ 于另双1心本發明之VEGF拮 抗劑。 。 在-態樣中’本發明提供—種用於治療及/或預防例如 實體腫瘤之癌症的本發明之VEGF拮抗劑。在一實施例 中’實體腫瘤係選自由肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、胰 腺癌、乳癌、削列腺癌或卵巢癌組成之群。 在一態樣中’本發明提供-種用於治療及/或預防灰管 增生性疾病的本發明<VEGF拮抗劑，該疾病例如血管生 成、動脈粥樣硬化及眼睛中之血管增生性疾病諸如 AMD(年齡相關黃斑退化）。 在一態樣中，本發明提供一種用於治療及/或預防發炎 性病狀之本發明之VEGF拮抗劑。在一態樣中，本發明提 供種VEGF拮抗劑在製造用於治療及/或預防發炎性病狀 之藥物中的用途。在一實施例中，該病狀係選自由關節 炎、多發性硬化症、發炎性腸疾病及慢性阻塞性肺病組成 之群。舉例而言，在一態樣中，本發明提供一種用於治療 及7或預防呼吸道疾病之VEGF拮抗劑。在一態樣中，本發 明提供一種VEGF拮抗劑在製造用於治療及/或預防呼吸道 疾病之藥物中的用途。舉例而言，該呼吸道疾病係選自由 131458.doc •33· 200911832 以下各病組成之群：肺發炎、慢性阻塞性肺病'哮喘、肺 炎、過敏性肺炎、與嗜伊紅金球増多相關之肺浸潤、環境 肺病、肺炎、支氣管擴張、囊性纖維化，肺病、原發 性肺動脈高壓、肺血栓栓塞、胸膜H、縱隔奮亂、隔膜 紊礼、換氣不足、換氣過度、睡眠呼吸暫停、急性呼吸碧 迫症候群、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗宿主疾 病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏症、石棉沈著病、曲黴菌 腫、曲黴菌病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣腫、嗜 伊紅血球肺炎、特發性肺纖維化、侵襲性肺炎球菌疾病' 流感、非結核性分枝桿菌病、胸膜積液、塵肺病、肺抱子 蟲病、肺炎、肺放線菌，病、肺泡蛋白沉著症、肺炭殖、肺 水腫、肺栓子、肺發炎、肺組織細胞增多病χ、肺動脈高 血壓、肺諾卡氏菌病（pulmonary n〇cardi〇sis)、肺結核、肺 靜脈閉塞疾病、類風濕性肺病、肉狀瘤病及韋格納肉牙腫 病（Wegen心granul_t〇sis)。舉例而言該疾病為慢性 阻塞性肺病（C0PD)。舉例而言，該疾病為哮喘。 —包含抑制VEGF之藥劑的本發明之拮抗劑（例如，其中該 :劑係選自由以下各物組成之群：抗體片段(例如，F吐片 #又Fab片段、Fv片段（例如，scFv、雙硫鍵鍵結之Η)、 F(ab’)2片段、dAb)、配位體及⑽單體及多聚體（例如，同 =或異το二聚體））可使用任何合適方法局部向個體之組織 ，器官（例如肺組織（例如，肺））或眼睛投與。舉例而言、， 樂劑可經由吸入或鼻内投藥局部向肺組織投與。對於吸入 或鼻内投_，VEGF之拮抗劑可使用喷霧器、吸人器、霧 131458.doc -34- 200911832 化器、氣霧化器（aerosolizer)、彌霧器（mister)、乾於吸入 器、定劑量吸入器、定劑量喷霧器、定劑量彌霧器： 篁霧化器或其他合適吸人器或鼻内傳遞裝置投與。因此， 在-實施例t，本發明提供含有VEGF^劑之肺傳遞裝 置。在一實施例中，該裝置為吸入器或鼻内傳遞裝置。、 几在-實施例中，藥劑可經由可植人傳遞裝置局部向眼睛 投與’在-實施例中，本發明提供含有ve 劑之可植入傳遞裝置。 σ 在一態樣中，本發明提供一種包含¥£(^拮抗劑之口服 調配物。調配物可為鍵劑、丸劑、膠囊、液體或糖聚。在 一態樣中，本發明提供包含VEGF拮抗劑之用於向眼睛傳 遞之眼用調配物，該調配物例如可為液體滴眼劑或凝膠。 在一實施例中，本發明提供一種用於向肺傳遞之肺調配 物，其中該調配物包含粒度範圍小於5微米、例如小於 4-5、4、3.5或3微米之本發明之拮抗劑、多肽或可變區域 (例如，當在例如pH 6.5至8.0、例如pH 7至7.5、例如pH 7 或PH 7.5之伯瑞坦.魯賓遜（Britt〇n_R〇bins〇n)緩衝液中 時）。 在一實施例中’提供一種pH 6.5至8.0、例如7至7.5、例 如7、例如7.5之本發明之調配物及組合物。 本發明之任何態樣之可變區域可具有5(rc或至少55〇c或 至少60。(：或至少65。(：或至少70°c之Tm。本發明之拮抗劑、 用途、方法、裝置或調配物可包含該可變區域。 在本發明之一態樣中，本發明之多肽、可變區域、拮抗 Ϊ31458.doc -35- 200911832 劑、組合物或調配物在37它至50勺下在伯瑞坦-魯賓遜或 PBS缓衝液中培養（多狀或可變區域之濃度為i mg㈣14天 後大體上為穩定的。在一實施例中，至少65、70、75、 80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、 97、 98、99%之多肽、拮抗劑或可變區域在37。[下進行該 培養後仍不聚集。在一實施例中，至少65、7〇、乃、⑽、 85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、 99%之多肽或可變區域在37。〇下進行該培養後仍為單 體。在一實施例中，至少5、1〇、15、2〇、25、3〇、h、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、 88、90、91、92、93、94、95、96、97、98 ' 99% 之多 肽、拮抗劑或可變區域在50。(：下進行該培養後仍不聚集。 在一實施例中’至少 5、10、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99〇/〇之多肽或可 變區域在50°C下進行該培養後仍為單體，在一實施例中， 在任何一個該等培養後未見多肽、可變區域、拮抗劑之聚 集。在一實施例中，多肽或可變區域之…在；^^下在伯瑞 坦-魯賓遜緩衝液中在i mg/ml之多肽或可變區域濃度下培 養後仍未變化或大體上未變化。 在本發明之一態樣中，本發明之多肽、可變區域、拮抗 劑、組合物或調配物在4〇C下在伯瑞坦-魯賓遜或pbs緩衝 液中在pH 7至7.5(例如pH 7或pH 7.5)下培養（多肽或可變區 域之濃度為100 mg/ml)7天後大體上為穩定的。在—實施 131458.doc -36- 200911832 例中’至少 95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99 或99·5°Λ之多肽、拮抗劑或可變區域在該培養後仍不聚 集。在一實施例中，至少95、95.5、96、96.5、97、 97.5、98、98.5、99或99.5%之多肽或可變區域在該培養後 仍為單體。在一實施例中，在任何一個該等培養後未見多 肽、可變區域、拮抗劑之聚集。 在本發明之一態樣中，本發明之多肽、可變區域、拮抗 劑、組合物或調配物（例如）在室溫、2〇。〇或37它下（例如） 在噴射喷霧器（例如Pari LC+杯）中喷霧（例如，多肽或可變 區域之濃度為40 mg/ml) 1小時後大體上為穩定的。在一實 施例中，至少 65、70、75、8〇、85、86、87、88、9〇、 91、92、93、94、95、95.5 96、96.5、97、97.5、98、 98.5、99或99.5%之多肽、拮抗劑或可變區域在該噴霧後 仍不聚集。在一實施例中，至少65、7〇、75、8〇、85、 86、87、88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、 96.5、97、97.5、98、98.5、99或99 5%之多肽或可變區域 在該噴霧後仍為單體。在-實施例中，在任何—個該喷霧 後未見多肽、可變區域、拮抗劑之聚集。 在一態樣中，本發明提供一種經分離或重組核酸，其編 石馬包含本發明之任何態樣之免疫球蛋白單—可變區域之多 肽或編碼本發明之任何態樣之多肽、拮抗劑或可變區域。 在-態樣中’本發明提供一種包含核酸之载體。在一態樣 中，本發明提供—種包含核酸或載體之宿主細胞。在一態 樣中’本發明提供一種產生包含免疫球蛋白單一可變區域 131458.doc -37- 200911832 之多肽之方法’該方法包含將宿主細胞維持在適於該核酸 或該載體表現之條件下，藉此產生包含免疫球蛋白單一可 變區域之多肽。該方法可進一步包含分離多肽、可變區域 或拮抗劑及視情況產生比經分離多肽、可變區域或拮抗劑 具有改良之親和力及/或ND50的變異體（例如，突變變異 體）。此項技術已知改良免疫球蛋白單一可變區域之結合 親和力之技術，例如親和力成熟技術。
在一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發 明之，何態樣之免疫球蛋白單—可變區域、多肽或枯抗劑 及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。 在-實施例中，本發明之任何態樣之免疫球蛋白單一可 變區域或拮抗劑包含抗體恆定區$，例如抗體Fc，視情況 其中Fc之N_末端連接於（視情況直接連接於）可變區域之c_ 末端。合適卜之胺基酸序列展示於圖52b中。 本發明之多肽或可變區域可為 在一態樣’本發明為—種選擇蛋白酶抗性肽或多肽、例 如血管内皮生長因子（VEGF)之拮抗劑（例如抗vegf 之方法。該方法包含提供肽或多肽譜系，在適於蛋白酶活 性之條件下使該譜系與蛋白酶組合，心收具有想要之生 物活性之肽或多肽，μ 遁视 猎此選擇蛋白酶抗性肽或多肽。 通常將5普糸及蛋白美 京臼酶培養至少約30分鐘之時間。在方法 中可使用任何想要之蛋白故 要之蛋白酶，諸如一或多種以下蛋白酶： 絲胺酸蛋白酶、半脱胺酸疋 千朊胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶、硫醇 蛋白酶基質金屬蛋白酶、羧肽酶(例如羧肽酶A、羧肽酶 131458.doc -38- 200911832 B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白 蛋白酶、白血球酶、騰酶1㈣ 木瓜酶、彈性 (例如組織蛋白酶G)、蛋白酶(例如蛋=、：織蛋白酶 白酶3)、法埶喆疋a故 贫曰崎1、蛋白酶2、蛋 )曰熱囷蛋白酶、凝乳酶、腸 如卡斯蛋白U斯蛋白酶2、 卡斯蛋白轉（例 ^ ^ 卞斯蛋白酶4、+邶疋a 酶5、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶12、卡斯蛋卡二蛋白 激活蛋白酶、無花果蛋白酶、 ，丐 絡η 困货白酶、獼猴桃蛋白 '%、 \ 轉、鳳梨酶及分離酶。在特定實施例中1白酶為姨蛋白 酶、弹性蛋白酶或白血球酶。蛋白酶亦可由生物提取物、 生物組織勻漿或生物製劑提供。必要時，該方法進一步包 含在培養完成後向譜系與蛋白酶之組合中添加蛋白酶抑制 劑。 在一些實施例中，基於結合活性回收具有想要之生物活 性之肽或多肽。舉例而言，可基於結合諸如蛋白質A、蛋 白質G或蛋白質L之一般配位體回收肽或多肽。結合活性 亦可為與靶配位體之特異性結合。例示性靶配位體包括
ApoE、Apo-SAA、BDNF、心營養素-i、CEA、CD40、 CD40 配位體、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF 受體、 ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因 子-2、次級淋巴組織趨化因子（Ex〇dus)-2、FAPa、FGF-酸 性、FGF-鹼性、纖維母細胞生長因子_ 1 〇、FLT3配位體、 弗拉塔凱（CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βΙ、人 類 jk 清白蛋白、胰島素、IFN_y、IGF-I、IGF-Π、IL-la、 IL-Ιβ、IL-1 受體 ' IL-1 受體 1 型、IL-2、IL-3、IL-4、IL- 131458.doc •39· 200911832 5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL- 10、 IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素a、抑制素β、IP-10、角化細胞生長因 子-2(KGF-2)、KGF、痩體素、LIF、淋巴細胞趨化因子、 穆勒氏抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘 蛋白、M-CSF、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、MCP_ l(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a)、 MDC(69 a.a·)、MIG、ΜΙΡ-Ια、ΜΙΡ-1β、ΜΙΡ-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髓祖細胞抑制劑因子-l(MPIF-l)、NAP-2、 神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制 瘤素 Μ、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、 RANTES、SDFla、SDFlp、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-a、TGF-β、TGF-P2、TGF-P3、腫瘤 壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 11、 TNIL-l、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、 GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、 HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、澱 粉樣蛋白（例如，澱粉樣（x)、MMP12、PDKl、IgE、IL-13Ral、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23 IL-23R、IL-25、CD2、CD4、 CDlla、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、 CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、 131458.doc -40- 200911832 凝乳酶、FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性粒細胞趨化 因子（例如，嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化 因子-2、嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、GM-CSF、ICAM-1、 ICOS、IgE、IFNa、1-309、整合素、L-選擇素、MIF、 MIP4、MDC、MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白酶、骨橋 蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、 siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、 TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、 CCR2 、 CCR3 、 CCR4 、 CCR5 、 CCR7 、 CCR8 、 ανβ6 、 ανβ8、cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例如，澱粉樣 a)、MMP12、PDK1 及 IgE。 在特定實施例中，藉由淘選回收肽或多肽。 在一些實施例中，譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 系統可為噬菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、嘌呤黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或共 價呈現。例示性呈現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編 碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施例中，呈現 系統包含可複製之基因組。 在一些實施例中，呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 言，噬菌體可為fd、M13、λ、MS2或T7。在特定實施例 中，噬菌體呈現系統為多價系統。在一些實施例中，肽或 多肽呈現為ρΙΠ融合蛋白。 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼具有想要之 生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中，藉由嘻菌 131458.doc -41 - 200911832 體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 在一些實施例中，譜系為免疫球蛋白單一可變區域講 系’其例如結合血管内皮生長因子（VEGF)且為血管内皮生 長因子（VEGF)之拮抗劑。在特定實施例t，免疫球蛋白單 一可變區域為重鏈可變區域。在更特定實施例中，重鏈可 變區域為人類重鏈可變區域。在其他實施例中，免疫球蛋 r 白單可變區域為輕鏈可變區域。在特定實施例中，輕鏈 可變區域為人類輕鏈可變區域。 在另一態樣中，本發明為一種自肽或多肽譜系選擇以高 親和力結合乾配位體（例如，VEGF)之狀或多狀之方法。: 方法包含提供肽或多肽譜系，在適於蛋白酶活性之條件下X 使譜系與蛋白酶組合’及回收結合乾配位體之肽或多肽。 通常將譜系及蛋白酶培養至少⑽分鐘之時間 中可使用任何想要之蛋白酶，諸如—或多種以下蛋㈣· =酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、天冬胺酸 蛋白轉、基質金屬蛋白酶，酶(例如幾肽酶 ： B)、胰蛋白酶、騰凝乳蛋白酶 羧肽轉 I白磁a 胃蛋白酶、木瓜酶、彈性 蛋白轉、白丘球酶m 彈杜 (例如組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如蛋=轉、組織蛋白酶 白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸激酶、卡t白酶2、蛋 如卡斯蛋白酶i、卡斯蛋白酶2、％卡斯蛋白軸 酶5、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶 自^、卡斯蛋白 激活蛋白酶、無花果蛋白酶二1菌蛋卡斯蛋白酶13)、舞 酶、鳳梨酶及分離酶。在特定實施白酶、铜猴桃蛋白 ’蛋白酶為胰蛋白 131458.doc •42- 200911832 酶、彈性蛋白酶或白血球酶。蛋白酶亦可由生物提取物、 生物組織句t或生物製劑提供。必要時，該方法進一步包 含在培養完成後向譜系與蛋白酶之組合中添加蛋白酶抑制 劑。 可基於結合任何想要之靶配位體、諸如本文中所揭示之 靶配位體回收肽或多肽。在特定實施例中，藉由淘選回收 肽或多肽。 在一些實施例中，譜系包含呈現系统。舉例而言，呈現 系統可為噬菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、嘌呤黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或共 價呈現。例示性呈現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編 碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施例中，呈現 系統包含可複製之基因組。 在一些實施例中，呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 吕’喧菌體可為fd、M13、λ、MS2或T7。在特定實施例 中，嗤菌體呈現系統為多價系統。在一些實施例中，狀或 夕肽呈現為pill融合蛋白。 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼具有想要之 生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中，藉由嗟菌 體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 在一些實施例中，譜系為免疫球蛋白單—可變區域譜 系，例如其結合VEGF且為¥卿之抬抗劑。在特定實施= 中，免疫球蛋白單一可變區域為重鏈可變區域。在更特定 實施例中，重鏈可變區域為人類重鏈可變區域。在其他實 131458.doc -43 _ 200911832 施例中，备广 在特 〜 充疫球蛋白單一可變區域為輕鏈可笑跑埤 、例中，輕鏈可變區域為人類輕鏈可變區域。 譜，本發明為-種產生蛋白酶抗性肽或多狀 酶活性之條件包含提供狀或多狀譜系，在適於蛋白 數種具有相要多狀譜系與蛋白酶組合’及回收複 〜要之生物活性之肽或多肽，藉此 性肽或多肽譜系。 变曰酶抗 在-些實施例中’通常將譜系及蛋 鐘之時間。與 胥主乂約3〇分 種以下蛋白酶.碎。t法中所使用之蛋白酶可為—或多 酸蛋白酿 蛋白酶、半耽胺酸蛋白酶、天冬胺 竣肽酶Γ、硫醇蛋白酶、基質金屬蛋白酶、竣狀酶（例如 酶、…竣肽酶B)、胰蛋白酶、騰凝乳蛋白酶、胃蛋白 一木瓜酶、彈性蛋白酶、白血球酶、胰酶、凝血 ，'織蛋白％(例如組織蛋白酶G)、蛋白酶(例如蛋白 、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋 酶、+邶疋二a 故孔轉、腸激 斯蛋白辦（例如卡斯蛋白酶】、卡斯蛋白酶2、卡斯 蛋白§§4、卡斯蛋白酿5、士虹疋二a 卡斯IP 蛋酶9、卡斯蛋白酶12、 白酶Γ13)、飼激活蛋白酶、無花果蛋白酶、梭菌蛋 _，蛋蛋白酶、鳳梨酶及分離酶。在特定實施例 冑為胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白 :可：生物提取物、生物組織勾浆或生物製劑提供。必要 二==包含在培養完成後向譜系與蛋白酶之組 σ T添加蛋白轉抑制劑。 在—些實施例中，基於結合活性回收複數種具有想要之 13I458.doc •44- 200911832 生物活性之肽或多肽。舉例而言，可基於結合諸如蛋白質 A蛋白質0或蛋白質L之一般配位體回收複數種肽或多 肽。結合活性亦可為與靶配位體、諸如本文中所述之靶配 位體之特異性結合°在特定實施财，藉由淘選回收複數 種具有想要之生物活性之肽或多肽。 /在一些實施例中，譜系包含呈現系統。舉例而言，呈現 系、、先可為噬菌體呈現、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、 酵母呈現、嗓呤黴素呈現、細菌呈現、質體上之呈現或共 見在特疋實知例中，呈現系統使核酸之編碼功能與 由核酸所編碼之肽或多肽之功能特徵相關聯。在特定實施 例中，呈現系統包含可複製之基因組。 在—些實施例中，呈現系統包含噬菌體呈現。舉例而 言，嗟菌體可為fd、M13、λ、MS2或T7。在特定實施例 中’嗜菌體呈現系統為多價系統。在一些實施例中狀或 多肽呈現為pill融合蛋白。 在其他實施例中，方法進一步包含擴增編碼複數種具有 想要之生物活性之肽或多肽的核酸。在特定實施例中，藉 由嗟菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈反應擴增核酸。 在二實她例中，譜系為免疫球蛋白單一可變區域譜 系，例如其結合VEGF且為VEGF之拮抗劑。在特定實施例 中，免疫球蛋白單一可變區域為重鏈可變區域。在更特定 實％例中，重鏈可變區域為人類重鏈可變區域。在其他實 施例中’ t疫球蛋白單一可變區域為輕鍵可變區域。在特 疋實施例中，輕鏈可變區域為人類輕鏈可變區域。 131458.doc .45- 200911832 在另態樣中’本發明為一種自譜系選擇包含結合靶配 位體（例如’ VEGF)之免疫球蛋白單一可變區域（dAb)之蛋 @酶抗)·生夕肽的方法。在一實施例中該方法包含提供包 =多肽之"Γ系的噬菌體呈現系統，該等肽包含免疫球蛋白 單可文區域之，在適於蛋白酶活性之條件下使噬菌體呈 見系統。選自由彈性蛋白酶、白血球酶及姨蛋白酶組成之 、。酶、’且σ，及回收呈現包含結合靶配位體之免疫球 蛋白單一可變區域之多肽的噬菌體。 f . , 。—些實施例中，使用10〇 μδ/mL之蛋白酶，且在約 37C下將所組合之則體呈⑽統及蛋白酶培養隔夜。 在-些實施例中，藉由與靶配位體結合 合該乾之免疫球蛋白單一可變區域之夕肤 域多肽的噬菌體。在其 他實把例中’藉由淘選 玻疋1"收呈現包“吉合靶配位體之免疫 衣蛋白早一可變區域之多肽的噬菌體。 本發明亦係關於一種由本 自本文中所述之方法可選擇或選擇 I明：:： 或多肽。在-特定實施例中，本發 酶(例如，姨蛋白： 選擇或選擇之經分離蛋白 v J ^ 賤蛋白酶、彈柹 蛋白單—可變區域 血球酶）抗性免疫球 k匚域（例如，人類抗體重鏈可 抗體輕鏈可變區域）。 °°或、人類 本發明亦係關於—種編碼由本文中所述之 k擇之蛋白酶抗性肽或多肽(例如，胰蛋白酶選擇或 酶或白血球酶抗性免疫球蛋白單一 彈性蛋白 重組核醆，及係闕於包含該等核醆之裁二:經= 131458.doc -46- 200911832 體）及宿主細胞。 本發明亦係關於一種製儳由本文中 T所返之方法可還挥—、 選擇之蛋白酶抗性肽或多肽（例如， 、5 w J 姨蛋白酶、彈性蛋 酶或白血球酶抗性免疫球蛋白單— l h域）之方法，該 方法包含將含有編碼蛋白酶抗性肽或多肽之重組核酸 主細胞維持在適於表現之條件下， 1 百 精此14蛋白酶抗性肽 或多肽。 本發明亦係關於-種由本文中所述之方法可選擇或選擇 之蛋白酶抗性肽或多肽(例胰蛋白酶、彈性蛋白 白血球酶抗性免疫球蛋白單一 一 干 域），其用於醫學中 (例如’用於治療或診斷)。本發明亦係關於一種由本文中 所述之方法可選擇或選擇之蛋白酶抗性肽或多肽（例如， 胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白企球酶抗性免疫球蛋白單一可 變區域）用於製造供治療疾病用之藥物的用途。本發明亦 係關^治療疾病之方法，該方法包含向有需要之個體投與 有效量之由本文中所述之方法可選擇或選擇之蛋白酶抗性 肽或多肽（例騰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血球酶抗性 免疫球蛋白單一可變區域）。 本發明亦係關於一種確定樣品中是否存在VEGF或樣品 中存在多少VEGF之診斷套組’該套組包含本發明之多 肽、免疫球蛋白可變區域（dAb)或拮抗劑及使用說明書（例 如，確疋樣品中VEGF之存在性及/或數量p在一些實施例 中，套組進一步包含一或多種輔助試劑，諸如合適緩衝液 或合適偵測試劑（例如，結合本發明之多肽或dAb或與其締 131458.doc •47- 200911832 合或接合之部分的經可偵性標記之抗體或其抗原結合片 段。 本發明亦係關於一種包含固體表面的裝置，可在該固體 表面上固定本發明之多肽、拮抗劑或dAb以使所固定多肽 或dAb結合VEGF。可使用上面可固定抗體或其抗原結合片 段之任何合適固體表面，例如，玻璃、塑膠、礙水化合物 (例如，瓊脂糖珠粒）。必要時，支撐物可含有或經改質以 含有有助於固定之想要官能基。裝置及/或支撐物可具有 I . 任何合適形狀，例如片、桿、帶、板、載玻片、珠粒、小 球、盤狀物、凝膠、試管、球體、晶片、板或器孤及其類 似物。在一些實施例中，該裝置為量桿。 本文中（說明書及申請專利範圍中）所提及之DOM15-26-595之核酸序列如下： DOM15-26-595 ：
GAGGTGCAGCTGTTGGTTTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCGGGTCC CTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGGCTTATCCGATOA i TGTGGarCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGAGATCT cgccttcgggttcttatacatactacgcagactccgtgaagggccggttcac
CATCTCCCGCQACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCT
GCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCCTCGGAAGAT
TGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC 【實施方式】 在本說明書内，已參考實施例以使得能夠編寫清楚且簡 明之說明書之方式描述本發明。希望且應瞭解，在不脫離 131458.doc •48- 200911832 本發明之情況下，實施例可不同地組合或分離。 除非另有規定，否則本文中所使用之所有技術及科學術 語具有一般熟習此項技術（例如，細胞培養、分子遺傳 學、核酸化學、雜交技術及生物化學）者通常所理解之相 同之含義。關於分子、遺傳及生化法（通常參見，
Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manua卜 第 2版（1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold
Spring Harbor，N.Y.及 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第 4版，John Wiley & Sons，Inc.， 其係以引用之方式併入本文中）及化學方法，使用標準技 術。 如本文中所使用，術語"血管内皮生長因子（VEGF)拮抗 劑"或”抗VEGF拮抗劑”或其類似物係指結合vegf且可抑 制VEGF之（亦即，一或多種）功能之藥劑（例如，分子、化 合物）。 如本文中所使用，"肽"係指經由肽鍵結 個至約50個胺基酸。 *起之約2 如本文中所使用 少約50個胺基酸。 域。 ,多肽”係指經由肽鍵結合在一起之至 夕肽通g包含二級結構且摺疊為功能區 如本文中所使用，”抗蛋白酶降解"狀或多狀（例如， 抗體㈣聯在適於蛋白酶活性之條件下與蛋⑽-起典 養時大體上不會被蛋㈣降解。^ 度’例如在—C下與蛋白酶一起 = 131458.doc .49、 200911832 超過約25%、不超過約20%、不超過約i5%、不超過約 14%、不超過約13%、不超過約12%、不超過約ιι%、不超 過約⑽、不超過約9%、不超過約8%、不超過約7%、不 超過祕、不超過約5%、不超過約4%、不超過約3%、不 超過約2%、不超過約1%或大體上無蛋白質被蛋白酶降解 時，多肽⑼如，dAb)大體上不降解。舉例而I，可使用 任何合適方法評估蛋白質降解，例如WDs_pAGE或由如 本文中所述之功能檢定（例如，配位體結合）。 如本文中所使用，”呈現系統I，係指其中多狀或狀之集合 易於基於想要之特徵（諸如物理、化學或功能特徵）加以選 擇之系統。呈現系統可為多肽或肽之合適譜系(例如，在 溶液中’固定於合適支樓物上)。呈現系統亦可為採用細 胞表現系統（例如，於（例如）經轉型、感染、轉染或轉導細 胞中表現核酸庫及於細胞表面上呈現經編碼多狀）或非細 胞表現系統(例如，乳液隔室化及呈現)之系統。例示性呈 現系統使核酸之編碼功能與由核酸所編碼之多肽或肽之物 理、化學及/或功能特徵相關聯。當採用該呈現系統時， 可選擇具有想要之物理、化學及/或功能特徵之多狀或 肽’且可谷易地分離或回收編碼所選擇之多肽或狀之核 酸。此項技術已知許多使核酸之編碼功能與多肽或肽之物 理、化學及/或功能特徵相關聯之呈現系、统，例如嗟菌體 呈現 _吻hagedisplay/phagedisplay)(例如嗟質體 呈現)、核糖體呈現、乳液隔室化及呈現、酵母呈現、嗓 呤Μ素呈現、細菌呈現、質體上之呈現、共價呈現及其類 131458.doc -50- 200911832 似者。（例如參見EP 〇436597(Dyax)、美國專利第ό,172，197 號（McCafferty 等人）、美國專利第 6,489，1〇^(Griffith4 人）。） 如本文中所使用，”譜系”係指以胺基酸序列多樣性為特 徵之多肽或肽之集合。譜系之個體成員可具有常見特徵， 諸如常見結構特點（例如，常見核心結構）及/或常見功能特 徵（例如，結合常見配位體（例如，一般配位體或靶配位體） 之能力）。 如本文中所使用，，功能"描述具有生物活性、諸如特異 性結合活性之多肽或肽。舉例而言，術語”功能多肽"包括 經由抗原結合位點結合靶抗原之抗體或其抗原結合片段。 如本文中所使用，”一般配位體”係指結合給定譜系之相 當一部分（例如，大體上所有）功能成員之配位體。一般配 位體（例如，常見一般配位體）可結合給定譜系之許多成 員，即使該等成員可能對常見靶配位體不具有結合特異 性。多肽上存在功能一般配位體結合位點（如結合一般配 位體之能力所指示）通常指示多肽經適當摺疊且具有功 月般配位體之合適實例包括超抗原、結合表現於譜系 之相§ 一部分功能成員上之抗原決定基之抗體及其類似 者。 超抗原’’為技術術語，其係指與免疫球蛋白超家族之成 員在不同於該等蛋白質之靶配位體結合位點之位點處相互 作用之一般配位體。葡萄球菌腸毒素為與丁_細胞受體相互 作用之超抗原實例。結合抗體之超抗原包括結合IgG恆定 131458.doc •51 · 200911832 區之蛋白質 G(Bjorck 及 Kronvall，乂 133:969 (1984));結合IgG怪定區及VH區域之蛋白質A(F〇rsgren及 Sjoquist，J. 似/·，97:822 (1966));及結合 Vl 區域之蛋 白質 L(Bjorck，《/· /wmwwo/., 140:1194 (1988))。 如本文中所使用，”靶配位體"係指多肽或肽特異性或選 擇性結合之配位體。舉例而言，當多肽為抗體或其抗原結 合片段時，靶配位體可為任何想要之抗原或抗原決定基。 與革巴抗原之結合係視具有功能性之多狀或狀而定。 如本文中所使用，抗體係指源自任何天然產生抗體之物 種或由DNA重組技術產生的自血清、b細胞、融合瘤、轉 染瘤、酵母或細菌分離的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片 段（諸如Fab、F(ab，）2、Fv、雙硫鍵鍵結之Fv、scFy、封閉 構形多特異性抗體、雙硫鍵鍵結之scpv、雙抗體）。 如本文中所使用’抗體格式（antibody format)”係指其中 可合併一或多個抗體可變區域以在結構上賦予抗原結合特 異性之任何合適多肽結構。此項技術已知多種合適抗體格 式，諸如後合抗體、人化抗體、人類抗體、單鏈抗體、雙 特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈及/或輕鏈 之同元二聚體及異元二聚體、任何上述各者之抗原結合片 段（例如’ Fv片段（例如單鏈Fv(scFv)、雙硫鍵鍵結之Fv)、 Fab片段、Fab'片段、F(ab’）2片段）、單一抗體可變區域（例 如，dAb、VH、VHH、VL)及任何上述各者之經修飾形式 (例如經由共價連接聚乙二醇或其他合適聚合物或人化Vhh 來修询）。 131458.doc -52- 200911832 -免疫球蛋白單—可變區域，，係指獨立於其他v區或 區域特異性結合抗原或抗原決定基之抗體可變區域（vH、 —L)免疫球蛋白單一可變區域可以某一格式（例 5元或.、元夕聚體）與其他可變區或可變區域一起存 在，其中該等,、 ™或區域不為單一免疫球蛋白可變區域 之抗原結合所需（亦gp ^ ^ ^ ’/、中免疫球蛋白單一可變區域獨 立於其他可變區域 场'、、.°合抗原）。"區域抗體"或"d Ab "與本文 斤使用之術5吾免疫球蛋白單-可變區域'，相同。”單一 免疫球蛋白可變區诚，，伽士 〇〇 硃與本文中所使用之術語"免疫球蛋白 單一可變區域"相同。"單一 早抗體可變區域"與本文中所使 用之術語”免疫球蛋白單一可變區域"㈣。在一實施例 中，免疫球蛋白單一可變區域為人類抗體可變區域，且包 括來自其他物種 柳裡之早一抗體可變區域，諸如齧齒動物 ^ /纟W〇 〇〇/29004中所揭示，其内容係以引用之方 式整體併入本文中）、等+ 戍士魚（nurse shark)及絡乾類 (C_/M)Vhh dAb。㈣類％為自產生天然缺少輕鍵之 重鏈抗體之包括絡歇、美洲，它、羊乾、單峰路乾及原乾之 物種獲得的免疫球蛋白單—可變區域多肽。VHH可為人化 的0 ”區域"為具有獨立於蛋白f其餘部分之三級結構之擅疊 蛋白質結構。區域通常會產生蛋白質之離散功能性質，且 在許多狀況下，可在不招生疋a# 貝失蛋白質之其餘部分及/或區域 之功能之情況下，添加至其他蛋白質中、自其他蛋白質中 移除或轉移至其他蛋白質中。”單—抗體可變區域，，為包含 131458.doc -53- 200911832 具有抗體可變區域特徵之序列之摺疊多肽區域。因此，其 包括完全抗體可變區域及（例如）其中一或多個環已經被不 具有抗體可變區域之特徵之序列置換的經修飾可變區域， 或已經被截斷或包含N_末端或^末端延伸之抗體可變區 域，以及保留全長區域之至少結合活性及特異性之可變區 域的摺疊片段。 術語"庫"係指異源多肽或核酸之混合物。庫包含各具有 單一多肽或核酸序列之成員。就此而論，”庫”與"譜系"同 義。庫成員之間的序列差異產生庫中所存在之多樣性。庫 可採取多肽或核酸之簡單混合物形式或可呈經核酸庫轉型 之例如細菌、病毒、動物或植物細胞及其類似者之生物體 或細胞形式。在一實施例中，各個體生物或細胞僅含有一 個或有限數目之庫成員。在一實施例中，將核酸併入表現 載體中以允許表現由核酸所編碼之多肽。因此，在一態樣 中，庫可採取宿主生物體群體之形式，各生物體含有一或 多個含有單個呈核酸形式之庫成員的表現載體複本，該庫 成員可經表現以產生相應多肽成員之核酸形式之庫成員。 因此，宿主生物體群體具有編碼多樣性多肽大譜系之潛 厶匕 月B 。 ”通用構架”為對應於如 Kabat(，，SeqUences 〇f Proteins 〇f Immunological Interest", US Department of Health and
Human Services)所定義之在序列方面保守之抗體區或對應 於如 Chothia 及 Lesk，（1987) j· M〇1. Bi〇1 196:91〇_917 所定 義之人類生殖系免疫球蛋白譜系或結構的單一抗體構架序 131458.doc -54- 200911832 列。庫及譜系可使用單-構架或-組該等構架，儘管僅高 變區中存在變異但已發現其仍准許實際上任何結合特異性 之起源。 如本文中所使用，術語”劑量，，係指一次（單位劑量）或在 規定時間間隔内分兩次或兩次以上投藥向個體投與之配位 體之數量。舉例而言，劑量可指在κ(24小時）（每日劑 量）、2天、i週、2週、3週或—或多個月之時程内向個體 投與(例如，單次投藥或兩次或兩次以上投藥)之配位體(例 如，包含結合乾抗原之免疫球蛋白單—可變區域之配位 體)之數量。劑量之間的間隔可為任何想要之時間量。 短語"半衰期，，係指配位體（例如，dAb、多狀或括抗劑） 之血清濃度（例如）歸因於自然機制所致之配位體降解及/或 配位體清除或隔離而活體内減小观所需之時間。本發明 之配位體在活體内係為穩定的且其半衰期可因結合抗^解 及/或清除或隔離之分子而增加。該等分子通常為本身且 V, 有長活體内半衰期之天, 然存在之蛋白質。若配位體之功能 活性在活體内比對半衰期增加分子不具有特異性之類似配 位體持續更長之時間’則其半衰期增加。舉例而言，對人 2清白蛋白（HAS)絲分子具有特異性之配位 於對脱不存在特異性（即不結合脱但結合另— 相同配位體。舉例而言，其可結合細胞上之 期通常增加聰、挪、3〇%、4〇%、观或以上。2倍衣3 倍、4倍、5倍、1〇俾、 2〇倍、30倍、40倍、50倍或以上蘇 圍内之半衰期之增加為可能的。另外或其他，高達30倍、 131458.doc -55- 200911832 4(Ησ 50倍、6〇倍、7〇倍、8〇倍、％倍⑽倍、倍範 圍内之半衰期之增加為可能的。 女本文中所使用，"流體動力學尺寸"係指基於分子擴散 通過水溶分子（例蛋白質分子、配位體）表觀尺 寸。可使仔蛋白質擴散或運動通過溶液獲得蛋白質之表觀 尺寸，其中該尺寸係以蛋白質粒子之„斯托克斯半徑 (Stokes radius)"或"流體動力學半徑·，給出。蛋白質之”流體 動力學尺寸”視質量與形狀（構形）而定，如此兩個具有相同 分子質量之蛋白質基於蛋白質之總構形可能具有不同流體 動力學尺寸。 如本文中所提及’術語”競爭"意謂第一靶與其同源靶結 合區域之結合在存在對該同絲具有特異性之第二結合區 域的情況下受到抑制。舉例而言，結合可能（例如）因:合 區域之物理阻斷或結合區域之結構或環境之改變以致里對 歡之親和力（affinity或avidity)減小而在空間上受到抑制。 關於如何執行競爭ELISA及競爭BiaC〇re實驗以確定第一與 第二結合區域之間的競爭的詳情，參見w〇2〇_8〇^、 如下執行兩個序列之間的"同源性”或”一致似 性，，之計算（該等術語在本文中可互換使用）。出於最佳比較 目的比對序列(例#，為最佳比對，可在第—與第 :或核酸序列之一個或兩個中引入間隙，1出於比：之： 的，可忽視非同源序列）。在一實施例 的所比對之參考序狀長度為至少參考序列 乂之目 30%、或至少4〇%、或 、又的至少 禹至y 50/。、或至少6〇%、或至少 131458.doc •56, 200911832 70%、80%、90%、100%。隨後比較相應胺基酸位置或核 4酸位置處之胺基酸殘基或核普酸。當第一序列中之某一 位置由與第二序列中之相應位置相同之胺基酸殘基或核普 酸佔據時’則分子在該位置處一致（如本文中所使用，胺 基酸或核酸"同源性"等效於胺基酸或核酸"一致性"）。兩個 序列之間的一致性。/。係隨考慮為最佳比對兩個序列所引入 之缺口之數目及各間隙之長度的序列所共享之一致位置之 數目而變化。可使用算法BLAST 2 Sequences使用缺省參 數（Tatusova, Τ· A·等人，FEMSMicrobiolLett，174:187- 188 (1999))準備且確定如本文中所定義之胺基酸及核苷酸 序列比對及同源性、相似性或一致性。 選擇方法 在一實施例中’本發明係關於由選擇具有想要之生物活 性（例如，結合VEGF)之蛋白酶抗性肽及多肽的方法選擇的 多肽及dAb，例如抗VEGF dAb。方法中使用兩個選擇壓力 以產生選擇高度穩定且抗蛋白酶降解且具有想要之生物活 性之多肽的高效過程。如本文中所述，蛋白酶抗性肽及多 肽通常保留生物活性。相反，蛋白酶敏感肽及多肽在本文 中所述之方法中會被蛋白酶裂解或分解，且因此喪失其生 物活性。因此，通常基於諸如結合活性之生物活性選擇蛋 白酶抗性肽或多肽。 本文中所述之方法提供數個優點。舉例而言，如本文中 所揭示及例示，經選擇而抗一種蛋白酶（例如，胰蛋白酶） 之蛋白水解降解的可變區域、拮抗劑、肽或多肽亦對其他 131458.doc -57- 200911832 蛋白酶（例如，彈性蛋白酿、&丄丄 酶白血球酶）降解具有抗性。在 一實施例中，蛋白酶抗性與肽或多肽之較高熔融溫度（Tm) 相關。較高炼融溫度指示較穩定可變區域、括抗劑、狀及 多肽。在一實施例中’抗蛋白酶降解亦與結合粗配位體之 高親和力相關。因此，本文中所述之方法提供一種選擇、 刀離及/或回收具有想要之生物活性且因其具蛋白酶抗性 且穩定而極適於活體内治療及/或診斷使用之可變區域、 拮抗劑、肽、多肽的有效方式。在一實施例中，蛋白酶抗 性與改良之PK(例如’比不具蛋白酶抗性之可變區域、垆 抗劑、肽或多肽改良）相關。改良之ρκ可為改良之就（曲 線下面積）及/或改良之半衰期。在一實施例中，蛋白酶抗 性與可變區域、括抗劑、狀或多肽對剪切力及/或熱應力 之改良穩定性及/或噴霧期間減小之聚集傾向(例如，比不 具蛋白酶抗性之可變區域、拮抗劑、肽或多肽改良)相 關。在-實施例中’蛋白酶抗性與改良之儲存穩定性(例 比不具蛋白酶抗性之可變區域、结抗劑、肽或多狀改 良）相關。在一態樣中，提供一個、二個、三個、四個或 所有該等優點，該等優點Α始；占# Μ α 合把配位體之高親和力蛋㈣降解、較高Τ讀結 選擇方法 在一態樣中，提供自肽及多肽之庫或譜系（例如，呈現 系統m擇、分離及/或回收抗蛋白酶（例如—或多種蛋白 ^ 解之肽或多肽之方法。在—實施例中該方法為自 肽及夕肽之庫或譜系(例如，呈現系統)選擇、分離及/或回 131458.doc -58- 200911832 f 例如或多種蛋白酶）降解之多狀之方法。 Λ法通*包含提供肽或多肽之庫或譜系，在適於蛋白酶 (例如’騰蛋白酶、彈性蛋白酶、白血球酶、騰酶、痰）活 性之條件下使該庫或該譜系與蛋白酶組合，及選擇、分: 及/或时抗蛋白酶降解且具有想要之生物活性之肽或多 :知因於蛋白酶之活性’由蛋白酶降解之肽或多肽通常 、.活性減小或喪失其生物活性。因此，可使用基於生物 之方法選擇、分離及/或回收抗蛋白酶降解之肽或多 肽，該生物活性諸如結合活性（例如，結合一般配位體、 口特異）·生配位體、結合受f)、催化活性或其他生物活 性0 在適於蛋白酶（例如，—或多種蛋白酶）之蛋白水解活性 之條件下使肽或多肽之庫或譜系與蛋白酶組合。適於蛋白 酶及具有蛋白水解活性之生物製劑或混合物之蛋白水解活 的條件為此項技術所熟知或可由一般熟習此項技術者容 2地確定^要時’可（例如）藉由在一定範圍之PH值條 彳蛋白酶浪度、溫度下評估蛋白酶活性及/或藉由改變 f庫或譜系與蛋白酶反應之時間之量來鐘別或優化合適條 1。舉例而言’在-些實施例中’蛋白酶(例如，胰蛋白 ⑷與肽或多狀（例如，可變區域）之比率⑼莫耳/莫 _比8〇,〇〇(例如，8，_比80，_)蛋白酶：肽或多肤例 如當使㈣微克/毫升蛋白酶時，比率為8⑽比⑼，咖蛋白 每·肽或多肽；或當使用刚微克/毫升蛋白酶時， 8，_比80，_蛋白酶：肽或多肽。在一實施财，蛋白酶 131458.doc -59- 200911832 (例如，胰蛋白酶）鱼日备+夕 重量/重量、例如微克^克γ’ι區域）之比率（以 ^Μοο.^ο,οοο)^^ ^ ^ 毫升蛋白酶時，=肽 肽;或當使二蛋白“ 蛋白酶：肽或多狀 至少100或1〇〇0微克/毫升之蛋白酶 使用〉辰度為 白酶）盥肽戋多肽(^丨1 蛋白鉍（例如，胰蛋 或夕肽(例如’可變區域)之蛋白酶：Μ…、 莫耳/莫耳計）為8，咖比80，_蛋白酶：肽戍 ；以 知例中，使用濃度為至少10微克/毫升之蛋白酶，: :(例如’騰蛋白酶)與肽或多肽(例如 多…一 L 十)為800比80，_蛋白酶：肽或 施例中，蛋白酶（例如，姨蛋 = 肽（例如，可變區域）之比率（以重 ）與肽或夕 請觸比160，_蛋白酶：_多重狀'列如微克/微克 克州;或當—微二例微 比⑽，_蛋白酶··肽或多肽。在一實施例中，二：〇: 為至少1〇〇或1_微克/毫升蛋白酶 / 4或〇 狀或多肽（例如，免疫球蛋白可變區域/，'例如^經分離 或庫分離之肽或多肽，可向肽或多狀存二如早已自譜系 如’咖)中之溶液中添加蛋白 ：：。適緩衝液(例 溶液，諸如至少約0.01% (w/w :,多狀/蛋白酶 至約5。—白酶/肽或多肽、約:。=^ 白酶/肽或多肽、約0·”/。至約5 酿/。（，蛋 )蛋白酶/肽或多肽、 131458.doc 200911832 約0.5%至約5% (w/w)蛋白酶 (W/W)蛋白酶/肽或多肽、至小5夕肽、約1%至約5% 多肽、至少約0.02% (w/ :':〇’〇1% (W/w)蛋白酶/肽或 (w/w)蛋白酶/肽或多肽、至| /狀或多肽、至少約0.03% 多狀、至少約。·(，蛋 O/w)蛋白酶/肽或多 S夕肽、至少約0.06〇/〇 ^ ^ 至少約0 07。/ / 夕肽、至少約0.08% (w/w) 。 W/w)蛋白酶/肽或 (w/w)蛋白酶/肽或多酶/肽或多肽、至少約〇 〇9% 人’肌、至少約0 狀、至少約0.2% (w/w)蛋白酶/狀w)蛋白酶/肽或多 (W/W)蛋白酶/肽或多肽、至少約〇作（夕/肽、至少約〇·3% 狀、至少約請（吟）蛋白酶/狀;蛋白酶/肽或多 (W/W)蛋白酶/肽或多肽、至少約〇7/ 肽、至少約〇.6% 狀、至少約。篇(w/w)蛋白酶/肽：(:’:)蛋白酶’肽或多 —蛋白酶/肽或多肽、至少約 至少約0.9% 肽、至少㈣（叫蛋白酶/肽或多°狀^蛋白酶/肽或多 蛋白酶/肽或多肽、至少約 至 >、約3% (w/w) 5〇/ r / (W/W)蛋白酶/肽或多肽或约 5/。—蛋白酶/肽或多 肽次户肽或約 之溫^ ，合液。可在適於蛋白酶活性 恤度（例如，室溫，約37。〇下捭 A仏 間隔(例如，H、時、2小時、3小“：二:且可以時間 何合谪太、土 ^ ’ ）採集樣品。可使用任 、方法、啫如SDS_PAGE分析或 降解分拆P n 竹次配位體結合就蛋白質 ' 可使用結果建立降解時程。 +在述之方法中可使用任何想要之蛋白酶。舉例而 或且右I ώ u 蛋白酶之任何想要之組合， "蛋白水解活性之任何生物製劑、生物提取物或生物 131458.doc -61 - 200911832 ^水不需要知道所用蛋白酶之身份。可單獨或以任何想 之組合使用之蛋白酶之適合實例包括絲胺酸蛋白酶 胱胺馱蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、基質金屬 蛋白酶、叛肽酶（例如叛肽酶A、缓肽酶B)、騰蛋白酶、姨 凝礼蛋白冑、胃蛋白酶、木瓜酶、彈性蛋白酶、白血球酶 V./ (leUcozyme)、胰酶、凝血酶、纖溶酶、、组織蛋白酶 (cathepsins)(例如組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如蛋白酶卜 蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶（therm〇iysin)、凝乳 酶、腸激酶、卡斯蛋白酶（caspase)(例如卡斯蛋白酶丨、卡 斯蛋白酶2、卡斯蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶9、 卡斯蛋白酶12、卡斯蛋白酶13)、鈣激活蛋白酶（caipain)、 無花果蛋白酶（ficain)、梭菌蛋白酶、獼猴桃蛋白酶 (actimdain)、鳳梨酶、分離酶及其類似物。具有蛋白水解 活性之適合生物提取物、勻漿及製劑包括痰、黏液（例如 胃黏液、鼻黏液、支氣管黏液）、支氣管肺泡灌洗液、肺 組織勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液、眼淚及 其類似物。蛋白酶係以適於發生蛋白水解降解之量使用。 舉例而言，如本文中所述’可使用約〇.〇1〇/0至約5% (w/w， 蛋白酶/肽或多肽）蛋白酶。當蛋白酶與包含肽或多肽譜系 之呈現系統（例如嗟菌體呈現系統）組合時，例如，可使用 濃度約 10 pg/ml至約 3 mg/ml、約 1〇 μδ/ηι1、約 20 pg/mi、 約 30 pg/ml、約 40 pg/ml、約 50 pg/ml、約 60 pg/ml、約 70 pg/ml、約 80 pg/ml、約 90 pg/ml、約 100 pg/ml、約 200 pg/ml、約 300 pg/ml、約 400 pg/ml、約 500 pg/ml、約 600 131458.doc -62- 200911832 pg/m〗、約700 μ§/η1卜約800 μ§Λη卜約9〇〇叫/m】、約〗〇〇〇 Kg/ml、約】，5 mg/ml、約 2 mg/ml、約 2 5 邮―或約 3 mg/ml之蛋白酶。 在適於蛋白酶活性之溫度下，將蛋白酶與肽或多肽之集 合（庫或譜系）一起培養。舉例而言，可在約2〇t；至約 4(TC(例如，室溫、約贼、約21、約饥、約坑、約 ⑽、約25°C、約26°C、約听、約28t：、約29t、約 贼、約 31°C、約 32°G、@33°C、約 34。(：、約 35t、約 36^、約37C、約38°C、約39°C、約4。。〇之溫度下培養蛋 白酶及肽或多肽之集合。將蛋白酶及肽或多肽之集合一起 培養奴足以發生蛋白水解降解之時間。舉例而言，可將 狀或夕肽之集合與蛋白酶—起培養約3G分鐘至約24或約48 J一時在—些實例’將肽或多肽之集合與蛋白酶-起培養 ^仪’或至少約30分鐘、約1小時、約1.5小時、約2小 時、.勺3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、 約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約 :二、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約 23小時、約24、時寺、約2〇小時、約21小時、約22小時、約 ^24小時、約48小時或更長。
通常希望，至小+曰# A 系統時)，傲不二在早期各輪選擇中(例如’當使用呈現 I括與蛋白酶一起培養之選擇相比，蛋白 _使侍所選擇之 贫白 -個數量級”有心要之生物活性之純系數目減少至少 條件足以使所在回^定實例中，方法中所使用之蛋白酶量及 °欠到之純系數目減少至少約1個對數（1〇 131458.doc -63· 200911832 5 ( …_倍）一…個對數_倍)或 至少約4個對數（10,000倍）。 ）次 U 一旦 . 座生心要之回收純系減少之合 、蛋白酶里及培養條件可使用習知士、+ 供之指導容易地確定。 方法及/或本文中所提 可使蛋白酶與肽或多肽之集合組合且使用任何合適方法 ，活體外、活體内或離體)培養。舉例而言，可使蛋 酶與肽或多肽之集合組合於八.交哭士 w 適奋器中且在適於蛋白酶 活性之溫度下保持固定、搖 'y v ^ 動震盪、渦旋或其類似情 况。必要時，可使蛋白 沐丄 /、肮次夕肽之集合組合於活體内 戍離體系統中，諸如藉由將 TB 夕胧之集合（例如，噬菌體呈 現庫或譜系）引入合適動物（例如， ,_ j氣）〒，且在足以使蛋 一 ^活性起作用之時間過後，回收肽或多肽之集合。在另 用多肽之集合(例如’噬菌體呈現庫或譜系)灌 广或組織’且在足以使蛋白酶活性起作 後’回收多肽之集合。 白L養後’可基於諸如結合活性之想要之生物活性選擇蛋 白鉍抗性肽或多肽。必要時， 制制 J在選擇之則添加蛋白酶抑 。可使用大體上不會干擾選擇方法之任何合適蛋白酶 白卩種或兩種以上蛋白酶抑制劑之組合Ρ合適蛋 Θ姆抑制劑之實例包 ΜΙ括A抗胰蛋白酶、‘巨球蛋白、阿 酶、4 (am_tln)、抗痛素（anUpain)、抗凝血酶出、抑肽 4 (2_胺基乙基）苯磺醯氟鹽酸鹽（AEBSF)、（4-脒A-苯 _(bestatin)、笨二抑 礼蛋白酶素、3,4_二氣異香豆素、說嶙酸二異丙醋 131458.doc -64 - 200911832 (DIFP)、E-64、乙二胺四乙酸（EDTA)、彈性蛋白酶抑制劑 (elastatinal)、亮肽素、N-乙基馬來醯亞胺、苯基甲基磺醯 氟（PMSF)、胃酶抑素、u〇_菲羅啉（phenanthr〇nne)、膦 醯二肽（phosphoramidon)、絲胺酸蛋白酶抑制劑、N_曱苯 磺醯基-L-離胺酸-氯甲基酮（TLCK)、Na_甲苯磺醯基_phe_ 氣甲基酮（TPCK)及其類似物。另外，可在購得許多含有數 類蛋白酶抑制劑之製劑（例如，Roche complete Pr0tease Inhibitor Cocktail TabletSTM(Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis，IN，USA)，其抑制胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋 白酶、木瓜酶、鏈黴蛋白酶、胰腺提取物及胰蛋白酶 可使用想要之生物活性選擇方法選擇蛋白酶抗性肽或多 肽，該方法使得具有想要之生物活性之肽及多肽不同於不 具有想要之生物活性之肽及多肽且對其加以選擇。已經被 蛋白酶分解或裂解之肽或多肽通常喪失其生物活性，而蛋 白酶抗性肽或多肽仍具功能性。因此，可使用生物活性之 合適檢定選擇蛋白酶抗性肽或多肽。舉例而言，可使用合 適結合檢定（例如，ELISA，淘選）評估常見結合功能（例 如、、’=a叙配位體、結合特異性配位體或結合受質）。 舉例而β可藉由淘選或使用合適親和力基質選擇、分離 及/或回收結合靶配位體或諸如蛋白質A、蛋白質l之一般 配位體或抗體之多肽。可藉由向合適容器（例如，試管、 皮氏培養皿（petri dish))中添加配位體（例如，一般配位 體、靶配位體)之溶液且使配位體變得沈積或塗佈於容器 壁上之來實現淘選。可洗除過量配位體且可向容器中添加 131458.doc -65- 200911832 多狀（例如，噬菌 固定配位體之條件下7 容器維持在適於多肽結合 削或(例如潸低阳值之：結合多肽且可使用諸如到 a " 之任何合適方法回收結合多肽。 合。可 見糸統…可在嗟菌體ELISA中測試結 何合適程序執行嗤菌體EUSA。在-實例 入:可由EUSA就與所選擇之乾配位體或—般配位體之結 口師選各輪選擇下所產生之㈣體群體以鑑別呈現蛋白酶 抗性肽或多肽之嘆菌體。必要時，可由例如此脱使用例 如針對C.末端或N_末端標籤之試劑就與乾配位體或一般配 位體之結合測試可溶性肽及多肽（例如參見，Winter等人， (1994M紙細.7_”〇/㈣12, 433 55及其中所引用之參 考文獻）。亦可由PCR產物之凝膠電泳（Marks等人，i99i, 同上；Nissini 等人，1994 ’ 同上）、探測（pr〇bing) (T〇mlinson等人，1992, 乂 M〇/ 价〇/ 227, 776)或藉由對載 體DNA測序評估所選擇之噬菌體之多樣性。 i \ 除對VEGF具有特異性外，包含抗¥]£(}17蛋白酶抗性多肽 (例如，單一抗體可變區域）之拮抗劑或多肽（例如，雙特異 性配位體）可對一般配位體或任何想要之乾配位體具有結 合特異性’該一般配位體或乾配位體諸如人類或動物蛋白 質，包括細胞激素、生長因子、細胞激素受體、生長因子 受體、酶（例如’蛋白酶）、酶之輔因子、DNA結合蛋白、 脂質及碳水化合物。 在一些實施例中，蛋白酶抗性肽或多肽（例如，dAb)或 拮抗劑結合肺組織中之VEGF。在一實施例中，拮抗劑或 131458.doc -66- 200911832 多肽亦結合肺組織中之另一乾。 田在本文中所述之方法中使用呈現系統（例如，使核酸 之編碼功能與由核酸編石馬之肽或多肽之功能特徵相關聯的 呈現系統）時，擴增或增加編碼所選擇之狀或多狀之核酸 的複本數通常有利。此提供獲得足夠數量之供使用本文中 所述之方法或其他合適方法之其他㈣擇用或供 譜系(例如，親和力成熟譜系)用之核酸及/或肽或多肽的有 效方式。因此，在-些實施例中，該等方法包含使用呈現 系統(例如，使核酸之編碼功能與由核酸編碼之肽或多肽 之功能特徵相關聯之呈現系統’諸如噬菌體呈現)，且進 一步包含擴增或增加編碼所選擇之肽或多肽之核酸的複本 數。核酸可使用任何合適方法、諸如藉由嗜菌體擴增、細 胞生長或聚合酶鏈反應擴增。 本文中所述之方法可用作必要時可包含其他合適選擇方 法之分離蛋白酶抗性肽或多肽(例如，dAb)之程序的部 分。在該等情形中，可在程序之任何想要之點採用本文中 所述之方法，諸如使用其他選擇方法之前或之後。如 中所描述且例示，本文中所述 兩輪以上選擇。 料供兩輪或 在一實例中’提供—種選擇特異性結合卿 白酶降解之狀或多狀(例如，dAb)的方法，該方法包= 供肽或多肽之庫或譜系，在適於姨蛋白酶蛋白 條件下使庫或譜系與姨蛋白酶組合及選擇、分離及/或回 收抗胰蛋白酶降解且特異性結合VEGF之肽或多肽。 I31458.doc -67- 200911832 在特定實施例中，提供一種選擇抗胰蛋白酶降解且特異 性結合VEGF之免疫球蛋白單一可變區域（dAb)之方法。在 該等實施例中，提供包含dAb之庫或譜系且在適於胰蛋白 酶（或包含胰蛋白酶之生物製劑、提取物或組織勻漿）蛋白 水解分解之條件下使其與胰蛋白酶組合。選擇結合 之胰蛋白酶抗性dAb。舉例而言，騰蛋白酶抗性⑽當在 37C下在姨蛋白酶之Q.G4% (w/w)溶液中培養至少約2小時 /之時間時大體上不降解。在一實施例中，胰蛋白酶抗性 1 _當在坑下在胰蛋㈣之U4% (w/w)溶液中培養至少 約3小時之時間時大體上不降解。在一實施例中，姨蛋白 酶抗性dAb當在37°C下在騰蛋白酶之〇 〇4% (w/w)溶液中培 養至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時、至少約了小 時、至少約8小時、至少約9小時、至少約1〇小時、至少約 11小時或至少約12小時之時間時大體上不降解。 在-例示性實施例中’提供一種選擇抗胰蛋白酶降解且 ,特異性結合VEGF之免疫球蛋白單一可變區域之方 V法。該方法包含提供包含多肽譜系之盤菌體呈現系統，該 等多肽包含免疫球蛋白單一可變區域，使谨菌體呈現系統 與肤蛋白酶（1〇〇 pg/mL)組合且在約饥下培養混合物⑽ 如）隔夜（例如，約12_16小時），及隨後選擇呈現特異性結 合VEGF之dAb之嗔菌體。 在另-實例中’該方法為選擇抗彈性蛋白酶降解之狀或 多肽（例如，dAb)，其包含提供狀或多狀之庫或譜系，在 適於彈性蛋白酶（或包含彈性蛋白酶之生物製劑、提取物 131458.doc -68 - 200911832 或組織勻漿）蛋白水解分解之條件下使庫或譜系與彈性蛋 白酶組合，及選擇、分離及/或回收抗彈性蛋白酶降解且 具有VEGF結合活性之肽或多肽。 在特定實施例中，提供一種選擇抗彈性蛋白酶降解且結 合VEGF的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方法。在該等 實施例中，提供包含dAb之庫或譜系且在適於彈性蛋白酶 (或包含彈性蛋白酶之生物製劑、提取物或組織勻漿）蛋白 水解分解之條件下使其與彈性蛋白酶組合。選擇特異性結 口 VEGF之彈性蛋白酶抗性dAb。舉例而言，彈性蛋白酶抗 性dAb當在37°C下在0.04% (w/w)彈性蛋白酶溶液令培養至 少約2小時之時間時大體上不降解。在一實施例中彈性 蛋白酶抗性dAb當在37°C下在0.04% (w/w)彈性蛋白酶溶液 中培養至少約12小時之時間時大體上不降解。在一實施例 中，彈性蛋白酶抗性dAb當在37t：下在〇〇4% (w/w)彈性蛋 白酶溶液中培養至少約24小時、至少㈣小時或至少約48 小時之時間時大體上不降解。 VEGF的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方法 含提供包含多肽譜系之噬菌體呈現系統，該等 在-實施例中，提供一種選擇抗彈性蛋白酶降解且結合
種選擇抗白血球酶降解之肽或多肽 131458.doc •69· 200911832 (例如，dAb)之方法，該方法包含提供肽或多肽之庫或譜 系，在適於白血球酶（或包含白血球酶之生物製劑、提取 物或組織勻衆）蛋白水解分解之條件下使庫或譜系與白血 球酶組合，及選擇、分離及/或回收抗白血球酶降解且具 有特異性VEGF結合活性之肽或多肽。 在特定實施例中，提供一種選擇抗白血球酶降解且結合 VEGF的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方法。在該等實 施例中，提供包含dAb之庫或譜系且在適於白血球酶（或包 含白血球酶之生物製劑、提取物或組織勻漿）蛋白水解分 解之條件下使其與白血球酶組合。選擇特異性結合vegf 之白血球酶抗性dAb。舉例而言，白血球酶抗性dAb當在 3 7°C下在0.04% (w/w)白血球酶溶液中培養至少約2小時之 時間時大體上不降解。在一實施例中，白血球酶抗性dAb 當在37°C下在O.O4% (w/w)白血球酶溶液中培養至少約12小 時之時間時大體上不降解。在一實施例中，白血球酶抗性 dAb當在37°C下在0.04% (w/w)白血球酶溶液中培養至少約 24小時、至少約36小時或至少約48小時之時間時大體上不 降解。 在一實施例中’提供一種選擇抗白血球酶降解且特異性 結合VEGF的免疫球蛋白單一可變區域（dAb)的方法。詨方 法包含提供包含多肽譜系之噬菌體呈現系統，該等多狀包 含免疫球蛋白單一可變區域，使噬菌體呈現系統與白血球 酶（約100 pg/ml)組合且將混合物在約:^它下 1 1口脣（例如）隔 夜（例如約12-16小時），及隨後選擇呈現特異性結合 131458.doc -70- 200911832 之dAb的巫菌體。在另一態樣中，提供一種產生蛋白酶抗 性肽或多肽（例如’ dAb)譜系之方法。該方法包含提供狀 或多肽譜系；在適於蛋白酶活性之條件下使肽或多狀譜系 與蛋白酶組合；及时複數種特異性結^歸之肽或多 肽’藉此產生蛋白酶抗性肽或多肽譜系。適用於方法中之 蛋白酶、呈現系統、蛋白酶活性之條件及選擇肽或多狀之 方法係在本文中相對於其他方法描述。 在-些實施例中，使用包含狀或多狀譜系之呈現系統 (例如，使核酸之編碼功能與由核酸編碼之肽或多肽之功 能特徵相關聯的呈現系統），且該方法進一步包含擴增或 增加編碼複數種所選擇之肽或多肽之核酸的複本數;核酸 可使用任何合適方法、諸如藉由噬菌體擴增、細胞生長或 聚合酶鏈反應加以擴增。 在特定實施例中，提供一種產生包含抗VEGf dAb之蛋 白酶抗性多狀之譜系的方法。該方法包含提供包含抗 VEGF dAb之多肽譜系；在適於蛋白酶(例如，胰蛋白酶、 彈性蛋白酶、白企球酶）活性之條件下使肽或多肽譜系與 蛋白酶組合；及回收複數種包含對VEGF具有結合特異性 之dAb之多肽。該方法可用於產生未經處理之二或偏向 於想要之結合特異性之譜系，諸如基於對有結合 特異性之親本dAb的親和力成熟譜系。 多肽呈現系統 在一實施例中，提供用於本文中所述之士 叮逆之方法中之肽或多 肽之譜系或庫包含合適呈現系統。呈現备 主現系統可抗蛋白酶 131458.doc -71 · 200911832 (YJ如車一蛋白酶或香白酿之纟日人 之拉…， 合及具有蛋白水解活性 占液、支乳官黏液）、支氣管肺泡灌洗 ^組織句漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液、 ;;轉在實施例中，呈現系統及呈現 …與所呈現多肽之間的關聯為至少與譜系之大多 / 肽或多肽—樣抗蛋白酶。此使得編碼所選擇之呈現多狀之 核酸易於分離及/或擴增。 實例中’可自溶液中或共價或非共價連接於合適表 :(諸如塑膠或玻璃(例如，微量滴定板、多肽陣列，諸如 诂陣列))之肽或多肽(例如，dAb)譜系選擇、分離及/或回 好白酶抗性肽或多肽。舉例而言，可使用以將各不同庫 成貝(例如，獨特肽序列)置放在陣列離散預定位置上之方 式位於表面上之肽陣列。可由其在陣列中之空間位置確定 該陣列中之各庫成員之—致性。可確定陣列中發生⑽如） 乾配位體與活性庫成員之間的結合相互作用之位置，從而 基於空間位置鑑別活性成員之序列。（例如參見，美國專 利第 5，143,854號、W0 90/15〇7〇及 w〇 92/1〇〇92。） 在-實施例中，方法採用使核酸之編碼功能與由核酸編 碼之多肽之物理、化學及/或功能特徵相關聯之呈現系 統。該呈現系統可包含複數種可複製基因組，諸如嗔菌體 或細胞(細菌）。在一實施例中，呈現系統包含庫，諸如嗔 菌體呈現庫。 已描述許多合適㈣體呈現系統（例如，單價呈現及多 131458.doc •72- 200911832 價呈現系統）。（例如參見，Griffiths等人’美國專利第 6,5 5 5,3 13 B1號（以引用之方式併入本文中）；Johnson等 人，美國專利第5,73 3,743號（以引用之方式併入本文中）； 14(^&[£61^等人，美國專利第5,969,108號（以引用之方式併 入本文中）；]\41111丨§&11-{^11〇6，美國專利第5,702,892號（以 引用之方式併入本文中）；Winter, G.等人，
Immunol. 12:433-455 (1994) ； Soumillion, P.等人，Appl· Biochem. Biotechnol. 47(2-3): 175-189 (1994) ； Castagnoli, L·專尺 ’ Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2): 121-133 (2001)。）呈現於噬菌體呈現系統中之肽或多肽可呈現 於任何合適噬菌體上’諸如絲狀噬菌體（例如，fd、μ 1 3、 F 1 )、裂解性嗟菌體（例如，Τ4、Τ7、λ)或RNA嗟菌體（例 如，MS2)。 通常產生或提供以與合適噬菌體外殼蛋白（例如，fd ρΙΠ 蛋白）形成之融合蛋白形式呈現肽或嗟菌體多狀错系之嗤 菌體庫。融合蛋白可在噬菌體外殼蛋白之尖端或必要時在 内部位置呈現肽或多肽。舉例而言，所呈現之肽或多肽可 存在於pill之區域丨之胺基未端位置。（ρΙΠ之區域}亦稱為 N1。）所呈現之多肽可與pIIIi接融合（例如，ρπι之區域i 之N-末端）或使用連接子與口⑴融合。必要時，融合物可進 一步包含標籤（例如，myc抗原決定基、His標籤）。可使用 任何合適方法產生包含以與噬菌體外殼蛋白形成之融合蛋 白形式呈現之肽或多肽譜系之庫’該等方法諸如藉由將編 碼所呈現之肽或多肽之噬菌體載體或噬質體(phages句载 131458.doc -73- 200911832 體庫引入合適伤主細菌+，且培養所得細菌以產生嗟菌體 (例如’必要時使用合適辅助噬菌體或互補質體）。可使用 諸如沈殿及離心之任何合適方法自培養物中回收噬菌體 庫。 呈現系統可包含含有任何想要之量之多樣性的肽或多肽 譜系。舉例而言’譜系可含有胺基酸序列具有對應於由生 物體、生物體群（例如，自駱駝類分離之Vhh (1八1?序列之譜 系）、想要之組織或想要之細胞類型表現之天然存在之多 狀的狀或多狀或可含有具有隨機或隨機化之胺基酸序列之 肽或多肽。必要時，多肽可共享共同核心或骨架。該譜系 或該庫中之多肽可包含具有隨機或隨機化之胺基酸序列之 規定區及常見胺基酸序列區。在某些實施例中，譜系中之 所有或大體上所有多肽具有想要之類型，諸如想要之酶 (例如’聚合酶）或想要之抗體之抗原結合片段（例如，人類 vH或人類vL)。在實施例中，多肽呈現系統包含多肽譜 系’其中各多肽包含抗體可變區域。舉例而言，譜系中之 各多肽可含有Vh、Vl或Fv(例如，單鍵Fv)。 可使用任何合適方法將胺基酸序列多樣性引入肽或多肽 或骨架之任何想要之區中。舉例而言，可藉由使用任何合 適突變誘發方法（例如，低保真度PCR、募核苷酸介導之突 變誘發或定位突變誘發，使用NNK密碼子多樣化）或任何 其他合適方法製備編碼多樣性多肽之核酸庫將胺基酸序列 多樣性引入靶區、諸如抗體可變區域或疏水性區域之互補 判定區中。必要時，可隨機化待要使多樣化之多肽之區。 131458.doc • 74· 200911832 構成譜系之纽之尺寸基本上為-個需要選擇之問題， 要均一的多肽尺寸。在一實施例中，譜系中之多肽 ”有至少三級結構(形成至少一個區域）。 選擇/分離/回收 、可使用任何合適方法自譜系或庫（例如，於呈現系統中） 選擇、分離及/或回收 ^ 蛋白酶抗性肽或多肽（例如，蛋白酶 夕肽群體）纟-實施例中，基於可選擇之特徵（例 t，物理特徵、化學特性、功能特徵）選擇或分離蛋白酶 抗!生多肽。合適之可選擇之功能特徵包括譜系中之肽或多 肽之生物活性，例如與_般配位體(例如’超抗原)之結 合、與起配位體（例如’抗原、抗原決定基、《質）之社 合、與抗體之結合(例如，經由肽或多肽上所表現之抗原 決定基）’及催化活性。（例如參見，T〇mlin議等人，w〇
99/20749、WO ◦ 01/57065、W〇 99/58655)。在一實施例 中:選擇係基於特異性結合VEGF。在另一實施例中，選 擇係基於所選擇之功能特徵以產生成員具有蛋白酶抗性之 第二譜系’接著自該第二譜系中選擇特異性結合v卿之 成員。 2一些實施例中’自大體上所有蛋白酶抗性肽或多肽共 旱吊見之可選擇之特禮文的肽或多1之庫或譜系選擇及/或 分離蛋白酶抗性肽或多&。舉例而言，蛋白酶抗性肽或多 肽可k自大體上所有蛋白酶抗性肽或多肽結合常見一般配 =、結合常見靶配位體、結合常見抗體(或由常見抗體 ’··D a )或八有㊉見催化活性之庫或譜系。該類型之選擇尤 131458.doc -75· 200911832 物活性的親本肽或多肽之 當執行免疫球蛋白單一可 其適用於製備基於具有想要之生 蛋白酶抗性肽或多肽譜系，例如 變區域之親和力成熟化作用時。 f..
基於與常見-般配位體之結合選擇可產生含有所有或大 體上所有為原始庫或譜系之組分的蛋㈣抗性肽或多肤之 肽或多肽集合或群體。舉例而言，可藉由淘選或使用合適 親和力基質選擇、分離及/或回收結合乾配位體或諸如蛋 白質A、蛋白質L之一般配位體或抗體之肽或多肽。可藉 由向合適容器（例如，試管、皮氏培養皿）中添加配位體（例 如，一般配位體、靶配位體）之溶液且使配位體變得沈積 或塗佈於容器壁上來實現淘選。可洗除過量配位體且可向 容器中添加肽或多肽（例如，已與蛋白酶一起培養之譜系） 且將容器維持在適於肽或多肽結合固定配位體之條件下。 可洗除未結合肽或多肽且可使用諸如刮削或（例如）降低pH 值之任何合適方法回收結合肽或多肽。 合適配位體親和力基質通常含有配位體共價或非共價連 接之固體支撐物或珠粒（例如，瓊脂糖）。可使用分批法、 官柱法或任何其他合適方法在適於使肽或多肽與基質上之 配位體結合的條件下使親和力基質與肽或多肽（例如，已 與蛋白酶一起培養之譜系）組合。可洗除不結合親和力基 質之肽或多肽，且可使用任何合適方法溶離及回收結合肽 或多狀’該合適方法諸如用較低pH值之缓衝液、用溫和變 性劑（例如，尿素）或用競爭以與配位體結合之肽進行溶 離。在一實例中，在適於譜系中之肽或多肽結合靶配位體 131458.doc -76· 200911832 (VEGF)之條件下使經生物素標記輕配位體與譜系組合。使 用固定抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素（例如，在珠粒上） 回收結合肽或多肽。 在—實施例中，一般配位體為抗體或其抗原結合片 段。結合在庫或譜系之肽或多肽中大體上為保守的狀或多 肽之結構特徵之抗體或抗原結合片段尤其適合作為一般配 位體。適合用作分離、選擇及/或回收蛋白酶抗性狀或多 肽之配位體之抗體及抗原結合片段可為單株或多株，且可 使用任何合適方法製備。 庫/譜系 :其他態樣中，提供蛋白酶抗性肽及多肽譜系編碼蛋 白酶抗性肽及多肽之庫及產生該等庫及譜系之方法。 /使用任何合適方法製備或獲得編碼及/或含有蛋白酶 抗性肽及多肽之庫。該庫可基於所關注之肽或多肽(例 如，選自庫之抗VEGF肽或多肽）經設計以編碼蛋白酶抗性 肽或多肽’或可使用本文中所述之方法選自另一庫。舉例 而言’可使用合適之多肽呈現系統製備富集蛋白酶 肽之庫。 7 在—實财，如本文情述，在適於蛋自料性停件下 使包含呈現多肽（包含免疫球蛋白單—可變區域（例如， νΗ、νκ、νλ))之譜系的噬菌體呈現庫與 相1人 玄白酶組合。基於 Μ要之生物活性，諸如結合活性（例如，姓人 , 、、’σ σ —般配位 产合把配位體)回收蛋白酶抗性多狀，從而產 蛋白鉍抗性多肽之噬菌體呈現庫。在一 八 實施例中’回收係 131458.doc -77· 200911832 基於結合一般配位體以產生富集庫，接著基於特異性結合 VEGF選擇該庫之抗VEGF成員。 在另一實例中，首先篩選包含呈現多肽（包含免疫球蛋 白單-可變區域(例如’ Vh、Vk、νλ))之譜系的噬菌體呈 現庫以鑑別譜系中對想要之靶抗原（例如，VEGF)具有結合 特異性之成員。回收具有想要之結合特異性之多肽集合， 且如本文中所述，在適於蛋白水解活性之條件下使集合與 蛋白酶組合。回收具有想要之靶結合特異性之蛋白酶抗性 多肽集合，從而產生富集蛋白酶抗性且高親和力多肽之 庫。如本文在另一實施例中所述，該選擇方法中之蛋白酶 抗性與高親和力結合相關。 可使用㈣合適方&容易地產生編碼想要類型之多狀譜 系之庫。舉例而言，可獲得編碼想要類型之多肽(例如： 聚合酶、免疫球蛋白可變區域）之核酸序列，且可（例如）藉
由使用易錯（e_-pr_)聚合酶鏈反應（pcR)系統擴增核 酸、藉由化學突變誘發（Deng等Λy⑽以㈣, 269:9533 (1994))或使用細菌突變菌株（w等人乂線 二/·，26。:359 (1996))製備各含有一或多個突變之核酸集 在其他實施例中，向核酸之特定區以供多樣化。使 所選位置產生大變之方法亦為此項技術所熟知且包括(例 如）在使用或不㈣PCR之情況τ㈣錯配寡料 併 寡核㈣。舉例而言’已藉由使突變㈣抗原結合環建立 合成抗體庫。已將隨機或半隨機抗體HUL3區附加至生 131458.doc -78- 200911832 殖系免疫球蛋白v基因片段以產生具有未突變構架區之大 (1994) (1995) 庫（Hoogenboom及 Winter(1992)同上；Nissim 等人， 同上；Griffiths等人，（1994)同上；DeKruif等人’ 同上）。已擴展該多樣化以包括部分或所有其他抗原結合 環（Crameri等人，（1996) 她么，2:1〇〇 ; 等人，（1995) 13:475 ; M〇rph〇sys，wo 97/08320，同上）。在其他實施例中，可例如由採用第一 PCR產物作為"大引子（mega_primer)”之兩步pcR策略靶向 核酸之特定區以供多樣化。（例如參見，Landt，〇等人， 仏加P6·· 125-128 (1990)。）亦可（例如）由S〇E 1>(：11實現靶向 多樣化。（例如參見’ Horton，R.M.等人，G咖77:61-68 (1989)。）
所選擇位置處之序列多樣性可藉由改變指定多肽序列之 編碼序列以便可在該位置併入許多可能的胺基酸（例如， 所有20種或其子集）來實現。使用IUpAC命名法，最通用密 碼子為NNK，其可編碼所有胺基酸以及tag終止密碼子。 可使用NNK密碼子以引入所需之多樣性。亦使用實現相同 終端之其他密碼子，包括NNN密碼子，其使得產生其他終 止雄碼子TGA及TAA。該耙向方法可使完全序列空間處於 待探索之靶區域内。 該等庫可包含具有已知主鏈構形之蛋白酶抗性抗體多 狀。（例如參見，Tomlinson等人，WO 99/20749。） 庫可在合適質體或载體中製備。如本文中所使用，裁體 係指用於將異源DNA引入細胞中以用於其表現及/或複製 131458.doc -79- 200911832 之離散元件。可使用任何合適載體，包括質體（例如，細 菌質體）、病t或嗟菌體載體、人造染色體及游離型载 體。可使用該等载體進行簡單的選殖及突變誘發，或可使 用表現載體驅動庫表現。載體及質體通常含有一或多個選 殖位點（例如，多接頭）、複製起點及至少一個可選擇標記 物基因。表現載體可進一步含有驅動多肽轉錄及轉譯之元 件’諸如增強子元件、啟動子、轉錄終止信號、信號序列 及其類似物m件可以可操作性連接於編碼多肽之經 選殖插入物以致當該表現載體維持在適於表現之條件下 (例如，在合適宿主細胞中）時表現且產生多肽的方式排 列0 選殖及表現載體通常含有使得載體能夠複製於一或多個 所選擇之宿主細胞中之核酸序列。在㈣㈣巾，該序列 通兩為使付載體能夠獨立於宿主染色體dna複冑之序列且 v 包括複製起點或自發複製序列。對於多種細菌、酵母及病 毒’該等序列為吾人所熟知。質體_322之複製起點適 ;大多數革蘭氏陰性菌（Gram_negative b⑽eda)，2微米質 體起點適於酵母’ 多種病毒起點(例如，π糾、腺病毒) 適用於在哺乳動物細胞中選殖載體。哺乳動物表現載體通 常不而要複1起點’除非該等表現載體用於能夠複製高級 DNA之哺乳動物細胞（諸如c〇s細胞）中。 選殖或表現载體可含有亦稱為可選擇標記物之選擇基 =。該等標記物基因編碼為在選擇性培養基中生長之轉型 a、’胞之存活或生長所需的蛋白質。因此，未經含有選 131458.doc 200911832 擇基因之載體轉型之宿主細胞在培養基中將不能存活。典 型選擇基因編碼帶有抗生素及其他毒素（例如，胺苄西林 (ampicillin)、新黴素、甲胺喋呤或四環素）抗性、互補營 養缺陷不足或不可在生長培養基中供應關鍵營養物蛋白 質。 合適表現載體可含有許多組分，例如複製起點、可選擇 “ Z物基因 或多個表現控制元件（諸如轉錄控制元件 (例如’啟動子、強化子、終止子))及/或一或多個轉譯信 號、信號序列或前導序列及其類似物。表現控制元件及信 號或前導序列存在時可由载體或其他來源提供。舉例而 吕，可使用編碼抗體鏈之選殖核酸之轉錄及/或轉譯控制 序列引導表現。 可提供啟動子以表現於想要之宿主細胞中。啟動子可為 組成性或可誘導性啟動子。舉例而言，啟動子可可操作性 連接於編碼抗體、抗體鏈或其部分之核酸，如此其引導核 酸轉錄。可利用多種合適啟動子，對於原核宿主（例如7 對於大腸桿菌（E. coli)為卜内醯胺酶及乳糖啟動子系統、 鹼性磷酸酶、色胺酸（trp)啟動子系統、丁3、丁7 啟動子）及對於真核宿主（例如’猿猴病毒4Q早期或晚期啟 動子、勞氏肉瘤病毒（RoUS sareGma ν_)長末端重複序列 啟動子、細胞巨大病毒啟動子、腺病毒晚期啟動子、即_ 1 a啟動子）。 另外，表現載體通常包含選擇運栽載體之宿主細胞之可 選擇標記物’且在可複製表現載體之狀況下，包含複製起 131458.doc 200911832 點。編碼帶有抗生素或藥物抗性之產物之基因為常見之可 選擇標記物且可用於原核細胞（例如，β-内醯胺酶基因（胺 苄西林抗性）、Tet基因（四環素抗性））及真核細胞（例如，新 黴素（G418或遺傳黴素）、gpt(麥考酚酸）、胺苄西林或潮黴 素抗性基因）中。二氫葉酸還原酶標記物基因准許在多種 宿主中用曱胺喋呤選擇。編碼宿主之營養缺陷標記物之基 因產物的基因（例如，LEU2、URA3、HIS3)通常用作酵母 中之可選擇標記物。亦涵蓋使用病毒（例如，桿狀病毒）或 噬菌體載體及能夠整合於宿主細胞基因組中之載體，諸如 反轉錄病毒載體。 適於表現於原核細胞（例如，細菌細胞，諸如大腸桿菌） 或哺乳動物細胞中之表現載體包括（例如）pET載體（例如， pET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40、Novagen及 其他）、嗟菌體載體（例如，pCANTAB 5 E，Pharmacia)、 pRIT2T(蛋白質 A 融合載體，Pharmacia)、pCDM8、 pCDNAl.l/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-l(Invitrogen, Carlsbad, CA)、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXTl (Stratagene, La Jolla, CA)、pCDEF3(Goldman, L.A.等人， Biotechniques, 27:1013-1015 (1996)) ' pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD)、pEF-Bos (Mizushima，S.等人，Nucleic Acids Res.，18:5322 (1990))及其類似物。可利用適於用於多種表 現宿主中之表現載體，該等宿主諸如原核細胞（大腸桿 菌）、昆蟲細胞（果繩史奈德S2細胞Schnieder S2 cells)、Sf9)、酵母（嗜曱醇酵母（尸· weM㈣o/z'ca)、馬斯 131458.doc -82- 200911832 德畢赤酵母（尸· …）、釀酒酵母（iS· cerevwae))及哺乳 動物細胞（例如，cos細胞）。 載體之實例為使得能夠表現對應於多肽庫成員之核苷酸 序列之表現載體。因此，可藉由使表現多肽庫成員之單一 純系獨立繁殖及表現執行用一般及/或靶配位體進行之選 擇。如上所述，選擇呈現系統可為噬菌體呈現。因此，可 使用嗟菌體或嗔質體載體。例示性載體為具有大腸桿菌複 製起點（用於雙鏈複製）以及噬菌體複製起點（用於產生單鏈 DNA)之嗟質體載體。該等載體之操作及表現在此項技術 中為熟知的（Hoogenboom 及Winter(i992)同上；Nissim 等 人，（1994)同上）。簡言之，载體可含有賦予噬質體選擇性 之β-内醯胺酶基因及在表現卡£上游可含有合適前導序 列、多個選殖位點 '一或多個狀標鐵、一或多個tag終止 密碼子及噬菌體蛋白質pIII之lac啟動子。因此，使用大腸 桿菌之多種抑制因子及非抑制因子菌株且添加葡萄糖、異 丙基硫基-P-D-半乳糖皆（IPTG)或輔助喔菌體，諸如vcs㈣，、 該載體能夠以質體形式複製而不表現，來產生大量僅多肽 庫成員或產物嗤菌冑，其中一些在其表面上含有至少一個 多狀-pill融合物複本。 本文中所述之庫及譜系可含有抗體格式。舉例而言，庫 及譜系中所含之多肽可為整個獨立的^或％區域，其任一 係經修飾或未經修韩。可使用任何合適方法容易：產生 scFv片段以及其他抗體多肽。此項技術中熟知許多 體工程化方法。舉例而言，scFv可藉由使編碼兩個；變^ 131458.doc -83- 200911832 域之核酸與編碼適當連 Q Η、# ^ m (Gly-Gly-Gly-Gly-
Ser)3或其他合適連接子 )5適寡核苷酸相連接而形 成。連接子橋接第一 V區c-末 不端與第二V區N-末端。可使 用構造諸如Fv、Fab及F(ab')只趴 )2片&之其他抗體格式之類似 技術。為編排格式Fab及F(ab丨、 ()2片長，可使VH及VL多肽與 可自重排基因、生殖系c基因分離或由抗體序列資料合成 之怪定Μ段組合。本文中所述之庫或譜系可 或譜系。 f
V 包含蛋白酶抗性可變區域之多肽可包含_配位體（例 如，VEGF)結合位點及一般配位體結合位點。在某些實施 例中，一般配位體結合位點為諸如蛋白質Α、蛋白質L或 蛋白質G之超抗原之結合位點。可變區域可基於任何想要 之可變區域，例如人類Vh(例如，Vh la、vH lb、Vh 2、 VH 3、VH 4、VH 5、VH 6)、人類 νλ(例如，νλΙ、VJI、 νλΙΙΙ、νλιν、νλν、νλνι 或 νκ1)或人類 Vk(例如，Vk2、 VK3、VK4、VK5、Vk6、Vk7、Vk8、Vk9 或 Vk1〇)或視情況經 人化之駱駝類vHH。 產生蛋白酶抗性多肽之核酸、宿主細胞及方法 本發明係關於編碼（例如）由本文中所述之方法可選擇或 選擇之蛋白酶抗性肽或多肽的經分離及/或重組核酸。 本文中稱為"經分離”之核酸為已其原始環境中（例如，細 胞中或諸如庫之核酸混合物中）之其他物質（例如，其他核 酸，諸如基因組DNA、cDNA及/或RNA)遠遠分離之核酸。 經分離核酸可以載體（例如，質體）之部分形式分離。 131458.doc -84- 200911832 本文中稱為”重組”之核酸為已由重組DNA方法產生之核 酉欠，3亥等方法包括依賴於諸如使用（例如）限制酶、同源重 組、病毒及其類似物選殖於載體或染色體中之人工重組之 方法’及使用聚合酶鏈反應（PCR)製得之核酸。 本發明亦係關於重組宿主細胞，其包含（一或多個）包含 編碼蛋白酶抗性肽或多肽、例如由本文中所述之方法可選 擇或選擇之肽或多肽之核酸的重組核酸或表現構築體。亦 提供製造蛋白酶抗性肽或多肽之方法，其包含將本發明之 重組宿主細胞維持在適於表現蛋白酶抗性肽或多肽之條件 下。該方法必要時可進一步包含分離或回收蛋白酶抗性肽 或多肽之步驟。 舉例而言，可使用任何適合於所選擇之宿主細胞之方法 (例如’轉型、轉染、電穿孔、感染），將編碼蛋白酶抗性 肽或多肽之核酸分子（亦即，一或多個核酸分子）或包含該 (該等）核酸分子之表現構築體（亦即，一或多個構築體）引 入合適宿主細&中以冑立重組宿主細&，如此核酸分子可 刼作性連接於一或多個表現控制元件（例如，於載體中、 於由諸多方法在細胞中產生之構築體中、整合於宿主細胞 基因組中）。彳將所得重組宿主細胞維持在適於表現（例 如，在誘導物存在下、在合適動物中、在補充有適當鹽、 生長因子'抗生素'營養增補劑等之合適培養基中）:條 件下，藉此產生經編碼之肽或多肽。必要時，可分離或回 收（例如’自動物、宿主細胞、培養基、乳汁中）經編碼之 肽或多肽。該方法涵蓋表現於轉殖基因動物之宿主細胞中 131458.doc -85- 200911832 (例如參見，WO 92/03918，τ ·
GenPharm International)。
亦可在合適活體外表現备i A 系統中由化學合成或任何其他合 適方法產生由本文中所述之古、、么，n嫂： > 求，t 方法選擇之蛋白酶抗性肽或多 肽。 多肽、dAb及拮抗劑 如本文中所描述及例#，本發明之蛋白酶抗性⑽通常 以高親和力結合其靶配位體。因&，在另一態樣中，提供 選擇、分離及/或回收以高親和力結合VEGF之本發明之多 肽或dAb的方法。該方法通常包含提供肽或多肽（例如， dAb)之庫或譜系，在適於蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性 蛋白酶、白血球酶、胰酶、痰）活性之條件下使該庫或該 譜系與蛋白酶組合，及選擇、分離及/或回收結合配位體 (例如，靶配位體）之肽或多肽。因為庫或譜系已在蛋白酶 敏感肽或多肽將會分解之條件下暴露於蛋白酶中，所以蛋 白酶之活性可消除具有弱結合親和力之不太穩定的多肽， 且從而產生高親和力結合肽或多肽之集合。 舉例而言，本發明之多肽或dAb可以3〇〇 nM至約i (亦 即，3x10 7至 5x10 12 Μ)、例如 50 nM至 1 pM、例如 5 nM至 1 pM且例如1 nM至！ pM之親和力（KD ;如由表面電毁共振 所測定KD。。。〆]^)/：^。〆!^))結合VEGF ;例如如由表面電 漿共振所測定，KD為1 X 1 〇·7 Μ或以下，例如1 X丨〇·8 M戈以 下，例如lxlO-9 Μ或以下’例如ΐχ10·]〇 μ或以下及例如 1χ1〇-11 Μ或以下；及/或Κ()„速率常數為5XUT1 s-]至lxl〇-7sl， 例如 lxl〇-2 s-i至 1x10-6 s-i，例如 5x1〇-3 s-i至 1χ1〇-5 〆，例 131458.doc •86- 200911832 如5χ1〇 1 S-1或以下’例如lxl〇-2 S-1或以下，例如1χ1〇·3 , 或以下，例如1 x 1 〇·4 S.1或以下，例如丨X丨0-5 S_1或以下，例 如lxio·6 S-1或以下。 雖然吾人不受任何特定理論限制，但咸信，抗蛋白酶之 狀及多肽具有較低熵及/或較高穩定能。因此，蛋白酶抗 性與高親和力結合之間的相關性可能與由本文中所述之方 法所選擇之肽及及多肽及dAb之表面緊密性及穩定性相 關。 在一實施例中，本發明之多肽、dAb或拮抗劑以約1 μΜ 或以下、約500 ηΜ或以下、約100 ηΜ或以下、約75 ηΜ或 以下、約50 ηΜ或以下、約1〇 ηΜ或以下或約1 ηΜ或以下 之抑制濃度5〇(IC50)抑制VEGF之結合。 在某些實施例中’多肽、dAb或拮抗劑以如由表面電漿 共振所測定300 ηΜ至1 pM、或300 ηΜ至5 pM、或5〇 nM至 1 PM、或 50 nM至 5 pM、或 50 ηΜ至 20 pM、或約 1() pM、 或約1 5 PM、或約20 pM之解離常數（KD)特異性結合 VEGF ’例如人類VEGF且與人類VEGF解離。在某些實施 例中，多肽、dAb或括抗劑以如由表面電衆共振所測定 klO·1 S·1 至 lxl〇·7 S·1、例如 lxl0_2 S_1 至 lxl〇-6 s_〗、例如 5xl0·3 S·1 至 1χ10_5 s-1、例如 5X10·1 s·1 或以下、例如 lxl〇-2 S-1 或以下、例如或lxio·3 S·1或以下、例如lxio·4 S-1或以下、 例如lxl〇-5 S-1或以下及例如lxl0-6 S-1或以下之艮咐速率常 數特異性結合VEGF，例如人類VEGF，且與人類vEGF解 離〇 131458.doc -87- 200911832 在某些實施例中，多肽、dAb或拮抗劑以lx 1〇·3 Μ、·1至 1χ10_7 M-1s-1、或 lxlO·3 M-1s_1至 1χ1〇-6 Μ·、-1、或約 1χ1〇-4 Μ·丨s·1、或約lxio^MdS·1之Kon特異性結合VEGF，例如人 類VEGF。在一實施例中，多肽、dAb或拮抗劑以如該段落 中所詳細說明之解離常數（KD)及KQff特異性結合VEGF，例 如人類VEGF，且與人類VEGF解離。在一實施例中，多 肽、dAb或拮抗劑以如該段落中所詳細說明之解離常數 (Κ〇)及K〇n特異性結合VEGF，例如人類VEGF，且與人類 VEGF解離。在一些實施例中，多肽或dAb以該段落中所述 之KD及/或及/或Km特異性結合VEGF(例如，人類 VEGF) ’ 且包含與具有選自〇〇河15-26-595、0〇]\415-26-591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM15-26-555 及 DOM 15-10-11之胺基酸序列之胺基酸序列的dAb的胺基酸 序列至少或至少約 80%、85%、90%、91%、92%、93。/〇、 94%、95%、96%、97%、98%或99%—致之胺基酸序列。 可將多肽、dAb或拮抗劑表現於大腸桿菌或畢赤酵母物 種（例如，馬斯德畢赤酵母）中。在一實施例中，當表現於 大腸桿菌或畢赤酵母物種（例如，馬斯德畢赤酵母）中時， 分泌至少約0.5 mg/L之量之配位體或dAb單體。雖然當表 現於大腸桿菌或畢赤酵母物種（例如，馬斯德畢赤酵母）中 時，可分泌本文中所述之配位體及dAb單體，但其可使用 任何合適方法產生，諸如合成化學方法或不採用大腸桿菌 或畢赤酵母物種之生物產生方法。 在-些實施例巾，多肽、dAbS拮抗劑不包含路歇類免 131458.doc -88- 200911832 疫球蛋白可變區域或一或多個僅為駱駝類生殖系抗體基因 片段所編碼之免疫球蛋白可變區域所特有之構架胺基酸， 例如在位置108、37、44、45及/或47處° 本發明之VEGF之拮抗劑可為單價或多價拮抗劑。在一 些實施例中，拮抗劑為單價且含有一個與VEGF相互作用 之結合位點，該結合位點由本發明之多肽或dAb提供。單 價拮抗劑結合一個VEGF且可能不會誘導可引起受體活化 及信號轉導之細胞表面上之VEGF的交聯或叢集。 在其他實施例中，VEGF之拮抗劑為多價拮抗劑。VEGF 之多價拮抗劑可含有兩個或兩個以上特定VEGF結合位點 複本或含有兩個或兩個以上結合VEGF之不同結合位點， 該等結合位點中之至少一個由本發明之多肽或dAb提供。 舉例而言，如本文中所述，VEGF之拮抗劑可為包含兩個 或兩個以上結合VEGF之本發明之特定多肽或dAb複本或兩 個或兩個以上結合VEGF之本發明之不同多肽或dAb的二聚 體、三聚體或多聚體。在某些實施例中，VEGF之多價拮 抗劑含有兩個或兩個以上VEGF之想要之抗原決定基或區 域的結合位點。 因為某些配位體（及拮抗劑）可用於結合且偵測、定量或 量測樣品中之VEGF，所以其可具有診斷劑之效用。因 此，可進行樣品中是否存在VEGF或存在多少VEGF之精確 測定。 在其他實施例中，多肽、dAb或拮抗劑以本文中所述之 KD特異性結合VEGF且在標準鼠類異種移植模型中抑制腫 131458.doc -89- 200911832 瘤生長（例如，與合適對照相比，抑制腫瘤生長至少約 10/。）在一實施例中，當投與約1 mg/kg或以上，例如約5 或10 mg/kg時，與標準鼠類異種移植模型中之合適對照相 比，多肽、dAb或拮抗劑抑制腫瘤生長至少約丨〇0/。或至少 約25%或至少約50〇/〇。 在其他實施例中’多肽、dAb或拮抗劑結合VEGF且在標 準細胞檢定中以$ 1〇〇 nM之ND50拮抗VEGF之活性。 在某些實施例中，當在發炎性疾病之動物模型（諸如w〇 2006038027 及 WO 2006059108 及 WO 2007049017 中所述之 杈型）中投與有效量之本發明之多肽、dAb或拮抗劑時為有 效的。有效量通常為約1 mg/kg至約1〇 mg/kg(例如，約！ mg/kg、 約 2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 ό mg/kg、約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg 或約 10 mg/kg)。熟習此項技術者認為慢性發炎性疾病模型可預測 在人類中之治療功效。 本發明配位體（例如，拮抗劑）通常將以純形式與藥理學 上適當之載劑一起使用。該等載劑通常包括水性或醇性/ 水性溶液、乳液或懸浮液，任何均包括生理食鹽水及/或 緩衝介質。非經腸媒劑包括氣化鈉溶液、林格氏右旋糖 dngef’s dextrose)、右旋糖及氣化鈉及乳酸化林格氏液 (lactated Ringeris)。必要時保持多肽複合物呈懸浮狀之合 適的生理學上可接受之佐劑可選自增稠劑，諸如羧甲基纖 維素、聚乙烯吡咯啶酮、明膠及海藻酸鹽。 靜脈内媒劑包括流體及營養物補充劑及電解質補充劑， 131458.doc 200911832 諸如基於林格氏右旋糖之彼等。亦可存在諸如抗菌劑、抗 氧化劑、螯合劑及惰性氣體之防腐劑及其他添加劑（Mack (1982) Remingtonis pharmaceuticaJ ，第 版）。可 使用多種合適調配物，包括延緩釋放調配物。 本發明之配位體（例如，拮抗劑）可以單獨投與之組合物 形式使用或與其他藥劑結合使用。該等藥劑可包括多種免 疫：療藥物，諸如環孢素、甲胺嗓吟、阿黴素或順翻及免 疫毒素。醫藥組合物可包括多種細胞毒性劑或其他藥劑與 本發明之配位體或甚至不管在投藥之前是否彙集之具有不 =特ί生的本發明之配位體（諸如使用不同乾抗原或抗原決 定基選擇之配位體）之組合結合的"混合物"。 本發明之醫藥組合物之投藥途徑可為_般熟習此項技術 者L韦已知之任-投藥途徑。對於治療（包括不限於免疫 治療)而言，可根據標準技術向任何患者投與本發明之所 選擇之配位體。 i. 投藥可藉由任何適當模式，包括非經腸、靜脈内、肌肉 内、腹膜内、經皮、經由肺途徑或亦適當地，#由用導管 直接輸注。投藥劑量及頻率應視患者之年齡、性別及病 症、其他藥物之並行投與、禁忌症及臨床醫師要考慮之其 財數而冑。如所指示，投藥可為局部（例如，藉由肺投 樂方式局部向肺傳遞，例如，鼻内投藥方式）或全身性。 =明之配位體可轉乾以便儲心在使用之前於合適 已經由^免疫球蛋白展示該技術有效，且 可採用技術已知之魏及復原技術。熟習此項技術者應瞭 131458.doc 200911832 ，束乾及復原可導致不同程度之抗體活性損失（例如， 對於習知免疫球蛋白而言，IgM抗體傾向於比砂抗體具有 較大之活性損失）且可能必須上調用量來補償。 含有本發明配位體（例如，括抗劑）或其混合物之組合物 可出於預防性及/或治療性治療目的而投與。纟某些治療 應时二所選擇細胞之群體之足以實現至少部分抑制、抑 止"周即、权死或-些其他可量測參數之量係定義為"治 療有效劑夏"°達成該劑量所需之量應視疾病之嚴重程度 及患者自身免疫系統之—般狀態而定，但通常在每公斤體 重005 mg至5.0 mg配位體（例如dAb或拮抗劑）範圍内，其 中更通常使用0.05至2.〇毫克/公斤/劑量之劑量。對於預防 性應用，亦可以類似或稍低劑量投與含有本發明配位體或 其混合物之組合物以預防、抑制或延遲疾病發作（例如， .隹持症狀緩解或靜止期，或阻止急性期）。熟練的臨床醫 師應能夠確定治療、抑止或預防疾病之適當給藥間隔。當 投與VEGF配位體（例如，拮抗劑）以治療、抑止或預防疾病 時，可以（例如）約10料/kg至約8〇 mg/kg、約1〇〇叩心至 mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg 約1 mg/kg至約30 約1 mg/kg至約l〇 約1 〇 pg/kg至約5 約 1 mg/kg、約 2 約 mg/kg 約1 mg/kg至約 8〇 mg/kg、約 1 mg/kg至約 70 mg/kg、約丨mg/kg至約6〇 mg/kg、約丨至約 約 1 mg/kg 至約 40 mg/kg、 約 1 mg/kg 至約 20 mg/kg 約 1〇 pg/kg 至約 10 mg/kg 約1〇 pg/kg 至約 2.5 mg/kg 約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg 131458.doc -92- 200911832 約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg或約1 0 mg/kg之劑量每 天才又與至多4次、每週兩次、每週一次、每兩週一次、每 月一次或每兩月一次。在特定實施例中，以約1 〇 gg/kg至 約 10 mg/kg(例如，約 1〇 gg/kg、約 1〇〇 gg/kg、約 1 mg/kg、 約 2 mg/kg、約 3 mg/kg、約 4 mg/kg、約 5 mg/kg、約 6 mg/kg、約 7 mg/kg、約 8 mg/kg、約 9 mg/kg或約 10 mg/kg) 之劑量每兩週一次或每月一次投與vEgf配位體（例如，拮 抗劑）來治療、抑止或預防疾病。 若相對於治療之前所存在之一或多個症狀或相對於未經 該組合物或其他合適對照物治療之個體（人類或模型動物） 中之該或該等症狀，減少該或該等症狀（例如，減少至少 10%或臨床評估表上之至少一個點），則認為使用本文中所 述之組合物執行之治療或療法"有效”。雖然症狀顯然將視 靶向之疾病或病症而變化，但其可由一般熟練的臨床醫師 或技師加以量測。該等症狀可（例如）藉由監測疾病或病症 之或多個生化指標之含量（例如，與疾病、感染細胞數 目等相關之酶或代謝物之含量）、藉由監測物理表現症狀 (例士發乂、腫瘤尺寸等）或藉由公認之臨床評估表量 測。 類似地，若相對於未經組合物治療之類似個體（人類或 動物杈)中之一或多個症狀’延遲、減少或消除該或該 等症狀之發作或嚴重程度，驗用如本文巾料之組合物 執行之預防"有效"。 3有本發明之配位體（例 抬抗劑）或其混合物之組合 131458.doc •93- 200911832 物可在預防性及治療性情形下使用以幫助改變、滅活、殺 死或移除哺乳動物中所選擇之靶細胞群體。另外，可離體 或活體外選擇性使用本文中所述之所選擇之多肽譜系以殺 死、排除或自細胞之異源集合有效移除把細胞群體。可使 哺乳動物之血液與配位體離體組合，藉此根據標準技術殺 死或自金液移除不想要之細胞從而將血液送回至哺乳動物 中〇 含有本發明之配位體（例如，拮抗劑）之組合物可在預防 性及治療性情形下使用以幫助改變、滅活、殺死或移除哺 乳動物中所選擇之靶細胞群體。 配位體（例如，抗VEGF拮抗劑、dAb單體）可與一或多種 八他/α療或活性劑一起投與及/或調配。當配位體（例如， dA=與其他治療劑—起投與時，配位體可在投與其他藥劑 之:與其同時或在其之後投與。配位體及其他藥劑通常 以提供疊加治療效應之方式投與。
在一實施例中，本發明主 _ ^ 發月為一種治療、抑止或預防選自 (例如）癌症（例如，眘辦M广、 U女實體腫瘤）、發炎性疾病、自體免疫疾 病、血管增生性痴、忘r ，广、产 疾病(例如’ AMD(年齡相關黃斑退化))之 疾病之方法，該方法包含 效劑量或量之… 哺乳動物投與治療有 拮抗劑。多肽、結合vEGF之敗^咖之 本發明提供—種、Λ，底 之方法。因此， 抑止或預防肺病 要之哺乳動物投 H、抑止或預防 在另一實施例中，太欲。。 ”本發明為-種治4 (例如，肺癌）之方法， 項方法包含向 131458.doc -94* 200911832 與治療有效劑量或量之本發明之多狀、dAb0EGF之抬抗 劑0 +在特定實施例中，VEGI^#抗劑係經由肺傳遞、諸如 藉由吸入(例如’支氣管内、鼻内或經口吸入、鼻内滴劑) 投與或藉由全身傳遞(例如，非經腸、靜脈内、肌肉内、 腹膜内、皮下）投與。 日在本發明之另—態樣中，提供-種組合物，纟包含本發 月之多肽、dAb或VEGF拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑、 稀釋劑或賦形劑。 此外，本發明提供一種使用本發明之多肽、⑽或VEgf 拮抗劑或組合物治療疾病之方法。在—實施射，疾病為 =Ή Η實體腫瘤）或發炎性疾病⑽如，類風濕性關節 炎）或自體免疫疾病或血管增生性疾病（諸如年齡相 關黃斑退化））。 格式
半衰期增加可適用於免疫球蛋白、尤其抗體且最尤其小 尺寸抗體片段之活體内應用。該等片段（F”雙硫鍵鍵結 之卜、1^、咖，遭遇自身體内之快速清除；因 :，雖然其能夠快速到達身體之大部分且快速產生且易於 0理，但其活體内應用因其僅短暫之活體㈣久性而受到 ,. 、包例藉由提供活體内半衰期增加且因 此在身體内具有持續時間較 來解決該問題。 之配位體功…之配位體 ‘習此項技術者應熟悉藥物動力學分析及配位體半衰期 131458.doc -95- 200911832 之測定之方法。詳情可見於ATe^mei/2, J等人，Chemical
Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists及
Peters # A，Phannacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)。亦參考"Pharmacokinetics”，M Gibaldi及 D Perron, 由 Marcel Dekker 出版，第 2 修訂附加版（Rev. ex edition) (1982) ’其描述藥物動力學參數，諸如仏及邙半衰期及曲 線下面積（AUC)。 半衰期（tKa及t1/#)及AUC可由配位體之血清濃度對時間 之曲線確定。可使用WinNonlin軟體套件（自Pharsight Corp·，Mountain View，CA94040, USA獲得）模擬曲線。在 第一期（α期）中，配位體主要分布於患者中，其中部分消 除。第二期（β期）為末期，此時配位體已分布且血清濃度配 位體隨著自患者中清除配位體而降低。ta半衰期為第一期 之半农期且tp半衰期為第二期之半衰期。因此，在一實施 例中’本發明提供ta半衰期在15分鐘或以上範圍内之配位 體或包含本發明之配位體的組合物。在—實施例中，範圍 ,下限為30分鐘、45分鐘、工小時、2小時、3小時、4小 ^外5/時、6小時、7小時、叫時、叫、時或12小時。 ，其他，本發明之配位體或組合物應具有在至多…、 匕括12小時範圍内之ta半衰期。在__ f浐& 之上限為在實她例中，範圍 或1 7 6或5小時。合適範圍之眚办丨 為1至6小時、㈣、時或3至4小時。“圍之實例 ^實施例中，本發明提供料衰期在 圍内之配位鲈，交刀理4 Μ上耗 ^或拮抗劑)或包含本發明之配位 131458.doc -96- 200911832 體的組合物。在一實施例中，範圍之下限為45分鐘、 時、2小時3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、1〇小 時、11小時或12小時。另外或其他，本發明之配位體或組 合物具有在至多21天且包括21天範圍内之叩半衰期。在一 實施例中，範圍之上限為12小時、24小時、2天、3天、5 天、10天、15天或20天。在一實施例中，本發明之配位體 或組合物應具有12至60小時範圍内之tp半衰期。在另一實 施例中，其應在12至48小時範圍内。在又一實施例中，其 應在12至26小時範圍内。 除以上標準以外或其他’本發明提供AUC值（曲線下面 積）在1 mg · min/ml或以上範圍内之配位體或包含本發明之 配位體之組合物在一實施例中，範圍之下限為5、1 〇、 15、20、30、100、200或 300 mg.min/ml。另外或其他，本 發明之配位體或組合物具有在至多600 mg.min/ml範圍内之 AUC。在一實施例中’範圍之上限為50〇、400、300、 200、150、100、75 或 50 mg . min/ml。在一實施例中，本 發明之配位體應具有在選自由以下各範圍組成之群之範圍 内之AUC: 15至 150 mg.min/ml、15至 1〇〇 mg.min/ml、15 至 75 mg · min/ml及 1 5 至 50 mg · min/ml。 本發明之多肽及dAb及包含該等多肽及dAb之拮抗劑可 經編排格式以具有較大流體動力學尺寸，例如，藉由連接 PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少 其轉鐵蛋白結合部分、抗體Fc區，或藉由接合抗體區域。 舉例而言’多肽dAb及拮抗劑經編排格式為抗體之較大抗 131458.doc -97· 200911832 原結合片段或抗體（例如’經編排格式為Fab、Fab'、 F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFv)。 可使用此項技術中熟知之方法測定本發明之配位體（例 如，dAb單體及多聚體）之流體動力學尺寸。舉例而言，可 使用凝膠過濾層析法測定配位體之流體動力學尺寸。諸如 交聯瓊脂糖基質之測定配位體之流體動力學尺寸之合適凝 膠過濾基質為吾人所熟知且可容易地獲得。 配位體格式之尺寸（例如，連接於dAb單體之peg部分之 尺寸）可視想要之應用而變化。舉例而言，當配位體意欲 離開循環且進入周邊組織時，希望保持配位體之流體動力 學尺寸較低以有助於自血流溢出。或者，當希望使配位體 保留在體循環中較長時間時，可（例如）藉由編排格式為“ 樣蛋白增加配位體尺寸。 藉由靶向增加活髏内半衰期之抗原或抗原決定基延長半衰期
亦可藉由使本發明之VEGF結合多肽、dAb或拮抗劑與結 合如本文中所述之增加活體内半衰期之抗原或抗原決定基 的結合區域(例如’抗體或抗體片段)接合或締合來增加配 位體之流體動力學尺寸及其血清半衰期。舉例而言，可使 VEGF結合劑（例如，多肽）與抗血清白蛋白或抗新生兒以受 體抗體或抗體片段（例如，抗SA或抗新生兒卜受體抓、 Μ、Fab’或scFv)或與抗s a親和體或抗新生兒&受體親和 體或抗SA avimer或抗SA結合區域接合或連接，該抗从結 ^區域包含選自（但較佳不限於）由以下各物組成之群之骨 木.CTLA-4、脂質運載蛋白、SpA、親和體、⑽繼、 131458.doc -98- 200911832
GroEl及纖維連接蛋白（參見，2008年2月8日由+主 甲s月之揭示該 等結合區域之PCT/GB2008/000453，該等區域及其序列γ 引用之方式併入本文中且構成本發明正文之揭示内容之j 部分）。接合物係指包含鍵結（共價或非共價）於結合血清 蛋白之結合區域的本發明之多肽、dAb或拮抗劑之 物。 增加活體内血清半衰期之合適多肽包括（例如）轉鐵蛋白 受體特異性配位體-神經藥劑融合蛋白（參見美國專利第 5’977,307號’其教示内容以引用之方式併入本文中）' 腦 毛細血管内皮細胞受體、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體（例 如’可溶性轉鐵蛋白受體）、騰島素、騰島素樣生長因子 i(igf 1)受體、騰島素樣生長因子2(IGF2)受體、騰島素受 體、金凝因子X、al_抗騰蛋白酶及HNF 1α。增加血清半 衰期之合適多肽亦包括α-1醣蛋白（血清類黏蛋白；AAG)、 α-l抗凝乳蛋白酶（ACT)、α—丨微球蛋白（蛋白質HC ; AIM)、抗凝血酶ΠΙ(ΑΤΙ11)、脫脂蛋白Α-1(Αρο Α_υ、脫脂 蛋白Β(Αρο Β)血漿銅藍蛋白（Cp)、互補組分C3(c3)、互 補組分C4㈣、C1SI酶抑制劑（C1 INH)、c_反應蛋白 (⑽）、鐵蛋白（FER)、*液結合素（Ηρχ)、脂蛋白 (a)(Lp(a))、甘露糖姓a疋^ / 、 糖、、°蛋白（MBP)、肌血球素（My0)、前 白蛋白（甲狀腺素運送蛋白；pAL)、視黃醇結合蛋白（RBp) 及類風濕因子（RF)。 來自細胞外基質之人、*说 土買之合適蛋白質包括（例如）膠原' 層黏連 蛋白、整合素及纖維連接蛋白。膠原為細胞外基質之主要 131458.doc -99· 200911832 蛋白質。目前已知約15種類型之膠原分子，可見於身體之 不同部位，例如I型膠原（佔體膠原之90%)可見於骨、皮 膚、鍵、動帶、角膜、内臟中或II型膠原可見於軟骨、脊 椎盤、脊索及眼睛玻璃狀液中。 企液之合適蛋白質包括（例如）血漿蛋白（例如，纖維蛋 白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原（例如，纖維 蛋白原A、纖維蛋白原Β)、血清澱粉樣蛋白a、結合珠蛋 則纖維蛋白（pr()fllin) '泛素、子宮球蛋白及卜2-微球 蛋白）、酶及酶抑制劑（例如，纖溶酶原、溶菌酶、半胱胺 酸蛋白酶抑制劑C(cystatin 〇、α+抗胰蛋白酶及胰腺胰 蛋白酶抑制劑)、免疫系統蛋白f，諸如免疫球蛋白蛋白 質（例如、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白輕鏈 (κ/λ))、轉運蛋白（例如，視黃醇結合蛋白、心丨微球蛋 白）、防禦素（defensin)(例如，β_防禦素i、嗜中性白企球 防禦素1、嗜中性白血球防禦素2及嗜中性白血球防禦素3) 及其類似物。 、” 血腦屏障或神經組織中可見之合適蛋白質包括（例如）黑 色素皮質素梵體、髓磷脂、抗壞血酸轉運體及其類似物。 增加活體内血清半衰期之合適多肽亦包括位於腎中之蛋 白質（例如，多囊蛋白（p〇lycystin)、IV型膠原、有機陰離 子轉運體K1、海曼氏抗原（Heymannj antigen))、位於肝中 之蛋白質（例如，乙醇脫氫酶、G25〇)、位於肺中之蛋白質 (例如，結合IgA之分泌組分）、位於心臟中之蛋白質（例 如，與擴張性心肌病相關之HSp 27)、位於皮膚之蛋白質 】31458.doc -100- 200911832 =如’角蛋白）、骨特異性蛋白f (諸如促進骨生成之蛋白 質（BMP)，其為顯示成骨活性之蛋白f之轉化生長因子陳 家族的子集（例如，ΒΜΡ_2、ΒΜρ·4、BMp_5、驗“ 跳7、驗价腫瘤特異性蛋白f(例如，滋養母細胞 抗原、贺癌平受體（h⑽Ptin reeeptGr)、雌激素受體組 織蛋白酶（例如，可見於肝及脾中之組織蛋白酶… 合適之疾病特異性蛋白質包括（例如）僅表現於活化τ_細 胞上之抗原（包括LAG_3(淋巴細胞活化基因））、骨保護素
配位體（OPGL ;參見加e 402, 304-309 (1999))、〇X4〇(TNF 受體家族之成員，表現於活化T細胞上且尤其在1型人類τ 細胞白血病病毒（HTLV-I)產生細胞中上調；參見 165 (1):263-70 (2000))。合適之疾病特異性蛋白質亦包括 (例如）金屬蛋白酶（metall〇proteaseK與關節炎/癌症相關）， 包括CG6512果蠅、人類截癱蛋白（paraplegin)、人類
FtsH、人類AFG3L2、鼠類ftsH;及血管生成生長因子，包 括酸性纖維母細胞生長因子（FGF—；!)、鹼性纖維母細胞生 長因子(FGF-2)、血管内皮生長因子/血管滲透因子(VEGF/vpF)、 轉化生長因子-a(TGF α)、腫瘤壞死因子_a(TNF-a)、血管 生長素（angiogenin)、介白素-3(IL-3)、介白素-8(IL-8)、血 小板源内皮生長因子（PD-ECGF)、胎盤生長因子（P1GF)、 中期因子血小板源生長因子-BB(PDGF)及弗拉塔凱。 增加活體内血清半衰期之合適多肽亦包括應力蛋白，諸 如熱休克蛋白（HSP)。HSP通常在細胞内可見。當其細胞 外可見時，其為細胞已死亡且溢出其内含物之指示。因外 131458.doc -101 - 200911832 傷、疾病或損傷，發生該未計劃之細胞死亡（壞死），細胞 外HSP引發免疫系統之反應。與細胞外HSp之結合可使得 使本發明之組合物定位於疾病部位。 涉及Fc轉運之合適蛋白質包括（例如）布蘭貝爾受體 (Brambell receptor)(亦稱為FcRB)。Fc受體具有兩種功能， 兩者均潛在適用於傳遞《該等功能為（丨）自母體穿過胎盤轉 運IgG至小孩’（2)保護IgG以免降解，從而延長其血清半 衰期。認為受體使IgG自核内體再循環。（參見，Holliger 等人，iVoi 15(7):632-6 (1997)。） 結合血清白蛋白之dAb 在一實施例中，本發明提供一種包含結合TNFR1之抗 TNFR1 dAb(第一 dAb)及結合血清白蛋白（SA)之第二dAb之 多肽或拮抗劑（例如’雙特異性配位體），該第二dAb以如 由表面電漿共振所測定1 nM至1、2、3、4、5、10、20、 30、40、50 ' 60、70、100、200、300、400 或 500 μΜ(亦 即，xlO·9至 5Χ10-4)或 100 nM至 1〇 μΜ、或 1至 5 μΜ、或 3至 70 nM、或10 nM至1、2、3、4或5 μΜ之KD結合SA。舉例 而言，如由表面電漿共振所測定3〇至70 nM。在一實施例 中’第一 dAb(或dAb單體）以如由表面血聚共振所測定約
1、50、70、100、150、200、300 nM或 1、2 或 3 μΜ之 KD 結合SA(例如，HSA)。在一實施例中，對於包含第一抗SA dAb及第二抗VEGFdAb之雙特異性配位體而言，第二从匕 對其靶之親和力（例如，如由表面電漿共振、例如使用 BiaCore所量測，KD及/或Koff)為第一 dAb對SA之親和力的i 131458.doc -102· 200911832 至 100000 倍（例如 ’ 100 至 100000、或 1000 至 100000、或 10000至100000倍）。在一實施例中，血清白蛋白為人類血 清白蛋白（HSA)。舉例而言，第一 dAb以約ίο μΜ之親和力 結合SA，而第二dAb以100 ρΜ之親和力結合其無。在一實 施例中’血清白蛋白為人類血清白蛋白（HSA)。在一實施 例中，第一 dAb 以約 50 ηΜ ’ 例如 70、1〇〇、150 或 200 ηΜ 之KD結合SA(例如，HSA)。雙特異性配位體之詳情可見於 WO 03002609、WO 04003019及 WO 04058821 中。 在一實施例中，本發明之配位體可包含以如由所表面電 漿共振測定 1 ηΜ至 1、2、3、4、5、10、20、30、40、 50、60、70、100、200、3 00、400或 500 μΜ(亦即，χΐ(Γ9 至 5xl〇-4)或 1〇〇 ηΜ 至 10 μΜ、或 1至 5 μΜ、或3 至 70 ηΜ、 或ΙΟηΜ至1、2、3、4或5 μΜ之KD結合血清白蛋白（SA)之 dAb。舉例而言，如由表面電漿共振所測定3〇至7〇 ηΜ。 在一實施例中，第一 dAb(或dAb單體）以如由表面血漿共振 所測定約 1、50、70、1〇〇、150、200、300 ηΜ或 1、2 或 3 pM2KD結合SA(例如，HSA)。在一實施例中，第一及第 二dAb由連接子連接，例如1至4個胺基酸或1至3個胺基酸 或超過3個胺基酸或超過4、5、6、7、8、9、10、15或20 個胺基酸之連接子。在一實施例中，使用較長連接子（超 過3個胺基酸）增加效價（拮抗劑中之一個或兩個dAb之 KD)。 在配位體及拮抗劑之特定實施例中，dAb結合人類血清 白蛋白且與選自由以下各物組成之群之dAb競爭以結合白 131458.doc •103· 200911832 蛋白： MSA-16、MSA-26(關於該等序列之揭示内容，參見WO 04003019，該等序列及其核酸對應物以引用之方式併入本 文中且構成本發明正文之揭示内容的一部分）， DOM7m-16(SEQ ID NO: 473) ' DOM7m-12(SEQ ID NO: 474)、DOM7m-26(SEQ ID NO: 475)、DOM7r-l(SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3(SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4(SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5(SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7(SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8(SEQ ID NO: 481)、DOM7h-2(SEQ ID NO: 482) ' DOM7h-3(SEQ ID NO: 483) > DOM7h-4(SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6(SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l(SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7(SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22(SEQ ID NO: 489) ' DOM7h-23(SEQ ID NO: 490) ' DOM7h-24(SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25(SEQ ID NO: 492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO: 493) > DOM7h-21(SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27(SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8(SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13(SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14(SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15(SEQ ID NO: 499) ' DOM7r-16(SEQ ID NO: 500)、DOM7r-17(SEQ ID NO: 501)、 DOM7r-18(SEQ ID NO: 502)、DOM7r-19(SEQ ID NO: 503)、DOM7r-20(SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21(SEQ ID NO: 505)、DOM7r-22(SEQ ID NO: 506) ' DOM7r-23(SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24(SEQ ID NO: 508)、DOM7r-25(SEQ ID NO: 509)、DOM7r-26(SEQ ID NO: 510)、 131458.doc • 104- 200911832 DOM7r-27(SEQ ID NO: 511) ' DOM7r-28(SEQ ID NO: 512) ' DOM7r-29(SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30(SEQ ID NO: 514)、DOM7r-31(SEQ ID NO: 515)、DOM7r-32(SEQ ID NO: 516)、DOM7r-33(SEQ ID NO: 517)(關於該等序列 之揭示内容，參見W02007080392，該等序列及其核酸對 應物以引用之方式併入本文中且構成本發明正文之揭示内 容的一部分；該段落中之SEQ ID No為W02007080392中所 出現之SEQ ID No)， dAb8(dAb 10)、dAb 10、dAb36、dAb7r20(DOM7r20)、 dAb7r21(DOM7r21) 、 dAb7r22(DOM7r22) ' dAb7r23(DOM7r23) dAb7r24(DOM7r24) ' dAb7r25(DOM7r25) > dAb7r26(DOM7r26) 、 dAb7r27(DOM7r27) dAb7r28(DOM7r28) dAb7r29(DOM7r29) dAb7r29(DOM7r29) 、 dAb7r31(DOM7r31) dAb7r32(DOM7r32) 、 dAb7r33(DOM7r33) dAb7r33(DOM7r33) 、 dAb7h22(DOM7h22) 、 dAb7h23(DOM7h23) 、 dAb7h24(DOM7h24) dAb7h25(DOM7h25) 、 dAb7h26(DOM7h26) dAb7h27(DOM7h27) 、 dAb7h30(DOM7h30) ' dAb7h31(DOM7h31)、dAb2(dAb4、 dAb7、dAb41)、dAb4 、dAb7 、dAbll、dAbl2(dAb7ml2)、 dAbl3(dAb 15)、dAb 15、dAbl6(dAb21、dAb7ml6)、 dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、dAb23、 dAb24、dAb25(dAb26、dAb7m26)、dAb27、dAb30(dAb35)、 131458.doc -105- 200911832 dAb31 、dAb33 、dAb34、dAb35 、dAb38(dAb54)、 dAb41、dAb46(dAb 47、dAb 52 及 dAb 56)、dAb47、 dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7ml2、 dAb7ml6、dAb7m26、dAb7rl(DOM7rl)、dAb7r3(DOM7r3)、 dAb7r4(DOM7r4)、dAb7r5(DOM7r5)、dAb7r7(DOM7r7)、 dAb7r8(DOM7r8)、dAb7rl3(DOM7rl3)、dAb7rl4(DOM7rl4)、 dAb7rl5(DOM7rl5)、dAb7rl6(DOM7rl6)、dAb7rl7(DOM7rl7)、 dAb7rl8(DOM7rl8)、dAb7rl9(DOM7rl9)、dAb7hl(DOM7hl)、 dAb7h2(DOM7h2)、dAb7h6(DOM7h6)、dAb7h7(DOM7h7)、 dAb7h8(DOM7h8)、dAb7h9(DOM7h9)、dAb7hlO(DOM7hlO)、 dAb7hll(DOM7hll)、dAb7hl2(DOM7hl2)、dAb7hl3(DOM7hl3)、 dAb7hl4(DOM7hl4)、dAb7pl(DOM7pl)及dAb7p2(DOM7p2)(關 於該等序列之揭示内容，參見2008年2月8曰申請之 PCT/GB2008/000453 >該等序列及其核酸對應物以引用之 方式併入本文中且構成本發明正文之揭示内容之一部 分）。dAb後之括號中展示替代名稱，例如dAb8具有替代名 稱¢iAblO，亦即dAb8(dAblO)。該等序列亦陳述於圖51a及b 中。 在某些實施例中，dAb結合人類血清白蛋白且包含與選 自由以下各物組成之群之dAb的胺基酸序列具有至少約 80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至 少約96%、或至少約97%、或至少約98°/。、或至少約99%之 胺基酸序列一致性的胺基酸序列： MSA-16、MSA-26、 131458.doc -106- 200911832 DOM7m-16(SEQ ID NO: 473) ' DOM7m-12(SEQ ID NO: 474) ' DOM7m-26(SEQ ID NO: 475)、DOM7r-l(SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3(SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4(SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5(SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7(SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8(SEQ ID NO: 481)、DOM7h-2(SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3(SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4(SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6(SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l(SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7(SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22(SEQ ID NO: 489) ' DOM7h-23(SEQ ID NO: 490) > DOM7h-24(SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25(SEQ ID NO: 492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21(SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27(SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8(SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13(SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14(SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15(SEQ ID NO: 499)、DOM7r-16(SEQ ID NO: 500)、DOM7r-17(SEQ ID NO: 501)、 DOM7r-18(SEQ ID NO: 502) ' DOM7r-19(SEQ ID NO: 503) ' DOM7r-20(SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21(SEQ ID NO: 505) ' DOM7r-22(SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23(SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24(SEQ ID NO: 508)、DOM7r-25(SEQ ID NO: 509)、DOM7r-26(SEQ ID NO: 510)、 DOM7r-27(SEQ ID NO: 511) > DOM7r-28(SEQ ID NO: 512) > DOM7r-29(SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30(SEQ ID NO: 514)、DOM7r-31(SEQ ID NO: 515)、DOM7r-32(SEQ ID NO: 516)、DOM7r-33(SEQ ID NO: 517)(該段落中之 131458.doc -107- 200911832 SEQ ID No為 W02007080392 中所出現之SEQ ID No)， dAb8 、 dAb 10 、 dAb36 、 dAb7r20 、 dAb7r21 、 dAb7r22 、dAb7r23 、 dAb7r24 、 dAb7r25 、dAb7r26 、 dAb7r27 、 dAb7r28 ' dAb7r29 、 dAb7r30 、 dAb7r31 、 dAb7r32、dAb7r33 、dAb7h21 、dAb7h22、dAb7h23 、
Ab7h24 > Ab7h25 ' Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30 、 dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、 dAbl5 、 dAbl6 、 dAbl7 、 dAb 18 、 dAbl9 、 dAb21 、 dAb22 、 dAb23 、 dAb24 、 dAb25 、 dAb26 、 dAb27 、 dAb30 、 dAb31 、 dAb33 、 dAb34 、 dAb35 、 dAb38 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52 、 dAb53 、 dAb54 、 dAb55 、dAb56、dAb7ml 2、dAb7m 16 、dAb7m26 、 dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、 dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、 dAb7rl8 、dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl 及 dAb7p2 ° 舉例而言，結合人類血清白蛋白之dAb可包含與以下各 物具有至少約90°/。、或至少約95%、或至少約96%、或至 少約97%、或至少約98%、或至少約99%之胺基酸序列一 致性的胺基酸序列：〇01^711-2(8丑(5 1〇]^0:482)、0€^711-3(SEQIDNO:483)、DOM7h-4(SEQIDNO:484)、DOM7h-6(SEQIDNO:485)、DOM7h-l(SEQIDNO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、DOM7h-8(SEQ ID NO:496)、DOM7r- 131458.doc -108- 200911832 13(SEQ ID NO:497)、D〇M7r-14(SEQ ID NO:498)、 DOM7h-22(SEQ ID NO:489) ' DOM7h-23(SEQ ID NO:490) ' DOM7h-24(SEQ ID NO:491)、DOM7h-25(SEQ ID NO:492)、 DOM7h-26(SEQ ID NO:493)、DOM7h-21(SEQ ID NO:494)、 DOM7h-27(SEQ ID NO:495)(該段落中之 SEQ ID No 為 W02007080392 中所出現之SEQ ID No)， dAb8 、dAb 10、dAb36、dAb7h21 、dAb7h22、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30 、dAb7h31 、 dAb2 、dAb4 、dAb7 、 dAbll、 dAbl2 、 dAbl3 、dAbl5 、 dAb16 ' dAbl7 、 dAbl8、 dAbl9 、 dAb21 、dAb22 ' dAb23 、 dAb24 、 dAb25、 dAb26 、 dAb27 、dAb30 、 dAb31 、 dAb33、 dAb34 ' dAb35 、 dAb38 、dAb41 、 dAb46 、 dAb47、 dAb52 ' dAb53 、 dAb54 、dAb55 、 dAb56 、 dAb7hl 、 dAb7h2 、 dAb7h6 、 dAb7h7 、dAb7h8 、 dAb7h9 、dAb7hlO 、 dAb7hll 、 dAb7hl2 、 dAb7hl3及dAb7hl4 ° 在某些實施例中，dAb結合人類血清白蛋白且包含與選 自由以下各物組成之群之dAb的胺基酸序列具有至少約 80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至 少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%之 胺基酸序列一致性的胺基酸序列： DOM7h-2(SEQ ID NO:482) > DOM7h-6(SEQ ID NO:485) > DOM7h-l(SEQ ID NO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、 DOM7h-8(SEQ ID NO:496)、DOM7h-22(SEQ ID NO:489)、 -109- 131458.doc 200911832 DOM7h-23(SEQ ID NO:490)、DOM7h-24(SEQ ID NO:491)、 DOM7h-25(SEQ ID NO:492)、DOM7h-26(SEQ ID NO:493)、 DOM7h-21(SEQ ID NO:494)、DOM7h-27(SEQ ID NO:495)(該段 落中之SEQ ID No為W02007080392中所出現之SEQ ID No)， dAb7h21 、 dAb7h22 、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、 dAb7 、 dAb38 、 dAb41、dAb7hl、dAb7h2 、 dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO 、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3及 dAb7hl4 ° 在更特定實施例中，dAb為結合人類血清白蛋白且具有 選自由以下各物組成之群之胺基酸序列的VK dAb : DOM7h-2(SEQ ID NO:482)、DOM7h-6(SEQ ID NO:485)、 DOM7h_l(SEQ ID NO:486)、DOM7h-7(SEQ ID NO:487)、 DOM7h-8(SEQ ID NO:496)(該段落中之 SEQ ID No 為 W02007080392 中所出現之SEQIDNo)， dAb2、dAb4 、 dAb7、dAb38、dAb41 、dAb54、 dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9 ' dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 及 dAb7hl4 〇 在更特定實施例中，dAb為結合人類血清白蛋白且具有 選自dAb7h3 0及dAb7h31之胺基酸序列的VH dAb。 在更特定實施例中，dAb為dAb7hll或dAb7hl4。 在其他實施例中’ dAb、配位體或括抗劑結合人類血清 白蛋白且包含任何上述胺基酸序列中之一、兩或三個 131458.doc -110- 200911832 CDR，例如dAb7hll或dAb7hl4中之一、兩或三個CDR。
結合血清白蛋白之合適駱駝類VHH包括WO 2004/041862 (Ablynx N.V.)及W020070803 92中所揭示之彼等VHH(該等 VHH序列及其核酸對應物以引用之方式併入本文中且構成 本發明正文之揭示内容之一部分），諸如序列A(SEQ ID NO:518)、序列B(SEQ ID NO:519)、序列 C(SEQ ID NO:520)、 序列 D(SEQ ID NO:521)、序列 E(SEQ ID NO:522)、序列 F(SEQ ID NO:523) ' 序列 G(SEQ ID NO:524)、序列 H(SEQ ID NO:525)、序列 I(SEQ ID NO:526)、序列 J(SEQ ID NO:527)、序列 K(SEQ ID NO:528)、序列 L(SEQ ID
NO:529)、序列 M(SEQ ID NO:530)、序列 N(SEQ ID
NO:531)、序列 0(SEQ ID NO:532)、序列 P(SEQ ID NO:53 3)、序列Q(SEQ ID NO:534)，該等序列號對應於WO 2007080392或 WO 2004/04 1862(Ablynx N.V.)中所引用之序 列號。在某些實施例中，駱駝類VHH結合人類血清白蛋白 且包含與WO 2007080392中所揭示之ALB 1或SEQ ID NOS:5 1 8-534中之任何一個具有至少約80%、或至少約 85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96°/。、或至 少約97°/。、或至少約98%、或至少約99%之胺基酸序列一 致性的胺基酸序列，該等序列號對應於WO 2007080392或 WO 2004/04 1862中所引用之序列號。 在一些實施例中，配位體或拮抗劑包含與本文中所揭示 之任何抗血清白蛋白dAb競爭以結合血清白蛋白（例如人類 血清白蛋白）之抗血清白蛋白dAb。 131458.doc -111 - 200911832 在一替代實施例中，拮抗劑或配位體包含對VEGF(例 如，人類VEGF)具有特異性之結合部分，其中該部分包含 如2008年2月8日申請之同在申請中之申請案 PCT/GB2008/000453中所述的非免疫球蛋白序列，該等結 合部分其製造及選擇（例如，自多樣性庫）方法及其序列之 揭示内容、以引用之方式併入本文中作為本發明正文之揭 示内容之一部分）。 接合半衰期延長部分（例如，白蛋白） 在一實施例中，使（一或多個）半衰期延長部分（例如，白 蛋白、轉鐵蛋白及其片段及類似物）與本發明之VEGF結合 多肽、dAb或拮抗劑接合或締合。供VEGF結合格式使用之 合適白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變異體之實例描述於 WO 2005 077042中，其揭示内容以引用之方式併入本文中 且構成本發明正文之揭示内容之一部分。在本發明中尤其 可使用以下白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變異體： • SEQ ID NO: 1(如WO 2005 077042中所揭示，該序列明 確地以引用之方式併入本發明揭示内容中）； •包含 WO 2005 077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 1-387 或由該等胺基酸1-387組成之白蛋白片段或變異體； •包含選自由以下各物組成之群之胺基酸序列的白蛋白 或其片段或變異體：（a)WO 2005077042中之SEQ ID NO: 1 之胺基酸 54 至 61 ; (b)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 76 至 89 ; (c)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基酸92至 100; (d)WO 2005077042 中 131458.doc -112· 200911832 之 SEQ ID ΝΟ:1 胺基酸 170 至 176 ; (e)\V〇 2005077042 中之SEQ ID NO: 1之胺基酸247至252 ; (f)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 266 至 277; (g)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 280 至 288 ; (h)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1胺基酸 362 至 368 ; (02005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之胺基酸 439 至 447; (j)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO，· 1 之胺基 酸 462至 475 ; (k)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1 之 胺基酸 478 至 486;及（l)WO 2005077042 中之 SEQ ID NO: 1之胺基酸560至566。 供VEGF結合格式使用之合適白蛋白、片段或類似物之 其他實例描述於WO 03076567中，其揭示内容以引用之方 式併入本文中且構成本發明正文之揭示内容之一部分。在 本發明中尤其可使用以下白蛋白、片段或變異體： •如WO 03076567中之（例如）圖3中所述之人類血清白蛋 白，（該序列資訊係明確地以引用之方式併入本發明 揭示内容中）； •由具有66,500之化學式分子量（formula molecular weight)之585個胺基酸的非糖基化多肽單鏈組成的人 類血清白蛋白（HA)(參見，Meloun等人，F五Leiiea (1975) ; Behrens等人，Fed Proc. (1975);
Lawn 等人，iVwc/ez'c /Icfcls 9:6102-6114 (1981) ; Minghetti 等人，《/·仏〇/. CAew. 2(57..6747 (1986))； 131458.doc 113 200911832 •如 Weitkamp 等人，如謂._57:219(1973)中 所述之白蛋白之多晶型變異體或類似物或片段； •如EP 322094中所述之白蛋白片段或變異體，例如 HAU-373)、HA(l-388)、HAU-389)、HA(1-369)及 HA(1-419)及1-369與1-419之間的片段； •如EP 399666中所述之白蛋白片段或變異體，例如 HA(1-177)及ΗΑ(1-200)及HA(l-X)之間的片段，其中χ 為178至199之任何數字。 當使用（一或多個）半衰期延長部分（例如，白蛋白、轉鐵 蛋白及其片段及類似物）編排本發明之VEgf結合多肽、 dAb及拮抗劑格式時，可使用任何合適方法（諸如，直接融 合）例如藉由使用編碼融合蛋白之單一核苷酸構築體使其 與VEGF結合部分（例如，抗VEGF 接合，其中該融合 蛋白係編碼為半衰期延長部分定位於VEGF結合部分之N_ 末端或C-末端之多肽單鏈。或者，可藉由在部分之間使用 狀連接子實現接合’肽連接子例如WO 〇3〇76567或彻 2004003’中所述之肽連接子（該等連接子揭示内容以引 用之方式併入本發明揭示内容中以提供用於本發明之實 例）°增加活體内i清半衰期之多肽通常為活體内天然存 在且抗降解或由自生物體（例如，人類）移除不想要之物質 之内源性機制移除的多&。例如，增加活體内血清半衰期 之：肽可選自來自細胞外基質之蛋白冑、血液中可見之蛋 白貝、血腦屏障或神經組織中可見之蛋白質、位於腎、 肝、肺、心臟、皮膚或骨中之蛋白質、應力蛋白、疾病特 131458.doc -】14· 200911832 異性蛋白質或涉及Fc轉運之蛋白質。 在貫穿該揭示内容所述之本發明之實施例中，代替在本 發明之拮抗劑或配位體中使用抗VEGf "dAb"，涵蓋熟練 的使用者可使用包含結合VEGF之本發明之dAb的一或多個 或所有三個CDR(例如，接枝於合適蛋白質骨架或骨幹上 之CDR，該骨架或骨幹例如親和體、SpA骨架、受體a 類區域或EGF區域）的多肽或區域。因此，揭示内容整體應 解釋為提供使用該等區域代替dAb之拮抗劑之揭示内容。 4 在廷點上，參見2008年2月8日申請之pCT/GB20〇8/〇〇〇453， 其揭示内容以引用之方式併入）。 因此，在一實施例中，本發明之拮抗劑包含合適格式之 對VEGF具有結合特性的免疫球蛋白單一可變區域或區域 抗體（dAb)或該dAb之互補判定區。拮抗劑可為由該㈣組 成或大體上由該dAb組成之多肽。拮抗劑可為包含合適格 式、諸如抗體格式（例如，IgG樣格式、scFv、Fab、Fab，、 (F(ab)2)中之dAb(或dAb之CDR)之多肽，或包含結合乂職 "及結合另—乾蛋白質、抗原或抗原決定基（例如’血 /月白蛋白）之第一 dAb的雙特異性配位體。 可將本發明之多肽、dAb及拮抗劑可編排格式為此項技 術已知之多種合適抗體格式，諸如IgG樣格式、嵌合抗 體、人化抗體、人類抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗 =重鏈、抗體輕鍵、抗體重鍵及/或輕鍵之同元二聚體及 異元二聚體、任何上述者之抗原結合片段（例如，Fv片段 (例如，單鏈FV(SCFV)、雙硫鍵鍵結之Fv)、Fab片段、Fabi 131458'doc •U5- 200911832 片段' F(ab，）2片段）、單一可變區域（例如，％、ν^、湯 及任何上述者之經修餅形或 巾t式（例如’猎由共價連接聚伸烷 二醇(例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其他合適 聚合物而修飾）。 在二實施i1列巾本發明提供為IgG樣格式之配位體（例 如抗VEGF拮抗劑）。該等格式具有習知砂分子之四鏈 結構（兩個重鏈及兩個輕鏈），其中—或多個可變區（^及/ 或VL)已經本發明之dAb置換。在—實施例中，各可變區（2 個VH區及2個VL區）經dAb或單一可變區域置換，其中之至 少-個為本發明之抗VEGF dAb。包括在砂樣格式之心 或單一可變區域可具有相同特異性或不同特異性。在一些 實施例中，IgG樣格式為四價且可具有一種（僅抗vegf)、 兩以例如，抗VEGF及抗SA)、三種或四種特異性。舉例 而。，IgG樣格式可為單特異性且包含四個具有相同特異 I"生之dAb ’可為雙特異性且包含三個具有相同特異性之 dAb及另-具有不同特異性之⑽：彳為雙特異性且包含 兩個具有相同特異性之dAb及兩個具有常見但不同特異性 之dAb ;可為三特異性且包含具有相同特異性之第一及第 二dAb、具有不同特異性之第三dAb及具有不同於第一、 第二及第三dAb之特異性之第四dAb;或可為四異性且包 含四個各具有不同特異性之dAbe可製備IgG樣格式之抗原 結合片段（例如，Fab、F(ab，）2、Fabl、Fv、scFv)。在—實 包例中IgG樣格式或其抗原結合片段不會交聯，例 如該格式對VEGF而言可為單價。若想要補體活化及/或抗 131458.doc •116- 200911832 體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)功能，則配位體可為 gG 1樣格式。必要時’樣格式可包含突變恆定區（變異 體IgG重鏈恆定區）以最小化與Fc受體之結合及/或固定補體 之月b 力’（例如參見 Winter等人，GB 2,209,757 B ; Morrison等 人，WO 89/07142 ; Morgan等人，WO 94/29351，1994年 12 月22曰）。 可將本發明之配位體（多肽、dAb及拮抗劑）編排格式為 含有與第二免疫球蛋白單一可變區域直接融合之第一免疫 球蛋白單一可變區域的融合蛋白。必要時，該格式可進一 步包含半衰期延長部分。舉例而言，配位體可包含與第二 免疫球蛋白單一可變區域直接融合的第一免疫球蛋白單一 可變區域的融合蛋白中該第二免疫球蛋白單一可變區 域直接融合於結合血清白蛋白之免疫球蛋白單一可變區 域。 具有對靶具有結合特異性之結合位點之多肽區域的定向 及配位體是否包含連接子通常為設計所要選擇之問題。然 而’一些定向在有或無連接子之情況下可提供較其他定向 佳之結合特徵。本發明所涵蓋之所有定向(例如，“以-連 接子-dAb2、dAb2_連接子_dAbl)為含有提供可藉由韩選容 易地鑑別之想要結合特徵的定向的配位體。 可使本發明之多肽及dAb(包括dAb單體、二聚體及三聚 體）與抗體Fe區連接，該抗訊區包含Ch2及Μ區域= -者或兩者及視情況鼓鏈區。舉例而言，可使用編竭以單 一核苷酸序列形式連接於㈣之配位體之載體製造該等多 131458.doc 117· 200911832 肽。 此外’本發明提供上述dAb單體（例如，抗VEGF dAb單 體）之二聚體、三聚體及聚合物。 密碼子優化序列 如上所述，本發明之實施例提供編碼本發明之多肽及可 變區域之密碼子優化核苷酸序列。如以下說明中所示，可 產生編碼相同可變區域（在此狀況下，可變區域胺基酸序 列與DOMlh-13 1-206—致）之具有約70%—致性之密碼子優 化序列。在該情況下，序列經優化從而由馬斯德畢赤酵母 paWorh)(密碼子優化序列丨_3)或大腸桿菌（密碼子 優化序列4及5)表現。 考慮到遺傳密碼中之及簡併度執行計算且最大化由 DOMlh-13 1-206之核苷酸序列（如下文 DOMlh-13 1-206 WT 所示）及還編碼與DOMlh-131-206 —致之可變區域之理論 核苷酸序列所編碼的各簡併密碼子中的核苷酸變化數。計 算揭露理論序列將與DOMlh-13 1-206之核苷酸序列具有僅 5 7 %之一致性。 密碼子優化序列1 DNA序列 gaggtte&attgttggaatcc9gtgftgga.ttggttcaacctggtggttctttgagattgtcctgtgctg cttccggttttactttcgctcacgagactatggtttgggttagacaggctccaggtaaaggattggaatg ggtttccca-cattccaccagatggtcaagatccattctacgctgactccgttaagggaagattcactatc tccagagacaactccaagaacaotttgtacttgcagatgaactccttgagagetgaggatactgctgttt accactgtgctttgttgccaaa9arg^gg&ccttggtfct9attact.gg9ga：cag^gaactttggtt:actgt ttcttcc 相應aa序列 evijllesggglvqpggslrlsca 在 sgftfahetMvwrgapgkglewvsliippdggdpfyad^vkgrftl srdnsknt lylcpsaslraedtavyhcal lpkrgpwf dyntfgqgt Ivtvss •118- 131458.doc 200911832 與WT序列之核苷酸序列一致性為74.1 % 密碼子優化 D〇mlh-131-20S (1) Oomlh-131-206 WT (1) —致 ⑴ 密碼子優化 D〇B»lh-131-206 (51) Domlh·131·206 WT (51) -致 即 密碼子優化 Do»lh-13i-206 (101) Domlb-131-206 WT (101) —致(101) 密碼子優化 Domlh-131-206 U51> Donlh-131-206 WT (151) —致(151) 密碼子優化 Domlh-131-206 (201) Domlh-131-206 WT (201} —致（201> 密瑪子優化 D〇»lb-131-206 (251) Donah· 131·206 WT (251) —致（251) 密碼子優化 Domlh-131-206 <301ϊ Domlh-131-206 ffT {301) 一致(301) 密瑪子優化 D〇mlii-131-206 <3511 Domlh-131-206 WT (3S1) 一致（351Ϊ
1 50 gaggttcaattgttggaatccsgtogtggattogttcaacctgotggttc GAOOTOCAOCTGTTOOA6TCTOGGGOAOGCTTG0TACA6CCTGGGOGGTC GAG6T CA TSTTOGA TC 66 GG GG TTGGT CA CCT6G GQ TC 51 100 TTTeAGATTGTCCTOTOCTOCTTCCOGTrTTACTTTCOCTCACQAGACTA iCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTOCGCXTGAOACOA G T TCCTGTGC GC TCCGG TT AC TT OC CA GAQAC A 101 150 STTTGGOTTAGACAGOCTCCAGGTAAAGGATTGGAATGGCiTTTCCCAC 3TGTOGGTCCOCCAGGCACCAOOGA\GG6TCTAGAOTOGGTCTCACAT TOOT TOOGT 0 CAGGC CCAGO AA GG T GA TOGQT TC CA 151 200 ArrCCACCAGATOOTCAAGATCCATTCTXCOCTGACTCCGTTA ATTCCCCCGOATOOTCAGGATCCCTTCTACGCAOACTCCOTGA ATTCC CC OATOOTCA GATCC TTCTACQC QACTCCGT 201 250 ATTCACTATCTCCAGAGACAACTCCAAeAACACTTTQTACTTGCAGATGA ：CT〇( TO L01 TGG' TGG' TAAGOGAAS 6AAOOOCCO AAGG6 0
GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAOAACACGCTATATCTGCAAAtGA TTCAC ATCTCC O GACAA TCCAAOAACAC T TA T6CA ATGA 251 300 ACTCCTTGAGAGCTGAGGATACTGCTOTTTACCACTGTGCTTTGTTGCCA ACAOCCTeCGTaCCGAOOACACAOCGOTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT AC C TG G GC OAGGA AC GC GT TA CACTQTGC TG T CC 301 350 AAGAGAiSOACCTTOGTTTaArrACTGGGGACAGGGAACTTTGGTTACTGT AAOAQGOQQCCTTGGTTTGACTACTGOGGTCAOGGAACCCTGGTCACCGT AAGAG 6G CCTTG6TTTOA TACTQGGG CAGGGAAC TG6T KC GT 351 363 TTCTTCCTAATGA CTCGAGC...... TC C 密碼子優化序列2 DNA序列 gagaaaagagaggttcaattgcttgaatctfgaggaggtttggtccagccaggagggtcccttcgactaa fttgtfctgfccagft^gggtttacgtttgctcatgaaactatggtatgggtccgacaggcacctggtaaagg tcttgaatgggtttcacatatccctccagac^tcaagacccattttacgctgattccgtgaaaggcaga tttacaatttcacgagataattctaaaaacaccttgtacttacaaatgaactcatfcgagagctgaggaca
Ctgcagtttatcactgcgctttactaccaaaacgtggaccttggtttgattattggggccaaggtacgtt agtgactgttagttct 相應AA序列 i. ekrevqllesggglvqpgg^Xrlscaasgf tfahetTTivwvrciapfkglewvshlppdgqdpfyadsvkgr ftisr^skatlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfclywggftlvtvss •與wt序列 D〇mlh-X31-206 WT 僅畢赤酵# MPa 206 dAb —致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MPa 206 dAb —致 D〇mlb-131-206 WT 僅畢赤酵母MPa 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MPa 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤醉母MPa 206 dAb 一致 之核苷酸序列一致性為71.1% 1 50
(1) .........GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCC
(1) GAGAAAAGAGAGGTTCAATTOCTTGAATCTGGAGGAGGTTTGGTCCAGCC (1) 6AGGT CA TG T GA TCTGO GGA6Q TTG6T CAGCC 51 100 (42) TGOGGOGTCCCTGCOTCTCTCCTGTGCAOCCTCCGGATTCACCTTTOCOC (51) AGGAGGGTCCCTTCGiACTAAGTTGTOCTOCCAGTGGGTTTACGTTTGCTC (51) GO GGGTCCCT CG CT TGTGC GCC GG TT AC TTTGC C 101 150 (92) ATGAGACGATOGTGTGGGTCCGCCAGCiCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGG (101) ATGAAACTATGGTATGGGTCCCSACAGGCACCTGGTAAAGGTCTTGAATGG (101) ATGA AC ATGGT TGGGTCCG CAGGCACC GG AA GGTCT GA TGG 151 200 (X4 2) GTCTCACATATTCCCCCGGATOOTCAGGATCCCTTCTACGCAOACTCCGT (151) GTTTCACATATCCCTCCAGACOGTCAAGACCCATTTTACGCTGATTCCOT (151) GT TCACATAT CC CC GA GOTCA GA CC TT TACGC GA TCCGT 201 250
(192) GAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAAtTCCAAGXACACGCTATATC (201) GAAAGGCAGATTTACAATTTCACGXGATAATTCTAAAAACACCTTGTACT (201) GAA G6C G TT AC AT TC CG GA AATTC ΑΛ AACAC T TA 251 300 •119- 131458.doc 200911832 9omlh-13X>206 WT 僅畢赤酵母MPa 206 dAto一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母MPa 206 dAb一致
Domlh-131-206 僅畢赤酵母MF· 2〇6 C •致
(242) TGCIUUlTeAACAGCCTGCGTGCCG&GGXCACA6CGGTATATCACTGTGCG (251) TACAAATQAACTCATTGJIGAGCTGAGGACACTGCAGTTTATCACTGCGCT (25X) T CAAATGAAC TO G GC CUIGGACAC GC GT TATCACTG GC 301 350 (2 92} CTGCTTCCTAAGAGGGGGCCTTGGmGACTACTOGGOTCAGGQAACCCT (301) TTACTACCAAAACCTGGACCTTGGTTTGATTATTGGGGCCAAGCTACGTT (30X) T CT CC AA G GG CCTTGGTTTGA TA TGGGG CA GG AC T 351 367 {342 > GGTCACCOTCTCCiAOC-(351) AOTGXCTGT-TAGTTCT (351) GT AC GT T G C 密碼子優化序列3 DNA序列 gaagtgcagcttettgaaagtggtggagggctagtgcagccagggggatctttaagattatcatgcgctg ccagtggatttacttttgctcacgagacgatggtctgggtgagacaagctcctggaaaaggtctagagtg ggtttctcacattccacctgatggtcaagatccttttctacgcagattccgtcaaaggaagatttactatc tccagagataatagtaaaaacactttgtacctacagatgaactcacttagagccgaagataccgctgtgt accactgcgccttgttgccaaagagaggtccttggttcgattactggggtcagggtactccggttacagt ctcstct 相應AA序列 evgllesggglvqpgg^lrXscaaSgftfahetravwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti srdnskutlylipinslraedtavyhcallpkrgpwfdywgggtlvtvss 與WT序列之核苷酸序列一致性為72.6% D〇mlh-131>206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb 一致 D〇mlh-X31-206 WT 僅畢赤酵母Pre 2〇e dAb一致 Domlh-X31-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb 一致 DomXh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb 一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb一致 Domlh-131-206 WT 僅畢赤酵母Pre 206 dAb一致 ί/ «ί if ί/ ί/ ίτ 111 111 (101) (101) <1〇1) (151) <151) U51) <201) (201) (201)
t/ \/ %/ \/ \Jf if 1X1 1X1 5 5 5 ο ο ο 2 2 2 3 3 3 / ι /1. /19 /V /V (351) (351) (351)
1 50 GAGGTGCAOCTCrrrGGAGTCTGOGGGAGOCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC GAAGTGCAGCTTCTTGAAAGTGGTGGAGGGCTAGTGCAGCCAGGCGGATC GA GTGCAGCT T GA TG6 CGAG6 T GT CA6CC GGGGG TC 51 100 CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCOCATCSAOACC» TTTAAGATTATCATOCGCTGCCAGTGGATTTACTTTTGfCTCACGAOACGA T 6 T TC TG GC GCC GGATT AC TTTGC CA QAGACGA 101 150 TGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGQGTCTCACAT TGOTCTQGGTGAGACAAQCTCCTGGAA&AGGTTTAQAGTQGQTTTCTCAC TGGT TGGGT 6 CA GC CC GG AA GGT TAGAOTGGOT TC CA 151 200 ATTCCCCCGGATeOTCAGOATCCCTTCTACaCAQACTCCGTGAAGGGCCG ATTCCACGTGaiTGGTCAAG&TCCTTTCTACGCAGATTCCGTCAAAGGAAG ATTCC CC GATGGTCA GATCC TTCTACGCAGA TCCGT λλ G6 G 201 250 GTTCACCATCTCCCQCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAiUlTGA ATTTACTATCTCCAGHGATAATAGTAAAAACACTTTeTACCTACAGATGA TT AC ATCTCC G GA AAT AA AACAC T TA CT CA ATGA 251 300 ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT ACTCACTTAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTACCACTGCGCCTTGTTGCCA AC CT G GCCGA GA AC GC GT TA CACTG GC TG T CC 301 350 AAGAGGGQGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT AAGAOACGTCCTTOGTTCGATTACTGGGGTCAGGGTACTCTGGTTACAGT AAGAG GG CCTTGGTT GA TACTGGGGTCAGGG AC CTGGT AC GT 351 CTCGAGC-CTC-ATCT CTC A C 密碼子優化序列4 DNA序列 120- 131458.doc 200911832 graagtacaacfcgctggagagcggtggcggcctggttcaaccgggtggttccctgcgcctgtcotgtgcgg catctggtttcaccttcgcacacgaaaccatggtgtgggttcgccaagct.ccgggcaa.aggcctggaatg ggtaagcc^cat^cefcccagafcggccaggacccat^ctatgcggattfcccgfctaagggtcgcrtttaccatt; tctcgtgataactccaaaaacaccctgtacctgcagatgaactcccfcgcgcgccgaggatactgcggtgt accattgtgcgdtgct^cctaaacgtggcccgtggttcgattaGtgcrg^tcagggtactctggtcaccgt aagcagc 相應AA序列 e^llesggglv^gpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvsiiippdgqdpfyadsvkgrfti srdiiskntlylqtmslraedtavyhcalipkxgpwfdywgqgtlvtvss •與WT序列之核苷酸序列一致性為76.5%
I
Domlh-131>206 WT 僅大勝桿菌Sec 206 dAb一致 Domlh-13X-206 WT 僅大勝桿菌Sec 206 dAb一致 Domlh-131-206 WT 僅大勝桿菌Sec 2〇6 dAb一致 Domlh-131-206 WT僅大勝桿菌Sec 2〇6 dAb一致 Donlh-131-20$ WT 僅大腸桿菌S«c 2〇S dAb一致 Domlh-131-206 WT 僅大勝桿菌Sec 206 dAb—致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌sec 206 dAb一致 Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌Sec 206 dAb—致
i/ if if \/ 111 XXX (101) U〇l) (101) (151) (151) (15i) (201) (201) (201) 2 2 2
111 (301) <301) (301) (351) (351) (351)
1 50 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGOGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC GAAOTACAACTGCTGGAGACK：GGTGGCG6CCTGGTTCAACCGGGTG6TTC GA GT CA CTG TGG&G GG GG GGC TG6T CA CC 66 GG TC 51 100 CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCQGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA CCTGCGCCTOTCCTaTaCGOCATCTGGTTTCACCTTCGCACACOXAACCA CCTOCG CT TCCT6T6C 6C TC GG TTCACCTT GC CA GA AC A 101 150 TGGTGTGGGTCCGCOiGOCACCAiOGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT TGGTGTGGGTTCGCCAACKrTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTAAGCCAC TG6TGT6G6T CGCCA GC CC GG AA GG CT GA TGGGT CA 151 200 ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAXGGGCCG attcctccaoatggccaggacccattctatgcggattccgttaaoogtco ATTCC CC GATGG CAGGA CC TTCTA GC GK TCCGT AAGGG C6 201 250 GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTCK：AAATGA CTTTACCATTTCTCGTGATAACTCCAAAAACACCCTGTACCTGCAGATGA TT ACCAT TC CG GA AA TCCAA AACAC CT ΤΛ CTGCA ATGA 25X 300 ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTCTGCGCTGCTTCCT ACTCCCTGCGCGCCGAGOATACTOCQGTGTACCATTOTOCGCTGCTGCCT AC CCTGCG GCCGAGGA AC 6CGGT TA CA TGTGCGCTGCT CCT 301 350 AAGAGGQGGCCTTGGTTTaACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT fcCGTGGCCCGTGGTTCCATTACTGGGGTCAGGGTACTCTGGTCACCGT 3GGGTC 351 QTCGAOC AAGCAGC AGC
AAAC AA
G G6 CC TGGTT OX TACTOOGOTCAGGC AC CT6GTCACC6T 密碼子優化序列5DNA序列 gaggttcaactgctggaatctggtggtggtctggtacaaccgggtggttccctgcgtctgagctgtgcag ccfcetggrfcttcaccttegetcatgagaccatggtttgggtacgccaggctccgggtaaaggcctggagtg ggtaa.gccatatccctcctgatggtcagga.cccgttctatgctgattccgtcaaaggccgttttaccatt tctcgtgacaacagca.aaaacaccctgtacctgcaaa.tgaactccctgcgtgcagaagacacggcggttt atcactgtgcactgctgccaaaacgcggcccttggttcgactactggggcceigggtactctggtcactgt atcttct 相應AA序列 evqllesggglvqpggslrlscaa^gftfalietMvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrfti jsrdnskJitlylqmnslraecltavyhcallpkrgpwfdywg<|gtlvtvse 與WT序列之核苷酸序列一致性為78.4%
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC 206 dAb 一致
50 CTGGGGGGTC
(1} GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCi (1) GAGGTTCAACTGCTCKSAATCTGGTGGTGGTCTQGTACAACCGGGTGGTTC (1) GAGGT CA CTG TGGA TCTOG GG GG TGGTACA CC 56 GG TC 131458.doc -121 - 200911832
51 100 (51) CCTGCGTCTCTCCTOTGCAOCCTCCGGATTCACCTTTOCGCATGAGACGA (51) CCTOCGTCTaAOCTGTGCAGCCTCTOGTTTCACCTTCGCTCATGAGACCA (51) CCTGCGTCT CTGTGCAGCCTC GG TTCACCTT GC CATGAGAC A 101 X50 (101) TGGTGTOOGTCCGCCAGOCACCAGOGAAGGQTCTAGAGTGGGTCTCACAT (101) TOCnrTTGGGTACGCCAGGCTCCGGGTAAAGGCCTGGAOTGOGTAAGCCAT (101) TGGT TGGGT C6CCA6GC CC GG ΑΛ GG CT GAGTGGGT CAT 151 200 (151) ATTCCCCCOaATaOTCAGOATCCCTTCTACGCAaACTCCGTGAAGGGCCG (151) ATCCCTCCTGaTGGTCAOGACCCGTTCTATaCTGATTCCGTCAXAOOCCG <151> AT CC CC GATGGTCAG6A CC TTCTA GC 6Λ TCCGT AA 6GCCG 201 250 (201) GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGA <201) TTTTACCATTTCTCGTGACAACAGCAAAAACACTCTGTACCTCXaVAATGA (201) TT ACCAT TC CG GACAA CAA AACAC CT TA CTGCAAATGA 251 300 (251) ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTOCTTCCT (2 51) ACTCCCTGCGTGCAOAAGACACGGCGGTTTATCACTOTGCACTGCTGCCA (251} AC CCTGCGTGC GA GXCAC GCGGT TATCACTGTGC CTGCT CC 301 350 (301) AAGAGGGGGCCTTGGTTTOACTACTGGGOTCAGGGAACCCTGGTCACCGT (301) AAACGCGGCCCTTGCiTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACTCTGGTCACTGT (301) AA G GG CCTTGGTT 6ACTACTGG6G CAGGG AC CTG6TCAC GT 351 (351) CTCGAGC (351) ATCTTCT (351) TC
Domlh-131*206 WT 僅大勝桿菌IC 206 dAb 一致
Domlh-131-206 WT 僅大勝桿菌IC 206 dAb 一致
Donlh-131-206 WT 僅大騰桿菌ic 206 dAb 一致
Domlh-131-206 HT 僅大腸桿菌 IC 206 (UUb 一致
Domlh-131-206 HT 僅大腸桿菌IC 206 dAb 一致
Domlh-131-206 WT 僅大腸桿菌IC 206 dAb 一致
Domlh-131-206 WT 僅大腸样菌IC 206 dAb f 一致 例證 實例A :主要選擇及表徵人類VEGF之區域抗體 所產生之區域抗體係源自噬菌體庫。根據相關標準方法 執行被動吸收之人類TNFR1之可溶性選擇與淘選。人類 TNFR1係以可溶性重組蛋白質形式自R&D systems(目錄號 636-R1-025/CF)或 Peprotech(目錄號 310-07)購得，且直接 使用（在被動選擇之狀況下）或在生物素標記後，經由一級 \ 胺偶合使用，接著在生物檢定中品質控制其活性且由質譜 分析其MW及生物素標記程度。通常執行3輪選擇，在每下 一輪中利用遞減含量之抗原。 由噬菌體ELISA篩選來自選擇物之輸出物的抗TNFR1結 合純系之存在。自該等噬菌體選擇物分離DNA且亞克隆於 表現載體中以表現可溶性dAb片段。將可溶性dAb片段表 現於96孔板中，且使用以抗c-myc债測之直接結合ELISA 或使用抗生蛋白鏈菌素/經生物素標記TNFR1 BIAcoreT%$ -122· 131458.doc 200911832 片之BIAcore™使用上清液篩選抗TNFR1結合dAb之存在， 且根據解離速率（off-rate)分等級。 下文所述之前導分子係源自命名為domww揭示於 WO 2006038027中）之親本dAb。該分子在使用6〇 nM經生 物素標記抗原選擇3輪後自噬菌體呈現庫選得。在各輪選 擇中將經抗生蛋白鏈菌素或中性鏈親和素塗佈之珠粒 交替作為捕獲試劑以防止選擇針對抗生蛋白鏈菌素或中性 鏈親和素之結合劑。該階段前導D〇Mlh“31之效價如在 MRC-5纖維母細胞/IL-8釋放細胞檢定中所測定處於低微莫 耳範圍内。如由BIAcoreTM所測定之結合動力學通常呈現 快速締合速率（on rate)/快速解離速率。該D〇Mlh-l 31前導 为子之大腸桿菌表現含量以C-末端myc標記單體計處於8 mg/Ι之範圍内。 前導分子之親和力成熟作用： 使DOMlh-131進行親和力成熟作用以產生具有較高效價 及改良生物物理學特徵之突變體（關於D〇Mlh-13 1來源之 河導分子之胺基酸序列，參見圖3)。使用易錯pcr聚合酶 (Genemorph II，Stratagene)產生易錯庫（平均數為每dAb序 列1個胺基酸變化，庫規模8x1 〇7)後，利用該等易錯庫執 行7輪選擇。該策略可引起純系D〇Mlh-131-8分離，一種 如由MRC-5細胞檢定所量測4個胺基酸變化（一個在構架 1(FR1)中，一個在CDR1中’一個在CDR3中及一個在FR4 中）產生約100倍效價提高（約4 nM)之分子。在該檢定中， 將MRC-5細胞與測試樣品一起培養1小時，隨後添加tnF- 131458.doc •123- 200911832 α(200 pg/ml)。培養隔夜後，使用il-8 ABI 8200細胞偵測 檢定（FMAT)測定IL-8釋放。各實驗中包括TNF-α劑量曲 線。在該檢定中，所使用之與dAb競爭結合TNFR1之TNF-a的濃度（200 pg/ml)為最大TNF-a反應之約70%。 為進一步提高效價，由易錯之前導一致資訊提示之關鍵 位置處之募核苷酸引導的突變誘發使單一胺基酸位置多樣 化。該過程期間，經由BIAcore™篩選分離具有單個K94R 胺基酸突變（胺基酸編號根據〖35&〇及200-3 00卩]^1之1^八效 價之DOMlh-131-8純系的改良形式，DOMlh-131-24(在修 正之前，最初命名為DOMlh-131-8-2)。 產生其他基於該前導分子及源於其之NNS庫之易錯庫且 使用熱處理使其經受3輪噬菌體選擇（關於方法，參見
Jespers L 等人，Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation. Nat Biotechnol. 2004年9月；22(9):1161-5)。在此選擇期間，彙集庫且自第 2輪選擇所獲得之純系產生認為更加熱穩定之諸如DOMlh-13 1-53之dAb。假定該等純系將具有較佳生物物理特徵。 使純系DOMlh-13 1-53中之一些構架突變生殖系化以產生 純系DOMlh-131-83。該純系形成使用如上所述之喔菌體 呈現選擇或使用使用乳液之活體外隔室化技術經由寡核苦 酸引導的個體CDR突變誘發進一步多樣化之基礎。嗤菌體 呈現策略產生前導分子DOMlh-131-117及DOMlh-131-151。活體外隔室化技術產生DOMlh-131-511。 在該階段中，在生物物理及生物檢定中比較此等三個前 131458.doc • 124- 200911832 導分子’且DOMlh-131-511為具有最佳性質之分子。此 外’在胰蛋白酶或白血球酶存在下測試該等分子的蛋白水 解裂解抗性。白血球酶由自患有囊性纖維化之患者彙集的 痰組成且含有高含量之彈性蛋白酶及其他蛋白酶且用作肺 疾病活體内條件之替代品。該資料指示所有三個前導分子 DOMlh-131-117、DOMlh-131-151 及 DOMlh-131-511 在胰
V 蛋白酶或白血球酶存在下均快速降解。該研究結果引起對 當DOM 1 h-13 1 -5 11處於患者體内時其活體内持久性之關注 且研發一種選擇改良胰蛋白酶抗性之策略。假定該經改良 胰蛋白酶抗性會對分子之其他生物物理性質產生有利效 應。基本上修改標準噬菌體選擇方法以允許在對抗原選擇 之前在蛋白酶存在下進行選擇。為此目的，使缺失c_myc 標籤之新穎噬菌體載體工程化以允許在胰蛋白酶存在但未 使所呈現之dAb裂解脫離噬菌體的情況下進行選擇。產生 基於DOMlh_131_511之易錯庫且選殖於pD〇M33載體中⑽ 於_33載體圖，參見圖50)。在抓下用】叫㈤或ι〇〇 Kg/ml胰蛋白酶預處理由該庫產生之噬菌體儲備液μ小 時，接著添加為Roche完全蛋白酶抑制劑（R〇che
Mease mhibito^x)之蛋白酶抑·以在選擇相關抗原 之前阻斷胰蛋白酶活性。執行4輪選擇。 下在存在 或不存在胰蛋白酶（在H)〇 _U1咖pg/mi最级騰蛋白 酶漢度下）之情況下培養H、時或培養隔夜期間，在存在或 不存在蛋白酶之情況下使用BIAcore™袢社π ^ 冲估可溶性表現 TNFR1結合dAb的結合TNFR1之能力。 131458.doc -125- 200911832 此引起兩個前導分子〇〇^4111-131-202及〇〇]^111-131-206 分離，該兩個前導分子如BIAcoreTM抗原結合實驗所示顯 示改良之蛋白酶抗性。令人關注地注意到，與DOMlh-131-511相比，DOMlh-131-202僅含有一個突變在CDR2中 (V5 3D)(所有胺基酸編號根據Kabat)，而DOMlh-131-206僅 含有兩個突變：第一突變與DOMlh-131-202相同（在CDR2 中之V5 3D突變）及第二突變為FR3中之Y91H突變（參見圖 3)。該FR3中之Y91H突變出現在3-20人類生殖系基因中， 指示該殘基出現在人類抗體中。該三個純系DOMlh-131-511、〇〇1^111-131-202及〇〇]^111-131-206具有如圖3中所示 之胺基酸序列。 如下測定分子活性： DOM1H-13 1-202、DOMlH-m-511 及 DOM1H-13 1-206結 合人類TNFR1之BIAcoreTM結合親和力評估。 由 BIAcore™ 分析評估 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511及DOM1H-13 1-206結合人類重組大腸桿菌表現之人類 TNFR1之結合親和力。使用生物素標記之人類TNFR1進行 分析。將1400 RU經生物素標記之TNFRT塗佈於抗生蛋白 鏈菌素（SA)晶片上。使用弱酸溶離條件使表面再生回到基 線。規定濃度之 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206使用50 μΐ/min之流速通過該表面。在 81八〇〇^頂3 000機器上進行研究，分析資料且擬合於1:1之 結合模型。所有測試分子之結合資料充分擬合於1:1模 型。由速率計算所有KD值。在25°C進行BIAcore™ 131458.doc -126- 200911832 運行。 以下資料由三個獨立的實驗產生。在各個實驗中，藉由 平均大量擬合結果（對kd而言使用最高之dAb濃度及對ka而 言使用較低之濃度）來計算結果。資料以結果之平均值及 標準偏差（在括號中）呈示（表1)。 表1 :結合人類 TNFR1 之 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206之 BIAcoreTM 資料 Κ〇η Krr DOM1H-131-511 5.03Ε+05 5.06E-04 1.07 (511) (1.07Ε+05) (1.01E-04) (0.44) DOM1H-131-202 1.02Ε+06 5.42E-04 0.55 (202) (2.69Ε+05) (3.69E-05) (o.ll) DOM1H-131-206 1.55Ε+06 7.25E-04 0.47 (206) (3.57Ε+05) (1.95E-04) (0.06) DOM1H-13 1-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206類 似地且以高親和力結合人類TNFR1。DOM1H-13 1-202及 DOM1H-131-206分別以0.55 nM及0.47 nM之平均親和力結 合。與具有1.07 nM之平均親和力之DOM1H-131-511相 比，DOM1H-131-202及DOM1H-131-206具有稍佳之親和 力。 受體結合檢定： 在受體結合檢定中測定dAb對人類TNFR1之效價。該檢 定量測TNF-α與TNFR1之結合及可溶性dAb阻斷該相互作 用之能力。將TNFR1-FC融合物捕獲在預塗佈山羊抗人類 IgG(H&L)之珠粒上。將受體塗佈珠粒與TNF-a(10 ng/mL)、dAb、生物素接合抗TNF-a及抗生蛋白鏈菌素 131458.doc •127- 200911832 alexa fluor 647在黑色側面透明底面之384孔板中一起培 養。6小時後，將板在ABI 8200細胞偵測系統中讀數且測 定珠粒相關螢光。若dAb阻斷TNF-α與TNFR1之結合，則 螢光強度將減小。 使用ABI 8200分析軟體分析資料。使用GraphPad Prism 及具有可變斜率之S形劑量反應曲線測定濃度效應曲線及 效價（ec5Q)值。在三種獨立的情形下重複檢定。各實驗中 包括TNF-α劑量曲線（圖38及39)。所使用之與dAb競爭以結 合TNFR1之TNF-α濃度（10 ng/ml)在該檢定中為最大TNF-a 反應之約90%。 圖39中展示代表性曲線圖，其展示dAb抑制TNF-a與 TNFR1之結合之能力。在所有三個實驗中，陰性對照樣品 (HEL4，抗雞蛋白溶菌酶dAb及VH模擬物）在高濃度下微弱 抑制TNF-a與TNFR1之間的相互作用。表2中展示測試樣品 及陽性對照（自R&D Systems獲得之抗TNFR1 mAb， mAb225)及 EnbrelTM(依那西普（etanercept);由連接於 IgGl Fc部分之TNFR2組成之二聚融合物；經許可用於治療類風 濕性關節炎）的平均效價（EC5〇)值。 表2 :三個重複實驗之TNFR1受體結合檢定中DOMlH-131-202 、 DOM1H-131-206 及 DOM1H-131-511 之效價 （EC50) 值 樣品 平均 EC5()(iiM) SEM DOM1H-131-202 0.11 0.008 DOM1H-131-206 0.07 0.01 DOM1H-131-511 0.19 0.01 Enbrel™(Etanercept) 0.20 0.07 抗TNFRl mAb # mAb225 0.08 0.003 131458.doc -128- 200911832 在該檢定中，DOMlh-131-206似乎比正測試之其他兩種
dAb 有效且與市售抗 TNFR1 mAb，MAB225(R and D
Systems)具有類似效價。 如下文所述進行來自馬斯德畢赤酵母之前導純系之表 現： 使用二個前導分子之一級胺基酸序列產生分泌表現於馬 斯德畢赤酵母中之密碼子優化基因。密碼子優化d〇mih_ 131-206與非密碼子優化〇〇1^出_1312〇6之間存在75%之序 列一致性。將三個合成基因選殖於表現載體ppIc_Za(來自
InVhr〇gen)中，且隨後轉型為兩個畢赤酵母菌株X33及KM71H。 將轉型細胞濾出置於遞增濃度之芬森（Ze〇cin)(丨〇〇、3〇〇、 600及900 pg/ml)上以選擇具有多個整合子（integrant)之純 系。選擇各個細胞系及構築體的約15個純系以用於表現篩 選。因為馬斯德畢赤酵母中高/低基因複本數與表現含量之 間的相關性尚未完全理解，所以在整個芥森濃度範圍内挑選 數個純系。使用尚未就高產量進行廣泛篩選之純系進行5 L 醱酵罐運行。此使得產生大量用於進一步研究之物質。 用於蛋白質表徵之物質產生： 已廣乏使用基於蛋白質A之層析樹脂自微生物培養上清 液中純化VH dAb。雖然此舉使得單步純化方法產生高純度 (在大多數情況下通常>90%)材料，但對於一些分子，低pH 值溶離條件會導致形成聚集體。亦存在用於dAb之親和力 樹脂之容量受到限制之問題，此#意謂使用纟量樹脂來加 工來自醱酵罐之物。為產生用於表徵且進一步用於穩定性 131458.doc -129- 200911832 及噴霧器研究之高品質物質，使用混合模態電荷感應樹脂 (mixed modal charge induction resin)將下游的純化過程設 計為初級捕獲步驟，接著陰離子交換。未顯著優化，此允 許回收約70%之純度為約95%之表現dAb。 對於混合模態電荷感應樹脂’來自Ge Healthcare之 Capto MMC上之捕獲步驟，使用5〇 mM碟酸鈉（pH 6 〇)執 行管柱平衡且在不需要任何稀釋液或pH值調節之情況下加 載上清液。洗滌管柱後，使用為5〇 mM Tris(pH 9 〇)之溶 離緩衝液由pH梯度溶離蛋白質。特定洗滌及梯度條件將略 視正溶離之蛋白質之pI而變化。 隨後使用陰離子交換層析用流經步驟（fl〇w thr〇ugh step) 進一步純化溶離液峰。此舉可移除諸如醇氧化酶之殘餘 HMW污染且減少内毒素。使樹脂與PBS或無鹽之磷酸鹽緩 衝液（pH 7.4)平衡。將來自Capt〇 MMC之溶離液加載於陰 離子父換树知上之後，dAb不結合且由流經步驟回收。内 毋素及其他污杂物與樹脂結合。鹽之存在（若使用pBS緩衝 液）使該步驟之蛋白質回收率提高為91%，而非無鹽情況下 所達成之86%回收率。然而，鹽之存在會降低内毒素移除 之效力’以致與當不存在鹽時所獲得之<1.0 EU/ml之dAb 之内母·素含夏相比，包括鹽之該步驟之後的典型含量經量 測為 58 EU/ml。 蛋白質表徵： 使用電喷霧質譜、胺基末端測序及等電聚焦表徵由5 L 酸酵罐運行所產生之物質的一致性，且使用SDS-PAGE、 131458.doc •130· 200911832 SEC及Gelcode醣蛋白染色套組（pierce)表徵純度。 一致性： 各蛋白質之第一個5殘基之胺基末端序列分析係如所預 期（EVQLL...)。使用C4 zip尖頭（MiUip〇re)對已緩衝液交 換於含有0.1%冰醋酸之50:5〇 H20:乙腈中之蛋白質樣品執 行質谱分析。二種蛋白質中每一種之量測質量當允許因形 成内部雙硫鍵而產生之_2的質量差時係在基於一級胺基酸 序列之理論質量（使用平均質量計算）之〇5 Da範圍内。使 用IEF基於對於各蛋白質為不同之pI鑑別蛋白質。 純度： 將二種蛋白質以1叩及i 〇叩之量—式兩份裝載於非還原 SDS-PAGE凝膠上。在所有情況下，觀察到單一條帶。亦 執行尺寸排阻層析以顯示純度級。對於尺寸排阻層析 (SEC)，將100 各蛋白質裝載於t〇s〇h g2〇〇〇 SWXL管 柱上，在0·5 ml/min下流動。移動相為PBS/1〇%乙醇。 研究dAb穩定性用於候選物選擇： 對於COPD適應症，將有必要（例如）使用噴霧器裝置傳 遞dAb至肺中。此將意謂視所使用之喷霧器類型而定蛋白 質可潛在經歷一定範圍之剪切應力及熱應力且在肺環境下 可經受蛋白酶酶促降解。已確定若蛋白質可使用該類型之 裝置傳遞，則其形成適當粒度分布且在㈣器傳遞後保留 功能。因此，研究各分子對一定範圍之物理應力之固有穩 定性以確定指示基線穩定性及最敏感冑定性<檢$。因為 各蛋白質之穩定性將依賴於各蛋白質溶解於其中之緩衝溶 131458.doc -131 - 200911832 液，所以一些預調配研究為必需的。該諸如緩衝液、1?11值 之資訊亦適用於理解下游純化過程及隨後儲存期間蛋白質 之穩定性。為表徵暴露於一定範圍之物理應力期間分子之 變化，使用大ϊ:分析技術’諸如尺寸排阻層析（sec)、 SDS-PAGE及等電點聚焦（ief)。 DOM1H-131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-131-206 之蛋 白酶穩定性之評估： 在過量蛋白酶中預培養規定時間點後由BIAc〇reTM分析 殘餘結合活性評估DOM1H-131-202、DOM1H-131-511及 DOM1H-131-206之蛋白酶穩定性。將約14〇〇 RU經生物素 才不a己TNTR1塗佈於抗生蛋白鍵菌素（sa)晶片上。在3〇。〇下 使 250 nM DOM1H-13 1-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H- 131-206與僅PBS—起或與1〇〇 pg/mi騰蛋白酶、彈性蛋白 酶或白血球酶一起培養1、3及24小時。藉由添加蛋白酶抑 制劑混合物使反應停止。然後使用參考池扣除法（reference cell subtraction)使dAb/蛋白酶混合物越過TNFR1塗佈晶 片。在每次注射循環之間用1〇 μ1 〇丨M甘胺酸（pH 2 2)使 晶片表面再生。相對於無蛋白酶之dAb結合，測定結合與 蛋白酶一起預培養之人類TNFR1 (在1〇秒内）iDOMlH- 131-202、DOM1H-131-511 及 DOM1H-13 1-206 的比例。在 25°C下進行BIAc〇re™運行。由三個獨立的實驗產生資料。 條形圖指示平均值且誤差棒指示結果之標準偏差（關於結 果’參見圖24)。 已發現，與 DOM1H-131-511相比，展示 DOM1H-131-202 131458.doc -132- 200911832 及DOM1H-131-206具有較高胰蛋白酶、彈性蛋白酶或白血 球酶蛋白水解降解抗性。與DOM1H-131-511相比，DOM1H-131-202與001^111-131-206之間的差異在與胰蛋白酶一起1 小時後及與彈性蛋白酶或白血球酶一起3小時後最明顯。 如使用DSC所測定之熱穩定性： 為測定在何pH值下分子具有最大穩定性，使用差示掃描 量熱計（DSC)量測各dAb在伯瑞坦-魯賓遜缓衝液中之熔融 溫度（Tm)。當伯瑞坦-魯賓遜係由三組分緩衝液系統（乙酸 鹽、磷酸鹽及硼酸鹽）構成時，在同一溶液中有可能產生3-10範圍内之pH值。由蛋白質一級胺基酸序列確定理論pi。 由DSC，可見dAb具有最大内在熱穩定性之pH值對 DOM1H-131-202 (202)而言為 pH 7，對 DOM1H-131-206 (206)而言為 pH 7-7.5，且對 DOM1H-131-511 (511)而言為 pH 7.5。關於所有隨後應力及穩定性研究，對於各dAb使 用以下pH值：在伯瑞坦-魯賓遜缓衝液中，對於DOM1H-131-202 (202)及 DOM1H-131-206 (206)，pH 7.0 ;且對於 DOM1H-131-511 (511)，pH 7.5。結果概述於下表3 中： 表3 :如由DSC所測定於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之1 mg/ml DOM1H-131-202 (202)、DOM1H-131-206 (206)及 DOM1H-131-511 (511)之pH及Tm的概述 dAb 產生最大固有 熱穩定性之pH值 在給定pH值下 dAb 之 Tm (。〇 DOM 1H-131-202 (202) 7.0 68.6 DOM 1H-131-206 (206) 7.0-7.5 65.8 DOM1H-131-511 (511) 7.5 58.0 131458.doc -133- 200911832 固有溶解度測試： 在離〜乂㈣啊濃、缩器（5K截止點）中漢縮所有前導⑽ 以確定其最大溶解度及濃縮後之回收含量。在伯瑞择-魯 賓遜緩衝液中在最穩定Η值下執杆眚給一 ρ值卜執仃實驗。經—定時程量測 樣品體積及濃度，且記錄盥預助 τW期/辰度之偏差以及樣品回收 百分率。 已發現’所有蛋白f均可在伯瑞坦魯賓遜緩衝液中濃 縮至超過u)〇 mg/nU。雖然與D〇MlH_i3i_5u (5ΐι)相比， D〇M1H-l31-2G2⑽）與刪1H_131德⑽）展示比預期 低之回收率，但仍在可接受之水準内。 前導dAb之噴霧器傳遞： 藉由測試不同噴霧器及調配物緩衝液，已證明dAb可使 用廣泛範圍之噴霧裝置有效傳遞。更重要地，首次展示 d、Ab於調配物緩衝液中之喷霧產生有效肺傳遞想要之粒度
刀布（使用<5 μηι之液滴之百分率進行比較），同時維持蛋 白質功能性。此進一步描述如下。 比較多種裝置中之效能： 在六個喷霧it裝置中測試DOM1H_131_5U (5ιι)，該六 個喷霧器裝置包含三個主要種類之液體調配物喷霧器(亦 即，超音喷霧器、喷射喷霧器及振㈣霧器）之每一類的 ，兩個裝置。在各裝置中，在一定範圍之卿濃度下，測 / mg/ml dAb。對於各樣品，使用 Malvern Spraytek
DeviCe(Malvern j她霞咖 Limhed，υκ)量測 <5 _之液 滴尺寸之百分率且結果展示於圖35中。使用舰評估各樣 131458.doc -134· 200911832 品噴霧後之穩定性以分析已二聚於殘留在杯中及所收集之 氣霧劑中之物質中的樣品的量。結果可見於圖36中。二聚 體形成程度越小，穩定性越高。 大多數裝置可傳遞40%或更多的適當尺寸範圍内之液體 調配物’但eFlow(振網噴霧器裝置）及PARI LC(噴射噴霧 器）裝置表現更佳，其中當緩衝液中包括pEG時，pARI LC*(星號）裝置傳遞超過8〇%。由eF1〇w亦觀察到因pEG該 傳遞之增加，對於PARI LC+，程度較小。 重要地’亦發現’ dAb之活性在噴霧後仍保留（參見圖8 中之結果）。 緩衝液添加劑之效應： 由於DOM1H-131-511 (511)之較低穩定性，5〇mM磷酸鹽 調配物緩衝液含有PEG 1000與蔗糖（且具有定義為約等於 約2%至約i〇% PEG 1〇〇〇於含有丨2% w/v蔗糖之5〇 磷酸 鹽緩衝液中之溶液黏度之範圍内的黏度）以有助於保護dAb
以免受剪切應力與熱應力。當D〇M1H_131_2〇2 (2〇2)及 DOM1H.13 1_2G6 (2G6)具有較高Tmi展示顯著增加之熱應 力穩定性時，在原始調配物緩衝液中及伯瑞坦-魯賓遜緩 衝液（其具有比調配物緩衝液低之黏度）中測試所有分子。 在5 mg/ml之蛋白質濃度下在35分鐘之運行時間内在e_ flow與Pari LO裝置中測試dAb且使用
Spraytek
Device測定粒度分布。作為比較 使用噴霧器裝置傳遞之 用於膀胱纖維化之市售藥物（命名為標準蛋白質幻在其自 身調配物緩衝液中測試。結果展示於圖37中。為獲得良好 131458.doc -135- 200911832 傳遞及於深肺中之分配，理想粒度小糾微米，例如々叫。 所有⑽在伯瑞坦_魯賓遜緩衝液與調配物緩衝液(如先前 所述）中均得到小於5 μιη之可比較級別之粒度。然而，調 配物緩衝液之較高黏度尤其可有利產生適當尺寸範圍内之 粒子’例如<5叫之粒子。在噴霧之前及之後由“。量測 法測定裝置之杯中dAb之濃度。已發現，$白質濃度並未 顯著變化’指示蛋白質與媒劑在傳遞期間均不會優先喷 霧。 結論 · 如上所述，已證明諸如dAb之多肽可在大量市售喷霧器 裝置中喷霧，且重要地，其在噴霧後保留穩定性及生物活 性，且喷霧後未觀察到顯著聚集。當向緩衝液調配物中添 加諸如PEG之黏度增強賦形劑時，粒度分布及小於5 μιη之 液滴尺寸百分率得以改良，因此潛在改良dAb至深肺之傳 遞。 dAb至肺之傳遞亦可藉由增加dAb濃度、例如高達約4〇 mg/ml之濃度及傳遞時間來改良而無dAb穩定性或活性之 任何降低。 實例1 噬菌體載體PDOM13 使用絲狀噬菌體（fd)呈現載體pDOM13。該載體與噬菌 體外殼蛋白III產生融合蛋白。圖1中說明pDOM13之多個 選殖位點。將編碼dAb之基因選殖為片段。 實例2 131458.doc • 136- 200911832 測試蛋白酶對具有一定範圍之胰蛋白酶抗性之噬菌體呈 現區域抗體（dAb)的選擇 將編碼結合IL-IR1之dAb DOM4-130-54、結合TNFR1之 〇〇1^111-131-511及,结合乂£〇?八之〇〇河15-10、〇〇1^15-26及 DOM15-26-501的基因選殖於pD〇M13中，且根據標準技術 產生呈現該等dAb之噬菌體。將噬菌體由PEG沈澱純化， 再懸浮於PB S中且測力價。 當以經分離蛋白質形式測試時，上述dAb展示一定範圍 之抗胰蛋白酶降解之能力。如下評估抗降解性：在3〇c>c下 將40 pg/ml於PBS中之dAb(l mg/ml)與胰蛋白酶一起培養， 產生25:1 dAb :胰蛋白酶之分子比。添加胰蛋白酶之前即 刻，且隨後在T=1小時、3時間及24小時時採集樣品（3〇 μΐ)。藉由添加Roche完全蛋白酶抑制劑（2x)中和蛋白酶活 性，接著浸入液氮中且儲存於乾冰上。隨後藉由在 10-20% Tricine凝膠上電泳分析15旧各（1从樣品，且用 SureBlue(lx)染色蛋白質。 \ 第一個3小時期間，DOM1 5-10與DOM1 5-26-501顯著分 解。DOM15-26、DOM4-130-54 及 DOMlh-131-511 較穩 定’其中dAb之分解僅在24小時後變得明顯（圖2)。
亦在胰蛋白酶存在下培養噬菌體呈現dAb以評估噬菌體 呈現dAb之胰蛋白酶抗性是否與由經分離可溶性dAb所獲 得之結果相關。測試多種濃度之胰蛋白酶及培養時間。在 所有狀況下，用Roche完全蛋白酶抑制劑中和胰蛋白酶 後，測試噬菌體結合一般配位體：蛋白質A(其纟士人所有V 131458.doc -137- 200911832 £ 域抗體（例如 ’ DOMlh-131、DOM15-26、DOM15-26-501))或蛋白質1^(其結合所有¥<區域抗體（例如，1)〇1^4-130-54、D〇M1 5-10))之能力。亦測試噬菌體與靶抗原之結 合。在該兩種狀況下，認為結合與因經抗蛋白水解性保留 dAb結構完整性相關。由ELISA(使用針對噬菌體之接合抗 體）或由溶離所結合之嗟菌體及指數生長大腸桿菌TG丨細胞 感染後進行力價分析來量測結合活性。 用 DOM15-10、DOM15-26及 DOM15-26-501 測試嗔菌艘 在室溫下在一定範圍之胰蛋白酶濃度（1〇〇 gg/ml、1〇 pg/ml及0 pg/ml)下，將各dAb處理1小時。用尺〇(：1^完全蛋 白酶抑制劑（1 X)阻斷胰蛋白酶活性，且隨後將噬菌體稀釋 於PBS中之2% Marvell中’在室溫下與50 nM經生物素標記 抗原（重組人類VEGF(R & D systems))—起培養1小時β添 加在室溫下用PBS中之2% Marvell預阻斷1小時之抗生蛋白 鏈菌素塗佈微珠（Dynabeads M-280(Invitrogen))，且隨後在 室溫下將混合物培養5分鐘。所有與Dynabeads —起培養之 步驟均在轉輪上進行。藉由用i ml於PBs中之〇 1〇/〇 Tween_ 20洗滌珠粒8次洗除未結合噬菌體。用〇 5 mi 〇1 M甘胺酸 (卩112.2)溶離所結合噬菌體且用10〇4111^1^_11(^(1)11 8.0)中和。使用溶離噬菌體感染指數生長之TG1細胞（在 37 C下1小時）且塗鋪於四環素板上。在37艺下將板培養隔 夜，且進行菌落計數（參見表4)。由與1〇〇 μ§/ηι1胰蛋白酶 一起培養之選擇觀察到最佳結果。與D〇M15_1()&D〇Ml5_ 26-501相比，DOM15-26之產率增加約1〇倍。 131458.doc -138- 200911832 進行弟一實驗以在更％'刻培養條件下進一步證實該等结 果。在攪拌（250 rpm)下在37°C下將噬菌體呈現dAb處理 守或2小時。由與gg/mi胰蛋白酶一起培養2小時之選擇 觀察到最佳結果。DOM15-26之產率比d〇M1 5-26-501之產 率高200倍且比DOM15-10之產率高1000倍。 在苐二實驗中，開始時將呈現DOM15-26及DOM15-26· 501之益卤體i:i混合。隨後在授拌（25〇 rpm)下在η 下在 有騰蛋白轉（1 〇〇〇 pg/ml)或無胰蛋白酶之情況下將其培養2 小時’且隨後如上所述就抗原結合加以選擇。測序來自各 選擇之1 0個菌落，對於無胰蛋白酶預處理之選擇，揭露純 系混合群體（DOM15-26 : 4/10 ; DOM15_26_5〇1 : 6/1〇),而 有胰蛋白酶進行選擇之所有純系如所預期編碼D〇M丨5 _26。 該等實驗指示選擇壓力可藉由向噬菌體呈現dAb中添加 蛋白酶來獲得，以致優先選擇呈現蛋白水解最穩定之dAb 之4菌體（在淘選一般配位體或抗原之後）。 表4 實驗 培養時間長短 温度 胰蛋白酶 濃度 DOM15-26 力價 DOM15-26-501力價 1:1 混合 DOM1S--10 力價 Η^ΗΗ πχΐ〇/ 1 輸入1010 lhr 室溫 100 μ^τηΐ 1.6χ]〇8 6.3χ107 lhr 室溫 10 pg/ml 3xl〇8 4.4χ108 lhr 室溫 0 gg/ml 0.9χ1〇8 2χ108 2 輸入109 1 hr * 250 rpm 37°C 100 pg/ml 2x1 〇7 1x10^ 2 hr » 250 rpm 37〇C 100 μ^πιΐ ΐχίο7 6χ104 2 hr » 250 rqm 37〇C 0 μ^ιηΐ 5.4χ1〇7 4 1χ1〇7 3 輸入I010 — — 2 h » 250 rpm 37°C 100 pg/ml 2.3χ1〇8 8χ105 Ο,^,,ΐυ 2 h，250 rpm 37°C 0 μ^ηαΐ 3.9χ1〇8 4.4χ1〇8 4 8χ108 用D〇M4-130-54測試噬菌體 以如上所述之類似方案測試DOM4-130-54。變化之參數 為：胰蛋白酶之濃度、溫度及培養時間長短。針對il_ri_ 131458.doc •139- 200911832 «亥專測„式實驗顯然展示1 〇〇 胰蛋白酶及之溫度 適於將選擇壓力應用於呈現多種抗胰蛋白酶蛋白水解程度 之dAb之嗟菌體上。必要時，可優化各噬菌體呈現dAb之 蛋白酶培養時間。 實例3 嗤菌趙呈現區域抗體譜系之蛋白酶選擇 使用以下dAb作為親本分子建立四個譜系：〇〇1^14-130- 54、DOMlh-131-511、DOM15-10 及 DOM15-26-555。使用 Stratagene Mutazyme II套組、經生物素標記引子及供5〇 μ1 反應用之5-50 pg模板由pcr在基因中引入隨機突變。用 心/1及iVoil分解後，用抗生蛋白鏈菌素塗佈微珠自未分解 產物中純化插入物且使其在相應位點連接於pD〇M 13中。用 純化連接混合物使大腸桿菌TB1細胞轉型，從而產生四環素 抗性純系大譜系：8.5xl08(DOM4-130-54)、1.5xl〇9(D〇Mlh-131-511)、6xl08(DOM15-10)及3xl09(DOM15-26-555)。 藉由以PEG雙重沈澱製備噬菌體庫且再懸浮於pbs中。 胺基酸突變率對DOMlh-131-511及DOM4-130-54镨系而 言分別為2.3及4.4。藉由在噬菌體ELISA中使用塗佈有蛋 白質A或蛋白質L(1 gg/ml)之孔測試96個純系評估功能性。 在 DOMlh-131-511 及 DOM4-130-54譜系中分別有 62.5。/〇及 27%之純系展示功能性呈現dAb。 胺基酸突變率對DOM1 5-10及DOM1 5-26-555譜系而言> 別為2.5及4_6。藉由在噬菌體ELISA中使用塗佈有蛋白質A 或蛋白質L(1 pg/ml)之孔測試96個純系來評估功能性。在 131458.doc -141 - 200911832 DOMl 5-1 0及 DOMl 5-26-555譜系中分別有 31.3%及 10.4%之 純系展示功能性呈現dAb。 DOM4-130-54及 DOMlh-131-511 譜系 對該等庫進行4輪選擇以選擇具有改良蛋白酶抗性之 dAb。 第1輪選擇係抗原結合（1 nM或1 0 nM抗原）而無蛋白酶處 理從而淨化庫以移除不再以高親和力結合抗原之任何純 系。第1輪之輸出係在1〇8-1〇h範圍内（與1〇n噬菌體之輸入 形成對比），指示庫之大部分以高親和力結合抗原。 在第2輪中引入1〇〇 pg/mi胰蛋白酶之蛋白酶處理，且輸 出展示於下表7中： 胰蛋白酶培養條件 DOMlh-131-511 庫 DOM4-130-54庫 37°C隔夜 1.86xlOb 2.1xl〇b 37UC，2小時 ^ 4.8x10s 5.1x10* 室溫，2小時 1.2xlOy 4.62xlOv 無胰蛋白酶 約lxlOy 約4xl09 無抗原 1.8χ1〇4 <6xlOj _在37°C下用胰蛋白酶處理dAb隔夜時，存在顯著選 擇。將該輸出物送至第3輪，其中在37°C下用j瓜岁…或 1〇〇 pg/ml胰蛋白酶處理噬菌體24小時。來自第3輪之經胰 蛋白酶處理過之噬菌體的力價對D〇Mlh_131_51i譜系而言 為 1〇5-106 且對 DOM4-130-154譜系而言為ι〇7·1〇8。 來自第3輪之所有輪出物（〇〇1^111_131_511及〇〇1^4_13〇· 154, i mg/ma100 μ§/ιη1)在 1〇〇 gg/ml胰蛋白酶下經受針 131458.doc -142- 200911832 子原之第4輪選擇。類似於第3輪中所見 心。8範圍内。對於D◦隱⑶·51竭可見―此』在 而對於DOM4-130_54譜系無富集。 、 DOM1S-10及 D〇Ml5_26 5S5譜系 第1輪選擇係用2 nM經生物素標記hVEGF(人類血管内皮 生長因子）濃縮物來進行而無蛋白酶處理從而淨化庫以移 除不再以高親和力結合抗原之任何純系。第i輪之輸出為 約 108(與 DOM15-1(^1〇1〇嗟菌體及 D〇M15_26_55521〇"嗤 菌體之輸入形成對比），指示庫之大部分以高親和力結合 抗原。 用2 nM經生物素標記hVEGF執行第2及第3輪選擇。在對 hVEGF淘選之前，在37t下在震盪器（25〇 rpm)中在胰蛋白 酶（100 pg/ml)存在下培養噬菌體。培養時間對d〇M15_1() 譜系而言為1小時且對DOM 15-26-555譜系而言2小時。 輸出如下：DOM15-10譜系之第2及第3輪選擇為l.5xl〇6 及9x1 〇5 ; DOM15-26-555之第2及第3輪選擇為2.2 XI 〇8及 3.9xl〇9 〇 實例4 分析選擇輸出物：DOM4-130-54及DOMlh-131-511譜系 將來自第3及第4輪之所有輸出物亞選殖於pd〇M5載體中 且轉型於JM83細胞中。pDOM5載體為pUC119基載體。由 Plac啟動子驅動蛋白質之表現。GAS 1前導序列（參見WO 2005/093074)確保經分離可溶性dAb分泌於大腸桿菌JM83 之周質及培養上清液中。隨機挑選96個及72個來自第3輪 131458.doc -143- 200911832 及第4輪之個體菌落來表現。 對第3輪及第4輪輸出物之各12-24個純系進行測序。在 該兩輪選擇中觀察到一致突變且挑選約25個持有一致基序 (consensus motif)之純系來進一步表徵。該等純系之胺基 酸序列展示於圖3(DOMlh-13 1-5 11所選擇之變異體）及圖 4(DOM4-130-54所選擇之變異體）中且以DNA序列形式列於 圖1 9A 1 9L中。犬出所選擇之純糸中不同於親本序列的胺 基酸（彼等一致胺基酸由點標記）。對應於Cdr〗、CDR2及 【 CDR3之環用框勾畫。 該等純系係以大量表現’在蛋白質L(就d〇M4_13〇_54變 異體而言）及蛋白質八（就1)0]^111_131_511變異體而言）上純 化且在存在或不存在胰蛋白酶（最終濃度為1〇〇 pg/ml* 1000 pg/ml)之情況下在37t下培養i小時或隔夜後就抗原 結合以BIAcore方式測試。 來自DOM4-130-54選擇之輸出物通常較穩定，大多數純 , 系保留胰蛋白酶抗性1小時且最佳純系保留隔夜。比較而 1 言，來自DOMlh-131_511選擇之少量純系抗胰蛋白酶1小 時，而無純系抗胰蛋白酶隔夜。 實例5 分析選擇輸出物：DOM15-10及DOM15-26-555譜系 首先以單株噬菌體ELISA方式在存在或不存在胰蛋白酶 分解之情況下測試經胰蛋白酶預處理之選擇有效性。挑選 各庫之來自第2輪選擇之18個菌落及來自第3輪選擇之叫固 菌洛。使用純系 D〇M15_1〇、d〇m15_26_5〇^d〇mi5_26 131458.doc •144· 200911832 作為對照。其他對照包括第2及第3輪胰蛋白酶選擇後來自 各庫之擴增且純化的噬菌體溶液。 將各嗟菌體樣品分為兩部分，第一部分用⑽叫㈤騰蛋 白酶處理，第二部分不賴蛋白酶處理。在抓下在授伴 (250 rpm)下將該兩個部分培養i小時，且藉由添加心心完 全蛋白酶抑制劑（1 X)阻斷。 使用經胰蛋白酶分解及未經分解樣品執行噬菌體 ELISA。使ELISA孔塗佈有濃度為！ μ§/ιη1之於〇」m碳酸氫 鹽緩衝液中之中性鏈親和素。用PBS進行洗滌及在室溫下 用1%於PBS中之Tween-20阻斷抗原塗佈孔！小時之步驟 後，使孔塗佈有遭度為100 ng/ml之稀釋於^^於卩則中之 Tween-20中的經生物素標記hVEGF。接著，用PBS洗滌各 孔且添加用1% TWeen-20/PBS 1:1稀釋之經處理或未經處理 之噬菌體上清液。在37°C下培養30分鐘後，用1。/。Tween_ 20/PBS洗滌孔，接著在37°c下與抗M13噬菌體_HRp接合物 (1/5000稀釋於1% Tween-20/PBS中）一起培養30分鐘。隨後 用PBS及過氧化酶洗猶:孔。藉由添加SureBiue試劑啓始反 應。約10分鐘後，用等效體積1 M HC1使反應停止，且在 OD450 nM下讀取孔。 經姨蛋白酶處理之不穩定對照DOM1 5-10及DOM 15-26-501之£1^18八讀數給出低於〇.4〇4之〇〇45()’且認為該值為不 穩定純系之邊界值。產生低於〇 4〇4之〇D之所有樣品視為 不穩定。超過彼值之所有樣品視為穩定。 131458.doc -145- 200911832 表8 庫 胰蛋白酶 無胰蛋白酶 第2輪選擇 第3輪選擇 第2輪選擇 第3輪選擇 DOM15-10 33% 89% 100% 100% DOM15-26-555 94.4% 100% 100% 100% 表8展示各庫之第2及第3輪胰蛋白酶選擇後穩定純系之 百分率。第3輪選擇後，該兩個庫中可見胰蛋白酶抗性純 系之富集。在各狀況下，胰蛋白酶分解後，每次選擇後含 有擴增純化噬菌體混合物之對照ELISA孔之值大大高於 0.404。此外，當比較來自第3輪選擇之胰蛋白酶處理噬菌 體與來自第2輪選擇之胰蛋白酶處理噬菌體時，觀察到信 號小幅增加。DOM1 5-10噬菌體庫展示該起始值之約14% 之增加。DOM15-26-555噬菌體庫展示代表該起始值之約 2 %之增加。 所有該等結果展示經胰蛋白酶預處理之選擇係有效自 DOM1 5-10及DOM1 5-26-5 55譜系選擇胰蛋白酶抗性噬菌體 純系。 將來自第2及第3輪選擇（DOM15-26-555)及僅來自第3輪 選擇（DOM15-10)之所有輸出物亞選殖於pDOM5載體中且 轉型於HB2 1 5 1電穿孔法勝任細胞（electrocompetent cell) 中。pDOM5載體為pUC119基載體。由Plac啟動子驅動蛋白 質表現。GAS 1前導序列確保經分離可溶性dAb分泌於大腸 桿菌HB21 51之周質及培養上清液中。隨機挑選184個來自 各輪選擇（3及4)之個體集落來在1 ml培養物體積中表現。 將細菌上清液稀釋於HBS-EP BIAcore緩衝液（1:1體積比） 131458.doc -146- 200911832 中且分成兩份。僅向一個小瓶中添加胰蛋白酶，最終濃度 為20 pg/ml。在攪拌（250 rpm)下在37它下培養4〇分鐘。用 Roche完全蛋白酶抑制劑（lx)阻斷反應後，在bia⑶κ儿⑼ 上就抗原結合（SA感應器晶片上之2,〇〇〇 Ru經生物素標記 hVEGF)測試經胰蛋白酶處理與未經處理之噬菌體上清 液。 挑選純系之標準為：相對於未經處理之dAb ’ <15%之經 胰蛋白酶處理之dAb的抗原結合減小（基於在所選擇之時點 所達到之最大RU)，此通常將反映dAb對蛋白酶處理之穩 定性；及dAb自抗原解離期間，兩個時點之間的解離速率 減小<40%。基於該等值，對6〇個來自D〇M15_26_555庫之 第2與第3輪選擇之純系及17個來自D〇M15_1〇庫之第3輪選 擇之純系進行測序。在該兩個庫之輸出物中觀察到一致突 變’且自各持有一致基序之庫挑選丨7個純系來進一步表 徵。該等純系之胺基酸序列展示於圖5(d〇m 15-26-555所 選擇之變異體）及圖6(d〇M15-10所選擇之變異體）中，且以 DNA序列形式列於圖2〇a_2〇E中。突出所選擇之純系中不 同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺基酸由點標記）。對應 於CDR1、CDR2及CDR3之環由框勾畫。 將該等純系表現於5 0 ml表現培養物中，在稀釋於hbS-EP緩衝液中至10〇 nM濃度之蛋白質A(就DOM15-26-555變 異體而言）或蛋白質L(就DOM1 5-10變異體而言）上純化且在 存在或不存在胰蛋白酶（最終濃度為20 pg/ml)之情況下在 授拌（250 rpm)下在37〇c下培養15小時後就抗原結合以 131458.doc -147- 200911832 BIAcore方式測試。 亦使用實例2中所述之方法測試該等純系胰蛋白酶抗 性。將蛋白質缓衝液父換至PBS中且濃縮至1 mg/ml。將25 Kg蛋白質與1 gg胰蛋白酶（Promega)混合且在30°C下培養〇 小時及24小時。此後，用Roche完全蛋白酶抑制劑（丨X)阻 斷反應’且添加DTT以及增重劑（loading agent)。使樣品在 100°C下變性5分鐘。隨後由電泳在Novex 10-20% Tricine凝 膠上分析15 pg各樣品，且用SureBlue(l X)染色蛋白質。 來自DOM1 5-26-555選擇之輸出物通常較穩定，當以 BIAcore方式測試時大多數純系保留胰蛋白酶抗性丨5小 時’且當以SDS-PAGE方式運行時，保留隔夜。相比較而 言’當以SDS-PAGE方式運行時，對於隔夜處理，僅少量 來自DOMI5-10選擇之純系抗胰蛋白酶。 實例6 鑑別DOMlh-131-511變異體 更詳細地分析 DOMlh-131-203、DOMlh-131-204 及 DOMlh-13 1-206。在37°C下與不同濃度之胰蛋白酶（在〇至 100 pg/ml範圍内）一起培養隔夜後，以BIAc〇re方式在5〇〇 nM之dAb濃度下將其加以比較。BIAe〇re迹線展示於圖7 中。結果顯然展不在高濃度胰蛋白酶（1〇〇 下該兩個 變異體比其親本對蛋白水解更具抗性。亦在上述條件下就 抗大罝包括白血球酶、彈性蛋白酶及胰酶之其他蛋白酶而 言，在100 Kg/ml之蛋白酶濃度下’比較兩個dAb D〇Mih_ 13 1-202及DOMlh-13 1-2G6與其親本。與親本相比，dAb抗 131458.doc -148- 200911832 所有所測試之蛋白酶之蛋白水解展示增加之抗性。彈性蛋 白酶及白血球酶之BIAcore迹線展示於圖8中。 用100 pg/ml測序級胰蛋白酶處理5 i、3及 24小時。用25 X R0che完全蛋白酶抑制劑抑制反應，且使 反應物在4-12% N〇Vex Bis-Tris凝膠上運行。凝膠展示於 圖9中。 實例7 鑑別DOM4-130-54變異體
更詳細地分析DOM4-130-201 及 DOM4-130-202。在37°C 下與不同/辰度之胰蛋白酶（在〇與1〇〇 pg/ml範圍内）一起培 養隔夜後，以BIAcore方式在500 nM之dAb濃度下將其加以 比較。BIAcore迹線展示於圖10中。結果顯然展示在高濃 度騰蛋白酶（100 pg/rnl)下所有三個變異體比其親本對蛋白 水解更具抗性。亦在上述條件下就抗大量包括白血球酶、 彈性蛋白酶及胰酶之其他蛋白酶而言，在1〇〇 pg/W之蛋白 酶濃度下，比較DOM4-130-201及DOM4-130-202與親本。 雖然結果與在姨蛋白酶下相比不太明顯，但前導dAb與親 本相比對所有所測試之蛋白酶展示增加之抗蛋白水解性。 彈性蛋白酶及白血球酶之BIAcore迹線展示於圖丨丨中。 用100 pg/ml測序級胰蛋白酶處理5 μΜ各dAb 〇、！、3及 24小時。用25 X Roche完全蛋白酶抑制劑抑制反應，且使 反應物在4-12% N〇Vex Bis-THs凝膠上運行。凝膠展示於 圖9中。 實例8 131458.doc •149· 200911832 進一步表徵DOMlh-131-511 及 DOM4-130-54變異體 首先使用差示掃描量熱法（DSC)分析dAb以蜂定胰蛋白 酶抗性之增加是否與炼融溫度（Tm)之增加相關。胰蛋白酶 穩定性之增加確實與Tm之增加相關（參見表9)。 表9 名稱 Tm (°C) DOMlh-131-511 57.9 DOMlh-131-202 67.5 DOMlh-131-203 65.7 DOMlh-131-204 62.3 DOMlh-131-206 64.9 DOM4-130-54 54.1 DOM4-130-201 64.7 DOM4-130-202 64.5 亦在MRC-5細胞基檢定（cell-based assay)中比較DOMlh-131-511來源之dAb(參見表10)。在該檢定中，量測dAb中 和TNFtx刺激之IL-8釋放之能力以確定胰蛋白酶穩定性之增 加是否已使得功效降低。然而，胰蛋白酶抗性dAb之活性 在該檢定中大體上未受影響。 表10 樣品 ND50 (nM) DOMlh-131-511 1.98 DOMlh-131-511 1.71 DOMlh-131-511 (230307CE) 1.89 DOMlh-131-203 (230307CE) 2.28 DOMlh-131-204 (230307CE) 1.89 DOMlh-131-511 1.46 DOMlh-131-206 (230307CE) 0.71 在受體結合檢定中測試DOM4-130-54來源之dAb以瞭解 其是否仍具有相同的抑制IL-1與IL-RI結合之能力（參見表 131458.doc -150- 200911832 11)。胰蛋白酶抗性dAb之活性在該檢定中未受影響。 表11
dAb IC50 (nM) DOM4-130-54 280 pM DOM4-130-201 257 pM DOM4-130-202 254 pM 實例9 鑑別DOM15-26-555變異體 更詳細地分析 DOM15-26-588、DOM15-26-589、DOM15-26-591及DOM15-26-593以及其親本及兩個其他dAb DOM 15-26-594及DOM 15-26-595，其係藉由組合將對效價 及穩定性產生最大影響之突變（E6V及F100S/I)之突變誘發 而創建。序列展示於圖12中。與濃度為200 pg/ml之胰蛋白 酶一起培養後在1〇〇 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以 BIAcore方式比較純系。在授拌（250 rpm)下在37°C下使反 應進行3小時及24小時。最佳純系DOM1 5-26-593及親本之 BIAcore迹線展示於圖13中。其他結果以圖表形式呈示於 圖14中。結果顯然展示在胰蛋白酶處理24小時後，所有變 異體比親本對蛋白水解更具抗性。 亦藉由以SDS-PAGE方式運行經處理及未經處理之樣品 來檢查DOM15-26-593及親本之胰蛋白酶抗性。簡言之’ 將蛋白質緩衝液交換至PBS中且濃縮至1 mg/ml。將25 pg 蛋白質與1 pg測序級胰蛋白酶（Promega)混合且在30°C下培 養0小時、1小時、3小時及24小時。此後，用Roche完全蛋 白酶抑制劑（1 X)阻斷反應，且添加DTT以及增重劑。使樣 131458.doc -151 - 200911832 品在100°C下變性5分鐘。將15 pg各樣品加載於Novex 10-20% Tricine凝膠上，且用SureBlue(lx)染色蛋白質。結果 展示於圖15中。該實驗中DOM15-26-593之胰蛋白酶抗性 概況不同於BIAcore實驗所展示之概況，從而提示反應條 件之不同可能會影響胰蛋白酶裂解之最終結果。儘管如 此，如下文所示，DOM15-26-593仍具有較其他所選擇之 純系佳之生物物理性質以及親和力。DOM1 5-26-555變異 體之性質之概述亦展示於下表12中。 表12 屬性 SEC-MALLS DSC RBA BIAcore 胰蛋白酶穩定性 dAb 單體％ 估算mw Tm (°C) nM KD(nM) 在+24小時時之結合％ 15-26 0 37-136 64 10 28.2 30 15-26-501 0-40 18-290 51 1.14 9.1 5 15-26-555 0 28-78 63 11.7 26.1 10 15-26-588 10 33 70 27 59.1 15 15-26-589 90 17 63 1.94 9.6 65 15-26-591 20 21-234 63 16 38 35 15-26-593 80 17 65 0.323 3.2 80 15-26-595 60 17 65 0.828 5 70 實例1 0 鑑別DOM15-10變異體 更詳細地分析DOM15-10-11以及其親本DOM15-10。序 列展示於圖16中。與濃度為200 pg/ml之胰蛋白酶一起培養 後在100 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以BIAcore方式比較 dAb。在攪拌（250 rpm)下在37°C下使反應進行1小時、3小 時及24小時。該等dAb之BIAcore迹線展示於圖17中。結果 顯然展示在胰蛋白酶處理24小時後，所選擇之變異體比親 131458.doc -152- 200911832 本對蛋白水解更具抗性。 乂亦藉由運行SDS-PAGE之！呈處理及未經處理之樣品檢查 前導分子及親本之胰蛋白酶抗性。簡言之，將蛋白質緩衝 液交換至PBS中且濃縮至1 mg/ml。將25叫蛋白質與1 μ 測序級胰蛋白酶（promega)混合且在3〇它下培養〇小時、1小 時、3小時及24小時。此後，用Roche完全蛋白酶抑制劑（ΐχ) 阻斷反應，且添加DTT以及增重劑。使樣品在1〇〇。〇下變 性5分鐘。將Η Kg各樣品加載於Novex 10-20。/。Tricine凝膠 上，且用SUreBlue(lx)染色蛋白質。結果呈示於圖18中。 在此狀況下’胰蛋白酶抗性概況與BIAc〇re胰蛋白酶測試 充分相關，從而展示結合活性直接反映蛋白質之完整性。 實例11 進一步表徵DOM15-26-555及DOM15-10變異艘 首先使用差示掃描量熱法（DSC)分析dAb以確定騰蛋白 酶抗性之增加是否與Tm之增加相關。結果展示於表i 3 中。DOM1 5-26-555變異體之胰蛋白酶抗性與炫融溫度之 間存在相關性。前導DOM15-26-588及DOM15-26-593展示 改良之Tm，但其他純系不展示。值得注意的是，雖然起 始時 DOM15-26-555 及 DOM15_10親本分子（63.3-63.7。〇 具 有比DOM4-13 0-54及DOMlh-131-511親本分子（起始時 Tm : 57.9-54.1°C )高得多之Tm，但總之，蛋白酶抗性純系 達到類似範圍内之Tm(DOMlh-13 1-511/DOM4-130-54變異 體之平均 Tm 為 65.1°C，DOM15-26-55/DOM15-10 變異體之 平均 Tm為 64.9°C)。 131458.doc -153- 200911832 表13 名稱 Tm (°〇 D0M 15-26-555 63.3 DOM15-26-588 70.1 DOM15-26-589 63 DOM15-26-591 63 DOM15-26-593 65 DOM15-10 63.7 DOM15-10-11 63.3 在受體結合檢定中比較dAb，且量測BIAcore動力學以確 定胰蛋白酶穩定性之增加是否已使得功效降低。然而， dAb之活性在該檢定中大體上未受影響或甚至得以改良。 結果呈示於表14中。 表14 純系ID EC5〇(nM) K〇(nM) DOM15-26-555 11.7 26.1 DOM15-26-588 27 59.1 DOM15-26-589 1.94 9.6 DOM15-26-591 16 38 DOM15-26-593 0.323 3.2 DOM15-26-594 4.09 15.1 DOM15-26-595 0.828 5 DOM15-10 10.23 23.6 DOM15-10-11 3.58 14.6 T m增加之優點 大多數蛋白質（包括區域抗體）以兩種狀態存在：摺疊狀 態（產生生物學活性分子）及展開狀態（不具有功能活性）。 該兩種狀態在所有溫度下共存且各狀態之相對比例通常由 隨摺疊及展開之動力學常數而變之常數K確定。熔融溫度 通常定義為κ=1之溫度，亦即，摺疊蛋白質之比例等於展 開蛋白質之比例時的溫度。常數K係由蛋白質之穩定及不 穩定分子内相互作用確定，且因此主要由蛋白質之胺基酸 131458.doc -154- 200911832 序列確定。諸如产许 數影響κ，且因f & p 、、’、衝液組成、塵力之外在參 且因此影響熔融溫度。 展開蛋白貝為降解機制之容易靶 而定會增加氧化π ()暴路雙石瓜鍵视境況 助於自身蛋白欢紐“ “口主鏈靈活性可有 龙白水解反應，（出）暴露肽片段 白酶、製造渦鉑《 77仅J杈仏活體内蛋 留蛋白酶之靶，…1 Μ 及長期儲存期間遺 及GY)暴露有聚集傾向片段會導致八$ Μ 聚集及蛋白質嗦璐A ^ S等致刀子間 蛋白f人詈，在 況下，發生蛋白質完整性、 貝3量及蛋白質活性損失’從而危及⑴確保批次重現 (⑴確保存放長期穩定性及（ϋ0活體内功效之努力。 在自Μ界中’蛋白質已藉由進化設計以適於在體溫下執 行且經由穩態機制容易地置換。經由生物技術方法製造出 之治療蛋白質面對不同環境：其通常由dna重組技術在外 來宿主中產生’在大容器中以較高量表現，整個下游過程 中經受極重大之pH值或緩衝液組成變化且最後長期以高濃 度儲存在非生理學緩衝液中。新穎傳遞技術（例如吸入、 皮下貼片、緩慢傳遞奈米粒子）亦會增加治療蛋白質所經 受之應力。最後，蛋白質工程化技術之出現使得可產生增 強或完全新穎之治療蛋白質。因為大多數工程化技術為旨 在改變或創造新穎胺基酸序列之基於活體外之技術，不會 發生逐步改良生物蛋白質之進化過程，因而產生在應力抗 性方面具有次最佳效能之蛋白質。 本發明之技術旨在再現整個達爾文進化（Darwinian evolution)中蛋白質所面對之條件中之一種。用在組織重 塑及蛋白質穩態中發揮重要作用之蛋白酶灌注肽或多肽 131458.doc •155· 200911832 (例如免疫球蛋白單一可變區域）。亦測試任何可產生具有 改良之功能適應之蛋白質的特定突變的適應其表現環境之 能力。在本發明之一實施例中，再現該過程：建立肽或多 肽變異體譜系且暴露於蛋白酶中。在第二步驟中，使變異 體譜系與特定靶接觸。僅彼等經受住蛋白酶降解之蛋白質 變異體能夠與靶接合，且因此（例如）由稱為‘淘選’之簡 單親和力純化過程回收。與活體内過程相比，該系統提供 多個優點：蛋白質譜系可面對較寬範圍之條件，例如多種 蛋白酶、在較高濃度下、歷時較長時間、在不同緩衝液或 pH值下且在不同溫度下。因此，該活體外技術提供一種設 計可在較所起源之環境範圍寬之環境中表現且仍穩定的蛋 白質之方式。顯然，此為生物技術工業且尤其治療蛋白質 領域提供多個優點。 實例12 :蛋白酶抗性前導分子之PK相關性資料 進一步在活體内評估四個dAb品系中之每一個品系之親 本dAb及蛋白酶抗性dAb(關於清單及詳情，參見下表15)。 表15 : 品系 dAb ID 胰蛋白酶抗性 Tm(°C) 活性（nM) Fc融合物 形式之ID DOM4-130 DOM4-130-54 良好 54 0.128* DMS1541 DOM4-130-202 極南 64 0.160* DMS1542 DOMlh-131 DOMlh-131-511 良好 57 0.048f DMS1543 DOMlh-131-206 極兩 64 0.047f DMS1544 DOM15-10 DOM15-10 低 64 0.913f DMS1546 DOM15-10-11 63 0.577f DMS1531 DOM15-26 DOM15-26-501 (*) 低 52 0.330f DMS1545 DOM15-26-593 南 65 0.033f DMS1529 * :如由MRC5/IL-a生物檢定戶斤測定；t :如由RBA檢定戶斤測定 131458.doc •156· 200911832 註解：DOMl 5-26-501為本專利申請案中上文所例示之 DOM15-26-555 之親本形式。DOM15-26-555 在 CDR1(134M) 中具有一個生殖系胺基酸突變。DOM15-26-501具有比 DOM15-26-5 5 5低之熔融溫度（52 V對63.3 V)及增加之對胰 蛋白酶之分解的敏感性。優於DOM15-26-555挑選DOM15-26-501用於PK研究，因為與DOM15-26-593相比，其更充 分代表不良穩定性。 吾人可如下解釋抗性： / 1 低 2 中 3 良好 4 高 5 極尚 則此意謂親本分子之胰蛋白酶抗性為： DOM4-130-54 良好 DOMlh-131-511 良好 DOM15-10 低 DOM15-26-501 低 關於所選擇之前導分子： DOM4-130-202 極高 DOMlh-13 1-206 極高 DOM15-10-11 高 DOM15-26-593 高 因為區域抗體之尺寸小（1 2-1 5 kDa)，所以其在靜脈内或 131458.doc -157- 200911832 點㈣循壤中快速清除。實際上，f絲球過滤截止 點超過5〇kDa，且因此諸如dAb之小蛋自##其穿過腎時 不會保留在循環中。因&，為評估活體内蛋白酶抗性之長 期效應’ i人用增加全身性滞留之部分標記區域抗體。文 獻中已報導數種旨在延長半衰期之方法（例如咖、&融 合、白蛋白融合等）°在本中請案中’用人類IgG1抗體之 Fc部分標記區域抗體（或對其編排格式）。該格式提供兩個 優點：⑴所得dAb-Fe之分子尺寸為約75伽，其足夠大以 確保保留在循環中；（ii)抗體卜部分結合FcRn受體（亦 稱”布蘭貝爾"受體）。該受體定位於上皮細胞、内皮細胞 及肝細胞中且涉及延長抗體及白蛋白之壽命：實際上，在 抗體及其他血清蛋白之胞飲作㈣，蛋白質係引導至酸化 核内體，其中FCRn受體在抗體轉運至核内體且使其返回至
循環中之前截取抗體（經由與以部分結合）^因此，藉由使 Fc部分標記於dAb，確保dAb將長期暴露於至少兩個隔 室·血清及前核内體隔室（pre-en(josomal c〇mpartment) 中’其各自含有一組特定蛋白水解酶。另外，FcRn受體介 導之穿胞運輸（transcytosis)，藉此使攜帶Fc之蛋白質遷至 及遷出血管外空間。 藉由經由短介入肽連接子（粗體）使編碼VH及Vk dAb之 基因與編碼人類IgGl Fc之基因融合實現用Fc編排格式： 對於VH dAb(加下劃線）： EVQ......GQGTL VTV S S ASTHTCPPCP APELLGGP... (hlgG 1 Fc)... PGK* 對Vk dAb(加下劃線）： 131458.doc •158· 200911832
DIQ.........GQGTKVEIKRTVAAPSTHTCPPCPAPELLGGP.. .(hIgGIFc).. .P GK* 根據標準方案使用293-fectin(Invitrogen)藉由瞬時轉染 HEK293/6E細胞產生物質。該等細胞係經設計以當與pTT 系列載體組合使用時高含量瞬時表現（Durocher等人， 2002)。因此，將dAb基因選殖於經修改pTT5載體 (pDOM3 8)中以產生Fc融合物表現載體（參見圖21)。在轉染 後5天收集轉染細胞之上清液，藉由離心澄清且經0.2 μηι 過濾器過濾。藉由捕獲於蛋白質Α流線型樹脂（GE Healthcare)上純化dAb-Fc融合蛋白。以1 0 mM檸檬酸鈉 (pH 3)自管柱中溶離蛋白質，接著添加…及1 Μ檸檬酸鈉 (pH 6)以達到100 mM檸檬酸鈉（pH 6)之最終組成。 就活體内半衰期在大鼠中以於雌性Sprague-Dawley大鼠 (每組n=3)中5 mg/kg之乾劑量測試dAb-Fc分子。應注意， 靶劑量大大超過大鼠中之靶濃度，所以預期親本dAb與胰 蛋白酶抗性dAb之間的親和力差異（參見實例11)不會影響 活體内分子之最終結果。因此，希望dAb之間的PK概況之 差異歸咎於抗原獨立性排除過程。 在投藥後 〇.〇3、1、4、8、24、48、72、96、120及 168 小時採集血樣。凝塊形成後，抽出血清且隨後在hlL-1R1、TNFR1或VEGF抗原捕獲檢定中測試： hIL-lRl抗原捕獲檢定： 塗佈有 4 pg/mL 抗 hIL-lRl 阻斷 添加 500 ng/mL shIL-lRl 131458.doc -159- 200911832 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 TNFR1抗原捕獲檢定： 塗佈有 0.1 pg/mL sTNFRl 阻斷 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 VEGF抗原捕獲檢定： 塗佈有 0.25 pg/mL VEGF 阻斷 添加樣品 在1:10,000下用抗人類Fc HRP偵測 使檢定之原始資料轉化為各血清樣品中之藥物之濃度。 隨後在WinNonLin中使用非隔室分析（non-compartmental analysis，NCA)分析各時點之平均pg/mL值。各dAb-Fc對 之PK概況展示於表1 6中，其概述所測出之PK參數。 表16 : ID dAb 半衰期（hr) AUC/D(0-inf) (hr*pg/mL)/(mg/kg) 外推AUC % DMS1541 4-130-54 93.2 691.5 22.7 DMS1542 4-130-202 176.8 710.1 49 DMS1543 lh-131-511 140.8 1807.5 40 DMS1544 lh-131-206 158.6 2173.0 43.6 DMS1546 15-10 43.2 324.6 3.8 DMS1531 15-10-11 56.6 770.5 n_d. DMS1545 15-26-501 12.9 89 5.1 DMS1529 15-26-593 86.2 804.7 21.0 結果清楚指示，雖然dAb-Fc對4-130-54至lh-13 1-206之 131458.doc -160- 200911832 pk概況幾乎可重疊，但該等概況與其他對相差甚遠。當考 慮AUC/Dh ’主要可見如下效應：15_i(^auc/d僅為a 】〇 11 之 42/。。15-26-501 之 AUC/D僅為 15-26-593 之 11%。 該等重要差異亦影響（較小程度）半衰期：15_1〇及151〇11 刀別為43.2 h對56.6 h。對於DOM15-26品系可見更大差 異：15-26-501 及15-26_593 分別為 129 m# 86 2 h。實際 上，對於使用非隔室分析之良MPK分析，應存在至少4個 用以擬合線性回歸斜率之資料點，且半衰期估算值之時間 應為半衰期計算值之至少3倍。 根據本文中之實例中所述之生物物理性質，任何給定 dAb抗胰蛋白酶降解之能力似乎與dAb_Fc融合物在大鼠血 清中循環較長時間之能力相關。實際上，如實例（諸如實 例ίο)中所示，00]^15_1〇及〇〇]^15_26_5〇1為最易降解之 dAb :在1叫胰蛋白酶存在下在3(rc下培養25叫dAt^3小 時可產生元全降解。該研究中之所有其他dAb(不管其是否 以騰蛋白酶來選擇（亦即，DOM15-10-11、D〇M15_26_ 593、DOM4-130-202 及 DOMlh-131-206)或其是否已具有部 分如親本分子之胰蛋白酶抗性（D〇M4-130-54及DOMlh-131-511))當再編排格式於dAb_Fc分子中時在大鼠中具有可 比之pk概況。因此，本發明之？尺研究提示當彼等dAb具有 極低抗蛋白水解性時，對蛋白水解敏感會對dAb之活體内 L疋1"生產生最大影響。亦展示，超過一定程度，胰蛋白酶 降解抗性之進一步增量（例如DQM4-130-206對DOM4-130-54)並不等於說dAb_Fc分子進一步減緩活體内排除之 131458.doc 200911832 力。 在三種狀況下，在胰蛋白酶存在下之選擇產生熱穩定性 (由熔融溫度所定義）增加之新穎分子：D〇M4-130-202、 DOMlh-131-206 及 DOM15-26-593。PK研究指示，在本發 明資料集中，炼融溫度不足以使所觀察到之pK概況合理化 之參數：實際上，DOM15-10具有比D〇M15_1〇_U高之 Tm，但比DOM 15-10-11更快速地自循環中清除。另外， DOM4-130品系之兩個dAb具有顯著不同之丁⑺（相差1〇。〇)， 但當編排格式於dAb-Fc分子中時展示幾乎相同之活體内穩 疋性。應注意，本質上不應排除熔融溫度作為預測活體内 穩定性之關鍵參數。對於本發明之資料集恰好發生的為， 大Tm差異（自54°C及以上）並不對活體内dAb之走向產生顯 著影響。此並不排除在低於54它之熔融溫度下，dAb之活 體内穩定性可能與熱穩；t性相關或也許甚至與熱穩定性及 蛋白酶抗性都相關的可能性。 實例1 3 v 對DOM10-53-474之胰蛋白酶選擇 經純化DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性： _〇_53~474為以高效價與結合之區域抗體。為 評估在胰蛋白酶存在下該dAb之穩^性，用騰蛋白酶分解 純化dAb歷時增加之時點且在凝膠上運行以檢查任何可能 的蛋白質降解。在3吖下使25 μ1 ι 一之純化觸〇· 53-474與i μ1 ! mg/ml之測序級胰蛋白酶一起培養，從而產 生25:1 dAb:月夷蛋白酶之分子比。使心與騰蛋白酶一起 131458.doc -162- 200911832 培養1 h、4 h及24 h’且藉由添加4 μ1 R〇che完全蛋白酶抑 制劑中和蛋白酶活性’接著在冰上培養。藉由向dAb中添 加蛋白酶抑制劑而不添加胰蛋白酶製備時間〇之樣品。接 著藉由電泳使用Labchip根據製造商說明書分析2 μ樣品。 圖22展示以與胰蛋白酶一起培養歷時增加之時點之 d〇m10_53_474運行的凝膠。為了比較，亦如以上所說明 用胰蛋白酶處理一種胰蛋白酶穩定dAb DOM15_26_593且 並排運行。如圖中所示，doM15_26_593即使在與胰蛋白 酶一起培養24 h後看起來亦為穩定的。然而，雖然 d〇m10-53_474在24 h後在一定程度上降解，但在ι }1及4匕 時點％看起來為穩定的。該等資料表明D〇M1〇_53_474在 一定程度上抗胰蛋白酶降解，但不如最具胰蛋白酶穩定性 之 dAbD〇M15-26-593 穩定。 嗟菌體呈現DOM10-53-474之胰蛋白酶穩定性： 為評估噬菌體呈現D〇M10-53_474之胰蛋白酶穩定性， 將編碼DOM10-53-474之基因選殖於pD〇M33(圖5〇)之 立點中及根據標準技術產生噬菌體。將噬菌體由 PEG沈澱純化’再懸浮於pBS中且測力價。 使噬菌體呈現dAb與胰蛋白酶一起培養不同時點以評估 胰蛋白酶抗性。與胰蛋白酶一起培養後，在感染指數生長 大腸桿菌TG1細胞後，由力價分析量測穩定性。 在37C下在震盪培養箱中使1〇〇 μι噬菌體於1〇〇 胰 蛋白酶中培養1 h、2 h、4 h及隔夜。用Roche完全蛋白酶 抑制劑（X2)阻斷胰蛋白酶活性，且隨後將噬菌體稀釋於2% 131458.doc -163- 200911832 於PBS中之marvel中，在室溫下與1〇载經生物素標記化 13 —起培養1小時。添加在室溫下用2%於？則中之 預阻斷1小時的抗生蛋白鍵菌素塗佈珠粒（如咖他m_ 280(InVitrogen))，且隨後在室溫下將混合物培養5分鐘。 所有與Dynabeads -起進行之培養步驟均在轉輪上進行。 藉由用存於PBS中之〇·1% Tween_2(h^料粒8次洗除未結 合喔菌體。用0.5 ml (Μ M甘胺酸（pH 22)溶離結合嗟菌體 ,且用⑽W 1 M T—HCL(pH 8.〇)中和。使用經溶離嗟菌 %體感染指數生長之TG1細胞（在坑下H、時）且塗鋪於四環 素板上。在37C下將各板培養隔夜，且進行菌落計數。將 胰蛋白酶分解後之噬菌體輸出力價概述於表17中。當與胰 蛋白酶一起培養歷時增加時點時，噬菌體力價降低。培養 24小時後，所有噬菌體分解。 表17 :對嗟菌體呈現D〇M_10_53_474親本執行之姨蛋白 酶選擇之輸出力價
選擇更抗姨蛋白酶之dAb : 為選擇更抗胰蛋白酶降解之dAb，使用stmergene Mutazyme η套組、，經生物素標記引子及供5〇 ^反應用之 弘50 Pg模板由PCR向編碼D〇M1〇_53_474之基因中引入隨 機突變。㈣/!及祕分解後，用抗生蛋白鍵菌素塗佈珠 13I458.doc 164- 200911832 粒自未分解產物中純化插入物且將其在相應位點處連接於 PDOM33中。用經純化連接混合物轉型大腸桿菌π!細 胞，=而產生DOM10-53-474之易錯庫。庫之規模為 1.9xl〇9且胺基酸突變率為13。 對該庫執行3輪選擇以選擇具有改良蛋白酶抗性之心。 在僅有抗原而無胰蛋白酶處理的情況下執行第！輪選擇以 淨化庫從而移除不再以高親和力結合抗原之任何純系。在 10福IL]3下進行選擇。與㈣…個輸入 1輪之輸出為2X109,從而沪干庙+丄 第 4, E 從而扣不庫之大部分以高親和力結合 抗原。 用1 nM經生物辛標印η ^ 7批 视京知忑IL-13執仃第2及第3輪選擇。 IL-13淘選之前，在37χ： 晨盪益（250卬m)中使噬菌體 與〇〇 _丨胰蛋白酶—起培養。對於第2輪選擇，在室„ 下或在37t：下培養胰蛋白酶丨^拄 ^ ^ 於表18中： 夷蛋白酶1小時。第2輪選擇之輸出展示
使用來自37°C下1 h填蛋白_ _ 表18:第2輪選擇後輸出之噬菌體力價 ^白酶處理 ^ ^ 駟處理的第2輪選擇的噬餡舻 輸出物作為第3輪選擇 每體 、释之輪入物。對於第3輪選擇，用_ μ*ι胰蛋白酶處理噬菌體 擇用100 體且歷時杈長時點：在37t下2 h， 在37C下4 h，在室溫下隐在 下^伩或在37t下隔夜。第3輪選擇 131458.doc -165 - 200911832 之輸出力價概述於表19中： 表19:第3輪選擇後輸出之噬菌體力價
對來自第1、2及3輪之各選擇輸出物之數個純系進行測 序以評估序列多樣性。無胰蛋白酶處理之第1輪選擇後， 選擇輸出物之50%具有親本〇〇馗1〇_53_474序列。第2輪選 擇後，親本之百分率增加至75%。第3輪選擇後親本之 百分率增加至80%。
該資料指示DOM10-53-474已抗胰蛋白酶降解，且可自 =等胰蛋白酶選擇物中選擇不太多之新穎純系。圖22展示 田用胰蛋白酶分解經純化蛋白質時，DOM10-53-474即使 在騰蛋白酶處理隔夜後亦不會完全分解。然而，為瞭解在 選擇輪出物中是否存在任何比麵1〇53_474更具胰蛋白 酶抗性之新穎純系，將在37。〇下用胰蛋白酶處理噬菌體隔 夜之第3輪選擇之輸出物亞選殖於pD〇M5中。隨後對數百 ’”屯系測序以尋找任何騰蛋白酶抗性純系。在所分析之數 百個純系中’僅26個純系具有新穎序列，然而該等純系中 沒有個在胰蛋白酶裂解位點（離胺酸或精胺酸）具有突 變表明δ亥等純系不比DOM1 0-53-474更具胰蛋白酶抗 性0 131458.doc •166- 200911832 實例14 在胰蛋白酶存在下由嗤菌體選擇引入前導DOMO101 (抗 TNFRl)dAb中之儲存及生物物理性改良： 為改良前導分子DOMlh-1 3 1-5 11之蛋白酶抗性，如先前 所述在胰蛋白酶存在下進行噬菌體選擇。該方法產生大量 與親本DOMlh-131-511分子相比具有改良胰蛋白酶穩定性 之純系。選擇兩個純系DOMlh-131-202及DOMlh-131-206 以進一步表徵’因為其展示胰蛋白酶作用之最顯著改良。 如下文所概述之進一步研究展示’對於胰蛋白酶作用具有 改良抗性’主要對分子抗剪切應力及熱應力之穩定性存在 其他有利效應。該兩個參數對增加生物醫藥產物之儲存及 存放期穩定性至關重要。 馬斯德畢赤酵母中前導DOM0101 dAb之產生： 使用編碼三種前導分子之一級胺基酸序列之基因在馬斯 德畢赤酵母中產生分泌蛋白質。將三種合成基因（D〇Mih_ 131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh-131-206)選殖於表現 載體pPIC-Ζα中，且隨後轉型於兩種畢赤酵母菌株χ33及 ΚΜ71Η中。將經轉型細胞濾出置於遞增濃度之芥森（1〇〇、 3 00、600及900 pg/ml)上以選擇具有多個整合子之純系。 隨後在2 L燒瓶中篩選數個純系以鑑別高表現細胞系。隨 後使用最佳表現純系在酸酵罐中以5 l規模產生物質。 蛋白質純化及物質表徵： 為產生尚品質物質用於表徵且用於進一步穩定性研究， 使用混合模態電荷感應樹脂（Capt〇 MMC)將下游純化過程 131458.doc -167- 200911832 設計為初級捕獲步驟，接著進行陰離子交換（q Sepharose)。未顯著優化，此允許回收約7()%之純度為約 95%之表現dAb。冑用電噴霧質譜、胺基末端測序及等電 聚焦表徵物質一致性，且使用SDS_PAGE&SEc(尺寸排阻 層析法）表徵純度。 蛋白質一致性： 各蛋白質之第一個5殘基之胺基末端序列分析係如所預 期（EVQLL…）。使用C4 Zip尖頭（MilUp〇re)對已緩衝液交換 於含有〇.1%冰醋酸之50:50 ho:乙腈中之蛋白質樣品執行 質譜分析。冑於三種蛋白質中每一種戶斤量測到的質量當允 許因形成内部雙硫鍵而產生之·2質量差時係在基於一級胺 基酸序列之理論質量（使用平均質量計算）的〇.5 Da範圍 内。使用IEF基於對於各蛋白質為不同之pI鑑別蛋白質。 蛋白質純度： 叫及10 gg之量一式兩份裝载於非還原 將三種蛋白質以1 k SDS-PAGE凝膠上。在所有情況下，觀察到單一條帶。 亦執行尺寸排阻層析以顯示純度級。對於尺寸排阻層析 (SEC)，將1〇〇叩各蛋白質裝載於T〇s〇H G2〇〇〇 柱上，在0.5 ml/min下流動。移動相為pBS/1〇%乙醇。基 於曲線下之面積量測單體百分率（參見圖23)。 DOMlh-131-202 及 DOMlh-131- 比較 DOMlh-13 1-5 11 2〇6之穩定性 評估蛋白酶穩定性： 在過量蛋白酶中預培養規定時點後，由BIAc〇reTM分析 131458.doc 200911832 殘餘結合活性評估:DOMlh-131-511、DOMlh-131-202 及 DOMlh-131-206之蛋白酶穩定性。將約14〇〇 Ru經生物素 標記TNFR1塗佈於抗生蛋白鏈菌素（SA)晶片上。在3〇它下 使 250 nM DOMlh-l31_511、DOMlh_131_202 及DOMlh_ l31-206 與僅 PBS— 起或與100 叫/〇11胰蛋白酶 、彈性蛋白酶 或白血球酶一起培養i、3及24小時。藉由添加蛋白酶抑制 劑混合物使反應停止。隨後使用參考池扣除法使dAb/蛋白 酶混合物穿過TNFR1塗佈晶片。在每次注射循環之間用1〇 μΐ 0’ 1 Μ甘胺酸（pH 2.2)使晶片表面再生。相對於無蛋白酶 之dAb結合，測定與蛋白酶一起預培養結合人類TnfR1之 DOMlh-131-511、DOMlh-131-202及 D〇Mlh-131-206(10秒 時）之比例。在25 C下進行BIAcore™運行。以下資料由三 個獨立的實驗產生。條形圖指示平均值’且誤差棒指示結 果之標準偏差（圖24)。 已發現，與 DOMlh-131-511相比，DOMlh-131-202 及 DOMlh-13 1-206展示具有較大的胰蛋白酶、彈性蛋白酶或 白血球酶蛋白水解降解抗性。與胰蛋白酶一起1小時後及 與彈性蛋白或白血球酶一起3小時後，與d〇m 1 h-13 1 _ 5 11 相比 ’ DOMlh-13 1-202 與 DOMlh-13 1-206 之間的差異 最明顯。在大部分測試條件下，存在與〇〇河111131_2〇2相 比’ DOMlh-131-206稍更穩定之趨勢。 如使用DSC所測定之dAb之熱穩定性： 為確定在何pH值下前導分子具有最大穩定性，使用差示 掃描量熱計（DSC)量測各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之 131458.doc -169- 200911832 熔融溫度（Tm)。因為伯瑞坦-魯賓遜由三組分緩衝系統（乙 酸、磷酸及硼酸各40 mM)構成，所以有可能在同一溶液中 產生3-10範圍内之pH值。由蛋白質一級胺基酸序列確定理 論pi。由DSC，可見dAb具有最大内在熱穩定性之pH值對 DOMlh-131-202而言為 pH 7，對DOMlh-131-206 而言為 pH 7-7.5，且對DOMlh-131-511而言為pH 7.5。對於所有隨後 應力及穩定性研究’各dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中使用 以下 pH 值：對 DOMlh-131-202 及 GSK1995057A DOMlh-131-206而言，pH 7.0，且對DOMlh-131-511 而言，pH 7.5。 結果概述於表20中。 表20 :如由DSC所測定於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中1 mg/ml 之 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 之 pH值及Tm的概述。溫度以180°C/小時勻變。 dAb 產生最大固有熱穩定性之pH值 在給定pH值下dAb之Tm ΓΓ、 DOMlh-131-202 7.0 68.6 DOMlh-131-206 7.0-7.5 65.8 DOMlh-131-511 7.5 58.0 兩週熱穩定性測試 蛋白質在高溫下持續長時間之能力通常為其穩定性之良 好指示。在該等條件下，蛋白質可經受數種諸如聚集之物 理過程，或化學改質。在37。〇及5〇〇c下在伯瑞坦_魯賓遜緩 衝液中將dAb(l mg/ml)培養μ天。使用SEC測定經14天之 時間溶液中遺留多少單體（圖2 5)。 由圖 25 可見 DOMlh-131-202 與 DOMlh-131-206 顯著比 DOMlh-131-511對熱應力穩定。通常將蛋白質暴露於諸如 131458.doc -170- 200911832 37^及5(TC之高溫下來給出藥物長期存放期之指示。使用 該等較高溫度加速與室溫下長期儲存相關之正常過程，諸 如脫酿胺作用、氧化或聚集。亦可使用SEC監測溶液中聚 集形成之程度（圖26A至I)。37。(：下14天後，D〇Mlh_131_5u 自溶液中之損失可歸於沈澱與如由SEC所測定之較高有序 性聚集體之形成（圖26B)。14天後在37。〇下，關於D〇Mih_ 131-202與DOMlh-131-206亦可見顯著較低之蛋白質損 失其中聚集體形成極少或無實質性增加，尤其在 DOMlh-131-206之狀況下（圖26H)。在50°C下，分子之間的 差異甚至更明顯’ D〇Mlh-131-206在14天後在較高溫度下 展示較DOMlh-131-202佳之穩定性，展示較高分子量聚集 體之形成顯著降低（圖26)。相對於t=0，14天後，D〇Mlh_ 13 1-206僅展示聚集體形成之小幅增加（圖261)，*D0Mlh_ 131-511幾乎沈澱析出溶液（圖26C)。 此展示由胰蛋白酶選擇引入dAb中之變化（例如改良之熱 穩定性）顯著改良蛋白質在37。〇及50°C下儲存穩定性。 DOMlh-1 3 1-202明顯具有且DOMlh-1 31-206更顯著明顯具 有改良之溶液穩定性及較低的在高溫下形成聚集體之傾 向，此可直接解釋為在諸如+4°C及室溫之更多相關溫度下 具有改良之長期儲存穩定性。 隨後由IEF分析熱應力實驗24小時、48小時、7天及14天 時點之樣品以瞭解蛋白質是否經受任何會影響蛋白質總電 荷之生物物理變化（圖27)。 在 37°C 下，DOMlh-131-202 與 DOMlh-131-206 再次展示 131458.doc «171 - 200911832 與DOMlh-131-511相比無顯著變化。關於D〇Mih-l3i_ 511，24小時後在37。(：下出現微弱之第二條帶。咸信，該 額外出現的帶係歸因於蛋白質之二聚作用，從而掩蔽電荷 且產生兩個分子群體。在50°C下，分子之間的差異更明 顯，在高溫下DOMlh-13 1-206明顯展示無顯著變化，而24 小時後，DOMlh-131-2〇2展示一些改質跡象。在伯瑞坦_ 魯賓遜中48小時後，大部分DOMlh_13l_5n因沈澱而損 失。 由TNFR-1 RBA分析50〇C下之T=0、7及14天時點以確定 暴露於尚溫後蛋白質之功能性（圖28)。雖然目前該檢定在 檢測％因於應力之分子之微小變化方面不如Sec或ieF靈 敏’但可使用其展示dAb仍可結合抗原。 D〇Mlh-131-511之曲線之向左移動反映大部分dAb已歸 因於沈澱而損失之事實。溶液中遺留之物質仍能夠結合抗 原。如圖25中所示’大部分D〇Mlh-131-202與DOMlh-13 1-206即使在14天後亦能夠保持在溶液中。rba展示所 有可溶性蛋白質仍具功能性且能夠結合TNFR1。 高蛋白濃度下測試之儲存穩定性： 進行實驗以研究+4°C極高蛋白質濃度下之儲存穩定性以 瞭解在該等條件下各分子如何表現。將所有前導dAb在最 穩定pH值在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中在離心Vivaspin濃縮器 中濃縮（5K截止點）至約1〇〇 mg/ml。隨後將約1〇〇 mg/ml之 樣品擱置在+4°C下7天’且隨後由SEC分析以瞭解在高濃度 下儲存期間樣品是否會發生任何其他物理變化（圖29)。在 131458.doc •172- 200911832 SEC管柱上k1xpbs 10%乙醇（v/v)中走柱之前，將樣品稀 釋至約1 mg/ml。 由 SEC迹線，可見DOM1h-131-202與DOMlh-131-206在7 天後在I集體形成方面均不展示任何顯著增加，而 DOMlh-131-511單體濃度存在約2%之減小。 前導dAb之噴霧器傳遞： 為進行早期毒理學及臨床研究，將dAb調配為液體形式 且經由噴霧裝置傳遞。視裝置（例如，超音波、噴射或振 網）而定，dAb當其經噴霧以形成規定粒度之氣霧劑時將經 歷一定程度之剪切應力及熱應力。因為與D〇Mlh-13ldll 相比，DOMlh-131-202 與 DOMlh-131-206 具有較高^ 且展 示大大改良之熱應力穩定性，所以所有dAb均在兩種嘴霧 器裝置中測試以瞭解其如何回應喷霧期間所誘發之剪切應 力/熱應力。隨後由SEC分析來自噴霧氣霧劑之蛋白質與裝 置中（亦即，杯中）之殘留dAb以確定該過程期間產生聚集 之量。 在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中在最穩定pH值下測試所有分 子。在E-fl〇w Rapid(振網）與Pari LC+(喷射噴霧器）中測試 dAb，其中操作時間為3 5分鐘，蛋白質濃度為5 且 粒度分布使用Malvern Spraytek確定。結果展示於圖3〇 中。為良好傳遞且分布於深肺中，理想粒度為<5 μιη。所 有dAb在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中產生小於5 μηι之可比粒度 級在喷霧之刖及之後’由Am量測法測定襄置杯中之 dAb之濃度（資料未圖示）。已發現，蛋白質濃度並未顯著 131458.doc • 173- 200911832 改變，從而指示蛋白質與媒劑在傳遞期間均不會優先霧 化。 在SEC上運行在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中霧化之dAb之樣 品以確定傳遞期間蛋白質是否經受任何物理變化。圖31展 示由SEC所測定之杯或氣霧劑中之相對百分率變化。可 見，在單體濃度方面，DOMlh-131-202 與 DOMlh-131-206 相對於DOMlh-131-511經受相對較小之變化。此證明具有 改良T„之DOMlh-13 1-202與DOMlh-131-206在喷霧期間具 有較小的聚集傾向。 圖32展示於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之D〇Mlh-131_206 及DOMlh-131-511在喷霧後之實際SEC迹線且顯示單體之 相對損失（圖3 1)係歸因於二聚體形成。此再次提供由 DOMlh-131-202及DOMlh-13 1-206所展示之較高熱穩定性 即使在未優化調配物緩衝液中亦可阻止顯著聚集之理論的 其他證據。 關於毒理學及安全評估研究，有必要傳遞比給予患者之 治療劑量顯著高之含量的dAb至動物中。此僅可藉由使用 顯著較高之蛋白質濃度及/或經長時間傳遞dAb來達成。因 為已展示DOM1 h-1；31-511在經3.5分鐘在5 mg/ml下噴霧時 形成聚集體，所以DOMlh-131-206係在PBS中在40 mg/ml 下測試且使用Pari LC+喷霧至多1小時。整個運行期間在 各時點採集杯及氣霧劑之樣品以瞭解延長喷霧是否會導致 dAb歸因於剪切應力或熱應力（由SEC測定）及蛋白質濃度 (A280 nm量測法）而聚集。表21展示由A280確定之杯與氣 131458.doc •174- 200911832 霧劑中之dAb的蛋白質濃度。 表21 .在使用Pari LC +在約4〇 mg/ml下喷霧dAb期間， 杯與氣霧劑之由A280吸光度讀數確定之〇〇1^1}1_131_2〇6的 經量測蛋白質濃度 小時噴霧dAb後，才! 。考慮到稀釋誤差及儀器誤差，在經（ 6品濃度並未改變。 wt ί 曰j ^iviin) 1 孙像品〇ng/ml) /11 Ο 氣霧劑樣品（mg/ml) 29 II 件 3.0 44 S 43.4 59 ________*t*t. j - 44.6 43.5 44.1 由表可見蛋白質濃度在運行期間並未顯著改變，顯示 不存在顯著的歸因於聚集之蛋白質損失。圖”展示如由 SEC所測定’、時之喷霧時間，D〇Mih_i3i领並未形 成任何較高有序性之聚集體，諸如二聚體。此明顯顯示如 由騰蛋白酶選擇向分子中引人之改良生物物理性質顯著辦 加dAb抗剪切應力及熱應力性，且此可與改良之儲存㈣ 期及噴霧蛋白質以致不形成較高有序性聚集體之能力直接 相關8 前導dAb之溶解狀態： U為所有二種前導dAb之主要降解途徑似乎為最初導致 二聚合接著進-步聚集且最終沈殿之自締合，所以由分析 超速離心（Analytieal UUra_Centrifugati〇n，Αυ〇研究該二 種前導分子以確定自締合之程度。由兩種方法，即沈：: 衡及沈降速度研究蛋白質。 關於沈降平衡方法，在〇. 5 種不同濃度下用離心效應使用 mg/ml至5 mg/ml範圍内之三 三個不同轉子速度運行三個 131458.doc -175- 200911832 樣品。由該方法，確定DOMlh_131_511為穩定二聚體 (26.1-34.4 kDa)，DOMlh-131-202 為單體 / 二聚體平衡 (22.7-27.8 kDa)，由Kd=i.3 μΜ量測在各濃度下具有相對穩 定之二聚物狀態，且DOMlh-131-206主要為單體性（154_ 17.9kDa)，單體締合為二聚體之1為36〇^^。 由沈降速度方法，所有樣品在稀釋後展示一定程度之解 離。由展示於圖34中之所獲得之結果，關於D〇Mlh_ui_ 511所觀察到之沈降係數指示較高有序性聚集體，且稀釋 後峰位移為該等聚集體解離之指示。蛋白質聚集及解離互 相抵消，可得出如由沈降平衡所觀察到之穩定二聚體之印 象。關於DOMlh-1 31-202所觀察到之沈降係數指示快速動 力平衡，且因此可將單體及二聚體峰彼此分開，從而得到 具有比適於樣品質量高之沈降係數之單峰。該結果與沈降 平衡方法所獲得之結果一致，且解離常數經量測為丨。 DOM 1 h-1 3 1 -206係經測定比其他兩個樣品更具單體性，與 其他兩個樣品之2.5 s相比，其具有1.9 s之沈降係數。該資 料與沈降平衡資料極一致。在量測濃度下，36〇 ^河之心以 下約10倍’樣品主要為單體性。 實例1 5 DOM15-26-593 dAb之效價增強：
圖40中展示VEGFR2受體結合檢定中d〇M 15-26-593 dAb 比DOM1 5-20親本之效價增加之實例。在該檢定中’在板 基檢定中量測潛在抑制劑阻止VEGF與VEGFR2結合之能 力。在該檢定中’將VEGFR2-FC後合體塗佈於96孔ELISA 131458.doc -176- 200911832 板上，且向其中添加預定量之已與測試dAb稀釋系列一起 預培養之VEGF。洗除未結合蛋白質後，用抗VEGF抗體偵 測與受體結合之VEGF之量，比色測定其含量。以隨測試 物質濃度變化之VEGF結合抑制百分率繪製劑量-反應效 應。因此有效抑制劑為顯示在低濃度下實質性阻斷配位體 結合之抑制劑。 FC融合物之效價及半衰期： VEGF阻斷在治療腫瘤中之治療潛能已實現超過30年。 癌症之慢性性質指示生物醫藥需要長的血清半衰期來介導 其效應，而此與游離dAb因腎濾過而自循環快速清除不相 符。為評估VEGF dAb作為治療癌症之抗血管生成劑之效 用，藉由使用FcRn介導抗體補救途徑經由雜交連接子使前 導區域抗體編排格式為與野生型人類IgGl Fc之融合物以 形成具有延長的血清半衰期之二價分子。 在該Fc融合物格式中，使用先前所述之檢定，可將前導 胰蛋白酶選擇dAb(DOM15-26-593)之效價與最初親本 dAb(DOMl 5-26)及胰蛋白酶不穩定 dAb(DOMl 5-26-501)作 比較。結果展示於下表22中： 表22:呈Fc融合物格式之DOM1 5-26前導分子之效價 (RBA)及半衰期特徵 dAb Fc 效價（nM) Tl/2b (hr) DOM15-26 hlgGl 0.506 ND D0M15-26-501 hlgGl 0.323 12.9 DOM15-26-593 hlgGl 0.033 84.6 由該等結果可見，在二聚體Fc融合格式中，親和力及效 131458.doc -177- 200911832 價歸因於親和性（avidity)效應相對於游離dAb增加。顯 然，由於胰蛋白酶選擇所獲得之DOM15-26-5 93之效價增 加得以維持且在該Fc格式中甚至更明顯。此外，熱及蛋白 酶穩定性之改良解釋為分子活體内藥物動力學特性之深度 改變。與DOM15-26-501相比，DOM15-26-593之排除半衰 期之改良（參見圖41)很可能為dAb穩定性增加之直接結 果，從而使其變得更抗核内體隔室（endosomal compartment) 所發生之降解過程。因此，亦預期具有增強蛋白酶穩定性 之dAb能夠在其中蛋白水解為涉及生物分子轉換（turnover) 之活性過程的其他生物隔室（諸如血清、黏膜表面及多種 組織隔室）中持續較長時間。 藥物動力學清除概況： 在向3隻大鼠靜脈内投與濃度為5 mg/kg之DOM15-26-593及 DOM15-26-501後，量測 DOM15-26-593及 DOM15-26-501之藥物動力學清除概況。隨後使用直接VEGF結合標準 ELISA檢定及抗人類Fc抗體量測DOM15-26-593及DOM 15-26-50 1在血清中之含量，因此僅偵測血清樣品中之完整藥 物。完整藥物動力學概況展示於下表23中： 表23 :大鼠中DOM15-26及DOM15-26-593 Fc融合物之 藥物動力學參數概述 dAb 半衰期 Cmax AUC (0-inf) (hr*pg/ml) 清除率 (ml/hr/kg) DOM 15-26-501 12.9 91.4 445.1 11.8 DOM15-26-593 84.6 101.8 3810 1.3 由該等結果可見DOM15-26-593具有顯著改良之藥物動 131458.doc -178- 200911832 力學概況，（例如）延長之半衰期及降低之清除率。 DOMl 5-26-593之顯著改良之效價及藥物動力學性質產 生對分析化合物之多種其他生物物理屬性的分析。 溶解狀態性質：由SEC-MALLs及AUC分析： 由尺寸排阻層析-多角雷射散射（SEC-MALLS)與分析超 速離心（AUC)評估DOM1 5-26-593之溶解著的狀態。在 Superdex 200 GF管柱（瓊脂糖基質）上在0.3 nU· min·1之流速 下在杜氏 PBS(Dulbecco’s PBS)(Sigma)中運行 SEC-MALLS，其中在Wyatt Optilab rEX上偵測折射率（RI)且在 Wyatt TREOS MALLS偵測器上偵測 MALLS。使用 ASTRA 軟體分析資料。分析兩批獨立的DOM15-26-593且兩批均 展示在至多2.5 mg/ml之濃度下表現為溶解狀態的單體，其 中計算分子質量為78-81 KDa，與約76 kDa之計算完整分 子質量一致。 對於AUC分析，將DOM15-26-593在PBS中稀釋至0.2、 0.5及1.0 mg/ml濃度，且在Beckman XL-A分析超速離心機 中在40000 rpm下進行沈降速度操作。在2〇°C之設定溫度 下以5分鐘為間隔獲得資科，使用SEDFIT軟體分析資料， 且使用c(S)或ls-g(s*)程式產生沈降係數分布。 該分析之結果展示D〇M15_26_593在至多2 5 mg/ml之濃 度下表現為溶解狀態之單體，其中計算分子質量為78-8 1 KDa，與約76 kDa之計算完整分子質量（圖42a及42b) — 致。 熱熔融性質：由DSC分析 131458.doc ' 179- 200911832 用D〇Ml5-26-593(及Fc融合物）如下進行實驗： 使用差示掃描量熱法分析dAb及Fc融合物之熱穩定性。 簡言之，將濃度為2 mg.mr1之蛋白質與緩衝液參比一起置 放於Microcal量熱計中。在適當緩衝液中將樣品以} 8〇。〇心-】 之速率自20T：加熱至l〇〇t，且使用"〇rigin”軟體使用適合 於所分析之蛋白質之性質的擬合模型分析熱變性資料。 胰蛋白酶選擇dAb(65°C，圖43之中間圖）之增加之熱穩 定性在Fc融合物（64.5°C，圖43之上圖）中得以維持。展示 i D〇Ml5-26-501 dAb(52°〇，圊 43 之下圖）iTm 曲線以便比 較。 冷床-解滚、溫度應力及血清組分之穩定性 用DOM15-26_593(及Fc融合物）如下進行實驗： DOM1 5-26-593 dAb之穩定性性質意謂可使其經受物理 及生物應力，而對其結合VEGF之能力產生最小影響（參見 圖44-47(a及b))。在所有狀況下，由ELISA測定VE(}F dAb_
Fc融合物與VEGF之結合。簡言之，使9^lelisa板塗佈 V 有250 m§/ml存於碳酸鹽緩衝液中之vegf〗65隔夜。隨後用 1%存於PBS中之BSA阻斷板，之後添加稀釋於相同緩衝液 中之測試物質。培養60分鐘後’洗除未結合物質，且用 HRP-接合抗人類lgG之1:10,000稀釋液，接著”SureBlue，，顯 色受質且用1 M HC1停止來偵測結合物質。 舉例而言，可使分子自液氮（·196〇〇至體溫（37°c)重複 冷凍解凍10次循環，而如由ELISA所測定不損失結合活性 (圖44)。如由習知尺寸排阻層析法所評估，該處理亦不對 13l458.doc -180- 200911832 分子聚集狀態產生明顯改變（圖45)。其他測試證明分子可 置放於-80°C至55 °C範圍之不同溫度下而僅在最高培養溫度 下168小時後，抗原結合活性稍微減小（圖46)。此外，如由 VEGF結合ELISA所測定，在37。。下與人類或獼猴血清一起 培養14天不導致抗原結合能力損失（圖47a及47b)。 VEGFR2受體結合檢定及HUVEC細胞檢定中之效價： 使用上述受體結合檢定評估DOM1 5-26-593 dAb-Fc融合 物之效價（圖48)。已發現，DOM15-26-593 dAb在該檢定中 具有增強之效價，此確立dAb阻斷VEGF與VEGFR2活體外 結合之能力。亦在量測VEGF拮抗劑阻斷HUVE細胞之 VEGF刺激增生之能力的HUVEC(人類臍靜脈内皮細胞）檢 定中證明DMS1529之效價。簡言之，將約4e3個HUVE細胞 分配於96孔板之孔中，向該等孔中添加VEGF與測試物質 之稀釋系列之混合物以致VEGF之最終濃度為5 ng/ml或如 由劑量-反應滴定所測定。將細胞在37°C下再培養4天，此 時藉由使用諸如"CellTiter”之細胞定量試劑測定細胞數 目。此使得可與標準物比較來比色測定經過4天實驗之細 胞增生。在與預定量之VEGF及不同量之測試物品一起培 養固定時期結束時，測定細胞數目。拮抗劑越有效，所觀 察到之細胞增生越低（圖49)。 【圖式簡單說明】 圖1說明用於製備噬菌體呈現譜系之pDOM13(亦稱為 pDOM33)之多個選殖位點。 圖2展示以來自在30°C與40 pg/ml胰蛋白酶一起培養之 131458.doc -181 - 200911832 dAb之不同時點的樣品運行之數個N〇vex 1 〇_2〇% Tricene凝 膠。在添加胰蛋白酶之前即刻及隨後在添加胰蛋白酶之後 1小時、3小時及24小時獲取樣品。用lx SureBlue染色蛋白 質。凝膠說明在與胰蛋白酶一起培養第一個3小時期間， DOM15-10 與 £)ΟΜ15·26_5〇1 顯著分解。d〇m15_26、 DOM4-130-54及DOMlh-131-511之分解僅在與胰蛋白酶一 起培養24小時後才變得明顯。 圖3說明OOMlh-1 31-511及24個所選擇之變異體之胺基 ί 酸序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸 (彼等一致胺基酸由點標記）。對應於Cdri、CDR2及CDR3 之環用框勾畫。 圖4說明DOM4-13 0-5 4及27個所選擇之變異體之胺基酸 序列。突出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼 等一致胺基酸由點標記）。對應於Cdri、CDR2及CDR3之 環用框勾畫。 圖5說明DOM15-26-5 55及21個所選擇之變異體之胺基酸 " 序列。犬出所選擇之純糸中不同於親本序列之胺基酸（彼 等一致胺基酸由點標記）。對應於Cdri、CDR2及CDR3之 環用框勾畫。 圖6說明DOM15-10及16個所選擇之變異體之胺基酸序 列。突出所選擇之純系_不同於親本序列之胺基酸（彼等 一致胺基酸由點標記）。對應於CDRi、CDR2及CDR3之環 用框勾晝。 圖7A-7D為展示在37°C下與不同濃度之胰蛋白酶（在〇至 131458.doc •182· 200911832 100 pg/ml範圍内）一起培養隔夜後，親本dAb DOMlh-131-511(圖 7A)及三個變異體 dAb DOMlh-131-203(圖 7B)、 DOMlh-131-204(圖 7C)及 DOMlh-13 1-206(圖 7D)與固定 TNFR1之結合的BIAcore迹線。結果展示在高濃度胰蛋白 酶（100 pg/ml)下，所有三個變異體比親本對蛋白水解更具 抗性。 圖8 A-8C為展示在與彈性蛋白酶及白血球酶一起培養隔 夜後 dAb DOMlh-131-511(圖 8A)、DOMlh-131-202(圖 8B) 及〇(^111_131-206(圖8(：)與固定丁爾111之結合的81入(：(^迹 線。與親本相比’ dAb對彈性蛋白酶與白血球酶之蛋白水 解展示增加之抗性。 圖 9 展示以 dAb DOMlh-131-511、DOMlh-131-203、 DOMlh-13 1-204 ' DOM 1 h-1 3 1-206 ' DOMlh-131-54 > DOM lh-1 3 1-201及DOM lh-13 1-202之與胰蛋白酶一起培養 之月il的樣品及以100 pg/ml騰蛋白酶一起培養1小時、3小時 及24小時後的樣品運行的兩個4-12% Novex Bis-Tris凝 膠。 圖10A-10C為展示在37°C下與不同濃度胰蛋白酶（在〇至 100 gg/ml範圍内）一起培養隔夜後，DOM4-130-54(圖 10A)、DOM4-130-201(圖 10B)及 DOM4-130-202(圖 10C)與 固定IL- 1R1融合蛋白之結合的BIAcore迹線。結果展示在 高濃度騰蛋白酶（100 pg/ml)下，兩個變異體比其親本對蛋 白水解更具抗性。 圖11A-11C為展示與彈性蛋白酶及白血球酶一起培養隔 131458.doc -183· 200911832 夜後 ’ DOM4-130-54(圖 llA)、DOM4-130-201(圖 11B)及 DOM4-130-202(圖11C)與固定il-1R1融合蛋白之結合的 BIAcore迹線。與親本相比’ dAb對兩種所測試之蛋白酶之 蛋白水解展示增加之抗性。 圖12說明DOM1 5-26-555及6個變異體之胺基酸序列。突 出所選擇之純系中不同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺 基酸由點標記）。 圖13A及13B為展示親本dAb DOM15-26-555(圖13A)及最 具蛋白每抗性變異體Γ)ΟΜ15-26-593(圖13B)與固定VEGF 之結合的BIAcore迹線。與濃度為2〇〇 pg/ml之胰蛋白酶一 起培養後在100 nM之dAb濃度下就hVEGF結合以BIAcore方 式比較親本及變異體。在37。(：下進行反應3小時或24小 時。結果展示在胰蛋白酶處理24小時後，變異體比親本對 蛋白水解更具抗性。 圖14為展示騰蛋白酶處理對d〇M1 5-26-555變異體之 hVEGF結合之影響的圖表。結果顯然展示騰蛋白酶處理24 小時後’所有變異體比親本（DOM1 5-26-555)對蛋白水解更 具抗性。 圖1 5展示兩個加載1 5 pg經處理及未經處理之d〇m 1 5- 26-555 或 DOM15-26-593 樣品之 Novex 10-20% Tricine 凝 膠。在添加胰蛋白酶之前即刻及隨後在添加胰蛋白酶之後 1小時、3小時及24小時獲取樣品。用ix SureBlu^色蛋白 貝。凝勝說明DOM 1 5-26-593之騰蛋白酶抗性概況不同於 由BIAcore實驗展示之概況。 131458.doc • 184- 200911832 圖1 6說明DOMl 5-10及變異體D〇Ml 5-10-11之胺基酸序 列。突出變異體中不同於親本序列之胺基酸（彼等一致胺 基酸由點標記）。 圖17A及17B為展示親本D〇M15-1〇(圖17A)及變異體 D〇M15-10-11(圖17B)與固定VEGF之結合的BIAc〇re迹線。 與》辰度為200 pg/ml之騰蛋白酶一起培養後在nM之dAb 濃度下就hVEGF結合以BIAcore方式比較親本及變異體。 在37°C下進行反應1小時、3小時及24小時。結果展示在胰 蛋白酶處理24小時後，變異體比親本對蛋白水解更具抗 性。 圖18展示兩個加载15 gg DOM15-10及DOM15-10-11樣品 之Novex 10-20〇/〇 TriCene凝膠。在添加胰蛋白酶之前即刻 及隨後在添加胰蛋白酶之後1小時、3小時及24小時獲取樣 品。用SureBlue(lx)染色蛋白質。結果展示BIAcore研究中 可見之結合活性直接反映蛋白質之完整性。 圖1 9A-1 9L說明數個編碼為d〇Mlh-131-511或DOM4· 130-54之變異體之dAb的核酸的核苷酸序列。核苷酸序列 分別編碼圖3及圖4中所呈示之胺基酸序列。 圖20A-20E說明數個編碼為DOM15-26-555或DOM15-10 之變異體之dAb的核酸的核苷酸序列。核苷酸序列分別編 碼圖5及圖6中所呈示之胺基酸序列。 圖21展示pD〇M38之载體圖。 圖22展示不同時點在3(TC下以25:1 dAb :胰蛋白酶比率 用胰蛋白酶處理之DOM10-53-474及DOM15-26-593蛋白質 13I458.doc •185- 200911832 之在Labchip上運行的凝膠。箭頭展示全長蛋白質。 圖23為展示各樣品由MMC層析接著陰離子交換純化後 所獲得之高純度級的尺寸排阻層析迹線。在225 nm下監測 UV且用具有1〇%乙醇（v/v)之lxpBS走柱。藉由經基線校正 之峰面積積分計算單體百分率。 圖 24 展示 DOMlh-131_511、DOMlh-131-202 及 DOMlh- 13 1 -206之蛋白酶穩定性資料。 圖 25 為說明 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511在37°C及50°C下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中 之14天穩疋性資料的sec。所有dAb之蛋白質濃度為1 mg/ml。使用SEC確定熱應力期間蛋白質中是否會發生任 何變化及相對於時間=0(T0)樣品溶液中所遺留之單體之 量。 圖26Α至I展示SEC迹線，其展示DOMlh-131-511(A至 C)、DOMlh-131-202(D 至 F)及 DOMlh-131-206(G 至 I)之熱 應力（3 7 C及50 C )效應。亦展示給定時點下相對於τ=〇時溶 液中所遺留之單體百分率。 圖27展示熱應力24小時、48小時及7天及14天時DOMlh- 131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 之 IEF 分析。 樣品已在37°C或50°C下在伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中培養。 圖 28 為展示在 50°C 下將 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131-511 培養 14 天之效應的 TNFR-1 RBA。假 定蛋白質濃度為1 mg/ml。亦展示不結合抗原之陰性對照 dAb(VH模擬物）。 131458.doc -186· 200911832 圖29說明在+4°C下在約100 mg/ml下將A : DOMlh-13卜 202 ’ B : DOMlh-131-206及 C : DOMlh-131-511在伯瑞坦- 魯賓遜緩衝液中儲存7天之效應。在2 8 0 nm下監測UV。 圖 30 展示 Pari E-flow 及 LC+ 中之 DOMlh-131-202、 DOMlh-1 31-206及DOMlh-131-511之喷霧器測試的資料。 蛋白貝》辰度在任一伯瑞坦-魯賓避緩衝液中為5 mg/ml。 圖3 1說明在以5 mg/ml存於伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之 DOMlh-131-202、DOMlh-131-206 及 DOMlh-131_511 喷霧 期間，單體濃度之相對百分率之變化。 圖32展示伯瑞坦-魯賓遜缓衝液中之D〇Mlh-l 3 1-206及 DOMlh-131-511 自 Pari LC +噴霧後之 SEC迹線。 圖3 3展示經1小時噴霧過程期間以4〇1^/1111存於？則中之 DOMlh-13 1-206之SEC迹線。噴霧器杯與氣霧劑中之蛋白 質對噴霧期間dAb可能會經歷之剪切應力及熱應力效應具 有高抗性。 圖34展示三種主要蛋白質（D〇Mlh-13 1-206及DOMlh-131-511 及DOMlh-131-202)各自之沈降速度曲線 。所觀察 到之較低濃度樣品DOM lh-131-206之雙峰為在此情況下由 來自樣品池之樣品茂漏所致之偽跡。 圖35展示緩衝液及裝置對gsk 1995 056A(DOMlh-13 1- 5 11)之噴霧液滴尺寸之影響。 圖36為如由SEC所量測，在各裝置中噴霧後，由二聚體 形成 έ平估之 GSK1995 056 A(DOMlh-13 1-511)之穩定性。 圖 37 展示 Pari E-fl〇w& LC+ 中 GSK1922567A(202)、 131458.doc -187- 200911832 08〖199505 7八（206)及081<：1995 05 6八（511)之噴霧器測試。 A)伯瑞坦-魯賓遜緩衝液中之測試，B)PEG1000/蔗糖緩衝 液中之測試。 圖38描繪人類TNFR1受體結合檢定中之TNF-α劑量曲 線。以四個複本測試各樣品。 圖39展示人類TNFR1受體結合檢定中 GSK1922567A(DOMlh-131-202)、GSK1995057A(DOMlh-131-206)及 GSK1995056A(DOMlh-131_511)之抑制。以四 f 個複本測試各樣品。 圖 40說明 DOM15-26及 DOM15-26-593 dAb在 VEGF RBA 中之效價。 圖41展示〇]^81529(0€^15-26-593)及〇]^81545(0〇]^15-26-501)在以5 mg/mg單次快速靜脈内注射向大鼠投與後之 藥物動力學。 圖42a展示確認單體性質之DMS 1 529 Fc融合物（DOM 1 5-2-593 Fc融合物）之SEC-MALLs(尺寸排阻層析-多角雷射散 { 射）分析。展示在折射率（亦即’濃度；虛線）及光散射（實 線）方面顯示類似性質之兩個不同批次。用箭頭標記之線 表示分子質量計算值。 圖42b展示確認單體性質之DMS1529 Fc融合物（DOM15· 26-593 Fc融合物）之AUC(分析超速離心）分析。在三個不 同浪度’即約0.2、0 · 5及1.0 mg/ml下在PB S緩衝液中測試 一個批次之材料。沈降速率分析確認分子質量約80 kDa。 圖 43 展示 DMS1529(DOM 15-26-593)及 DOM15-26-501 之 131458.doc • 188 · 200911832 DSC迹線。 圖44為對兩個不同批次之材料進行10次冷凍-解凍循環 之前及之後，DMS1529(DOM15-26-593)之 VEGF 結合 ELISA。 圖45展示10次冷凍-解凍循環之前及之後，DOM15-26-5 93 SEC概況之一致性。 圖46說明DMS15 29融合物（DOM15-26-593 Fc融合物）之 加速穩定性研究的結果；結合ELISA在所示溫度下顯示培 養7天後之活性。 圖47A展示在37T：下培養14及15天後， DMS1529(DOMl 5-26-593)在人類獼猴中之穩定性。 圖47B展示在37°C下培養14及15天後， DMS15 29(DOMl 5-26-5 93)在人類血清中之穩定性。 圖48展示DOM15-26及DOM15-26-593 dAb作為Fc融合物 (相應DMS1564及 15 29)在VEGFRBA中之效價。 圖49說明DMS1529融合物（DOM15-26-593 FC融合物）對 HUVEC細胞增生之抑制。 圖50為pDom33載體圖。 圖5 1 a描繪結合血清白蛋白之dAb之胺基酸序列。 圖5 1 b描繪結合血清白蛋白之dAb之核酸序列。 圖52A描繪DOM15-26-593-FC融合物之胺基酸序列。 圖52B描繪抗體Fc之胺基酸序列。 圖52C描繪DOM15-26-593-FC融合物之核酸序列。 131458.doc -189- 200911832 序列表 <11〇>英商多曼提斯有限公司 <120>多肽、抗體可變區域及拮抗劑 <130> D0052 <140> TW097121295 <141> 2008-06-06 <150> US 60/933,632 <151> 2007-06-06 <150> GB 0724331.4 <151> 2007-12-13 <]60> 238 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 109 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223> pD0M13 <400> 1 taatgttatt taaatcatta tcaaaattag caaccgcagc agcatttttt gcaggcgtgg 60 caacagcgtc gacacactgc aggaggcggc cgcagaaact gttgaacgt 109 <210〉 2 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 2
Clu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys A]a Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His lie Pro Pro Val Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys 01y Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys S5 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400〉 3
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Tyr Leu Asn 20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45 131458-seq.doc 200911832
Asn Phe Gly Ser Glu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin Pro Ser Phe Tyr Phe Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> 】16 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 4
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 ]〇 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr 20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Glu Me Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <2】3>智人 <400> 5
Asp lie Gin Mel Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Gly Pro Glu 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr His Thr Ser He Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Met Phe Gin Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Arg Arg 100 105 <210> 6 <211> 358 <212> DNA <213>會人 <400> 6 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc atggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcclgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggi ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccitciac )80 gcagaciccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca aitccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtai attactgtgc gctgcttcct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 7 <211> 358 <212> DNA <2I3>智人 <400> 7 -2- 131458_seq.doc 200911832 gaggtgcagc tgitggagtc 丨gggggaggc itggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cgcclttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggci 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg tiggtcagga tcccttciac 180 gcagactccg tgaaggEccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgciatai 240 ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcci 300 aagagggggc citggmga ciaciggggt cagggaaccc tggicaccgi ctcgagcg 358 <210> 8 <21I> 358 <212> DNA <2)3>智人 <400> 8 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt caactttgcg ccagggaagg gtciagagtg ggtctcacat gcagactccg tgaagggccg gttcaccaic ctgcaaatga acagcctgcg igccgaggac aagagggggc cttggtttga ctactggggt ttggtacagc ctggggggtc ccigcgtctc 60 catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 attcccccgg nggtcagga 丨cccttciac 180 tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 acagcggtat attactgtgc gctgcticct 300 cagggaaccc tggtcaccgl ctcgagcg 358 <210> 9 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 9 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc Uggtacagc ctggggggtc ccigcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggi ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ttggtcagga tcccttciac i80 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgacg attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg igccgaggac acagcgglai aitactgigc gctgcticct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggicaccgt ctcgagcg 358 <210> 10 <211> 358 <212> DNA <213>智人 ctggggggtc ccigcgtclc 60 tggtfiigggi ccgccaggct 】20 ttggtcagga tcccttctai 180 attccaagaa cacgctatat 240 attactgigc gctgcticct 300 tggtcaccgt ctcgagcg 358 <400> 10 gaggtgcagc tgttggagtc tcctgtgcag cctccggatt ccagggaagg gtctagagtg gcagactccg tgaagggccg ctgcaaatga acaacctgcg aagagggggc cttggtttga tgggggaggc ttggtacagc cacctttgcg catgagacga ggtctcacat aitcccccgg gttcaccatc tcccgcgaca cgccgaggac acagcggtat ctactggggt cagggaaccc <210> 11 <21!> 358 <212> DNA <213>智人 <400> Π gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc uggtacagc ciggggggic cctgcgictc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacciitgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg gtciagagtg ggtctcacat attcccccgg ctggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc icccgcgaca attccaagag cacgctaiai 240 ctgcaaatga acggcctgcg igccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcticct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggicaccgt ctcgagcg 358 <210> 12 <2]]> 358 <212> DNA <2】3>智人 <400> 12 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc 【tggtaaagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct 120 cctgggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg ctggtcagga tcccttctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtal aitactgtgc gctgcticct 300 aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358
<210> 13 <211> 358 <212> DNA 131458-seq.doc 200911832 <2】3>智人 <400> 13 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ciggggggtc cclgcgtctc tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtglgggt ccgccaggcc ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg acggtcaaga tcccttctac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca aliccaagaa cacgctaiai dgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat aitactgtgc gctgcttcct aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggicaccgt ctcgagcg <2I0> 14 <211> 358 <212> DNA <2]3>智人 <400> 14 gaggtgcagc tgtgggagtc tgggggaggc ttggtacagc ciggggggtc cclgcgtctc tcctgigcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtglgggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcitcct aagagggggc cttggattga ctactggggt cagggaaccc tggicaccgt ctcgagcg <210> 15 <21]> 358 <212> DNA <213〉智人 <400> 15 gaggtgcagc tgtcggagtc tgggggaggc nggtacagc ciggggggtc cctgcgtctc tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtglgggt ccgccaggci ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat aitcccccag aiggicagga tcccttctac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca altccaagaa cacgctatat ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtat attactgtgc gctgcttcct aatagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggicaccgt ctcgagcg <210〉 16 <211> 358 <212> DNA <213>智人 <400> 16 gaggtgcagc tgtlggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggic cctgcgtctc tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtgtgggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat attcccccgg atggtcagga tcccttctac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctatat ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acagcggtal attactgtgc gctgcttcct aagagggggc cttggtttga ctactggggt cagggaaccc aggtcaccgt ctcgagcg <210> 17 <211〉 358 <212> DNA <213>智人 <400> 17 gaggtgcggc tguggagic tgggggaggc ttggtacagc ctggggggic ccigcgtcic tcctgtacag cctccggatt cacctttgcg catgagacga tggtglgggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacat 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acagcctgcg actactgggg tgggggaggc cacctttaag ggtctcagag gitcaccaic tgccgaggac tcagggaacc ttggtacagc gcttatccga ai t tcgcct t tcccgcgaca accgcggtat ctggicaccg ctggggggtc tgatgtgggt cgggttctta attccaagaa attacigtgc tctcgagc cctgcgtctc 60 ccgccaggci 120 lacatactac 180 cacgcigtai 240 gaatgatcci 300 348 κ. <210> 63 <211> 348 <212> DNA <213> %人 <400> 63 gaggtgcagc tguggagu' tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcglclc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacatttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cggguctta tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gitcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acggcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaacgatcct 300 cggaagattg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 64 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <40〇> 64 gaggtgcagc tgttggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgaigtgggt ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttcgcctt cgggttelta gcatactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa ctgcaaatga acagcctgca tgccgaggac accgcggtat attactgtgc cggaagttag actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc cctgcgictc 60 ccgccaggct 120 tacatactac 180 cacgcigtai 240 gaaagatcci 300 348 <210> 65 <21l> 348 131458-seq.doc 12- 200911832 <212> DNA <213>智人 <400> 65 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc caggg£ggtc ccigcgtctc 60 tcctgtgctg cctccggatt cacctttaag gcttaiccga tgatgigggt ccgccaggct 120 ccagggaaga gtctagagtg ggtctcagag aittcgcctt cgggttctta tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggiat attactgtgc gaaagatcct 300 cggaagattg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 66 <2U> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 66 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tccigtgcag cctccggat t cacctttaag get iatccga tgaigtgggi ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttegeett cgggttctta tacatactac 180 gcagagiccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtac gaaagaicct 300 eggaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 67 <211> 348 <212> DNA <2】3>智人 <4Q0> 67 gaggigeagt tgttggtgtc tgggggaggc uggtacagc ctggggggtc ccigcgtcic 60 tcctgtgcag cclccggatt caccutaag gctiatccga tgaigigggt ccgccaggc丨 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atttegeett cgggttctta tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatt tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 cigcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagaicct 300 eggaagmg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 68 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 68 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc uggtacagc ciggggggic cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggait cacctttaag gctutccga tgatgtgggi ccgccaggct 】20 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag at t tcgcct t egggilet ta lacataciac ]80 gcaaactccg tgaagggtcg gttcaccatc icccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat atiacigtgc gaaagaicct 300 cggaagattg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 69 <2Π> 348 <212> DNA <213>智人 cctgcgtctc 60 ccgccaggct 120 tacatactac 180 cacgctgtat 240 gaaagaicct 300 348 <400> 69 gaggtgcagc tccigtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga eggaagtetg tgttggagtc cctccggat ΐ gtctagagtg tgaagggccg acagcctgcg actactgggg tgggggaggc cacctttaag ggtctcagag gttcaccatc tgccgaggac tcagggaacc uggtacagc getlaiccga aittcgcctt tcccgcgaca accgcggtat ciggtcaccg ctggggggtc igatgtgggt cgggttctta attccaagaa attactgtgc tctcgagc <210> 70 <211> 348 <2)2> DNA <213>智人 <400> 70 gaggtgcagc tgitggagtc tgggggaggc uggtacagc ctggggggtc ccigcgtcic 60 tccigtgcag cctccggatt cacctttaag gcttaiccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag atctcgcctt cgggttctta tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtai 240 ctgcaaaiga acagcctgcg tgccgaggac accgcggiat attactgtgc gaaagaicct 300 cggaagattg actactgggg tcagggaacc ciggtcaccg tctcgagc 348 -13- 131458-seq.doc 200911832 <210> 71 <211> 348 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tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtcicagag amcgccit cggguctta tacaiacuc 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 cigcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtac gaaagatcct 300 cggaagtttg actactgggg tcagggaacc ciggtcaccg ictcgagc 348 <2】0> 74 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 74 gaggtgcagc tgttggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 icctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtttcagag atttcgcctt cggguctta lacaiaciac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatcct 300 cggaagttag actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 / <210> 75 <21]> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 75 gacatccaga tgacccagic tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc claagctcct gatctatcat cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattug ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag acgg <210〉 76 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 76 gacaiccaga igacccaglc tccatcctcc cigictgca丨 cigtaggaga LXgigtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca giggattggt ccggagnaa gitggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatcat tcgtccattt tgcaaagtgg ggtcccaica ]80 ctgtctgcai ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gtiggtacca gcagaaacca 120 acgtccatit tgcaaagtgg ggtcccaica 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tatatgtttc agcctaggac gttcggccaa 300 324 131458-seq.doc -14- 200911832 / cgtttcagtg gcagtggatc gaagat i t tg ctacgtacta gggaccaagg tggaaatcag <210> 77 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 77 gacatccaga tgacccagtc atcacttgtc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcci cgtticagig gcagtggatc gaagattttg ctacgtacta gggaccaagg tggaaatcag <210> 78 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400〉 78 gacatccaga tgacccagtc aicactigcc gggcaagica gggaaagccc ctaagcacct cgtttcagtg gcagtagatc gaagattitg ctacgtacta gggaccaagg tggaaatcag <210> 79 <21]> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 79 gacatccaga tgacccagtc aicactigcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcci cgtltcagtg gcagtggata gaagamtg ctacgtacta gggaccaagg tggaaaitag <210〉 80 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 80 gacatccaga tgacccagtc atcacttgcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcci cgtttcagtg gcagtggatc gaagattttg ctacgtacta gggaccaagg tggaaatcag tgggacagat ttcactctca ctgtcaacag latatgtug acag tccatcctcc ctgtctgcat gtggattggt ccggagttaa gatctatcat acgtccattt tgggacagat ttcadctca ctgtcaacag tatatgtttc acgg tccatcctcc ctgtctgcat giggattggt ccggagttaa gatctatcat acgtccattt tgggacagat ttcadctca ctgtcaacag tatatgtttc atgg tccatcctcc ctgtctgcat gtggattggi ccigagttaa gatctatcat acgtccatu tgggacagat ttcacit tea ctgtcaacag tatatglttc acgg tccatcctcc ctgtctgcat gtggattggt ccggagtiaa gatctatcat acgtccattt tgggacagat ttcactctca ctgtcaacag tataigtttc atgg ccatcagcag Ectgcaacct 240 agcctaggac gttcggccaa 300 324 ctgiaggaga ccgtgtcacc 60 gatggtacca gaagaaacca 120 igcaaagigg ggtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 agcctaggac gttcggccaa 300 324 cigtaggaga ccgtgtcacc 60 griggtacca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 agcciaagac gttcggccaa 300 324 cigtaggaga ccgtgtcacc 60 gatggtacca gaagaaacca 120 tgcaaagtgg ggicccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 agcctaggac gttcggccca 300 324 ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 gtlggtacca gcagaaacca 120 tgcgaa^tgg ggtcccaic丨 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 agcctaggac gttcggccaa 300 324 <210> 81 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400〉 81 gacatccaga 丨gacccagic iccaiccicc cigicigcat ctgiaggaga ccgigicacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggatiggt ccggagtiaa gitggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatcat acgtccam tacagagtgg ggicccatca 180 cgtttcagtg gcagtggaia tgggacagat ttcactctca ccaicagcag tctgcaacct 240 gcagattttg caacgtacta ctgtcaacag tataigtttc agcctaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcag acag 324 <210> 82 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 82 131458-seq.doc -15- 200911832
gacatccaga tgacccagtc cccaicctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cgittcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag acaa <210> 83 <211> 324 <212> DNA <2]3>智人 <400> 83 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagica gtggattggt gggaaagctc ctaagctcct gatctatcal cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat gaagatttig ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag aggg <210> 84 <21]> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 84 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc 〆 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagttcct gatctatcat cgtttcagtg gcagtggata tgggacagat ggagattitg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag acgg <210> 85 <211> 324 <212〉 DNA <213>智人 <40〇> 85 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cgtitcagig gcagtggata tgggacagat gaagaitttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag acag <210> 86 <211> 324 <212> DNA <213> |人 <400> 86 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ^ atcacttgcc gggcaagtca gtggaitggt 、 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag aggg <210> 87 <211> 324 <212> DNA <2】3>智人 <400> 87 gacatccaga tgacccagtc iccatccicc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cgtucagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattctg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaaccag acgg <210> 88 <211> 324 <212> DNA ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tatatgutt ggcctaggac gttcggccaa 300 324 ctgtccgcat ctgiaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaactt 240 tatatgtttc tgcctaggac gttcggccaa 300 324 cigtctgcai ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gttggtacca gcagaaacca 120 acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 1δ0 ttcactctca ccatcaacag tctgcaacct 240 tatatgtttc agcctaggac gttcggccaa 300 324 ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggaguaa gttggtacca gcagaaacca 120 acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacci 240 tatatgtaic agcctaggac gttcggccaa 300 324 ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gatggtacca gcagaaacca 120 acgtccatt! tgcaaagtgg ggtcccaica 180 ttcactctca ccatcagcag 丨cigcaaeci 240 latatgtttc agcctaigac gitcggccaa 300 324 ctgictgcal ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gatggtacca gaagaaacca 120 acgtccaltt tgcaaagtgg ggtcccaica 180 ttcacicica ccatcagcag tclgcaagct 240 tatatgitic agcctaggac gucggccaa 300 324 131458-seq.doc 16- 200911832 <213>智人 <400> 88 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt cggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cgtttcactg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag acgg <210> 89 <2】1> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 89 gacatcctga tgacccagtc tccatcctcc atcacugcc gggcaagtca gtggattggi gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cgtitcagtg gcagtggata tgggacagat gaagatttcg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag atgg <210> 90 <211> 324 <212> DNA <213>智人 <400> 90 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc caaagctcct gatctatcat cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaggattttg ctacgtacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcag acag <210> 91 <211> 300 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 9] gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacugcc gggcaagtca gtggattggt gggaaagccc ctaagcicci gatctatcat cgtttcagtg gcagtggaic tgggacagat gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cigtctgcat ctgaaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagt taa gt tggtacca gcagaaacca 120 acgtccatti tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ticactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tatatgtttc agcctatgac gttcggccaa 300 324 cigtctgcat ctgiaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttac gttggtacca gcataaacca 120 acgtccatti igcaaagtgg ggicccatca 180 ncacictct ccatcagcag icigcaacci 240 tatatgtttc agcctaggac gttcggccaa 300 324 ctgtctgcai clgtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggagttaa gt tggtacca gcagaaacca 120 acgtccattt tgcaaggtgg ggtcccatca 180 Itcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 utatgtttt ggcctaggac gttcggccaa 300 324 ctgtctgcat cigtaggaga ccgtgtcacc 60 ccggaguac gttgglacca gcagaaacca 120 acgtccai i 1 tgcaaagigg ggtcccatca 180 ticactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 tatatgittc agcctatgac gttcggccaa 300 <2I0> 92 <211> 22 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Gas前導序列 <400> 92 Met Leu Phe 1 Ala Gly Val
Lys Ser Leu Scr Lys Leu Ala Thr Ala Ala Ala Phe Phe 5 10 15 Ala Thr Ala 20 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>基因UI序列 <400> 93 Ala Ala Ala Glu Thr Val Glu Ser 131458-seq.doc 17- 200911832 <210> 94 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 94
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie 丁hr Cys Arg Ala Ser G】n Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu l]e 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Phe Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Thr Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Gin 100 105 <210> 95 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 # <400> 95 、 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
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Leu Asn 丁rp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Ser He Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 96 <211> 108 <232> PRT <2丨3>智人 <400> 96
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Arg Pro lie Gly Thr Thr 20 25 30
Leu Ser Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Trp Phe Gly Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Scr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 όΐιι Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin Ala Gly Thr His Pro 丁hr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 97 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 97
Asp Me Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly -18 - 131458-seq.doc 200911832 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Lys Tyr Me Gly Ser Gin 20 25 30
Leu Asn Trp 丁yr G】n Gin Lys Pro G】y Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 4〇 45
Ala Trp Ala Ser Val Leu Gin Ser Gly Va) Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Scr Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ar^ Gin Gly Ala Ala Ser Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 98 <2J]> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 98
Asp Me Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gty 1 5 !0 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Phe He Tyr Arg Tyr 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser 丁yr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly ITir Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Ala His Leu Pro Arg 85 90 95
Tlir Phe Gly Gin Gly Thr Lys VaJ Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 99 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 99
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg AU Ser Gin Trp lie Gly Ser Gin 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Met 丁rp Arg Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe A!a Thr Tyr Tyr Cys Ala Gin Gly Ala Ala Leu Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Va! Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 100 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 100
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Va! Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Lys Me A【a Thr 丁yr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Arg Ser Ser Ser Leu Gin Ser Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 19- 131458-seq.doc 200911832
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Ala Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 101 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 101
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin 丁rp lie Asp Thr Gly 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asn Val Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Trp Gly Ser Pro Thr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 f ' <230> 102 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 102
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Glu lie Tyr Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser His Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ήίγ Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val lie Gly Asp Pro Val 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <2)0> 103 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 103
Asp Me Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Leu Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser G]y Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 01u Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Asn Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly 丁hr Lys Val Glu Ik Lys Arg 100 105
<210> 104 <211> 108 <212> PRT 20- 131458-seq.doc 200911832 <213〉智人 <400> 104
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 】5
Asp Arg Va! 丁hr ne Thr Cys Arg Ah Ser Gin Ser lie Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Gin Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Phe Ala Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <2)0> 105 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 105
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser l>cu Ser Ala Scr Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Me Ser Ser Tyr # 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Arg Asn Ser Pro Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Arg Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 106 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 106
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin His lie Gly Leu Trp 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ser Ser Leu Leu G)n Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser G!y Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Lys Tyr Asn Leu Pro Tyr 85 90 95
Thr Ser Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 107 <211> )08 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 107
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Arg His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 -21 - 131458-seq.doc 200911832
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Ala Leu Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 108 <2]1> ]08 <212> PRT <213>智人 <400> 108
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He lie Lys His 20 25 30
Leu Lys Trp 了yr Gin G]n Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gjy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 丨 le Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Ala Arg Trp Pro Gin 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg ]〇0 105 <210〉 109 <211> 108 <212> PR丁 <213>智人 <400> 109
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ] 5 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Scr He Tyr Tyr His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 όίιι Asp Phe Ala Thr Tyr 丁yr Cys Gin Gin Val Arg Lys Val Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 # <210> Π0 <211> 108 <2]2> PR丁 <2]3>智人 <400> 110
Asp lie Gin Thr Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ] 5 10 15
Asp Arg Va) Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr Me Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Va! Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Arg Met Pro 丁yr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Val Glu lie Lys Arg 100 105 •11· 131458-seq.doc 200911832 <2io> m <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 111
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly ] 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin His lie His Arg Glu 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glv Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Gin Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GJy 50 55 60
Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Lys Tyr Leu Pro Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 112 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 112
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser G)n His lie His Arg Glu 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gin Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Arg Val Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 113 <2Π> 108 <212> PRT <213〉智人 <400> 113
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Gly Arg Arg 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ala Ala Pro Arg Leu Leu Me 35 40 45 丁yr Arg Thr Ser Trp Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 丁hr Ser Gin Trp Pro His 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 H)5 <210> 114 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 114
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 •23- 131458-seq.doc 200911832
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Lys Me Tyr Lys Asn 20 25 30
Leu Arg 丁rp Tyr G)n Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ser Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 G)u Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin Gin Arg 丁yr Leu Ser Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 115 <21!> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 115
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Lys He Tyr Asn Asn 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Thr Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu G)n Pro 65 70 75 80 άΐιι Asp Phe A】a Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg 丁卬 Arg Ala Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 116 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 116
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Tyr Lys Ser 20 25 30
Leu Gly Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gin Ser Ser Leu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 0!u Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys G’ln G!n Tyr His Gin Met Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Jle Lys Arg 100 105 <210> 117 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 117
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp Me Tyr Arg His 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp A)a Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe llir Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr His Asn Pro Pro Lys 24- 131458-seq.doc 200911832 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 118 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 118
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gin Ser Gly Va) Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr Met Gin Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 119 <211> 108 <212> PR丁 <213>智人 <400> 119
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va! Gly 1 5 10 15
Asp Arg Va) Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Gly Ser Gin Leu Gin Ser Gly Va] Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg 丁yr Leu Gin Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> )20 <211> 108 <212〉 PRT <2]3>智人 i <400> 120
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr lie Gly Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr 丁yr Cys Gin Gin Arg Tyr Ser Ser Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 12】 <211> 108 <212> PRT <213>智人 25- 131458-seq.doc 200911832 <400> 121
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Giy 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Tyr lie Ser Arg Gin 20 25 30
Leu Arg Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Val Leu Gin Ser Gly Me Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr 丁yr Tyr Cys Gin Gin Arg Tyr !le Thr Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg 100 ]〇5 <210> 122 <211> 108 <2i2> PR丁 <213>^人 <400> 122
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Trp He His Arg Gin 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 11e 35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser lie Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Phe Ser Lys Pro Ser 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Giy Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 )05 <210> 123 <211> 118 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 123
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie 丁hr His Thr Gly Giy Val Thr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 K Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala G】u Asp Thr Ala Val Tyr 丁yr Cys 85 90 95
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Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 124 <211> 120 <212> PRT <213>智人 <400> 124
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 26· 131458-seq.doc 200911832 35 40 45
Ser Ser Me Val Asn Ser Gly Val Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Va) 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Leu Asn Gin Ser Tyr His Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 125 <211> 123 <2]2> PR丁 <213>智人 <400> 125
Glu Va! G3n Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 ]0 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 丁rp Val 35 40 45
Ser Ser lie Asp Phe Met Gly Pro His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Arg Thr Ser Met Leu Pro Met Lys Gly Lys Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 126 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 126
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Va! Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Arg Tyr 20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Leu Pro Gly Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Giy Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Thr Pro Asp Tyr Met Phe Asp 丁yr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 127 <211> 117 <212> PRT <213>智人 <400> 127
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 】5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Lys Tyr 20 25 30
Asn Met Ala Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Leu Gly Glu G】y Asn Asn Thr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Va) 50 55 60 27- 131458-seq.doc 200911832
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 丁yr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Thr Met Asp Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115 <2)0> 128 <211> 118 <212> PRT <213〉智人 <400> 128
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Leu Pro His Gly Asp Arg Thr Tyi· 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Va) Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asp Pro Leu Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Giy Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Scr Ser 115 <210> 129 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 129
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly } 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Arg Met Ser Trp Va! Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 丁rp Val 35 40 45
Ser Thr lie lie Ser Asn G】y Lys Phe Thr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe 丁hr ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 丁hr Leu 丁yr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asp Trp Met Tyr Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 130 <211> 118 <212> PRT <213>智人 <400> 130
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Glv Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30
Thr Met Ala 丁rp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Thr Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr 丁yr A!a Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 28- 131458-seq.doc 200911832 85 90 95
Ala Lys Val Asn Ser Leu Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Cly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 131 <211> 119 <212> PRT <2】3>智人 <220> <221> VARIANT <222> 119 <223> Xaa =：任何胺基酸 <400> 131
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Va! Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Pro Thr 20 25 30
Asn Met Ser Trp Val Arg G]n A】a Pro Gly Lys Gly Leu Glu 丁rp Val 35 40 45
Ser Thr lie Thr Gly Thr Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Aia Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gin Asn Ser Arg Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 Π0
Leu Vai Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210〉 132 <211> 117 <212> PRT <213>智人 <220〉 <221> VARIANT <222> 117 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 132
Glu Val Gin Lea Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 丁rp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 、 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Gly Lys Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 133 <211> 123 <212> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 123 <223> Xaa =任何胺基酸 29- 131458-seq.doc 200911832 <400> 133
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gin Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Ser Asp Val Leu Lys 丁hr Gly Leu Asp Gly Phe Asp 丁yr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <210> 134 <211> 121 <212> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 121 f <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 134
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Ala Tyr 20 25 30
Gin Met Ala Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie His Gin Thr Gly Pfie Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu On Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Va) Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Arg Ser Met Arg Pro Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120 <210> 135 <211> 118 <212> PRT <2丨3>智人 ^ <220〉
V <221> VARIANT <222> 118 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 135
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly ] 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 丁yr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Asn Leu Glu Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 -30- 131458-seq.doc 200911832 <210> 136 <2Π> 119 <212> PRT <213〉智人 <220〉 <221> VARIANT <222> 119 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 136
Glu Val Gin Leu Leu G!u Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 丁rp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Va] 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Va] 丁yr Tyr tys 85 90 95
Ala Lys Lys Thr Gly Pro Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 137 <2]1> 1】8 <212> PRT <213>智人 <220〉
<221〉 VARIANT <222> MS <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 137
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ieu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 丁yr Cys 85 90 95
Ala Lys Lys Leu Ser Asn Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu / 100 105 110 \ Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 138 <21l> 119 <212> PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> Π9 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 138
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro 丁yr 20 25 30 -31 - 131458-seq.doc 200911832
Thr Met Ser 丁rp Val Arg G】n Ala Pro CJly Lys G’ly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn ITir Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Aia Lys Val Val Lys Asp Asn Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Va] Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 139 <211> 119 <212> PRT <2]3>智人 <220> <221> VARIANT <222> 119 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 139
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 3 5 10 】5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Aia Val Tyr Tyr Cys S5 90 95
Ala Lys Asn Thr Gly Gly Lys Gin Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 <210> 140 <211> 121 <212〉 PRT <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> 121 <223> Xaa =任何胺基酸 i <400> 140 、 Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 ]ϋ 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Pro Tyr 20 25 30
Thr Mel Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Thr lie Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 A]a Lys Arg Thr Glu Asn Arg Gly Vai Ser Phe Asp Tyr 丁卬 Cily Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Va] Thr Val Ser Ser Xaa 115 120
<2I0> 14J <211> 121 <212> PRT -32· 131458-seq.doc 200911832 <213>智人 <220> <221> VARIANT <222> ]21 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 141
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 】 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30
Asp Met Thr Trp Va! Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Met lie Ser Ser Ser Gly Leu Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 A】a Lys Gly Phe Arg Leu Phe Pro Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Xaa 115 120
<2】0> 142 <211〉 108 / <212> PRT <213>智人 <400> 142
Asp ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Scr Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Scr Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Pro Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Ser Val Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 143 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 143
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Ser 丁yr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Pro Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Arg lie Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 144 <2]1> 108 <212> PRT <213>智人 -33- 131458-seq.doc 200911832 <400> 144
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Lys Ser 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Tyr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 GIu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Val Tyr Trp Pro Val 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <2】0> 145 <21]> 107 <212> PRT <2]3>智人 <400> 145
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Me Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Tyr His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin G]n Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Lys Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Arg Lys Val Pro Arg Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 146 <21]> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 146
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Aia Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr I】e Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser 丨 le Arg Arg Tyr 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gin Ala Ser Val Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Ary Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro \ 65 70 75 80 dlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys G】n Gin Gly Leu Tyr Pro Pro He 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <2!0> 147 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 147
Asp 丨 le Gin Met 丁hr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Tyr Asn Trp 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Scr Gly 50 55 60 • 34· 131458-seq.doc 200911832
Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Val Val lie Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 148 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 148
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Leu 丁rp His 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Me 35 40 45
Tyr His Ala Ser Leu Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Ala Val Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 149 <211> 108 <212> PR丁 <213>智人 <400> 149
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Arg Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr His Ala Ser His Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Leu Leu Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉】50 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400〉】50
Asp Me Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Tyr His 20 25 30
Leu Ala Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Gly Lys A】a Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Pro Ala Ser Lys Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Me Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ala Arg Trp Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 15) •35· 131458-seq.doc 200911832 <211> 108 <212> PRT <213> 人 <400> 151
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Me He Trp His 20 25 30
Leu Asn 丁rp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Ala Arg Val Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 152 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 152 f Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Tyr Arg Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp 丁yr Gin Gin Lys Pro Giy Lys Ala Pro Lys Leu Leu ]le 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Giy 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Val Gly Tyr Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 )05 <210> 153 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 153
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Leu Lys Tyr 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro G]y Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser His Leu G)n Ser Gly Va) Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe 丁hr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Thr Tyr Tyr Pro lie 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 154 <211> 108 <212> PRT <2Π>智人 <400> 354
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va) Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Leu Arg Tyr 20 25 30 -36· 131458-seq.doc 200911832
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Trp Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin G】n Val Leu Tyr 丁yr Pro Gin 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 155 <21]> 108 <212> PRT <213〉士人 <400> 155
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va] Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Leu Arg Ser 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 丁yr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser CHy Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro i 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Val Tyr Trp Pro Ala 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 156 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 156
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Scr Va) Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Arg His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Me 35 40 45
Tyr Ala A!a Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe 丁hr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 01u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Ala Leu Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 157 <211> 108 <212> PRT <2]3>智人 <400> 157
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Arg Lys 丁yr 20 25 30
Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glv Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Leu Phe Trp Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 37- 131458-seq.doc 200911832 100 105 <210> 158 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 158
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Arg Arg Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp 亍yr Gin Gin Lys Pro Giy Lys Ala Pro Lys Leu Leu I丨e 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Μεΐ Leu Phe Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 159 <211> 108 <212> PR丁 ( <213>智人 \ <400> 159
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Scr Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie lie Lys His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 丁yr Gly Ah Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Ala Arg Trp Pro Gin 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 160 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 160
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Scr Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Aia Ser Gin Ser lie Tyr 丁yr His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 11e 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 161 <211> 108 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 161 -38 - 131458-seq.doc 200911832
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Va) Gly 15 ]〇 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Tyr Lys His 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Gly Arg Tyr Pro Lys 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 162 <211> 108 <212> PR丁 <213>智人 <400> 162
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Phe Lys Ser 20 25 30
Leu Lys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Ser Tyr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala 丁hr 丁yr 丁yr Cys G)n G]n Val Val 丁yr Trp Pro Va] 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 163 <211> 116 <212> PRT <2]3> ^人 <400> 163
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Val Tyr 20 25 30
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Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Glv Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly ! 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Ser Tyr 20 25 30
Gin Met Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser lie Ser Ser Phe Gly Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 39- 131458-seq.doc 200911832 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Gly Arg Asp His Asn Tyr Ser Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
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193 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gtggattcat gggaaagccc daagctcct gatctattat cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat gaagattttg ctacgiacta ctgtcaacag gggaccaagg tggaaatcaa acgg <210> 194 <211> 354 <2J2> DNA <213> ^人 <400> 194 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cciccggatt caccttitat ccagggaagg gtclagagtg ggtctcaaci gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc cigcaaatga acagcctgcg igccgaggat ccttcttatc agtttgacia ctggggtcag <210> 195 <211> 360 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 195 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac cagagttatc atigggattt tgaciactgg ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 aggcagltaa agtggtacca gcagaaacca 120 gcttccattt tgcaaagigg ggtcccatca 180 ucactctca ccatcagcag ictgcaacct 240 acgttttcta agccttctac gttcggccaa 300 324 tiggtacagc ciggggggic cctgcgtctc 60 gattataata tgtcttgggt ccgccaggct 120 aitacgcaia cgggiggggi lacataciac 180 tcccgcgaca 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gtctagagtg ggtctcaacg attttgcctg gtggtgatgt tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagacg 300 ccigattata tglltgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage 354 <210> 198 <211> 351 <212> DNA <213>智人 <400> 198 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc ccigcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctlttgg aagtataata tggcgtgggt ccgccaggci 120 45· 131458-seq.doc 200911832 ccagggaagg gtctagagtg ggtcicaact attcitggtg agggtaataa tacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca aticcaagaa cacgctgtai ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaacgatg gatiataagt ttgactactg gggtcaggga accciggtca ccgtctcgag c <210> 199 <211> 354 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 199 gaggtgcagc tgttggagtc igggggaggc tiggtacagc ctggggggic cctgcglcic tccigtacag cctccggatt cacctttgat gagtataata tgtctt^ggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attctgccgc aiggtgatcg gacatactac gcagactccg tgaagggccg gticaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgigc gaaacaggai cctttgtata ggtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage <210> 200 <211> 354 <212> DNA <213>智人 <400> 200 gaggtgcagc tgUggagtc igggggaggc Uggiacagc ciggggggic cctgcgtcic tccigtgcag cctccggatt caccttttcg gattategga igagttgggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg aitaittcga aigglaagtt lacatacMac ,.. gcagactccg tgaagggccg gticaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgiai ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggae accgcggtat attactgtgc gaaacaggai tggaigiaia iglltgacia ciggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage <2 Kb 201 <211> 354 <212> DNA <213>智人 <400> 201 gaggtgcagc igttggagtc tgggggaggc tiggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgg acgtatacta tggcttgggt ccgccaggcc ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attactagta gtggticttc tacaiaciac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagtgaat tctttgtata agttigacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gage <210> 202 <211> 355 <212> DNA <2丨3>智人 <400> 202 gaggtgcagc rgttggagtc tgggggaggc tiggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgg ccgactaata tglcgtgggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacl attactggta ctggtgctgc gacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat f ctgcaaatga acagcctgcg igccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagaat V— tctcgitata ggtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gageg <210> 203 <211> 349 <212> DNA <213>智人 <400> 203 gaggtgcagc igttggagtc tgggggaggc tiggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc tcctgtgcag cctccggatt oacctutgg ccgtatacga igagttgggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg aittcgccgt itggttcgac tacataciac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctglat ctgcaaatga acagcctgcg 〖geegaggae accgcggtat anaetgtgc gaaagggggg aaggattitg actactgggg tcagggaacc ciggicaccg tetegageg <210> 204 <211〉 367 <212> DNA <2]3>智人 46- 131458-seq.doc 200911832 <400> 204 gaggtgcagc tguggagtc 丨gggggaggc 丨tggtacagc ctggggggtc ctngcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgl ttggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctecg tgccgaggac accgcggiat attactgtgc gaaaagtgat 300 gttcttaaga cgggtctgga tggttttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgic 360 tcgagcg 367 <210> 205 <211> 361 <2]2> DNA <2]3>智人 <400> 205 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc Uggtacagc ctggggggtc cclgcgtnc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg gcgtatcaga tggcttgggi ccgccaggct 120 ccagggaagg gictagagtg ggtctcaaci attcatcaga cgggttiuc 〖acataciac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat aitacigtgc gaaagtgcgi 300 tctatgcgtc cttataagit tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtcicgagc 360 g 361 <210> 206 <211> 352 <212> DNA <2]3>智人 <400> 206 gaggigcagc igtiggagtc 丨gggggaggc itggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga tgagugggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt tiggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca aliccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggiai aiiactgtgc gaaaggtaat 300 cttgagccgt Ugactactg gggtcaggga aecctggtca ccgicicgag eg 352 <210> 207 <211〉 355 <212> DNA <213>智人 <400> 207 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggiacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga igagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atticgccgt ttggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactglgc gaaaaagacg 300 ggtccgtcgt cgtttgacta ctggggicag ggaaccctgg 〖caccgtclc gageg 355 <210> 208 <21)> 352 <212> DNA <213>+人 <400> 208 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggt uggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt ttggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaaagcit 300 agtaatggtt itgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag eg 352 <210> 209 <211> 355 <212> DNA <2〗3>智人 <400> 209 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttugg ccgtatacga tgagitgggi ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt ttggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaaiga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagtggtt 300 aaggataata cgtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccglctc gageg 355 47- 131458-seq.doc 200911832 <210> 210 <211> 355 <212> DNA <213>智人 <400> 210 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tiggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg ccgtatacga igagugggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg aiitcgccgi itggttcgac tacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatt tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtai ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat aitactgtgc gaaaaatact gggggtaagc agtttgacta ctggggicag ggaaccctgg icaccgicic gagcg <210> 211 <211> 361 <212> DNA <213>智人 <400> 2Π gaggigcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtcic tcctgtgcag cctccggatt cacctmgg ccgtatacga tgagttgggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccgt ttggucgac tacaiactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca aticcaagaa cacgctgtai ctgcaaaiga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attacigtgc gaaaaggact gagaataggg gggtttcttt igactactgg ggtcagggaa ccciggtcac cgictcgagc g <210> 212 <211> 361 <212> DNA <2]3> ^人 <400> 212 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cclgcgtctc tcctgtgcag cctccggati cacctttaag gattatgata tgacltgggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtcicaatg atttcttcgt cgggtctttg gacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaaiga acagcctgcg tgccgaggac accgcggiai attactgtgc gaaaggtttt aggctgtttc ctcggacttt tgactactgg ggicagggaa ccctggtcac cgtctcgagc g <2I0> 2]3 <211> 343 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 213
Glu Val Gin Leu Leu Val Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 丁hr Phe Lys Ala Tyr 20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Glu lie Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr 丁yr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lyy Asn Me Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Pro Arg Lys Leu Asp 丁yr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 130 135 140
Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Va] 145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 210 215 220 48- 131458-seq.doc 200911832
Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 225 230 235 240
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 245 250 255
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 260 265 270 lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 275 280 285
Thr lie Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 290 295 300
Lys Leu Thr Va! Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Giy Lys 340 <210〉 214 <211> 225 <212> PRT <213>智人 <400> 214
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 15 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Va] Va] Asp VaJ Ser His Glu Asp 35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 100 105 110
Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Asp G!u Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 130 135 140
Cys Leu Va】 Lys Gly Phe 丁yr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 145 150 155 160
Ser Asn Gly Gin Pro G]u Asn Asn Tyr Lys 丁hr Thr Pro Pro Val Leu 165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Va] Asp Lys 180 185 190
Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220
Lys <210> 215 <2M> 1029 <2I2> DNA <2丨3>智人 <400> 215 gaggigeage tgttggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgigggt ccgccaggct ccagggaagg gtctagagtg ggtttcagag atttegeett cgggitcita tacauclac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc icccgcgaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgcg tgeegaggae accgcggiat attactgtgc gaaagatcct eggaagttag actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tcicgagcgc tagcacccac acctgccccc cctgccctgc ccccgagctg ctgggcggac ctagcgtgtt cctgttcccc cccaagccta aggacaccct gatgatcagc aggacccccg aagtgacctg cgtggtggtg gatgtgagcc acgaggaccc tgaagtgaag ttcaactggt aegiggaegg cgtggaagtg cacaacgcca agaccaagcc cagagaggag cagtacaaca gcacctaccg cglggtgtct gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg aacggcaagg agtacaagtg caaagtgagc aacaaggccc tgcctgcccc tategagaaa accatcagca aggccaaggg ccagcctaga gagccccagg tctacaccct gcciccctcc agagatgage tgaccaagaa ccaggigtcc 49· 131458-seq.doc 200911832 ctgacctgtc tggtgaaggg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 840 ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccctglgc tggacagcga tggcagcttc 900 ttccigtact ccaagctgac cgtggacaag agcagatggc agcagggcaa cgtgttcagc 960 tgcagcgtga igcacgaggc cctgcacaat cactacaccc agaagagict gagcctgicc 1020 cctggcaag 1029 <210> 216 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 216 gaggttcaat tgttggaatc cggtggtgga ttggttcaac ciggtgguc tttgagattg 60 tcctgtgctg cttccggttt tactttcgct cacgagacta tggUtgggt tagacaggct 120 ccagglaaag gattggaatg ggtttcccac attccaccag atggtcaaga tccatictac 180 gcigactccg ttaagggaag attcactaic 丨ccagagaca actccaagaa cacmgtac 240 ttgcagatga actccitgag agctgaggat actgcigttt accactgtgc tttgUgcca 300 aagagaggac cttggtitga ttactgggga cagggaacii tggtiacigt ticttcc 357 <210> 217 <211> 119 <212> PRT <2]3>智人 <400> 217
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gty 15 10 15 / Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His lie Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Va! Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin G]y 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 】】5 <210> 21S <2]1> 357 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉一致序列 <220> <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n 或 g <220> <221> misc.feaiure <222> (9)...(9) <223> n = a 或 g <220> <221> misc.feature <222> (10)...(10) <223> n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> ¢18)...(18) <223> n = a 或 g <220> <221> misc.feature <222> (21)...(21) 50- 131458_seq.doc 200911832 <223〉 η = c 或 t <220> <221> misc feature <222〉（24)…（24) <223〉 η = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (27)...(27) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (30)...(30) <223〉 n = a 或 c <220> <22]> misc一feature <222> (36),..(36) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (39)...(39) <223> π = a 或 g <220〉 <221> misc_feature <222> (45)...(45) <223> n = t 或 g <220〉 <22]> misc一feature <222> (48)...(48) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (51)...(5]) <223> π = t 或 c <220> <221〉 misc一feature <222> (52)...(52) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feaiure <222> (55)...(55) <223> n = a 或 c <220> <221> misc.feature <222> (57),..(57) <223> n = a 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (58)...(58) <223> n = t 或 c -51 - 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc一feature <222> ¢60)...(60) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222〉 （69)…（69) <223> n = t 或 a <220> <221> misc一feature <222> (72)...(72) <223> n = t 或 c <220> <22\> misc_feature <222> ¢78)...(78) <223> n = t ^ a <220> <221> misc_feature <222> (81)...(81) <223> n = i ^ c / ^ <220> <221> misc一feature <222> (84)...(84) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (87)...(87) <223> n = c 或 t <22ϋ> <221> misc.feature <222> (90)...(90) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> ¢93)...(93) <223> n = c ^ t <220> <22l> misc.feature <222> (99)...(99) <223> n = t ^ g <220> <221> misc_feature <222> (105)...(105) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> ¢1111...(111) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222〉 （112了.(112) -52- 131458-seq.doc 200911832 <223〉η = a 或 c <220> <221> misc feature <222> (114T，..(114) <223> η = a 或 c <220> <221> misc一feature <222> (12〇T...(120) <223> η = t 或 a <220> <221> misc—feature <222> (1267...¢126) <223〉 η = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (129T...(129) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_ieature <222> (132T...(132) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (133T...(133) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (135T...(135) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (138T...(138) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (144)...(144) <223> n = t 或 c <220> <221> misc feature <222> (147)...(147) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (150)...(150) <223> n = c 或 i <220> <221> miiic_feature <222> ¢156)...(156) <223> n = a 或 c -53 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc_feature <222> (159)...(159) <223> n = a 或 g <220> <221> misc.feature <222> (168T...(168) <223> n = a 或 g <220> <221> misc-i’eature <222> (174T-·.(174) <223> n = a 或 c <220> <221> misc^feature <222>(183了..，（183) <223> n = t 或 a <220> <221> misc一feature <222> (192T...(192) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (198)...(198) <223〉 n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (199T，..(199) <223> n = a 或 c <220> <221> misc_feature <222> (201)...(201) <223〉 n = a 或 g <220> <22]> mi sc一feature <222> (207)...(207) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (214)...(214) <223> π = a 或 c <220> <221> mi sc一feature <222> (216)...(216) <223> n = a 或 c <220〉 <221> misc_feature <222> ¢222)...(222) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_fealure <222> ¢234)...(234) -54- 131458-seq.doc 200911832 <223> η = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (235T...(235) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (237T...(237) <223> n = g 或 a <220> <22]> misc一feature <222> (24〇y...(240) <223> n = c 或 l <220> <221> misc_feature <222> (240...(241) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (246)...(246) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (253T...(253) <223> n = t 或 a <220> <221> mi sc一feature <222> (254T...(254) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_reature <222> (256)...(256) <223> n = t 或 c <220> <221> mi sc一feature <222> (259T...(259) <223> n = a 或 c <220> <221> misc一feature <222> (261)...(261) <223> n = a 或 i <220> <221> misc一feature <222> (264T...(264) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (270j...(270) <223> n = t 或 c -55 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc_feature <222> (273T...(273) <223> η = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (276了...（276) <223> n = t 或 g <220> <221> misc.feature <222> (279j...(279) <223> π = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (282了…（282) <223> n = c 或 1 <220> <221> misc_feature <222> (290-..(291) <223〉n = t 或 g <220> <221> misc—feature <222> (292T.·.(292) <223> n = t 或 c <220〉 <221> misc^feature <222> (295)...(295) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (297)...(297) <223> η ：= g 或 t <220> <221> misc.feature <222> (30〇T...(300) <223〉 η = a 或 ί <221> misc.feature ' <222> (306Τ...C306) \ <223> η = a 或 g <220> <221> misc-feature <222> (309Τ...(309) <223> η = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (32lT...(321) <223> η = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (33〇Τ...(330) <223> η = a 或 t -56 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc_feature <222> (339)...(339) <223> η = t 或 c <220> <221> misc„feature <222> (34〇T-..(340) <223> η = l 或 c <220> <221> misc_feature <222> (345T...(345) <223> n = t 或 c <220> <22I> misc_feaiure <222> (348T...(348) <223> n = t 或 c <220> <22]> misc一feature <222> (35lj...(351) <223> n = l 或 c <220> <221> misc_feature <222> (354T...(354) <223〉 n = t 或 g <220> <221> misc一feature <222> (355T...(355) <223> n = t 或 a <220> <221> misc一feature <222> (356T...(356) <223> n = c 或 g nntgngnntn 60 nngneaggen 120 tccnttctac 180 cacnntntan 240 nntgntnccn 300 mennne 357 <400> 218 gaggtncann tcctgtgcng ccaggnaang gcngactccg ntgcanatga aagagnggnc tgttggantc cntccggnt t gnntngantg tnaagggnng acnncntgng citggtttga nggnggnggn nacnt tngcn ggtntcncan nt tcacnatc ngcngaggan ntactggggn ttggtncanc cangagacna at iccnccng tccngngaca acngcngtnt cagggaacnn ctggnggruc tggtntgggt atggtcanga antccaagaa ancactgigc iggtnacngt
<2I0> 219 <211> 366 <212> DNA <2】3>智人 <400> 219 gagaaaagag ct tcgactaa cgacaggcac ccat 11 tacg accitgiact ttactaccaa agt tct <210> 220 <2i]> 122 <212> PRT aggttcaatt gttgtgctgc ctggtaaagg ctgat tccgt tacaaaigaa aacgtggacc get tgaatet cagtgggttt tettgaatgg gaaaggcaga cicangaga ttggtttgat ggaggaggtt acgtttgctc gtttcacata 11 tacaat 11 getgaggaca tattggggcc tggtccagcc atgaaactat tccctccaga cacgagaiaa ctgcagt tia aaggtacgtt aggagggtcc 60 ggtatgggtc 120 cggtcaagac ]80 ttctaaaaac 240 tcactgcgct 300 agtgactgti 360 366 57- 131458-seq.doc 200911832 <2丨3>智人 <400> 220
Glu Lys Arg Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly G)y Leu Val Gin 15 10 15
Pro G!y Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30
Ala His Glu Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Giy Leu 35 40 45
Glu Trp Val Ser His lie Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala 50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75 80
Thr Leu Tyr Leu G)n Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95
Tyr His Cys Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro 丁rp Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 221 <211> 366 <212> DNA <213>馬斯德畢赤酵母 <400> 221 gagaaaagag aggttcaatt gcttgaatct ggaggaggtt tggtccagcc aggagggtcc 60 cttcgactaa gttgtgctgc cagtgggttt acgtttgctc atgaaactat ggtatgggtc 120 cgacaggcac ctggtaaagg tcttgaatgg gtticacata tccctccaga cggtcaagac 180 ccattttacg ctgattccgi gaaaggcaga titacaattt cacgagaiaa ttctaaaaac 240 accttgtact tacaaatgaa ctcattgaga gctgaggaca ctgcagttia tcactgcgct 300 tiaclaccaa aacgiggacc ttggutgai lattggggcc aaggiacgtt agtgactgtt 360 aguct 366 <210> 222 <211> 358 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> —致序列 <220> <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223〉 n = g 或 l <220> <22l> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> (10)...(10) <223> n = c 或 i <220> <221> misc_feature <222> (13)...(13) <223> n = i 或 c <220> <221> misc_feature <222> (15)...(15) <223> n = g 或 t <220> -58· 131458-seq.doc 200911832 <221> mi sc_feature <222> (18)...(IS) <223> n = g ^ a <220> <221> misc_feature <222> (24)...(24) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (30)...(30) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (36)7..(36) <223> n = a 或 c <220> <221〉 misc一feature <222> (42)...(42) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (45)...(45) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (54)...(54) <223> n = g 或 t <220> <221> mi sc一feature <222> (57)...(57) <223> n = t ^ a <220> <221> misc_feature <222> (60)...(60) <223> n = c 或 a / <220> \ <221> misc feature <222> (61)...(61) <223> n = l 或 a <220> <22]> misc—feature <222> (62)…（62) <223> n = c 或 g <220> <221> misc一feature <222> (63)...(63) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (69)...(69) <223> n = a ^ t -59- 131458-seq.doc 200911832 <220> <22\> misc feature <222> (73)...(73) <223> η = t 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （74)...(74) <223〉 η = c 或 g <220> <221> misc_fealure <222〉 （75).,.(75) <223> n = c 或 t <220> <22]> misc一feature <222〉 （78)...(78) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (81)...(81) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (84)...(84) <223〉 n = c 或 g <220> <221> misc一feature <222> (90)7,.(90) <223> n 二 g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (96).,.(96) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (99)7..(99) <223〉 n = g 或 t <220> <221> mi sc一feature <222> (105)...(105) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (1147...(114) <223> n = c 或 a <220> <22]> misc一feature <222> (123T...(123) n = a 或 t <220> -60 131458-seq.doc 200911832 <221> misc_feature <222> (126*). ..(126) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (129)...(129) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (135T...(135) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (138T...(138) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (144)...(144) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feaiure <222> (153]...(153) <223> n = t 或 c <220〉 <221> misc_feature <222> (156T...(156) <223> n = c 或 l <220> <221> misc一feature <222> (159)...(159) <223> n = g 或 a <220> <221> misc feature <222> (162]...(162) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (168T...(168) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (17Π. ..(171) <223> n = t 或 c <220> <221> misc feature <222> (174-)... ( 174) <223> n = c 或 a <220> <221> misc.feature <222> (177T...(177) <223> n = c 或 t -61 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> mi sc_feature <222> (183T...(183) <223> η = a 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (186T...(186) <223> η = c 或 t <220> <22)> mi sc^feature <222> (195T...(195) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> C199T...U99) <223〉 n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (20lT...(201) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (204)...(204) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (207T-..(207) <223> n = c 或 a <220〉 <221> misc一feature <222> (21〇T...(210) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (213了…（2]3) <223> π = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (216)...(216) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (219)...(219) <223> n = c 或 i <220> <221> misc_feature <222> (225T...(225) <223> n = c 或 t <220> <221> misc.feature •62 I31458-seq.doc 200911832 <222> (228)…（228) <223> n = g 或 a <220〉 <221> misc_feaiure <222> (234)...(234) <223〉 n = g 或 c <220> <221> misc_fealure <222> (235T...(235) <223> η =： c 或 t <220> <22!> misc^feature <222> (237j...(237) <223> n = a 或 g <220> <221> misc一feature <222> (24〇T...(240) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (24lT...(241) <223> η = c 或 t <220> <221> misc_feaiure <222> (243"). · .(243) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (253)...(253) <223> n = a 或 t <22ϋ> <221> mi sc一feature <222> (254T...(254) <223> n = g 或 c <220> <22]> misc一feature / <222> (255T.-.(255) <223〉n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （256]...(256) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (259j...(259) <223> n = c 或 a <220> <221> misc^feature <222> (26lT-..(261) <223> n = t 或 a •63 131458-seq.doc 200911832 <220> <22]> misc_i.eature <222> (264T...(264) <223> η = c 或 t <220> <221> misc_feaiure <222> (273)...(273) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (276T...(276) <223> n = g 或 a <220> <221> mi sc一feature <222> (279了...（279) <223> η = a 或 t <220> <221> misc一feature <222〉 （288],..(288) <223> n = t 或 c <220> <22】> misc一feature <222> (29lT...(291) <223〉 n = g 或 t <220> <221> misc—feature <222> (2927...(292) <223> η = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (294)...(294) <223> η = g 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (297T-.-(297) <223> η = ΐ 或 a <220> <221> misc_feature <222> (300T...(300) <223> n = t 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (303T...(303) <223> n = g 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (304)...(304) <223> n = a 或 c <220> <221> mi sc_feature -64 131458-seq.doc 200911832 <222> (306)...(306) <223> η = g 或 t <220> <221> misc一feature <222> (309j·._(309) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (321]…（321) <223> n = c 或 t <220> <221> misc一feature <222> (3247…（324) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc feature <222> (33〇T...(330) <223> η = t 或 c <220> <221> misc feature <m> (333). ..(333) <223〉 n = g 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (336T...(336) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (339j...(339) <223> n = c 或 g <220> <221> mi sc一feature <222> (34〇T...(340) <223> n 二 c 或 t <220> <221> mi sc—feature <222> (342T...(342) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (345T...(345) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (348T...(348) <223〉 n = c 或 t <220> <221> mi sc feature <222> (350...(351) •65 131458-seq.doc 200911832 <223> η = c或空白 <220> <221> misc—feature <222> (353T...(353) <223> n = c 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> (355)...(355) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (356T...(356) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (358)...(358) <223> n =空白或t <400> 222 ， gaggtncann tgntnganic tggnggaggn ttggtncagc cnggngggtc cctncgnctn nnntgtgcng ccnnnggntt nacntttgcn catganacna iggtntgggt ccgncaggca ccnggnaang gtctngantg ggtntcacai ainccnccng anggicanga nccniintac gcngantccg tgaanggcng ntinacnatn icncgngana attcnaanaa cacnntnian nlncaaatga acnnnntgng ngcngaggac acngcngtni atcactgngc nntnctnccn aanngnggnc ct iggt t tga nuntggggn canggnacnn tngtnacngt ntngnncn <210> 223 <21]> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 223 gaagtgcagc ttcttgaaag iggtggaggg clagtgcagc cagggggaic tttaagatta tcatgcgctg ccagtggatt tacttttgct cacgagacga tggtctgggt gagacaagct cctggaaaag gtttagagtg ggtttctcac aitccacctg atggtcaaga tcctttctac gcagattccg tcaaaggaag atttactatc tccagagata atagtaaaaa caclttgtac ctacagaiga actcacttag agccgaagat accgctgigt accactgcgc cttgttgcca aagagaggtc cttggucga ttactggggt caggglactc iggttacagt ctcatct <210> 224 <2Π> 119 <2]2> PRT <213>智人 <400> 224
Giu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly G!y Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly i 1 5 丨0 15 ^ Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Giy Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys G】y Leu Glu 丁rp Val 35 40 45
Ser His lie Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Me Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Va! Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Tlir Val Ser Ser 115
<210> 225 <21)> 357 <212> DNA 66 - I31458-seq.doc 200911832 <2B>馬斯德畢赤酵母 <400> 225 gaagtgcagc ttcttgaaag tggtggaggg clagtgcagc cagggggatc ttiaagatta 60 tcatgcgctg ccagtggatt tacttttgct cacgagacga iggtctgggt gagacaagct 120 cctggaaaag gtttagagtg ggtttctcac aticcacctg atggtcaaga tcctttctac 180 gcagattccg tcaaaggaag atttactatc tccagagata atagtaaaaa cacutgtac 240 ctacagatga actcacttag agccgaagat accgctgtgt accactgcgc cttgttgcca 300 aagagaggtc cttggttcga ttactggggt cagggtactc tggttacagt ctcatct 357 <210> 226 <2]1> 358 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> —致序列 <220> <221> misc一feature <222> (3)...(3) <223> n = g 或 a <220> <221> misc feature <222> (12)…（12) f <223> n = g ^ t <220> <221> misc„feature <222> (13)...(13) <223> n = t 或 c <220> <22t> misc_feature <222> (15)...(15) <223> n = g 或 t <220〉 <221> misc一feature <222〉 （18)…（18) <223> n = g 或 a <220> <221> misc^feature <222> (19)...(19) <223> n = t ^ a <220> <221> mi sc一feature <222> (20)...(20) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feaiure <222> (24)...(24) <223> n = g ^ t <220> <221> mi sc一feature <222> (30)..,(30) <223> n = c ^ g <220> <221> misc_feaiure -67- 131458-seq.doc 200911832 <222> (31)...(31) <223> η = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (33)...(33) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc feature <222> (36)...(36) <223> η = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (42)...(42) <223〉 n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (48)...(48) <223> n = g 或 a 广 <220> <221> misc_feature <222> (51)...(51) <223> n = c 或 1 <220> <221> misc feature <222> (52)…（52) <223> n = c 或 I <220> <221> misc feature <222> (54)…（54) <223〉 π = g 或 a <220> <22]> misc一feature <222> (55)...(55) <223> n = c 或 a <220> <22]> miscj’eaiure / <222〉 （57)..,(57) \ <223> n = t 或 a <220> <221> misc feature <222> (58)...(58) <223〉 n = c 或 t <220> <22]> misc feature <222> (60)...(60) <223> n = c 或 a <220> <221> misc feature <222> (63)...(63) <223> n = c ^ a -68- 131458-seq.doc 200911832 \ <220> <221> m i s c一 feature <222> (66). ..(66) <223> n = t <220> <221> misc feature <222> (69)： ..(69) <223> η = a 或1 <220> <221> misc feature <222〉 (73)： ..(73) <223> n = t 或a <220> <221> misc feature <222〉 (74)： ,.(74) <223> n = c 或g <220〉 <221> mi sc feature <222> (75): ..(75) <223> n = c 或i <220> <221> mi sc feature <222> (81). ..(81) <22 3> n = c ^ 1 <220> <221> misc feature <222> (84). ,.(84) <223〉 n = c 或t <220〉 <221> misc feature <222> (90)： ..(90) <223> n = g 或1 <220> <221> misc feature <222> (93)： ..(93) <223> n = t 或c <220> <221> misc feature <222> (105) ...(105) <223> n = g 或c <220> <221> mi sc feature <222> (111)…（111) <223> n = c 或g <220> <221> mi sc feature <222〉 (Π2Τ ...(112) <223> n = c 或a <220> <221> misc feature <22 2> (114)…⑴4) I31458-seq.doc -69 200911832 <223> η = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (117T...(117) <223> n = g 或 a <220> <22]> misc_feature <222> (120T...C120) <223> n = a 或 t <220> <221> misc一feature <222> (123T...(123) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (126)...(126) <223> π = g 或 a <220> <221> misc_feaiure <222> (I29T...(129) <223> n = g 或 a <220> <221> misc.feature <222> (133T...(133) <223> n = c 或 t <220> <221〉 misc一feature <222> (144)...(144) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (147),..(147) <223> n = a 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (150)...(150) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (156)...(156) <223> n = c 或 a <220> <221〉 misc一feature <222> (159T...(159) <223> n = g 或 t <220> <22)> misc^feaiure <222> (168)...(168) <223> n = g 或 a -70 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc_feature <222> (174T...(174) <223> η = c 或 l <220> <221〉 misc一feature <222> (186T...(186) <223> η = c 或 t <220> <221> misc^feature <222> (192)...(192) <223〉 η = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (195T...(195) <223> n = g 或 a <220> <221> misc feaiure <222> (198T...(198) <223> n = c 或 a <220〉 <221> misc.feature <222> (]99). ..(199) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feaiure <222> (2〇ΰ. ..(201) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （204)...(204) <223> n = c 或 l <220〉 <221> misc_feature <222> (207j...(207) <223〉 n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (214j...(214) <223> n = c 或 a <220〉 <22)> misc一feature <222> (216T...(216) <223> π = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (219)...(219) <223> n = c 或 t <220> -71 - 131458-seq.doc 200911832 <221> misc_feature <222> (223T...(223) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (224j...(224) <223> n = c 或 g <220> <221> mi sc一feature <222> (225T...(225) <223> n = c 或 t <220> <221> misc—feature <222> (228T...(228) <223> n = g 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (234T...(234) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (235)...(235) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (237)...(237) <223> n = a 或 g <220> <221> misc^feature <222> (24〇T...(240) <223〉 n = t 或 c <220> <221> misc feature <222> (243T...(243) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (246*). ..(246) <223> n = a 或 g <220> <221> mi sc_feature <222> (253T.-.(253) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (254T，..(254) <223> n = g 或 c <220> <221> misc—feature <222> (255T-..(255) <223> n = c 或 a -72 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc_feaiure <222> (258T...(258) <223> n = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (259)...(259) <223> n = c 或 a <220> <221> misc^feaiure <222> (26lT...(261) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> ¢267)...(267) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (270)...(270) <223> n = c 或 t <220〉 <221> misc_feature <222> (273T...(273) <223〉 n = a 或 c <220> <221> misc一feature <222> (276T…（276) <223> n = g 或 1 <220> <221〉 mifeature <222> (279了…（279) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (282T-..(282) <223〉 π = t 或 c <220> <221> misc.feature \ <222> (288了…（288) <223> π =〖或 c <220> <221> misc_feature <222> (29Π.. .(291) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (292了...（292) <223> n = c 或 t <220> -73 131458-seq.doc 200911832 <221> misc_fea!ure <222> (295)...(295) <223> η = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (297)...(297) <223> η = t 或 g <220> <221> misc^feature <222> (300)...(300) <223> n = t 或 a <220> <221> misc^feature <222> (306)...(306) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc^feature <222> (309T...(309) <223> η = g 或 t <220> <221> misc^feature <222> (318T...(318) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> ¢321)...(321) <223> n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (336)...(336) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc feature <222> ¢339)...(339) <223〉π = c 或 t <220> <221> misc^feature <222> (345T...(345) <223> n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (348)...(348) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (3547...(354) <223> n = g或空白 <220> <221〉 misc一feature <222> (356T...(356) <223> n = g 或 t -74 I31458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc一feature <222> (358T...(358) <223> π =空白或t <400> 226 ganglgcagc tnntngannn tggnggaggn ntngtncagc cngggggntc nntnngnntn tcntgngcng ccnnnggatt nacnt ttgcn cangagacga tggtntg^gt nngncangcn ccnggnaang gtntagagtg ggtntcncan attccnccng atgglcanga tccnttctac gcagantccg tnaanggnng nttnacnatc tccngngana ainnnaanaa cacnntntan ctncanatga acnnnctnng ngccgangan acngcngtnt ancactgngc nntgntnccn aagagnggnc cttggttnga ntactggggt cagggnacnc tggtnacngt ctcnancn <2]〇> 227 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 227 gaagtacaac tgctggagag cggtggcggc ctggttcaac cgggtggttc cctgcgcctg tcctgtgcgg catctggttt caccttcgca cacgaaacca tggtgtgggt tcgccaagct ccgggcaaag gcctggaatg ggtaagccac attcctccag atggccagga cccattctat gcggattccg ttaagggtcg ctttaccatt tctcgtgata actccaaaaa caccctgtac ctgcagatga actccctgcg cgccgaggat actgcggigt accattgtgc gcigctgcct aaacgtggcc cgiggttcga ttaclggggt cagggtactc tgglcaccgt aagcagc f <210> 228 <211> 119 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 228
Glu Val Gin Leu Leu G!u Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser His lie Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 229 <21]> 357 / <212> DNA \ <213>大腸桿菌 <400> 229 gaagiacaac tgctggagag cggtggcggc ctggttcaac cgggtggttc cctgcgcctg tcctgtgcgg catctggttt caccttcgca cacgaaacca l^gigtgggt tcgccaagct ccgggcaaag gcctggaatg ggtaagccac aitcctccag atggccagga cccattctai gcggattccg ttaagggtcg ctttaccatt tctcgtgata aciccaaaaa cacccigtac ctgcagatga actccctgcg cgccgaggat actgcggtgt accattgtgc gcigcigcci aaacgtggcc cgtggttcga ttactggggi cagggtactc iggicaccgt aagcagc <210> 230 <211> 357 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> —致序列 -75- 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc_feature <222> (3)...(3) <223〉 η = g 或 a <220> <22]> mi sc一feature <222> (6)...(6) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feaiure <222> (9)...(9) <223> n 二 g 或 a <220> <22]> misc一feature <222> (13)…（13) <223> n = t ^ c <220> <221> misc一feature <222> (19)...(19) <223> n = i 或 a <220> <221> misc_feature <222> (20)...(20) <223> π = c 或 g <220> <221〉 misc—feature <222> (21)...(21) <223〉 n = t 或 c <220> <221> mi sc_feature <222> (24).,.(24) <223> n = g 或 l <220> <221> misc_feature <222> (27)...(27) <223> n = a ^ c <220> <221> misc_feature <222> (31)7..(31) <223> n = t ^ c <220> <221> misc^feature <222> (36)...(36) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (39)...(39) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature -76 131458-seq.doc 200911832 <222> (42)...(42) <223> η = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (45)…（45) <223> n = g 或 I <220> <221> misc^feature <222> (48)...(48) <223> n = g 或 I <220> <221> misc^feature <222> (57)7..(57) <223> η = I 或 c <220> <221> misc_feature <222> (60)...(60) <223〉 π = c 或 g <220> <221> misc feature <222> (69)7..(69) <223〉 n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222〉 （72)，..（72) <223> η = c 或 a <220> <221> misc一feature <222> (75)7..(75) <223> n = c 或 1 <220〉 <221> misc_feature <222> (78)...(78) <223> n = a ^ t <22ϋ> <221> misu'一feature <222> ¢87)...(87) / <223;> n = t 或 c <220> <221> mii；c_reature <222> (90)...(90) <223> n = g 或 a <220> <221> misc feature <222> (93)7..(93) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (96)...(96) <223:> n =： g 或 a -77 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc一feature <222> (99)...(99) <223> n = g 或 c <220> <22)> misc_feature <222> (Π 0...(111) <223〉 n = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (117了.(117) <223> n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> (120)...(120) <223> n = a 或 1 <220> <221> misc feature <222> (123)...(123) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (126)...(126) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (1297,..(129) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (132)...(132) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (135)...(135) <223〉 n = a 或 g <220> <221> mi sc—feature <222> (138T..(138) <223> n = g 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> (i44了…（144) <223> n = c 或 a <220> <221> misc一feature <222〉 （145了...（145) <223> n = ΐ 或 a <220> -78 131458-seq.doc 200911832 <221> mi sc_feature <222> (146T...(146) <223〉 n = c 或 g <220> <221> misc.feature <222> (147j...(147) <223> n = a 或 c <220> <221> misc.feature <222> (150)...(150) <223> n = t 或 c <220> <221> misc.feature <222> <223> n = c 或 l <220> <221〉mi sc一feature <222> (1591...(159) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (165)...(165) <223> n = t 或 c <220> <221> misc^feature <222> (17Π...(171) <223> n = ΐ 或 c <220> <221> misc_feature <222> (1747...(174) <223> n = c 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (ISO)...(180) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_i'eature <222> (183T...(183) <223> n = a 或 g <220> <221> mi sc feature <222> (186)...(186) <223> n = c 或 i <220> <221> misc_feature <222> (192T...(192) <223> n = g 或 t <220> <221> mi sc_feaiure <222> (198T...(198) <223> n = c 或 l -79 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc_feature <222> (201)...(201) <223〉 η = g 或 c <220> <221> misc^feature <222> (204-). ..(204) <223〉 n = c 或 1 <220> <221> misc_feature <222> (21〇T...(210) <223> n = c 或 t <220> <22)> misc_feature <222> (213T...(213) <】23> n = c·或 t <220> <221> misc_feature <222> (216T，..(216) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (219T...(219) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (222T...(222) <223> n = t 或 c <220> <221> misc feature <222> (228]...(228) <223> n = g 或 a <220> <221> mi sc_feature <222> (234T，..(234) <223> n = g 或 c <220> <221> misc—feature <222> (237T...(237) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (24〇T...(240) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (246)...(246) <223> n = a 或 g <220> <221> misc一feature •80· 131458-seq.doc 200911832 <222> (253)...(253) <223> η = a 或 ι <220> <221> misc^feature <222> (254)...(254) <223> η = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (261)..,(261) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (270T...C270) <223> n = c 或 I <220> <221> misc_fealure <222> (273了…（273) <223〉 n = a 或 t <220> <22i> mi sc一feature <222> (279T...(279) <223> n = a 或 g <220> <221> misc一feature <222> (282)...(282) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_fealure <222> (285)...(285) <223> n = c 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (297T...(297) <223〉 n = t 或 g <220> <221> mi sc feature , <222> (303T...(303) 、 <223> n = g 或 a <220> <221> rmsc_feature <222> (304)...(304) <223> n = a 或 c <220〉 <221> misc_feature <222> (306)...(306) <223> n = g 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (309)...(309) <223> π = g 或 c •81 - 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc_feature <222> (3)2)...(312) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (3]8了…（318) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (32lT...(321) <223> π = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (336T·..(336) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc一feature <m> (3397...(339) <223> n = c 或 t <220> <221> misc—feature <222> (351)...(351) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (352"). ..(352) <223> n = i 或 a <220> <221> misc_feature <222> (353T...(353) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (354)...(354) <223> n = g 或 c <400> 230 gangmcanc tcctgtgcng ccnggnaang gcngamccg ctgcanatga aanngnggnc <210> 231 <211> 357 <212> DNA <213>智人 <400> 231 gaggt tcaac agctgtgcag ccgggtaaag gctgattccg cigcaaatga tgntggagnn cntcnggnt t gnctngantg tnaagggncg acnncctgcg cntggunga nggnggnggc caccttngcn ggtnnnncan nttnaccatn ngccgaggan ntactggggt niggtncanc canganacna attccnccng 【cncgngana acngcggmt cagggnacnc cnggnggnic tggtgtgggt atggncagga antccaanaa ancantgtgc tggtcaccgt cctgcgnctn ncgccangcn nccnltctan cacnctntan gctgctnccl nnnnagc 00007 028 405 6 1 — 2 3 3 tgctggaatc cctctggtt l gcctggagtg tcaaaggccg actccctgcg iggtggtggt caccttcgct ggtaagccat 111 taccat t tgcagaagac ctggiacaac catgagacca atccctcctg ictcgtgaca acggcggttt cgggtggttc tggttlgggt atggtcagga acagcaaaaa atcactgtgc cctgcgtctg 60 acgccaggct ]20 cccgttctat 1B0 cactctgtac 240 actgctgcca 300 131458-seq.doc 82- 200911832 aaacgcggcc cttggttcga ctactggggc cagggtactc tggtcactgt atctict 357 <210> 232 <211> 119 <212> PRT <213>智人 <400> 232
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 30 )5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu 20 25 30
Thr Met Val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Va) 35 40 45
Ser His He Pro Pro Asp Gly Gin Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Giy Arg Phe Thr I]e Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 丁yr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95
Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Va] Ser Ser 115 <210〉 233
<211> 357 / <212> DNA <213>大腸桿菌 <400> 233 gaggttcaac tgctggaatc tggtggiggt ctggtacaac cgggtggttc cctgcgtctg 60 agctgigcag cctctggttt caccucgct catgagacca tggtttgggi acgccaggci 120 ccgggtaaag gcctggagtg ggtaagccat atccctcctg atggtcagga cccgttctat 180 gclgat tccg tcaaaggccg 111 taccat t icicgtgaca acagcaaaaa cactctgiac 240 ctgcaaatga actccctgcg tgcagaagac acggcggttt atcactgtgc actgcigcca 300 aaacgcggcc cttggttcga ctactggggc cagggtactc tggicactgt atcttct 357 <210> 234 <211> 357 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220〉 <223>—致序列 <220> <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = g 或 t <220> / <22】> mi sc一feature V <222> (9)...(9) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (13).,.(13) <223> η = t 或 c <220> <221> nnsc_feature <222> (18)..,(18) <223> n = g 或 a <220> <221> fnisc_feature <222> (24)...(24} -83- 131458-seq.doc 200911832 <223> η = g 或 l <220> <221> misc_feature <222> (27).,.(27) <223> n = a 或 t <220> <221> misc一feature <222> (30).,.(30) <223> n = c 或 t <220> <221> misc_feature <222> (31).,.(31) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (39)...(39) <223〉 n = g 或 a <220> <221> misc.feature <222〉 （42)…（42) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (45)...(45) <223> n = g 或 t <220> <221〉 misc一feature <222> (48)...(48) <223> n = g 或 t <220〉 <221> misc_feature <222> (60)...(60) <223> n = c 或 g <220> <221> m]sc—feature <222> (61)...(61) <223> n = t 或 a <220> <22】> nusc一feature <222〉 （62)...(62) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (75)...(75) <223> n = c;或 t <220> , <221> misc_feature <222> (78)"..(78) <223> n = a 或 t •84 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc_feature <222> (87)...(87) <223> η = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> (90)...(90) <223> n = g 或 I <220> <22)> misc.feature <222> ¢99)...(99) <223> n = g 或 c <220> <221> misc feature <222> (105)...(105) <223> n = g 或 I <220> <221> misc.feature <222〉（]11了…（]11) <223> n = c 或 a <220〉 <221> misc_feature <222> (120)...(120) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (123T...(123) <223> n = a 或 g <220> <22]> miiic^feature <222> (126T...()26) <223> n = g 或 1 <220> <221> mi sc_feature <222> (129T...(129) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222〉 （1327…（132) <223> n = t 或 c <220> <221> misc_feature <222> ¢1357...(135) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (144j...(144) <223> n = c 或 a <220> <221> mi sc feature <222> (145)...(145) -85- 131458-seq.doc 200911832 <223> η = 1 或 a <220> <221> misc_feature <222> (146)...(146) <223> n = c 或 g <220> <221> misc—feature <222> (147-). ..(147) <223> η = a 或 c <220> <22]> misc一feature <222> (153了…（153) <223> n = t 或 c <220> <22]> mi sc一feature <222〉（156了…（156) <223> n = c 或 t <220> <221> misc.feature <222> (159T...(159) <223> n = g 或 t <220> <22i> misc一feature <222> (17)T...(171) <223> η = I 或 c <220〉 <221> misc—feature <222> (174T...(174) <223> n = c 或 g <220> <22)> misc_feature <222> (1807...(180) <223> n = c 或 i <220> <221> misc_feature <222> (183T...(183) <223> n = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (186)...(186) <223> n = c 或 l <220> <221> misc一feature <222> (192T...(192) <223> n = g 或 c <220> <221> misc_feature <222> (195T...(195) <223> n = g 或 a •86· 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc^feature <222> (20lT.- -(201) <223> η = g 或 t <220> <22]> misc一feature <222> (204T-..(204) <223> n = c 或 t <220> <221> misc^feature <222> (210)...(210) <223> n = c 或 t <220> <221> misc^feature <222> (213T...(213) <223> n = c 或 t <220> <221> misc feature <222> (216)...(216) <223> n = c 或 t <220> <221> misc^feature <222> (222)...(222) <223> n = t 或 c <220> <221> misc一feature <222> (223T...(223) <223> π = t 或 a <220〉 <221> misc feaiure <222> (224T.-.(224) <223> n = c 或 g <220> <221> misc_feature <222> (228)...(228) <223> n = g 或 a <220〉 <221> misc一feature <222> (234T...(234) <223> n = g 或 i <220> <221> misc_feature <222〉 （237了...（237) <223> n = a 或 g <220> <221> misc—feature <222> (240"). ..(240) <》23> n = t 或 c <220> •87 131458-seq.doc 200911832 <221> misc一feature <222> (253)...(253) <223〉 n = a 或 t <220> <221> misc_fealure <222> (254T...(254) <223> n = g 或 c <220> <221> misc—feature <222> (264*)...(264) <223> n = c 或 a <220> <221> misc_feature <222> (267)...(267) <223> n = g 或 a <220> <221> misc_feature <222> (273)...(273) <223> n = a 或 g <220> <221> misc_feature <222> (279^...(279) <223> n = a 或 I <220> <221> misc_feature <222> (29lT...(291) <223> n = g 或 a <220> <221> mi sc一feature <222> (297^...(297) <223> n = t 或 g <220> <221> misc_feature <222> (30〇T...(300) <223> n = t 或 a <220> <221> misc_feature <222> (3037...(303) <223> n = g 或 a <220> <221> misc一feature <222> (304T...(304) <223> n = a 或 c <220> <221> misc.feature <222> (306T...(306) <223> n = g 或 c <220> <221> misc^feature <222> ¢309)...(309) <223> n = g 或 c -88 131458-seq.doc 200911832 <220> <221> misc_feature <222> (318T...(318) <223> η = t 或 c <220> <221> misc—feature <222> ¢330)...(330) <223> n = t 或 c <220> <22]> misc一feature <222> (336T-..(336) <223> n = a 或 i <220〉
<22]> misc一feature <222> (339^...(339) <223> n = c 或 I <220> <221> misc_feature <222> (348).,,(348) <223> n = c 或 t <220> <221> misc„feature <222> (35lT...(351) <223> η = c 或 a <220> <221〉 misc一feature <222> (354)...(354) <223> π = g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (355T...(355) <223> η = a 或 t <220> <221> misc_feature <222> (356T.,,(356) <223> η = g 或 c / <220> \ <221> misc一feature
<222> (357T...(357) <223〉 n = c 或 I <400> 234 gaggtncanc nnctgtgcag ccnggnaang gcngantccg ctgcaaatga aanngnggnc tgntgganlc cctcnggnt t gnctngagtg tnaanggccg acnncctgcg cttggttnga tggnggnggn cacct tngcn ggtnnnncat nt tnaccatn tgcngangac ctaciggggn niggiacanc ca tgagacna atnccnccng tcncgngaca acngcggtnt cagggnacnc cnggnggntc tggtntgggt atggtcagga annncaanaa atcactgtgc tggtcacngt cctgcgtctn 60 ncgccaggcn 120 nccnttctan 180 cacnctntan 240 nctgcinccn 300 ntcnnnn 357 <210〉 235 <211〉 5 131458-seq.doc 89- 200911832 <212> PRT <2丨3>智人 <400> 235
Glu Va】ό!η Leu Leu <210〉 236 <211> 28 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>肽連接子 <400> 236
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser A3a Ser Thr His Thr Cys 15 10 15
Pro Pro Cys Pro Ala Pro G!u Leu Leu Gly Gly Pro 20 25 <2)0> 237 <211> 32 <2)2> PRT <213>人工序列 <220> <223>肽連接子 <400> 237
Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 15 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 20 25 30 <2)0> 238 <211> 348 <212> DNA <213>智人 <400> 238 gaggtgcagc tguggtttc tgggggaggc Uggtacagc ctggggggtc cclgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag aictcgcctt cgggttcita tacatactac 380 gcagactccg tgaagggccg gt tcaccatc tcccgcgaca at tccaagaa cacgctgiat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatcct 300 cggaagattg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 V. 90- 131458-seq.doc

Claims (1)

  1. 200911832 十、申請專利範圍： 1. 一種抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域，其包含一個選 自以下之fe基酸序列：（i) 1 5-26品系（lineage)之變異體的 胺基酸序列，其選自：（幻與1)01^15-26-595之胺基酸序 列（展示於圖5中）至少97% —致之胺基酸序列，（b)與 DOM15-26-591之胺基酸序列（展示於圖5中）至少98% 一致 之胺基酸序列，（c)與DOM15-26-589之胺基酸序列（展示 於圖5中）至少98%—致之胺基酸序列，（d)與d〇m 15-26-588之胺基酸序列（展示於圖5中）至少98% —致之胺基酸 序列，（e)與DOM1 5-26-555之胺基酸序列（展示於圖5中） 至少99%—致之胺基酸序列；以及⑴）與d〇m 15-1 0-11之 胺基酸序列（展示於圖6中）至少98%—致之胺基酸序列。 2. 如請求項1之免疫球蛋白單一可變區域，其包含纈胺酸 在位置6，其中編號係根據Kabat。 3. 如請求項1或2之免疫球蛋白單一可變區域，其包含白胺 酸在位置99，其中編號係根據Kabat。 C 4.如請求項1或2之免疫球蛋白單一可變區域，其包含離胺 酸在位置30，其中編號係根據Kabat。 5. —種抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域，其包含一個與 選自以下之胺基酸序列一致之胺基酸序列：（i) 15-26品系 之變異體，其選自（a)與DOM15-26-595之胺基酸序列（展 示於圖5中）一致之胺基酸序列，（b)與DOM1 5-26-591之 胺基酸序列（展示於圖5中）一致之胺基酸序列，（c)與 DOM15-26-589之胺基酸序列（展示於圖5中）一致之胺基 131458.doc 200911832 酸序列，（d)與DOM15-26-588之胺基酸序列（展示於圖5 中）一致之胺基酸序列，與D〇M1 5-26-555之胺基酸序 列（展不於圖5中致之胺基酸序列；以及（ii)與d〇M15_ 10-11之胺基酸序列（展示於圖6中）一致之胺基酸序列。 6. 種抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域，其係由一個選 自以下之核苷酸序列編碼：⑴編碼15-26品系之變異體之 核苷酸序列，其選自（a)與DOM15-26-595之核酸序列至 少80%—致之核酸序列，（b)與d〇m15_26_591之核酸序列 (展示於圖20c中）至少8〇% 一致之核酸序列，（勾與 DOM15-26-589之核酸序列（展示於圖2〇b中）至少8〇%一致 之核酸序列，（d)與DOM15-26-588之核酸序列（展示於圖 20b中）至少80%—致之核酸序列，（e)與D〇M15_26_555之 核酸序列（展示於圖2〇a中）至少80% 一致之核酸序列；以 及（11)與DOM 15-10-11之核酸序列（展示於圖2〇e中）至少 80% —致之核酸序列。 7. —種抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域，其係由—個與 選自以下之核苷酸序列一致之序列編碼：⑴編碼丨5·%品 系之變異體之核苷酸序列，其選自（幻與〇〇^115_26_595 之核酸序列一致之核酸序列，化）與13〇]^15_26_591之核 酸序列（展不於圖2〇c中）一致之核酸序列，（幻與1)〇]^15_ 26-589之核酸序列（展示於圖2〇b中）一致之核酸序列，^) 與DOM15-26-588之核酸序列（展示於圖2〇b中）一致之核 酸序列，（e)與DOM15-26-555之核酸序列（展示於圖2〇a 中）一致之核酸序列；以及（ii)與D〇M15_1(M12核酸序 131458.doc 200911832 歹1J (展示於圖20e中）一致之核酸序列。 8. —種抗VEGF拮抗劑，其包含如請求項1至7中任—項之 抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域。 9. 如請求項8之拮抗劑，其包含第一及第二免疫球蛋白單 一可變區域，其中各可變區域係如請求項1至7中任一 項。 1 0 ·如請求項8或9之拮抗劑，其中該拮抗劑包含該單一可 變區域之單體或該單一可變區域之同元二聚體 (homodimer) ° 11，如請求項8或9之拮抗劑，其中該單一可變區域或各單一 可變區域之胺基酸序列係與一個選自以下之胺基酸序列 一致：（i)15-26品系之變異體，其選自（a)DOM15-26-595 之胺基酸序列（展示於圖5中），（b)DOM15-26-591之胺基 酸序列（展示於圖5中），（c)DOM 15-26-589之胺基酸序列 (展示於圖5中），(d)DOM15-26-588之胺基酸序歹(展示於 圖5中），（e)DOM15-26-555之胺基酸序列（展示於圖5 中）；以及（ii)DOM15-10-ll之胺基酸序列（展示於圖6 中）。 12. —種抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域，其包含胺基酸 序列與一個選自以下之胺基酸序列一致：（i) 15-26品系之 變異體，其選自（a)DOM 15-26-595之胺基酸序列（展示於 圖5中），（b)DOM15-26-591之胺基酸序列（展示於圖5 中），（c)DOM15-26-589之胺基酸序列（展示於圖5中）， (d)DOM15-26-588之胺基酸序列（展示於圖5中）， 131458.doc 200911832 (e)DOM15-26-555之胺基酸序列（展示於圖5中）；以及 (ii)DOM15-10-ll之胺基酸序列（展示於圖6中），或不超 過14個胺基酸位置與該等胺基酸序列不同，且具有與 DOM15-26-595、DOM15-26-591 、DOM15-26-589、 DOM1 5-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-1 (Ml 序列之 各別CDR1序列至少50%—致之CDR1序列。 13. —種抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域，其包含胺基酸 序列與一個選自以下之胺基酸序列一致：（i)l 5-26品系之 變異體，其選自（a)DOM 15-26-595之胺基酸序列（展示於 圖5中），（b)DOM15-26-591之胺基酸序列（展示於圖5 中），（c)DOM15-26-589之胺基酸序列（展示於圖5中）， (d) DOM15-26-588之胺基酸序列（展示於圖5中）， (e) DOM1 5-26-555之胺基酸序列（展示於圖5中）；以及 (ii)DOM15-10-ll之胺基酸序列（展示於圖6中），或不超 過14個胺基酸位置與該等胺基酸序列不同，且具有與 DOM15_26-595 、DOM15-26-591 、DOM15-26-589 、 DOM1 5-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 序列之 各別CDR2序列至少50%—致之CDR2序列。 14. 一種抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域，其包含胺基酸 序列與一個選自以下之胺基酸序列一致：（i) 1 5-26品系之 變異體，其選自（a)DOM15-26-595之胺基酸序列（展示於 圖5中），（b)DOM15-26-591之胺基酸序列（展示於圖5 中），（c)DOM15-26-589之胺基酸序列（展示於圖5中）， (d)DOM15-26-588之胺基酸序列（展示於圖5中）， 131458.doc 200911832 (e)DOMl 5-26-5 55之胺基酸序列（展示於圖5中）；以及 (ii)DOM15-10-ll之胺基酸序列（展示於圖6中），或不超 過14個胺基酸位置與該等胺基酸序列不同，且具有與 DOM15-26-595 ' DOM15-26-591 ' DOM15-26-589 ' DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15· 10-11 序列之 各別CDR3序列至少50%—致之CDR3序列。 1 5 · —種抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域，其包含胺基酸 序列與一個選自以下之胺基酸序列一致：（i) 15-26品系之 變異體，其選自（a)DOM1 5-26-595之胺基酸序列（展示於 圖5中），（b)DOM15-26-591之胺基酸序列（展示於圖5 中），（c)DOM15-26-589之胺基酸序列（展示於圖5中）， (d) DOM15-26-588之胺基酸序列（展示於圖5中）， (e) DOM15-26-555之胺基酸序列（展示於圖5中）；以及 (ii)DOM15-10-ll之胺基酸序列（展示於圖6中），或不超 過14個胺基酸位置與該等胺基酸序列不同，且具有與 DOM15-26-595 、DOM15-26-591 、DOM15-26-589 、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11 序列之 各別CDR1序列至少50% —致之CDR1序歹|〗，且具有與 DOM15-26-595 、DOM15-26-591 、DOM15-26-589 、 DOM1 5-26-5 88、DOM15-26-555 或 DOM15-1 0-11 序列之 各別CDR2序列至少50%—致之CDR2序列。 16. —種抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域，其包含胺基酸 序列與一個選自以下之胺基酸序列一致：（i)l 5-26品系之 變異體，其選自（a)DOM15-26-595之胺基酸序列（展示於 131458.doc 200911832 圖5中），（b)DOM15-26-591之胺基酸序列（展示於圖5 中），（c)DOM15-26-589之胺基酸序列（展示於圖5中）， (d) DOM15-26-588之胺基酸序列（展示於圖5中）， (e) DOM15-26-555之胺基酸序列（展示於圖5中）；以及 (ii)DOM15-10-ll之胺基酸序列（展示於圖6中），或不超 過14個胺基酸位置與該等胺基酸序列不同，且具有與 DOM15-26-595 、DOM15-26-591 、DOM15-26-589 、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15_10-11之各別 CDR1序列至少50%—致之CDR1序歹|J，且具有與001^15-26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM1 5-26-555 或 DOM15-10-11之各別 CDR3 序列至 少50%—致之CDR3序列。 17. —種抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域，其包含胺基酸 序列與一個選自以下之胺基酸序列一致：（i) 15-26品系之 變異體，其選自（a)DOM15-26-595之胺基酸序列（展示於 圖5中），（b)DOM15-26-591之胺基酸序列（展示於圖5 中），（c)DOM15-26-589之胺基酸序列（展示於圖5中）， (d) DOM15-26-588之胺基酸序列（展示於圖5中）， (e) DOM 15-26-5 55之胺基酸序列（展示於圖5中）；以及 (ii)DOM15-10-ll之胺基酸序列（展示於圖6中），或不超 過14個胺基酸位置與該等胺基酸序列不同，且具有與 DOM15-26-595 、DOM15-26-591 、DOM15-26-589、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 或 DOM15-10-11之各別 CDR2序列至少50%—致之CDR2序列，且具有與DOM15- 131458.doc 200911832 26-595、DOM15-26-591、DOM15-26-589、DOM15-26-588、DOM1 5-26-555 或 DOM15-10-11之各別 CDR3序列至 少50%—致之CDR3序列。 1 8. —種抗VEGF免疫球蛋白單一可變區域，其包含胺基酸 序列與一個選自以下之胺基酸序列一致：（i)l5-26品系之 變異體，其選自（a)DOM15-26-595之胺基酸序列（展示於 圖5中），（b)DOM15-26-591之胺基酸序列（展示於圖5 中），（c)DOM15-26-589之胺基酸序列（展示於圖5中）， (d) DOM15-26-588之胺基酸序列（展示於圖5中）， (e) DOM15-26_555之胺基酸序列（展示於圖5中）；以及 〇1)0〇]^15-10-11之胺基酸序列（展示於圖6中），或不超 過14個胺基酸位置與該等胺基酸序列不同，且具有與 DOM15-26-595 、DOM15-26-591 、DOM15-26-589 、 DOM15-26-588、DOM15-26-555 及 DOM15-10-11之各別 CDR1序列至少50%—致之CDR1序列，且具有與〇0厘15-26-595 > DOM15-26-591 ' DOM15-26-589 ' DOM15-26-5 88、DOM1 5-26-555 及 DOM1 5-10-11之各別 CDR2序列至 少50% —致之CDR2序列，且具有與DOM15-26-595、 DOM15-26-591 、DOM15-26-589 、 DOM15-26-588 、 DOM15-26-555 及 DOM15-10-11 之各別 CDR3 序列至少 50%—致之CDR3序列。 19. 一種抗VEGF拮抗劑，其具有一個與選自以下各序列之 CDR1之CDR1序列至少50%—致之CDR1序列：DOM15-26-595(展示於圖5中）、DOM15-26-591(展示於圖5中）、 131458.doc 200911832 DOM 15-26-589(展示於圖 5 中）、DOMl5-26-588(展示於圖 5 中）、DOM15-26-555(展示於圖 5 中）及 001^15-10-11(展 示於圖6中）。 20. —種抗VEGF拮抗劑，其具有一個與選自以下各序列之 CDR2之CDR2序列至少50%—致之CDR2序列：DOM15-26-595(展示於圖5中）、DOM15-26-591(展示於圖5中）、 DOM1 5-26-589(展示於圖 5 中）、DOM 15-26-588(展示於圖 5 中）、DOM1 5-26-555(展示於圖 5 中）及 DOM 15-10-11(展 示於圖6中）。 21. —種抗VEGF拮抗劑，其具有一個與選自以下各序列之 CDR3之CDR3序列至少50%—致之CDR3序列：DOM15-26-595(展示於圖5中）、DOM15-26-591(展示於圖5中）、 DOM15-26-5 89(展示於圖 5 中）、DOM 15-26-588(展示於圖 5 中）、DOM15-26-555(展示於圖 5 中）及 DOM 15-10-11(展 示於圖6中）。 22· —種抗VEGF拮抗劑’其具有一個與選自以下各序列之 CDR1之CDR1序列至少50%—致之CDR1序列：DOM15-26-595(展示於圖5中）、DOM15-2 6-5 91 (展示於圖5中）、 DOM15-26-5 89(展示於圖 5 中）、DOM15-26-588(展示於圖 5 中）、DOM15-26-5 55(展示於圖 5 中）及 DOM15-10-11(展 示於圖6中）；及一個與選自以下各序列之CDR2之CDR2 序列至少50%—致之CDR2序列：DOM15_26-595(展示於 圖 5 中）、DOM15-26-591(展示於圖 5 中）、DOM15-26-589(展示於圖5中）、DOM15-26-588(展示於圖5中）、 131458.doc 200911832 DOM 1 5-26-555(展示於圖5中）及DOM 15-10-11(展示於圖6 中）。 23. —種抗VEGF拮抗劑，其具有一個與選自以下各序列之 CDR1之CDR1序列至少50%—致之CDR1序列：DOM15-26-595(展示於圖5中）、D0M1 5-2 6-5 91 (展示於圖5中）、 001^15-26-589(展示於圖5中）、00河15_26-588(展示於圖 5 中）、DOM15-26-555(展示於圖 5 中）及 D〇M 15-1 0-11(展 示於圖6中）；及一個與選自以下各序列之CDR3之CDR3 序列至少50%—致之CDR3序列：DOM15-26-595(展示於 圖 5 中）、DOM15-26-591(展示於圖 5 中）、DOM15-26-589(展示於圖5中）、DOM15-26-588(展示於圖5中）、 DOM1 5-26-5 55(展示於圖5中）及DOM 15-10-11(展示於圖6 中）。 24. —種抗VEGF拮抗劑’其具有一個與選自以下各序列之 CDR2之CDR2序列至少50%—致之CDR2序列：DOM15-26-595(展示於圖5中）、DOM15-26-591(展示於圖5中）、 DOM1 5-26-5 89(展示於圖 5 中）、DOM15-26-588(展示於圖 5 中）、DOM15-26-555(展示於圖 5 中）及 〇〇厘15-10-11(展 示於圖6中）；及一個與選自以下各序列之CDR3之CDR3 序列至少50%—致之CDR3序列：DOM15-26-595(展示於 圖 5 中）、DOM15-26-591(展示於圖 5 中）、DOM15-26-589(展示於圖5中）、DOM1 5-26-588(展示於圖5中）、 DOM1 5-26-5 5 5(展示於圖5中）及DOM 15-10-11(展示於圖6 中）。 131458.doc 200911832 25 . —種抗VEGF拮抗劑，其具有一個與選自以下各序列之 00111之00111序列至少50%—致之€0111序列：〇〇]^15-26-595(展示於圖5中）、DOM15-26-591(展示於圖5中）、 001^115-26-589(展示於圖5中）、001\415-26-588(展示於圖 5 中）、DOM1 5-26-55 5(展示於圖 5 中）及 DOM 15-10-11(展 示於圖6中）；及一個與選自以下各序列之CDR2之CDR2 序列至少50%—致之CDR2序列：DOM15-26-595(展示於 圖 5 中）、DOM15-26-591(展示於圖 5 中）、DOM15-26-589(展示於圖5中）、DOM15-26-588(展示於圖5中）、 DOM 1 5-26-55 5(展示於圖5中）及DOM 15-10-11(展示於圖6 中）；及一個與選自以下各序列之CDR3之CDR3序列至少 50%—致之CDR3序列：DOM15-26-595(展示於圖5中）、 DOM15-26-591(展示於圖 5中）、DOM15-26-589(展示於圖 5中）、00^415-26-588(展示於圖5中）、001^15-26-555(展 示於圖5中）及DOM15-10-11(展示於圖6中）。 26. —種抗VEGF结抗劑，其包含免疫球蛋白單一可變區 域，該免疫球蛋白單一可變區域包含選自以下各序列之 CDR1、CDR2 及 / 或 CDR3 序列：（a)DOM15-26-595(展示 於圖5中），或（b)DOM15-26-591(展示於圖5中），或 (c)DOM15-26-589(展示於圖 5 中），或（d)DOM15-26-588(展示於圖5中），（e)DOM15-26-555(展示於圖5中）及 (f)DOM15-10-l 1(展示於圖 6 中）。 27·—種抗VEGF拮抗劑，其係與DOM15-26-595(展示於圖5 中）、DOM15-26-591(展示於圖 5 中）、DOM15-26-589(展 131458.doc -10- 200911832 不於圖5中）、D〇Ml5_26588(展示於圖…d簡5_26_ 555(展示於圖5中rd〇Mi5_i(mi(展示於圖…競爭結 合VEGF。 28. -種蛋白酶抗性免疫球蛋白單一可變區域，其包含 VEGF結合位點，其中該可變區域在37它與至少1〇微 毫升之濃度(c)之蛋白酶一起培養至少】小時之時間⑴； 或在3(TC與至少40微克/毫升之濃度（c，）之蛋白酶一起培 養至少1小時之時間⑴時對蛋白酶具有抗性。 29. 如請求項28之可變區域，其中該濃度（咖，）為至少⑽或 1000微克/毫升蛋白酶。 30. 如請求項28或29之可變區域，其中時間⑴為i、3或24小 時或隔夜。 3 1.如請求項28之可變區域，其中該可變區域在條件⑴下具 抗性且該濃度（c)為1〇或1〇〇微克/毫升蛋白酶且時間⑴為 1小時。 32·如請求項28之可變區域，其中該可變區域在條件下具 抗性且該濃度（c')為40微克/毫升蛋白酶且時間⑴為3小 時。 33.如請求項28、29、3 1及32中任一項之可變區域，其中該 蛋白酶係選自胰蛋白酶、彈性蛋白酶、白血球酶 (leucozyme)及騰酶。 3 4.如請求項28、29、3 1及32中任一項之可變區域，复 〆、T孩 蛋白酶為姨蛋白酶。 35.如請求項28、29、31及32中任一項之可變區域，复 T 0¾ 131458.doc 11 200911832 可變區域對騰蛋白酶及至少另一種選自彈性蛋白酶、白 血球酶及胰酶之蛋白酶具有抗性。 3 6.如請求項28、29、31及32中任—項之可變區域，其中該 可變區域在條件⑴或（ii)下培養後特異性結合vEGf。 37. 如請求項36之可變區域，該可變區域在條件⑴或（Η)下培 養後在ELISA中具有至少0.404之〇j)450讀數。 38. 如請求項28、29、31及32中任一項之可變區域，其中該 可變區域在條件⑴或（ii)下培養後特異性結合蛋白質A或 蛋白質L。 3 9.如請求項28、29、3 1及32中任一項之可變區域，其中該 可變區域在條件⑴或（ii)下培養後在凝膠電泳中大體上展 現單一條帶。 4〇· 一種VEGF拮抗劑’其包含如請求項1-7、12-18及28至39 中任一項之可變區域。 41. 如請求項40之VEGF拮抗劑，其係用於經口傳遞。 42. 如請求項40或41之VEGF拮抗劑，其係用於向患者之胃 腸（GI)道傳遞。 43，一種如請求項40之VEGF拮抗劑在製造用於經口傳遞之 藥物的用途。 44. 一種如請求項4〇之vEGF拮抗劑在製造用於向患者之⑴ 道傳遞之藥物的用途。 45·如請求項40或41之拮抗劑，其中該可變區域對胰蛋白 酶、彈性蛋白酶及/或胰酶具有抗性。 46’如凊求項43或44之用途，其中該可變區域對胰蛋白酶、 131458.doc -12- 200911832 彈性蛋白酶及/或胰酶具有抗性。 47.如請求項40之VEGF拮抗劑，其係用於肺傳遞。 4 8.如請求項40之VEGF拮抗劑，其係用於向患者之眼睛傳 遞。 49. 一種如請求項40之VEGF拮抗劑在製造用於肺傳遞之藥 物的用途。 50. —種如請求項40之VEGF拮抗劑在製造用於向患者之眼 睛傳遞之藥物的用途。 51. 如請求項47或48之拮抗劑，其中該可變區域對胰蛋白酶 具有抗性。 52. 如請求項49或50之用途，其中該可變區域對胰蛋白酶具 有抗性。 53.如請求項40之VEGF拮抗劑，其係用於治療及/或預防癌 症、發炎、自體免疫疾病或年齡相關黃斑退化(amd)或 VEGF介導之病狀或錢、慢性阻塞性相（⑶pD)或肺 炎。 i 认一種如請求項4kVE㈣抗劑在製造用於治療及/或預 防癌症、發炎、自體免疫疾病或_或乂咖介導之病 狀或疾病、COPD或肺炎之藥物的用途。 55.如請求項53之拮抗劑，其中 古π _ 艰症係選自由肺癌、結腸 直腸癌、頭頸部癌、胰腺癌、 _ 組成之群。 4癌、則列腺癌及卵巢癌 56·^求項54之用途，其中該癌症係選自由肺癌、，腸直 腸癌、頭頸部癌、胰腺癌、 孔癌、則列腺癌及卵巢癌組 131458.doc 200911832 成之群。 57.如睛求項53之拮抗劑，其中該病狀為amd。 58·如請求項54之用途，其中該病狀為AMD。 59.如請求項53之拮抗劑，其中該發炎性疾病為發炎性腸疾 病且係選自由克羅恩氏病（Crohn's disease)及潰瘍性鈇腸 炎組成之群。 60·如請求項54之用途，其中該發炎性疾病為發炎性腸疾病 且係選自由克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎組成之群。 61·如請求項53之拮抗劑，其中該慢性阻塞性肺病係選自由 慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎及肺氣腫組成之 群0 62. 如請054之料，其中該慢性阻塞性肺病係選自由慢 性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎及肺氣腫組成之群。 63. 如請求項53之拮抗劑，其中該肺炎為細菌性肺炎。 64. 如請求項54之用途，其中該肺炎為細菌性肺炎。 \ 65·^請求項63之括抗劑，其中該細菌性肺炎為葡萄球菌肺 (Staphylococcal pneumonia)。 其中該細菌性肺炎為葡萄球菌肺 66.如請求項64之用途， 炎。 67.如請求項40之VEGF拮抗劑 症。 其係用於治療及/或預防癌 68. 69. 一種如請求項40之VEGF拮抗劑在絮 ⑷仕I造用於治療及/或預 防癌症之藥物的用途。 如請求項67之拮抗劑，其中該癌 馬選自由肺癌、結腸 131458.doc •14· 200911832 直腸癌、頭頸部癌、胰腺癌、乳癌、前列腺癌及卵巢癌 組成之群之實體腫瘤。 70. 如明求項68之用途，其中該癌症為選自由肺癌、結腸直 腸癌、頭頸部癌、胰腺癌、乳癌、前列腺癌及印巢癌組 成之群之實體腫瘤。 71. —種肺傳遞裝置，其含有如請求項4〇、47、48或51之 VEGF拮抗劑。 72. 如請求項71之裝置，其中該裝置為吸入器或鼻内投藥裝 置。 73. —種口服調配物，其包含如請求項4〇或4丨之vEGF拮抗 劑。 74. 如請求項73之調配物，其中該調配物為錠劑、丸劑、膠 囊、液體或糖漿。 75. 如請求項 8、9、40、41、47、48、53、55、57、59、 61、63、65、67及69中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑 包含如請求項1至7、12至18及28至39中任一項之可變區 域。 76. 如請求項 8、9、40、41、47、48、53、55、57、59、 61、63、65、67及69中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑 包含具有至少5(TC之Tm之可變區域。 77. 如請求項 8、9 ' 40、41、47、48、53、55、57、59、 61、63、65、67及69中任一項之拮抗劑，其中該拮抗劑 包含在標準HUVEC細胞檢定中以500 nM至50 pM之ND50 中和人類VEGF之可變區域。 131458.doc -15 - 200911832 78. 如請求項 43、44、49、50、54、56、58、60、62、64、 66 68及70中任一項之用途，其中該拮抗劑包含如請求 項1至7、12至18及28至39中任一項之可變區域。 79. 如請求項 43、44、49、50、54、56、58、60、62、64、 66、68及70中任一項之用途，其中該拮抗劑包含具有至 少50°C之Tm之可變區域。 80. 如請求項 43、44、49、50、54、56、58、60、62、64、 66、68及70中任一項之用途，其中該拮抗劑包含在樑準 HUVEC細胞檢定中以5〇〇 nM至50 pM之ND50中和人类貝 VEGF之可變區域。 81. 如請求項71或72之裝置，其中該拮抗劑包含如請求項^ 至7、12至18及28至39中任一項之可變區域。 82. 如請求項7 1或72之裝置’其中該拮抗劑包含具有至少 50°C之Tm之可變區域。 83. 如請求項71或72之裝置，其中該拮抗劑包含在標準 HUVEC細胞檢定中以500 nM至50 pM之ND50中和人類 VEGF之可變區域。 84·如請求項73或74之調配物，其中該拮抗劑包含如請求 1至7、12至18及28至39中任一項之可變區域。 85. 如請求項73或74之調配物，其中該拮抗劑包含具有至少 50°C之Tm之可變區域。 86. 如請求項73或74之調配物，其中該拮抗劑包含在標準 HUVEC細胞檢定中以500 nM至50 pM之ND50中和人类員 VEGF之可變區域。 131458.doc -16- 200911832 7. 士口月求項 1、2、5至 7、12至 18、28、29、31 及 32中任一 員之了 區域，其中該拮抗劑包含具有至少5〇 °C之Tm之 可變區域。 88.如請求項！、2、5至7、12至18、28、29、31及32中任一 項之可變區域，丨中該可變區域在標準而¥£(：細胞檢定 中以500 nM至50 PM之ND50中和人_VEGF。 89· —種雙特異性配位體，其包含如請求項丨至？、^至⑺、 28至39、87及88中任一項之可變區域。 90. —種分離或重組核酸，其編碼包含如請求項丨至7、丨2至 18、28至39、87及88中任一項之免疫球蛋白單一可變區 域之多月太。 91. 一種載體，其包含如請求項9〇之核酸。 92· -種宿主細胞’其包含如請求項9〇之核酸或如請求項91 之載體。 93· -種產生包含免疫球蛋白單一可變區域之多肽之方法， ί. ^ I 3將如μ求項92之宿主細胞維持在適於該核酸 或該載體表現之條件下，藉此產生包含免疫球蛋白單一 可變區域之多肽。 94·如吻求項％之方法，其進一步包含分離該多狀，及視情 生比刀離之多肽具有改良親和力及/或ND50之變 異體，例如突變變異體。 95· 一種醫藥組合物’其包含如請求項1至7、12至18、28至 39、87及88中任一頊夕Α产+ 、之免疫球蛋白單一可變區域或如請 求項 8 至 11、,, « 至 27、40至 42、45、47、48、51、53、 131458.doc •17- 200911832 55、57、59、61、63、05、07、69 及 75 至 77 中任一項之 拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。 96· —種多肽，其包含一個選自以下之胺基酸序列：（i)15_26 品系之變異體，其選自：（a)與DOM 15-26-595之胺基酸 序列（展示於圖5中）至少97% —致之序列，（b)與DOM1 5-26-591之胺基酸序列（展示於圖5中）至少98%—致之胺基 酸序列，（c)與DOM15-26-589之胺基酸序列（展示於圖5 中）至少98%—致之胺基酸序列，（d)與d〇M15-26-588之 胺基酸序列（展示於圖5中）至少98%—致之胺基酸序列， (e)與DOM15-26-555之胺基酸序列（展示於圖5中）至少 99%—致之胺基酸序列；以及⑴）與domi 5-1 0-11之胺基 酸序列（展示於圖6中）至少98% —致之胺基酸序列。 97. —種多肽，其係由一個選自以下之核苷酸序列編碼：⑴ 編碼15-20品系之變異體之核苷酸，其選自（a)與d〇m15-26-595之核酸序列至少8〇% —致之核酸序列，（b)與 DOM15-26-591之核酸序列（展示於圖2〇c中）至少8〇%一致 之核酸序列，（c)與DOM15-26-589之核酸序列（展示於圖 20b中）至少80%—致之核酸序列，（d)與d〇m15-26-588之 核酸序列（展示於圖20b中）至少80%—致之核酸序列，（e) 與DOM1 5-26-555之核酸序列（展示於圖2〇a中）至少80% — 致之核酸序列；以及（ii)與DOM15-10-11之核酸序列（展 示於圖20e中）至少80%—致之核酸序列。 98· 一種融合蛋白’其包含如請求項96或97之多肽。 "· 一種分離或重組核酸，其編碼如請求項96或97之多肽或 131458.doc •18- 200911832 如請求項98之融合蛋白。 1 〇〇.如請求項1、2、5至7、12至18、28、29、31及32中任一 項之免疫球蛋白單一可變區域，其包含抗體恆定區域。 101 •如請求項1〇〇之可變區域，其包含抗體Fc，視情況其中 該Fc之N端連接於（視情況直接連接於）該可變區域之c 端。 102. 如請求項 8、9、40、41、47、48、53、55、57、59、 61、63、65、67及69中任一項之拮抗劑’其包含抗體恆 \ 定區域。 103. 如請求項1〇2中任一項之拮抗劑，其包含抗體Fc，視情 況其中該Fc之N端連接於（視情況直接連接於）該可變區域 之C端。 104. 如請求項96或97之多肽，其包含抗體恆定區域。 105. 如請求項1 04中任一項之多肽，其包含抗體Fc，視情況 其中該Fc之N端連接於（視情況直接連接於）該可變區域之 C端。 131458.doc -19·
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