SE439109B - Anvendning av tarmsaltlake som utgangsmaterial for framstellning av rent heparin - Google Patents

Description

79000717-4 parin. Det var ej heller väntat att detta heparin förekommer näs- tan helt fritt från kemiskt närbesläktade biprodukter; så att saltlake som hittills endast ansetts som en miljön belastande av- fallsprodukt, utgör en ny råvarukälla för heparin, som det genom râvaruinmutningar redan är mycket ont om. Genom den vittgående avsaknaden av föroreningar kan upparbetningen till råheparin före- tas särskilt skonsamt och man behöver därför ej ta till de enligt 'hittillsvarande teknik kända kostsamma isoleringsmetoderna (jämför US-A-3 451 996 och GB-B-1 221 784). Man får slutligen fram hepa- rinkvaliteter, som inte på långt när uppnås i de på marknaden till- gängliga heparinpreparaten. De enligt kända upparbetningsmetoder ur enligt uppfinningen använd tarmsaltlake som råvara isolerade râheparinerna föreligger redan i sådan renhet, att den efterföljan- de reningen leder fram till hepariner med långt över 2.00 USP-enhe- ter/mg. De fram till nu i handeln tillgängliga heparinpreparaten uppvisar i regel heparinkvaliteter av 150 USP-enheter/mg, i några enstaka fall även 155 USP-enheter/mg. Därvid förstås med en USP- -enhet/mg den specifika aktiviteten enligt U.S.P. assay, med vil- ken man mäter när klumpbildningen i konserverad fårplasma hämmas.

En USP-enhet motsvarar ca 1,1 internationella enheter (UI). Efter- som aktivitetsvärdena för de i handeln förekommande heparinprepa- raten trots talrika förbättringar i metoderna fortfarande är otill- fredsställande, föreskriver t.ex. USP att heparinpreparat (ur tarm- slem) måste innehålla minst 140 USP-enheter. Endast i laboratorium har L.W. Kananagh och L.B. Jaques Åärzneimittelforschung (Drug Res.) gå, nr. 12, 1942 (1974[Z lyckats isolera heparin genom upprepad kristallisation som bariumsalt med maximalt 175 USP-enheter/mg.

För konservering och avvattning av djurtarmar lämpar sig särskilt koksaltlösningar, vars halt av koksalt uppgår till mellan 0,5 mol och mättnadsmolmängderna. Särskilt föredras sådana koksaltlösnin- gar, vars halt av koksalt uppgår till mellan 3 mol och mättnads- molmängden. Med mättnadsmolmängd förstås den molmängd, som en kon- centrerad vattenlösning innehåller av löst koksalt vid rumstempera- tur i ett slakteri (en koncentrerad koksaltlösning är ca 26,4%-ig).

Som regel behandlas de avslemmade djurtarmarna medloksaltlösning under en tid mellan 2 timmar upp till 3 dagar. Mestadels avslutas dock behandlingen av djurtarmarna redan efter 3-24 timmar. Efter 7900077-4 avlägsnande av de konserverade och avvattnade djurtarmarna ur koksaltlösningen erhåller man en tarmsaltlake, som uppvisar en överraskande hög halt av heparin.

Genom användningen enligt uppfinningen av sådana tarmsaltlakar som råvara har man lyckats isolera heparin även i teknisk skala i sådan renhet att heparinet föreligger som i det närmaste färglös substans. Alla hittills ur andra råvaror framställda hepariner har däremot måst avfärgas medelst kostsamma och förlustbringande metoder (US-A-3 179 566).

Tarmsaltlake är dessutom en lagringsbeständig, nästan luktfri råvara, som ej undergår några kvalitetsförändringar genom långva- rig förvaring. Därmed blir kemiska och andra konserveringsmetoder överflödiga.

Uppfinningen hänför sig sålunda till användningen av tarmsaltlake, som erhållits genom inläggning av från tarmslem befriade djurtar- mar i koksaltlösningar, för framställning av rent heparin samt ett förfarande för isolering av rent heparin ur saltlösningar från djurvävnad på i och för sig känt sätt, som kännetecknas av att man som utgångsmaterial använder tarmsaltlake, som erhållits genom inläggning av från tarmslem befriade djurtarmar i koksaltlösningar.

Uppfinningen belyses närmare nedan i anslutning till ett antal ut- föringsexempel på föredragna utföringsformer.

Exempel 1 I ett kärl rymmande 1500 liter och försett med omrörare försattes 600 liter saltlake vid rumstemperatur under omröring med 600 liter metanol inom 1/2 timma. Lika lång tid användes för efteromröring, varefter blandningen fick stå i ca 1 timma.

Man dekanterade av den överstående grumliga vätskan i ett annat kärl, och återförde den utfällda saltkakan. Den utvunna suspensio- nen fick stå i 2 dagar. Därefter företogs ånyo dekantering, den överstående vätskan kastades bort och fällningen isolerades genom centrifugering. Efter torkning i vakuum erhöll man 1,44 kg av en produkt, som uppvisade ca 10 USP-enheter/mg. Den bestod fortfaran- de till ca 45% av koksalt. En viss mängd av det sålunda erhållna 7900077-4 råheparinet motsvarande ca 425 000 USP-enheter eller 42,5 g, extra- herades tre gånger med vardera 200 ml 2 M koksaltlösning, varvid omröring företogs mellan varje extraktion vid 6000 under 1 timma.

De förenade extrakten späddes med vatten tills lösningen innehöll ca 0,9 mol/liter kloridjoner. Man tillsatte 200 ml av en anjonbyta- re ("LewatitkÉ)CA 9249", Bayer AG, Västtyskland) i kloridform och företog omröring i 1 timma. Man sög därefter av och tvättade med ca 200 ml 0,9 M koksaltlösning. Jonbytaren omrördes därefter under timmar med 2 M koksaltlösning vid 40°C och sögs därefter av och tvättades med 2 M koksaltlösning. Elueringslösningen förenades med tvättlösningen och fälldes med 1,5 gånger så stor volym metanol.

Fällningen avskildes genom centrifugering och tvättades först med ca 50 ml vatten-metanol (volymförhållande 1:1,5) och sedan med ca 50 ml metanol och torkades. Man.erhöll 198 g Na-heparinat med 195 USP-enheter/mg. ,5 g av ett på ovan beskrivet sätt erhållet natriumheparinat med ca 200 USP-enheter/mg löstes i 200 ml 2 M koksaltlösning.

Lösningen sögs av med hjälp av en sugflaska och återstoden tvätta- des först med 30 ml 2 M koksaltlösning och därefter med ca 250 ml lhelt avmineraliserat vatten. De förenade lösningarna överfördes därefter med helt avmineraliserat vatten till en kloridmolaritet av 0,9. Därefter upprepades på ovan beskrivet sätt reningen med 1 \ liter "Lewatit R'CA 9249".

Den kombinerade eluerings- och tvättlösningen bearbetades vidare på ovan beskriviet sätt. Efter tvättning och torkning av fällnin- gen erhöll man 11,2 g natriumheparinat, som uppvisade en aktivitet av 251 USP-enheter/mg.

Exempel 2 I enlighet med förfarandet beskrivet i GB-B-754 885 surgjordes 3 liter saltlake under omröring med ättiksyra till pH 3,1-3,2 (ca 50 ml). Efter några timmar företogs dekantering och återstoden cent- rifugerades. Fällningen kastades bort och de förenade lösningarna neutraliserades med natronlut.

Lösningen försattes långsamt under omröring med en lika stor vo- lym metanol. Efter 45 minuter dekanterades vätskan från det utfäll- da koksaltet. Suspensionen fick stå i flera timmar och den överstå- ende vätskan dekanterades och återstoden centrifugerades. Fällningen 7900077-4 torkades i vakuum. Man erhöll 3,43 g med 21 USP-enheter/mg. En viss mängd av det sålunda råheparinet motsvarande ca 425 000 USP- -enheter eller 20,2 g renades på samma sätt som beskrivits i exem- pel 1. Man erhöll 10,65 g natriumheparinat med en aktivitet av 262 USP-enheter/mg.

Exemgel 3 3 liter saltlake späddes med 12 liter vatten till en kloridmolari- tet av ca 0,85. Därefter tillsattes 50 g kiselgur samt en lösning av 6 g bensetoniumklorid (= "Hyamin 1622", Rohm & Haas) i 100 ml vatten. Efter nâgra timmar företogs dekantering och återstoden sögs av. Efter tvättning med vatten extraherades den ännu fuktiga fäll- ningen tre gånger på det sätt som beskrivits i DE-C1-1 228 241 med 200 ml 2 M koksaltlösning. De förenade extrakten fälldes med 2 vo- lymdelar metanol. Den isolerade och torkade fällningen vägde 465 mg och uppvisade en aktivitet av 155 USP-enheter/mg. läëmfiêli liter saltlake späddes med 120 liter vatten till en kloridmola- ritet av ca 0,85 (jämför DE-C1-1 156 938). Därefter surgjordes med ättiksyra (ca 50 ml) till pH 3,2. Efter nägra timmar hade en fäll- ning bildats, som frâncentrifugerades efter dekantering av den kla- ra överstående vätskan. Efter torkning erhöll man 111 g råheparin med 6,5 USP-enheter/mg. En viss mängd av det sålunda erhållna råhe- parinet motsvarande ca 425 000 USP-enheter eller 65,5 g renades på samma sätt som beskrivits i exempel 1. Efter det första reningsste- get över jonbytare erhöll man 196 g Na-heparinat med 198 USP-enhe- ter/mg. g av ett på ovan beskrivet sätt erhållet natriumheparinat med ca 200 USP-enheter/mg löstes i 200 ml 2 N kalciumkloridlösning.

Lösningen sögs av medelst en sugflaska och återstoden tvättades med först 30 ml 2 N kalciumkloridlösning och därefter med ca 250 ml helt avmineraliserat vatten. De förenade lösningarna bringades till en kloridmolaritet av 0,9 med användning av helt avmineraliserat vatten. Därefter företogs omröring på ovan beskrivet sätt med 1 li- ter "hewatitkš3CA 9249". Elueringen och eftertvättningen utfördes med 2 N kalciumkloridlösning i stället för med koksaltlösning. 7900077-4 Den kombinerade eluerings- och tvättlösningen upparbetades på ovan beskrivet sätt. Efter tvättning och torkning av fällningen erhöll man 10,7 g kalciumheparinat uppvisande en aktivitet av 260 USP-en- heter/mg.

Exempel 5 liter saltlake späddes med 40 liter vatten till en kloridmolari- tet av ca 0,85. Denna lösning pumpades genom ett filter över en jonbytarkolonn med en diameter av 26 mm och en längd av 380 mm (ca 3 liter/h). Man använde ett besiskt makroporöst anjonbytarharts i Cl--form (“LewatitkEfCA 9249"). Man hade också kunnat använda and- ra anjonbytarhartser som t.ex. det i DE~C1-1 253 868 beskrivna "Dowex\§¿1-X-1" (The Dow Chemical Co., USA).

Hartset avlägsnades därefter ur kolonnen och tvättades tvâ gånger med 500 ml 0,9 M koksaltlösning och eluerades med 400 ml 2 M kok- saltlösning under 5 timmar vid 40°C under omröring. Denna lösning fälldes med 1,5 gånger så stor volym metanol. Den isolerade och torkade fällningen vägde 1,2 g och uppvisade 149 USP-enheter/mg.

Claims (1)

1. ? 7900077-4 Patentkrav Användning av tarmsaltlake, som erhållits genom inläggning av från tarmslem befriade djurtarmar i koksaltlösningar, som utgångs- material för framställning av rent heparin.