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BRPI0812268A2 - domínio variável simples de imunoglobulina tipo 1 de receptor anti-interleucina-1, antagonista tipo 1 do receptor anti-interleucina-1, uso do mesmo, método para a dispensação oral ou dispensação de um medicamento ao trato gi de um paciente ou ao pulmão ou tecido pulmonar de um paciente, dispositivo de dispensação pulmonar, formulação oral, ligando específico duplo, ácido nucleico isolado ou recombinante, vetor, célula hospedeira, método para produzir polipeptídeo, composição farmacêutica, polipeptídeo, proteína de fusão, e, ácido nucleico isolado ou recombinante. - Google Patents

domínio variável simples de imunoglobulina tipo 1 de receptor anti-interleucina-1, antagonista tipo 1 do receptor anti-interleucina-1, uso do mesmo, método para a dispensação oral ou dispensação de um medicamento ao trato gi de um paciente ou ao pulmão ou tecido pulmonar de um paciente, dispositivo de dispensação pulmonar, formulação oral, ligando específico duplo, ácido nucleico isolado ou recombinante, vetor, célula hospedeira, método para produzir polipeptídeo, composição farmacêutica, polipeptídeo, proteína de fusão, e, ácido nucleico isolado ou recombinante. Download PDF

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Publication number
BRPI0812268A2
BRPI0812268A2 BRPI0812268A BRPI0812268A BRPI0812268A2 BR PI0812268 A2 BRPI0812268 A2 BR PI0812268A2 BR PI0812268 A BRPI0812268 A BR PI0812268A BR PI0812268 A BRPI0812268 A BR PI0812268A BR PI0812268 A2 BRPI0812268 A2 BR PI0812268A2
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BR
Brazil
Prior art keywords
variable domain
antagonist
fact
sequence
dom4
Prior art date
Application number
BRPI0812268A
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Inventor
Enever Carolyn
Tomlinson Ian
Jespers Laurent
Pupecka Malgorzata
Original Assignee
Domantis Ltd
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Publication date
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Application filed by Domantis Ltd filed Critical Domantis Ltd
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Abstract

domínio variável simples de imunoglobulina tipo 1 de receptor anti-interleucina-1, antagonista tipo 1 do receptor anti-interleucina-1, uso do :mesmo, niétodo para a dispensação oral ou dispensação de um medicamento ao trato gi de um paciente ou ao pulmão ou tecido pulmonar de um paciente, dispositivo de dispensação pulmonar, formulação oral, ligando específico duplo, ácido nucleico isolado ou recombinante, vetor, célula hospedeira, método para produzir polipeptídeo, composição farmacêutica, polipeptídeo, proteína de fusão, e, ácido nucleico isolado ou recombinante a invenção se refere a polipeptídeos anti-il-1r1 e domínios variáveis simples de anticorpo ( dabs) que são resistentes à degradação por uma protease, assim como antagonistas compreendendo o mesmo. os polipeptídeos, dabs e antagonistas são úteis como produtos terapêuticos e/ou profiláticos que são prováveis para encontrar proteases quando administrados a um paciente, por exemplo para administração pulmonar, administração oral, dispensação ao pulmão e dispensação ao trato gi de um paciente, assim como para tratamento de doença inflamatória, tal como artrite ou copo.

Description

“DOMÍNIO VARIÁVEL SIMPLES DE IMUNOGLOBULINA TIPO 1 DE i RECEPTOR ANTI-INTERLEUCINA-1, ANTAGONISTA TIPO 1 DO
RECEPTOR ANTI-INTERLEUCINA-1, USO DO MESMO, MÉTODO PARA A DISPENSAÇÃO ORAL OU DISPENSAÇÃO DE UM
MEDICAMENTO AO TRATO GI DE UM PACIENTE OU AO PULMÃO OU TECIDO PULMONAR DE UM PACIENTE, DISPOSITIVO DE DISPENSAÇÃO PULMONAR, FORMULAÇÃO ORAL, LIGANDO ESPECÍFICO DUPLO, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO OU RECOMBINANTE, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA
PRODUZIR POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, POLIPEPTÍDEO, PROTEÍNA DE FUSÃO, E, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO OU RECOMBINANTE”
A presente invenção diz respeito a polipeptídeos resistentes à protease, domínios variáveis simples de imunoglobulina (anticorpo) e 15 antagonistas do Tipo 1 de Receptor anti-Interleucina-1 (IL-1R1) que compreende estes. A invenção ainda diz respeito ao uso, formulações, composições e dispositivos que compreende tais como ligando anti-IL-lRl. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Os polipeptídeos e peptídeos tomaram-se agentes 20 crescentemente importantes em uma variedade de aplicações, incluindo aplicações industriais e uso como agentes médicos, terapêuticos e diagnósticos. Entretanto, em certos estados fisiológicos, tais como estados inflamatórios (por exemplo, COPD) e câncer, a quantidade de proteases presente em um tecido, órgão ou animal (por exemplo, no pulmão, em ou 25 adjacente a um tumor) pode aumentar. Este aumento nas proteases pode resultar na degradação e inativação acelerada de proteínas endógenas e de peptídeos, polipeptídeos e proteínas terapêuticas que são administradas para tratar a doença. Consequentemente, alguns agentes que têm potencial para o uso in vivo (por exemplo, uso no tratamento, diagnóstico ou prevenção de doença) tem apenas eficácia limitada porque são rapidamente degradados e inativados pelas proteases.
Os polipeptídeos resistentes à protease fornecem diversas vantagens. Por exemplo, polipeptídeos resistentes à protease que permanecem 5 ativos in vivo por mais tempo do que os agentes sensíveis à protease e, consequentemente, permanecem funcionais por um período de tempo que é suficiente para a produção de efeitos biológicos. Existe uma necessidade quanto a métodos melhorados para a seleção de polipeptídeos que são resistentes à degradação da protease e também têm atividade biológica 10 desejável.
IL-1R1
Certos agentes que ligam o receptor de Interleucina Tipo 1 (IL-1R1) e neutraliza a sua atividade mostraram ser agentes terapêuticos eficazes contra certas condições inflamatórias, tais como artrite reumatóide 15 moderada ou gravemente ativa. Entretanto, outros agentes que ligam IL-1R1, tal como o anticorpo anti-IL-lRl AMG 108 (Amgen) falharam em satisfazer os objetivos primários em estudos clínicos. Deve ser desejável fornecer agentes que liguem e antagonizem IL-1R1 e que sejam eficazes no tratamento de inflamação do pulmão ou doenças respiratórias, tais como doença 20 pulmonar obstrutiva crônica (COPD).
Existe uma necessidade quanto a agentes melhorados que antagonizem IL-1R1 e métodos para administrar tais agentes para o tratamento de inflamação pulmonar e doença pulmonar.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 98 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou pelo menos 97 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4). Em uma forma de realização, o percentual da identidade é em pelo menos 97,5, 98,
98,5 ou 99 %. Em uma forma de realização, o polipeptídeo é DOM4-130-201 ou D0M4-130-202. A invenção ainda fornece (substancialmente) monômero DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 puro. Em uma forma de realização, o DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 é em pelo menos 98, 99, 99,5 % puro ou 100 % de monômero puro.
Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo que compreende uma resistente a protease da sequência de aminoácido que é pelo menos 90 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-13 0-201 ou DOM4-130-202. Em uma forma de realização estes aspectos, o percentual da identidade é em pelo menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 %. Em uma forma de realização, o polipeptídeo é DOM4-130-201 ou DOM4130-202.
Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo codificado por uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntico à sequência de nucleotídeo da sequência de nucleotídeo de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 19). Em uma forma de realização, o percentual da identidade é em pelo menos 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 %.
Em um aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 57 % idêntico à sequência de nucleotídeo de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 19) e em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 98 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou pelo menos 97 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-130-202. Em uma forma de realização, o percentual da identidade da sequência de nucleotídeo é em pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 %. Em uma forma de realização, o percentual da identidade de uma sequência de aminoácido é em pelo menos 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % ou 100 %. Por exemplo, a sequência de nucleotídeo pode ser uma versão otimizada por códon da sequência de nucleotídeo de DOM4-13 0-201 ou DOM4-13 0-202 (mostrado na figura 19). A otimização por códon da sequência é conhecido na técnica. Em uma forma de realização, a sequência de nucleotídeo é otimizada pela expressão em uma célula hospedeira bacteriana (por exemplo, E. coli ou Pseudomonas, por exemplo P fluorescens), mamífera (por exemplo, CHO) ou de levedura (por exemplo Picchia ou Saccharomyces, por exemplo P. pastoris ou S', cerevisiae).
Em um aspecto, a invenção fornece uma proteína de fusão que compreende o polipeptídeo da invenção.
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina1 que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 98 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou pelo menos 97 % idêntico à sequência de aminoácido de D0M4-130-202 (mostrado na figura 4). Em uma forma de realização, o percentual da identidade é em pelo menos
97,5, 98, 98,5 ou 99 %.
Em uma forma de realização, o domínio variável simples de imunoglobulina compreende pelo menos um aminoácido selecionado de 22S, 49S, 83S e 94Y, em que a numeração está de acordo com Kabat (“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Department of Health and Human Services 1991).
Em uma forma de realização, o domínio variável simples de imunoglobulina compreende 22S, 49S, 83S e 94Y, em que a numeração está de acordo com Kabat.
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina1 que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DQM4-130-202.
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina1 codificado por uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 80 % idêntico à sequência de nucleotídeo de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 19). Em uma forma de realização, o percentual da identidade é em pelo menos 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 %.
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina1 codificado por uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 57 % idêntico à sequência de nucleotídeo de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 19) e em que o domínio variável compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 98 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou pelo menos 97 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-130-202. Em uma forma de realização, o percentual da identidade da sequência de nucleotídeo é em pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 %. Em uma forma de realização, o percentual da identidade de uma sequência de aminoácido é em pelo menos 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % ou 100 %. Por exemplo, a sequência de nucleotídeo pode ser uma versão otimizada por códon da sequência de nucleotídeo de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 19). A otimização por códon da sequência é conhecido na técnica. Em uma forma de realização, a sequência de nucleotídeo é otimizada pela expressão em uma célula hospedeira bacteriana (por exemplo, E. coli ou Pseudomonas, por exemplo P fluorescens\ mamífera (por exemplo, CHO) ou de levedura (por exemplo Picchia ou Saccharomyces, por exemplo P. pastoris ou S’. cerevisiaè).
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina1 codificado por uma sequência de nucleotídeo que é idêntica à sequência de nucleotídeo de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 19).
Em um aspecto, a invenção fornece um antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor anti-Interleucina-1 que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina anti-IL-lRl de acordo com a invenção. Em uma forma de realização, o antagonista compreende o primeiro e segundo domínios variáveis simples de imunoglobulina, em que cada domínio variável está de acordo com a invenção. Por exemplo, em que o antagonista compreende um monômero do dito domínio variável simples ou um homodímero do dito domínio variável simples. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácido de cada um dos domínios variáveis simples é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4).
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina1 que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou D0M4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-13 0-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR1 de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202. Em uma forma de realização, a diferença não é mais do que 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 posição de aminoácido. Em uma forma de realização, a identidade de sequência CDR é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %.
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina1 que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou D0M4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de
CDR2 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR2 de DOM4-130201 ou DOM4-130-202. Em uma forma de realização, a diferença não é mais do que 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 posição de aminoácido. Em uma forma de realização, a identidade de sequência CDR é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %.
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina de Tipo 1 de receptor interleucina-1 (IL-1R1) que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência CDR3 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR3 de DOM4-130-201 ou D0M4-130-202. Em uma forma de realização, a diferença não é mais do que 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 posição de aminoácido. Em uma forma de realização, a identidade de sequência CDR é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %.
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina1 que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR1 de DOM4-13 ΟΣΟΙ ou DOM4-130-202 e tem uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR2 de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202. Em uma forma de realização, a diferença não é mais do que 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 posição de aminoácido. Em uma forma de realização, uma ou ambas identidades de sequência CDR é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % respectivamente.
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina1 que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR1 de DOM4-130201 ou DOM4-130-202 e tem uma sequência CDR3 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR3 de DOM4-13 0-201 ou DOM4-130-202. Em uma forma de realização, a diferença não é mais do que 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 posição de aminoácido. Em uma forma de realização, uma ou ambas identidades de sequência CDR é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % respectivamente.
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina1 que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR2 de DOM4-130201 ou DOM4-130-202 e tem uma sequência CDR3 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR3 de DOM4-130-201 ou DOM4-130-201 ou D0M4-130-202. Em uma forma de realização, a diferença não é mais do que 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 posição de aminoácido. Em uma forma de realização, uma ou ambas identidades de sequência CDR é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % respectivamente.
Em um aspecto, a invenção fornece um domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina1 que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR1 de DOM4-130201 ou DOM4-130-202 e tem uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR2 de DOM4-13 0-201 ou DOM4-130-202 e tem uma sequência CDR3 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR3 de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202. Em uma forma de realização, a diferença não é mais do que 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 posição de aminoácido. Em uma forma de realização, um ou duas ou cada uma da identidade de sequência CDR é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % respectivamente.
Em um aspecto, a invenção fornece um antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor anti-Interleucina-1 que tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR1 de DOM4-130-201 ou D0M4-130-202 (mostrado na figura 4). Em uma forma de realização, a identidade de sequência CDR é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %. O antagonista pode ser resistente a protease, por exemplo um ou mais da protease como nestes descritos, por exemplo sob uma série de condições como nestes descritos.
Em um aspecto, a invenção fornece um antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor anti-Interleucina-1 que tem uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR1 de DOM4-130-201 ou
DOM4-130-202 (mostrado na figura 4). Em uma forma de realização, a identidade de sequência CDR é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %. O antagonista pode ser resistente a protease, por exemplo um ou mais da protease como nestes descritos, por exemplo sob uma série de condições como nestes descritos.
Em um aspecto, a invenção fornece um antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor anti-Interleucina-1 que tem uma sequência de CDR3 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR1 de D0M4-13 0-201 ou DOM4-13 0-202 (mostrado na figura 4). Em uma forma de realização, a identidade de sequência CDR é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 %. O antagonista pode ser resistente a protease, por exemplo um ou mais da protease como nestes descritos, por exemplo sob uma série de condições como nestes descritos.
Em um aspecto, a invenção fornece um antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor anti-Interleucina-1 que tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR1 de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) e uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR2 de DOM4-130-201 ou DOM4130-202 respectivamente. Em uma forma de realização, a identidade de sequência CDR de um ou ambos CDRs é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % respectivamente. O antagonista pode ser resistente a protease, por exemplo uma ou mais protease como nestes descritos, por exemplo sob uma série de condições como nestes descritos.
Em um aspecto, a invenção fornece um antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor anti-Interleucina-1 que tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR1 de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) e uma sequência de CDR3 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR3 de DOM4-130-201 ou DOM4130-202 respectivamente. Em uma forma de realização, a identidade de sequência CDR de um ou ambos CDRs é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % respectivamente. O antagonista pode ser resistente a protease, por exemplo um ou mais da protease como nestes descritos, por exemplo sob uma série de condições como nestes descritos.
Em um aspecto, a invenção fornece um antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor anti-Interleucina-1 que tem uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR2 de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) e uma sequência de CDR3 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR3 de DOM4-130-201 ou DOM4130-202. Em uma forma de realização, a identidade de sequência CDR de um ou ambos CDRs é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % respectivamente. O antagonista pode ser resistente a protease, por exemplo um ou mais da protease como nestes descritos, por exemplo sob uma série de condições como nestes descritos.
Em um aspecto, a invenção fornece um antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor anti-Interleucina-1 que tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR1 de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) e uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR2 de DOM4-130-201 ou DOM4130-202 respectivamente e uma sequência de CDR3 que é pelo menos 50 % idêntico à sequência de CDR3 de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 respectivamente. Em uma forma de realização, a identidade de sequência CDR de um ou dois ou cada um dos CDRs é em pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99 % respectivamente. O antagonista pode ser resistente a protease, por exemplo um ou mais da protease como nestes descritos, por exemplo sob uma série de condições como nestes descritos.
Em um aspecto, a invenção fornece um antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor anti-Interleucina-1 que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina que compreende a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 (por exemplo, CDR1, CDR2, CDR3, CDR1 e 2, CDR1 e 3, CDR2 e 3 ou CDR1, 2 e 3) de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 (mostrado na figura 4). O antagonista pode ser resistente a protease, por exemplo um ou mais da protease como nestes descritos, por exemplo sob uma série de 5 condições como nestes descritos.
Em um aspecto, a invenção fornece um antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor anti-Interleucina-1 que compete com DOM4-130-201 ou DOM4-130-202 para a ligação a IL-1R1. Deste modo, o antagonista pode ligar-se ao mesmo epítopo como D0M4-130-201 ou DOM4-130-202 em um 10 epítopo de sobreposição. Em uma forma de realização, o antagonista compreende um domínio variável simples de imunoglobulina tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 98 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou pelo menos 97 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4). Em uma forma de 15 realização, o percentual da identidade é em pelo menos 97,5, 98, 98,5 ou 99 %. Em uma forma de realização, o domínio variável é D0M4-130-201 ou DOM4-130-202. O antagonista pode ser resistente a protease, por exemplo um ou mais da protease como nestes descritos, por exemplo sob uma série de condições como nestes descritos. Em uma forma de realização, o antagonista 2Q é um anticorpo ou fragmento de ligação por antigeno destes, tal como um fragmento de ligação por antigeno monovalente (por exemplo, scFv, Fab, Fab’, dAb) que tem especificidade de ligação por IL-1R1. Outros antagonistas preferidos são ligandos descritos nestes que ligam-se ao IL-1R1. Os ligandos que compreendem um domínio variável simples de imunoglobulina ou 25 anticorpo de domínio (dAb) que tem a especificidade de ligação por IL-1R1, ou a complementaridade que determina as regiões de um tal dAb em um • formato adequado. Em algumas formas de realização, o ligando é um monômero dAb que consiste essencialmente de, ou consiste de, um domínio variável simples de imunoglobulina ou dAb que tem especificidade de ligação por IL-1R1. Em outras formas de realização, o ligando é um polipeptídeo que compreende um dAb (ou os CDRs de um dAb) em um formato adequado, tal como um formato de anticorpo.
Em um aspecto, a invenção fornece uma resistente um domínio variável simples de imunoglobulina anti-IL-lRl de protease que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-130-201 ou DOM4-130-202. Em uma forma de realização estes aspectos, o percentual da identidade é em pelo menos 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 %.
Em uma forma de realização, os ligandos (por exemplo, polipeptídeos, antagonistas, domínios variáveis) da invenção são formatados por ter um amplo tamanho hidrodinâmico, por exemplo, pela ligação de um grupo, por exemplo, albumina de soro, transferrina, receptor de transferrina ou pelo menos a porção de ligação de transferrina destes, uma região Fc de 15 anticorpo, ou pela conjugação a um domínio de anticorpo. Por exemplo, um monômero dAb pode ser formatado como um amplo fragmento de ligação de antigeno de um anticorpo ou como e anticorpo (por exemplo, formatado como um Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2, IgG, scFv). o tamanho hidrodinâmico de um ligando e sua vida média do soro também pode ser aumentado pela 20 conjugação ou ligação de um agente de ligação IL-1R1 (ligando; antagonista) a um domínio de ligação (por exemplo, fragmento de anticorpo ou anticorpo) que ligam-se a um antigeno ou epítopo que aumenta a vida média in vivo, como descrito neste (ver, Annex 1 de W02006038027 incorporado neste por referência em sua totalidade). Por exemplo, o agente de ligação (por exemplo, 25 polipeptídeo) pode ser conjugado ou ligado a uma anti-albumina de soro ou fragmento de anticorpo receptor Fc anti-neonatal ou anticorpo, por exemplo * um receptor anti-SA ou anti-neonatal Fc dAb, Fab, Fab’ ou scFv, ou a um aficorpo anti-SA ou aficorpo receptor anti-neonatal Fc.
Exemplos de albumina adequada, fragmentos de albumina ou variantes de albumina para o uso em um ligando de ligação IL-1R1 de acordo com a invenção são descritos em WO 2005/077042A2 e W02006038027, que são incorporados neste por referência em sua totalidade.
Em outras formas de realização da invenção descritas em toda parte desta divulgação, em vez do uso de um “dAb” em um antagonista ou ligando da invenção, é considerado que o destinatário habilitado pode usar um domínio que compreende os CDRs de um dAb que liga-se aos IL-1R1 (por exemplo, CDRs enxertados em uma armação ou esqueleto de proteína adequada, por exemplo um aficorpo, uma armação SpA, um domínio de classe A do receptor LDL ou um domínio EGF) ou pode ser um domínio de proteína que compreende um local de ligação por IL-1R1, por exemplo, em que o domínio é selecionado de um aficorpo, um domínio SpA, um domínio de classe A do receptor LDL ou um domínio EGF. A divulgação como um total será construída consequentemente para fornecer a descoberta de antagonistas, ligandos e métodos usando tais domínios no lugar de um dAb.
Os polipeptídeos, domínios variáveis simples de imunoglobulina e antagonistas da invenção podem ser resistentes a um ou mais dos seguintes: serina protease, cisteína protease, aspartato protease, tiol protease, matriz metaloprotease, carboxipeptidase (por exemplo, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B), tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, elastase, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, catepsinas (por exemplo, catepsina G), proteinase (por exemplo, proteinase 1, proteinase 2, proteinase 3), termolisina, quimiosina, enteropeptidase, caspase (por exemplo, caspase 1, caspase 2, caspase 4, caspase 5, caspase 9, caspase 12, caspase 13), calpaina, ficaina, clostripaina, actinidaina, bromelaina, e separase. Em formas de realização particulares, a protease é tripsina, elastase ou leucozima. A protease também pode ser fornecida por um extrato biológico, homogenado biológico ou preparação biológica. Se desejado, o método ainda compreende a adição de um inibidor de protease a combinação do repertório e a protease após a incubação ser completa. Em uma forma de realização, a protease é uma protease observada na expectoração, muco (por exemplo, muco gástrico, muco nasal, muco bronquial), lavagem broncoalveolar, homogenato de pulmão, extrato de pulmão, extrato pancreático, fluido gástrico, saliva ou lágrimas. Em uma forma de realização, a protease é uma observada nos olhos e/ou lágrimas. Em uma forma de realização, a protease é uma protease não bacteriana. Em uma forma de realização, a protease é um animal, por exemplo, mamífero, por exemplo, humano, protease. Em uma forma de realização, a protease é um trato GI protease ou um tecido pulmonar protease, por exemplo, um trato GI protease ou um tecido pulmonar protease observado em humanos. Tal protease listada aqui também pode ser usada nos métodos descritos nestes que envolve a exposição de um repertório de biblioteca a uma protease.
Em um aspecto, a invenção fornece uma resistente um domínio de variável simples de imunoglobulina de protease que compreende um local de ligação de receptor de Interleucina-1 Tipo 1 (IL-1R1), em que o domínio variável é resistente à protease, por exemplo tripsina, quando incubado com (i) uma concentração (c) de pelo menos 10 microgramas/ml de protease a 37° C por tempo (t) de pelo menos uma hora ou (ii) uma concentração (c’) de pelo menos 40 microgramas/ml de protease a 30° C por tempo (t) de pelo menos uma hora, em que o domínio variável compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-13 0-201 ou DOM4-130-202. Em uma forma de realização, a razão (em uma base mol /mol) de protease, por exemplo tripsina, pelo domínio variável é 8.000 a 80.000 protease:domínio variável, por exemplo quando C é 10 microgramas/ml, a razão é 800 a 80.000 protease:domínio variável ou quando C ou C’ é 100 microgramas/ml, a razão é 8.000 a 80.000 protease:domínio variável. Em uma forma de realização a razão (em um peso/peso, por exemplo, micrograma/base de micrograma) de protease (por exemplo, tripsina) pelo domínio variável é 16.000 a 160.000 protease:domínio variável por exemplo quando C é 10 microgramas/ml, a razão é 1.600 a 160.000 protease:domínio variável ou quando C ou C’ é 100 microgramas/ml, a razão é 1.6000 a 160.000 protease:domínio variável. Em uma forma de realização, a concentração (c ou c’) é pelo menos 100 ou 1000 microgramas/ml de protease. A referência é feita a descrição neste das condições adequadas pela atividade proteolítica de uma protease para o uso quando trabalhado com repertórios ou bibliotecas de peptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, parâmetros p/p). Estas condições podem ser usadas pelas condições para determinar a resistência protease de um domínio variável simples de imunoglobulina particular. Em uma forma de realização, o período (t) é ou é de cerca de um, três ou 24 horas ou durante a noite (por exemplo, cerca de 12 a 16 horas). Em uma forma de realização, o domínio variável é resistente sob condições (i) e a concentração (c) é ou é de cerca de 10 ou 100 microgramas/ml de protease e o tempo (t) é 1 hora. Em uma forma de realização, o domínio variável é resistente sob condições (ii) e a concentração (c’) é ou é de cerca de 40 microgramas/ml de protease e o tempo (t) é ou é de cerca de 3 horas. Em uma forma de realização, a protease é selecionada de tripsina, elastase, leucozima e pancreatina. Em uma forma de realização, a protease é tripsina. Em uma forma de realização, a protease é uma protease observada na expectoração, muco (por exemplo, muco gástrico, muco nasal, muco bronquial), lavagem broncoalveolar, homogenato de pulmão, extrato de pulmão, extrato pancreático, fluido gástrico, saliva ou lágrimas. Em uma forma de realização, a protease é observada nos olhos e/ou lágrimas. Em uma forma de realização, a protease é uma protease não bacteriana. Em uma forma de realização, a protease é um animal, por exemplo, mamífero, por exemplo, protease humana. Em uma forma de realização, a protease é um trato GI protease ou um tecido pulmonar protease, por exemplo, um trato GI protease ou um tecido pulmonar protease observada em humanos. Tai protease listada aqui também pode ser usada nos métodos descritos nestes que envolve a exposição de um repertório de biblioteca a uma protease.
Em uma forma de realização, o domínio variável é resistente à tripsina e/ou pelo menos uma outra protease selecionada de elastase, leucozima e pancreatina. Por exemplo, a resistência é pela tripsina e elastase; tripsina e leucozima; tripsina e pacreatina; tripsina, elastase e leucozima; tripsina, elastase e pancreatina; tripsina, elastase, pancreatina e leucozima ou tripsina, pancreatina e leucozima.
Em uma forma de realização, o domínio variável é apresentado em bacteriófago quando incubado sob condições (i) ou (ii), por exemplo em um tamanho de biblioteca de 106 a 1013, por exemplo 108 a 1012 unidades replicativas (virions infecciosos).
Em uma forma de realização, o domínio variável liga especialmente IL-1R1 seguindo a incubação sob condição (i) ou (ii), por exemplo avaliando o uso BiaCore™ ou ELISA, por exemplo ELISA de fago ou ELISA de fago monoclonal.
Em uma forma de realização, o domínio variável da invenção especialmente liga-se a proteína A ou proteína L. Em uma forma de realização, a ligação específica a proteína A ou L está presente seguindo a incubação sob condição (i) ou (ii).
Em uma forma de realização, o domínio variável da invenção pode ter uma leitura OD450 em ELISA, por exemplo ELISA de fago ou ELISA de fago monoclonal) de pelo menos 0,404, por exemplo, seguindo a incubação sob condição (i) ou (ii).
Em uma forma de realização, o domínio variável da invenção apresentam (substancialmente) um grupo simples na eletroforese em gel, por exemplo seguindo a incubação sob condição (i) ou (ii).
Em certas formas de realização, a invenção fornece um antagonista IL-1R1 que é um ligando específico duplo que compreende um primeiro dAb de acordo com a invenção que liga-se aos IL-1R1 e um segundo dAb que a mesma ou uma diferente especificidade de ligação a partir do primeiro dAb. O segundo dAb pode ligar-se a um alvo selecionados de ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofm-1, CEA, CD40, ligando CD40, CD56, CD38, CD 138, EGF, receptor EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FAPcc, ácido FGF, FGF básico, fator-10 de desenvolvimento de fiborblasto, ligando FLT3, Fractalcina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-βΙ, albumina de soro humano, insulina, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-la, IL-Ιβ, receptor IL-1, receptor IL-1 tipo 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL18 (IGIF), inibina a, inibina β, IP-10, fator-2 de desenvolvimento de queranócito (KGF-2), KGF, leptina, LIF, linfotactina, substância inibidora Muleriano, fator inibidor de colônia de monócito, proteína atraente de monócito, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-1β, MIP-3a, ΜΙΡ-3β, MIP-4, fator-1 inibidor progenitor mielóide (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, fator de desenvolvimento do nervo, β-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDFla, 8ϋΡ1β, SCF, SCGF, fator celular de haste (SCF), TARC, TGF-a, TGF-β, ΤΘΡ-β2, ΤΘΡ-β3, fator de necrose de tumor (TNF), TNF-a, TNF-β, receptor I TNF, receptor I TNFI, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, receptor 1 VEGF, receptor 2 VEGF, receptor 3 VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, albumina de soro, vWF, proteínas amielóides (por exemplo, alfa amilóide), MMP12, PDK1, IgE, IL-13Ral, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CDlla, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcERl, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimase, FGF,
Furina, endotelina-1, Eotaxinas (por exemplo, Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, 1-309, integrinas, Lselectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, neutrofil elastase, osteopontina, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TRANCE, Triptase, VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfa versos beta 6, alfa versos beta 8, cMET, CD8, vWF, proteínas amielóides (por exemplo, alfa amilóide), MMP12, PDK1, e IgE.
Em um exemplo, o ligando específico duplo compreende um primeiro dAb que liga-se ao um primeiro epítopo em IL-1R1 e um segundo dAb que liga-se ao um epítopo em um alvo diferente. Em um outro exemplo, o segundo dAb liga-se a um epítopo em albumina de soro.
Em outras formas de realização, o ligando é um ligando multiespecífico que compreende um primeiro domínio de ligação de epítopo que tem especificidade de ligação por IL-1R1 e em pelo menos outro domínio de ligação do epítopo que tem especificidade de ligação diferente do primeiro domínio de ligação do epítopo. Por exemplo, o primeiro domínio de ligação do epítopo pode ser um dAb que liga-se aos IL-1R1 ou pode ser um domínio que compreende os CDRs de um dAb que liga-se aos IL-1R1 (por exemplo, CDRs enxertados em uma armação ou esqueleto de proteína adequada, por exemplo, um aficorpo, uma armação SpA, um domínio de classe A do receptor LDL ou um domínio EGF) ou pode ser um domínio que liga-se ao IL-1R1, em que o domínio é selecionado de um aficorpo, um domínio SpA, um domínio de classe A do receptor LDL ou um domínio EGF).
Em uma forma de realização, o antagonista do IL-1R1 compreende um domínio polipeptideo que tem especificidade de ligação por IL-1R1 que liga-se ao IL-1R1 humano com a afinidade (KD) de cerca de 300 nM a cerca de 5 pM, como determinado pela ressonância de plasmon de superfície. Em uma forma de realização, o domínio variável da invenção tem a especificidade de ligação por IL-1R1 que liga-se ao IL-1R1 humano com a afinidade (KD) de cerca de 300 nM a cerca de 5 pM, como determinado pela ressonância de plasmon de superfície.
Os antagonistas, polipeptídeos e domínios variáveis que ligase ao IL-1R1 pode ligar IL-1R1 com qualquer afinidade desejada, e pode ser rapidamente identificado usando qualquer método de avaliação adequado. Os antagonistas, polipeptídeos e domínios variáveis que ligam-se ao IL-1R1 (por exemplo, dAb) geralmente ligam-se com um KD (KD=Koff (kd)/Kon (ka) como determinado pela ressonância de plasmon de superfície) de cerca de KD de 300 nM a 5 pM (isto é, 3 x 10’7 a 5 x 10’12M), preferivelmente 50 nM a 20 pM, por exemplo 5 nM a 200 pM e por exemplo 1 nM a 100 pM, por exemplo 1 x IO'7 M ou menos, por exemplo 1 x 10'8 M ou menos, por exemplo 1 x 10’9 M ou menos, por exemplo 1 x IO’10 M ou menos, por exemplo 1 x 10’11 M ou menos; e/ou uma taxa constante de Κοβ· 5 x 10'1 s’l a 1 x 10’7 s’1, por exemplo 1 x IO’2 s’l a 1 x 10’6 s’1, por exemplo 5 x 10’3 s’l a 1 x 10'5 s’1, por exemplo 5 x 10’ s’ ou menos, por exemplo 1x10’ s’ ou menos, por exemplo 1x10 s’ 1 ou menos, por exemplo 1 x 10’4 s’1 ou menos, por exemplo 1 x 10*5 s’1 ou menos, por exemplo 1 x IO’6 s'1 ou menos como determinado pela ressonância de plasmon de superfície. Certos antagonistas, polipeptídeos e domínios variáveis que liga-se ao IL-1R1, especialmente liga-se ao IL-1R1 humano com um KD de 50 nM a 20 pM, e uma taxa constante de Koff de 5x10'1 s’l a 1x10’ s’ , como determinado pela ressonância de plasmon de superfície.
Preferivelmente, os antagonistas, polipeptídeos e domínios variáveis que liga-se a ligação que inibe IL-1R1 de IL-Ία e/ou IL-Ιβ a IL1R1 com uma concentração inibidora 50 (IC50) que é < 10 μΜ, < 1 μΜ., < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 500 pM, < 300 pM, < 100 pM, ou < 10 pM. O IC5o é por exemplo determinado pelo uso em um ensaio de ligação receptor in vitro, tal como o ensaio descrito em W02006059108.
Também é preferido que os antagonistas, polipeptídeos e domínios variáveis que ligam-se ao IL-1R1 que inibe as funções induzidas por IL-Ια e/ou IL-Ιβ em um ensaio in vitro adequado com uma dosagem que neutraliza 50 (ND50) que é < 10 μΜ, < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 500 pM, < 300 pM, <100 pM, ou < 10 pM. Por exemplo, os antagonistas, polipeptídeos e domínios variáveis que ligam-se ao IL-1R1 pode inibir a liberação induzida por IL-Ια e/ou IL-Ιβ de Interleucina-8 pelas células MRC5 (N° de acessão ATCC CCL-171) em um ensaio in vitro, tal como o ensaio descrito em W02006059108. Em um outro exemplo, os polipeptídeos e domínios variáveis ligam-se ao IL-1R1 podendo inibir a liberação induzida por IL-Ια e/ou IL-Ιβ de Interleucina-6 em um ensaio sanguíneo total, tal como o ensaio descrito em WO2006059108.
Os medicamentos, domínios variáveis, polipeptídeos e antagonistas da invenção podem ser pela administração sistêmica ou local. Em algumas formas de realização, o medicamento é para a administração intraperitoneal ou subcutânea. Em outras formas de realização, o medicamento é para a administração local ao tecido pulmonar, por exemplo, o medicamento pode ser pela administração intranasal ou inalação.
Em algumas formas de realização o medicamento ou antagonista ainda compreende o antagonista do Receptor 1 de fator de necrose de tumor 1 (TNFR1, p55), ou é pela administração junto com um antagonista do receptor de fator de necrose de tumor 1 (TNFR1, p55).
Os polipeptídeos resistentes à protease, domínios variáveis simples de imunoglobulina e antagonistas da invenção tem utilidade na terapia, profilaxia e diagnose de doenças ou condições em mamíferos, por exemplo, humanos. Em particular, os peptídeos e os polipeptídeos tem utilidade como a base de medicamentos que são semelhantes aos encontrados na protease quando administrado a um paciente, tal como um humano. Por exemplo, quando administrado no trato GI (por exemplo, administrado oralmente, sublingualmente, retalmente), no qual o caso dos polipeptídeos, domínios variáveis simples de imunoglobulina e antagonistas podem ser submetidos a protease em um ou mais do trato GI superior, trato GI inferior, boca, estômago, intestino delgado e intestino grosso. Uma forma de realização, portanto, fornece uma resistente a protease de polipeptídeo, domínio variável simples de imunoglobulina ou antagonista a ser administrado oralmente, sublingualmente ou retalmente no trato GI de um paciente para tratar e/ou prevenir uma doença ou condição no paciente. Por exemplo, a administração oral a um paciente (por exemplo, um paciente humano) para o tratamento e/ou prevenção de uma condição ou doença mediada por IL-1 tal como artrite (por exemplo, artrite reumatóide), IBD, psoríase ou doença de Crohn. Em um outro exemplo, o polipeptídeo, domínio variável ou antagonista é semelhante ao encontrado na protease quando administrado (por exemplo, por inalação ou intranasalmente) ao tecido pulmonar (por exemplo, o pulmão ou vias aéreas). Uma forma de realização, portanto, fornece para a administração de um polipeptídeo resistente a protease, domínio variável simples de imunoglobulina ou antagonista a um paciente (por exemplo, a um humano) por inalação ou intranasalmente ao tecido pulmonar do paciente para tratar e/ou prevenir uma doença ou condição no paciente. Tal condição pode ser asma (por exemplo, asma alérgica), COPD, influenza ou quaisquer outras doenças ou condições pulmonares divulgadas no W02006038027, incorporado neste por referência. Os antagonistas, polipeptideos e domínios variáveis simples de imunoglobulina de acordo com a invenção podem apresentar temperaturas de fusão relativamente altas ou melhoradas (Tm), fornecendo a estabilidade intensificada. A ligação alvo de alta afinidade também pode ou altemativemente será uma característica dos antagonistas, polipeptideos e domínios variáveis. Uma ou mais destas características, combinadas com resistência a protease, fabricação de antagonistas, domínios variáveis e polipeptideos responsáveis pelo uso como medicamentos em mamíferos, tal como humanos, onde a protease é semelhante a encontrada, por exemplo pela administração do trato GI ou tecido pulmonar. Em um outro exemplo, o polipeptideo, domínio variável ou antagonista é semelhante ao encontrado na protease quando administrado (por exemplo, pela injeção intraocular ou como gotas nos olhos) no olho de um paciente. Uma forma de realização, portanto, fornece para a administração ocular de um polipeptideo resistente a protease, domínio variável simples de imunoglobulina ou antagonista a um paciente (por exemplo, a um humano) para tratar e/ou prevenir uma doença ou condição (por exemplo, uma doença ou condição do olho) no paciente. A administração deve ser administração tópica ao olho, na forma de gotículas nos olhos ou pela injeção no olho, por exemplo no humor vítreo.
Deste modo, em um aspecto, a invenção fornece o antagonista de IL-1R1 para a liberação oral. Em um aspecto, a invenção fornece o antagonista de IL-1R1 para a liberação ao trato GI de um paciente. Em um aspecto, a invenção fornece o uso do antagonista de IL-1R1 na fabricação de um medicamento para a liberação oral. Em um aspecto, a invenção fornece o uso do antagonista de IL-1R1 na fabricação de um medicamento para a liberação ao trato GI de um paciente. Em uma forma de realização, o domínio variável é resistente à tripsina e/ou pelo menos uma outra protease selecionada de elastase, leucozima e pancreatina. Por exemplo, a resistência é por tripsina e elastase; tripsina e leucozima; tripsina e pacreatina; tripsina, elastase e leucozima; tripsina, elastase e pancreatina; tripsina, elastase, pancreatina e leucozima ou tripsina, pancreatina e leucozima.
Em um aspecto, a invenção fornece o antagonista de IL-1R1 para a liberação pulmonar. Em um aspecto, a invenção fornece o antagonista de IL-1R1 para a liberação ao pulmão de um paciente. Em um aspecto, a invenção fornece o uso do antagonista de IL-1R1 na fabricação de um medicamento para a liberação pulmonar. Em um aspecto, a invenção fornece o uso do antagonista de IL-1R1 na fabricação de um medicamento para a liberação ao pulmão de um paciente. Em uma forma de realização, o domínio variável é resistente à leucozima.
Em um aspecto, a invenção fornece um método para a liberação ou liberação de um medicamento no trato GI de um paciente ou ao pulmão ou tecido pulmonar de um paciente, em que o método compreende administrar ao paciente uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um antagonista IL-1R1 da invenção.
Em um aspecto, a invenção fornece o antagonista de IL-1R1 da invenção para o tratamento e/ou profilaxia de uma condição inflamatória. Em um aspecto, a invenção fornece o uso do antagonista de IL-1R1 na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de uma condição inflamatória. Em uma forma de realização, a condição é selecionada do grupo que consiste de artrite, esclerose múltipla, doença do intestino inflamatória e doença pulmonar obstrutiva crônica. Por exemplo, a dita artrite é artrite reumatóide ou artrite reumatóide juvenil. Por exemplo, a dita doença do intestino inflamatória é selecionada do grupo que consiste de doença de Crohn e colite ulcerativa. Por exemplo, a dita doença pulmonar obstrutiva crônica é selecionada do grupo que consiste de bronquite crônica, bronquite obstrutiva crônica e enfisema. Por exemplo, a dita pneumonia é pneumonia bacteriana. Por exemplo, a dita pneumonia bacteriana é pneumonia Estafilocócica.
Em um aspecto, a invenção fornece o antagonista de IL-1R1 para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença respiratória. Em um aspecto, a invenção fornece o uso do antagonista de IL-1R1 na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença respiratória. Por exemplo, a dita doença respiratória é selecionada do grupo que consiste de inflamação do pulmão, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, pneumonia, pneumonite por hipersensibilidade, infiltrado pulmonar com eosinofilia, doença pulmonar ambiental, pneumonia, bronquiectasia, fibrose cística, doença pulmonar intersticial, hipertensão pulmonar primária, tromboembolismo pulmonar, distúrbios da pleura, distúrbios de mediastino, distúrbios de diafragma, hipoventilação, hiperventilação, apnéia do sono, síndrome da angústia respiratória aguda, mesotelioma, sarcoma, rejeição a enxerto, doença enxerto versus hospedeiro, câncer de pulmão, rinite alérgica, alergia, asbestose, aspergiloma, aspergilose, bronquiectasia, bronquite crônica, enfisema, pneumonia eosinofílica, fibrose pulmonar idiopática, doença pneumocócica invasiva, influenza, micobactéria não tuberculosa, efusão pleural, pneumoconiose, pneumocitose, pneumonia, actinomicose pulmonar, proteinose alveolar pulmonar, antraz pulmonar, edema pulmonar, êmbolo pulmonar, inflamação pulmonar, histiocitose pulmonar X, hipertensão pulmonar, nocardiose pulmonar, tuberculose pulmonar, doença venooclusiva pulmonar, doença pulmonar reumatóide, sarcoidose, e granulomatose de Wegener. Por exemplo, a doença é doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). Por exemplo, a doença é asma.
Um antagonista da invenção que compreende um agente que inibe IL-1R1 (por exemplo, em que o agente é selecionado do grupo que consiste de fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmento Fab, fragmento Fab’, fragmento Fv (por exemplo, scFv, Fv ligado por bissulfeto), fragmento F(ab’)2, dAb), ligandos e monômeros dAbs e multímeros (por exemplo, homo- ou heterodímeros) podem ser localmente administrados ao tecido pulmonar (por exemplo, pulmão) de um paciente usando qualquer método adequado. Por exemplo, um agente pode ser localmente administrado ao tecido pulmonar por intermédio de inalação ou administração intranasal. Pela administração intranasal ou inalação, o antagonista de IL-1R1 pode ser administrado usando um nebulizador, inalador, atomizador, aerolizador, misturador, inalador de pó seco, inalador de dose medida, pulverizador de dose medida, misturador de dose medida, atomizador de dose medida, ou outros inaladores adequados ou dispositivo de liberação intranasal. Deste modo, em uma forma de realização, a invenção fornece um dispositivo de liberação pulmonar contendo o antagonista de IL-1R1. Em uma forma de realização, o dispositivo é um inalador ou um dispositivo de liberação intranasal.
A invenção também diz respeito a um dispositivo de liberação de medicamento que compreende uma composição farmacêutica, antagonista, polipeptideo ou domínio variável da invenção. Por exemplo, o dispositivo de liberação de medicamento pode ser um dispositivo de liberação parenteral, dispositivo de liberação intravenoso, dispositivo de liberação intramuscular, dispositivo de liberação intraperitoneal, dispositivo de liberação transdérmico, dispositivo de liberação pulmonar, dispositivo de liberação intraarterial, dispositivo de liberação intratecal, dispositivo de liberação intraarticular, dispositivo de liberação subcutâneo, dispositivo de liberação intranasal, dispositivo de liberação vaginal, e dispositivo de liberação retal. Em formas de realização particulares o dispositivo de liberação de medicamento é selecionado do grupo que consiste de uma seringa, um dispositivo de liberação transdérmico, uma cápsula, um tablete, um nebulizador, um inalador, um atomizador, um aerolizador, um misturador, um inalador de pó seco, um inalador de dose medida, um pulverizador de dose medida, um misturador de dose medida, um atomizador de dose medida, e um cateter.
Em um aspecto, a invenção fornece uma formulação oral que compreende o antagonista de IL-1R1. A formulação pode ser um tablete, pílula, cápsula, líquido ou xarope.
Em uma forma de realização, a invenção fornece uma formulação pulmonar para a liberação ao pulmão, em que a formulação que compreende um antagonista, polipeptideo ou domínio variável da invenção com uma faixa de tamanho de partícula de menos do que 5 microns, por exemplo menos do que 4,5, 4, 3,5 ou 3 microns (por exemplo, quando no tampão Britton-Robinson, por exemplo em um pH de 6,5 a 8,0, por exemplo em um pH de 7 a 7,5, por exemplo em um pH7 ou em pH7,5).
Em uma forma de realização, as formulações e composições da invenção são fornecidas em um pH de 6.5 a 8.0, por exemplo 7 a 7.5, por exemplo 7, por exemplo 7.5.
Os domínios variáveis de acordo com qualquer aspecto da invenção pode ter uma Tm de pelo menos 50° C, ou pelo menos 55° C, ou pelo menos 60° C, ou pelo menos 65° C, ou pelo menos 70° C. Um antagonista, uso, método, dispositivo ou formulação da invenção por compreender um tal domínio variável.
Em um aspecto da invenção, os polipeptídeos, domínios variáveis, antagonistas, composições ou formulações da invenção são substancialmente estáveis após a incubação (em uma concentração de polipeptideo ou domínio variável de 1 mg/ml) a 37 a 50° C por 14 dias em tampão Britton-Robinson. Em uma forma de realização, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % do polipeptideo, antagonista ou domínio variável permanece não agregado após tal incubação em 37° C. Em uma forma de realização, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % do polipeptideo ou domínio variável permanece monomérico após tal incubação em 37° C. Em uma forma de realização, pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % do polipeptideo, antagonista ou domínio variável permanece não agregado após tal incubação em 50 graus C. Em uma forma de realização, pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % do polipeptideo ou domínio variável permanece monomérico após tal incubação em 50 graus C. Em uma forma de realização, nenhuma agregação dos polipeptídeos, domínios variáveis, antagonistas é visto após qualquer uma das tais incubações. Em uma forma de realização, o pi do polipeptideo ou domínio variável permanece não mudado ou substancialmente não mudado após a incubação a 37° C em uma concentração de polipeptídeo ou domínio variável de lmg/ml no tampão Britton-Robinson.
Em um aspecto da invenção, os polipeptídeos, domínios variáveis, antagonistas, composições ou formulações da invenção são substancialmente estáveis após a incubação (em uma concentração de polipeptídeo ou domínio variável de 100mg/ml) a 4o C por 7 dias no tampão Britton-Robinson em um pH de 7 a 7,5 (por exemplo, em pH7 ou pH7,5). Em uma forma de realização, pelo menos 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 ou 99,5 % do polipeptídeo, antagonista ou domínio variável permanece não agregado após tal incubação. Em uma forma de realização, pelo menos 95,
95.5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 ou 99,5 % do polipeptídeo ou domínio variável permanece monomérico após tal incubação. Em uma forma de realização, nenhuma agregação dos polipeptídeos, domínios variáveis, antagonistas é visto após qualquer uma das tais incubações.
Em um aspecto da invenção, os polipeptídeos, domínios variáveis, antagonistas, composições ou formulações da invenção são substancialmente estáveis após a nebulização (em uma concentração de polipeptídeo ou domínio variável de 40 mg/ml) por exemplo, em temperatura ambiente, 20 graus C ou 37° C, por 1 hora, por exemplo em um nebulizador de jato, por exemplo um copo Pari LC+. Em uma forma de realização, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97,
97.5, 98, 98,5, 99 ou 99,5 % do polipeptídeo, antagonista ou domínio variável permanece não agregado após tal nebulização. Em uma forma de realização, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96,
96.5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 ou 99,5 % do polipeptídeo ou domínio variável permanece monomérico após tal nebulização. Em uma forma de realização, nenhuma agregação dos polipeptídeos, domínios variáveis, antagonistas é visto após qualquer uma da tal nebulização.
Um domínio variável de acordo com a invenção em uma forma de realização inibe a liberação induzida por IL-1 de Interleucina-8 pelas células MRC-5 (N° de Acessão ATCC CCL-171) em um ensaio in vitro com um ND50 que é < 1 μΜ. Em uma forma de realização, o domínio variável adicionalmente ou altemativemente inibe a ligação de IL-1 a IL-1R1 com um IC50 que é < 1 μΜ. Em uma forma de realização, o domínio variável additionalmente ou altemativemente inibe a liberação induzida por IL-1 de Interleucina-6 em um ensaio e sangue total com um ND50 que é < 1 μΜ. Um antagonista, uso, método, dispositivo ou formulação da invenção pode compreender um tal domínio variável.
Os sistemas de modelos de animais que podem ser usados para avaliar a efetividade dos antagonistas de IL-1 RI na prevenção, supressão ou tratamento da inflamação do pulmão ou uma doença respiratória estão disponíveis. Por exemplo, modelos de animais adequados da doença respiratória incluem modelos de doença respiratória crônica obstrutiva (ver, Groneberg, DA et al., Respiratory Research 5:18 (2004)), e modelos de asma (ver, Coffman et al., J. Exp. Med. 207(12):1875-1879 (2001). Preferivelmente, o antagonista de IL-1 RI é eficaz em um modelo induzido pela fumaça do tabaco no camundongo da doença respiratória crônica obstrutiva (por exemplo, o modelo subcrônico divulgado neste) ou um modelo de primata adequado de asma ou doença respiratória crônica obstrutiva. Mais preferivelmente, o antagonista de IL-1 RI é eficaz em um modelo induzido pela fumaça do tabaco no camundongo da doença respiratória crônica obstrutiva (por exemplo, o modelo subcrônico divulgado neste) (ver, também, Wright and Churg, Chest, 122:301-306 (2002)). Por exemplo, a administração de uma quantidade eficaz de ligando pode reduzir, atrasar ou prevenir o início dos sintomas de COPD no modelo, como comparado com um controle adequado. Para detalhes adicionais dos ensaios e modelos para o uso na avaliação dos antagonistas e domínios variáveis da presente invenção ver W02006059108, a descoberta de que é incorporado neste por referência em sua totalidade.
Os antagonistas de IL-1R1 podem ser usados como composições separadamente administradas ou em conjunção com outros agentes. Estes podem incluir vários medicamentos, tal como inibidores de fosfodiesterase (por exemplo, inibidores de fosfodiesterase 4), bronquiodilatadores (por exemplo, beta2-agonistas, anticolinergéricos, teofilina), beta-agonistas de atuação curta (por exemplo, albuterol, salbutamol, bambuterol, fenoterol, isoeterina, isoproterenol, levalbuterol, metaproterenol, pirbuterol, terbutalina e tomlato), beta-agonistas de longa atuação (por exemplo, formoterol e salmeterol), anticolinérgicos atuação curta (por exemplo, brometo de ipratrópio e brometo de oxitrópio), anticolinérgicos atuação longa (por exemplo, tiotrópio), teofilina (por exemplo formulação de atuação curta, formulação de atuação longa), esteróides inalados (por exemplo, beclometasona, beclometasona, budesonida, flunisolida, proprionato de fluticasona e triamcinolona), esteróides orais (por exemplo, metilprednisolona, prednisolona, prednisolona e prednisona), beta-agonistas de atuação curta combinados com anticolinérgicos (por exemplo, albuterol/salbutamol/ipratópio, e fenoterol/ipratópio), beta-agonistas de longa atuação combinados com esteróides inalados (por exemplo, salmeterol/fluticasona, e formoterol/budesonida) e agentes mucomentéticos (por exemplo, erdosteína, acetilcisteína, bromeksina, carbocisteína, guiafenesina e gmentecerol iodinado), cilcosporina, antibióticos, antivirais, metotrexato, adriamicina, cisplatina, e imunotoxinas.
As composições contendo um antagonista do IL-1R1 ou um coquetel destes podem ser administradas pelos tratamentos terapêuticos e/ou profiláticos. Em certas aplicações terapêuticas, uma quantidade que é suficiente para acompanhar pelo menos inibição parcial, supressão, modulação, morte, ou alguns outros parâmetros medidos, de uma população de células selecionadas é definido como uma dosagem terapeuticamente eficaz ou dosagem “farmaceuticamente eficaz”. Por exemplo, para o tratamento da inflamação do pulmão e/ou a doença respiratória, uma quantidade que inibe a expectoração, uma quantidade que inibe a inflamação da biospia bronquial, uma quantidade que inibe a dispnéia, um volume expiratório forçado em um segundo (FEV (1)) que aumenta a quantidade, um melhoramento no estado da saúde que aumenta a quantidade, como quantificado em um questionário adequado tal como os questionário respiratório de St. George’s (por exemplo, um melhoramento na contagem de 4 pontos).
As quantidades necessárias para atingir estes efeitos dependerão da gravidade da doença e o estado geral do próprio sistema imune do paciente, mas geralmente varia de 0,005 a 10,0 mg do antagonista do IL1R1 por quilograma de peso corporal, com dosagens de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose sendo mais comumente usado.
Para as aplicações profiláticas, as composições contendo o antagonista do IL-1R1 ou coquetéis destes também podem ser administradas em dosagens levemente inferiores ou similares, para prevenir, inibir ou atrasar o início da doença (por exemplo, para sustentar a remissão ou quietude, ou para prevenir a fase aguda). O clínico habilitado será capaz de determinar o intervalo de dosagem apropriada para tratar, suprimir ou prevenir a doença. Quando um antagonista do IL-1R1 é administrado para tratar, suprimir ou prevenir a inflamação do pulmão ou a doença respiratória, pode ser administrado até quatro vezes ao dia, duas vezes semanalmente, uma vez semanalmente, uma vez a cada dois meses, uma vez ao mês, ou uma vez a cada dois meses, em uma dosagem, por exemplo, cerca de 10 pg/kg a cerca de 80 mg/kg, cerca de 100 pg/kg a cerca de 80 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 80 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 70 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 60 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 10 pg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 10 pg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 pg/kg a cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg. Em formas de realização particulares, o antagonista de IL-1R1 é administrado para tratar, suprimir ou prevenir a inflamação do pulmão ou a doença respiratória a cada dia, a cada dois dias, uma vez por semana, uma vez a cada dois meses ou uma vez ao mês em uma dosagem de cerca de 10 pg/kg a cerca de 10 mg/kg (por exemplo, cerca de 10 pg/kg, cerca de 100 pg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg). O antagonista de IL-1R1 também pode ser administrado para tratar, suprimir ou prevenir a inflamação do pulmão ou a doença respiratória em uma dosagem diária ou dosagem unitária de cerca de 10 mg, cerca de 9 mg, cerca de 8 mg, cerca de 7 mg, cerca de 6 mg, cerca de 5 mg, cerca de 4 mg, cerca de 3 mg, cerca de 2 mg ou cerca de 1 mg.
O tratamento ou terapia realizado usando o antagonista de IL1R1 descrito nestes é considerado “efetivo”, por exemplo “farmaceuticamente efetivo” se um ou mais sintomas são reduzidos (por exemplo, por pelo menos 10 % ou pelo menos um ponto em uma escala de avaliação clínica), relativo a tais sintomas presentes antes do tratamento, ou relativo a tais sintomas em um indivíduo (humano ou modelo animal) não tratado com tal composição ou outros controles adequados. Os sintomas variarão dependendo da doença ou distúrbio alvejado, mas pode ser medido por um clínico ou técnico com habilidade comum na técnica. Tais sintomas podem ser medidos, por exemplo, pelo monitoramento de um ou mais indicadores físicos da doença ou distúrbio (por exemplo, infiltrado celular no tecido do pulmão, produção de expectoração, infiltrado celular na expectoração, dispnéia, tolerância ao exercício, espirometria (por exemplo, capacidade vital forçada (FVC), volume expiratório forçado em um segundo (FEV (1), FEV (1)/FVC), taxa e gravidade da exacerbação da doença, ou por uma escala de avaliação clínica aceitável, por exemplo, o questionário respiratório de St. George’s. As escalas de avaliação clínica adequada incluem, por exemplo, a gravidade da obstrução de fluxo de ar der acordo com FEV (1) (Clinical Guideline 12, Chronic Obstructive Respiratory disease, Management of Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Adults in Primary and Secondary Care, National Institute for Clinical Excellence, London (2004)), Peak Expiratory Flow (PEF) (British Guideline on the Management of Asthma, British Thoracic Society, Scottish Intercollegiate Guidelines Network, Edição revisada (2004)), estágio COPD de acordo com o padrão da Sociedade Torácica Americana (ATS) (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152:S77-S120 (1995), asthma impairment class de acordo com o padrão ATS (Am. Rev. Respir. Dis., 147:1056-1061 (1993), ou outras escalas de avaliação clínicas aceitáveis como conhecido no campo. Uma redução sustentada (por exemplo, um dia ou mais, preferivelmente mais longos) nos sintomas da doença ou distúrbio por pelo menos 10 % ou por um ou mais pontos em uma dada escala clínica é indicativo de um tratamento “efetivo”. Similarmente, a profilaxia realizada usando uma composição como descrito neste é “eficaz” se o início ou gravidade de um ou mais sintomas é atrasado, reduzido ou abolido relativo a tais sintomas em um indivíduo similar (humano ou animal model) não tratado com a composição.
Uma composição contendo um antagonista do IL-1R1 de acordo com a presente invenção pode ser utilizada nos ajustes profiláticos e terapêuticos para ajudar na alteração, inativação, morte ou remoção de uma população de células alvos selecionadas em um mamífero. Por exemplo, tais composições podem ser usadas para reduzir os níveis de células inflamatórias no pulmão e/ou inibem a infiltração celular do pulmão.
Em um aspecto, a invenção fornece um ácido nucléico isolado ou recombinante que codifica um polipeptideo que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina de acordo com qualquer aspecto da invenção ou codifica um polipeptideo, antagonista ou domínio variável de acordo com qualquer aspecto da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece um vetor que compreende o ácido nucléico. Em um aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira que compreende o ácido nucléico ou o vetor. Em um aspecto, a invenção fornece um método de produzir polipeptideo que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina, o método que compreende a manutenção da célula hospedeira sob condições adequadas para a expressão do dito ácido nucléico ou vetor, deste modo um polipeptideo que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina é produzido. O método ainda pode compreender o isolamento do polipeptideo, domínio variável ou antagonista e opcionalmente produzir uma variante, por exemplo uma variante mutada, tendo uma afinidade melhorada e/ou ND5o do que o polipeptideo isolado, domínio variável ou antagonista. As técnicas para o melhoramento da afinidade de ligação de domínio variável simples de imunoglobulina são conhecidas na técnica, por exemplo as técnicas para a maturação por afinidade.
Em um aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina, polipeptideo ou um antagonista de qualquer aspecto da invenção e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Em uma forma de realização, o domínio variável simples de imunoglobulina ou o antagonista de qualquer aspecto da invenção compreende um domínio constante de anticorpo, por exemplo, um anticorpo Fc, optionalmente em que o terminal N do Fc é ligado (optionalmente ligado direto) ao terminal C do domínio variável.
O polipeptideo ou domínio variável da invenção pode ser isolada e/ou recombinante.
Existe nestes descritos um método para a seleção de um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease. O método compreende fornecer um repertório de peptídeos ou polipeptídeos, combinando o repertório e uma protease sob condições adequadas para a atividade de protease, e recuperação de um peptideo ou polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada (por exemplo, a ligação específica ao IL-1R1), pelo qual um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease é selecionado.
O repertório e a protease são geralmente incubados por um período de pelo menos cerca de 30 minutos. Qualquer protease desejada pode ser usado no método, tal como um ou mais dos seguintes, serina protease, cisteina protease, aspartato proteases, tiol protease, matriz metaloprotease, carboxipeptidase (por exemplo, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B), tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, elastase, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, catepsinas (por exemplo, catepsina G), proteinase (por exemplo, proteinase 1, proteinase 2, proteinase 3), termolisina, quimiosina, enteropeptidase, caspase (por exemplo, caspase 1, caspase 2, caspase 4, caspase 5, caspase 9, caspase 12, caspase 13), calpaina, ficaina, clostripaina, actinidaina, bromelaina, e separase. Em formas de realização particulares, a protease é tripsina, elastase ou leucozima. A protease também pode ser fornecida por um extrato biológico, homogenado biológico ou preparação biológica. Se desejado, o método ainda compreende a adição de um inibidor de protease a combinação do repertório e a protease após a incubação ser completa.
Em algumas formas de realização, um peptideo ou polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada é recuperado com base na atividade de ligação. Por exemplo, o peptideo ou polipeptídeo pode ser recuperado com base na ligação de um ligando genérico, tal como proteína A, proteína G ou proteína L. A atividade de ligação também pode ser uma ligação específica a um ligando alvo. Os ligandos alvos exemplares incluem ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofma-1, CEA, CD40, ligando CD40, CD56, CD38, CD138, EGF, receptor EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FAPa, ácido FGF, FGF básico, fator de desenvolvimento de fiborblasto-10, ligando FLT3, Fractalcina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-βΙ, albumina de soro humano, insulina, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1 a, IL1β, receptor IL-1, receptor IL-1 tipo 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), inibina a, inibina β, IP-10, fator de desnvolvimento de queranócito-2 (KGF-2), KGF, leptina, LIF, linfotactina, substância inibidora Muleriano, fator inibidor de colônia de monócito, proteína atraente de monócito, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-1β, MIP-3a, ΜΙΡ-3β, MIP-4, fator inibidor progenitor mielóide-1 (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, fator de desenvolvimento do nervo, β-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDFla, 8ϋΡ1β, SCF, SCGF, fator celular de haste (SCF), TARC, TGF-a, TGF-β, TGF-fi2, TGF-fi3, fator de necrose de tumor (TNF), TNF-a, TNF-β, receptor I TNF, receptor I TNFI, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, receptor VEGF 1, receptor VEGF 2, receptor VEGF 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, albumina de soro, vWF, proteínas amielóides (por exemplo, alfa amilóide), MMP12, PDK1, IgE, IL-13Ral, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CDlla, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcERl, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimase, FGF, Furina, endotelina-1, Eotaxinas (por exemplo, Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, 1-309, integrinas, selectina L, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, neutrofil elastase, osteopontina, OX
40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TRANCE, Triptase, VEGF, VLA-4, VC AM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfa versos beta 6, alfa versos beta 8, cMET, CD8, vWF, proteínas amielóides (por exemplo, alfa amilóide), MMP12, PDK1, e IgE.
Em formas de realização particulares, o peptídeo ou polipeptídeo é recuperado por extração.
Em algumas formas de realização, o repertório compreende um sistema de apresentação. Por exemplo, o sistema de apresentação pode ser apresentação de bacteriófago, apresentação de ribossomo, compartimentalização e apresentação de emulsão, apresentação de levedura, apresentação de puromicina, apresentação bacteriana, apresentação em plasmídeo, ou apresentação covalente. Os sistemas de apresentação exemplares ligam a função codificadora a um ácido nucléico e características funcionais do peptídeo ou polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico. Em formas de realização particulares, o sistema de apresentação compreende as embalagens genéticas replicáveis.
Em algumas formas de realização, o sistema de apresentação compreende a apresentação de bacteriófago. Por exemplo, o bacteriófago pode ser fd, Ml3, lambda, MS2 ou T7. Em formas de realização particulares, o sistema de apresentação bacteriófago é multivalente. Em algumas formas de realização, o peptídeo ou polipeptídeo é apresentado como uma proteína de fusão pill.
Em outras formas de realização, o método ainda compreende a amplificação do ácido nucléico que codifica um peptídeo ou polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada. Em formas de realização particulares, o ácido nucléico é amplificado pela amplificação de fago, desenvolvimento celular ou reação de cadeia de polimerase.
Em algumas formas de realização, o repertório é um repetórios dos domínios variáveis simples de imunoglobulina. Em formas de realização particulares, o domínio variável simples de imunoglobulina é um domínio variável de cadeia pesada. Em formas de realização mais particulares, o domínio variável de cadeia pesada é um domínio variável de cadeia pesada humana. Em outras formas de realização, o domínio variável simples de imunoglobulina é um domínio variável de cadeia leve. Em formas de realização particulares, o domínio variável de cadeia leve é um domínio variável de cadeia leve humana.
Em um outro aspecto, aqui é fornecido um método para a seleção de um peptídeo ou polipeptídeo que liga-se a um ligando alvo (por exemplo, IL-1R1) com alta afinidade a partir do repertório de peptídeos ou polipeptídeos. O método compreende fornecer um repertório de peptídeos ou polipeptídeos, combinando o repertório e uma protease sob condições adequadas para a atividade de protease, e recuperação de um peptídeo ou polipeptídeo que liga-se ao ligando alvo.
O repertório e a protease são geralmente incubados por um período de pelo menos cerca de 30 minutos. Qualquer protease desejada pode ser usado no método, tal como um ou mais dos seguintes, serina protease, cisteína protease, aspartato proteases, tiol protease, matriz metaloprotease, carboxipeptidase (por exemplo, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B), tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, elastase, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, catepsinas (por exemplo, catepsina G), proteinase (por exemplo, proteinase 1, proteinase 2, proteinase 3), termolisina, quimiosina, enteropeptidase, caspase (por exemplo, caspase 1, caspase 2, caspase 4, caspase 5, caspase 9, caspase 12, caspase 13), calpaina, ficaina, clostripaina, actinidaina, bromelaina e separase. Em formas de realização particulares, a protease é tripsina, elastase ou leucozima. A protease também pode ser fornecida por um extrato biológico, homogenado biológico ou preparação biológica. Se desejado, o método ainda compreende a adição de um inibidor de protease a combinação do repertório e a protease após a incubação ser completa.
O peptídeo ou polipeptídeo pode ser recuperado com base na ligação de qualquer ligando alvo desejado, tal como os ligandos alvos divulgado neste (por exemplo, IL-1R1). Em formas de realização particulares, o peptídeo ou polipeptídeo é recuperado por extração.
Em algumas formas de realização, o repertório compreende um sistema de apresentação. Por exemplo, o sistema de apresentação pode ser apresentação de bacteriófago, apresentação de ribossomo, compartimentalização e apresentação de emulsão, apresentação de levedura, apresentação de puromicina, apresentação bacteriana, apresentação em plasmídeo, ou apresentação covalente. O sistema de apresentação exemplar liga a função codificadora a ácido nucléico e características funcionais do peptídeo ou polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico. Em formas de realização particulares, o sistema de apresentação compreende embalagens genéticas replicáveis.
Em algumas formas de realização, o sistema de apresentação compreende apresentação de bacteriófago. Por exemplo, o bacteriófago pode ser fd, M13, lambda, MS2 ou T7. Em formas de realização particulares, o sistema de apresentação bacteriófago é multivalente. Em algumas formas de realização, o peptídeo ou polipeptídeo é apresentado como uma pill proteína de fusão.
Em outras formas de realização, o método ainda compreende a amplificação do ácido nucléico que codifica um peptídeo ou polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada. Em formas de realização particulares, o ácido nucléico é amplificado pela amplificação de fago, desenvolvimento celular ou reação de cadeia de polimerase.
Em algumas formas de realização, o repertório é um repetório dos domínios variáveis simples de imunoglobulina. Em formas de realização particulares, o domínio variável simples de imunoglobulina é um domínio variável de cadeia pesada. Em formas de realização mais particulares, o domínio variável de cadeia pesada é um domínio variável de cadeia pesada humana. Em outras formas de realização, o domínio variável simples de imunoglobulina é um domínio variável de cadeia leve. Em formas de realização particulares, o domínio variável de cadeia leve é um domínio variável de cadeia leve humana.
Em um outro aspecto, existe nestes descritos um método de produção de um repertório de peptídeos ou polipeptideos resistentes a protease. O método compreende fornecer um repertório de peptídeos ou polipeptideos, que combinam o repertório de peptídeos ou polipeptideos e a protease sob condições adequadas para a atividade de protease e recuperação de uma pluralidade de peptídeos ou polipeptideos que tem uma atividade biológica desejada, pelo qual um repertório de peptídeos ou polipeptideos resistentes a protease é produzido.
Em algumas formas de realização, o repertório e a protease são incubados por um período de pelo menos cerca de 30 minutos. Por exemplo, a protease usada no método pode ser um ou mais dos seguintes, serina protease, cisteina protease, aspartato proteases, tiol protease, matriz metaloprotease, carboxipeptidase (por exemplo, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B), tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, elastase, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, catepsinas (por exemplo, catepsina G), proteinase (por exemplo, proteinase 1, proteinase 2, proteinase 3), termolisina, quimiosina, enteropeptidase, caspase (por exemplo, caspase 1, caspase 2, caspase 4, caspase 5, caspase 9, caspase 12, caspase 13), calpaina, ficaina, clostripaina, actinidaina, bromelaina e separase. Em formas de realização particulares, a protease é tripsina, elastase ou leucozima. A protease também pode ser fornecida por um extrato biológico, homogenado biológico ou preparação biológica. Se desejado, o método ainda compreende a adição de um inibidor de protease a combinação do repertório e a protease após a incubação ser completa.
Em algumas formas de realização, uma pluralidade de peptídeos ou polipeptídeos que tem uma atividade biológica desejada é recuperada com base em uma atividade de ligação. Por exemplo, uma pluralidade de peptídeos ou polipeptídeos pode ser recuperada com base na ligação de um ligando genérico, tal como proteína A, proteína G ou proteína L. A atividade de ligação também pode ser a ligação específica a um ligando alvo, tal como um ligando alvo descrito nestes. Em formas de realização particulares, uma pluralidade de peptídeos ou polipeptídeos que tem a atividade biológica desejada é recuperada por extração.
Em algumas formas de realização, o repertório compreende um sistema de apresentação. Por exemplo, o sistema de apresentação pode ser apresentação de bacteriófago, apresentação de ribossomo, compartimentalização e apresentação de emulsão, apresentação de levedura, apresentação de puromicina, apresentação bacteriana, apresentação em plasmídeo, ou apresentação covalente. Em formas de realização particulares, o sistema de apresentação liga-se a função codificadora de um ácido nucléico e características funcionais do peptideo ou polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico. Em formas de realização particulares, o sistema de apresentação compreende embalagens genéticas replicáveis.
Em algumas formas de realização, o sistema de apresentação compreende apresentação de bacteriófago. Por exemplo, o bacteriófago pode ser fd, M13, lambda, MS2 ou T7. Em formas de realização particulares, o sistema de apresentação bacteriófago é multivalente. Em algumas formas de realização, o peptideo ou polipeptídeo é apresentado como uma proteína de fusão pill.
Em outras formas de realização, o método ainda compreende a amplificação do ácido nucléico que codifica uma pluralidade de peptídeos ou polipeptídeos que tem uma atividade biológica desejada. Em formas de realização particulares, o ácido nucléico é amplificado pela amplificação de fago, desenvolvimento celular ou reação de cadeia de polimerase.
Em algumas formas de realização, o repertório é um repetórios dos domínios variáveis simples de imunoglobulina. Em formas de realização particulares, o domínio variável simples de imunoglobulina é um domínio variável de cadeia pesada. Em formas de realização mais particulares, o domínio variável de cadeia pesada é um domínio variável de cadeia pesada humana. Em outras formas de realização, o domínio variável simples de imunoglobulina é um domínio variável de cadeia leve. Em formas de realização particulares, o domínio variável de cadeia leve é um domínio variável de cadeia leve humana.
Em um outro aspecto, existe nestes descritos um método para a seleção de um polipeptídeo resistente a protease que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina (dAb) que ligam-se aos um ligando alvo (por exemplo, IL-1R1) a partir de um repertório. Em uma forma de realização, o método compreende fornecer um sistema de apresentação de fago que compreende um repertório de polipeptídeos que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina, combinando o sistema de apresentação de fago e a protease selecionada do grupo que consiste de elastase, leucozima e tripsina, sob condições adequadas para a atividade de protease e recuperação de um fago que apresenta um polipeptídeo que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina que liga-se ao ligando alvo.
Em algumas formas de realização, a protease é usada a 100 pg/ml e o sistema de apresentação de fago combinado e protease são incubados a cerca de 37° C durante a noite.
Em algumas formas de realização, o fago que apresenta um polipeptídeo que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina que liga ao ligando alvo é recuperado pela ligação do dito alvo. Em outras formas de realização, o fago que apresenta um polipeptídeo que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina que liga ao ligando alvo é recuperado por extração.
Aqui também é descrito um peptideo resistente a protease isolada ou polipeptídeo selecionável ou selecionado pelos métodos descritos nestes. Em uma forma de realização particular, aqui é fornecido uma domínio variável simples de imunoglobulina resistente a protease isolada (por exemplo, tripsina, elastase, leucozima) (por exemplo, domínio variável de cadeia pesada de anticorpo humano, domínio variável de cadeia leve de anticorpo humano) selecionável ou selecionado pelos métodos descritos nestes.
Ainda são descritos nestes um ácido nucléico isolado ou recombinante que codifica um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease (por exemplo, domínio variável simples de imunoglobulina resistente a tripsina, elastase, ou leucozima) selecionável ou selecionado pelos métodos descritos nestes e por vetores (por exemplo, vetores de expressão) e células hospedeiras que compreendem o ácido nucléico.
Ainda são descritos nestes um método para a fabricação de um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease (por exemplo, domínio variável simples de imunoglobulina resistente a tripsina, elastase, ou leucozima) selecionável ou selecionado pelos métodos descritos nestes, que compreende a manutenção de uma célula hospedeira que contém um ácido nucléico recombinante que codifica um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease sob condições adequadas para a expressão, pelo qual um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease é produzido.
Ainda são descritos nestes um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease (por exemplo, domínio variável simples de imunoglobulina resistente a tripsina, elastase, ou leucozima) selecionável ou selecionado pelos métodos descritos nestes para o uso na medicina (por exemplo, para a terapia ou dignose). Ainda são descritos nestes o uso de um peptídeo ou polipeptideo resistente a protease (por exemplo, domínio variável simples de imunoglobulina resistente a tripsina, elastase, ou leucozima) selecionável ou selecionado pelos métodos descritos nestes pela fabricação de um medicamento para o tratamento da doença. Ainda são descritos nestes um método de tratamento de uma doença, que compreende a administração a um paciente em necessidade destes, uma quantidade eficaz de um peptídeo ou polipeptideo resistente a protease (por exemplo, domínio variável simples de imunoglobulina resistente a tripsina, elastase, ou leucozima) selecionável ou selecionado pelos métodos descritos nestes.
Ainda são descritos nestes um kit diagnóstico para determinar se IL-1R1 está presente em uma amostra ou quanto IL-1R1 está presente em uma amostra, que compreende um polipeptideo, dAb ou antagonista da invenção e instruções para o uso (por exemplo, para determinar a presença e/ou quantidade de IL-1R1 na amostra). Em algumas formas de realização, o kit ainda compreende um ou mais reagentes ancilares, tal como um tampão adequado ou reagente de detecção adequado (por exemplo, um anticorpo detectavelmente rotulado ou fragmento de ligação por antígeno destes que liga o polipeptideo ou dAb da invenção ou uma porção associada ou conjugada destes.
A invenção também diz respeito a um dispositivo que compreende uma superfície sólida em que um polipeptideo ou dAb da invenção é imobilizado tal que o polipeptideo imobilizado ou dAb liga-se ao IL-1R1. Quaisquer superfícies sólidas adequadas em que um anticorpo ou fragmento de ligação por antígeno destes pode ser imobilizado pode ser usado, por exemplo, vidro, plásticos, carboidratos (por exemplo, pérolas de agarose). Se desejado o suporte pode conter ou ser modificado por conter os grupos funcionais desejados para facilitar a imobilização. O dispositivo e ou suporte, pode ter qualquer forma adequada, por exemplo, uma chapa, bastão, faixa, placa, lâmina, pérola, grânulo, disco, gel, tubo, esfera, fragmento, placa ou prato e outros. Em algumas formas de realização, o dispositivo é uma sonda.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A FIG. 1 é uma ilustração do local de clonagem múltipla de pDOM13 (aka pDOM33), que foi usado para preparar um repertório de apresentação de fago.
A FIG. 2 mostra diversos Novex 10-20 % de géis de Triceno realizados com amostras de diferentes períodos de tempos de dAbs que foram incubados com tripsina a 40 ug/ml a 30° C. As amostras foram retiradas imediatamente antes da adição de tripsina e então em uma hora, três horas e 24 horas após a adição de tripsina. As proteínas foram tingidas com lx SureBlue. Os géis ilustram que tanto DOM 15-10 quanto DOM 15-26-501 foram significantemente digeridos durante o primeiro de três horas de incubação com tripsina. A digestão de DOM 15-26, DOM4-130-54 e DOMlh131-511 apenas tomar-se aparente após 24 horas de incubação com tripsina.
A FIG. 3 é uma ilustração de uma sequência de aminoácidos de DOMlh-131-511 e 24 variantes selecionadas. Os aminoácidos que diferem a partir da sequência parente nos clones selecionados são iluminados (aqueles que são idênticos são marcados por pontos). Os arcos correspondem ao CDR1, CDR2 e CDR3 são contornados com caixas.
A FIG. 4 é uma ilustração de uma sequência de aminoácidos de DOM4-130-54 e 27 variantes selecionadas. Os aminoácidos que diferem a partir da sequência parente nos clones selecionados são iluminados (aqueles que são idênticos são marcados por pontos). Os arcos correspondem ao CDR1, CDR2 e CDR3 são contornados com caixas.
A FIG. 5 é uma ilustração de uma sequência de aminoácido de DOM15-26-555 e 21 variantes selecionadas. Os aminoácidos que diferem a partir da sequência parente nos clones selecionados são iluminados (aqueles que são idênticos são marcados por pontos). Os arcos correspondem ao CDR1, CDR2 e CDR3 são contornados com caixas.
A FIG. 6 é uma ilustração de uma sequência de aminoácido de DOM15-10 e 16 variantes selecionadas. Os aminoácidos que diferem a partir da sequência parente nos clones selecionados são iluminados (aqueles que são idênticos são marcados por pontos). Os arcos correspondem ao CDR1, CDR2 e CDR3 são contornados com caixas.
As FIGS. 7A-7D são traços BIAcore que mostram a ligação de um dAb parente, DOMlh-131-511 (FIG. 7A) e três variantes dAbs, DOMlh131-203 (FIG. 7B), DOMlh-131-204 (FIG. 7C) e DOMIh-131-206 (FIG. 7D), pelos TNFR1 imobilizado após a incubação com diferentes concentrações de tripsina (variação de 0 a 100 pg/ml) durante a noite a 37° C. Os resultados mostram que todas as três variantess são mais resistentes do que origem por proteomentese em altas concentrações de tripsina (100 ug/ml).
As FIGS. 8A-8C são traços BIAcore que mostram a ligação de dAbs DOMlh-131-511 (FIG. 8A), DOMlh-131-202 (FIG. 8B) e DOMlh131-206 (FIG. 8C) pelo TNFR1 imobilizado após a incubação com elastase e leucozima durante a noite. Os dAbs mostraram a resistência aumentada pela proteomentese em comparação à origem contra tanto elastase quanto leucozima.
A FIG. 9 mostra dois 4-12 % de géis de Novex Bis-Tris realizados com amostras de dAbs DOMlh-131-511, DOMlh-131-203, DOMlh-131-204, DOMlh-131-206, DOMlh-131-54, DOMlh-131-201 e DOMlh-131-202 antes da incubação com tripsina e amostras após a incubação com 100 pg/ml de tripsina por 1 hora, 3 horas e 24 horas.
As FIGS. 10A-10C são traços BIAcore que mostram a ligação de DOM4-130-54 (FIG. 10A), DOM4-130-201 (FIG. 10B) e DOM4-130-202 (FIG. 10C) a proteína de fusão de IL-1R1 imobilizado após a incubação com diferentes concentrações de tripsina (variação de 0 a 100 pg/ml) durante a noite a 37° C. Os resultados mostram que ambas as variantes são mais resistentes do que sua origem pela proteomentese em altas concentrações de tripsina (100 pg/ml).
As FIGS. 11 A-l 1C são traços BIAcore que mostram a ligação de DOM4-130-54 (FIG. 11A), DOM4-130-201 (FIG. 11B) e DOM4-130-202 (FIG. 11C) a proteína de fusão IL-1R1 imobilizada após a incubação com elastase e leucozima durante a noite. Os dAbs mostraram a resistência aumentada pela proteomentese em comparação a origem contra ambas proteases testadas.
A FIG. 12 é uma ilustração de uma sequência de aminoácido de DOM15-26-555 e 6 variantes. Os aminoácidos que diferem a partir da sequência parente nos clones selecionados são iluminados (aqueles que são idênticos são marcados por pontos).
As FIGS. 13A e 13B são traços BIAcore que mostram a ligação do dAb parente, DOM15-26-555 (FIG. 13A) e mais resistente a protease, DOMI 5-26-593 (FIG. 13B) ao VEGF imobilizado. A origem e a variante foram comparadas em BIAcore pela ligação hVEGF na concentração de dAb de 100 nM após a incubação com tripsina em uma concentração de 200 pg/ml. A reação foi realizada por três horas ou 24 horas a 37° C. Os resultados mostram que a variante é mais resistente do que origem por proteomentese após 24 horas de tratamento de tripsina.
A FIG. 14 é um gráfico que mostra os efeitos de tratamento de tripsina na ligação hVEGF pelas variantes DOM15-26-555. Os resultados claramente mostram que todas as variantes são mais resistentes do que a origem (DOM 15-26-555) pela proteomentese após 24 horas de tratamento de tripsina.
A FIG. 15 mostra dois Novex 10-20 % de géis de Tricino que foram carregados com 15 pg de amostras tratadas e não tratadas de DOM 1548
26-555 ou DOMI 5-26-593. As amostras foram retiradas imediatamente antes da adição de tripsina e então em uma hora, três horas e 24 horas após a adição de tripsina. As proteínas foram tingidas com Ix SureBlue. Os géis ilustram que o perfil de resistência a tripsina de DOM15-26-593 variou do perfil mostrado pelo experimento BIAcore.
A FIG. 16 é uma ilustração de uma sequência de aminoácido de DOM15-10 e uma variante, DOM 15-10-11. Os aminoácidos que diferem a partir da sequência parente na variante são iluminados (aqueles que são idênticos são marcados por pontos).
As FIGS. 17A e 17B são traços BIAcore que mostram a ligação da origem, DOM15-10 (FIG. 17A) e a variante, DOM15-10-11 (FIG. 17B), ao VEGF imobilizado. A origem e a variante foram comparadas em BIAcore pela ligação hVEGF na concentração de dAb de 100 nM após a incubação com tripsina em uma concentração de 200 pg/ml. A reação foi realizada por uma hora, três horas e 24 horas a 37° C. Os resultados mostram que a variante é mais resistente do que origem por proteomentese após 24 horas de tratamento de tripsina.
A FIG. 18 mostra dois Novex 10-20 % de géis de triceno que foram carregados com 15 pg das amostras de DOM15-10 e DOM 15-10-11. As amostras foram retiradas imediatamente antes da adição de tripsina e então em uma hora, três horas e 24 horas após a adição de tripsina. As proteínas foram tingidas com SureBlue (Ix). Os resultados mostram que a atividade de ligação vista no estudo BIAcore diretamente reflete a integridade das proteínas.
As FIGS. 19A-19L ilustram uma sequência de nucleotídeos de diversos ácidos nucléicos que codificam dAbs que são as variantes de DOMlh-131-511 ou DOM4-130-54. A sequência de nucleotídeos codifica uma sequência de aminoácidos apresentada na FIG. 3 e FIG. 4, respectivamente.
As FIGS. 20A-20E ilustram uma sequência de nucleotídeos de diversos ácidos nucléicos que codificam dAbs que são variantes de DOM1526-555 ou DOM15-10. A sequência de nucleotídeos codifica uma sequência de aminoácidos apresentada na FIG. 5 e FIG. 6, respectivamente.
A FIG. 21 mostra um mapa de vetor de pDOM 38.
A FIG. 22: mostra um Gel que realiza em um Labchip de proteínas DOM10-53-474 e D0M15-26-593 tratadas com tripsina a razão 25:1 dAb:tripsina em 30° C pelos períodos de tempos diferentes. As setas mostram compirmento total da proteína.
A Fig. 23: E um traço de cromatografia de exclusão de tamanho que mostra o alto nível de pureza obtida para cada amostra após a purificação por cromatografia MMC seguido pela troca de ânion. O UV foi monitorado a 225 nm e a coluna foi realizada em lx PBS com 10 % de etanol (v/v). O monômero de porcentagem foi calculado pela integração da área de pico com correção na linha de base.
A Fig. 24: Mostra os dados de estabilidade de protease por DOMlh-131-511, DOMlh-131-202 e DOMlh-131-206.
A Fig. 25: é um SEC que ilustra 14 dias de dados de estabilidade de DOMlh-131-202, DOMlh-131-206 e DOMlh-131-511 no tampão Britton-Robinson a 37 e 50° C. A concentração de proteína para todos os dAbs foi de lmg/ml. O SEC foi usado para determinar se qualquer mudança tem ocorrido na proteína durante a tensão térmica e uma quantidade de monômero deixado na solução relativa no período da amostra =0 (T0).
As Figs. 26 A a I: mostram os traços SEC que mostram o efeito da tensão térmica (37 e 50° C) em DOMlh-131-511 (A a C), -202 (D a F) e -206 (G a I). Também mostrado é a porcentagem do monômero deixado em uma solução relativa ao T=0 em um dado período de tempo.
A Fig. 27: Mostra análise IEF de DOMlh-131-202, DOMlh131-206 e DOMlh-131-511 a 24 horas, 48 horas e 7 e 14 dias de tensão térmica. As amostras tem sido incubadas a 37 ou 50° C no tampão BrittonRobinson.
A Fig. 28: TNFR-1 RBA que mostra o efeito de 14 dias de incubação de DOMlh-131-202, DOMlh-131-206 e DOMlh-131-511 a 50°
C. A concentração de proteína foi assumida ser lmg/ml. Um controle negativo dAb (VH silencioso) que não liga o antígeno é também mostrado.
A Fig. 29: ilustra os efeitos de armazenagem A: DOMlh-131202, B: DOMlh-131-206 e C: DOMlh-131-511 a -100 mg/ml por 7 dias no tampão Britton-Robinson a +4 °C. O UV foi monitorado a 280 nm.
A Fig. 30: Mostra os dados de teste de nebulisador de DOMlh-131-202, DOMlh-131-206 e DOMlh-131-511 no fluxo E Pari e LC+. A concentração de proteína foi de 5mg/ml no tampão Britton-Robinson.
A Fig. 31: ilustra as mudanças da porcentagem relativa em concentrações de monômeros durante a nebulização de DOMlh-131-202, DOMlh-131-206 e DOMlh-131-511 no tampão Britton-Robinson a 5 mg/ml.
A Fig. 32: Mostra os traços SEC de DOMlh-131-206 e DOMlh-131-511 no tampão Britton-Robinson pós-nebulização de Pari LC+.
A Fig. 33: Mostra os traços SEC de DOMlh-131-206 durante o processo de nebulização em 1 hora a 40mg/ml em PBS. A proteína tanto do copo do nebulizador quanto do aerossol são altamente resistentes aos efeitos de corte e tensão térmica que podem ser experimentados pelo dAb durante a nebulização.
A Fig. 34: Mostra as curvas de velocidade de sedimentação para cada uma das três proteínas de chumbo (DOMlh-131-206 e DOMlh131-511 e DOMlh-131-202). O pico bimodal observado pela amostra de concentração inferior de de DOMlh-131-206 é um artefato devido a fenda da amostra a partir da célula neste exemplo.
A Fig. 35: Mostra o efeito do tampão e dispositivo em tamanho de gotas nebulisadas de GSK 1995056A (DOMlh-131-511).
A Fig. 36: estabilidade de GSK1995056A (DOMlh-131-511) após a nebulização em vários dispositivos avaliados pela formação de dímero como medido por SEC.
A Fig. 37: Mostra o teste do nebulisador de GSK1922567A (202), GSK1995057A (206) e GSK1995056A (511) no fluxo E Pari e LC+. A) teste no tampão Britton-Robinson, B) teste no tampão PEGlOOO/sacarose.
A Fig. 38: Descreve uma curva de dosagem TNF-oc no ensaio de ligação do receptor TNFR1 humano. Cada amostra foi testada por quatro cópias.
A Fig. 39: Mostra a inibição por GSK1922567A(DOMlh-131202), GSK1995057A (DOMlh-131-206) e GSK1995056A (DOMlh-131511) no ensaio de ligação do receptor TNFRI humano. Cada amostra foi testada como quatro cópias.
A Fig. 40: ilustra a potência de DOM15-26 e DOM15-26-593 dAbs no VEGF RBA.
A Fig. 41: Mostra farmacocinéticos de DMS1529 (DOM 1526-593) e DMS1545 (DOM15-26-501) após a administração da dosagem i.v. de bolo simples aos ratos a 5 mg/mg
A Fig. 42 a: Mostra análise de fusão SEC-MALLs (cromatografia de exclusão de tamanho de multiângulo de dispersão de luz de laser) DMS1529 Fc (fusão DOM 15-26-593 Fc) que confirma as propriedades monoméricas. Duas bateladas diferentes são mostradas demonstrando as propriedades similares com relação ao índice refrativo (isto é concentrações, linhas quebradas) e dispersão de luz (linhas sólidas). A linha marcada com as setas significa o cálculo de massa molecular.
A Fig. 42b: Mostra a análise AUC (analiticamente ultracentrifugação) da fusão DMS1529 Fc (fusão DOM 15-26-593 Fc) que confirma as propriedades monoméricas. Uma batelada do material foi testada em três concentrações diferentes, aproximando a 0,2, 0,5 & 1,0 mg/ml no tampão PBS. A análise da taxa de sedimentação confirmou a massa molecular de aproximadamente 80kDa.
A Fig. 43: Mostra os traços DSC de DMS1529 (DOMI 5-26593) e DOMI 5-26-501.
A Fig. 44: é uma ligação VEGF ELISA por DMS1529 (DOM 15-26-593) antes e depois, 10 ciclos de congelamento-esfriamento em duas bateladas diferentes de materiais.
A Fig. 45: Mostra a consistência de perfil DOM 15-26-593 SEC antes e depois 10 ciclo de congelamento-esfriamento.
A Fig. 46: ilustra os resultados a partir de um estudo de estabilidade acelerada da fusão DMS1529 (fusão DOM 15-26-593 Fc); ligação ELISA que demonstra a atividade após 7 dias de incubação na temperatura mostrada.
A Fig. 47A: Mostra a estabilidade de DMS1529 (DOM 15-26593) em cinomólogo humano após 14 & 15 dias de incubação a 37° C.
A Fig. 47B: Mostra a estabilidade de DMS1529 (DOM 15-26593) no soro humano após 14 & 15 dias de incubação a 37° C.
A Fig. 48: Mostra a potência de DOM15-26 & DOM15-26593 dAbs como fusões Fc (DMS1564 & 1529 respectivamente) no VEGF RBA.
A Fig. 49: ilustra a inibição da proliferação celular HUVEC pela fusão DMS1529 (fusão DOM15-26-593 FC).
A Figure 50: mapa do vetor pDom33.
A Fig. 51: descreve as seqüências (aminoácidos e nucleotídeos) de dAbs que ligam-se a albumina de soro.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Dentro desta eespecíficoação a invenção foi descrita, com referências as formas de realização, em uma maneira que capacita uma eespecíficoação breve e clara a ser escrita. E pretendido e deve ser apreciado que as formas de realização podem ser variavelmente combinadas ou separadas sem a divisão da invenção.
A não ser de outra maneira definida, todas as técnicas e termos específicos usados neste tem o mesmo significado como comumente endendido por aquela pessoa comum habilitada na técnica (por exemplo, na cultura celular, genéticos moleculares, química de ácido nucléico, técnicas de hibridização e bioquímica). As técnicas padrões são usadas para os métodos bioquímicos, genéticos e moleculares (ver geralmente, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2o ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4° Ed, John Wiley & Sons, Inc. que são incorporados neste por referência) e métodos químicos.
Como usado neste, “Tipo 1 de receptor de interleucina 1” (IL1R1; CD121a) refere-se a proteínas IL-1R1 de mamífero endogéno ou de ocorrência natural e as proteínas tendo uma sequência de aminoácido que tem o mesmo como que de uma proteína de IL-1R1 de mamífero correspondente endógeno ou de ocorrência natural (por exemplo, proteínas recombinantes, proteínas sintéticas (isto é, produzindo usando os métodos de química orgânica sintética)). Consequentemente, como definido neste, o termo inclui proteína madura, variantes polifórmicas ou alélicas e outros isoformos de um IL-1R1 (por exemplo, produzidos pela união alternativa ou outros processos celulares) e formas modificadas ou não modificadas do precedente (por exemplo, lipidado, glicosilado). O IL-1R1 endógeno ou de ocorrência natural inclui as proteínas de tipo selvagem tal como IL-1R1 maduras, variantes polifórmicas ou alélicas e outros isoformos que ocorrem naturalmente em mamíferos (por exemplo, humanos, primatas não humanos). Tais proteínas podem ser recuperadas ou isoladas a partir de uma fonte que produz naturalmente IL-1R1, por exemplo. Estas proteínas e proteínas IL-1R1 tendo a mesma sequência de aminoácido como um IL-1R1 endógeno ou de ocorrência natural correspondente, são referidos pelo nome do mamífero correspondente. Por exemplo, onde o mamífero correspondente é um humano, a proteína é projetada como um humano IL-1R1.
Como usado neste, “antagonista de Tipo 1 de receptor de interleucina 1 (IL-1R1)” refere-se a qualquer composto (por exemplo, polipeptideo) que pode ser administrado a um indivíduo para produzir um efeito diagnóstico ou terapêutico benéfico através da ligação ao IL-1R1 e inibição de uma função de IL-1R1 no indivíduo (por exemplo, inibe a ligação de IL-la e/ou IL-Ιβ a IL-1R1, inibie a sinalização através de IL-1R1 na ligação de IL-Ια e/ou IL-Ιβ).
Como usado neste, “peptídeo” refere-se a cerca de dois a cerca de 50 aminoácidos que são unidos juntos por intermédio de ligações de peptídeos.
Como usado neste, “polipeptideo” refere-se a pelo menos cerca de 50 aminoácidos que são unidos juntos pelas ligações de peptídeos. Os polipeptídeos geralmente que compreendem a estrutura terciária e dobra em domínios funcionais.
Como usado neste, um peptídeo ou polipeptideo (por exemplo, um anticorpo de domínio (dAb)) que é “resistente a degradação a protease” não é substancialmente degradado pela protease quando incubado com a protease sob condições adequadas para a atividade de protease. Um polipeptideo (por exemplo, a dAb) não é substancialmente degradado quando não mais do que cerca de 25 %, não mais do que cerca de 20 %, não mais do que cerca de 15 %, não mais do que cerca de 14 %, não mais do que cerca de 13 %, não mais do que cerca de 12 %, não mais do que cerca de 11 %, não mais do que cerca de 10 %, não mais do que cerca de 9 %, não mais do que cerca de 8 %, não mais do que cerca de 7 %, não mais do que cerca de 6 %, não mais do que cerca de 5 %, não mais do que cerca de 4 %, não mais do que cerca de 3 %, não mais do que cerca de 2 %, não mais do que cerca de 1 %, ou substancialmente nenhuma das proteínas é degradado pela protease após a incubação com a protease por cerca de uma hora em uma temperatura adequada para a atividade de protease. Por exemplo a 37 ou 50 graus C. A degradação da prorteína pode ser avaliada usando qualquer método adequado, por exemplo, por SDS-PAGE ou pelo ensaio funcional (por exemplo, ligação do ligando) como descrito neste.
Como usado neste, “sistema de apresentação” refere-se a um sistema em que uma coleção de polipeptídeos ou peptídeos são acessíveis pela seleção com base nas características desejadas, tal como uma característica funcional, química ou física. O sistema de apresentação pode ser um repertório adequado de polipeptídeos ou peptídeos (por exemplo, em uma solução, imobilizado em um suporte adequado). O sistema de apresentação também pode ser um sistema que utiliza um sistema de expressão celular (por exemplo, expressão de uma biblioteca de ácidos nucléicos em, por exemplo, células transdutoras, transfectadas, infectadas ou transformadas e apresentação dos polipeptídeos codificados na superficie das células) ou um sistema de expressão celular (por exemplo, compartimentalização e apresentação de emulsão). O sistema de apresentação exemplar liga a função codificadora de um ácido nucléico e características funcionais químicas e/ou físicas de um polipeptídeo ou peptideo codificado pelo ácido nucléico. Quando um tal sistema de apresentação é utilizado, polipeptídeos ou peptídeos que tem uma característica funcional, química e/ou física pode ser selecionado e um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo ou peptideo selecionado pode ser rapidamente isolado ou recuperado. Um número de sistema de apresentação que liga a função codificadora de um ácido nucléico e características funcionais químicas e/ou físicas de um polipeptídeo ou peptideo são conhecidas na técnica, por exemplo, apresentação de bacteriófago (apresentação de fago, por exemplo apresentação de fagomídeo), apresentação de ribossomo, compartimentalização e apresentação de emulsão, apresentação de levedura, apresentação de puromicina, apresentação bacteriana, apresentação em plasmídeo, apresentação covalente e outros, (ver, por exemplo, EP 0436597 (Dyax), Patente U.S. N°. 6.172.197 (McCafferty et al.), Patente U.S. N°. 6.489.103 (Griffiths etal.).)
Como usado neste, “repertório” refere-se a uma coleção de polipeptídeos ou peptídeos que são caracterizados pela sequência de diversidade de aminoácido. Os membros individuais de um repertório pode ter características comuns, tal como características estruturais comuns (por exemplo, uma estrutura de núcleo comum) e/ou características funcionais comuns (por exemplo, capacidade de ligar-se a um ligando comum (por exemplo, um ligando genérico ou um ligando alvo, IL-1R1)).
Como usado neste, “funcional” descreve um polipeptídeo ou peptideo que tem a atividade biológica, tal como atividade de ligação específica. Por exemplo, o termo “polipeptídeo funcional” inclui um anticorpo ou fragmento de ligação por antigeno destes que liga-se a um antigeno alvo através de seu local de ligação por antigeno.
Como usado neste, “ligando genérico” refere-se a um ligando que liga-se a uma porção substancial (por exemplo, substancialmente todas) dos membros funcionais de um dado repertório. Um ligando genérico (por exemplo, um ligando genérico comum) pode ligar qualquer membro de um dado repertório ainda através dos membros não pode ter a especificidade de ligação para um alvo ligando comum. Em geral, a presença de um local de ligação genérico de ligando funcional em um polipeptídeo (como indicado pela capacidade para ligar-se a um ligando genérico) indica que o polipeptídeo é corretamente dobrado e funcional. Exemplos adequados de ligando genéricos incluem super antígenos, anticorpos que ligam-se ao epítopo expressado em uma porção substancial de membros funcionais de um repertório e outros.
O “super antigeno” é um termo da técnica que refere-se a um ligando genérico que interage com os membros da superfamília de imunoglobulina em um local que é distinto a partir dos locais de ligação do alvo ligando destas proteínas. As enterotoxinas staphylococcal são exemplos de super antígenos que interagem com receptores de célula T. os super antígenos que ligam-se ao anticorpos incluem proteína G, que liga-se a região constante IgG (Bjorck and Kronvall, J. Immunol., 133:969 (1984)); proteína A que liga-se a região constante IgG e domínios VH (Forsgren and Sjoquist, J. Immunol., 97:822 (1966)); e proteína L que liga-se os domínios VL (Bjorck, J. Immunol., 140:1194 (1988)).
Como usado neste, “ligando alvo” refere-se a um ligando que é específicoalmente ou selectivemente de ligação por um polipeptideo ou peptideo. Por exemplo, quando um polipeptideo é um anticorpo ou fragmento de ligação por antigeno destes, o ligando alvo pode ser qualquer antigeno ou epítopo desejado. A ligação ao antigeno alvo é dependente do polipeptideo ou peptideo sendo funcional.
Como usado neste um anticorpo refere-se a IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE ou um fragmento (tal como a Fab, F(ab’)2, Fv, Fv ligado por bissulfeto, scFv, anticorpo multiespecífico de conformação fechada, scFv ligado por bissulfeto, diacorpo) se derivado a partir de qualquer espécie naturalmente que produz um anticorpo, ou criado pela tecnologia de DNA recombinante; se isolado a partir do soro, células B, hibridomas, transfectomas, levedura ou bactéria.
Como usado neste, “formato de anticorpo” refere-se a qualquer estrutura de polipeptideo adequado em que uma ou mais variáveis de domínios de anticorpo pode ser incorporado de modo como para conferir a especificidade de ligação pelo antigeno na estrutura. Uma variedade de formato de anticorpos adequados são conhecidos na técnica, tal como, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos de cadeia simples, anticorpos biespecíficos, cadeias pesadas de anticorpo, cadeias leves de anticorpo, homodímeros e heterodímeros de cadeias pesadas de anticorpo e/ou cadeias leves, fragmentos de ligação de antígeno de qualquer do precedente (por exemplo, um fragmento Fv (por exemplo, Fv de cadeia simples (scFv), um Fv ligado por bissulfeto), um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab’)2), um domínio variável de anticorpo simples (por exemplo, a dAb, VH, Vhh, VLj e versões modificadas de qualquer do precedente (por exemplo, modificado pela ligação covalente de polietileno glicol ou outros polímeros adequados ou um Vhh humanizado).
A frase “domínio variável simples de imunoglobulina” referese a um anticorpo domínio variável (VH, Vhh, Vl) que liga especialmente um antígeno ou epítopo independentmente de outras regiões V ou domínios. Um domínio variável simples de imunoglobulina pode estar presente em um formato (por exemplo, homo- ou hetero-multímero) com outras regiões variáveis ou domínios variáveis onde outrias regiões ou domínios não são requeridos pela ligação de antígeno pelo domínio variável de imunoglobulina simples (isto é, onde o domínio variável simples de imunoglobulina liga-se a antígeno independentmente dos domínios variáveis adicionais). Um “anticorpo de domínio” ou “dAb” é o mesmo como um “domínio variável simples de imunoglobulina” como o termo é usado neste. Um “domínio variável de imunoglobulina simples” é o mesmo como um “domínio variável simples de imunoglobulina” como o termo é usado neste. Um “domínio variável de anticorpo simples” ou um “domínio variável de anticorpo simples” é o mesmo como um “domínio variável simples de imunoglobulina” como o termo é usado neste. Um domínio variável simples de imunoglobulina é em uma forma de realização um domínio variável de anticorpo humano, mas também inclui variáveis simples de domínios de anticorpo a partir de outra espécies tal como roedor (por exemplo, como divulgado no WO 00/29004, os conteúdos de que são incorporados neste por referência em sua totalidade), tubarão lixa e Camelídeo Vhh dAbs. O camelídeo Vhh são domínios variáveis simples de polipeptídeos de imunoglobulinas que são derivados de espécies incluindo camelo, lhama, alpaca, dromedário e guanaco, que produz anticorpos de cadeia pesada naturalmente isento de cadeias leves. Os VHh podem ser humanizados.
Um “domínio” é uma estrutura de proteína dobrada que tem estrutura terciária independente do restante da proteína. Geralmente, os domínios são responsáveis pelas propriedades funcionais discretas de proteínas em muitos casos pode ser adicionados, removidos ou trasfectados a outras proteínas sem perda de função do remanescente da proteína e/ou do domínio. Um “domínio variável de anticorpo simples” é um domínio polipeptideo dobrado que compreende as características de sequências de variáveis de domínios de anticorpo. Este portanto inclui as variáveis de domínios de anticorpo completas e domínios variáveis modificados, por exemplo, em que um ou mais arcos foram substituídos pelas seqüências que não são características de variáveis de domínios de anticorpo, ou variáveis de domínios de anticorpo que foram truncadas ou que compreendem extensões de terminal N ou C, bem como fragmentos dobrados de domínios variáveis que retém pelo menos a atividade de ligação e especificidade do domínio de comprimento total.
O termo “biblioteca” refere-se a uma mistura de polipeptídeos heterogêneos ou ácidos nucléicos. A biblioteca é cmposta de membros, cada um de que tem um polipeptideo simples ou sequência de ácido nucléico. Para esta extensão, a “biblioteca” é sinônimo com “repertório.” A sequência diferencia entre os membros da biblioteca que são responsáveis pela diversidade presente na biblioteca. A biblioteca pode tomar forma de uma mistura simples de polipeptídeos ou ácidos nucléicos, ou podem ser na forma de organismos ou células, por exemplo células bacterianas, virais, animais ou vegetais e outras, transformadas com a biblioteca de ácidos nucléicos. Em uma forma de realização, cada organimos individual ou célula contém apenas um ou um número limitado de membros da biblioteca. Em uma forma de realização, os ácidos nucléicos são incorporados nos vetores de expressão, a fim de permitir a expressão dos polipeptídeos codificado pelos ácidos nucléicos. Em um aspecto, portanto, a biblioteca pode tomar forma de uma população de organismos hospedeiros, cada organismo contendo um ou mais cópias de um vetor de expressão contendo um membro simples de uma biblioteca na forma de ácido nucléico que pode ser expressado para produzir seu membro de polipeptídeo correspondente. Deste modo, a população de organismos hospedeiros tem o potencial para codificar um amplo repertório de diversos polipeptídeos.
Uma “armação universal” é uma simples seqüência de armação de anticorpo simples que corresponde as regiões de um anticorpo conservado na seqüência como definido por Kabat (“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Department of Health and Human Services) ou correspondem ao repertório ou estrutura de imunoglobulina da linha germinativa humana como definido por Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917. As bibliotecas e repertórios podem usar uma armação simples, ou uma série de tais armações, que foram observadas permitir a derivação de virtualmente qualquer especificidade de ligação através da variação das regiões hipervariáveis sozinhas.
Como usado neste, o termo “dosagem” refere-se a quantidade de ligando administrado a um paciente todos em um período (dosagem unitária), ou em duas ou administrações em um intervalo do período definido. Por exemplo, a dosagem pode referir-se a quantidade de ligando (por exemplo, ligando que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina que liga-se ao antigeno alvo) administrado a um paciente no curso de um dia (24 horas) (dose diária), dois dias, uma semana, duas semanas, três semanas ou um ou mais meses (por exemplo, por uma simples administração, ou por duas ou mais administrações). O intervalo entre as dosagens podem ser qualque quantidades desejadas de tempo.
A frase, “vida média,” refere-se ao período de retirada a partir da concentração do soro do ligando (por exemplo, dAb, polipeptídeo ou antagonista) para reduzir por 50 %, in vivo, por exemplo devido a degradação do ligando e/ou liberação ou sequestro do ligando pelos mecanismos naturais. Os ligandos da invenção podem ser estabilizados in vivo e sua vida média aumentada pela ligação das moléculas que resiste a degradação e/ou liberação ou sequestro. Tipicalmente, tais moléculas são proteínas de ocorrência natural que por si só tem uma longa vida média in vivo. A vida média de um ligando é aumentada se sua atividade funcional persiste, in vivo, por um longo período do que um ligando similar que não é específico para a vida média aumentando a molécula. Por exemplo, um ligando específico por albumina de soro humano (HAS) e uma molécula alvo é comparado com o mesmo ligando em que a especificidade ao HSA não está presente, que é não liga-se a HSA mas liga-se a uma outra molécula. Por exemplo, este pode ligar-se a um terceiro alvo na célula. Tipicalmente, a vida média é aumentada por 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % ou mais. Aumento na faixa de 2x, 3x, 4x, 5x, lOx, 20x, 30x, 40x, 50x ou mais da vida média são possíveis. Altemativemente, ou em adição, aumento na faixa de até 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, lOOx, 150x da vida média são possíveis.
Como usado neste, “tamanho hidrodinâmico” refere-se ao tamanho aparente de uma molécula (por exemplo, uma molécula de proteína, ligando) com base na difusão da molécula através de uma solução aquosa. A difusão, ou moção da proteína através da solução pode ser processada para derivar um tamanho aparente da proteína, onde o tamanho é dado pelo “raio de Stokes” ou “raio hidrodinâmico” da partícula de proteína. O “tamanho hidrodinâmico” de uma proteína depende de tanto a massa quanto a forma (conformação), tal que as duas proteínas tendo a mesma massa molecular pode ter a diferenciação do tamanho hidrodinâmico com base na conformação total da proteína.
Como referido neste, o termo “compete” significa que a ligação de um primeiro alvo e seu domínio de ligação de alvo cognado é inibido na presença de um segundo domínio de ligação que é específico para o dito alvo cognado. Por exemplo, a ligação pode ser inibida estericamente, por exemplo pelo bloqueio físico de um domínio de ligação ou pela alteração da estrutura ou ambiente de um domínio de ligação tal que sua afinidade ou avidez para um alvo é reduzida. Ver W02006038027 para os detalhes como para realizar os experimentos de competição ELISA e competição BiaCore para determinar a competição entre primeiro e segundo domínio de ligação.
Os cálculos de “homologia” ou “identidade” ou “similaridade” entre duas sequências (os termos são usados intercambealmente neste) são realizados como seguem. As sequências são alinhadas para o ótimo propósito de comparação (por exemplo, fendas podem ser introduzidas em uma ou ambas de um primeiro e um segundo aminoácido ou sequência de ácido nucléico para ótimo alinhamento e seqüências não homólogas podem ser indiferentes para os propósitos de comparação). Em uma forma de realização, o comprimento de uma sequência de referência alinhada para os propósitos de comparação é em pelo menos 30 %, ou pelo menos 40 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 100 % do comprimento da sequência de referência. Resíduos ou nucleotídeos de aminoácidos em posições de aminoácido correspondentes ou posições de nucleotídeos são então comparados. Quando uma posição na primeira seqüência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda seqüência, então as moléculas são idênticas aquela posição (como usado neste aminoácido ou ácido nucléico “homologia” é equivalente ao aminoácido ou ácido nucléico “identidade”). O percentual da identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas formadas pelas sequências, levando em conta o número de fendas e o comprimento de cada fenda, que necessita ser introduzida para o ótimo alinhamento de duas sequências. O alinhamento das seqüências de aminoácido e nucleotídeo e homologia, similaridade ou identidade, como definido neste podem ser preparados e determinados pelo uso das sequências de algoritmo BLAST 2, usando parâmetros default (Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174AZ7-\W> (1999)).
MÉTODOS DE SELEÇÃO
A invenção em uma forma de realização diz respeito a polipeptídeos e dAbs selecionados por um método de seleção de protease resistante aos peptídeos e polipeptídeos que tem uma atividade biológica desejada. Duas pressões selecionadas são usadas no método para produzir um processo eficiente para a seleção de polipeptídeos que são altamente estáveis e resistentes a degradação a protease e que tem uma atividade biológica desejada. Como descrito nestes, os peptídeos resistentes as protease e polipeptídeos geralmente retém a atividade biológica. Em contraste, os peptídeos sensíveis a protease e polipeptídeos são clivados ou digeridos pela protease nos métodos descritos nestes e portanto, perde sua atividade biológica. Consequentemente, os peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease são geralmente selecionados com base em sua atividade biológica, tal como atividade de ligação.
Em um aspecto, aqui é fornecido um método para a seleção de, isolamento e/ou recuperação de um peptideo ou polipeptídeo a partir da biblioteca ou um repertório de peptídeos e polipeptídeos (por exemplo, um sistema de apresentação) que é resistente à degradação pela protease (por exemplo, um ou mais proteases). Em uma forma de realização, o método é um método para a seleção de isolamento e/ou recuperação de um polipeptídeo a partir da biblioteca ou um repertório de peptídeos e polipeptídeos (por exemplo, um sistema de apresentação) que é resistente à degradação pela protease (por exemplo, um ou mais proteases). Geralmente, o método compreende fornecer uma biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptídeos, combinando a biblioteca ou repertório com uma protease (por exemplo, tripsina, elastase, leucozima, pancreatina, expectoração) sob condições adequadas para a atividade de protease e seleção, isolamento e/ou recuperação de um peptídeo ou polipeptídeo que é resistente à degradação pela protease e tem uma atividade biológica desejada. Os peptídeos ou polipeptídeos que são degradados pela protease geralmente tem atividade biológica reduzida ou perda na sua atividade biológica devido a atividade de protease. Consequentemente, os peptídeos ou polipeptídeos que são resistente a degradação a protease podem ser selecionados, isolados e/ou recuperados usando o método com base em sua atividade biológica, tal como atividade de ligação (por exemplo, ligação de um ligando geral, ligação de um ligando específico, ligação de um substrato), atividade catalítica ou outra atividade biológica.
A biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptídeos é combinada com a protease (por exemplo, um ou mais proteases) sob condições adequadas pela atividade proteolítica da protease. As condições que são adequadas pela atividade proteolítica de protease e preparações biológicas ou misturas que contém a atividade proteolítica, são bem conhecidos na técnica ou pode ser rapidamente determinado por uma pessoa com habilidade comum habilitado na técnica. Se desejado, as condições adequadas podem ser identificadas ou otimizadas, por exemplo, pela atividade de protease de avaliação sob uma faixa de condições pH, concentrações de protease, temperaturas e/ou pela variação de uma quantidade de tempo da biblioteca ou repertório e a protease são permitidas por reagir. Por exemplo, em algumas formas de realização, a razão (em uma base mol /mol) de protease, por exemplo tripsina, ao peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, domínio variável) é 800 a 80,00 (por exemplo, 8.000 a 80,000) protease:peptídeo ou polipeptídeo, por exemplo quando 10 microgramas/ml de protease é usado, a razão é de 800 a 80,000 protease:peptídeo ou polipeptídeo ou quando 100 microgramas/ml de protease é usada, a razão é 8.000 a 80,000 protease:peptídeo ou polipeptídeo. Em uma forma de realização a razão (em um peso/peso, por exemplo, micrograma/base de micrograma) de protease (por exemplo, tripsina) ao peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, domínio variável) é 1.600 a 160,000 (por exemplo, 16.000 a 160,000) protease :peptídeo ou polipeptídeo por exemplo quando 10 microgramas/ml de protease é usada, a razão is 1.600 a 160,000 protease:peptídeo ou polipeptídeo ou quando 100 microgramas/ml de protease é usada, a razão é 16.000 a 160,000 protease:peptídeo ou polipeptídeo. Em uma forma de realização, a protease é usada a uma concentração de pelo menos 100 ou 1000 microgramas/ml e a protease: razão de peptídeo (em uma base mol /mol) de protease, por exemplo tripsina, ao peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, domínio variável) é de 8.000 a 80,000 protease:peptídeo ou polipeptídeo. Em uma forma de realização, a protease é usada a uma concentração de pelo menos 10 microgramas/ml e a protease: razão de peptídeo (em uma base mol /mol) de protease, por exemplo tripsina, ao peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, domínio variável) é de 800 a 80,000 protease:peptídeo ou polipeptídeo. Em uma forma de realização a razão (em um peso/peso, por exemplo, micrograma/base de micrograma) de protease (por exemplo, tripsina) ao peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, domínio variável) é de 1600 a 160,000 protease:peptídeo ou polipeptídeo por exemplo quando C é 10 microgramas/ml ou quando C ou C’ é 100 microgramas/ml, a razão é de 16.000 a 160,000 protease:peptídeo ou polipeptídeo. Em uma forma de realização, a concentração (c ou c’) é pelo menos 100 ou 1000 microgramas/ml de protease. Para o teste de um indivíduo ou peptídeo isolado ou polipeptídeo (por exemplo, um domínio variável de imunoglobulina), por exemplo um que já tem sido isolado a partir de um repertório ou biblioteca, a protease pode ser adicionada a uma solução de peptideo ou polipeptideo em um tampão adequado (por exemplo, PBS) para produzir uma solução de peptideo ou polipeptídeo/protease, tal como uma solução de de pelo menos cerca de 0,01 % (p/p) protease/peptídeo ou polipeptideo, cerca de 0,01 % a cerca de 5 % (p/p) protease/peptídeo ou polipeptideo, cerca de 0,05 % a cerca de 5 % (p/p) protease/peptídeo ou polipeptideo, cerca de 0,1 % a cerca de 5 % (p/p) protease/peptídeo ou polipeptideo, cerca de 0,5 % a cerca de 5 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, cerca de 1 % a cerca de 5 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,01 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,02 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,03 % (P/P)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,04 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,05 % (P/P)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,06 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,07 % (P/P)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,08 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,09 % (P/P)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,1 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,2 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,3 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,4 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,5 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,6 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,7 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,8 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 0,9 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca d( 3 1 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca d( 3 2 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca d( 3 3 % (p/p)
protease/peptídeo ou polipeptideo, pelo menos cerca de 4 % (p/p) protease/peptídeo ou polipeptideo, ou cerca de 5 % (p/p) protease/peptídeo ou polipeptideo. A mistura pode ser incubada em uma temperatura adequada para a atividade de protease (por exemplo, temperatura ambiente, cerca de 37° C) e amostras podem ser retiradas em intervalos de (por exemplo, a 1 hora, 2 horas, 3 horas, etc.). As amostras pode ser analisadas pela degradação de proteína usando qualquer método adequado, tal como análise SDS-PAGE ou ligação do ligando e os resultados podem ser usados para estabelecer um período de tempo da degradação.
Qualquer protease desejada ou proteases pode ser usada nos métodos descritos nestes. Por exemplo, uma simples protease, qualquer combinação desejada de diferentes proteases, ou qualquer preparação biológica, extrato biológico, ou homogenado biológico que contém a atividade proteolítica pode ser usado. Não é necessário que a identidade da protease ou proteases que são usadas a serem conhecidas. Exemplos adequados de proteases que podem ser usadas sozinhas ou em qualquer combinação desejada incluem serina protease, cisteína protease, aspartato proteases, tiol protease, matriz metaloprotease, carboxipeptidase (por exemplo, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B), tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, elastase, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, catepsinas (por exemplo, catepsina G), proteinase (por exemplo, proteinase 1, proteinase 2, proteinase 3), termolisina, quimiosina, enteropeptidase, caspase (por exemplo, caspase 1, caspase 2, caspase 4, caspase 5, caspase 9, caspase 12, caspase 13), calpaina, ficaina, clostripaina, actinidaina, bromelaina, separase e outros. Os extratos biológicos adequados, homogenados e preparações que contém a atividade proteolítica incluem expectoração, muco (por exemplo, muco gástrico, muco nasal, muco bronquial), lavagem broncoalveolar, homogenato de pulmão, extrato de pulmão, extrato pancreático, fluido gástrico, saliva, lágrimas e outros. A protease é usada em uma quantidade adequada para a degradação proteolítica para ocorrer. Por exemplo, como descrito neste, protease pode ser usada a cerca de 0,01 % a cerca de 5 % (p/p, protease/peptídeo ou polipeptídeo). Quando protease é combinada com um sistema de apresentação que compreende o repertório de peptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, a sistema de apresentação de fago), por exemplo, a protease pode ser usado em uma concentração de cerca de 10 pg/ml a cerca de 3 mg/ml, cerca de 10 pg/ml, cerca de 20 pg/ml, cerca de 30 pg/ml, cerca de 40 pg/ml, cerca de 50 pg/ml, cerca de 60 pg/ml, cerca de 70 pg/ml, cerca de 80 pg/ml, cerca de 90 pg/ml, cerca de 100 pg/ml, cerca de 200 pg/ml, cerca de 300 pg/ml, cerca de 400 pg/ml, cerca de 500 pg/ml, cerca de 600 pg/ml, cerca de 700 pg/ml, cerca de 800 pg/ml, cerca de 900 pg/ml, cerca de 1000 pg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de 2 mg/ml, cerca de 2,5 mg/ml ou cerca de 3 mg/ml.
A protease é incubada a coleção de peptídeos ou polipeptídeos (biblioteca ou repertório) em uma temperatura que é adequada pela atividade de uma protease. Por exemplo, a protease e coleção de peptídeos ou polipeptídeos podem ser incubadas em uma temperature de cerca de 20° C a cerca de 40° C (por exemplo, em temperatura ambiente, cerca de 20° C, cerca de 21° C, cerca de 22° C, cerca de 23° C, cerca de 24° C, cerca de 25° C, cerca de 26° C, cerca de 27° C, cerca de 28° C, cerca de 29° C, cerca de 30° C, cerca de 31° C, cerca de 32° C, cerca de 33° C, cerca de 34° C, cerca de 35° C, cerca de 36° C, cerca de 37° C, cerca de 38° C, cerca de 39° C, cerca de 40° C). A protease e a coleção de peptídeos ou polipeptídeos são incubados juntos por um período de tempo suficiente pela degradação proteolítica ocorra. Por exemplo, a coleção de the peptídeos ou polipeptídeos podem ser incubados junto com protease por cerca de 30 minutos a cerca de 24 ou cerca de 48 horas. Em alguns exemplos, a coleção de peptídeos ou polipeptídeos é incubado junto com a protease durante a noite, ou por pelo menos cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 1,5 horas, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 48 horas, ou mais longos.
Este é geralmente desejado, pelo menos nos ciclos de seção precoce (por exemplo, quando um sistema de apresentação é usado), que um resultado de protease em uma redução no número de clones que tem a atividade biológica desejada que é selecionado por por pelo menos uma ordem de magnitude, em comparação as seleções que não incluem a incubação com protease. Em particular os exemplos, a quantidade de protease e condições usadas nos métodos são suficientes para reduzir o número de clones recuperados por pelo menos cerca de um log (um fator de 10), pelo menos cerca de 2 logs (um fator de 100), pelo menos cerca de 3 logs (um fator de 1000) ou pelo menos cerca de 4 logs (um fator de 10.000). As quantidades adequadas de protease e condições de incubação que resultará na redução desejada nos clones recuperados podem ser facilmente determinados pelo uso dos métodos convencionais e/ou a orientação fornecida neste.
A protease e coleção de peptídeos ou polipeptídeos podem ser combinados e incubados usando qualquer método adequado (por exemplo, in vitro, in vivo ou ex vivo). Por exemplo, a protease e coleção de peptídeos ou polipeptídeos podem ser combinados em um recipiente adequado e mantido estacionário, firme, agitado, submetido ao turbilhonamento ou outros, em uma temperatura adequada para a atividade de protease. Se desejado, a protease e a coleção de peptídeos ou polipeptídeos podem ser combinadas em um sistema in vivo ou ex vivo, tal como pela introdução da coleção de polipeptídeos (por exemplo, a apresentação de faga biblioteca ou repertório) em um animal adequado (por exemplo, um camundongo) e após o período suficiente para a atividade de protease tem passado, a recuperação da coleção de peptídeos ou polipeptideos. Em um outro exemplo, um órgão ou tecido é espalhado com a coleção de polipeptideos (por exemplo, a apresentação de faga biblioteca ou repertório) e após o período suficiente para a atividade de protease tem passado da coleção de polipeptideos é recuperada.
Seguindo a incubação, um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease pode ser selecionado com base na atividade biológica desejada, tal como a atividade de ligação. Se desejado, um inibidor de protease pode ser adicionado antes da seleção. Qualquer inibidor de protease adequado (ou combinação de dois ou mais inibidores de protease) que não interferirão substancialmente com o método de seleção pode ser usado. Exemplos de inibidores de protease adequados incluem, al-anti-tripsina, a2-macroglobulin, amastatina, antipaína, antitrombina III, aprotinina, 4-(2-Aminoetil) cloridreto de fluoreto de benzenosulfonila (AEBSF), fluoreto de (4-Amidino-fenil)Metano-Sulfonila (APMSF), bestatina, benzamidina, quimostatina, 3,4Dicloroisocoumarina, fluorofosfato de diisopropila (DIFP), E-64, ácido tetraacético de etilenodiamina (EDTA), elastatinal, leupeptina, NEtilmaleimida, fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), pepstatina, 1,10fenantrolina, fosforamidona, inibidores de serina protease, cetona de N-tosilL-mentesina-clorometila (TLCK), cetona de Na-Tosil-Fe-clorometila (TPCK) e outros. Além disso, muitas preparações que contém os inibidores de diversas classes de proteases são comercialmente disponíveis (por exemplo, Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets™ (Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis, IN, USA), que inibe a quimiotripsina, termolisina, papaína, pronase, extrato pancreático e tripsina).
O peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease pode ser selecionado usando um método de seleção da atividade biológica desejada, que permite aos peptídeos e polipeptideos que tem a atividade biológica desejada a ser distinguida de e selecionado nos peptídeos e polipeptideos que não tem a atividade biológica desejada. Geralmente, os peptídeos ou polipeptídeos que foram digeridos e clivados perdem a protease de sua atividade biológica, enquanto os peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease permanecem funcionais. Deste modo, os ensaios adequados para a atividade biológica podem ser usados para selecionar os peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease. Por exemplo, uma função de ligação comum (por exemplo, ligação de um ligando geral, ligação de um ligando específico, ou ligação de um substrato) pode ser avaliada usando um ensaio de ligação adequado (por exemplo, ELISA, extração). Por exemplo, os polipeptídeos que liga-se ao um ligando alvo ou um ligando genérico, tal como proteína A, proteína L ou um anticorpo, pode ser selecionado, isolado e/ou recuperado por extração ou usando uma matriz de afinidade adequada. A extração pode ser acompanhado pela adição de uma solução de ligando (por exemplo, ligando genérico, ligando alvo) a um recipiente adequado (por exemplo, tubo, disco de petri) e permitindo o ligando tomar-se depositado ou revstidos nas paredes do recipiente. O excesso do ligando pode ser lavado fora e polipeptídeos (por exemplo, a apresentação de faga biblioteca) pode ser adicionado ao recipiente e o recipiente mantido sob condições adequadas para os polipeptídeos ligar-se ao ligando imobilizado. O polipeptideo não ligado pode ser lavado fora e polipeptídeos ligados podem ser recuperados usando qualquer método adequado, tal como fragmentação ou diminuição do pH, por exemplo.
Quando a sistema de apresentação de fago é usado, a ligação pode ser testada em uma ELISA de fago. ELISA de fago pode ser realizada de acordo com qualquer procedimento adequado. Em um exemplo, as populações de fagos produzidos em cada ciclo de seleção podem ser avaliadas pela ligação por ELISA ao ligando alvo selecionado ou ligando genérico, para identificar o fago que apresenta os peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease. Se desejado, peptídeos solúveis e polipeptídeos podem ser testados para a ligação de um ligando alvo ou ligando genérico, por exemplo por ELISA usando reagentes, por exemplo, contra o rótulo de terminal C ou N (ver por exemplo Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 e referências citadas neste). A diversidade do fago selecionado também pode ser avaliada pela eletroforese em gel de produtos PCR (Marks et al. 1991, supra-, Nissim et al. 1994 supra\ sondagem (Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776) ou pelo sequenciamento do vetor DNA.
Além disso a especificação por IL-1R1, um antagonista ou polipeptídeo (por exemplo, um ligando específico duplo) que compreende um polipeptídeo resistente a protease anti-IL-lRl (por exemplo, domínio variável de anticorpo simples) pode ter a especificidade de ligação por um ligando genérico ou qualquer ligando alvo desejado, tal como proteínas humanas ou animais, incluindo citocinas, fatores de desenvolvimento, receptores de citocina, receptores de fator de desenvolvimento, enzimas (por exemplo, proteases), co-fatores por enzimas, proteína de ligação de DNA, lipídeos e earboidrato s.
Em algumas formas de realização, um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease (por exemplo, dAb) ou antagonista liga-se ao IL-1R1 no tecido pulmonar. Em uma forma de realização, o antagonista ou polipeptídeo também liga-se a um alvo adicional no tecido pulmonar.
Quando um sistema de apresentação (por exemplo, um sistema de apresentação que liga-se a função codificadora de um ácido nucléico e características funcionais do peptídeo ou polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico) é usado nos métodos descritos nestes, este pode ser frequentemente vantajoso para amplificar ou aumentar o número de cópias dos ácidos nucléicos que codificam os peptídeos ou polipeptídeos selecionados. Este fornece uma maneira eficiente de obter as quantidades suficientes dos ácidos nucléicos e/ou peptídeos ou polipeptídeos para os ciclos adicionais de seleção, usando os métodos descritos nestes ou outros métodos adequados, ou pela preparação de repertórios adicionais (por exemplo, repertórios de maturação por afinidade). Deste modo, em algumas formas de realização, os métodos que compreendem usando um sistema de apresentação (por exemplo, que liga-se a função codificadora de um ácido nucléico e características funcionais do peptídeo ou polipeptideo codificado pelo ácido nucléico, tal como apresentação de fago) e ainda compreende a amplificação do aumento do número de cópias de um ácido nucléico que codifica um peptídeo ou polipeptideo selecionado. Os ácidos nucléicos podem ser amplificados usando qualquer método adequado, tal como pela amplificação de fago, desenvolvimento celular ou reação de cadeia de polimerase.
Os métodos descritos nestes podem ser usados como parte de um programa para isolar os peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease, por exemplo dAbs, que podem compreender, se desejado, outros métodos adequados de seleção. Nesta situação, os métodos descritos nestes podem ser utilizados em um ponto desejado no programa, tal como antes ou depois de outros métodos de seleção serem usados. Os métodos descritos nestes também podem ser usados para fornecer dois ou mais ciclos de seleção, como descritos e exemplificados neste.
Em um exemplo, o método é para a seleção de um peptídeo ou polipeptideo, por exemplo um dAb, que é resistente à degradação pela elastase, que compreende fornecer uma biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptídeos, combinando a biblioteca ou repertório com elastase (ou uma preparação biológica, extrato ou homogenado que compreende elastase) sob condições adequadas para a digestão proteolítica pela elastase e seleção, isolamento e/ou recuperação um peptídeo ou polipeptideo que é resistente à degradação pela elastase e tem atividade de ligação IL-1R1.
Em formas de realização particulares, aqui é fornecido um método para a seleção de um domínio variável simples de imunoglobulina (a dAb) que é resistente à degradação pela elastase e liga-se IL-1R1. Nestas formas de realização, a biblioteca ou repertório que compreende dAbs é fornecido e combinado com elastase (ou uma preparação biológica, extrato ou homogenado que compreende elastase) sob condições adequadas para a digestão proteolítica por elastase. Os dAbs resistentes a elastase são selecionados e que especialmente liga-se a IL-1R1. Por exemplo, o dAb resistente a elastase não é substancialmente degradado quando incubado a 37° C em uma solução de 0,04 % (p/p) de elastase por um período de pelo menos cerca de 2 horas. Em uma forma de realização, o dAb resistente a elastase não é substancialmente degradado quando incubado a 37° C em uma solução de 0,04 % (p/p) de elastase por um período de pelo menos cerca de 12 horas. Em uma forma de realização, o dAb resistente a elastase não é substancialmente degradado quando incubado a 37° C em uma solução 0,04 % (p/p) de elastase por um período de pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos cerca de 36 horas, ou pelo menos cerca de 48 horas.
Em uma forma de realização, aqui é fornecido um método para a seleção de um domínio variável simples de imunoglobulina (um dAb) que é resistente à degradação por elastase e liga-se a IL-1R1. O método compreende fornecer um sistema de apresentação de fago que compreende um repertório de polipeptideos que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina, combinando o sistema de apresentação de fago com elastase (cerca de 100 pg/ml) e incubando a mistura a cerca de 37° C, por exemplo, durante a noite (por exemplo, cerca de 12 a 16 horas) e então o fago de seleção que apresenta um dAb que especialmente liga-se a IL-1R1.
Em um exemplo, aqui é fornecido um método para a seleção de um peptideo ou polipeptideo (por exemplo, a dAb) que é resistente à degradação por leucozima, que compreende fornecer uma biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptideos, combinando a biblioteca ou repertório com leucozima (ou uma preparação biológica, extrato ou homogenado que compreende leucozima) sob condições adequadas pela digestão proteolítica por leucozima e seleção, isolamento e/ou recuperação de um peptideo ou polipeptídeo que é resistente à degradação por leucozima e tem atividade de ligação IL-1R1 específica.
Em formas de realização particulares, aqui é fornecido um método para a seleção de um domínio variável simples de imunoglobulina (a dAb) que é resistente à degradação por leucozima e liga-se a IL-1R1. Nestas formas de realização, a biblioteca ou repertório que compreende dAbs é fornecido e combinado com leucozima (ou uma preparação biológica, extrato ou homogenado que compreende leucozima) sob condições adequadas para a digestão proteolítica por leucozima. Os dAbs resistentes a leucozima são selecionados e que especialmente liga-se a IL-1R1. Por exemplo, o dAb resistente a leucozima não é substancialmente degradado quando incubado a 37° C em uma solução 0,04 % (p/p) de leucozima por um período de pelo menos cerca de 2 horas. Em uma forma de realização, o dAb resistente a leucozima não é substancialmente degradado quando incubado a 37° C em uma solução 0,04 % (p/p) de leucozima por um período de pelo menos cerca de 12 horas. Em uma forma de realização, o dAb resistente a leucozima não é substancialmente degradado quando incubado a 37° C em uma solução 0,04 % (p/p) de leucozima por um período de pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos cerca de 36 horas, ou pelo menos cerca de 48 horas.
Em uma forma de realização, aqui é fornecido um método para a seleção de um domínio variável simples de imunoglobulina (a dAb) que é resistente à degradação por leucozima e liga especialmente IL-1R1. O método compreende fornecer um sistema de apresentação de fago que compreende um repertório de polipeptídeos que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina, combinando o sistema de apresentação de fago com leucozima (cerca de 100 μg/ml) e incubando a mistura a cerca de 37° C, por exemplo, durante a noite (por exemplo, cerca de 12 a 16 horas) e então o fago de seleção que apresenta um dAb e que especialmente liga-se a IL-1R1.
Em um outro exemplo, aqui é fornecido um método para a seleção de um peptideo ou polipeptídeo (por exemplo, a dAb) que é resistente à degradação por tripsina, que compreende fornecer uma biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptideos, combinando a biblioteca ou repertório com tripsina sob condições adequadas pela digestão proteolítica por tripsina e seleção, isolamento e/ou recuperação um peptideo ou polipeptídeo que é resistente à degradação por tripsina e liga especialmente IL-1R1.
Em formas de realização particulares, aqui é fornecido um método para a seleção de um domínio variável simples de imunoglobulina (a dAb) que é resistente à degradação por tripsina e liga especialmente IL-1R1. Nestas formas de realização, a biblioteca ou repertório que compreende dAbs é fornecido e combinado com tripsina (ou uma preparação biológica, extrato ou homogenado que compreende tripsina) sob condições adequadas para a digestão proteolítica por tripsina. Os dAbs resistentes a tripsina são selecionados e ligam-se ao IL-1R1. Por exemplo, o dAb resistente a tripsina não é substancialmente degradado quando incubado a 37° C em uma solução 0,04 % (p/p) de tripsina por um período de pelo menos cerca de 2 horas. Em uma forma de realização, dAbs resistente a tripsina não é substancialmente degradado quando incubado a 37° C em uma solução 0,04 % (p/p) de tripsina por um período de pelo menos cerca de 3 horas. Em uma forma de realização, dAb resistente a tripsina não é substancialmente degradado quando incubado a 37° wm uma solução (p/p) de tripsina por um período pelo menos cerca de 4 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 7 horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 9 horas, pelo menos cerca de 10 horas, pelo menos cerca de 11 horas, ou pelo menos cerca de 12 horas.
Em uma forma de realização exemplar, aqui é fornecido um método para a seleção de um domínio variável simples de imunoglobulina (um dAb) que é resistente à degradação por tripsina e liga especialmente IL
1R1. O método compreende fornecer um sistema de apresentação de fago que compreende um repertório de polipeptídeos que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina, combinando o sistema de apresentação de fago com tripsina (100 pg/ml) e incubando a mistura a cerca de 37° C, por exemplo durante a noite (por exemplo, cerca de 12 a 16 horas) e então o fago de seleção que apresenta um dAb que especialmente liga-se a IL-1R1.
Em um outro aspecto, aqui é fornecido um método de produção de um repertório de peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease (por exemplo, dAbs). O método compreende fornecer um repertório de peptídeos ou polipeptídeos; que combinam o repertório de peptídeos ou polipeptídeos e uma protease sob condições adequadas para a atividade de protease; e recuperação de uma pluralidade de peptídeos ou polipeptídeos que especialmente liga-se a IL-1R1, pelo qual um repertório de peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease é produzido. As proteases, sistema de apresentaçãos, condições para a atividade de protease e métodos para a seleção de peptídeos ou polipeptídeos que são adequados para o uso nos métodos são descritos nestes com relação a outros métodos.
Em algumas formas de realização, um sistema de apresentação (por exemplo, um sistema de apresentação que liga-se a função codificadora de um ácido nucléico e características funcionais do peptideo ou polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico) que compreende um repertório de peptídeos ou polipeptídeos é usado e o método ainda compreende a amplificação do aumento do número de cópias dos ácidos nucléicos que codificam a pluralidade dos peptídeos ou polipeptídeos selecionados. Os ácidos nucléicos podem ser amplificados usando qualquer método adequado, tal como pela amplificação de fago, desenvolvimento celular ou reação de cadeia de polimerase.
Em particular forma de realização, aqui é fornecido um método de produção de um repertório de polipeptídeos resistentes à protease que compreende anti-IL-lRl dAbs. O método compreende fornecer um repertório de polipeptídeos que compreende dAbs; que combinam o repertório „dç3peptídeos ou. polipeptídeos e uma protease (por exemplo, tripsina, elastase, leucozima) sob condições adequadas para a atividade de protease; e recuperação de uma pluralidade de polipeptídeos que compreende dAbs que tem a especificidade de ligação por IL-1R1. O método pode ser usado para produzir um repertório simples, ou a repertório que é baseado em relação a especificidade de ligação desejada, tal como um repertório de maturação por afinidade com base no dAb parenteral que tem especificidade de ligação por IL-1R1.
Sistema de apresentação de polipeptídeos
Em uma forma de realização, o repertório ou biblioteca de peptídeos ou polipeptídeos fornecido para o uso nos métodos descritos nestes que compreendem um sistema de apresentação adequado. O sistema de apresentação pode resistir a degradação por protease (por exemplo, a protease simples ou uma combinação de proteases e qualquer extrato biológico, homogenado ou preparação que contém atividade proteolítica (por exemplo, expectoração, muco (por exemplo, muco gástrico, muco nasal, muco bronquial), lavagem broncoalveolar, homogenato de pulmão, extrato de pulmão, extrato pancreático, fluido gástrico, saliva, lágrimas e outros). O sistema de apresentação e outros entre o sistema de apresentação e o polipeptídeo apresentado é em uma forma de realização pelo menos como resistente a protease como os peptídeos ou polipeptídeos mais estáveis do repertório. Este permite um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo apresentado selecionado a ser facilmente isolado e/ou amplificado.
Em um exemplo, um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease, por exemplo um dAb, pode ser selecionado, isolado e/ou recuperado a partir do repertório de peptídeos ou polipeptídeos que é na solução, ou é covalentemente ou não covalentemente ligado a uma superfície adequada, tal como plástico ou vidro (por exemplo, placa microtituladora, arranjo polipeptídeo tal como a microarranjo). Por exemplo um arranjo de peptídeos em uma superfície em uma maneira que coloca cada membro distinto da biblioteca (por exemplo, seqüência de peptídeo única) em uma localização pré-definida discreta no arranjo pode ser usado. A identidade de cada membro da biblioteca em um tal arranjo pode ser determinados pela localização espacial no arranjo. As localizações no arranjo onde as interações de ligações entre um ligando alvo, por exemplo e membros da biblioteca reativa ocorrem e podem ser determinados, portanto identificando as sequências dos membros reativos na base de localização espacial, (ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.143.854, WO 90/15070 e WO 92/10092.)
Em uma forma de realização, os métodos utilizam um sistema de apresentação que liga a função codificadora de um ácido nucléico e características funcionais químicas e/ou físicas do polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico. Um tal sistema de apresentação pode compreender uma pluralidade de embalagens genéticas replicáveis, tal como bacteriófago ou células (bactérias). Em uma forma de realização, o sistema de apresentação compreende a biblioteca, tal como a apresentação de biblioteca de bacteriófago.
Um número de sistema de apresentação de bacteriófago adequado (por exemplo, apresentação monovalente e sistema de apresentação multivalente) foram descritos. (Ver, por exemplo, Griffiths et al., Patente U.S. N°. 6.555.313 BI (incorporado neste por referência); Johnson et al., Patente U.S. N°. 5.733.743 (incorporado neste por referência); McCafferty et al., Patente U.S. N°. 5.969.108 (incorporado neste por referência); MulliganKehoe, Patente U.S. N°. 5.702.892 (incorporado neste por referência); Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 72:433-455 (1994); Soumillion, P. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994); Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001)). Os peptídeos ou polipeptídeos apresentaram em um sistema de apresentação bacteriófago que pode ser apresentado em qualquer bacteriófago adequado, tal como um fago filamentoso (por exemplo, fd, Ml3, Fl), um fago lítico (por exemplo, T4, T7, lambda), ou um fago RNA (por exemplo, MS2), por exemplo.
Geralmente, a biblioteca de fago que apresenta um repertório de peptídeos ou polipeptídeos de fagos, as proteína de fusão com uma proteína revestida por fago adequado (por exemplo, proteína fd pill), é produzido ou fornecido. A proteína de fusão pode apresentar os peptídeos ou polipeptídeos na ponta da proteína revestida por fago, ou se desejado na posição interna. Por exemplo, o peptídeo ou polipeptídeo apresentado pode estar presente em uma posição que é terminal amino ao domínio 1 de pill. (Domínio 1 de pill é também referido como Nl.) O polipeptídeo apresentado pode ser diretamente fundido a pill (por exemplo, o terminal N do domínio de pill) ou fundido a pill usando um ligador. Se desejado, a fusão ainda pode compreender um rótulo (por exemplo, epítopo myc, rótulo His). As bibliotecas que compreendem um repertório de peptídeos ou polipeptídeos que são apresentados como proteínas de fusão com uma proteína revestida por fago pode ser produzida usando qualquer método adequados, tal como pela introdução de uma biblioteca de vetores de fagos ou vetores fagomídeos que codificam os peptídeos ou polipeptídeos apresentados nas bactérias hospedeiras e cultura da bactéria resultante para produzir fagos (por exemplo, usando um fago auxiliar adequado ou complementar o plasmídeo se desejado). A biblioteca de fago pode ser recuperada a partir da cultura usando qualquer método adequado, tal como precipitação e centrifugação.
O sistema de apresentação pode compreender um repertório de peptídeos ou polipeptídeos que contém qualquer quantidade desejada de diversidade. Por exemplo, o repertório pode conter os peptídeos ou polipeptídeos que tem a sequência de aminoácidos que corresponde aos polipeptídeos de ocorrência natural expressado por um organimos, grupo de organismos (por exemplo, um repertório de seqüências de VHh dAbs isolado a partir do Camelídeo), tecido desejado ou tipo celular desejado, ou pode conter os peptídeos ou polipeptídeos que tem a sequência de aminoácido aleatória ou aleatorizada. Se desejado, os polipeptídeos podem formar um núcleo ou armação comum. Os polipeptídeos em um tal repertório ou biblioteca pode compreender as regiões defmidas da sequência de aminoácido aleatória ou aleatorizada de sequência de aminoácido comum. Em certas formas de realização, todos ou substancialmente todos os polipeptídeos em um repertório são de um tipo desejado, tal como uma enzima desejada (por exemplo, uma polimerase) ou um fragmento de ligação de antígeno desejado de um anticorpo (por exemplo, VH humano ou VL humano). Em formas de realização, o polipeptideo sistema de apresentação compreende um repertório de polipeptídeos em que cada um polipeptideo compreende um anticorpo domínio variável. Por exemplo, cada polipeptideo no repertório pode conter um VH, um VL ou um Fv (por exemplo, um Fv de cadeia simples).
A diversidade das seqüências de aminoácidos pode ser introduzida em qualquer região desejada de um peptídeo ou polipeptideo ou armação usando qualquer método adequado. Por exemplo, sequência de diversidade de aminoácido pode ser introduzida em uma região alvo, tal como uma complementaridade para determinar a região de um anticorpo domínio variável ou um domínio hidrofóbico, para a preparação de uma biblioteca de ácidos nucléicos que codifica os polipeptídeos diversificados usando os métodos de mutagênese adequados (por exemplo, PCR de baixa fidelidade, mutagênese direcionada ao local ou mediada por oligonucleotídeo, diversificação usando códons NNK) ou qualquer outro método adequado. Se desejado, uma região de um polipeptideo a ser diversificado podem ser aleatorizado.
Os tamanhos dos polipeptídeos que são feitos até o repertório é amplamente um assunto de escolha e tamanho de polipeptideo uniforme não é requerido. Em uma forma de realização, os polipeptídeos no repertório tem pelo menos a estrutura terciária (forma pelo menos um domínio).
Seleção/Isolamento/Recuperação
O peptídeo ou polipeptideo resistente a protease (por exemplo, a população de polipeptídeos resistentes à protease) pode ser selecionado, isolado e/ou recuperado a partir de um repertório ou biblioteca (por exemplo, em um sistema de apresentação) usando qualquer método adequado. Em uma forma de realização, um polipeptideo resistente a protease é selecionado ou isolado com base nas características selecionáveis (por exemplo, características físicas, características químicas, características funcionais). As características funcionais selecionáveis adequadas incluem atividades biológicas dos peptídeos ou polipeptídeos no repertório, por exemplo, ligação a um ligando genérico (por exemplo, um super antígeno), ligação a um ligando alvo (por exemplo, um antígeno, um epítopo, um substrato), ligação a um anticorpo (por exemplo, em direção a um epítopo expressado em um peptídeo ou polipeptideo) e atividade catalítica, (ver, por exemplo, Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655). Em uma forma de realização, a seleção é baseado em uma ligação específica a IL-1R1. Em uma outra forma de realização, a seleção é na base das características funcionais selecionadas para produzir um segundo repertório em que os membros são resistentes a protease, seguido pela seleção de um membro a partir do segundo repertório que liga especialmente IL-1R1.
Em algumas formas de realização, um peptídeo ou polipeptideo resistente a protease é selecionado e/ou isolado a partir da biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptídeos em que todos substancialmente peptídeos ou polipeptídeos resistentes a forma de protease de uma característica selecionável comum. Por exemplo, um peptídeo ou polipeptideo resistente a protease pode ser selecionado de uma biblioteca ou repertório em que substancialmente todos os peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease liga-se a um ligando genérico comum, liga-se a um ligando alvo comum, liga-se a um anticorpo comum (ou são ligados por), ou possuem uma atividade catalítica comum. Este tipo de seleção é particularmente útil para a preparação de um repertório de peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease que são com base em um peptideo ou polipeptídeo parental que tem uma atividade biológica desejada, por exemplo, quando realizados pela maturação por afinidade de um domínio variável simples de imunoglobulina.
Com base na seleção de uma ligação a um ligando genérico comum pode produzir uma coleção ou população de peptídeos ou polipeptídeos que contém todos ou substancialmente todas de uma peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease que foram componentes da biblioteca ou repertório original. Por exemplo, os peptídeos ou polipeptídeos que liga ao um ligando alvo ou um ligando genérico, tal como proteína A, proteína L ou um anticorpo, pode ser selecionado, isolado e/ou recuperado por extração ou usando uma matriz de afinidade adequada. A extração pode ser acompanhada pela adição uma solução de ligando (por exemplo, ligando genérico, ligando alvo) a um recipiente adequado (por exemplo, tubo, disco de petri) e permitindo o ligando tomar-se depositado ou revstidos nas paredes do recipiente. O excesso do ligando pode ser lavado fora e peptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, a repertório que foi incubado com protease) pode ser adicionado ao recipiente e o recipiente mantido sob condições adequadas pelos peptídeos ou polipeptídeos ligar-se ao ligando imobilizado. Os peptídeos ou polipeptídeos não ligados podem ser lavado fora e os peptídeos ou polipeptídeos ligados podem ser recuperados usando qualquer método adequado, tal como fragmentação ou diminuição do pH, por exemplo.
As matrizes de afinidade do ligando adequado geralmente contém um suporte ou pérola sólida (por exemplo, agarose) que um ligando é covalentemente ou não covalentemente ligado. A matriz por afinidade pode ser combinado com peptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, um repertório foi incubado com protease) usando um processo por batelada, processo de coluna ou quaisquer outros processos adequados sob condições adequadas pela ligação de peptídeos ou polipeptídeos ao ligando na matriz. Os peptídeos ou polipeptídeos que não liga-se a matriz por afinidade pode ser lavado fora e os peptídeos ou polipeptídeos ligados pode ser eluído e recuperado usando qualquer método adequado, tal como eluição com um tampão pH inferior, com um agente brando de desnaturação (por exemplo, úreia), ou com um peptídeo que compete para a ligação ao ligando. Em um exemplo, um ligando alvo biotinilado é combinado com a repertório sob condições adequadas pelos peptídeos ou polipeptídeos no repertório liga-se ao ligando alvo (IL-1R1). Os peptídeos ou polipeptídeos de ligação são recuperados usando avidina imobilizada ou estreptavidina (por exemplo, em uma pérola).
Em algumas formas de realização, o ligando genérico é um anticorpo ou ligação de fragmento de antígeno destes. Os fragmentos de anticorpos ou ligação de antígeno que ligam-se as características estruturais de peptídeos ou polipeptídeos que são substancialmente conservados nos peptídeos ou polipeptídeos de uma biblioteca ou repertório são particularmente úteis como ligando genéricos. Os anticorpos e ligação de fragmentos de antígeno adequados para o uso como ligandos pelo isolamento, seleção e/ou recuperação de peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser preparados usando qualquer método adequado.
BIBLIOTECAS/REPERTÓRIOS
Em outros aspectos, aqui são fornecidos repertórios de peptídeos e polipeptídeos resistentes a protease, as bibliotecas que codificam os peptídeos e polipeptídeos resistentes a protease e os métodos para a produção de tais bibliotecas e repertórios.
As bibliotecas que codificam e/ou contém os peptídeos e polipeptídeos resistentes a protease podem ser preparadas ou obtidas usando qualquer método adequado. A biblioteca pode ser projetada para codificar os peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease com base em um peptídeo ou polipeptideo de interesse (por exemplo, um peptídeo ou polipeptideo anti-IL1R1 selecionado de uma biblioteca) ou pode ser selecionado de uma outra biblioteca usando os métodos descritos nestes. Por exemplo, a biblioteca enriquecida nos polipeptídeos resistentes à protease podem ser preparados usando um sistema de apresentação de polipeptideo adequado.
Em um exemplo, a apresentação de biblioteca de fago que compreende um repertório de polipeptídeos apresentados que compreendem domínios variáveis simples de imunoglobulina (por exemplo, VH, Vk, VÀ) é combinado com a protease sob condições adequadas para a atividade de protease, como descrito neste. Os polipeptídeos resistentes à protease são recuperados com base na atividade biológica desejada, tal como a atividade de ligação (por exemplo, ligação de ligando genérico, ligação de ligando alvo) portanto produzindo uma apresentação de biblioteca de fago enriquecida nos polipeptídeos resistentes à protease. Em uma forma de realização, a recuperação é na base da ligação do ligando genérico para produzir uma biblioteca enriquecida, seguido pela seleção de um membro anti-IL-lRl de que a biblioteca com base na ligação específica a IL-1R1.
Em um outro exemplo, a apresentação de biblioteca de fago que compreende um repertório de polipeptídeos apresentados que compreendem os domínios variáveis simples de imunoglobulina (por exemplo, VH, Vk, VÀ) é primeiro avaliado para identificar os membros do repertório que tem a especificidade de ligação por um antígeno alvo desejado (IL-1R1). Uma coleção de polipeptídeos tendo a especificidade de ligação desejada é recuperada e a coleção é combinada com protease sob condições adequadas pela atividade proteolítica, como descrito neste. Uma coleção de polipeptídeos resistentes à protease que tem uma especificidade de ligação alvo desejada é recuperada, produzindo uma biblioteca enriquecida pela resistência a protease e polipeptídeos de alta afinidade. Como descrito nestes em uma forma de realização, resistência a protease nestes método de seleção correlacionam com a alta afinidade de ligação.
As bibliotecas que codificam um repertório de tipo desejado de polipeptídeos podem ser rapidamente produzidas usando qualquer método adequado. Por exemplo, a sequência de ácido nucléico que codifica um tipo desejado de polipeptídeo (por exemplo, um polimerase, um domínio variável de imunoglobulina) pode ser obtido e uma coleção de ácidos nucléicos que cada um contém um ou mais mutações podem ser preparados, por exemplo pela amplificação do ácido nucléico usando um sistema de reação de cadeia de polimerase propensa ao erro (PCR), pela mutagênese química (Deng et al., J. Biol. Chem., 269:9533 (1994)) ou usando as cepas mutadoras bacterianas (Low et al., J. Mol. Biol., 260:359 (1996)).
Em outras formas de realização, as regiões particulares do ácido nucléico podem ser alvejadas pela diversificação. Os métodos pela mutação selecionada pelas posições são também bem conhecidas na técnica incluem, por exemplo, o uso de oligonucleotídeos mal combinados ou oligonucleotídeos degenerados, com ou sem o uso de PCR. Por exemplo, as bibliotecas de anticorpos sintéticos foram criadas pelas mutações de alvejamento aos arcos de ligação de antigeno. O anticorpo aleatório ou semialeatório H3 e regiões L3 foram anexadas pela linha germinativa aos segmentos de gene V de imunoglobulina para produzir as amplas bibliotecas com regiões de armação não mutadas (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra; Griffiths et al. (1994) supra; DeKruif et al. (1995) supra). Tal diversificação foi estendida incluindo alguns ou todos de outros arcos de ligação de antigeno (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra). Em outras formas de realização, as regiões particulares do ácido nucléico podem ser alvejadas pela diversificação, por exemplo, uma estratégia de duas etapas PCR utilizando o produto do primeiro PCR como um “megainiciador.” (ver, por exemplo, Landt, O. et al., Gene 96:125-128 (1990)). A diversificação alvejada também pode ser acompanhada, por exemplo, por SOE PCR. (ver, por exemplo, Horton, R.M. et al., Gene 77:61-68 (1989).)
A diversidade de seqüência nas posições selecionadas podem ser atingidas pela alteração da seqüência codificadora que especifica uma sequência do polipeptídeo tal que um número de aminoácidos possíveis (por exemplo, todos de 20 ou uma subsérie destes) podem ser incorporados naquela posição. Usando a nomeclatura IUPAC, o códon mais versátil é NNK, que codifica todos os aminoácidos bem como o códon interrompido TAG. O códon NNK pode ser usado a fim de introduzir a diversidade requerida. Outros códons que atingem as mesmas extremidades são também de uso, incluindo o códon NNN, que leva a produção de códons de interrupção adicional TGA e TAA. Um tal método alvejado pode permitir o espaço da seqüência total em uma área alvo a ser explorada.
As bibliotecas podem compreender os polipeptídeos de anticorpo resistente a protease que tem uma conformação de cadeia principal conhecida, (ver, por exemplo, Tomlinson et al., WO 99/20749.)
As bibliotecas podem ser preparadas em um plasmídeo ou vetor adequado. Como usado neste, o vetor refere-se a um elemento discreto que é usado para introduzir o DNA heterólogo nas células para a expressão e/ou replicação destes. Qualquer vetor adequado pode ser usado, incluindo plasmídeos (por exemplo, plasmídeos bacterianos), vetores virais ou bacteriófagos, cromossomos artificiais e vetores epissômicos. Tais vetores podem ser usados pela clonagem simples e mutagênese, ou um vetor de expressão pode ser usado para conduzir a expressão de uma biblioteca. Os vetores e plasmídeos usualmente contém um ou mais locais de clonagem (por exemplo, um poliligador), uma origem de replicação e em pelo menos gene marcador selecionável. Os vetores de expressão ainda podem conter elementos para conduzir a transcripção e tradução de um polipeptideo, tal como um elemento itensificador, promotor, sinal de terminação de transcripção, sequências de sinais e outros. Estes elementos podem estar dispostos em uma tal maneira a ser operalmente ligado a uma inserção clonada que codifica um polipeptideo, tal que o polipeptideo é expressado e produzido quando um tal vetor de expressão é mantido sob condições adequadas para a expressão (por exemplo, em uma célula hospedeira adequada).
A clonagem e vetores de expressão geralmente contém a sequência de ácido nucléico que capacita o vetor de replicar-se em um ou mais células hospedeiras selecionadas. Tipicalmente nos vetores de clonagem, esta seqüência é um que capacita o vetor para replicar independentemente do DNA cromossomal hospedeiro e inclui as origens de replicação ou automaticamente as seqüências de replicação. Tais seqüências são bem conhecidas por uma variedade de bactéria, levedura e vírus. A origem da replicação a partir do plasmídeo pBR322 é adequada mais para a bactéria Gram-negativa, a origem de plasmídeo de 2 microns é adequado para as origens de levedura e vários vírus (por exemplo SV40, adenovirus) são úteis nos vetores de clonagem em células mamíferas. Geralmente, a origem de replicação não é necessária para os vetores de expressão de mamífero, a não ser que estes sejam usados em células de mamíferos capaces de replicar altos high níveis de DNA, tal como células COS.
A clonagem ou vetores de expressão podem conter um gene de seleção também referido como marcador selecionável. Tais genes marcadores codificam uma proteína necessária para a sobrevivência ou desenvolvimento de células hospedeiras transformadas desenvolvidas em um meio de cultura seletivo. As células hospedeiras não transformadas com o vetor contendo o gene de seleção portanto não sobreviverá no meio de cultura. Os genes de seleção típica que codifica as proteínas que conferem a resistência a antibióticos e outras toxinas, por exemplo ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, deficiência auxotrófica de complemento, ou nutrientes críticos de estoque não disponíveis no meio de desenvolvimento.
Os vetores de expressão adequados pode conter um número de componentes, por exemplo, uma origem de replicação, a gene marcador selecionável, um ou mais elementos de controle de expressão expression, tal como um elemento de controle de transcripção (por exemplo, promotor, intensificador, terminador) e/ou um ou mais sinais de tradução, uma seqüência de sinal ou seqüência líder e outros. Os elementos de controle de expressão e um sinal ou seqüências líder, se presente, pode ser fornecido pelo vetor ou outra fonte. Por exemplo, as seqüências de controle transcripcionais e/ou de tradução de um ácido nucléico clonado que codifica uma cadeia de anticorpo pode ser usado para direcionar a expressão.
Um promotor pode ser fornecido pela expressão em uma célula hospedeira desejada. Os promotores podem ser constitutivos ou induzidos. Por exemplo, um promotor pode ser operavelmente ligado a um ácido nucléico que codifica um anticorpo, cadeia de anticorpo ou porção deste, tal que este direciona a transcripção do ácido nucléico. Uma variedade de promotores adequados pelos hospedeiros procarióticos (por exemplo, os sistemas promotores β-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, o sistema promotor de triptofano (trp), promotores lac, tac, T3, T7 por E. colí) e eucarióticos (por exemplo, promotor do vírus símio 40 precoce ou tardio, promotor de repetição do terminal longo do vírus de sarcoma Rous, promotor de citomegalovírus, promotor de adenovirus tardio, promotor EG-la) estão disponíveis.
Além disso, os vetores de expressão tipicalmente que compreendem um marcador selecionável para a seleção de células hospedeiras que realizam o vetor e, no caso de um vetor de expressão replicável, uma origem de replicação. Os genes que codificam os produtos que conferem a resistência a antibióticos ou medicamentos são marcadores selecionáveis comuns e podem ser usados em células procarióticas (por exemplo, gene β-lactamase (resistente a ampicilina), gene Tet para resistência a tetraciclina) eucarióticas (por exemplo, neomicina (G418 ou geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina, ou genes resistentes a higromicina). Os genes marcadores de diidrofolato de reductase permitem a seleção com metotrexate em uma variedade de hospedeiros. Os genes que codificam o produto do gene de marcadores auxotróficos de hospedeiros (por exemplo, LEU2, URA 3, HIS3) são frequentemente usados como marcadores selecionáveis na levedura. O uso de vetores (por exemplo, bacilovírus) ou vetores de fagos que são capazes de integrar-se no genoma da célula hospedeira, como vetores de retrovirus, são também considerados.
Os vetores de expressão adequados para a expressão em células procarióticas (por exemplo, células bacterianas tal como E. colí) ou de mamíferos incluem, por exemplo, um vetor pET (por exemplo, pET-12a, pET-36, pET-37, pET-39, pET-40, Novagen e outros), um vetor de fago (por exemplo, pCANTAB 5 E, Pharmacia), pRIT2T (vetor de fusão de proteína A, Pharmacia), pCDM8, pCDNAl.l/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXTl (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L.A., et al., Biotechniques, 27:1013-1015 (1996)), pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD), pEF-Bos (Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)) e outros. Os vetores de expressão que são adequados para o uso em vários hospedeiros de expressão, tal como células procarióticas (E. colí), células de inseto (células Drosophila Schnieder S2, Sf9), levedura (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) e células de mamíferos (por exemplo, células COS) estão disponíveis.
Os exemplos de vectors são vetores de expressão que capacitam a expressão de uma seqüência de nucleotídeo que corresponde ao um membro da biblioteca de polipeptideo. Deste modo, a seleção com ligandos genéricos e/ou alvos podem ser realizada pela propagação separada e expressão de um clone simples que expressa o membro de biblioteca de polipeptideo. Como descrito acima, o sistema de apresentação de seleção 5 pode ser a apresentação de bacteriófago. Deste modo, os vetores de fagos ou fagomídeos podem ser usados. Exemplos de vetores são os vetores fagomídeos que tem uma origem E. coli. de replicação (para a replicação filamentada dupla) e também uma origem de fago de replicação (para a produção de DNA filamentado simples). A manipulação e expressão de tais TO vetores são bem conhecidas na técnica (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). Brevemente, o vetor pode conter um gene β-lactamase para conferir a seletividade em um fagomídeo e um promotor lac a montante de um cassete de expressão que pode conter uma seqüência líder adequada, um local de clonagem múltipla, um ou mais rótulos de peptídeos, 15 um ou mais códons de interrupção TAG e a proteína pill de fago. Deste modo, usando várias cepas supressoras e não supressoras de E. coli e com a adição de glicose, iso-propil tio-fi-D-galactosídeo (IPTG) ou um fago auxiliar, tal como VCS Ml3, o vetor é capaz de replicar-se como um plasmídeo com nenhuma expressão, produzir amplas quantidades do membro da biblioteca de 20 polipeptideo apenas ou produto do fago, alguns de que contém pelo menos uma cópia da fusão pill de polipeptideo em sua superfície.
As bibliotecas e repertórios descritos nestes podem conter os formatos de anticorpos. Por exemplo, o polipeptideo contido dentro das bibliotecas e repertórios podem ser os domínios VH ou VL totais separados, 25 qualquer de que são fragmentos scFv modificados e não modificados, bem como outros polipeptídeos de anticorpo, pode ser rapidamente produzidos usando qualquer método adequado. Um número de métodos que projeta o anticorpo adequado são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um scFv pode ser formado pela ligação dos ácidos nucléicos que codifica dois domínios variáveis com um oligonucleotídeo adequado que codifica um peptideo ligador apropriado, tal como (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 ou outros peptídeos ligadores. As pontes ligadoras da extremidade de terminal C da primeira região V e a extremidade do terminal N da segunda região V. as técnicas similares para a construção de outro formato de anticorpos, tal como fragmentos Fv, Fab e F(ab )2 podem ser usados. Para formatar Fab e fragmentos F(ab )2, polipeptídeos VH e VL podem ser combinados com segmentos de região constante, que podem ser isolados a partir dos genes reagrupados, genes de linha germinativa C ou sintetizados de dados da seqüência de anticorpo. Uma biblioteca ou repertório descrito nestes pode ser uma biblioteca ou repertório VH ou VL.
Os polipeptídeos que compreendem uma resistente ao domínio variável de protease podem compreender um local de ligação do ligando alvo (IL-1R1) e um local de ligação do ligando genérico. Em certas formas de realização, o local de ligação do ligando genérico é um local de ligação para um super antigeno, tal como proteína A, proteína L ou proteína G. os domínios variáveis podem ser baseados em qualquer dos domínios variáveis desejados, por exemplo um VH humano (por exemplo, VH la, VH 1b, VH 2, VH 3, VH 4, VH 5, VH 6), um VX humano (por exemplo, VXI, νλΠ, ΥλΙΠ, VÀIV, VÀV, VZVI ou VkI) ou um Vk humano (por exemplo, Vk2, Vk3, Vk4, Vk5, Vk6, Vk7, Vk8, Vk9 ou VkIO) ou um Camelídeo Vhh, opcionalmente que foi humanizado.
ÁCIDOS NUCLEICOS, CÉLULAS HOSPEDEIRAS E MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS RESISTENTES À PROTEASE
A invenção diz respeito a ácidos nucléicos isolados ou recombinantes que codificam peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease por exemplo, que são selecionáveis ou selecionados pelos métodos descritos nestes.
Os ácidos nucléicos referidos neste como “isolados” são ácidos nucléicos que foram separados de outro material (por exemplo, outros ácidos nucléicos, tais como DNA, cDNA e/ou RNA genômicos) em seu ambiente original (por exemplo, em células ou em uma mistura de ácidos nucléicos, tal como uma biblioteca). Um ácido nucléico isolado pode ser isolado como parte um vetor (por exemplo, um plasmídeo).
Os ácidos nucléicos referidos neste como “recombinante” são ácidos nucléicos que foram produzidos pela metodologia de DNA recombinante, incluindo métodos que conta com a recombinação artificial, tal como clonagem em um vetor ou cromossomo usando-se, por exemplo, enzimas de restrição, recombinação homóloga, vírus e outros e ácidos nucléicos preparados usando-se a reação de cadeia de polimerase (PCR).
A invenção também diz respeito a uma célula hospedeira recombinante que compreende um (um ou mais) ácido nucléico recombinante ou construção de expressão que compreende a ácido nucléico que codifica um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease, por exemplo, um peptideo ou polipeptídeo selecionável ou selecionado pelos métodos descritos nestes. Também é fornecido um método de preparar um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease, que compreende manter uma célula hospedeira recombinante da invenção sob condições apropriadas para a expressão de um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease. O método ainda pode compreender a etapa de isolamento ou recuperação um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease, se desejado.
Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico (isto é, uma ou mais moléculas de ácido nucléico) que codificam um peptideo ou polipeptídeo resistente a protease ou uma construção de expressão (isto é, um ou mais construções) que compreendem tais moléculas de ácido nucléico, pode ser pode ser introduzida em uma célula hospedeira adequada para criar uma célula hospedeira recombinante usando qualquer método apropriado para a célula hospedeira selecionada (por exemplo, transformação, transfecção, eletroporação, infecção), tal que as moléculas de ácido nucléico são operacionalmente ligadas a um ou mais elementos de controle de expressão (por exemplo, em um vetor, em uma construção criada pelos processos na 5 célula, integrada no genoma da célula hospedeira). A célula hospedeira recombinante resultante pode ser mantida sob condições adequadas para a expressão (por exemplo, na presença de um indutor, em um animal adequado, em um meio de cultura adequado suplementado com sais apropriados, fatores de desenvolvimento, antibióticos, suplementos nutricionais, etc.), pelo qual o 10 peptideo ou polipeptídeo codificados é produzido. Se desejado, o peptideo ou polipeptídeo codificados podem ser isolados ou recuperados (por exemplo, a partir do animal, a célula hospedeira, meio, leite). Este processo abrange a expressão em uma célula e uma célula hospedeira de umanimal transgênico (ver, por exemplo, WO 92/03918, GenPharm International).
O peptideo ou polipeptídeo resistentes à protease selecionados pelos métodos descritos nestes também podem ser produzidos em um sistema de expressão in vitro adequado, pela síntese químcia ou por qualquer outro método adequado. Deste modo, a presente invenção fornece for peptídeos e polipeptideos resistentes à protease.
POLIPEPTIDEOS, dAbs & ANTAGONISTAS
Como descritoe exemplificado neste, os dAbs resistentes à protease da invenção, em geral, ligam seu ligando alvo com alta afinidade. Deste modo, em um outro aspecto, é fornecido um método para a seleção de, isolamento e/ou recuperação um polipeptídeo ou dAb da invenção que ligam25 se aos IL-1R1 com alta afinidade. Em geral, o método compreende fornecer um biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptideos (por exemplo, dAbs), combinando o biblioteca ou repertório com uma protease (por exemplo, tripsina, elastase, leucozima, pancreatina, expectoração) sob condições adequadas para a atividade de protease e seleção, isolamento e/ou recuperação um peptideo ou polipeptídeo que ligam-se aos um ligando (por exemplo, ligando alvo). Porque a biblioteca ou repertório foi exposta à protease sob condições onde os peptídeos ou polipeptídeos sensíveis à protease serão digeridos, a atividade de protease pode eliminar os 5 polipeptídeos menos estáveis que têm afinidade de ligação baixa e desse modo produz uma coleção de peptídeos ou polipeptídeos de ligação por afinidade alta. Por exemplo, o polipeptídeo ou dAb selecionados da invenção pode ligar IL-1R1 com a afinidade (KD; KD = K^kdj/Kenfka) como determinado pela ressonância de plasmon de superfície) de 1 μΜ ou mais 10 forte ou cerca de 500 nM a cerca de 0,5 pM. Por exemplo, o polipeptídeo de afinidade alta ou dAb da invenção pode ligar IL-1R1 com a afinidade de cerca de 500 nM, cerca de 100 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 10 pM, cerca de 1 pM ou cerca de 0,5 pM. Embora não estejamos ligados a qualquer teoria, os peptídeos e polipeptídeos 15 que são resistantes à proteases são acreditados ter uma entropia mais baixa e/ou uma energia de estabilização mais alta. Deste modo, a correlação entre resistência a protease e ligação de afinidade alta podem ser relacionadas com a compactabilidade e estabilidade das superfícies dos peptídeos e polipeptídeos e dAbs selecionados pelos métodos descritos nestes.
Em uma forma de realização, o polipeptídeo, dAb ou antagonista da invenção inibe a ligação de IL-1 a IL-1R1 com uma concentração inibidora 50 (IC5o) de ou cerca de 500 nM a 50 pM, ou 100 nM a 50 pM ou 10 nM a 100 pM, ou 1 nM a 100 pM; por exemplo 50 nM ou menos ou 5 nM ou menos, ou 500 pM ou menos, ou 200 pM ou menos, ou 25 100 pM ou menos.
Em certas formas de realização, o polipeptídeo, dAb ou antagonista liga especialmente IL-1R1, por exemplo, IL-1R1 humano e dissociados a partir de IL-1R1 humano com uma constante de dissociação (KD) de 300 nM a 1 pM ou 300 nM a 5 pM ou 50 nM a 1 pM ou 50 nM a 5 pM ou 50 nM a 20 pM ou cerca de 10 pM ou cerca de 15pM ou cerca de 20 pM como determinado pela ressonância de plasmon de superfície. Em certas formas de realização, o polipeptídeo, dAb ou antagonista liga especialmente IL-1R1, por exemplo, IL-1R1 humano e dissocia-se do IL-1R1 humano com uma constante de taxa de Koff de 5 x 10'1 s’l a 1 x 10‘7 s1 ou 1 x 10‘3 s'l a 1 x IO'7 s’1 ou 1 x IO'4 s’l a 1 x IO'7 s'1 ou 1 x IO’3 s’l a 1 x IO'7 s'1 ou 1 x IO’4 s’1 ou 1 x 10'5 s’1 como determinado pela ressonância de plasmon de superfície. Em certas formas de realização, o polipeptídeo, dAb ou antagonista liga especialmente IL-1R1, por exemplo, IL-1R1 humano, com um Kon de 1 x 103 M^s'l a 1 x 10’7 M'k’1 ou 1 x 10’3 M’Vl a 1 x 10’6 M^s’1 ou cerca de 1 x 10'4 M'V1 ou cerca de 1 x IO'5 M^s’1. Em uma forma de realização, o polipeptídeo, dAb ou antagonista liga especialmente IL-1R1, por exemplo, IL-1R1 humano e dissocia-se do IL-1R1 humano com uma constante de dissociação (Kd) e um Koffcomo definido neste parágrafo. Em uma forma de realização, o polipeptídeo, dAb ou antagonista liga especialmente IL-1R1, por exemplo, IL-1R1 humano e dissocia-se do IL-1R1 humano com uma constante de dissociação (KD) e a Kon como definido neste parágrafo. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo ou dAb liga especialmente IL1R1 (por exemplo, IL-1R1 humano) com um KD e/ou K()f-f e/ou Kon como recitado neste parágrafo e compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos ou pelo menos cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico à sequência de aminoácido de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4).
O polipeptídeo, dAb ou antagonista pode ser expressado em E. coli ou em espécies Pichia (por exemplo, P. pastoris). Em uma forma de realização, o ligando ou monômero dAb é secretado em uma quantidade de pelo menos cerca de 0,5 mg/L quando expressado em espécies E. coli ou em espécies Pichia (por exemplo, P. pastoris). Embora, os ligandos e monômero dAbs descritos nestes pode ser secretável quando expressado em espécies E.
coli ou em espécies Pichia (por exemplo, P. pastoris), pode ser produzido usando qualquer método adequado, tal como métodos químicos sintéticos ou métodos de produção biológica que não utiliza espécies E. coli ou Pichia.
Em algumas formas de realização, o polipeptídeo, dAb ou antagonista que não compreendem um domínio variável de imunoglobulina de Camelídeo ou uma ou mais estruturas aminoácidos que são únicos aos domínios variáveis de imunoglobulina codificados pelos segmentos de gene de anticorpo de linha germinativa de Camelídeo, por exemplo, na posição 108,37, 44, 45 e/ou 47.
Os antagonistas de IL-1R1 de acordo com a invenção podem ser monovalentes ou multivalentes. Em algumas formas de realização, o antagonista é monovalente e contém um local de ligação que interage com IL1R1, o local de ligação fornecido por um polipeptídeo ou dAb da invenção. Os antagonistas monovalentes ligam um IL-1R1 e podem não induzir a reticulação ou agrupamento de IL-1R1 na superfície das células que pode levar à ativação do receptor e transdução de sinal.
Em outras formas de realização, o antagonista de IL-1R1 é multi valente. Os antagonistas multivalentes de IL-1R1 podem conter duas ou mais cópias de um local de ligação particular para IL-1R1 ou contém dois ou mais locais de ligação diferentes que ligam-se ao IL-1R1, pelo menos um dos locais de ligação sendo fornecidos por um polipeptídeo ou dAb da invenção. Por exemplo, como descrito neste o antagonista de IL-1R1 pode ser a dímero, trímero ou multímero que compreende dois ou mais cópias de um polipeptídeo particular ou dAb da invenção que ligam-se aos IL-1R1 ou dois ou mais polipeptídeos diferentes ou dAbs da invenção que ligam-se ao IL1R1. Em uma forma de realização, um antagonista multivalente do IL-1R1 não agoniza substancialmente o IL-1R1 (atua como um agonista de IL-1R1) em um ensaio celular padrão (isto é, quando presente em uma concentração de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ, 1000 μΜ ou 5.000 μΜ, resulta não mais do que cerca de 5 % da atividade mediada por IL-1R1 induzido por IL-1 (100 pg/ml) no ensaio).
Em certas formas de realização, o antagonista multivalente do IL-1R1 contém dois ou mais locais de ligação para um epítopo ou domínio de IL-1R1 desejados.
Em formas de realização particulares, o polipeptideo, dAb ou antagonista não agonizam substancialmente IL-1R1 (atua como um agonista de IL-1R1) em um ensaio celular padrão (isto é, quando presente em uma concentração de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ, 1000 μΜ ou 5,000 μΜ, resulta em não mais do que cerca de 5 % da atividade mediada por IL-1 induzida por IL-1 (100 pg/ml) no ensaio).
Em certas formas de realização, o polipeptideo, dAb ou antagonista da invenção são eficazes em modelos de doenças inflamatórioas crônicas quando uma quantidade eficaz é administrada é. Em geral, uma quantidade eficaz é de cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg (por exemplo, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, ou cerca de 10 mg/kg). Os modelos de doença inflamatória crônica (ver aquelas descritas em W02006059108) são são reconhecidas por aqueles habilitados na técnica como sendo preditivos de eficácia terapêutica em humanos.
Em outras formas de realização, o polipeptideo, dAb ou antagonista é eficaz no sulfato de sódio de dextrano de modelo induzido de camundongo (DSS) de IBD (ver W02006038027 para detalhes do modelo). Por exemplo, a administração de uma quantidade eficaz do polipeptideo, dAb ou antagonista pode reduzir o registro de gravidade médiano modelo DSS de camundongo de IBD, por exemplo, por cerca de 0,1 a cerca de 2,5, cerca de 0,5 a cerca de 2,5, cerca de 1 a cerca de 2,5, cerca de 1,5 a cerca de 2,5, ou cerca de 2 a cerca de 2,5, como comparado com um controle adequado. Em um outro exemplo, a administração de uma quantidade eficaz do polipeptideo, dAb ou antagonista pode atrasar o início de sintomas de IBD no modelo DSS de camundongo de IBD, por exemplo, por cerca de 1 dia, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, cerca de 10 dias, cerca de 14 dias, cerca de 21 dias ou cerca de 28 dias, como comparado com um controle adequado. Em um outro exemplo, a administração de uma quantidade eficaz do polipeptideo, dAb ou antagonista pode resultar em um registro de gravidade médio no modelo DSS de camundongo de IBD de 0 a cerca de 0,5, cerca de 0,5 a cerca de 1, cerca de 1 a cerca de 1,5, cerca de 1,5 a cerca de 2, ou cerca de 2 a cerca de 2,5.
Em formas de realização particulares, o polipeptideo, dAb ou antagonista é eficaz no modelo de fumaça de tabaco no camundongo mouse de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) (ver W02006038027 e W02007049017 para detalhes do modelo). Por exemplo, a administração de uma quantidade eficaz do ligando pode reduzir ou início atrasado dos sintomas de COPD, como comparado com um controle adequado.
Os sistemas de modelos de animais que podem ser usados para avaliar a efetividade dos antagonistas de IL-1R1 (por exemplo, ligandos, anticorpos ou proteínas de ligação destes) na proteção contra ou tratamento da doença estão disponíveis. O métodos para o teste de lúpus eritematoso sistêmico (SLE) em camundongos suscetíveis são conhecidas na técnica (Knight et al. (1978) J Exp. Med., 147: 1653; Reínarsten et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515). Myasthenia Gravis (MG) is tested in SJL/J female mice by inducing the disease with soluble AchR protein from another species (Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). Artrite is induced in a susceptible strain of mice by injection of Type II collagen (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). A model by que adjuvant artrite is induced in susceptible rats by injection of mycobacterial heat shock protein foi descrita (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). Thyroiditis is induced in mice by
100 administration of thyroglobulin as described (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). Insulin dependent diabetes mellitus (IDDM) occurs naturalmente ou pode ser induced in certain strains of mice tal como those described by Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, Tl\ 113. EAE in mouse and rat serves as a model for MS in human. In this model, the demyelinating disease is induced by administration of myelin basic protein (ver Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: and Satoh et al. (1987) J. Immunol., 138: 179).
Em geral, os presentes ligandos (por exemplo, antagonistas) serão utilizados na forma purificada junto com os carreadores farmacologicamente apropriados. Tipicamente, estes incluem soluções aquosas ou alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, qualquer uma incluindo solução salina e/ou meio tamponado. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio e Ringer lactado. Os adjuvantes fisiologicamente aceitáveis adequados, se necessário mantém um complexo de polipeptídeo em suspensão, podem ser escolhidos a partir de espessantes, tais como carboximetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina e alginatos.
Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluido e de nutriente e reabastecedores de eletrólito, tais como aqueles fundamentados na dextrose de Ringer. Os preservantes e outros aditivos, tais como antimicrobianos, antioxidantes, agentes queladores e gases inertes, também podem estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16° Edição). Uma variedade de formulações adequadas podem ser usadas, incluindo formulações de liberação estendida.
Os ligandos (por exemplo, antagonitas) da presente invenção podem ser usados como composições separadamente administradas ou em conjunção com outros agentes. Estes podem incluir various medicamentos
101 imunoterapêuticos, tal como cilcosporina, metotrexato, adriamicina ou cisplatina e imunotoxinas. As composições farmacêuticas podem incluir coquetéis de vários agentes citotóxicos ou outros agentes em conjunção com os ligandos da presente invenção ou ainda combinações de ligandos de acordo com a presente invenção tendo especificidades diferentes, tais como ligandos selecionados usando-se antígenos ou epítopos alvos diferentes, se ou não estes são unidos antes da administração.
A via de administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser pode ser qualquer uma daquelas comumente conhecidas por aquele com habilidade comum na técnica. Para terapia, incluindo imunoterapia sem limitação, os seus ligandos selecionados da invenção podem ser administrados a qualquer paciente de acordo com as técnicas padrão.
A administração pode ocorrer por qualquer modo apropriado, incluindo parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, transdermalmente, por intermédio da via pulmonar ou também, appropriatemente, pela infusão direta com um cateter. A dosagem e a frequência de administração dependerá da idade, sexo e condição do paciente, a administração concorrente de outros medicamentos, contraindicações e outros parâmetros a serem levados em conta pelo clínico. A administração pode ser local (por exemplo, liberação local ao pulmão pela administração pulmonar, por exemplo, administração intranasal) ou sistêmica como indicado.
Os ligandos desta invenção podem ser liofilizadas pode ser liofilizado para armazenagem e reconstituído em um carreador adequado antes do uso. Esta técnica foi mostrada ser eficaz com as imunoglobulinas convencionais e técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na técnica podem ser utilizadas. Será estimado por aqueles habilitados na técnica que a liofilização e reconstituição pode levar a graus variantes de perda de atividade
102 de anticorpo (por exemplo, com imunoglobulinas convencionais, anticorpos IgM tendem a ter perda de atividade maior do que os anticorpos IgG) e usam níveis que podem ser ajustados para cima para compensar.
As composições contendo os presentes ligandos (por exemplo, antagonistas) ou um coquetel destes pode ser administrado pelos tratamentos terapêuticos e/ou profíláticos. Em certas aplicações terapêuticas, uma quantidade adequada para realizar pelo menos inibição parcial, supressão, modulação, morte, ou alguns outros parâmetros medidos, de uma população de células selecionadas é definido como um dosagem terapeuticamente eficaz. As quantidades necessárias para atingir esta dosagem dependerão da gravidade da doença e o estado geral do próprio sistema imune do paciente, mas em geral varia de 0,005 a 5,0 mg de ligando, por exemplo, dAb ou antagonista por quilograma de peso corporal, com dosagens de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose sendo mais comumente usado. Para as aplicações profiláticas, as composições contendo os presentes ligandos ou coquetéis destes também podem ser administradas em dosagens levemente inferiores ou similares, para prevenir, inibir ou atrasar o início da doença (por exemplo, para sustentar a remissão ou quietude, ou para prevenir fase aguda). O clínico habilitado será capaz de determinar o intervalo de dosagem apropriada para tratar, suprimir ou prevenir a doença. Quando um ligando de IL-1R1 (por exemplo, antagonista) é administrado para tratar, suprimir ou prevenir a doença inflamatória crônica, este pode ser administrado até quatro vezes ao dia, duas vezes semanalmente, uma vez semanalmente, uma vez a cada dois meses, uma vez ao mês, ou uma vez a cada dois meses, em uma dosagem, por exemplo, cerca de 10 qg/kg a cerca de 80 mg/kg, cerca de 100 qg/kg a cerca de 80 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 80 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 70 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 60 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca
103 de 10 mg/kg, cerca de 10 gg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 10 gg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 gg/kg a cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg. Em formas de realização particulares, o ligando de IL-1R1 (por exemplo, antagonista) é administrado para tratar, suprimir ou prevenir a doença inflamatória crônica uma vez a cada dois meses ou uma vez ao mês em uma dosagem de cerca de 10 gg/kg a cerca de 10 mg/kg (por exemplo, cerca de 10 gg/kg, cerca de 100 gg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, 10 cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg.)
O tratamento ou terapia realizados usando-se as composições descritas neste é considerado “efetivo” se um ou mais sintomas forem reduzidos (por exemplo, por pelo menos 10 % ou pelo menos um ponto em 15 uma escala de avaliação clínica), relativos a tais sintomas presentes antes do tratamento, ou relativos a tais sintomas em um indivíduo (humano ou modelo animal) não tratado com tal composição ou outros controles adequado. Os sintomas, obviamente, variarão dependendo da doença ou distúrbio alvejado, mas pode ser medido por um clínico ou técnico com habilidade comum na 20 técnica. Tais sintomas pode ser medidos, por exemplo, pelo monitoramento do nível de um ou mais indicadores bioquímicos da doença ou distúrbio (por exemplo, níveis de uma enzima ou metabólitos correlacionados com a doença, número de células afetadas, etc.), pelo monitoramento de manifestações físicas (por exemplo, inflamação, tamanho do tumor, etc.) ou por uma escala 25 de estimativa clínica aceita, por exemplo, a Escala de Estado de Expanded Incapacidade Expandida (para esclerose múltipla), O Questionário de Doença do Intestino Inflamatório Irvine (estimativa de 32 pontos que avalia a qualidade de vida com respeito à função do intestino, sintomas sistêmicos, função social e estado emocional - variações de registro de 32 a 224, com os
104 registros mais altos indicando uma qualidade melhor de vida), a Escala de Artrite Reumatóide de Qualidade de Vida ou outra escala de estimativa clínica aceita Cómo conhecido nocampo. Uma redução sustentada (por exemplo, um dia ou mais ou mais longa) nos sintomas da doença ou distúrbio 5 por pelo menos 10 % ou por um ou mais pontos em uma dada escala clínica é indicativo de tratamento “efetivo”. Similarmente, a profilaxia realizada usando-se uma composição como descrito neste é “efetivo” se o início ou gravidade de um ou mais sintomas for atrasado, reduzido ou anulado com relação a tais sintomas em um indivíduo similar (modelo humano ou animal) 10 não tratados com a composição.
Uma composição contendo um ligando (por exemplo, antagonista) ou coquetel desta de acordo com a presente invenção pode ser utilizada nos ajustes profiláticos e terapêuticos para ajudar na alteração, inativação, morte ou remoção de uma população de células alvos selecionadas 15 em um mamífero. Além disso, os repertórios selecionados de polipeptídeos descritos nestes podem ser usados extracorporalmente ou in vitro selectivemente para matar, esgotar ou, de outra maneira, remover eficazmente uma população de células alvo de uma coleção heterogênea de células. O sangue de um mamífero pode ser combinado extracorporalmente com os 20 ligandos pelos quais as células indesejadas são mortas ou, de outra maneira, removidas do sangue para o retomo ao mamífero de acordo com as técnicas padrão.
Uma composição contendo um ligando (por exemplo, antagonista) de acordo com a presente invenção podem ser utilizada nos 25 ajustes profiláticos e terapêuticos para ajudar na alteração, inativação, morte ou remoção de uma população de células alvos selecionadas em um mamífero.
Os ligandos (por exemplo, antagonistas anti-IL-lRl, monômero dAbs) pode ser administrados e ou formulado junto com um ou
105 mais agentes terapêuticos ou ativos adicionais. Quando um ligando (por exemplo, a dAb) é administrado comum agente terapêutico adicional, o ligando podé ser administrado antes, simultaneamente ou subsequente à administração do agente adicional. Em geral, o ligando e o agente adicionais 5 são administrados e uma maneira que forneça uma sobreposição de efeito terapêutico.
Em uma forma de realização, a invenção é um método para o tratamento, supressão ou prevenção da doença inflamatória crônica, que compreende admnistrar a um mamífero em necessidade de uma dosagem 10 terapeuticamente eficaz ou quantidade de um polipeptideo, dAb ou antagonista de IL-1R1 de acordo com a invenção.
Em uma forma de realização, a invenção é um método para o tratamento, supressão ou prevenção de artrite (por exemplo, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, espondilite ancilosante, artrite 15 psoriática) que compreende a administração a um mamífero em necessidade desta dosagem terapeuticamente eficaz ou quantidade de um polipeptideo, dAb ou antagonista de IL-1R1 de acordo com a invenção.
Em uma outra forma de realização, a invenção é um método para o tratamento, supressão ou prevenção de psoríase que compreende 20 administrar a um mamífero em necessidade destes uma dosagem terapeuticamente eficaz ou quantidade de um polipeptideo, dAb ou antagonista de IL-1R1 de acordo com a invenção.
Em uma outra forma de realização, a invenção é um método para o tratamento, supressão ou prevenção doença do intestino inflamatória 25 (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa) que compreende a administração a um mamífero em necessidade destes de uma dosagem terapeuticamente eficaz ou uma quantidade de um polipeptideo, dAb ou antagonista de IL-1R1 de acordo com a invenção.
Em uma outra forma de realização, a invenção é um método
106 para o tratamento, supressão ou prevenção doença pulmonar obstrutiva crônica (por exemplo, bronquite crônica, bronquite obsrutiva crônica, enfisema), que compreende administrar a um mamífero em necessidade destes a dosagem terapeuticamente eficaz ou quantidade de um polipeptídeo, dAb ou 5 antagonista de IL- IR1 de acordo com a invenção.
Em uma outra forma de realização, a invenção é um método para o tratamento, supressão ou prevenção pneumonia (por exemplo, pneumonia bacteriana, tal como pneumonia por estafilococos) que compreende a administração a um mamífero em necessidade destes de uma 10 dosagem terapeuticamente eficaz ou quantidade de um polipeptídeo, dAb ou antagonista de IL-1R1 de acordo com a invenção.
A invenção fornece um método para o tratamento, supressão ou prevenção de outras doenças pulmonares além de doença pulmonar obstrutiva crônica e pneumonia. Outras doenças pulmonares que podem ser 15 tratadas, suprimidas ou prevenidas de acordo com a invenção incluem, por exemplo, fibrose cística e asma (por exemplo, asma resistente a esteróide). Deste modo, em uma outra forma de realização, a invenção é um método para o tratamento, supressão ou prevenção de uma doença pulmonar (por exemplo, fibrose cística, asma) que compreende administrar a um mamífero em 20 necessidade destes uma dosagem terapeuticamente eficaz ou quantidade de um polipeptídeo, dAb ou antagonista de IL-1R1 de acordo com a invenção.
Em formas de realização particulares, um antagonista de IL1R1 é administrado por itnermédio da liberação pulmonar, tal como por inalação (por exemplo, intrabronquial, intranasal ou inalação oral, gotas 25 intranasais) ou pela liberação sistêmica (por exemplo, parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea).
Em uma outra forma de realização, a invenção é um método de tratamento, supressão ou prevenção de choque séptico que compreende a administração a um mamífero em necessidade destes de uma dosagem
107 terapeuticamente eficaz ou quantidade de um polipeptídeo, dAb ou antagonista de IL-1R1 de acordo com a invenção.
Em um outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição que compreende a um polipeptídeo, dAb ou antagonista de IL1R1 de acordo com a invenção e um carreador diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
Além disso, a presente invenção fornece um método para o tratamento de doença usando-se um polipeptídeo, dAb ou antagonista de IL1R1 ou uma composição de acordo com a presente invenção. Em uma forma de realização a doença é câncer ou uma doença inflamatória, por exemplo, artrite reumatóide, asma ou doença de Crohn.
FORMATOS
A vida média aumentada é útil em aplciações in vivo de imunoglobulinas, especialmente anticorpos e mais especialmente fragmentos de anticorpo de tamanho pequeno. Tais fragmentos (Fvs, Fvs ligado por bissulfeto, Fabs, scFvs, dAbs) sofrem com a liberação rápida a partir do corpo; deste modo, enquanto são capazes de atingir a maioria das partes do corpo rapidmente e são rápidos de produzir e mais fáceis de manusear para produzir, suas aplicações in vivo foram limitadas apenas por sua persistência breve in vivo. Uma forma de realização da invenção resolve o problema fornecendo vida média aumentada dos ligandos in vivo e consequentmente tempos de persistência mais longos no corpo da atividade funcional do ligando.
Os métodos para a análise farmacocinética e determinação da vida média do ligando será familiar para aqueles habilitados na técnica. Os detalhes podem ser observados em Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists e em Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). Referência também é feita a “Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel
108
Dekker, 2 edição Rev. ex (1982), que descreve parâmetros farmacocinéticos, tais como vida média de t alfa e t beta e área sob a curva (AUC).
As vidas médias (t'A alfa e O/2 beta) e AUC podem ser determinadas a partir de uma curva de concentração do soro de ligando contra 5 o tempo. O pacote de análise WinNonlin (disponível da Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA) pode ser usado, por exemplo, para modelar a curva. Em uma primeira fase (a fase alfa) o ligando está sofrendom principalmente a distribuição no paciente, com alguma eliminação. Uma segunda fase (fase beta) é a fase terminal quando o ligando foi distribuído e a 10 concentração do soro é decrescente assim como o ligando é retirado do paciente. A vida média de t alfa é a vida média da primeira fase e a vida média de t beta é a vida média da segunda fase. Deste modo, em uma forma de realização, a presente invenção fornece um ligando ou uma composição que compreende um ligando de acordo com a invenção tendo uma vida média 15 de ta na faixa de 15 minutos ou mais. Em uma forma de realização, a extremidade inferior da faixa é de 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas ou 12 horas, além disso ou ou altemativemente, um ligando ou composição de acordo com a invenção terá uma vida média ta na faixa de até e incluindo 12 horas. Em 20 uma forma de realização, a extremidade superior da faixa é de 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 horas, um exemplo de uma faixa adequada é de 1 a 6 horas, 2 a 5 horas ou 3 a 4 horas.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um ligando (polipeptideo, dAb ou antagonista) ou uma composição que 25 compreende um ligando de acordo com a invenção tendo uma vida média ίβ na faixa de 2,5 horas ou mais. Em uma forma de realização, a extremidade inferior da faixa 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas ou 12 horas, além disso, ou altemativemente, um ligando ou composição de acordo com a invenção tem uma vida média ίβ na faixa de até e incluindo 21
109 dias. Em uma forma de realização, a extremidade superior da faixa é 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias ou 20 dias. Em uma forma de realização um ligando ou composição de acordo com a invenção terá uma vida média ίβ na faixa de 12 a 60 horas, ainda em uma outra forma de 5 realização, estará na faixa de 12 a 48 horas. Ainda em uma outra forma de realização ainda estará na faixa de 12 a 26 horas.
Além disso ou altemativamente aos critérios acima, a presente invenção fornece um ligando ou uma composição que compreende um ligando de acordo com a invenção (área sob a curva) na faixa de 1 mg.min/ml 10 ou mais. Em umatendo um valor AUC forma de realização, a extremidade inferior da faixa é 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ou 300 mg.min/ml. Além disso ou altemativemente, um ligando ou composição de acordo com a invenção tem um AUC na faixa de até 600 mg.min/ml. Em uma forma de realização, a extremidade superior da faixa é 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ou 50 15 mg.min/ml. Em uma forma de realização um ligando de acordo com a invenção terá um AUC na faixa selecionada do grupo que consiste dos seguintes: 15 a 150 mg.min/ml, 15 a 100 mg.min/ml, 15 a 75 mg.min/ml e 15 a 50mg.min/ml.
Os polipeptídeos e os dAbs da invenção e os antagonistas que 20 compreende estes podem ser formatados para ter um amplo tamanho hidrodinâmico, por exemplo, pela ligação de um grupo PEG, albumina de soro, transferrina, receptor de transferrina ou pelo menos a porção de ligação de transferrina destes, uma região Fc de anticorpo ou pela conjugação a um domínio de anticorpo. Por exemplo, polipeptídeos dAbs e antagonistas 25 formatados como um amplo fragmento de ligação de antigeno de um anticorpo ou as um anticorpo (por exemplo, formatado como um Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2, IgG, scFv).
O tamanho hidrodinâmico dos ligandos (por exemplo, monômero dAbs e multímeros) da invenção podem ser determinado pelo uso
110 de métodos que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, cromatografia de filtração em gel podem ser usado para determinar o tamanho hidrodinâmico de um ligando. As matrizes de filtração em gel para a determinação dos tamanhos hidrodinâmicos de ligandos, tais como matrizes 5 de agarose: reticuladas, são bem conhecidos e facilmente disponíveis.
O tamanho de um formato de ligando (por exemplo, o tamanho de uma porção de PEG a um monômero dAb), pode ser variado dependendo da aplicação desejada. Por exemplo, onde o ligando é pretendido deixar a circulação e entrar nos tecidos periféricos, é desejável manter o tamanho 10 hidrodinâmico do ligando baixo para facilitar o extravazamento da corrente sanguínea. Altemativemente, quando é desejado ter o remanescente de ligando na circulação sistêmica por um período mais longo de tempo, o tamanho do ligando pode ser aumentado, por exemplo pela formatação como uma proteína semelhante a Ig.
Extensão de vida média pelo alvejamento de um antígeno ou epítopo que aumenta a vida média in vivo
O tamanho hidrodinâmico de um ligando e sua vida média do soro também pode ser aumentada pela conjugação ou associação de um polipeptídeo de ligação de IL-1R1, dAb ou antagonista da invenção a um 20 domínio de ligação (por exemplo, fragmento de anticorpo ou anticorpo) que liga-se a um epítopo ou antígeno que aumenta a vida média in vivo, como descrito neste. Por exemplo, o agente de ligação de IL-1R1 (por exemplo, polipeptídeo) pode ser conjugado ou ligado a uma albumina anti-soro ou fragmento de anticorpo ou anticorpo receptor Fc anti-neonatal, por exemplo 25 um dAb receptor Fc anti-neonatal ou anti-SA, Fab, Fab’ ou scFv, ou a um aficorpo anti-SA ou aficorpo receptor Fc anti-neonatal ou um avímero antiSA, ou um domínio de ligação anti-SA que compreende uma armação selecionado de. mas preferivelmente não limitado a. o grupo que consiste de CTLA-4, lipocalina, SpA. um aficorpo. um avímero. GroEl e fibronectina
Ill (ver PCT/GB2008/000453 depositado em 8 de Fevereiro de 2008 para a divulgação deste domínio de ligação, no qual o domínio e suas sequências são incorporados neste por referência e formam partes da descoberta do presente texto). A conjugação refere-se a uma composição que compreende um polipeptideo, dAb ou antagonista da invenção que é ligado (covalentemente ou não covalentemente) a um domínio de ligação que liga-se a albumina de soro.
Polipeptídeos adequados que intensificam a vida média in vivo incluem, por exemplo, proteínas de fusão do agente neurofarmacêutico 10 ligando específico pelo receptor de transferrina (ver Patente U.S. N°.
5.977.307, as técnicas de que são incorporados neste por referência), receptor celular endotelial capilar, transferrina, receptor de transferrina (por exemplo, receptor de transferrina solúvel), insulina, receptor de fator 1 (IGF1) de desenvolvimento semelhante à insulina, receptor de fator 2 (IGF2) de 15 desenvolvimento semelhante à insulina, receptor de insulina, fator X de coagulação sanguínea, ocl-anti-tripsina e HNF lot. Os polipeptídeos adequados que intensificam a vida média também incluem alfa-1 glicoproteína (orosomucóide; AAG), alfa-1 anti-quimiotripsina (ACT), alfa-1 microglobulina (proteína HC; AIM), anti-trombina III (AT III), 20 apolipoproteína A-l (Apo A-l), apolipoproteína B (Apo B), ceruloplasmina (Cp), componente C3 de complemento (C3), componente C4 de complemento (C4), inibidor de estearase Cl (Cl INH), proteína reativa C (CRP), ferritina (FER), hemopexina (HPX), lipoproteína(a) (Lp(a)), proteína de ligação de manose (MBP), mioglobina (Myo), pré-albumina (transtirretina; PAL), 25 proteína de ligação retinol (RBP) e fator reumatóide (RF).
As proteínas adequadas a partir da matriz extracelular incluem, por exemplo, colágenos, lamininas, integrinas e fibronectina. Os colágenos são as maiores proteínas da matriz extracelular. Cerca de 15 tipos de moléculas de colágeno são correntemente conhecidos, observados em partes
112 diferentes do corpo, por exemplo colágeno tipo I (respondendo por 90 % do colágeno corporal) observado no osso, pele, tendão, ligamentos, córnea, órgãos internos ou colágeno tipo II observado em cartilagem, disco vertebral, humor vítreo e notocorda do olho.
As proteínas adequadas a partir do sangue incluem, por exemplo, proteínas de plasma (por exemplo, fibrina, a-2 macroglobulina, albumina de soro, fibrogênio (por exemplo, fibrogênio A, fibrogênio B), proteína A de soro amilóide, haptoglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina e oc-2-microglobulina), enzimas e inibidores de enzima (por exemplo, plasminogênio, lisozima, cistatina C, alfa-l-antitripsina e inibidor de tripsina pacreática), proteínas do sistema imune, tal como proteínas de imunoglobulina (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, cadeias leves de imunoglobulinas (capa/lambda)), proteínas de transporte (por exemplo, proteína de ligação de retinol, ot-1 microglobulina), defensinas (por exemplo, beta-defensina 1, defensina 1 de netrófilo, defensina 2 de netrófilo e defensina 3 de netrófilo) e outros.
As proteínas adequadas observadas na barreira cerebral sanguínea ou no tecido neural incluem, por exemplo, receptor de melanocortina, mielina, transportador de ascorbato e outros.
Os polipeptídeos adequados que intensificam a vida média in vivo também incluem proteínas localizadas no rim (por exemplo, policistina, colágeno tipo IV, transportador Kl de ânion orgânico, antigeno de Heymann), proteínas localizadas no fígado (por exemplo, desidrogenase alcoólica, G250), proteínas localizadas no pulmão (por exemplo, componente secretório, que liga-se ao IgA), proteínas localizadas no coração (por exemplo, HSP 27, que é associado com cardiomiopatia dilatada), proteínas localizadas na pele (por exemplo, queratina), proteínas específicass do osso tal como proteínas morfogênicas (BMPs), que são uma superfamília β de sub-série do fator de desenvolvimento de transformação das proteínas que demonstram a atividade
113 osteogênica (por exemplo, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP8), proteínas específicass por tumor (por exemplo, antigeno trofoblasto, receptor de herceptina, receptor de oestrogênio, catepsinas (por exemplo, catepsina B, que podem ser observadas no fígado e baço)).
As proteínas específicas de doenças adequadas incluem, por exemplo, antígenos expressados apenas em células T ativadas, incluindo LAG-3 (gene de ativação de linfócito), ligando de osteoprotegerina (OPGL; ver Nature 402, 304-309 (1999)), 0X40 (um membro da família do receptor TNF, expressado em células T ativadas e especificamente células que produzem o tipo I do vírus de leucemia de célula T superreguladas em humanos (HTLV-I); ver Immunol. 165 (1):263-70 (2000)). As proteínas específicas de doenças adequadas também incluem, por exemplo, metaloprotease (associada com artrite/cânceres) incluindo drosofila CG6512, paraplegina humana, FtsH humano, AFG3L2 humano, ftsH de murino; e fatores de desenvolvimento angiogênico, incluindo fator de desenvolvimento de fibroblastoo ácido (FGF-1), fator de desenvolvimento de fíbroblastoo básico (FGF-2), fator de desenvolvimento endotelial vascular/fator de permeabilidade vascular (VEGF/VPF), α-fator de desenvolvimento de transformação (TGF-α), fator alfa de necrose de tumor (TNF-α), angiogenina, Interleucina-3 (IL-3), Interleucina-8 (IL-8), fator de desenvolvimento endotelial derivado por plaqueta (PD-ECGF), fator de desenvolvimento placental (P1GF), fator-BB de desenvolvimento derivado por plaqueta de midcina (PDGF) e fractalcina.
Os polipeptideos adequados que intensificam a vida média in vivo também incluem proteínas de tensão tal como proteínas de choque por calor (HSPs). Os HSPs são normalmente observados intracelularmente. Quando estes são observados extracelularmente, é indicador que uma célula está morta e derramou seu conteúdo. Esta morte celular não programada (necrose) ocorre quando como um resultado de trauma, doença ou dano, HSPs
114 extracelulares disparam uma resposta a partir do sistema imune. A ligação ao HSP extracelular pode resultar na localização das composições da invenção a um local da doença.
As proteínas adequadas envolvidas no transporte Fc incluem, por exemplo, receptor de Brambell (também conhecido como FcRB). Este receptor Fc tem duas funções, ambas que são potencialmente úteis para a liberação. As funções são (1) transporte de IgG da mãe ao filho através da placenta (2) proteção de IgG a partir da degradação portanto prolongando a vida média do soro. Este é o conceito que o receptor recicla IgG a partir dos endossomos. (ver, Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997).) dAbs que liga-se a albumina de soro
A invenção em uma forma de realização fornece um polipeptídeo ou antagonista (por exemplo, ligando específico duplo que compreende um anti-IL-lRl dAb (um primeiro dAb)) que liga-se ao IL-1R1 e 15 um segundo dAb que liga-se a albumina de soro (SA), a segunda ligação de dAb SA com um Kd como determinado pela resonância de plasmon de superfície de 1 nM a 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 ou 500 μΜ (isto é, x 10'9 a 5 x 10’4), ou 100 nM a 10 μΜ, ou 1 a 5 μΜ ou 3 a 70 nM ou 10 nM a 1, 2, 3, 4 ou 5 μΜ. Por exemplo 30 a 70 nM como 20 determinado pela resonância de plasmon de superfície. Em uma forma de realização, o primeiro dAb (ou um monômero dAb) liga-se ao SA (por exemplo, HSA) com um Kd como determinado pela resonância de plasmon de superfície de aproximadamente 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM ou 1, 2 ou 3 μΜ. Em uma forma de realização, para um ligandoo específico duplo que 25 compreende um primeiro anti-SA dAb e um segundo dAb ao IL-1R1, a afinidade (por exemplo KD e/ou Koff como medido pela resonância de plasmon de superfície, por exemplo usando BiaCore) do segundo dAb para seu alvo é de 1 a 100000 vezes (por exemplo, 100 a 100000, ou 1000 a 100000, ou 10000 a 100000 vezes) a afinidade do primeiro dAb por SA. Em
115 uma forma de realização, a albumina de soro é albumina de soro humana (HSA). Por exemplo, o primeiro dAb liga-se ao SA com uma afinidade de aproximadamente 10 μΜ, enquanto o segundo dAb liga-se ao seu alvo com uma afinidade de 100 pM. Em uma forma de realização, a albumina de soro é 5 albumina de soro humana (HSA). Em uma forma de realização, o primeiro dAb liga-se ao SA (por exemplo, HSA) com um KD de aproximadamente 50, por exemplo 70, 100, 150 ou 200 nM. Detalhes dos ligandos específicos duplos são observados no W003002609, W004003019 e W004058821.
Os ligandos da invenção podem em uma forma de realização 10 compreender um dAb que liga-se a albumina de soro (SA) com um KD como determinado pela resonância de plasmon de superfície de 1 nM a 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 ou 500 μΜ (isto é, x 10'9 a 5 x 10-4), ou 100 nM a 10 μΜ, ou 1 a 5 μΜ ou 3 a 70 nM ou lOnM a 1, 2, 3, 4 ou 5 μΜ. Por exemplo 30 a 70 nM como determinado pela resonância de 15 plasmon de superfície. Em uma forma de realização, o primeiro dAb (ou um monômero dAb) liga-se ao SA (por exemplo, HSA) com um KD como determinado pela resonância de plasmon de superfície de aproximadamente 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM ou 1, 2 ou 3 μΜ. Em uma forma de realização, o primeiro e segundo dAbs são ligados por um ligador, por exemplo um 20 ligador de 1 a 4 aminoácidos ou de 1 a 3 aminoácidos, ou maior do que 3 aminoácidos ou maior do que 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 aminoácidos. Em uma forma de realização, um ligador mais longo (maior do que 3 aminoácidos) é usado para intensificar a potência (KD de um ou ambos dAbs no antagonista).
Em formas de realização particulares dos ligandos e antagonistas, o dAb liga-se a albumina de soro humano e compete para a ligação da albumina com um dAb selecionado do grupo que consiste de MSA-16, MSA-26 (ver W004003019 para a divulgação destas sequências, no qual as sequências e sua contraparte de ácido nucléico são incorporados neste
116 por referência e formam partes da descoberta do presente texto),
DOM7m-16 (SEQ ID N°: 473), DOM7m-12 (SEQ ID N°: 474), DOM7m-26 (SEQ ID N°: 475), DOM7r-l (SEQ ID N°: 476), DOM7r-3 (SEQ ID N°: 477), DOM7r-4 (SEQ ID N°: 478), DOM7r-5 (SEQ ID N°: 5 479), DOM7r-7 (SEQ ID N°: 480), DOM7r-8 (SEQ ID N°: 481), DOM7h-2 (SEQ ID N°: 482), DOM7h-3 (SEQ ID N°: 483), DOM7h-4 (SEQ ID N°: 484), DOM7h-6 (SEQ ID N°: 485), DOM7h-l (SEQ ID N°: 486), DOM7h-7 (SEQ ID N°: 487), DOM7h-22 (SEQ ID N°: 489), DOM7h-23 (SEQ ID N°: 490), DOM7h-24 (SEQ ID N°: 491), DOM7h-25 (SEQ ID N°: 492), DOM7h*10 26 (SEQ ID N°: 493), DOM7h-21 (SEQ ID N°: 494), DOM7h-27 (SEQ ID
N°: 495), DOM7h-8 (SEQ ID N°: 496), DOM7r-13 (SEQ ID N°: 497), DOM7r-14 (SÈQ ID N°: 498), DOM7r-15 (SEQ ID N°: 499), DOM7r-16 (SEQ ID N°: 500), DOM7r-17 (SEQ ID N°: 501), DOM7r-18 (SEQ ID N°: 502), DOM7r-19 (SEQ ID N°: 503), DOM7r-20 (SEQ ID N°: 504), DOM7r15 21 (SEQ ID N°: 505), DOM7r-22 (SEQ ID N°: 506), DOM7r-23 (SEQ ID
N°: 507), DOM7r-24 (SEQ ID N°: 508), DOM7r-25 (SEQ ID N°: 509), DOM7r-26 (SEQ ID N°: 510), DOM7r-27 (SEQ ID N°: 511), DOM7r-28 (SEQ ID N°: 512), DOM7r-29 (SEQ ID N°: 513), DOM7r-30 (SEQ ID N°: 514), DOM7r-31 (SEQ ID N°: 515), DOM7r-32 (SEQ ID N°: 516), DOM7r20 33 (SEQ ID N°: 517) (ver W02007080392 para a divulgação destas sequências, no qual as sequências e sua contraparte de ácido nucléico são incorporados neste por referência e formam partes da descoberta do presente texto; a SEQ ID N°’s neste parágrafo são aquelas que aparecem no W02007080392), dAb8 (dAblO), dAb 10, dAb36, dAb7r20 (DOM7r20), dAb7r21 (DOM7r21), dAb7r22 (DOM7r22), dAb7r23 (DOM7r23), dAb7r24 (DOM7r24), dAb7r25 (DOM7r27), dAb7r28 (DOM7r29), dAb7r31 (DOM7r25), dAb7r26 (DOM7r28), dAb7r29 (DOM7r31), dAb7r32 (DOM7r26), dAb7r27 (DOM7r29), dAb7r29 (DOM7r32), dAb7r33
117 (DOM7r33), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7h22 (DOM7h22), dAb7h23 (DOM7h23), dAb7h24 (DOM7h24), dAb7h25 (DOM7h25), dAb7h26 (DOM7h26), dAb7h27 (DOM7h27), dAb7h30 (DOM7h30), dAb7h31 (DOM7h31), dAb2 (dAbs 4,7,41), dAb4, dAb7, dAbll, dAbl2 (dAb7ml2), 5 dAbl3 (dAb 15), dAbl5, dAbló (dAb21, dAb7ml6), dAbl7, dAbl8, dAbl9, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25 (dAb26, dAb7m26), dAb27, dAb30 (dAb35), dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38 (dAb54), dAb41, dAb46 (dAbs 47, 52 and 56), dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7ml2, dAb7ml6, dAb7m26, dAb7rl (DOM 7rl), dAb7r3 (DOM7r3), '10 dAb7r4 (DOM7r4), dAb7r5 (DOM7r5), dAb7r7 (DOM7r7), dAb7r8 (DOM7r8), dAb7rl3 (DOM7rl3), dAb7rl4 (DOM7rl4), dAb7rl5 (DOM7rl5), dAb7rl6 (DOM7rl6), dAb7rl7 (DOM7rl7), dAb7rl8 (DOM7rl8), dAb7rl9 (DOM7rl9), dAb7hl (DOM7hl), dAb7h2 (DOM7h2), dAb7h6 (DOM7h6), dAb7h7 (DOM7h7), dAb7h8 (DOM7h8), dAb7h9 15 (DOM7h9), dAb7hlO (DOM7hlO), dAb7hll (DOM7hll), dAb7hl2 (DOM7hl2), dAb7hl3 (DOM7hl3), dAb7hl4 (DOM7hl4), dAb7pl (DOM7pl) e dAb7p2 (DOM7p2) (ver PCT/GB2008/000453 depositado em 8 de Fevereiro de 2008 para a divulgação destas sequências, no qual as sequências e sua contraparte de ácido nucléico são incorporados neste por 20 referência e formam partes da descoberta do presente texto). Nomes alternativos são mostrados nos parênteses após o dAb, por exemplo dAb8 tem um nome alternativo que é dAb 10 isto é dAb8 (dAb 10). Estas sequências também são apresentadas nas Figuras 51a e b.
Em certas formas de realização, o dAb liga-se a albumina de 25 soro humano e compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 80 %, ou pelo menos cerca de 85 %, ou pelo menos cerca de 90 %, ou pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 %, ou pelo menos cerca de 97 %, ou pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 % da indentidade de sequência de aminoácido com uma sequência de
118 aminoácido de um dAb selecionado do grupo que consiste de
MSA-16, MSA-26, DOM7m-16 (SEQ ID N°: 473), DOM7m- (SEQ ID N°: 474), DOM7m-26 (SEQ ID N°: 475), DOM7r-l (SEQ ID N°: 476), DOM7r-3 (SEQ ID N°: 477), DOM7r-4 (SEQ ID N°: 478),
DOM7r-5 (SEQ ID N°: 479), DOM7r-7 (SEQ ID N°: 480), DOM7r-8 (SEQ ID N°: 481), DOM7h-2 (SEQ ID N°: 482), DOM7h-3 (SEQ ID N°: 483), DOM7h-4 (SEQ ID N°: 484), DOM7h-6 (SEQ ID N°: 485), DOM7h-l (SEQ ID N°: 486), DOM7h-7 (SEQ ID N°: 487), DOM7h-22 (SEQ ID N°: 489), DOM7h-23 (SEQ ID N°: 490), DOM7h-24 (SEQ ID N°: 491), DOM7h-25 '10 (SEQ ID N°: 492), DOM7h-26 (SEQ ID N°: 493), DOM7h-21 (SEQ ID N°: 494), DOM7h-27 (SEQ ID N°: 495), DOM7h-8 (SEQ ID N°: 496), DOM7r- (SEQ ID N°: 497), DOM7r-14 (SEQ ID N°: 498), DOM7r-15 (SEQ ID N°: 499), DOM7r-16 (SEQ ID N°: 500), DOM7r-17 (SEQ ID N°: 501), DOM7r-18 (SEQ ID N°: 502), DOM7r-19 (SEQ ID N°: 503), DOM7r-20 (SEQ ID N°: 504), DOM7r-21 (SEQ ID N°: 505), DOM7r-22 (SEQ ID N°: 506), DOM7r-23 (SEQ ID N°: 507), DOM7r-24 (SEQ ID N°: 508), DOM7r25 (SEQ ID N°: 509), DOM7r-26 (SEQ ID N°: 510), DOM7r-27 (SEQ ID N°: 511), DOM7r-28 (SEQ ID N°: 512), DOM7r-29 (SEQ ID N°: 513), DOM7r-30 (SEQ ID N°: 514), DOM7r-31 (SEQ ID N°: 515), DOM7r-32 20 (SEQ ID N°: 516), DOM7r-33 (SEQ ID N°: 517) (a SEQ ID N°’s neste parágrafo são aquelas que aparecem no W02007080392), dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, 25 Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAbll, dAbl2, dAbl3, dAbl5, dAbló, dAb!7, dAbl8, dAbl9, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7ml2, dAb7m!6, dAb7m26, dAb7rl, dAb7r3,
119 dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7rl3, dAb7rl4, dAb7rl5, dAb7rl6, dAb7rl7, dAb7rl8, dAb7rl9, dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hlO, dAb7hll, dAb7hl2, dAb7hl3, dAb7hl4, dAb7pl e dAb7p2.
Por exemplo, o dAb que liga-se a albumina de soro humano podem compreender uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 90 %, ou pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 %, ou pelo menos cerca de 97 %, ou pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 % da indentidade de sequência de aminoácido com DOM7h-2 (SEQ ID '10 N° :482), DOM7h-3 (SEQ ID N° :483), DOM7h-4 (SEQ ID N°:484), DOM7h6 (SEQ ID N°:485), DOM7h-l (SEQ ID N°:486), DOM7h-7 (SEQ ID N° :487), DOM7h-8 (SEQ ID N°:496), DOM7r-13 (SEQ ID N° :497),
DOM7r-14 (SEQ ID N° :498), DOM7h-22 (SEQ ID N° :489), DOM7h-23 (SEQ ID N° :490), DOM7h-24 (SEQ ID N° :491), DOM7h-25 (SEQ ID
N°:492), DOM7h-26 (SEQ ID N°:493), DOM7h-21 (SEQ ID N°:494),
DOM7h-27 (SEQ ID N° :495) (a SEQ ID N°’s neste parágrafo são aquelas que aparecem no W02007080392), dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, 20 dAb7, dAbll, dAbl2, dAbl3, dAbl5, dAbl6, dAbl7, dAbl8, dAbl9, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hl0, dAb7hl 1, dAb7hl2, dAb7hl3 e dAb7hl4.
Em certas formas de realização, o dAb liga-se a albumina de soro humano e compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 80 %, ou pelo menos cerca de 85 %, ou pelo menos cerca de 90 %, ou pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 %, ou pelo menos cerca de 97 %, ou pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de
120 % da indentidade de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácido de um dAb selecionado do grupo que consiste de
DOM7h-2 (SEQ ID N° :482), DOM7h-6 (SEQ ID N° :485), DOM7h-l (SEQ ID N°:486), DOM7h-7 (SEQ ID N°:487), DOM7h-8 (SEQ ID N° :496), DOM7h-22 (SEQ ID N°:489), DOM7h-23 (SEQ ID N° :490), DOM7h-24 (SEQ ID N°:491), DOM7h-25 (SEQ ID N°:492), DOM7h-26 (SEQ ID N°:493), DOM7h-21 (SEQ ID N°:494), DOM7h-27 (SEQ ID N°:495) (a SEQ ID No,s neste parágrafo são aquelas que aparecem no W02007080392), dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hlO, dAb7hll, dAb7hl2, dAb7hl3 e dAb7hl4.
Nas formas de realização mais particulares, o dAb é um VK dAb que liga-se a albumina de soro humano e tem uma sequência de aminoácido selecionado do grupo que consiste de
DOM7h-2 (SEQ ID N° :482), DOM7h-6 (SEQ ID N°:485), DOM7h-l (SEQ ID N°:486), DOM7h-7 (SEQ ID N°:487), DOM7h-8 (SEQ ID N° :496) (a SEQ ID N°’s neste parágrafo são aquelas que aparecem no W02007080392), dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb54, dAb7hl, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hlO, dAb7hll, dAb7hl2, dAb7hl3 e dAb7hl4.
Nas formas de realização mais particulares, o dAb é um VH dAb que liga-se a albumina de soro humano e tem uma sequência de aminoácido selecionado de dAb7h30 e dAb7h31.
Nas formas de realização mais particulares, o dAb é dAb7hl 1 ou dAb7hl4.
Em outras formas de realização, o dAb, ligando ou antagonista
121 ligam-se a albumina de soro humano e compreendem um, dois ou três dos CDRs de qualquer um das sequências de aminoácidos precedentes, por exemplo um, dois ou três dos CDRs de dAb7hl 1 ou dAb7hl4.
Vhh de Camelídeo adequado que liga-se a albumina de soro incluem aqueles divulgados no WO 2004/041862 (Ablynx N.V.) e no W02007080392 (no qual as sequências VHH e sua contraparte de ácido nucléico são incorporados neste por referência e formam partes da descoberta do presente texto), tal como Sequência A (SEQ ID N°:518), Sequência B (SEQ ID N°:519), Sequência C (SEQ ED N°:520), Sequência D (SEQ ID N°:521), Sequência E (SEQ ID N°:522), Sequência F (SEQ ID N°:523), Sequência G (SEQ ED N°:524), Sequência H (SEQ ID N°:525), Sequência I (SEQ ID N°:526), Sequência J (SEQ ID N°:527), Sequência K (SEQ ID N°:528), Sequência L (SEQ ID N°:529), Sequência M (SEQ ID N°:530), Sequência N (SEQ ID N°:531), Sequência O (SEQ ID N°:532), Sequência P (SEQ ID N°:533), Sequência Q (SEQ ID N°:534), estes números de sequências correspondem aquelas citadas no W02007080392 ou WO 2004/041862 (Ablynx N.V.). Em certas formas de realização, o VHH de Camelídeo liga-se a albumina de soro humano e compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 80 %, ou pelo menos cerca de 85 %, ou pelo menos cerca de 90 %, ou pelo menos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 %, ou pelo menos cerca de 97 %, ou pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 % da indenidade de sequência de aminoácido com ALB1 divulgado no W02007080392 ou qualquer uma da SEQ ID N°S: 518-534, estes números de sequências correspondem aquelas citadas no W02007080392 ou WO 2004/041862.
Em algumas formas de realização, o ligando ou antagonista compreendem um dAb de albumina anti-soro que compete com qualquer dAb de albumina anti-soro divulgado neste para a ligação a albumina de soro (por exemplo, albumina de soro humano).
122
Em uma forma de realização alternativa, o antagonista ou ligando compreendem uma porção de ligação específica por IL-1R1 (por exemplo, IL-1R1 humano), em que a porção compreende não sequências de imunoglobulina como descritas no Pedido co-pendente PCT/GB2008/000453 depositado em 8 de Fevereiro de 2008, a descoberta destas porções de ligação, seus métodos de produção e seleção (por exemplo, a partir de diversas bibliotecas) e suas sequências são incorporadas neste por referência como partes da descoberta do presente texto)
Conjugação a uma porção que estende a vida média (por exemplo, albumina)
Em uma forma de realização, uma porção que estende a vida média (uma ou mais) (por exemplo, albumina, transferrina e fragmentos análogos destes) é conjugado ou associado com o polipeptídeo de ligação IL1R1, dAb ou antagonista da invenção. Exemplos de albumina adequada, fragmentos de albumina ou variante de albumina para o uso em um formato de ligação IL-1R1 como descrito no WO 2005077042, no qual a descoberta é incorporada neste por referência e formam partes da descoberta do presente texto. Em particular, a seguinte albumina, fragmentos de albumina ou variantes de albumina podem ser usadas na presente invenção:
• SEQ ID N°:l (como divulgado no WO 2005077042, esta sequência sendo explicitamente incorporada nesta presente descoberta por referência);
• Fragmento ou variante de albumina que compreendem ou que consistem de aminoácidos 1-387 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042;
• Albumina, ou fragmento ou variante destes, que compreendem uma sequência de aminoácido selecionado do grupo que consiste de: (a) aminoácidos 54 a 61 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042; (b) aminoácidos 76 a 89 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042; (c) aminoácidos 92 a 100 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042; (d) aminoácidos
123
170 a 176 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042; (e) aminoácidos 247 a 252 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042; (f) aminoácidos 266 a 277 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042; (g) aminoácidos 280 a 288 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042; (h) aminoácidos 362 a 368 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042; (i) aminoácidos 439 a 447 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042 (j) aminoácidos 462 a 475 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042; (k) aminoácidos 478 a 486 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042; e (1) aminoácidos 560 a 566 da SEQ ID N°:l no WO 2005077042.
Ainda os exemplos de albumina adequada, fragmentos e análogos para o uso em um formato de ligação IL-1R1 como descrito no WO 03076567, no qual a descoberta é incorporada neste por referência e que formam partes da descoberta do presente texto. Em particular, a seguinte albumina, fragmentos ou variantes podem ser usados na presente invenção:
• Albumina de soro humano como descrito no WO 03076567, por exemplo, na figura 3 (esta informação da sequência sendo explicitamente incorporada na presente descoberta por referência);
• Albumina de soro humano (HA) que consiste de uma cadeia de polipeptídeo não glicosilado simples de 585 aminoácidos com uma fórmula de peso molecular de 66.500 (ver, Meloun, et al., FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 267:6747(1986));
• Uma variante ou análogo ou fragmento de albumina como descrito no Weitkamp, etal., Ann. Hum. Genet. 57:219 (1973);
• Um fragmento ou variante de albumina como descrito no EP 322094, por exemplo, HA(l-373., HA(l-388), HA(l-389), HA(l-369) e HA(1-419) e fragmentos entre 1-369 e 1-419;
• Um fragmento ou variante de albumina como descrito no EP 399666, por exemplo, HA(1-177) e HA( 1-200) e fragmentos entre HA(l-X),
124 onde X é qualquer número de 178 a 199.
Onde uma porção que estende a vida média (um ou mais) (por exemplo, albumina, transferrina e fragmentos análogos destes) é usada para formatar o polipeptídeo de ligação IL-1R1, dAbs e antagonistas da invenção, este pode ser conjugado usando qualquer método adequado, tal como, pela fusão direta à porção de ligação IL-1R1 (por exemplo, anti-IL-lRl dAb), por exemplo pelo uso de uma construção de nucleotídeo simples que codifica uma proteína de fusão, em que a proteína de fusão é codificada como uma cadeia de polipeptídeo simples com a porção que estende a vida média localizada no terminal C ou N à porção de ligação IL-1R1. Altemativamente, a conjugação pode ser atingida pelo uso de um ligador de peptídeo entre as porções, por exemplo, um ligador de peptídeo como descrito no WO 03076567 ou WO 2004003019 (estas descobertas de ligadores sendo incoporadas por referência na presente descoberta para fornecer exemplos para o uso na presente invenção). Tipicamente, um polipeptídeo que intensifica a vida média do soro in vivo é um polipeptídeo que ocorre naturalmente in vivo e que resiste a degradação ou remoção pelos mecanismos endógenos que removem o material não desejado a partir do organismo (por exemplo, humano). Por exemplo, um polipeptídeo que intensifica vida média do soro in vivo pode ser selecionado de proteínas a partir da matriz extracelular, proteínas observadas no sangue, proteínas observadas na barreira cerebral sanguínea ou no tecido neural, proteínas localizadas no rim, fígado, pulmão, coração, pele ou osso, proteínas de tensão, proteínas específicas por doenças, ou proteínas envolvidas no transporte Fc.
Em formas de realização da invenção descritas em toda partes desta descoberta, em vez do uso de um anti-IL-lRl “dAb” em um antagonista ou ligando da invenção, é considerado que o destinatário habilitado pode usar um polipeptídeo ou domínio que compreende um ou mais ou todos os 3 de CDRs de um dAb da invenção que liga-se a IL-1R1 (por exemplo, CDRs
125 enxertados em uma armação ou esqueleto de proteína adequado, por exemplo um aficorpo, uma armação SpA, um domínio A de classe receptora LDL ou um domínio EGF ) A descoberta como um total é para ser construído de acordo para fornecer a divulgação de antagonistas usando tais domínios no 5 lugar de um dAb. Neste respeito, ver PCT/GB2008/000453 depositado em 8 de Fevereiro de 2008, a descoberta de que é incorporado por referência).
Em uma forma de realização, portanto, um antagonista da invenção compreende um domínio variável simples de imunoglobulina ou anticorpo de domínio (dAb) que tem a especificidade de ligação por IL-1R1 10 ou as regiões que determinam a complementaridade de um tal dAb em um formato adequado. O antagonista pode ser um polipeptideo que consiste de um tal dAb, ou consiste essencialmente de um tal dAb. O antagonista pode ser um polipeptideo que compreende um dAb (ou os CDRs de um dAb) em um formato adequado, tal como um formato de anticorpo (por exemplo, formato 15 semelhante ao IgG, scFv, Fab, Fab’, F(ab’)2), ou um ligandoo específico duplo que compreende um dAb que liga-se ao IL-1R1 e um segundo dAb que liga-se a uma outra proteína alvo, antigeno ou epítopo (por exemplo, albumina de soro).
Os polipeptideos, dAbs e antagonistas de acordo com a 20 invenção podem ser formatados com uma variedade de formatos de anticorpo adequados que são conhecidos na técnica, tal como, formato semelhante ao IgGs, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos de cadeia simples, anticorpos biespecíficos, cadeias pesadas de anticorpos, cadeias leves de anticorpos, homodímeros e heterodímeros de 25 cadeias pesadas de anticorpos e/ou cadeias leves, fragmentos de ligação de antígenos de qualquer um dos precedentes (por exemplo, um fragmento Fv (por exemplo, Fv de cadeia simples (scFv), um Fv ligado a bissulfeto), um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab’)2), um domínio de variável simples (por exemplo, VH, VL), um dAb e versões modificadas de
126 qualquer um dos precedentes (por exemplo, modificado pela ligação covalente de polialquileno glicol (por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polibutileno glicol) ou outros polímeros adequados).
Em algumas formas de realização, a invenção fornece um ligando (por exemplo, um antagonista anti-IL-lRl) que é um formato semelhante ao IgG. Tais formatos tem as quatro cadeias convencionais da estrutura de uma moléculas IgG (2 duas cadeias pesadas e duas cadeias leves), em que uma ou mais das regiões variáveis (VH e ou VL) foram substituídos com um dAb da invenção. Em uma forma de realização, cada uma das regiões * 10 variáveis (2 regiões VH e 2 regiões VL) é substituído com um dAb ou domínio de variável simples, pelo menos um de que é um anti-IL-lRl dAb de acordo com a invenção. Os dAb(s) ou domínio de variável simples(s) que são incluídos em um formato semelhante ao IgG pode ter a mesma especificidade ou especificidades diferentes. Em algumas formas de realização, o formato 15 semelhante ao IgG é tetravalente e pode ter um (anti-IL-lRl apenas), dois (por exemplo, anti-IL-lRl e anti-SA), três ou quatro especificidades. Por exemplo, o formato semelhante ao IgG pode ser monoespecífico e compreende 4 dAbs que tem a mesma especificidade; biespecifico e que compreende 3 dAbs que tem a mesma especificidade e um outro dAb que tem 20 uma especificidade diferente; biespecifico e que que compreende two dAbs que tem a mesma especificidade e dois dAbs que tem um comum mas especificidade diferente; triespecífico e que compreende primeiro e segundo dAbs que tem a mesma especificidade, um terceiro dAb com a especificidade diferente e um quatro dAb com a especificidade diferente a partir do primeiro, 25 segundo e terceiro dAbs ou tetraespecífico e que compreende quatro dAbs que cada um tem uma especificidade diferente. Os fragmentos de ligação do antígeno de formato semelhante ao IgGs (por exemplo, Fab, F(ab’)2, Fab’, Fv, scFv) pode ser preparado. Em uma forma de realização, o formato semelhante ao IgGs ou fragmentos de ligação de antígenos deste não reticula IL-1R1, por
127 exemplo, o formato pode ser monovalente por IL-1R1. Se o complemento da ativação e/ou função da citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) é desejado, o ligando pode ser um formato semelhante ao IgGl. Se desejado, o formato semelhante ao IgG pode compreender uma região 5 constante mutada (região constante de cadeia pesada de variante IgG) para minimizar uma ligação ao receptor Fcs e/ou capacidade ao complemento fixo, (ver por exemplo Winter et al., GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, December 22, 1994).
Os ligandos da invenção (polipeptídeos, dAbs e antagonistas) * 10 podem ser formatados como uma proteína de fusão que contém um primeiro domínio de variável simples de imunoglobulina que é fundido diretamente a um segundo domínio de variável simples de imunoglobulina. Se desejado um tal formato ainda pode compreender uma porção que estende a vida média. Por exemplo, o ligando pode compreender um primeiro domínio de variável 15 simples de imunoglobulina que é fundido diretamente a um segundo domínio de variável simples de imunoglobulina que é fundido diretamente a um domínio variável simples de imunoglobulina que liga-se a albumina de soro.
Geralmemte a orientação dos domínios de polipeptídeo que tem um local de ligação com a especificidade de ligação por um alvo e se o 20 ligando compreende um ligador, é uma origem de projeto escolhido. Entretanto, algumas orientações, com ou sem ligadores, pode fornecer maiores características de ligação do que outras orientações. Todas as orinetações (por exemplo, dAbl-ligador-dAb2; dAb2-ligador-dAbl) são abrangidos pela invenção são ligandos que contém uma orientação que 25 fornece as características de ligação desejadas podem ser facilmente identificados pela avaliação.
Os polipeptídeos e dAbs de acordo com a invenção, incluindo monômeros dAb, dímeros e trímeros, pode ser ligado a uma região Fc do anticorpo, que compreende um ou ambos dos domínios CH2 e Ch3 e
128 opcionalmente uma região de junta. Por exemplo, os vetores que codifica os ligandos ligados como uma sequência de nucleotídeo simples a uma região Fc pode ser Usado para preparar tais polipeptideos.
A invenção além disso fornece dímeros, trímeros e poímeros 5 dos monômeros dAb anteriormente mencionados.
SEQUÊNCIAS OTIMIZADAS POR CÓDON
Como descrito acima, as formas de realização da invenção fornecem sequências de nucleotídeos otimizados por códon que codifica os polipeptideos e domínios de variáveis da invenção. Como mostrado na 10 ilustração seguinte, as sequências otimizadas por códon de cerca de 70 % de identidade pode ser produzido que codifica para o mesmo domínio de variável (neste caso a sequência de aminoácido de domínio variável é idêntica ao DOMlh-131-206). Neste exemplo, as sequências foram otimizadas para a expressão por Pichia pastoris (as sequências otimizadas por códon 1-3) ou E. 15 coli (as sequências otimizadas por códon 4 e 5).
Realizamos um cálculo que leva em conta a degeneração no código genético e maximizado no número de mudanças de nucleotídeo dentro de cada códon degenerado codificado pela sequência de nucleotídeo de DOMlh-131-206 como mostrado na figura 19 e uma sequência de 20 nucleotídeo teórico que ainda codifica um domínio variável que é idêntico ao DOMlh-131-206. O cálculo revelou que a sequência teórica teria apenas 57 % de identidade da sequência de nucleotídeo de DOMlh-131-206 como mostrado na figura 19.
Sequência 1 otimizada por códon
Sequência de DNA gaggttcaattgttggaatccggtggtggattggttcaacctggtggttctttgagattgtcctgtgctgctt ccggttttactttcgctcacgagactatggtttgggttagacaggctccaggtaaaggattggaatgggtttc ccacattccaccagatggtcaagatccattctacgctgactccgttaagggaagattcactatctccagagac aactccaagaacactttgtacttgcagatgaactccttgagagctgaggatactgctgtttaccactgtgctt
129 tgttgccaaagagaggaccttggtttgattactggggacagggaactttggttactgtttcttcc
Sequência AA correspondente evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgq dpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss · 74,1 % da identidade da sequência à sequência WT
150
Domlh Códon otimizado por Domlh-131-206 (1) GAGGTTCAATTGTTGGAATCCGGTGGTGGATTGGTTCAACCTGGTGGTTC
Domlh-131-206 WT (1) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC
Consenso (1) GAGGT CA TGTTGGA TC GG GG GG TTGGT CA CCTGG GG TC
51100
Domlh Códon otimizado por Domlh-131-206 (51) TTTGAGATTGTCCTGTGCTGCTTCCGGTTTTACTTTCGCTCACGAGACTA
Domlh-131 -206 WT (51) CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA
Consenso (51) TG G T TCCTGTGC GC TCCGG TT AC TT GC CA GAGAC A
101150
Domlh Códon otimizado por Domlh-131-206 (101) TGGTTTGGGTTAGACAGGCTCCAGGTAAAGGATTGGAATGGGTTTCCCAC
Domlh-131-206 WT (101) TGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT
Consenso (101) TGGT TGGGT G CAGGC CCAGG AA GG T GA TGGGT TC CA
151200
Domlh Códon otimizado por Domlh-131-206 (151) ATTCCACCAGATGGTCAAGATCCATTCTACGCTGACTCCGTTAAGGGAAG
Domlh-131-206 WT (151) ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCG
Consenso (151) ATTCC CC GATGGTCA GATCC TTCTACGC GACTCCGT AAGGG G
201250
Domlh Códon otimizado por Domlh-131-206 (201) ATTCACTATCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACTTTGTACTTGCAGATGA
Domlh-131-206 WT (201) GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGA
Consenso (201) TTCAC ATCTCC G GACAA TCCAAGAACAC T TA TGCA ATGA
251300
Domlh Códon otimizado por Domlh-131-206 (251) ACTCCTTGAGAGCTGAGGATACTGCTGTTTACCACTGTGCTTTGTTGCCA
Domlh-131-206 WT (251) ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT
Consenso (251) AC C TG G GC GAGGA AC GC GT TA CACTGTGC TG T CC
301350
Domlh Códon otimizado por Domlh-131-206 (301) AAGAGAGGACCTTGGTTTGATTACTGGGGACAGGGAACTTTGGTTACTGT Domlh-131-206 WT (301) AAGAGGGGGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT
Consenso (301) AAGAG GG CCTTGGTTTGA TACTGGGG CAGGGAAC TGGT AC GT
351363
Domlh Códon otimizado por Domlh-131-206 (351) TTCTTCCTAATGA
Domlh-131-206 WT (351) CTCGAGC-----Consenso (351) TC C
Consenso (351) TC C
Sequência 2 otimizada por códon
Sequência de DNA gagaaaagagaggttcaattgcttgaatctggaggaggtttggtccagccaggagggtcccttcgactaagttgtgc tgccagtgggtttacgtttgctcatgaaactatggtatgggtccgacaggcacctggtaaaggtcttgaatgggttt cacatatccctccagacggtcaagacccattttacgctgattccgtgaaaggcagatttacaatttcacgagataat tctaaaaacaccttgtacttacaaatgaactcattgagagctgaggacactgcagtttatcactgcgctttactacc aaaacgtggaccttggtttgattattggggccaaggtacgttagtgactgttagttct
Sequência AA correspondente ekrevqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippd gqdpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss • 71,1 % da identidade da sequência à sequência WT
130
150
Domlh-131-206 WT (1) ---------GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCC
Pichia MFa 206 dAb apenas (1) GAGAAAAGAGAGGTTCAATTGCTTGAATCTGGAGGAGGTTTGGTCCAGCC
Consenso (1) GAGGT CA TG T GA TCTGG GGAGG TTGGT CAGCC
51100
Domlh-131-206 WT (42) TGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGC
Pichia MFa 206 dAb apenas (51) AGGAGGGTCCCTTCGACTAAGTTGTGCTGCCAGTGGGTTTACGTTTGCTC
Consenso (51) GG GGGTCCCT CG CT TGTGC GCC GG TT AC TTTGC C
101150
Domlh-131-206 WT (92) ATGAGACGATGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGG
Pichia MFa 206 dAb apenas (101) ATGAAACTATGGTATGGGTCCGACAGGCACCTGGTAAAGGTCTTGAATGG
Consenso (101) ATGA AC ATGGT TGGGTCCG CAGGCACC GG AA GGTCT GA TGG
151200
Domlh-131-206 WT (142) GTCTCACATATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGT
Pichia MFa 206 dAb apenas (151) GTTTCACATATCCCTCCAGACGGTCAAGACCCATTTTACGCTGATTCCGT
Consenso (151) GT TCACATAT CC CC GA GGTCA GA CC TT TACGC GA TCCGT
201250
Domlh-131-206 WT (192) GAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATC
Pichia MFa 206 dAb apenas (201) GAAAGGCAGATTTACAATTTCACGAGATAATTCTAAAAACACCTTGTACT
Consenso (201) GAA GGC G TT AC AT TC CG GA AATTC AA AACAC T TA
251300
Domlh-131-206 WT (242) TGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCG
Pichia MFa 206 dAb apenas (251) TACAAATGAACTCATTGAGAGCTGAGGACACTGCAGTTTATCACTGCGCT
Consenso (251) T CAAATGAAC TG G GC GAGGACAC GC GT TATCACTG GC
301350
Domlh-131-206 WT (292) CTGCTTCCTAAGAGGGGGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCT
Pichia MFa 206 dAb apenas (301) TTACTACCAAAACGTGGACCTTGGTTTGATTATTGGGGCCAAGGTACGTT
Consenso (301) T CT CC AA G GG CCTTGGTTTGA TA TGGGG CA GG AC T
351367
Domlh-131-206 WT (342) GGTCACCGTCTCGAGCPichia MFa 206 dAb apenas (351) AGTGACTGT-TAGTTCT
Consenso (351) GT AC GT T G C
Sequência 3 otimizada por códon
Sequência de DNA gaagtgcagcttcttgaaagtggtggagggctagtgcagccagggggatctttaagattatcatgcgctgcca gtggatttacttttgctcacgagacgatggtctgggtgagacaagctcctggaaaaggtttagagtgggtttc tcacattccacctgatggtcaagatcctttctacgcagattccgtcaaaggaagatttactatctccagagat aatagtaaaaacactttgtacctacagatgaactcacttagagccgaagataccgctgtgtaccactgcgcct tgttgccaaagagaggtccttggttcgattactggggtcagggtactctggttacagtctcatct
Sequência AA correspondente evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrd nskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss • 72,6 % da identidade da sequência à sequência WT
150
Domlh-131-206 WT (1) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC
Pichia Pre 206 dAb apenas (1) GAAGTGCAGCTTCTTGAAAGTGGTGGAGGGCTAGTGCAGCCAGGGGGATC
Consenso (1) GA GTGCAGCT T GA TGG GGAGG T GT CAGCC GGGGG TC
51100
Domlh-131-206 WT (51) CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA
Pichia Pre 206 dAb apenas (51) TTTAAGATTATCATGCGCTGCCAGTGGATTTACTTTTGCTCACGAGACGA
Consenso (51) T G T TC TG GC GCC GGATT AC TTTGC CA GAGACGA
101150
Domlh-131-206 WT (101) TGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT
Pichia Pre 206 dAb apenas(101) TGGTCTGGGTGAGACAAGCTCCTGGAAAAGGTTTAGAGTGGGTTTCTCAC
Consenso (101) TGGT TGGGT G CA GC CC GG AA GGT TAGAGTGGGT TC CA
151200
Domlh-131-206 WT (151) ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCG
Pichia Pre 206 dAb apenas(151) ATTCCACCTGATGGTCAAGATCCTTTCTACGCAGATTCCGTCAAAGGAAG
Consenso (151) ATTCC CC GATGGTCA GATCC TTCTACGCAGA TCCGT AA GG G
201250
Domlh-131-206 WT (201) GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGA
Pichia Pre 206 dAb apenas(201) ATTTACTATCTCCAGAGATAATAGTAAAAACACTTTGTACCTACAGATGA
Consenso (201) TT AC ATCTCC G GA AAT AA AACAC T TA CT CA ATGA
251300
131
Domlh-131-206 WT (251) ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT
Pichia Pre 206 dAb apenas(251) ACTCACTTAGAGCCGAAGATACCGCTGTGTACCACTGCGCCTTGTTGCCA Consenso (251) AC CT G GCCGA GA AC GC GT TA CACTG GC TG T CC
301 350
Domlh-131-206 WT (301) AAGAGGGGGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT
Pichia Pre 206 dAb apenas(301) AAGAGAGGTCCTTGGTTCGATTACTGGGGTCAGGGTACTCTGGTTACAGT Consenso (301) AAGAG GG CCTTGGTT GA TACTGGGGTCAGGG AC CTGGT AC GT
351
Domlh-131-206 WT (351) CTCGAGCPichia Pre 206 dAb apenas(351) CTC-ATCT Consenso (351) CTC A C
Sequência 4 otimizada por códon
Sequência de DNA gaagtacaactgctggagagcggtggcggcctggttcaaccgggtggttccctgcgcctgtcctgtgcggcat ctggtttcaccttcgcacacgaaaccatggtgtgggttcgccaagctccgggcaaaggcctggaatgggtaag 5 ccacattcctccagatggccaggacccattctatgcggattccgttaagggtcgctttaccatttctcgtgat aactccaaaaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgcgccgaggatactgcggtgtaccattgtgcgc tgctgcctaaacgtggcccgtggttcgattactggggtcagggtactctggtcaccgtaagcagc
Sequência AA correspondente evqllesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrftisrd nskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss • 76,5 % da identidade da sequência à sequência WT
150
Domlh-131-206 WT (1) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC Ecoli See 206 dAb apenas (1) GAAGTACAACTGCTGGAGAGCGGTGGCGGCCTGGTTCAACCGGGTGGTTC Consenso (1) GA GT CA CTG TGGAG GG GG GGC TGGT CA CC GG GG TC
51100
Domlh-131-206 WT (51) CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA Ecoli See 206 dAb apenas (51) CCTGCGCCTGTCCTGTGCGGCATCTGGTTTCACCTTCGCACACGAAACCA Consenso (51) CCTGCG CT TCCTGTGC GC TC GG TTCACCTT GC CA GA AC A
101150
Domlh-131-206 WT (101) TGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT Ecoli See 206 dAb apenas (101) TGGTGTGGGTTCGCCAAGCTCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTAAGCCAC Consenso (101) TGGTGTGGGT CGCCA GC CC GG AA GG CT GA TGGGT CA
151200
Domlh-131-206 WT (151) ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCG Ecoli See 206 dAb apenas (151) ATTCCTCCAGATGGCCAGGACCCATTCTATGCGGATTCCGTTAAGGGTCG Consenso (151) ATTCC CC GATGG CAGGA CC TTCTA GC GA TCCGT AAGGG CG 201 250
Domlh-131-206 WT (201) GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGA Ecoli See 206 dAb apenas (201) CTTTACCATTTCTCGTGATAACTCCAAAAACACCCTGTACCTGCAGATGA Consenso (201) TT ACCAT TC CG GA AA TCCAA AACAC CT TA CTGCA ATGA
251 300
Domlh-131-206 WT (251) ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT Ecoli See 206 dAb apenas (251) ACTCCCTGCGCGCCGAGGATACTGCGGTGTACCATTGTGCGCTGCTGCCT Consenso (251) AC CCTGCG GCCGAGGA AC GCGGT TA CA TGTGCGCTGCT CCT
301 350
Domlh-131-206 WT (301) AAGAGGGGGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT Ecoli See 206 dAb apenas(301) AAACGTGGCCCGTGGTTCGATTACTGGGGTCAGGGTACTCTGGTCACCGT Consenso (301) AA G GG CC TGGTT GA TACTGGGGTCAGGG AC CTGGTCACCGT 351
Domlh-131-206 WT (351) CTCGAGC
Ecoli See 206 dAb apenas(351) AAGCAGC Consenso (351) AGC
Sequência 5 otimizada por códon
Sequência de DNA gaggttcaactgctggaatctggtggtggtctggtacaaccgggtggttccctgcgtctgagctgtgcagcct ctggtttcaccttcgctcatgagaccatggtttgggtacgccaggctccgggtaaaggcctggagtgggtaag ccatatccctcctgatggtcaggacccgttctatgctgattccgtcaaaggccgttttaccatttctcgtgac aacagcaaaaacactctgtacctgcaaatgaactccctgcgtgcagaagacacggcggtttatcactgtgcac tgctgccaaaacgcggcccttggttcgactactggggccagggtactctggtcactgtatcttct
Sequência AA correspondente
132 evqllesggglvqpggslriscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgq dpfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyhcallpkrgpwfdywgqgtlvtvss • 78,4 % da identidade da sequência à sequência WT
150
Domlh-131-206 WT (1) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTC
Ecoli IC 206 dAb apenas (1) GAGGTTCAACTGCTGGAATCTGGTGGTGGTCTGGTACAACCGGGTGGTTC Consenso (1) GAGGT CA CTG TGGA TCTGG GG GG TGGTACA CC GG GG TC
51100
Domlh-131-206 WT (51) CCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATGAGACGA
Ecoli IC 206 dAb apenas (51) CCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCCTCTGGTTTCACCTTCGCTCATGAGACCA Consenso (51) CCTGCGTCT CTGTGCAGCCTC GG TTCACCTT GC CATGAGAC A
101150
Domlh-131-206 WT (101) TGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACAT
Ecoli IC 206 dAb apenas (101) TGGTTTGGGTACGCCAGGCTCCGGGTAAAGGCCTGGAGTGGGTAAGCCAT Consenso (101) TGGT TGGGT CGCCAGGC CC GG AA GG CT GAGTGGGT CAT
151200
Domlh-131-206 WT (151) ATTCCCCCGGATGGTCAGGATCCCTTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCG
Ecoli IC 206 dAb apenas (151) ATCCCTCCTGATGGTCAGGACCCGTTCTATGCTGATTCCGTCAAAGGCCG
Consenso (151) AT CC CC GATGGTCAGGA CC TTCTA GC GA TCCGT AA GGCCG
201250
Domlh-131-206 WT (201) GTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTATATCTGCAAATGA
Ecoli IC 206 dAb apenas (201) TTTTACCATTTCTCGTGACAACAGCAAAAACACTCTGTACCTGCAAATGA Consenso (201) TT ACCAT TC CG GACAA CAA AACAC CT TA CTGCAAATGA
251300
Domlh-131-206 WT (251) ACAGCCTGCGTGCCGAGGACACAGCGGTATATCACTGTGCGCTGCTTCCT
Ecoli IC 206 dAb apenas (251) ACTCCCTGCGTGCAGAAGACACGGCGGTTTATCACTGTGCACTGCTGCCA Consenso (251) AC CCTGCGTGC GA GACAC GCGGT TATCACTGTGC CTGCT CC
301350
Domlh-131-206 WT (301) AAGAGGGGGCCTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT
Ecoli IC 206 dAb apenas (301) AAACGCGGCCCTTGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACTCTGGTCACTGT Consenso (301) AA G GG CCTTGGTT GACTACTGGGG CAGGG AC CTGGTCAC GT
351
Domlh-131-206 WT (351) CTCGAGC
Ecoli IC 206 dAb apenas(351) ATCTTCT Consenso (351) TC
EXEMPLIFICAÇÃO
EXEMPLO A: Seleção de chumbo & Caracterização dos anticorpos de domínio ao TNFR1 humano.
Os anticorpos de domínio gerados foram derivados a partir das bibliotecas de fagos. Ambas as seleções solúveis e panning passivamente absorvido por TNFR1 humano foram realizados de acordo com os métodos 10 padrões relevantes. O TNFR1 humano foi adquirido como uma proteína recombinante solúvel de sistemas R&D (Catálogo N° 636-R1-025/CF) ou Peprotech (Catálogo N°. 310-07) e usado diretamente (no caso de seleções passivas) ou após a biotinilação usando uma ligação por intermédio de aminas seguido pelo controle de qualidade de sua atividade em um ensaio e análise 15 biológica de seu MW e extensão de biotinilação pela espectrometria de massa.
Tipicamente 3 ciclos de seleção foram realizados utilizando níveis de diminuição de antigeno em cada próximo ciclo.
133
As produções a partir das seleções foram avaliadas pela ELISA de fago para a presença de clones de ligação anti-TNFRl. O DNA foi isolado a partir destas seleções de fagos e subclonados em um vetor de expressão para a expressão dos fragmentos dAb solúveis. Os fragmentos dAb 5 solúveis foram expressados em placas de 96 reservatórios e os sobrenadantes foram usados para avaliar pela presença de dAbs de ligação anti-TNFRl, usando um ELISA de ligação direta com uma detecção anti-c-myc ou BIAcore™ usando um TNFR1 de estreptavidina/biotinilado chip BIAcore™ e classificado de acordo com as off-rates.
*10 As moléculas de chumbo, descritas abaixo, foram derivados de dAb parental, DOMlh-131 indicado (divulgado no W02006038027). Esta molécula foi selecionada da biblioteca de apresentação de fago após 3 ciclos de seleção usando 60 nM de antigeno biotinilado. As perólas de Dyna revetido por estreptavidina ou neutravidina foram alternados como reagentes 15 de captura em cada ciclo de seleção para prevenir a seleção dos ligadores contra a estreptavidina ou neutravidina. A potência do DOMlh-131 de chumbo neste estágio foi na faixa micromolar baixa como determinado no ensaio celular de liberação MRC-5 fibroblasto/IL-8. os cinéticos de ligação como determinado por BIAcore™ tipicamente apresentou taxas fast-on/fast20 off. E.coli níveis de expressão desta molécula de chumbo DOMlh-131, como um monômero alvejado myc de terminal C foram na região de 8 mg/1.
Maturação por afinidade de chumbo:
O DOMlh-131 foi levado em direção na maturação por afinidade para gerar os mutantes com as mais altas potências e características 25 biofísicas melhoradas (ver Figura 3 para as sequências de aminoácidos de chumbos derivados de DOMlh-131). Após a geração de uma biblioteca propensa ao erro (número médio de 1 mudança de aminoácido por sequência dAb, tamanho da biblioteca 8x10 ) usando uma polimerase de PCR propenso ao erro (Genemorph II, Stratagene), sete ciclos de seleção que utilizam estas
134 bibliotecas propensas ao erro foram realizados. Esta estratégia leva ao isolamento do clone DOMlh-131-8, uma molécula onde 4 mudança de aminoácidos (uma na estrutura 1 (FR1), um em CDR1, um em CDR3 e um em FR4) dão um aproximado de melhoramento de 100 vezes na potência como medido pelo ensaio celular MRC-5 (~4 nM). Neste ensaio as células MRC-5 foram incubadas com os testes de amostras por uma hora então TNFcc (200 pg/ml) foi adicionado, após uma incubação durante a noite a liberação IL-8 foi determinado usando um ensaio de detecção celular IL-8 ABI 8200 (FMAT). Uma curva de dosagem TNF-α foi incluída em cada experimento. A concentração de TNF-α usado para comparar com a ligação dAb ao TNFR1 (200 pg/ml) foi de aproximadamente 70 % da resposta TNF-α máxima neste ensaio.
Ainda a fim de melhorar a potência, simples posições de aminoácido foram diversificados pela mutagênese direcionada ao oligo em posições chaves sugerido pela informação de consenso de chumbo propenso ao erro. Durante este processo uma versão melhorada do clone DOM Ih-1318, DOMlh-131-24 (originalmente nomeado DOMlh-131-8-2 antes da correção) foi isolada através da avaliação BIAcore™ que tem uma simples mutação de aminoácido K94R (numeração de aminoácido de acordo com Kabat) e uma potência RBA de 200 a 300 pM.
Ainda as bibliotecas propensas ao erro com base neste chumbo e a bilioteca NNS de que foi derivado foram gerados e submetidos aos três ciclos de seleções de fagos usando tratamento por calor (para o método ver Jespers L, et dl., Aggregation-resistant domain antibodies selected em fagos by heat denaturation. Nat Biotechnol. 2004 Sep;22(9):l 161-5). Durante esta seleção, libraries foram unidas e os clones derivados de dois ciclos da seleção de dAbs produzidos tal como DOMlh-131-53 que foram considerados serem mais estáveis ao calor. Foi hipotetizado que estes clones possuiríam maiores características biofísicas. Algumas estruturas de mutação no clone DOMlh
135
131-53 foram submetidos à formação de linha germinativa para gerar o clone DOMlh-131-83. Este clone formado a base para a diversificação adicional por intermédio do CDR individual direcionado ao oligo usando seleção de apresentação de fago como descrito acima ou usando a tecnologia de compartimentalização in-vitro usando emulsões. A estratégia de apresentação de fago gerados por DOMlh-131-117 e DOMlh-131-151 de chumbo. A tecnologia de compartimentalização in-vitro gera DOMlh-131-511.
Neste estágio estes três chumbos foram comparados em ensaios biofísicos e biológicos e DOMlh-131-511 foi a molécula com a melhores propriedades. Além disso estas moléculas foram testadas por sua resistência para a divagem proteolítica na presença de tripsina ou leucozima. A leucozima consiste de espectoração unida a partir dos pacientes com fibrose cística e contém altos níveis de elastase e outras proteases e foi usado como um substituto para as condições in vivo nas doenças pulmonares. Estes dados indicam que todos os três DOMlh-131-117, DOMlh-131-151 e DOMlh-13 Ιό 11 de chumbos foram rapidamente degradados na presença de tripsina ou leucozima. Este observa o aumento de interesse de cerca da persistência in vivo de DOMlh-131-511 quando no paciente e uma estratégia foi desenvolvida para selecionar para a resistência à tripsina. Foi hipotetizado que tal resistência de tripsina melhorada deve ser um efeito benéfico em outras propriedades biofísicas da molécula. Essencialmente o método de seleção do fago padrão foi modificado para permitir a seleção na presença de proteases antes da seleção do antigeno. Para esta extremidade um novo vetor de fago foi projetado em que o rótulo c-myc foi anulado para permitir as seleções na presença de tripsina sem a divagem que o dAb apresentou fora do fago. As bibliotecas propensas ao erro com base em DOMlh-131-511 foram geradas e clonadas no vetor pDOM33 (ver Fig 50 para o mapa do vetor pDOM33). Os estoques de fagos gerados a partir desta biblioteca foram pré-tratados com 1 mg/ml ou 100 pg/ml de tripsina em 37° C por 24 horas, subsequentemente o
136 inibidor de protease que foi inibidor de protease completo de Roche (2x) foi adicionado para bloquear a atividade de tripsina antes da seleção no antigeno relevante. Quatro ciclos de seleção foram realizados. Os dAbs de ligação TNFR1 expressados foram avaliados usando o BIAcore™ para sua capacidade de ligar-se TNFR1 com ou sem a presença de protease durante uma hora ou incubações durante a noite a 37° C na presença ou ausência de tripsina (a 100 pg/ml ou 1000 pg/ml de concentração de tripsina final).
Este isolamento ao chumbo de duas moléculas de chumbo DOMlh-131-202 e DOMlh-131-206 que demonstrou a resistência de protease melhorada como mostrado pelos experimentos de ligação de antigeno BIAcore™. Este é de interesse para notar que DOMlh-131-202 contém apenas uma mutação em CDR2 (V53D), todos da numeração de aminoácido de acordo com Kabat) em comparação ao DOMlh-131-511, onde o DOMlh-131-206 contém apenas duas mutações: a primeira mutação é a mesma como no DOMlh-131-202 (mutação V53D em CDR2) e a segunda é a mutação Y91H em FR3 (ver Figura 3). Esta mutação Y91H no FR3 não ocorre no gene de linha de germe humano 3-20 que indica que este resíduo ocorre em anticorpos humanos. Os três clones DOMlh-131-511, DOMlh131-202 e DOMlh-131-206 tem as seqüências de aminoácido como mostrado na figura 3.
A atividade da molécula foi determinada como abaixo:
A avaliação de afinidade de ligação BIAcore™ de DOM1H131-202, DOM1H-131-511 e DOM1H-131-206 para a ligação ao TNFR1 humano.
As afinidades de ligação de DOM 1H-131-202, DOM1H-131511 e DOM 1H-131-206 para a ligação de um recombinante humano que expressa E.coli do TNFR1 humano foram avaliados pela análise BIAcore™. A análise foi realizada usando o TNFR1 humano biotinilado. O 1400 RU do TNFR1 biotinilado foi revestido a um chip de estreptavidina (SA). A
137 superfície foi regenerada novamente usando a linha de base usando condições de eluição de ácido brando. O DOM 1H-131-202, DOM1H-131-511 e DOM1H-131-206 foram passados nesta superfície em concentrações definidas usando uma taxa de fluxo de 50 μΐ/min. O trabalho foi realizado em uma máquina BIAcore™ 3000 e os dados foram analisados e ajustados ao modelo 1:1 de ligação. Os dados de ligação bem ajustados ao modelo 1:1 para todas as moléculas testadas. Todos os valores KD foram calculados de taxas kon e koff. A operação BIAcore™ foi realizada em 25° C.
Os dados abaixo foram produzidos a partir de três experimentos independentes. Em cada experimento os resultados foram calculados pela média de um número de ajustes usando maiores concentrações de dAb para kd e concentrações mais baixas por ka. Os dados são apresentados como o meio e o desvio padrão (nos parênteses) dos resultados (Tabela 1).
Tabela 1: Dados BIAcore™ para a ligação DOM1H-131-202,
DOM1H-131-511 e DOM1H-131-206 aoTNFRl humano
k ^on koff G(n-M)
DOM1H-131-511 5,03E+05 5,06E-04 1,07
(511) (l,07E+05) (l,01E-04) (0,44)
DOM1H-131-202 l,02E+06 5,42E-04 0,55
(202) (2,69E+05) (3,69E-05) (0,H)
D0M1H-131-206 l,55E+06 7,25E-04 0,47
(206) (3,57E+05) (l,95E-04) (0,06)
A ligação DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 e DOM1H131-206 similarmente e com alta afinidade ao TNFR1 humano. O DOM1H131-202 e DOM1H-131-206 liga-se com as afinidades médias de 0,55 nM e 0,47 nM respectivamente. Tanto o DOM1H-131-202 quanto o DOM1H-131206 tem levemente uma maior afinidade em comparação ao DOM1H-131-511 que tem uma afinidade média de 1,07 nM.
Ensaio de ligação do receptor:
A potência dos dAbs foi determinado contra o TNFR1 humano em um ensaio de ligação do receptor. Este ensaio mede a ligação de TNF-alfa
138 ao TNFR1 e a capacidade do dAb solúvel para bloquear esta interação. A fusão TNFR1-FC é capturado em uma pérola pré-revestida com IgG antihumano de cabra (H&L). As perólas revestidos de receptor são incubados com TNF-alfa (10 ng/ml), dAb, anti-TNF-alfa conjugado de biotina e flúor de estreptavidina alexa 647 em uma placa de 384 reservatórios na parte funda clara com lados pretos. Após 6 horas a placa é lida no sistema de detecção celular ABI 8200 e pérola associada a fluorescência determinada. Se os blocos da ligação dAb TNF-alfa ao TNFR1 a intensidade fluorescente reduzirá.
Os dados foram analisados usando o software de análise ABI 8200. As curvas de efeito da concentração e valores de potência (EC50) foram determinados usando GraphPad Prism e uma curva de resposta da dosagem sigmoidal com o declive variável. O ensaio foi repetido em três ocasiões separadas. Uma curva de dosagem TNF-alfa foi incluída em cada experimento (Figuras 38 e 39). A concentração de TNF-alfa usado para comparar com a ligação dAb ao TNFR1 (10 ng/ml) é aproximadamente 90 % da resposta TNF-alfa máxima neste ensaio.
Um gráfico representativo é mostrado na figura 39 mostrando a capacidade de dAbs inibir a ligação de TNF-alfa ao TNFR1. Em todos os três experimentos as amostras de controle negativo (HEL4, um dAb e um VH de lisozima branca de ovo anti-galinha silencioso) ffacamente inibe a interação entre TNF-alfa e TNFR1 em altas concentrações. Os valores da potência média (EC50) para as amostras testadas e controles positivos (antiTNFR1 mAb obtido dos sistemas R&D, mAb225) e Enbrel ™ (etanercept; uma fusão dimérica que consiste de TNFR2 ligado à porção Fc de IgGl; licenciado para o tratamento de artrite reumatóide) são mostrados na Tabela 2.
139
Tabela 2: Os valores da potência (EC50) para DOM1H-13ΙΣΟΣ, DOMlH-131-ΣΟό e DOM1H-131-511 em um ensaio de ligação do receptor TNFR1 por três experimentos repetidos.
Amostra EC50 médio (nM) SEM
DOM1H-131-202 0,11 0,008
DOM1H-131-206 0,07 0,01
DOM1H-131-511 0,19 0,01
Enbrel ™ (Etanercept) 0,20 0,07
Anti-TNFRl mAb # mAb225 0,08 0,003
Neste ensaio o DOMlH-131-ΣΟό parece mais pontente do que os outros dois dAbs sendo testado e tem uma potência similar ao anti-TNFRl mAb comercialmente disponível, ΜΑΒΣΣ5 (sistemas R e D).
Expressão de clones de chumbo de Pichia pastoris foi realizado como descrito abaixo:
A sequência de aminoácido primário das três moléculas de chumbo foi usado para produzir os genes otimizados por códon para a expressão secretada em Pichia pastoris. Existe 75 % da identidade de sequência entre o códon otimizado e o DOMlH-131-ΣΟό códon não otimizado. Os três genes sintéticos foram clonados no vetor de expressão pPIC-Zoc (de Invitrogen) e então transformados em duas cepas Pichia, X33 e KM71H. As células transformadas foram colocadas em concentrações aumentadas de Zeocina (100, 300, 600 e 900 pg/ml) para selecionar pelos clones com integrantes múlitplos. Aproximadamente 15 clones para cada linha celular e construção foram selecionados para a avaliação da expressão. Como a correlação entre número de cópia do gene alto/baixo e nível de expressão não é totalmente entendido em Pichia pastoris, diversos clones foram selecionados através da faixa de concentração de Zeocina. As produções dos fermentadores 5L foram realizadas usando clones que não tem sido extensivamente avaliado pela alta produtividade. Este permitiu a produtivida das quantidades significantes do material por estudos adicionais.
Produção do material para a caracterização da proteína:
As resinas de cromatografia com base na proteína A foram
140 extensivamente usadas para purificar os VH dAbs a partir dos tensoativos de cultura microbiana. Embora estes permitam um método simple da etapa de purificação para a produção de alta pureza do material, usualmente > 90 % em mais casos, para algumas moléculas as condições de eluição de pH baixo podem resultar na formação de agregados. Também existe o debate da capacidade limitada de afinidade de resinas por dAbs; este significaria o uso de quantidades significantes de resina para processar a partir dos fermentadores. A fim de produzir material de alta qualidade para a caracterização e ainda estabilidade e estudos de nebulizadores, um processo de purificação à jusante foi desviado usando uma resina de indução de carga modal misturada como a etapa de captura primária seguido pela trocadora de ânion. Sem a otimização significante, este permitiu a recuperação de ~70 % do dAb expressado em uma pureza de ~ 95 %.
Para a etapa de captura em uma resina de indução de carga modal misturada, Capto MMC de GE Healthcare, equilibração de coluna é realizada usando 50 mM de fosfato de sódio pH6.0 e o sobrenadante é carregado sem qualquer necessidade para a diluição ou ajuste de pH. Após a lavagem de coluna, a proteína é eluída por pH de gradiente usando um tampão de eluição que é 50 mM de Tris pH 9.0. A lavagem específica e condições gradientes variarão levemente dependendo do pi da preotína a ser eluída.
O pico de eluato é então purificado adicional com uma etapa através do fluxo usando cromatografia trocadora de ânion. Este remove a contaminação HMW residual tal como oxidase alcoólica e reduz a endotoxina. A resina é equilibrada com PBS ou tampão de fosfato pH 7.4 sem sal. No carregamento do eluato a partir de Capto MMC na resina trocadora de ânion o dAb não liga-se e é recuperada a partir do fluxo direto. A endotoxina e outros contaminantes ligam-se a resina. A presença de sal se usado o tampão PBS melhora a recuperação da proteína a 91 % para esta etapa antes do que 86 % da recuperação atingida sem sal. Entretanto a presença de sal reduz a
141 efetividade da remoção da endotoxina tal que um nível de endotoxina típica de dAb seguindo esta etapa com a inclusão do sal foi medido como 58EU/ml comparado com o nível de < 1,0 EU/ml obtido quanto nenhum sal está presente.
Caracterização da proteína:
O material produzido a partir das operações dos fermentadores 5L foi caracterizado pela identidade usando espectrometria de massa por eletropulverizador, sequenciamento do terminal amino e focagem isoelétrica e para a pureza usando kit de tingimento de glicoproteína SDS-PAGE, SEC e Gelcode (Pierce).
Identidade:
A análise da sequência do terminal amino do primeiro de cinco resíduos de cada proteína, foi como esperado (EVQLL...). A espectrometria de massa foi realizada em amostras das proteínas no qual foi o trocador de tampão em 50:50 H2O:acetonitrila contendo 0,1 % do ácido acético glacial usando C4 Zip-tips (Millipore). A massa medida para cada uma das três proteínas está dentro de 0,5 Da da massa teórica com base na sequência de aminoácido primário (calculado usando as massas médias) quando permtindo por um diferença de massa de -2 a partir da formação da ligação de bissulfeto interna. O IEF foi usado para identificar as proteínas com base em seu pi que foi diferente para cada proteína.
Pureza:
As três proteínas foram carregadas em géis SDS-PAGE de não redução em quantidades de 1 pg e 10 pg em cópias. Um simples grupo foi observado em todos os exemplos. A cromatografia de exclusão de tamanho também foi realizada para demonstrar níveis de pureza. Para a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) 100 pg de cada proteína foram carregadas em uma coluna TOSOH G2000 SWXL seguindo em 0,5 ml/min. A fase móvel foi de PBS / 10 % de etanol.
142
Investigação da estabilidade dAb para a seleção candidato:
Para a indicação de COPD, seria necessário liberar o dAb no pulmão, por exemplo usando um dispositivo nebulizador. Este significaria que a proteína pode potencialmente experimentar uma faixa de corte e tensões térmicas dependendo do tipo de nebulisador usado e pode ser submetida a degradação enzimática pela protease no ambiente pulmonar. Foi determinado se a proteína deve ser liberada usando este tipo de dispositivo, forma a distribuição de tamanho da partícula correta e permanece funcional seguindo a liberação do nebulisador. Portanto a estabilidade intrísica de cada molécula a uma faixa de tensões físicas foi investigado para determinar a estabilidade da linha de base e a estabilidade mais sensível que indica os ensaios. Como a estabilidade de cada proteína será dependente da solução de tampão esta é solubilizada em, alguns trabalhos de pré-formulação ser necessário. Esta informação, tal como tampão, pH, também seria útil para o entendimento da estabilidade da proteína durante o processo de purificação à jusante e armazenagem subseqüente. A fim de caracterizar as mudanças nas moléculas durante a exposição a uma faixa de tensões físicas, uma faixa de técnicas analíticas foram usadas tal como a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), SDS-PAGE e focagem isoelétrica (IEF).
Avaliação da estabilidade da protease de DOM 1H-131-202, DOM1H-131-511 eDOMlH-131-206:
A estabilidade da protease de DOM1H-131-202, DOM1H131-511 e DOM1H-131-206 foi avaliada pela análise BIAcore™ da atividade de ligação residual após a pré-incubação pelos períodos de tempos definidos em excesso de proteases. Aproximadamente 1400RU de TNFR1 biotinilado foi revestido a um chip de estreptavidina (SA). 250 nM de DOM 1H-131-202, DOM1H-131-511 e DOM1H-131-206 foi incubado com PBS apenas ou com 100 pg/ml de tripsina, elastase ou leucozima por 1, 3 e 24 horas a 30° C. A reação foi interrompida pela adição de um coquetel de inibidores de protease.
143
As misturas dAb/protease foram então passadas no chip TNFR1 revestido usando a subtração celular de referência. A superfície do chip foi regenerado com 10 ul de O,1M de glicina pH 2.2 entre cada ciclo de injeção. A fração de DOM1H-131-202, DOM1H-131-511 e DOM1H-131-206 liga-se ao TNFR1 humano (a 10 segundos) pré-incubados com protease foi determinado relativo a ligação dAb sem protease. As operações BIAcore™ foram realizadas a 25°
C.
O dado foi produzido a partir dos três experimentos independentes. O gráfico de barra indica o significado dos valores e as barras de erros indicam o desvio padrão dos resultados (para os resultados ver Figura 24).
Foi observado que DOM1H-131-202 e DOM1H-131-206 foram mostrados ter maior resistência a degradação proteolítica pela tripsina, elastase ou leucozima em comparação ao DOM1H-131-511. A diferença entre DOM1H-131-202 e DOM1H-131-206 em comparação ao DOM1H-131-511 é mais pronunciada após 1 hora com tripsina e após 3 horas com elastase ou leucozima.
Estabilidade térmica como determinado usando DSC:
A fim de determinar em qual pH as moléculas tem a maior estabilidade, calorimetro de varredura diferencial (DSC) foi usado para medir as temperaturas de fusão (Tm) de cada dAb no tampão Britton-Robinson. Como Britton-Robinson é feito de até três sistemas de tampão de componentes (acetato, fosfato e borato), este é possível para produzir uma faixa de pH de 3 a 10 na mesma solução. O pi teórico foi determinado a partir das sequências de aminoácidos das proteínas primárias. A partir do DSC, o pH no qual o dAbs tem sua maior estabilidade térmica intrísica foi observado ser pH 7 por DOM1H-131-202 (202), pH 7-7.5 por DOM1H-131-206 (206) e pH 7.5 por DOM1H-131-511 (511). Para todos os trabalhos de estabilidade e tensão subsequentes os seguintes pHs foram usados para cada um dAb; por
144
DOM1H-131-202 (202) e DOM1H-131-206 (206) pH 7.0 e por DOM1H131-511 (511) pH 7.5 no tampão Britton-Robinson. Os resultados são resumidos na Tabela 3 abaixo:
Tabela 3: Resumo de pH e Tms de DOM1H-131-202 (202),
DOM1H-131-206 (206) e DOM1H-131-511 (511) como determinado pela
DSC no tampão Britton-Robinson em lmg/ml
dAb pH que dá maiores estabilidades térmicas intrísicas Tm (° C) do dAb no dado pH
DOM1H-131-202 (202) 7,0 68,6
DOM1H-131-206 (206) 7,0-7,5 65,8
DOM1H-131-511 (511) 7,5 58,0
Teste de solubilidade instrísica:
Todos os dAbs de chumbo foram concentrados em concentradores Visvapina centrífugos (5K corte), para determinar sua solubilidade máxima e os níveis de recuperação na concentração. Os experimentos foram realizados no tampão Britton-Robinson no pH mais estável. Os volumes de concentrações de amostras foram medidos em um período de tempo e desvio a partir da concentração esperada registrado bem como a porcentagem da recuperação da amostra.
Foi observado que todas as proteínas devem ser concentradas em 100 mg/ml no tampão Britton-Robinson. Tanto o DOM1H-131-202 (202) quanto o DOM1H-131-206 (206) mostrou recuperação inferior do que esperado em comparação ao DOM 1H-131-511 (511), mas ainda dentro dos npiveis aceitáveis.
Liberação do nebulisador dos dAbs de chumbo:
Pelos nebulisadores diferentes testados e tampões de formulações este foi demonstrado que o dAb deve ser eficazmente liberado usando uma ampla faixa de dispositivos nebulisadores. Mais importante, foi mostrado pelo primeiro período que a nebulização do dAb em um tampão de formulação produzido a distribuição do tamnaho de partícula desejado (em comparação com o uso da porcentagem de gotícuias < 5μηι) para a liberação
145 eficaz do pulmão enquanto mantém a funcionalidade da proteína. Este é ainda descrito abaixo.
Comparação do desempenho em vários dispositivos:
O DOM1H-131-511 (511) foi testado em seis dispositivos nebulisadores que compreendem dois dipositivos de cada um dos três grupos principais de nebulisadores para as formulações líquidas isto é nebulisadores ultrasônicos, nebulisadores à jato e nebulisadores de trama vibratória. Em cada dispostivo de dAb foi testado em 5 mg/ml com uma faixa de concentrações de PEG. Para cada amostra a porcentagem do tamanho da 10 gotícula < 5pm foi medido usando um dispositivo Malvem Spraytek (Malvern Instruments Limited, UK) e os resultados são mostrados na figura 35. A estabilidade de cada amostra após ser nebulisada foi avaliada usando SEC para analisar a quantidade da amostra que tem dimerizado tanto no material remanescnete no copo quanto no aerossol coletado. Os resultados 15 podem ser vistos na figura 36. A menor extensão da formação de dímero a maior estabilidade.
Mais dispostivos podem liberar 40 % ou mais da formulação líquida na faixa de tamanho correta mas os dispositivos efluxos (um dispositivo nebulisador de malha vibratória) e PARI LC (um nebulisador à 20 jato) realizam os melhores, que a liberação do dispositivo PARI LC* (star) mais do que 80 % quando o PEG é incluído no tampão. Este aumento na liberação com PEG também é observado com o efluxo e a uma menor extensão, com o PARI LC+.
Atividade importante de dAb também foi observado ser retido 25 após a nebulização (ver os resultados na figura 8)
Efeito dos aditivos de tampão:
Devido a estabilidade inferior de DOM1H-131-511 (511), o tampão de formulação de fosfato a 50 mM contendo tanto PEG 1000 quanto sacarose (tem uma viscosidade que está dentro da faixa que é definido como
146 cerca de igual a viscosidade de uma solução de cerca de 2 % a cerca de 10% de PEG 1000 no tampão de fosfato a 50 mM contendo 1,2 % (p/v de sacarose) para ajudar a proteger o dAb a partir de cada corte e tensões térmicas. Como tanto D0M1H-131-202 (202) quanto DOM1H-131-206 (206) tem maiores Tm’s e mostra consideravelmente a estabilidade melhorada as tensões térmicas, todas as moléculas foram testadas tanto no tampão de formulação original quanto no tampão Britton-Robinson (que tem uma viscosidade inferior do que o tampão de formulação). Os dAbs foram testados tanto no fluxo E quanto nos dispositivos Pari LC+ com a realização de tempo de 3,5 minutos em uma concentração de proteína de 5 mg/ml em uma distribuição do tamanho de partícula determinado usando um dispositivo Malvem Spraytek. Como em comparação, um medicamento marcador pela fibrose cística (denominado proteína X padrão) que é liberado usando um dispositivo nebulizador, foi testado neste próprio tampão de formulação. Os resultados são mostrados na figura 37. Para uma boa liberação e distribuição no pulmão profundo, o tamanho de partícula ideal é menos do que 6 microns, por exemplo < 5 pm. Todos os dAbs dão níveis comparáveis de tamanhos de partículas que foram menos do que 5 pm tanto no tampão Britton-Robinson quanto no tampão de formulação (como descrito precocemente). Entretanto, a maior viscosidade do tampão de formulação deve ser particularmente benéfico para a produção de partículas dentro da faixa de tamanho correto, por exemplo partículas a < 5 pm.
Uma concentração de dAb no copo do dispositivo foi determinado pelas medições A28o antes e depois da nebulização. Foi observado que a concentração de proteína não muda significantemente indicando que nenhuma proteína ou veículo seja preferivelmente nebulisado durante a liberação.
Conclusão:
Será demonstrado como descrito acima que os polipeptídeos
147 tal como dAbs podem ser nebulisados em uma faixa de dispositivos nebulisadores comercialmente disponíveis e importante que este retém a estabilidade e atividade biológica após a nebulização e não existe agregação significante observada seguindo a nebulização. Quanto os excipientes que intensificam a viscosidade, tal como PEG são adicionados a formulação do tampão, distribuição do tamanho de partícula e tamanho da porcentagem de gotículas menos do que 5 pm podem ser melhorados, deste potencialmente melhorando a liberação dAb no pulmão profundo.
A liberação do dAb ao pulmão também pode ser melhorada pelo aumento da concentração dAb por exemplo uma concentração de até cerca de 40 mg/ml e período de liberação sem qualquer redução na estabilidade ou atividade dAb.
EXEMPLO 1
Vetor de fago pDOM13
Um vetor de apresentação de fago filamentoso (fd), pDOM13 foi usado. Este vetor produz as proteínas de fusão com a proteína III que reveste o fago. O local de clonagem múltipla de pDOM13 é ilustrado na FIG.
1. Os genes que codificam dAbs foram clonados como fragmentos Sall/NotI.
EXEMPLO 2
Teste de seleção de protease em anticorpos de domínio que apresentam fagos (dAbs) com uma faixa de resistência a tripsina
Os genes que codificam dAbs D0M4-130-54 que liga-se ao IL-1R1, DOMlh-131-511 que liga-se aaTNFRl e DOM15-10, DOM15-26 e DOM 15-26-501, que liga-se ao VEGFA, foram clonados em pDOM13 e fagos que apresentam estes dAbs foram produzidos de acordo com as técnicas padrões. Os fagos foram purificados pela precipitação PEG, recolocados em suspensão em PBS e titulados.
Os dAbs acima apresentaram uma faixa de capacidade para resistir a degradação pela tripsina quando testados como proteínas isoladas. A
148 resistência a degradação foi avaliada como seguem: dAb (1 mg/ml) em PBS foi incubado com tripsina a 40 gg/ml a 30° C, resultando em uma razão molar de 25:1 dAb: tripsina. As amostras (30 μΐ) foram tiradas imediatamente antes da adição de tripsina e então a T= 1 hora, 3 horas e 24 horas. A atividade de protease foi neutralizada pela adição de inibidores de protease completo da Roche (2x) seguido pela imersão em nitrogênio líquido e armazenagem em gelo seco. 15 gg de cada amostra dAb foi subsequentemente analisado pela eletroforese em um Novex 10-20 % de gel de tricino e proteínas foram tingidas com SureBlue (Ix).
Tanto o DOM15-10 quanto o DOM 15-26-501 foram significantemente ingeridos durante as primeiras três horas. O DOM15-26, DOM4-130-54 e DOMlh-131-511 foram mais estáveis, com a digestão de dAbs apenas tomando-se aparente depois de 24 horas (FIG. 2).
Os dAbs que apresentaram fagos também foram incubados na presença de tripsina para avaliar se a resistência a tripsina de dAbs que apresentam fagos correlacionam com os resultados obtidos com os dAbs solúveis isolados. Várias concentrações de tripsina e períodos de incubações foram testadas. Em todos os casos, após a neutralização de tripsina com os inibidores de protease completo da Roche, os fagos foram testados para sua capacidade de ligar-se a um ligando genérico: proteína A, que liga-se a todos os VH anticorpos de domínio (por exemplo, DOMlh-131, DOM15-26, DOM15-26-501) ou proteína L, que liga-se a todos os VK anticorpos de domínio (por exemplo, DOM4-130-54, DOM15-10). Os fagos também foram testados para a ligação a um antígeno alvo. Em ambos os casos, a ligação foi assumida correlacionar com a retenção da integridade estrutural de dAb através da resistência a proteólise. A atividade de ligação foi medida either por ELISA (usando anticorpos conjugados contra o fago) ou pela eluição de fagos de ligação e análises tituladoras seguindo a infecção de células TG1 de E.coli exponencialmente desenvolvidas.
149
Testes com DOM15-10, DOM15-26 e DOM15-26-501 em fagos
Cada dAb foi tratado por uma hora em temperatura ambiente com uma faixa de concentrações de tripsina (100 pg/ml, 10 pg/ml e 0 pg/ml). A atividade de tripsina foi bloqueada com inibidor de protease completo da Roche (IX) e então os fagos foram diluídos em 2 % de Marvell em PBS, incubados com 50 nM de antigeno biotinilado (VEGF humano recombinante (sistemas R&D)) por uma hora em temperatura ambiente. As pérolas revestidas por estrepavidina (Dynabeads M-280 (Invitrogen)) que foram prébloqueadas por uma hora em temperatura ambiente com 2 % de Marvell em PBS foram adicionadas e a mistura foi então incubada por cinco minutos em temperatura ambiente. Todos das etapas de incubação com Dynabeads foram realizados em uma roda de rotação. Os fagos não ligados foram lavados foram pela lavagem de pérolas oito vezes com 1 ml de 0,1 % Tween-20 em PBS. Os fagos ligados foram eluídos com 0,5 ml de 0,lM de Glicina pH2.2 e neutralizados com 100 μΐ de IM de Tris-HCL pH 8.0. Os fagos eluídos foram usados para infectar as células TG1 exponencialmente desenvolvidas (uma hora a 37° C) e colocadas em placas de tetraciclina. As placas foram incubadas durante a noite a 37° C e as contagens de colônias foram feitas (ver Tabela 4). Os melhores resultados foram observados a partir da seleção com a incubação com 100 pg/ml de tripsina. Existe cerca de 10 vezes o aumento na produção de DOM15-26 em comparação ao DOM15-10 e DOM15-26-501.
Um segundo experimento foi feito ainda para confirmar estes resultados sob mais condições diversas de incubações. Os dAbs que apresentam fagos foram tratados por 1 hora ou 2 horas a 37° C com agitação (250rpm). Os melhores resultados foram observados a partir das seleções com 2 horas de incubação com 100 ug/ml de tripsina. A produção de DOM 15-26 foi 200 vezes maior do que a produção de DOM15-26-501 e 1000 vezes maior do que a produção de DOM 15-10.
150
Em um terceiro experimento, os fagos que apresentam
DOM15-26 e DOM15-26-501 foram misturados 1:1 no início. Estes foram então incubados com tripsina (1000 pg/ml) ou sem tripsina por duas horas a 37° C com agitação (250 rpm) e então selecionados para a ligação de antigeno 5 como descrito acima. O sequenciamento de dez colônias a partir de cada seleção revelou uma população misturada de clones para o pré-tratamento sem seleção de tripsina (DOM15-26: 4/10; DOM15-26-501: 6/10), onde todos os clones a partir da seleção com tripsina foram codificados por DOM 15-26 como esperados.
Estes experimentos indicam que a pressão de seleção pode ser obtido pela adição de uma protease aos fagos que apresentam dAbs, tal que os fagos que apresentam os dAbs proteoliticamente mais estáveis são preferencialmente selecionados (seguindoa extração em um ligando genérico ou o antigeno).
Tabela 4
Experimento Comprimento de incubação Temperatura Concentração de tripsina Titulador DOM1526 Titulador DOM 1526-501 Titulador misturad o 1:1 Titulador DOM15-10
1 entrada 1010 1 hora Temperatu ra ambiente 100 μ^ιηΐ l,6xl08 6,3xl07 Ι,ΙχΙΟ7
1 hora Temperatu ra ambiente 10 pg/ml 3xl08 4,4x108 2,4x108
1 hora Temperatu ra ambiente 0 pg/ml 0,9x10s 2x108 0,7xl08
2entrada 109 1 hora 250 rpm 37° C 100 pg/ml 2x10' IxlO6 IxlO5
2 horas 250 rpm 37° C 100 pg/ml IxlO7 6x104 IxlO4
2 horas 250 rpm 37° C 0 pg/ml 5,4x107 4,IxlO7 3xl08
3 entrada 1010 2 horas 250 rpm 37° C 100 pg/ml 2,3x108 8x105 6,8xl07
2 horas 250 rpm 37° C 0 pg/ml 3,9xl08 4,4x108 4,8x10s
Testes com DOM4-130-54 em fagos
O DOM4-130-54 foi testado em um protocolo similar como descrito acima. Os parâmetros que foram variados foram: concentração de tripsina, temperatura e compirmento de incubação. A bioextração foi
151 realizada contra IL-RI-Fc (uma fusão de IL-1RI e Fc) em concentração a 1 nM em PBS. As reduções significantes em tituladores de fagos foram apenas observados após a incubação dos fagos com 100 pg/ml de tripsina durante a noite a 37° C (ver Tabela 5).
Tabela 5
Comprimento de incubação Temperatura Concentração de tripsina Titulador
1 hora Temperatura ambiente 100 pg/ml 1,8 x 1010
1 hora Temperatura ambiente 10 pg/ml 7,2 x 109
1 hora Temperatura ambiente 0 pg/ml 6,6 x 109
Durante a noite Temperatura ambiente 100 pg/ml 2,16 x 109
Durante a noite Temperatura ambiente 10 pg/ml 7,2 x 109
Durante a noite Temperatura ambiente 0 pg/ml 7,8 x 109
Durante a noite 37°C 100 pg/ml 2,04 x 106
Durante a noite 37°C 10 pg/ml 3,84 x 108
Durante a noite 37°C 0 pg/ml 7,2 x 109
Testes com fago DOMIh-131
O fago DOM lh-131 (exatamente relacionada a DOM lh-131511 pela sequência de aminoácido) foram tratados com 0 pg/ml, 10 pg/ml, 100 pg/ml e 1000 pg/ml de tripsina por uma hora em temperatura ambiente, a 10 digestão foi inibida pela adição de 25x de inibidores de protease completo (Roche). As diluições de 2 vezes em séries do fago foram realizados abaixo da placa de ELISA revestido com 1 nM de TNFRI e os fagos de ligação foram detectados com anti-M13-HRP. Os resultados são shown abaixo na Tabela 6.
152
Tabela 6
DOMlh-131
Concentração de tripsina
Figure BRPI0812268A2_D0001
Estes experimentos testados claramente mostram que 100 pg/ml de tripsina e uma temperatura de 37° C são aprorpiados para aplicar uma pressão de seleção em fagos que apresentam dAbs de vários graus de resistência a proteólise pela tripsina. O período de incubação com a protease pode ser optimizado para cada dAb que apresenta fago, se desejado.
EXEMPLO 3
Seleção de protease de repertórios que apresentam fagos de anticorpos de domínio
Quatro repertórios foram criados usando o seguinte dAbs como moléculas parentes: DOM4-130-54, DOMlh-131-511, DOM15-10 e DOM 15-26-555. As mutações aleatórias foram introduzidas nos genes por PCR usando o kit Stratagene Mutazyme II, iniciadores biotinilados e 5 a 50 pg do modelo por uma reação a 50 μΐ. Após a digestão com Sall e Notl, as inserções foram purificadas a partir dos produtos não digeridos com pérolas revestidas por estreptavidina e ligado em pDOM13 nos locais correspondentes. As células E. coli TB1 foram transformadas com a mistura de ligação purificada resultando em amplos repertórios de clones resistentes a tetraciclina: 8,5 x 108 (DOM4-130-54), 1,5 x 109 (DOMlh-131-511), 6 x 108 (DOM15-10) e 3xl09 (DOM15-26-555).
As bibliotecas de fagos foram preparadas pela precipitação dupla com PEG e recolocados em suspensão em PBS.
153
As taxas de mutação de aminoácidos foram 2,3 e 4,4 para os repertórios DOMlh-131-511 e DOM4-130-54, respectivamente. A funcionalidade foi avaliada pelos 96 clones testados em ELISA de fago usando reservatórios revestidos com proteína A ou proteína L (a lpg/ml).
62,5 % e 27 % dos clones exibiram a apresentação funcional de dAbs nos repertórios DOMlh-131-511 e D0M4-130-54, respectivamente.
As taxas de mutação de aminoácidos foram 2,5 e 4,6 para os repertórios DOM15-10 e DOM15-26-555, respectivamente. A funcionalidade foi avaliada pelos 96 clones testados em ELISA de fago usando reservatórios revestidos com a proteína A ou proteína L (a 1 pg/ml). 31,3 % e 10,4 % dos clones exibiram a apresentação funcional de dAbs nos repertórios DOM15-10 e DOM15-26-555, respectivamente.
Repertórios DOM4-130-54 e DOMlh-131-511
Quatro ciclos de seleção foram realizados com estas bibliotecas para selecionar pelos dAbs com resistência de protease melhorada.
O primeiro ciclo de seleção foi pela ligação de antigeno (antigeno lnM ou lOnM) sem tratamento de protease para limpar a biblioteca para remover quaisquer clones que não liga-se mais longos com alta afinidade. As produções a partir do ciclo 1 foram na faixa 1O8-1O10 (comparados com uma entrada de fago 1011) que indica que a maioria do antigeno liga-se a biblioteca com alta afinidade.
No ciclo 2, o tratamento de protease com 100 pg/ml de tripsina foi introduzido e as produções são mostradas abaixo na Tabela 7:
Tabela 7
Condições de incubação de tripsina Biblioteca DOM 1 h-131 511 Biblioteca D0M4-130- 54
37° C durante a noite 1,86 x 106 2,1 x 106
37°C2horas 4,8 x 108 5,1 x 108
2 horas em Temperatura ambiente 1,2 x 109 4,62 x 109
Nenhuma tripsina ~1 x 10y ~4x 10y
Nenhum antigeno 1,8 x 104 <6x 10J
154
Existe seleção significante quando os dAbs foram tratados com tripsina a 37° C durante a noite. Esta produção foi levada em direção ao ciclo 3, onde os fagos foram tratados com 1 mg/ml ou 100 pg/ml de tripsina a 37° C por 24 horas. Os tituladores dos fagos tratados por tripsina a partir do ciclo 3 foram 105-106 para o repertório DOMlh-131-511 e 107-108 para o repertório DOM4-130-154.
Todas as produções a partir do ciclo 3 (DOMlh-131-511 e DOM4-130-154 com 1 mg/ml e 100 pg/ml) sofrem um quatro ciclo de seleção contra o antígeno a InM com 100 pg/ml de tripsina. Os tituladores foram na faixa de 106-108, similar aqueles visto no ciclo 3. Algum enriquecimento foi visto pelo repertório DOMlh-131-511, mas nenhum enriquecimento foi visto pelo repertório DOM4-130-54.
Repertórios DOM15-10 e DOM15-26-555
O primeiro ciclo de seleção foi realizado com 2nM de concentração hVEGF biotinilado (fator de desenvolvimento endotelial vascular humano) e sem tratamento de protease para limpar a biblioteca para remover qualquer clone que não liga-se mais longos com alta afinidade. As produções a partir do ciclo 1 foram cerca de 108 (comparados com uma entrada de fago 1010 por DOM15-10 e fago 1011 por DOM15-26-555) que indica que a maioria do antígeno liga-se a biblioteca com alta afinidade.
O segundo e terceiro ciclos de seleção foram realizados com 2nM hVEGF biotinilado. Antes da extração em hVEGF, os fagos foram incubados na presença de tripsina (100 pg/ml) a 37° C em um agitador (250 rpm). O período de incubação foi de uma hora pelo repertório DOM15-10 e duas horas pelo repertório DOM15-26-555.
As produções foram como seguem: 1,5 x 106 e 9 x 105 pelo segundo e terceiro ciclos de seleção com o repertório DOM15-10; 2,2 x 108 e 3,9 x 109 pelo segundo e terceiro ciclos de seleção com o DOM15-26-555.
EXEMPLO 4
155
Análise de produções de seleção: Repertórios DOM4-130-54 e DOMlh-131-511
Todas as produções a partir do ciclo 3 e ciclo 4 foram subclonados no vetor pDOM5 e transformadas em células JM83. O vetor pDOM5 é um vetor com base pUC119. A expressão das proteínas é conduzida pelo promotor Plac. Uma sequência líder GAS1 (ver WO 2005/093074) de secreção garantida de dAbs solúveis, isolados no periplasma e sobrenadante de cultura de E. coli JM83. 96 e 72 colônias de indivíduos a partir do ciclo 3 e ciclo 4 foram aleatoriamente selecionados pela expressão de 12 a 24 clones foram sequenciados a partir de cada produção de ciclo 3 e ciclo 4. As mutações de consenso foram observadas em ambas as seleções e aproximadamente 25 clones que abrigam os motivos de consenso foram escolhidos pela caracterização adicional. As sequências de aminoácidos destes clones são mostrados na FIG. 3 (variantes selecionadas DOMlh-131511) e FIG. 4 (variantes selecionadas DOM4-130-54) e listados como sequências de DNA nas FIGS. 19A-19L. Os aminoácidos que diferem a partir da sequência parente em clones selecionados são iluminados (aqueles que são idênticos são marcados por pontos). Os arcos correspondentes aos CDR1, CDR2 e CDR3 são sublinahos com caixas.
Estes clones foram expressados em uma ampla quantidade, purificado em proteína L (pelas variantes DOM4-130-54) e proteína A (pelas variantes DOMlh-131-511) e testados pela ligação de antígeno em BIAcore após uma hora ou durante a noite de incubação a 37° C na presença ou ausência de tripsina (100 pg/ml ou 1000 pg/ml de concentração final).
Geralmente, as produções a partir das seleções DOM4-130-54 foram mais estáveis com mais clones remanescentes resistentes a tripsina por uma hora e os clones mais resistentes durante a noite. Em comparação, um pequeno número de clones a partir das seleções DOMlh-131-511 foram resistentes a tripsina por uma hora, enquanto nenhum dos clones foram
156 resistentes durante a noite.
EXEMPLO 5
Análise de produções de seleção: repertórios DOM15-10 e DOM15-26-555
A efetividade de seleção com o pré-tratamento de tripsina foi primeiro testado em ELISA de fago monoclonal com e sem digestão de tripsina. Dezoito colônias a partir do segundo ciclo de seleção de 24 colônias a partir do terceiro ciclo de seleção de cada biblioteca foram escolhidas. Os clones DOM15-10, DOM15-26-501 e DOM15-26 foram usados como controles. Os controles adicionais incluídos, amplificados e purificados pela solução de fago a partir de cada biblioteca após o segundo e terceiro ciclos de seleção de trispina.
Cada amostra de fago foi dividida em duas frações, a primeira foi tratada com 100 ug/ml de tripsina, a segunda não foi tratada com tripsina. A incubação de ambas as frações foi realizada por uma hora a 37° C com agitação (250 rpm) e bloqueada pela adição do inibidor de protease completo da Roche (lx).
ELISA de fago foi realizada usando as amostras não digeridas e digeridas por tripsina. Os reservatórios de ELISA foram revestidos com neutravidina em 0,ÍM de tampão de bicarbonato em uma concentração de 1 pg/ml. Após as etapas de lavagem com PBS e bloqueamento dos reservatórios revestidos por antígenos com 1 % de Tween-20 em PBS por uma hora em temperatura ambiente, os reservatórios foram revestidos com hVEGF biotinilado diluídos em 1 % de Tween-20 em PBS em uma concentração de 100 ng/ml. A seguir, os reservatórios foram lavados com PBS e tratados ou sobrenadantes de fagos não tratados diluídos 1:1 com 1 % de Tween-20/PBS, foram adicionados. Após 30 minutos de incubação a 37° C, os reservatórios foram lavados com 1 % de Tween-20/PBS, seguido pela incubação a 30 minutos a 37° C com conjugado HRP de fago anti-M13 (diluídos 1/5000 em 1
157 % de Tween-20/PBS). Os reservatórios foram então lavados com PBS e peroxidase. A reação foi iniciada pela adição do reagente SureBlue. Após cerca de dez minutos, a reação foi interrompida com um volume equivalente de IM de HC1 e os reservatórios foram lidos em OD450nM.
As leituras de ELISA de controles instáveis DOM15-10 e DOM15-26-501 tratados com tripsina dão um OD450 inferior do que 0,404 e este valor foi assumido como uma margem de valor de um clone instável. Todas as amostras que dão um OD inferior do que 0,404 foram consideradas serem instáveis. Todas as amostras acima que o valor foram consideradas serem estáveis.
Tabela 8
Biblioteca Tripsina Nenhuma tripsina
2o seleção 3 o seleção 2 o seleção 3 o seleção
DOM15-10 33 % 89% 100 % 100 %
D0M15-26-555 94,4 % 100% 100 % 100%
A Tabela 8 mostra a porcentagem de clones estáveis após o segundo e terceiro ciclos de tripsina seleção de cada biblioteca. O enriquecimento de clones resistentes à tripsina é visível em ambas as bibliotecas após o terceiro ciclo de seleção. Os valore de controle dos reservatórios de ELISA contendo mistura de fago purificado, amplificado após cada seleção foram muito mais alta do que 0,404 em cada caso após a digestão de tripsina. Além disso, um pequeno aumento no sinal foi observado quando em comparação com o fago tratado por tripsina a partir do terceiro ciclo de seleção com fago tratado por tripsina a partir do segundo ciclo de seleção. A biblioteca de fago DOM15-10 mostrou um aumento de cerca de 14 % dos valores de partida. A biblioteca de fago DOM15-26-555 mostrou um aumento que representa cerca de 2 % dos valores de partida.
Todos estes resultados mostram que a seleção com prétratamento de tripsina foi efetivo para selecionar os clones de fagos resistentes a tripsina a partir dos repertórios DOM15-10 e D0M15-26-555.
158
Todas as produções do segundo e terceiro ciclos de seleção (DOMI 5-26-555) e a partir do terceiro ciclo de seleção apenas (DOM15-10) foram subclonados no vetor pDOM5 e transformadas em células eletrocompetentes HB2151. O vetor pDOM5 é um vetor pUC119 com base. A expressão das proteínas é conduzida pelo promotor Plac. Uma sequência líder GAS 1 de secreção garantida de dAbs solúveis, isolados no periplasma e sobrenadante de cultura de E. coli HB2151. As 184 colônias de indivíduos de cada ciclo de seleção (3 e 4) foram aleatoriamente selecionados pela expressão em volumes de cultura a 1 ml.
Os sobrenadantes bacterianos foram diluídos em tampão HBSEP BIAcore (1:1 razão de volume) e divididos em cópias. A tripsina foi adicionada apenas a um frasco em uma concentração final de 20 pg/ml. A incubação foi realizada por 40 minutos a 37° C com agitação (250 rpm). Após o bloqueamento da reação com inibidor de protease completo da Roche (IX), ambos a tripsina tratada e os sobrenadantes de fagos não tratados foram testadas em BIAcore 3000 pela ligação de antigeno (2.000 RU de hVEGF biotinilado em um sensorchip SA).
O critério para a coleta de clones foram: um aumento na ligação do antigeno de < 15 % dos dAbs tratados com tripsina relativo aos dAbs não tratados (com base em max RU reagido no período de tempo selecionado), que refletiría a estabilidade dAbs ao tratamento de protease em geral; e diminuição da taxa de < 40 % entre dois períodos de tempos durante a dissociação de um dAb a partir do antigeno. Com base nestes valores, os 60 clones a partir do segundo e terceiro ciclos de seleção da biblioteca DOM 1526-555 e 17 clones a partir do terceiro ciclo de seleção da biblioteca D0M1510 foram seqüenciados. As mutações de consenso foram observados em ambas as produções de bibliotecas e 17 clones a partir de cada biblioteca que abrigam os motivos de consenso foram escolhidos pela caracterização adicional. As sequências de aminoácidos destes clones são mostrados na FIG.
159 (variantes selecionadas DOMI 5-26-555) e FIG. 6 (variantes selecionadas DOM15-10) e listados como as sequências de DNA nas FIGS. 20A-20E. Os aminoácidos que diferem a partir da sequência parente em clones selecionados são iluminados (aqueles que são idênticos são marcados por pontos). Os arcos correspondentes aos CDR1, CDR2 e CDR3 são sublinhados nas caixas.
Estes clones foram expressados em 50 ml de culturas de expressão, purificados em proteína A (pelas variantes DOM15-26-555) ou proteína L (pelas variantes DOM15-10) diluídos na concentração lOOnM em tampão HBS-EP e testados pela ligação de antígeno em BIAcore após 1,5 horas de incubação a 37° C com agitação (250 rpm) na presença ou ausência de tripsina (20 pg/ml de concentração final).
Estes clones também foram testados pela resistência a tripsina usando o método descrito no Exemplo 2. As proteínas foram os trocadores de tampão ao PBS e concentrados a 1 mg/ml. 25 pg da proteína foi misturada com 1 pg de tripsina (Promega) e incubado por 0 hora e 24 horas a 30° C. Após este período, a reação foi bloqueada com o inibidor de protease completo da Roche (IX) e DTT, bem como agente de carregamento, foi adicionado. As amostras foram desnaturadas por cinco minutos a 100° C. Então 15 pg de cada amostra foi analisado pela eletroforese em Novex 10-20 % de gel de tricinos e proteínas foram tingidas com SureBlue (Ix).
Geralmente, as produções a partir das seleções DOM15-26555 foram mais estáveis, com mais clones remanescentes resistentes a tripsina por 1,5 horas quando testados em BIAcore e durante a noite quando realiza em SDS-PAGE. Em comparação, apenas um pequeno número de clones a partir das seleções DOM 15-10 foram resistentes a tripsina pelo tratamento durante a noite quando realiza em SDS-PAGE.
EXEMPLO 6
Identificação de variantes DOMlh-131-511
160
O DOMlh-131-203, DOMlh-131-204 e DOMlh-131-206 foram analisados em detalhes adicionais. Estes foram comparados no BIAcore em uma concentração dAb de 500 nM após a incubação com concentrações diferentes de tripsina (variando de 0 a 100 gg/ml) durante a noite a 37° C. Os traços BIAcore são mostrados na FIG. 7. Os resultados claramente mostram que ambas as variantes são mais resistentes do que seu parente a proteólise em alta concentração de tripsina (100 gg/ml). Dois de dAbs, DOMlh-131-202 e DOMlh-131-206, também foram comparados junto com sua origem contra uma faixa de outras proteases incluindo leucozima, elastase e pancreatina sob as condições descritas acima, com uma concentração de protease de 100 gg/ml. Os dAbs mostrou a resistência aumentada a proteólise comparado ao parente contra todas as proteases testadas. Os traços BIAcore para a elastase e leucozima são mostradas na FIG. 8.
gM de cada dAb foi tratado com 100 gg/ml de grau de sequenciamento de tripsina por 0, 1, 3 e 24 horas. A reação foi inibida com 25X inibidor de protease completo da Roche e as realizações foram realizadas em um 4-12 % de gel de Novex Bis-Tris. Os géis são mostrados na FIG. 9.
EXEMPLO 7
Identificação de variantes DOM4-130-54
O DOM4-130-201 e DOM4-130-202 foram analisados em detalhes adicionais. Estes foram comparados no BIAcore em uma concentração dAb de 500 nM após incubação com concentrações diferentes de tripsina (variando de 0 a 100 gg/ml) durante a noite a 37° C. Os traços BIAcore são mostrados na FIG. 10. Os resultados claramente mostram que todos as três variantes são mais resistentes do que seu parente a proteólise em altas concentrações de tripsina (100 gg/ml). O DOM4-130-201 e DOM4-130202 também foram comparados contra o parente de uma faixa de outras proteases incluindo leucozima, elastase e pancreatina sob as condições descritas acima com uma concentração de protease de 100 gg/ml. Embora os
161 resultados foram menos aparente do que com a tripsina, os dAbs de chumbos mostrou a resistência aumentada a proteólise em comparação ao parente contra todas as proteases testadas. Os traços BIAcore para a elastase e leucozima são mostrados na FIG. 11.
μΜ de cada dAb foi tratado com 100 ug/ml de grau de sequenciamento de tripsina por 0, 1, 3 e 24 horas. A reação foi inibida com 25X inibidor de protease completo da Roche e as realizações foram realizadas em um 4-12 % de gel de Novex Bis-Tris. Os géis são mostrados na FIG. 9.
EXEMPLO 8
Caracterização adicional de variantes DOMlh-131-511 e DOM4-130-54
Os dAbs foram primeiro analisados usando calorimetria de varredura diferencial (DSC) determinar se o aumento na resistência de trispsina correlacionada com um aumento na temperatura de fusão (Tm). Um aumento na estabilidade de tripsina não correlaciona com um aumento na Tm (ver Tabela 9)
Tabela 9
Nome Tm, ° C
DOMlh-131-511 57,9
DOMlh-131-202 67,5
DOMlh-131-203 65,7
DOMlh-131-204 62,3
DOMlh-131-206 64,9
DOM4-130-54 54,1
DOM4-130-201 64,7
DOM4-130-202 64,5
O dAbs derivado de DOMlh-131-511 também foram comparados em um ensaio com base celular MRC-5 (ver Tabela 10). Neste ensaio, a capacidade dos dAbs para neutralizar a liberação estimulada por TNFa IL-8 foi medido para determinar se o aumento na estabilidade de tripsina tem levado a um diminuição na eficácia. Entretanto, a atividade do dAbs resistente a tripsina no ensaio foi substancialmente afetado.
162
Tabela 10
Amostra ND50 nM
DOMlh-131-511 1,98
DOMlh-131-511 1,71
DOMlh-131-511 (230307CE) 1,89
DOMlh-131-203 (230307CE) 2,28
DOMlh-131-204 (230307CE) 1,89
DOMlh-131-511 1,46
DOMlh-131-206 (230307CE) 0,71
Os dAbs derivados de DOM4-130-54 foram testados em um ensaio de ligação do receptor para ver se estes ainda tem a mesma capacidade de inibir a ligação de IL-1 a IL-RI (ver Tabela 11). A atividade de dAbs 5 resistentes a tripsina não afetado neste ensaio.
Tabela 11
dAb IC50 (nM)
D0M4-130-54 280pM
DOM4-130-201 257pM
DOM4-130-202 254pM
EXEMPLO 9
Identificação das variantes DOM15-26-555
O DOM15-26-588, DOM15-26-589, DOM15-26-591 e
D0M15-26-593 foram analisados em detalhes adicionais junto com sua origem e dois dABs adicionais, D0M15-26-594 e DOM15-26-595, que foram criadas pela mutagênese para combinar as mutações que teria o maior impacto na potência ou estabilidade (E6V e F100S/I). As seqüências são mostradas na FIG. 12. Os clones foram comparados no BIAcore pela ligação hVEGF nas concentrações dAb de 100 nM após a incubação com tripsina a uma concentração de 200 pg/ml. A reação foi realizada por três horas e 24 horas a 37° C com agitação (250 rpm). Os traços BIAcore dos melhores clones, DOM15-26-593 e sua origem são mostrados na FIG. 13. Outros resultados são apresentados como um mapa na FIG. 14. Os resultados claramente
163 mostram que todas as variantes são mais resistentes do que sua origem a proteólise após 24 horas de tratamento de tripsina.
A resistência de trispsina de DOM15-26-593 e sua origem também foi examinado pela realização das amostras tratadas e não tratadas em SDS-PAGE. Brevemente, as proteínas foram trocadas de tampão ao PBS e concentradas a 1 mg/ml. 25 ug de proteína foi misturada com 1 pg da tripsina de grau de sequenciamento (Promega) e incubado por 0 horas, 1 hora, 3 horas e 24 horas a 30° C. Após este período, a reação foi bloqueada com inibidor de protease completo da Roche (lx) e DTT, bem como agente de carregamento, foi adicionado. As amostras foram desnaturadas por cinco minutos a 100° C. 15 ug de cada amostra foi carregado em Novex 10-20 % de gel de tricinos e proteínas foram tingidas com SureBlue (Ix). Os resultados são mostrados na FIG. 15. A resistência do perfil de trispsina de DOM15-26-593 neste experimento varia a partir do perfil mostrado pelo experimento BIAcore, sugerindo que as diferenças nas condições de reação pode influenciar no resultado final de clivagem de tripsina. Entretanto, o DOM15-26-593 tem maiores propriedades biofísicas, bem como afinidade, do que outros clones selecionados, como mostrado abaixo. Um resumo das propriedades das variantes D0M15-26-555 também é mostrado na tabela 12 abaixo.
164
Tabela 12
Atributo
SEC-MALLS DSC RBA BIAcore Estabilidade de tripsina
dAb % monômero Est. Mw Tm°C nM KDnM % de ligação @ +24 horas
15-26 0 37-136 64 10 28,2 30
15-26- 501 0-40 18-290 51 1,14 9,1 5
15-26- 555 0 28-78 63 11,7 26,1 10
15-26- 588 10 33 70 27 59,1 15
15-26- 589 90 17 63 1,94 9,6 65
15-26- 591 20 21-234 63 16 38 35
15-26- 593 80 17 65 0,323 3,2 80
15-26- 595 60 17 65 0,828 5 70
EXEMPLO 10
Identificação de variantes DOM 15-10
O DOM15-10-11 foi analisado em detalhes adicionais, junto com sua origem, DOM15-10. As seqüências são mostradas na FIG. 16. Os dAbs foram comparados no BIAcore pela ligação hVEGF na concentração dAb de 100 nM após a incubação com tripsina em uma concentração de 200 pg/ml. A reação foi realizada por 1 hora, 3 horas e 24 horas a 37° C com agitação (250 rpm). Os traços BIAcore destes dAbs são mostrados na FIG. 17.
O resultado claramente mostra que a variante selecionada é mais resistente do que sua origem a proteólise após 24 horas de tratamento de tripsina.
A resistência a tripsina do chumbo e sua origem também foi examinada pela realização das amostras tratadas e não tratadas de SDSPAGE. Brevemente, as proteínas foram trocadas de tampão ao PBS e 15 concentrados a lmg/ml. 25 pg de proteína foi misturada com 1 pg de tripsina de grau de sequenciamento (Promega) e incubado por 0 horas, 1 hora, 3 horas e 24 horas a 30° C. Após este período, a reação foi bloqueada com inibidor de protease completo da Roche (lx) e DTT, bem como agente de carregamento,
165 foi adicionado. As amostras foram desnaturadas por cinco minutos a 100° C. 15 pg de cada amostra foi carregado em Novex 10-20 % de géis de triceno e proteínas foram tingidas com SureBlue (Ix). Os resultados são apresentados na FIG. 18. Neste caso, o perfil resistente a tripsina correlaciona bem com o teste de tripsina BIAcore, mostrando que a atividade de ligação diretamente reflete a integridade das proteínas.
EXEMPLO 11
Caracterização adicional de variantes DOM 15-26-555 e DOM15-10
Os dAbs foram analisados usando calorimetria de varredura diferencial (DSC) determinando se o aumento na resistência de trispsina correlacionada com um aumento na Tm. Os resultados são mostrados na Tabela 13. Existe uma correlação entre a resistência de trispsina de variantes DOM15-26-555 e temperatura de fusão. O DOM15-26-588 e DOM15-26-593 de chumbo mostrou a Tm melhorada, mas os outros clones não. Este é sem custo que as moléculas da origem tanto do D0M15-26-555 quanto do DOM15-10 tem muito maé alto do Tm no início (63,3 a 63,7° C) do que as moléculas parentes DOM4-130-54 e DOMlh-131-511 (Tm no início: 57,9 a 54,1° C), mas todas os clones resistentes a protease atinge uma Tm em uma faixa similar (Tm média de 65,1° C para as variantes DOMlh-131511/DOM4-130-54 e a Tm média de 64,9° C para as variantes DOM15-2655ZDOM15-10).
Tabela 13
Nome Tm°C
D0M15-26-555 63,3
DOM15-26-588 70,1
DOM15-26-589 63
DOM 15-26-591 63
DOM15-26-593 65
DOM15-10 63,7
DOM15-10-11 63,3
Os dAbs também foram comparados em uma ensaio de ligação
166 do receptor e cinéticos BIAcore foram medidos para determinar se o aumento na estabilidade de tripsina tem levado a uma diminuição na eficácia. Entretanto, a atividade do dAbs no ensaio foi substancialmente afetado ou ainda melhorado. Os resultados são apresentados na Tabela 14.
Tabela 14
Clone ID EC50 (nM) KD (nM)
DOM15-26-555 11,7 26,1
DOM15-26-588 27 59,1
DOM15-26-589 1,94 9,6
DOM15-26-591 16 38
DOM15-26-593 0,323 3,2
DOM15-26-594 4,09 15,1
DOM15-26-595 0,828 5
DOM15-10 10,23 23,6
DOM15-10-11 3,58 14,6
Vantagens de uma Tm intensificada
Mais proteínas — incluindo anticorpos de domínio - existem em dois estados: um estado dobrado (que leva a molécula biologicamente ativa) e um estado não dobrado (que que não realiza a atividade funcional). Estes dois estados co-existem em todas as temperaturas e a proporção relativa de cada estado é usualmente determinado por um K constante que é uma função de constantes cinéticos de dobragem e não dobragem. A temperatura de fusão é usualmente definida como a temperatura no qual K =1, isto é a temperatura no qual a fração da proteína de dobra é igual a fração da proteína não dobrada. O K constante é determinado pela estabilização e desestabilização de interações intramoleculares de uma proteína e portanto é principalmente determinado por uma sequência de aminoácido da proteína. Os parâmetros extrínsicos tal como temperatura, pH, composição de tampão, influência de pressão K e portanto a temperatura de fusão.
As proteínas não dobradas são fáceis alvos para a degradação dos mecanismos: (i) exposição de ligações de bissulfeto que aumentam os riscos de oxidação ou redução dependendo das circunstâncias, (ii) favores de flexibilidade da cadeia secundária intensificada de reações auto-proteolíticas,
167 (iii) exposição de segmentos de peptídeos que oferecem os alvos as proteases in vivo, como proteases durante os processos de produção e para realizar a protease durante o processamento à jusante e armazenagem de termo longo e (iv) exposição de segmentos propensos a agregação que levam a agregação intermolecular e precipitação de proteína. Em todos os casos, a perda da integridade da proteína, conteúdo da proteína e ocorre a atividade da proteína, portanto comprometendo esforços (i) garantir a reprodutibilidade da batelada, (ii) garantir a estabilidade de termo longo em prateleira e (iii) eficácia in vivo.
As proteínas naturais foram projetadas pela evolução adequadamente para realizar na temperatura corporal e para ser rapidamente substituído por intermédio dos mecanismos homeostáticos. As proteínas terapêuticas fabricadas através dos processos biotecnológicos no aspecto de um ambiente diferente: estes são frequentemente produzidos pela tecnologia de DNA recombinante em um hospedeiro estranho, são expressados em altas quantidades em amplos reservarórios, que sofre mudanças muito importantes no pH ou composição do tampão em toda parte dos processos à jusante e finalmente são armazenados em altas concentrações em tampões não fisiológicos para o período prolongado de tempo. Novas técnicas de liberação (por exemplo inalação, emplastro sc, nanopartículas de liberação leve) também são adicionados na tensão sofrida pelas proteínas terapêuticas. Finalmente a chegada das técnicas que projetam a proteína tem resultado na produção de proteínas terapêuticas intensificadas e totalmente novas. Por causa das técnicas que mais projetam são técnicas com base in vitro que almeja a alteração ou criação de novas sequências de aminoácidos, processos de evolução que tem gradualmente proteínas biológicas melhoradas não acontecem, visto que resultando nas proteínas de ótimos sub-desempenhos com relação a resistência da tensão.
A técnica da presente invenção almeja a reprodução de uma das condições nos aspecto das proteínas em toda parte da evolução
168
Darwiniana. Os peptídeos ou polipeptídeos, por exemplo domínios variáveis simples de imunoglobulina são infundidos com proteases que desempenham o maior papel na remodelagem de tecido da homeostase da proteína. Qualquer mutação particular que pode resultar em uma proteína com um ajuste melhorado a sua função é também testado por sua capacidade de ajustar dentro do ambiente que é realizado. Este processo é reproduzido em uma forma de realização da presente invenção: um repertório de variantes de peptideo ou polipeptídeo é criado e exposto a uma protease. Em uma segunda etapa, o repertório de variantes é contactado com um alvo específico. Apenas as variantes de proteínas que tem a degradação sustentada por uma protease são capazes de empenhar com o alvo e portanto recuperar, por exemplo, por um simples processo de purificação por afinidade nomeado ‘bioextração’. O sistema oferece diversas vantagens em comparação aos processos in vivo: um repertório de proteína pode ser um aspecto com uma ampla faixa de condições, por exemplo uma faixa de protease, em concentrações mais altas, por longos períodos, em tampões diferentes ou pHs e em temperaturas diferentes. Deste modo esta tecnologia in vitro oferece um significado para projetar as proteínas que podem realizar e permanecem estpaveis em uma ampla faixa de ambientes do que aqueles que originam-se. Claramente estas oferecem vantagens mútliplas para a indústria biotecnológica e para a área das proteínas terapêuticas em particular.
EXEMPLO 12: Dados de correlação de PK para os chumbos resistentes a protease
Sua origem dAb e um dAb resistente a protease em cada uma das quatro linhagens dAb, foram ainda avaliados in vivo (ver Tabela 15 abaixo para a lista e detalhes)
169
Tabelai 5:
Linhagem dAb ID Resistência a tripsina Tm (°C) Atividade (nM) ID como fusão Fc
DOM4- 130 DOM4-130- 54 Bom 54 0,128* DMS1541
DOM4-130- 202 Muito alto 64 0,160* DMS1542
DOMlh- 131 DOMlh-131- 511 Bom 57 0,048f DMS1543
DOMlh-131- 206 Muito alto 64 0,047f DMS1544
DOM15- 10 DOM15-10 Baixo 64 0,913f DMS1546
DOM15-10- 11 Alto 63 0,577f DMS1531
DOM15- 26 DOM15-26- 501(*) Baixo 52 0,330f DMS1545
DOM15-26- 593 Alto 65 0,03 3 f DMS1529
*: como determinado pelo bioensaio MRC5/IL-a; f: como determinado pelo ensaio RBA
Anotação: O DOM15-26-501 é uma versão parente de 5 DOM15-26-555 exemplificado acima neste Pedido de Patente. O DOM15-26555 tem uma mutação de linha germinativa de aminoácido em CDR1 (134M). DOM15-26-501 tem uma temperatura de fusão inferior do que DOM15-26555 (52C v 63,3C) e uma susceptibilidade aumentada para a digestão pela tripsina. O DOM15-26-501 foi escolhido em D0M15-26-555 pelo estudo PK 10 como este é um melhor representativo para a estabilidade fraca em comparação ao DOM15-26-593.
Traduzimos a resistência como seguem:
é baixo é moderado
3 é bom é alto é muito alto
Então este meio que a resistência a tripsina de sua molécula de origem é:
170
DOM4-130-54 é Bom
DOMlh-131-511 é Bom
DOM15-10 é Baixo
DOM15-26-501 é Baixo
Como para chumbos selecionados:
DOM4-130-202 é Muito alto
DOMlh-131-206 é Muito alto
DOM15-10-11 é Alto
DOM15-26-593 é Alto
Por causa dos anticorpos de domínio são pequenos nos
tamanhos (12-15 kDa) estes são titpicamente claros a partir da circulação na injeção iv ou sc. De fato o corte de filtração glomerular renal é acima 50 kDa e portanto pequenas proteínas tal como dAbs não são retidos na circulação como passam através do rim. Portanto, a fim de avaliar os longos efeitos dos termos da resistência como proteases in vivo, anticorpos de rótulo de domínio com uma porção que aumenta a residência sistêmica. Diversos métodos (por exemplo PEG, fusões Fc, fusão de albumina, etc) almejando a vida média que extende-se e foram relatados na literatura. Nesta aplicação os anticorpos de domínio foram rotulados (ou formatados) com a porção Fc do anticorpo IgGl humano. Este formato oferece duas vantagens: (i) o tamanho molecular do dAb-Fc resultante é ~75kDa que é amplo o bastante para garantir a retenção em circulação, (ii) a porção Fc do anticorpo liga-se ao receptor FcRn (também conhecido como receptor “Brambell”). Este receptor é localizado nas células epiteliais, células endoteliais e hepatócitos e está envolvido no prolongamento da vida total de anticorpos e albumina: de fato na pinocitose de anticorpos e outras proteínas de soro, as proteínas são direcionados ao endossomo acidificado onde os anticorpos interceptores receptores FcRn (através da ligação a porção Fc) antes do trânsito do endossomo e retoma a este a circulação. Deste modo a rotulação da porção Fc ao dAb, é garantido que os
171 dAbs será exposto por longo período de dois pelo menos compartimentos - o soro e os compartimentos pré-endossômicos, cada um de que contendo uma série específica das enzimas proteolíticas. Além disso, o receptor FcRn media a transcitose onde pelas proteínas que carrega Fc migram a partir do espaço extravascular.
A formatação com Fc foi acompanhado pela fusão do gene que codifica o VH e VK dAbs ao gene que codifica o IgGl Fc humano, através de uma curta intervenção do ligador peptídeo (em negrito):
Por um VH dAb (sublinhado):
EVQ......GQGTLVTVSSASTHTCPPCPAPELLGGP.. .(hlgGlFc).. .PGK*
Para um VK dAb (sublinhado):
DIQ.........GQGTKVEIKRTVAAPSTHTCPPCPAPELLGGP... (hlgG 1 Fc)
...PGK*
Material foi produzido pela transfecção transiente de células HEK293/6E usando fectina 293 (Invitrogen) de acordo com os protocolos padrão. Estas células são projetadas pelo alto nível de expressão transiente quando usado na conjunção com as séries pTT de vetores (Durocher et al 2002). Deste modo os genes dAb foram clonados em um vetor pTT5 modificado (pDOM38) para gerar o vetor de expressão de fusão Fc (ver Figura 21). O sobrenadante a partir das células transfectadas foi coletado em 5 dias pós-transfecção, clarificado pela centrifugação e filtrado através de um filtro a 0,2 pm. As proteínas de fusão dAb-Fc foram purificados pela captura na resistência organizada de proteína A (GE Healthcare). A proteína foi eluída a partir da coluna em citrato de sódio a 10 mM pH3, seguido pela adição de e citrato de sódio 1M pH6, para atingir uma composição final de 100 mM de citrato de sódio pH6.
As moléculas dAb-Fc foram testadas pela vida média in vivo no rato em uma dosagem alvo de 5 mg/kg em ratos Sprague-Dawley fêmeas (n=3 por grupo). Deve ser notado que a dosagem alvo imensamente excede a
172 concentração alvo em ratos, de modo que é esperado que as diferenças nas afinidades entre dAbs parente e resistência dAbs a tripsina (ver exemplo 11) não impactará na fato da molécula in vivo. Visto que as diferenças em perfis PK entre dAbs são esperados refletir em um processo de eliminação independente de antígeno.
As amostras de sangue foram tiradas após 0,03, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120 e 168 horas pós-administração. Após a formação de coágulo, o soro foi retirado e então testados em ensaios de captura de antígeno hIL-lRl, TNFR1 ou VEGF:
Ensaios de captura de antígeno hIL-lRl:
Revestir com 4 ug/mL anti-hIL-lRl Bloquear
Adicionar 500 ng/mL shIL-lRl
Amostras adicionadas
Detectar com Fc HRP @ anti-humano 1:10.000
Ensaios de captura de antígeno TNFR1:
Revestir com 0,1 ug/mL sTNFRl
Bloquear
Amostras adicionadas
Detectar com Fc HRP @ anti-humano 1:10.000
Ensaios de captura de antígeno VEGF:
Revestir com 0,25 ug/mL VEGF
Bloquear
Amostras adicionadas
Detectar com Fc HRP @ anti-humano 1:10.000
Os dados brutos a partir dos ensaios foram convertidos nas concentraçãos do medicamento em cada amostra de soro. O meio de valores pg/mL em cada período de tempo foram então analisados em WinNonLin usando nenhuma análise compartimental (NCA). Os perfis PK de cada par
173 dAb-Fc são mostrados na Tabela 16 que resume os parâmetros PK determinados.
Tabela 16:
ID dAb Vida média (hora) AUC/D (0-inf) (hr*pg/mL)/(mg/kg) % AUC extrapolado
DMS1541 4-130-54 93,2 691,5 22,7
DMS1542 4-130-202 176,8 710,1 49
DMS1543 lh-131-511 140,8 1807,5 40
DMS1544 lh-131-206 158,6 2173,0 43,6
DMS1546 15-10 43,2 324,6 3,8
DMS1531 15-10-11 56,6 770,5 n.d.
DMS1545 15-26-501 12,9 89 5,1
DMS1529 15-26-593 86,2 804,7 21,0
Os resultados claramente indicam que - enquanto os perfis PK dos pares dAb-Fc 4-130-54 ao 111-131-206 são quase superimpossíveis- os perfis amplamente variam com os outros pares. Os efeitos são mais visíveis quando o AUC/D é considerado: o AUC/D de 15-10 é apenas 42 % de que de 15-10-11. O AUC/D de 15-26-501 é apenas 11 % de que 15-26-593. Estas diferenças importantes também impactam as vidas médias (a uma menor extensão): 43,2 h versos 56,6 h por 15-10 e 15-10-11, respectivamente. Uma grande diferença é visto com a linhagem DOM15-26: 12,9 h versos 86,2 h por 15-26-501 e 15-26-593, respectivamente. De fato para uma boa análise PK usando nenhuma análise compartimental, deve ter pelo menos 4 dados de pontos usados para ajustar o declive de regressão linear e o período de tempo em que a vida média é estimado deve ser pelo menos 3 vezes da vida média calculada.
Na luz das propriedades biofísicas descritas nos exemplos neste, este aparece que a capacidade de qualquer dAb dado para resistir a degradação pela tripsina é correlacionado com a capacidade da fusão dAb-Fc para circular por um período mais longo de tempo no soro de rato. De fato como mostrado nos exemplos, tal como Exemplo 10, DOM15-10 e DOM1526-501 são mais dAbs degradáveis: incubação de 25 ug dAb na presença de 1 ug de tripsina a 30° C por ~3 h resultou na degradação completa. Todos os
174 outros dAbs neste estudo (se estes foram selecionados com tripsina (isto é DOM15-10-11, DOM15-26-593, DOM4-130-202 e DOMlh-131-206) ou se estes já tem algumas resistências de trispsina como moléculas parentes (DOM4-130-54 e DOMlh-131-511)) tem perfis PK comparáveis em ratos quando re-formatados nas moléculas dAb-Fc. Deste modo, o estudo PK presente sugere que a susceptibilidade de uma proteólise tem um maior impacto na estabilidade in vivo de dAbs quando aqueles dAbs tem resistência mais baixa a proteólise. Também mostrou que — além de certos níveis — aumentos adicionais na resistência a degradação pela tripsina (por exemplo DOM4-130-206 versos DOM4-130-54) não significantemente adicionado até a capacidade das moléculas dAb-Fc para adicionar a eliminação abaixo in vivo.
Nos três casos, a seleção na presença de tripsina resultou em novas moléculas com a estabilidade térmica aumentada (definida pela temperatura de fusão): DOM4-130-202, DOMlh-131-206 e DOM15-26-593. O estudo PK indica que - na série de dados presentes - temperatura de fusão não é um parâmetro adequado para racionalizar os perfis PK observados: de fato DOM15-10 tem um maior Tm do que DOM15-10-11 e já é mais rapidamente limpo do que DOM 15-10-11 a partir da circulação. Em outra parte, os dois dAbs da linhagem DOM4-130 tem marcadamente a Tm diferente (por 10°C) e já mostra quase a estabilidade idêntica in vivo quando formatado nas moléculas dAb-Fc. Deve ser notado que a temperatura de fusão não é por si excluído como parâmetro chave para predizer a estabilidade in vivo. Isto acontece apenas com com a série de dados presentes, amplas diferenças Tm (de 54° C e acima) não tem um impacto significante no fato de dAbs in vivo. Este não exclui a possibilidade que na temperatura de fusão inferior do que 54° C, a estabilidade in vivo de dAbs pode correlacionar com a estabilidade térmica, ou possibilidade ainda com estabilidade térmica e resistência como protease juntas.
175
Exemplo 13
Seleções de tripsina em DOM10-53-474
Estabilidade de tripsina de DOM10-53-474 purificada:
O DOM10-53-474 é um anticorpo de domínio que liga-se ao IL-13 com a alta potência. Para avaliar a estabilidade deste dAb na presença de tripsina, o dAb purificado foi digerido com tripsina para o período aumentado de pontos de tempo e realiza em um gel para examinar qualquer degradação de proteína possível. 25 μΐ de DOM10-53-474 purificado em 1 mg/ml foi incubado com 1 μΐ de tripsina de grau de sequenciamento a 1 mg/ml a 30° C, resultante na razão molecular de 25:1 dAb:tripsina. O dAb foi incubado com tripsina por 1 hora, 4 horas e 24 horas e uma atividade de protease foi neutralisado pela adição de 4 μΐ de inibidores de protease completo da Roche seguido pela incubação em gelo. O tempo 0 da amostra foi feito pela adição de inibidores de protease ao dAb sem adição de tripsina. 2 μΐ de amostra foi subsequentemente analisado pela eletroforese usando Labchip de acordo com as instruções de fabricantes.
A Figura 22 mostra um gel que realiza com DOM10-53-474 incubado com tripsina aumentado por um período de tempo. Em comparação de uma tripsina estável por dAbs, DOM15-26-593 também foi tratado com tripsina como explicado acima e tem realizado lado a lado. Como mostrado na Figura, o DOM15-26-593 considera estável ainda após 24 horas a incubação com tripsina. Entretanto, o DOM10-53-474 é degradado por certa extensão após 24 horas, mas considera estável em 1 hora e 4 horas de período de tempo. Estes dados sugerem que DOM10-53-474 é resistente à degradação pela tripsina por certa extensão, mas não é tão estável quanto um dos dAbs mais estáveis a tripsina D0M15-26-593.
Estabilidade de tripsina de DOM10-53-474 que apresenta fago:
Para avaliar a estabilidade de tripsina do DOM 10-53-474 que
176 apresenta fago, o gene que codifica D0M10-53-474 foi clonado em locais de Sal/Not pDOM33 (Fig 50) e fagos produziram de acordo com as técnicas padrões. O fago foi purificado pela precipitação PEG, recolocado em suspensão em PBS e titulados.
Os dAbs que apresentam fagos foram incubados com tripsina por pontos diferentes de tempos para avaliar a resistência de trispsina. Seguindo a incubação com tripsina, a estabilidade foi medida pela análise tituladora seguindo a infecção de células E.coli TG1 exponencialmente desenvolvidas.
100 μΐ de fago foi incubado em 100 μg/ml de tripsina por 1 hora, 2 hora, 4 hora e durante a noite a 37° C, em um incubador de agitação. A atividade de tripsina foi bloqueada com inibidor de protease completo da Roche (2x) e então o fago foi diluído em 2 % de marvel em PBS, incubados com 10 nM de IL-13 biotinilado por uma hora em temperatura ambiente. As pérolas revestidas de estreptavidina (Dynabeads M-280 (Invitrogen) que foram pré-bloqueadas por uma hora em temperatura ambiente com 2 % de marvel em PBS foi adicionado e a mistura foi então incubada por 5 minutos em temperatura ambiente. Todos as etapas de incubação com Dynabeads foram realizados em uma roda de rotação. Os fagos de não ligação foram lavados foram pela lavagem de pérolas oito vezes com 1 ml de 0,1 % de Tween-20 em PBS. Os fagos de ligação foram eluídos com 0,5 ml de 0,lM de Glicina pH 2.2 e neutralizados com 100 μΐ de IM de Tris-HCL pH 8.0. Os fagos eluídos foram usados para infectar o TG1 exponencialmente desenvolvidos (1 hora a 37° C) e colocado em placas de tetraciclina. As placas foram incubadas a 37° C durante a noite e as contagens de colônias foram feitas. Os tituladores de produção de fago seguindo a digestão com tripsina é resumido na Tabela 17. Os tituladores de diminuem quando incubados com tripsina para o período de tempo aumentado. Após 24 horas de incubação todos os fagos são digeridos.
177
Tabela 17. Tituladores de produção de seleção de trispinas realizados em fagos que apresentam origem DOM-10-53-474:
Comprimento de incubação de tripsina Concentração de tripsina Titulador
Nenhum controle de tripsina - 3 x 10z
1 hora 100 pg/ml 1 x 10z
2 horas 100 pg/ml 7x 10ϋ
4 horas 100 pg/ml 5x 106
Durante a noite 100 pg/ml 0
Seleção de dAbs mais resistentes a tripsina:
A fim de selecionar os dAbs que são mais resistentes a degradação pela tripsina, as mutações aleatórias foram introduzidas ao gene que codifica DOM10-53-474 por PCR usando kit Stratergene Mutazyme 11, iniciadores biotinilados e 5-50 pg do modelo por 50 μΐ de reação. Após a digestão com Sall e Notl, as inserções foram purificadas a partir dos produtos não digeridos com as pérolas revestidas por estreptavidina e ligado em pDOM33 nos locais correspondentes. As células E. Coli TB1 foram transformadas com a mistura de ligação purificação resultante em uma biblioteca propensa ao erro de DOM10-53-474. O tamanho da biblioteca foi de 1,9 x 109 e a taxa de mutação de aminoácido foi de 1,3.
Três ciclos de seleção foram realizados com esta biblioteca para selecionar os dAbs com resistência de protease melhorada. O primeiro ciclo de seleção foi realizada apenas com antígeno sem tratamento de tripsina para limpar até a biblioteca para remover qualquer clone que não liga-se mais longo com alta afinidade. A seleção foi realizada a 10 nM IL-13. As produções a partir do ciclo um foram 2 x 109 comparados ao fago de entrada de 6 x 1010 que indica que a maioria do antígeno da ligação de biblioteca com alta afinidade.
O segundo e terceiro ciclos de seleção foram realizados com 1 nM IL-13 biotinilado. Antes da extração no IL-13, o fago foi incubado com 100 pg/ml de tripsina a 37° C em um agitador (250 rpm). Para o segundo ciclo de seleção, a incubação de tripsina foi realizada por 1 hora em
178 temperatura ambiente ou a 37° C. As produções a partir do ciclo 2 de seleção é mostrado na Tabela 18:
Tabela 18. Tituladores de fagos de produção seguindo a seleção de segundo ciclo.
Tratamento de tripsina Titulador
Nenhum tratamento 1 x 108
1 hora em Temperatura ambiente 5x 10'
1 hora a 37° C 2x 10'
As produções de fagos a partir do ciclo 2 de seleção com 1 hora de tratamento de tripsina a 37° C foi usado como a entrada para a 3 ciclo de seleção. Para o 3 ciclo de seleção, o fago foi tratado com 100 pg/ml de tripsina mas por um longo período de tempo: 2 horas a 37° C, 4 horas a 37° C, durante a noite em temperatura ambiente ou durante a noite a 37° C. Os tituladores de produção para o 3o ciclo de seleção são resumidos na Tabela 19:
Tabela 19: Tituladores de fagos de produção seguindo o terceiro ciclo de seleção
Tratamento de tripsina Titre
Nenhuma tripsina 1,3 x 108
2 horas a 37° C 1,9 x 10'
4 horas a 37° C 2x 106
Durante a noite em Temperatura ambiente 4x 10'
Durante a noite a 37° C 2,1 x 106
Diversos clones a partir de cada produção de seleção a partir do ciclo 1, 2 e 3 foram sequenciados para avaliar a diversidade da sequência. Seguindo o primeiro ciclo de seleção sem tratamento de tripsina, 50 % das produções de seleção tem origem da sequência DOM10-53-474. Após 2° ciclo de seleção, a porcentagem de origem aumentou de 75 %. Após 3° ciclo de seleção, a porcentagem de origem aumentou de 80 %.
Este dado indica que DOM10-53-474 já é resistente a degradação pela tripsina e não muitos novos clones podem ser selecionados destas seleções de tripsina. Figura 22 mostrou que quando a proteína purificada foi digerida com tripsina, o DOM10-53-474 não foi completamente
179 digerido ainda após, durante a noite o tratamento de tripsina. Entretanto para ver se este são qualquer novos clones que são mais resistentes a tripsina do que DOM 10-53-474 nas produções de seleção, a entrada 3 de seleção onde o fago foi tratado durante a noite com tripsina a 37° C foi sub-clonado em pDOM5. Cem clones foram então sequenciados para observar por qualquer clone resistente à tripsina. For a dos cem clones analisados, apenas 26 clones tem novas sequências, entretanto nenhum destes clones tem mutações em divagem de locais de tripsina (Lisina ou Arginina) que sugere que estes clones não são mais resistentes a tripsina do que DOM 10-53-474.
Exemplo 14
Armazenagem e melhoramento biofísicos introduzidos nos dAbs DOMO 101 de chumbo (anti-TNFRl) pela seleção de fago na presença de tripsina:
Para melhorar a resistência a protease da molécula DOMlh131-511 de chumbo, as seleções de fago na presença de tripsina foram realizados como descrito precocemente. O método produzido em uma faixa de clones com estabilidade de tripsina melhorada comparada a sua molécula DOMlh-131-511 de origem. Dois clones, DOMlh-131-202 e DOMlh-131206 foram selecionados pela caracterização adicional como estes mostraram melhoramentos mais significantes a ação de tripsina. O trabalho adicional como sublinhado abaixo mostra que com a resistência melhorada a ação de tripsina existem outros efeitos benéficos, principalmente em uma estabilidade da molécula para cortar e tensões térmicas. Estes dois parâmetros são centrais para aumentar a armazenagem e vida de prateleira dos produtos biofarmacêuticos.
Produção de DOM0101 dAbs de chumbo em Pichia pastoris:
Os genes que codificam a sequência de aminoácido primária das três moléculas de chumbo foram usados para produzir a proteína secretada em Pichia pastoris. Os três genes sintéticos (DOMlh-131-511,
180
DOMlh-131-202 e DOMlh-131-206) foram clonados no vetor de expressão pPIC-Ζα e então transformados em duas cepas Pichia, X33 e KM71H. As células transformadas foram colocadas em concentrações aumentadas de Zeocina (100, 300, 600 e 900 pg/ml) para selecionar os clones com integrantes múlitplos. Diversos clones foram então avaliados em frascos de 2L para identificar alta expressão das linhas celulares. Os clones de expressão melhor foram então usados para produzir o material na escala de 5L nos fermentadores.
Purificação da proteína e caracterização do material:
A fim de produzir o material de alta qualidade para a caracterização e ainda estudos de estabilidades, um processo de purificação à jusante foi desviado usando uma resina de indução de carga modal misturada (Capto MMC) como a etapa de captura primária seguido pela trocadora de ânion (Q Sefarose). Sem a otimização significante, este permitiu a recuperação de —70 % do dAb expressado em uma pureza de —95 %. O material foi caracterizado pela identidade usando espectrometria de massa por eletropulverizador, sequenciamento do terminal amino e focagem isoelétrica e para a pureza usando SDS-PAGE e SEC (a cromatografia de exclusão de tamanho).
Identidade da proteína:
A análise da sequência do terminal amino do primeiro a cinco resíduos de cada proteína, foi como esperado (EVQLL...). A espectrometria de massa foi realizada em amostras das proteínas no qual foi o trocador de tampão em 50:50 H2O:acetonitrila contendo 0,1 % de ácido acético glacial usando C4 Zip-tips (Millipore). A massa medida para cada uma das três proteínas está dentro de 0,5Da de massa teórica com base na sequência de aminoácido primário (calculado usando as massas médias) quando permitido por uma diferença de massa de -2 a partir da formação da ligação de bissulfeto interno. O IEF foi usado para identificar as proteínas com base em
181 seu pi que foi diferente para cada proteína.
Pureza da proteína:
As três proteínas foram carregadas em géis de SDS-PAGE de não redução nas quantidades de Ipg e 10pg em cópias. Um simples grupo foi observado em todos os exemplos.
A cromatografia de exclusão de tamanho também foi realizada para demonstrar níveis de pureza. Para cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) 100 pg de cada proteína foi carregada em uma coluna TOSOH G2000 SWXL seguindo a 0,5 ml/min. A fase móvel foi de PBS / 10 % de etanol. A porcentagem de monômero foi medido com base na área sob a curva (ver Fig 23).
Comparação de estabilidade de DOMlh-131-511, -202 e -206
Avaliação da estabilidade de protease:
A estabilidade de protease de DOMlh-131-511, DOMlh-131202 e DOMlh-131-206 foi avaliada pela análise BIAcore™ da atividade de ligação residual após a pré-incubação para os período de tempos definidos em excesso da protease. Aproximadamente 1400 RU de TNFR1 biotinilado foi revestido a um chip de estreptavidina (SA). 250 nM de DOMlh-131-511, DOMlh-131-202 e DOMlh-131-206 foi incubado com PBS apenas ou com 100 ug/ml de tripsina, elastase ou leucozima por 1, 3 e 24 horas a 30° C. A reação foi interrompida pela adição de um coquetel de inibidores de protease. As misturas de dAb/protease foram então passados no chip TNFR1 revestido usando subtração celular de referência. A superfície do chip foi regenerado com 10 ul de 0,lM de glicina pH 2.2 entre cada ciclo de injeção. A fração de DOMlh-131-511, DOMlh-131-202 e DOMlh-131-206 liga-se ao TNFR1 humano (a 10 segundos) pré-incubados com protease foi determinado relativo a ligação dAb sem protease. As operações de BIAcore™ foram realizadas a 25°C. Os dados abaixo foram produzidos a partir dos três experimentos independentes. O gráfico de barra indica o significado dos valores e as barras
182 de erros indicam o desvio padrão dos resultados (Figura 24).
Foi observado que DOMlh-131-202 e DOMlh-131-206 foram mostrados ter maior resistência a degradação proteolítica pela tripsina, elastase ou leucozima em comparação ao DOMlh-131-511. A diferença entre DOMlh-131-202 e DOMlh-131-206 em comparação ao DOMlh-131-511 é mais pronunciada após 1 hora com tripsina e após 3 horas com elastase ou leucozima. Existe uma direção que DOMlh-131-206 é levemente mais estáveis em comparação ao DOMlh-131-202 em mais das conditions testadas.
Estabilidade térmica dos dAbs como determinado usando DSC:
A fim de determinar em qual pH as moléculas de chumbo tem a maior estabilidade, calorimetro de varredura diferencial (DSC) foi usado para medir as temperaturas de fusão (Tm) de cada dAb no tampão BrittonRobinson. Coomo o Britton-Robinson é feito de até três sistemas de tampão de componentes (40 mM de cada um do ácido acético, fosfórico e bórico), este é possível para produzir uma faixa de pH de 3 - 10 na mesma solução. O pi teórico foi determinado a partir das sequências de aminoácidos das proteínas primárias. A partir do DSC, o pH no qual o dAbs tem sua maior estabilidade térmica intrísica foi observado ser pH 7 por DOMlh-131-202, pH 7-7.5 por DOMlh-131-206 e pH 7.5 por DOMlh-131-511. Para todos os trabalhos de estabilidade e tensão subsequentes os seguintes pHs foram usados para cada um dAb; por DOMlh-131-202 e GSK1995057A DOMlh131-206 pH 7.0 e por DOMlh-131-511 pH 7.5 no tampão Britton-Robinson. Os resultados são resumidos na Tabela 20.
183
Tabela 20: Resumo do pH e Tms de DOMlh-131-202,
DOMlh-131-206 e DOMlh-131-511 como determinado pelo DSC no tampão Bfitton-Róbinson a lmg/ml. A temperatura foi elevada a 180° C/hora.
dAb pH que dá maiores estabilidades térmicas intrísicas Tm (° C) do dAb no dado pH
DOMlh-131-202 7,0 68,6
DOMlh-131-206 7,0-7,5 65,8
DOMlh-131-511 7,5 58,0
Duas semanas de teste de estabilidade térmica
A capacidade da proteína para suportar os períodos prolongados de tempo em temperaturas elevadas é usualmente uma boa indicação desta estabilidade. Sob estas conditions, a proteína pode sofrer diversos processos físicos tal como agregação ou modificação química. Os dAbs (a lmg/ml) foram incubados a 37 e 50° C por 14 dias no tampão Britton-Robinson. O SEC foi usado para determinar como tal monômero foi deixado na solução no período do dia 14 (Figura 25).
A partir da Figura 25 pode ser visto que tanto o DOMlh-131202 quanto o DOMlh-131-206 são significantemente mais estáveis do que DOMlh-131-511 das tensões térmicas. A exposição das proteínas à temperaturas elevadas, tal como 37 e 50° C, são rotineiramente usadas para dar uma indicação em uma vida de prateleira de longo prazo do medicamento. Estas temperaturas mais altas são usadas para acelerar o processo normal associado com a armazenagem de longo termo em temperatura ambiente tal como desamidação, oxidação ou agregação. O nível de agregação na formação na solução também pode ser monitorado usando SEC (Figura 26A a I). Após 14 dias a 37° C, a perda de DOMlh-131-511a partir da solução pode ser atribuído tanto a precipitação quanto a formação de agregados em ordem maior como determinado pelo SEC (Figura 26B). Uma perda inferior significante na proteína também é visto tanto com DOMlh-131-202 quanto em DOMlh-131-206 a 37° C após 14 dias com muito pouco ou nenhum aumento substancial na formação agregada, especialmente no caso de
184
DOMlh-131-206 (Figura 26H). Em 50° C, a diferença entre as moléculas é ainda mais pronunciada, com DOMlh-131-206 que mostra a maior estabilidade nas maiores temperaturas do que DOMlh-131-202 após 14 dias, que mostra a formação significantemente reduzida de maiores agregados de peso molecular (Figura 26). Relativo ao t=0, DOMlh-131-206 mostra apenas um pequeno aumento na formação de agregado após 14 dias (Figura 261), onde o DOMlh-131-511 tem todos precipitados fora da solução (Figura 26C).
Este mostra que as mudanças introduzidas no dAb pela seleção de tripsina, por exemplo a estabilidade térmica melhorada, tem significantemente melhorado a estabilidade de armazenagem da proteína a 37 e 50° C. Tanto o DOMlh-131-202 quanto mais significantemente o DOMlh131-206, claramente tem melhorado a estabilidade da solução e tendência inferior para formar agregados em temperaturas elevadas que podem ser diretamente traduzidas para melhorar a estabilidade de armazenagem a longo prazo em temperaturas mais relevantes tal +4° C e temperatura ambiente.
As amostras de 24 horas, 48 horas, 7 ddias e 14 dias de períodos de tempos a partir do experimento de tensões térmicas foram então analisadas por IEF para ver se as proteínas tem sofrido qualquer mudança biofísica que afetaria na mudança total de proteína (Figura 27).
Contra tanto o DOMlh-131-202 quanto o DOMlh-131-206 nenhuma mudança significante foi mostrada a 37° C em comparação com DOMlh-131-511. Com DOMlh-131-511 um segundo grupo fraco aparece a 37° C após 24 horas. É acreditado este extra agrupamento é devido a dimerização da proteína, deste modo mascarando a mudança e produção de duas populações de moléculas. Em 50° C uma diferença entre as moléculas é mais pronunciado, DOMlh-131-206 claramente não mostra mudanças significantes na temperatura elevada onde o DOMlh-131-202 é que mostra algum sinal de modificação após 24 horas. A maioria de DOMlh-131-511 é perdido pela precipitação após 48 horas em Britton-Robinson.
185
Os períodos de tempos T=0, 7 e 14 dias em 50° C foram analisados pela TNFR-1 RBA para determinar a funcionalidade da proteina após a exposição em altas temperaturas (Figura 28). O ensaio não é correntemente tão sensível quanto SEC ou IEF na detecção de mudanças sutis a molécula devido a tensão, mas esta pode ser usada para mostrar que o dAb ainda pode ligar-se ao antígeno.
A mudança na curva deixa para DOMlh-131-511 refletir a maioria dos dAb que foram perdidos na precipitação. O material que é deixado na solução ainda é capaz de ligar-se ao antígeno. Como mostrado na figura 25, a maioria de tanto DOMlh-131-202 quanto DOMlh-131-206 são capazes de manter a solução ainda após 14 dias. O RBA mostra que todas as proteínas solúveis ainda são funcionais e capazes de ligar-se ao TNFR1.
Teste de estabilidade de armazenagem nas altas concentrações de proteína:
Os experimentos foram realizados para investigar a estabilidade de armazenagem a +4° C em concentrações muito altas de proteínas para ver como cada molécua realizada sob estas condições. Todos os dAbs de chumbo foram concentrados em concentradores centrífugos Visvapina (5K corte) no tampão Britton-Robinson em seu pH mais estável, a -100 mg/ml. As amostras em -100 mg/ml foram então deixadas a +4° C por 7 dias e analisadas por SEC para ver se qualquer outra mudança física tenha ocorrido nas amostras durante a armazenagem em altas concentrações (Figura 29). As amostras foram diluídas a —1 mg/ml antes de ser realizada na coluna SEC em IxPBS 10 % de etanol (v/v).
A partir dos traços SEC este pode ser visto que nenhum DOMlh-131-202 ou DOMlh-131-206 mostra qualquer aumento significante na formação de agregados após 7 dias, onde existe -2 % de redução na concentração de monômero por DOM lh-131-511.
Liberação do nebulisador dos dAbs de chumbo:
186
Para a toxicologia do estágio precoce e trabalho clínico, os dAbs serão formulados como um líquido e liberado por intermédio de um dispositivo de nebulização. Dependendo do dispositivo (por exemplo, ultrasônico, a jato ou de malha vibratória), o dAb experienciará um grau de corte e tensões térmicas como este foi nebulisado para formar um aerossol de tamanho de partículas definidas. Como tanto DOMlh-131-202 quanto -206 tem maiores Tm’s e mostrou consideravelmente a estabilidade melhorada a tensões térmicas comparados a DOMlh-131-511, todos os dAbs foram testados em dois dispositivos nebulisadores para ver como estes respondem ao corte /tensões térmicas induzidos durante a nebulização. Tanto a proteína a partir dos nebulisados aerossóis e o dAb remanescente no dispositivo (isto é no corte) foram então analisados por SEC para determinar a quantidade da agregação gerado durante o processo.
Todas as moléculas foram testadas no tampão BrittonRobinson em seu pH estável. Os dAbs foram testados tanto no fluxo E rápido (malha vibratória) quanto no Pari LC+ (nebulisador a jato) com a realização de tempo de 3,5 minutos em uma proteína concentração de 5 mg/ml e a distribuição do tamanho de partícula determinada usando um Malvem Spraytek. Os resultados são mostrados na figura 30. Para uma liberação e distribuição no pulmão profundo, o tamanho de partícula ideal é < 5 pm. Todos os dAbs são níveis comparáveis de tamanhos de partículas que foram menos do que 5 pm no tampão Britton-Robinson. A concentração de dAb no corpo do dispositivo foi determinado pelas medições A2so antes e após a nebulização (dados não mostrados). Foi observado que a concentração de proteína não significantemente muda que indica que nenhuma proteína ou veículo são preferencialmente nebulisados durante a liberação.
As amostras dos nebulisadores dAbs no tampão BrittonRobinson foram realizados em SEC para determinar se durante a liberação da proteína tem sofrido qualquer mudança física. A Figura 31 mostra a
187 porcentagem da mudança relativa no corpo ou o aerossol como determinado por SEC. Este pode ser visto que tanto o DOMlh-131-202 quanto o DOMlh131-206 sofre as pequenas mudanças relativas em uma concentração de monômero relativo ao DOMlh-131-511. Este demonstra que tanto o DOMlh131-202 quanto o DOMlh-131-206 com seus Tm’s melhorados por ter menos propensidade para agregar durante a nebulização.
A Figura 32 mostra os traços SEC atuais por DOMlh-131-206 e DOMlh-131-511 no tampão Britton-Robinson pós-nebulização e demonstra que a perda relativa em monômero (Figura 31) é devido a formação de dímero. Este novamente fornece ainda o suporte que a evidência da teoria que a maior estabilidade térmica mostra ao DOMlh-131-202 e DOMlh-131-206 pode prevenir a agregação significante ainda em um tampão de formulação não otimizado.
Para a toxicologia e satisfação da avaliação do trabalho, este é necessário para a liberação ao dAb significantemente maiores níveis no animal do que as dosagens terapêuticas dando aos pacientes. Este pode ser atingido apenas pelo uso de maiores concentrações significantemente de proteínas e/ou a liberação de dAb em um período prolongado de tempo. Como já tem mostrado que DOMlh-131-511 formam os agregados na nebulização a 5 mg/ml em 3,5 minutos, DOMlh-131-206 foi testado em 40 mg/ml em PBS e nebulisados usando o Pari LC+ por até 1 hora. As amostras a partir do corpo e aerossol foram retirados nos pontos de tempos em toda parte a operação para ver se a nebulização prolonga causada pelos dAbs para agregar devido ao corte ou tensões térmicas como determinado pelo SEC e a concentração de proteína (medições A280 nm). Tabela 21 mostra a concentração de proteína do dAb tanto no copo quanto aerossol como determinado pela A280.
Tabela 21: Concentração de proteína medida de DOMlh-131206 como determinado pelas leituras de absorbância A280 tanto pelo copo
188 quanto o aerossol durante a nebulização do dAb a ~40 mg/ml usando o Pari LC+. Permitindo pelos erros de diluição e erro instrumental da concentração da amostra não muda após a nebulização do dAb em 1 hora.
Período (Minutos) Amostra do copo (mg/ml) Amostra aerossol (mg/ml)
1 43,8 43,4
29 44,5 43,5
59 44,6 44,1
A partir da Tabela 21 este pode ser visto que a concentração de proteína não significantemente muda durante a operação, que demonstra que não existe a perda significante da proteína devido a agregação. A Figura 33 mostra que no período de 1 hora da nebulização, DOMlh-131-206 não forma qualquer maior agregados em ordem tal como dímeros como determinado pelo SEC. Este claramente demonstra que as propriedades biofísicas melhoradas, como introduzido na molécula pelas seleções de tripsina, significantemente aumenta as resistências aos dAbs para corte e tensões térmicas e que este pode ser diretamente correlacionado a cida de prateleira de armazenagem melhorada e a capacidade para nebulisar a proteína de modo que meior agregados em ordens não formam.
Estado da solução dos dAbs de chumbo:
Visto que maior via de degradação para todos os três chumbos dAbs parecem ser associados por si só que levam inicialmente pela dimerização seguido pela agregação adicional e ultimamente precipitação, as três moléculas de chumbo foram invenstigadas pela ultra-centrifugação analítica (AUC) que determina o grau de associação por si própria. As proteínas foram investigadas por dois métodos, equilíbrio de sedimentação e velocidade de sedimentação.
Para o método de equilíbrio de sedimentação das três amostras foram realizados em três concentrações diferentes variando de 0,5 mg/ml a 5 mg/ml com efeitos de centrifugação usando três velocidades de rotor diferente. Por este método foi determinado que DOMlh-131-511 é um dímero
189 estável (26,1 a 34,4 kDa), DOMIh-131-202 é equilíbrio de monômero / dímero (22,7 a 27,8 kDa) com um estado dimérico relativamente estável nas concentraçãos medidas com K<j = 1,3 μΜ e DOMlh-131-206 é predominantemente monomérico (15,4 a 17,9 kDa) com um IQ para o monômero pela associação de dímero de 360 μΜ.
Pelo método de velocidade de sedimentação todas as amostras mostrou alguns graus de dissociação na diluição. A partir dos resultados obtidos, mostrado na figura 34, o coeficiente de sedimentação observado por DOMlh-131-511 é indicativo de maiores ordens de agregados e o pico muda na diluição é uma indicação da dissociação destes agregados. A agregação de proteína e a dissociação cancela cada outro que pode dar a impressão de ser um dímero estável como observado pelo equilíbrio de sedimentação. Os coeficientes de sedimentação observados por DOMlh-131-202 são indicativos por um rápido equilíbrio dinâmico e portanto o monômero e picos de dímeros não deve ser separado de cada outro, dando um pico simples com um coeficiente de maior sedimentação do que é apropriado para a massa da amostra. Este resulta concorda com o resultado obtido pelo método de equilíbrio de sedimentação e a constante de dissociação foi medido como ser ΙμΜ. O DOMlh-131-206 foi determinado a ser mais monomérico do que as outras duas amostras, tendo um coeficiente de sedimentação de 1,9 segundos em comparação ao 2,5 segundos para as outras duas amostras. Este dado concorda bem com o dado de equilíbrio de sedimentação. Nas concentraçãos medidas, ~10 vezes abaixo por K(] de 360 μΜ, a amostra é predominantemente monomérico.
Exemplo 15
Intensificação de potência de DOM15-26-593 dAb:
Um exemplo de intensificação da potência em VEGFR2 Ensaio de ligação do receptor do DOM15-26-593 dAb na origem DOM15-26 é mostrado na figura 40. Neste ensaio, a capacidade de um inibidor potencial
190 para prevenir a ligação de VEGF a VEGFR2 é medido em um ensaio com base em placa. Neste ensaio a quimera VEGFR2-Fc é revestida em uma placa de ELISA de 96 resevatórios e por este é adicionado a uma quantidade prédeterminada de VEGF que tem sido pré-incubado com uma série de diluição de testes dAb. Seguindo a lavagem de proteína não ligada, a quantidade de VEGF liga-se ao receptor é detectado com um anticorpo anti-VEGF, o nível de que é calorimetricamente determinado. Um efeito de resposta de dosagem é plotado como inibidor de percentual de ligação de VEGF como uma função de concentração de substância de teste. Um inibidor efetivo é portanto um que demonstra o bloqueamento substancial de ligação de ligando em concentrações baixas.
Potências de fusão FC em vida média:
A potencial terapêutico de bloqueio VEGF no tratamento dos tumores foi realizado em 30 anos. A natureza crônica do câncer dita que os biofarmacêuticos requer uma vida média de soro longo para medir os efeitos e este não consiste com a liberação rápida de dAbs livres a partir da circulação pela filtração renal. Para avaliar se a utilidade dos VEGF dAbs como antiangiogênicos para o tratamento do câncer, os anticorpos de domínio de chumbos foram formatados como fusão com IgGl Fc humano de tipo selvagem por intermédio de um ligador híbrido de modo como para formar uma molécula bivalente com uma vida média de soro extendido pelo uso de anticorpo mediado por FcRn salvo pelos caminhos.
Neste formato de fusão Fc, a potência da tripsina de chumbo selecionados de dAb, DOM 15-26-593 foi comparado com o dAb parente inicial (DOM15-26) & dAb de rótulo de tripsina (DOM15-26-501) usando os ensaios previamente descritos. Os resultados são mostrados na Tabela 22 abaixo:
191
Tabela 22. Características das potências (RBA) & vida média de DOM15-26 de chumbos em formato de fusão Fc
dAb Fc Potência (nM) TI/2b (horas)
DOM 15-26 hlgGl 0,506 ND
D0M15-26-501 hlgGl 0,323 12,9
DOM 15-26-593 hlgGl 0,033 84,6
Este pode ser visto a partir destes resultados que no formato de fusão Fc dimérico, afinidade & potência são intensificados em relação ao dAbs livre devido ao efeito da avidez. Este é claro que intensifica a potência obtida em DOM15-26-593 pela virtude de seleção de trispina é mantido e é ainda mais pronunciado neste formato Fc. Além disso, os melhoramentos na estabilidade térmica e protease que traduz nas mudanças profundas na maneira farmacocinética in vivo das moléculas. O melhoramento na eliminação da vida média (ver Figura 41) de DOM 15-26-593 comparado com DOM15-26-501 é semelhante ser a conseqüência direta da estabilidade aumentada do dAb, que rende é mais resistente aos processos degradativos que ocorre dentro do compartimento endossômico. Este será esperado, portanto, que os dAbs com a estabilidade de protease intensificada são capazes de persistir por um período mais longo em outros compartimentos biológicos tal como o soro, superfícies mucosais e vários compartimentos de tecidos onde a proteólise é um processo ativo envolvido na rotação das moléculas biológicas.
Perfis de liberação farmacocinética:
Perfis de liberação farmacocinética de DOM15-26-593 e DOM15-26-501 foram medidos após a administração i.v. DOM15-26-593 e DOM15-26-501 a 3 ratos nas concentrações de 5mg/kg. Os níveis de DOM15-26-593 e DOM15-26-501 no soro foram então medidos usando uma ligação VEGF direta no ensaio ELISA padrão e um anticoro Fc anti-humano, portanto apenas o medicamento intacto nas amostras de soro foram detectados. O perfil total de farmacocinético é mostrado na Tabela 23 abaixo:
192
Tabela 23. Resumo de parâmetros farmacocinéticos de fusões
DOM15-26 & DOM15-26-593 Fc em ratos
dAb Vida média (hora) Cmax (pg/ml) AUC (0-inf) (hr* gg/ml) Liberação (ml/hr/kg)
DOM 15-26- 501 12,9 91,4 445,1 11,8
DOM15-26- 593 84,6 101,8 3810 1,3
Este pode ser visto a partir dos resultados que DOM15-26-593 tem um perfil significantemente farmacocinético melhorado com por exemplo uma vida média estendida e reduz a taxa de liebração.
A potência significantemente melhorada e propriedades farmacocinéticas de DOM15-26-593 resultou na análise do composto por uma faixa de outros atributos biofísicos.
Propriedades de estado de solução: análise por SEC-MALLs & AUC:
Experimentos foram feitos com D0M15-26-593 como seguem:
O DOM15-26-593 conduz um monômero na solução nas concentrações de até 2,5 mg/ml com uma massa molecular calculada de 78 a 81KDa, consistente com a massa molecular intacto calculado de aproximadamente 76 kDa (Figura 42a & 42b).
Propriedades de fusão térmica: análise por DSC
Experimentos foram feitos com DOM15-26-593 como seguem:
A estabilidade térmica aumentada do dAb selecionado a tripsina (65° C, Figura 43 painel central) é mantido na fusão Fc (64,5° C, Figura 43 painel superior). A curva Tm de D0M15-26-501 dAb (52° C, Figura 43 painel inferior) é mostrado pela comparação.
Estabilidade pelo resfriamento-congelamento, tensão de temperatura e componentes de soro
193
Experimentos foram feitos com DOM15-26-593 como seguem:
As propriedades da estabilidade do DOM15-26-593 dAb significa o D0M15-26-593 dAb pode ser submetido a tensão física e biológica com efeitos mínimos na sua capacidade para ligar-se VEGF (Figuras 44-47 (a e b)). Por exemplo, a molécula pode ser repetidamente resfriada-congelada a partir do nitrogênio líquido (-196° C) ao temperatura corporal (37° C) por 10 ciclos sem perda da atividade de ligação como determinado pela ELISA (Figura 44). Este tratamento também resultou em nenhuma alteração óbvia no estado de agregação das moléculas, como avaliado pela cromatografia de exclusão de tamanho convencional (Figura 45). Os testes adicionais demonstraram que a molécula pode ser colocada em uma faixa de temperaturas diferentes de -80° C a 55° C com apenas uma menor gotícula na atividade da ligação do antígeno após 168 horas a apenas a temperatura maiores de incubação (Figura 46). Além disso, a incubação com soro a partir dos macacos cinomólogos ou humanos a 37° C por 14 dias causando nenhuma perda da capacidade de ligação de antígeno (Figura 47a e 47b), como determinado pela ligação VEGF ELISA.
Potência no ensaio de ligação do receptor VEGFR2 & ensaio celular HUVEC:
O ensaio de ligação dos receptores descritos acima foram realizados como seguem:
O ensaio de ligação do receptor descrito acima foi usado para avaliar a potência das fusões Fc (Figura 48). Foi observado que o DOM15-26593 dAb tem potência intensificada neste ensaio, que estabelece uma capacidade dos dAb para bloquear a ligação de VEGF a VEGFR2 in vitro. A potência dos DMS1529 também foi demonstrado em um ensaio HUVEC (célula endotelial da veia umbilical humana), onde a capacidade de antagonistas VEGF para bloquear a proliferação estimulada por VEGF de
194 células HUVE é medido. Os números celulares são determinados na extremidade do período de incubação fixa com uma quantidade prédeterminada de VEGF e uma variação de quantidade do artigo do teste. O mais potente do antagonista, os inferiores da proliferação celular observada 5 (Figura 49).
A sequência de nucleotídeo DOMlh-131-511 é apresentado neste parágrafo.
A seqüência de nucleotídeo de DOMlh-131-511:
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG CATGAGACGA TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACAT ATTCCCCCGG TTGGTCAGGA TCCCTTCTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTATAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACAGCGGTAT ATTACTGTGC GCTGCTTCCT AAGAGGGGGC CTTGGTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC

Claims (87)

1. Domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor anti-interleucina-1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 97 % idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4).
2. Domínio variável simples de imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um aminoácido selecionado de 22S, 49S, 83S e 94Y, em que a numeração está de acordo com Kabat
3. Domínio variável simples de imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende 22S, 49S, 83 S e 94Y, em que a numeração está de acordo com Kabat
4. Domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina-1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-202.
5. Domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina-1, caracterizado pelo fato de que é codificado por uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 80 % idêntica à sequência de nucleotídeo de DOM4-130-202 (mostrado na figura 19).
6. Domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo
1 de Receptor de anti-Interleucina-1, caracterizado pelo fato de ser codificado por uma sequência que é idêntica à sequência de nucleotídeo de DOM4-130202 (mostrado na figura 19).
7. Antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor anti-Interleucina1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina anti-IL-lRl como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.
8. Antagonista de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende o primeiro e o segundo domínios variáveis simples de imunoglobulina, em que cada domínio variável é como definido qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.
9. Antagonista de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o antagonista compreende um monômero do dito domínio variável simples ou um homodímero do dito domínio variável simples.
10. Antagonista de acordo com a reivindicação 7, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de cada um dos domínios variáveis simples é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4130-202 (mostrado na figura 4).
11. Domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina-1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR1 de D0M4-130-202.
12. Domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina-1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de D0M4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR2 de DOM4-130-202.
13. Domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina-1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência CDR3 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR3 de DOM4-130-202.
14. Domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina-1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR1 de DOM4-130-202 e tem uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR2 de DOM4-130-202.
15. Domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina-1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR1 de DOM4-130-202 e tem uma sequência CDR3 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR3 de DOM4-130-202.
16. Domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina-1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de D0M4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR2 de DOM4-130-202 e tem uma sequência CDR3 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR3 de DOM4-130-202.
17. Domínio variável simples de imunoglobulina (IL-1R1) Tipo 1 de Receptor de anti-Interleucina-1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) ou difere da sequência de aminoácido de DOM4-130-202 em não mais do que 25 posições de aminoácido e tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR1 de DOM4-13 0-202 e tem uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR2 de DOM4-130-202 e tem uma sequência CDR3 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR3 de DOM4-130-202.
18. Antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor antiInterleucina-1, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR1 de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4).
19. Antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor antiInterleucina-1, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR1 de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4).
20. Antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor antiInterleucina-1, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de CDR3 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR1 de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4).
21. Antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor antiInterleucina-1, caracterizado pelo fato de que uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR1 de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) e uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR2 de DOM4-130-202.
22. Antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor antiInterleucina-1, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR1 de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) e uma sequência de CDR3 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR3 de DOM4-130-202.
23. Antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor antiInterleucina-1, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR2 de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) e uma sequência de CDR3 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR3 de DOM4-130-202.
24. Antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor antiInterleucina-1, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de CDR1 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR1 de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4) e uma sequência de CDR2 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR2 de DOM4-130-202 e uma sequência de CDR3 que é pelo menos 50 % idêntica à sequência de CDR3 de DOM4-130-202.
25. Antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor antiInterleucina-1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina que compreende a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4).
26. Antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor antiInterleucina-1, caracterizado pelo fato de que compete com DOMlh-131-511206 para a ligação a IL-1R1.
27. Domínio variável simples de imunoglobulina, caracterizado pelo fato de que compreende um local de ligação de Receptor de anti-Interleucina-1 Tipo 1 (IL-1R1), em que o domínio variável é resistente à protease quando incubado com (i) uma concentração (c) de pelo menos 10 microgramas/ml de protease a 37° C por tempo (t) de pelo menos uma hora ou (ii) uma concentração (c’) de pelo menos 40 microgramas/ml de protease a 30° C por tempo (t) de pelo menos uma hora;
em que o domínio variável compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90 % idêntica à sequência de aminoácido de
DOM4-130-202 (mostrado na figura 4).
28. Domínio variável de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a concentração (c ou c’) é pelo menos 100 ou 1000 microgramas/ml de protease.
29. Domínio variável de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o tempo (t) é uma, três ou 24 horas ou durante a noite.
30. Domínio variável de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o domínio variável é resistente sob condições (i) e a concentração (c) é 10 ou 100 microgramas/ml de protease e o tempo (t) é 1 hora.
31. Domínio variável de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o domínio variável é resistente sob condições (ii) e a concentração (c’) é de 40 microgramas/ml de protease e o tempo (t) é de 3 horas.
32. Domínio variável de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 31, caracterizado pelo fato de que a protease é selecionada de tripsina, elastase, leucozima e pancreatina.
33. Domínio variável de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 32, caracterizado pelo fato de que a protease é tripsina.
34. Domínio variável de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 33, caracterizado pelo fato de que o domínio variável é resistente à tripsina e pelo menos uma outra protease selecionada de elastase, leucozima e pancreatina.
35. Domínio variável de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 34, caracterizado pelo fato de que o domínio variável liga especialmente IL-1R1 seguindo a incubação sob condição (i) ou (ii).
36. Domínio variável de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o domínio variável tem uma leitura de OD450 em ELISA de pelo menos 0,404 seguindo a incubação sob condição (i) ou (ii).
37. Domínio variável de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 36, caracterizado pelo fato de que o domínio variável liga especialmente a proteína A ou proteína L seguindo a incubação sob condição (i) ou (ii).
38. Domínio variável de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a 37, caracterizado pelo fato de que o domínio variável apresenta substancialmente uma faixa simples na eletroforese em gel seguindo a incubação sob condição (i) ou (ii).
39. Antagonista (IL-1R1) Tipo 1 do Receptor antiInterleucina-1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável como definido em qualquer uma das reivindicações 27 a 38.
40. Antagonista de IL-1R1 de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que é para a dispensação oral.
41. Antagonista de IL-1R1 de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que é para a dispensação ao trato GI de um paciente.
42. Uso do antagonista de IL-1R1 como definido na reivindicação 39, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para a dispensação oral.
43. Uso do antagonista de IL-1R1 como definido na reivindicação 39, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para a dispensação ao trato GI de um paciente.
44. Antagonista de acordo com a reivindicação 39, 40 ou 41 ou o uso de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que o domínio variável é resistente à tripsina, elastase e/ou pancreatina.
45. Antagonista de IL-1R1 de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que é para a dispensação pulmonar.
46. Antagonista de IL-1R1 de acordo com a reivindicação 39 ou 45, caracterizado pelo fato de que é para a dispensação ao pulmão de um paciente.
47. Uso do antagonista de IL-1R1 como definido na reivindicação 39, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para a dispensação pulmonar.
48. Uso do antagonista de IL-1R1 como definido na reivindicação 39, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para a dispensação ao pulmão de um paciente.
49. Antagonista de acordo com a reivindicação 45 ou 46 ou o uso de acordo com a reivindicação 47 ou 48, caracterizado pelo fato de que o domínio variável é resistente à leucozima.
50. Método para a dispensação oral ou dispensação de um medicamento ao trato GI de um paciente ou ao pulmão ou tecido pulmonar de um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade farmaceuticamente eficaz do antagonista de IL-1R1 como definido na reivindicação 39.
51. Antagonista de IL-1R1 de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento e/ou profilaxia de uma condição inflamatória.
52. Uso do antagonista de IL-1R1 como definido na reivindicação 39, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de uma condição inflamatória.
53. Antagonista de acordo com a reivindicação 51 ou o uso de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a condição é selecionada do grupo que consiste de artrite, esclerose múltipla, doença do intestino inflamatória e doença pulmonar obstrutiva crônica.
54. Antagonista ou uso de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a dita artrite é artrite reumatóide ou artrite reumatóide juvenil.
55. Antagonista ou uso de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a dita doença do intestino inflamatória é selecionada do grupo que consiste de doença de Crohn e colite ulcerativa.
56. Antagonista ou uso de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a dita doença pulmonar obstrutiva crônica é selecionada do grupo que consiste de bronquite crônica, bronquite obstrutiva crônica e enfisema.
57. Antagonista ou uso de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a dita pneumonia é pneumonia bacteriana.
58. Antagonista ou uso de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a dita pneumonia bacteriana é pneumonia Estafilocócica.
59. Antagonista de IL-1R1 de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença respiratória.
60. Uso do antagonista de IL-1R1 como definido na reivindicação 39, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença respiratória.
61. Antagonista de acordo com a reivindicação 59 ou o uso de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a dita doença respiratória é selecionada do grupo que consiste de inflamação do pulmão, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, pneumonia, pneumonite por hipersensibilidade, infiltrado pulmonar com eosinofilia, doença pulmonar ambiental, pneumonia, bronquiectasia, fibrose cística, doença pulmonar intersticial, hipertensão pulmonar primária, tromboembolismo pulmonar, distúrbios da pleura, distúrbios de mediastino, distúrbios de diafragma, hipoventilação, hiperventilação, apnéia do sono, síndrome da angústia respiratória aguda, mesotelioma, sarcoma, rejeição a enxerto, doença enxerto versus hospedeiro, câncer de pulmão, rinite alérgica, alergia, asbestose, aspergiloma, aspergilose, bronquiectasia, bronquite crônica, enfisema, pneumonia eosinofilica, fibrose pulmonar idiopática, doença pneumocócica invasiva, influenza, micobactéria não tuberculosa, efusão pleural, pneumoconiose, pneumocitose, pneumonia, actinomicose pulmonar, proteinose alveolar pulmonar, antraz pulmonar, edema pulmonar, êmbolo pulmonar, inflamação pulmonar, histiocitose pulmonar X, hipertensão pulmonar, nocardiose pulmonar, tuberculose pulmonar, doença venooclusiva pulmonar, doença pulmonar reumatóide, sarcoidose e granulomatose de Wegener.
62. Dispositivo de dispensação pulmonar, caracterizada pelo fato de que contém o antagonista de IL-1R1 como definido na reivindicação
39, 45, 46 ou 49.
63. Dispositivo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é um inalador ou um dispositivo de administração intranasal.
64. Formulação oral, caracterizada pelo fato de que compreende o antagonista de IL-1R1 como definido na reivindicação 39 ou
40.
65. Formulação de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a formulação é um tablete, pílula, cápsula, líquido ou xarope.
66. Antagonista, uso, método, dispositivo ou formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10 e 39 a 65, caracterizado(a) pelo fato de que o antagonista compreende um domínio variável como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 11 a 17 e 27 a 38.
67. Antagonista, uso, método, dispositivo ou formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10 e 39 a 65, caracterizado(a) pelo fato de que o antagonista compreende um domínio variável que tem uma Tm de pelo menos 50° C.
68. Domínio variável de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 11 a 17 e 27 a 38, caracterizado pelo fato de que o domínio variável tem uma Tm de pelo menos 50° C.
69. Antagonista, uso, método, dispositivo ou formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10 e de 39 a 65, caracterizado(a) pelo fato de que o antagonista compreende um domínio variável que inibe a liberação induzida por IL-1 de Interleucina-8 pelas células MRC-5 (N° de acessão ATCC CCL-171) em um ensaio in vitro com um ND50 que é < 1 μΜ.
70. Domínio variável de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, 11 a 17 e 27 a 38, caracterizado pelo fato de que o domínio variável inibe a liberação induzida por IL-1 de Interleucina-8 pelas células MRC-5 (N° de acessão ATCC CCL-171) em um ensaio in vitro com um ND50 que é < 1 μΜ.
71. Antagonista, uso, método, dispositivo ou formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10 e 39 a 65, caracterizados pelo fato de que o antagonista compreende um domínio variável que inibe a ligação de IL-1 a IL-1R1 com um IC50 que é < 1 μΜ.
72. Domínio variável de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 11 a 17 e 27 a38, caracterizado pelo fato de que o domínio variável inibe a ligação de IL-1 a IL-1R1 com um IC50 que é < 1 μΜ.
73. Domínio variável de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 11 a 17 e 27 a 38, caracterizado pelo fato de que o domínio variável 1R1 inibe a liberação induzida por IL-1 de Interleucina-6 em um ensaio e sangue total com um ND50 que é < 1 μΜ.
74. Antagonista, uso, método, dispositivo ou formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10 e 39 a 65, caracterizado(a) pelo fato de que o antagonista compreende um domínio variável cujo 1R1 inibe a liberação induzida por IL-1 de Interleucina-6 em um ensaio e sangue total com um ND50 que é < 1 μΜ.
75. Ligando específico duplo, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 11 a 17, 27 a 38, 68, 70, 72 e 73.
76. Ácido nucleico isolado ou recombinante, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptideo que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 11 a 17, 27 a 38, 68, 70, 72 e 73.
77. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 76.
78. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 76 ou o vetor como definido na reivindicação 77.
79. Método para produzir polipeptideo que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina, caracterizado pelo fato de que compreende manter uma célula hospedeira como definida na reivindicação 78 sob condições adequadas para a expressão do dito ácido nucleico ou vetor, desse modo um polipeptideo que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina é produzido.
80. Método de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que ainda compreende isolar o polipeptideo e opcionalmente produzir uma variante, por exemplo, uma variante mutada, tendo uma afinidade e/ou ND50 melhor do que o polipeptideo isolado.
81. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, 11 a 17, 27 a 38, 68, 70, 72 e 73 ou um antagonista como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a
10, 18 a 26, 39 a 41, 44 a 46, 49, 51, 53 a 59, 61, 66, 67, 69, 71 e 74 e um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
82. Polipeptideo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência que é pelo menos 97 % idêntica à sequência de aminoácido de DOM4-130-202 (mostrado na figura 4).
83. Polipeptideo, caracterizado pelo fato de que é codificado por uma sequência que é pelo menos 80 % idêntica à sequência de nucleotídeo da sequência de nucleotídeo de DOM4-130-202 (mostrado na figura 19).
84. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptideo como definido na reivindicação 82 ou 83.
85. Ácido nucleico isolado ou recombinante, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptideo como definido na reivindicação 82 ou 83 ou uma proteína de fusão como definido na reivindicação 84.
86. Domínio variável simples de imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, 11 a 17, 27 a 38, 68 e 70 ou um antagonista de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10, 18 a 26, 39 a 41, 44 a 46, 49, 51, 53 a 59, 61, 66, 67, 69, 71 ou 74 ou o polipeptideo de acordo com a reivindicação 82 ou 83, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio constante de anticorpo.
87. Domínio variável, antagonista ou polipeptideo de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo Fc, opcionalmente em que o terminal N do Fc é ligado (opcionalmente, ligado diretamente) ao terminal C do domínio variável.
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