MX2009000349A - Produccion de glicoproteinas. - Google Patents

Abstract

Se provee un sistema mejorado para la producción de glicoproteínas a gran escala en cultivo celular. De acuerdo con la presente invención, las células que expresan una glicoproteína se hacen crecer en medios que contienen manganeso en una concentración de entre aproximadamente 10 y 600 nM. La utilización del sistema permite la producción de una glicoproteína con un patrón de glicosilación incrementado y/o un patrón de glicosilación que refleja con mayor precisión el patrón de glicosilación de la glicoproteína que ocurre naturalmente. Una glicoproteína expresada de acuerdo con la presente invención se puede utilizar de modo ventajoso en la preparación de composiciones farmacéuticas.

Description

PRODUCCION DE GLICOPROTEINAS Campo de la Invención Esta invención se refiere a un método para producir una glicoproteina en un medio de cultivo celular que comprende manganeso, y a un medio de cultivo celular para utilizar en el método .

Antecedentes de la Invención Las proteínas y los polipéptidos se han convertido en agentes terapéuticos cada vez más importantes. En la mayoría de los casos, estas proteínas y polipéptidos se producen en cultivo celular, a partir de células que se han sometido a ingeniería y/o seleccionado para producir niveles inusualmente elevados de la proteína o polipéptido particular de interés. El control y la optimización de las condiciones del cultivo celular es críticamente importante para la exitosa producción comercial de proteínas y polipéptidos. Muchas proteínas y polipéptidos producidos en cultivo celular son glicoproteínas que contienen estructuras de carbohidratos unidas covalentemente que incluyen cadenas de oligosacáridos . Estas cadenas de oligosacáridos se encuentran unidas a la proteína en el retículo endoplasmático y en el aparato de Golgi por medio o bien de uniones N o bien de uniones O. Las cadenas de oligosacáridos pueden comprender una Ref . : 199311 porción significativa de la masa de la glicoproteina . Se cree que las cadenas de oligosacáridos cumplen roles clave en la función de la glicoproteina que incluyen facilitar el correcto plegamiento de la glicoproteina, mediar las interacciones proteina-proteina, conferir estabilidad, conferir ventajosas propiedades farmacodinámicas y/o farmacocinéticas , inhibir la digestión proteolitica, dirigir la glicoproteina hacia la vía secretora apropiada y dirigir la glicoproteina hacia un órgano u órganos particulares. Generalmente, las cadenas de oligosacáridos unidas a N se adicionan a la proteina naciente, de translocación en el lumen del retículo endoplasmático (véase Molecular Biology of the Cell, por Alberts et al., 1994, incorporado en la presente como referencia) . El oligosacárido se adiciona al grupo amino sobre la cadena lateral de un residuo de asparagina contenido dentro de la secuencia consenso objetivo de Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier amino ácido excepto prolina. La cadena de oligosacáridos inicial usualmente se recorta mediante enzimas glicosidasa específicas en el retículo endoplasmático, resultando en un oligosacárido de núcleo ramificado, corto compuesto de dos residuos de N-acetilglucosamina y tres residuos de mañosa. Luego del procesamiento inicial en el retículo endoplasmático, la glicoproteina se transporta por medio de pequeñas vesículas hacia el aparato de Golgi, donde la cadena de oligosacáridos experimenta procesamiento adicional antes de ser segregada hacia la superficie celular. La cadena de oligosacáridos unida a N recortada se puede modificar mediante la adición de diversos residuos de mañosa, resultando en un oligosacárido de alta mañosa. Alternativamente, una o más unidades de monosacáridos de N-acetilglucosamina se pueden adicionar a las subunidades de mañosa del núcleo para formar oligosacáridos complejos. Se puede adicionar galactosa a subunidades de N-acetilglucosamina, y se pueden adicionar subunidades de ácido siálico a las subunidades de galactosa, resultando en cadenas que terminan con cualquiera de un residuo de ácido siálico, galactosa o N-acetilglucosamina. Adicionalmente, se puede adicionar un residuo de fucosa a un residuo de N-acetilglucosamina del núcleo del oligosacárido. Cada una de estas adiciones se cataliza con glicosil transferasas especificas. Además de ser modificadas por la via de glicosilación unida a N, las glicoproteinas también se pueden modificar mediante la adición de cadenas de oligosacáridos unidas a O a residuos de serina o treonina específicos a medida que se procesan en el aparato de Golgi . Los residuos de un oligosacárido unido a 0 se adicionan uno a uno y la adición de cada residuo se cataliza con una enzima específica. A diferencia de la glicosilación unida a N, la secuencia consenso de amino ácidos para la glicosilación unida a 0 es menos bien definida. La calidad y extensión finales de la glicosilación de proteínas se puede afectar drásticamente por las condiciones del cultivo celular. Por ejemplo, los procesos de cultivo por lote y por lote alimentado tradicionales se han concentrado en el nivel final del péptido producido y a menudo resultan en la producción de una glicoproteína con un patrón de glicosilación menos extenso y/o un patrón de glicosilación cuyos residuos de azúcar de las cadenas de oligosacáridos reflejan escasamente los residuos de azúcar gue se encuentran presentes en la forma de la glicoproteína gue ocurre naturalmente. El incremento de la extensión de la glicosilación y/o la regulación de la composición de los residuos de azúcar para reflejar más de cerca el nivel y la composición de la glicosilación que se encuentran presentes en la forma natural de la glicoproteína podrían resultar potencialmente en un agente terapéutico de glicoproteína con mayor potencia, mejores propiedades farmacodinámicas y/o farmacocinéticas y menores efectos secundarios. Mientras que se ha efectuado cierto esfuerzo para mejorar la calidad y cantidad de glicosilación de los glicoproteínas producidas en cultivo celular, permanece una necesidad de mejoramientos adicionales. Existe una necesidad particular por el desarrollo de sistemas para producir glicoproteínas con mejores patrones de glicosilación con cultivo celular en medios definidos.

Sumario de la Invención Los métodos y composiciones de la presente invención proveen un sistema mejorado para la producción de glicoproteinas a gran escala con mejores patrones de glicosilación en cultivo celular. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la presente invención provee métodos de cultivo a escala comercial (por ejemplo, 500 L o más) que utilizan un medio que contiene una concentración molar acumulativa de manganeso entre aproximadamente 10 y 600 nM. En ciertas modalidades, la concentración molar acumulativa de glutamina en los medios es inferior a aproximadamente 8 mM. En ciertas modalidades, la concentración molar acumulativa de glutamina en los medios es inferior a aproximadamente 4 mM. Deberla comprenderse que "acumulativa", según se utilizó precedentemente, se refiere a la cantidad total de un componente o componentes particulares adicionados durante el curso del cultivo celular, incluyendo componentes adicionados al comienzo del cultivo y componentes adicionados subsiguientemente. En ciertas modalidades de la invención, es deseable minimizar "alimentaciones" del cultivo con el transcurso del tiempo, de modo que es deseable maximizar las cantidades presentes inicialmente . Por supuesto, los componentes del medio se metabolizan durante el cultivo de modo que los cultivos con las mismas cantidades acumulativas de determinados componentes tendrán diferentes niveles absolutos si aquellos componentes se adicionan en tiempos diferentes (por ejemplo todos los presentes inicialmente frente a algunos adicionados a través de alimentaciones) . De acuerdo con la presente invención, la utilización del medio permite la producción de glicoproteinas que contienen patrones de glicosilación deseables. En algunas modalidades, las glicoproteinas pueden tener un patrón de glicosilación más extenso y/o pueden tener una distribución de cadenas de oligosacáridos que más de cerca se asemeja a la distribución de las cadenas de oligosacáridos aplicadas a la glicoproteina a través de la célula hospedante natural. En algunas modalidades, la utilización del sistema de la invención puede resultar en la producción de una glicoproteina con un patrón de glicosilación similar o idéntico al patrón de glicosilación que se encontraría presente si la glicoproteina estuviera expresada en una célula humana endógena. Un experto en la técnica comprenderá que las formulaciones de medios de la presente invención incluye tanto a los medios definidos como a los complejos. En ciertas modalidades, el medio de cultivo consiste en un medio definido en el cual la composición del medio es conocida y controlada.

En algunas modalidades, las células se cultivan bajo una o más de las condiciones descritas en la Solicitud de Patente Estadounidense Provisional Acta No. 60/605.097, incorporada en la presente como referencia. En algunas modalidades, las células se cultivan bajo una o más de las condiciones descritas en la Solicitud de Patente Estadounidense Acta No. 11/213.308, incorporada en la presente como referencia. Los cultivos celulares de la presente invención pueden estar opcionalmente suplementados con nutrientes y/u otros componentes del medio que incluyen hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones particulares (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio, y fosfato) , amortiguadores, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, elementos traza (compuestos inorgánicos usualmente presentes en muy bajas concentraciones finales), amino ácidos, lipidos, o glucosa u otra fuente de energía. En ciertas modalidades, puede ser beneficioso suplementar los medios con inductores químicos tales como hexametilen-bis (acetamida) ("HMBA") y butirato de sodio ("NaB") . Los suplementos opcionales se pueden adicionar al comienzo del cultivo o se pueden adicionar en un punto posterior con el objeto de reponer nutrientes agotadas o por otra razón. En general, es deseable seleccionar la composición del medio inicial para minimizar el suplemento de acuerdo con la presente invención.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la Investigación de la Actividad Glicosídica en Material Retentado ÜF/DF. Para cada experimento, las barras que representan las diversas especies K4 y ?4' son, de izquierda a derecha: K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA), K4' (Fuc-GlcNAc-Gal) , K4' (Fuc-GlcNAc) y K4' (Fue). La Figura 2 muestra Distribuciones de Especies K4 en rFIX Generado en Cultivos en Frascos de Agitación. Para cada experimento, las barras que representan las diversas especies K4 y K4' son, de izquierda a derecha: K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA), K4' (Fuc-GlcNAc-Gal), K4' (Fuc-GlcNAc) y K4' (Fue). La Figura 3 muestra Distribuciones de Especies K4 de Cultivos en Frascos de Agitación con Diversos Aditivos de Medios. Para cada experimento, las barras que representan las diversas especies K4 y K4 ' son, de izquierda a derecha: K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA), K4' (Fuc-GlcNAc-Gal), K4' (Fuc-GlcNAc) y K4' (Fue) . La Figura 4 muestra Distribuciones de Especies K4 de Cultivos en Frascos de Agitación con Medio Suplementado . Para cada experimento, las barras que representan las diversas especies K4 y K4 ' son, de izquierda a derecha: K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA), K4' (Fuc-GlcNAc-Gal), K4' (Fuc-GlcNAc) y K4' (Fue). La Figura 5 muestra Distribuciones de Especies K4 de Cultivos en Frascos de Agitación con Diversos Aditivos de Medio. Para cada experimento, las barras que representan las diversas especies K4 y K ' son, de izquierda a derecha: K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA), K4' (Fuc-GlcNAc-Gal), K4' (Fuc-GlcNAc) y K4' (Fue) . La Figura 6 ¦ muestra Distribuciones de Especies K4 de Cultivos en Frascos de Agitación a Niveles Variables de Manganeso. Para cada experimento, las barras que representan las diversas especies K4 y K4' son, de izquierda a derecha: K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA) , K4' (Fuc-GlcNAc-Gal) , K4' (Fuc-GlcNAc) y K4' (Fue) . La Figura 7 muestra una Comparación Gráfica del Porcentaje del Área Pico Total para los Picos de HPAEC-PED de GO, Gl, y G2. Para cada experimento, las barras que representan los glicanos biantenarios unidos a N complejos son, de izquierda a derecha: GO, Gl y G2. La Figura 8 muestra una Comparación Gráfica del Porcentaje del Área Pico Total para los Picos de HPAEC-PED de GO, Gl, y G2. Para cada experimento, las barras que representan los glicanos biantenarios unidos a N complejos son, de izquierda a derecha: GO, Gl y G2.

Definiciones "Amino ácido": El término "amino ácido" según se utiliza en la presente se refiere a cualquiera de los veinte amino ácidos que ocurren naturalmente que se utilizan normalmente en la formación de polipéptidos, o a análogos o derivados de esos amino ácidos o a cualquier amino ácido que no ocurre naturalmente. Los amino ácidos de la presente invención se proveen en medio a cultivos celulares. Los amino ácidos provistos en el medio se pueden proveer como sales o en forma de hidrato. "Anticuerpo": El término "anticuerpo" según se utiliza en la presente se refiere a una molécula de inmunoglobulina o a una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina, es decir, una molécula que contiene un sitio de unión a antigeno el cual específicamente se une a un antígeno, tales como . un fragmento Fab o F(ab')2- En ciertas modalidades, un anticuerpo consiste en un anticuerpo natural típico conocido por aquéllos expertos en la técnica, por ejemplo, glicoproteína que comprende cuatro cadenas polipeptídicas : dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas. En ciertas modalidades, un anticuerpo es un anticuerpo de cadena única. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo de cadena única comprende una variante de un anticuerpo natural típico en donde dos o más miembros de las cadenas pesada y/o liviana se han unido covalentemente, por ejemplo, a través de un enlace peptídico. En ciertas modalidades, un anticuerpo de cadena única es una proteína que tiene una estructura de cadena de dos polipéptidos que consiste en una cadena pesada y en una liviana, las cadenas se estabilizan, por ejemplo, a través de enlazadores peptídicos entre cadenas, la proteína tiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. En ciertas modalidades, un anticuerpo es un anticuerpo compuesto solamente de cadenas pesadas tales como, por ejemplo, aquéllas que se encuentran naturalmente en miembros de la familia Camelidae, incluyendo llamas y camellos (véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses números 6.765.087 por Casterman et, al., 6.015.695 por Casterman et al., 6.005.079 y por Casterman et al., cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad) . Los términos "anticuerpos monoclonales" y "composición de anticuerpos raonoclonales", según se utilizan en la presente, se refieren a una población de moléculas de anticuerpos que contienen solamente una especie de un sitio de unión a antigeno y por consiguiente usualmente interactúan solamente con un epitope único o un antigeno particular. Las composiciones de anticuerpos monoclonales de este modo despliegan típicamente una afinidad de unión única para un epitope particular con el cual ellas inmunoreaccionan . Los términos "anticuerpos policlónales" y "composición de anticuerpos policlonales" se refieren a poblaciones de moléculas de anticuerpos que contienen múltiples especies de sitios de unión a antigeno que interactúan con un antigeno particular. "Cultivo por lote": El término "cultivo por lote" según se utiliza en la presente se refiere a un método de cultivo de células en el cual todos los componentes que finalmente se utilizarán para cultivar las células, incluyendo el medio (véase la definición de "Medio" a continuación) asi como también las células en si mismas, se proveen al comienzo del proceso de cultivo. Un cultivo por lote típicamente se detiene en cierto punto y las células y/o componentes en el medio se recogen y opcionalmente se purifican. "Biorreactor" : El término "biorreactor" según se utiliza en la presente se refiere a cualquier recipiente utilizado para el crecimiento de un cultivo celular mamífero. Un biorreactor puede ser de cualquier tamaño siempre que éste sea útil para el cultivo de células de mamíferos. Típicamente, el biorreactor será de al menos 1 litro y puede ser de 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 litros o más, o de cualquier volumen intermedio. Las condiciones internas del biorreactor, que incluyen, pero no se limitan a pH, oxígeno disuelto y temperatura, típicamente se controlan durante el período de cultivo. Un biorreactor puede estar compuesto de cualquier material que sea adecuado para contener cultivos celulares mamíferos suspendidos en medios bajo las condiciones de cultivo de la presente invención, incluyendo vidrio, plástico o metal. El término "biorreactor de producción" según se utiliza en la presente se refiere al biorreactor final utilizado en la producción de la glicoproteína de interés. El volumen del biorreactor de producción es típicamente de al menos 500 litros y puede ser de 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 litros o más, o de cualquier volumen intermedio. Un experto en la técnica tendrá conocimiento y será capaz de seleccionar biorreactores adecuados para utilizar en la práctica de la presente invención. "Densidad celular": El término "densidad celular" según se utiliza en la presente se refiere a la cantidad de células presentes en un volumen de medio determinado . "Viabilidad celular": El término "viabilidad celular" según se utiliza en la presente se refiere a la capacidad de las células en cultivo para sobrevivir bajo un conjunto determinado de condiciones de cultivo o variaciones experimentales. El término según se utiliza en la presente también se refiere a aquella porción de células que se encuentran vivas en un momento particular en relación con la cantidad total de células, vivas y muertas, en el cultivo en ese momento. "Medio complejo": El término "medio complejo" según se utiliza en la presente se refiere a un medio que contiene al menos un componente cuya identidad o cantidad o bien no se conoce o bien no está controlada. "Cultivo", "Cultivo celular": Estos términos según se utilizan en la presente se refieren a una población celular que se encuentra suspendida en un medio (véase la definición de "Medio" a continuación) bajo condiciones adecuadas para la supervivencia y/o crecimiento de la población celular. Según resultará claro para aquéllos con experiencia corriente en la técnica, en ciertas modalidades, estos términos según se utilizan en la presente se refieren a la combinación que comprende la población celular y el medio en el cual está suspendida la población. En ciertas modalidades, las células del cultivo celular comprenden células de mamíferos. "Medio definido": El término "medio definido" según se utiliza en la presente se refiere a un medio en el cual la composición del medio o bien se conoce o bien está controlada.

"Cultivo por lote alimentado": El término "cultivo por lote alimentado" según se utiliza en la presente se refiere a un método de cultivo de células en el cual se proveen componentes adicionales al cultivo en un momento o momentos subsiguientes al comienzo del proceso de cultivo. Los componentes provistos típicamente comprenden componentes nutricionales para las células que se han agotado durante el proceso de cultivo. Adicionalmente o alternativamente, los componentes adicionales pueden incluir componentes suplementarios (véase la definición de "Componentes suplementarios" a continuación) . En ciertas modalidades, los componentes adicionales se proveen en un medio de alimentación (véase la definición de "Medio de alimentación" a continuación) . Un cultivo por lote alimentado típicamente se detiene en cierto punto y las células y/o componentes en el medio se recogen y opcionalmente se purifican. "Medio de alimentación": El término "medio de alimentación" según se utiliza en la presente se refiere a una solución que contiene nutrientes que alimentan a las células de mamíferos en crecimiento que se adiciona luego del comienzo del cultivo celular. Un medio de alimentación puede contener componentes idénticos a aquéllos provistos en el medio de cultivo celular inicial. Alternativamente, un medio de alimentación puede contener uno o más componentes adicionales además de aquéllos provistos en el medio de cultivo celular inicial. Adicionalmente o alternativamente, un medio de alimentación puede carecer de uno o más componentes que se proveyeron en el medio de cultivo celular inicial. En ciertas modalidades, uno o más componentes de un medio de alimentación se proveen en concentraciones o niveles idénticos o similares a las concentraciones o niveles en los cuales se proveyeron esos componentes en el medio de cultivo celular inicial. En ciertas modalidades, uno o más componentes de un medio de alimentación se proveen en concentraciones o niveles diferentes de las concentraciones o niveles en los cuales se proveyeron esos componentes en el medio de cultivo celular inicial. Los medios de alimentación e emplificativos se muestran en la Tabla 2, aunque la presente invención no se limita a la utilización de estos medios. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden utilizar medios de alimentación alternativos y/o que se pueden realizar ciertas alteraciones a las composiciones de los medios de alimentación ej emplificativos que se enumeran en la Tabla 2. En ciertas modalidades, un medio de alimentación contiene componentes suplementarios (véase la definición de "Componentes suplementarios" a continuación) . "Fragmento": El término "fragmento" según se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido que se define como cualquier porción discreta de un polipéptido determinado que es única o característica de ese polipéptido. Por ejemplo, el término según se utiliza en la presente se refiere a cualquier porción de un polipéptido determinado que incluye al menos un elemento de secuencia establecido que se encuentra en el polipéptido de longitud completa. En ciertos fragmentos, el elemento de secuencia se extiende a al menos 4-5, 10, 15, 20, 25, 30 ,- 35, 40, 45, 50 o más amino ácidos del polipéptido de longitud completa. Alternativamente o adicionalmente, el término según se utiliza en la presente se refiere a cualquier porción discreta de un polipéptido determinado que retiene al menos una fracción de al menos una actividad del polipéptido de longitud completa. En ciertas modalidades, la fracción de actividad retenida es de al menos 10% de la actividad del polipéptido de- longitud completa. En ciertas modalidades, la fracción de actividad retenida es de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la actividad del polipéptido de longitud completa. En ciertas modalidades, la fracción de actividad retenida es de al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la actividad del polipéptido de longitud completa. En ciertas modalidades, el fragmento retiene el 100% de más de la actividad del polipéptido de longitud completa. En ciertas modalidades, un fragmento de la presente invención contiene una secuencia peptidica que sirve como un sitio de glicosilacion. En algunas modalidades, un fragmento de la presente invención contiene una porción de un sitio de glicosilacion de modo tal que, cuando se une o otra fragmento que contiene la otra porción del sitio de glicosilacion, se reconstituye un sitio de glicosilacion funcional. "Gen": El término "gen" según se utiliza en la presente se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos, ADN o ARN, al menos cierta porción de la cual codifica un producto final discreto, típicamente, pero no limitado a, un polipéptido, que funcione en cierto aspecto de desarrollo o metabolismo celular. Opcionalmente, el gen comprende no solamente la secuencia de codificación que codifica el polipéptido u otro producto final discreto, sino que también comprende regiones que preceden y/o siguen la secuencia de codificación que modulan el nivel de expresión basal (véase la definición de "Elemento de control .genético" a continuación) , y/o las secuencias intervinientes ("introñes") entre segmentos de codificación individuales ("exones") . "Elemento de control genético": El término "elemento de control genético" según se utiliza en la presente se refiere a cualquier elemento de secuencia que modula la expresión de un gen hacia el cual éste se encuentra unido de modo operable.

Los elementos de control genético pueden funcionar o bien incrementando o bien disminuyendo los niveles de expresión y pueden estar situados antes, dentro de o después de la secuencia de codificación. Los elementos de control genético pueden actuar en cualquier etapa de expresión génica mediante la regulación, por ejemplo, de la iniciación, elongación o terminación de la transcripción, corte y empalme de ARNm, corrección de ARNm, estabilidad del ARNm, localización del ARNm dentro de las células, iniciación, elongación o terminación de la traducción, o cualquier otra etapa de expresión génica. Los elementos de control genético pueden funcionar individualmente o en combinación entre, si "Glicoproteina" : El término "glicoproteina" según se utiliza en la presente se refiere a una proteina o polipéptido que contiene una o más cadenas de oligosacáridos unidas covalentemente . - Las cadenas de oligosacáridos pueden estar compuestas de un residuo de azúcar único, de una cadena no ramificada única de residuos de azúcar o pueden estar compuestas de una cadena de residuos de azúcar que se ramifica una o más veces. En ciertas modalidades, las cadenas de oligosacáridos se encuentran unidas a N. En ciertas modalidades, las cadenas de oligosacáridos se encuentran unidas a 0. "Patrón de glicosilacion": El término "patrón de glicosilacion" se refiere a la glicosilacion observada de una glicoproteina o glicoproteinas determinadas. Se dice que una glicoproteina con una mayor cantidad de residuos de azúcar unidos covalentemente en la cadena de oligosacáridos tiene un patrón de glicosilación mayor o más extenso. Por el contrario, se dice que una glicoproteina con menos residuos de azúcar unidos covalentemente en la cadena de oligosacáridos tiene un patrón de glicosilación menor o menos extenso. El término "patrón de glicosilación" según se utiliza en la presente también se refiere a una distribución característica de diversos patrones de glicosilación diferentes en glicoproteínas individuales expresadas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. En este sentido, un mayor patrón de glicosilación significa un incremento en la distribución característica de los patrones de glicosilación de las glicoproteínas expresadas. "Célula hospedante": El término "célula hospedante" según se utiliza en la presente se refiere a una célula que es manipulada de acuerdo con la presente invención para producir una glicoproteina con un patrón de glicosilación deseable según se describe en la presente.. En algunas modalidades, una célula hospedante es una célula de mamífero. "Hibridoma" : El término "hibridoma" según se utiliza en la presente se refiere a una célula o progenie de una célula que resulta de la fusión de una célula inmortalizada y una célula que produce anticuerpos. El hibridoma resultante consiste en una célula inmortalizada que produce anticuerpos. Las células individuales utilizadas para crear el hibridoma pueden provenir de cualquier fuente mamifera, que incluye, pero no se limita, rata, cerdo, conejo, oveja, cerdo, cabra, y humano. En ciertas modalidades, un hibridoma es una linea celular de trioma, que resulta cuando la progenie de fusiones de mieloma heterohibridas, las cuales constituyen el producto de una fusión entre células humanas y una linea celular de mieloma murino, se fusionan subsiguientemente con un célula plasmática. En ciertas modalidades, un hibridoma es cualquier linea celular híbrida inmortalizada que produce anticuerpos tales como, por ejemplo, cuadromas (Véase, por ejemplo, Milstein et al., Nature, 537:3053, 1983). "Medio", "Medio de cultivo celular", "Medio de Cultivo": Estos términos según se utilizan en la presente se refieren a una solución que contiene nutrientes que alimentan las células de mamíferos en crecimiento. Típicamente, las soluciones proveen amino ácidos esenciales y no esenciales, vitaminas, fuentes de energía, lípidos, y elementos traza requeridos por las células para el crecimiento y/o supervivencia mínimos. La solución también puede contener componentes suplementarios (véase la definición de "Componentes suplementarios" a continuación) que mejoran el crecimiento y/o la supervivencia por encima de la tasa mínima, que incluyen, pero no se limitan a, hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones particulares (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio, y fosfato) , amortiguadores, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, elementos traza (compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales muy bajas), amino ácidos, lipidos, y/o glucosa u otra fuente de energía. En ciertas modalidades, un medio se formula de modo ventajoso hasta un pH y concentración de sales óptimos para la supervivencia y proliferación celular. Los medios de cultivo ej emplificativos se muestran en la Tabla 1, aunque la presente invención no se limita a la utilización de estos medios. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden utilizar medios de cultivo alternativos y/o que se pueden efectuar ciertas alteraciones a las composiciones de los medios de cultivo ej emplificativos que se enumeran en la Tabla 1. En ciertas modalidades, un medio consiste en un medio de alimentación que se adiciona luego del comienzo del cultivo celular (véase la definición de "Medio de alimentación", precedente) . "Polipéptido" : El término "polipéptido" según se utiliza en la presente se refiere a una cadena secuencial de amino ácidos unidos conjuntamente por medio de enlaces peptídicos. El término se utiliza para referirse a una cadena de amino ácidos de cualquier longitud, pero un experto en la técnica comprenderá que el término no se limita a cadenas extensas y que se puede referir a una cadeNa mínima que comprende dos amino ácidos unidos conjuntamente por medio de un enlace peptidico. Según es conocido por aquéllos expertos en la técnica, los polipéptidos se pueden procesar y/o modificar. Por ejemplo, un polipéptido se puede glicosilar (véase la definición de "glicoproteína" precedente) . "Proteína": El término "proteína" según se utiliza en la presente se refiere a uno o más polipéptidos que funcionan como una unidad discreta. Si un polipéptido único es la unidad de funcionamiento discreta y no requiere asociación física permanente o temporaria con otros polipéptidos con el objeto de formar la unidad de funcionamiento discreta, los términos "polipéptido" y "proteína" se pueden utilizar de modo indistinto. Si la unidad funcional discreta se compone de más de un polipéptido que se asocian físicamente entre sí, el término "proteína" se refiere a los múltiples polipéptidos que están físicamente acoplados y que funcionan conjuntamente como la unidad discreta. "Glicoproteína expresada de modo recombinante" y "Glicoproteína recombinante" : Estos términos según se utilizan en la presente se refieren a una glicoproteína expresada a partir de una célula hospedante que ha sido manipulada por la mano del hombre para expresar esa glicoproteína. En ciertas modalidades, una célula hospedante es una célula de mamífero. En ciertas modalidades, la manipulación comprende una o más modificaciones genéticas. Por ejemplo, las células hospedantes de mamíferos se pueden modificar genéticamente mediante la introducción de uno o más genes heterólogos que codifican una glicoproteina a ser expresada. La glicoproteina heteróloga expresada de modo recombinante puede ser idéntica o similar a las glicoproteinas que están expresadas normalmente en la célula hospedante de mamífero. La glicoproteina heteróloga expresada de modo recombinante también puede ser foránea con respecto a la célula hospedante, es decir heteróloga con respecto a glicoproteinas normalmente expresadas en la célula hospedante de mamífero. En ciertas modalidades, una glicoproteina heteróloga expresada de modo recombinante es quimérica en cuanto a que las porciones de- la glicoproteina contienen secuencias de amino ácidos que son idénticas o similares a las glicoproteinas normalmente expresadas en la célula hospedante de mamífero, mientras que otras porciones son foráneas con respecto a la célula hospedante. Alternativamente, una célula hospedante de mamífero se puede modificar genéticamente mediante la activación o regulación ascendente de uno o más genes endógenos. "Componentes suplementarios": El término "componentes suplementarios" según se utiliza en la presente se refiere a componentes que mejoran el crecimiento y/o la supervivencia por encima de la tasa mínima, que incluyen, pero no se limitan a, hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones particulares (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio, y fosfato) , amortiguadores, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, elementos traza (compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales muy bajas), amino ácidos, lipidos, y/o glucosa u otra fuente de energía. En ciertas modalidades, los componentes suplementarios se pueden adicionar al cultivo celular inicial. En ciertas modalidades, los componentes suplementarios se pueden adicionar luego del comienzo del cultivo celular. "Título": El término "título" según se utiliza en la presente se refiere a la cantidad total de glicoproteína expresada de modo recombinante producida por un cultivo celular mamífero en una cantidad determinada de volumen del medio. El título típicamente se expresa en unidades de miligramos de glicoproteína por mililitro del medio.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención provee sistemas mejorados para la producción de glicoproteínas en cultivo celular. En particular, se proveen sistemas que resultan en la producción de una glicoproteína que contiene un patrón de glicosilación deseable. Por ejemplo, una glicoproteína puede tener un patrón de glicosilación más extenso y/o puede tener una distribución de cadenas de oligosacáridos que se asemeja más de cerca de la distribución de cadenas de oligosacáridos aplicada a la glicoproteína por la célula hospedante natural. En algunas modalidades, la utilización de sistemas de la invención puede resultar en la producción de una glicoproteína con un patrón de glicosilación similar o idéntico al patrón de glicosilación que se encontraría presente si la glicoproteína estuviera expresada en una célula humana endógena. Ciertas modalidades de la invención se plantean en detalle a continuación. Aquéllos expertos en la técnica comprenderán, sin embargo, que las diversas modificaciones a estas modalidades se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Son las reivindicaciones y los equivalentes de las mismas los que definen el alcance de la presente invención, el cual no está y no debería estar limitado hasta o por esta descripción de ciertas modalidades.

Composiciones de los Medios Una amplia variedad de medios de crecimiento de mamíferos se puede utilizar de acuerdo con la presente invención. En ciertas modalidades, las células se pueden hacer crecer en una de una variedad de medios definidos químicamente, en donde los componentes de los medios son tanto conocidos como controlados. En ciertas modalidades, las células se pueden hacer crecer- en un medio complejo, en el cual no todos los componentes del medio son conocidos y/o controlados. Los medios de crecimiento definidos químicamente para el cultivo celular mamífero se han desarrollado y publicado extensamente durante las últimas décadas. Todos los componentes de los medios definidos están bien caracterizados, y de este modo los medios definidos no contienen aditivos complejos tales como suero o hidrolizados . Las anteriores formulaciones de medios se desarrollaron para permitir el crecimiento celular y el mantenimiento de la viabilidad con poca o sin preocupación por la producción de proteínas. Más recientemente, se han desarrollado formulaciones de medios con el propósito expreso de respaldar cultivos celulares que producen glicoproteínas y/o proteínas recombinantes altamente productivas . Los medios definidos consisten típicamente en aproximadamente cincuenta entidades químicas en concentraciones conocidas en agua. La mayoría de ellos también contienen una o más proteínas bien caracterizadas tales como insulina, IGF-1, transferrina o BSA, pero otros requieren componentes de no proteína y de este modo se hece referencia a ellos como medios definidos libres de proteínas. Los componentes químicos de los medios se incluyen dentro de cinco categorías amplias: amino ácidos, vitaminas, sales inorgánicas, elementos traza, y una categoría miscelánea que desafía la categorización pura. Los elementos traza consisten en una variedad de sales inorgánicas incluidas en niveles micromolares o inferiores. Los cuatro elementos traza aún más comúnmente incluidos presentes en casi todos los medios definidos son hierro, zinc, selenio y cobre. El hierro (sales ferrosas o férricas) y el zinc típicamente se adicionan en concentraciones micromolares , mientras que los otros usualmente lo hacen en concentraciones nanomolares. Los numerosos elementos traza menos comunes usualmente se adicionan en concentraciones nanomolares. El manganeso se incluye frecuentemente entre los elementos traza como un catión divalente (MnCl2 o MnS04) . En las anteriores versiones de los medios definidos, éste o bien se omitió o bien se incluyó en una alta concentración en el orden de 1 µ? (véase, por ejemplo, Barnes and Sato, 1980 [Medio DMEM/F12] y Kitos et. al., 1962 [Medio MD 705/1]). En medios definidos más recientemente desarrollados, comúnmente se ha incluido el manganeso, pero en concentraciones muchos más bajas, por ejemplo en el intervalo de 1-5 nM (véase, por ejemplo, Hamilton and Ham, 1977 [Medio MCDB 301] y Cniveland and Erlanger, 1988 [medio sin nombre] ) . La presente invención comprende el descubrimiento de que las glicoproteínas producidas por un cultivo de células que crecieron en medios definidos conteniendo concentraciones de manganeso entre estos extremos contienen patrones de glicosilación más extensos que los que de otro modo ellas contendrían si las células crecieran en medios tradicionales, tales como aquéllos descritos precedentemente. En ciertas modalidades, se provee manganeso en el medio en una concentración de entre aproximadamente 10 y 600 nM. En ciertas modalidades, se provee manganeso en el medio en una concentración de entre aproximadamente 20 y 100 nM. En ciertas modalidades, se provee manganeso en el medio en una concentración de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, o 600 nM, o en cualquier intervalo dentro de estas concentraciones.

La presente invención también comprende el descubrimiento de que las glicoproteinas producidas por un cultivo de células que crecieron en medios definidos conteniendo niveles de glutamina relativamente bajos contienen patrones de glicosilación más extensos que los que de otro modo ellas contendrían si las células crecieran en medios tradicionales que contienen niveles más elevados de glutamina. En ciertas modalidades, el nivel de glutamina inicial en el medio es inferior a o igual a aproximadamente 8 mM. En ciertas modalidades, el nivel de glutamina inicial en el medio es inferior a o igual a aproximadamente 4 mM. Un/o experto/a en la técnica será capaz de elegir la concentración exacta de manganeso dentro de estos intervalos de la invención en base a los atributos particulares de su diseño experimental, que incluyen el carácter de las células a partir de las cuales es expresada la glicoproteína, el carácter de la glicoproteína a producirse, y la presencia o ausencia de otros componentes en el medio en el cual se hacen crecer las células. Por ejemplo, las diferencias entre estructuras unidas a N y unidas a 0, o las diferencias entre estructuras de oligosacáridos particulares dentro de cada una de estas amplias clases puede requerir diferentes concentraciones de manganeso en el medio de crecimiento con el objeto de producir cadenas de oligosacáridos más extensas y/o más naturales.

Glicoproteinas Cualquier glicoproteína que sea expresable en una célula hospedante se puede producir de acuerdo con las presentes enseñanzas. Una glicoproteína se puede expresar a partir de un gen que es endógeno con respecto a la célula hospedante, o a partir de un gen heterólogo que se introduce en la célula hospedante. Una glicoproteína puede ser una que ocurre en la naturaleza, o puede alternativamente tener una secuencia que fue sometida a ingeniería o seleccionada por la mano del hombre. Una glicoproteína a producirse se puede ensamblar a partir de fragmentos de polipéptidos que ocurren individualmente en la naturaleza, al menos uno de los cuales contiene una secuencia peptídica que sirve como un sitio de glicosilación . Alternativamente, . cada fragmento de polipéptido puede tener solamente una porción de un sitio de glicosilación, el sitio se reconstituye al ensamblar los fragmentos de polipéptidos . Adicionalmente o alternativamente, la glicoproteina sometida a ingeniería puede incluir uno o más fragmentos que no ocurren naturalmente, siempre que la glicoproteina sometida a ingeniería contenga al menos una secuencia peptídica que sirva como un sitio de glicosilación.

Las glicoproteínas que se pueden expresar de modo deseable de acuerdo con la presente invención a menudo estarán seleccionadas sobre la base de una actividad biológica o química interesante o útil. Por ejemplo, la presente invención se puede emplear para expresar cualquier enzima, receptor, anticuerpo, hormona, factor regulador, antígeno, agente de unión, etc farmacéuticamente o comercialmente importante. La siguiente lista de glicoproteínas que se pueden producir de acuerdo con la presente invención es meramente de naturaleza ej emplificativa, y no pretende constituir una enumeración limitativa. Un/a experto/a en la técnica comprenderá que cualquier glicoproteina se puede expresar de acuerdo con la presente invención y será capaz de seleccionar la glicoproteina particular a ser producida en base a sus necesidades particulares.

Factores de Coagulación Se ha demostrado que los factores de coagulación son efectivos como agentes farmacéuticos y/o comerciales. Dada la importancia de los factores de coagulación recombinantes en el tratamiento de enfermedades tales como Hemofilia, es de particular interés la optimización del patrón de glicosilación de los factores de coagulación producidos de modo recombinante de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, el Factor de Coagulación IX (Factor IX, o "FIX") consiste en una glicoproteina de cadena única cuya deficiencia resulta en Hemofilia B, un trastorno en el cual la sangre del paciente es incapaz de coagular. De este modo, cualquier pequeña herida que resulte en sangrado es potencialmente un evento que pone la vida en peligro. El FIX se sintetiza como un cimógeno de cadena única que se puede activar hacia una serina proteasa de dos cadenas (Factor IXa) mediante la liberación de un péptido de activación. El dominio catalítico del Factor IXa se sitúa en la cadena pesada (véase Chang et al., J. Clin. Invest., 100:4, 1997, incorporado en la presente como referencia) . El FIX tiene múltiples sitios de glicosilación que incluyen ambos carbohidratos unidos a N y unidos a 0. Una vez se pensó que una estructura unida a O particular en la Serina 61 (Sia-c¿2,3-Gal-ß? , 4-GlcNAc~ 1 , 3-Fuc-al-O-Ser) era única con respecto al FIX pero desde entonces se ha encontrado en unas pocas de otras moléculas que incluyen la proteina Notch en mamíferos y Drosophila (Maloney et al, Journal of Biol. Chem. , 275(13), 2000) . El FIX producido por células de Ovario de Hámster Chino ("CHO", por sus siglas en inglés) en cultivo celular presenta cierta variabilidad en la cadena de oligosacáridos Serina 61. Estas diferentes glucoformas, y otras glucoformas potenciales, pueden tener diferentes capacidades para inducir la coagulación cuando se administran a humanos o animales y/o pueden tener diferentes estabilidades .en la sangre, resultando en una coagulación menos efectiva. La Hemofilia A, la cual ¦ no se distingue clínicamente de la Hemofilia B, es causada por un defecto en el factor de coagulación humano VIII, otra glicoproteína gue se sintetiza como un cimógeno de cadena única y luego se procesa en una forma activa de dos cadenas. La presente invención también se puede emplear para controlar o alterar el patrón de glicosilación del factor de coagulación VIII con el objeto de modular su actividad de coagulación. Otros factores de coagulación de glicoproteínas que se pueden producir y cuyo patrón de glicosilación se puede controlar o alterar de acuerdo con la presente invención incluyen por ejemplo, pero no se limitan a, factor tisular y factor de von Willebrands .

Anticuerpos Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno particular. Dada la gran cantidad de anticuerpos actualmente en uso o bajo investigación como agentes farmacéuticos u otros agentes comerciales, es de particular interés la producción de anticuerpos con patrones de glicosilación deseables de acuerdo con la presente invención. Más aún, puede ser menos probable que los anticuerpos con diferentes patrones de glicosilación inicien una respuesta inmune en el individuo al cual ellos se administran, resultando en un régimen terapéutico más efectivo. Adicionalmente o alternativamente, los anticuerpos con diferentes patrones de glicosilación en sus regiones constantes pueden presentar una mejor función efectora farmacocinética o farmacodinámica . Adicionalmente o alternativamente, los anticuerpos con diferentes patrones de glicosilación pueden ser más estables en las condiciones de cultivo celular en las cuales ellos se producen, por ejemplo al ser más resistentes a las proteasas u otros componentes en el cultivo celular, de modo que se produce un más elevado titulo final de anticuerpos. Cualquier anticuerpo que se puede expresar en una célula hospedante se puede utilizar de acuerdo con las enseñanzas de la presente revelación. En algunas modalidades, un anticuerpo a expresarse es un anticuerpo monoclonal. En ciertas modalidades, un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico, ün anticuerpo quimérico contiene fragmentos de amino ácidos que se derivan de más de un organismo. Las moléculas de anticuerpos quiméricos pueden incluir, por ejemplo, un dominio de unión a antigeno a partir de un anticuerpo de un ratón, rata, u otras especies, con regiones constantes humanas. Se han descrito una variedad de aproximaciones para elaborar anticuerpos quiméricos (véase por ejemplo, Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.E.Ü.Ü. 81, 6851, 1985; Takeda et al., Nature 314, 452, 1985, Cabilly et al., Patente Estadounidense No. 4.816.567; Boss et al., Patente Estadounidense No. 4.816.397; Tanaguchi et al., Publicación de Patente Europea EP171496; Publicación de Patente Europea 0173494, Patente del Reino Unido GB 2177096B, cada uno de los cuales - se incorpora en la presente como referencia) . En algunas modalidades, un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo quimérico en donde la gran mayoría de los residuos de amino ácidos se derivan de anticuerpos humanos, minimizando de este modo cualquier potencial reacción inmune cuando se suministra a un sujeto humano. En los anticuerpos humanizados, los residuos de amino ácidos en la región hipervariable se reemplazan con residuos de una especie no humana que confieren una especificidad o afinidad de antígeno deseada. En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado tiene una secuencia de amino ácidos que es 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 porciento idéntica o superior a un anticuerpo humano.

En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado se optimiza mediante la introducción de sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de linea germinal y/o retromutaciones . Las moléculas de inmunoglobulina alteradas se pueden elaborar a través de diversos métodos conocidos en el técnica, (por ejemplo, Teng et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.E.U.U., 80, 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol . , 92, 3-16.1982, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia) . En algunas modalidades, las moléculas de inmunoglobulina alteradas se elaboran de acuerdo con las enseñanzas de la Publicación PCT WO92/06193 o EP 0239400, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En ciertas modalidades, un anticuerpo producido de acuerdo con las enseñanzas de la presente revelación puede contener una región Fe o constante de inmunoglobulina que presenta un mejorado patrón de glicosilación. Por ejemplo, un anticuerpo producido de acuerdo con las enseñanzas en la presente se puede unir con más fuerza o con más especificidad a las moléculas efectoras tales como receptores Fe y/o de complemento, lo cual puede controlar diversas funciones inmunes del anticuerpo tales como la actividad de célula efectora, lisis, actividad mediada por complemento, depuración de anticuerpos, y vida media del anticuerpo. Los receptores Fe típicos que se unen a una región Fe de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo IgG) incluyen, pero no se limitan a, los receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FcyRIII y FcRn, que incluyen variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Se efectúa una revisión de los receptores Fe en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunométodos 4:25-34,1994; y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41,1995, cada uno de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Pero como un ejemplo no limitativo, un anticuerpo que se puede producir de acuerdo con las presentes enseñanzas es un anticuerpo anti-ABeta. Los anticuerpos anti-ABeta consisten en un potencial camino de terapia particularmente promisorio en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. La enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en inglés) consiste en una enfermedad progresiva que resulta en la demencia senil (véase en general: Selkoe, TINS 16:403, 1993; Hardy et al., WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438, 1994; Duff et al., Nature 373:476, 1995; Games et al., Nature 373:523, 1995, cada uno de las cuales se incorpora en la presente como referencia) . En lineas generales, la enfermedad cae dentro de dos categorías: comienzo tardío, en el cual tiene lugar en una edad avanzada (65 + años) y comienzo temprano, en el cual se desarrolla bien antes del período senil, es decir, entre los 35 y los 60 años. En ambos tipos de la enfermedad, la patología es la misma pero las anormalidades tienden a ser severas y a extenderse más en los casos que comienzan a una edad temprana. La enfermedad se caracteriza por al menos dos tipos de lesiones en el cerebro, ovillos neurofibrilares y placas seniles. Los ovillos neurofibrilares son depósitos intracelulares de proteína tau asociada a microtúbulos que consisten en dos filamentos retorcidos entre sí en pares. Las placas seniles (es decir, las placas amiloides) son áreas de neuropilos desorganizados hasta 150 µp? conjuntamente con depósitos amiloides extracelulares en el centro que son visibles a través de análisis microscópico de las secciones del tejido cerebral. La acumulación de placas amiloides dentro del cerebro también se asocia con el síndrome de Down y otros trastornos cognitivos. El principal constituyente de las placas es un péptido denominado péptido ABeta o Beta-amiloide . El péptido ABeta es un fragmento interno de 4 kDa de 39-43 amino ácidos de una proteína denominada glicoprotexna de transmembrana más grande llamada proteína precursora amiloide (APP, por sus siglas en inglés) . Como resultado del procesamiento proteolítico de APP por diferentes enzimas secretasa, ABeta se encuentra principalmente tanto en una forma corta, de una longitud de 40 amino ácidos, como en una forma larga, con un intervalo en longitud desde 42-43 amino ácidos. Parte del dominio de la transmembrana hidrofóbica de APP se encuentra en el extremo carboxi de ABeta, y puede ser responsable de la capacidad de ABeta para agregarse en las placas, particularmente en el caso de la forma larga. La acumulación de placas amiloides en el cerebro conduce eventualmente a la muerte de las células neuronales. Los síntomas físicos asociados con este tipo de deterioro neural caracterizan la enfermedad de Alzheimer. Diversas mutaciones 'dentro de la ' proteína APP se han correlacionado con la presencia de la enfermedad de Alzheimer (véase, por ejemplo, Goate et al., Nature 349:704, 1991 (valina717 a isoleucina) ; Chartier Harían et al. Nature 353:844, 1991 (valina717 a glicina); Murrell et al., Science 254:97,1991 (valina717 a fenilalanina) ; Mullan et al., Nature Genet. 1:345,1992 (una doble mutación que cambia lisina595-metionina596 a asparagina595-leucina596) , cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Se cree que las mutaciones causan la enfermedad de Alzheimer mediante el procesamiento incrementado o alterado de APP a ABeta, particularmente el procesamiento de APP a mayores cantidades de la forma larga de ABeta (es decir, ABetal-42 y ABetal 43) . Se cree que las mutaciones en otros genes, tales como los genes presenilina, PS1 y PS2, afecta indirectamente el procesamiento de APP para generar mayores cantidades de la forma larga de ABeta (véase Hardy, TINS 20: 154,1997, incorporado en la presente como referencia en su totalidad) .

Los modelos de ratones se han utilizado exitosamente para determinar la importancia de las placas amiloides en el Alzheimer (Games et al., supra; Johnson-Wood et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 94:1550, 1997, incorporados en la presente como referencia en su totalidad) . En particular, cuando se inyectan ratones transgénicos PDAPP, (los cuales expresan una forma imitante de APP humana y desarrollan la enfermedad de Alzheimer en edad joven) , con la forma larga de ABeta, ellos presentan tanto una disminución en la progresión del Alzheimer como un incremento en los títulos de anticuerpos hacia el péptido ABeta (Schenk et al., Nature 400, 173, 1999, incorporado en la presente como referencia en su totalidad) . Las observaciones planteadas precedentemente indican que ABeta, particularmente en su forma larga, es un elemento causativo en la enfermedad de Alzheimer. El péptido ABeta puede existir en solución y se puede detectar en el SNC (por ejemplo, CSF) y plasma. Bajo ciertas condiciones, ABeta soluble se transforma en formas de láminas Beta, fibrilares, tóxicas, que se encuentran en las placas neuríticas y en los vasos sanguíneos cerebrales de pacientes con AD. Se han investigado tratamientos que involucran la inmunización con anticuerpos monoclonales frente a ABeta. Tanto la inmunización activa como pasiva se han ensayado en modelos de ratones de AD. La inmunización activa resultó en cierta reducción en la carga de placas en el cerebro, pero solamente mediante la administración nasal. También se ha investigado la inmunización pasiva de ratones transgénicos PDAPP (Bard, et al., Nat . Med. 6:916-19, 2000, incorporado en la presente como referencia en su totalidad) . Se descubrió que los anticuerpos que reconocen los dominios centrales y amino-terminales de ABeta estimularon la fagocitosis de los depósitos de ABeta, mientras que los anticuerpos frente a los dominios cerca del dominio carboxi-terminal no lo hicieron. El mecanismo de depuración de ABeta luego de la inmunización pasiva o activa se encuentra bajo investigación continua. Se han propuesto dos mecanismos para la depuración efectiva, es decir, para la degradación central y la degradación periférica. El mecanismo de degradación central se basa en anticuerpos que son capaces de cruzar la barrera hemato-encefálica, unirse a las placas, e inducir la depuración de placas pre-existentes. Se ha demostrado que la depuración se promueve a través de fagocitosis mediada por un receptor Fe (Bard, et al., supra) . El mecanismo de degradación periférica de la depuración de ABeta se basa en una interrupción del equilibrio dinámico de ABeta entre el cerebro, CSF, y plasma luego de la administración del anticuerpo, conduciendo al transporte de ABeta desde un compartimento hasta el otro. El ABeta que se deriva centralmente se transporta hacia el CSF y el plasma donde éste se degrada. Estudios recientes han concluido que el ABeta soluble y no unido están involucrados en el deterioro de la memoria asociado con la AD, aún sin reducción en el depósito amiloide en el cerebro. Se necesitan estudios adicionales para determinar la acción y/o interacción de estas vías para la depuración de ABeta ( Dodel , et al., The Lancet Vol . 2:215, 2003, incorporado en la presente como referencia en su totalidad) . Los anticuerpos Anti-ABeta constituyen una via de traatamiento de la AD potencialmente promisoria puesto que ellos pueden unirse a y depurar el ABeta u otros componentes que comprenden las placas amiloides. El Anti-ABeta producido de acuerdo con las enseñanzas de la presente revelación puede servir para tratar mejor el Alzheimer u otras enfermedades relacionadas mediante, por ejemplo, la unión y depuración de los componentes de las placas amiloides de modo más efectivo, mediante la depuración de las placas amiloides con menos efectos secundarios o menos graves, o mediante la prevención de la formación o acumulación de placas amiloides. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta producidos de acuerdo con las presentes enseñanzas son anticuerpos monoclonales. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta producidos de acuerdo con las presentes enseñanzas se unen específicamente a la forma agregada de ABeta sin unirse a la forma soluble. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta producidos de acuerdo con las presentes enseñanzas se unen específicamente a la forma soluble de anti-ABeta bajo condiciones en las cuales ellos no se unen a la forma agregada. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta producidos de acuerdo con las presentes enseñanzas se unen tanto a las formas agregadas como a las solubles. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta producidos de acuerdo con las presentes enseñanzas se unen a ABeta en las placas. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta producidos de acuerdo con las presentes enseñanzas cruzan la barrera hemato-encefálica. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta producidos de acuerdo con las presentes enseñanzas reducen la carga amiloide en un sujeto. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta producidos de acuerdo con las presentes enseñanzas reducen la distrofia neurítica en un sujeto. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta pueden mantener arquitectura sináptica (por ejemplo, sinaptofisina) .

De acuerdo con algunas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta producidos de acuerdo con las presentes enseñanzas se unen a un epitopo dentro de los residuos 13-28 de ABeta (con el primer residuo N terminal de ABeta natural designado 1) . En algunas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta producidos de acuerdo con las presentes enseñanzas se unen a un epitopo dentro de los residuos 19-22 de ABeta. En algunas modalidades, se utilizan múltiples anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión a diferentes epitopos anti-ABeta. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo especifico para un epitopo dentro de los residuos 19-22 de ABeta se coadministra con un anticuerpo especifico para un epitopo fuera de los residuos 19-22 de ABeta. Los anticuerpos se pueden administrar secuencialmente o simultáneamente. También se pueden utilizar (por ejemplo, administrar o co-administrar) anticuerpos a componentes amiloides distintos a ABeta. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-ABeta producidos de acuerdo con las presentes enseñanzas se unen a un epitopo ABeta con más fuerza o con más especificidad que los anticuerpos anti-ABeta producidos de otro modo. La especificidad del epitopo de un anticuerpo se puede determinar a través de técnicas conocidas, por ejemplo, mediante la formación de una biblioteca de expresión en fago en la cual diferentes miembros presentan diferentes subsecuencias de ABeta. La biblioteca de expresión en fago luego se puede seleccionar para miembros que se unen específicamente a un anticuerpo bajo ensayo. Una familia de secuencias se aisla. Típicamente, la familia contiene una secuencia de núcleo común, y longitudes variables de secuencias de flanqueo en miembros diferentes. La secuencia de núcleo más corta que presenta unión específica al anticuerpo típicamente define el epitopo unido por el anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, los anticuerpos se pueden ensayar en cuanto a la especificidad del epitopo en un ensayo de competencia con un anticuerpo cuya especificidad del epitopo ya se ha determinado. Por ejemplo, se considera que los anticuerpos que compiten con el anticuerpo 15C11 en cuanto a la unión a ABeta se unen al mismo epitopo a 15C11 o similar, es decir, dentro de los residuos ABeta 19-22. En ciertas modalidades, el cribado de anticuerpos para la especificidad del epitopo constituye un indicador útil de eficacia terapéutica. Por ejemplo, es probable que un anticuerpo determinado por unirse a un epitopo dentro de los residuos 13-28 (por ejemplo, hasta ?ß 19-22) de ABeta sea efectivo para prevenir y tratar la enfermedad de Alzheimer de acuerdo con las metodologías de la presente invención. Los anticuerpos que se unen específicamente a un segmento preferido de ABeta sin unirse a otras regiones de ABeta poseen una cantidad de ventajas relativas a los anticuerpos monoclonales que se unen a otras regiones, o a suero policlonal hasta ABeta intacto. Entre otras cosas, para dosificaciones de igual masa, las dosificaciones de anticuerpos que se unen específicamente a los segmentos preferidos contienen una más alta dosificación molar de anticuerpos efectivos en la depuración de placas amiloides. Además, los anticuerpos que se unen específicamente a los segmentos preferidos pueden inducir una respuesta de depuración frente a depósitos amiloides sin inducir una respuesta de depuración frente a polipéptido de APP intacto, reduciendo por consiguiente los potenciales efectos secundarios . En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales , quiméricos, de cadena única, o humanizados descritos precedentemente pueden contener residuos de amino ácidos que no ocurren naturalmente en ningún anticuerpo en ninguna especie en la naturaleza. Los residuos foráneos se pueden utilizar, por ejemplo, para conferir especificidad, afinidad o función efectora nuevas o modificadas en el anticuerpo monoclonal, quimérico, de cadena única o humanizado.

Enzimas Otra clase de glicoproteinas que han demostrado ser efectivas como agentes farmacéuticos y/o comerciales incluye las enzimas. Las enzimas pueden ser glicoproteinas cuyo patrón de glicosilacion afecta la actividad enzimática. De este modo, es también de particular interés la producción de enzimas con patrones de glicosilacion deseables de acuerdo con la presente invención . Pero como un ejemplo no limitativo, una deficiencia en la glucocerebrosidasa (GCR) resulta en una afección conocida como enfermedad de Gaucher, la cual es causada por una acumulación de glucocerebrosidasa en los lisosomas de ciertas células. Los sujetos con enfermedad de Gaucher presentan un intervalo de síntomas que incluyen esplenomegalia, hepatomegalia, trastorno esquelético, trombocitopenia y anemia. Friedman y Hayes demostraron que la GCR recombinante (rGCR, por sus siglas en inglés) que contenia una sustitución única en la secuencia primaria de amino ácidos presentó un patrón de glicosilación alterado, específicamente un incremento en los residuos de fucosa y N-acetil glucosamina en comparación con la GCR que ocurre naturalmente (véase la Patente Estadounidense número 5,549,892). Friedman y Hayes también demostraron que esta la rGCR presentó mejores propiedades farmacocinéticas en comparación con la rGCR que ocurre naturalmente. Por ejemplo, la GCR se dirigió a células hepáticas de Kupffer tanto como aproximadamente el doble de lo que lo hizo la GCR que ocurre naturalmente. Aunque las secuencias de amino ácidos primarias de las dos proteínas difirieron en un único residuo, Friedman y Hayes elaboraron la hipótesis de que el alterado patrón de glicosilación de la rGCR también puede ejercer influencia en la dirección hacia células de Kupffer. Un experto en la técnica tendrá conocimiento de ejemplos conocidos de enzimas que presentan propiedades enzimáticas, farmacocinéticas y/o farmacodinámicas alteradas que resultan de una alteración en sus patrones de glicosilación.

Factores de Crecimiento y Otras Moléculas de Señalización Otra clase- de glicoproteínas que han demostrado ser efectivas como agentes farmacéuticos y/o comerciales incluye los factores de crecimiento y otra moléculas de señalización. De este modo, es también de particular interés la producción de receptores con patrones, de glicosilación deseables de acuerdo con la presente invención. Los factores de crecimiento típicamente son glicoproteínas que son segregadas por las células y que se unen a y activan receptores en otras células, iniciando un cambio metabólico o para el desarrollo en la célula receptora. Ejemplos no limitativos de factores de crecimiento de mamíferos y de otras moléculas de señalización incluyen citoquinas; factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) ; factor de crecimiento derivado de plaquetas ( PDGF, por sus siglas en inglés); factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs, por sus siglas en inglés) tales como FGF-5; factor de crecimiento de tipo insulínico I y II (IGF-I e IGF-II , por sus siglas en inglés); des (1-3) -IGF-I (IGF-I cerebral) , factor de crecimiento de tipo insulínico que se une a proteínas; proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 , y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductivos ; immunotoxinas ; proteínas morfogenéticas óseas (BMPs, por sus siglas en inglés) ; interferones tales como interferón-alfa, -beta, y -gamma; factores de estimulación de colonias (CSFs, por sus siglas en inglés) , por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; la mayoría de interleuquinas ; factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) beta; hormona folículo estimulante; calcitonina; hormona luteinizante; factores de anticoagulación tales como Proteína C; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; activadores del plasminógeno, tales como uroquinasa u orina humana o activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA, por sus siglas en inglés) ; factor de crecimiento hematopoyético; y encefalinasa . Un experto en la técnica tendrá conocimiento de otros factores de crecimiento o moléculas de señalización que se pueden expresar de acuerdo con la presente invención. Las alteraciones específicas en el patrón de glicosilación de los factores de crecimiento o de otras moléculas de señalización han demostrado tener efectos dramáticos en sus propiedades terapéuticas. Pero como un ejemplo no limitativo, un método común de tratamiento para pacientes que sufren de anemia crónica les proveerá frecuentes inyecciones de eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO, por sus siglas en inglés) con el objeto de estimular su producción de glóbulos rojos, ün análogo de la rHuEPO, darbepoyetina alfa (Aranesp®) , se ha desarrollado para tener una duración en el cuerpo más prolongada que la rHuEPO normal. La principal diferencia entre la darbepoyetina alfa y la rHuEPO consiste en la presencia de dos cadenas de oligosacáridos extra unidas a N que contienen ácido siálico. La producción de darbepoyetina alfa se ha logrado utilizando glicoingeniería in vitro (véase Elliott et al., Nature Biotechnology 21 (4) : 414-21, 2003). Elliott et al . utilizaron mutagénesis in vitro para incorporar sitios de glicosilacion extra dentro de la estructura principal del polipéptido de rHuEPO, resultando en la expresión del análogo de darbepoyetina alfa. Las cadenas de oligosacáridos extra se ubican alejadas del centro del sitio de unión al receptor EPO y aparentemente no interfirieren con la unión al receptor. Sin embargo, la vida media de la darbepoyetina alfa es hasta tres veces más alta que la de la rHuEPO, resultando en un agente terapéutico mucho más efectivo . Este ejemplo demuestra que las alteraciones en un factor de crecimiento u otro patrón de glicosilacion de la molécula de señalización pueden tener efectos dramáticos en la estabilidad y/o actividad in vivo de una glicoproteina terapéutica. De este modo, la expresión de un factor de crecimiento o de otra molécula de señalización de interés de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención puede resultar en que el factor de crecimiento o la molécula de señalización expresados tengan un mejor patrón de glicosilacion y mejores propiedades terapéuticas.

Receptores Otra clase de glicoproteinas que han demostrado ser efectivas como agentes farmacéuticos y/o comerciales son los receptores. De este modo, es también de particular interés la producción de receptores con patrones de glicosilación deseables de acuerdo con la presente invención. Los receptores son típicamente glicoproteínas trans-membrana que funcionan mediante el reconocimiento de un ligando de señalización extra-celular. Además del dominio de reconocimiento de ligando, los receptores tienen a menudo un dominio de proteína quinasa que inicia una vía de señalización mediante la fosforilación de moléculas intracelulares objetivo luego de unirse al ligando, conduciendo a cambios metabólicos o de desarrollo dentro de las células. En ciertas modalidades, el receptor de glicoproteínas a ser producido de acuerdo con la presente invención es un receptor tirosina quinasa (RTK, por sus siglas en inglés) . La familia RTK incluye receptores que son cruciales para una variedad de funciones de numerosos tipos celulares (vése, por ejemplo, Yarden and Ullrich, Aun. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich and Schlessinger, Cell 61:243-254, 1990, incorporados en la presente como referencia) . Ejemplos no limitativos de RTKs incluyen miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en inglés) , miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) , receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por- sus- siglas en inglés)., receptores de dominios de homología -1 (TIE-1) y TIE-2 de tirosina quinasa con inmunoglobulina y EGF (Sato et al., Nature 376 ( 6535 ) : 70-74, 1995) y receptor c-Met, algunos de los cuales se han sugerido por promover la angiogénesis , . directamente o indirectamente (Mustonen and Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-898, 1995) . Otros ejemplos no limitativos de RTK' s incluyen quinasa de hígado fetal 1 (FLK-1) (a la que a veces se hace referencia como receptor que contiene dominio inserto quinasa (KDR, por sus siglas en inglés) (Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991) o receptor del factor de crecimiento celular endotelial vascular 2 (VEGFR-2, por sus siglas en inglés) ) , tirosina quinasa tipo fms-1 (Flt-1, por sus siglas en inglés) (DeVries et al. Science 255; 989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519-524, 1990), a la que a veces se hace referencia como receptor del factor de crecimiento celular endotelial vascular 1 (VEGFR-1 , por sus siglas en inglés) , neuropilina-1, endoglin, endosialina, y Axl. En ciertas modalidades, los receptores alfa y beta del factor de necrosis tumoral (TNFR-1, por sus siglas en inglés; EP 417.563 publicada el 20 de marzo de 1991; y TNFR-2, por sus siglas en inglés, EP 417.014 publicada el 20 de marzo de 1991) se expresan de acuerdo con la presente invención (para una revisión, véase Naismith and Sprang, J Inflamm. 47 (1-2) : 1-7 , 1995-96, incorporado en la presente como referencia) . En ciertas- modalidades, un receptor de glicoproteína a producirse de acuerdo con la presente invención consiste en un receptor acoplado a proteina G (GPCR, por sus siglas en inglés) . Los GPCRs son glicoproteinas que tienen siete dominios transmembrana. Luego de la unión de un ligando a un GPCR, una señal se transduce dentro de la célula lo cual resulta en un cambio en una propiedad biológica o fisiológica de la célula. Los GPCRs constituyen un objetivo principal para la acción y el desarrollo del fármaco. De hecho, los receptores han conducido a más de la mitad de los fármacos que se conocen en la actualidad (Drews, Nature Biotechnology, 14:1516, 1996) y los GPCRs representan el objetivo más importante para la intervención terapéutica con el 30% de los fármacos prescritos clínicamente o bien antagonizando o bien agonizando un GPCR (Milligan, G. and Rees, S., TIPS, 20: 118-124, 1999) . Puesto que los receptores poseen una historia establecida, probada como terapéuticos objetivo, también es de particular interés la producción de GPCRs con patrones de glicosilación deseables de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los dominios extracelulares de los GPCRs con patrones de glicosilación deseables expresados de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención podrían funcionar como importantes agentes terapéuticos mediante la titulación o secuestro de un ligando cuya unión a un GPCR endógeno es perjudicial . Los GPCRs, conjuntamente con proteínas G y efectores (enzimas y canales intracelulares los cuales son modulados por proteínas G) , constituyen los componentes de un sistema de señalización modular que conecta el estado de segundos mensajeros intracelulares a entradas extracelulares . Los genes y producto génicos son potenciales agentes causativos de enfermedades . La superfamilia de proteina de GPCR ahora contiene más de 250 tipos de parálogos , receptores que representan variantes generadas por duplicaciones génicas (u otros procesos) , en oposición a ortólogos, el mismo receptor a partir de diferentes especies. La superfamilia se puede dividir en cinco familias: Familia I, receptores tipificados por rodopsina y el receptor beta2-adrenérgico y actualmnete representada por más de 200 miembros únicos; Familia II, la recientemente caracterizada familia del receptor de hormona paratiroide/calcitonina/secretina; Familia III, la familia del receptor de glutamato metabotrópico en mamíferos; Familia IV, la familia del receptor de cA P, importante en la quimiotaxis y desarrollo de D. discoideum; y Familia V, los receptores de feromona de apareamiento fúngico tales como STE2. Los GPCRs incluyen receptores para aminas biogénicas, para mediadores lipidíeos de inflamación, hormonas peptídicas, y mediadores de señales sensoriales. El GPCR se torna activado cuando el receptor une su ligando extracelular . Los cambios conformacionales en el GPCR, los cuales resultan a partir de la interacción ligando-receptor, afectan la afinidad de unión de una proteina G a los dominios intracelulares del GPCR. Ello permite que GTP se una con una mejor afinidad a la proteina G. La activación de la proteina G mediante GTP conduce a la interacción de subunidad a de proteina G con adenilato ciclasa u otros segundos generadores moleculares mensajeros. Esta interacción regula la actividad de adenilato ciclasa y por lo tanto la producción de una segunda molécula mensajera, cAMP. cAMP regula la fosforilación y la activación de otras proteínas intracelulares. Alternativamente, los niveles celulares de otras segundas moléculas mensajeras, tales como cGMP o eicosinoides, se puede regular en forma ascendente o en forma descendente por la actividad de los GPCRs . La subunidad a de proteína G se desactiva mediante la hidrólisis de GTP por GTPasa, ' y las subunidades a, ?eta e ? se reasocian. La proteína G heterotrimérica luego se disocia de la adenilato ciclasa o de otro segundo generador molecular mensajero. La actividad del GPCR también se puede regular mediante la fosforilación de los dominios o bucles intra- y extracelulares . Los receptores de glutamato forman un grupo de GPCRs que son importantes en la neurotransmisión . El glutamato es el principal neurotransmisor en el SNC y se cree que tiene importantes roles en la plasticidad neuronal, cognición, memoria, aprendizaje y algunos trastornos neurológicos tales como epilepsia, accidente cerebrovascular, y neurodegeneración (Watson, S. and S. Arkinstall, 1994, The G- Proteina Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, págs . 130-132) . Estos efectos del glutamato están mediados por dos clases distintas de receptores denominados ionotrópicos y metabotropicos. Los receptores ionotrópicos contienen un canal catiónico intrínseco y median las rápidas acciones excitatorias del glutamato. Los receptores metabotropicos son moduladores, incrementando la excitabilidad de membrana de las neuronas mediante la inhibición de conductancias de potasio dependientes de calcio tanto inhibiendo como potenciando la transmisión excitatoria de los receptores ionotrópicos. Los receptores metabotropicos se clasifican en cinco subtipos en base a la farmacología agonista y a las vías de transducción de señales y se encuentran ampliamente distribuidos en los tejidos cerebrales. La glicosilación unida a N ha demostrado ser importante en la función del receptor de glutamato metabotrópico tipo 1 alfa humano (mGlulalpha) (Mody et al., Neuropharmacology 38 (10) : 1485-92, 1999). mGlulalpha normalmente está expresado, al menos en parte, como un dímero que consiste en monómeros de aprox. 145 y 160 KDa. Mediante el tratatamiento de mGlulalpha con tunicamicina, un potente inhibidor de glicosilación unida a N, Mody et al. demonstraron que aunque no estaba afectada la expresión de la superficie celular, solamente estaba expresado un péptido único con una masa de 130 kDa pronosticado por su secuencia de amino ácidos primaria. Funcionalmente, el tratamiento con tunicamicina redujo la hidrólisis de fosfoinositidos estimulada por agonistas en aproximadamente 50% en comparación con las poblaciones celulares no tratadas. De este modo, la regulación de los patrones de glicosilación de los GPCRs expresados de acuerdo con el presente sistema de la invención puede ser útil en la modulación de la función de señalización del GPCR expresado y potencialmente para controlar o afectar las propiedades farmacéuticas u otras del GPCR expresado. La familia del polipéptido intestinal vasoactivo (VIP, por sus siglas en inglés) es un grupo de polipéptidos relacionados cuyas acciones también se encuentran mediadas por GPCRs. Los miembros clave de esta familia son el VIP en si mismo, la secretina, y el factor liberador de la hormona del crecimiento (GRF, por sus siglas en inglés) . El VIP tiene un amplio perfil de acciones fisiológicas que incluyen la relajación de los músculos lisos, la estimulación o inhibición de la secreción en diversos tejidos, la modulación de diversas actividades de células inmunes, y varias actividades excitatorias e inhibitorias en el SNC. La secretina estimula la secreción de enzimas y iones en el páncreas y en el intestino y también se encuentra presente en pequeñas cantidades en el cerebro. Se ha demostrado que la glicosilación del receptor VIP posee un importante efecto en la unión de su VIP afin (Chochóla et al., J. Biol. Chem. 268: 2312-2318, 1993) . El bloqueo de modo estérico de las cadenas de oligosacáridos mediante el tratamiento del receptor VIP con aglutinina de germen de trigo inhibió marcadamente la unión a VIP en una manera dependiente de la dosis y redujo la respuesta de cA P estimulada por VIP. Adicionalmente, la mutación de los sitios de glicosilación unidos a N específicos en el receptor VIP resultó en la retención del receptor en el retículo endoplasmático, indicando que la glicosilación apropiada era crítica para el suministro a la superficie celular (Couvineau et al., Biochemistry 35 (6) : 1745-52, 1996) . De este modo, la regulación de los patrones de glicosilación de los GPCRs expresados de acuerdo con el presente sistema de la invención puede ser útil en la modulación (por ejemplo, o bien incrementando o bien disminuyendo) de la unión del GPCR expresado a su ligando afín y potencialmente para controlar o afectar las propiedades farmacéuticas u otras del GPCR expresado . En general, los practicantes de la presente invención seleccionarán una glicoproteína de interés, y conocerán su secuencia de amino ácidos precisa. Las técnicas de la presente invención se han aplicado exitosamente tanto a glicoproteínas unidas a O (Ejemplos 1 y 2) como unidas a N (Ejemplos 3 y 4), indicando que la presente invención será útil para la expresión de glicoproteinas en general. Cualquier glicoproteina determinada que va a ser expresada de acuerdo con la presente invención puede tener sus propias características particulares y puede ejercer influencia en la densidad o viabilidad celular de las células cultivadas, puede ser expresada a niveles más bajos que otra glicoproteina que ha crecido bajo condiciones de cultivo idénticas, y puede ser glicosilada de modo diferente en uno o más sitios dependiendo de las condiciones de cultivo exactas y de las etepas que se llevaron a cabo. Un experto en la técnica podrá modificar de modo apropiado las etapas y composiciones utilizadas para producir una glicoproteina particular de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención con el objeto de optimizar el crecimiento celular y el patrón de glicosilación y/o la producción de cualquier glicoproteina expresada determinada. En ciertas modalidades, los inhibidores del factor de necrosis tumoral, en la forma de receptores del factor de necrosis tumoral alfa y beta (TNFR-1; EP 417.563 publicada el 20 de marzo de 1991; y TNFR-2, EP 417,014 publicada el 20 de marzo de 1991, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) se expresan de acuerdo con los sistemas y métodos de la presente invención (para una revisióm, véase Naismith and Sprang, J Inflamia. 47(1-2) '.1-1, 1995-96, incorporado en la presente como referencia en su totalidad) . De acuerdo con algunas modalidades, un inhibidor del factor de necrosis tumoral comprende un receptor de TNF soluble. En ciertas modalidades, un inhibidor del factor de necrosis tumoral comprende un TNFR-Ig soluble. En ciertas modalidades, los inhibidores de TNF de la presente invención consisten en formas solubles de TNFRI y TNFRII. En ciertas modalidades, los inhibidores de TNF de la presente invención son proteínas de unión a TNF solubles. En ciertas modalidades, los inhibidores de TNF de la presente invención son proteínas de fusión a TNFR-Ig, por ejemplo, TNFR-Fc o etanercept. Según se utiliza en la presente, "etanercept," se refiere a TNFR-Fc, el cual es un dímero de dos moléculas de la porción extracelular del receptor del TNF-OÍ p75, consistiendo cada molécula de una porción Fe de 235 amino ácidos de IgGl humana.

Introducción de Genes para la Expresión de Glicoproteínas dentro de Células Hospedantes Generalmente, una molécula de ácido nucleico introducida en la célula codifica la glicoproteína deseada a ser expresada de acuerdo con la presente invención. Alternativamente, una molécula de ácido nucleico puede codificar un producto génico que induce la expresión de la glicoproteína deseada por la célula. Por ejemplo, el material genético introducido puede codificar un factor de transcripción que activa la transcripción de una glicoproteina endógena o heteróloga. Alternativamente o adicionalmente, una molécula de ácido nucleico introducida puede incrementar la traducción o la estabilidad de una glicoproteina expresada por la célula. Los métodos adecuados para introducir ácidos nucleicos suficientes para lograr la expresión de una glicoproteina de interés dentro de células hospedantes de mamíferos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Gething et al., Na ture, 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979; Levinson et al. EP 117.060; y EP 117.058, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia. Para las células de mamíferos, los métodos comunes de introducción del material genético en células de mamíferos incluyen el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Erb (Virology, 52:456-457, 1978) o el Método lipofectamine™ (Gibco BRL) de Hawley-Nelson (Focus 15:73, 1993). Los aspectos generales de las transformaciones del sistema de células hospedantes de mamíferos se han descrito por Axel en la Pat. Estadounidense No. 4.399.216 emitida el 16 de agosto de 1983. En cuanto a diversas técnicas para introducir material genético en células de mamíferos, véase Keown et al., Métodos in Enzymology, 1989, Keown et al., Métodos in Enzymology, 185:527-537, 1990, y Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988. · En algunas modalidades, un ácido nucleico a introducirse se encuentra en forma de una molécula de ácido nucleico "desnuda". Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico introducida en una célula puede consistir solamente en el ácido nucleico que codifica la glicoproteína y los elementos de control genético necesarios. Alternativamente, un ácido nucleico que codifica la glicoproteína (incluyendo los elementos reguladores necesarios) puede estar contenido dentro de un vector plasmídico. Ejemplos representativos no limitativos de vectores adecuados para la expresión de glicoproteínas en células de mamíferos incluyen pCDNAl; pCD, véase Okayama, et al. Mol. Cell Biol. 5:1136-1142, 1985; pMClneo Poly-A, véase Thomas, et al. Cell 51:503-512, 1987; un vector de baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610; CDM8, véase Seed, B. Nature 329:840, 1987; y pMT2PC, véase Kaufman, et al. EMBO J. 6:187-195, 1987, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico a introducirse en una célula se encuentra contenida dentro de un vector viral. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la glicoproteína se puede insertar dentro del genoma viral (o un genoma viral parcial) . Los elementos reguladores que dirigen la expresión de la glicoproteína se pueden incluir con el ácido nucleico insertado dentro del genoma viral (es decir, unidos al gen insertado dentro del genoma viral) o pueden ser provistos por el genoma viral en sí mismo.

Se puede introducir ADN desnudo en las células mediante la formación de un precipitado que contiene el ADN y fosfato de calcio. Alternativamente, también se puede introducir en las células ADN desnudo mediante la formación de una mezcla del ADN y DEAE-dextrano y la incubación de la mezcla con las células o mediante la incubación de las células y el ADN conjuntamente en un amortiguador apropiado y sometiendo a las células a un pulso eléctrico de alto voltaje (por ejemplo, mediante electroporación) . Un método adicional para introducir células de ADN desnudo consiste en mezclar el ADN con una suspensión liposómica que contiene lipidos catiónicos. El complejo ADN/liposoma luego se incuba con las células. El ADN desnudo también se puede inyectar directamente dentro de las células, por ejemplo, mediante microinyección . Alternativamente, el ADN desnudo también se puede introducir en las células acomplejando el ADN a un catión, tal como polilisina, el cual se acopla a un ligando para un receptor de superficie celular (véase por ejemplo Wu, G. and Wu, C.H. J. Biol. Chem. 263:14621, 1988; Wilson et al. J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; y la Patente Estadounidense No. 5.166.320, cada uno de los cuales se incorpora por la presente como referencia en su totalidad) . La unión del complejo ADN-ligando al receptor facilita la recaptación del ADN mediante endocitosis mediada por receptor. La utilización de vectores . virales que contienen secuencias de ácidos nucleicos particulares, por ejemplo, un ADNc que codifica una glicoproteina, constituye una aproximación común para introducir secuencias de ácidos nucleicos dentro de una célula. La infección de células con un vector viral tiene la ventaja de que una gran proporción de células recibe el ácido nucleico, lo cual puede obviar la necesidad de la selección de células que han recibido el ácido nucleico. Adicionalmente, las moléculas codificadas dentro del vector viral, por ejemplo, a través de un ADNc contenido en el vector viral, generalmente se expresan de modo eficiente en las células que han recogido ácido nucleico de vector viral. Los retrovirus defectuosos están bien caracterizados para utilizar en transferencia génica para propósitos de terapia génica (para una revisión véase Miller, A.D. Blood 76:271, 1990) . Se puede construir un retrovirus recombinante teniendo un ácido nucleico que codifica uná glicoproteina de interés insertada dentro del genoma retroviral . Adicionalmente, las porciones del genoma retroviral se pueden remover para tornar defectuosa la replicación del retrovirus. El retrovirus de replicación defectuosa luego se empaca en viriones los cuales se pueden utilizar para infectar una célula objetivo a través de la utilización de un virus auxiliar mediante técnicas standard. El genoma de un adenovirus se puede manipular de modo tal que éste codifique y exprese una glicoproteina de interés pero que se inactive en términos de su capacidad para replicar en un ciclo de vida viral litica normal. Véase, por ejemplo, Berkner et al. BioTechniques 6:616, 1988; Rosenfeld et al. Science 252:431-434, 1991; y Rosenfeld et al. Cell 68:143-155, 1992. Los vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 dl324 o de otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) son conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Los adenovirus recombinantes son ventajosos en cuanto a que ellos no requieren dividir las células para ser vehículos de suministro de genes efectivos y se pueden utilizar para infectar una amplia variedad de tipos celulares, que incluyen el epitelio de las vías respiratorias (Rosenfeld et al., 1992, citado precedentemente), las células endoteliales (Lemarchand et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 89:6482-6486, 1992), los hepatocitos (Herz and Gerard, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 90:2812-2816, 1993) y las células musculares (Quantin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 89:2581-2584, 1992). Adicionalmente, el ADN adenoviral introducido (y el ADN foráneo contenido en el mismo) no se integra en el genoma de una célula hospedante sino que permanece episomal, evitando por consiguiente potenciales problemas que pueden ocurrir como resultado de la mutagénesis insercional en situaciones donde el ADN introducido se llega a integrar dentro del genoma hospedante (por ejemplo, ADN retroviral) . Más aún, la capacidad de carga del genoma adenoviral pare el ADN foráneo es grande (hasta 8 kilobases ) en relación con otros vectores de suministro génico (Berkner et al. citado precedentemente; Haj-Ahmand and Graham, J. Virol. 57:267, 1986). La mayoría de los vectores adenovirales con replicacion defectuosa actualmente en uso son delecionados para todo o partes de los genes El y E3 virales pero mantienen tanto como el 80% del material genético adenoviral. El virus adeno-asociado (A7AV, por sus siglas en inglés) es un virus defectuoso que ocurre naturalmente que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un virus herpes, como un virus auxiliar para la replicacion eficiente y un ciclo de vida productivo. (Para una reseña véase Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro, and Immunol . , 158:97-129, 1992). Éste es también uno de los pocos virus que puede integrar su ADN en células que no se dividen, y presenta una alta frecuencia de integración estable (véase por ejemplo Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol . 7:349-356, 1992; Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828, 1989; y McLaughlin et al., J. Virol. 62:1963-1973, 1989). Los vectores que contienen tan poco como 300 pares de bases de AAV se pueden empacar y se pueden integrar. El espacio para el ADN exógeno se limita a aproximadamente 4.5 kb. Se puede utilizar un vector AAV tal como aquél descrito en Tratschin et al. (Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260, 1985) para introducir ADN en las células. Una variedad de ácidos nucleicos se han introducido en diferentes * tipos celulares utilizando vectores AAV (véase por ejemplo Hermonat et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 81:6466-6470, 1984; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081, 1985; Wondisford et al., Mol. Endocrinol . 2:32-39, 1988; Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619, 1984; y Flotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790, 1993). Cuando el método utilizado para introducir moléculas de ácido nucleico en una población de células resulta en la modificación de una gran proporción de las células y en la eficiente expresión de la glicoproteina por las células, la población de células modificada se puede utilizar sin aislamiento adicional o subclonando las células individuales dentro de la población. Es decir, puede haber suficiente producción de la glicoproteina por la población de células de modo tal que no sea necesario el aislamiento celular adicional y la población se pueda utilizar inmediatamente para sembrar un cultivo celular para la producción de la glicoproteina. Alternativamente, puede ser deseable aislar y expandir una población homogénea de células a partir de unas pocas células o de una célula única que produce (n) la glicoproteina de modo eficiente . Como alternativa a la introducción de una molécula de ácido nucleico en una célula que codifica una glicoproteina de interés, el ácido nucleico introducido puede codificar otro polipéptido o proteina que induce o incrementa el nivel de expresión de la glicoproteína producida de modo endógeno por una célula. Por ejemplo, una célula puede ser capaz de expresar una glicoproteína particular pero puede fallar al hacerlo sin el tratamiento adicional de la célula. De modo similar, la célula puede expresar insuficientes cantidades de la glicoproteína para el propósito deseado. De este modo, un agente que estimula la expresión de la glicoproteína de interés se puede utilizar para inducir o incrementar la expresión de esa glicoproteína por la célula. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico introducida puede codificar un factor de transcripción que activa o regula en forma ascendente la transcripción de la glicoproteína de interés. La expresión del factor de transcripción conduce a su vez a la expresión, o a la expresión más fuerte de la glicoproteína de interés. En ciertas modalidades, un ácido nucleico que dirige la expresión de la glicoproteína se introduce de modo estable dentro de la célula hospedante. En ciertas modalidades, un ácido nucleico que dirige la expresión de la glicoproteína se introduce temporalmente dentro de la célula hospedante. Un experto/a en la técnica podrá seleccionar si introduce un ácido nucleico dentro de la célula ya sea de modo estable o temporalmente en base a sus necesidades experimentales. Un gen que codifica una glicoproteína de interés puede opcionalmente estar unido a uno o más elementos reguladores de control genético. En ciertas modalidades, un elemento de control genético dirige la expresión constitutiva de la glicoproteina . En ciertas modalidades, se puede utilizar un elemento de control genético que provee la expresión inducible de un gen que codifica la glicoproteina de interés. La utilización de un elemento de control genético inducible (por ejemplo, un promotor inducible) permite la modulación de la producción de la glicoproteina en la célula. Ejemplos no limitativos de elementos de control genético inducibles potencialmente útiles para utilizar en células eucarióticas incluyen elementos regulados por hormonas (por ejemplo, véase Mader, S. and White, J.H., Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 90:5603-5607, 1993), elementos regulados por ligandos sintéticos (véase, por ejemplo Spencer, D.M. et al., Science 262:1019-1024, 1993) y elementos regulados por radiación ionizante (por ejemplo, véase Manóme, Y. et al., Biochemistry 32:10607-10613, 1993; Datta, R. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 89:10149-10153, 1992). Se pueden utilizar de acuerdo con la invención sistemas de células especificas u otros sistemas reguladores adicionales conocidos en la técnica. Un experto en la técnica podrá seleccionar y, opcionalmente, modificar de modo apropiado el método de introducción de genes que ocasiona que la célula exprese la glicoproteina de interés de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención.

Células Cualquier célula hospedante susceptible a cultivo celular, y a la expresión de glicoproteinas , se puede utilizar de acuerdo con la presente invención. En ciertas modalidades, una célula hospedante es de mamífero. Ejemplos no limitativos de células de mamíferos que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención incluyen línea de mielorna de ratón BALB/c (NSO/1, ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos)); línea de riñon de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (293 o 293 células subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol . , 36:59,1977); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); . células de ovario de hámster chino +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU, 77:4216, 1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ; células de hígado humano (Hep G2, HB 8065) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2) . Adicionalmente, cualquier cantidad de líneas celulares de hibridoma disponibles en el comercio y no en el comercio que expresan glicoproteinas se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención. Un experto en la técnica apreciará que las líneas celulares de hibridoma podrían tener diferentes requirimientos nutricionales y/o podrían requerir diferentes condiciones de cultivo para un crecimiento y expresión de glicoproteinas óptimo, y podrá modificar las condiciones según sea necesario. Según se indicó precedentemente, en muchos casos las células se seleccionarán o someterán a ingeniería para producir altos niveles de glicoproteinas. A menudo, las células serán manipuladas por la mano del hombre para producir altos niveles de glicoproteinas, por ejemplo mediante la introducción de un gen que codifica la gíicoproteína de interés y/o mediante la introducción de elementos de control genético que regulan la expresión de ese gen (ya sea endógeno o introducido) . Un experto en la técnica apreciará que las glicoproteinas producidas en diferentes tipos celulares pueden contener diferentes patrones de glicosilación resultantes. Por ejemplo, Przybylo et al. demostraron que los patrones de glicosilación de las cadherinas diferían cuando se expresaban en cánceres de la vejiga urinaria de células transicionales, de células HCV29 transfectadas con v-raf y de células epiteliales de uréter no malignas (véase Przybylo et al., Cáncer Cell International, 2(1) : 6, 2002) . Lifely et al. demostraron que el patrón de glicosilación y la actividad biológica de un anticuerpo IgG humanizado diferian cuando se expresaban en lineas celulares de CHO, mieloma YO y mieloma NSO (véase Lifely et al., Glycobiology . 5(8) : 813-22, 1995) . Un experto en la técnica podrá seleccionar una linea celular deseable para la producción de una glicoproteina particular sin experimentación indebida. Independientemente de cuál linea celular se selecciona finalmente, una glicoproteina puede ser expresada de acuerdo con la presente invención, resultando en un patrón de glicosilación más extenso. Ciertas glicoproteinas pueden tener efectos perjudiciales en el crecimiento celular, en la viabilidad celular o en alguna otra característica de la células que finalmente limite la producción de la glicoproteina de interés de alguna manera. Aún entre una población de células de un tipo particular sometidas a ingeniería para expresar una glicoproteina específica, existe variabilidad dentro de la población celular de modo tal que ciertas células individuales crecerán mejor, producirán más glicoproteina de interés, producirán una glicoproteina con un patrón de glicosilación más extenso, o producirán una glicoproteina cuyo patrón de glicosilación refleje con más precisión el patrón de glicosilación de la glicoproteina que ocurre naturalmente. En ciertas modalidades, una linea celular es seleccionada de modo empírico por el practicante para el crecimiento fuerte bajo las condiciones particulares elegidas para el cultivo de las células. En algunas modalidades, las células individuales sometidas a ingeniería para expresar una glicoproteina particular son seleccionadas para la producción a gran escala en base al crecimiento celular, a la densidad celular final, al porcentaje de viabilidad celular, al título de la glicoproteina expresada, a la extensión y composición de las cadenas laterales de oligosacáridos o a cualquier combinación de éstas o de cualquiera de otras condiciones consideradas importantes por el practicante.

Cultivo de las Células La presente invención se puede utilizar con cualquier método de cultivo celular que sea susceptible a la expresión de glicoproteínas . Por ejemplo, las células se pueden hacer crecer en cultivos por lote o por lote alimentado, donde el cultivo se termina luego de la expresión suficiente de la glicoproteina, luego de lo cual se recoge la glicoproteina expresada. Alternativamente, las células se pueden hacer crecer en cultivos de perfusión, donde el cultivo no se termina y nuevos nutrientes y otros componentes se adicionan periódicamente o continuamente al cultivo, durante lo cual la glicoproteina expresada se recoge periódicamente o continuamente . Las células se pueden hacer crecer en cualquier volumen conveniente seleccionado por el practicante. Por ejemplo, las células se pueden hacer crecer en recipientes de reacción a pequeña escala con un intervalo en volumen desde unos pocos mililitros hasta varios litros. Alternativamente, las células se pueden hacer crecer en Biorreactores comerciales a gran escala con un intervalo en volumen desde aproximadamente al menos 1 litro hasta 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 litros o más, o cualquier volumen intermedio. La temperatura de un cultivo celular se seleccionará en base principalmente al intervalo de temperaturas en el cual el cultivo celular permanece viable, al intervalo en el cual se produce un alto nivel de glicoproteinas y/o al intervalo en el cual la glicoproteina expresada contiene un patrón de glicosilación deseable. Por ejemplo, las células CHO crecen bien y pueden producir glicoproteinas con patrones de glicosilación deseables a niveles comercialmente adecuados a aproximadamente 37°C. En general, la mayoría de las células de mamíferos crecen bien y pueden producir glicoproteinas con patrones de glicosilación deseables a niveles comercialmente adecuados dentro de un intervalo de aproximadamente 25°C hasta 42 °C, aunque los métodos enseñados por la presente revelación no se limitan a estas temperaturas. Ciertas células de mamíferos crecen bien y pueden producir glicoproteínas con patrones de glicosilación deseables a niveles comercialmente adecuados dentro del intervalo de aproximadamente 35 °C hasta 40°C. En ciertas modalidades, un cultivo celular se hace crecer a una temperatura de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45°C a una o más veces durante el proceso de cultivo celular. Aquéllos de experiencia corriente en la técnica podrán seleccionar la temperatura o temperaturas apropiadas en las cuales hacer crecer a las células, dependiendo de las necesidades particulares de las células y de los requirimientos de producción particulares del practicante. Más aún, un cultivo se puede someter a uno o más cambios de temperatura durente el curso del cultivo. Cuando se cambia la temperatura de un cultivo, el cambio de temperatura puede ser relativamente gradual. Por ejemplo, puede llevar varias horas o días completar el cambio de temperatura. Alternativamente, el cambio de temperatura puede ser relativamente abrupto. La temperatura se puede incrementar o disminuir constantemente durante el proceso de cultivo. Alternativamente, la temperatura se puede incrementar o disminuir en cantidades discretas en varios momentos durante el proceso de cultivo. La ( s ) subsiguiente ( s ) temperatura ( s ) o intervalo (s) de temperatura pueden ser inferior (es) o superior (es) a las temperatura ( s ) o intervalo (s) de temperatura inicial (es) o -previo (s). Un experto en la técnica comprenderá que se incluyen en esta modalidad múltiples cambios discretos de temperatura. Por ejemplo, la temperatura se puede cambiar una vez (o bien a una temperatura o intervalo de temperatura más alto o más bajo) , manteniendo las células a esta temperatura o intervalo de temperatura durante un cierto periodo de tiempo, luego del cual la temperatura se puede cambiar nuevamente a una nueva temperatura o intervalo de temperatura, los cuales pueden ser o bien más altos o más bajos que la temperatura o los intervalos de temperatura de la temperatura o intervalo de temperatura previos . La temperatura del cultivo luego de cada cambio discreto puede ser constante o se puede mantener dentro de un cierto intervalo de temperaturas . Al igual que la temperatura o intervalo de temperatura inicial, la temperatura o intervalo de temperatura de un cultivo celular luego de el (os) cambio (s) de temperatura generalmente se selecciona en base principalmente a la (s) temperatura ( s ) en la ( s ) cual (es) el cultivo celular permanece viable, al intervalo en el cual se produce un alto nivel de glicoproteina y/o al intervalo en el cual la glicoproteina expresada contiene un patrón de glicosilación deseable. En general, la mayoría de las células de mamíferos permanecen viables y expresan glicoproteínas con patrones de glicosilación deseables a niveles comercialmente adecuados dentro de un intervalo de aproximadamente 25°C hasta 42°C, aunque los métodos enseñados por la presente revelación no se limitan a estas temperaturas. En ciertas modalidades, las células de mamíferos permanecen viables y expresan glicoproteínas con patrones de glicosilación deseables a niveles comercialmente adecuados dentro de un intervalo de aproximadamente 25°C hasta 35°C. Aquéllos de experiencia corriente en la técnica podrán seleccionar temperatura (s) o intervalo (s) de temperatura apropiado (s) en los cuales hacer crecer a las células, dependiendo de las necesidades particulares de las células y de los requerimientos de producción particulares del practicante. Las células se pueden hacer crecer durante cualquier cantidad de tiempo, dependiendo de las necesidades del practicante y del requirimiento de las células en sí mismas. En ciertas modalidades, las reacciones de lote y de lote alimentado se terminan una vez que la glicoproteína expresada alcanza un título lo suficientemente alto y/o una vez que la glicoproteína expresada presenta un patrón de glicosilación deseable, según se determine por las necesidades del practicante. Adicionalmente o alternativamente, las reacciones de lote y de lote alimentado se pueden terminar una vez que las células alcancen una densidad lo suficientemente alta, según se determine por las necesidades del practicante. Por ejemplo, el cultivo se puéde terminar una vez que las células alcancen el 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 porciento de la densidad celular viable máxima. Adicionalmente o alternativamente, las reacciones de lote y de lote alimentado se pueden terminar antes de la excesiva acumulación de productos de desecho metabólico tales como lactato y amonio. En ciertos casos, puede ser beneficioso suplementar un cultivo celular durante la subsiguiente fase de producción con nutrientes u otros componentes del medio que se han deplecionado o metabolizado por las células. Como ejemplos no limitativos, puede ser beneficioso suplementar un cultivo celular con hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones inorgánicos (tales como, por ejemplo, sodio, cloruro, calcio, magnesio, y fosfato) , amortiguadores, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, elementos traza (compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales muy bajas) , amino ácidos, lipidos, o glucosa u otra fuente de energía. Los componentes suplementarios pueden ser todos adicionados al cultivo celular en una vez, o ellos se pueden proveer al cultivo celular en una serie de adiciones. En ciertas modalidades, las células se hacen crecer de acuerdo con cualquiera de los métodos de cultivo celular descritos en la Solicitud de Patente Estadounidense Provisional Acta No. 60/605,097, incorporada en la presente como referencia. En ciertas modalidades, las células se hacen crecer bajo una o más de las condiciones descritas en la Solicitud de Patente Estadounidense Acta No. 11/213,308, incorporada en la presente como referencia. Un experto en la técnica podrá adecuar las condiciones de cultivo celular especificas con el objeto de optimizar ciertas características del cultivo celular que incluyen pero no se limitan a tasa de crecimiento, viabilidad celular, densidad celular final del cultivo celular, concentración final de subproductos metabólicos perjudiciales tales como lactato y amonio, título final de la glicoproteína expresada, extensión y composición de las cadenas laterales de oligosacáridos o cualquier combinación de éstas u otras condiciones consideradas importantes por el practicante.

Aislamiento de la Glicoproteína Expresada En general, típicamente será deseable aislar y/o purificar las glicoproteínas expresadas de acuerdo con la presente invención. En ciertas modalidades, la glicoproteína expresada es segregada hacia el medio y de este modo se pueden remover las células y otros sólidos, tanto como por centrifugación como por filtrado por ejemplo, como una primera etapa en el proceso de purificación. Alternativamente, la glicoproteína expresada puede estar unida a la superficie de la célula hospedante. Por ejemplo, los medios se pueden remover y las células hospedantes que expresan la glicoproteina son Usados como una primera etapa en el proceso de purificación. La lisis de las células hospedantes de mamíferos se puede lograr a través de cualquier cantidad de medios muy conocidos por aquéllos de experiencia corriente en la técnica, incluyendo la disrupción física mediante esferas de vidrio y la exposición a condiciones de alto pH. La glicoproteina expresada se puede aislar y purificar a través de métodos standard que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, afinidad, exclusión de tamaño, e hidroxiapatita) , filtración en gel, centrifugación, o solubilidad diferencial, precipitación con etanol y/o a través de cualquier otra técnica disponible para la purificación de proteínas (Véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principies and Practice 2da Edición, Springer-Verlag, Nueva York, 1987; Higgins, S.J. and Hames, B.D. (eds. ) , Protein Expression : A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; y Deutscher, M.P., Simón, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification : Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol . 182), Academic Press, 1997, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia) . Para la cromatografía de inmunoafinidad en particular, la glicoproteina se puede aislar mediante su unión a una columna de afinidad que comprende anticuerpos que se formaron contra esa glicoproteina y se fijaron a un soporte estacionario. Alternativamente, etiquetas de afinidad tales como una secuencia de cubierta de influenza (influenza coat sequence) , poli-histidina, o glutatión-S-transferasa se puede unir a la glicoproteina a través de técnicas recombinantes standard para permitir la sencilla purificación mediante el pasaje sobre la columna de afinidad apropiada. Pueden ser adicionados inhibidores de proteasa tales como fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF) , leupeptina, pepstatina o aprotinina en cualquiera o en todas las etapas con el objeto de reducir o eliminar la degradación de la glicoproteina durante el proceso de purificación. Los inhibidores de proteasa son particularmente ventajosos cuando las células deben ser Usadas con el objeto de aislar y purificar la glicoproteina expresada. Adicionalmente o alternativamente, se pueden adicionar inhibidores de glicosidasa en cualquiera o en todas las etapas con el objeto de reducir o eliminar el recorte enzimático de cadenas de oligosacáridos unidas covalentemente. Las glicoproteinas expresadas de acuerdo con la presente invención pueden tener patrones de glicosilación más extensos, u alterados de otra manera, que los que tendrían si crecieran bajo condiciones de cultivo celular tradicionales. De este modo, un beneficio práctico de la presente invención del cual se puede sacar provecho en la etapa de purificación es que los residuos de azúcar adicionales - y/o alterados en una glicoproteina que creció de acuerdo con ciertos de los presentes métodos de la invención pueden conferir sobre ésta distintas propiedades bioquímicas que pueden ser utilizadas por el practicante para purificar esa glicoproteina de modo más sencillo, o hasta una pureza mayor, que lo que sería posible para una glicoproteina que creció de acuerdo con métodos más tradicionales. Un experto en la técnica apreciará que la técnica de purificación exacta variará dependiendo del carácter de la glicoproteina a ser purificada, del carácter de las células a partir de las cuales se expresa la glicoproteina, y/o de la composición del medio en el cual crecieron las células.

Composiciones Inmunogénicas Las glicoproteínas producidas de acuerdo con las enseñanzas de la presente revelación también se pueden utilizar en composiciones inmunogénicas, por ejemplo, como vacunas. En ciertas modalidades, un patrón de glicosilación mejorado logrado mediante la producción de glicoproteínas de acuerdo con ciertos métodos de la presente invención puede resultar en una composición inmunogénica más efectiva. Por ejemplo, la composición inmunogénica que contiene la glicoproteina producida puede ocasionar una respuesta inmune más efectiva en la cual el sistema inmune del sujeto produce una mayor cantidad de anticuerpos a la glicoproteina y/o produce anticuerpos que presentan una mayor especificidad para la glicoproteina inmunogénica . Adicionalmente o alternativamente, la glicoproteina puede ocasionar una respuesta inmune con menos efectos secundarios y/o menos graves. En ciertas modalidades, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden una o más glicoproteinas . Adicionalmente o alternativamente, una composición inmunogénica de la invención puede incluir uno o más portadores fisiológicamente aceptables. En general, la selección de la "cantidad efectiva" o dosificación apropiada para los componentes de una(s) composición (es) inmunogénica ( s ) de la invención se basa en una variedad de factores, que incluyen pero no se limitan a, la identidad de la ( s ) glicoproteina ( s ) seleccionada (s) en la composición inmunogénica empleada, el patrón de glicosilación de la ( s ) glicoproteina ( s ) , y la condición física del sujeto, aún más especialmente incluyendo la salud general, edad y/o peso del sujeto inmunizado. Según se conoce en la técnica, los métodos y las vías de administración particulares y la presencia de componentes adicionales en las composiciones inmunogénicas también pueden afectar las dosificaciones y cantidades de composiciones de plásmidos de ADN. La selección y regulación ascendente o descendente de la dosis efectiva se encuentra dentro de la experiencia de la técnica. La cantidad de composición inmunogénica requerida para inducir una respuesta inmune, que incluye pero no se limita a una respuesta protectora, o para producir un efecto exógeno en el paciente sin significativos efectos secundarios adversos varia dependiendo de estos factores. Las dosis adecuadas son fácilmente determinadas por las personas expertas en la técnica . Ciertas composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden contenen un adyuvante. Un adyuvante es una sustancia que mejora la respuesta inmune cuando se administra conjuntamente con un inmunógeno o antigeno. Se ha demostrado que una cantidad de citoquinas o linfoquinas poseen actividad moduladora inmune, y de este modo se pueden utilizar como adyuvantes, que incluyen, pero no se limitadan a, las interleuquinas 1-a, 1-ß, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,723,127, incorporada en la presente como referencia en su totalidad), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas imitantes) , los interferones- , ß y Y, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,078,996, incorporada en la presente como referencia en su totalidad) , factor estimulante de colonias de macrófagos, factor estimulante de colonias de granulocitos, GSF, y los factores de necrosis tumoral a y ß . Aún otros adyuvantes útiles en esta invención incluyen una quimioquina, que incluye sin limitación, MCP-1, ???-?a, ???-?ß, y RANTES . Las moléculas de adhesión, tales como una selectina, por ejemplo, L-selectina, P-selectina y E-selectina también pueden ser útiles como adyuvantes. Aún otros adyuvantes útiles incluyen, sin limitación, una molécula tipo mucina, por ejemplo, CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1, un miembro de la familia integrina tal como LFA-1, VLA-1, Mac-1 y pl50,95, un miembro de la superfamilia inmunoglobulina tal como PECA , ICAMs, por ejemplo, ICA -1, ICAM-2 y ICAM-3, CD2 y LFA-3, moléculas co-estimuladoras tales como CD40 y CD40L, factores de crecimiento que incluyen factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, B7,2, PDGF, BL-1, y factor de crecimiento endotelial, moléculas receptoras que incluyen Fas, receptor TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4 , DR5, KILLER, TRAIL-R2 , TRICK2, y DR6. Aún otra molécula de adyuvante incluye Caspase (ICE) . Véase también, la Publicaciones de Patentes Internacionales Nos. W098/17799 y W099/43839, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Son también -útiles como adyuvantes las toxinas del cólera (CT, por sus siglas en inglés) y los mutantes de las mismas, incluyendo aquéllos descritos en la publicada Solicitud de Patente Internacional número WO 00/18434 (en donde el ácido glutámico en la posición 29 del amino ácido se reemplaza por otro amino ácido (distinto al ácido aspártico) , con preferencia una histidina) . Los imitantes o las CTs similares se describen en la publicada Solicitud de Patente Internacional número WO 02/098368 (en donde la isoleucina en la posición 16 del amino ácido se reemplaza con otro amino ácido, ya sea solo o en combinación con el reemplazo de la serina en la posición 68 del amino ácido con otro amino ácido; y/o en donde la valina en la posición 72 del amino ácido se reemplaza con otro amino ácido) . Otras toxinas CT se describen en la publicada Solicitud de Patente Internacional número WO 02/098369 (en donde la arginina en la posición 25 del amino ácido se reemplaza con otro amino ácido; y/o un amino ácido se inserta en la posición 49 del amino ácido; y/o dos amino ácidos se insertan an las posiciones 35 y 36 del amino ácido) . Cada una de estas referencias se incorpora en la presente en su totalidad. En ciertas modalidades, las composiciones inmunogénicas de la presente invención se administran a un humano o a un vertebrado no humano a través de una variedad de vías que incluyen, pero no se limitan a, intranasal, oral, vaginal, rectal, parenteral, intradérmica, transdérmica (véase por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional No. WO 98/20734, la cual se incorpora por la presente como referencia en su totalidad) , intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, intravenosa e intraarterial . La via apropiada se puede seleccionar dependiendo de la naturaleza de la composición inmunogénica utilizada, de una evaluación de la edad, peso, sexo y salud general del paciente y de los antigenos presentes en la composición inmunogénica, y/o de otros factores conocidos por aquéllos de experiencia corriente en la técnica.

En ciertas modalidades, las composiciones inmunógenicas se administran múltiples veces. -El orden de administración de la composición inmunogénica y los periodos de tiempo entre las administraciones individuales pueden ser seleccionados por un experto en la técnica en base a factores relevantes conocidos por aquéllos de experiencia corriente en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, las características físicas y las respuestas precisas del hospedante a la aplicación del método .

Formulaciones Farmacéuticas En ciertas modalidades, las glicoproteínas producidas tendrán actividad farmacológica y serán útiles en la preparación de farmacéuticos. Las composiciones de la invención según se describieron precedentemente se pueden administrar a un sujeto o se pueden formular primero para el suministro a través de cualquier vía disponible que incluye, pero no se limita a las vías parenteral (por ejemplo, intravenosa) , intradérmica, subcutánea, oral, nasal, bronquial, oftálmica, transdérmica (tópica) , transmucosa, rectal, y vaginal. Las composiciones farmacéuticas de la invención típicamente incluyen una glicoproteina purificada expresada a partir de una linea celular de mamífero, un agente de suministro (es decir, un polímero catiónico, un transportador molecular de péptidos , un surfactante, etc., según se describió precedentemente) en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Según se utiliza en la presente el lenguaje "portador farmacéuticamente aceptable" incluye solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retardo de absorción e isotónicos, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos suplementarios. Por ejemplo, una glicoproteina producida de acuerdo con la presente invención se puede conjugar adicionalmente con otros fármacos para la farmacoterapia sistémica, tales como toxinas, fármacos citotóxicos de bajo peso molecular, modificadores de la respuesta biológica, y radionúclidos (véase por ejemplo, Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrier conjugates, US20040082764 Al) . Alternativamente o adicionalmente, una proteína o polipéptido producido de acuerdo con la presente invención se puede administrar en combinación con (ya sea simultáneamente o secuencialmente) uno o más agentes farmacéuticamente activos adicionales. Una lista ej emplificativa de estos agentes farmacéuticamente activos se puede encontrar en Physicians' Desk Reference, 55 Edición, publicado por Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ, 2001, incorporado en la presente como referencia. Para muchos de estos agentes enumerados, las dosificaciones y regímenes farmacéuticamente efectivos se conocen en la técnica; muchos se presentan en Physicians' Desk Reference en sí mismo. Una composición farmacéutica se formula de modo ventajoso para ser compatible con su vía de administración pretendida. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como bencil alcohol o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para la regulación de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede regular con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede incluir en ampollas, jeringas descartables o viales de dosis múltiples elaborados de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable típicamente incluyen dispersiones o soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o amortiguador fosfato salino (PBS) . En todos los casos, la composición deberla ser estéril y debería ser fluida para que pueda colocarse con facilidad en la jeringa. Ciertas formulaciones farmacéuticas de la presente invención son estables bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y se deben preservar frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. En general, un portador relevante puede ser un medio de dispersión o solvente que contiene, por ejemplo, agua, etanol , poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol, y polietilen glicol líquido, y similares) , y las mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y a través de la utilización de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr a través de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será ventajoso incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Se puede ocasionar la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando la glicoproteina purificada en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados precedentemente, según sea requerido, seguido por la esterilización con filtros. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando la glicoproteina purificada expresada a partir de una linea celular de mamífero en un vehículo estéril el cual contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de aquéllos enumerados precedentemente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación incluyen, por ejemplo, secado al vacío y liofilización lo cual produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Para el propósito de la administración terapéutica oral, la glicoproteina purificada se puede incorporar con excipientes y utilizar en forma de comprimidos, trociscos, o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina. Las composiciones orales también se pueden preparar utilizando un portador fluido para utilizar como un enjuague bucal. Se pueden incluir como parte de la composición materiales adyuvantes, y/o agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido alginico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un glidante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como saborizante de menta, salicilato de metilo, o de naranja. Las formulaciones para el suministro oral pueden incorporar de modo ventajoso agentes para mejorar la estabilidad dentro del tracto gastrointestinal y/o para mejorar la absorción. Para la administración mediante inhalación, las composiciones de la invención que comprenden una glicoproteína purificada expresada a partir de una línea celular de mamífero y un agente de suministro se proporcionan de modo ventajoso en forma de un spray en aerosol a partir de un envase o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador. La presente invención contempla particularmente el suministro de las composiciones utilizando un spray, inhalador nasal, u otro suministro directo hacia las vias respiratorias superiores y/o inferiores. Se ha demostrado que la administración intranasal de vacunas de ADN dirigidas contra los virus influenza induce respuestas de las células CD8 T, indicando que al menos algunas células en el tracto respiratorio pueden recoger ADN cuando se suministran a través de esta vía, y los agentes de suministro de la invención mejorarán la recaptación celular. De acuerdo con ciertas modalidades, las composiciones que comprenden una glicoproteína purificada expresada a partir de una línea celular de mamífero y un agente de suministro se formulan como grandes partículas porosas para la administración en aerosol.

La administración sistémica también puede tener lugar a través de medios transmucosos o transdérmicos . Para la administración transmucosa o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a ser penetrada. Los penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr a través de la utilización de supositorios o sprays nasales. Para la administración transdérmica, la glicoproteína purificada y los agentes de suministro se formulan en ungüentos, pomadas, geles, o cremas según se conoce generalmente en la técnica. Las composiciones también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para el suministro rectal. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención contienen excipientes opcionales tales como un anestésico local, un péptido, un lipido que incluye lipidos catiónicos, un liposoma o partícula lipídica, un policatión tal como polilisina, un policatión ramificado, tri-dimensional tal como un dendrímero, un carbohidrato, un anfífilo catiónico, un detergente, un surfactante de bencilamonio, u otro compuesto que facilite la transferencia de polinucleótidos a las células. Los agentes facilitadores incluyen los anestésicos locales bupivacaína o tetracaína (véase por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,593,972; 5,817,637; 5,380,876; 5,981,505 y 6,383,512 y la Publicación de Patente Internacional No. W098/17799, cada una de las cuales se incorpora por la presente como referencia en su totalidad) . En ciertas modalidades, las composiciones se preparan con portadores que protegerán a la glicoproteína frente a la rápida eliminación del cuerpo, tal - como una formulación de liberación controlada, que incluye sistemas de suministro microencapsulado e implantes. Se pueden utilizar polímeros biodegradables , bi o compatibles , tales como vinil acetato de etileno, polianhí dridos , ácido poliglicólico , colágeno, poliortoéster es , y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de las formulaciones serán evidentes para aquéllos expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a las células infectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos virales) . Las suspensiones se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por aquéllos expertos en la técnica, por ejemplo, según se describe en la Patente Estadounidense No. 4,522,811, incorporada en la presente como referencia en su totalidad . Puede ser ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosificación unitaria para una fácil administración y una uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria según se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratarse, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de glicoprot eina activa calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. Una glicoproteina expresada de acuerdo con la presente invención se puede administrar en varios intervalos y durante diferentes periodos de tiempo según sea requerido, por ejemplo, una vez por semana durante entre aproximadamente 1 a 10 semanas, entre 2 a 8 semanas, entre aproximadamente 3 a 7 semanas, aproximadamente 4, 5, o 6 semanas, etc. El experto en la técnica apreciará que ciertos factores pueden ejercer influencia en la dosificación y en el cálculo del tiempo requeridos para tratar a un sujeto de modo efectivo, que incluyen pero no se limitan a la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Generalmente, el tratamiento de un sujeto con una glicoproteina según se describe en la presente puede incluir un tratamiento único o, en muchos casos, puede incluir una serie de tratamientos. Se comprenderá que las dosis apropiadas pueden depender de la potencia de la glicoproteina y que opcionalment e se pueden adecuar al receptor particular, por ejemplo, a través de la administración de dosis crecientes hasta que se logre una respuesta deseada preseleccionada . Más aún se comprenderá que el nivel de dosificación especifico para cualquier sujeto animal particular puede depender de una variedad de factores que incluyen la actividad de la glicoproteina especifica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el género, y la dieta del sujeto, el tiempo de administración, la via de administración, la velocidad de excreción, cualquier combinación de fármacos, y/o el grado de expresión o actividad a modularse. La presente invención incluye la utilización de composiciones de la invención para el tratamiento de animales no humanos. En consecuencia, las dosis y métodos de administración se pueden seleccionar de acuerdo con principios de medicina y farmacología veterinaria conocidos. Se puede encontrar una orientación, por ejemplo, en Adams, R. (ed. ) , Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8va edición, Iowa State University- Press; ISBN: 0813817439; 2001. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden incluir en un envase, paquete, o distribuidor conjuntamente con instrucciones para la administración. La descripción precedente debe comprenderse como siendo solamente representativa y no pretende ser limitativa. Los métodos y materiales alternativos para implementar la invención y también las aplicaciones adicionales serán evidentes para un experto en la técnica, y pretenden ser incluidos dentro de las reivindicaciones que la acompañan.

Ejemplos Ejemplo 1: Formulaciones de Medios La presente invención comprende el descubrimiento de que las glicoproteinas producidas por un cultivo de células que crecieron en medios de cultivo que contienen manganeso en una o más concentraciones de la invención contienen patrones de glicosilación más extensos que los que ellas contendrían de otro modo si las células crecieran en medios tradicionales. El manganeso se puede adicionar a cualquier medio de cultivo que sea capaz de sustentar el crecimiento celular. Los medios de cultivo ej emplificativos a los cuales se puede adicionar manganeso dentro de cualquiera de las concentraciones de la invención se enumeran en la Tabla 1, aunque la presente invención no se encuentra limitada a la utilización de estos medios de cultivo. Según comprenderá un experto en la técnica, se pueden utilizar otros medios de cultivo para hacer crecer a las células y/o se pueden efectuar ciertas alteraciones a las composiciones de los medios de cultivo ej emplificativos que se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. Medios de cultivo ej emplificativos . Medio A Madio B sdio C Medio D Medio E Amino ácidos mg/L mM mg/L IDM mg/L mM mg/L mM mg/L mM alanina 24.87 24.87 0.28 96.03 1.08 0.28 17.80 0.20 arginina 1186.99 423.43 347.97 84.00 423.43 2.43 6.82 2.43 2.00 0.40 asparagina·H20 713.59 173.90 173.90 1.16 4.76 1.16 75.00 0.50 ácido aspártico 318.53 52.72 52.72 0.40 2.39 0.40 26.20 0.20 cisteina«HCl'H20 70.01 35.10 70.01 0.40 70.01 0.40 0.40 70.19 0.40 0.20 1 cisteina*2HCl 297.09 62.09 62.09 0.20 0.95 0.20 62.25 0.20 ácido glutámico 41.08 0.28 29.40 0.20 glutamato monosódico 158.59 41.08 1.08 0.28 glutamina 1892.40 12.96 1162.40 1163.95 584.60 1162 7.96 7.96 7.97 4.00 glicina 95.88 35.92 30.00 35.92 0.48 1.28 0.48 30.00 0.40 0.40 histidina·HC1·H20 369.10 75.27 42.00 75.27 0.36 1.76 0.36 46.00 0.22 0.20 isoleucina 623.63 151.90 104.99 104.80 151.90 1.16 4.76 1.16 0.80 0.80 leucina 852.31 172.69 104.99 104.80 172.69 1.32 6.51 1.32 0.80 0.80 lisina*HCl 945.96 218.38 145.99 146.20 218.38 1.20 5.20 1.20 0.80 0.80 metionina 291.82 53.55 30.00 53.55 0.36 1.96 0.36 29.80 0.20 0.20 fenilalanina 428.62 98.81 66.00 98.81 0.60 2.60 0.60 65.99 0.40 0.40 prolina 372.25 96.40 96.40 0.84 3.24 0.84 68.99 0.60 serina 904.71 273.07 126.00 273.07 2.60 8.62 2.60 1.20 treonina 513.39 132.81 95.20 132.81 1.12 4.31 1.12 94.99 0.80 0.80 triptofano 159.32 28.99 16.00 28.99 0.14 0.78 0.14 16.00 0.08 0.08 tirosina·2Na·2H20 560.81 145.10 103.79 89.46 145.10 0.56 2.15 0.56 0.40 0.40 valina 505.36 131.17 93.60 131.17 1.12 4.32 1.12 93.99 0.80 0.80 Vitaminas mg/L pM mg/L pM mg/L µ? mg/L pM mg/L pM biotina 2.00 0.36 1.49 8.21 0.36 1.49 0.20 0.821 pantotenato de calcio 22.02 4.03 8.47 46.27 4.03 8.47 2.24 4.71 4.00 8.40 cloruro de colina 87.67 16.11 115.92 64.31 16.11 115.92 630.74 8.99 4.00 28.60 ácido fólico 25.95 4.76 10.80 58.84 4.76 10.80 2.65 6.01 4.00 9.10 inositol 123.39 22.64 125.79 12.60 70.00 22.64 125.79 685.47 7.00 38.90 nicotinamida 19.60 16.56 3.61 29.62 160.70 3.61 29.62 2.02 4.00 32.80 piridoxal'HCl 1.99 1.99 9.83 9.83 1.99 9.83 2.00 9.89 4.00 19.60 piridoxina·HCl 18.06 1.67 8.10 87.67 1.67 8.10 0.03 0.15 riboflavina 2.20 0.40 1.06 5.85 0.40 1.06 0.22 0.58 0.40 1.10 tiamina'HCl 21.51 3.92 11.64 63.84 3.92 11.64 2.17 6.44 4.00 11.90 vitamina B12 6.93 1.34 0.99 5.12 1.34 0.99 0.78 0.58 Sales Inorgánicas mg/L itM mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM CaCl2 115.78 115.78 116.1 200.0 115.78 1.04 1.04 1.04 1.046 1.80 KC1 310.94 310.94 311.8 400.0 310.94 4.17 4.17 4.17 4.179 5.40 Na2HP04 71.0 70.81 0.50 70.81 0.50 70.81 0.50 0.500 NaCl 1104. 96 3704.96 5539.0 6400.0 3704 63.44 18. 92 63.44 94.846 110.30 NaH2P04 «H20 636.33 62.5 140.0 114.33 0.83 4. 61 114.53 0.83 0.453 0.91 MgS04 48.8 48.70 0.41 48.70 0.41 48.70 0.41 0.407 MgS04«7H20 200.0 0.03 95.00 0.39 8.60 0.03 0.80 8. 60 MgCl2 28. 6 28.53 0.30 28.53 0.30 28.53 0.30 0.301 NaHC03 10 2000.00 2440.0 3700.0 2440 29.04 23. 81 1220.00 14.52 29.044 44.00 Eleaientos traza. pg/L riM pg/L ríM pg/L riM pg/L riM pg/L riM Selenito de Sodio 29.0 40.49 28.00 161.94 7.00 40.49 0.005 7.00 Fe (N03) 3' 9H20 124 49.86 123.42 49.86 123.42 49.86 123.42 0.050 0.10 250 CuS04 5.0 2. 69 16.80 0.97 6.06 0.001 0. 97 6.06 0.23 0.64 .0864 .24 0.036 0.0001 0.09 Putrescina«2HCl 15.39 6.48 40.22 2.48 15.39 1.080 0.0067 2.48 ácido linoleico 0.22 0.80 0.057 0.20 0.040 0.0001 0.06 0.20 ácido tióctico 0.56 2.73 0.14 0.69 0.100 0.0005 0.14 0.69 D-glucosa (Dextrosa) 16039 89107 11042.24 61350 8950.7 49.7 4500.0 25000 11042 61345 PVA 2560 2400.0 2400.0 2520 2520.00 0.00 Nucellin 10.00 54.00 14.00 10.000 14.00 0.00 Piruvato de Sodio 500 500 110.0 498.63 54.85 498.63 54.85 54.995 1000 54.85 En ciertas modalidades, las células se suplementan en una o más veces luego de que ha comenzado el cultivo inicial con uno o más medios de alimentación. Los medios de alimentación ej emplificativos se enumeran en la Tabla 2, aunque la presente invención no se limita a la utilización de estos medios de alimentación. Según comprenderá un experto en la técnica, se pueden utilizar otros medios de alimentación para hacer crecer las células y/o se pueden efectuar ciertas alteraciones a las composiciones de los medios de alimentación ej emplificativos enumerados en la Tabla 2. Por ejemplo, las concentraciones de uno o más componentes de los medios de alimentación se pueden incrementar o disminuir para lograr una concentración deseada de los componentes. En ciertas modalidades, la concentración de cada componente de medio de alimentación se incrementa o disminuye por el mismo factor. Por ejemplo, la concentración de cada componente de medio de alimentación se puede incrementar o disminuir por lx, 2 x , 3x, 4 x , 5x , ß , 7x , 8 x , 9x, 1 Ox , llx, 12x , 13x, 14x, 15x, 16x, 17x, 18x, 19x, 20x, 25x, 30x, 35x, 4 Ox , 45x, 5 Ox o más.

Tabla 2. Medios de alimentación ejemplificat Medio F Medio 6 Medio H Medio I Medio J Amino ácidos mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM alanina 27.47 1.60 142.48 1.60 17.81 0.20 213.72 2.40 0.31 142.47 arginina 1074.21 1528.84 8.79 1528 8.79 191.07 1.10 2292.84 13.20 6.17 asparagina·H2O 3200.00 1080.60 7.20 1080 7.20 270.05 1.80 3240.60 21.60 21.33 ácido aspárico 338.70 4.00 4.00 66.66 0.50 799.92 6.00 2.55 532.40 532.40 10 cisteina'HCl»H20 108.66 1.51 0.00 0.00 0.00 0.00 0.62 473.00 cisteína·2HC1 687.50 470 1.50 1.60 48.83 0.16 585.96 1.92 2.20 235.38 ácido glutámico 1.60 1.60 29.47 0.20 353.64 2.40 235.38 142.48 glutamato monosódico 52.17 0.31 glutamina 6000 41.10 4820 33.01 456.25 3.13 5475.00 37.56 glicina 178.26 1.60 1.60 15.01 0.20 180.12 2.40 2.38 120.07 120.07 histidina -HCl ·?20 732.50 2.80 2.80 73.53 0.35 882.36 4.20 3.49 588.33 588.32 isoleucina 880.87 7.21 7.21 118.05 0.90 1416.60 10.80 6.72 944.52 944.52 leucina 1590.79 1360.75 10.39 1360 10.39 170.07 1.30 2040.84 15.60 12.14 lisina'HCl 2162.93 1456.81 8.00 1456 8.00 182.07 1.00 2184.84 12.00 11.88 metionina 597.92 3.20 3.20 59.62 0.40 715.44 4.80 4.01 477.06 477.06 femlalanina 782.51 4.00 4.00 82.53 0.50 990.36 6.00 4.74 660.36 660.36 prolina 832.67 4.80 4.80 69.03 0.60 828.36 7.20 7.24 552.31 552.31 serina 1623.67 1264.70 12.04 1264 12.04 158.06 1.51 1896.72 18.12 15.46 treoriina 871.72 6.40 6.40 95.24 0.80 1142.88 9.60 7.33 762.02 762.02 triptofano 423.14 1.28 1.28 32.61 0.16 391.32 1.92 2.07 260.94 260.94 tirosina · 2Na · 2H20 1100.00 3.19 3.19 104.26 0.40 1251.12 4.80 4.21 832.62 832.62 valina 1156.01 6.40 6.40 93.64 0.80 1123.68 9.60 9.88 749.21 749.21 Vitsndjnas mg/L µ? mg/L pM mg/L pM mg/L pM mg/L pM biotina 4.14 13.44 0.01 17.81 73.00 4.92 20.16 16.96 3.28 3.28 Pantotenato de 33.84 36.02 75.67 36.02 0.08 calcio 191.07 401.41 54.00 113.52 71.14 cloruro de colina 1545 244.57 1759 143.28 1030 143.28 1.03 1943 270.05 214.92 ácido fólico 40.02 42.43 96.21 0.10 66.66 151.27 63.72 144.60 90.86 42.43 inositol 1680 253.09 1406 201.71 1120. 201.71 1.12 302.52 nicotinamida 40.48 331.93 32.018 262.44 0.26 48.83 400.41 48.00 393.60 32.02 piridoxal'HCl 3.13 29.47 145.17 15.42 piridoxina «HCl 55.76 207.68 32.82 159.32 0.16 2215 456.25 49.20 238.92 32.82 riboflavina 3.73 3.60 0.01 15.01 39.92 5.40 14.40 9.92 9.57 3.60 tiamina'HCl 100.86 299.28 35.22 104.51 0.10 73.53 218.19 92.88 275.40 35.22 vitamina B12 32.67 11.21 0.01 118.05 87.12 16.80 12.36 24.11 8.27 11.21 Sales Inorgánicas mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM mg/L mM CaCl2 179.9 1.62 113.27 1.02 KC1 482.9 6.47 KH2F¾ 1640 12.06 1635 12.02 Na2HP0 87.4 0.62 NaCl NaH2F04'H20 1496.8 10.85 130.50 0.95 1566.00 11.40 MgSQ, 213.0 1.77 170 171.98 0.70 MgS04'7H20 21.50 0.09 258.00 1.08 0.690 MgCl2 44.0 0.46 NaH83 Elenentos Traza g/L nM pg/L nM g/L nM g/L nM g/L nM Selenito de Sodio 0.069 0.400 40 231.35 40.00 231.35 5.00 28.92 60.00 347.04 Fe(NQ3)3'9H20 0.077 0.191 CuS04 0.016 0.099 21.51 21.51 0.43 2.69 5.16 32.28 3.44 3.44 CuS04-5H20 0.025 0.100 30.00 30.00 1.54 6.19 18.48 74.28 7.49 7.49 FeS04-7H20 2056 6859 24675 7.000 25.180 2534 9115 2534 9115 571.64 ZnS04«7H20 1421 4896 17062 4.075 14.199 2704 9421 2704 9421 408.08 nS04-H20 0.10 0.57 1.20 6.84 0.17 1.01 0.17 1.01 Na2Si03-9H20 3326 140 492.84 140 492.84 78.75 277.22 945.00 ( ?4)#4-,¾4·4?20 0.70 0.56 8.40 6.72 1.24 1.00 1.24 1.00 N¾V¾ 0.37 3.13 4.44 37.56 0.65 5.56 0.65 5.56 NiS04-6¾0 0.07 0.28 0.84 3.36 0.13 0.49 0.13 0.49 RbCl 10.01 10.01 1.21 1.21 ZrOCl2'8H20 9.99 9.99 3.22 3.22 Otros Canponentes mg/L mg/L mg/L uM mg/L mg/L µ? Hidrocortisona 0.79 0.04 0.10 0.48 1.20 0.288 0.794 0.288 Putrescina«2HCl 12.00 8 49.66 8 49.66 l.'OO 6.21 74.52 ácido linoleico 0.04 0.15 0.48 1.80 0.336 1.20 0.336 1.20 ácido tióctico 0.11 0.51 1.32 6.12 0.841 4.08 0.841 4.08 D-glucosa (Dextrosa) 4194.14 23300.80 50329 279609 43005 238922 33005 183.37 pva 2400 2400 2400 200.00 Nucellin 120.00 80 10.00 80.00 Piruvato de Sodio Ejemplo 2: Investigación a Pequeña Escala de Mapeo Peptidico de rFIX Introducción: Durante la producción de sustancia de fármaco a granel ("BDS", por sus siglas en inglés) de factor de coagulación sanguínea humano recombinante IX ("rFIX") , se observó una diferencia lote a lote en la relación área pico relativa ("RPAR", por sus siglas en inglés) del péptido K4 dentro del mapa peptidico. Las muestras se prepararon mediante la digestión con lisil endopeptidasa de Achromobacter lyticus ("AchroK", Wako catálog #129-02541) , y la subsiguiente resolución mediante HPLC de fase inversa. La RPAR del péptido K4 cayó por debajo del límite inferior del 82% de la muestra de control del material de referencia en ciertos lotes y alcanzó un mínimo del 78% de la muestra de control. El resto del material se encontró en el pico de K4 ' . La diferencia entre los dos picos se debe por completo a la extensión de la glicosilación en Ser-61. La especie K4 tiene un tetrasacárido Sia-a2, 3-Gal-pi, 4-GlcNAc- i, 3-Fuc-al-O unido a la serina, mientras que la especie K ' que se incrementó proporcionalmente sólo tiene fucosa. Se llevó a cabo un experimento de cultivo celular a alta escala durante un período en el cual tenían lugar diferencias en el mapa peptidico. Las células se hicieron crecer en un medio de cultivo celular que se suplemento con FeS04, CuS04 y cloruro de colina hasta 2X, 7X y 2X, respectivamente. La BDS producida a través de la purificación a pequeña escala de los lotes experimentales presentó RPAR de K4 mejorada, pero el material de control purificado de la misma manera no lo hizo. Los lotes con BDS pasaron los requerimientos del mapa peptidico (> 82% de la muestra de control) , aunque ellos no alcanzaron el nivel observado en el material de referencia. Ello indicó que la diferencia observada en los mapas de RPAR es un resultado del proceso de cultivo celular y que se podría relacionar con una deficiencia de nutrientes. Análisis de Muestra En-Proceso: Las células se removieron del medio de cultivo celular a través de las etapas de microfiltración ("MF") y ultrafiltración/diafiltración C"UF/DF") , resultando en material medianamente puro a partir de biorreactores individuales que se encontraban disponibles para el análisis. Para investigar si la especie K4 se está degradando nuevamente a la especie K ' (solamente fucosa) luego de la secreción a partir de la célula o no, se llevó a cabo un análisis modificado en una muestra en-proceso a partir del retentado de UF/DF. Se dividió una gran muestra del retentado en tres alícuotas iguales. Una se purificó inmediatamente sobre una columna de captura a escala pequeña; esto sirvió como un control negativo. Las otras dos se incubaron cada una durante la noche a 37 °C antes de ser purificadas en una manera similar. A una de las alícuotas durante la noche se le adicionó sialidasa para remover el ácido siálico terminal de la especie K4 en el caso de que el ácido siálico estuviera bloqueando la actividad de alguna otra glicosidasa. Luego de la purificación a pequeña escala, todas las tres muestras se analizaron en cuanto a la especie K4 como precedentemente. La Figura 1 muestra que no hubo degradación en cualquier muestra más allá de aquélla catalizada por la sialidasa. Ésta constituyó un indicio muy fuerte de que el problema del mapa peptidico era anabólico, lo cual significa que los residuos de azúcar "faltantes" en Ser-61 nunca se adicionaron a la cadena naciente. Permaneció siendo posible, aunque es extremadamente improbable, que la actividad glicosidica responsable de la remoción de esos residuos de azúcar se inactivo o removió mediante las etapas de MF y ÜF/DF. Los resultados también demostraron la utilidad del sistema de purificación a pequeña escala para analizar muestras a partir de la corriente ascendente de la etapa de Q Sefarosa. Modelado a pequeña escala: Cultivos de rFIX a pequeña escala que se hicieron crecer es frascos de agitación se utilizaron como modelo para evaluar los efectos de varios medios y aditivos en la especie K4. En cada caso, el medio acondicionado a partir de los frascos de agitación se purificó directamente (sin UF/DF) sobre una columna de captura a pequeña escala utilizando recolección de picos basada en volumen y se determinó la distribución de K4 en la muestra.

La utilidad del modelo a pequeña escala se demostró utilizando los mismos aditivos que en el experimento de escala completa. También se analizaron las adiciones de manganeso, puesto que una investigación de la literatura descubrió que se requiere Mn++ para una actividad de glicosilación similar de una enzima de mosca de la fruta (véase Moloney et al., J. Biol. Chem. 275(13): 9604-9611, 2000; Bruckner et al., Nature 406: 411-415, 2000) . Las comparaciones se llevaron a cabo durante cuatro pasajes en los frascos de agitación, y los resultados se muestran en la Figura 2. Se muestran las inyecciones por duplicado para cada muestra. ???#" indica el número de pasaje de cada condición. Para Pl-2, la concentración de Mn fue de 1 nM; para P3-4, ésta fue de 10 nM. La diferencia entre las distribuciones de la especie K4 del medio suplementado y del control se compara con la diferencia observada en los biorreactores de producción. Las diferencias se manifiestan luego de un pasaje único y los pasajes múltiples no revelan tendencias algunas. Dado que los aditivos incluyeron tres componentes ( FeSOa, CuS04 y cloruro de colina) , el siguiente experimento determinó cuál de estos componentes era el responsable de la mejorada distribución de especie K4. Los tres componentes se adicionaron a tres cultivos de frasco de agitación de rFIX. Los componentes se adicionaron en pares para revelar cualquier efecto sinérgico. Otros cultivos incluyeron controles positivos (todos los tres componentes) y negativos (sin aditivos) . La Figura 3 muestra que FeS04 era el aditivo que fue el responsable de auxiliar a mejorar la distribución de especie K4. Se muestran inyecciones por duplicado para cada muestra. Las adiciones tuvieron lugar a concentraciones experimentales. Parece que la adición de CuS04 y 'cloruro de colina, en ausencia de FeS04, aún puede tornar peor la distribución. Debería notarse que, por razones desconocidas, la forma de-sialilada de K4r comenzó a aparecer en mayor abundancia tante en las muestras de ensayo como en la referencia de ensayo. Esta tendencia es evidente en la Figura 3 y continúa en experimentos subsiguientes. El análisis de espectroscopia de plasma acoplado inductivamente ("ICP", por sus siglas en inglés) del contenido de hierro del polvo del medio demostró que la cantidad apropiada de hierro se encontraba presente en el polvo. Ello condujo a la hipótesis de que el beneficio derivado del FeS04 adicionado realmente se provoca por úna traza contaminante de esa materia prima. El lote de FeS04 que se utilizó en las condiciones del medio originales se analizó mediante análisis de ICP, y diversas trazas de impurezas aparecieron en niveles por encima del límite de detección. Mediante la eliminación de inhibidores y componentes conocidos del medio de cultivo celular de rFIX, la lista se redujo a los siguientes nueve elementos potencialmente beneficiosos: Sb, Bi, B, Co, Ge, Mn, Mo, Ni, y V. Luego, se llevaron a cabo experimentos de modelado a pequeña escala para explorar algunos otros posibles aditivos que podrían complementar los aditivos del medio originales. Se ensayaron CuS04, ZnS04 y MnS04 (hasta 10 nM) adicionales. El ZnS04 se incluyó porque el zinc puede inhibir de modo competitivo la recaptación de otros cationes divalentes. Por razones desconocidas, las condiciones experimentales y de control proporcionaron distribuciones de especie K4 muy similares que eran más como las que se habían observado previamente para las condiciones de control (véase la Figura 4, se muestran inyecciones por duplicado para cada muestra) . Sin embargo, la adición de MnS04 a la condición experimental claramente mejoró la distribución de especie K4. Parece que el ZnS04 adicionado puede haber tornado peor la distribución de especie K4, pero la significación de esa diferencia no es cierta . Se notó precedentemente que en la. Figura 3 se observó un incremento en el nivel del pico de K4' de-sialilado . Este fenómeno continuó y tuvo una tendencia ascendente durante el curso de los estudios a escala pequeña descritos. Esta tendencia no cambia la interpretación de los resultados según se presentan. Conclusión: El ensayo extensivo de eluatos de columna de captura a pequeña escala y en-proceso ha provisto una fuerte evidencia de que una diferencia en el polvo del medio provocó el cambio en la RPAR de K4, lo cual a su vez condujo a las múltiples diferencias de mapa peptidico. Debido a que la adición de ciertos componentes al medio de cultivo celular revirtió el cambio, en parte, fue probable que la diferencia en el polvo del medio consiste en que uno o más componentes cambiaron a niveles más bajos. Dado que el aditivo aún más efectivo descubierto fue el FeS04, y que el análisis de ICP mostró que el polvo del medio contenia la cantidad apropiada de Fe, por consiguiente se efectuó la hipótesis de que una traza de impureza en el FeS04 es necesaria para la glicosilación apropiada en Ser-61. En base al análisis de ICP del FeS04, la traza de impureza no era un componente especificado del polvo del medio, sino que más bien era un nutriente incidental que previamente había estado siempre presente en el medio.

Ejemplo 3: Estudios a Pequeña Escala del Impacto de Aditivos del Medio en el Mapa Peptidico de rFIX Introducción: El Ejemplo 2 demostró que las diferencias lote a lote en la extensión de la glicosilación en Ser-61 se observaron en diversos lotes de rFIX, lo cual se observa como un cambio en la distribución de la población de péptidos K4. Todos los lotes de rFIX tienen una distribución de longitudes de cadena en este sitio dominada por el tetrasacárido de longitud completa (Sia-o¡2, S-Gal-ß?, 4-GlcNAc- i, 3-Fuc-al) , pero algunos lotes tenían una fracción de inusualmente alta de la forma con sólo fucosa. El Ejemplo 2 también demostró que el cambio en la distribución de K4 tuvo lugar en el biorreactor y estuvo estrechamente unido a un cambio de lote del polvo del medio. Los resultados del Ejemplo 2 prestan un fuerte apoyo a la hipótesis de que el cambio en la distribución de glucoformas constituía una función anabólica, no una catabólica. Más aún, estos experimentos demostraron que el FeS04 suplementario podía revertir parcialmente el cambio, pero el análisis de ICP mostró que no había diferencia significativa en la concentración de FeS04 entre los lotes de polvo del medio. De este modo, se efectuó la hipótesis de que otro componente traza, no identificado del FeS04 que se encontraba presente a niveles variables con los diferentes lotes de polvo del medio fue el responsable del cambio. Efectos de los Aditivos: Según se planteó en el Ejemplo 2, el análisis de ICP mostró cantidades mensurables de nueve elementos traza en el lote de FeS04 utilizado para las condiciones experimentales de cultivo. Una comparación de estos elementos traza frente a aquéllos en formulaciones de medio publicadas eliminó la necesidad de adicionar Sb o Bi. En base a las formulaciones del medio y a los análisis de ICP del FeS04, se creó una mezcla de cinco compuestos para adicionar a los cultivos de rFIX (concentraciones del medio finales proporcionadas) : (NH4)6Mo7024 1 nM, CoCl2 10 nM, NH4VO3 5,5 nM, NiS04 1,5 nM, y H3BO3 20 nM. Se adicionó MnS04 de modo separado puesto que una revisión de la literatura anterior habla indicado que el manganeso podia ser importante para la actividad glicosiltransferasa (véase Bretón and Imberty, Curr. Opinión in Structural Biol. 9: 563-571, 1999; Bruckner et al., Nature 406: 411-415, 2000) . En el mismo experimento, se ensayó el FeS04 adicional (2X o 4X) para determinar si éste podia incrementar más aún la cantidad relativa del tetrasacárido . En cada caso, los aditivos se utilizaron además de los suplementos descritos en el Ejemplo 2. Los resultados de este experimento de adición se muestran en la Figura 5. Se determinaron las distribuciones de la especie y los valores informados constituyen las relaciones del área de cada uno de los cuatro picos de K4 a su suma. La figura también muestra un material de referencia, los cultivos de control (sin aditivo) y los suplementados (como en el Ejemplo 2) . Se muestran inyecciones por duplicado para cada muestra. En cada conjunto de columnas, la columna que está más a la izquierda corresponde a la fracción de moléculas con un tetrasacárido en Ser-61, y la columna que está más a la derecha es la fracción con solamente una fucosa. La diferencia observada entre los cultivos de control positivo y negativo ( suplementado y no suplementado, respectivamente) fue menor que la que se habla observado previamente. No obstante, la Figura 5 demuestra claramente que la mezcla de elementos traza no tuvo efecto en la distribución de la especie K4 , mientras que la adición de FeS04 y MnS04 ambas mejoraron la distribución de la especie K4. Cuando se adicionó a los suplementos, MnS04 ' 15 n tuvo aproximadamente el mismo efecto en la distribución de la especie K4 que FeS04 12 µ? adicionales . La fuerte respuesta al manganeso condujo a experimentos diseñados para encontrar una concentración óptima para el manganeso en el medio de cultivo celular de rFIX. La Figura 6 muestra que este experimento proporcionó resultados consecuentes con aquéllos que se muestran en la Figura 5, puesto que todos los cultivos con manganeso adicionado tenían menos K4 con solamente fucosa que lo que tenía o bien el cultivo de control o bien el suplementado. De hecho, los cultivos con 40 nM o más manganeso tenían aproximadamente la misma cantidad de K4 con solamente fucosa que la que tenía el material de referencia de ensayo. Sin embargo, parecía haber más del trisacárido a manganeso 100 o 500 nM que a 40 nM. De este modo, se determinó que 40 nM era una concentración de manganeso inesperadamente ventajosa para la glicosilación de FIX más extensa en Ser-61. Utilidad del Modelo a Pequeña Escala: Una característica inusual de estos experimentos a pequeña escala, y de aquéllos presentados en el Ejemplo 2, consistió en el nivel variable del trisacárido, o. de la especie de-sialatada, de experimento a experimento. Debido a que esta especie varia de modo similar a la referencia del ensayo, se cree que constituye un artefacto del método de digestión en un único recipiente. Puesto que todas las muestras para un experimento determinado se digirieron al mismo tiempo utilizando la misma materia prima, no se cree que esta variabilidad ejerza un impacto en los análisis presentados en este Ejemplo o en el Ejemplo 2. Conclusión: Estos experimentos demostraron que la adición de MnS04 40 nM al medio de cultivo celular de rFIX mejora la distribución de la especie K4.

Ejemplo 4: Análisis de Oligosacárido Unido a N de Muestras de Medio de Cultivo anti-ABeta Introducción: Las huellas digitales del oligosacárido unido a N de células CHO que expresan un anticuerpo monoclonal IgGl peptidico anti-ABeta humanizado ("células anti-ABeta") se investigaron bajo cuatro condiciones de medios. Las identificaciones de las muestras y la información relevante se enumeran en la Tabla 3.

Tabla 3. Muestras anti-ABeta recogidas a partir de diversas condiciones de cultivo.

Procedimiento: Se hizo crecer cultivo anti-ABeta 1 y se alimentó periódicamente con medio de alimentación. En el cultivo anti-ABeta 2, se adicionaron los Elementos Traza E al comienzo. La Tabla 4 enumera la composición de los Elementos Traza E. Se hizo crecer cultivo anti-ABeta 3 en condiciones idénticas al cultivo 2 excepto que el nivel de glutamina inicial fue de 4 mM. El cultivo anti-ABeta 4 se hizo crecer en condiciones idénticas al cultivo 3 excepto que no se adicionó Traza E y el medio de alimentación se suplemento con glutamato hasta 2 g/L. Las distribuciones de glucoformas de cada muestra se determinaron mediante digestión de PNGasa F, seguida por análisis de Cromatografía de Intercambio Aniónico de Alto pH con Detección Electroquímica Pulsada (HPAEC-PED, por sus siglas en inglés) . Brevemente, las muestras fueron intercambiadas de amortiguador en formiato de amonio 50 M, buferadas a pH 7,3, utilizando concentradores de proteínas Amicon Ultra 30,000 MWCO . Después de la recuperación, cada muestra se digirió con 5 µL de PNGasa F (libre de glicerol) y se incubó durante la noche a 37 °C. Las muestras luego se secaron mediante centrifugación al vacío y se reconstituyeron en agua purificada. Las muestras luego se transferieron a viales automuestreadores para análisis de HPAEC-PED. El sistema de HPAEC-PED se equipa con un detector ED-40, columna analítica (2 x 250 mm) y guarda Dionex CarboPac PA100. Se utilizó un gradiente lineal de acetato de sodio el cual incluye dos eluyentes: el Eluyente A el cual consiste de NaOH 100 mM y el Eluyente B el cual consiste de NaOH 100 mM/acetato de sodio 500 mM.

Tabla 4. Composición de Elementos Traza E. Elementos Traza E g L nM (NH4) 6??7024·4?20 123.60 100.00 A1C13'6H20 0.48 2.00 H3BO3 6.18 100.00 CrCl3 7.92 50.00 CuS04'5H20 49.94 200.00 Ge02 0.21 2.00 KBr 0.24 2.00 KI 16.60 100.00 LiCl 0.08 2.00 MnS<_V¾0 16.90 100.00 Na2Si03«9H20 142.03 500.00 NaF 0.08 2.00 NH4VO3 1.17 10.00 NiS04«6H20 2.63 10.00 RbCl 0.24 2.00 SnCl2«2H20 0.45 2.00 Selenito de Sodio 34.58 200.00 Análisis de los Datos: Los tres tipos de glicanos biantenarios unidos a N complejos que están asociados con el anticuerpo anti-ABeta contienen cero ("G0") , uno ("Gl") o dos (G2" ) residuos de galactosa en sus brazos biantenarios unidos a N externos. Todas las muestras mostraron la presencia de los tres picos representativos de las glucoformas G0, Gl, y G2. La Figura 7 muestra una comparación gráfica del porcentaje del área pico total para los picos de HPAEC-PED de GO, Gl, y G2 de cada muestra. se observó la presencia de pequeños picos adicionales en los perfiles de todas las muestras presentadas. Los picos observados representan bajos niveles de glucofornas mono- y di-sialiladas . Discusión: Estos experimentos ensayaron la distribución relativa de los picos GO : Gl : G2 de cultivos anti-ABeta suplementados con medios de alimentación bajo diversas condiciones experimentales. Los cultivos en los cuales se adicionaron Elementos Traza E demostraron un descenso en los niveles de GO, con un correspondiente incremento en los niveles de Gl y G2 en relación con las condiciones de cultivo que carecían de Elementos Traza E (Figura 7) . Las condiciones de cultivo que contenían baja glutamina tuvieron un efecto similar, y los efectos fueron aditivos. Los cultivos de baja glutamina (4 mM) en los cuales se adicionaron Elementos Traza E demostraron un cambio dramático en la distribución de las glucoformas unidas a N, con proporciones casi iguales de GO y Gl y con G2 representando aproximadamente el 10% del área pico total (Figura 7) . Los cultivos a los cuales se les adicionaron Elementos Traza E contenían manganeso en una concentración de 156 nM. Sin embargo, debería notarse que los cultivos también contenían niveles elevados de otros metales. De este modo, es posible que, además de manganeso, otras condiciones de cultivo contribuyeran al mejorado patrón de glicosilación observado.

Conclusión: Es aún más probable que las diferencias en las distribuciones de glicosilacion observadas en las muestras anti-ABeta se deban a los respectivos cambios en las condiciones de cultivo. Nuestros datos sugieren con fuerza que la presencia de baja glutamina (4 m ) y/o la adición de Elemento Traza E conteniendo MnS04 100 mM resulta en un cambio dramático en la distribución del porcentaje de las diversas glucoformas unidas a en anti-ABeta. Estos efectos parecen ser independientes y aditivos.

Ejemplo 5: Análisis de Oligosacáridos Unidos a N de Muestras de Estudio de Manganeso anti-ABeta Introducción: El Ejemplo 4 demostró que los , mej oramientos en las distribuciones de glicosilacion en muestras anti-ABeta se podía lograr mediante la adición de Elementos Traza E a las condiciones de cultivo y manteniendo bajos los niveles de glutamina. Aquí nosotros ensayamos si la adición de manganeso solo en las condiciones de cultivo podría llevar a cabo un mejoramiento similar en las distribuciones de glicosilacion. Procedimiento: Se hicieron crecer cultivos anti-ABeta en medios de cultivo o bien que contenían o bien que carecían de manganeso 40 mM. Los cultivos se alimentaron con 40% del volumen total de los medios de alimentación. Las muestras se recogieron y analizaron de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 4. Análisis de los Datos: Las muestras analizadas se compararon en términos de presencia de picos y porcentaje de área de pico total para cada pico. La Figura 8 muestra una comparación gráfica del porcentaje del área de pico total para los picos de HPAEC-PED de GO, Gl, y G2 de cada muestra. Discusión: Los tres tipos de glicanos biantenarios unidos a N complejos que están asociados con el anticuerpo anti-ABeta son las estructuras GO, Gl, y G2, las cuales respectivamente contienen cero, uno o dos residuos de galactosa en sus brazos biantenarios unidos a N externos. Las muestras recogidas a partir de células que se hicieron crecer en medios o bien que carecían o bien que contenían manganeso 40 mM mostraron la presencia de todos los tres picos representativos de las glucoformas GO, Gl, y G2. El pico de GO disminuyó desde el 68% del área pico total en la muestra de control hasta el 53% en la muestra recogida a partir de medios que contenían manganeso adicionado (véase la Figura 8). También se observaron incrementos en los porcentajes del área pico total de Gl y G2 en la muestra recogida a partir de medios que contenían manganeso. Los porcentajes del área pico total de Gl fueron del 26% en la muestra de control, y del 39% en la muestra con manganeso adicionado. Los porcentajes del área pico total de G2 fueron del 6% en la muestra de control y del 9% en la muestra con manganeso adicionado (Figura 8) .

Conclusión: Estos datos indican que la adición de manganeso solo al medio de cultivo resulta en un patrón de glicosilación más extenso según se demostró mediante un cambio en la distribución del porcentaje de G0:G1:G2 en estas muestras. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (30)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para producir una glicoproteina en un cultivo celular caracterizado porque comprende: cultivar células de mamiferos que contienen un gen que codifica una glicoproteina de interés en un medio de cultivo celular que comprende manganeso entre aproximadamente 10 nM y 600 nM bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de la glicoproteina, en donde el patrón de glicosilación de la glicoproteina expresada es más extenso que el patrón de glicosilación observado bajo condiciones de otra manera idénticas en un medio de otra manera idéntico que carece de manganeso.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las etapas de: cultivar células de mamiferos que contienen un gen que codifica una glicoproteina de interés en un medio de cultivo celular que comprende manganeso entre aproximadamente 10 nM y 600 nM; mantener el cultivo en un primer intervalo de temperatura durante un primer periodo de tiempo suficiente para permitir a las células reproducirse hasta una densidad celular viable dentro de un intervalo de aproximadamente 20%-80% de la máxima densidad celular viable posible si el cultivo se hubiera mantenido en el primer intervalo de temperatura; cambiar el cultivo a un segundo intervalo de temperatura, en donde al menos una temperatura del segundo intervalo de temperatura es inferior a la temperatura más baja del primer intervalo de temperatura; mantener el cultivo durante un segundo periodo de tiempo bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de la glicoproteina, en donde el patrón de glicosilación de la glicoproteina expresada es más extenso que el patrón de glicosilación observado bajo condiciones de otra manera idénticas en un medio de otra manera idéntico que carece de manganeso.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el primer intervalo de temperatura comprende un intervalo de temperatura que es de aproximadamente 30 hasta 42 grados Celsius.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el primer intervalo de temperatura comprende una temperatura que es de aproximadamente 37 grados Celsius .
5. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el segundo intervalo de temperatura comprende un intervalo de temperatura que es de aproximadamente 25 hasta 41 grados Celsius.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el segundo intervalo de temperatura comprende una temperatura que es de aproximadamente 31 grados Celsius .
7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque comprende además una segunda etapa de cambio subsiguiente a la primera etapa de cambio que comprende cambiar el cultivo a una tercera temperatura o intervalo de temperatura, en donde al menos una temperatura del tercer intervalo de temperatura es inferior a la temperatura más baja del segundo intervalo de temperatura.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el tercer intervalo de temperatura comprende un intervalo de temperatura que es de aproximadamente 25 hasta 40 grados Celsius.
9. 9. El método de -conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el medio de cultivo celular comprende manganeso entre aproximadamente 20 y 200 nM.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el medio de cultivo celular comprende manganeso aproximadamente 40 nM.
11. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el medio de cultivo celular comprende glutamina en una concentración inicial que es inferior o igual a aproximadamente 8 mM.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la concentración de glutamina inicial del medio de cultivo celular es inferior o igual a aproximadamente 4 mM.
13. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el volumen del cultivo celular es de al menos aproximadamente 500 L.
14. 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el cultivo celular se provee además con un medio de alimentación luego de que ha comenzado el cultivo celular inicial.
15. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el cultivo celular se provee además con componentes suplementarios.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque los componentes suplementarios están seleccionados del grupo que consiste en hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones inorgánicos, amortiguadores, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, elementos traza, amino ácidos, lipidos, glucosa u otras fuentes de energía, y las combinaciones de los mismos.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el cultivo celular está suplementado con aproximadamente 2 gramos por litro de glucosa.
18. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque se define el medio de cultivo celular.
19. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque la glicoproteina de interés comprende el factor de coagulación IX.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el factor de coagulación IX es el Factor de coagulación humano recombinante IX.
21. 21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque la glicoproteina de interés comprende un anticuerpo anti-ABeta.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el anticuerpo anti-ABeta es un anticuerpo monoclonal.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el anticuerpo anti-ABeta es un anticuerpo monoclonal IgGl peptidico anti-ABeta humanizado.
24. 24. ün medio de cultivo celular caracterizado porque comprende manganeso entre aproximadamente 10 y 600 nM.
25. 25. El medio de cultivo celular de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende manganeso entre aproximadamente 20 y 200 nM.
26. 26. El medio de cultivo celular de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque comprende manganeso aproximadamente 40 nM.
27. 27. El medio de cultivo celular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, caracterizado porque el medio de cultivo celular comprende glutamina en una concentración inicial que es inferior o igual a aproximadamente 8 mM.
28. 28. El medio de cultivo celular de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la concentración de glutamina inicial es inferior o igual a aproximadamente 4 mM.
29. 29. El medio de cultivo celular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, caracterizado porque se define el medio.
30. 30. Una glicoproteina caracterizada porque es obtenida a través del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.