RS54786B1 - Nova jedinjenja koja moduliraju fxr (nr1h4) - Google Patents

Abstract

Jedinjenje prema sledećoj formuli (1), njegov enantiomer, diastereomer, tautomer ili farmaceutski prihvatljiva sou komeR je izabran iz grupe koja se sastoji od COOR6, CONR7R8, tetrazolil, SO2NR7R8, C1-6 alkil, SO2-C1-6 alkil i H, pri čemu je R6 nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od H ili C1-6 alkil, i R7 i R8 međusobno nezavisno su izabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-6 alkil, halo-C1-6 alkil, C1-6 alkilen-R9, SO2-C1-6 , alkil, gde je R9 izabran iz grupe koja se sastoji od COOH, OH i SO3H;A je izabran iz grupe koja se sastoji od: fenil, piridil, pirimidil, pirazolil, indolil, tienil, benzotienil, indazolil, benzizoksazolil, benzofuranil, benzotriazolil, furanil, benzotiazolil, tiazolil, oksadiazolil, svaki izborno supstituisan sa jednom ili dve grupe nezavisno izabrane iz grupe koja se sastoji od OH, O-C1-6 alkil, O-halo-C1-6 alkil, alkil, halo-C1-6 alkil, C3-6 cikloalkil i halogen;Q je izabran iz grupe koja se sastoji od fenil, piridil, tiazolil, tiofenil, pirimidil, svaka izborno supstituisana sa jednom ili dvegrupe nezavisno izabrane iz grupe koja se sastoji od C1-6 alkil, halo-C1-6 alkil, halogen i CF3;Y je izabran od N ili CH;Z je izabran odu komeX = CH, N, NO;R1 je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-3 alkil, C3-6 cikloalkil, C4-5 alkilcikloalkil, gde je C1-3 alkil izbomo supstituisan sa 1 do 3 supstituenta nezavisno izabrana od halogena, hidroksi ili C1-6alkoksi;R2 i R3 su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C1-3 alkil, C1-3 haloalkil, C1-3 alkoksi, C1-3 haloalkoksi i halogen.Prijava sadrži još 16 patentnih zahteva.

Description

[0001JPredstavljeni pronalazak se odnosi na jedinjenja koja se vezuju za NR1H4 receptor (FXR) i deluju kao agonisti ili modulatori FXR. Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu jedinjenja za lečenje i/ili profilaksu bolesti i/ili stanja preko vezivanja navedenog jedarnog receptora navedenim jedinjenjima.

[0002]Višećelijski organizmi su zavisni od naprednih mehanizama za prenos informacija između ćelija i delova tela. Informacija koja se prenosi može biti visoko složena i može imati za rezultat promenu genetičkih programa uključenih u ćelijsku diferencijaciju, proliferaciju ili reprodukciju. Signali ili hormoni, su često molekuli niske molekulske težine, kao što su peptidi, derivati masnih kiselina ili holesterola. [0003|Mnogi od ovih signala proizvode svoje efekte konačnom promenom transkripcije specifičnih gena. Jedna dobro ispitana grupa proteina koji posreduju u ćelijskim odgovorima na različite signale je familija transkripcionih faktora poznatih kao jedarni receptori, u daljem tekstu često označeni kao "NR". Članovi ove grupe obuhvataju receptore za steroidne hormone, vitamin D, ekdizon, cis i trans retinoinsku kiselinu, tiroidni hormon, žučne kiseline, derivate holesterola, masne kiseline (i druge peroksizomalne proliferatore), kao i takozvane orfan receptore, proteine koji su strukturno slični drugim članovima ove grupe, ali za koje nisu poznati ligandi. Orfan receptori mogu biti indikativni za nepoznate puteve prenosa signala u ćeliji ili mogu biti jedami receptori koji funkcionišu bez aktivacije Uganda. Aktivacija transkripcije pomoću nekih od ovih orfan receptora može da se javi u odsustvu egzogenog liganda i/ili preko puteva prenosa signala koji potiču sa ćclijske površine (D. J. Mangelsdorf et al., Cell 1995, 83, 835; R. M. Evans, Mol. Endocrinol. 2005, 19, 1429).

[0004]Uopšteno, tri funkcionalna domena su identifikovana u NRs. Veruje se da amino terminalni domen ima izvesnu regulatornu funkciju. Nakon njega sledi DNK-vezujući domen koji je u daljem tekstu označen kao "DBD" koji obično sadrži dva cinkova prsta i prepoznaje specifičan element hormonalnog odgovora u daljem tekstu označen kao "HRE" unutar promotora responsivnih gena. Pokazano je da specifični aminokiselinski ostaci u "DBD" daju specifičnost vezivanja za DNK sekvencu (M. Schena and K. R. Yamamoto, Science 1988, 241, 965). Ligand-vezujući-domen u daljem tekstu označen kao "LBD" je karboksi-terminalni region poznatih NRs.10005|U odsustvu hormona, izgleda da LBD ometa interakciju DBD sa njegovim HRE. Vezivanje hormona izgleda da ima za rezultat konformacionu promenu u NR i na taj način eliminiše ovo ometanje (A. M. Brzozowski et al., Nature 1997. 389. 753). NR bez LBD konstitutivno aktivira tranksripciju, ali na niskom nivou.[0006|Koaktivatori ili transkripcioni aktivatori su predloženi za premošćavanje između transkripcionih faktora specifičnih za sekvencu, osnovne transkripcionc mašinerije i pored toga za delovanje na strukturu hromatina ciljne ćelije. Nekoliko proteina kao što su SRC-1. ACTR i Gripi interaguju sa NRs pri čemu je interakcija poboljšana vezivanjem Uganda (D. M. Heery et al.. Nature 1997, 387, 733; T. Heinzel et al.. Nature 1997, 387, 43; K. W. Netties i G. L. Greene, Annu. Rev. Physiol. 2005, 67, 309). |0007| Modulatori jedarnih receptora kao što su steroidni hormoni utiču na rast i funkciju specifičnih ćelija vezivanjem za unutarćelijske receptore i formiranjem kompleksa jedarni receptor-ligand. Kompleksi jedarnog receptora-hormona zatim interaguju sa HRE u kontrolnom regionu specifičnih gena i menjaju ekspresiju specifičnih gena (A. Aranda and A. Pascual, Phvsiol. Rev. 2001, 81, 1269).[0008|Farnezoidni X-receptor alfa (u daljem tekstulakođe označen kao NR1H4 kada se odnosi na humani receptor) je prototipski jedarni receptor tipa 2 koji aktivira gene posle vezivanja za promotorski region ciljnih gena na heterodimeran način sa retinoidnim X-receptorom (B. M. Forman et al., Cell 1995, 81, 687). Relevantni fiziološki Ugandi NR1H4 su žučne kiseline (D. J. Parks et al., Science 1999, 284, 1365; M. Makishima et al., Science 1999, 284, 1362). Najpotentniji je henodeoksiholinska kiselina (CDCA). koja reguliše ekspresiju nekoliko gena koji učestvuju u homeostazi žučne kiseline. Farnezol i derivati, zajedno označeni kao farnezoidi, su originalno opisani tako da aktiviraju ortolog pacova u visokoj koncentraciji, ali da ne aktiviraju humani ili mišji receptor. FXR je eksprimiran u jetri, u ćelom gastrointestinalnom traktu uključujući jednjak, želudac, duodenum, tanko crevo, debelo crevo, jajnik, adrenalnu žlezdu i bubreg. Pored kontrole unutarćelijske genske ekspresije, izgleda da je FXR tak ode uključen u parakrini i endokrini prenos signala putem ushodne regulacije ekspresije citokina faktora rasta fibroblasta 15 (glodari) ili 19 (majmuni, ljudi, J. A. Holt et al., Genes Dev. 2003, 17, 1581; T. Inagaki et al., Cell Metab. 2005, 2, 217).

[0009]Jedinjenja mali molekuli koji dcluju kao modulatori FXR opisani su u sledećim publikacijama: WO 2000/037077, WO 2003/015771, WO 2004/048349, WO 2007/076260, WO 2007/092751, WO 2007/140174. WO 2007/140183, WO 2008/051942, VVO 2008/157270, WO 2009/005998, WO 2009/012125, WO 2008/025539 i VVO 2008/025540. Dodatni mali molekuli modulatori FXR su nedavno prikazani (M. L. Crawley, Expert Opin Ther. Pat. 2010, 20,1047; D. Merk et al., Future Med. Chem. 2012. 4, 1015).

[0010|U VVO 2011/020615 opisali smo hiralna ciklopropiliden jedinjenja sledeće opšte formule

gde su promenijive definisane slično kao u prijavi.

100111Problem koji je u osnovi predstavljenog pronalaska je generisanje agonista FXR sa poboljšanim fizičkohemijskim svojstvima generalno, i smanjenom hidrofobnošću, poboljšanom rastvorljivosću u vodi i boljom permeabilnošću membrane, naročito, u poređenju sajedinjenjima za koja je tražena zaštita u VVO 2011/020615.

[0012|Navedeni problem je rešen jedinjenjem prema sledećoj formuli (1). njegovim enantiomerom, diastereomerom, tautomerom ili farmaceutski prihvatljivom soli

u kojima

R je izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih: COORx, CONR7Rs, tetrazolil, SO2NR7RK, C|.f, alkil, SOi-Ci.f, alkil i H, pri čemu je R(, nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od H ili C|_6alkil, i R7i R({ međusobno nezavisno su izabrani iz grupe koja se sastoji od H, C]_6alkil, halo-C6 alkil, Cf, alkilen-Ro, S02-CM, alkil,

gde je R9izabran iz grupe koja se sastoji od COOH, OH i SO3H;

A je izabran iz grupe koja se sastoji od sledećih: fenil, piridil, pirimidil, pirazolil, indolil, tienil, benzotienil, indazolil, benzizoksazolil, benzofuranil, benzotriazolil, furanil, benzotiazolil, tiazolil, oksadiazolil, svaki izborno supstituisan sa jednom ili dve grupe nezavisno izabrane iz grupe koja se sastoji od sledećih: OH, 0-Ci.(, alkil, 0-halo-C|-(,alkil, Ci_6alkil, halo-Ci.6alkil, C3.6cikloalkil i halogen;

Q je izabran iz grupe koja se sastoji od: fenil, piridil, tiazolil, thiofenil, pirimidil, svaki izborno supstituisan sa jednom ili dve grupe nezavisno izabrane iz grupe koja se sastoji od: Cj-6alkil, halo-C[-(, alkil, halogen i CF3;

Y je izabran od N ili CH;

Z je izabran od

u kojima

X = CH, N, NO;

Ri je izabran iz grupe koja sc sastoji od vodom ka, C|.j alkil, C,v(, cikloalkil, C4_<; alkilcikloalkil, gde je C|_^ alkil izborno supstituisan sa 1 do 3 supstituenta nezavisno izabrana od halogena, hidroksi ili C|.& alkoksi;

Rti R3su nezavisno izabrani iz grupe koja sc sastoji od vodonika. Ci a alkil. C1-3haloalkil, Ci^alkoksi, C 1.3 haloalkoksi i halogena.

[0013| U sledećem primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo koji od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, R-A ujedinjenju prema formuli (1) je izabran od

[0014]U sledećem primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, Q ujedinjenju prema formuli (1) je 10015]U sledećem primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, Z ujedinjenju prema formuli (1) je

[0016]U sledećem primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, jedinjenje prema formuli (1) je izabrano od

10017]U sledećem primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, jedinjenje prema formuli (1) je

gde je R izabran iz grupe koja se sastoji od COiH, CONHSOiMe i tetrazolila.

[0018] U sledećem primeru izvođenja, predstavljeni pronalazak je usmeren na jedinjenje prema formuli (1) za upotrebu kao lek.

[0019] U sledećem primeru izvođenja, predstavljeni pronalazak je usmeren na jedinjenje prema formuli (1) za upotrebu u profilaksi i/ili lečenju bolesti posredovanih preko FXR. |0020| U sledećem primeru izvođenja, predstavljeni pronalazak je usmeren na upotrebu jedinjenja prema formuli (1) za pripremu leka za profilaksu i/ili iečenje bolesti posredovanih preko FXR.

[0021] U sledećem primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, bolest je izabrana od hroničnih intrahepatičnih ili izvesnih oblika ekstrahepatičnih holestatičkih stanja; fibroze jetre; opstruktivnih ili hroničnih inflamatornih poremećaja jetre; ciroze jetre; steatoze jetre i povezanih sindroma, holestatičkih ili tibrotičkih efekata koji su povezani sa cirozom koja je indukovana alkoholom ili sa virusnim oblicima hepatititsa; insuficijencije jetre ili ishemije jetre posle velike resekcije jetre; steatohepatitisa povezanog sa hemoterapijom (CASH); akutne insuficijencije jetre; i/ili inflamatornih bolesti creva. |0022] U sledećem primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, bolest je izabrana od poremećaja lipida i lipoproteina; dijabetesa tipa II i kliničkih komplikacija dijabetesa tipa I i tipa II, uključujući dijabetičku nefropatiju, dijabetičku neuropatiju, dijabetičku retinopatiju i druge zabeležene efekte klinički manifestovanog dugotrajnog dijabetesa; stanja i bolesti koji su rezultat hronične masne i librotičke degeneracije organa kao posledica pojačane akumulacije lipida i naročito akumulacije triglicerida i kasnije aktivacije profibrotičkih puteva, kao što je bolest nealkoholne masne jetre (NAFLD), ili nealkoholni steatohepatitis (NASH); gojaznosti ili metaboličkog sindroma (kombinovana stanja dislipidemije. dijabetesa ili abnormalno visokog indeksa telesne mase); i/ili akutnog infarkta miokarda. akutnog šloga ili tromboze koji se javlja kao krajnja tačka hronične opstruktivne arteroskleroze.

[0023]U sledećem primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, bolest je izabrana od ne-malignih hiperproliferativnih poremećaja i malignih hipeproliferativnih poremećaja, naročito hepatoćelijskog karcinoma, adcnoma debelog creva i polipoza, adenokarcinoma debelog creva, kancera dojke, adenokarcinoma pankreasa, Baretovog jednjaka ili drugih oblika neoplastičnih bolesti gastrointestinalnog trakta i jetre. |0024]Poboljšane fizičkohemijske osobine su postignute uvođenjem polarne hidroksil grupe na 1,3-ciklobutilidcn ili 1,3-azetidiniliden grupi zamenom bivšeg 1,2-ciklopropilidcn prstena.

|0025|Iznenađujuće, dobijena jedinjenja su održavala njihovu aktivnost na FXR rcceptoru, ali su pokazala poboljšane fizičkohemijske osobine, kao što je veća rastvorljivost u vodi i/ili permeabilnost membrane.

[0026]Jedinjenja prema predstavljenom pronalasku dele zajedničku hemijsku strukturu prema formuli (1) u patentnom zahtevu 1.

[0027|U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, predstavljeni pronalazak je usmeren na cnantiomer, diastereomer ili farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja prema formuli(1).

[0028J U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, R u formuli (1) je izabran iz grupe koja se sastoji od COOR(„ CONR7R8, S02NR7R8i S02-C|.6alkil.

[0029] U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, Rftu formuli(1) je H.

[0030| U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, R7i R«u formuli (1) su međusobno nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od H i SOi-Ci-(, alkil.

100311U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, R7u formuli (1) je H.

[0032] U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, Rsu formuli (1) jc SOi-Cn, alkil. |0033|U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, A je izabran iz grupe koja se sastoji od: fenil, piridil, pirimidil, pirazolil, indazolil i oksadiazolil.

[0034] U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim ođ primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta. A je supstituisan sa jednom ili dve grupe nezavisno izabrane od C|-(, alkil, poželjnije Cio alkil. U sledećem poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta. A je nesupstituisan. |0035j U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, Q je fenil.

[0036] U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, Q je supstituisan sa jednom ili dve grupe nezavisno izabrane od halogena, poželjnije jedna grupa je izabrana od halogena, naročito Cl.

[0037| U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, Z je

[0038| U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, X = CH.

[0039| U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta, R| je C3.6cikloalkil, naročito ciklopropil.

[0040| U poželjnom primeru izvođenja u kombinaciji sa bilo kojim od primera izvođenja iz prethodnog ili daljeg teksta. Rti R3 su nezavisno izabrani od halogena, naročito Cl.

[00411Tamo gde sc može javiti tautomerizam, kao što je npr. keto-enol tautomerizam jedinjenja prema predstavljenom pronalasku, pojedinačni oblici, kao što su npr. keto i enol oblik, su svaki unutar obima pronalaska kao i njihove smeše u bilo kom odnosu. Isto važi za stereoizomerizam, kao što su npr. enantiomeri, cis/trans izomeri, konformeri i slično.

[0042]Ako je poželjno, izomeri mogu biti odvojeni pomoću postupaka koji su dobro poznati u tehnici, npr. tečnom hromatografijom. Isto važi za enantiomere upotrebom npr. hiralnih stacionarnih faza. Pored toga, enantiomeri mogu biti izolovani njihovim konvertovanjem u diastereomere, tj. kuplovanjem sa enantiomerno čistim pomoćnim jedinjenjem, kasnijim odvajanjem dobijenih diastereomera i cepanjem pomoćnog ostatka. Alternativno, bilo koji enantiomer jedinjenja prema predstavljenom pronalasku može biti dobijen iz stereoselektivne sinteze upotrebom optički čistog početnog materijala. Drugi način za dobijanje čistih enantiomera od racemskih smeša bio bi upotreba enantioselektivne kristalizacije sa hiralnim protiv-jonima. |0043| Jedinjenja prema predstavljenom pronalasku mogu biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli. |0044] Termin "farmaceutski prihvatljive soli" označava soli pripremljene od farmaceutski prihvatljivih netoksičnih baza ili kiselina, uključujući neorganske baze ili kiseline i organske baze ili kiseline. U slučaju da jedinjenja prema predstavljenom pronalasku sadrže jednu ili više kiselih ili baznih grupa, pronalazak takođe sadrži njihove odgovarajuće farmaceutski ili toksikološki prihvatljive soli, naročito njihove farmaceutski upotrebljive soli. Na taj način, jedinjenja prema predstavljenom pronalasku koja sadrže kisele grupe mogu biti prisutna na ovim grupama i mogu se koristiti prema pronalasku, na primer. kao soli alkalnih metala, soli zemnoalkalnih metala ili amonijum soli. Tačniji primeri takvih soli obuhvataju soli natrijuma, soli kalijuma, soli kalcijuma, soli magnezijuma ili soli sa amonijakom ili organskim aminima kao što su, na primer, etilamin. etanolamin. trietanolamin ili aminokiseline. Jedinjenja prema predstavljenom pronalasku koja sadrže jednu ili više baznih grupa, tj. grupa koje mogu biti protonovane, mogu biti prisutna i mogu se koristiti prema pronalasku u obliku njihovih adicionih soli sa neorganskim ili organskim kiselinama. Primeri pogodnih kiselina obuhvataju hlorovodoničnu, bromovodoničnu, fosfornu kiselinu, sumpornu kiselinu, azotnu kiselinu, metansulfonsku kiselinu, p-toluensulfonsku kiselinu, naftalendisulfonske kiseline, oksalnu kiselinu, sirćetnu kiselinu, vinsku kiselinu, mlečnu kiselinu, saticilnu kiselinu, benzoevu kiselinu, mravlju kiselinu, propionsku kiselinu, pivalinsku kiselinu, dietilsirćetnu kiselinu, malonsku kiselinu, ćilibarnu kiselinu, pimelinsku kiselinu, futnarnu kiselinu, maleinsku kiselinu, jabučnu kiselinu, sulfaminsku kiselinu, fcnilpropionsku kiselinu, glukonsku kiselinu, askorbinsku kiselinu, izonikotinsku kiselinu, limunsku kiselinu, adipinsku kiselinu, i druge kiseline poznate stručnjaku iz date oblasti tehnike. Ako jedinjenja prema pronalasku istovremeno sadrže kisele i bazne grupe u molekulu, pronalazak takođe obuhvata, pored navedenih oblika soli, unutrašnje soli ili betainc (cviterjone). Odgovarajuće soli mogu biti dobijene pomoću uobičajenih postupaka koji su poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike kao što je, na primer, dovođenjem u kontakt ovih sa organskom ili neorganskom kiselinom ili bazom u rastvaraču ili disperzantu, ili anjonskom izmenom ili kartjonskom izmenom sa dru<g>im solima. Predstavljeni pronalazak takođe obuhvata sve soli jedinjenja prema predstavljenom pronalasku koje, zbog niske fiziološke kompatibilnosti, nisu direktno pogodne za upotrebu u lekovima, ali koje se mogu koristiti, na primer, kao intermedijeri za hemijske reakcije ili za pripremu farmaceutski prihvatljivih soli. [0045jPored toga, predstavljeni pronalazak daje farmaceutske kompozicije koje sadrže najmanje jedno jedinjenje prema predstavljenom pronalasku, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so kao aktivni sastojak zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. [0046|"Farmaceutska kompozicija" označava jedan ili više aktivnih sastojaka, i jedan ili više inertnih sastojaka koji čine nosač, kao i bilo koji proizvod koji nastaje kao rezultat, direktno ili indirektno, kombinacijom, formiranjem kompleksa ili agreagacijom bilo koja dva ili više sastojaka, ili disocijacijom jednog ili više sastojaka, ili iz drugih tipova reakcija ili interakcija jednog ili više sastojaka. Prema tome, farmaceutske kompozicije prema predstavljenom pronalasku obuhvataju bilo koju kompoziciju pripremljenu mešanjem najmanje jednog jedinjenja prema predstavljenom pronalasku i farmaceutski prihvatljivog nosača. [0047jFarmaceutska kompozicija prema predstavljenom pronalasku može dodatno da sadrži jedno ili više drugih jedinjenja kao aktivne sastojke kao što je jedinjenje prolek ili drugi modulatori jedarnog receptora. [0048[Kompozicije su pogodne za oralnu, rektalnu, topikalnu, parenteralnu (uključujući subkutanu, intramuskulamu i intravensku), okularnu (oftalmičku), pulmonarnu (nazalnu ili bukalnu inhalaciju) ili nazalnu primenu, iako će najpogodniji put u svakom datom slučaju zavisiti od prirode i težine stanja koja se lece i od prirode aktivnog sastojka. One mogu biti pogodno predstavljene u obliku jedinične doze i pripremljene pomoću bilo kog od postupaka dobro poznatih u tehnici farmacije. |0049] Jedinjenja prema predstavljenom pronalasku mogu biti pripremljena pomoću kombinovanja postupaka opisanih u Šemama I do III. Kao što je prikazano u Semi 1, 4-člani ciklični keton, supstituisan sa supstituentom A u 3-položaju može da reaguje sa metalizovanim aromatičnim ili heteroaromatičnim prstenom M-O-O-CH2Z (M = metal, npr. Li) u aprotonskim rastvaračima i poželjno na niskim temperaturama da bi se dobio hidroksil supstituisan 4-člani prsten koji nosi supstituente A i Q. U slučaju gde Y je CH, dva izomera mogu da formiraju (A i Q transanularni cis ili trans jedan prema drugom). Pod optimizovanim uslovima može se postići formiranje uglavnom jednog od dva izomera. Dva izomera mogu biti odvojena pomoću odgovarajućih postupaka poznatih u tehnici kao što je npr. hromatografija na si lika gelu ili preparati vna RP-HPLC.

[0050]U Šcmi II rezimirani su postupci koji su korišćeni za pripremu 4-članih cikličnih ketona potrebnih za sintezu jedinjenja prema ovom pronalasku. U opciji a) intermedijer koji nosi vinil, npr. pripremljen vinilacijom odgovarajućeg početnog materijala koji sadrži halogen R-A-X (X = halogen) može da reaguje sa in situ fonniraniin a.a-dihloro ketenom da bi se formirao 2,2-dihlorociklobutanon. Posle dehalogenizacije, npr. sa Zn u sirćetnoj kiselini pod refluksom, dobijeni su željeni 3-supstituisani ciklobutanoni. Alternativno, vinil-intermedijeri mogu da reaguju sa in situ generisanim nesupstituisanim ketenom da bi se u jednom koraku dobili željeni ciklobutanon interniedijeri. U opciji b) 3-metilenciklobutankarbonitril je korišćen kao početni materijal. Supstituisani heterociklusi mogu biti izgrađeni od cijano grupe u nekoliko koraka pomoću postupaka poznatih stručnjacima iz date oblasti tehnike. Željeni ciklobutanoni mogu biti dobijeni oksidativnim cepanjem egzociklične dvogube veze upotrebom usiova i reagenasa poznatih stručnjacima iz date oblasti tehnike, npr. upotrebom OSO4, ozona ili RhCh/NalG^ kao oksidanata. Opcija c) prikazuje postupke korišćene za pripremu supstituisanih azetidinona. Cu- ili Pd-katalizovano C-N unakrsno kuplovanje između 3-hidroksi-azetidina i halo-aromatičnih ili halo-heteroaromatičnih prstenova daje odgovarajuće N-supstituisane 3-hiđroksi-azetidine koji mogu biti transformisani u željene azetidinone putem oksidacije. [0051|Šema III ilustruje izvesne mogućnosti za izvođenje modifikacija supstituenata na A grupi posle formiranja 4-članih prstenova koji nose hidroksi. Na primer, odlazeća grupa X (npr. bromid) može biti supstituisana sa cijano grupom, karboksilnim estrom, metilsulfonilom ili tioetrom pomoću reakcija unakrsnog kuplovanja katalizovanih prelaznim metalom. Dobijeni derivati mogu biti dalje transfonnisani u druge derivate pomoću postupaka poznatih stručnjacima iz date oblasti tehnike. Na primer, cijano i estarska grupa mogu biti hidrolizovane pod baznim uslovima da bi se dobila karboksilna kiselina koja zatim može biti transformisana u acil-sulfonamide. Benzil tioetar može biti hlorisan da bi se dobio hlorosulfonil intermedijer koji reaguje sa amonijakom do odgovarajućih sulfonamida. [0052| Kao rezultat, predstavljeni pronalazak se odnosi na jedinjenja prema opštoj formuli (1) koja se vezuju za FXR i deluju kao agonisti ili modulatori FXR. |0053|Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu navedenih jedinjenja za lečenje i/ili profilaksu bolesti i/ili stanja preko vezivanja navedenog jedarnog receptora od strane navedenih jedinjenja. Dalje se predstavljeni pronalazak odnosi na upotrebu navedenih jedinjenja za pripremu leka za lečenje i/ili profilaksu bolesti i/ili stanja preko vezivanja navedenog jedarnog receptora od stane navedenih jedinjenja. Posebno, predstavljeni pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenja prema formuli (1) u pripremi leka za profilaksu i/ili lečenje hroničnih intrahepatičnih ili izvesnih oblika ekstrahepatičnih holestatičnih stanja, fibroze jetre, akutnih intrahepatičnih holestatičnih stanja, opstruktivnih ili hroničnih inflamatornih poremećaja koji su rezultat neodgovarajućeg sastava žuči, gastrointestinalnih stanja sa sniženim unosom masti i vitamina rastvorljivih u masti u ishrani, inflamatornih bolesti creva, poremećaja lipida i lipoproteina, dijabetesa tipa II i kliničkih komplikacija dijabetesa tipa I i tipa II, stanja i bolesti koji su rezultat hronične masne i iibrotičke degeneracije organa kao posledica podstaknute akumulacije lipida i naročito triglicerida i kasnije aktivacije profibrotiČnih puteva, gojaznosti i metaboličnog sindroma (kombinovanih stanja, dijabetesa i abnormalno visokog indeksa telesne mase), akutnog infarkta miokarda, akutnog sloga, tromboze koja se javlja kao krajnja tačka hronične opstruktivne ateroskleroze, upornih infekcija unutarćelijskim bakterijama ili parazitskim protozoama, nemalignih hiperproliferativnih poremaćaja, malignih hiperproliferativnih poremećaja, adenokarcinoma debelog creva i hepatocelularnog karcinoma naročito, steatoze jetre i povezanih sindroma, insuficijencije jetre ili malfunkctjc jetre kao rezultata hroničnih boleti jetre ili hirurške resekcije jetre, infekcije hepatitis B, infekcije hepatitis C i/ili holestatičnih i fibrotičnih efekata koji su povezani sa cirozom koja je inđukovana alkoholom ili sa virusnim oblicima hepatitisa. |0054|Lekovi kao što su ovde navedeni mogu biti pripremljeni pomoću uobičajenih postupaka, uključujući kombinaciju jedinjenja prema predstavljenom pronalasku i farmaceutski prihvatljivog nosača. [0055|FXR je predložen kao jedarni senzor žučne kiseline. Kao rezultat, on modulira oba, sintetičku proizvodnju žučnih kiselina u jetri i njihovo recikliranje u crevima (putem regulacije proteina koji vezuju žučnu kiselinu). Ali izvan fiziologije žučne kiseline, izgleda da je FXR uključen u regulaciju mnogih različitih fizioloških procesa koji su relevantni u etiologiji i za lečenje različitih bolesti kao što su holesterolsko kamenje u žuči, metabolički poremećaji kao što je dijabetes tipa II, dislipidemije ili gojaznost, hronične inflamatorne bolesti kao što su inflamatorne bolesti creva ili hronični intrahepatični oblici holestaze i

mnoge druge bolesti (T. Claudel et aL Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2005. 25, 2020; Y.

D. VVanget al., Cell Res. 2008. 18, 1087).

[0056|FXR reguliše složeni obrazac gena odgovora u jetri i u gastrointestinalnom traktu. Genski proizvodi imaju uticaj na različite fiziološke procese. U toku funkcionalne analize FXR. prva regulatoma mreža koja je analizirana bila je regulacija sinteze žučne kiseline. Dok LXRs indukuju ključni enzim konverzije holesterola u žučne kiseline, Cyp7Al, preko indukcije regulatornog jedarnog receptora LRH-I. FXR suzbija indukciju Cyp7Al preko ushodne regulacije iRNK koja kodira SHP, dodatni jedarni receptor koji dominantno vrši suzbijanje u odnosu na LRH-1. S obzirom na to da FXR vezuje krajnje proizvode ovog puta, primarne žučne kiseline kao što je holna kiselina (CA) ili CDCA. ovo se može smatrati primerom inhibicije po principu povratne sprege na nivou genske ekspresije (B. Goodwin et al., Mol. Cell 2000, 6, 517; T. T. Lu et al.. Mol. Cell 2000, 6, 507). Paralelno suzbijanju sinteze žučnih kiselina preko SHP, FXR indukuje opseg takozvanih ABC (za ATP-vezujuću kasetu) transportera koji su odgovorni za izvoz toksičnih žučnih kiselina iz citosola hepatocite u kanalikule, male ramifikacije žučnog puta odakle potiče žuč. Ova hepatoprotektivna funkcija FXR postaje prvi put vidljiva sa analizom FXR nokaut miševa (C. J. Sinal et al., Cell 2000, 102, 731) gde je pokazana nedovoljna ili prekomerna ekspresija nekoliko ABC-transportera u jetri. Dalja detaljna analiza je otkrila da su glavna ekskretorna pumpa žučne soli BSEP ili ABCBI1 (M. Ananthanaravanan et al., J. Biol. Chem. 2001, 276, 28857; J. R. Plass et al., Hepatology 2002, 35, 589) kao i ključni enzim koji posreduje u transferu lipida od lipoproteina do fosfolipida, PLTP (N. L. Urizar et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 39313) i dva ključna transportera kanikularne membrane za fosfolipide, MRP-2 (ABCC4) (H. R. Kast et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 2908) i MDR-3 (ABCB4); L. Huang et ah, J. Biol. Chem. 2003, 278, 51085) direktna ciljna mesta za Hgandom-usmerenu transkripcionu aktivaciju pomoću FXR (rezimirano u: M. Mivara, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005. 312, 759; G. Rizzo et al., Curr. Drug Targets Iramune Endocr. Metabol. Disord. 2005, 5, 289).

[0057|Činjenica da izgleda da je FXR glavni metabočki senzor i regulator za sintezu, izvoz i recirkulaciju žučnih kiselina sugeriše upotrebu FXR liganada za indukciju žučnog protoka i promene sastava žučne kiseline ka hidrofilnijem sastavu. Sa razvojem prvog sintetičkog FXR liganda GVV4064 (P. R. Maloney et al., J. Med. Chem. 2000. 43, 2971; T. M. Willson et al.. Med. Res. Rev. 2001, 21, 513) kao model jedinjenja i polu-sintetičkog veštačkog liganda žučne kiseline 6-alfa-etil-CDCA, mogli bi biti analizirani efekti superstimulacije FXR potentnim agonistima. Pokazano je da oba liganda indukuju protok žuči u životinjama sa ligatimim žučnim putevirna. Pored toga, pored holeretičkih efekata, takode mogu biti

pokazani hepatoprotektivni efekti (R. Pellicciari et al.. J. Med. Chem. 2002, 45, 3569: Y. Liu et al., J. Clin. Invest. 2003, 1 12, 1678). Ovaj hepatoprotektivan efekat je dalje sužen na anti-fibrotični efekat koji je rezultat suzbijanja tkivnih inhibitora matriksnih metaloproteinaza, TIMP-1 i 2, indukcije matriksne metaloproteinaze 2 koja razlaže naslage kolagena u hepatičnim stelatnim ćelijama i kasnije redukcije iRNK. alfa-kolagena i iRNK transformišućeg faktora rasta beta (TGF-beta) koji su oba pro-fibrotički faktori, pomoću agonista FXR (S. Fiorucci et al., Gastroenterologv 2004, 127, 1497: S. Fiorucci et al.. J. Phannacol. Exp. Ther. 2005. 314, 584). Pored toga, anti-holestatička aktivnost je pokazana u životinjskim modelima sa Hgatiranim žučnim putevima kao i u životinjskim modelima holeslaze indukovane estrogenom (S. Fiorucci et al., J. Phannacol. Exp. Ther. 2005, 313, 604).

|0()58J Genetičke studije pokazuju da u naslednim oblicima holestaze (progresivna porodična intrahepatiČna holestaza=PFIC. tip I - IV) ili je jedarna lokalizacija samog FXR snižena kao posledica mutacije u FIC1 genu (u PFIC tipa 1, takođe označena kao Byler-ova bolest) (F. Chen et al.. Gastroenterology 2004, 126, 756: L. Alvarez et al.. Hum. Mol. Genet. 2004. 13, 2451) ili su nivoi FXR ciljnog gena koji kodira MDR-3 fosfolipidnu eksportnu pumpu sniženi (u PFIC tipu III). Uzeti zajedno postoji rastući obim dokaza da će jedinjenja koja vezuju FXR pokazati značajnu kliničku korist u terapcutskom režimu hroničnih holestatičnih stanja kao što je primarna bilijarna ciroza (PBC) ili primarni sklerotizujući holangitis (PSC) (prikaz u: G. Rizzo et al., Curr. Drug Targets Immune Endoer. Metabol. Disord. 2005, 5, 289; G. Zollner et al., Mol. Pharm. 2006, 3, 231; S. Y. Cai et al., Expert Opin. Ther. Targets 2006, 10, 409).

|0059] Duboki uticaj koji aktivacija FXR ima na metabolizam i ekskreciju žučnih kiselina nije samo značajan za holestatičke sindrome, već je čak direktnije značajan za terapiju protiv formiranja kamenja u žuči. Holesterolsko kamenje u žiči se formira kao posledica niske rastvorljivosti holesterola koji se aktivno pumpa izvan ćelije jetre u lumen kanikula. Relativan procenat sadržaja tri glavne komponente, žučnih kiselina, fosfolipida i slobodnog holesterola određuje formiranje mešanih micela i stoga vidljivu rastvorljivost slobodnog holesterola u žuči. Polimorfizam FXR je korišćen za mapiranje lokusa kvantitativne karakteristike kao jedan faktor koji doprinosi bolesti kamenja u žuči (H. Wittenburg, Gastroenterology 2003, 125, 868). Upotrebom sintetičkog FXR model jedinjenja GW4064 moglo bi se pokazati da aktivacija FXR dovodi do poboljšanja indeksa zasićenja holesterola (CSI) i direktno do ukidanja formiranja kamenja u žuči u C57L miševima podložnim formiranju kamenja u žuči. dok tertman lekom kod FXR nokaut miševa ne pokazuje nikakve efekte na formiranje kamenja u žuči (A. Moschetta et al.. Nature Medicine 2004. 10, 1352).

|0060|Ovi rezultati kvalifikuju FXR kao dobro ciljno mesto za razvoj malih molekula agonista koji se mogu koristiti za prevenciju fomiranja holesterolskog kamenja u žuči ili za prevenciju ponovnog formiranja kamenja u žuči posle hirurškog uklanjanja ili litotripsije udarnim talasima (razmatrano u: S. A. Doggrell, Curr. Opin. Invcstig. Drugs 2006, 7, 344).

[00611Na taj način, u jednom primeru izvođenja prema pronalasku, jedinjenje prema fomuli (1) i farmaceutske kompozicije koje sadrže navedeno jedinjenje su korišćene za profilaksu i/ili lečenje opstruktivnih ili hroničnih inflamatornih poremećaja koji se javljaju kao posledica neispravnog sastava žuči kao što je holelitiaza takođe poznata kao holcsterolsko kamenje u žuči.

|0062]Pored njegovih snažnih hepatoprotektivnih i holeretičkih kao i anti-fibrotičkih efekata koje FXR pokazuje posle malim molekulom stimulisane aktivacije u jetri, izgleda da FXR ima ulogu u zaštiti creva od neoplastične transformacije i od razvoja polipa i njihovog prelaska u adenokarcinom u crevima (S. Modica et al., Cancer Res. 2008, 68, 9589 i R. R. Maran et al., J. Phannacol. Exp. Ther. 2009. 328, 469). Slično situaciji u crevima odsustvo FXR dovodi do visokog povećanja u formiranju hepatocelularnog karcinoma (HCC), najistaknutijeg oblika kancera jetre (1. Kim et al„ Carcinogenesis 2007, 28, 940 i F. Yang et al., Cancer Res. 2007, 67, 863). Dok funkcionalni FXR sprečava formiranje adenokarcinoma debelog creva i hepatocelularnog karcinoma, aktivacija FXR indukuje regeneraciju jetre posle hepatektomije (W. Huang et al., Science 2006, 312, 233).

[0063]Kombinovani hepatoprotektivni, anti-neoplastični efekti i efekti regeneracije jetre povezani sa aktivacijom FXR mogu biti terapeutski korišćeni za upotrebu agonista FXR u lečenju teških bolesti jetre. U jednom primeru izvođenja, jedinjenja prema pronalasku i farmaceutske kompozicije koje sadrže navedena jedinjenja su korišćeni u lečenju bolesti jetre kao što je HCC, stimulaciji ponovnog rasta jetre i poboljšanju sporednih efekata povezanih sa velikom resekcijom jetre, cirozom jetre nezavisno od etiologijc i prevenciji ili lečenju ishemije jetre u toku transplantacije jetre ili velike operacije jetre. |0064|Od otkrića prvog sintetičkog agonista FXR i njegove primenc na glodare postalo je očigledno da je FXR ključni regulator serumskih triglicerida (P. Malonev et al., J. Med. Chem. 2000, 43, 2971; T. \Villson et al.. Med. Res. Rev. 2001, 21,513). Tokom prošlih šest godina akumulirajući dokazi su objavljeni da aktivacija FXR pomoću sintetičkih agonista dovodi do značajne redukcije serumskih triglicerida. uglavnom u obliku redukovanog VLDL, ali takođe do redukovanog ukupnog serumskog holesterola (H. R. Kast et al.. Mol. Endocrinol. 2001, 15, 1720; N. L. Urizar et al.. Science 2002. 296, 1703; G. Lambert et al., J. Biol. Chem. 2003, 278, 2563; M. VVatanabe et al., J. Clin. lnvest. 2004, 113, 1408; A. Figge et al., J. Biol. Chem. 2004. 279, 2790; S. Bilz et al.. Am. J. Phvsiol. Endocrinol. Metab. 2006, 290, E716). [0065|Ali snižavanje serumskih triglicerida nije samostalni efekat. Tretman db/db ili ob/ob miševa sa sintetičkim agonistom FXR GW4064 rezultiralo je u upadljivoj i kombinovanoj redukciji serumskih triglicerida, ukupnog holesterola, slobodnih masnih kiselina, ketonskih tela kao što je 3-OH butirat. Pored toga, aktivacija FXR delujc zajedno sa unutarćelijskim putem prenosa signala insulina u hepatocitama, rezultirajući u sniženoj proizvodnji glukoze iz glukoneogeneze u jetri, istovremenom povećanju glikogena u jetri. Tretman sa FXR je pozitivno uticao na insulinsku senzitivnost kao i tolertanciju glukoze (K. R. Stavrook et al., Endocnnology 2005, 146, 984; Y. Zhang et al.. PNAS 2006, 103, 1006; B. Cariou et al., J. Biol. Chem. 2006, 281, 11039; K. Ma et al„ .1. Clin. Invest. 2006. 1 16, 1 102; D. Duran-Sandoval et al., Biochimie 2005, 87, 93). Efekat na redukciju telesne težine takođe jc nedavno zabeležen kod miševa prekomerno hranjenih hranom sa visokim sadržajem lipida (C. Lihong et al., American Diabetes Association (ADA) 66th annual scientifie sessions. June 2006, Abstract Numbcr 856-P). Ovaj efekat gubitka na telesnoj težini bi mogao da je rezultat indukcije FGF-19 pomoću FXR, pri čemu je FGF-19 - faktor rasta fibroblasta za koji je poznato da dovodi do gubitka u telesnoj težini i atletskog fenotipa (J. Holt et al., Genes Dev. 2003, 17, 1581; E. Tomlinson et al., Endocrinology 2002, 143, 1741). U skorijim patentnim prijavama, pokazan je efekat agonista FXR na redukciju telesne težine (WO 2004/087076; VVO 2003/080803). |0066]Uzeti zajedno, ovi farmakološki efekti agonista FXR mogu biti korišćeni na različite terapeutske načine: Veruje se da su jedinjenja koja vezuju FXR dobri kandidati za lečenje dijabetesa tipa II zbog njihove senzitizacijc insulina, glikogenogenih efekata i efekata snižavanja nivoa lipida. (0067jU jednom primeru izvođenja, jedinjenja prema pronalasku i farmaceutske kompozicije koje sadrže navedena jedinjenja su korišćeni u protilaksi i/ili lečenju dijabetesa tipa II koji može biti prevaziđen pomoću FXR-posredovane ushodne regulacije sistemske senzitivnosti na insulin i unutarćelijskim prenosom signala insulina u jetri, povećanim perifernim unosom glukoze i metabolizacije, povećanim skladištenjem glikogena u jetri, smanjenom proizvodnjom glukoze u serumu iz glukoneogeneze u jetri.

[0068]U sledećem primeru izvođenja, navedena jedinjenja i farmaceutske kompozicije su korišćeni za profilaksu i/ili lečenje hronične intrahepatične, kao što je PBC, PSC, progresivne porodične holestaze (PFIC), ciroze indukovane alkoholom i povezane holestaze, i nekih oblika ekstrahepatičnih holestatičkih stanja ili fibroze jetre. [0069JPronalazak se takođe odnosi na jedinjenje formule (1) ili na fannacetsku kompoziciju koja sadrži navedeno jedinjenje za profilaksi! i/ili lečenje gastrointestinalnih stanja sa siženim unosom masti i vitamina koji su rastvorljivi u masti u ishrani koja se mogu prevazići povećanim intestinalnim nivoima žučnih kiselina i fosfolipida.

[0070]U sledećem primeru izvođenja, navedeno jedinjenje ili farmaceutska kompozicija je korišćeno za prevenciju i/ili lečenje bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od poremećaja lipida i lipoproteina kao što su hiperholcsterolcmija, hipertrigliceridemija i ateroskleroza kao klinički manifestovano stanje koje može biti poboljšano pomoću korisnog efekta FXR na snižavanje ukupnog holesterola u plazmi, snižavanje triglicerida u serumu, povećanja konverzije holesterola u jetri u žučne kiseline i povećanog klirensa i metaboličke konverzije VLDL i drugih lipoproteina iu jetri. [00711U jednom sledećem primeru izvođenja, navedeno jedinjenje i farmaceutska kompozicija su korišćeni za profilaksu i/ili lečenje bolesti gde kombinovani efekti snižavanja količine lipida, anti-holestatički i anti-fibrotičlki efekti FXR-ciljanih lekova mogu biti korišćeni za lečenje steatoze jetre i povezanih sindroma kao što je NASH, ili za lečenje holestatičkih i fibrotiČkih efekata koji su povezani sa cirozom koja je indukovana alkoholom ili sa virusnim oblicima hepatitisa.

[0072]Zajedno sa hipolipidemijskim efektima takođe je pokazano da gubitak funkcionalnog FXR dovodi do povećane ateroskleroze kod ApoE nokaut miševa (E. A. Hanniman et al., J. Lipid Res. 2005, 46, 2595). Prema tome, agonisti FXR bi mogli imati kliničku korist kao anti-aterosklerotiČki i kardioprolektivni lekovi. Nishodna regulacija cndotelina-1 u vaskularnim glatkim mišićnim ćelijama bi takođe mogla da doprinese takvim korisnim terapeutskim efektima (F. He et al., Circ. Res. 2006, 98, 192). [0073JPronalazak sc takođe odnosi na jedinjenje prema formuli (1) ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži navedeno jedinjenje za preventivni i post-traumatski tretman kardiovaskularnih poremećaja kao što su akutni infarkt miokarda, akutni šlog ili tromboza koji se javljaju kao krajnja tačka hronične opstruktivne ateroskleroze. [0074J Pored kontrole formiranja polipa u crevima i u debelom crevu, izgleda da je FXR eksprimiran u tkivu i ćelijskim linijama kancera dojke, ali ne u zdravom tkivu dojke i izgleda da interaguje sa receptorom za estrogen u ER pozitivnim ćelijama kancera dojke (K. E. Swales et al., Cancer Res. 2006, 66, 10120 i F. Journe et al., Breast Cancer Res. Treat. 2009, 115, 523).

[0075]Ovo bi omogućilo da se FXR smatra takođe potencijalnim ciljnim mestom za lečenje proliferativnih bolesti, naročito oblika metastazirajućeg kancera koji eksprimiraju mali moiekul - responsivni oblik FXR. [0076[ Li sledećem primeru izvođenja, navedena jedinjenja i farmaceutske kompozicije su korišćeni za profilaksu i/ili lečenje malignih hiperproliferativnih poremećaja kao što su različiti oblici kancera, naročito određeni oblici kancera dojke, jetre ili debelog creva gde će delovanje na FXR ligand imati koristan uticaj. [0077|Konačno, izgleda da je FXR takođe uključen u kontrolu antibakterijske odbrane u crevima (T. Inagaki et al., PNAS. 2006, 103, 3920), iako tačan mehanizam nije dat. Iz ovih objavljenih podataka, međutim, moguće je zaključiti da lečenje sa agonistima FXR može imati koristan uticaj u terapiji inflamatornih poremećaja creva (1BD), naročito onih oblika gde je pogođen gornji (ileusni) deo creva (npr. ileusna Kronova bolest) zbog toga što ovo izgleda daje mesto delovanja kontrole FXR na bakterijski rast. Kod IBD desenzitizacija adaptivnog imunog odgovora je na neki način umanjena u intestinalnom imunom sistemu. Prekomerni rast bakterija bi mogao bili uzročnik uspostavljanja hroničnog inflamatornog odgovora. Stoga, inhibicija bakterijskog rasta pomoću FXR-posredovanih mahanizama mogao bi biti ključni mehanizam u prevenciji akutnih inflamatornih epizoda. [0078|Na taj način, pronalazak se takođe odnosi na jedinjenje prema formuli (1) ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži navedeno jedinjenje za prevenciju i/ili lečenje bolesti povezane sa inflamatornim bolestima creva kao što je Kronova bolest ili kolitis ulceroza. Veruje se da je FXR-posredovano obnavljanje funkcije intestinalne barijere i redukcije u koncentraciji ne-komensalnih bakterija korisno u redukciji izlaganja bakterijskih antigena intestinalnom imunom sistemu i može prema tome da redukuje inflamatorne odgovore.

[0079| Pronalazak se dalje odnosi na jedinjenje ili farmaceutsku kompoziciju za profilaksu i/ili lečenje gojaznosti i povezanih poremećaja kao sto je metabolički sindrom (kombinovana stanja dislipidemija, dijabetesa i abnormalno visokog indeksa telesne mase) koji mogu biti prevaziđeni pomoću FXR-posredovanog snižavanja serumskih triglicerida, glukoze u krvi i povećane insulinske senzitivnosti i FXR-posredovanog gubitka u telesnoj težini.

[0080]U sledećem primeru izvođenja, jedinjenja ili farmaceutska kompozicija prema predstavljenom pronalasku su korisni u prevenciji i/ili lečenju kliničkih komplikacija dijabetesa tipa I i tipa II. Primeri takvih komplikacija obuhvataju dijabetičku nefropatiju, dijabetičku retinopatiju. dijabetičke neuropatije ili perifernu arterijsku okluzivnu bolest (PAOD). Druge kliničke komplikacije dijabetesa su takođe obuhvaćene predstavljenim pronalaskom. [00811Pored toga, stanja i bolesti koji su rezultat hronične masne i fibrotičke degeneracije organa kao posledica pojačane akumulacije lipida i naročito triglicerida i kasnije aktivacije profibrotiČkih puteva takođe mogu biti sprečeni i/ili lečeni primenom jedinjenja ili farmaceutske kompozicije prema predstavljenom pronalasku. Takva stanja i bolesti obuhvataju NASH i hronična holestatička stanja u jetri, glomerulosklerozu i dijabetičku nefropatiju u bubregu, degeneraciju makule i dijabetičku retinopatiju u oku i neurodegenerativne bolesti kao što je Alzheimer-ova bolest u mozgu, ili dijabetičke neuropatije u perifernom nervnom sistemu. |0082| U praktičnoj upotrebi, jedinjenja prema predstavljenom pronalasku mogu biti kombinovana kao aktivni sastojak u bliskoj smeši sa farmaceutskim nosačem prema uobičajenim tehnikama farmaceutske sinteze. Nosač može imati široki niz različitih oblika u zavisnosti od oblika preparata željenog za primenu, npr.. oralni ili parenteralni {uključujući intravenski). U pripremi kompozicija za oblik oralne doze, bilo koji od uobičajenih farmaceutskih medijuma se može koristiti, kao što su, na primer, voda, glikoli. ulja, alkoholi, sredstva za poboljšanje ukusa, konzervansi, boje i slično u slučaju oralnih tečnih, kao što su, na primer, suspenzije, eliksiri i rastvori; ili nosači kao što su škrobovi, šećeri, mikrokristalna celuloza, razblaživači, granulaciona sredstva, lubrikanti. vezujuća sredstva, sredstva za raspadanje i slično u slučaju oralnih čvrstih preparata kao što su, na primer, praškovi, tvrde i mekane kapsule i tablete, pri čemu su čvrsti oralni preparati poželjni u odnosu na tečne preparate. [0083j Zbog njihove jednostavne primene, tablete i kapsule predstavljaju najpovoljniji oblik oralne jedinične doze u kom slučaju čvrsti farmaceutski nosači su očigledno korišćeni. Ako je poželjno, tablete mogu biti obložene standardnim vodenim ili nevodenim tehnikama. Takve kompozicije i preparati bi trebalo da sadrže najmanje 0.1 procenata aktivnog jedinjenja. Procenat aktivnog jedinjenja u ovim kompozicijama može, naravno, biti variran i može povoljno biti između oko 2 procenta do oko 60 procenata težine jedinice. Količina aktivnog jedinjenja u takvim terapcutski korisnim kompozicijama je takva da će se dobiti efikasna doza. Aktivna jedinjenja takođe mogu biti primenjivana intranazalno kao, na primer, tečne kapi ili sprej. 100841 Tablete, pilule, kapsule i slično takođe mogu da sadrže vezujuće sredstvo kao što je tragantova guma, akacija, kukuruzni škrob ili želatin; ekscipijense kao što je dikalcijum fosfat; sredstvo za raspadanje kao što je kukruzni škrob, škrob od krompira, alginska kiselina; lubrikant kao što je magnezijum stearat; i zaslađivač kao što je saharoza, laktoza ili saharin. Kada je oblik jedinične doze kapsula, ona može da sadrži, pored materijala gore navedenog tipa, tečni nosač kao sto je masno ulje.

[0085] Različiti drugi materijali mogu biti prisutni kao omotači ili za modifikaciju fizičkog oblika jedinice doze. Na primer, tablete mogu biti obložene šelakom, šećerom ili sa oba. Sirup ili eliksir može da sadrži, pored aktivnog sastojka, saharozu kao zaslađivač, metil i propilparabene kao konzervansc, boju i aromu kao šio je aroma višnje ili narandže.

[0086] S obzirom na to da jedinjenja prema predstavljenom pronalasku predstavljaju karboksilne kiseline ili njihove slične anjonske izoestre, i s obzirom na to daje dobro poznato da oblici soli jedinjenja jonskog leka mogu značajno da utiču na biodostupnost jedinjenja lekova, jedinjenja prema predstavljenom pronalasku takođe mogu biti korišćena kao soli sa različitim koncentracijama da bi se proizvela oralno dostupna formulacija. Takvi farmaceutski prihvatljivi katjoni mogu biti pored ostalih mono- ili bivalentni joni kao što su amonijum, alkalni metali - natrijum ili kalijum ili zemnoalkalni metali - magnezijum ili kalcijum, određeni farmaceutski prihvatljivi amini kao što je tris{hidroksimetil)aminometan, etilendiamin, dietilamin, piperazin ili drugi, ili određene katjonske aminokiseline kao što je lizin ili arginin. |0087] Jedinjenja prema predstavljenom pronalasku takode mogu biti primenjivana parenteralno. Rastvori ili suspenzije ovih aktivnih jedinjenja mogu biti pripremljeni u vodi pogodno mešanoj sa surfaklantom kao što je hidroksi-propilceluloza. Disperzije takođe mogu biti pripremljene u glicerolu, tečnim polietilen giikolima i njihovim smešama u ulju. Pod uobičajenim uslovima čuvanja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans radi sprečavanja rasta mikroorganizama. 10088] Farmaceutski oblici pogodni za injektabilnu upotrebu obuhvataju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ex tempore primenu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti tečan do te mere daje moguća jednostavna primena šprica. On mora biti sterilan pod uslovima proizvodnje i čuvanja i mora biti konzervisan protiv kontaminirajućeg delovanja mikroorganizama kao što su bakterije i gljive. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr., glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol), njihove pogodne smeše i biljna ulja.

[0089] Bilo koji pogodan način primene može biti korišćen za obezbedivanje sisaru, naročito čoveku, efikasne doze jedinjenja prema predstavljenom pronalasku. Na primer, mogu biti korišćene oralna, rektalna, topikalna. parenteralna, okulama, pulmonarna, nazalna primena i slično. Oblici doze obuhvataju tablete, pastile, disperzije, suspenzije, rastvore, kapsule. kreme, masti, aerosolove i slično. Poželjno jedinjenja prema predstavljenom pronalasku se primenjuju oralno. [0090| Efikasna doza aktivnog sastojka može da varira u zavisnosti od određenog jedinjenja koje je korišćeno, načina primene, stanja koje sc leči i težine stanja koje se Ječi. Takva doza može biti lako utvrđena od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike. (009*11 Kada se leče ili sprečavaju stanja posredovana preko FXR za koja su indikovana jedinjenja prema predstavljenom pronalasku, generalno se zadovoljavajući rezultati dobijaju kada se jedinjenja prema predstavljenom pronalasku primenjuju u dnevnoj dozi od oko 0.1 miligrama do oko 100 miligrama po kilogramu telesne težine životinje, poželjno dato kao jedna dnevna doza ili u podeljenim dozama dva do šest puta na dan. ili u obliku sa produženim oslobađanjem. Za većinu krupnih životinja, ukupna dnevna doza je od oko 1.0 miligrama do oko 1000 miligrama, poželjno od oko 1 miligrama do oko 50 miligrama. U slučaju odraslog čoveka od 70 kg, ukupna dnevna doza će generalno biti od oko 7 miligrama do oko 350 miligrama. Ovaj režim doziranja miže biti prilagođen da bi se obezbedio optimalan terapeutski odgovor. |0092] Jedinjenja prema predstavljenom pronalasku mogu biti pripremljena prema postupku iz sledećih Sema i Primera, upotrebom odgovarajućih materijala i dalje su ilustrovani sledećim specifičnim primerima. Pored toga, upotrebom postupaka koji su ovde opisani, zajedno sa uobičajenim znanjem u tehnici, dodatna jedinjenja prema predstavljenom pronalasku za koja je ovde tražena zaštita mogu biti jednostavno pripremljena. Jedinjenja ilustrovana u primerima ne treba, međutim, tumačiti lako kao da formiraju jedini rod koji se smatra pronalaskom. Primeri dalje ilustruju detalje za pripremu jedinjenja prema predstavljenom pronalasku. Stručnjaci iz date oblasti tehnike će lako razumeti da se poznate varijacije uslova i postupaka sledećih preparativnih procedura mogu koristiti za pripremu ovih jedinjenja. Ovde predstavljena jedinjenja su generalno izolovana u obliku njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, kao što su one opisane u prethodnom tekstu. [0093| Baze bez amina koje odgovaraju izolovanim solima mogu biti generisanc neutralizacijom sa pogodnom bazom, kao što je vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata, natrijum karbonata, natrijum hidroksida i kalijum hidroksida, i ekstrakcijom oslobođene baze bez amina u organski rastvarač, nakon čega sledi isparavanje. Baza bez amina, izolovana na ovaj način, može biti dalje prevedena u drugu farmaceutski prihvatljivu so rastvaranjem u organskom rastvaraču, nakon čega sledi dodavanje odgovarajuće kiseline i kasnije isparavanje, taloženje ili kristalizacija. Karboksilne slobodne kiseline koje odgovaraju izolovanim solima mogu biti generisane neutralizacijom sa pogodnom kiselinom, kao što je vodeni rastvor hlorovodonične kiseline, natrijum hidrogen sulfat, natrijum dihidrogen fosfat i ekstrakcijom oslobođene kiseline sa slobodnom karboksilnom grupom u organski rastvarač, nakon čega sledi isparavanje. Karboksilna kiselina, izolovana na ovaj način, može biti dalje prevedena u drugi farmaceutski prihavtljivu so rastvaranjem u organskom rastvaraču, nakon čega sledi dodavanje odgovarajuće baze i kasnije isparavanje, taloženje ili kristalizacija.

[0094]Ilustracija pripreme jedinjenja prema predstavljenom pronalasku je prikazana u daljem tekstu. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno u šemama, promenljive imaju isto značenje kao sto je opisano u prethodnom tekstu. Primeri predstavljeni u daljem tekstu su namenjeni za ilustraciju određenih primera izvođenja prema pronalasku. Pogodni početni materijali, gradivni blokovi i reagensi korišćeni u sintezi opisani su u daljem tekstu su komercijalno dostupni iz Sigma-Aldrich ili Acros Organics. na primer, ili se mogu rutinski pripremiti pomoću postupaka opisanih u literaturi, na primer u "March's Advanced Organic Chcmistrv: Reactions, Mechanisms, and Structure", 5th Edition; John Wiley & Sons or T, Eicher, S. Hauptmann "The Chemistry of Heterocyeles; Structures, Reactions. Synthesis and Application", 2nd edition, Wiley-VCH 2003; Fieser et al. "Fiesers<*>Reagents for organic Synthesis" John Wiley & Sons 2000.

Primeri

Primer 1:Metil 3-(( ls, 3s)- 3-( 2- hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofeninizoksazol- 4-

il) metoksi) fenil)- 3- hidroksiciklobutil) benzoat ( 1)

(0095|

Korak 1:4-(( 4- Bromo- 3- hlorofenoksi) metil)- 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofenil)- izoksazol ( la)

(00961U rastvor (5-ciklopropil-3-{2,6-dihloroienil)izoksazol-4-il)metanola (13 g, 45.8 rninol) u CH2Cb (DCM) (200 itiL) ukapavanjem je dodavati SOCN (40 mL. 336 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 časa i rastvarači su uklonjeni pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u MN-dimetilformamidu (DMF) (200 ml) i 4-bromo-3-hlorofenol (9.7 g, 47 mmol), K2COj(40 g, 290 mmol) i Nal (12 g, 80 mmol) su dodati u ovaj rastvor. Smeša je mešana na 60°C preko noći, zatim hlađena đo sobne temperature, razblažena vodom (1000 mL) i ekstrahovana sa etil acetatom (EA) (500 mL X 3). Kombinovane organske faze su isprane fiziološkim rastvorom (500 mL X 3), sušene preko NaiS04i koncentrovane pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću "flash" hromatografije na silika gelu(CC)da bi se dobilo jedinjenje iz naslovala(19 g. 88%) kao bela čvrsta supstanca.

Korak 1: Metil 3-( 2, 2- dihloro- 3- oksociklobutil) benzoat( lb)

[0097]U posudu sa tri grlića i okruglim dnom, pod atmosferom azota. opremljenu kondenzatorom, visećom mešalicom i levkom za dodavanje sa izjednačenim pritiskom rastvoren je metil 3-vinilbenzoat (5 g, 31 mmol) u suvom Et20 (150 mL). U ovu posudu je dodat cink u prahu (6 g, 3 ekv.) i reakcija je ultrazvučno obrađivana u trajanju od 30 min. Nakon ovog vremena ukapavanjem je dodavan rastvor trihloroacetilhlorida (8.7 mL, 2.5 ekv.) u suvom Et20 (50mL) dok je nastavljena ultrazvučna obrada tokom sledećih 30 min. U toku postupka reakciona smeša je zagrevana do 35°C. Ultrazvučna obrada je nastavljena u trajanju od 2.5 Časa na refluksu i pomoću 'H NMR analize je utvrđeno da je reakcija završena. Reakcija je ostavljena da se hladi do sobne temperature i ugašena vodom (-50 mL). Ovo je izvedeno ukapavanjem sa prekidima od po nekoliko minuta zbog toga što se može javiti odložena egzotermna reakcija. Posle 20 min mešanja u vodi reakciona smeša je filtrirana kroz čep od celita i ispirana kroz Et^O. Organski sloj je ispran sa porcijama vode (2 x 250 mL), zasićenog natrijum bikarbonata (2 x 250 mL) i fiziološkog rastvora (1 x 250 mL), sušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi prizvod lb kao tamno žuto gusto ulje (sirovo 8.7 g).

Korak 2: Metil 3-( 3- oksociklobutil) benzoat( lc)

[0098]Sirovo jedinjenje lb (8.7 g) je rastvoreno u glacijalnoj sirćetnoj kiselini (55 mL) u posudi sa okruglim dnom pod atmosferom azota. U ovu posudu je dodat cink u prahu (4.6 g.

2.2 ekv.) i reakcija je mešana i zagrevana do 120°C u trajanju od 3 časa. Posle hlađenja do sobne temperature smeša je filtrirana kroz čep od celita. ovo je isprano sa porcijama EA. Kombinovani rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom pre rastvaran ja u EA (500 mL), ispran fiziološkim rastvorom (150 mL x 2) i zatim sušen preko natrijum sulfata, filtriran i ponovo koncentrovan. Sirova smeša je mešana u trajanju od 5 min u hloroformu (250 mL) i filtrirana kroz sinterovani levak. Filtrat je koncentrovan da bi se dobio sirovi proizvod kao bledo žuto ulje. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću CC u (PE/EA = 9:1, PE = petroletar) da bi se dobio željeni proizvodlc(2.5 g, 38% za 2 koraka) kao svetio žuto ulje.

Korak 3: Metil 3-( 3-( 2- hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofenil) izoksazol- 4-

il) metoksi) fenil)- 3- hidroksiciklobutil) bcnzoat( 1)

[0099|U mešajući rastvor jedinjenja la (1.67 g, 3.5 mmol) u suvom THF (30 mL) ukapavanjem je dodavan n-BuLi (2.5 M u heksanu, 1.2 ekv., 1.69 mL) tokom 10 min na - 78°C pod atmosferom azota. Ovo je mešano 1 čas na ovoj temperaturi pre dodavanja putem ukapavanja rastvora jedinjenja 1 c (0.72 g, 1 ekv.) u suvom THF (10 mL) i mešanje je izvedeno u trajanju od 1 časa na ovoj temperaturi. Reakciona smeša je ostavljena da se zagreva do sobne temperature i ostavljena đa se mesa. Reakcija je ugašena rastvorom zasićenog rastvora amonijum hlorida (50 mL) i EA (250 mL).

[0100]Organski sloj je odvojen i vodeni sioj je ispran sa EA (2 x 100 mL). Kombinovani organski ekstrakti su sušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i konsentrovani da bi se dobio sirovi proizvod kao braon ulje. Proizvod je izolovan posle CC sa PE/EA (19:1 do 3:1). Reakcija i prečišćavanje su ponovljeni dva puta u istim razmerama i kombinovani proizvod (3.13 g) je ponovo prečišćen pod istim uslovima da bi se dobio krajnji proizvod 1 (1.7 g, 19%).<]>H NMR (CDCb): 7.93 (m, IH), 7.90-7.85 (m, IH), 7.50-7.30 (m. 5H), 6.88 (s, IH), 6.75-6.72 (m, IH), 4.80 (s, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.20-3.10 (m, IH), 3.00-2.91 (m, 2H), 2.60-2.49 (m, 2H), 2.15-2.08 (m, IH), 1.30-1.25 (m, 2H), 1.15-1.10 (m, 2H).

Primer 2: 3-(( ls, 3s)- 3-( 2- Hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofenil) izoksazol- 4-

il) metoksi) fenil)- 3- hidroksiciklobutil) benzoevakiselina ( 2)

[0101|

[0102]Jedinjenje 1 (1.7 g, 2.84 mmol) je rastvoreno u THF (100 mL) na sobnoj temperaturi. Dodat je rastvor LiOH (285 mg, 4.2 ekv.) u vodi (20 mL) i rastvor je mešan i zagrevan do 35°C tri dana. Nakon ovog vremena THF je uklonjen pod sniženim pritiskom. Preostali vodeni rastvor je razblažen vodom (25 mL) i ispran sa Et:0 (2 x 50 mL). Vodeni sloj je zatim prebačen u posudu sa okruglim dnom i zakišeljen do pH 6 upotrebom<!>N HC1. Formirani beli talog je otfiltriran i sušen pod sniženim pritiskom na 50°C da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 2 (1.3 g, 78%, jedan izomer pomoću 'H-NMR i LC-MS) kao bela čvrsta supstanca.

'H NMR (400 MHz, CD3OD) 6: 7.98 (s. IH). 7.86 (d. J = 7.6 Hz. IH). 7.58-7.46 (m, 5H), 7.41 (t, J = 7.6 Hz, IH), 6.91 (d, J = 2.4 Hz, IH), 6.80 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, IH), 4.95 (s, 2H), 3.29-3.25 <m, 2H), 2.96 (m, IH), 2.55-2.49 (m, 2H). 2.37 (m. IH), 1.24-1.22 (m, 4H). MS (ESI-) m/z: 584(582) [M-I]~.

[0103]Relevanti intenzivni NOEs (dobijeni iz ROESY spektra; strelice dole) ukazuju na to da su dve aromatične grupe 1,3-trans orijentisane u Primeru2.

Alternativniputdo Primera 2

Korak 1: 3-( 3- Bromofenil) ciklobutanon( 2a)

[0I04|N,/V-Dimetilacetamid (9.0 g, 103 mmol) je rastvoren u 1,2-dihloroetanu (200 mL). Rastvor je hlađen do 0°C pre dodavanja anhidrida trifluorometansuifonske kiseline (63 g, 223 mmol). Reakcija je mešana dodatnih 60 min na 0°C. Zatim su dodati l-bromo-3-vinilbenzen (15 g, 81.9 mmol) i 2,4,6-kolidin (10.5 g, 86.6 mmol). Reakcija je zagrevana do refluksa preko noći, ugašena dodavanjem vode (300 mL) i mešana 2 časa na sobnoj temperaturi. Smeša je ekstrahovana sa DCM (300 mL X 3). Kombinovani organski slojevi su sušeni preko Na2S04i koncentrovani pod vakuumom. Prečišćavanje pomoću CC (EA/PE = 1:20) dalo je jedinjenje iz naslova 2a (5.0 g, 27%) kao svetio žutu Čvrstu supstancu.

Korak 2: 3-( 3- Bromofenil)- l -( 2- hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofenil) izoksazol- 4-

il) metoksi) fenil) ciklobutanol( 2b)

|0105]U rastvor jedinjenja la (14 g, 29.6 mmol) u suvom THF (500 ml) na -78°C ukapavanjem je dodat n-BuLi (18.5 mL. 1.6 M u heksanu, 29.6 mmol). Smeša je mešana dodatni 1 čas na -78°C i rastvor jedinjenja 2a (6.5 g, 28.9 mmol) u suvom THF (50 mL) je dođavan ukapavanjem. Dobijena smeša je mešana na -78°C u trajanju od 1 Časa i zatim zagrevana do sobne temperature i ugašena zasićenim vodenim rastvorom NH4CI (500 mL). Smeša je ekstrahovana sa EA (500 mL X 2), kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom, sušeni preko Na2S04i koncentrovani pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću CC (EA/PE = 1:5) da bi sc dobilo jedinjenje iz naslova 2b (6.5 g, 37%) kao bela Čvrsta supstanca.

Korak 3: 3-( 3- Ciianofenil)- l-( 2- hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofenil) izoksazol- 4-

il) metoksi) fenil) ciklobutanol ( 2c)

(0106)U rastvor jedinjenja 2b (3.1 g, 5 mmol) u DMF (50 mL) pod atmosferom arogona dodavani su Zn(CN)2(500 mg, 4.3 mmol), Pd2(dba)3(300 mg, 0. 33 mmol) i Xantphos (150 mg, 0.31 mmol). Smeša je mešana 10 časova na 115°C pod mikrotalasnim zračenjem. Posle hlađenja do sobne temperature reakciona smeša je razblažena vodom (250 mL) i ekstrahovana sa EA (250 mL X 2). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (100 mL X 3) i sušeni preko Na2S04. Ostatak je prečišćen pomoću CC (EA/PE) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova 2c (1.2 g, 42%) kao svetio žuta Čvrsta supstanca.

Korak 4j 3-({ ls, 3s)- 3-( 2- rlloro- 4-( f5- ciklopropil- 3- f2, 6- dihlorofenil) izoksazol- 4-

il) metoksi) fenil)- 3- hidroksiciklobuul) benzocva kiselina( 2)

[0107|U rastvor jedinjenja 2c (15 g, 24.2 mmol) u EtOH (750 mL) dodat je vodeni rastvor NaOH (40 g u 100 mL vode). Dobijena smeša je zagrevana do refluksa preko noći i zatim hlađena do sobne temperature. Reakcija jc koncentrovana pod vakuumom da bi se uklonio ispraljivi rastvarač, razblažena vodom (1000 mL) i pH je podešena do 2 sa razblaženim vodenim rastvorom HC1 (1 N). Formirani t alog je sakupljen filtracijom da bi se dobio sirovi proizvod kao žuta čvrsta supstanca (13.8 g). Prečišćavanje pomoću preparativne reverzno fazne HPLC (RP-HPLC) dalo je jedinjenje iz naslova 2 (8.0 g, 56%, pojedinačni izomer pomoću 'H-NMR) kao bela Čvrsta supstanca.

Preparativni Primer 3

|0108j

Korak 1: Metil 3-( 3- hidroksiazetidin- l- ii) benzoat ( 3a)

[0109]U rastvor metil 3-jodobenzoata (4.5 g, 17.2 mmol) u DMSO (30 mL) dodata je 3-azetidin-3-ol hidrogenhloridna so (1.3 g, 11.8 mmol), CS2CO3(9.5 g, 29.2 mmol), Cul (446 mg, 2.3 mmol) i L-prolin (540 mg, 4.7 mmol) i zatim je smeša zagrevana na 90°C u trajanju od 18 časova pod atmosferom argona. Rastvor je razblažen sa EA i vodom i organski sloj je ispran fiziološkim rastvorom tri puta, koncentrovan pod sniženim pritiskom i prečišćen pomoću CC (PE/EA = 2:1) da bi se dobilo jedinjenje 3a (1.6 g, 66%) kao žuta čvrsta supstanca.

Korak 2: Metil 3-( 3- oksoazetidin- l - ipbenzoat ( 3)

1011 OJU rastvor jedinjenja3a(1.60 g, 7.7 mmol) u suvom DCM (30 mL) dodat je Dess-Martin perjodinan (6.5 g, 15.4 mmol) na 0°C i smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 časa pod atmsoferom N2. Smeša je ugašena sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i razbiažena sa EA. Organski deo je ispran fiziološkim rastvorom, sušen preko Na2S04, filtriran, koncentrovan pod sniženim pritiskom i prečišćen pomoću CC (PE/EA = 4:1) da bi se dobilo jedinjenje 3 (1.2 g, 75%) kao bela čvrsta supstanca.

Primer 4j3-(( ls, 3s)- 3-( 2- Hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofenil) izoksazol- 4-

il) metoksi) f' enil)- 3- hidroksiciklobutil)- N-( meti] sulfonil) benzamid( 4)

101111

[0112|U rastvor jedinjenja 2 (100 mg, 0.17 mmol) u DCM (5 mL) dodati su EDCfHCl (100 mg, 0.52 mmol), DMAP (100 mg, 0.81 mmol) i MeS02NH2(40 mg, 0.42 mmol). Smeša je mešana na 30°C preko noći i zatim razbiažena sa EA i isprana sa H20, fiziološkim rastvorom i sušena preko Na2S04. Koncentrovanje pod vakuumom i prečišćavanje pomoću prep-TLC dalo je sirovo ciljno jedinjenje kao svetio žutu Čvrstu supstancu. RP-HPLC prečišćavanje dalo je jedinjenje iz naslova 4 (38 mg, 33%) kao belu čvrstu supstancu. 'H NMR (400 MHz, CD3OD) 5: 7.87 (s, IH). 7.74 (d. J = 7.6 Hz. IH). 7.61-7.53 (m, 4H), 7.50-7.46 (m, 2H), 6.91 (d, J = 2.4 Hz, IH), 6.80 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, IH), 4.95 (s, 2H), 3.38(s, 3H), 3.30-3.26 (m, 2H), 3.01 (m, IH), 2.57-2.51 (m, 2H), 2.37 (m. IH). 1.25-1.23 (m, 4H). MS (ES1-) m/z: 659

Primer5: 3-( 3-( 2- Hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofenil) izoksazol- 4- il) metoksi) fenil)- 3-

hidroksiciklobutil) benzensulfonamid ( 5)

[0113|

Korak 1: 3-( 3-( Benziltio) fcnil)- 1 -( 2- hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2. 6- dihlorofeninizoksazol- 4-

il) metoksi) fenil) ciklobutanol ( 5a)

[0114]U rastvor jedinjenja 2b (619 mg, 1 mmol) u toluenu (20 mL) pod atmosferom argona dodati su K2C03(276 mg, 2 mmol), fenilmetantiol (125 mg, 1 mmol), Pd2(dba)3 (200 mg, 0. 22 mmol) i Xantphos (75 mg, 0.16 mmol). Zatim je smeša mešana na 115°C u trajanju od 4 Časa. Posle hlađenja do sobne temperature, reakcija je razbiažena vodom (100 mL) i ekstrahovana sa EA (100 mL X 2). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom (100 mL X 2), sušeni preko Na2S04i koncentrovani do sušenja. Prečišćavanje pomoću CC dalo je jedinjenje 5a (200 mg; 30%) kao svetio žutu čvrstu supstancu. 'H NMR (400 MHz, COCl3) 6: 7.36-7.32 (m, 3H), 7.28-7.07 (m, 9H), 7.01 (d, J = 7.2 Hz, IH), 6.82 (d, J = 2.0 Hz, IH), 6.66 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, IH), 4.75 (s, 2H), 4.04 (s, 2H). 3.06-3.00 (m. 2H), 2.84-2.78 (m, 2H), 2.44-2.38 (m, 3H), 2.09 (m, IH), 1.24-1.18 (m, 2H), 1.11-1.08 (m, 2H). MS (ESI+) m/z: 662 [M+lf.

Korak 2: 3-( 3-( 2- Hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2. 6- dihlorofenil) izoksazol- 4- il) metoksi) fenil)- 3-

hidroksiciklobutil) benzen- l- sulfonil hlorid( 5b)

[0115|U rastvor jedinjenja 5a (34 mg, 0.05 mmol) u CH3CN/HOAc/H20 (1 mU37 uL/25 uL) dodat je 2,4-dihloro-5,5-dimetilhidantion (20 mg, 0.1 mmol). Smeša je mešana na 0-5°C u trajanju od 2 časa. Reakcija je razbiažena vodom i ekstrahovana sa CH2C12. Kombinovani organski slojevi su isprani sa 5% rastvorom NaHC03, fiziološkim rastvorom i sušeni preko Na2S04. Koncentrovanje do sušenja dalo je sirovi proizvod5b(30 mg) kao bezbojno ulje, koje je korišćeno direktno u sledećem koraku.

Korak 3: 3-( 3-( 2- Hloro- 4-(( 5- cik] opropil- 3-( 2, 6- dihlorotenil) izoksa/ ;ol- 4- il) irietoksi) feni])- 3-

hidroksiciklobutiObenzensulfonamid ( 5)

|01I6] U rastvor jedinjenja 5b (30 mg) u CH3CN (2 mL) dodat jc NH4OH (0.3 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 časa. Koncentrovanje do sušenja i prečišćavanje pomoću prcp. RP-HPLC dalo je jedinjenje iz naslova 5 (3.5 mg, 10% u dva koraka) kao belu čvrstu supstancu. 'H NMR (400 MHz, CDC13) 6: 7.85 (s. IH). 7.77 (d. J = 7.6 Hz. 111), 7.54-7.41 (m, 5H), 7.35 (d, J = 8.4 Hz, IH), 6.90 (s. IH), 6.75 (d. J = 8.4 Hz, IH). 4.83 (s. 2H), 4.77 (s, broad, 2H), 3.20 (t, J = 10.4 Hz, 2H), 3.04 (m, IH), 2.58 (t, J = 10.6 Hz, 2H), 2.17 (m, IH), 1.31-1.30 (m, 2H), 1.20-1.16 (m, 2H). MS (ESI")m/z: 617 [M-!]\

Primer 6: 1 -(2-Hloro-4-((5-ciklopropil-3-(2,6-dihlorofenil)izoksazol-4-il)mctoksi)fenil)-3-(3-(metilsulfonil)fenil)ciklobutanol (6)

[01171

|0118]U rastvor jedinjenja2b(200 mg, 0.32 mmol) u DMSO, dodati su natrijum metansulfinat (50 mg, 0.46 mmol), Cul (20 mg, 0.1 mmol), L prolin (37 mg, 0.32 mmol) i diizopropilctilamin (DIEA) (41 mg, 0.32 mmol). Smeša je mešana na 95°C preko noći i zatim razbiažena vodom i eksrahovana sa EA. Kombinovani organski slojevi su isprani vodom i sušeni preko Na2S04. Koncentrovanje do sušenja pod sniženim pritiskom i prečišćavanje pomoću prep. RP-HPLC dali su jedinjenje iz naslova 6 kao belu čvrstu supstancu (35 mg, 21%, jedan izomer pomoću<]>H NMR u LC-MS). 'h NMR (400 MHz, CDC13) 5: 7.84 (s. III). 7.79 (d, J = 7.6 Hz, IH), 7.60 (d, J = 7.6 Hz, IH), 7.53 (t, J = 7.6 Hz, IH), 7.44-7.41 (m, 3H), 7.34 (t, J = 7.2 Hz, IH), 6.90 (d, J - 2.8 Hz, IH), 6.75 (dd. J = 8.4, 2.0 Hz, IH), 4.83 (s. 2H), 3.24-3.19 (m, 2H), 3.08-3.04 (m, 4H), 2.62-2.56 (m, 2H). 2.17 (m, IH), 1.31-1.29 (m, 2H), 1.20-1.16 (m, 2H). MS (ESI+) m/z: 618 (620) [M+l]\ 600 (602) [M-H20+1]<+>.

Primer7: Metil 5-(( ls, 3s)- 3-( 2- hloro- 4-(( 5- cik:lopropil- 3-( 2. 6- dihlorofenil) izoksazol- 4-

il) metoksi) fenil)- 3- hidroksiciklobutil)- l- izoprQpil- l H- pirazol- 34tarboksilat ( 7)

[0119|

Korak 1: Metil l- izopropil- 5- vinil- l//- pirazol- 34tarboksilat( 7a)

[0120]Suspenzija metiltrifeniifosfonijum bromida (2.69 g, 7.52 mmol) u suvom THF (40 mL) je hlađena do -78°C i ukapavanjem je dodat n-butil litijum (1.6 M rastvor u heksanu, 3.7 mL, 5.91 mmol). Žuto-narandžasta suspenzija je mešana na -78°C u trajanju od 50 min i zatim je ukapavanjem dodavan rastvor metil 5-tbrmil-l-izopropiLl//-pirazol-3-karboksilata (pripremljen kao što je opisano u VVO 2011/020615, 1.05 g, 5.37 mmol) u suvom THF (10 mL). Smeša je mešana na -78°C u trajanju od 1.75 časova, kupatilo za hlađenje je uklonjeno i smeša (beličasta suspenzija) je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 časa. Smeša je zatim podeljena između razblaženog vođenog rastvora NaHCO?(150 mL) i EA (150 mL). Vodeni sloj je eksirahovan dva puta sa EA (po 50 mL) i kombinovani organski sloj je ispran dva puta vodom (po 50 mL) i koncentrovan bez sušenja da bi se dobilo 2.74 g žutog ulja koje sporo kristalizuje. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću CC (preadsorpcija sa CHtCL, heksan/EA 4:1) da bi se dobio alken 7a (590 mg, 57%) kao bezbojno ulje.<!>H NMR (DMSO-d6) 6: 7.02 (s, IH). 6.87 (dd. J = 17.3. 11.2 Hz. IH). 5.94 (dd. J = 17.3, 1.3 Hz, IH), 5.45 (dd, J = 11.2, 1.3 Hz, IH), 4.80 (sept, J = 6.6 Hz, IH). 3.79 (s, 3H), 1.38 (d, J = 6.6 Hz. 6H). C,oH|4N202(194.23). LC-MS (ESI): 195 [M+H]<+>.

Korak 2: Metil l- izopropil- 5-( 3- oksociklobutil)- l/^- pirazol- S- karboksilat( 7b)

[0121|Reakcija je izvedena u dve suve hermetički zatvorene epruvete (dve serije iste količine). Serije su kombinovane sa obradu i prečišćavanje. Postupak sa jednom serijom: U rastvor 7V,/V-dimetilacetamida (0.22 mL, 2.34 mmol) u 1,2-dihloroetanu (12 mL) pod azotom

na - 15 do -20°C ukapavanjem je dodat anhidrid trifluorometansulfonskc kiseline (0.43 mL, 2.57 mmol), formirajući neprozirnu suspenziju. Smeša je mešana na -15°C u trajanju od 10 min, i rastvor alkena 7a (151 mg, 0.78 mmol) i sim. kolidina (0.42 mL, 3.12 mmol) u 1,2-dihloroetanu (3 mL) je dodat ukapavanjem (formiran je žuti rastvor). Po završetku dodavanja kupatilo za hlađenje je uklonjeno, smeša je ostavljena da se zagreva do sobne temperature (narandžasti mutan rastvor) i epruveta za je hermetički zatvorena. Smeša je zatim mešana na 90°C u trajanju od 15 časova (braon smeše). Voda (5 mL) je dodata na sobnoj temperaturi i smeše su mešane na 100°C u trajanju od 2 časa (mutni dvo-fazni rastvori). Posle hlađenja do sobne temperature, smeše su kombinovane i pođeljene između razblaženog vodenog rastvora NaHCO.i i CLLCb i vodeni sloj je ekstrahovan tri puta sa CH^CL (po 30 mL). Kombinovani orgasnki sloj je sušen (Na2S04), filtriran i koncentrovan da bi se dobilo braon ulje (2.2 g). Prečišćavanje pomoću CC (6 X 13 cm, preadsorpcija sa CLLCL, toluen/EA 3:1) dalo je ciklobutanon 7b (115.5 mg, 31%) kao žuto ulje. 'H NMR (DMSO-d6) 5: 6.81 (s. IH). 4.58 (sept, J = 6.5 Hz, IH), 3.78 (s, 3H), 3.85-3.73 (m, IH), 3.59-3.45 (m, 2H), 3.37-3.24 (m, 2H, delimiČno preklopljen signalom vode), 1.39 (d, J = 6.6 Hz, 6H). C^Hi^NiOj(236.27). LC-MS (ESI): 237 [M+H]+.

Korak 3: Metil 5-(( ls, 3s)- 3-( 2- hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofenil) izoksazol- 4-

il) metoksi) feniI)- 3- hidroksiciklobutil)- 1 - izopropil- 1 H- pirazol 3 karboksilat ( 7)

[0122J Rastvor bromida la (368 mg, 0.78 mmol) u suvom THF (6 mL) je hlađen do -78°C i ukapavanjem je dodavan 1.6M rastvor »-butil litijuma u heksanima (0.48 mL, 0.76 mmol). Smeša je mešana na -78°C u trajanju od 20 min i ukapavanjem je dodavan rastvor ciklobutanona 7b (164 mg, 0.69 mmol) u suvom THF (4 mL). Smeša je mešana na -78°C u trajanju od 2.5 časa i ukapavanjem je dodavan zasićeni vodeni rastvor NH4CI (1 mL) na ovoj temperaturi. Kupatilo za hlađenje je uklonjeno i smeša je ostavljena da se zagreva do sobne temperature i mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 0.5 časa. Smeša je zatim dodata u razblaženi vodeni rastvor NH4C1 i ekstrahovana tri puta sa EA. Kombinovani organski sloj je sušen (Na2S04), filtriran i koncentrovan da bi se dobilo 516 mg skoro bezbojnog ulja. Prečišćavanje pomoću CC (4.5x23 cm, preadsorpcija sa CILCL, cluent heksan/aceton = 2:1) dalo je obnovljeni ciklobutanon 7b (31.3 mg, 19%, svetio žuto ulje) i nečisti proizvod (333 mg). Ponovno prečišćavanje pomoću CC (4 X 22 cm. heksan/EA = 1:1) ili prep-TLC dalo je lčisti proizvod 7 (210 mg, 48%) kao belu penu. 'H NMR (DMSOd6) 6: 7.65 (d. J = 2.1 I Iz. IH), 7.62 (s, IH), 7.59-7.48 (m, 2H), 6.92 (d, J = 2.4 Hz, IH), 6.76 (đd, J = 8.6, 2.6 Hz, IH),

6.66 (s, IH), 5.49 (s. IH), 4.92 (s, 2H), 4.42 (quint-like m. J = 6.5 Hz, 1H). 3.78 (s, 3H), 3.24-3.11 (m, 2H, dclimično preklopljen signalom vode), 3.04-2.90 (m, IH), 2.54-2.33 (m, 3H. đelimično preklopljen signalom DMSO), 1.32 (d, J = 6.5 Hz, 6H). 1.26-1.08 (m. 4H). C31H30CI3N3OS (630.95). LC-MS (ESI): 630, 632 [M+H]\

Primer 8:5-(( ls. 3s)- 3-( 2- Hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2. 6- dihIorofenil) izoksazol- 4-

iI) metoksi) fenil)- 3- hidroksiciklobutiI)- l- izopropil- lH- pirazol- 3- karboksilna kiselina( 8)

|0123I

|0124]Estar 7 (98.3 mg, 0.156 mmol) je rastvoren u smeši THF (7.5 mL), MeOH (2.5 mL) i vode (2.5 mL) i dodat je LiOHH20 (65 mg, 1.56 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 18 Časova. Smeša je podeljena između razblaženog vodenog rastvora NH4C1 i EA i organski sloj je ispran jednom vodom. Kombinovani vodeni sloj je ekstrahovan dva puta sa EA. Kombinovani organski sloj je sušen (Na2S04), filtriran i koncentrovan da bi se dobilo 103 mg skoro bele Čvrste supstance. Proizvod je prečišćen pomoću CC (333.5 cm, EA/EtOH = 10:1 do 1:4) da bi se dobilo 8 (94.8 mg, 99%) kao bela čvrsta supstanca. 'H NMR (DMSO-d6) S: 7.66-7.60 (m, IH), 7.62 (s, IH), 7.59-7.49 (m, 2H), 6.91 (d, J = 2.5 Hz, IH), 6.76 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, IH), 6.38 (s, IH). 5.51 (s, IH, zamenljiv sa D20), 4.92 (s, 2H), 4.31 (kao kvinta m, J = 6.5 Hz, IH), 3.25-3.08 (m, 2H, đelimično preklopljen signalom vode), 2.93-2.77 (m, IH), 2.57-2.43 (m, IH, sakriven signalom DMSO), 2.43-2.29 (m, 2H, đelimično preklopljen signalom DMSO), 1.29 (d, J = 6.5 Hz, 6H), 1.26-1.08 (m, 4H). C02H signal se ne javlja u spektru. C3uH28Cl3N30s (616.92). LC-MS (ESI): 616,618 [M+H]'.

Alternativan put do Primera 8

Korak 1: l-( 3- Metilenciklobutil) etanon ( 8a)

[0125|Metilen ciklobutan karbonitril (5.0 g, 53.7 mmol) je rastvoren u suvom dietiletru (25 mL), hlađen u ledenom kupatilu i ukapavanjem je dodat MeMgBr (26.8 mL. 80.5 mmol, 3 M u etru). Smeša je ostavljena da se meša preko noći na sobnoj temperaturi, hlađena do 0°C. pažljivo ugašena sa 15% vodenim rastvorom NaHS04(100 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 min. i slojevi su odvojeni. Vodena faza je ekstrahovana sa pentanom (50 mL) i dietiletrom (50 mL). Kombinovani organski slojevi su isprani fiziološkim rastvorom i sušeni preko Na2S04. Rastvarači su uklonjeni pod vakuumom na sobnoj temperaturi i sirovi proizvod je dobijen kao žućkasta čvrsta supstanca.

Korak 2: Etil 4-( 3- metilenciklobutil)- 2, 4- dioksobutanoat( 8b)

[0126JNatrijum (1.15 g, 49.9 mmol) je rastvoren u suvom EtOH (30 mL. denaturisan sa 5% dietiletrom). Jedinjenje8a(5.5 g, 49.9 mmol, sirov) je rastvoreno u suvom EtOH (45 mL) i dodat je gore pripremljen rastvor natrijum etoksida. Ova smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 15 min i zatim je ukapavanjem dodat dictil oksalat (6.8 mL, 49.9 mmol). Reakciona smeša je postavljena u prethodno zagrejano (do 67°C) uljano kupatilo i mešana na ovoj temperaturi u trajanju od 4.5 časa. Smeša je ostavljena na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvarač je uklonjen, dodati su EA (100 mL) i 1 M HC1 (70 mL) i organska faza je odvojena. Vodena faza je ponovo ekstrahovana sa EA (50 mL). Kombinovane organske faze su isprane vođom, fiziološkim rastvorom i sušene preko anhidrovanog Na2S04. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i ostatak je prečišćen na silika gelu upotrebom heksana/MTBE 9:1 kao eluenta dajući čist proizvod 8b. Prinos: 6.29 g, 56% u dva koraka.

'H-NIV1R (CDCI3), 8 (ppm): 6.36 (s, IH), 4.85-4.80 (m, 2H), 4.34 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 3.35-3.25 (m, 1H), 3.05-2.85 (m, 4H), 1.36 (t, J = 8.0 Hz, 3H).

Korak 3: Etill- izopropil- 5-( 3- metilenciklobutil)- l//- pirazol- 3- karboksilat ( 8c)

10127jJedinjenje8b(6.29 g, 29.9 mmol) je rastvoreno u suvom EtOH (65 mL, denaturisan sa 5% MeOH) i dodat je izopropil hidrazin hidrohlorid (3.97 g, 35.9 mmol). Reakciona smešaje mešana u trajanju od 3 časa na sobnoj temperaturi. Rastvarač je uklonjen i u uljani ostatak redom su dodavani EA (100 mL), voda (50 mL) i zasićeni NaHCO^(50 mL). Slojevi su odvojeni i vodena faza je ponovo ekstrahovana sa EA (50 mL). Kombinovane organske faze su isprane fiziološkim rastvorom (70 mL) i sušene preko anhidrovanog Na2S04. Rastvarač je uklonjen pod vakuumom i ostatak je sušen pod sniženim pritiskom. Prinos: 7.23 g (sadrži

3.4% EtOAc pomoću NMR, ponovo izračunat čisti prinos: 6.98 g, 94%). Sirovi proizvod 8c je 98% čist pomoću HPLC i NMR. 'H-NMR (CDCb). 6 (ppm): 6.62 {s. IH). 4.88-4.82 (m, 2H), 4.42-4.32 (m, 3H), 3.56-3.45 (m, IH). 3.17-3.07 (m, 2H). 2.88-2.79 (m, 2H), 1.49 (d, J - 8.0 Hz, 6H), 1.37 (t, J = 8.0 Hz, 3H).

Korak 4: Etil l- izopropil- 5-( 3- oksociklobutil)- l//- pirazol- 3- karboksilat( 8d)

|0128|Jedinjenje 8c (6.45 g, 26.0 mmol) je rastvoreno u smeši MeCN (77 mL) i vode (13 mL) i hlađeno u ledenom kupatilu. U ovaj rastvor dodat je RuCl3XH20 (0.19 g, 0.86 mmol), a zatim je usledilo dodavanje u porcijama NaI04(19.35 g, 90.9 mmol). Egzoterma je zabeležena u toku ovog dodavanja. Dobijena gusta suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 45 min. Reakciona smeša je razbiažena vodenim rastvorom NaiS^Oi (10%, 260 mL), vodom (50 mL) i DCM (100 mL). Faze su odvojene i vođena faza je ekstrahovana sa DCM (2x70 mL). Kombinovane organske faze su isprane vodenim rastvorom Na^S^O} (10%, 50 mL), vodom (100 mL), fiziološkim rastvorom (100 mL) i sušene preko anhidrovanog Na2S04. Sirovi proizvod (6.5 g) je prečišćen na silika gelu, eluiranjem sa heksanima/MTBE da bi se dobio Čist proizvod kao ulje koje očvršćava usled čuvanja na - 20°C. Prinos: 5.8 g (78% u dva koraka). 1 H-NMR (DMSO-đ*). 5 (ppm): 6.78 (s, IH). 4.57 (h. J = 8.0 Hz, 1H), 4.26 (q. J = 8.0 Hz, 2H), 3.85-3.75 (m, 1H), 3.58-3.45 (m, 2H), 3.35-3.25 (m, 2H), 1.39 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 1.28 (t, J = 8.0 Hz, 3H).

Korak 5: 4-(( 4- Bromo- 3- hlorofenoksi) metil)- 5- ciklopropil- 3-( 2. 6- dih] orofenil) izoksazol ( 8e)

[012913-HIoro-4-bromofenol (3.8 g, 18.3 mmol) jc mešan sa (5-ciklopropil-3-(2,6-dihlorofenil)izoksazol-4-il)metanolom (3.47 g, 12.2 mmol) i trifenilfosfinom (6.41 g, 24.4 mmol) u toluenu (150 mL). Smeša je hlađena u ledenom kupatilu i ukapavanjem je dodat DIAD (4.8 mL, 24.4 mmol) kao rastvor u toluenu (10 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 21 časa i rastvarači su uklonjeni na rotavapu ostavljajući žuti uljasti ostatak. Ovo je rastvoreno u DCM (200 mL), dodat je silika gel (-20 g) i smeša je isparavana do sušenja. Ovaj materijal je sipan na vrh silika gel kolone i prečišćen eluiranjem sa heksanima/MTBE 9:1. Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, ostavljajući čist proizvod 8e kao bezbojno ulje koje kristališe posle sušenja pod vakuumom preko noći. Prinos: 5.07 g (88%).<l>H-NMR (CDC1-,). 5 (ppm): 7.45-

7.30 (m, 4H), 6.90 (s. IH), 6.60-6.55 (m. IH), 2.15-2.07 (m, IH). 1.32-1.25 (m, 2H), 1.20-1.1 I (m,2H).

Korak 6: Etil 5-(( ls, 3s)- 3-( 2- hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofcnil) izoksazol- 4-

il) metoksi) fenil)- 3- hidroksiciklobutil)- l - izopropil- l//- pirazol- 3- karboksilat ( 8f)

[0130| LiCl (0.684 g, 16.15 mmol) je rastvoren u THF (20 mL) na sobnoj temperaturi i dodat je /PrMgCl (2.0 M u THF, 8.1 mL. 16.15 mmol). Smeša je mešana 10 min na sobnoj temperaturi, hlađena u ledenom kupatilu i rastvor jedinjenja 8e (2.55 g. 5.38 mmol) u THF (20 mL) je dodavan tokom 5 min. Kupatilo za hlađenje je uklonjeno i smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 4 časa. Smeša je hlađena do -10°C i rastvor jedinjenja 8d (1.48 g, 5.92 mmol) u THF (16 mL) je brzo dodat. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 90 min. i zatim su dodati 0.5 M vodeni rastvor NaHS04(35 mL) i EA (50 mL). Dobijena smeša je mešana 10 min., slojevi su odvojeni i vodeni sloj je ekstrahovan sa EA (30 mL). Kombinovane organske faze su isprane vodenim rastvorom NaHCO^(50 mL), fiziološkim rastvorom (50 mL) i sušene preko anhidrovanog Na^SG^. Sirovi proizvod (3.79 g) je dobijen posle uklanjanja rastvarača kao bela pena. 3.6 g ovog sirovog proizvoda je prečišćeno na silika gel koloni, eluiranjem sa heksanima/EA 3:2 da bi se dobio čist proizvod 8f kao čvrsta pena. Prinos: 1.62 g (49%). 'H-NMR (DMSO-d6). 5 (ppm): 7.65-7.47 (m, 4H). 6.93.6.91 (m, IH), 6.79-6.72 (m, IH), 6.65 (s. IH). 5.48 (s, IH). 4.92 (s, 2H), 4.42 (h, J = 8.0 Hz, IH), 4.26 (q, J = 8.0 Hz, 2H). 3.32 (s, 2H), 3.22-3.14 (m, 2H), 3.05-2.90 (m, IH), 2.45-2.35 (m, 2H), 1.35-1.10 (m, 14H).

Korak 7j 5-(( ls. 3s)- 3-( 2- Hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofenil) izoksazol- 4-

il) metoksi) fenil)- 3- hidroksiciklobutiI)- l- izopropil- l//- pirazol- 3- karboksilna kiselina ( 8)

[0131]Jedinjenje 8f (1.60 g, 2.48 mmol) je rastvoreno u THF (100 mL), zatim su redom dodavani MeOH (50 mL), voda (50 mL) i LiOH X H20 (1.04 g, 24.8 mmol). Smeša je mešana 4.5 časa na sobnoj temperaturi i zatim konccntrovana pod sniženim pritiskom da bi se uklonio MeOH i THF. Preostali vodeni rastvor je zakišeljen dodavanjem 1 M vodenog rastvora HCI (24 mL) da bi se postigla pH od 4.05 (kontrola pomoću pH-elektrode). Već na približno pH 7 počeo je da se formira talog. Formirana čvrsta supstanca je ottiltrirana, isprana na filteru vodom i sušena pod vakuumom na sobnoj temperaturi da bi se dobio proizvod 8 kao beli prašak. Prinos: 1.40 g (92%).<f>H-NMR <CDC13). 6 (ppm): 7.44-7.32 (m, 4H), 6.91 (d, J = 4.0 Hz, IH), 6.78 (s, IH), 6.75 (dd, J - 4.0 Hz, J = 8.0 Hz. IH). 4.83 (s, 2H), 4.35-4.20 (m, IH), 3.25-3.14 (m, 2H), 3.04-2.90 (m, IH). 2.62-2.54 (m, 2H), 2.21-2.1 I (m. IH), 1.46 (d. J = 8.0 Hz, 6H), 1.34-1.28 (m,2H), 1.20-1.14 (m, 2H). nC-NMR (CDCl;,). 6 (ppm): 172.7. 164.8. 159.2, 158.4, 147.2, 141.3, 135.8. 134.1. 132.8. 131.3. 128.1. 127.6. 127.3. 117.7. 113.3. 110.0, 106.3, 73.1, 59.8, 51.1, 41.7, 22.6, 22.0, 8.5. 7.8. MS (ES1+) m/z: 616.4 [M+l]\

Primer8A: 5-(( lr, 3r)- 3-( 2- Hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihloroefnii) izok:sazo]- 4-

il) mctoksi) fenil)- 3- hidroksiciklobutil)- l- izopropil- l/-/- pirazol- 3- karboksilat ( 8A)

[0132|

|0133]Primer 8A može biti pripremljen podvrgavanjem sirovog proizvoda 8f hidrolizi estra kao što je opisano za 8 i izolacijom iz sirovog proizvoda 8 kao manji izomcr pomoću preparativne RP-HPLC. 1 H-NMR (CDC13). 5 (ppm): 7.42-7.30 (m. 2H), 7.1! (d, J = 8.0 Hz. IH), 6.75-6.65 (m, IH), 6.57 (s, IH), 4.79 (s, 2H), 4.50-4.41 (m, IH), 3.96-3.85 (m, IH), 2.98-2.90 (m, 2H), 2.67-2.57 (m, 2H), 2.20-2.09 (m, IH), 1.51 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 1.32-1.14 (m, 4H). I3C-NMR (CDCI3). 8 (ppm): 172.6, 166.2, 159.2, 158.4, 147.4, 141.2, 135.7. 134.6, 132.8, 131.3, 128.1, 127.7, 127.5, 116.8, 113.5, 110.0, 105.8, 75.1, 59.8, 51.2, 41.8, 25.4, 22.6, 8.5, 7.8. MS (ES1+) m/z: 616.3 [M+lf.[0134|Konfiguracija suprotnih atoma prstena glavnog izomera (jedinjenje 8) i manjeg izomera (jedinjenje 8A) je potvrđena pomoću NOE eksperimenata. Detektovani indikativni NOEs između protona su naznačene na sledećim slikama dvostrukim strelicama:

NOEs detektovani za Primer 8 sa f, 3- trans konfiguracijom . suprotnih atoma prstena

aromatičnih grupa

|0135)

NOEs detektovani za Primer 8A sa 1, 3- cis konfiguracijom suprotnih atoma prstena

aromatičnih grupa

Primer 9:Metil 6-( 3- f2- hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 216- dihlorofcnil) izoksazol- 4-

il) metoksi) fenil)- 3- hidroksiciklobutil)- l- metil- l//- indazol- 3- karboksilat( 9)

[0136)

Korak 1: Metil l- metil- 6- vinil- I//- indazol- 3- karboksilat ( 9a)

|0I37j U rastvor metil 6-bromo-l-metil-l//-indazol-3-karboksilata (60 mg, 0.22 mmol) u DMF (10 mL), dodat je tributil(vinil)kalaj (99 uL, 0.34 mmol). Pd(Ph.!)4 (11 mg, 9 umol). Postoje dodavanje završeno, smeša je mešana na 90°C u trajanju od 4 časa pod Ar. Zatim jc rastvarač uklonjen pod sniženim pritiskom. Prečišćavanje pomoću CC dalo jc jedinjenje 9a (52 mg, 88%).

Korak 2: Metil l- metil- 6-( 3- oksociklobutil)- l//- indazol- 3- karboksilat ( 9b)

[0138] Praćenjem postupka kao sto je opisan u Primeriu 7/Korak 2, jedinjenje 9b je dobijeno od 9a u prinosu od 57%. 'H NMR (400 MHz, CDCb) 6: 8.14 (d..1 = 8.4 Hz. IH). 7.31 (s. IH), 7.23 (d, J = 8.8 Hz, IH), 4.13 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 3.87-3.79 (m, IH), 3.58-3.51 (m, 2H), 3.33-3.26 (m, 2H). m/z: 259 [M+l]~.

Korak 3: Metil 6-( 3-( 2- hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2. 6- dihloroienil) izoksazol- 4-

il) metoksi) fenil)- 3- hidroksiciklobutil)- l- metil- 1 //- indazol- 3- karboksilat ( 9)

[0139] Praćenjem postupka kao sto je opisan u Primeru 7/Korak 3, jedinjenje 9 je dobijeno od 9b u prinosu od 40%.

Primer 10: 6-( 3-( 2- Hloro- 4-(( 5- ciklopropil- 3-( 2, 6- dihlorofenil) izoksazol- 4- il) metoksi) fenil)-3- hidroksiciklobutil)- l - metil- l//- indazol- 3- karboksilna kiselina ( 10)

|0140]

|0141|Praćenjem postupka kao što je opisan u Primeru 8, jedinjenje 10 je dobijeno od jedinjenja 9 u prinosu od 45% kao bela čvrsta supstanca. 'H NMR (400 MHz, CDCb) 6: 8.14 (d, J = 8.0 Hz, IH), 7.48 (d, J = 8.8 Hz, IH), 7.43-7.32 (m. 4H). 7.29 (m. IH). 6.92 (d, J = 2.4 Hz, IH), 6.76 (dd, J = 7.2 Hz, 2.4 Hz, IH), 4.84 (s. 2H), 4.18 (s, 3H), 3.45-3.40 (m, IH). 3.28-3.23 (m, 2H), 3.19-3.10 (m, IH), 2.68-2.63 (m, 2H), 2.21-2.14 (m, IH), 1.33-1.29 (m, 2H), 1.20-1.15 (m, 2H). m/z: 638 [M+1]\

Preparativni Primer 11

|0142]

Korak 1: Metil 5-( 3- hidroksiazetidin- l- il) nikotinat( 11a)

[0143]Smeša metil 5-bromonikotinata (2.00 g, 9.26 mmol), azetidin-3-oia (1.01 g, 9.26 mmol), Cs2CO, (9.06 g, 27.8 mmol), BINAP (1.15 g, 1.85 mmol) i Pd(OAc)2(0.44 g, 1.85 mmol) u suvom dioksanu (115 mL) je zagrevana preko noći na 85°C pod atmosferom N2. Dobijena smeša je filtrirana, koncentrovana pod sniženim pritiskom i prečišćena pomoću prep-HPLC da bi se dobilo jedinjenje11a(250 mg, 13%) kao žuta čvrsta supstanca.

Korak 2: Metil 5-( 3- oksoazetidin- l- il) nikotinat( 11)

[0144|U rastvor jedinjenja11a(250 mg, 1.20 mmol) u suvom DCM (15 mL) dodat je Dess-Martin perjodinan (1.014 g, 2.40 mmol) na 0°C pod atmosferom N2i rastvor je mešan na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 časa. Dobijeni rastvor je ugašen zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata i razblažen sa EA. Organski deo je ispran fiziološkim rastvorom, sušen preko Na2S04, filtriran, koncentrovan pod sniženim pritiskom i prečišćen pomoću CC (DCM/MeOH = 150:1) da bi se dobilo jedinjenje II (140 mg, 57%) kao žuta čvrsta supstanca.

Preparativni Primer 12

|0145jUpotrebom sličnog postupka kao što je onaj opisan u Preparativnom Primeru 11 pripremlj eno j e s ledeće jedinjenje:

Primer13/ 1do13/ 9

[0146]Sledeća tabela navodi dodatne primere pripremljene prema gore navedenim preparativnim primerima i primerima. Sva navedena jedinjenja su pripremljena kao pojedinačni izomeri.

Primer14/ 1 i 14/ 2

[0147]Upotrebom sličnog postupka kao šio je opisan u Primerima 1 do 13 i Šemama u prethodnom tekstu, sledeća jedinjenja su dobijcna upotrebom odgovarajućih gradivnih blokova.

[0148]Sledeće jedinjenje može biti pripremljeno na isti način upotrebom sličnih postupaka kao što su opisani u prethodnom tekstu:

Analize

Analiza aktivnosti pomoću FRET

10149)Određivanje Ugandom posredovane interakcije kofaktora-peptida radi kvantitativnog određivanja vezivanja liganda za jedarni receptor FXR izvedeno je na sledeći način: Priprema humanog FXR alfa ligand-vezujućeg domena: Humani FXRalfa LBD je eksprimiran uE. colisoju BL2I(DE3) kao N-terminalno GST obeležen fuzioni protein. DNK koja kodira FXR liganđ-vezujući domen je klonirana u vektor pDESTIS (Invitrogen). Ekspresija je bila pod kontrolom IPTG inducibilnog T7 promotora. Aminokiselinske granice ligand-vezujućeg domena bile su aminokiseline 187-472, fajla baze podataka NM 005123 (RefSekv.). Ekspresija i prečišćavanje FXR-LBD: Prekonoćna pre-kultura transformisanogE. colisoja je razbiažena 1:20 u LB-Ampicilin medijumu i gajena na 30°C do optičke gustine od ODf,ffl)=0.4-0.6. Genska ekspresija je zatim indukovana dodavanjem 0.5 mM IPTG. Ćelije su

inkubirane dodatnih 6 časova na 30°C\ 180 rpm. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem (7000 x g, 7 min, sobna temperatura). Po litru originalne ćelijske kulture, ćelije su resuspendovane u 10 mL pufera za lizu (50 mM glukoza, 50 mM Tris pH 7.9, 1 mM EDTA i 4 iiig/mL lizozima) i ostavljene na ledu u trajanju od 30 min. Ćelije su zatim podvrgnute ultrazvučnoj obradi i ćelijski ostaci su uklonjeni centrifugiranjem (22000 x g, 30 min. 4°C). Na 10 mL supernatanta dodato je 0.5 mL suspenzije prethodno isprane glutationsefaroz.e 4B (Qiagen) i suspenzija je održavana sporom rotacijom u trajanju od 1 časa na 4°C. Granule glutationsefaroze 4B su peletirane centrifugiranjem (2000 x g, 15 sek.. 4°C) i isprane dva puta u puferu za ispiranje (25 mM Tris, 50 mM KCl, 4 mM MgCh i IM NaCl). Pelct je rcsuspendovan u 3 mL pufera za eluiranje po litru originalne kulture (pufer za eluiranje: 20 mM Tris. 60 mM KCl, 5 mM MgCL i 80 mM glutationa dodato neposredno pre upotrebe kao prašak). Suspenzija je ostavljena da se rotira u trajanju od 15 min na 4°C, granule su peletirane i eluirane ponovo sa polovinom zapreminc pufera za eluiranje u odnosu na prvi put. Eluati su sakupljeni i dijalizirani preko noći u 20 mM Hepes pufera (pH 7.5) koji sadrži 60 mM KG, 5 mM MgCl?kao i 1 mM ditiotreitol i 10% (zapr./zapr.) glicerola. Protein je analiziran pomoću SDS-Page.

[0150|Postupak meri sposobnost prepostavijenih liganada da moduliraju interakciju između prečišćenog bakterijskog eksprimiranog FXR ligand-vezujućeg domena (LBD) i sintetičkog biotinilovanog peptida na osnovu ostataka 676-700 iz SRC-1 (LCD2, 676-700). Sekvenca peptida koja je korišćena bila je B-CPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSPS-COOH gde je N-terminus bio biotinilovan (B). Ligand-vezujući domen (LBD) FXR-a jc eksprimiran kao fuzioni protein sa GST u BL-21 ćelijama upotrebom vektora pDEST15. Ćelije su lizirane ultrazvučnom obradom, i fuzioni proteini su prečišćeni preko glutation sefaroze (Pharmacia) prema uputstvima proizvođača. Za skrining jedinjenja za njihov uticaj na interakaciju FXR-peptida, korišćena je Perkin Elmer LANCE tehnologija. Ovaj postupak se zasnovan na prenosu energije zavisnom od vezivanja od donora do akceptora fluorofora vezanog za vezujućeg partnera od interesa. Radi lakoće rukovanja i oduzimanja pozadine od fluorescencije jedinjenja, LANCE tehnologija koristi genetičke flurofor obeleživače i vremenski razloženu detekciju. Analize su izvedene u krajnjoj zapremini od 25 pL u 384 - komornoj ploči, u puferu na bazi Tris-a (20 mM Tris-HCl pH 7.5; 60 mM KC3, 5 mM MgCh;

35 ng/p.L BSA), koji sadrži 20-60 ng/komorici rekombinantno eksprimiranog FXR-LBD fuzionisanog sa GST, 200-600 nM N-terminalno biotinilovanog peptida, predstavljajući SRC1 aminokiseline 676-700, 200 ng/komorici Streptavidin-xlAPC konjugata (Prozvme) i 6-10 ng/komorici Eu W1024 - antiGST (Perkin Elmer). Sadržaj DMSO u uzorcima je održavan

na 1%. Posle generisanja mešavine za analizu i razblaživanja potencijalno FXR modulirajućih liganada, analiza je ekvilibrisana u trajanju od 1 časa u mraku na sobnoj temperaturi u crnim 384-komornim FIA-pločama (Grciner). LANCE signal je detektovan pomoću Perkin Elmer VICTOR2VTM Multilabel Countcr. Rezultati su vizuaiizovani putem nanošenja na grafikon odnosa između emitovane svetlosti na 665 i 615 nm. Bazalni nivo formiranja FXR-peptida je zabeležen u odsustvu dodatog liganda. Ligandi koji stimulišu formiranje kompleksa indukuju od koncentracije zavisno povećanje u vremenski razloženom fluorescentnom signalu. Jedinjenja koja se jednako dobro vezuju kako za monomerni FXR tako i za FXR-peptid kompleks očekivalo bi se da ne daju pramenu u signalu, dok bi se očekivalo da ligandi koji sc prvenstveno vezuju za monomerni receptor indukuju od koncentracije zavisno smanjenje u zabeleženom signalu.[01511Da bi se procenio inhibitorni potencijal jedinjenja, EC^ vrednosti su određene za primer jedinjenja kako je navedeno u daljem tekstu u Tabeli 1 (A = ECw < 25 nM; B = 255ECM < 100 nM; C = EC50 > 100 nM).

Jednohibridna analiza ćelija sisara (MIN)

[01521Određivanje Ugandom posredovane transaktivacije pod upravljanjem promotora Gal4 radi kvantitativnog određivanje aktivacije FXR posredovane preko vezivanja liganda izvedeno je na sledeći način: cDNK deo koji kodira ligand-vezujući domen FXR je kloniran u vektor pCMV-BD (Stratagene) kao fuzija sa kvaščevim GAL4 DNK-vezujućim domenom pod kontrolom CMV promotora. Aminokielinske granice ligand-vezujućeg domena bile su aminokiseline 187-472, fajla baze podataka NM 005123 (RefSekv.). Plazmid pFR-Luc (Stratagene) je korišćen kao reporterski plazmid, koji sadrži sintetički promotor sa pet tandem ponovaka kvaščevih GAL4 vezujućih mesta, koji kontroliše eskpresiju gena luciferaze Photinus pvralis (američki svilac) kao reporter gen. U cilju poboljšanja eksperimentalne tačnosti plazmid pRL-CMV (Promega) je kotransficiran. pRL-CMV sadrži konstitutivni CMV promotor, kontroliše ekspresiju luciferaze Renilla renifonnis. Sve analize sa Gal4

reporter genom izvedene su u HEK293 ćelijama (đobijene iz DSMZ, Braunschvveig, Germanv) gajenim u MEM sa L-Giutaminom i Earle-ovim BSS dopunjenim sa 10% fetusnim telećim serumom, 0.1 mM ne-esencijalnim aminokiselinama, 1 mM natrijum piruvatom i 100 jedinica penicilina/streptavidina po mL na 37°C u 5% COt. Medijum i suplementi su dobijeni iz Invitrogcn. Za analizu, 5 x 105 ćelija jc postavljeno po komorici u 96-komorne ploče u 100 uL po komorici MEM bez fenol crvenog i L-Glutamina i sa Earle-ovim BSS dopunjenim sa 10% uglja/dekstrana tretiranim FBS (HvClone, South Logan, Utah), 0.1 mM ne-esencijalnim aminokiselinama, 2 mM glutaminom, 1 mM natrijum piruvatom i 100 jedinica penicilina/ streptavidina po mL, inkubirano na 37°C u 5% C02. Sledećeg dana ćelije su bile<>>90% konfluentne. Medijum je uklonjen i ćelije su prolazno transficirane upotrebom 20 uL po komorici OptiMEM - transfekcionog reagensa na bazi polietilenimina {OptiMEM, Invitrogcn; Polvetileneimine. Aldrich kat. br. 40,827-7) uključujući tri plazmida opisana u prethodnom tekstu. MEM sa istim sastavom kao što jc korišćen za postavljanje ćelija na ploču dodat je 2-4 časa posle dodavanja transfekcione smeše. Zatim su dodati stokovi rastvora jedinjenja. prethodno razblaženog u MEM (krajnja koncentracija nosača ne prelazi 0.1%). Ćelije su inkubirane dodatnih 16 časova pre nego što su merene aktivnosti luciferaze svica i Renilla-e sekvencijalno u istom ćelijskom ekstraktu upotrebom Dual-Light sistema za analizu luciferaze {Dyer et al., Anal. Biochem. 2000, 282, 158-161). Svi eksperimenti su izvedeni u tri ponavljanja.

[0153]Da bi se ocenila sposobnost primera jedinjenja za agonističku potenciju prema FXR, opsezi potencije određeni su u analizi M1 H kao što je navedeno u daljem tekstu u Tabeli 2 (A = EC5(,<<>25 nM; B = 25 nM EC5() < 100 nM; C = EC5„ > 100 nM).

Analiza rastvorljivosti u vodi

[0154]Rastvorljivost u vodi u PBS, pH 7.4 određivana je na sleđeći način. 10 mM stok rastvor jedinjenja u DMSO dodat je u PBS (pH 7.4) da bi sc postigla teorijska krajnja koncentracija od 200 uM. Dobijeni rastvor/suspenzija je mućkan/mućkana na 1250 rpm 1 čas i zatim čuvan/čuvana u mraku na sobnoj temperaturi u trajanju od 23 časa. U ovo vreme sav talog je odvojen od rastvora centrifugiranjem na 3900 rpm u trajanju od 30 min. Rastvorljivost u vodi jc određivana poredenjem površine pika glavnog pika u kalibracionom standardu (200 uM) u organskom rastvaraču (metanol/vida 60:40. zapr./zapr.) sa površinom pika odgovarajućeg pika u uzorku pufera. Kao postupak za detekciju korišćen je HPLC-UV/VIS na 230 nm.

Analiza prodiranja kroz paralelnu veštaeku membranu (PAMPA)

[0155]Za PAMPA. 5 mM stok rastvori test jedinjenja pripremljeni su u DMSO. 5 mM stok rastvori referentnih jedinjenja pripremljeni su u EtOH (karbamazepin, guanabenz) ili u EtOH:H20 1:1 (zapr./zapr.) (eeftriakson), respektivno. Jedinjenja su razbiažena u PBS (pH 7.4) da bi se dobili početni rastvori koji sadrže 5% odgovarajućeg organskog rastvarača i 250 uM referentnih jedinjenja ili 10 uM test jedinjenja, respektivno. Za analizu, korišćen je modifikovani postupak PAMPA kao što su opisali Kansy et al. (J. Med. Chem. 1998, 41. 1007). Referentna jedinjenja za nisko (eeftriakson). srednje (guanabenz) i visoko prodiranje (karbamazepin) uključena su kao interne kontrole. [0156|Eksperimenti prodiranja izvedeni su u Multiscreen 96-komornoj ploči (donor) pokrivenoj sa 96-komornim Multiscreen Immobilon (akceptor). Hidrofobni filterski materijal Immobilon ploče je prethodno ovlažen sa 70% etanolom i tretiran rastvorom lipida (lecitin rastvoren u dodekanu). Donorska ploča je napunjena test jedinjenjima i referentnim jedinjenjima i obe ploče su umetnute jedna u drugu i postavljene na orbitalnu mućkalicu u trajanju od 15 min na 100 rpm. Ispitivanje prenosa je započeto nanošenjem 150 uL PBS-pufera koji sadrži test i referentna jedinjenja na donorsku ploču. Posle 15-16 časova difuzije na sobnoj temperaturi, sadržaj akceptorne i donorske ploče jc sakupljen i kvantitativno određen upotrebom LC/MS-detekcije (test jedinjenja) ili pomoću UV spektroskopije upotrebom Spectramax Plus<3*4>(Molecular Devices) (referentna jedinjenja). Maksimalna apsorpcija za referentna jedinjenja eeftriakson, guanabenz i karbamazepin bila je 240 nm, 270 nm and 286 nm, respektivno. Uzorci za oporavak su pripremljeni kao što je opisano za uzorke analize prodiranja i inkubirani su u reprezentativnim bočicama u toku perioda prodiranja pod istim uslovima.

[0157]Za LC/MS analizu test jedinjenja, 100 uL inkubiranog rastvora je uklonjeno iz akceptorskog i donorskog odeljka i obrađeno za taloženje acetonitrilom (ACN) kao što je opisano u daljem tekstu. Pored toga, uzorci test jedinjenja iz lipidnog sloja su ekstrahovani ispiranjem svake komorice dva puta sa 150 uL EA. Rastvori su sakupljeni u reakcione epruvete od 1.5 mL i rastvarač je isparavam Osušeni ostaci su resuspendovani u PBS/DMSO/ACN smešu reflektujući sastav akceptorskih i donorskih uzoraka (tj. 100 uL pufera dopunjen sa 5% DMSO, 200 u.L ACN+ISTD). Krajnji sadržaj rastvarača svakog uzorka bio je 66% ACN. |0158]Uzorci iz donorskih i akceptorskih odeljaka i kaiibracioni standardi su taloženi dodavanjem 200 uL ACN/ISTD ili 400 pL ACN/ISTD. respektivno, Posle snažnog mešanja (10 sekundi) i centrifugiranja (5 min na 4800 x g. sobna temperatura), supernatanti bez čestica su podvrgnuti LC-MS/MS. Membranski odeljci su ekstrahovani kao što je opisano u prethodnom tekstu. Posle rekonstitucije. uzorci su snažno mućkani (10 sekundi) i peletirani (5 min na 4800 x g, sobna temperatura). Supernatanti bez čestica su podvrgnuti LC-MS/MS.

[0159]Za analizu jedinjenja pod predstavljenim pronalaskom, HPLC sistem se sastojao od Accela U-HPLC pumpe i Accela automatskog dozatora (Thenno Fisher Scientific. USA). Masena spektrometrija je izvedena na Exactivc masenom spektrometru (orbitrap tehnologija sa tačnom masom) opremljenim sa zagrevanom elektrosprej (H-ESI2) kontaktnom površinom (Thermo Fisher Scientific, USA) povezanom sa računarom sa standardnim softverom Xcalibur2.1.

[0160|LC je izvedena u gradijent režimu (Tabela 3) upotrebom ACN/0.1% mravlje kiseline kao organske faze (A) i 10 mM amonijum formata/0.1% mravlje kiseline kao vodene faze

(B); i stopa protoka pumpe je podešena na 500 uL/min. Odvajanje je izvedeno na Gemini C6-Fenil, 3 um, 50x2.0 mm (Phenomenex. Germanv) analitičkoj koloni sa prc-kolonom (Gemini

C6-Fenil, 3 um, 4x2.0 mm).

[01611Kao MS fajl za podešavanje korišćen jc generički fajl za podešavanje za sve analite upotrebom režima pozitivnih ili negativnih jona. Kao fiksna masa za internu kalibraciju mase korišćen je [M+H]~ jon diizooktil ftalata (m/z 391.28429), koji je svestrano prisutan u sistemu rastvarača.[0162)Analit je dobijen skeniranjem u dijapazonu ±i Thomson oko očekivane mase monoizotopnog [M+H]~ ili [MH]" jona. Rezolucija mase Orbitrap-a je podešena na 50,000. Tačna masa svakog analita je korišćena za inlegraciju pika. Dalja podešavanja instrumenata su bila kao što sledi: HCD-Gas isključen, AGC visoki dinamički opseg, maksimalno vreme injekcije u zamci 100 ms, zaštitni gas 30. pomoćni gas 8, gas za čišćenje 2, napon izvora jonizacijc 4 kV, temperatura kapilara 250°C, temperatura grejača ESI 2 250°C. |0163J Cilj predstavljenog pronalaska je bio da se generišu agonisti FXR sa poboljšanim lizičko-hemijskim osobinama u poredenju sa jedinjenjima za koja se traži zaštita u VVO 2011/020615. Ovo jc postignuto uvođenjem polarne hidroksil grupe na 1,3-ciklobutiliden ili 1,3-azetidinilidcn grupi zamenom ranijeg 1,2-ciklopropiliden prstena.

[0164]Iznenađujuće, dobijena jedinjenja su održavala svoju aktivnost na FXR receptom, ali su pokazala poboljšane fizičko-hemijske osobine, kao što je veća rastvorljivost u vodi i/ili permeabilnost membrane. Direktno poređenje odgovarajućih jedinjenja dve serije jc dato u Tabeli 4.

[0165j U svakom slučaju rastvorljivost u vodi ili permeabilnost PAMPA membrane ili oba su značajno poboljšani uvođenjem hidroksi-ciklobutil ili hidroksi-azetidil grupe. Kao većina molekula aktivnih za jedarni receptor, agonisti FXR su generalno veoma lipofilni (M. L. Crawley, Expert Opin. Ther. Patents 2010, 20. 1047). Prema tome, bolja rastvorljivost u vodi i permeabilnost membrane bi trebalo da imaju za rezultat veću oralnu biodostupnost i generalno bolju prikladnost za klinički razvoj ovih jedinjenja kao lekova {L. Huang, J. Dong, S. Karki in Evaluation of drug candidates for preclinical development (Eds. C. Han, C. B. Daviš, B. Wang), Wiley & Sons, Hoboken 2010, 187-2 i 7).

Claims (17)

1. Jedinjenje prema sledećoj formuli (!). njegov cnantiomer. diastereomer, tautomer ili farmaceutski prihvatljiva so u kome R je izabran iz grupe koja se sastoji od COORf„ CONR7Rs, tetrazolil, S02NR7RN, C,_6alkil, SO2-C1.6alkil i H, pri čemu je R6 nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od H ili Cu,alkil, i R7i R*međusobno nezavisno su izabrani iz grupe koja se sastoji od H, Ci^alkil, halo-C|_(1alkil, Ci-t, alkilen-R9, S02-C].(l, alkil, gde je R<y>izabran iz grupe koja se sastoji od COOH, OH i SO3H; A jc izabran iz grupe koja se sastoji od: fenil, piridil, pirimidil, pirazolil, indolil, tienil, benzotienil, indazolil, benzizoksazolil, benzofuranil, benzotriazolil, furanil, benzotiazolil, tiazolil, oksadiazolil, svaki izborno supstituisan sa jednom ili dve grupe nezavisno izabrane iz grupe koja sc sastoji od OH, 0-Cj_(, alkil, O-halo-CVf, alkil, alkil, halo-C|.(, alkil, CYfi cikloalkil i halogen; Q je izabran iz grupe koja se sastoji od fenil, piridil, tiazolil, tiofenil, pirimidil, svaka izborno supstituisana sa jednom ili dvegrupe nezavisno izabrane iz grupe koja se sastoji od CV(,alkil, halo-Ci.6alkil, halogen i CF-?; Y je izabran od N ili CH; Z je izabran od u kome X = CH, N, NO; Rtje izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika. Cj.jalkil, Ci.heikloalkil, C4.5 alkilcikloalkil. gde je C|.3alkil izborno supstituisan sa I do 3 supstituenta nezavisno izabrana od halogena, hidroksi ili CV^alkoksi; R2i R3su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, C|.ialkil, C\_3 haloalkil. Cio alkoksi. C|_3haloalkoksi i halogen.

2.Jedinjenje prema patentnom zahtevu I naznačeno time što R-A je izabran od

3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili 2 naznačeno time što Q je

4. Jedinjenjeprema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 naznačeno time što Z je

5. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 izabrano od ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva I do 5 koje ima sledeću strukturu ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

7. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 koje ima sledeću strukturu ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

9. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 za upotrebu kao lek.

10. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva i do 7 za upotrebu u profilaksi i/ili lečenju bolesti posredovanih preko FXR.

11.Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 10 naznačeno time stoje bolest izabrana od hroničnog intrahepatičnog ili izvesnih oblika ekstrahepatičnih holestatičkih stanja; fibroze jetre; opstruktivnih ili hroničnih inflamatornih poremećaja jetre; ciroze jetre; steatoze jetre i srodnih sindroma, holestatičkih ili fibrotičkih efekata koji su povezani sa cirozom koja je indukovana alkoholom ili sa virusnim oblicima hepatitisa; insuficijencije jetre ili ishemije jetre posle velike resekcije jetre; steatohepatitisa povezanog sa hemoterapijom (CASH); akutne insuficijencije jetre; i/ili inflamatornih bolesti creva.

12. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 10 naznačeno time što jc bolest izabrana od poremećaja lipida i lipoproteina; dijabetesa tipa II i kliničkih komplikacija dijabetesa tipa I i tipa II, uključujući dijabetičku nefropatiju, dijabetičku neuropatiju, dijabetičku retinopatijti i druge zabeležene efekte kliničke manifestacije dugotrajnog dijabetesa; stanja i bolesti koja su rezultat hronične masne i tibrotičke degeneracije organa kao posledica pojačane akumulacije lipida i naročito triglicerida i kasnije aktivacije profibrotičkih puteva, kao što je bolest nealkoholne masne jetre (NAFLD) ili nealkoholni steatohepatitis (NASH); gojaznosti ili metaboličkog sindroma (kombinovana stanja dislipidemije. dijabetesa ili abnormalno visokog indeksa telesne mase); i/ili akutnog infarkta miokarda, akutnog sloga ili tromboze koji se javlja kao krajnja tačka hronične opstruktivne ateroskleroze.

13. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 10 naznačeno time što je bolest izabrana od nemalignih hiperproliferativnih poremećaja i malignih hiperproliferativnih poremećaja, naročito hepatoćelijskog karcinoma, adenoma debelog creva i polipoza, adenokarcinoma debelog creva, kancera dojke, adenokarcinoma pankreasa, Baretovog jednjaka ili drugih oblika neoplastičnih bolesti gastrointestinalnog trakta i jetre.

14. Upotreba jedinjenja prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 za pripremu leka za profilaksu i/ili lečenje bolesti posredovanih preko FXR.

15. Upotreba prema patentnom zahtevu 14 naznačena time što je bolest izabrana od hroničnih intrahepatičnih ili izvesnih oblika ekstrahepatičnih holestatičkih stanja; fibroze jetre: opstruktivnih ili hroničnih inflamatornih poremećaja jetre; ciroze jetre; steatoze jetre i povezanih sindroma, holestatičkih ili fibrotičkih efekata koji su povezani sa cirozom koja je indukovana alkoholom ili sa virusnim oblicima hepatitisa; insuficijencije jetre ili ishemije jetre posle velike resekcije jetre; steatohepatitisa povezanog sa hemoterapijom (CASH); akutne insuficijencije jetre; i/ili inflamatornih bolesti creva.

16. Upotreba prema patentnom zahtevu 14 naznačena time što je bolest izabrana od poremećaja lipida i lipoproteina; dijabetesa tipa II i kliničkih komplikacija dijabetesa tipa 1 i tipa II, uključujući dijabetičku nefropatiju, dijabetičku neuropatiju, dijabetičku retinopatiju i druge zabeležene efekte kliničke manifestacije dugotrajnog dijabetesa; stanja i bolesti koji su rezultat hronične masne i fibrotičke degeneracije organa kao posledica pojačane akumulacije lipida i naročito triglicerida i kasnije aktivacije profibrotičkih puteva; kao što je bolest nealkoholne masne jetre (NAFLD) ili nealkoholni steatohepatitis (NASH); gojaznosti ili metaboličkog sindroma (kombinovana stanja dislipidemijc. dijabetesa ili abnormalno visokog indeksa telesne mase); i/ili akutnog infarkta miokarda, akutnog šloga ili tromboze koja se javlja kao krajnja tačka hronične opstruktivne ateroskleroze.

17. Upotreba prema patentnom zahtevu 14 naznačena time što je bolest izabrana od nemalignih hiperproliferativnih poremećaja i malignih hiperproliferativnih poremećaja, naročito hepatoćelijskog karcinoma, adenoma debelog creva i polipoza, adenokarcinoma debelog creva, kancera dojke, adenokarcinoma pankreasa, Baretovog jednjaka ili drugih oblika neoplasličnih bolesti gastrointestinalnog trakta i jetre.