CH638818A5 - Verwendung von darm-salzlake zur herstellung von heparin. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRUCH Verwendung von Darm-Salzlake, die durch Einlegen von vom Darmschleim befreiten Tierdärmen in Kochsalzlösungen erhalten worden ist, zur Herstellung von reinem Heparin.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Darm-Salzlake, die durch Einlegen von vom Darmschleim befreiten Tierdärmen in Kochsalzlösung erhalten wird, zur Herstellung von reinem Heparin.

Mit Heparin steht der Medizin seit langem ein natürlich vorkommendes Antikoagulierungsmittel zur Verfügung, das auch in der modernen Medizin nach wie vor unentbehrlich ist und immer breitere Anwendung findet.

In den letzten Jahren wurden eine Reihe von Verfahren bekannt, die alle zum Ziel haben, den Wirkstoff Heparin auf immer schonendere Weise aus Heparin-haltigem tierischem Gewebe wie Lunge, Leber und in neuerer Zeit vor allem aus Darmschleim (Mucosa) von Schweinen, Rindern und Schafen zu isolieren (GB-PS 754885, DE-PS 1228241,

US-PS 3 058 884, DE-PS 1253 868). Derartige Rohstoffe haben wegen ihrer leichten Verderblichkeit den Nachteil einer begrenzten Lagerfähigkeit, die durch Gefrieren zwar verlängert werden kann, was jedoch neben technischem Mehraufwand auch zu erheblichen Kostensteigerungen führt. Bei der Aufarbeitung werden sowohl das Betriebspersonal als auch Anwohner aus der angrenzenden Umgebung nicht selten wegen der damit verbundenen Geruchsbelästigung vor unzumutbare Probleme gestellt.

In der DE-PS 1253 868 wird die Gewinnung von Heparin für einige übliche Verfahren zusammenfassend beschrieben. Danach bringt man das tierische Gewebe in der Anfangsstufe mit einer heissen wässrigen Salzlösung in Berührung, um das Heparin aus den Zellen herauszulösen. Der Heparinanteil des dabei anfallenden Mediums ist äusserst gering.

Es wurde nun gefunden, dass in den Schlachthöfen und Darmschleimereien anfallende Salzlake Heparin enthält. Diese Salzlake entsteht gewöhnlich, wenn man Tierdärme, die vorher vom Darmschleim befreit wurden, zur Konservierung und Entwässerung in Kochsalzlösungen einlegt.

Es ist deshalb im Hinblick auf die DE-PS 1253 868 als ausgesprochen überraschend zu bezeichnen, dass die beim Einlegen von tierischen Därmen in Kochsalzlösung entstandene Salzlake grössere Mengen Heparin enthält. Es war auch nicht zu erwarten, dass dieses Heparin fast völlig frei von chemisch verwandten Nebenprodukten vorkommt, so dass Salzlake, bisher nur als umweltbelastendes Abfallprodukt bekannt, eine neue Rohstoffquelle für das durch Rohstoffengpässe bereits sehr knappe Heparin darstellt. Durch das weitgehende Fehlen von Verunreinigungen kann die Aufarbeitung zum Rohheparin besonders schonend vorgenommen werden und es entfallen damit die nach dem bisherigen Stand der Technik bekannten aufwendigen Isolierungsmethoden (siehe US-PS 3451996 und GB-PS 1221784). Man gelangt schliesslich zu Heparinqualitäten, die in den auf dem Markt verfügbaren Heparinpräparaten bei weitem nicht erreicht werden. Die nach bekannten Aufarbeitungsverfahren aus erfindungsge-mäss verwendeter Darm-Salzlake als Rohstoff isolierten Rohheparine liegen bereits in solcher Reinheit vor, dass die sich anschliessende Reinigung zu Heparinen mit weit über 200 USP-Einheiten/mg führt. Die bis jetzt im Handel erhältlichen Heparinpräparate besitzen in der Regel Heparin-Qua-litäten von 150 USP-Einheiten/mg, in einigen wenigen Fällen auch 155 USP-Einheiten/mg. Dabei versteht man unter einer USP-Einheit/mg die spezifische Aktivität, die sich aus dem U.S.P. assay ergibt, mit dem die Hemmung der

Klümpchenbildung von konserviertem Schafsplasma gemessen wird. 1 USP-Einheit entspricht etwa 1,1 internationalen Einheiten (UI). Da die Aktivitätswerte der im Handel befindlichen Heparin-Präparate trotz zahlreichen Verfahrensverbesserungen weiterhin unbefriedigend sind, schreibt z. B. USP vor, dass Heparinpräparate (aus Darmschleim) mindestens 140 USP-Einheiten enthalten müssen. Lediglich im Labor gelang es bisher L.W. Kananagh und L.B. Jaques [Arzneimittelforschung (Drug Res.) 24, Nr. 12,1942 (1974)] Hepärin durch wiederholte Kristallisation als Bariumsalz mit maximal 175 USP-E/mgzu isolieren.

Zur Konservierung und Entwässerung von Tierdärmen eignen sich besonders Kochsalzlösungen, deren Gehalt an Kochsalz 0,5 m bis Sättigungsmolmenge beträgt. Besonders bevorzugt sind solche Kochsalzlösungen, deren Gehalt an Kochsalz 3 m bis Sättigungsmolmenge beträgt. Unter Sättigungsmolmenge versteht man die Molmenge, die eine konzentrierte wässrige Lösung bei Raumtemperatur eines Schlachthofes an gelöstem Kochsalz enthält. (Eine konzentrierte wässrige Kochsalzlösung ist ca. 26,4%ig.)

Eine konzentrierte NaCl-Lösung entsteht z.B. auch durch Einstreuen der tropfnassen Tierdärme mit Kochsalz.

In der Regel werden die entschleimten Tierdärme 2 Std. bis zu 3 Tagen mit Kochsalzlösungen behandelt. Meistens ist die Behandlung der Tierdärme jedoch schon nach 3-24 Std. beendet. Nach Entfernen der konservierten und entwässerten Tierdärme aus der Kochsalzlösung erhält man eine Darm-Salzlake, die einen überraschend hohen Gehalt an Heparin besitzt.

Durch die erfindungsgemässe Verwendung derartiger Darm-Salzlaken als Rohstoff gelang es, Heparin auch in technischem Massstab in einer Reinheit zu isolieren, dass es als nahezu farblose Substanz vorliegt. Alle bis heute aus anderen Rohstoffen verfügbaren Rohheparine müssen dagegen erst durch aufwendige und verlustreiche Verfahren entfärbt werden (US-PS 3 179 566).

Darm-Salzlake ist darüber hinaus ein lagerfähiger, fast geruchloser Rohstoff, der durch lange Lagerung keine Qualitätseinbussen erfährt. Damit entfallen chemische und andere Konservierungsmethoden.

Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von Darm-Salzlake, die durch Einlegen von vom Darmschleim befreiten Tierdärmen in Kochsalzlösungen erhalten worden ist, zur Herstellung von reinem Heparin. Aus dieser Darm-Salzlake kann das reine Heparin nach bekannten Verfahren isoliert werden.

Beispiel 1

600 Ltr. Salzlake wurden in einem 1500-Ltr.-Rührwerkbei Raumtemperatur unter Rühren innerhalb einer halben Stunde mit 600 Ltr. Methanol versetzt. Es wurde die gleiche Zeit nachgerührt, wonach die Mischung ca. eine Stunde stehen blieb.

Nun dekantierte man den trüben Überstand in ein zweites Gefäss und liess den ausgefallenen Salzkuchen zurück. Die gewonnene Suspension blieb nun zwei Tage stehen. Danach wurde wieder dekantiert, der Überstand verworfen und der Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert. Nach dem Trocknen im Vakuum erhielt man 1,44 kg eines Produkts, das ca. 10 USP-Einheiten/mg besitzt. Es besteht noch zu ca. 45% aus Kochsalz. Ein Aliquot des so erhaltenen Rohheparins, entsprechend ca. 425 000 USP-E bzw. 42,5 g, wurde dreimal mit je 200 ml zweimolarer Kochsalzlösung extrahiert, wobei jeweils eine Stunde bei 60°C gerührt wurde. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser verdünnt, bis die Lösung ca. 0,9 Mol/1 Chloridionen enthielt. Es wurden nun 200 ml eines Anionenaustauschers (Lewatit CA 9249) in der Chlorid-Form zugegeben und man rührte eine Stunde. Anschliessend s

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wurde abgesaugt und mit ca. 200 ml 0,9molarer Kochsalzlösung nachgewaschen. Der Ionenaustauscher wurde dann fünf Stunden mit zweimolarer Kochsalzlösung bei 40°C gerührt und danach abgesaugt und mit zweimolarer Kochsalzlösung nachgewaschen. Die Elutionslösung wurde mit der Waschlösung vereinigt und mit dem l,5fachen Volumen Methanol gefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, erst mit ca. 50 ml Wasser-Methanol (1 + 1,5 Volumenteile), dann mit ca. 50 ml Methanol nachgewaschen und getrocknet.

Man erhielt 198 g Na-Heparinatmit 195 USP-Einheiten pro mg.

15,5 g eines in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Natriumheparinats mit ca. 200 USP-Einheiten pro mg wurden in 200 ml zweimolarer Kochsalzlösung aufgelöst. Die Lösung wurde über eine Nutsche gesaugt und der Rückstand wurde mit zunächst 30 ml zweimolarer Kochsalzlösung, dann mit ca. 250 ml vollentsalztem Wasser gewaschen. Die vereinigten Lösungen wurden nun mit vollentsalztem Wasser auf eine Chlorid-Molarität von 0,9 gebracht. Nun wurde wie vorstehend die Reinigung mit einem Liter Lewatit CA 9249 wiederholt.

Die vereinigte Elutions- und Waschlösung wurde wie oben weiterverarbeitet. Nach dem Waschen und Trocknen der Fällung erhielt man 11,2 g Natriumheparinat, das eine Aktivität von 251 USP-Einheiten pro mg besass.

Beispiel 2

Ähnlich britischem Patent 754 885 wurden 3 Ltr. Salzlake unter Rühren mit Essigsäure auf pH 3,1-3,2 angesäuert (ca. 50 ml). Nach einigen Stunden wurde dekantiert und der Rest zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen, die vereinigten Lösungen wurden mit Natronlauge neutralisiert.

Nun wurde unter Rühren langsam mit dem gleichen Volumen Methanol versetzt. Nach 45 Minuten wurde vom ausgefallenen Kochsalz dekantiert. Diese Suspension Hess man mehrere Stunden stehen, dekantierte den Überstand und zentrifugierte den Rest. Die Fällung wurde im Vakuum getrocknet. Man erhielt 3,43 g mit 21 USP-Einheiten/mg. Ein Aliquot des so erhaltenen Rohheparins entsprechend ca. 425 000 USP-E bzw. 20,2 g, wurden analog Beispiel 1 gereinigt. Man erhielt 10,65 g Natriumheparinat, mit einer Aktivität von 262 USP-Einheiten pro mg.

Beispiel 3

3 Ltr. Salzlake wurden mit 12 Ltr. Wasser auf eine Chlorid-Molarität von ca. 0,85 m verdünnt. Dann wurden 50 g Kieselgur sowie eine Lösung von 6 g Bezethoniumchlorid (=Hyamin 1622, Rohm & Haas) in 100 ml Wasser zugegeben. Nach einigen Stunden wurde dekantiert und der Rest abgesaugt. Nach dem Waschen mit Wasser wurde der noch feuchte Niederschlag dreimal nach dem Verfahren aus der

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deutschen Patentschrift 1228 241 mit je 200 ml 2molarer Kochsalzlösung extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 2 Volumenteilen Methanol gefällt. Der isolierte und getrocknete Niederschlag wog 465 mg und besass eine Aktivität von 155 USP-Einheiten/mg.

Beispiel 4

30 Ltr. Salzlake wurden mit 120 Ltr. Wasser auf eine Chlorid-Molarität von ca. 0,85 m verdünnt (vgl. DE-PS 1 156 938). Dann wurde mit Essigsäure (ca. 50 ml) auf pH 3,2 angesäuert. Nach einigen Stunden hatte sich eine Fällung abgesetzt, die nach dem Dekantieren des klaren Überstandes abzentrifugiert wurde. Nach dem Trocknen erhielt man 111g Rohheparin mit 6,5 USP-Einheiten/mg. Ein Aliquot des so erhaltenen Rohheparins, entsprechend ca. 425 000 USP-Einheiten bzw. 65,5 g, wurden zunächst analog Beispiel 1 gereinigt. Nach der ersten Reinigungsstufe über Ionenaustauscher erhielt man 196 g Na-Heparinat mit 198 USP-E pro mg.

15 g eines in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Natriumheparinats mit ca. 200 USP-Einheiten pro mg wurden in 200 ml zweimolarer Calciumchloridlösung aufgelöst. Die Lösung wurde über eine Nutsche gesaugt und der Rückstand wurde mit zunächst 30 ml zweinormaler Calciumchloridlösung, dann mit ca. 250 ml vollentsalztem Wasser gewaschen. Die vereinigten Lösungen wurden nun mit vollentsalztem Wasser auf eine Chlorid-Molarität von 0,9 gebracht. Nun wurde wie vorstehend mit einem Liter Lewatit CA 9249 gerührt. Die Elution und das Nachwaschen wurden mit zweimolarer Calciumchloridlösung anstelle von Kochsalzlösung durchgeführt.

Die vereinigte Elutions- und Waschlösung wurde wie oben weiterverarbeitet. Nach dem Waschen und Trocknen der Fällung erhielt man 10,7 g Calciumheparinat, das eine Aktivität von 260 USP-Einheiten pro mg besass.

Beispiel 5

10 Ltr. Salzlake wurden mit 40 Ltr. Wasser auf eine Chlorid-Molarität von ca. 0,85 m verdünnt. Diese Lösung wurde durch einen Filter über eine Ionenaustauschersäule mit einem Durchmesser von 26 mm und einer Länge von 380 mm gepumpt (ca. 3 Ltr./Std.). Es wurde ein mittelbasisches makroporöses Anionenaustauscherharz in der Cl-Form verwendet (Lewatit CA 9249). Es können auch andere Anio-nenaustauscherharze verwendet werden, wie z.B. das in der deutschen Patentschrift 1 253 868 beschriebene Dowex 1-X-l.

Anschliessend wurde das Harz aus der Säule entfernt, zweimal mit 500 ml 0,9molarer Kochsalzlösung gewaschen und mit 400 ml 2molarer Kochsalzlösung 5 Stunden bei 40°C unter Rühren eluiert. Diese Lösung wurde mit 1,5 Volumenteilen Methanol gefällt. Der isolierte und getrocknete Niederschlag wog 1,2 g und besass 149 USP-Einheiten/mg.

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