DE2652272C2

DE2652272C2 - Verfahren zur Herstellung von Heparin

Info

Publication number: DE2652272C2
Application number: DE2652272A
Authority: DE
Inventors: Hans-Joerg Dr. 1000 Berlin Vidic
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1976-11-12
Filing date: 1976-11-12
Publication date: 1979-02-15
Also published as: CA1088522A; NL7711746A; AU3026577A; NL179481B; IL53254A; GB1592806A; AU515671B2; PL108607B1; IS2410A7; SE7712732L; FR2370757A1; JPS5362816A; DK142059B; RO78597A; GR65226B; IT1088965B; FR2370757B1; BR7707493A; US4283530A; DE2652272B1

Description

Beispiel 1

600 Liter Salzlake wurden in einem 1500 Liter-Rührwerk bei Raumtemperatur unter Rühren innerhalb einer halben Stunde mit 600 Liter Methanol versetzt. Es wurde die gleiche Zeit nachgerührt, wonach die Mischung ca. eine Stunde stehen blieb.

Nun dekantierte man den trüben Überstand in ein zweites Gefäß und ließ den ausgefallenen Salzkuchen zurück. Die gewonnene Suspension blieb nun 2 Tage stehen. Danach wurde wieder dekantiert, der Überstand verworfen und der Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert. Nach dem Trocknen im Vakuum erhielt man I,b8 kg eines Produkts, das 11 USP-Einheiten/mg besitzt. Es besteht noch zu ca. 60% aus Kochsalz.

Ein Aliquot des so erhaltenen Rohheparins entsprechend 425 000 USP-E bzw. 38,65 g, wurde dreimal mit je 200 ml zweimolarer Kochsalzlösung extrahiert, wobei jeweils eine Stunde bei 6O⁰C gerührt wurde. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser verdünnt, bis die Lösung ca. 0,9 Mol/l Chloridionen enthielt. Es wurden nun 200 ml eines Anionenaustauschers (Lewatit® CA 9249) in der Chlorid-Form zugegeben, und man rührte eine Stunde. Anschließend wurde abgesaugt und mit ca. 200 ml 0,9 molarer Kochsalzlösung nachgewaschen. Der Ionenaustauscher wurde dann 5 Stunden mit zweimolarer Kochsalzlösung bei 40⁰C gerührt und danach abgesaugt und mit zweimolarer Kochsalzlösung nachgewaschen. Die Elutionslösung wurde mit der

Waschlösung vereinigt und mit dem l,5fachen Volumen Methanol gefällt Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, erst mit ca. 50 ml Wasser-Methanol (1 + 1,5 Voumenteile), dann mit ca. 50 ml Methanol nachgewaschen und getrocknet

Man erhielt 1,91 g Na-Heparinat mit 202 USP-Einheiten pro mg.

15 g eines in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Natriumheparinats mit ca. 200 USP-Einheiten pro mg wurden in 200 ml zweimolarer Kochsalzlösung aufgelöst Die Lösung wurde über eine Nutsche gesaugt und der Rückstand wurde mit zunächst 30 ml zweimolarer Kochsalzlösung, dann mit ca. ?50 ml vollentsalztem Wasser gewaschen. Die vereinigten Lösungen wurden nun mit vollentsalztem Wasser auf eine Chlorid-Molarität von 0,9 gebracht. Nun wurde wie vorstehend die Reinigung mit einem Liter Lewatit® CA 9249 wiederholt

Die vereinigte Elutions- und Waschlosung wurde wie oben weiterverarbeitet. Nach dem Waschen und Trocknen der Fällung erhielt man 11,1 g Natriumheparinat, das eine Aktivität von 254 USP-Einheiten pro mg besaß.

Beispiel 2

3 Liter Salzlake wurden mit 14 Liter Wasser verdünnt. Dann wurden 50 g Kieselgur sowie eine Lösung von 7 g Bezethoniumchlorid (= Hyamin 1622, Rohm & Haas) in 100 ml Wasser zugegeben. Nach einigen Stunden wurde dekantiert und der Rest abgesaugt. Nach dem Waschen mit Wasser wurde der noch feuchte Niederschlag dreimal nach dem in der DE-PS 12 28241 beschriebenen Verfahren mit je 200 ml 2molarer Kochsalzlösung extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 2 Volumenteilen Methanol gefällt. Der isolierte und getrocknete Niederschlag wog 560 mg und besaß eine Aktivität von 163 USP-Einheiten/mg.

Beispiel 3

3 Liter Salzlake wurden mit 13 Liter Wasser verdünnt (vgl. DE-PS 11 56 938). Dann wurde mit Essigsäure (ca. 50 ml) auf pH 3,2 angesäuert. Nach einigen Stunden hatte sich eine Fällung abgesetzt, die nach dem Dekantieren des klaren Überstandes abzentrifugiert wurde. Nach dem Trocknen erhielt man 16,6 g Rohheparin mit 5,5 USP-Einheiten/mg.
Ein Aliquot des so erhaltenen Rohheparins entsprechend 425 000 USP-Einheiten bzw. 7730 g, wurde dreimal mit je 200 ml zweimolarer Kochsalzlösung extrahiert, wobei jeweils eine Stunde bei 60°C gerührt wurde. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser

ίο verdünnt, bis die Lösung ca. 0,9 Mol/l Chloridionen enthielt Es wurden nun 200 ml eines Anionenaustauschers (Lewatit® CA 9249) in der Chlorid-Form zugegeben und man rührte eine Stunde. Anschließend wurde abgesaugt und mit ca. 200 ml 0,9molarer Kochsalzlösung nachgewaschen. Der Ionenaustauscher wurde dann 5 Stunden mit zweimolarer Kochsalzlösung bei 40⁰C gerührt und danach abgesaugt und mit zweimolarer Kochsalzlösung nachgewaschen. Die EIutionslösung wurde mit der Waschlösung vereinigt und mit dem l,5fachen Volumen Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, erst mit ca. 50 ml Wasser-Methanol (1+1,5 Volumenteile), dann mit ca. 50 ml Methanol nachgewaschen und getrocknet

Man erhieli 1,84 g Na-Heparinat mit 206 USP-Einhei-

2^rj ten pro mg.

Beispiel 4

10 Liter Salzlake wurden mit 50 Liter Wasser verdünnt. Diese Lösung wurde durch ein Filter über eine

in lonenaustauschersäule mit einem Durchmesser von 26 mm und einer Länge von 380 mm gepumpt (ca. 3 Liter/Std.). Es wurde ein mittelbasisches makroporöses Anionenaustauscherharz in der Cl--Form verwendet (Lewatit® CA 9249). Es können auch andere Anionen-

r, austauscherharze verwendet werden, wie z. B. das in der DE-PS 12 53 868 beschriebene Dowex«l-X-1.

Anschließend wurde das Harz aus der Säule entfernt, zweimal mit 500 ml 0,9molarer Kochsalzlösung gewaschen und mit 400 ml 2moiarer Kochsalzlösung 5

to Stunden bei 40⁰C unter Rühren eluiert Diese Lösung wurde mit 1,5 Volumenteilen Methanol gefällt. Der isolierte und getrocknete Niederschlag wog 1,5 g und besaß 152 USP-Einheiten/mg.

Claims

Patentanspruch:

Verwendung von Darm-Salzlake, die durch Einstreuen von vom Darmschleim befreiten Tierdärmen mit festem Kochsalz erhalten worden ist, zur Herstellung von reinem Heparin.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Heparin aus Salzlake, die bei der Verarbeitung von tierischen Därmen anfällt (Darm-Salzlake).

Mit Heparin steht der Medizin seit langem ein natürlich vorkommendes Antikoagulierungsmittel zur Verfügung, das auch in der modernen Medizin nach wie vor unentbehrlich ist und immer breitere Anwendung findet.

In den letzten Jahren wurden eine Reihe von Verfahren bekannt, die alle zum Ziel haben, den Wirkstoff Heparin auf immer schonendere Weise aus heparinhaltigem tierischen Gewebe wie Lunge, Leber und in neuerer Zeit vor allem aus Damischleim (Mucosa) von Schweinen, Rindern und Schafen zu isolieren (GB-PS 7 54 885, DE-PS 12 28 241, US-PS 30 58 884, DE-PS 12 53 868). Derartige Rohstoffe haben wegen ihrer leichten Verderblichkeit den Nachteil einer begrenzten Lagerfähigkeit, die durch Gefrieren zwar verlängert werden kann, was jedoch neben technischem w Mehraufwand auch zu erheblichen Kostensteigerungen führt. Bei der Aufarbeitung werden sowohl das Betriebspersonal als auch Anwohner aus der angrenzenden Umgebung nicht selten wegen der damit verbundenen Geruchsbeiästigung vor unzumutbare Γι Probleme gestellt.

In der DE-PS 12 53 868 wird die Gewinnung von Heparin für einige übliche Verfahren zusammenfassend beschrieben. Danach bringt man das tierische Gewebe in der Anfangsstufe mit einer heißen wäßrigen Salzlösung in Berührung, um das Heparin aus den Zellen herauszulösen. Der Heparinanteil des dabei anfallenden Mediums ist äußerst gering.

Es wurde nun gefunden, daß in den Schlachthöfen und Darmschleimereien anfallende Salzlake Heparin enthält. Diese Salzlake entsteht, wenn man Tierdärme, die vorher vom Darmschleim befreit wurden, zur Konservierung und Entwässerung mit festem Kochsalz einstreut.

Es ist deshalb im Hinblick auf die DE-PS 12 53 868 als ausgesprochen überraschend zu bezeichnen, daß die beim bloßen Einsalzen von tierischen Därmen entstandene Salzlake größere Mengen Heparin enthält. Es war auch nicht zu erwarten, daß dieses Heparin fast völlig frei von chemisch verwandten Nebenprodukten vorkommt, so daß Salzlake, bisher nur als umweltbelastendes Abfallprodukt bekannt, eine neue Rohstoffquelle für das durch Rohstoffengpässe bereits sehr knappe Heparin darstellt. Durch das weitgehende Fehlen von Verunreinigungen kann die Aufarbeitung zum Rohhe- txj parin besonders schonend vorgenommen werden, und es entfallen damit die nach dem bisherigen Stand der Technik bekannten aufwendigen Isolierungsmethoden (siehe US-PS 34 51996 und GB-PS 12 21784). Man gelangt schließlich zu Heparinqualitäten, die in den auf >>"> dem Markt verfügbaren Heparinpräparaten bei weitem nicht erreicht werden. Die nach bekannten Aufarbeitungsverfahren aus erfindungsgemäß verwendeter Darm-Salzlake als Rohstoff isolierten Rohheparine liegen bereits in solcher Reinheit vor, daß die sich anschließende Reinigung zu Heparinen mit weit über 200 USP-Einheiten/mg führt Die bis jetzt im Handel erhältlichen Heparinpräparate besitzen in der Regel Heparin-Qualitäten von 150 USP-Einheiten/mg, in einigen wenigen Fällen auch 155 USP-Einheiten/mg. Dabei versteht man unter einer USP-Einheit/mg die spezifische Aktivität, die sich aus dem U.S.P. assay ergibt, mit dem die Hemmung der Klümpchenbildung von konserviertem Schafsplasma gemessen wird. 1 USP-Einheit entspricht etwa 1,1 internationalen Einheiten (UI). Da die Aktivitätswerte der im Handel befindlichen Heparin-Präparate trotz zahlreicher Verfahrensverbesserungen weiterhin unbefriedigend sind, schreibt z. B. USP vor, daß Heparinpräparate (aus Darmschleim) mindestens 140 USP-Einheiten enthalten müssen. Lediglich im Labor gelang es bisher L W. Kananagh und L B. Jaques (Arzneimittelforschung [Drug Res.] 24, Nr. 12, 1942 [1974]) Heparin durch wiederholte Kristallisation als Bariumsalz mit maximal 175 USP-E/mg zu isolieren.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung von Darm-Salzlake als Rohstoff gelang es. Heparin in technischem Maßstab in einer Reinheit zu isolieren, daß es als nahezu farblose Substanz vorliegt. Alle bis heute aus anderen Rohstoffen verfügbaren Rohheparine müssen dagegen erst durch aufwendige und verlustreiche Verfahren entfärbt werden (US-PS 31 79 566).

Salzlake ist darüber hinaus ein lagerfähiger, fast geruchsloser Rohstoff, der durch lange Lagerung keine Qualitätseinbußen erfährt. Damit entfallen chemische und andere Konservierungsmethoden.

Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von Darm-Salzlake, die durch Einstreuen von vom Darmschleim befreiten Tierdärmen mit festem Kochsalz erhalten worden ist, zur Herstellung von reinem Heparin.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.