RS61228B1 - Modulacija tumorske imunosti - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na modulaciju tumorske imunosti u lečenju uznapredovalih tumora. Konkretno, predmetni pronalazak obezbeđuje antagoniste PD-1 u kombinaciji sa agonistima GITR kako bi se poboljšali anti-tumorski odgovori na uznapredovale tumore.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Mikrookolina tumora je važan aspekt biologije kancera koji doprinosi inicijaciji tumora, progresiji tumora i odgovorima na terapiju. Ćelije i molekuli imunskog sistema su fu immune system are a fundamentalna komponenta mikrookoline tumora. Veoma je važno to da terapeutske strategije mogu da omoguće imunskom sistemu da specifično ciljano deluje na tumorske ćelije, a to je naročito atraktivno zbog mogućnosti da se indukuje imunološka memorija specifična za tumor, što može da dovede do dugotrajne regresije i da spreči relaps kod pacijenata sa kancerom.

[0003] Sastav i karakteristike mikrookoline tumora variraju u širokom rasponu i važni su kada se određuje anti-tumorski imunski odgovor. Na primer, neke ćelije imunskog sistema, uključujući ćelije prirodne ubice, dentritske ćelije (DC ćelije) i efektorske T ćelije, sposobne su da pokrenu moćne anti-tumorske odgovore. Međutim, tumorske ćelije često indukuju imunosupresivnu mikrookolinu, što favorizuje razvoj imunosupresivnih populacija imunskih ćelija kao što su supresorske ćelije mijeloidnog porekla i regulatorne T ćelije. Razumevanje složenosti imunomodulacije od strane tumora važno je za razvoj imunoterpije. U toku je razvoj različitih strategija za poboljšanje anti-tumorskih imunskih odgovora, uključujući vakcine na bazi DC ćelija i antagonista inhibitornih signalnih puteva sa ciljem da se izbegnu ’imunske kontrolne tačke.

[0004] Glukokortikoidima indukovani TNFR-srodan protein (GITR), član TNFR superfamilije, eksprimiran je u brojnim komponentama urođenog i adaptivnog imunskog sistema (videti, npr., Hanabuchi, et al. (2006) Blood 107:3617-3623; i Nocentini i Riccardi (2005) Eur. J. Immunol.

2005. 35:1016-1022). Njegova ekspresija na membrani povećava se nakon aktivacije T ćelija (Hanabuchi, supra; i Nocentini i Riccardi, supra); njegovo aktiviranje aktivira efektorske T limfocite i moduliše aktivnost regulatornih T ćelija (Treg) (videti, npr., McHugh, et al. (2002) Immunity 2002. 16:311-323; Shimizu, et al. (2002) Nat. Immunol.. 3:135-142; Ronchetti, et al.

(2004) Eur. J. Immunol. 34:613-622; i Tone, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:15059-15064.

[0005] GITR se aktivira pomoću GITR liganda (GITRL), koji je uglavnom eksprimiran na APC i sugerisano je da je njegova uloga da putem svog citoplazmatskog domena isporučuje signale, mada su dodatne studije neophodne da bi se definisali biohemijski signalni putevi (Nocentini, supra; Ronchetti, supra; Suvas, et al. (2005) J. Virol. 79:11935-11942; i Shin, et al. (2002) Cytokine 19:187-192).

[0006] Aktivacija GITR povećava otpornost na tumore i na virusne infekcije, uključena je u autoimunske/inflamatorne procese i reguliše ekstravazaciju leukocita (Nocentini supra; Cuzzocrea, et al. (2004) J. Leukoc. Biol.76:933-940; Shevach, et al. (2006) Nat. Rev. Immunol.

6:613-618; Cuzzocrea, et al. (2006) J. Immunol. 177:631-641; and Cuzzocrea, et al. (2007) FASEB J. 21:117-129). U mišijim modelima tumora, antitelo koje je agonist GITR, DTA-1, kombinovano je sa antitelom koje je antagonist CTLA-4, i u nekim testiranim grupama miševa su pokazani sinergistički rezultati u vidu potpune regresije tumora kod tumora u uznapredovalim stadijumima (Ko, et al. (2005) J. Exp. Med. 7:885-891). U publikaciji Schaer et al (Curr. Opin. Immunol. (2012) 24(2):217-24) opisano je prekliničko ispitivanje koje pokazuje da ciljano delovanje na GITR antitelima koja su agonisti ili prirodni ligandi može da služi kao efikasna anti-tumorska terapija i opisana je argumentacija koja je dovela do otpočinjanja kliničkih ispitivanja faze 1 sa ciljem da se ispita GITR kao novi imunoterapeutski pristup lečenju kancera.

[0007] Receptor programirane smrti 1 (PD-1) je imunoinhibitorni receptor koji je primarno eksprimiran na aktiviranim T i B ćelijama. Pokazano je da interakcija sa njegovim ligandima atenuira T-ćelijske odgovore, kako in vitro, tako i in vivo. Pokazano je da blokada interakcije između PD-1 i jednog od njegovih liganada, PD-L1, pojačava tumor-specifičnu CD8<+>T-ćelijsku imunost i da stoga može da bude od pomoći pri uklanjanju tumorskih ćelija od strane imunskog sistema.

[0008] PD-1 (koga kodira gen Pdcdl) je član superfamilije imunoglobulina srodan sa CD28 i CTLA-4. Pokazano je da PD-1 negativno reguliše signaliziranje putem antigen receptora nakon vezivanja njegovih liganada (PD-L1 i/ili PD-L2) Struktura mišijeg PD-1 je razrešena, kao i kokristalna struktura mišijeg PD-1 sa ljudskim PD-L1 (Zhang, X., et al., (2004) Immunity 20: 337-347; Lin, et al., (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 3011-6). PD-1 i slični članovi familije su transmembranski glikoproteini tipa I koji sadrže Ig domen varijabilnog tipa (V-tipa) koji je zadužen za vezivanje liganda, i citoplazmatski rep koji je zadužen za vezivanje signalnih molekula. Citoplazmatski rep molekula PD-1 sadrži dva tirozinska signalna motiva, jedan ITIM (imunoreceptorski tirozinski inhibitorni motiv) i jedan ITSM (imunoreceptorski tirozinski „prekidač“ motiv).

[0009] Ekspresija PD-1 (na limfocitima koji se infiltriraju u tumor) i/ili PD-L1 (na tumorskim ćelijama) kod ljudi, pokazana je putem imunohistohemije na nizu biopsija primarnih tumora. Ova tkiva uključuju kancere pluća, jetre, jajnika, grlića materice, kože, debelog creva, glije, bešike, dojke, bubrega, jednjaka, želuca, oralnih skvamoznih ćelija, urotelnih ćelija i pankreasa, kao i tumora glave i vrata (Brown, J. A., et al., (2003) J. Immunol.170: 1257-1266; Dong H., et al., (2002) Nat. Med.8: 793-800; Wintterle, et al., (2003) Cancer Res.63: 7462-7467; Strome, S. E., et al., (2003) Cancer Res. 63: 6501-6505; Thompson, R. H., et al., (2006) Cancer Res. 66: 3381-5; Thompson, et al., (2007) Clin. Cancer Res. 13: 1757-61; Nomi, T., et al., (2007) Clin. Cancer Res. 13: 2151-7). Ono što je još upadljivije, ekspresija PD-liganda na tumorskim ćelijama povezana je sa lošom prognozom kod pacijenata sa kancerom, za više tipova tumora (pregled je dat u publikaciji Okazaki i Honjo, (2007) Int. Immunol.19: 813-824).

[0010] Do sada su brojne studije pokazale da interakcija PD-1 sa njegovim ligandima (PD-L1 i PD-L2) dovodi do inhibicije proliferacije limfocita in vitro i in vivo. Blokada interakcije PD-1/PD-L1 mogla bi da vodi pojačanoj tumor-specifičnoj T-ćelijskoj imunosti i da tako bude od pomoći pri uklanjanju tumorskih ćelija od strane imunskog sistema. Izvedene se brojne studije kako bi se razmotrila ova tema. Terapeutska efikasnost blokade PD-1/PD-L1 je pokazana na mišijem modelu agresivnog kancera pankreasa (Nomi, T., et al. (2007) Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157). Primena antitela usmerenog ili na PD-1 ili na PD-L1 značajno je inhibirala rast tumora. Blokada pomoću antitela je efikasno pospešivala infiltraciju tumor-reaktivnih CD8<+>T ćelija u tumor dovodeći do pojačanog delovanja anti-tumorskih efektora, uključujući IFN gama, granzim B i perforin. Dodatno, autori su pokazali da blokada PD-1 može efikasno da se kombinuje sa hemioterapijom da bi se proizveo sinergistički efekat. U drugoj studiji, u kojoj je korišćen model karcinoma skvamoznih ćelija kod miševa, blokada PD-1 ili PD-L1 pomoću antitela, značajno je inhibirala rast tumora (Tsushima, F., et al., (2006) Oral Oncol.42: 268-274).

[0011] Postoji potreba za poboljšanim postupcima i kompozicijama za lečenje imunskih i proliferativnih poremećaja, npr., tumora i kancera, upotrebom sredstava koja modulišu tumorsku imunost. Predmetni pronalazak ispunjava ovu potrebu time što obezbeđuje antagoniste PD-1 u kombinaciji sa agonistima GITR za lečenje tumora na uznapredovalim stadijumima.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0012]

Slike 1A-1K prikazuju efekat anti-GITR antitela, kada se doziraju sama ili u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelima, na anti-tumorski odgovor kod miševa kod kojih je implantirana ćelijska linija MC38 (n=10/grupi). Tretman je otpočeo kada su tumori dostigli 240-360 mm3.

Slike 2A-2F prikazuju anti-tumorsku efikasnost jedne doze anti-GITR antitela, praćene jednom dozom anti-PD-1 antitela, nedelju dana kasnije (Sl.2B), ili obrnutim redosledom (Sl. 2C). Ova situacija je poređena sa svakim pojedinačnim antitelom (Slike 2E-2F; n=10/grupi)

Slike 3A-3D prikazuju anti-tumorsku efikasnost monoterapije samo anti-GITR ili samo anti-PD-1 antitelima (Figs 3C-3D), u poređenju sa istovremenom primenom oba antitela (Sl. 3A) u CT26 tumorskom modelu (n=10/grupi).

Slike 4A-4D prikazuju efekat anti-GITR i anti PD-1 antitela kada su dozirana pojedinačno, ili sa istovremenom primenom oba antitela, na anti-tumorski odgovor miševa kod kojih je inplantirana MB49 ćelijska linija (n=10/grupi). Tretman je otpočeo kada su tumori dostigli 85-122 mm3.

Slike 5A-5B prikazuju dozno zavisan efekat kombinacije anti-GITR (MK-4166) i anti-PD-1 (MK-3475) na Treg ćelije (Sl. 5A) i odnos Treg:CD8 ćelija (Sl. 5B) u reakciji mešanih limfocita (MLR).

Slika 6 pokazuje da inkubacija sa kombinacijom MK-4166 i MK-3475 dovodi do smanjene supresivne aktivnosti Treg ćelija u MLR reakciji.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0013] Predmetni pronalazak ispunjava ove potrebe prisutne u stanju tehnike, i više od toga, na taj način što obezbeđuje kombinaciju PD-1 antagonista i GITR agonista za upotrebu u postupku za lečenje tumora kod pacijenta, pri čemu se PD-1 antagonist i GITR agonist primenjuju istovremeno ili jedan za drugim. PD-1 antagonist je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji vezuje PD-1 ili PD-L1; a GITR agonist je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji vezuje GITR. U nekim primerima izvođenja, GITR agonist i PD-1 ili PD-L1 antagonist vezuju se za ljudske proteine. Antitelo ili njegov vezujući fragment je humanizovano ili potpuno ljudsko antitelo.

[0014] U dodatnim primerima izvođenja, PD-1 antagonist je odabran iz grupe koja se sastoji od BMS-936558, MK-3475 i MPDL3280A; a GITR agonist je odabran iz grupe koja se sastoji od antitela koja imaju najmanje jedan CDR sekvenci SEQ ID NOs: 1 - 66; TRX518 i TRX385. GITR agonist može da bude antitelo koje ima: CDR1 teškog lanca sekvenci SEQ ID NO: 1-11, CDR2 sekvenci SEQ ID NO: 12-22 i CDR3 sekvenci SEQ ID NO: 23-33; i/ili CDR1 lakog lanca sekvenci SEQ ID NO: 34-44, CDR2 sekvenci SEQ ID NO: 45-55 i CDR3 sekvenci SEQ ID NO: 56-66. U još jednom primeru izvođenja, GITR agonist je antitelo koje ima: varijabilan teški lanac sekvenci SEQ ID NO: 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 i 87; i/ili verijabilan laki lanac sekvenci SEQ ID NO: 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 i 88.

[0015] Predmetni pronalazak takođe razmatra situaciju kada se PD-1 antagonist i GITR agonist primenjuju istovremeno najmanje jedanput. U nekim primerima izvođenja, PD-1 antagonist i GITR agonist se primenjuju istovremeno najmanje 2 puta. U nekim primerima izvođenja, tumor je tumor u uznapredovalom stadijumu i može da se odabere iz grupe koja se sastoji od kancera skvamoznih ćelija, sitnoćelijskog kancera pluća, nesitnoćelijskog kancera pluća, gastrointestinalnog kancera, pankreasnog kancera, glioblastoma, glioma, cervikalnog kancera, kancera jajnika, kancera jetre kao što su hepatični karcinom i hepatom, kancera bešike, kancera dojke, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, endometrijalnog karcinoma, mijeloma (kao što je multipli mijelom), karcinoma pljuvačnih žlezda, kancera bubrega kao što su karcinom bubrežnih ćelija i Vilmsovi tumori, karcinoma bazalnih ćelija, melanoma, kancera prostate, kancera vulve, kancera štitne žlezde, kancera testisa i kancera jednjaka.

[0016] Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvu ruku koja se vezuje za PD-1 ili PD-L1 i deluje kao antagonist PD-1 activity, and a second arm that binds to GITR and agonizes GITR activity za upotrebu u postupku za lečenje tumora. U nekim primerima izvođenja, prva ruka je odabrana iz grupe koja se sastoji od antigen-vezujućeg fragmenta dobijenog od BMS-936558, MK-3475 i MPDL3280A; a druga ruka je odabrana iz grupe koja se sastoji od antigen-vezujućeg fragmenta antitela koja ima najmanje CDR sekvence SEQ ID NO: 1 - 66; TRX518; i TRX385. U još jednom dodatno primeru izvođenja, druga ruka ima CDR1 teškog lanca sa sekvencama SEQ ID NO: 1-11, CDR2 sa sekvencama SEQ ID NO: 12-22 i CDR3 sa sekvencama SEQ ID NO: 23-33; i/ili CDR1 lakog lanca sa sekvencama SEQ ID NO: 34-44, CDR2 sa sekvencama SEQ ID NO: 45-55, i CDR3 sa sekvencama SEQ ID NO: 56-66. U nekim primerima izvođenja, druga ruka ima varijabilan teški lanac sa sekvencama SEQ ID NO: 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 i 87; i/ili varijabilan laki lanac sa sekvencama SEQ ID NO: 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 i 88.

[0017] Predmetni pronalazak obezbeđuje kombinaciju PD-1 antagonista i GITR agonista za upotrebu u postupku za lečenje tumora, pri čemu tumor predstaVLja tumor u uznapredovalom stadijumu. U nekim primerima izvođenja, tumor u uznapredovalom stadijumu je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera skvamoznih ćelija, sitnoćelijskog kancera pluća, nesitnoćelijskog kancera pluća, gastrointestinalnog kancera, kancera pankreasa, glioblastoma, glioma, cervikalnog kancera, kancera jajnika, kancera jetre kao što su hepatični karcinom i hepatom, kancera bešike, kancera dojke, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, endometrijalnog karcinoma, mijeloma (kao što je multipli mijelom), karcinoma pljuvačnih žlezda, kancera bubrega kao što su karcinom bubrežnih ćelija i Vilmsovi tumori, karcinoma bazalnih ćelija, melanoma, kancera prostate, kancera vulve, kancera štitne žlezde, kancera testisa i kancera jednjaka.

[0018] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži PD-1 antagonist i GITR agonist. Takođe je obezbeđena upotreba PD-1 antagonista u kombinaciji sa GITR agonistom, za lečenje tumora u uznapredovalom stadijumu.

DETALJAN OPIS

[0019] Kako se ovde koriste, uključujući i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju sebi odgovarajuće reference u množini, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tabela 15 data u nastavku teksta, obezbeđuje listu identifikacionih oznaka za sekvence koje se koriste u ovoj patentnoj prijavi. Nije predviđeno da ovde navedene reference budu priznanje da bilo šta od prethodno navedenog predstaVLja relevantno stanje tehnike, niti da predstaVLjaju bilo kakvo priznanje kad je u pitanju sadržaj ili datum objave ovih publikacija ili dokumenata.

I. Definicije

[0020] Izraz “glukokortikoidima indukovani TNF receptor” (ovde skaraćeno “GITR”), takođe poznat i kao receptor 18 TNF superfamilije (TNFRSF18), TEASR i 312C2, kako se ovde koristi, odnosi se na jednog od članova familije receptora za faktor nekroze tumora/faktor rasta nerava. GITR je transmembranski protein tipa I, dug 241 amino kiselinu, koga karakterišu tri cisteinska pseudo-ponovka u vanćelijskom domenu i koji obezbeđuje specifičnu zaštitu od apoptoze indukovane T-ćelijskim receptorima, premda ne štiti ćelije od drugih apoptotskih signala, uključujući Fas inicijaciju, tretman deksametazonom ili UV zračenje (Nocentini, G., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6216-622). Sekvence nukleinskih kiselina i amino kiselinske sekvence ljudskog GITR (hGITR), koji postoji u tri splajsovane varijante, poznate su, i mogu da se nađu pod, na primer, GenBank pristupnim brojevima gi:40354198, gi:23238190, gi:23238193, gi:23238196.

[0021] “GITR agonist” označava bilo koje hemijsko jedinjenje ili biološki molekul koji stimuliše imunsku reakciju putem aktivacije GITR signalnih puteva. Sekvence anti-GITR antitela na agoniste obezbeđene su u WO 2011/028683 i WO 2006/105021, a takođe i kao TRX-385 i TRX-518. Takođe se razmatraju GITR-L proteini, koji predstaVLjaju vezujućeg partnera za GITR.

[0022] “PD-1 antagonist” označava bilo koje hemijsko jedinjenje ili biološki molekul koji blokira vezivanje PD-L1 liganda eksprimiranog na ćeliji kancera, za PD-1 koji je eksprimiran na imunskoj ćeliji (T ćeliji, B ćeliji ili NKT ćeliji) i poželjno takođe blokira vezivanje PD-L2 liganda eksprimiranog na ćeliji kancera, za PD-1 eksprimiran na imunskoj ćeliji. Alternativna imena ili sinonimi za PD-1 i njegove ligande uključuju: Receptor 1 programirane ćelijske smrti; PDCD1, PD1, CD279 i SLEB2 za PD-1; PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 i B7-H za PD-L1; Ligand 1 receptora programirane ćelijske smrti , PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc i CD273 za PD-L2. U bilo kom postupku lečenja, medikamentima i upotrebama prema predmetnom pronalasku, kojima se leči ljudska individua, PD-1 antagonist blokira vezivanje ljudskog PD-L1 za ljudski PD-1, i poželjno blokira vezivanje i ljudskog PD-L1 i ljudskog PD-L2 za ljudski PD-1. Amino kiselinske sekvence ljudskog PD-1 mogu da se nađu na lokusu NCBI Locus No.: NP_005009. Amino kiselinske sekvence ljudskog PD-L1 i PD-L2 mogu da se nađu na lokusima NCBI Locus No.: NP_054862 i NP_079515, redom.

[0023] PD-1 antagonisti korisni u bilo kom od postupaka lečenja, medikamenata i upotreba prema predmetnom pronalasku uključuju monoklonsko antitelo (mAb), ili njegov antigenvezujući fragment, koji se specifično vezuju za PD-1 ili PD-L1, i poželjno specifično vezuju za ljudski PD-1 ili ljudski PD-L1. mAb može da bude ljudsko antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo, i može da uključuje ljudski konstatni region. U nekim primerima izvođenja ljudski konstatni region je odabran iz grupe koja se sastoji od konstantnih regiona IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, i, u poželjnim primerima izvođenja, ljudski konstatni region je IgG1 ili IgG4 konstantni region. U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući fragment je odabran iz grupe koja se sastoji od Fab, Fab’-SH, F(ab’)2, scFv i Fv fragmenata.

[0024] Primeri mAb koja se vezuju za ljudski PD-1, i koja su korisna u postupku lečenja, medikamentima ili upotrebama prema predmetnom pronalasku, opisani su u US7521051, US8008449 i US8354509. Specifična anti-humana PD-1 mAb, korisna kao PD-1 antagonisti u postupku lečenja, medikamentima ili upotrebama prema predmetnom pronalasku uključuju: MK-3475, humanizovano IgG4 mAb sa strukturom opisanom u publikaciji WHO Drug Information, Vol. 27, No. 2, strane 161-162 (2013) i koje sadrži amino kiselinske sekvence teškog i lakog lanca prikazane na Slici 6, nivolumab (BMS-936558), humano IgG4 mAb sa strukturom opisanom u publikaciji WHO Drug Information, Vol.27, No.1, strane 68-69 (2013) i koje sadrži amino kiselinske sekvence teškog i lakog lanca prikazane na Slici 7; pidilizumab (CT-011, poznat i kao hBAT ili hBAT-1); i humanizovana antitela h409A11, h409A16 i h409A17, koja su opisana u WO2008/156712.

[0025] Primeri mAbs koja se vezuju za ljudski PD-L1, i koja su korisna u postupku lečenja, medikamentima ili upotrebama prema predmetnom pronalasku, opisani su u WO2013/019906, WO2010/077634 A1 i US8383796. Specifična anti-humana PD-L1 mAb, korisna kao PD-1 antagonisti u postupku lečenja, medikamentima ili upotrebama prema predmetnom pronalasku uključuju MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB0010718C i antitelo iz WO2013/019906, koje sadrži varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca, sa sekvencama SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:21, redom.

[0026] Izraz “primena”, kako se ovde koristi, odnosi se na fizičko uvođenje kompozicije koja sadrži GITR agonist i najmenje jedno dodatno sredstvo za lečenje kancera, npr., PD-1 antagonist, u pacijenta koji ima kancer. Prema pronalasku je predviđen bilo koji postupak uvođenja; postupak ne zavisi od bilo kojih konkretnih sredstava za uvođenje. Sredstva za uvođenje su dobro poznata stručnjacima u oblasti, a njihovi primeri su ovde obezbeđeni.

[0027] Izraz “združena primena”, kako se ovde koristi označava postupak kojim se kombinacija GITR agonista i najmanje jednog dodatnog sredstva za lečenje kancera , npr., PD-1 antagonista, primenjuje kod istog pacijenta. GITR agonist i PD-1 antagonist mogu da se primenjuju istovremeno ili jedan za drugim. Ukoliko se primenjuju jedan za drugim, GITR agonist i/ili PD-1 antagonist mogu da se primenjuju pre ili posle datog dodatnog sredstva za lečenje kancera ili dodatnog tretmana. Tretman GITR agonistom i PD-1 antagonistom ne moraju nužno da se primenjuju posredstvom istog vehikuluma. GITR agonist i PD-1 antagonist mogu da se primenjuju jednom ili više puta i broj primena svake kombinacije može da bude isti ili različit. Osim toga, GITR agonist i PD-1 antagonist ne moraju da budu primenjeni na istom mestu.

[0028] Izraz “terapeutski efikasna količina” ili “terapeutski efikasna kombinacija”, kako ssse ovde koristi, odnosi sse na neku količinu ili dozu GITR agonista, zajedno sa količinom ili dozom dodatnog sredstva ili tretmana, npr., PD-1 antagonista, koji je dovoljan da moduliše, npr., stimuliše, sistemski imunski odgovor individue. Količina svakog molekula u datoj terapeutski efikasnoj kombinaciji može da bude različita za različite indiviue i tipove tumora, i zavisiće od jednog ili više dodatnih sredstava ili tretmana koji su uključeni u kombinaciju. “Terapeuski efikasna količina” se određuje upotrebom procedura koje rutinski koriste stručnjaci u oblasti, na takav nači da dolazi do “poboljšanog terapijskog ishoda”.

[0029] Kako se ovde koriste, izrazi “poboljšan terapijski ishod” i “pojačana terapijska efikasnost”, u odnosu na kancer, odnosi se na usporavanje ili smanjenje rasta ćelija kancera ili čvrstog tumora, ili na smanjenje ukupnog broja ćelija kancera ili ukupnog tumorskog opterećenja. “Poboljšan terapijski ishodi” i “pojačana terapijska efikasnost”, znači, dakle, da postoji poboljšanje stanja pacijenta u skladu sa bilo kojim klinički prihvatljivim kriterijumom, uključujući, na primer, smanjenu veličinu tumora, produžetak vremena do progresije tumora, produženo vreme oprežiVLjavanja bez progresije, produženo ukupno vreme prežiVLjavanja, povećanje očekivanog životnog veka ili poboljšanje kvaliteta života. Konkretno, “poboljšan” ili “pojačan”, odnosi se na poboljšanje ili pojačanje od 1%, 5%, 10%, 25% 50%, 75%, 100%, ili više od 100%, bilo kog klinički prihvatljivog indikatora terapijskog ishoda ili efikasnosti.

[0030] Kako se ovde koristi, izraz “antitelo” odnosi se na bilo koji oblik antitela koji ispoljava željenu biološku aktivnost. Dakle, koristi se u najširem smislu i specifično pokriva monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela potpune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), himerna antitela, humanizovana antitela, potpuno ljudska antitela, itd., sve dotle dok ona ispoljavaju željenu biološku aktivnost.

[0031] Kako se ovde koriste, izrazi “GITR, PD-1 ili PD-L1-vezujući fragment”, “njegov vezujući fragment” ili “njegov antigen-vezujući fragment” obuhvataju fragment ili derivat antitela koji i dalje u osnovi zadržava biološku aktivnost antitela koja se sastoji u indukovanju GITR signalnog puta, što se ovde označava kao “GITR indukujuća aktivnost”. Alternativno, PD-1 ili PD-L1-vezujući fragment obuhvata fragment ili derivat antitela koji inhibira PD-1 aktivnost, npr., vezivanje za PD-L1 ili PD-L2. Izraz “fragment antitela” ili GITR, PD-1 ili PD-L1-vezujući fragment odnosi se na deo antitela ili antitelo potpune dužine, u principu na njegov antigenvezujući ili varijabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab’, F(ab’)2i Fv fragmente; diatela; linearna antitela; molekule antitela sa jednim lancem, npr., sc-Fv; i multispecifična antitela koja nastaju od fragmenata antitela. Vezujući fragment ili derivat uobičajeno zadržava najmanje 10% svoje aktivnosti kao GITR agonist. Poželjno, vezujući fragment ili derivat zadržava najmanje 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ili 100% (ili više) svoje aktivnosti kao GITR agonist ili PD-1 antagonist, premda će biti koristan svaki vezujući fragment sa dovoljnim afinitetom da ispoljava željeni biološki efekat. Takođe je predviđeno da GITR, PD-1 ili PD-L1-vezujući fragment može da uključuje varijante koje imaju konzervativne amino kiselinske supstitucije koje ne menjaju u značajnoj meri njegovu biološku aktivnost.

[0032] Izraz “monoklonsko antitelo”, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije antitela koja je u osnovi homogena, tj., individualna antitela koja sačinjavaju

1

populaciju su identična, osim što prirodne mutacije mogu da budu u manjoj meri prisitne. Monoklonska antitela su visoko specifična, budući da su usmerena protiv jedinstvenog antigenog epitopa. Nasuprot tome, preparacije konvencionalnih (poliklonskih) antitela uobičajeno uključuju mnoštvo antitela usmerenih protiv (ili specifičnih za) različitih epitopa. Atribut "monoklonski" ukazuje na onaj karakter antitela koje ima antitelo dobijeno od suštinski homogene populacije antitela, i ne treba ga shvatati tako da podrazumeva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja su predviđena za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu da budu napraVLjena metodom hibridoma koju su prvi opisali Kohler, et al. (1975) Nature 256: 495, ili mogu da budu napraVLjena metodom rekombinantne DNK (videti, npr., SAD Pat. br. 4,816,567). “Monoklonska antitela” takođe mogu da budu izolovana iz fagne biblioteke antitela, tehnikama koje su opisane u Clackson, et al. (1991) Nature 352: 624-628 i Marks, et al. (1991) J. Mol. Biol.222: 581-597, na primer.

[0033] Monoklonska antitela ovde specifično uključuju “himerna” antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa, ili homolog, odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim iz konkretne vrste, ili spadaju u neku određenu klasu ili potklasu antitela, dok je ostatak lanca(aca) identičan sa, ili homolog, odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i u fragmentima ovih aantitela, sve dotle dok ona ispoljavaju željenu biološku aktivnost. SAD Pat. br.4,816,567; Morrison, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855.

[0034] “Domen antitela” je imunološki funkcionalan fragment imunoglobulina koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više VHregiona kovalentno se povezuju sa peptidnim linkerom, kako bi nastalo antitelo sa bivalentnim domenom. Dva VHregiona antitela sa bivalentnim domenom mogu ciljano da interaguju sa istim ili sa različitim antigenima.

[0035] “Bivalentno antitelo” sadrži dva antigen-vezujuća mesta. U nekim slučajevima, ta dva vezujuća mesta imaju istu specifičnost za antigen. Međutim, bivalentna antitela mogu da budu bispecifična (videti tekst koji sledi).

[0036] Kako se ovde koristi, izraz “jednolančano Fv” ili “scFv” antitelo odnosi se na antitela fragmente antitela koji sadrže VHi VLdomene antitela, pri ;emu su ovi domeni prisutni u jednom polipetidnom lancu. U principu, Fv polipeptid dodatno sadrži polipeptid linker između VHi VLdomena što omogućava da sFv obrazuje željenu strukuru za vezivanje antigena. Za pregled kad je u pitanju sFv, videti Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol.113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315.

[0037] Monoklonska antitela ovde takođe uključuju kamelizovana antitela sa jednim domenom. “Fragment antitela sa domenom” je imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više VHregiona spajaju se kovalentno sa peptidnim linkerom kako bi se stvorio fragment antitela sa multivalentnim domenom. Ova dva VHregiona fragmenta antitela sa bivalentnim domenom mogu ciljano da deluju na isti ili na različite antigene. Videti, npr., Muyldermans, et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann, et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; SAD Pat. br. 6,005,079). U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela sa jednim domenom koji sadrži dva VHdomena sa modifikacijama, tako da se obrazuju antitela da jednim domenom.

[0038] Kako se ovde koristi, izraz “diatela” odnosi se na male fragmente antitela sa dva antigenvezujuća mesta, pri čemu ti fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u isti polipeptidni lanac (VH-VLili VL-VH). Ako se korsti linker koji je dovoljno kratak tako da ne omogućava sparivanje allow pairing između dva domena na istom lancu, ovi domeni bivaju prinuđeni da se spare sa komplementarnim domenima na drugom lancu, tako da se stvaraju dva antigen-vezujuća mesta. Diatela su potpunije opisana u, npr., EP 404,097; WO 93/11161; i u Holliger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Za uopšteni pregled varijanti anitela dobijenim tehnikama inženjerstva, videti Holliger i Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

[0039] Kako se ovde koristi, izraz “humanizovano antitelo” odnosi se na oblike antitela koji sadrže sekvence ne-ljudskih (npr., mišijih) anitela, kao i ljudskih antitela. Ovakva antitela sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-ljudskog imunoglobulina. U principu, humanizovano antitelo će u osnovi sadržati sve od najmanje jednog, a tipično dva varijabilna domena u kojima sve, ili u osnovi sve, hipervarijabilne petlje odgovaraju petljama u ne-ljudskom imunoglobulinu i svi, ili u osnovi svi, FR regioni su regioni sa sekvencom ljudskog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će izborno takođe sadržati i najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), uobičajeno konstantnog regiona ljudskog imunoglobulina. Prefiks "hum", "hu" or "h" se dodaje oznakama za klonove anitela kada je neophodno da se napravi razlika između humanizovanih antitela i roditeljskih glodarskih antitela. Humanizovani oblici glodarskih antitela u principu će sadržati iste CDR sekvence roditeljskih glodarskih antitela, iako je moguće da neke amino kiselinske supstitucije budu uključene kako bi se povećao afinitet ili stabilnost humanizovanog antitela, ili iz drugih razloga.

[0040] Izraz “potpuno ljudsko antitelo” odnosi se na antitelo koje sadrži samo ljudske proteinske imunoglobulinske sekvence. Potpuno ljudsko antitelo može da sadrži mišije ugljenohidratne lance ukoliko je proizvedeno u mišu, mišijoj ćeliji ili u hibridoma ćeliji dobijenoj od mišije. Slično tome, “mišije antitelo” ili “pacovsko antitelo” odnosi se na antitelo koje sadrži samo mišije ili pacovske imunoglobulinske sekvence, redom. Potpuno ljudsko antitelo može da bude generisano u ljudskom biću, u transgenoj životinji koja ima humane imunoglobulinske sekvence klicine linije, putem prikazivanja na fagima ili drugim molekularno biološkim postupcima. Tipične tehnike koje mogu da se koriste za pravljenje antitela, opisane su u SAD patentima: 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140. Druge tehnike, kao što je upotreba biblioteka, takođe su poznate u oblasti.

[0041] Antitela prema predmetnom pronalasku takođe uključuju antitela sa modifikovanim (ili blokiranim) Fc regionima koji obezbeđuju izmenjene efektorke funkcije. Videti, npr., SAD Pat. br. 5,624,821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Ove modifikacije mogu da se koriste da bi se pojačale ili suprimirale različite reakcije imunog sistema, sa mogućim korisnim efektima prilikom postavljanja dijagnoze i lečenja. Izmene Fc regiona uključuju promene amino kiselina (supstitucije, delecije i insercije), glikozilaciju ili deglikozilaciju, i dodavanje višestrukih Fc. Izmene Fc takođe mogu da promene polu-život antitela kad su u pitanju terapeutska antitela, a duži polu-život bi doveo do ređeg doziranja, uz istovremeno povećanje povoljnosti i smanjenje upotrebe materijala. Videti Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 na 734-35.

[0042] Antitela prema predmetnom pronalasku takođe uključuju antitela sa Fc regionima koji obezbeđuju potpune efektorske funkcije, npr. antitela IgG1 izotipa, koji u ciljnoj ćeliji indukuju citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) ili ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC).

[0043] Antitela prema predmetnom pronalasku takođe uključuju antitela konjugovana sa citotoksičnim elementima, kao što su citotoksični agensi ili radionuklidi. Ovakvi konjugati antitela mogu da se koriste za imunoterapiju u sprezi sa tretmanom pomoću anti-GITR, anti-PD-1 ili anti PD-L1, kako bi se ciljano delovalo na ćelije koje na svojoj površini eksprimiraju određene antigene i kako bi takve ćelije bile ubijene. Tipični citotoksični agensi uključuju ricin, vinka alkaloid, metotreksat, Psuedomonas egzotoksin, saporin, difterija toksin, cisplatin, doksorubicin, abrin toksin, gelonin i antivirusni protein vinobojke. Tipični radionuklidi za upotrebu u imunoterapiji antitelima prema predmetnom pronalasku uključuju<125>I,<131>I,<90>Y,<67>Cu, 211At, 177Lu, 143Pr i 213Bi. Videti, npr., Objavu SAD patentne prijave br.2006/0014225.

[0044] Bispecifična antitela takođe su korisna u predmetnim postupcima i kompozicijama. Kako se ovde koristi, izraz “bispecifično antitelo” odnosi se na antitelo, obično na monoklonsko antitelo, koje ima vezujuće funkcionalnosti za najmanje dva različita antigena epitopa. U jednom

1

primeru izvođenja, epitopi su od istog antigena. U drugom primeru izvođenja, epitopi su od dva različita antigena. Postupci za praVLjenje bispecifičnih antitela su poznati u oblasti. Na primer, bispecifična antitela mogu da se proizvode rekombinantno, upotrebom koekspresije dva para imunoglobulinskog teškog lanca/lakog lanca. Videti, npr., Milstein, et al. (1983) Nature 305: 537-39. Alternativno, bispecifična antitela mogu da se pripreme upotrebom hemijskog povezivanja. Videti, npr., Brennan, et al. (1985) Science 229:81. Bispecifična antitela uključuju bispecifične fragmente antitela. Videti, npr., Holliger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

90:6444-48, Gruber, et al. (1994) J. Immunol. 152:5368.

[0045] Izraz “multispecifičan” uključuje vezujuće molekule koji imaju specifičnost za više od jednog ciljnog antigena. Ovi molekuli imaju više od jednog vezujućeg mesta od kojih svako specifično vezuje (npr., imunoreaguje sa) različite ciljne molekule ili različita antigena mesta na istom ciljnom molekulu. U jednom primeru izvođenja, multispecifični vezujući molekul prema pronalasku predstaVLja bispecifični molekul (npr., antitelo, minitelo, antitelo sa deletiranim domenom, ili fuzioni protein) koje ima vezujuću specifičnost za najmanje dva cilja, npr., za više od jednog ciljnog molekula ili za više od jednog epitopa n istom ciljnom molekulu.

[0046] Kako se ovde koristi, izraz “hipervarijabilni region” odnosi se na amino kiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži amino kiselinske ostatke iz “regiona koji određuje komplementarnost ili “CDR” regiona (npr. ostatke 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) i 89-97 (CDRL3) u varijabilnom domenu lakog lanca i ostatke 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) i 95-102 (CDRH3) u varijabilnom domenu teškog lanca (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) i/ili ostatke iz “hipervarijabilne petlje” (npr., ostatke 26-32 (LI), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (HI), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca (Chothia i Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Kako se ovde koristi, izraz “okvirni” ili “FR” ostaci odnosi se na ostatke varijabilnog regiona koji nisu isti oni ostaci hipervarijabilnog regiona koji su ovde definisani kao CDR ostaci. Navedeni način numeracije ostataka odnosi se na sistem numeracije po Kabatu.

[0047] “Vezujuće jedinjenje” se odnosi na molekul, mali molekul, makromolekul, polipeptid, antitelo ili njegov fragment ili analog, ili solubilni receptor, koji je u stanju da se veže za ciljnu kategoriju. “Vezujuće jedinjenje” takođe može da se odnosi na molekulski kompleks, npr., nekovalentni kompleks, na jonizovani molekul i na kovalentno ili nekovalentno modifikovan molekul, npr., modifikovan fosforilacijom, acilacijom, unakrsnim povezivanjem, ciklizacijom ili ograničenom degradacijom, koji je u stanju da se veže za ciljnu kategoriju. Kada se odnosi na antitela, izraz “vezujuće jedinjenje” odnosi se i na antitela i na njihove antigen-vezujuće fragmente. “Vezivanje” se odnosi na asocijaciju vezujuće kompozicije i ciljne kategorije gde ta asocijacija dovodi do smanjenja normalnog Braunovog kretanja u vezujućoj kompoziciji, u slučajevima kada vezujuća kompozicija može da se rastvori ili suspenduje u rastvoru. “Vezujuća kompozicija” se odnosi na molekul, npr. vezujuće jedinjenje, u kombinaciji sa stabilizatorom, ekscipijensom, solju, puferom, rastvaračem ili aditivom, koje je u stanju da se veže za ciljnu kategoriju.

[0048] Kako se ovde koristi, “konzervativno modifikovane varijante” ili “konzervativna supstitucija” odnosi se na supstitucije amino kiselina koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti i često mogu da se uvode čak i u esencijalnim regionima antitela, a da se biološka aktivnost dobijenog antitela ne promeni. Ovakve tipične supstitucije poželjno se uvode u skladu sa supstitucijama izloženim u Tabeli 1 koja sledi:

Tabela 1

1

[0049] Stručnjaci u oblasti će uočiti da je u principu moguće da supstitucije pojedinačnih amino kiselina u neesencijalnim regionima polipeptida ne izmene u osnovi biološku aktivnost. Videti, npr., Watson, et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition).

[0050] Fraza “sastoji se u osnovi od”, ili varijacije kao što su “sastoji se u osnovi od” ili “koji se u osnovi sastoji od”, onako kako se koristi kroz celu specifikaciju i u patentnim zahtevima, ukazuje na uključivanje bilo kog navedenog elementa ili grupe elemenata, i izborno uključivanje drugih elemenata, slične ili različite prirode u odnosu na navedene elemente, koji ne menjaju temeljno osnovna ili inovativna svojstva specifikovanih režima doziranja, postupaka ili kompozicija. Kao neograničavajući primer, vezujuće jedinjenje koje se u osnovi sastoji od navedene amino kiselinske sekvence može takođe da uključuje jednu ili više amino kiselina, uključujući supstitucije jednog ili više amino kiselinskih ostataka, koje ne utiču temeljno na svojstva vezujućeg jedinjenja.

[0051] “Imunsko stanje” ili “imunski poremećaj” obuhvata, npr., patološko zapaljenje, zapaljenski poremećaj i autoimunski poremećaj ili bolest. “Imunsko stanje” takođe se odnosi na infekcije, dugotrajne infekcije i proliferativna stanja kao što su kancer, tumori i angiogeneza, koja su otporna na uklanjanje delovanjem imunskog sistema. “Kancerozno stanje “ uključuje, npr. kancer, ćelije kancera, tumore, angiogenezu i prekancerozna stanja kao što je displazija.

[0052] "Proliferativna aktivnost” obuhvata aktivnost koja pospešuje, koja je neophodna za, ili koja je specifično povezana sa, npr., normalnom ćelijskom deobom, kao i sa kancerom, tumorima, displazijom, transformacijom ćelija, metastazama i angiogenezom.

[0053] Izrazi “kancer”, “tumor”, “kancerozno” i “maligno” odnose se na, ili opisuju, fiziološko stanje kod sisara koje se obično odlikuje neregulisanim ćelijskim rastom. Primeri kancera

1

uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom uključujući adenokarcinom, limfom, blastom, melanom, sarkom i leukemiju. Konkretniji primeri ovih kancera uključuju

kancer skvamoznih ćelija, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, gastrointestinalni kancer, Hočkinov i ne-Hočkinov limfom, kancer pankreasa, glioblastom, gliom, cervikalni kancer, kancer jajnika, kancer jetre kao što je hepatični karcinom i hepatom, kancer bešike, kancer dojke, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, endometrijalni karcinom, mijelom (kao što je multipli mijeloma), karcinom pljuvačnih žlezda, kancer bubrega kao što su karcinom bubrežnih ćelija i Vilmsovi tumori, karcinom bazalnih ćelija, melanom, kancer prostate, kancer vulve, kancer štitne žlezde, kancer testisa, kancer jednjaka i različiti tipovi kancera glave i vrata.

[0054] Kada kancerozne ćelije rastu i umnožavaju se, one obrazuju masu kanceroznog tkiva, odnosno tumor, koja osvaja i uništava susedna normalna tkiva. Maligni tumori predstaVLjaju kancer. Maligni tumori mogu da se uklone, ali mogu i ponovo da narastu removed. Ćelije iz malignih tumora mogu da osvoje i oštete obližnja tkiva i organe. Takođe, ćelije kancera se odvajaju od malignog tumora i ulaze u krvotok i limfni sistem, što predstaVLja način na koji se ćelije kancera šire od primarnog tumora (tj., originalnog kancera) da bi obrazovale nove tumore u drugim organima. Širenja kancera u telu označava se kao metastaza (What You Need to Know About Cancer- an Overview, NIH Publication No. 00-1566; postaVLjeno 26. septembra, 2000, ažurirano 16. septembra, 2002 (2002)).

[0055] Kako se ovde koristi, izraz “čvrsti tumor” odnosi se na poremećen rast ili masu tkiva koja obično ne sadrži ciste ili oblasti sa tečnošću. Solid tumori mogu da budu benigni (nekancerozni) or maligni (kancerozni). Različiti tipovi čvrstih tumora dobijaju imena na osnovu tipa ćelija koje ih obrazuju. Primeri čvrstih tumora su sarkomi, karcinomi i limfomi. Leukemije (kanceri krvi) u principu ne obrazuju čvrste tumore (National Cancer Institute, Dictionary of Cancer Terms).

[0056] “Tumorsko opterećenje” koje se označava i kao “tumorski teret”, odnosi se na ukupnu količnu tumorskog materijala raspoređenog u telu. Tumorsko opterećenje se odosi na ukupan broj ćelija kancera ili ukupnu veličinu tumora(â), u celom telu, uključujući limfne čvorove i koštanu srž. Tumorsko opterećenje može da se odredi pomoću niza različitih postupaka poznatih u oblasti, kao, npr. merenjem dimenzija tumora(â) nakon uklanjanja iz subjekta, npr., upotrebom kalipera, ili, dok je tumor u telu, upotrebom tehnika vizelizacije, npr., ultrazvuka, skeniranjem kostiju, kompjuterskom tomografijom (CT) ili skeniranjem vizuelizacije magnetne rezonance (MRI).

[0057] Izraz “veličina tumora” odnosi se na ukupnu veličinu tumora koja može da se meri kao dužina i širina tumora. Veličina tumora može da se određuje nizom različitih postupaka koji su

1

poznati u oblasti, kao, npr. merenjem dimenzija tumora(â) nakon uklanjanja iz subjekta, npr., upotrebom kalipera, ili, dok je tumor u telu, upotrebom tehnika vizelizacije, npr., skeniranjem kostiju, ultrazvukom, CT tehnikom ili MRI skeniranjem.

[0058] Kako se ovde koristi, izraz “primarni kancer” odnosi se na originalni tumor ili prvi tumor. Kancer može da počne u bilo kom organu ili tkivu u telu. Obično dobija ime prema delu tela ili tipu ćelije u kojima otpočinje (Metastatic Cancer: Questions and Answers, Cancer Facts 6.20, National Cancer Institute, pregledano 1. septembra 2004. (2004)).

[0059] Kako se ovde koristi, izraz “karcinom in situ” odnosi se na kancerozne ćelije koje se i dalje nalaze u tkivu u kome su i počele da rastu, i koje još nisu postale invazivne niti su se proširile na druge delove tela.

[0060] Kako se ovde koristi, izraz “karcinomi” se odnosi na kancere epitelnih ćelija, a to su ćelije koje pokrivaju površinu tela, proizvode hormone i sačinjavaju žlezde. Primeri karcinoma su kanceri kože, pluća, debelog creva, želuca, dojke, prostate i štitne žlezde.

[0061] Kako se ovde koristi, izraz “izolovani molekul nukleinske kiseline” odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminirajućeg molekula nukleinske kiseline sa kojim je uobičajeno povezan u prirodnom izvoru nukleinske kiseline antitela. Izolovani molekul nukleinske kiseline je drugačiji od oblika ili okruženja u kome se nalazi u prirodi. Izolovani molekuli nukleinske kiseline se, dakle, razlikuju od molekula nukleinske kiseline kakav postoji u prirodnim ćelijama. Međutim, izolovani molekul nukleinske kiseline uključuje molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje obično eksprimiraju antitelo, gde se, na primer, molekul nukleinske kiseline nalazi na hromozomskoj lokaciji različitoj od one u prirodnim ćelijama.

[0062] Izraz “kontrolne sekvence” odnosi se na DNK sekvence uključene u ekspresiju operabilno povezanih kodirajućih sekvenci u konkretnom organizmu domaćina. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokriote, na primer, uključuju promotorsku, izborno operatorsku sekvencu i mesto za vezivanje ribozoma. Za eukariotske ćelije je poznato da koriste promotore, signale za poliadenilaciju i enhensere.

[0063] Nukleinska kiselina je “operabilno povezana” kada je postaVLjena u funkcionalan odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za presekvencu ili sekretornu lidersku sekvencu operabilno je povezana sa DNK za polipeptid ukoliko je eksprimirana kao preprotein koji učestvuje u sekreciji tog polipeptida; promotor ili enhenser je operabilno povezan sa kodirajućom sekvencom ukoliko utiče na transkripciju te sekvence; ili, mesto za vezivanje ribozoma je operabilno povezano sa kodirajućom sekvencom ukoliko je pozicionirano tako da olakšava translaciju. Generalno, „operabilno povezan“ znači da se DNK sekvence koje su

1

povezane, nastaVLjaju jedna na drugu, i u slučaju sekretorne liderske sekvence, da se nastaVLjaju jedna na drugu i da su u okviru čitanja. Međutim, enhenseri ne moraju da se nastaVLjaju jedan na drugi. Povezivanje se ostvaruje ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adaptori ili linkeri, u skladu sa konvencionalnom praksom.

[0064] Kako se ovde koriste, izrazi „ćelija“, „ćelijska linija“ i „ćelijska kultura“ se naizmenično koriste i sva takva označavanja uključuju potomstvo. Dakle, reči „transformanti“ i „transformisane ćelije“ uključuju primarne ćelije subjekta i iz njih izvedene kulture, bez obzira na broj transfera. Takođe se podrazumeva da potomstvo može da ne bude precizno identično po DNK sadržaju, usled namerno izazvanih ili slučajnih mutacija. Ovde se uključuje i mutirano potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što su funkcija i biološka aktivnost za koje je obaVLjen skrining u originalno transformisanoj ćeliji. Kada je predviđeno drugačije značenje oznaka, ono će biti jasno iz konteksta.

[0065] Kako se ovde koristi, „lančana reakcija polimeraze“ ili „PCR“ odnose se na proceduru ili tehniku u kojoj se veoma male količine specifičnog delića nukleinske kiseline, RNK i/ili DNK, are amplifikuju kao što je opisano u as described in, npr., SAD Pat. br. 4,683,195. U principu, neophodno je da bude dostupna informacija o sekvenci na krajevima regiona od interesa ili iza njih, tako da mogu da se dizajniraju oligonukleotidni prajmeri; ovi prajmeri će po sekvenci biti identični ili slični naspramnim lancima matrice koja se amplifikuje.5’ terminalni nukleotidi dva prajmera mogu da se poklapaju sa krajevima amplifikovanog materijala. PCR može da se koristi za amplifikaciju specifične RNK sekvence, specifične DNK sekvence na osnovu ukupne genomske DNK i cDNK koja se transkribuje na osnovu RNK, sekvence bakteriofaga ili plazmidne sekvence, itd. Videti uopšteno Mullis, et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) Kako se ovde koristi, smatra se da je PCR jedan, ali ne i jedini, primer metode za reakciju polimeraze sa nukleinskim kiselinama kojom se ispitivani uzorak nukleinske kiseline amplifikuje i koji obuhvata upotrebu poznate nukleinske kiseline kao prajmera i polimeraze nukleinskih kiselina, kako bi se amplifikovao ili obrazovao specifičan delić nukleinske kiseline.

[0066] Kako se ovde koristi, izraz „sekvenca klicine linije“ odnosi se na sekvencu neuređene imunoglobolinske DNK, uključujući glodarske (npr. mišije) i ljudske sekvence klicine linije. Moguće je koristiti bilo koji pogodan izvor neuređene imunoglobulinske DNK. Ljudska sekvenca klicine linije može da se dobije, na primer, iz baze podataka u vezi sa klicinim linijama JOINSOLVER® na internet stranici institucije National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the United States National Institutes of Health. Mišije

1

sekvence klicine linije mogu da se dobiju, na primer, kao što je opisano u publikaciji Giudicelli et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:D256-D261.

[0067] Da bi se ispitao stepen pojačanja, npr. GITR aktivnosti, uzorci ili testovi koji sadrže dati, npr. protein, gen, ćeliju ili organizam, tretiraju se potencijalnim agensom koji aktivira ili inhibira i upoređuju se sa kontrolnim uzorcima tretiranim neaktivnim kontrolnim molekulom. Kontrolnim uzorcima dodeljuje se relativna vrednost aktivnosti od 100%. Inhibicija se postiže kada je vrednost aktivnosti u odnosu na kontrolu oko 90% ili manje, tipično 85% ili manje, tipičnije 80% ili manje, najčešće 75% ili manje, obično 70% ili manje, generalno 65% ili manje , najčešće 60% ili manje, obično 55% ili manje, obično 50% ili manje, obično 45% ili manje, najčešće 40% ili manje, poželjno 35% ili manje, još poželjnije 30% ili manje, još poželjnije 25% ili manje, a najpoželjnije manje od 20%. Aktivacija se postiže kada je vrednost aktivnosti u odnosu na kontrolu oko 110%, uglavnom najmanje 120%, općenito najmanje 140%, općenito najmanje 160%, često najmanje 180%, češće najmanje dvostruko, najčešće najmanje 2,5 puta, obično najmanje 5 puta, obično najmanje 10 puta, poželjno najmanje 20 puta, još bolje najmanje 40 puta, a najpoželjnije preko 40 puta više.

[0068] Krajnje tačke aktivacije ili inhibicije mogu da se prate na sledeći način. Aktivacija, inhibicija i odgovor na tretman, npr., ćelije, fiziološke tečnosti, tkiva, oragana i životinjskog ili ljudskog subjekta, može da se meri preko krajnje tačke. Krajnja tačka može da obuhvata prethodno utvrđenu količinu ili procentni iznos, npr., nekog indikatora zapaljenja, onkogenosti ili ćelijske degranulacije ili sekrecije, kao što je oslobađanje citokina, toksičnog kiseonika ili proteaze. Krajnja tačka može da obuhvata, npr., prethodno utvrđenu količinu jonskog fluksa ili transporta; ćelijsku migraciju; ćelijsku adheziju; ćelijsku proliferaciju; potencijal za metastaze; ćelijsku diferencijaciju; i promenu fenotipa, npr., promenu ekspresije gene u vezi sa zapaljenjem, apoptozom, transformacijom, ćelijskim ciklusom ili metastazama (videti, npr., Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood i Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins and Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am.

86:1467-1495; Grady and Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic and Satoh (2000) Brain Pathol.10:113-126).

[0069] Krajnja tačka inhibicije u principu iznosi 75% kontrole ili manje, poželjno 50% kontrole ili manje, poželjnije 25% kontrole ili manje, i najpoželjnije 10% kontrole ili manje. U principu, krajnja tačka aktivacije iznosi najmanje 150% kontrole, poželjno najmanje dva puta više od kontrole, poželjnije najmanje četiri puta više od kontrole, i najpoželjnije najmanje 10 puta više od kontrole.

[0070] „Mali molekul” je definisan kao molekul sa molekulskom težinom manjom od 10 kDa,

2

obično manjom od 2 kDa, a poželjno manjom od 1 kDa. Mali molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na, neorganske molekule, organske molekule, organske molekule sadrži neorgansku komponentu, molekule koji sadrže radioaktivni atom, sintetičke molekule, mimetike peptida i mimetike antitela. Kao terapeut, mali molekul može biti propusniji za ćelije, manje podložan razgradnji i manje spreman da izazove imuni odgovor od velikog Opisani su mali molekuli, poput peptidnih mimetika antitela i citokina, kao i toksini malih molekula. Videti, npr., Casset, et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001) J. Biotechnol.

74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol.18:1251-1256; Apostolopoulos, et al. (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini, et al. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues, et al. (1999) Nat. Struct. Biol.6:652-656; Sato and Sone (2003) Biochem. J.371:603-608; SAD Patent br. 6,326,482.

[0071] Konkretno "ili" selektivno "se vezuje, kada se odnosi na ligand / receptor, antitelo / antigen ili drugi vezujući par, ukazuje na reakciju vezivanja koja je odlučujuća za prisustvo proteina u heterogenoj populaciji proteina i drugim biološkim sredstvima. Dakle, pod određenim uslovima, navedeni ligand se vezuje za određeni receptor i ne veže se u značajnoj količini za druge proteine prisutne u uzorku.Kao što se ovde koristi, za antitelo se kaže da se specifično veže za polipeptid koji sadrži datu sekvencu (u ovom slučaju GITR) ako se veže za polipeptide koji sadrže sekvencu GITR, ali se ne vezuju za proteine kojima nedostaje sekvenca GITR. Na primer, antitelo koje se specifično vezuje za polipeptid koji sadrži GITR može se vezati za oblik GITR-a sa oznakom FLAG®, ali će ne vezuju se za druge proteine označene FLAG®.

[0072] Izraz „epitop“ ili „antigena determinanta“ odnosi se na mesto na antigenu za koje se vezujući molekul specifično vezuje. Epitopi mogu da se obrazuju i od amino kiselina od susednih ili nesusednih amino kiselina između kojih se nalazi tercijarna struktura proteina. Epitopi koje obrazuju susedne amino kiseline uobičajeno se zadržavaju nakon izlaganja denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi obrazovani zahvaljujući tercijarnoj strukturi uobičajeno gube are typically lost on treatment with denaturing solvents. An epitop uobičajeno uključuje najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 amino kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Postupci za dređivanje prostorne konformacije epitopa uključuju, na primer, rendgensku kristalografiju i 2-dimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonancu.

[0073] Binding molecules that recognize the same epitope can be identified in a simple immunoassay showing the ability of one antibody to block the binding of another antibody to a target antigen, i.e., a competitive binding assay. Competitive binding is determined in an assay in which the binding molecule being tested inhibits specific binding of a reference binding molecule to a common antigen, such as GITR. Numerous types of competitive binding assays are known, na primer: solid phase direct or indirect radioimmunoassay (RIA); solid phase direct or indirect enzyme immunoassay (EIA) sandwich competition assay (videti Stahli, et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242); solid phase direct biotin-avidin EIA (videti Kirkland, et al., (1986) J. Immunol. 137:3614); solid phase direct labeled assay, solid phase direct labeled sandwich assay (videti Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); solid phase direct label RIA using 1-125 label (videti Morel, et al., (1988) Mol. Immunol.25(1):7); solid phase direct biotin-avidin EIA (Cheung, et al., (1990) Virology 176:546); and direct labeled RIA. (Moldenhauer, et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77).

[0074] Typically, such an assay involves the use of purified antigen bound to a solid surface or cells bearing either of these, an unlabeled test binding molecule and a labeled reference binding molecule. Competitive inhibition is measured by determining the amount of label bound to the solid surface or cells in the presence of the test binding molecule.

[0075] Usually the test binding molecule is present in excess. Usually, when a competing binding molecule is present in excess, it will inhibit specific binding of a reference binding molecule to a common antigen by at least 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% or more.

[0076] The antibody, or binding composition derived from the antigen-binding site of an antibody, of the contemplated method binds to its antigen with an affinity that is at least two fold greater, preferably at least ten times greater, more preferably at least 20-times greater, and most preferably at least 100-times greater than the affinity with unrelated antigens. In a preferred embodiment the antibody will have an affinity that is greater than about 109 liters/mol, as determined, npr., by Scatchard analysis. Munsen, et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239.

II. Opšte

[0077] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje treating advanced stage tumora u uznapredovalom stadijumu, kombinacijom with a combination of GITR agonista i PD-1 antagonistâ, uključujući anti-GITR and anti-PD-1 or anti-PD-Ll antibodies.

III. Farmaceutske kompozicije

[0078] Da bi se pripremile farmaceutske ili sterilne kompozicije GITR, PD-1 ili PD-L1 antitela se mešaju sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom. Videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

[0079] Formulacije terapeustskih i dijagnostičkih agenasa mogu da se pripremaju tako što se mešaju sa fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima, u obliku, npr., liofiliziranih praškova, gustih rastvora, vodenih rastvora ili suspenzija. Videti, npr., Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY.

[0080] Toksičnost ili terapeutska efikasnost kompozicija sa antitelima, kada se primenjuju same ili u kombinaciji sa nekim imunosupresivnim sredstvom, mogu da se odrede pomoću standardnih farmaceutskih procedura u ćelijskim kulturama ili na eksperimentalnim životinjama, npr., kako bi se odredile LD50(doza koja je letalna za 50% populacije) i ED50(doza koja je terapeutski efikasna za 50% populacije). Odnos doze između toksičnog i terapeutskog efekta je terapeutski indeks i on može da se izrazi kao odnos LD50prema ED50. Poželjna su antitela koja ispoljavaju visoke terapeutske indekse. Podaci dobijeni iz ovih testova na ćelijskim kulturama i iz životinjskih studija mogu da sse koriste kako bi se formulisao opseg doziranja za upotrebu kod ljudi. Doze ovih jedinjenja poželjno se nalaze unutar opsegâ koncentracija u cirkulaciji koji uključuju ED50sa malo ili ni malo toksičnosti. Doziranje može da se nalazi unutar ovog opsega u zavisnosti od oblika doziranja koji se upotrebljava, kao i rute primene.

[0081] The mode of administration is not particularly important. Suitable routes of administration may, na primer, include oral, rectal, transmucosal, or intestinal administration; parenteral delivery, uključujući intramuscular, subcutaneous, intramedullary injections, as well as intrathecal, direct intraventricular, intravenous, intraperitoneal, intranasal, or intraocular injections. Administration of antibody used in the pharmaceutical composition or to practice the method of the present invention can be carried out in a variety of conventional ways, such as oral ingestion, inhalation, topical application or cutaneous, subcutaneous, intraperitoneal, parenteral, intraarterial or intravenous injection.

[0082] Alternately, one may administer the antibody in a local rather than systemic manner, na primer, via injection of the antibody directly into an arthritic joint or pathogen-induced lesion characterized by immunopathology, often in a depot or sustained release formulation. Furthermore, one may administer the antibody in a targeted drug delivery system, na primer, in a liposome coated with a tissue-specific antibody, targeting, na primer, arthritic joint or

2

pathogeninduced lesion characterized by immunopathology. The liposomes will be targeted to and taken up selectively by the afflicted tissue.

[0083] Izbor režima primene za terapiju zavisi od nekoliko faktora, uključujući stopu serumskog ili tkivnog obrta entiteta, nivo simptoma, imunogenost entiteta i dostupnost ciljnih ćelija u biološkom matriksu. Poželjno je da režim primene maksimizira količinu terapije koja se isporučuje pacijentu u skladu sa prihvatljivim nivoom neželjenih efekata. Shodno tome, količina isporučenog biološkog proizvoda delimično zavisi od određenog entiteta i težine stanja koje se leči. Dostupna su uputstva za odabir odgovarajućih doza antitela, citokina i malih molekula. Videti, npr., Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh, et al. (2003) New Engl. J. Med.348:24-32; Lipsky, et al. (2000) New Engl. J. Med.343:1594-1602.

[0084] Odgovarajuću dozu određuje kliničar, npr., koristeći parametre ili faktore koji su poznati ili se sumnja u struci da utiču na lečenje ili za koje se predviđa da će uticati na lečenje. Generalno, doza započinje sa količinom nešto manjom od optimalne doze i nakon toga se povećava malim koracima dok se ne postigne željeni ili optimalni efekat u odnosu na bilo kakve negativne neželjene efekte. Važne dijagnostičke mere uključuju one simptoma, npr. Upale ili nivoa proizvedenih inflamatornih citokina. Poželjno je da biološki lek koji će se koristiti u osnovi potiče od iste vrste kao i životinja ciljana na lečenje (npr. Humanizovano antitelo za lečenje ljudi), čime minimizira bilo kakav imuni odgovor na reagens..

[0085] Antitela i fragmenti antitela mogu se dobiti kontinuiranom infuzijom ili dozama u intervalima, npr. jedan dan, 1-7 puta nedeljno, nedelju dana, dve nedelje, mesečno, dvomesečno itd. Doze se mogu davati intravenozno, subkutano, lokalno, oralno, nazalno, rektalno, intramuskularno, intracerebralno, intraspinalno ili inhalacijom. Poželjni protokol doze je onaj koji uključuje maksimalnu dozu ili učestalost doze koji izbegava značajne neželjene neželjene efekte. Ukupna nedeljna doza je uglavnom najmanje 0.05 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 0.2 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg telesne težine ili više. Videti, npr., Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych.

67:451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144. Željena doza terapeutskog sredstva koje ima mali molekul, npr., peptidni mimetik, prirodni proizvod ili organska hemikalije, otprilike je ista kao i za antitelo ili polipeptid, na bazi mola/kg.

[0086] Postupci za združenu primenu ili tretman sa drugim terapeutskim sredstvom treatment with a second therapeutic agent, npr., a cytokine, antibody, steroid, chemotherapeutic agent, antibiotic, anti-viral, or radiation, are well known in the art, videti, npr., Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA. Konkretno, primena PD-1 ili PD-L1 antitela može se desiti istovremeno ili uzastopno. U određenim realizacijama, anti-GITR antitelo se prvo može primeniti, a zatim periodično (npr. Nedelju dana kasnije ili nedeljno) doziranje antitela protiv PD-1 ili anti-PD-Ll. Alternativno, lečenje anti-PD-1 ili PD-L1 antitelima može biti praćeno lečenjem anti-GITR antitelima po sličnom rasporedu. U daljim rešenjima, antitela na GITR se daju zajedno sa anti-PD-1 ili anti-PD-Ll u najmanje jednom tretmanu ili u više doza (npr. nedeljno davanje).

[0087] GITR, PD-1 ili PD-L1 antitela mogu da se kombinuju sa hemioterapijskim sredstvima, uključujući alkilkilirajuće agense kao što su tiotepa i CITOXAN® ciklofosfamidi; alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenin (posebno bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući svoj adocelesin, karzelesin i bizelesin sintetic analozi); kriptoficin (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB 1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodictin; spongistatin; azotna jedinjenja kao hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorida, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil mustard; nitrozuree kao karmustine, hlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, and ranimnustine; antibiotics suh as te enediine antibiotics (npr., caliheamicin, naročito calihemicin gama i caliheamicin omega 1 (videti, npr., Agnew, Hem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicin, uključujući dinemicin A; bisfosfonates, suh as klodronate; an esperamicin; as well as neocarzinostatin hromofore and related hromoprotein enediine antibiotic hromofore), aklacinomisini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kactinomicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucine, ADRIAMICIN® doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin,

2

cijanomorfolino doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini kao mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti kao metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidine kao ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgeni kao kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenergici kao aminoglutetimid, mitotan, trilostan; dopune folne kiseline kao frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsakrine; bestrabucil; bisantrene; edatraksate; defofamine; demekolcin; diazikvon; elformitin; eliptinijum acetat; epotiloe; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; maitansinoidi kao maitansin i anzamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazide; procarbazine; PSK® polisacharide compleks (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoksane; rhizoksin; sizofuran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2,2’,2"-trihlorotrietilamine; trihotecenes (especialli T-2 toksin, verakurin A, roridin A i angvidin); uretan; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosine; arabinoside ("Ara-C"); ciklofosfamide; tiotepa; taksoidi, npr., TAXOL® paklitaksel (Bristol-Miers Squibb Oncologi, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ Kremofor-free, albuminom izmenjena nanočestična formulacija paklitaksela (American Farmaceutical Partners, Shaumberg, Ill.), i TAXOTERE® doksetaksel (Rhône-Poulenc Rorer, Antoni, France); hloranbucil; GEMZAR® gemcitabine; 6-tioguanine; mercaptopurine; metotreksate; platinum analogs suh as cisplatin and carboplatin; vinblastine; platinum; etoposide (VP-16); ifosfamide; mitoksantrone; vinkristine; NAVELBINE® vinorelbine; novantrone; teniposide; edatreksate; daunomicin; aminopterin; XELODA® capecitabine; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitine (DMFO); retinoids suh as retinoic acid; and farmaceuticalli acceptable salts, acids or derivatives of ani of te above.

[0088] Takođe su uključeni anti-hormonalni agensi that act to regulate or inhibit hormone action on tumors such as antiestrogens and selective estrogen receptor modulators (SERMs), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX ® tamoksifen), raloksifene, droloksifene, 4 hydroksytamoksifen, trioksifene, keoksifene, LY117018, onapristone, and FARESTON. toremifene; aromatase inhibitors that inhibit the enzyme aromatase, which regulates estrogen production in the adrenal glands, such as, na primer, 4(5)-imidazoles,

2

aminoglutethimide, MEGASE® megestrol acetate, AROMASIN® exemestane, formestanie, fadrozole, RIVISOR® vorozole, FEMARA® letrozole, and ARIMIDEX® anastrozole; and antiandrogens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, and goserelin; as well as troxacitabine (a 1,3-dioxolane nucleoside cytosine analog); antisense oligonucleotides, particularly those which inhibit expression of genes in signaling pathways implicated in abherant cell proliferation, such as, na primer, PKC-alpha, Ralf and H-Ras; ribozymes such as a VEGF expression inhibitor (npr., ANGIOZYME® ribozyme) and a HER2 expression inhibitor; vaccines such as gene therapy vaccines, na primer, ALLOVECTIN® vaccine, LEUVECTIN® vaccine, and VAXID® vaccine; PROLEUKIN ® rIL-2; LURTOTECAN® topoisomerase 1 inhibitor; ABARELIX® rmRH; and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above.

[0089] Kombinovana terapija se koristi za lečenje tumora u poodmakloj fazi dimenzija najmanje oko 175 mm3. U još jednom izvođenju pronalaska, kombinovana terapija se koristi za lečenje tumora koji ima najmanje oko 200 mm3, 300 mm3, 400 mm3, 500 mm3, 750 mm3, do 1000 mm3. Kombinovana terapija prema pronalasku koristi se za lečenje tumora koji je dovoljno velik da se pronađe palpacijom ili tehnikama slikanja dobro poznatim u struci, kao što su MRI, ultrazvuk ili CAT skeniranje.

[0090] „Sinergistički efekat“ dva jedinjenja je onaj kod koga je efekat kombinacije dva agensa veći od zbira njihovih pojedinačnih efekata i statistički se razlikuje od kontrola i pojedinačnih lekova. U još jednom primeru izvođenja, kombinovane terapije prema pronalasku imaju aditivni efekat. „Aditivni efekat“ dva jedinjenja je onaj kod koga je efekat kombinacije dva agensa zbir njihovih pojedinačnih efekata i statistički se razlikuje i od kontrola i/ili od pojedinačnih lekova.

[0091] Predmetne metode rezultiraju inhibicijom veličine tumora za više od oko 10%, za više od oko 20%, za više od oko30%, za više od oko 35%, za više od oko 42%, za više od oko 43%, za više od oko 44%, za više od oko 45%, za više od oko 46%, za više od oko 47%, za više od oko 48%, za više od oko 49%, za više od oko 50%, za više od oko 51%, za više od oko 52%, za više od oko 53%, za više od oko 54%, za više od oko 55%, za više od oko 56%, za više od oko 57%, za više od oko 58%, za više od oko 59%, za više od oko 60%, za više od oko 65%, za više od oko 70%, za više od oko 75%, za više od oko 80%, za više od oko 85%, za više od oko 90%, za više od oko 95%, or za više od oko 100%. U jednom primeru izvođenja, primena GITR vezujućeg molekula u sadejstvu sa molekulom PD-1 antagonista može da dovede do potpune regresije uznapredovalog tumora.

[0092] Takođe se razmatra i istovremena primena kombinacije GITR agonista/PD-1 antagonista sa antivirusnim terapeutima. Antivirusni lekovi uključuju bilo koji lek koji uništava viruse.

2

Antivirusi mogu da uključuju interferone koji funkcionišu da inhibiraju replikaciju virusa, inhibitore proteaze i inhibitore reverzne transkriptaze ili agense sadržane u kombinaciji visoko aktivne antiretrovirusne terapije (HAART) za HIV.

[0093] Tipični veterinarski, eksperimentalni ili istraživački subjekti uključuju majmune, pse, mačke, pacove, miševe, zečeve, zamorce, konje i ljude.

IV. Upotrebe

Kancer

[0094] GITR, PD-1 ili PD-L1 antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu da se koriste za lečenje kancera (tj., za inhibiciju rasta ili prežiVLjavanja tumorskih ćelija). Poželjni kanceri čiji rast može da se inhibira pomoću antitela prema pronalasku, uključuju kancere koji su uobičajeno responsivni na imunoterapiju, ali i kancere koji do sada nisu bili povezivani sa imunoterapijom. Neograničavajući primeri kancera koji su poželjni za lečenje uključuju melanom (npr., metastatski maligni melanom), bubrežni kancer (npr. karcinom jasnih ćelija), kancer prostate (npr. hormonski neosetljiv adenokarcinom prostate), pankreasni adenokarcinom, kancer dojke, colon kancer debelog creva, lung cancer (npr. non-small cell lung kancer), esophageal kancer, squamous cell carcinoma of the head and neck, liver kancer, ovarian kancer, cervical kancer, thyroid kancer, glioblastoma, glioma, leukemia, lymphoma, and other neoplastic malignancies. Additionally, the invention includes refractory or recurrent malignancies whose growth may be inhibited using the antibodies of the invention.

[0095] GITR agonist / PD-1 antagonističko antitelo ili antigen-vezujući fragmenti mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa: drugim antineoplastičnim agensima ili imunogenim agensima (prajmer, oslabljene kancerogene ćelije, tumorski antigeni (uključujući rekombinantne proteine, peptide i ugljene hidrate) molekuli), ćelije koje predstaVLjaju antigen, poput dendritičnih ćelija pulsiranih antigenom ili nukleinskim kiselinama izvedenih iz tumora, imuno stimulišući citokini (na prajmeru, IL-2, IFNa2, GM CSF) i ćelije transfektovane genima koji kodiraju imunostimulišuće citokine, kao što su, ali bez ograničenja do GM-CSF); standardni kancerski tretmani (prajmer, hemioterapija, radioterapija ili hirurška intervencija); ili druga antitela (uključujući, ali ne i ograničeno, antitela VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF receptore, ostale receptore faktora rasta, CD20, CD40, CTLA-4, OKS-40, 4-IBB i ICOS).

Infektivne bolesti

2

[0096] Kombinacija GITR agonista / PD-1 antagonista takođe se može koristiti za sprečavanje ili lečenje infekcija i zaraznih bolesti. Kombinacija GITR agonista / PD-1 antagonista može se koristiti samostalno, ili zajedno sa vakcinama, za podsticanje imunološkog odgovora na patogene, toksine i samoantigene. Antitela ili njihov fragment koji veže antigen mogu se koristiti za podsticanje imunološkog odgovora na viruse zarazne za ljude, kao što su, ali bez ograničenja, virusi humane imunodeficijencije, virusi hepatitisa klase A, B i C, virus Eppstein Barr, humani citomegalovirus, čovek virusi papiloma, herpes virusi. Antitela ili njihov fragment koji veže antigen mogu se koristiti za stimulisanje imunog odgovora na infekciju bakterijskim ili gljivičnim parazitima i drugim patogenima.

Adjuvansi za vakcinaciju

[0097] Kombinacija antitela protiv GITR agonista/PD-1 antagonista ili fragmenata antitela može da se koristi u sadejstvu sa drugim rekombinantnim proteinima i/ili peptidima (kao što su tumorski antigeni ili ćelije kancera) kako bi se pojačao imunski odgovor na ove proteine (tj., u protokolima za vakcinaciju).

[0098] Na primer, antitela na GITR agonist/PD-1 antagonist i njihovi fragmenti mogu da se koriste za stimulaciju antigen-specifičnih imunskih odgovora, na taj način što se kombinacija GITR agonista/PD-1 antagonista združeno primenjuje sa antigenom od interesa (npr., vakcinom). Shodno tome, u drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za pojačavanje imunskog odgovora na antigen kod subjekta, koji obuhvata primenu kod subjekta: (i) antigena; i (ii) kombinacije GITR agonista/PD-1 antagonista, tako da se imunski odgovor subjekta na antigen pojačava. Antigen može da bude, na primer, tumorski antigen, virusni antigen, bakterijski antigen ili antigen nekog patogena.

Aktivacija T ćelija ex-vivo

[0099] Antitela i fragmeti antigena prema pronalasku mogu takođe da se koriste za ex vivo aktivaciju i ekspanziju antigen-specifičnih T ćelija i za adoptivni transfer ovih ćelija u recipijente, kako bi se povećalo delovanje antigen-specifičnih T ćelija protiv tumora. Ovi postupvi mogu takođe da se koriste za aktivaciju odgovora T ćelija na infektivne agense, kao što je CMV. Može da se očekuje da ex vivo aktivacija u prisustvu kombinacije GITR agonista/PD-1 antagonista poveća učestalost i aktivnost T ćelija stečenih adoptivnim transferom.

PRIMERI

2

Primer 1

Opšti postupci

[0100] Opisani su standardni postupci u molekularnoj biologiji. Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol.217, Academic Press, San Diego, CA. Standardni postupci se takođe jaVLjaju u publikaciji Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, u kojoj su opisani kloniranje u bakterijskim ćelijama i DNK mutageneza (Vol. 1), kloniranje u ćelijama sisara i kvasca (Vol.2), ekspresija glikokonjugata i proteina (Vol.3), i bioinformatika (Vol.4).

[0101] Opisani su postupci za prečišćavanje proteina, uključujući imunoprecipitaciju, hromatografiju, elektroforezu, centrifugiranje i kristalizaciju. Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol.1, John Wiley and Sons, Inc., New York. Opisani su hemijska analiza, hemijska modifikacija, post-translaciona modifikacija, proizvodnja fuzionih proteina, glikozilacija proteina. Videti, npr., Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5 16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 4589; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp.384-391. Opisani su proizvodnja, prečišćavanje i fragmentacija poliklonskih i monoklonskih antitela. Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, supra. Dostupne su standardne tehnike za karakterizaciju interakcija ligand/receptor. Videti, npr., Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol.4, John Wiley, Inc., New York.

[0102] Moguća je priprema monoklonskih, poliklonskih i humanizovanih antitela (videti, npr., Sheperd i Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann i Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia, et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol.224:487-499; U.S. Pat. No.6,329,511).

[0103] Alternativa humanizaciji je upotreba biblioteka humanih antitela prikazanih na fagima ili biblioteka humanih antitela u transgenim miševima (Vaughan, et al. (1996) Nature Biotechnol.

14:309 314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146 156; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas, et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay, et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin, et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399).

[0104] Prečišćavanje antigena nije neophodno za generisanje antitela. Životinje mogu da se imunizuju ćelijama koje nose antigen od interesa. Splenociti zatim mogu da se izoluju iz imunizovanih životinja, i mogu da se fuzionišu sa ćelijskom linijom mijeloma kako bi dali hibridom (videti, npr., Meyaard, et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright, et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston, et al., supra; Kaithamana, et al. (1999) J. Immunol. 163:5157 5164).

[0105] Antitela mogu da se konjuguju sa, npr., lekovima čiji su molekuli mali, enzimima, lipozomima, polietilen glikolom (PEG). Antitela su korisna za terapeutske i dijagnostičke svrhe i za kitove, i uključuju antitela kuplovana sa, npr., bojama, radioizotopima, enzimima ili metalima, npr., koloidnim zlatom (videti, npr., Le Doussal, et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini, et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing i Bishop (1999) J. Immunol.

162:2804-2811; Everts, et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889).

[0106] Dostupni su postupci za protočnu citometriju, uključujući detekcione sisteme za sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS®). Videti, npr., Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ. Dostupni su fluorescentni reagensi pogodni za modifikaciju nukleinskih kiselina, uključujući nukleinsko-kiselinske prajmere i probe, polipeptide i antitela, koja su predviđena za upotrebu kao, npr., dijanostički reagensi. Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO.

[0107] Opisani su standardni postupci za histologiju imunskog sistema. Videti, npr., Muller--Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, i Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY.

1

[0108] Dostupni su softverski paketi i baze podataka za određivanje, npr., antigenih fragmenata, liderskih sekvenci, savijanja proteina, funkcionalnih domena, mesta za glikozilaciju, i poravnavanje sekvenci. Videti, npr., GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690.

Primer 2

Postupci za tretman in vivo

[0109] Ženke C57Bl/6J ili BALB/c/AnN miševa, stare približno osam do deset nedelja, dobijene su od kompanije Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine ili Sacramento, California) ili Taconic Laboratory (Oxnard, California), redom. Konvencionalana hrana i voda bile su obezbeđene za životinje ad libitum. Sve protokole u kojima se koriste životinje odobrila je kompanije Merck & Co., Inc. i Komitet za upotrebu i negu životinja laboratorije Merck Research Labs (MRL) Palo Alto.

[0110] Pre tretmana, miševima je izmerena težina i izmereni su pojedinačni tumori iz miševa. Kako bi bila sprečena neobjektivnost, sve životinje sa odstupanjima telesne težine ili zapremine tumora, uklonjene su, a preostali miševi su nasumično raspoređeni u grupe sa ekvivalentnom veličinom tumora, predviđene za različite tretmane.

[0111] Materijali za testove i izotipske kontrole dobijeni su u vidu zamrznutih (-80°C) stokova od MRL Palo Alto Protein Sciences departmana. Formulacije pufera su bile specifične za svako antitelo, sa ciljem da se proteini stabilizuju ida se spreči precipitacija, a detalji su dati u tekstu koji sledi:

[0112] Formulacije/razblaživači dobijeni su od MRL Palo Alto Protein Sciences departmana u obliku u kome se čuvaju na 4°C. Izotipska kontrola mIgG2a i formulacija/razblaživač za anti-PD-1 sa 20mM Na acetata, 7% saharoze, na pH5.5, formulacija/razblaživač za mIgG1 sa 75mM NaCl, 10mM fosfata, 3% saharoze, na pH7.3, i formulacija/razblaživač za mDTA-1 (antimGITR) sa 20mM Na acetata, 7% saharoze, 0.02% Tween80 sa niskim sadržajem peroksida, na pH5.5 korišćeni su za stabilizaciju proteina i sprečavanje precipitacije.

Primer 3

2

Priprema i implantacija tumorske ćelijske linije

[0113] MC38 ili CT26 ćelije karcinoma debelog creva gajene su u RPMI medijumu suplementiranom sa 10% toplotom inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma. 1 x 1 MB49 ćelije karcinoma bešike gajene su u medijumu Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementiranom sa 10% fetalnog goveđeg seruma i sa 1% GlutaMAX™. 1 x 10<6>ćelija MC38, 3 x 105 ćelija CT26, ili 0.5X10<6>ćelija MB49 linije, injecirano je potkožno SC u zapremini od 100 mL fosfatom puferovanog fiziološkog rastvora u oblast sa leve strane stomaka ili u desni bok svakog miša. Miševi su obično najpre obrijani elektronskim makazama u oblasti tela u koju je vršena implantacija.

Primer 4

Merenja tumora i telesne težine

[0114] Tumori su mereni dan pre davanja prve doze i dva puta nedeljno nakon toga. Dužina i širina tumora su merene pomoću elektronskog kalipera i zapremina tumora je određivana upotrebom formule Zapremina (mm3) = 0.5 x Dužina x Širina<2>gde je dužina bila duža dimenzija.

[0115] Miševi su mereni periodično, kako bi se pratilo njihovo opšte zdravstveno stanje ali takođe i da bi se procenila stvarna isporuka doze u mg/kg po mišu kada je to bilo potrebno.

Primer 5

Priprema rastvora za doziranje, primena i analize

[0116] Smrznute zalihe su odmrznute i prenete na mokri led. Da bi se izbeglo ponoVLjeno otapanje zamrzavanjem, svaka bočica sa osnovnim sastojcima jednom se odmrzava i prave alikvoti u količinama dovoljnim za jednokratnu upotrebu. U tu svrhu korišćene su polipropilenske cevi sa niskim prijanjanjem. Alikvoti su brzo zamrznuti u suvom ledu i čuvani na 80 ° C. Pre svakog doziranja, jedan alikvot je otopljen i razblažen do nominalne koncentracije u odgovarajućem razblaživaču i odmah doziran. Alikvoti rastvora za doziranje su brzo zamrznuti u suvom ledu i čuvani na -80 ° C do analiza. Rešenja za doziranje procenjena su pomoću platforme Meso Scale Discoveri (MSD®, Rockville, MD) koja se zasniva na tehnologiji višestrukih nizova; kombinacija elektrohemiluminiscencije i nizovi sa uzorcima.

[0117] Doziranje ispitivanih materijala otpočinjalo je nakon što MC38 i CT26 tumori dostignu prosečnu veličinu od približno 300 mm<3>i 220 mm<3>, redom, obično oko dve nedelje nakon implantacije. Doziranje ispitivanih materijala otpočinjalo je nakon što timori MB49 dostignu prosečnu veličinu od približno 105 mm<3>, nedelju dana nakon implantacije. Ispitane su varijacije u učestalosti doziranja (u opsegu od pojedinačne doze pa do 6 doza nedeljno) pri koncentraciji doziranja od 5 mg/kg, a detalji ispitivanja su dati u tekstu koji sledi.

Primer 6

Murinizacija DTA-1 antitela

[0118] DTA-1 GITR antitelo protiv pacova (S. Sakaguchi, Univerzitet Kjoto, Kjoto, Japan), murinizovano je na sledeći način. Sekvenca antitela pacova DTA-1 je određena za promenljive teške (VH) i promenljive lake (VL) domene. Sekvenca DTA-1 VHpacova upoređena je sa sekvencama VHzakletnih linija miša iz baze podataka Immunogenetics IMGT Database (www.imgt.org) (Lefranc, M.-P. et al. (1999) Nuc. Acids Res.27:209-212). DTA-1 VHsekvenca je poravnata sa sekvencom mišićnih VHklica i ocenjena slično kao u prethodnom sistemu humanizacije (videti, npr. VO 2005/047326). Pacov DTA-1 VHbio je najsličniji mišjim zamecima IGVH5-4, IGVH5-6 i IGVH5-9. CDR ostaci su preneti sa pacova DTA-1 VHna mišju zarodnu liniju IGVH5-4; dva ostatka okvira IGVH5-4 su izmenjena u one koji odgovaraju IGVH5-6 i mišji J region IGHJ-4 (IMGT) je korišćen za povezivanje sa mišjim IgG1 i mišjim IgG2a Fc regionima.

[0119] Sekvenca DTA-1 VL(lambda) pacova je poravnata sa sekvencom VLmiša (lambda) iz GenBank: AAH02129.1. CDR ostaci su preneti sa pacova DTA-1 VL(lambda) na mišiju AAH02129 sekvencu okvira. Sedam ostataka okvira na murinizovanom DTA1 izmenjeno je na osnovu računarskih grafičkih modela pacova i murinizovanih VLdomena. Murinizovani DTA-1 VL(lambda) domen je stopljen sa lakim konstantnim domenom miša.

[0120] Za sva tri konstrukta (jedan VHi dva VL(lambda)) sintetisani su geni optimizovani za kodon i inserirani su u ekspresione vektore. Antitela su eksprimirana privremenom ekspresijom u HEK293 ćelijama i prečišćena pomoću protein-A hromatografije.

Primer 7

Rezultati anti-GITR/anti-PD-1 tretmana

[0121] C57BL/6J miševi sa uznapredovalim MC38 tumorima tretirani su sa jednom ili dve injekcije nedeljno murinizovanog anti-mGITR (Merck Research Labs, Palo Alto, CA) antitela, subkutano (SC), i murinizovanog anti-mPD-1 (Merck Research Labs, Palo Alto, CA) antitela, intraperitonealno (IP), u dozama od po 5 mg/kg. Tretman je otpočinjao kada bi veličine tumora

4

dostigle 240-360 mm3. Tumori su mereni dva puta nedeljno. Potpuna regresija (CR) tumora služila je kao očitavanje za antitumorsku efikasnost. Kombinovano doziranje je dovelo do robustne, sinergističke efikasnosti, sa 100% CR nakon dve nedeljne kombinovane doze. Ograničavanje režima na jednu dozu svakog od antitela (Ab.) smanjilo je CR na 70%, slično situciji koja je postignuta sa kombinacijom anti-mGITR koje je praćeno sa četiri nedeljne primene anti-mPD-1 koje su otpočele nedelju dana kasnije. Ubacivanje intervala od dve nedelje između primene anti-mGITR i anti-mPD-1 nije bilo u istoj meri efikasno. Sa monoterapijom od najviše do šest tretmana jednom nedeljno sa anti-mGITR ili 2-4 tretmana jednom nedeljno sa anti-mPD-1 Ab (videti Slike 1A-1K), uočeno je 20-30% CR.

[0122] C57BL/6J miševi sa uznapredovalim MC38 tumorima tretirani su sa anti-mGITR (SC) i anti-mPD-1 (IP), svaki u dozi od po 5 mg/kg. Tretman je otpočinjao kada bi veličina tumora dostigla 200-350 mm3. Tumori su mereni dvaput nedeljno. Potpuna regresija (CR) tumora služila je kao očitavanje za anti-tumorsku efikasnost. Kombinovano doziranje je dovelo do robustne, sinergističke efikasnosti, sa 100% CR nakon dve nedeljne kombinovane doze. Ovo je uporedivo sa rezultatima čiji su detalji dati u tekstu koji sledi. Međutim, smanjena CR od 60% uočena je kada su antitela isporučivana zasebno, u intervalu od nedelju dana. Dve nedeljne doze monoterapije sa anti-mGITR ili sa anti-mPD-1 inhibirale su rast tumor ali nisu dovele do CR (videti Slike 2A-2F).

[0123] BALB/cAnN miševi sa uznapredovalim CT26 tumorima tretirani su sa anti-mGITR (SC) i anti-mPD-1 (IP), svaki u dozi od po 5 mg/kg. Tretman je otpočinjao kada je prosečna veličina tumora iznosila 220 mm3 (180 - 260 mm3). Tumori su mereni dvaput nedeljno. Potpuna regresija (CR) tumora služila je kao očitavanje za anti-tumorsku efikasnost. Jednokratno doziranje kombinacije dovelo je do robustne sinergističke efikasnosti sa 70% CR. Antitumorska efikasnost sa bilo kojim antitelom pojedinačno isporučenim u vidu monoterapije iznosila 0-10% CR (videti Slike 3A-3D).

[0124] C57BL/6J miševi sa uznapredovalim MB49 tumorima tretirani su samo jednom dozom anti-GITR (SC) i anti-PD-1 (IP) u koncentraciji od 5mg/kg i 10mg/kg, redom. Tumori su mereni dvaput nedeljno. Potpuna regresija (CR) tumora služila je kao očitavanje za anti-tumorsku efikasnost. Kombinovani tretman sa anti-GITR i anti-PD-1 doveo je do poboljšane efikasnosti od 40% CR. U grupama koje su tretirane samo jednim agensom nije zabelezena CR (videti Slike 4A-4D).

Primer 8

Efekat kombinacije anti-PD-1 i anti-GITR na odnos regulatornih T ćelija i CD8 ćelija

A. Metode

1. Reakcija mešanih limfocita u kulturi

[0125] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz leukocitnih slojeva centrifugiranjem sa gradijentom gustine uz upotrebu reagensa Ficoll Paque Plus, na 1200 × g tokom 20 minuta. Mononuklearne ćelije periferne krvi su sakupljene iz graničnog sloja medijum:plazma i isprane 2 puta fosfatom puferovanim Dulbeccovim fiziološkim rastvorom (DPBS). Preostala crvena krvna zrnca (RBC) su lizirana pomoću rastvora za liziranje RBC sa amonijakom-hloridom-kalijumom (rastvor za liziranje RBC).

[0126] Dendritske ćelije (DC) su generisane od CD14 monocita upotrebom sledeće procedure. Monociti su prvo izolovani iz leukocitnih slojeva pomoću koktela za obogaćivanje ljudskih monocita RosetteSep i Ficoll-Paque Plus centrifugiranjem sa gradijentom gustine uz upotrebu reagensa Ficoll-Paque Plus, na 1200 × g tokom 20 minuta. Monociti su uklonjeni iz interfejsa medijum: plazma i isprani 2 puta sa DPBS. Preostali eritrociti su lizirani pomoću rastvora za liziranje eritrocita. Obogaćeni monociti su kultivisani u modifikovanom medijumu Eagle Dulbecco-a, dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), 1.000 U / mL granulocitmakrofagnog faktora stimulacije kolonije. Na dan 6, u kulturu je dodato 0.5mg/mL lipopolisaharida; ćelije su posle toga gajene još 2 dana.

[0127] Kulture za reakciju mešanih limfocita su postaVLjene u pločama sa 24 bunara. Mononuklearne ćelije periferne krvi (2 × 10<6>/mL) gajene su sa γ-ozračenim (30 Gy) alogenim DC (0.2×106/mL) u prisustvu 100 U/mL IL-2; 5 ng/mL IL-15; anti-hGITR antitela (MK 4166), anti-hPD-1 antitela (MK-3475), kombinacije MK-3475 i MK-4166 ili mAb za izotipsku kontrolu (anti-RSV). Broj regulatornih T ćelija (Treg ćelija) u MLR kulturama je ocenjivan na dan 7, pomoću protočne citometrije.

2. Detekcija T reg ćelija u kulturama reakcije mešanih limfocita pomoću protočne citometrije

[0128] U cilju detekcije Treg ćelija (CD3+ CD4+ CD25+ FoxP3+) i CD8<+>T ćelija, 1 do 2×10<6>ćelija iz MLR kultura, inkubirano je sa anti-CD3, anti-CD4, anti-CD25 i anti-CD8 u 50 mL pufera za bojenje proizvođača BD Pharmingen. Mrtve ćelije su isključene bojenjem pomoću Fixable Viability Dye eFluor 506. Nakon površinskog boljenja pomoću anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 i anti-CD25 mAb, obaVLjeno je bojenje unutarćelijskog FoxP3 pomoću kita za fiksiranje i permeabilizaciju FoxP3 Fixation/Permeabilization kit, u skladu sa uputstvima proizvođača (eBioscience). Snimanje uzoraka je izvedeno na LSR II protočnom citometru i podaci su analizirani pomoću softvera FlowJo, verzija 10.0.6 (Tree Star, Inc.). Treg ćelije su identifikovane fokusiranjem na CD3+ CD4+ ćelije, a zatim na CD25+ FoxP3+ ćelije.

3. Test supresije regulatornih T-ćelija

[0129] CD4 T ćelije su izolovane iz leukocitnog sloja pomoću RosetteSep kita za obogaćivanje ljudskih CD4+ T ćelija i centrifugiranjem sa gradijentom gustine uz upotrebu reagensa Ficoll Paque Plus na 1200 × g tokom 20 minuta. CD4 T ćelije su sakupljene iz graničnog sloja medijum:plazma i isprane 2 puta sa DPBS. Preostali eritrociti su lizirani pomoću rastvora za liziranje eritrocita. CD4 CD25 Tregs i CD4 CD25-efektorske T ćelije (Teffs) su odvojene upotrebom humanog CD25 konjugovanog mikro zrna II zrna u skladu sa uputstvima proizvođača (Miltenii Biotec). Čistoća CD4 CD25 CD127- tregova bila je približno 40% do 70%. Ljudski DC su generisani kako je gore opisano.

[0130] Za testove supresije T-ćelija, ukupno 1 3 105 T ćelija (Tregs i Teffs) i 2 3 104 ozračenih (30 Gi) DC po bunarusu kultivisane u pločama sa 96 bunara sa okruglim dnom tokom 7 dana u prisustvu MK-4166, MK-3475, kombinacija MK-3475 i MK-4166 ili izotipski mAb (anti-RSV). CD4 CD25- Teffs i CD4 CD25 Tregs su pomešani u omjeru 4: 1. 6. dana, timidin obeležen triticijumom je dodat u kulture tokom 20 sati. Posle inkubacije sa tritijumom obeleženim timidinom, ćelije su sakupljene, lizirane vodom i analizirane pomoću brojača Per (PerkinElmer, brojač mikrotabli 2450). Nivo proliferacije T-ćelija odražavao se nivoom ugrađenog timidina obeleženog tricijumom. Svi testovi su izvedeni u tri primerka. Humane DC su generisane kao što je prethodno opisano.

[0130] For the T-cell suppression assays, a total 13 105 T cells

irradiated (30 Gy) DCs per well were cultured in 96-well round-bottom plates for 7 days in the presence of MK-4166, MK-3475, combination of MK-3475 and MK-4166 or isotype control mAb (anti-RSV). CD4+ CD25- Teffs and CD4+ CD25+ Tregs were mixed at 4:1 ratio. On Day 6, tritium-labeled thymidine was added to the cultures for 20 hours. Following incubation with tritiumlabeled thymidine, the cells were harvested, lysed using water, and analyzed using a nter (PerkinElmer, 2450 microplate counter). The level of T-cell proliferation was reflected by the levels of incorporated tritium-labeled thymidine. All assays were conducted in triplicates.

B. Rezultati

[0131] Sposobnost anti-mišijeg GITR agonist-antitela mAb DTA-1 da menja stabilnost i intratumorsku akumulaciju Treg ćelija od suštinskog je značaja za mehanizam delovanja DTA-1 (videti, npr., Cohen et al (2010) PLoS One 5(e10436): 1-12; i Schaer et al. (2013) Cancer Immunol. Res. 1:320-331). Sposobnost MK-4166, samog ili u kombinaciji sa MK 3475 da utiče na indukovanje humanih Treg ćelija i njihova supresivna aktivnost, ispitani su pomoću humanih in vitro testova.

[0132] Indukovanje Tregs u MLR je dobro dokumentovano (videti, npr. Levitsky et al (2013) Transplantation 96:689-696). MLR je dakle upotrebljena da bi se povećao broj ljudskih Treg ćelija koje se prirodno jaVLjaju u krvi i da bi se ocenio efekat MK-4166, kada je samo ili u kombinaciji sa MK-3475 na ljudske Treg ćelije i odnos CD8:Treg. Kada je u kulture MLR dodato 10 mg/mL MK 4166 došlo je do smanjenja broja CD4+ CD25+ FoxP3+ Treg ćelija nakon 7 dana (Slika 5A). Samo MK 3475 nije imao efekta na broj Treg ćelija. Međutim, kombinacija MK-3475 i MK-4166 imala je najizraženiji efekat na broj Treg ćelija i odnos CD8:Treg (Slika 5B).

[0133] Da bi se procenio efekat MK-4166 na supresivnu aktivnost humanih Treg ćelija, ustanoVLjen je test supresije Treg ćelija. U ovom testu, nivo proliferacije T-ćelija se odražava nivoima inkorporisanog timidina obeleženog tricijumom. Dozno-zavisno povećanje proliferacije T ćelija uočeno je kada je MK-4166 kombinovano sa MK-3475 (slika 6). Ovi rezultati obezbeđuju dokaz da inkubacija sa MK-4166 i MK3475 smanjuje broj MLR-indukovanih Treg ćelija, povećava odnos CD8:Treg i smanjuje supresivnu funkciju ljudskih Treg ćelija in vitro.

Table 2 obezbeđuje kratak opis sekvenci iz listinga sekvenci

4

4

4

4

4

4

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Kombinacija PD-1 antagonista, koji je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, i koji se vezuje za PD-1, i GITR agonista, koji je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, i koji se vezuje za GITR, za upotrebu u postupku lečenja tumora kod pacijenta, naznačena time što se PD-1 antagonist i GITR agonist primenjuju istovremeno ili jedan za drugim.

2. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što

a. PD-1 antagonist je MK3475; i

b. GITR agonist je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se vezuje za GITR koji sadrži varijabilni region imunoglobulinskog lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 82

i

varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 81.

3. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 2 naznačena time što je GITR agonist antitelo.

4. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačena time što je GITR agonist antitelo humanizovano.

5. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što je PD-1 antagonist MK-3475.

6. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačena time što je GITR agonist anitelo koje sadrži:

varijabilni domen imunoglobulinskog lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 82, pri čemu, amino kiselina 31 je Q i amino kiselina 57 je Q, i varijabilni domen imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja je amino kiselinska sekvenca izložena u SEQ ID NO:81.

7. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što se PD-1 antagonist i GITR agonist primenjuju istovremeno ili jedan za drugim najmanje jedanput.

8. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što se PD-1 antagonist i GITR agonist primenjuju istovremeno ili jedan za drugim najmanje 2 puta.

9. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što tumor predstaVLja tumor u uznapredovalom stadijumu.

10. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, naznačena time što tumor u uznapredovalom stadijumu može da se odabere iz grupe koja se sastoji od kancera skvamoznih ćelija, sitnoćelijskog kancera pluća, nesitnoćelijskog kancera pluća, gastrointestinalnog kancera, kancera pankreasa, glioblastoma, glioma, cervikalnog kancera, kancera jajnika, kancera jetre, hepatičnog karcinoma, hepatoma, kancera bešike, kancera dojke, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, endometrijalnog karcinoma, mijeloma, multiplog mijeloma, karcinoma pljuvačnih žlezda, kancera bubrega, karcinoma bubrežnih ćelija, Vilmsovih tumora, karcinoma bazalnih ćelija, melanoma, kancera prostate, kancera vulve, kancera štitne žlezde, kancera testisa i kancera jednjaka.

11. Bispecifično antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu u lečenju tumora kod pacijenta, koji sadrži prvu ruku koja se vezuje za PD-1 ili PD-L1 i deluje kao antagonist PD-1 aktivnosti, a koja predstaVLja antigen-vezujući fragment MK-3475, i drugu ruku koja se vezuje za GITR i deluje kao agonist GITR aktivnosti, a koja predstaVLja antigen-vezujući fragment koji sadrži varijabilni region imunoglobulinskog lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 82 i varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 81.

12. Bispecifično antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, naznačeno time što druga ruka ima:

a) varijabilni domen imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 81; i

b) varijabilni domen imunoglobulinskog lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 82, pri čemu, amino kiselina 31 je Q i amino kiselina 57 je Q.

13. Bispecifično antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, naznačeno time što tumor predstaVLja tumor u uznapredovalom stadijumu.

14. Bispecifično antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, naznačeno time što je tumor u uznapredovalom stadijumu odabran iz grupe koja se sastoji od kancera skvamoznih ćelija, sitnoćelijskog kancera pluća, nesitnoćelijskog kancera pluća, gastrointestinalnog kancera, kancera pankreasa, glioblastoma, glioma, cervikalnog

1

kancera, kancera jajnika, kancera jetre, hepatičnog karcinoma, hepatoma, kancera bešike, kancera dojke, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, endometrijalnog karcinoma, mijeloma, multiplog mijeloma, karcinoma pljuvačnih žlezda, kancera bubrega, karcinoma bubrežnih ćelija, Vilmsovih tumora, karcinoma bazalnih ćelija, melanoma, kancera prostate, kancera vulve, kancera štitne žlezde, kancera testisa i kancera jednjaka.

15. Farmaceutska kombinacija koja sadrži PD-1 antagonist i GITR agonist, naznačena time što:

a) PD-1 antagonist je MK-3475, i

b) GITR agonist je antitelo koje sadrži:

imunoglobulinski laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 82; i

imunoglobulinski teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 81.

16. Farmaceutska kombinacija prema patentnom zahtevu 15 naznačena time što imunoglobulinski laki lanac sadrži amino kiselinsku sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 82, pri čemu, amino kiselina 31 je Q i amino kiselina 57 je Q.

17. Kombinacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 naznačena time što je PD-1 antagonist BMS-936558.

2