TR201807021T4 - Geliştirilmiş glikosilasyon şablonuna sahip pıhtılaşma faktörü ıx?un üretilmesi. - Google Patents

Abstract

Glikoproteinlerin hücre kültürü içinde büyük ölçekli üretilmesi için geliştirilmiş bir sistem sunulur. Mevcut buluşa göre bir glikoproteini eksprese eden hücreler, yaklaşık 10 ile 600 nM arasındaki bir konsantrasyonda manganez ihtiva eden ortamlar içinde büyütülür. Böyle bir sistemin kullanılması, arttırılmış bir glikosilasyon şablonuna ve/veya doğal yoldan meydana gelen glikoproteinin glikosilasyon şablonunu daha doğru yansıtan bir glikosilasyon şablonuna sahip bir glikoproteinin üretilmesine izin verir. Mevcut buluşa göre eksprese edilen bir glikoprotein, farmasötik kompozisyonların hazırlanmasında avantajlı şekilde kullanılabilir.

Description

TARIFNAMEGELISTIRILMIS GLIKOSILASYON SABLONUNA SAHIP PIHTILASMA FAKTORU IX9UN URETILMESIBu açiklama, manganez içeren bir hücre kültürü ortami içinde bir glikoproteinin üretilmesine yönelik bir yöntem ve böyle bir yöntemdekullanilmaya yönelik bir hücre kültürü ortaini ile ilgilidir.Bulusun GeçmisiProteinler ve polipeptitler, giderek artan öneme sahip terapötik ajanlar haline geldi. Birçok durumda bu proteinler ve polipeptitler, hücre kültürü içinde, ilgili belirli protein veya polipeptitten olagandisi yüksek düzeyler üretmek üzere yapilandirilmis ve/veya seçilmis hücrelerden üretilir. Hücre kültürü kosullarinin kontrolü ve optimizasyonu, proteinler ve polipeptitlerin basarili ticari üretimi için kritik derecede önemlidir.Hücre kültürü içinde üretilen birçok protein ve polipeptit, oligosakarit zincirler içeren, kovalent sekilde baglanmis karbohidrat yapilari ihtiva eden glikoproteinlerdir. Bu oligosakarit zincirleri, endoplazmik retikulum ve Golgi cisimcigi içindeki proteine N baglari veya 0 baglari üzerinden baglanir. Oligosakarit zincirleri, glikoprotein kütlesinin önemli bir kisinini içerebilir. Oligosakarit zincirlerinin, glikoproteinin dogru katlanmasinin saglanmasi, protein-protein etkilesimlerine aracilik edilmesi, stabilite verilmesi, avantajli farmakodinamik ve/veyafarmakokinetik özelliklerin verilinesi, proteolitik sindirimin inhibeedilmesi, glikoproteinin düzgün sekretör yolagina hedefleninesi ve glikoproteinin belirli bir organa veya organlara hedefleninesi dahil glikoprotein fonksiyonunda kilit roller oynadiklari düsünülür.

Genellikle N bagli oligosakarit zincirleri, endoplazmik retikulum lümeni içinde yeni dogan, yer degistiren proteine eklenir (bakiniz buraya referans olarak dahil edilinis bulunan Molecular Biology of the Cell, Alberts ve arkadaslari, 1994). Oligosakarit, Asn-X-Ser/Thr'nin hedef konsensus sekansi içinde bulunan bir asparagin tortusunun yan zinciri üzerindeki ainino grubuna ilave edilir, buradaki X, prolin hariç herhangi bir amino asit olabilir. Baslangiç oligosakarit zinciri genellikle endoplazmik retikulum içindeki spesifik glikosidaz enzimleri tarafindan kirpilir, bu da iki N-asetilglukozamin ve üç mannoz tortusundan olusan, kisa, dalli inerkezi bir oligosakarit ile sonuçlamr.Endoplazmik retikulum içinde ilk prosesten soiira glikoprotein, küçük Vesiküller araciligiyla Golgi cisimcigine mekiklenir, burada oligosakarit zinciri, hücre yüzeyine salgilanmadan önce ileri prosese ugrar. Kirpilan N bagli oligosakarit zinciri, birçok inannoz tortusunun ilavesi ile modifiye edilebilir, bu da yüksek mannozlu bir oligosakarit ile sonuçlanir. Alternatif olarak N-asetilglukozaminin bir veya daha fazla monosakarit ünitesi, merkezi mannoz alt ünitelerine ilave edilerek kompleks oligosakaritler olusturulabilir. Galaktoz, N-asetilglukozamin alt ünitelerine ilave edilebilir ve sialik asit alt üniteleri, galaktoz alt ünitelerine ilave edilebilir, bu da bir sialik asit, bir galaktoz veya bir N-asetilglukozamin tortusundaii biri ile sonlanan zincirler ile sonuçlanir. Ek olarak bir fukoz tortusu, merkezi oligosakaritin bir N-asetilglukozamin tortusuna ilave edilebilir. Bu ilavelerin her birinespesifik glikosil transferazlar kataliz'orlük eder.N bagli glikosilasyon yolagi tarafindan modifiye edilmeye ek olarak glikoproteinler ayrica 0 bagli oligosakarit zincirlerinin spesifik serin veya treonin tortularina, bunlar Golgi cisimcigi içinde islendikleri sirada ilave edilerek modifiye edilebilir. Bir O bagli oligosakaritin tortulari, bir seferde ilave edilir ve her tortunun ilavesine spesifik bir enzim katalizörlük eder. N bagli glikosilasyonun aksine O bagli glikosilasyona yönelik konsensus amino asit sekansi daha az iyi tanimlanmistir.Protein glikosilasyonunun nihai kalitesi ve derecesi, hücre kültürünün kosullarindan dramatik düzeyde etkilenebilir. Örnegin geleneksel kesikli ve beslemeli kesikli kültür prosesleri, üretilen peptitin nihai düzeyine odaklanmistir ve siklikla daha az yayilmis bir glikolizasyon sablonuna ve/Veya oligosakkarid zincirlerinin seker tortulari glikoproteinin dogal yoldan meydana gelen formunda bulunan seker tortularini zayif yansitan bir glikolizasyon sablonuna sahip bir glikoproteinin üretilmesi ile sonuçlanir. Glikosilasyon düzeyinin arttirilmasi ve/Veya seker tortularinin kompozisyonunun, glikoproteinin dogal formunda bulunan glikosilasyonun düzeyini ve kompozisyonunu daha yakindan yansitacak sekilde ayarlanmasi potansiyel olarak daha yüksek potansa, gelistirilmis farinakodinamik Ve/Veya farmakokinetik özelliklere ve daha az yan etkiye sahip terapötik bir glikoprotein ajani ile sonuçlanabilir. Hücre kültürü içinde üretilen glikoproteinlerin glikosilasyonunun kalitesini ve miktarini gelistirmek için bazi çabalar sarf edilmis olmakla birlikte hala ilave gelistirnielere ihtiyaç vardir. Gelistirilmis glikosilasyon sablonlarina sahip glikoproteinlerin hücre kültürü tarafindan tanimli ortamlar içindeüretilmesine yönelik sistemlerin gelistirilmesine Özel bir ihtiyaç vardir.Bulusun OzetiMevcut açiklamaya ait yöntemler ve koinpozisyonlar, gelistirilmis glikosilasyon sablonlarina sahip glikoproteinlerin hücre kültürü içinde büyük ölçekli üretimine yönelik gelistirilmis bir sistem sunar. Bulus, bir hücre kültüründe gelistirilmis bir glikosilasyon sablonuna sahip pihtilasma faktörü IX”un üretilmesine yönelik olup, asagidakileri içeren bir yöntem ile ilgilidir:bir pihtilasma faktörü IX,un sifreleyen bir gen ihtiva eden memeli hücrelerinin, 10 nM ile 600 nM arasinda inanganez içeren bir hücre kültürü ortaini içinde, pihtilasma faktörü IX°un ekspresyonuna izin vermek için yeterli kosullar altinda ve süreyle kültürlenmesi, burada eksprese edilen pihtilasma faktörü IX7un glikosilasyon sablonu, manganez içermeyen, diger açilardan özdes ortam içinde, diger açilardan özdes kosullar altinda gözlemlenen glikosilasyon sablonundan daha yaygindir, buradaki daha yaygin glikosilasyon sablonu, oligosakarit zincirinde daha fazla sayida kovalent bagli seker tortusudur.Ornegin bazi düzeneklerde mevcut bulus, yaklasik 10 ile 600 nM arasinda molar kümülatif bir manganez konsantrasyonu ihtiva eden bir ortamin kullanildigi, ticari ölçekli (öm., 500 L veya daha fazla) kültür yöntemleri sunar. Bazi düzeneklerde ortam içindeki molar kümülatif glutamin konsantrasyonu, yaklasik 8 mM'den azdir. Bazi düzeneklerde ortam içindeki molar küinülatif glutamin konsantrasyonu, yaklasik 4 mM'den azdir. Yukarida kullanildigi gibi "kümülatif", kültürün basinda ilave edilen bilesenler ve ardindan ilave edilen bilesenler dahil, hücre kültürü akisi sirasinda ilave edilen bilesenlerin veya belirli bir bilesenin toplam miktarina karsilik gelir. Bulusun bazi düzeneklerinde kültürün"beslemelerinin" minimize edilmesi arzu edilebilir, böyleliklebaslangiçta var olan iniktarlarin maksimize edilmesi arzu edilebilir.

Süphesiz ortam bilesenleri, kültür sirasinda metabolize edilir, böylelikle verilen bilesenlerin ayni kümülatif miktarlarina sahip kültürler, bu bilesenler farkli zamanlarda ilave edilirse farkli mutlak düzeylere sahip olacaktir (Örn., tamaminin baslangiçta bulunmasina karsilik bazilari beslemelerle ilave edilir).Mevcut açiklamaya göre böyle bir ortamin kullanilmasi, arzu edilebilen glikosilasyon sablonlarini ihtiva eden glikoproteinlerin üretilmesine iziii verir. Bazi düzeneklerde glik0pr0teinler, daha kapsamli bir glikosilasyon sablonuna sahip olabilir ve/veya glikoproteine dogal konakçi hücre tarafindan uygulanan oligosakarit zincirleri dagiliinini daha yakindan andiran bir oligosakarit zincirleri dagilimina sahip olabilir. Bazi düzeneklerde bulusa ait sistemin kullanilmasi, glikosilasyon sablonu, glikoprotein bir endojen insan hücresi içinde eksprese edilseydi var olacak olan glikosilasyon sablonuna benzeyen veya bununla özdes olan bir glikoproteinin üretilmesi ile sonuçlanabilir.Bu konuda siradan bilgiye sahip bir kisi, mevcut bulusa ait ortam formülasyonlarinin hem tanimli hem kompleks ortamlari kapsadigini anlayacaktir. Bazi düzeneklerde kültür ortami, ortam kompozisyonunun bilindigi ve kontrol edildigi tanimli bir ortamdir.

Mevcut bulusa ait hücre kültürleri istege bagli olarak besin maddeleri ve/Veya baska ortam bilesenleri, 'Örnegin hormonlar ve/veya diger büyüme faktörleri, 'özellikle iyonlar (sodyuin, klorid, kalsiyum, magnezyum ve fosfat gibi), tamponlar, Vitaminler, iiükleosidler veya nükleotitler, eser elementler (inorganik bilesikler genellikle çok düsük konsantrasyonlarda bulunur), amino asitler, lipitler veya glukoz gibibaska ortam bilesenleri veya baska bir enerji kaynagi ile desteklenebilir.Bazi düzeneklerde ortamlarin heksametilen-bis(asetamid) ("HMBA") ve sodyum butirat ("NaB") gibi kimyasal indüktanlar ile desteklenmesi faydali olabilir. Bu tür istege bagli destekler, kültürün basinda ilave edilebilir veya tükenen besinleri yenilemek için veya baska bir amaçli daha sonraki bir noktada ilave edilebilir. Genel olarak ilk ortam kompozisyonunun, mevcut bulusa uygun destekleineyi en azaindirecek sekilde seçilmesi arzu edilebilir.Çizimlerin Kisa TarifiSekil 1, UF/DF Retentat Materyal içinde Glikosidik Aktivitenin Arastirilmasini gösterir. Her deney için çesitli K4 ve K4' türlerini temsil eden çubuklar soldan saga söyledir: K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA), K4' (Fuc-GlcNAc-Gal), K4' (Fuc-GlcNAc) ve K4' (Fuc).Sekil 2, Çalkalama Sisesi Kültürleri içinde Uretilen rFlX'teki K4 Türü Dagiliinlarini gösterir. Her deney için çesitli K4 ve K4' türlerini temsil eden çubuklar soldan saga söyledir: K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA), K4' (Fuc-GlcNAc-Gal), K4' (Fuç-GlcNAc) ve K4' (Fuc).Sekil 3, Çesitli Ortam Katkilari ile Çalkalama Sisesi Kültürlerinden K4 Türü Dagilimlarini gösterir. Her deney için çesitli K4 ve K4' türlerini temsil eden çubuklar soldan saga söyledir: K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA), K4' (Fuc-GlcNAc-Gal), K4' (Fuc-GlcNAc) ve K4' (Fuc).Sekil 4, Desteklenmis Ortama Sahip Çalkalama Sisesi Kültürlerinin K4 Türü Dagilimini gösterir. Her deney için çesitli K4 ve K4' türlerini temsil eden çubuklar soldan saga söyledir: K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA), K4' (Fuc-GlcNAc-Gal), K4' (Fuc-GlcNAc) ve K4' (Fuc).Sekil 5, Çesitli Ortam Katkilari ile Çalkalama Sisesi Kültürlerinden K4 Türü Dagilimlarini gösterir. Her deney için çesitli K4 ve K4' türlerinitemsil eden çubuklar soldan saga söyledir: K4 (Fuc-GlcNAC-Gal-SA),K4' (Fuc-GlcNAc-Gal), K4' (Fuc-GlCNAc) ve K4' (Fuc).Sekil 6, Degisken Mangaiiez Düzeylerinde Çalkalama Sisesi Kültürlerinden K4 Türü Dagilimlarini gösterir. Her deney için çesitli K4 ve K4' türlerini temsil eden çubuklar soldan saga söyledir: K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA), K4' (Fuc-GlcNAc-Gal), K4' (Fuc-GlcNAc) ve K4' (Fuc).Sekil 7, GO, G] ve G2 HPAEC-PED Piklerine ait Toplam Pik Alani Yüzdesinin Grafiksel bir Karsilastirmasini gösterir. Her deney için koinpleks N bagli iki antenli glikanlari temsil edeii çubuklar soldan saga söyledir: GO, Gl ve G2.Sekil 8, GO, G] ve G2 HPAEC-PED Piklerine ait Toplam Pik Alani Yüzdesinin Grafiksel bir Karsilastirmasini gösterir. Her deney için kompleks N bagli iki antenli glikanlari temsil eden çubuklar soldansaga söyledir: GO, Gl ve GZ.Tanimlar"Amino asit": Burada kullanildigi gibi "amino asit" terimi, polipeptitlerin olusturulmasinda normal olarak kullanilan, dogal yoldan meydana gelen yirmi amino asitten birine veya bu amino asitlerin analoglarina veya türevlerine veya dogal yoldan meydana gelmeyen bir amino aside karsilik gelir. Mevcut bulusa ait amino asitler, hücre kültürlerine ortam içinde sunulur. Ortam içinde sunulari amino asitler, tuz halinde veya hidrat formunda sunulabilir."Antikor": Burada kullanildigi gibi "antikor" terimi, bir immünoglobulin molekülüne veya bir immünoglobulin molekülünün, yani bir anti jeni spesifik olarak baglayan bir antijen baglama sahasi, örnegin bir Fab veya F(ab')2 fragmani ihtiva eden bir molekülünimmünolojik olarak aktif bir kismina karsilik gelir. Bazi düzeneklerdebir antikor, bu konuda siradan bilgiye sahip kisilerce bilinen tipik bir dogal antikor, örn., dört polipeptit zinciri: iki agir zincir ve iki hafif zincir içeren glikoproteindir. Bazi düzeneklerde bir antikor, tek Zincirli bir antikordur. Örnegin bazi düzeneklerde tek Zincirli bir antikor, tipik dogal bir antikorun bir varyantini içerir, burada agir ve/veya hafif zincirlerin iki veya daha fazla elemani, kovalent sekilde örn., bir peptit bagi üzerinden baglanmistir. Bazi düzeneklerde tek zincirli bir antikor, bir agir ve bir hafif zincirden olusan iki-polipeptit Zincirli bir yapiya sahip bir protein olup bu zincirler 'Örnegin zincirler arasi peptit baglari tarafindan stabilize edilir ve bu protein, bir antijeni spesifik olarak baglama yeterliligine sahiptir. Bazi düzeneklerde bir antikor, sadece agir zincirlerden olusan bir antikor 'örnegin Devegiller familyasinin, lamalar ve develer dahil üyelerinde dogal olarak bulunanlar gibi bir antikordur (bakiniz `Örnegin her biri buraya bütün halinde referans olarak dahil edilmis bulunan ABD Patentleri no. 6,765,087, Casterman ve arkadaslari; no. 6,015,695, Casterinan ve arkadaslari ve no. 6,005,079, Casterman ve arkadaslari). Burada kullanildigi gibi "mon- oklonal antikorlar" ve "monoklonal antikor kompozisyonu" terimleri, bir anti jen baglanma sahasinin sadece bir türünü ihtiva eden ve bu nedenle genellikle sadece tek bir epitop veya belirli bir antijen ile etkilesime giren antikor moleküllerinin bir popülasyonuna karsilik gelir.

Monokloiial antikor koinpozisyonlari böylelikle tipik olarak immüno-reaksiyona girdikleri belirli bir epitop için tek bir baglanma afinitesi sergiler. "Poliklonal antikorlar" ve "poliklonal antikor kompozisyonu" terimleri, belirli bir anti jen ile etkilesime giren anti jen baglanma sahalariiiin birçok türünü ihtiva eden antikor moleküllerinin popülasyonlarina karsilik gelir."Kesikli kültür": Burada kullanildigi gibi "kesikli kültür" terimi, ortam(asagidaki "Ortam" tanimina bakiniz) dahil hücrelerin kültürlenmesinde nihayetinde kullanilacak olan tüm bilesenlerin ve ayrica hücrelerin kendilerinin kültürleme prosesinin basinda saglandigi bir hücre kültürleme yöntemine karsilik gelir. Kesikli kültür tipik olarak bir noktada durdurulur ve ortam içindeki hücreler ve/Veya bilesenler toplanir ve istege bagli olarak saflastirilir."Biyo-reaktör": Burada kullanildigi gibi "biyo-reaktör" terimi, bir memeli hücre kültürünün büyütülmesi için kullanilan bir kaba karsilik gelir. Bir biyo-reaktör, memeli hücrelerinin kültürleiimesi için faydali oldugu sürece herhangi bir ebatta olabilir. Tipik olarak böyle bir biyo-reaktör, en az 1 litre olacaktir ve 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000 litre veya daha fazla veya bunlarin arasinda herhangi bir hacimde olabilir. Bunlarla sinirli olmamakla birlikte pH, çözülmüs oksijen ve sicaklik dahil biyo-reaktörün dahili kosullari tipik olarak kültürleme periyotu sirasinda kontrol edilir. Bir biyo-reaktör, memeli hücre kültürlerini, mevcut bulusa ait kültür kosullari altiiida ortam içinde süspanse durumda tutmak için uygun herhangi bir materyalden, 'Örnegin cam, plastik veya metalden meydana gelebilir.

Burada kullanildigi gibi "üretim biyo-reakt'orü" terimi, ilgili glikoproteinin üretilmesinde kullanilan nihai biyo-reaktöre karsilik gelir. Uretim biyo-reakt'orünün hacmi tipik olarak en az 500 litredir ve 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000 litre veya daha fazla veya bunlarin arasinda herhangi bir hacimde olabilir. Bu konuda siradan bilgiye sahip bir kisi, mevcut bulusun uygulanmasinda kullanilmaya uygun biyo-reaktörleri bilecek ve seçebilecektir."Hücre yogunlugu": Burada kullanildigi gibi "hücre yogunlugu" terimi, verilen bir ortam hacmi içinde bulunan hücre sayisina karsilik gelir."Hücre canliligi": Burada kullanildigi gibi "hücre canliligi" terimi,10verilen bir kültür kosullari seti veya deneysel varyasyonlar altinda kültür içinde hücrelerin hayatta kalma yeterliligine karsilik gelir.

Burada kullanildigi gibi terim ayrica belirli bir zamanda canli ve ölü, toplam hücre sayisina göre bu sirada canli olan hücre kismina karsilik gelir."Kompleks ortam": Burada kullanildigi gibi "kompleks ortam" terimi, kimligi veya miktari bilinmeyen veya kontrol edilmeyen en az bir bilesen ihtiva eden bir ortama karsilik gelir."Kültür", "Hücre kültürü": Burada kullanildigi gibi bu terimler, hücre popülasyonunun hayatta kalinasi ve/Veya büyümesi içiii uygun kosullar altinda bir ortam (asagidaki "Ortam" tanimina bakiniz) içinde süspanse olmus bir hücre popülasyonuna karsilik gelir. Bu konuda siradan bilgiye sahip kisilerin anlayacagi gibi bazi düzeneklerde burada kullanildigi gibi bu terimler, hücre popülasyonunu ve içinde popülasyonun süspanse oldugu ortami içeren kombinasyona karsilik gelir. Bazi düzeneklerde hücre kültürünün hücreleri, memeli hücreler içerir."Tanimli ortam": Burada kullanildigi gibi "tanimli ortam" terimi, ortam kompozisyonunun hem bilindigi hem kontrol edildigi bir ortama karsilik gelir."Beslemeli kesikli kültür": Burada kullanildigi gibi "beslemeli kesikli kültür" terimi, ilave bilesenlerin kültür prosesinin baslamasindan sonraki bir zamanda veya zamanlarda kültüre ilave edildigi bir hücre kültürleme yöntemine karsilik gelir. Bu verilen bilesenler tipik olarak kültürleme prosesi sirasinda tüketilmis hücrelere yönelik besin bilesenleri içerir. Ek veya alternatif olarak bu ilave bilesenler, destekleyici bilesenler (asagidaki "Destekleyici bilesenler" taniminabakiniz) olabilir. Bazi düzeneklerde ilave bilesenler, bir besleme ortami11(bakiniz asagidaki "Besleme ortami" taiiimi) içinde sunulur. Bir beslemeli kesikli kültür tipik olarak bir noktada durdurulur ve ortain içindeki hücreler ve/Veya bilesenler toplanir ve istege bagli olarak saflastirilir."Besleme ortami": Burada kullanildigi gibi "besleme ortami" terimi, büyüyen memeli hücrelerini besleyen besin inaddeleri ihtiva eden ve hücre kültürü basladiktan sonra ilave edilen bir çözeltiye karsilik gelir.

Bir besleme ortami, baslangiçtaki hücre kültürü ortami içinde sunulanlara özdes bilesenler ihtiva edebilir. Alternatif olarak bir besleme ortami, baslangiçtaki hücre kültürü ortami içinde sunulanlarin ötesinde bir veya daha fazla ilave bilesen ihtiva edebilir, Ek veya alternatif olarak bir besleme ortami, baslangiçtaki hücre kültürü ortami içinde sunulan bir veya daha fazla bileseni ihtiva etmeyebilir. Bazi düzeneklerde bir besleme ortaminin bir veya daha fazla bileseni, bu bilesenlerin baslangiçtaki hücre kültürü ortami içinde sunuldugu konsantrasyonlara veya düzeylere özdes veya benzer konsantrasyonlarda veya düzeylerde sunulur. Bazi düzeneklerde bir besleme ortaminin bir veya daha fazla bileseni, bu bilesenlerin baslangiçtaki hücre kültürü ortami içinde sunuldugu konsantrasyonlardan veya düzeylerden farkli konsantrasyonlarda veya düzeylerde sunulur. Ornek besleme ortamlari Tablo 2'de gösterilmekle birlikte mevcut bulus, bu ortamlarin kullanilmasi ile sinirli degildir. Bu konuda siradan bilgiye sahip kisiler, alternatif besin ortainlarinin kullanilabilecegini ve/veya Tablo 2'de siralanan örnek besleme ortamlarinin kompozisyonlari üzerinde bazi degisikliklerin yapilabilecegini fark edecektir. Bazi düzeneklerde bir besleme ortami, destekleyici bilesenler (bakiniz asagidaki "Destekleyici bilesenler"tanimi) ihtiva eder.12"Fragman": Burada kullanildigi gibi "fragman" terimi, verilen bir polipeptitin, bu polipeptite `Özgü veya karakteristik ayri bir kismi olarak tanimlanan bir polipeptite karsilik gelir. Ornegin burada kullanildigi gibi terim, verilen bir polipeptite ait olup tam uzunluktaki polipeptit içinde bulunan en azindan tespit edilmis sekans elemanini içeren bir kisma karsilik gelir. Bazi fragmanlarda sekaiis elemani, tam uzunluktaki polipeptitin en az 4-5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 veya daha fazla amino asidini kapsar. Alternatif veya ek olarak burada kullanildigi gibi terim, verilen bir polipeptite ait olup tam uzunluktaki polipeptitin en az bir aktivitesinin en azindan bir fraksiyonunu koruyan, ayri bir kisma karsilik gelir. Bazi düzeneklerde korunan aktivite fraksiyonu, tam uzunluktaki polipeptitin aktivitesinin en az %10'udur.

Bazi düzeneklerde korunan aktivite fraksiyonu, tam uzunluktaki polipeptitin aktivitesinin en az %20, %30, %40, %50, %60, %70, %80 veya %90'1dir. Bazi düzeneklerde korunan aktivite fraksiyonu, tam uzunluktaki polipeptitin aktivitesinin en az %95, %96, %97, %98 veya %99'udur. Bazi düzeneklerde fragman,tam uzunluktaki polipeptitin aktivitesinin %IOO'ünü veya daha fazlasini korur. Bazi düzeneklerde mevcut bulusa ait bir fragman, bir glikosilasyon sahasi görevi gören bir peptit sekansi ihtiva eder. Bazi düzeneklerde mevcut bulusa ait bir fragman, bir glikosilasyon sahasinin bir kisinini ihtiva eder, böylelikle glikosilasyon sahasinin diger kismini ihtiva edeii baska bir fragmana baglandiginda fonksiyonel bir glikosilasyon sahasi yeiiiden olusturulur."Gen": Burada kullanildigi gibi "gen" terimi, DNA veya RNA herhangi bir nükleotit sekansina karsilik; bunun en azindan bir kismi ayri bir nihai ürünü, tipik olarak bunlarla sinirli olmamakla birlikte hücremetabolizmasinin veya gelisiminin bir yönünde fonksiyon gösteren bir13polipeptiti sifreler. Istege bagli olarak gen, polipeptiti veya baska bir ayri nihai ürünü sifreleyen kodlaya sekansini içermekle kalmaz, ayrica kodlama sekansinin önünde ve/veya arkasinda, bazal düzeyde ekspresyonu modüle eden bölgeler (asagidaki "Genetik kontrol elemani" taniinina bakiniz) ve/veya tek tek kodlama segmentleri ("eksonlar") arasindaki araya giren sekanslari ("intronlar") içerir.

"Genetik kontrol elemani": Burada kullanildigi gibi "genetik kontrol elemani" terimi, islevsel olarak baglandigi bir genin ekspresyonunu modüle eden bir sekans elemanina karsilik gelir. Genetik kontrol elemanlari, ekspresyon düzeylerinin arttirilmasi veya azaltilmasi yoluyla islev gösterebilir ve kodlama sekansinin önüne, içine veya arkasina konulabilir. Genetik kontrol elemanlari, gen ekspresyonunun herhangi bir asamasinda örnegin transkripsiyonun, mRNA eklenmesinin, mRNA düzenlemesinin, mRNA stabilitesinin, mRNA'nin hücre içinde lokalizasyonunun baslatilmasini, uzatilmasini veya sonlandirilmasini, translasyonun veya gen ekspresyonunun baska bir asamasinin baslatilmasini, uzatilmasini veya sonlandirilmasini regüle etmek suretiyle etkide bulunabilir. Genetik kontrol eleinanlari tek tek veya birbirleri ile kombinasyon halinde fonksiyon gösterebilir.

"Glikoprotein": Burada kullanildigi gibi "glikoprotein" terimi, bir veya daha fazla kovalent sekilde bagli oligosakarit zinciri ihtiva eden bir protein veya polipeptite karsilik gelir. Oligosakarit zincirleri, tek bir seker tortusundan, seker tortularinin tek bir dalsiz zincirinden olusabilir veya seker tortularinin bir veya daha fazla kez dallanan bir zincirinden olusabilir. Bazi düzeneklerde oligosakarit zincirleri N baglidir. Bazi düzeneklerde oligosakarit zincirleri O baglidir."Glikosilasyon sablonu": "Glikosilasyon sablonu" terimi, verilen birglikoproteinin veya glikoproteinlerin gözlemlenen glikosilasyonuna14karsilik gelir. Oligosakarit zinciri içinde daha yüksek sayida kovalent sekilde bagli seker tortularina sahip bir glikoproteinin arttirilmis veya daha fazla kapsamli bir glikosilasyon sablonuna sahip oldugu söylenir.

Buna karsilik oligosakarit zinciri içinde daha az sayida kovalent sekilde bagli seker tortularina sahip bir glikoproteinin azaltilmis veya daha az kapsamli bir glikosilasyon sablonuna sahip oldugu söylenir. Burada kullanildigi gibi "glikosilasyon sablonu" terimi ayrica birçok farkli glikosilasyon sablonunun, mevcut bulusun ögretilerine göre eksprese edilmis tek tek glikOproteinler üzerindeki karakteristik bir dagilimina karsilik gelir. Bu baglamda arttirilinis bir glikosilasyon sablonu, eksprese edilmis glikoproteinlerin glikosilasyon sablonlarinin karakteristik dagilimindaki bir artis anlamina gelir."Konakçi hücre": Burada kullanildigi gibi "konakçi hücre" terimi, burada tarif edildigi gibi arzu edilen bir glikosilasyon sablonu ile bir glikoprotein üretmek üzere mevcut bulusa göre manipüle edilmis bir hücreye karsilik gelir. Bazi düzeneklerde bir konakçi hücre, bir memeli hücresidir."Hibridoma": Burada kullanildigi gibi "hibridoma" terimi, ölümsüzlestirilmis bir hücrenin ve antikor üreten bir hücrenin füzyonundan kaynaklanan bir hücreye veya bu hücrenin dölüne karsilik gelir. Ortaya çikan böyle bir hibridoma, antikorlar üreten, ölümsüzlestirilmis bir hücredir. Hibridomayi yaratmada kullanilan tek tek hücreler, bunlarla sinirli olmamakla birlikte siçan, domuz, tavsan, koyun, domuz, keçi ve insan dahil herhangi bir memeli kaynaktan olabilir. Bazi düzeneklerde bir hibridoma, insan hücreleri ile bir murin miyeloma hücre çizgisi arasindaki füzyonun ürünü olan heterohibrid miyeloma füzyonlarinin dölü daha sonra bir plazma hücresi ilefüzyonla birlestirildiginde ortaya çikan bir trioma hücre çizgisidir. Bazi15düzeneklerde bir hibridoma, antikorlar üreten, ölümsüzlestirilmis bir hibrid hücre çizgisi örnegin kuadromadir (Bakiniz örn., Milstein ve arkadaslari, Nature, 5373053, 1983)."Ortam", "Hücre kültürü ortami", "Kültür ortami": Burada kullanildigi gibi bu terimler, büyüyen memeli hücrelerini besleyen besinler ihtiva eden bir çözeltiye karsilik gelir. Tipik olarak bu çözeltiler, esansiyel ve esansiyel olmayan amino asitler, vitaminler, enerji kaynaklari, lipitler ve minimal büyüme ve/veya hayatta kalma için hücrenin ihtiyaç duydugu eser elementler sunar. Böyle bir çözelti ayrica minimal hizin üzerinde büyümeyi ve/veya hayatta kalmayi güçlendiren destekleyici bilesenler (asagidaki "Destekleyici bilesenler" tanimina bakiniz), bunlarla sinirli olmamakla birlikte Örnegin hormonlar ve/veya diger büyüme faktörleri, 'Özellikle iyonlar (sodyum, klorid, kalsiyum, magnezyum ve fosfat gibi), tamponlar, vitaminler, nükleosidler veya nükleotitler, eser elementler (inorganik bilesikler genellikle çok düsük konsantrasyonlarda bulunur), amino asitler, lipitler ve/veya glukoz veya baska bir enerji kaynagi ihtiva edebilir. Bazi düzeneklerde bir ortam, hücrenin hayatta kalmasi ve proliferasyonu için optimum pH ve tuz konsantrasyonu verecek sekilde avantajli olarak formüle edilir.

Ornek kültür ortamlari Tablo 1'de gösterilmekle birlikte mevcut bulus, bu ortamlarin kullanilmasi ile sinirli degildir. Bu konuda siradan bilgiye sahip kisiler, alternatif kültür ortamlarinin kullanilabilecegini ve/veya Tablo 1'de siralanan örnek kültür ortainlarinin kompozisyonlari üzerinde bazi degisikliklerin yapilabilecegini fark edecektir. Bazi düzeneklerde bir ortam, hücre kültürünün baslamasindan sonra ilave edilen bir besleme ortamidir (yukaridaki "Besleme ortami" tanimina bakiniz)."Polipeptit": Burada kullanildigi gibi "polipeptit" terimi, peptit baglari16araciligiyla birbirlerine baglanmis sirali bir amino asit zincirine karsilik gelir. Terim, herhangi bir uzunluktaki bir amino asit zincirine karsilik kullanilir, ancak bu konuda siradan bilgiye sahip bir kisi, terimin uzunlamasina zincirlerle sinirli olmadigiiii ve bir peptit bagi araciligiyla birbirlerine baglanmis iki amino asit içeren minimal bir zincir anlamina da gelebilecegini anlayacaktir. Bu konuda uzman kisilerce bilindigi gibi polipeptitler, islenebilir ve/Veya modifiye edilebilir. Örnegin bir polipeptit, glikosile edilebilir (yukaridaki "glik0protein" tanimina bakiniz)."Protein": Burada kullanildigi gibi "protein" terimi, ayri bir ünite halinde fonksiyon gösteren bir veya daha fazla polipeptite karsilik gelir.

Tek bir polipeptit, ayri fonksiyon gösteren ünite ise ve ayri fonksiyon gösteren üniteyi olusturmak için diger polipeptitler ile kalici veya geçici fiziksel baglanti gerektirmiyorsa "polipeptit" ve "protein" terimleri birbirlerinin yerine kullanilabilir. Ayri fonksiyon ünite, birbirleri ile fiziksel olarak birlesmis birden fazla polipeptitten olusuyorsa "protein" terimi, fiziksel olarak bir araya gelmis ve ayri ünite halinde birlikte fonksiyon gösteren birçok polipeptite karsilik gelir."Rekombinant sekilde eKSprese edilinis glikOprotein" ve "Rekombinant glikoprotein": Burada kullanildigi gibi bu terimler, bir glikoproteini eksprese etmek üzere iiisan eliyle manipüle edilmis bir konakçi hücreden eksprese edilen glikoproteine karsilik gelir. Bazi düzeneklerde bir konakçi hücre, bir memeli hücresidir. Bazi düzeneklerde bu manipülasyon, bir veya daha fazla genetik modifikasyon içerir. Örnegin memeli konakçi hücreler, eksprese edilecek bir glikoproteini sifreleyen bir veya daha fazla heterolog geninsokulmasi suretiyle genetik olarak modifiye edilebilir. Heterolog17rekombinant sekilde eksprese edilmis glikoprotein, memeli konakçi hücre içinde normalde eksprese edilen glikoproteinlere özdes veya benzer olabilir. Heterolog rekombinant sekilde eksprese edilmis glikoprotein ayrica konakçi hücreye yabanci, yani memeli koiiakçi hücre içinde normalde eksprese edilen glikoproteinlere heterolog olabilir. Bazi düzeiieklerde heterolog rekombinant sekilde eksprese edilmis bir glikoprotein, kimeriktir yaiii glikoproteinin bazi kisimlari, memeli konakçi hücre içinde normalde eksprese edilen glikoproteinlere 'özdes veya benzer amino asit sekanslari ihtiva ederken diger kisimlari konakçi hücreye yabancidir. Alternatif olarak bir memeli konakçi hücre, bir veya daha fazla endojen genin aktivasyonu veya yukari regülasyonu suretiyle genetik olarak modifiye edilebilir."Destekleyici bilesenler": Burada kullanildigi gibi "destekleyici bilesenler" terimi, minimal hizin üzerinde büyümeyi ve/veya hayatta kalmayi güçlendiren bilesenlere, bunlarla sinirli olmamakla birlikte 'Örnegin hormonlar ve/Veya diger büyüme faktörleri, özellikle iyonlar (sodyuin, klorid, kalsiyum, magnezyum ve fosfat gibi), tamponlar, Vitaminler, nükleosidler veya nükleotitler, eser elementler (inorganik bilesikler genellikle çok düsük koiisantrasyonlarda bulunur), amino asitler, lipitler ve/veya glukoz veya baska bir enerji kaynagina karsilik gelir. Bazi düzeneklerde destekleyici bilesenler, baslangiçtaki hücre kültürüne ilave edilebilir. Bazi düzeneklerde destekleyici bilesenler, hücre kültürünün baslamasindan sonra ilave edilebilir."Titer": Burada kullanildigi gibi "titer" terimi, verilen ortam hacmi miktari içinde bir memeli hücre kültürü tarafindan üretilen, rekombinant sekilde eksprese edilmis toplam glikoprotein miktarina karsilik gelir. Titer tipik olarak mililitre ortam basina miligramglikoprotein birimi cinsinden ifade edilir.18Bazi Düzeneklerin Ayrintili TarifiMevcut bulus, glikoproteinlerin hücre kültürü içinde üretilmesine yönelik gelistirilmis sistemler sunar. Ozellikle arzu edilen bir glikosilasyon sablonu ihtiva eden bir glikoproteinin üretilmesi ile sonuçlanan sistemler sunulur. Örnegin bir glikoprotein, daha kapsamli bir glikosilasyon sablonuna sahip olabilir ve/veya glikoproteine dogal konakçi hücre tarafindan uygulanan oligosakarit zincirleri dagilimini daha yakindan andiran bir oligosakarit zincirleri dagilimina sahip olabilir. Bazi düzeneklerde bulusa ait sisteinlerin kullanilinasi, glikosilasyon sablonu, glikoprotein bir endojen insan hücresi içinde eksprese edilseydi var olacak olan glikosilasyon sablonuna benzeyen veya bununla özdes olan bir glikoproteinin üretilmesi ile sonuçlanabilir.

Bulusun bazi düzenekleri asagida detayli olarak tartisilmistir. Bununla birlikte bu konuda siradan bilgiye sahip kisiler, bu düzenekler üzerinde yapilacak çesitli modifikasyonlarin ekteki istemlerin kapsaini dahilinde oldugunu anlayacaktir. Mevcut bulusun kapsami, isteinler ile tanimlanir ve bu da belirli düzeneklerin bu tarifi ile sinirli degildir veyasinirli tutulmamalidir.Ortam Kompozisyonlari Çok çesitli memeli büyütme ortamlari, mevcut bulusa göre kullanilabilir. Bazi düzeneklerde hücreler, kimyasal olarak tanimlanmis çesitli ortamlardan biri içinde büyütülebilir, burada ortam bilesenleri hein bilinir hem kontrol edilir. Bazi düzeneklerde hücreler, bir kompleks ortam içinde büyütülebilir, burada ortamin tüm bilesenleri bilinir ve/veya kontrol edilir degildir.Memeli hücre kültürü için kimyasal olarak tanimlanmis büyümeortamlari son yillarda kapsainli sekilde gelistirilmis ve bunlarla ilgili19yayinlar yapilmistir. Tanimlanmis ortainlarin tüm bilesenleri iyi karakterize edilmistir ve bu nedenle tanimlanmis ortamlar, serum veya hidrolizatlar gibi kompleks katki maddeleri ihtiva etmez. Ilk ortam formülasyonlari, protein üretimine çok az dikkat edilerek veya hiç edilmeden hücre büyümesine ve canliligin korunmasina izin verecek sekilde gelistirildi. Daha yakin zamanlarda ise yüksek oranda üretken, rekombinant protein ve/veya glikoprotein üreten hücre kültürlerinin desteklenmesine yönelik açik bir hedef ile ortam formülasyonlari gelistirildi.Tanimli ortamlar tipik olarak su içinde bilinen konsantrasyonlarda kabaca elli kimyasal ögeden olusur. Bunlarin çogu ayrica iyi karakterize edilmis bir veya daha fazla protein örnegin insulin, IGF-l, transferin veya BSA ihtiva eder, ancak digerleri protein bilesenleri gerektirmez ve bu nedenle proteinsiz tanimli ortamlar olarak anilir.

Ortamlarin kimyasal bilesenleri, bes büyük kategoriye ayrilir: amino asitler, vitaminler, inorganik tuzlari, eser elementler ve düzgüii bir kategorizasyonu reddeden bir çesitlilik kategorisi.Eser elementler, mikromolar veya daha düsük düzeylerde dahil edilen çesitli inorganik tuzlardan olusur. Hemen hemen tüm tanimli ortamlar içinde bulunun, en yaygin sekilde dahil edilen dört eser element, demir, çinko, selenyum ve bakirdir. Demir (ferröz veya ferrik tuzlar) ve çinko tipik olarak mikromolar konsantrasyonlarda ilave edilirken digerleri genellikle nanoinolar konsantrasyonlarda bulunur. Sayisiz daha az yaygin eser element genellikle nanomolar konsantrasyonlarda ilave edilir.Manganez siklikla eser elementler arasinda bir divalent katyon (MnClz veya MnSO4) olarak dahil edilir. Tanimli ortamlarin ilk versiyonlarindabu ya ihmal edilmis ya da 1 uM civarinda yüksek bir konsantrasyonda20dahil edilmistir (bakiniz örnegin Bames ve Sato, 1980 [Medium DMEM/FIZ] ve Kitos ve arkadaslari, 1962 [Medium MD 705/ l]).

Daha yeni gelistirilmis tanimli ortamlara manganez yaygin sekilde, ancak çok daha düsük konsantrasyonlarda, `Örnegin 1-5 nM araliginda dahil edilmistir (bakiniz örnegin Hamilton ve Ham, 1977 [Medium MCDB 301] ve Cleveland ve Erlanger, 1988 [isimsiz 0rtam]).Mevcut bulus, bu ekstremler arasinda manganez konsantrasyonlari ihtiva eden tanimli ortamlar içinde büyütülmüs hücrelerin bir kültürü tarafindan üretilen glik0proteinlerin, hücreler yukarida tarif edilenler gibi geleneksel ortamlar içinde büyütülseydi ortaya çikacak olandan daha kapsamli glikosilasyon sablonlari ihtiva ettigi bulgusunu kapsar.

Bazi düzeneklerde inanganez, ortam içinde yaklasik 10 ile 600 nM arasindaki bir konsantrasyonda sunulur. Bazi düzeneklerde manganez, ortam içinde yaklasik 20 ile 100 nM arasindaki bir konsantrasyonda sunulur. Bazi düzeneklerde manganez, ortam içinde yaklasik 10, 15, 20, , 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590 veya 600 nM konsantrasyonda veya bu konsantrasyonlar dahilindeki herhangi bir aralikta sunulur.Mevcut bulus ayrica nispeten düsük düzeylerde glutamin ihtiva eden tanimli ortamlar içinde büyütülmüs hücrelerin bir kültürü tarafindan üretilen glikoproteinlerin, hücreler daha yüksek düzeylerde glutainin ihtiva eden geleneksel ortamlar içinde büyütülseydi ortaya çikacak olandan daha kapsamli glikosilasyon sablonlari ihtiva ettigi bulgusunu kapsar. Bazi düzeneklerde ortam içindeki baslangiç glutamin düzeyi,yaklasik 8 mM'den düsük veya buna esittir. Bazi düzeneklerde ortam21içindeki baslangiç glutamin düzeyi, yaklasik 4 mM'den düsük veya buna esittir.Bu konuda siradan bilgiye sahip bir kisi, glikoproteinin eksprese edildigi hücrelerin karakteri, üretilecek glikoproteinin karakteri ve içinde hücrelerin büyütüldügü ortam içinde baska bilesenlerin varligi veya yoklugu dahil kendi deneysel tasariminin özel niteliklerine dayanarak bulusa ait bu araliklar içinde kesin manganez konsantrasyonunu seçebilecektir. Örnegin N bagli ve O bagli yapilar arasindaki farkliliklar veya bu genis siniflarin her biri dahilinde 'ozel oligosakarit yapilari arasindaki farkliliklar, daha kapsamli ve/veya daha fazla dogal oligosakarit zincirleri üretmek için büyüme ortami içindefarkli manganez konsantrasyonlari gerektirebilir.GlikoproteinlerBir konakçi hücre içinde eksprese edilebilen bir glikoprotein, mevcut 'Ögretilere göre üretilebilir. Bir glikoprotein, konakçi hücre için endojen bir genden veya konakçi hücre içine sokulan bir heterolog genden eksprese edilebilir. Bir glikoprotein, dogada meydana gelen olabilir veya alternatif olarak insan eliyle yapilandirilmis veya seçilmis bir sekansa sahip olabilir. Uretilecek bir glik0protein, dogada tek tek meydana gelen ve en az biri, bir glikosilasyon sahasi görevi gören bir peptit sekansi ihtiva eden polipeptit fragmanlarindan birlestirilebilir.

Alternatif olarak her polipeptit fragmani, bir glikosilasyon sahasinin sadece bir kismina sahip olabilir, bu saha ise polipeptit fragmanlarinin birlestirilmesi üzerine yeniden olusturulur. Ek veya alternatif olarak yapilandirilmis glikoprotein, bir glikosilasyon sahasi görevi yapan en az bir peptit sekansi ihtiva ettigi sürece yapilandirilmis glikoprotein,dogal yoldan meydana gelmeyen bir veya daha fazla fragman içerebilir.22Mevcut açiklamaya göre eksprese edilmesi arzu edilebilecek glikoproteinler siklikla ilginç veya faydali bir biyolojik veya kimyasal aktivite bazinda seçilecektir. Örnegin mevcut açiklama, farmasötik veya ticari açidan alakali bir enzimi, reseptörü, antikoru, hormonu, regülatör faktörü, anti jeni, baglanma ajanini, Vb. eksprese etmek için kullanilabilir. Mevcut açiklamaya göre üretilebilecek asagidaki glikoprotein listesi sadece ömektir ve sinirlayici bir açiklama olma amaci tasiinaz. Bu konuda siradan bilgiye sahip bir kisi, mevcut açiklamaya göre herhangi bir glik0proteinin ekSprese edilebilecegini anlayacak ve üretilecek özel glikoproteini kendi özel ihtiyaçlarina göreseçebilecektir.Pihtilasma FaktörleriPihtilasma faktörlerinin farmasötik ve/veya ticari ajanlar olarak etkili olacagi gösterilmistir. Hemofili gibi hastaliklarin tedavisinde rekombinant pihtilasina faktörlerinin önemi düsünüldügünde mevcut açiklamaya göre rekombinant sekilde üretilmis pihtilasma faktörlerinin glikosilasyon sablonunun optimize edilmesi özel ilgi konusudur. Örnegin Pihtilasma Faktörü IX (Faktör IX veya "FIX"), eksikligi, buna sahip kisinin kaninin pihtilasamadigi bir bozukluk olan Hemofili B ile sonuçlanan tek zincirli bir glikoproteindir. Bu nedenle kanama ile sonuçlanan küçük bir yara potansiyel olarak yasami tehdit eden bir olaydir.FlX, tek zincirli bir ziinojen halinde sentezlenir, bu da bir aktivasyon peptitinin salinmasi ile iki Zincirli bir serin proteazi (Faktör IXa) halinde aktiflestirilebilir. Faktör IXa'nin katalitik alani, agir zincir içinde bulunur (bakiniz buraya referans olarak dahil edilmis Chang vearkadaslari, J. Clin. Invest., lOO:4, 1997). FIX, hem N bagli ve O bagli23karbohidratlar içeren birçok glikosilasyon sahasina sahiptir. Serin 61 'deki belirli bir 0 bagli yapinin (Sia-aZ,3-Gal-ßl,4-GlcNAc-ßl,3-Fuc-a1-O-Ser) bir zamanlar FlX'e özel oldugu düsünüldü, ancak daha sonra memeliler ve Drosophila'da Notch proteini dahil birkaç baska molekül bulundu (Maloney ve arkadaslari, Journal of Biol. Chem., 275(l3), 2000). Çin Hamster Yumurtalik ("CHO") hücreleri tarafindaii hücre kültürü içinde üretilen FIX, Serin 61 oligosakarit zincirinde bir miktar degiskenlik sergiler. Bu farkli glikoformlar ve diger potansiyel glikoformlar, insanlara veya hayvaiilara uygulandiklarinda pihtilasmayi indüklemek için farkli yeterliliklere sahip olabilir ve/veya kanda farkli stabilitelere sahip olabilir, bu da daha az etkili pihtilasma ile sonuçlanir.Hemofili B'den klinik açidan ayirt edilebilir olmayan Hemofili A'ya, tek Zincirli bir zimojen olarak sentezlenen ve sonra iki Zincirli aktif bir form halinde islenen bir baska glikoprotein olan insan pihtilasma faktörü VIII'deki bir kusur neden olur. Mevcut bulus ayrica pihtilasma aktivitesini niodüle etmek için pihtilasma faktörü VIII'in glikosilasyon sablonunu kontrol etmede veya degistirmede kullanilabilir. Mevcut açiklamaya göre üretilebilecek ve glikosilasyon sablonu kontrol edilebilecek veya degistirilebilecek diger glikOprotein pihtilasma faktörleri arasinda örnegin bunlarla siiiirli olmamakla birlikte dokufaktörü ve von Willebrands faktörü bulunur.AntikorlarAntikorlar, belirli bir anti jeni spesifik olarak baglayabileii proteinlerdir.

Farmasötik veya baska ticari ajanlar seklinde hali hazirda kullanimda veya arastirilmakta olan çok sayida antikor düsünüldügünde mevcutaçiklamaya göre arzu edilebilen glikosilasyon sablonlarina sahip24antikorlarin üretilmesi özel ilgi konusudur. Ek olarak farkli glikosilasyon sablonlarina sahip antikorlarin uygulandiklari kisilerde bir iinmün tepkisi baslatma olasiligi daha düsük olabilir, bu da daha etkili bir terapötik rejim ile sonuçlanir. Ek veya alternatif olarak sabit bölgelerinde farkli glikosilasyon sablonlarina sahip antikorlar, gelistirilmis farmakokinetik veya farinakodinainik efektör fonksiyonu sergileyebilir. Ek veya alternatif olarak farkli glikosilasyon sablonlarina sahip antikorlar, içinde üretildikleri hücre kültürü kosullarinda, Ömegin proteazlara veya hücre kültürü içindeki diger bilesenlere karsi daha dirençli olarak daha stabil olabilir, bu sekilde daha yüksek nihai titerde antikor üretilir.Bir konakçi hücre içinde eksprese edilebilen bir antikor, mevcut açiklamanin 'Ögretilerine göre kullanilabilir. Bazi düzeneklerde eksprese edilecek bir antikor, bir monoklonal antikordur. Bazi düzeneklerde bir monoklonal antikor, bir kimerik antikordur. Bir kiinerik antikor, birden fazla organizmadan türetilmis ainino asit fragmanlari ihtiva eder. Kimerik antikor molekülleri 'Örnegin bir fare, siçan veya baska bir türün bir antikorundan gelen bir anti jen baglanma ajani ile insan sabit bölgeleri içerebilir. Kimerik antikorlarin yapilmasina yönelik çesitli yaklasimlar tarif edilmistir (bakiniz örn., Morrison ve arkadaslari, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 6851, 1985; Takeda ve arkadaslari, Nature 314, 452, 1985, Cabilly ve arkadaslari, ABD Patenti No. 4,816,567; Boss ve arkadaslari, ABD Patenti No. 4,816,397; Tanaguchi ve arkadaslari, Avrupa Patent Yayini EPl7l496; Avrupa Patent Yayini 0173494, Ingiltere Patenti GB 2177096B).Bazi düzeneklerde bir monoklonal antikor, insanlastirilmis bir antikordur. Bir insanlastirilmis antikor, amino asit tortularinin büyükkisminin insan antikorlarindan türetildigi kimerik bir antikordur, bu25sekilde bir insan süjeye verildiginde potansiyel bir iminün reaksiyonu en aza indirilir. Insanlastirilniis antikorlarda hiper-degisken bölge içindeki amino asit tortulari, insan disi bir türden alinan ve arzu edilen bir anti jen spesifikligini veya afinitesini veren tortular ile degistirilir.

Bazi düzeneklerde bir insanlastirilmis antikor, bir insan antikoruna yüzde 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 veya daha yüksek oranda özdes bir amino asit sekansina sahiptir. Bazi düzeiieklerde bir insanlastirilinis antikor, konservatif ikamelerin, konsensus sekansi ikamelerinin, germline ikamelerinin ve/veya geri mutasyonlarin sokulinasi suretiyle optimize edilir. Bu degistirilmis iminünoglobulin molekülleri, bu konuda bilinen birçok teknikten biriyle yapilabilir (örn., Teng ve arkadaslari, Proc. Natl. Acad Sci. USA., 80, 7308-7312, 1983; Kozbor ve arkadaslari, Immunology Today, 4, 7279, 1983; Olsson ve arkadaslari, Meth. Enzymol., 92,3-1 6.1982). Bazi düzeneklerde degistirilmis immünoglobulin molekülleri, PCT Yayini WO92/06193 veya EP 0239400'ün ögretilerine göre yapilir.Bazi düzeneklerde mevcut açiklamanin ögretilerine göre üretilen bir antikor, gelistirilmis bir glikosilasyon sablonu sergileyen bir immünoglobuliii sabit veya FC bölgesi ihtiva edebilir. Örnegin buradaki ögretilere uygun sekilde üretilen bir antikor, efektör hücre aktivitesi, liziz, komplement aracili aktivite, antikor temizlenmesi ve antikor yari `Ömrü gibi antikorun birçok immün fonksiyonunu kontrol edebilen komplement ve/veya FC reseptörleri gibi efektör moleküllere daha güçlü veya daha fazla spesifiklik ile baglanabilir. Bir antikorun (örn., bir IgG antikorunun) bir FC bölgesine baglanan tipik FC reseptörleri arasinda bunlarla sinirli olmamakla birlikte FcyRI, FcyRII, FcyRIII ve FcRn altsiniflarinin reseptörleri, bu reseptörlerin alelik varyantlari vealternatif olarak eklenmis formlari bulunur. FC reseptörleri, Ravetch ve26Kiiiet, Annu. Rev. liiimunol., 9:457-92, 41991; Capel ve arkadaslari, Iinmunoinethods, 4:25 -34, 1994 ve de Haas ve arkadaslari, J. Lab. Clin.

Med., 1262330-41, 1995'te inceleiimistir.Sinirlayici olmayan bir örnek olarak mevcut ögretilere göre üretilebilen bir antikor, bir anti-ABeta antikorudur. Anti-ABeta antikorlari, Alzheiiner hastaliginin tedavisinde özellikle uinut veren potansiyel bir terapi alanidir. Alzheimer hastaligi (AD), senil demansa nedeii olan, ilerleme gösteren bir hastaliktir (bakiniz genel olarak: Selkoe, TlNS 16:403,l993; Hardy ve arkadaslari, WO 92/ 13069; Selkoe, J.

Neuropathol. Exp. Neural. 53:438,l994; Duff ve arkadaslari, Nature 373:476, 1995; Games ve arkadaslari, Nature 3732523, 1995). Genis anlamda söylendiginde hastalik, iki kategoriye ayrilir: Geç yasta (65+ yas) ortaya çikan geç baslayan ve yaslilik periyodundan önce, yaiii 35 ila 60 yas arasi iyice gelisen erken baslayan. Hastaligin her iki tipinde de patoloji aynidir ancak anormallikler, erken yasta baslayan vakalarda daha ciddi ve daha yaygin olina egilimi gösterir. Hastalik, beyin, nörofibriler aglar ve yaslilik plaklarinda en az iki tip lezyon ile karakterize edilir. Nörofibriler aglar, birbiri etrafina çiftler halinde bükülmüs iki filamandan olusan mikrotübül baglantili tau proteininin hücre içi tortularidir. Yaslilik plaklari (yani ainiloid plaklari), merkezde hücre disi amiloid tortularina 150 um kadar mesafede, beyin dokusu kesitleriniii mikroskobik analizi ile görülebilen daginik nöropil bölgeleridir. Amiloid plaklariiiin beyin içerisinde birikmesi, Down sendromu ve diger kogiiitif bozukluklar ile de baglantilidir.Plaklarin temel bileseni, ABeta veya Beta-amiloid peptit olarak adlandirilan bir peptittir. ABeta peptiti, amiloid `Öncü proteini (APP) olarak adlandirilan daha büyük bir transmembran glikoprotein adliproteinin 39-43. amino asitlerinden olusan 4 kDa'lik bir dahili27fragmandir. APP°nin, farkli sekretaz enzimleri tarafindan proteolitik isleme tabi tutulmasinin sonucunda ABeta temel olarak hem 40 amino asitlik kisa bir formda hem de 42-43 amino asit arasinda degisen uzunlukta, uzun bir formda bulunur. APP”nin hidrofobik transmembran alaninin bir kismi, ABetasnin karboksi ucunda bulunur ve ABeta°nin, özellikle uzun formda olmasi durumunda plaklar halinde birikme kabiliyetinden sorumlu olabilir. Amiloid plaklarinin beyinde birikmesi nihayetinde nöronal hücre ölümüne yol açar. Bu tip iiöronal bozulma ile baglantili fiziksel semptomlar, Alzheimer hastaligini karakterize edenAPP proteinindeki birçok mutasyon, Alzheimer hastaliginin varligi ile iliskilendirilmektedir (bakiniz örn., Goate ve arkadaslari, Nature 349:704,l99l (valin7l7'den izolösine), Chartier Harlan ve arkadaslari, Nature 353:844,1991 (valin717'den glisine); Murrell ve arkadaslari, Science 254:97,l99l (valin717'den fenilalanine); Mullan ve arkadaslari, Nature Genet. l :345,1992 (lizin595-metiyonin596'y1 asparaginS95-lösin596 olarak degistiren ikili bir mutasyon). Bu gibi mutasyonlarin, APP”nin ABeta yönünde islenmesinin artmasi veya degismesi, özellikle APPSnin artan miktarlarda uzun formda ABeta (yani ABetal-42 ve ABetal 43) yönünde islemesiyle Alzheimer hastaligiiia neden oldugu düsünülmektedir. Presenilin genleri, PSl ve PSZ gibi baska geiilerdeki mutasyonlarin, APP”nin, artmis miktarlarda uzun formda ABeta olusturmak üzere islenmesini dolayli olarak etkiledigi düsünülür (bakiniz Hardy, TlNS 20: 154, 1997).Fare modelleri, Alzheimer°de amiloid plaklarinin öneminin belirlenmesinde basarili bir sekilde kullanilmistir (Games ve arkadaslari, yukarida, Johnson-Wood ve arkadaslari, Proc. Natl. Acad Sci. USA 9411550, 1997). Ozellikle PDAPP transgenik farelerine28(inutant formda bir insan APP”sini eksprese eden ve genç yasta Alzheimer hastaligi gelistiren) uzun formda ABeta enjekte edilmesi durumunda bunlar, hem Alzheimer ilerleyisinde bir azalma hem de ABeta peptitine yönelik antikor titerlerinde bir artis gösterir (Schenk ve arkadaslari, Nature 400, 173,1999). Yukarida müzakere edilen gözlemler, özellikle uzun formda ABeta°nin, Alzheimer hastaliginin ettirgen bir elementi oldugunu gösterir.ABeta peptiti, çözelti içinde var olabilir ve CNS (örn., C SF) ve plazma içinde saptanabilir. Belirli kosullar altinda çözülebilen ABeta, AD'li hastalarin növritik plaklarinda ve serebral kan damarlarinda bulunan, fibriler, toksik, Beta-yaprak forrnlarina dönüstürülür. ABeta'ya karsi monoklonal antikorlar ile immünizasyonu içeren tedaviler arastirilmistir. Hem aktif hem pasif immünizasyon, AD'nin fare modellerinde test edilmistir. Aktif immünizasyon, beyindeki plak yükünde, ancak nazal uygulama ile bir miktar azalmaya yol açti.

PDAPP transgenik farelerinin pasif immünizasyonu da arastirildi (Bard ve arkadaslari, Nat. Med. 6:916-19,2000). ABeta'nin amino-terminal ve merkezi alanlarini taniyan antikorlarin, ABeta kalintilarinin fagositozunu uyarirken karboksi-terminal alani yakinindaki alanlara yönelik antikorlarin uyarmadigi bulundu.Pasif veya aktif immünizasyon sonrasinda ABeta'nin teinizlenme mekanizmasi hala arastirilmaktadir. Merkezi degradasyon ve periferal degradasyon olmak üzere efektif temizlenme için iki mekanizma önerilmistir. Merkezi degradasyon, antikorlarin kan-beyin bariyerinden geçebilmelerine, plaklara baglanabilmelerine ve daha önceden var olan plaklarin teinizlenmesini indükleyebilmelerine dayanir.

Temizlenmenin, Fc-reseptörü aracili fagositoz yoluyla tesvikedilebilecegi gösterilmistir (Bard ve arkadaslari, yukarida). ABeta29teinizlenmesinin periferal degradasyon mekanizmasi, ABeta'nin beyin, CSF ve plazma arasindaki dinamik dengesinin, antikorun uygulanmasi ile bozulmasina dayanir, bu da ABeta'nin bir bölmeden digerine tasinmasina yol açar. Merkezi türetilmis ABeta, CSF ve plazma içine tasinir, burada degrade olur. Son çalismalar, çözülebilir ve baglaninainis ABeta'nin beyindeki ainiloid birikinesinde azalma olmadan bile AD ile baglantili hafiza bozulmasinda yer aldigi sonucuna vardi. ABeta teinizlenmesine yönelik bu yolaklarin etkisi ve/veya etkilesiinini belirleinek için baska çalismalara ihtiyaç vardir (Dodel ve arkadaslari, The Laiicet Cilt 2:215,2003).Anti-ABeta antikorlari, AD'nin potansiyel olarak umut veren bir tedavi yoludur, çünkü bunlar ABeta'ya veya amiloid plaklar] içeren diger bilesenlere baglanabilir ve bunlari temizleyebilir. Mevcut açiklamanin ögretilerine göre üretilen anti-ABeta, Alzheimer veya baska alakali hastaliklari 'Örnegin amiloid plaklarinin bilesenlerinin daha etkili sekilde baglanmasi ve temizlenmesi suretiyle, amiloid plaklarinin daha az veya daha az siddetli yan etkilerle temizlenmesi suretiyle veya amiloid plaklarinin olusumunun veya birikinesinin `Önlenmesi suretiyle daha iyi tedavi etmeye yarayabilir. Bazi düzeneklerde mevcut ögretilere göre üretilen anti-ABeta antikorlari, monoklonal antikorlardir.Bazi düzeneklerde mevcut ögretilere göre üretilen anti-ABeta antikorlari, çözülebilen forina baglanmadan ABeta”nin agrege olinus formuna spesifik olarak baglanir. Bazi düzeneklerde mevcut ögretilere göre üretilen anti-ABeta antikorlari, agrege olmus forma baglanmadiklari kosullar altinda ABeta'nin çözülebilen formuna spesifik olarak baglanir. Bazi düzeneklerde mevcut ögretilere göreüretilen anti-ABeta antikorlari, hein agrege olinus hem çözülebilen30formlara baglanir. Bazi düzeneklerde mevcut ögretilere göre üretilen anti-ABeta antikorlari, plaklar içindeki ABeta'yi baglar. Bazi düzeneklerde mevcut 'Ögretilere göre üretilen anti-ABeta antikorlari, kan-beyin bariyerini geçer. Bazi düzeneklerde mevcut ögretilere göre üretilen anti-ABeta antikorlari, bir sü jede amiloid yükünü azaltir. Bazi düzeneklerde mevcut ögretilere göre üretilen anti-ABeta antikorlari, bir süjede n'ovritik distrofiyi azaltir. Bazi düzeneklerde anti-ABeta antikorlari, sinaptik miinariyi koruyabilir (örn., sinaptofizin).Bazi düzeneklere göre mevcut ögretilere göre üretilen anti-ABeta antikorlari, ABetasnin 13-28. tortulari dahilindeki bir epitopa baglanir (dogal ABeta°nin birinci N terminal tortusu, 1 olarak tanimlanir). Bazi düzeneklerde mevcut ögretilere göre üretilen anti-ABeta antikorlari, ABeta'nin 19-22. tortulari dahilindeki bir epitopa baglanir. Bazi düzeneklerde farkli anti-ABeta epitoplarina yönelik baglanma spesifikliklerine sahip çoklu monoklonal antikorlar kullanilir. Örnegin bazi düzeneklerde ABeta'nin 19-22. tortulari dahilindeki bir epitopa spesifik bir antikor, ABeta'nin 19-22. tortulari disindaki bir epitopa spesifik bir antikor ile birlikte uygulanir. Bu antikorlar, sirayla veya es zamanli olarak uygulanabilir. ABeta disindaki amiloid bilesenlerine yönelik antikorlar da kullanilabilir (örn., uygulanabilir veya birlikte uygulanabilir).Bazi düzeneklerde mevcut ögretilere göre üretilen anti-ABeta antikorlari, bir ABeta epitopuna, baska sekilde üretilmis anti-ABeta antikorlarindan daha güçlü bir sekilde veya daha yüksek spesifiklik ile baglanir. Bir antikorun epitop spesifikligi örnegin farkli elemanlarin ABeta°nin farkli alt sekanslarini sergiledigi bir faj gösterim kütüphanesi olusturularak bilinen tekniklerle belirlenebilir. Fajgösterim kütüphanesi daha sonra test edilen bir antikora spesifik olarak31baglanan elemanlar açisindan seçilebilir. Bir sekans familyasi izole edilir. Tipik olarak böyle bir familya, farkli elemanlar içinde ortak bir göbek sekansi ve degisen uzunluklarda çevreleyici sekanslar ihtiva eder.

Antikora spesifik baglanma gösteren en kisa göbek sekansi tipik olarak antikor tarafindan baglanan epitopu tanimlar. Alternatif veya ek olarak antikorlar, epitop Spesifikligi hali hazirda belirlenmis bir antikor ile bir rekabet deneyinde epitop spesifikligi açisindan test edilebilir. Ornegin ABeta”ya baglanma için 15Cl l antikoru ile rekabet eden antikorlarin, 15C11 ile ayni veya benzer, yani ABeta 19-22. tortulari dahilindeki epitopa baglandiklari kabul edilir. Bazi düzeneklerde epitop spesifikligi açisindan antikorlarin taranmasi, terapötik etkinlik için faydali bir tahmin aracidir. Ornegin ABetainin 13-28. tortulari dahilindeki bir epitopa (örn., Aß 19-22) baglandigi belirlenen bir antikor büyük olasilikla mevcut bulusa ait metodolojilere uygun sekilde Alzheimer hastaliginin önlenmesi ve tedavisinde etkili olacaktir.ABeta”nin diger bölgelerine baglanmadan ABeta°nin tercih edilen bir segmentine spesifik olarak baglanan antikorlar, bozulmamis ABeta°nin diger bölgelerine veya poliklonal serumlarina baglanan monoklonal antikorlara göre bir dizi avantaja sahiptir. Diger seylerin arasinda esit kütle dozajlari için tercih edilen seginentlere spesifik olarak baglanan antikorlarin dozajlari, amiloid plaklarinin temizlenmesinde etkili antikorlarin daha yüksek molar dozajini ihtiva eder. Ayrica tercih edilen segmentlere spesifik olarak baglanan antikorlar, bozulmamis APP polipeptitine karsi bir temizleme tepkisini indüklemeden amiloid birikintilerine karsi bir temizleme tepkisi indükleyebilir, bu sekilde potansiyel yan etkiler azaltilir.Bazi düzeneklerde yukarida tarif edilen monoklonal, kimerik, tekZincirli veya insanlastirilmis antikorlar, dogada hiçbir türde bir32antikorda dogal yoldan meydana gelmeyen ainino asit tortulari ihtiva edebilir. Bu yabanci tortular Örnegin monokloiial, kimerik, tek Zincirli veya insanlastirilmis antikora yeni veya modifiye edilmis spesifiklik,afinite veya efektör fonksiyon vermek için kullanilabilir.EnzimlerFarmasötik ve/veya ticari ajanlar olarak etkili olacagi gösterilmis bir baska glikoprotein sinifi, enzimleri içerir. Enzimler, glikosilasyon sablonu enzimatik aktiviteyi etkileyen glik0pr0teinlerdir. Bu nedenle arzu edilen glikosilasyon sablonlarina sahip enzimlerin mevcut açiklamaya göre üretilmesi de özel ilgi konusudur.Sinirlayici olmayan bir örnek olarak glukoserebrosidazda (GCR) bir eksiklik, Gaucher hastaligi olarak bilinen ve glukoserebrosidazin bazi hücrelerin lizoziinleri içinde birikmesinin neden oldugu bir durum ile sonuçlanir. Gaucher hastaligi olan sü jeler, spleiiomegali, hepatomegali, iskelet bozuklugu, trombositopeni ve anemi dahil bir dizi semptom sergiler. Friedman ve Hayes, birincil amiiio asit sekansinda tek bir ikame ihtiva eden rekombinant GCR'nin (rGCR), degistirilmis bir glikosilasyon sablonu, spesifik olarak fukoz ve N-asetil glukozamin tortularinda dogal yoldan meydana gelen GCR'ye kiyasla bir artis sergiledigini gösterdi (bakiniz Birlesik Devletler Pateiiti no. ,549,892).Friedman ve Hayes ayrica bu rGCR'nin dogal yoldan meydana gelen rGCR'ye kiyasla gelistirilmis farmakokinetik özellikler sergiledigini gösterdi. Örnegin rGCR, karaciger Kupffer hücrelerini dogal yoldan meydana gelen GCR'nin yaklasik iki kati kadar hedefledi. Iki proteinin birincil amino asit sekanslari, tek bir tortuda farklilasmakla birlikteFriedman ve Hayes, rGCR'nin degistirilmis glikosilasyon sablonunun,33Kupffer hücrelerine hedeflemeyi de etkileyebilecegi varsayiminda bulundu.Bu konuda siradan bilgiye sahip bir kisi, glikosilasyon sablonlarindaki bir degisiklikler kaynaklanan, degistirilmis enzimatik, farmakokinetik ve/Veya farmakodinamik özellikler sergileyen enzimlerin diger bilinenörneklerini bilecektir.Büyüme Faktörleri ve Diger Sinyalleme MolekülleriFarmasötik ve/veya ticari ajanlar olarak etkili olacagi gösterilmis bir baska glikoprotein sinifi, büyüme faktörlerini ve diger Sinyalleme moleküllerini içerir. Bu nedenle arzu edilen glikosilasyon sablonlarina sahip reseptörlerin mevcut açiklamaya göre üretilmesi de özel ilgi konusudur. Büyüme faktörleri tipik olarak hücreler tarafindan salgilanan ve diger hücreler üzerindeki reseptörlere baglanan ve bunlari aktiflestirerek reseptör hücre içinde bir metabolik veya gelisimsel degisim baslatan glikoproteinlerdir.Memeli büyüme faktörlerinin ve diger Sinyalleme moleküllerinin sinirlayici olmayan örnekleri arasinda sitokinler; epidermal büyüme faktörü (EGF); plateletten türetilmis büyüme faktörü (PDGF); fibroblast büyüme faktörleri (FGF'ler) ömegin FGF-5; insulin benzeri büyüme faktörü-I ve -II (IGF-I ve IGF-II); des(l-3) -IGF-I (beyin [GF-I), insulin benzeri büyüme faktörü baglanma proteinleri; CD proteinleri örnegin CD-3, CD-4, CD-8 ve CD-l9; eritropoietin; osteoindüktif faktörler; immünotoksinler; kemik morfogenetik proteinleri (BMP'ler); interferonlar örnegin interferon-alfa, -beta ve -gamma; koloni uyarma faktörleri (CSF'ler), örn., M-CSF, GM-CSF ve G-CSF; çogu interlökinler; tümör nekroz faktörü (TNF) beta; foliküluyarma hormonu; kalsitonin; luteinize edici hormon; anti-pihtilasma34faktörleri örnegin C Proteini; atriyal natriüretik faktör; akciger surfektani; plazmiiiojen aktiflestiriciler örnegin ürokinaz veya insan idrar veya doku tipi plazminojen aktiflestirici (t-PA); hematopoietik büyüme faktörü ve ensefalinaz bulunur. Bu konuda siradan bilgiye sahip kisiler mevcut açiklamaya göre eksprese edilebilecek diger büyüme faktörleriiii veya sinyalleine moleküllerini bilecektir.Büyüme faktörlerinin veya diger sinyalleme moleküllerinin glikosilasyon sablonundaki spesifik degisimlerin bunlariii terapötik özellikleri üzerinde öiiemli etkilere sahip olduklari gösterilmistir.

Sinirlayici olmayan bir örnek olarak kronik anemi çeken hastalara yönelik ortak bir tedavi yöntemi, bunlara kirmizi kan hücrelerinin üretiinini boost etmek amaciyla rekombinant insan eritropoietinin (rHuEPO) sik enjeksiyonlarini vermektir. rHuEPO'nun bir analogu olan darbepoetin alfa (Aranesp®), Vücutta normal rHuEPO'dan daha uzun süreye sahip olacak sekilde gelistirilmistir. Darbepoetin alfa ile rHuEPO arasindaki baslica farklilik, iki ekstra sialik asit ihtiva eden N bagli oligosakarit zincirinin varligidir. Darbepoetin alfa üretimi, in vitro gliko-yapilandirma kullanilarak gerçeklestirildi (bakiniz Elliott ve arkadaslari, Nature Biotechnology 21(4):4l4-21, 2003). Elliott ve arkadaslari, ekstra glikosilasyon sahalarini rHuEPO polipeptit oinurgasi içine dahil etmek için in vitro mutajenez kullandi, bu da darbepoetin alfa analogunun ekspresyonu ile sonuçlandi. Ekstra oligosakarit zincirleri, EPO reseptörü baglanina sahasina uzak konumlanir ve reseptör baglanmasina müdahale etmedikleri görülür.

Bununla birlikte darbepoetin alfa'nin yari ömrü, rHuEPO'dan üç kat daha yüksektir, bu da çok daha etkili bir terapötik ajan ile sonuçlanir.

Bu örnek, bir büyüme faktörünün veya baska sinyalleme molekülününglikosilasyon sablonundaki degisiinlerin, bir terapötik glikoproteinin in35vivo stabilitesi ve/veya aktivitesi üzerinde dramatik etkilere sahip olabilecegini gösterir. Böylelikle ilgili bir büyüme faktörünün veya diger sinyalleme molekülünün, mevcut açiklamanin ögretilerine uygun ekspresyonu, gelistirilmis bir glikosilasyon sablonuna ve gelistirilmis terapötik özelliklere sahip, eksprese edilmis büyüme faktörü veyasinyalleine molekülü ile sonuçlanabilir.ReseptörlerFarmasötik ve/veya ticari ajanlar olarak etkili olacagi gösterilmis bir baska glikoprotein sinifi, reseptörlerdir. Bu nedenle arzu edilen glikosilasyon sablonlarina sahip reseptörlerin mevcut açiklamaya göre üretilmesi de özel ilgi konusudur. Reseptörler tipik olarak bir hücre disi sinyalleme ligandinin taninmasi suretiyle islev gösteren transmembran glikoproteinlerdir. Ligand tanima alanina ek olarak reseptörler siklikla ligandin baglanmasi üzerine hedef hücre içi inolekülleri fosforile ederek bir sinyalleme yolagini baslatan bir protein kinaz alanina sahiptir, bu da hücre içinde gelisimsel veya metabolik degisimlere yol açar.Bazi düzeneklerde mevcut açiklamaya göre üretilecek glikoprotein reseptörü, bir reseptör tirosiii kinazidir (RTK). RTK fainilyasi, sayisiz hücre tipinde çesitli fonksiyonlar için elzein reseptörler içerir (bakiniz öm. Yarden ve Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich ve Schlessinger, Cell 61: 243-254, 1990, buraya referans olarak dahil edilmistir). RTK'lerin sinirlayici olmayan örnekleri arasinda fibroblast büyüme faktörü (FGF) reseptör familyasi üyeleri, epidermal büyüme faktörü (EGF) reseptör fainilyasi üyeleri, plateletten türetilmis büyüme faktörü (PDGF) reseptörü, iinmünoglobulin ve EGF homolojialanlari-l (TIE-l) ve TIE-2 reseptörlerine sahip tirosin kinazi (Sato ve36arkadaslari, Nature 376(6535):70-74, 1995) ve c-Met reseptörü bulunur, bunlarin bazilarinin anjiyojenezi dogrudan veya dolayli olarak tesvik ettigi ileri sürülmüstür (Mustonen ve Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-898, 1995). RTK'lerin diger sinirlayici olmayan örnekleri arasinda fetal karaciger kinazi 1 (FLK-l) (bazen kinaz ek alani ihtiva eden reseptör (KDR) olarak adlandirilir (Terman ve arkadaslari, Oncogene 6: 1677-83, 1991) veya vasküler endoteliyal hücre büyüme faktörü reseptörü 2, (VEGFR-Z), fms benzeri tirosin kinazi-l (Flt-l) (DeVries ve arkadaslari, Science 255, 989-991, 1992; Shibuya ve arkadaslari, Oncogene 5:519-524, 1990), bazen vasküler endoteliyal hücre büyüine faktörü reseptörü 1 (VEGFR-l) olarak anilir), nöroflin-fl, endoglin, endosialin ve Axl bulunur. Bazi düzeneklerde tümör nekroz faktörü alfa ve beta reseptörleri (TNFR-l; EP 417,563 yayin tarihi 20 Mart 1991; ve TNFR-Z, EP 417,014 yayin tarihi 20 Mart 1991), mevcut açiklamaya uygun sekilde eksprese edilir (inceleme için bakiniz Naismith ve Sprang, J Inflamm. 47(1-2):1-7, 1995-96).Bazi düzeneklerde mevcut açiklamaya göre üretilecek bir glikoprotein reseptörü, G-protein bagli reseptördür (GPCR). GPCR'ler, yedi transmembran alanina sahip glikoproteinlerdir. Bir ligandin bir GPCR'ye baglanmasi üzerine hücre içinde bir sinyal transdükte edilir, bu da hücrenin biyoloji veya fizyolojik bir özelliginde bir degisim ile sonuçlanir. GPCR'ler, ilaç etkisi ve gelistirme için önemli bir hedeftir.

Gerçekte reseptörler, su anda bilinen ilaçlarin yarisindan fazlasina yol açmistir (Drews, Nature Biotechnology, 14:1516, 1996) ve GPCR'ler, antagonize veya agonize edici bir GPCR olsun klinik olarak yazilan ilaçlarin %30'u ile terapötik müdahale için en önemli hedefi temsil eder (Milligan, G. ve Rees, S., TIPS, 20:118-124, 1999). Bu reseptörler,terapötik hedef olarak kabul görmüs, kanitlanmis bir geçmise sahip37oldugundan mevcut bulusa göre arzu edilen glikosilasyon sablonlarina sahip GPCR'lerin üretilmesi de Özel ilgi konusudur. Örnegin mevcut bulusun ögretilerine göre eksprese edilen, arzu edilen glikosilasyon sablonlarina sahip GPCR'lerin hücre disi alanlari, bir endojen GPCR'ye baglanmasi zararli olan bir ligandin titre edilmesi veya hapsedilmesi suretiyle `Önemli terapötik ajanlar olarak görev yapabilir.GPCR'ler, G-proteinler ve efekt'orler (hücre içi enzimler ve G-proteinlerin inodüle ettigi kanallar) ile birlikte hücre içi ikinci mesajcilarin durumunu hücre disi girdiler ile birlestiren modüler bir sinyalleme sisteminin bilesenleridir. Bu genler ve gen ürünleri, hastaligin potansiyel ettirgen ajanlaridir.GPCR proteini süperfamilyasi simdi 250 tipin üzerinde paralog ihtiva eder, buiilarin varyantlari temsil eden reseptörleri, farkli türden ayiii reseptöre sahip ortologlarin aksine gen çiftlenmeleriyle (veya baska proseslerle) üretilir. Süperfamilya, bes familyaya ayrilabilir: Familya I, rodopsin ve betaZ-adrenerjik reseptörü ile tiplenen ve su anda 200'ün üzerinde benzersiz üye ile temsil edilen reseptörler; Familya 11, yeni karakterize edilmis paratiroit hormonu/kalsitonin/sekretin reseptör familyasi; Familya III, memelilerde metabotropik glutamat reseptör familyasi; Familya IV, D. discoideum kemotaksinda ve gelisiminde 'Önemli cAMP reseptörü familyasi ve Familya V, STE2 gibi fungal çiftlesme feromon reseptörleri.GPCR'ler arasinda biyojenik aminlere yönelik, lipit enflamasyon aracilarina, peptit hormonlarina ve sensör sinyal aracilarina yönelik reseptörler bulunur. Reseptör, kendi hücre disi ligandini bagladiginda GPCR aktiflestirilir. GPCR içinde, ligand-reseptör etkilesiminden kaynaklanan konformasyonel degisimler, bir G proteininin GPCRhücre içi alanlarina baglanma afinitesini etkiler. Bu, GTP'nin G38proteinine güçlendirilmis afinite ile baglanmasini saglar.G proteininin GTP tarafindan aktivasyonu, G proteini (1 alt ünitesinin adenilat siklaz veya baska ikinci mesajci molekül üreticileri ile etkilesimine yol açar. Bu etkilesim, adenilat siklaz aktivitesini ve böylelikle bir ikinci mesajci inolekül, cAMP'nin üretimini regüle eder.

CAMP, diger hücre içi proteinlerin fosforilasyonunu ve aktivasyoiiunu regüle eder. Alternatif olarak diger ikinci mesajci moleküllerin örnegin CGMP veya eikosinoidleriii hücre düzeyleri, GPCR'lerin aktivitesi tarafindan yukari veya asagi regüle edilebilir. G proteini (1 alt ünitesi, GTP'nin GTPaz tarafindan hidrolizi yoluyla deaktive edilir ve (1, Beta ve y alt üniteleri yeniden birlesir. Heterotrimerik G proteini ise adenilat siklaz veya baska ikinci mesajci molekül üreticisinden ayrilir. GPCR aktivitesi ayrica hücre içi ve disi alanlarin veya halkalarin fosforilasyonu ile regüle edilebilir.Glutainat reseptörleri, nöro-iletinide önemli bir GPCR grubu olusturur.

Glutainat, CNS'deki en öneinli nöro-vericidir ve nöron plastikligi, idrak, hafiza, ögrenme ve bazi nörolojik bozukluklar örnegin epilepsi, inme ve nöro-dejenerasyonda önemli rolleri olduguna inanilir (Watson, S. ve S. Arkinstall, 1994), The G- Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, sayfa 130-132). Glutainat etkilerine, iyoiiotropik ve metabotropik adi verilen iki ayri reseptör sinifi aracilik eder. Iyonotropik reseptörler, iiitrinsik bir katyon kanali ihtiva eder ve glutamatin hizli uyarimsal etkilerine aracilik eder. Metabotropik reseptörler, inodülatör olup kalsiyuma bagimli potasyum iletkenliklerinin iiihibe edilmesi suretiyle nöronlarin membran uyarilabilirligini arttirir ve iyonotropik reseptörleriii uyarici iletiinini hem inhibe eder hem güçlendirir. Metabotropik reseptörler, agonistfarmokolojisi ve sinyal transdüksiyon yolaklarina dayali olarak bes alt39tip halinde siniflandirilir ve beyin dokulariiida yaygin sekilde dagitilir.

N bagli glikosilasyonun insan tip 1 alfa metabotropik glutamat (mGlul alfa) reseptörü fonksiyonunda önemli oldugu gösterilmistir (Mody ve arkadaslari, Neuropharmacology 38(10): l485-92,l999). mGlulalfa, en az kismen yaklasik 145 ve 160 KDa'lik inonomerlerden olusan bir dimer halinde norinalde eksprese edilir. mGlulalfayi N bagli glikosilasyoiiuii güçlü bir iiihibitörü olan tunikamisin ile isleme tabi tutarak Mody ve arkadaslari, hücre yüzeyi ekspresyonu etkilenmemekle birlikte birincil ainino asit sekansi ile tahmin edilen 130 kDa kütleli sadece bir peptitin eksprese edildigini gösterdi.

Fonksiyonel olarak tunikamisiii ile isleme tabi tutma, agonist ile uyarilan fosfoinositid hidrolizini isleme tabi tutulmamis hücre popülasyonlarina kiyasla yaklasik %50 oraninda azaltti. Böylelikle mevcut açiklamaya ait sisteme göre eksprese edilen GPCR'lerin glikosilasyon sabloiilarinin ayarlanmasi, eksprese edilen GPCR'nin sinyalleme fonksiyonunun modifiye edilmesinde ve potansiyel olarak eksprese edilmis GPCR'nin farmasötik veya diger özelliklerini koiitrol etmede veya etkileinede faydali olabilir.Vazo-aktif bagirsak polipeptiti (VIP) familyasi, tesirlerine yine GPCR'lerin aracilik ettigi alakali bir polipeptit grubudur. Bu familyasinin kilit elemanlari, VIP'nin kendisi, sekretin ve büyüme hormonu saliin faktörü (GRF)'dir. VIP, yumusak kaslarin gevsetilmesi, çesitli dokularda salginin uyarilmasi veya iiihibisyonu, çesitli immün hücre aktivitelerinin inodülasyonu ve CNS'de çesitli uyariinsal ve inhibit'or aktiviteler dahil genis bir fizyolojik tesir profiline sahiptir.

Sekretin, pankreas ve bagirsakta enzimlerin ve iyonlarin salgilanmasini uyarir ve ayrica beyinde küçük miktarlarda bulunur. VIP reseptörününglikosilasyonunun bunun kognat VIP'sinin baglanmasi üzerinde önemli40bir etkiye sahip oldugu gösterilmistir (Chochola ve arkadaslari, J. Biol.

Chem.268: 2312-2318, 1993). Oligosakarit zincirlerinin, VIP reseptörünün bugday gcrm aglutinin ile isleme tabi tutulmasi suretiyle sterik olarak bloke edilmesi, VIP baglanmasini doza bagimli olarak çarpici sekilde inhibe etti ve VIP ile uyarilan CAMP tepkisini azaltti. Ek olarak spesifik N bagli glikosilasyon sahalarinin VIP reseptöründe mutasyoiiu, reseptörün endoplazmik retikulum içinde tutulmasi ile sonuçlandi, bu da düzgün glikosilasyonuii hücre yüzeyine verme için kritik oldugunu gösterir (Couvineau ve arkadaslari, Biocheinistry (6):l745-52, 1996). Böylelikle mevcut açiklamaya göre eksprese edilen GPCR'lerin glikosilasyon sablonlarinin ayarlanmasi, eksprese edilen GPCR'nin kendi kognat ligandina baglanmasinin modüle edilmesinde (örnegin arttirilmasinda veya azaltilmasinda ve potansiyel olarak eksprese edilmis GPCR'nin farmasötik veya diger özelliklerini kontrol etmede veya etkilemede faydali olabilir.Genel olarak mevcut bulusun uygulamacilari, ilgili bir glikoproteini seçecek ve bunun kesin amino asit sekansini bilecektir. Mevcut açiklamanin teknikleri hem O bagli (Örnek 1 ve 2) hem de N bagli (Ornek 3 ve 4) glikoproteinlere basariyla uygulandi, bu da mevcut açiklamanin, genel olarak glikoproteinlerin eKSpresyonu için faydali olacagini gösterir. Mevcut açiklamaya göre eksprese edilecek verilen bir glikoprotein, kendi özel karakteristiklerine sahip olacak ve kültürlenmis hücrelerin hücre yogunlugunu veya canliligini etkileyebilecek, ayni kültür kosullari altinda büyütülen baska bir glikoproteinden daha düsük düzeylerde eksprese edilebilecek ve kesin kültür kosullariiia ve gerçeklestirilen adimlara bagli olarak bir veya daha fazla sahada farkli sekilde glikosile edilebilecektir. Bu konudasiradan bilgiye sahip bir kisi, hücre büyümesini ve verilen bir eksprese41edilmis glikoproteinin üretimini ve/veya glikosilasyon sablonunu optimize etmek amaciyla mevcut açiklamanin ögretilerine göre belirli bir glikoprotein üretmek için kullanilan adimlari ve kompozisyonlari uygun sekilde modifiye edebilecektir.Bazi düzeneklerde tüinör nekroz faktörü inhibitörleri, tümör nekroz faktörü alfa ve beta reseptörleri (TNFR-l; EP 417,563 yayin tarihi 20 Mart 1991; ve TNFR-2, EP 417,014 yayin tarihi 20 Mart 1991) formunda, mevcut açiklamaya ait sistemlere ve yöntemlere uygun sekilde ekSprese edilir (iiiceleme için bakiniz Naismith ve Sprang, J Inflamm. 47(1-2):1-7, 1995-96). Bazi düzeneklere göre bir tümör nekroz faktörü inhibitörü, çözülebilen bir TNF reseptörü içerir. Bazi düzeneklerde bir tümör iiekroz faktörü inhibitörü, çözülebilen bir TNF-lg içerir. Bazi düzeneklerde mevcut açiklamaya ait TNF inhibitörleri, TNFRI ve TNFRII'nin çözülebilen formlaridir. Bazi düzeneklerde mevcut açiklamaya ait TNF inhibitörleri, çözülebilen TNF baglanma proteinleridir. Bazi düzeneklerde mevcut açiklamaya ait TNF inhibitörleri, TNFR-Ig füzyon proteinleri, öm., TNFR-Fc veya etanersepttir. Burada kullanildigi gibi "etanersept", p75 TNF-OL reseptörünün hücre disi kisminin iki molekülünün bir dimeri olan TNFR-Fc'ye karsilik gelir; her molekül, insan IgG 1 'in 235 amino asitlikbir PC kismindan olusur.Glikoproteinlerin Ekspresyonu için Genlerin Konakçi Hücreler Içine SokulmasiGenellikle hücre içiiie sokulan bir nükleik asit molekülü, mevcut açiklamaya göre eksprese edilmesi arzu edilen glikoproteini sifreler.

Alternatif olarak bir nükleik asit molekülü, arzu edilen glikoproteininhücre tarafindan ekspresyonunu indükleyen bir gen ürününü42sifreleyebilir. Örnegin sokulan genetik materyal, bir endojen veya heterolog glikoproteinin traiiskripsiyonunu aktiflestiren bir transkripsiyon faktörünü sifreleyebilir. Alternatif veya ek olarak sokulan bir nükleik asit molekülü, hücre tarafindan eksprese edilen bir glikoproteinin translasyonunu veya stabilitesini arttirabilir,Ilgili bir glikoproteinin ekspresyonunu saglainak için yeterli nükleik asitlerin memeli konakçi hücreler içine sokulmasiiia uygun yöntemler bu konuda bilinmektedir. Bakiniz örnegin Gething ve arkadaslari, Nature, 293z620-625, 1981; Mantei ve arkadaslari, Nature, 281 :40-46, 1979; Levinson ve arkadaslari, EP 117,060; ve EP 117,058. Memeli hücreleri için genetik materyalin memeli hücreleri içine sokulmasina yönelik yaygin yöntemler arasinda Graham ve van der Erb'nin kalsiyum fosfat çökeltme yöntemi (Virology, 52:456-457, 1978) veya Hawley-Nelson'in 1ip0fectamin`1`M(Gibco BRL) Yöntemi (Focus 15:73, 1993) bulunur. Memeli hücre konakçi sistem transformasyonlarinin genel yönleri, 16 Agustos l983”te verilen ABD Patenti No. 4,399,216'da Axel tarafindan tarif edilmistir. Geiietik materyalin memeli hücreler içine sokulmasina yönelik çesitli teknikler için bakiniz Keown ve arkadaslari, Methods in Enzymology, 1989, Keown ve arkadaslari, Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990 ve Mansour Ve arkadaslari, Nature, 336:348-352,1988.Bazi düzeneklerde sokulacak bir nükleik asit, çiplak bir nükleik asit molekülü formundadir. Örnegin bir hücre içine sokulan nükleik asit molekülü sadece glikoproteini ve gerekli genetik kontrol elemanlarini sifreleyen nükleik asitten olusabilir. Alternatif olarak glikoproteini (gerekli regülatör elemanlar dahil) sifreleyen bir nükleik asit, bir plazmid vektör içinde bulunabilir. Glikoproteinlerin memeli hücreleriçinde ekspresyonu için uygun vektörlerin sinirlayici olmayan temsilci43örnekleri arasinda pCDNAl; pCD, bakiniz Okayama ve arkadaslari, Mol. Cell Biol. 5:] 136-1 142,1985; pMCIneo Poly-A, bakiniz Thomas ve arkadaslari, Cell 51 :503-512, 1987; bir bakülovirüs vektörü örnegin pAC 373 veya pAC 610; CDM8, bakiniz Seed, B. Nature 329:840,1987; ve pMTZPC, bakiniz Kaufman ve arkadaslari, EMBO J. 6:187-195,1987 bulunur. Bazi düzeneklerde bir hücre içine sokulacak bir nükleik asit molekülü, bir viral vektör içinde bulunur. Örnegin glikoproteini sifreleyen bir nükleik asit, viral genom (veya bir kismi Viral genom) içine sokulabilir. Glik0proteinin ekSpresyonunu yöneten regülatör elemanlar, viral genom içine sokulan nükleik asit ile birlikte dahil edilebilir (yani viral genom içine sokulan gene baglanabilir) veya viral genomun kendisi tarafindan saglanabilir.Çiplak DNA, DNA'yi ve kalsiyum fosfat ihtiva eden bir çökelti olusturarak hücrelerin içine sokulabilir. Alternatif olarak çiplak DNA, bir DNA ve DEAE-dekstran karisiminin olusturulmasi ve karisimin hücreler ile inkübe edilinesi veya hücrelerin DNA'nin birlikte uygun bir tampon içinde inkübe edilmesi ve hücrelerin yüksek voltajli bir elektrik pulsuna (örn., elektroporasyon yoluyla) tabi tutulmasi suretiyle hücrelerin içine sokulabilir. Çiplak DNA hücrelerinin sokulmasina yönelik baska bir yöntem, DNA'nin katyonik lipitler ihtiva eden bir lipozom süspansiyonu ile karistirilmasidir. DNA/lipozom kompleksi daha sonra hücreler ile inkübe edilir. Çiplak DNA ayrica hücrelerin içine örnegin mikro-enjeksiyon yoluyla direkt olarak enjekte edilebilir.

Alternatif olarak çiplak DNA ayrica DNA'nin polilizin gibi bir katyona koinplekslenmesi suretiyle hücrelerin içine sokulabilir, bu da bir hücre yüzeyi reseptörüne ait bir liganda birlestirilir (bakiniz örnegin Wu, G. ve Wu, C.H. J. Biol. Chem. 263214621, 1988; Wilson ve arkadaslari, J.

Biol. Chem. 267:963-967,1992; ve ABD Patenti No. 5,166,320).44DNA-ligand kompleksinin reseptöre baglanmasi, DNA'nin reseptör aracili endositoz tarafindan alinmasini kolaylastirir.Belirli nükleik asit sekanslari örn. bir glikoproteiiii sifreleyen bir CDNA ihtiva eden viral vektörlerin kullanilmasi, nükleik asit sekanslariniii bir hücre içine sokulmasi için yaygin bir yaklasimdir. Hücrelerin bir viral vektör ile enfeksiyonu, yüksek oranda hücrelerin nükleik asidi almasi avantajiiia sahiptir, bu da iiükleik asidi almamis hücreleriii seçilmesi gerekliligini ortadan kaldirabilir. Ek olarak viral vektör içinde, örn., viral vektörde buluiian bir CDNA tarafindan sifrelenen moleküller genel olarak viral vektör nükleik asidini almis hücreler içinde erimli sekilde eksprese edilir.Kusurlu retrovirüsler, gen terapisi amaçli olarak gen transferinde kullanilmak üzere iyi karakterize edilmistir (inceleme için bakiniz Miller A.D. Blood 76:27],1990). Retroviral genom içine sokulmus ilgili bir glikoproteiiii sifreleyen bir nükleik aside sahip bir rekombinant retrovirüs yapilandirilabilir. Ek olarak retrovirüsü replikasyoii kusurlu kilmak için retroviral genoinun kisimlari çikarilabilir. Böyle bir replikasyoii kusurlu retrovirüs daha soiira Viryonlar halinde paketlenir, bunlar ise bir yardimci Virüs kullaiiilarak bir hedef hücreyi standart tekniklerle enfekte etmede kullanilabilir.Bir adenovirüs genomu, ilgili bir glikoproteini sifreleyecek ve eksprese edecek sekilde manipüle edilebilir, ancak bir normal litik viral yasam döngüsü içinde replike olabilme açisindan eylemsizlestirilmistir.

Bakiniz örnegin Berkner ve arkadaslari, BioTechniques 62616, 1988; Rosenfeld ve arkadaslari, Scieiice 252:431-434, 1991 ve Rosenfeld ve arkadaslari, Cell 68:143-155, 1992. Adenovirüs susu Ad tip 5 dl324 veya adenovirüsün baska suslariiidan (örn., Ad2, Ad3, Ad7 vb.)türetilmis uygun adenoviral vektörler bu konuda uzman kisilerce45bilinmektedir. Rekombinant adenovirüsler, etkili gen verme araçlari olmak üzere hücrelerin bölünmesini gerektirmeineleri açisindan avantajlidir ve solunum yolu epitelyumu (Rosenfeld ve arkadaslari, 1992, yukarida belirtilmistir), endoteliyal hücreler (Lemarchand ve arkadaslari, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486,1992), hepatositler (Herz ve Gerard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9022812-2816,l993) ve kas hücreleri (Quantin ve arkadaslari, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA8922581-2584, 1992) dahi] çok çesitli hücre tiplerini enfekte etinede kullanilabilir. Ek olarak sokulan adenoviral DNA (ve bunun içinde bulunan yabanci DNA), bir konakçi hücrenin genomu içine entegre edilmez, ancak epizomal kalir, bu sekilde sokulan DNA'nin konakçi genom (örn., retroviral DNA) içine entegre hale geldigi durumlarda sokma mutajenezinin sonucu olarak meydana gelebilen potansiyel problemler önlenir. Ek olarak adenoviral genomun yabanci DNA'ya yönelik tasima kapasitesi, diger gen verme vektörlerine göre büyüktür (8 kilobaza kadar) (Berkner ve arkadaslari, yukarida belirtilmistir; Haj-Ahmand ve Graham, J. Virol. 572267, 1986). Hali hazirda kullanimda olan, replikasyon kusurlu çogu adenoviral vektör, viral El ve E3 genlerinin tamami veya bazi kisimlari açisindan delete edilir, ancak adeiioviral genetik materyalin %80 kadarini inuhafaza eder.Adeno baglantili virüs (AAV), verimli replikasyon ve üretken bir yasam döngüsü için yardimci bir Virüs olarak baska bir Virüs, 'Örnegin bir adenovirüs veya bir herpes virüs gerektiren, dogal yoldan meydana gelen kusurlu bir Virüstür. (Inceleme için bakiniz Muzyczka ve arkadaslari, Curr. Topics in Micro and Iminunol., 158z97-129, 1992).

Kendi DNA'sini bölünmeyen hücreler içine entegre edebilen ve yüksekfrekansta stabil entegrasyon sergileyen birkaç virüsten de biridir46(bakiniz örnegin Flotte ve arkadaslari, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356,1992; Samulski ve arkadaslari, J. Virol. 63:3822-3828,l989; ve McLaughlin ve arkadaslari, J. Virol. 62:1963-1973,l989). 300 baz çift kadar az AAV ihtiva eden vektörler paketlenebilir ve entegre edilebilir. Eksojen DNA için alan, yaklasik 45 kb ile sinirlidir.

Tratschin ve arkadaslarinda (Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260, 1985) tarif edilen gibi bir AAV vektörü, DNA'yi hücrelerin içine sokmak için kullanilabilir. Çesitli nükleik asitler, farkli hücre tipleri içine AAV vektörleri kullanilarak sokuldu (bakiniz 'Örnegin Hermonat ve arkadaslari, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6466-6470,1984; Tratschin ve arkadaslari, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081, 1985; Wondisford ve arkadaslari, Mol. Endocrinol. 2:32-3 9, 1988; Tratschin ve arkadaslari, J.

Virol. 51:611-619, 1984; ve Flotte ve arkadaslari, J. Biol. Chem. 268:3781-3790, 1993).Nükleik asit moleküllerini bir hücre popülasyonu içine sokmak için kullanilan yöntem, hücrelerin büyük kisminin inodifikasyonu ve glikoproteinin hücreler tarafiiidan verimli ekspresyonu ile sonuçlandiginda modifiye edilmis hücre popülasyonu, tekrar izolasyon veya popülasyon içindeki tek tek hücrelerin alt klonlanmasi yapilmadan kullanilabilir. Yani ileri hücre izolasyonu gerekmeyecek sekilde glikoproteinin hücre popülasyonu tarafindan yeterli üretimi olabilir ve popülasyon, glikoproteinin üretimi için bir hücre kültürünün tohumlanmasinda hemen kullanilabilir. Alternatif olarak homojen bir hücre popülasyonunun, glikoproteini verimli sekilde üreten birkaç hücreden veya tek bir hücreden izole edilmesi ve genisletilmesi arzu edilebilir.Bir nükleik asit molekülünün, ilgili bir glikoproteini sifreleyen birhücre içine sokulmasina alternatif olarak sokulan nükleik asit, bir hücre47tarafindan endojen sekilde üretilen glikoproteinin ekspresyon düzeyini indükleyen veya arttiran baska bir polipeptiti veya proteini sifreleyebilir. Örnegin bir hücre, belirli bir glikoproteini eksprese edebilir, ancak hücre ilave bir isleme tabi tutulmadan bunu yapamayabilir. Benzer sekilde hücre, arzu edilen amaç için yetersiz miktarlarda glikoprotein eksprese edebilir. Böylelikle ilgili glikoproteinin ekspresyonunu uyaran bir ajan, bu glikoproteinin hücre tarafindan ekspresyonunu indüklemek veya arttirmak için kullanilabilir. Örnegin sokulan nükleik asit molekülü, ilgili bir glikoproteinin transkripsiyonunu aktiflestiren veya yukari regüle eden bir transkripsiyon faktörünü sifreleyebilir. Böyle bir transkripsiyon faktörünün ekspresyonu ise ilgili glikoproteinin ekspresyonuna veya daha saglim ekspresyonuna yol açar.Bazi düzeneklerde glikoproteinin ekspresyonunu yöneten bir nükleik asit, konakçi hücre içine stabil sekilde sokulur. Bazi düzeneklerde glikoproteinin ekspresyonunu yöneten bir nükleik asit, konakçi hücre içine geçici sekilde sokulur. Bu konuda siradan bilgiye sahip kisiler, bir nükleik asidin hücre içine stabil mi yoksa geçici sekilde mi sokulacagini deneysel ihtiyaçlarina göre seçebilecektir.Ilgili bir glikoproteini sifreleyen bir gen istege bagli olarak bir veya daha fazla regülatör genetik kontrol elemanina baglanabilir. Bazi düzeneklerde bir genetik kontrol elemani, glikoproteinin konstitütif ekspresyonunu yönetir. Bazi düzeneklerde ilgili glikoproteini sifreleyen bir genin indüklenebilir ekspresyonunu saglayan bir genetik kontrol elemani kullanilabilir. Indüklenebilen bir genetik kontrol elemaninin (örn., indüklenebilen bir promoterin) kullanilmasi, glikoproteinin hücre içinde üretiminin modülasyonuna izin verir.Okaryotik hücrelerde kullanilmaya yönelik, potansiyel olarak faydali,48indüklenebilir genetik kontrol elemanlarinin sinirlayici olmayan örnekleri arasinda hormonla düzenlenen eleinanlar (bakiniz örn., Mader, S. ve White, J .H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607, 1993), sentetik ligandla düzenlenen elemanlar (bakiniz örn., Spencer, D.M. ve arkadaslari, Science 262:1019-1024, 1993) ve iyonize edici radyasyon ile düzenlenen elemanlar (bakiniz örn., Manoine, Y. ve arkadaslari, Biochemistry 32:10607-10613, 1993; Datta, R. ve arkadaslari, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: lOl49-10153,l992) bulunur. Bu konuda bilinen ilave hücreye spesifik veya baska regülatör sistemler, bulusa göre kullanilabilir.Bu konuda siradan bilgiye sahip kisiler, mevcut açiklamanin ögretilerine göre ilgili glikoproteiiii hücreye eksprese ettirecek genleri sokma yöntemini seçebilecek ve istege bagli olarak uygun sekildemodifiye edebilecektir.MHücre kültürüne ve glikoproteinlerin ekspresyonuna yatkin bir konakçi hücre mevcut açiklamaya göre kullanilabilir. Bazi düzeneklerde konakçi hücre memelidir. Mevcut bulusa göre kullanilabilecek memeli hücrelerin sinirlayici olmayan örnekleri arasinda BALB/c fare miyeloma çizgisi (NSO/I, ECACC No: 851 10503), insan retinoblastlari (PER.C6 (CruCell, Leiden, Hollanda)); SV40 ile transforme edilmis maymun böbregi CVl çizgisi (CCS-7, ATCC CRL 1651); insan embriyonik böbrek çizgisi (293 veya süspansiyon kültürü içinde büyüme için alt klonlanmis 293 hücreleri, Graham ve arkadaslari, J.

Gen Virol., 36:59, 1977); yavru hamster böbrek hücreleri (BHK, ATCC CCL 10); Çin hamster yumurtalik hücreleri +/-DHFR (CHO, Urlaub ve Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); fare sertoli49hücreleri (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); maymun böbrek hücreleri (CVl ATCC CCL 70); Afrika yesil mayinun böbrek hücreleri (VERO-76, ATCC CRL-l 587); insan servikal karsinoma hücreleri (HeLa, ATCC CCL 2); köpekgiller böbrek hücreleri (MDCK, ATCC CCL 34); bufalo siçani karaciger hücreleri (BRL 3A, ATCC CRL 1442); insan akciger hücreleri (W138, ATCC CCL 75); insan karaciger hücreleri (Hep G2, HB 8065); fare meme tümörü (MMT 060562, ATCC CCL51); TR] hücreleri (Mather ve arkadaslari, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 hücreleri; FS4 hücreleri ve bir insan hepatoina çizgisi (Hep G2) bulunur.Ek olarak glikoproteinleri eksprese eden, ticari ve ticari olmayan sekilde temin edilebilen bir dizi hibridoma hücre çizgisi, mevcut bulusa göre kullanilabilir. Bu konuda uzman bir kisi, hibridoina hücre çizgilerinin farkli besin gereksinimleri olabilecegini ve/veya optimum büyüme ve glikoprotein ekspresyonu için farkli kültür kosullari gerektirebilecegini takdir edecek ve kosullari gerekli sekilde modifiye edebilecektir.Yukarida belirtildigi gibi birçok durumda yüksek düzeylerde glikoprotein üretilecek sekilde hücreler seçilecek veya yapilandirilacaktir. Siklikla hücreler, yüksek düzeylerde glik0pr0tein üretmek üzere örnegin ilgili glikoproteini sifreleyen bir genin sokulmasi yoluyla ve/veya bu genin ekspresyonunu regüle eden genetik kontrol elemanlarinin (endojen veya sokulmus) sokulmasi yoluyla insan eliyle manipüle edilecektir.Bu konuda siradan bilgiye sahip bir kisi, farkli hücre tiplerinde üretilen glikoproteinlerin ortaya çikan farkli glikosilasyon sablonlari ihtiva edebilecegini takdir edecektir. Örnegin Przybilo ve arkadaslari,kadherinlerin glikosilasyon sablonlarinin, malignan olmayan epiteliyal50üreter hücreler, V-raf ile transfekte edilmis HCV29 hücreleri ve idrar kesesinin geçici hücre kanserleri içinde eksprese edildiginde farklilik gösterdigini gösterdi (bakiniz Przybilo ve arkadaslari, Cancer Cell International, 2(1): 6,2002). Lifely ve arkadaslari, insanlastirilmis bir IgG antikorunun glikosilasyon sablonunun ve biyolojik aktivitesinin, CHO, YO iniyeloma ve N80 miyeloma hücre çizgileri içinde eksprese edildiginde farklilik gösterdigini gösterdi (bakiniz Lifely ve arkadaslari, Glycobiology. 5(8):813-22, 1995). Bu konuda siradan bilgiye sahip kisiler, belirli bir glik0pr0teinin üretilinesi için arzu edilecek hücre çizgisini denemelere gerek kalmadan seçebilecektir. Nihayetinde seçilen hücre çizgisinden bagimsiz olarak bir glik0pr0tein, mevcut bulusa uygun sekilde eksprese edilebilir ve bu da daha kapsainli bir glikosilasyon sablonu ile sonuçlanir.Bazi glikoproteinler, hücre büyümesi, hücre canliligi veya hücrelerin bazi baska karakteristikleri üzerinde bozucu etkilere sahip olabilir ve bu da ilgili glik0pr0teinin üretimini bir sekilde sinirlandirir. Spesifik bir glik0pr0teini eksprese etmek üzere yapilandirilmis belirli bir tipte hücre popülasyonu içinde bile bazi tekli hücreler daha iyi büyüyecek, ilgili glik0pr0tein daha fazla üretilecek, daha kapsamli bir glikosilasyon sablonuna sahip bir glik0pr0tein üretilecek veya glikosilasyon sablonu, dogal yoldan meydana gelen glik0pr0teinin glikosilasyon sablonunu daha dogru yansitan bir glik0pr0tein üretilecek sekilde hücre popülasyonu içinde degiskenlik olur. Bazi düzeneklerde hücrelerin kültürlenmesi için seçilen özel kosulla altinda saglam büyüme için bir hücre çizgisi uygulainaci tarafindan deney yoluyla seçilir. Bazi düzeneklerde belirli bir glik0pr0teini eksprese etmek üzere yapilandirilmis tek tek hücreler, hücre büyümesine, nihai hücreyogunluguna, hücre canliligi yüzdesine, eksprese edilen glik0pr0teinin51titerine, oligosakarit yan zincirlerinin derecesine ve koinpozisyonuna veya bunlarin veya uygulamaci tarafindan 'Önemli görülen diger kosullarin bir koinbinasyonuna dayanilarak büyük ölçekli üretim içinseçilir.Hücrelerin Kültürlenmesi Mevcut bulus, glikoproteinlerin ekspresyonuna yatkin herhangi bir hücre kültürü yöntemi ile birlikte kullanilabilir. Örnegin hücreler, kesikli veya beslemeli kesikli kültürler içinde büyütülebilir, burada glikoproteinin yeterli ekspresyoiiu sonrasinda kültür sonlandirilir, bundan sonra eksprese edilen glikoprotein toplanir. Alternatif olarak hücreler, perfüzyon kültürleri içinde büyütülebilir, burada kültür sonlandirilmaz ve yeni besin maddeleri ve diger bilesenler kültüre sürekli veya periyodik sekilde ilave edilir, bu sirada eksprese edilen glikoprotein periyodik veya sürekli sekilde toplanir.Hücreler, uygulainaci tarafindan seçilen elverisli bir hacimde büyütülebilir. Örnegin hücreler, hacim olarak birkaç mililitre ile birçok litre arasinda degisen küçük 'Ölçekli reaksiyon kaplari içinde büyütülebilir. Alternatif olarak hücreler, hacmi yaklasik en az 1 litre ila , 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000 litre veya daha fazlasi arasinda degisen veya bunlarin arasindaki bir hacimde bulunan büyük ölçekli ticari Biyo-reaktörler içinde büyütülebilir.Bir hücre kültürünün sicakligi asil olarak hücre kültürünün canli kaldigi sicaklik araligina, yüksek düzeyde glikoproteinin üretildigi araliga ve/Veya eksprese edilen glikoproteinin arzu edilen glikosilasyon sablonunu ihtiva ettigi araliga göre seçilecektir. Örnegin CHO hücreleri iyi büyür ve arzu edilen glikosilasyon sablonlarina sahipglikoproteinleri, yaklasik 37°C'de ticari açidan yeterli düzeylerde52üretebilir. Genel olarak memeli hücrelerinin büyük kismi, yaklasik °C ila 42°C araliginda iyi büyür ve arzu edilen glikosilasyon sablonlarina sahip glikoproteinleri üretebilir, bununla birlikte mevcut açiklamanin ögrettigi yöntemler, bu sicakliklarla sinirli degildir. Bazi memeli hücreleri, yaklasik 35°C ila 40°C araliginda iyi büyür ve arzu edilen glikosilasyon sablonlarina sahip glikoproteinleri ticari açidan yeterli düzeylerde üretebilir. Bazi düzeneklerde bir hücre kültürü, hücre kültürü prosesinde bir veya daha fazla kez 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45°C sicaklikta büyütülür. Bu konuda siradan bilgiye sahip kisiler, hücrelerin büyütülecegi uygun sicakligi veya sicakliklari, hücrelerin özel ihtiyaçlarina ve uygulamacinin özel üretim gerekliliklerine göre seçebilecektir.Ek olarak bir kültür, kültür seyri sirasinda bir veya daha fazla sicaklik kaydirmasina tabi tutulabilir. Bir kültürün sicakligi kaydirilirken sicaklik kaymasi nispeten dereceli olabilir. Örnegin sicaklik degisiminin tamamlanmasi birkaç saat veya günler sürebilir. Alternatif olarak sicaklik kaymasi nispeten ani olabilir. Sicaklik kültür prosesi sirasinda sabit bir sekilde arttirilabilir veya azaltilabilir. Alternatif olarak sicaklik kültür prosesi sirasinda çesitli zamanlarda ayri miktarlarla arttirilabilir veya azaltilabilir. Takip eden sicaklik(lar) veya sicaklik aralik(lar)i, baslangiç veya `Önceki sicaklik(lar)dan veya sicaklik aralik(lar)indan daha düsük veya daha yüksek olabilir. Bu konuda siradan bilgiye sahip bir kisi, birçok ayri sicaklik kaymasinin bu düzenegin dahilinde oldugunu anlayacaktir. Örnegin sicaklik bir kez (daha yüksek veya daha düsük bir sicakliga veya sicaklik araligina) kaydirilabilir, hücreler belirli bir süre bu sicaklikta veya sicaklikaraliginda tutulabilir, bundan sonra sicaklik yeni bir sicakliga veya53sicaklik araligina tekrar kaydirilabilir, bu da önceki sicakliktan veya sicaklik araliginda daha yüksek veya daha düsük olabilir. Her ayri kaydirma sonrasinda kültürün sicakligi sabit olabilir veya berili bir sicaklik araliginda korunabilir.Baslangiç sicakligi veya sicaklik araliginda oldugu gibi sicaklik kaydirma(lar)indan sonra bir hücre kültürünün sicakligi veya sicaklik araligi genellikle asil olarak hücre kültürünün canli kaldigi sicaklik(lar)a, yüksek düzeyde glik0pr0teinin üretildigi araliga ve/veya ekSprese edilen glik0pr0teinin arzu edilen glikosilasyon sablonunu ihtiva ettigi araliga göre seçilir. Genel olarak meineli hücrelerinin büyük kismi, yaklasik 25°C ila 42°C araliginda canli kalir ve arzu edilen glikosilasyon sablonlarina sahip glik0pr0teinleri eksprese eder, bununla birlikte mevcut açiklamanin ögrettigi yöntemler, bu sicakliklarla sinirli degildir. Bazi düzeneklerde memeli hücreleri, yaklasik 25°C ila 35°C araliginda canli kalir ve arzu edilen glikosilasyon sablonlarina sahip glik0pr0teinleri ticari açidan yeterli düzeylerde eksprese eder. Bu konuda siradan bilgiye sahip kisiler, hücrelerin büyütülecegi uygun sicaklik(lar)i veya sicaklik aralik(lar)ini hücrelerin özel ihtiyaçlarina ve uygulamacinin 'Özel üretim gerekliliklerine göre seçebilecektir. Hücreler, uygulamacinin ihtiyaçlarina ve hücrelerin kendilerinin gereksinimine göre herhangi bir süreyle büyütülebilir.Bazi düzeneklerde kesikli ve beslemeli kesikli reaksiyonlar, eksprese edilmis glik0pr0tein yeterince yüksek bir titere ulastiginda ve/Veya eksprese edilmis glik0pr0tein, uygulamacinin ihtiyaçlarina göre belirlenen, arzu edilen bir glikosilasyoii sablonunu sergilediginde sonlandirilir. Ek veya alternatif olarak kesikli ve besleineli kesiklireaksiyonlar, uygulamacinin ihtiyaçlarina göre belirlendiginde hücreler54yeterince yüksek bir yogunluga ulastiginda sonlandirilabilir. Örnegin kültür, hücreler maksimum canli hücre yogunlugunun yüzde 1, 5, 10, , 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 veya 99'una ulastiginda sonlandirilabilir. Ek veya alternatif olarak kesikli ve beslemeli kesikli reaksiyonlar, laktat ve amonyum gibi metabolik atik ürünlerin asiri birikmesinden önce sonlandirilabilir.Bazi durumlarda takip eden üretim fazi sirasinda bir hücre kültürünün, hücreler tarafindan tüketilinis veya metabolize edilmis besin maddeleri veya diger ortam bilesenleri ile destekleninesi faydali olabilir.

Sinirlayici olinayan örnek olarak bir hücre kültürünün hormonlar ve/Veya diger büyüme faktörleri, inorganik iyonlar (örnegin sodyum, klorid, kalsiyum, magnezyum ve fosfat gibi), tamponlar, Vitaminler, nükleosidler veya nükleotitler, eser elementler (inorgaiiik bilesikler genellikle çok düsük konsantrasyonlarda bulunur), ainino asitler, lipitler veya glukoz veya baska bir enerji kaynagi ile desteklenmesi faydali olabilir. Bu destekleyici bilesenlerin tamami hücre kültürüne bir seferde ilave edilebilir veya hücre kültürüne bir dizi ilavede sunulabilir.

Bazi düzeneklerde hücreler, buraya referans yoluyla dahil edilmis 60/605,097 Seri Numarali Birlesik Devletler Geçici Patent Basvurusunda tarif edilen hücre kültürü yöntemlerinden birine göre büyütülür. Bazi düzeneklerde hücreler, buraya referans yoluyla dahil edilmis ll/213,308 Seri Numarali Birlesik Devletler Patent Basvurusunda tarif edilen bir veya daha fazla kosul altinda büyütülür.

Bu konura siradan bilgiye sahip bir kisi, bunlarla sinirli olmamakla birlikte büyüme hizi, hücre canliligi, hücre kültürünün nihai hücre yogunlugu, laktat veya amonyum gibi zararli metabolik yan ürünlerin nihai konsantrasyonu, eksprese edilen glikoproteinin nihai titeri,oligosakarit yan zincirlerinin derecesi ve kompozisyonu veya bunlarin55veya uygulamaci tarafindan öneinli görülen diger kosullarin bir kombinasyonu dahil hücre kültürünün bazi karakteristiklerini optimizeetmek için spesifik hücre kültürü kosullarini düzenleyebilecektir.Eksprese Edilmis Glikoproteinin Izolasyonu Genel olarak mevcut bulusa göre eksprese edilmis glikoproteinlerin izole edilmesi ve/veya saflastirilmasi tipik olarak arzu edilecektir. Bazi düzeneklerde eksprese edilmis glikoprotein, ortam içine salgilanir ve böylelikle hücreler ve diger katilar, santrifü j veya filtreleme yoluyla örnegin saflastirma prosesinde birinci adim olarak çikarilabilir.

Alternatif olarak eksprese edilmis glikoprotein, konakçi hücrenin yüzeyine baglanabilir. Ornegin ortam çikarilabilir ve glikoproteini eksprese eden konakçi hücreler, saflastirma prosesinde birinci adim olarak lize edilir. Memeli konakçi hücrelerin lizizi, cam tanelerle fiziksel parçalama ve yüksek pH kosullarina tabi tutma dahil bu konuda siradan bilgiye sahip kisilerce iyi bilinen bir dizi vasitayla gerçeklestirilebilir.Eksprese edilmis glikoprotein bunlarla sinirli olmamakla birlikte kromatografi (örn., iyon degistirme, afinite, ebat eksklüzyon ve hidroksiapatit kromatografisi), jel filtreleme, santrifüj veya farkli çözünürlük, etanol ile çökeltme ve/Veya proteinlerin saflastirilmasina yönelik baska bir mevcut teknik dahil standart yöntemlerle izole edilebilir ve saflastirilabilir (Bakiniz örn., her biri buraya referans olarak dahil edilmis Scopes, Protein Purification Principles and Practice, 2. baski, Springer-Verlag, NeW York, 1987; Higgins, SJ. ve Hames,B.D.(eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford UniV Press, 1999; ve Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology56(Methods in Enzymology Series, Cilt 182), Academic Press, '1997.

Immüno-afinite kromatografisi için özellikle glikoprotein, glikoproteine karsi olusturulmus ve sabit bir destege eklenmis antikorlar içeren bir afinite kolonuna baglanarak izole edilebilir.

Alternatif olarak bir influenza kilif sekansi, poli-histidin veya glutatiyon-S-transferaz gibi afinite takilari, uygun afinite kolonu üzerinden geçis yoluyla kolay saflastinna saglainak üzere standart rekombinant tekniklerle glikoproteine eklenebilir. Proteaz inhibitörleri örnegin fenil metil sülfonil florid (PMSF), leu-peptin, pepstatin veya aprotinin, saflastirma prosesi sirasinda glikoproteinin degradasyonunu azaltmak veya ortadan kaldirinak için herhangi bir veya tüm asamalarda ilave edilebilir. Proteaz inhibitörleri, eksprese edilinis glikoproteini izole etinek ve saflastirmak için hücrelerin lize edilmesi gerektiginde özellikle avantajlidir. Ek veya alternatif olarak glikosidaz inhibitörleri, kovalent sekilde eklenmis oligosakarit zincirlerinin enziinatik kirpilinasini azaltinak veya ortadan kaldirinak için herhangi bir veya tüm asamalarda ilave edilebilir.Mevcut bulusa göre eksprese edilmis glikoproteinler, geleneksel hücre kültürü kosullari altinda büyütülmelerine göre daha kapsamli veya baska sekilde degismis glikosilasyon sablonlarina sahip olabilir.

Böylelikle mevcut bulusun, saflastirma adiminda kullanilabilecek pratik bir faydasi, mevcut bulusa ait bazi yöntemlere göre büyütülmüs bir glikoprotein üzerinde ilave ve/veya degistirilmis seker tortularinin, buna ayri biyokimyasal özellikler verebilmesi ve bunlarin da uygulamaci tarafindan, glikoproteini daha geleneksel yöntemlere göre büyütülmüs bir glikoprotein için mümkün olandan daha kolay saflastirmada veya daha fazla saflastirinada kullanilabilmesidir.Bu konuda siradan bilgiye sahip bir kisi, kesin saflastirma tekniginin57saflastirilacak glikoproteinin karakterine, glikoproteinin eksprese edilecegi hücrelerin karakterine ve/veya içinde hücrelerin büyütüldügü ortamin kompozisyonuna bagli olarak degisebilecegini takdiredecektir.Immüno ienik Kompozisyonlar Mevcut açiklamanin ögretilerine göre üretilen glikoproteinler ayrica immünojenik kompozisyonlarda örn., asi olarak kullanilabilir. Bazi düzeneklerde mevcut açiklamanin bazi yöntemlerine göre glikoproteinlerin üretilmesi suretiyle saglanan, gelistirilmis bir glikosilasyon sablonu, daha etkili bir immünojenik kompozisyon ile sonuçlanabilir. Örnegin üretilen glikoproteini ihtiva eden immünojenik kompozisyon, sü jenin immün sisteminin glikoproteine karsi daha fazla sayida antikorlar ürettigi ve/veya immünojenik glikoprotein için daha yüksek bir spesifiklik sergileyen antikorlar ürettigi, daha etkili bir immün tepkisini tetikleyebilir. Ek veya alternatif olarak böyle bir glikoprotein, daha az ve/veya daha az siddetli yan etkileri olan bir immün tepkisini tetikleyebilir. Bazi düzeneklerde açiklamaya ait immünojenik kompozisyonlar, bir veya daha fazla glikoprotein içerir.

Ek veya alternatif olarak bulusa ait bir immünojenik kompozisyon, bir veya daha fazla fizyolojik açidan kabul edilebilir tasiyici içerebilir.Genel olarak mevcut bulusa ait bir iinmünojenik kompozisyon(lar)1n bilesenleri için uygun “etkili miktarin” veya dozajin seçilmesi, bunlarla sinirli olmamakla birlikte kullanilan immünojenik kompozisyon içindeki seçilen glikoprotein(ler)in kimligi, glikoprotein(ler)in glikosilasyon sablonu ve süjenin fiziksel durumu, en önemlisi de immünize edilen süjenin genel sagligi, yasi ve/veya kilosu gibi çesitlifaktörlere dayanir. Bu konuda bilindigi gibi özel uygulama yöntemleri58ve yollari ve immünojenik kompozisyonlarda ilave bilesenlerin bulunmasi da DNA plazmid kompozisyonlarinin dozajlarini ve miktarlarini etkileyebilir. Etkili dozun bu sekilde seçilmesi ve yukari veya asagi ayarlanmasi, bu konudaki uzmanlik dahilindedir. Bunlarla sinirli olmamakla birlikte koruyucu bir tepki dahil bir immün tepkisini indüklemek veya anlamli olumsuz yan etkiler olmadan hastada eksojen bir etki üretmek için gerekli iinmünojenik kompozisyon miktari, bu faktörlere bagli olarak degisiklik gösterir. Uygun dozlar, bu konuda uzman kisilerce kolaylikla belirlenir.Mevcut açiklamaya ait bazi immünojenik koinpozisyonlar, bir ad juvan ihtiva edebilir. Bir adjuvan, bir immünojen veya antijen ile birlikte uygulandiginda immün tepkisini güçlendiren bir maddedir. Bir dizi sitokin veya lenfokinin, iminün modüle edici aktiviteye sahip oldugu gösterilmistir ve bu nedenle bunlarla sinirli olmamakla birlikte interlökinler 1-(1, l-ß, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (bakiniz örn., ABD Patenti No. 5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 ve 18 (ve bunun mutant formlari), interferonlar 01, [3 ve y, granülosit-makrofaj koloni uyarma faktörü (bakiniz örn., ABD Patenti No. 5,078,996), makrofaj koloni uyarma faktörü, granülosit koloni uyarma faktörü, GSF ve tümör nekroz faktörleri (x ve ß dahil olmak üzere ad juvan olarak kullanilabilir. Bu bulusta faydali yine baska adjuvanlar arasinda bir kemokin, sinirlama olmadan örnegin MCP-l, MIP-lot, MIP-lß ve RANTES bulunur. Bir selektin, örn., L-selektin, P-selektin ve E-selektin gibi adezyon molekülleri de adjuvan olarak faydali olabilir. Yine diger faydali adjuvanlar arasinda, sinirlama olmadan, bir musin benzeri molekül, örn., CD34, GlyCAM-l ve MadCAM-l, integrin familyasinin bir üyesi, örnegin LFA-l, VLA-l, Mac-1 ve p150.95, irnmünoglobulin süperfamilyasinin bir üyesi örnegin PECAM, 1CAM”1ar, örn., ICAM-l ,59[CAM-2 ve [CAM-3, CD2 ve LFA-3, ortak uyarici moleküller örnegin CD40 ve CD40L, büyüme faktörleri Örnegin vasküler büyüme faktörü, sinir büyüme faktörü, fibroblast büyüme faktörü, epidermal büyüme faktörü, B7.2, PDGF, BL-l ve vasküler endoteliyal büyüme faktörü, reseptör molekülleri örnegin Fas, TNF reseptörü, Flt, Apo-l, p55, WSL-l, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAlL-R2, TRICK2 ve DR6 bulunur. Yine bir baska adjuvan molekülü, Kaspaz (ICE) içerir. Bakiniz ayrica Uluslararasi Patent Yayinlari No. WO98/ 17799 ve WO99/43839.Yayinlanmis Uluslararasi Patent Basvurusu no. WO 00/18434°te tarif edilenler dahil, kolera toksinleri (CT) ve bunlarin mutantlari da ad juvan olarak faydalidir (burada 29. amino asit pozisyonundaki glutamik asit, bir baska amino asit (aspartik asit disinda), tercihen bir histidin ile degistirilir). Benzer CT'ler veya mutantlar, yayinlanmis Uluslararasi Patent Basvurusu no. WO 02/098368°de tarif edilmistir (burada 16. amino asit pozisyonundaki izolösin, tek basina veya 68. amino asit pozisyonundaki serinin bir baska amino asit ile degistirilmesi ile kombinasyon halinde bir baska ainino asit ile degistirilir ve/veya burada 72. amino asit pozisyonundaki valin, bir baska amino asit ile degistirilir). Diger CT toksinleri, yayinlanmis uluslararasi Patent Basvurusu no. WO 02/098369”da tarif edilmistir (burada 25. amino asit pozisyonundaki arginin, bir baska amino asit ile degistirilir ve/veya bir amino asit, 49. amino asit pozisyonuna sokulur ve/veya iki amino asit, ve 36. amino asit pozisyonlarina sokulur).Bazi düzeneklerde mevcut açiklamaya ait immünojenik kompozisyonlar, bir insana veya insan disi bir omurgaliya, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, intranazal, oral, vajinal, rektal, parenteral,intradermal, transdermal (bakiniz örnegin Uluslararasi patent yayini No.60WO 98/20734), intramüsküler, intraperitonal, subkütan, intravenöz ve iiitraarteriyal dahil çesitli yollardan uygulanir. Uygun yol, kullanilan immünojenik kompozisyonun dogasina, hastanin yasinin, kilosunun, cinsiyetinin ve geiiel sagliginin degerlendirmesine ve immünojenik kompozisyon içinde bulunan anti jenlere ve/veya bu konuda siradan bilgiye sahip kisilerce bilinen diger faktörlere bagli olarak seçilebilir.Bazi düzeneklerde immünojenik kompozisyonlar, birçok sefer uygulanir. Inimünojenik kompozisyon uygulamasinin sirasi ve tek tek uygulamalar arasindaki zaman periyotlari, bu konuda uzman bir kisi tarafindan, bunlarla sinirli olmamakla birlikte konakçinin fiziksel özellikleri ve uygulama yöntemine verdigi kesin tepkiler dahil bu konuda siradan bilgiye sahip kisilerce bilinen alakali faktörleredayanarak seçilebilir.Farmasötik Formülasvonlar Bazi düzeneklerde üretilen glikoproteinler, farmakolojik aktiviteye sahip olacaktir ve farniasötiklerin hazirlanmasinda faydali olacaktir.

Bulusa ait yukarida tarif edilen kompozisyonlar, bir süjeye uygulanabilir veya ilk önce bunlarla sinirli olmamakla birlikte parenteral (örn., intravenöz), intradermal, subkütan, oral, nazal, bronsiyal, oftalmik, transdermal (topik), transmukozal, rektal ve va jinal yollar dahil uygun bir yolla verilmek üzere formüle edilebilir. Bulusa ait farmasötik kompozisyoiilar tipik olarak farinasötik açidan kabul edilebilir bir tasiyici ile kombinasyon halinde bir memeli hücre çizgisinden eksprese edilen, saflastirilmis bir glikoprotein, bir verme ajani (yani yukarida tarif edildigi gibi katyonik bir polimer, peptit moleküler tasiyici, surfektan, vb.) içerir. Burada kullanildigi gibi"farmasötik açidan kabul edilebilir tasiyici" ifadesi, farmasötik61uygulama ile uyumlu solventler, dispersiyon ortamlari, kaplamalar, antibakteriyel ve antifungal ajanlar, izotonik ve absorpsiyonu geciktirici ajanlar ve benzerlerini kapsar. Destekleyici aktif bilesikler de kompozisyonlar içine dahil edilebilir. Örnegin mevcut açiklamaya göre üretilen bir glikoprotein ek olarak toksinler, düsük moleküler agirlikli sitotoksik ilaçlar, biyolojik tepki modifiye edicileri ve radyo-nüklidler gibi sistemik farinakoterapiye yöiielik baska ilaçlara konjüge edilebilir (bakiniz öm., Kunz ve arkadaslari, Kalikeamisintürevi-tasiyici koni'ugatlari, USZOO40082764 A1). Alternatif veya ek olarak mevcut açiklamaya göre üretilmis bir protein veya polipeptit, bir veya daha fazla ilave farniasötik açidan aktif ajan ile (es zamanli veya sirali) kombinasyon halinde uygulanabilir.

Farinasötik açidan aktif a janlariii daha kapsainli bir listesi, Physicians' Desk Reference, 55. baski, yayinlayan Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ, 2001'de bulunabilir. Siralanan bu ajanlarin çogu için farmasötik açidan etkili dozajlar ve rejimler bu konuda bilinmektedir; birçogu ise Physicians' Desk Reference'iii kendisinde sunulur.Farinasötik bir kompozisyon bunun için amaçlanan uygulaina yoluyla uyumlu olacak sekilde avantajli olarak formüle edilir. Parenteral, intradermal veya subkütan uygulama için kullanilan çözeltiler veya süspansiyonlar, su bilesenleri içerebilir: steril bir seyreltici örnegin enjeksiyonlu su, tuz çözeltisi, sabit yaglar, polietilen glikoller, gliserin, propilen glikol veya diger sentetik solventler; antibakteriyel ajanlar örnegin benzil alkol veya inetil parabenler; antioksidanlar örnegin askorbik asit veya sodyuin bisülfit; selatlaina ajanlari örnegin etilendiainintetraasetik asit; tamponlar örnegin asetatlar, sitratlar veya fosfatlar ve tonikligi ayarlama ajanlari örnegin sodyum klorid veyadekstroz. pH, hidroklorik asit veya sodyuin hidroksid gibi asitler veya62bazlarla ayarlanabilir. Parenteral preparasyon, ampuller, tek kullanimlik siringalar veya camdan veya plastikten yapilma çok dozluk siseler içine alinabilir.Enjeksiyonluk kullanima uygun farmasötik kompozisyonlar tipik olarak steril sulu çözeltiler (suda çözülebilen oldugunda) veya dispersiyonlar ve steril enjeksiyonluk çözeltilerin veya dispersiyonun ekstemporane preparasyonuna yönelik steril tozlar kullanir. intravenöz uygulama için uygun tasiyicilar arasinda fizyolojik tuz, bakteriyostatik su, CremOphor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) veya fosfat tamponlu tuz (PBS) bulunur. Her duruinda kompozisyon, steril olinali ve kolay siringa edilebilecegi derecede akiskan olmalidir. Mevcut açiklamaya ait bazi farmasötik formülasyonlar, üretim ve depolaina kosullari altinda stabil olmali ve bakteriler ve mantarlar gibi mikroorganizmalarin bulasma hareketlerine karsi korunmalidir. Genel olarak alakali bir tasiyici, bir solvent veya örnegin su, etanol, poliol (örn., gliserol, propilen glikol ve sivi polietilen glikol ve benzeri) ve bunlarin uygun karisimlarini ihtiva eden dispersiyon ortann olabilir.

Uygun akiskanlik örnegin lesitin gibi bir kaplaina kullanilarak, dispersiyonlar durumunda gerekli partikül ebadi korunarak ve surfektanlar kullanilarak muhafaza edilebilir. Mikroorganizmalarin tesirinin önlenmesi, çesitli antibakteriyel ve aiitifungal ajanlar örnegin, parabenler, klorobutanol, fenol, sorbik asit, tiinerosal ve benzeri ile gerçeklestirilebilir. Birçok durumda izotoiiik ajanlar, örnegin sekerler, polialkoller örnegin manitol, sorbitol veya sodyum kloridin koinpozisyona dahil edilmesi avantajli olacaktir. Enjekte edilebilir kompozisyonlarin uzun süreli absorpsiyonu, absorpsiyonu geciktirebilen bir ajanin, örnegin alüminyum monostearat ve jelatininkompozisyon içine dahil edilmesi suretiyle saglanabilir.63Steril enjekte edilebilir çözeltiler, saflastirilmis glikoproteinin, gerektigi gibi yukarida siralanan muhteviyatlarin biri veya bunlarin bir kombinasyonu ile uygun bir solvent içine gereken miktarda dahil edilmesi ve ardindan filtre ile sterilize edilmesi suretiyle hazirlanabilir.

Genellikle dispersiyonlar, memeli bir hücre çizgisinden eksprese edilen, saflastirilmis glikoproteinin, bazik bir dispersiyon ortaini ve yukarida sayilanlardan gerekli baska muhteviyatlar ihtiva eden steril bir araç içine dahil edilmesi suretiyle hazirlanir. Steril enjekte edilebilir çözeltilerin preparasyonu için steril tozlar söz konusu oldugunda preparasyon yöntemleri arasinda 'Ömegin vakuinla kurutma ve dondurarak kurutma bulunur; bu da bir aktif muhteviyat tozu arti bunun daha 'Önceden steril filtre edilmis bir çözeltisinden arzu edilen ilave bir muhteviyat verir.Oral koinpozisyonlar genel olarak eyleinsiz bir seyreltici veya yenilebilir bir tasiyici içerir. Oral yoldan terapötik uygulama maksadiyla saflastirilmis glikoprotein, eksipiyanlar ile dahil edilebilir ve tablet, pastil veya kapsül, ömegin jelatiii kapsülleri halinde kullanilabilir. Oral kompozisyonlar ayrica bir gargara suyu olarak kullanilmak üzere bir akiskan tasiyici kullanilarak hazirlanabilir.

Farmasötik açidan uyumlu baglama ajanlari ve/veya adjuvan materyaller, kompozisyonun bir parçasi olarak dahil edilebilir.

Tabletler, haplar, kapsüller, pastiller ve benzeri, asagidaki muhteviyatlardan herhangi birini veya benzer dogada bilesikler ihtiva edebilir: mikrokristalli selüloz, tragakant zainki veya jelatin gibi bir baglayici; nisasta veya laktoz gibi bir eksipiyan; alginik asit, Primogel veya misir nisastasi gibi bir ayristirma ajani; magnezyum stearat veya Sterotes gibi bir yaglayici; kolodyal silikon dioksid gibi birkayganlastirici; sukroz veya sakarin gibi bir tatlandirma ajani veya nane,64metil salisilat veya portakal aromasi gibi bir aroina ajani. Oral yoldan vermeye yönelik formülasyonlar, gastrointestinal sistem içinde stabiliteyi gelistirme ve/veya absorpsiyonu güçlendirme amaçli ajanlar barindirabilir.Inhalasyon yoluyla uygulama için bir memeli hücre çizgisinden eksprese edilen, saflastirilmis bir glikoprotein ve bir verme ajani içeren kompozisyonlar, bir aerosol sprey formunda, uygun bir itici örn., karbon dioksid gibi bir gaz veya bir nebulizer ihtiva eden basinçli bir kap veya dISpenserden avantajli sekilde verilir. Mevcut açiklama, kompozisyonlarin bir nazal sprey, inhaler veya üst ve/ veya alt solunum yoluna baska bir dogrudan verme araci kullanilarak verilmesini özellikle öngörür. Influenza virüslerine yönelik DNA asilarinin intranazal uygulanmasinin, CD8 T hücresi tepkilerini indükledigi gösterilmistir, bu da solunum sistemindeki en azindan bazi hücrelerin, bu yolla verildiginde DNA'yi alabilecegini gösterir ve açiklamaya ait verme ajanlari, hücresel aliini güçlendirecektir. Bazi düzeneklere göre memeli hücre çizgisinden eksprese edilen, saflastirilmis bir glikoprotein ve bir verme ajani içeren kompozisyonlar, aerosol uygulamasi için büyük gözenekli partiküller halinde formüle edilir.

Sistemik uygulama, transmukozal veya transdeimal yollarla da yapilabilir. Transmukozal veya transdermal uygulamada formülasyon içinde nüfuz edilecek bariyer için uygun penetranlar kullanilir. Bu penetranlar genel olarak bu konuda bilinmektedir ve bunlar arasinda örnegin transmukozal uygulama için deterjanlar, safra tuzlari ve fusidik asit türevleri bulunur. Transmukozal uygulama, burun spreyleri veya fitil kullanilarak gerçeklestirilebilir. Transderinal uygulama için saflastirilmis glikoprotein ve verme ajanlari, bu konuda genel olarakbilindigi gibi merhemler, pomatlar, jeller veya kremler halinde formüle65edilir.Koinpozisyonlar ayrica rektal yoldan verine için fitil (örn., kakao yagi ve diger gliseritler gibi geleneksel fitil bazlari ile) veya lavman formunda hazirlanabilir.Bazi düzeneklerde farmasötik kompozisyonlar, istege bagli eksipiyanlar örnegin bir lokal anestetik, bir peptit, bir lipit örnegin katyonik lipitler, bir lipozom veya lipidik partikül, bir polikatyon örnegin polilizin, bir dalli, üç boyutlu polikatyon örnegin bir dendrimer, bir karbohidrat, bir katyonik amfifil, bir deterjan, bir benzilamonyuin surfektan veya hücrelere polinükleotit transferini kolaylastiran bir baska bilesik ihtiva eder. Bu tür kolaylastirici ajanlar arasinda lokal anestetikler bupivakain veya tetrakain (bakiniz ABD Patentleri No. ,593,972; 5,817,637; 5,380,876; 5,981,505 ve 6,383,512 ve Uluslararasi Patent Yayini No. WO98/ 17799) bulunur.Bazi düzeneklerde kompozisyonlar, glikoproteini vücuttan hizli atilmaya karsi koruyacak, bir kontrollü salim formülasyonu, örnegin implantlar ve mikro kapsül haline getirilmis verme sistemleri gibi tasiyicilar ile hazirlanir. Etilen vinil asetat, polianhidridler, poliglikolik asit, kolajen, poliortoesterler ve polilaktik asit gibi biyo-degrade olabilen, biyo-uyumlu polimerler kullanilabilir. Bu tür formülasyonlari hazirlama yöntemleri, bu konuda uzman kisilerce bilinecektir.

Materyaller, Alza Corporation ve Nova Pharinaceuticals, 1nc°den ticari olarak temin edilebilir. Lipozom süspansiyonlari (viral aiitijenlere yönelik monoklonal antikorlara sahip, enfekte olmus hücrelere hedeflenen lipozoinlar dahil) da farmasötik açidan kabul edilebilir tasiyicilar olarak kullanilabilir. Bu süspansiyonlar, bu konuda uzman kisilerce bilinen, örnegin ABD Patenti No. 4,522,8119de tarif edilenyöntemlere göre hazirlanabilir.66Oral veya parenteral kompozisyonlarin, uygulama kolayligi ve dozaj tektipliligi açisindan birim dozaj formunda formüle edilmesi avantajli olabilir. Burada kullanildigi gibi birim dozaj formu, tedavi edilecek süje için üniter dozajlar halinde uygun, fiziksel olarak ayrilmis birimlere karsilik gelir; her birim, gerekli farmasötik tasiyici ile iliskili olarak arzu edilen terap'ötik etkiyi üretmek üzere hesaplaninis, 'Önceden belirlenmis miktarda aktif glikoprotein ihtiva eder.Mevcut açiklamaya göre eksprese edilen bir glikoprotein, çesitli araliklarla ve gerektigi kadar farkli zainan periyotlarinda örn., yaklasik 1 ila 10 hafta arasinda, 2 ila 8 hafta arasinda, yaklasik 3 ila 7 hafta arasinda, yaklasik 4, 5 veya 6 hafta süreyle haftada bir kez, vb. uygulanabilir. Uzman kisiler, bunlarla sinirli olmamakla birlikte hastaligin veya bozuklugun siddeti, `Önceki tedaviler, süjenin genel sagligi ve/veya yasi ve var olan diger hastaliklar dahil bazi faktörlerin, bir süjeyi etkili sekilde tedavi etmek için gerekli dozaji ve zamanlamayi etkileyebilecegini takdir edecektir. Genel olarak bir sü jenin burada tarif edildigi gibi bir glikoprotein ile tedavisi, tek bir tedavi içerebilir veya birçok durumda bir dizi tedavi içerebilir. Uygun dozlarin, glikoproteinin potansina bagli olabilecegi ve istege bagli olarak ilgili aliciya göre 'Örnegin 'Önceden seçilmis arzu edilen bir tepkiye ulasilana kadar dozlarin arttirilarak uygulanmasi yoluyla düzenlenebilecegi anlasilacaktir. Ayrica belirli bir hayvan sü je için spesifik doz düzeyinin, kullanilan spesifik glikoproteinin aktivitesi, süjenin yasi, vücut agirligi, genel sagligi, cinsiyeti ve diyeti, uygulama süresi, uygulama yolu, bosaltiin hizi, ilaç kombinasyonu ve/veya inodüle edilecek aktivitenin veya ekspresyonun derecesi dahil olmak üzere çesitli faktörlere bagli olabilecegi anlasilacaktir.Mevcut açiklama, kompozisyonlarin insan disi hayvanlarin tedavisinde67kullanilmasini içerir. Buna göre uygulama dozlari ve yöntemleri, veterinerlik farmakolojisi ve tibbinin bilinen prensiplerine göre seçilebilir. Ornegin Adams, R. (ed), Veterinary Pharmacology and Therapeulics, 8. baski, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001'de kilavuz bilgiler bulunabilir.Farmasötik kompozisyonlar, uygulama talimatlari ile birlikte bir kap, paket veya dispenser içine konulabilir.Yukaridaki tarif sadece temsilci olarak anlasilacaktir ve sinirlama amaci tasimaz. Bulusun uygulanmasina yönelik alternatif yöntemler ve materyaller ve ayrica ilave uygulamalar, bu konuda uzman kisiler içinaçik olacaktir.ÖrneklerOrnek 1: Ortam FormülasyonlariMevcut açiklama, bulusa ait bir veya daha fazla konsantrasyonda inanganez ihtiva eden kültür ortamlari içinde büyütüleii hücrelerin bir kültürü ile üretilen glikoproteinlerin, hücreler geleneksel ortamlarda büyütülseydi bunlarin sahip olacaklarindan daha kapsamli glikosilasyon sablonlari ihtiva ettikleri bulgusunu kapsar. Manganez, hücre büyümesini destekleyebilen herhangi bir kültür ortamina ilave edilebilir. Manganezin bulusa ait konsantrasyonlardan biri dahilinde ilave edilebildigi örnek kültür ortamlari Tablo 1'de siralanmis olmakla birlikte mevcut bulus, bu kültür ortainlarinin kullanilmasi ile sinirli degildir. Bu konuda siradan bilgiye sahip kisilerce anlasilacagi gibi hücreleri büyütmek için baska kültür ortamlari kullanilabilir ve/Veya Tablo 1'de siralanan örnek kültür ortamlarinin kompozisyonlariüzerinde bazi degisiklikler yapilabilir. 68Tablo 1. Ornek kültür ortamlari. Ortam A Ortam B Ortam C Ortam D Ortam E Amino Asitler mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM alanin 96.03 1.08 24.87 0.28 17.80 0.20 24.87 0.28 arginin 1186.99 6.82 42343 243 347.97 2.00 84.00 0.40 423.43 2.43 asparagin°H20 713.59 4.76 17390 116 75.00 0.50 173.90 1.16 aspartik asit 318.53 2.39 52.72 0.40 26.20 0.20 52.72 0.40 sisteiiiil-IO'HZO 70.01 0.40 70.01 0.40 70.19 0.40 35.10 0.20 70.01 0.40 sistein-ZHCI 297.09 0.95 62.09 0.20 62.25 0.20 62.09 0.20 glutamik asit 29.40 0.20 41.08 0.28monosodyum glutamat 158.59 1.08 41.08 0.28glutamin 1892.40 12.96 1162.40 7.96 1 163.95 7.97 584.60 4.00 1162 7.96 glisin 95.88 1.28 35.92 0.48 30.00 0.40 30.00 0.40 35.92 0.48 -histidiii-HCl'l-lgO 369.10 1.76 75.27 0.36 46.00 0.22 42.00 0.20 75.27 0.36 Izolösin 623.63 4.76 151.90 116 104.99 080 104.80 0.80 151.90 1.16 Lösin 85231 651 172.69 132 104.99 080 104.80 0.80 172.69 1.32 lizin-HCI 945.96 5.20 218.38 1.20 145.99 0.80 146.20 0.80 218.38 1.20 Metiyonin 291,82 1.96 53.55 0.36 29.80 0.20 30.00 0.20 53.55 0.36 Fenilalanin 428.62 2.60 98.81 0.60 65.99 0.40 66.00 0.40 98.81 0.60 Prolin 372.25 3.24 96.40 0.84 68.99 0.60 96.40 0.84 Serin 904.71 8.62 273.07 260 126.00 1.20 273.07 2.60 Treonin 513.39 4.31 132.81 1.12 94.99 0.80 95.20 0.80 132.81 1.12 Triptofan 159.32 0.78 28.99 0.14 16.00 0.08 16.00 0.08 28.99 0.14 tirosin-2Na-2H20 560,81 2.15 145.10 0.56 103.79 0.40 89.46 0.40 145.10 0.56 69 Valiii 505.36 4.32 131.17 1.12 93.99 0.80 93.60 0.80 131.17 1.12 Vitaminler mg/L uM mg/L pM mg/L pM mg/L uM mg/L ;iM Biyotiii 2.00 8.21 0.36 1.49 0.20 0.821 0.36 1.49 kalsiyum paiitotenat 22.02 46.27 4.03 8.47 2.24 4.71 4.00 8.40 4.03 8.47 koliii klorid 87.67 630.74 16.11 115.92 8.99 64.31 4.00 28.60 16.11 115.92 folik asit 25.95 58.84 4.76 10.80 2.65 6.01 4.00 9.10 4.76 10.80 Inosito] 123.39 685.47 22.64 125.79 12.60 70.00 7.00 38.90 22.64 125.79 nikotinamid 19.60 160.70 3.61 29.62 2.02 16.56 4.00 32.80 3.61 29.62 piridoksa1°HCI 1.99 9.83 1.99 9.83 2.00 9.89 4.00 19.60 1.99 9.83 piridoksin°HCI 18.06 87.67 1.67 8.10 0.03 0.15 1.67 8.10 riboflavin 2.20 5.85 0.40 1.06 0.22 0.58 0.40 1.10 0.40 1.06 tiyamin-HCI 21.51 63.84 3.92 11.64 2.17 6.44 4.00 11.90 3.92 11.64 vitamin BIZ 6.93 5.12 1.34 0.99 0.78 0.58 1.34 0.99 Inorganik Tuzlar mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM CaCIz 115.78 1.04 115.78 1.04 116.1 1.046 200.0 1.80 115.78 1.04 KCI 310.94 4.17 310,94 4.17 311.8 4.179 400.0 5.40 310.94 4.17 NaZHPO4 70.81 0.50 70.81 0.50 71.0 0.500 70.81 0.50 NaCl 110496 1892 370496 63.44 55390 94846 64000 11030 3704 63.44 NaHzPO4-H20 636.33 46] 114.53 0.83 625 0.453 140.0 0.91 114.33 0.83 MgSO. 48.70 0.41 48.70 041 48.8 0407 48.70 0.41 MgSO4-7H20 95.00 0.39 8.60 0.03 200.0 0.80 8.60 0.03 MgC12 28.53 0.30 28.53 0.30 28.6 0.301 28.53 0.30 NaHC03 2000.00 23.81 1220.00 14.52 24400 29.044 37000 44.00 2440 29.04 70 Eser Elementler ug/L nM ug/L nM ug/L nM pg/L nM pg/L nM Sodyum Selenit 28.00 161.94 7.00 40.49 0005 29.0 7.00 40.49 Fe(N03)3-9HZO 49.86 12342 49.86 123.42 0.050 124 0.10 250 49.86 123.42CuSO4 2.69 16.80 0.97 6.06 0.001 5.0 0.97 6.06 CuSO4-5HZO 11.24 45.00 7.49 30.00 7.49 30.00 FeSO4°7H20 2503.85 900664 1542 5549 0.84 3.021 1542 5549 ZnSO4-7H20 273477 952882 1383 4821 0.430 1498 1383 4821 MnSO4-HZO 0.26 1.51 0.17 1.01 0.17 1.01NaZSi03'9H20 210.00 739.27 140 492.84 140.00 492.84 (NH4)6M07OZ4'4HZO 1.86 1.50 1.24 1.00 1.24 1.00 N1-14VO3 0.98 8.33 0.65 5.56 0.65 5.56 NiSO4~6H20 0.20 0.74 0.13 0.49 0.13 0.49 SnC12°2HzO 0.18 0.80 0.12 0.53 0.12 053 Diger Bilesenler mg/L pM mg/L ;IM mg/L pM mg/L uM mg/L uM Hidrokortizoii 0.23 0.64 .0864 .24 0.036 0.0001 0.09 0.24 Putresin'ZHCI 6.48 40.22 2.48 15,39 1.080 0.0067 2.48 15.39 linoleik asit 0.22 0.80 0.057 0.20 0.040 0.0001 0.06 0.20 tiyoktik asit 0.56 2.73 0.14 0.69 0.100 0.0005 0.14 0.69 D-glukoz (Dekstroz) 16039 89107 1 1042.24 61350 89507 497 45000 25000 1 1042 61345 PVA 2560 2520.00 24000 24000 2520 0.00 Nusellin 54.00 14.00 10.000 10.00 14.00 0.00 Sodyum Piruvat 54.85 498.63 54.85 500 54.995 500 110.0 1000 54.85 498.63 71Bazi düzeneklerde ilk kültür bir veya daha fazla besleme ortami ile basladiktan sonra hücreler bir veya daha fazla kez desteklenir. Ornek besleme ortamlari Tablo 2'de siralanmakla birlikte mevcut bulus, bu besleme ortainlarinin kullanilmasi ile sinirli degildir. Bu konuda siradan bilgiye sahip kisilerce anlasilacagi gibi hücreleri büyütmek için baska besleme ortamlari kullanilabilir ve/Veya Tablo 2'de siralanan öniek besleme ortamlarinin kompozisyonlari üzerinde bazi degisiklikler yapilabilir. Örnegin bu besleme ortainlarinin bir veya daha fazla bileseninin konsantrasyonlari, bu bilesenlerin arzu edilen konsantrasyonuna ulasmak için arttirilabilir veya azaltilabilir. Bazi düzeneklerde her besleme ortami bileseninin konsantrasyonu ayni faktör kadar arttirilir veya azaltilir. Örnegin her besleme ortami bileseninin konsantrasyonu, 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 11x, 12X, 13x, 14X, 15x, 16x, 17x, 18X, 19x, 20x, 25x, 30x, 35x, 40x, 45X,50X veya daha fazla arttirilabilir veya azaltilabilir. 72Tablo 2. Ornek besleme ortamlari. Ortam F Ortam G Ortam H Ortam I Ortam J Amino Asitler mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM alanin 17.81 020 213.72 2.40 27.47 0.31 142.47 1.60 142.48 1.60 arginin 19107 110 229284 13.20 107421 6.17 1528.84 8.79 1528 8.79 asparagin'HZO 270.05 180 3240.60 21.60 320000 21.33 1080.60 7.20 1080 7.20 aspartik asit 66.66 050 799.92 6.00 338.70 2.55 532.40 4.00 532.40 4.00 sistein'HClil-lzO 0.00 0.00 0.00 0.00 10866 062 473.00 1.51 sistein-ZHCI 48.83 0.16 58596 1.92 687.50 2.20 470 1.50 235.38 1.60 glutamik asit 29.47 0.20 353.64 2.40 235.38 1.60 142.48 1.60 monosodyum glutamat 52.17 0.31glutamin 456.25 313 5475.00 37.56 6000 41.10 4820 33.01 glisin 15.01 020 180.12 2.40 178.26 2.38 120.07 1.60 120.07 1.60 histidiirHCl'HZO 73.53 0.35 88236 420 732.50 3.49 58833 2.80 588.32 2.80 Izolösin 118.05 090 1416.60 10.80 880.87 6.72 944.52 7.21 944.52 7.21 Lösin 170.07 1.30 204084 15.60 1590.79 12.14 1360.75 10.39 1360 10.39 liziii-HCI 182.07 100 2184.84 12.00 216293 11.88 1456.81 8.00 1456 8.00 metiyonin 59.62 040 715.44 4.80 59792 4.01 477.06 3.20 477.06 3.20 fenilalanin 82.53 050 990.36 6.00 782.51 4.74 660.36 4.00 66036 . .4.00 prolin 69.03 0.60 82836 7.20 83267 7.24 55231 4.80 552.31 4.80 serin 158.06 1.51 1896.72 18.12 162367 15.46 1264.70 12.04 1264 12.04 treoniii 95.24 0.80 1142.88 9.60 871.72 733 762.02 6.40 762.02 6.40 triptofan 32.61 0. 16 391,32 1.92 423.14 2.07 260.94 1.28 260.94 1.28 73 1ir0sin-2Na-2H20 104.26 0.40 1251.12 4.80 1100.00 4.21 832.62 3.19 832.62 3.19 Valin 93.64 080 1123.68 9.60 1156.01 9.88 749.21 6.40 749.21 6.40 Vitaminler mg/L pM mg/L pM mg/L piM mg/L iiM mg/L ;IM Biyotin 17.81 73.00 4.92 20.16 4.14 16.96 3.28 13.44 3.28 0.01 kalsiyum pantotenat 191.07 401.41 54.00 113.52 33.84 71.14 36.02 75.67 36.02 0.08 k01in klorid 270.05 1943 214.92 1545 244.57 1759 143.28 1030 143.28 1.03 folik asit 66.66 151.27 63.72 144.60 40.02 90.86 42.43 96.21 42.43 0.10 Inositol 30252 1680 25309 1406 201.71 1120. 201.71 1.12 nikotinamîd 48.83 400.41 48.00 393.60 40.48 331.93 32.018 26244 32.02 0.26 piridoksa1°HCl 29.47 145.17 3.13 15.42 piridoksin'HCl 456.25 2215 49.20 238.92 55.76 207.68 32.82 159.32 32.82 0.16 rib0f1avin 15.01 39.92 5.40 14.40 3.73 9.92 3.60 9.57 3.60 0.01 tiyamin-HCI 73.53 21819 92.88 275.40 . 100.86 299.28 35.22 104.51 35.22 0.10 vitamin B12 118.05 87.12 16.80 12.36 32.67 24.11 11.21 8.27 11.21 0.01 Inorganik Tuzlar mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM CaCIz 1799 1.62 113.27 1.02 KCI 4829 6.47 KH2P04 1640 12.06 1635 12.02 NazHPO4 87.4 0.62 NaC1 NaHZPO4.'H20 130.50 095 1566.00 11.40 14968 10.85 MgSO4 2130 1.77 MgSO4.°71-IZO 21.50 009 258.00 1.08 170 0.690 17198 070 74 MgCIz 440 0.46 NaHC03 Eser Elementler pg/L nM ;Lg/L nM ug/L nM iig/L nM ;lg/L nM Sodyum Selenit 5.00 28.92 60.00 34704 0.069 0.400 40 231.35 40.00 231.35 Fe(N03)3'91~120 0.077 0.191 CuSO4 0.43 2.69 5.16 32.28 0.016 0.099 3.44 21.51 3.44 21.51 CuSO4.°5H20 1.54 6.19 18.48 74.28 0.025 0.100 7.49 30.00 7.49 30.00 FeSO4.-7HZO 571.64 2056 6859 24675 7.000 25.180 2534 9115 2534 9115 ZriSO4.°7HZO 408.08 1421 4896 17062 4.075 14.199 2704 9421 2704 9421 MnSO4-H20 0.10 0.57 1.20 6.84 0.17 1.01 0.17 1.01 NaZSiO3-9HZO 78.75 277.22 945.00 3326 140 492.84 140 492.84 (NH4)(,9M07024 °4H20 0.70 0.56 8.40 . 6.72 1.24 1.00 1.24 1.00 NH4VO3 0.37 3.13 4.44 37.56 0.65 5.56 0.65 5.56 NiSOi, '61-120 0.07 0.28 0.84 3.36 0.13 0.49 0.13 0.49 SnCIz '21-120 0.07 0.30 0.84 3.60 0.12 0.53 0.12 0.53 AICIJ '6H20 1.2 4.97 1.20 4.97 AgNO, 0.17 1.00 0.17 1.00 Ba(C2H302)2 2.55 9.98 2.55 9.98 KBr 0.12 1.01 0.12 1.01 CdCIz -2.5H20 2.28 9.99 2.28 9.99 CoCIZ '61-120 2.38 10.00 2.38 10.00 CrC13 0.32 2.02 0.32 2.02 NaF 4.2 10002 4.20 100.02 0602 0.53 5.07 0.53 5.07 75 K1 0.17 1.02 0.17 1.02 RbCI 1.21 10.01 1.21 10.01 ZrOCIZ-SHZO 3.22 9.99 3.22 9.99 Diger Bilesenler mg/L pM mg/L pM mg/L pM mg/L pM mg/L uM Hidrokortizon 0.04 0.10 0.48 1.20 0.288 0.794 0.288 0.79 Putresin°2HCl 1.00 6.21 12.00 74.52 8 49.66 8 49.66 linoleik asit 0,04 0.15 0.48 1.80 0.336 1.20 0.336 1.20 tiyoktik asit 0.11 0.51 1.32 6.12 0.841 4.08 0.841 4.08 D-glukoz (Dekstroz) 419414 2330080 50329 279609 43005 238922 33005 183.37 PVA 200.00 2400 2400 2400 Nusellin 10.00 120.00 80 80.00 Sodyum Piruvat 76Ornek 2: rFIX Peptit Haritalandirmasinin Küçük Ölçekli ArastirmasiGiris: Rekombinant insan kani pihtilasma Faktörü IX ("rFIX") dökme ilaç maddesinin ("BDS") üretilmesi sirasinda peptit haritasi dahilindeki K4 peptitinin nispi pik alani oraninda ("RPAR") partiden partiye bir farklilik gözlendi. Ornekler, Achromobacter lyticus'tan lizil endopeptidaz ("AchroK", Wako katalog #129-02541) ile sindirim ve ardindan ters fazli HPLC ile yeniden çözülme suretiyle hazirlandi. K4 peptitinin RPAR'si, bazi partilerde referans inateryalden kontrol örneginin %82'lik alt sinirinin altina düstü ve kontrol örneginin %78'lik minimumuna ulasti. Materyal bakiyesi, K4' pikinde bulundu. Iki pik arasindaki farklilik tamamen Ser-61'de glikosilasyon derecesine bagliydi. K4 türü, serine baglanmis bir Sia-oiZß-Gal-ß l ,4-GlcNAc-ßl ,3-Fuc-0il -O tetrasakaritine sahipken orantili olarak artan K4' türü sadece fukoza sahipti.Tain ölçekli bir hücre kültürü deneyi, peptit haritasi farkliliklarinin meydana geldigi bir periyot içinde çalistirildi. Hücreler, FeSO4 CuSO4 ve kolin klorid ile sirasiyla 2X, 7)( ve 2X'e desteklenmis bir hücre kültürü ortami içinde büyütüldü. Deney partilerinin küçük ölçekli saflastirilmasi ile üretilen BDS, gelistirilmis K4 RPAR gösterdi, ancak ayni sekilde saflastirilmis kontrol materyali göstermedi. BDS partileri, peptit haritasi gerekliliklerinden geçti (2 kontrol örneginin %82'si), bununla birlikte referans materyalde görülen düzeye ulasmadi. Bu, RPAR haritalarinda gözlemlenen farkin, hücre kültürü prosesinin sonucu oldugunu ve bir besin eksikligi ile iliskili olabilecegini gösterdi.

Proses içi Ornek Analizleri: Hücreler, hücre kültürü ortamindan mikro-filtreleme ("MF") ve ultra-filtreleme/diya-filtreleme ("UF/DF")adimlari ile çikarildi ve tek tek biyo-reaktörlerden analiz için uygun,77oldukça saf bir materyal elde edildi.K4 türünün hücreden salgilandiktan sonra K4' (sadece fukoz) türüne geri degrade olup olinadigini arastirmak için modifiye edilmis bir analiz, UF/DF retentatindan gelen bir proses içi örnek üzerinde yapildi.

Büyük bir retentat örnegi, üç esit parçaya bölündü. Biri hemen küçük ölçekli bir yakalama kolonu üzerinde saflastirildi; bu, negatif kontrol görevi gördü. Diger ikisinin her biri bir gece süreyle 37°C'de inkübe edildikten sonra benzer bir sekilde saflastirildi. Bir gecelik parçalardan birine, sialik asidin baska bir glikosidazin aktivitesini bloke etme olasiligina karsi K4 türünden terminal sialik asidi çikartmak ainaciyla sialidaz ilave edildi. Küçük ölçekli saflastirmadan sonra üç örnegin tamami, yukaridaki gibi K4 türü açisindan analiz edildi. Sekil 1, sialidaz tarafindan katalizörlük edilenin ötesinde hiçbir örnekte degradasyon olmadigini gösterir. Bu, peptit haritasi probleminin anabolik olduguna dair çok güzlü bir belirtiydi, bunun anlaini ise Ser-6l'deki "eksik" seker tortularinin yeni dogan zincire asla ilave edilmemesiydi. Son derece düsük olasilik olinakla birlikte bu seker tortularinin çikarilinasindan soruinlu glikosidik aktivitenin MF ve UF/DF adimlari ile eylemsizlestirilmis veya çikarilmis olmasi hala olasiydi. Sonuçlar ayrica Q Sefaroz adiminin yukari akisindan gelen örneklerin analiz edilmesinde küçük ölçekli saflastirma sisteininin faydasini gösterdi.Küçük ölçekli modelleme: Çalkalama siselerinde büyütülen küçük ölçekli rFlX kültürleri, çesitli ortamlarin ve katki maddelerinin K4 türleri üzerindeki etkilerini degerlendirinek için bir model olarak kullanildi. Her durumda çalkalama siselerinden gelen kosullandirilmis ortam, hacim bazli pik koleksiyon kullanilarak küçük ölçekli biryakalama kolonu üzerinde direkt olarak (UF/DF olmadan) saflastirildi78ve örnek içindeki K4 dagilimi belirlendi.Küçük ölçekli modelin faydasi, tam ölçekli deney ile ayni katki maddeleri kullanilarak gösterildi. Manganez ilaveleri de analiz edildi, çünkü bir literatür arastirmasi, Mn+_'nin bir meyve sinegi enziminin benzer glikosilasyon aktivitesi için gerekli oldugunu gösterdi (bakiniz Moloney ve arkadaslari, J. Biol. Chem. 275(13): 9604-9611, 2000; Bruckner ve arkadaslari, Nature 406: 411-415, 2000). Çalkalama siselerinde dört geçis üzerinde karsilastirmalar yapildi ve sonuçlar Sekil 2'de gösterildi. Her örnek için iki tekrarli enjeksiyon gösterilir.

"P#", her durumun geçis numarasini gösterir. Pl-2 için Mn konsantrasyonu l nM; P3-4 için 10 nM idi. Kontrol ve desteklenmis ortamda K4 türü dagilimlari arasindaki fark, üretim biyo-reaktörlerinde görülen farka denkti. Farkliliklar, tek bir geçis sonrasi ortaya konur ve çoklu geçisler herhangi bir trend sergilemedi.Katki maddeleri üç bilesen (FeSO4, CuSO4 ve kolin klorid) içerdiginden bir sonraki deney, gelistirilmis K4 türü dagilimindan bu bilesenlerin hangisinin sorumlu oldugunu ele aldi. Uç bilesen, üç rFIX çalkalama sisesi kültürüne ilave edildi. Bilesenler, sinerjistik etkileri ortaya çikarmak için çiftler halinde ilave edildi. Diger kültürler, pozitif (üç bilesenin tamami) ve negatif (katki maddesi yok) kontrol içeriyordu.Sekil 3, FeSO4'ün K4 türü dagiliminin gelistirilmesine yardiinci olinaktan sorumlu oldugunu gösterir. Her örnek için iki tekrarli enjeksiyon gösterilir. Ilaveler, deney konsantrasyonlarinda yapildi.

FeSO4 yoklugunda CuSO4 ve kolin klorid ilavesinin dagilimi daha da kötülestirebildigi görülür. Bilinmeyen nedenle K ' 'ün de-sialile edilmis formunun, hem test örneklerinde hem de deney referansindadaha yüksek bollukla ortaya çikmaya basladigi belirtilmelidir. Bu trend,79Sekil 3'te belirgindin ve takip eden deneylerde devain eder.Ortam tozunun demir içeriginin indüktif sekilde birlestirilmis plazma spektroskopi ("ICP") analizi, toz içinde uygun miktarda demir bulundugunu gösterdi. Bu, ilave edilen FeSO4'ten saglanan faydaya gerçekte bu ham materyalin bir eser kirleticisinin neden oldugu varsayimina yol açti. Orijinal ortam kosullarinda kullanilan FeSO4 partisi, ICP analizi ile analiz edildi ve birçok eser katisik, saptama liinitinin üzerindeki düzeylerde ortaya çikti. rFlX hücre kültürü ortaininin bilinen inhibitörleri ve bilesenleri elimine edilerek liste, potansiyel olarak faydali su dokuz eleinente kadar daraltildi: Sb, Bi, B, Co, Ge, Mn, Mo, Ni ve V.Daha sonra orijinal ortam katki maddelerini tamamlayabilecek diger olasi katki maddelerini kesfetmek için küçük ölçekli modelleme deneyleri yapildi. Ilave CuSO4, ZnSO4 ve MnSO4 (10 nM'ye kadar) test edildi. ZnSO4 dahil edildi çünkü çinko, diger divalent katyonlarin alimini tamamen inhibe edebilir. Bilinmeyen nedeiilerde koiitrol ve deney kosullari, kontrol kosullari için daha önce gözleinleiiinis olanlara daha fazla benzeyen, çok benzer K4 türü dagilimlari verdi (bakiiiiz Sekil 4, her örnek için iki tekrarli enjeksiyonlar gösterilir). Bununla birlikte deney kosuluna MnSO4 ilavesi, K4 türü dagiliinini açikça gelistirdi. Ilave edilen ZnSO4'ün K4 türü dagilimiiii kötülestirebilecegi görülür, ancak bu farkin anlaini belirgin degildir.De-sialile edilmis K4' piki düzeyinde bir artisin Sekil 3'te gözleinlendigi yukarida belirtilmisti. Bu olgu devam etti ve tarif edilen küçük ölçekli çalisinalarin seyri boyunca yukari trend gösterdi. Bu trend, sunulan sonuçlarin yoruinunu degistirinedi.Sonuç: Proses içi ve küçük ölçekli yakalama kolonu elüatlarininkapsamli testi, ortam tozundaki bir farkliligin K4 RPAR'da kaymaya80neden olduguna, bunun da çoklu peptit haritasi farkliliklarina yol açtigina dair güçlü bir kanit sagladi. Bazi bilesenlerin hücre kültürü ortamina ilave edilmesi, bu kaymayi kisinen tersine çevirdiginden olasilikla ortam tozundaki fark, bir veya daha fazla bilesenin daha düsük düzeylere kayma yapmasidir. Kesfedilen en etkili katki maddesi FeSO4 oldugundan ve ICP analizi, ortam tozunun uygun miktarda Fe ihtiva ettigini gösterdiginden FeSO4 içindeki bir eser katisigin Ser-61'de düzgün glikosilasyon için gerekli oldugu varsayiminda bulunuldu. FeSO4'ün ICP analizine dayanarak eser katisik, ortam tozunuii belirtilen bir bileseni degildi, bunun yerine ortam içinde herzaman daha önceden bulunan istem disi bir besindi.Ornek 3: Ortam Katki Maddelerinin rFIX Peptit Haritasi Uzerindeki Etkisine Dair Küçük Ölçekli ÇalismalarGiris: Örnek 2, Ser-Öl'deki glikosilasyon derecesinde partiden partiye farklarin çesitli rFIX partilerinde gözlendigini, bunun da K4 peptit popülasyonu dagiliminda bir kayma olarak görüldügünü gösterdi. Tüin rFIX partileri, tam uzunlukta tetrasakarit (Sia-aZ,3-Gal-ßl ,4-GlcNAc-ßl,3-Fuc-oil) ile tanimlanan bu sahada bir zincir uzunlugu dagiliinina sahiptir, ancak bazi partiler, olagan disi yüksek bir sadece fukoz formu fraksiyonuna sahipti.Ornek 2 ayrica K4 dagilimindaki kaymanin biyo-reaktörde meydana geldigini ve ortam tozundaki bir parti degisimi ile yakindan baglantili oldugunu gösterdi. Ornek 2'nin sonuçlari, glikoform dagilimindaki degisimin, katabolik degil anabolik bir fonksiyon oldugu hipotezine güçlü bir destek sagladi. Ek olarak bu deneyler, destekleyici FeSO4'ün kaymayi kismen geri çevirebilecegini gösterdi, ancak ICP analizi,ortam tozu partileri arasinda FeSO4 konsantrasyonunda anlamli bir81farkin olmadigini gösterdi. Bu nedenle farkli ortam tozu partilerinde degisen düzeylerde bulunan, baska bir tanimlanmamis FeSO4 eser bileseninin bu kaymadan sorumlu oldugu varsayiminda bulunuldu.

Ilave Etkiler: Ornek 2'de tartisildigi gibi ICP analizi, deney kültür kosullari için kullanilan FeSO4 partisinde ölçülebilir miktarlarda dokuz eser element gösterdi. Bu eser elementlerin yayinlanmis ortam formülasyonlari ile karsilastirilmasi, Sb veya Bi ekleme ihtiyacini ortadan kaldirdi. Ortam formülasyonlarina ve F eSO4'ün [CP analizine dayanarak bes bilesikten olusan bir karisim rFIX kültürlerine ilave edilmek üzere yaratildi (nihai ortam konsantrasyonlari verilmistir): 1 nM (NH4)6M07024, lO nM CoCIz, 5.5 nM NH4VO3, 1.5 nM NiSO4 ve nM H3BO3. MnSO4 ayrica ilave edildi çünkü daha önceki bir literatür incelemesi, manganezin glikosiltransferaz aktivitesi için önemli olabilecegini göstermisti (bakiniz Breton ve Iinberty, Curr.

Opinion in Structural Biol. 9: 563-571, 1999; Bruckner ve arkadaslari, Nature 406: 411-415, 2000). Ayni deneyde ilave FeSO4 (2X veya 4X), nispi tetrasakarit miktarini daha da arttirip arttiramayacagini belirlemek için test edildi. Her durumda katkilar, Ornek 2'de tarif edilen desteklere ilave olarak kullanildi.Bu ilave deneyinin sonuçlari Sekil 5'te gösterilmektedir. Tür dagilimlari belirlendi ve bildirilen degerler, dört K4 pikinin her birinin alaninin bunlarin toplamlarina oranidir. Sekil ayrica bir referans materyal, kontrol (katki yok) ve desteklenmis (Ornek 2'deki gibi) kültürlerini gösterir. Her örnek için iki tekrarli enjeksiyon gösterilir.

Her kolon setinde en soldaki kolon, Ser-6l'de bir tetrasakarite sahip moleküllerin fraksiyonuna karsilik gelirken en sagdaki kolon, sadece fukozlu olan fraksiyondur. Pozitif ve negatif kontrol kültürleri(sirasiyla desteklenmis ve destekleninemis) arasinda gözlemlenen fark,82daha önce görülenden daha küçüktü. Yine de Sekil 5, eser elementlerin karisiminin K4 türü dagiliini üzerinde hiçbir etkiye sahip olmadigini, buna karsilik FeSO4 ve MnSO4 ilavesinin K4 türü dagilimini gelistirdigini açikta gösterir. Desteklere ilave edildiginde 15 nM MnSO4, K4 türü dagiliini üzerinde ilave 12 uM FeSO4 ile yaklasik olarak ayni etkiye sahipti.Manganeze verilen güçlü tepki, deneylerin, rFIX hücre kültürü ortami içinde manganez için optimum konsantrasyonu bulmaya yönelik tasarlanmasina yol açti. Sekil 6, bu deneyin, Sekil 5'te gösterilenlerle tutarli sonuçlar verdigini gösterir, çünkü ilave manganeze sahip kültürlerin tamaini, desteklenmis veya kontrol kültüründen daha az sadece fukozlu K4'e sahipti. Gerçekte 40 nM veya daha fazla manganeze sahip kültürler, deney referans materyali ile yaklasik olarak ayni miktarda sadece fukozlu K4'e sahipti. Bununla birlikte 100 veya 500 nM'de 40 nM manganezden daha fazla trisakarit olacagi görüldü.

Böylelikle 40 nM'nin Ser-6l'de daha kapsamli FIX glikosilasyonu için beklenmedik derecede avantajli bir manganez konsantrasyonu oldugu belirlendi.Küçük Ölçekli Modelin Faydasi: Bu küçük ölçekli deneylerin ve Ornek 2'de sunulanlarin olagandisi bir özelligi, trisakarit veya de-siale edilmis tür düzeylerinin deneyden deneye farklilik göstermesiydi. Bu tür, deney referansina benzer sekilde farklilik gösterdiginden bunun, tek potali sindirme yönteminin bir kusuru olduguna inanildi. Verilen bir deney için tüm örnekler, ayni hammadde kullanilarak ayni zamanda sindirildiginden bu degiskenligin, bu Ornekte veya Ornek 2'de sunulan analizleri etkiledigine inanilmadi.Sonuç: Bu deneyler, 40 nM MnSO4'ün rFIX hücre kültürü ortaminailavesinin, K4 türü dagilimini gelistirdigini gösterdi. 83Referans Ornegi 4: Anti-ABeta Kültür Ortami Orneklerinin N Bagli Oligosakarit AnaliziGiris: Insanlastirilmis bir anti-ABeta peptiti IgGl monoklonal antikorunu ("anti-ABeta hücreleri") eksprese eden CHO hücrelerinin N bagli oligosakarit parmak izleri, dört ortam kosulu altinda arastirildi.Ornek tanimlamalari ve ilgili bilgiler, Tablo 3”te siralanmistir.Tablo 3. Çesitli kültür kosullarindan toplanmis anti-ABeta örnekleri Ornek [D1siKosulGlnEser EHacim (mL)GünKonsantrasyon 1YüksekHayir1143 .06 mg/mL Eser EYüksekEvet1144.61 mg/mL #WMDüsük Gln (4mM) Eser EDüsükEvet1144.44 mg/mL Düsük Gln (4mM) 2g/L Glu Düsük Hayir 1 14 4.14 mg/mL Prosedür: Anti-ABeta kültürü 1 büyütüldü ve besleme ortami ile periyodik olarak beslendi. Anti-ABeta kültürü 2'de Eser Elementler E, basta ilave edildi. Tablo 4, Eser Elementler E'nin kompozisyonunu gösterir. Anti-ABeta kültürü 3, baslangiç glutamin düzeyinin 4 mM olmasi haricinde kültür 2'yle ayni kosullarda büyütüldü. Anti-ABeta kültürü 4, Eser E'nin ilave edilmemesi ve besleme ortaminin glutamat ile 2 g/L'ye kadar desteklenmesi haricinde kültür 3 ile ayni kosullarda büyütüldü.Her örnegin glikoform dagilimlari, PNGaz F sindirimi, ardindan Yüksek pH'li Anyonik Degistirme Kromatografisi ile Pulslu Elektrokimyasal Saptama (HPAEC-PED) analizi ile belirlendi. Kisaca örneklerin tamponu, 50 mM amonyum formiata degistirildi, pH 7.3'te Amicon Ultra 30,000 MWCO protein konsantre ediciler kullanilarak tamponlandi. Geri kazanimdan sonra her örnek, 5 aL PNGaZ F(gliserolsüz) ile sindirildi ve bir gece süreyle 37°C'de inkübe edildi.84Örnekler daha sonra hizli vakumlu santrifuj yoluyla kurutuldu ve saflastirilmis su içinde yeniden olusturuldu. Örnekler daha sonra HPAEC-PED analizi için oto örnekleyici siselerine aktarildi.

HPAEC-PED sistemi, bir Dionex CarboPac PA100 korumasi ve analitik kolon (2x250 mm) ve bir ED-40 dedektör ile donatildi. Iki elüent içeren lineer bir sodyum asetat gradyani kullanildi: Elüent A, lOOmM NaOH'den olusur ve Elüent B, 100 mM NaOH/ 500 mMsodyum asetattan olusur.Tablo 4. Eser Elementler E'nin Kompozisyonu. Eser Elementler E [lg/L nM (NH4)6M07024.4H20 123.60 100.00 AICI3.6H20 0.48 2.00 H3BO3 6.18 100.00 CrCI3 7.92 50.00 CuSO4.5HZO 49.94 200.00 GeOz 0.2l 2.00 KBr 0.24 2.00 K1 16.60 100.00 LiCl 0.08 2.00 MnSO4.HZO 16.90 100.00 NaZSi03.9H20 142.03 500.00 NaF 0.08 2.00 NH4VO3 1.17' 10.00 NiSO4.6H20 2.63 10.00 RbCl 0.24 2.00 SnC12.2H20 0.45 2.00 Sodyum Selenit 34.58 200.00 85Veri Analizi: Anti-ABeta antikoru ile birlestirilmis üç tip kompleks N bagli iki antenli glikan, dis N bagli iki antenli kollari üzerinde sifir ("GO"), bir ("Gl") veya iki (G2") galaktoz tortusu ihtiva eder. Tüin örnekler, GO, Gl ve G2 glikoformlarinin temsilcisi üç pikin varligini gösterdi. Sekil 7, her örnegin GO, Gl ve GZ HPAEC-PED piklerine ait toplam pik alaiii yüzdesinin grafiksel bir karsilastirmasini gösterir.

Ilave küçük piklerin varligi, sunulan tüm örneklerin profillerinde gözlendi. Gözlemlenen pikler, düsük düzeylerde mono- ve di-sialile edilmis glikoformlari temsil eder.Tartisma: Bu deneyler, çesitli deney kosullari altinda besleme ortami ile desteklenmis anti-ABeta kültürlerinin G02G'12G2 piklerinin nispi dagilimini test etti. Eser Elementler E'nin ilave edildigi kültürler, Eser Elementler E'yi içermeyen kültür kosullarina göre GO düzeylerinde bir düsme ile birlikte G] ve G2 düzeylerinde buna karsilik bir artis gösterdi (Sekil 7). Düsük glutamin ihtiva eden kültür kosullari, benzer bir etkiye sahipti ve etkiler toplainsaldi. Eser Elementler E'nin ilave edildigi düsük glutaminli (4 mM) kültürler, N bagli glikoformlarin dagiliminda dramatik bir kayma ile birlikte toplam pik alaninin yaklasik %lO'unu temsil eden G2 ve hemen hemen esit oranlarda GO ve Gl gösterdi (Sekil 7). Eser Elementler E'nin ilave edildigi kültürler, 156 nM konsantrasyonda manganez ihtiva ediyordu. Bununla birlikte kültürlerin ayrica yükselmis düzeylerde baska metaller ihtiva ettigi de belirtilinelidir. Bu nedenle manganeze ek olarak diger kültür kosullarinin da gözlemlenen gelistirilmis glikosilasyon sablonuna katkida bulunnius olmasi olasidir.Sonuç: Anti-ABeta örneklerinde gözlemlenen glikosilasyon dagilimlarindaki farklar büyük olasilikla kültür kosullarindaki ilgilidegisimlere baglidir. Verilerimiz, düsük glutamin (4 mM) varliginin86ve/veya 100 mM MnSO4 ihtiva eden Eser Element E ilavesinin, anti-ABeta'da çesitli N bagli glikoformlarin dagilim yüzdesinde dramatik bir degisim ile sonuçlandigini güçlü sekilde ileri sürer. Buetkiler, bagimsiz ve toplamsal görünür.Referans Ornegi 5: Anti-ABeta Manganez Çalismasi Orneklerinin N Bagli Oligosakarit AnaliziGiris: Ornek 4, anti-ABeta örneklerinin glikosilasyon dagiliinlarindaki gelistirmelerin, kültür kosullarina Eser Elementler E ilave edilerek ve glutamin düzeyleri düsük tutularak saglanabilecegini gösterdi. Burada kültür kosullarinda tek basina manganez ilavesinin, glikosilasyon dagilimlarinda benzer bir gelistirme saglayip saglayamayacagini test ettik.Prosedür: Anti-ABeta kültürleri, 40 mM manganez ihtiva eden veya etmeyen kültür ortamlari içinde büyütüldü. Kültürler, %40 toplam hacimde besleme ortami ile beslendi. Örnekler toplandi ve Örnek 4'te tarif edilen yönteme göre analiz edildi.Veri Analizi: Analiz edilen örnekler, pik varligi ve her pike ait toplam pik alani yüzdesi açilarindan karsilastirildi. Sekil 8, her örnegin GO, Gl ve G2 HPAEC-PED piklerine ait t0plam pik alani yüzdesinin grafiksel bir karsilastirinasini gösterir.Tartisma: Anti-ABeta antikoru ile birlestirilmis üç tip kompleks N bagli iki aiitenli glikan, dis N bagli iki antenli kollari üzerinde sirasiyla sifir, bir veya iki galaktoz tortusu ihtiva eden GO, G] ve G2 yapilaridir. 40 mM manganez içermeyen veya ihtiva eden ortamlar içinde büyütülmüs hücrelerden toplanan örnekler, GO, Gl ve G2 glikoformlarini temsil eden üç pikin tamaminin bulundugunu gösterdi.GO piki, kontrol ömegindeki %68 toplam pik alanindan, ilave87manganez ihtiva eden ortamdan toplanmis örnek içinde %53'e azaldi (bakiniz Sekil 8). Toplain pik alaninin Gl ve G2 yüzdelerindeki artislar da manganez ihtiva eden ortamlardan toplanmis örnekte görüldü.

Toplam pik alaninin Gl yüzdeleri, kontrol örneginde %26 ve manganez ilave edilmis örnekte %39 idi. Toplam pik alaninin GZ yüzdeleri, kontrol örneginde %6 ve manganez ilave edilmis öriiekte %9 idi (Sekil 8).Sonuç: Bu veriler, manganezin tek basina kültür ortamina ilavesinin, bu örneklerde GO:G1:G2 yüzde dagiliminda bir kayma ile gösterildigi gibi daha kapsamli bir glikosilasyon sablonu ile sonuçlandiginigösterir. 88TARIFNAME IÇERISINDE ATIF YAPILAN REFERANSLARBasvuru sahibi tarafindan atif yapilan referanslara iliskin bu liste,yalnizca okuyucunun yardimi içindir ve Avrupa Patent Belgesinin birkismini olusturmaz. Her ne kadar referanslarin derlenmesine büyük o ALBERTS et al. Molecular Biology of the Cell, 1994 [0004]° MILSTEIN et al. Nature, 1983, vol. 537, 3053 [0030]° MALONEY et al. Journal of Biol. Chem., vol. 275 (13), 2000 [0049]o MORRISON et al. Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A.,1985, vol. 81, 6851 [0052]o TAKEDA et al. Nature, 1985, vol. 314, 452 [0052]- TENG et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1983, v01.80, 7308-7312 [0053]° KOZBOR et al. lmmunology Today, 1983,5 önem verilmis olsa da, hatalar veya eksiklikler engellenememektedir ve EPO bu baglamda hiçbir sorumluluk kabul etmemektedir.

Tarifname içerisinde atifta bulunulan patent dökümanlari: ° US 6765087 B, Casterman [0014] ° US 60605097 B [0112]- US 6015695 A, Casterman [0014] o US 11213308 B [0112]. US 6005079 A, Casterman i0014i . Us 5723127 A i0121]° US 4816567 A, Cabilly [0052] ° US 5078996 A [0121]° US 4816397 A, Boss [0052] ° WO 9817799 A [0121] [0134] ° EP 171496 A [0052] 0 WC 9943839 A [0121]' EP 0173494 A [0052] 0 WC 0018434 A [0122]0 GB 2177096 B [0052] 0 WC 02098368 A [0122]0 WC 9206193 A [0053] 0 WC 02098369 A [0122]. EP 0239400 A i0053i . wo 9820734 A i0123i° WO 9213069 A, Hardy [0055] - US 20040082764 A1 [0125] . US 5549892 A [0068] - US 5593972 A [0134]- EP 417563 A [0076] [0085] ° US 5817637 A [0134]° EP 417014 A [0076] [0085] - US 5380876 A [0134]0 EP 117060 A, Levinson [0087] ° US 5981505 A [0134]° EP 117058 A [0087] ° US 6383512 B [0134]. US 4399216 A, Axel [0087] . us 4522811 A [0135]. US 5166320 A [0090]Tarifnamede belirtilen patentlestirilmemis literatür:' CHARTIER HARLAN et al. Nature, 1991, vol. 353, 844 [0057]o MURRELL et al. Science, 1991, vol. 254, 97 [0057]- MULLAN et al. Nature Genet., 1992, vol. 1, 345 [0057]. HARDY. TINS, 1997, vol. 20, 154 i0057i - JOHNSON-WOOD et al. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 1997, vol. 94, 1550 [0058] ° SCHENK et al. Nature, 1999, vol. 400, 173 [0058]. BARD et al. Nat. Med., 2000, vol. 6, 916-19 [0059] vol. 4, 7279 [0053]° OLSSON et al. Meth. Enzymol., 1982, vol. 92, 3-16 [0053]° RAVETCH ; KINET. Annu. Rev. lininunol, 1991, vol. 9, 457-92 [0054]° CAPEL et al. Immunomethods, 1994, vol. 4, 25-34 [0054]- DE HAAS et al. J. Lab. Clin. Med., 1995, vol. 126, 330-41 [0054]o SELKOE. TINS, 1993, vol. 16, 403 [0055] ° SELKOE. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 1994, vol. 53, 438 [0055]o DUFF et al. Nature, 1995, vol. 373, 476

[0055]0 GAMES et al. Nature, 1995, vol. 373, 523

[0055]- GOATE et al. Nature, 1991, vol. 349, 704

[0057]- NAISMITH ; SPRANG. J Inflamm., 1995, vol. 47 (1-2), 1-7 [0076] [0085]o DREWS. Nature Biotechnology, 1996, vol. 14, 1516 [0077]° MILLIGAN, G. ; REES, S. TIPS, 1999, vol. 20, 118-124 [0077]° WATSON, S. ; S. ARKINSTALL. The G- Protein Linked Receptor Facts Book.

Academic Press, 1994, 130-132 [0082]- MODY et al. Neuropharmacology, 1999, vol. 38 (10), 1485-92 [0082]° CHOCHOLA et al. J. Biol. Chem., 1993, vol. 268, 2312-2318 [0083]° COUVINEAU et al. Biochemistry, 1996, vol. 35 (6), 1745-52 [0083]° GETHING et al. Nature, 1981, vol. 293, 620-625 [0087]° MANTEI et al. Nature, 1979, vol. 281, 40-46 [0087]° GRAHAM ; VAN DER ERB. Virology, 1978, vol. 52, 456-457 [0087]° HAWLEY-NELSON. Focus, 1993, vol. , 73 [0087]° KEOWN et al. Methods in Enzymology, 1989 [0087]- KEOWN et al. Methods in Enzyinology, 1990, vol. 185, 527-537 [0087]o MANSOUR et al. Nature, 1988, vol. 336, 348-352 [0087]- OKAYAMA et al. Mol. Cell Biol., 1985,89o DODEL et 31. The Lancet, 2003, vol. 2, 215 [0060]o ELLIOTT et al. Nature Biotechnology, 2003, vol. 21 (4), 414-21 [0073]o YARDEN ; ULLRICH. Ann. Rev.

Biochem., 1988, vol. 57, 433-478 [0076]- ULLRICH ; SCHLESSINGER. Cell, 1990, vol. 61, 243-254 [0076]o SATO et al. Nature, 1995, vol. 376 (6535), 70-74 [0076]0 MUSTONEN ; ALITALO. J. Cell Biol., 1995, vol. 129, 895-898 [0076]- TERMAN et al. Oncogene, 1991, vol. 6, 1677-83 [0076]o DEVRIES et al. Science, 1992, vol. 255, 989-991 [0076]o SHIBUYA et al. Oncogene, 1990, vol. 5, 519-524 [0076]- FLOTTE et al. Am. J. Respir. Cell. Mol.

Biol., 1992, vol. 7, 349-356 [0094]' SAMULSKI et al. J. Virol., 1989, vol. 63, 3822-3828 [0094]o MCLAUGHLIN et al. J. Virol., 1989, vol. 62, 1963-1973 [0094]° TRATSCHIN et al. Mol. Cell. Biol., 1985, vol. 5, 3251-3260 [0094]° HERMONAT et al. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 1984, vol. 81, 6466-6470 [0094]° TRATSCHIN et al. Mol. Cell. Biol., 1985, vol. 4, 2072-2081 [0094]° WONDISFORD et al. Mol. Endocrinol., 1988, vol. 2, 32-39 [0094]o TRATSCHIN et al. J. Virol., 1984, vol. 51, 611-619 [0094]° FLOTTE et al. J. Biol. Chem., 1993, vol. 268,3781-3790 [0094]0 MADER, S. ; WHITE, J.H. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA,1993, vol. 90, 5603-5607 [0098]o SPENCER, D.M. et al. Science, 1993, vol. 262, 1019-1024 [0098]- MANOME, Y. et al. Biochemistry, 1993, vol. 32, 10607-10613 [0098]o DATTA, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 1992, vol. 89, 10149-10153 [0098]° GRAHAM et al. J. Gen Virol., 1977, vol. 36, 59 [0100] vol. 5, 1136-1142 [0088]- THOMAS et al. Cell, 1987, vol. 51, 503-512 [0088]° SEED, B. Nature, 1987, vol. 329, 840

[0088]o KAUFMAN et al. EMBO J., 1987, vol. 6, 187-195 [0088]. WU, G.; WU, C.H. J. Biol. Chem., 1988, vol. 263, 14621 [0090]o WILSON et al. J. Biol. Chem., 1992, vol. 267, 963-967 [0090]- MILLER, A.D. Blood, 1990, vol. 76, 271

[0092]° BERKNER et al. BioTechniques, 1988, vol. 6, 616 [0093]- ROSENFELD et al. Science, 1991, vol. 252, 431-434 [0093]° ROSENFELD et al. Cell, 1992, vol. 68, 143-155 [0093]° LEMARCHAND et al. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 1992, vol. 89, 6482-6486 [0093] o HERZ; GERARD. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 1993, vol. 90, 2812-2816 [0093]o QUANTIN et al. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 1992, vol. 89, 2581-2584 [0093]o HAJ-AHMAND ; GRAHAM. J. Virol., 1986, vol. 57, 267 [0093]- MUZYCZKA et al. Curr. Topics in Micro.and Immunol.,1992, vol. 158, 97-129 [0094] 901l URLAUB ; CHASIN. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0100]o MATHER. Biol. Reprod., 1980, vol. 23, 243-251 [0100]o MATHER et al. Annals N.Y. Acad. Sci., 1982, vol. 383, 44-68 [0100]' PRZYBYLO et al. Cancer Cell International, 2002, vol. 2 (1), 6 [0103]o LIFELY et al. Glycobiology, 1995, vol. 5 (8), 813-22 [0103]° SCOPES. Protein Purification Principles and Practice.Springer-Verlag, 1987 [0116]- Protein Expression : A Practical Approach.

Oxford Univ Press, 1999 [0116]o Guide to Protein Purification : Methods in EnzyinologyMethods in Enzymology Series. Academic Press, 1997, vol. 182

[0116]- Physicians° Desk Reference. Medical Economics C0., Inc, 2001 [0126]' Veterinary Pharmacology and Therapeutics. lowa State University Press, 2001 [0138]0 MOLONEY et al. J. Biol. Chein., 2000, vol. 275 (13), 9604-9611 [0148]0 BRUCKNER et al. Nature, 2000, vol. 406, 411-415 [0148] [0157]0 BRETON ; 1MBERTY. Curr. Opinion in Structural Biol., 1999, vol. 9, 563-571 [0157]

Claims (13)

ISTEMLER

1. Bir hücre kültüründe gelistirilmis bir glikosilasyon sablonuna sahip pihtilasma faktörü IX”un üretilmesine yönelik, asagidakileri içeren bir yöntem: bir pihtilasma faktörü IX”un sifreleyeii bir gen ihtiva eden memeli hücrelerinin, 10 nM ile 600 nM arasinda manganez içeren bir hücre kültürü ortami içinde, pihtilasma faktörü lX”un ekspresyonuna izin vermek için yeterli kosullar altinda ve süreyle kültürlenmesi, burada eksprese edilen pihtilasma faktörü IX°un glikosilasyoii sablonu, manganez içermeyen, diger açilardan özdes ortam içinde, diger açilardan özdes kosullar altinda gözlemlenen glikosilasyon sablonundan daha yaygindir, buradaki daha yaygin glikosilasyon sablonu, oligosakarit zincirinde daha fazla sayida kovalent bagli seker tortusudur.

2. Istem l”e göre yöntem, buradaki hücre kültürü ortami, yaklasik 20 ile 200 nM arasinda inanganez içerir.

3. Istem 2°ye göre yöntem, buradaki hücre kültürü ortami, yaklasik 40 nM maiiganez içerir.

4. Istem 1 ila 3'ten herhangi birine göre yöntem, buradaki hücre kültürü ortaini, yaklasik 8 mM'nin altinda veya buna esit bir baslangiç konsantrasyonunda glutainin içerir.

5. Istem 4'e ait yöntem, burada hücre kültürü ortaminin baslangiç glutamin konsantrasyonu, yaklasik 4 mM'den az veya buna esittir.

6. Istein 1 ila 5°ten herhangi birine göre yöntem, buradaki hücre kültürü hacmi, en az yaklasik 500 L”dir.

7. Istem 1 ila 6'dan herhangi birine göre yöntem, buradaki hücre kültürüne ayrica baslangiç hücre kültürü basladiktan sonra bir besleme ortami verilir.

8. Istem 1 ila 7°den herhangi birine göre yöntem, buradaki hücre kültürüne ayrica destekleyici bilesenler verilir.

9. Istem 8'e ait yöntem, buradaki destekleyici bilesenler, horinonlar ve/Veya diger büyüme faktörleri, inorganik iyonlar, tamponlar, Vitaminler, nükleosidler veya nükleotitler, eser elementler, amino asitler, lipitler, glukoz veya diger enerji kaynaklari ve bunlarin koinbinasyonlarindan olusan gruptan seçilir.

10. Istem 9'a ait yöntem, buradaki hücre kültürü, litre basina yaklasik

11. Istem 1 ila lO°dan herhangi birine göre yöntem, buradaki hücre kültürü ortami tanimlidir.

12. Istein l'e ait yöntem, buradaki pihtilasma faktörü IX, rekombinant insan pihtilasma Faktörü IX'dur.

13. Istem l'e ait yöntem, burada eksprese edilen pihtilasma faktörü IX, izole edilmis ve/Veya saflastirilmistir.