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KR102078764B1 - 합성 브라시카-유래 엽록체 전이 펩티드 - Google Patents

합성 브라시카-유래 엽록체 전이 펩티드 Download PDF

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KR102078764B1
KR102078764B1 KR1020147024566A KR20147024566A KR102078764B1 KR 102078764 B1 KR102078764 B1 KR 102078764B1 KR 1020147024566 A KR1020147024566 A KR 1020147024566A KR 20147024566 A KR20147024566 A KR 20147024566A KR 102078764 B1 KR102078764 B1 KR 102078764B1
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저스틴 엠 리라
로버트 엠 시칠로
칼라 예케스
앤드류 이 로빈슨
Original Assignee
다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
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Abstract

본 개시내용은 펩티드, 폴리펩티드, 및 단백질을 색소체-함유 세포의 색소체로 표적화하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 폴리펩티드를 색소체로 유도할 수 있는 엽록체 전이 펩티드, 및 그를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 트랜스제닉 식물 물질(예컨대, 트랜스제닉 식물)을 제조하는 방법 뿐만 아니라, 이러한 방법에 의해 제조된 식물 물질, 및 그로부터 제조된 식물 일용품 제품에 관한 것이다.

Description

합성 브라시카-유래 엽록체 전이 펩티드{SYNTHETIC BRASSICA-DERIVED CHLOROPLAST TRANSIT PEPTIDES}
우선권 주장
본 출원은 2012년 2월 1일 출원된 미국 가특허 출원 시리얼 번호 제61/593,555호, 및 또한 2012년 4월 17일 출원된 미국 가특허 출원 시리얼 번호 제61/625,222호의 이점을 주장한다.
37 C.F.R. § 1.821 (c) 또는 (e)에 따른 진술 -
ASCII 텍스트 파일로 제출된 서열 목록
37 C.F.R. § 1.821(c) 또는 (e)에 따라, ASCII 텍스트 버전의 서열 목록을 포함하는 파일을 본 출원과 동시에 제출하였다.
기술분야
본 개시내용은 색소체-함유 세포의 색소체로 표적화되는 폴리펩티드를 유전적으로 코딩하고, 발현하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 폴리펩티드를 엽록체(예를 들어, 고등 식물)로 표적화하는 아미노산 서열, 및/또는 그를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 키메라 폴리펩티드의 색소체로의 전이를 제어하는 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩티드, 및/또는 그를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
식물 세포는 특징적인 막 시스템에 의해 경계가 정해져 있고, 세포내 분화된 기능을 수행하는, 일반적으로는 "색소체"로 지칭되는 독특한 세포하 세포소기관을 포함한다. 특정 색소체는 광합성 뿐만 아니라, 특정 화학 화합물의 합성 및 저장도 담당한다. 모든 색소체는 식물의 분열 조직부에 존재하는 전색소체로부터 유래된다. 전색소체는 예를 들어, 엽록체, 에티오플라스트, 유색체, 게론토플라스트, 백색체, 아밀로플라스트, 엘라이오플라스트, 및 단백질체로 발생할 수 있다. 자기 자신의 유전 시스템 및 단백질 합성 기구를 함유하지만, 그의 발생 및 생합성 활성에서 핵-세포질 시스템과의 긴밀한 협력에 의존하는 색소체는 세포내에서 반-자율 방식으로 존재한다.
고등 식물의 광합성 잎 세포에서 가장 눈에 띄는 색소체는 엽록체이다. 엽록체의 가장 본질적인 기능은 광합성의 광-구동 반응 수행이다. 그러나, 엽록체는 또한 식물 세포에 중요한 많은 다른 생합성 과정을 수행한다. 예를 들어, 세포의 지방산들은 모두 엽록체 스트로마에 위치하는 효소에 의해, 상기 위치에서 쉽게 이용가능한 ATP, NAOPH 및 탄수화물을 이용하여 제조된다. 또한, 광-활성화된 전자의 환원력이 엽록체에서의 아질산염 (NO2 -)의 암모니아 (NH3)로의 환원을 구동시킨다; 상기 암모니아는 아미노산 및 뉴클레오티드 합성을 위해 요구되는 질소를 식물에 제공한다.
엽록체는 또한 농약 산업에서 특히 중요한 과정에 참여한다. 예를 들어, 많은 제초제는 엽록체 내에서 수행되는 기능을 차단시킴으로써 작용하는 것으로 알려져 있다. 최근 연구 결과, 여러 제초제의 특이적인 표적이 확인되었다. 예를 들어, 트리아진-유도 제초제는 광계 II의 32 kD 폴리펩티드 중의 그의 결합 부위로부터 플라스토퀴논 분자를 대체함으로써 광합성을 억제시킨다. 상기 32 kD 폴리펩티드는 엽록체 게놈에서 코딩되고, 세포소기관 기구에 의해 합성된다. 트리아진 제초제에 대해 저항성을 가지는 돌연변이체 식물을 수득하였다. 상기 식물은 트리아진 제초제에 의해 플라스토퀴논이 더 이상 대체될 수 없는 돌연변이체 32 kD 폴리펩티드를 포함한다. 술포닐우레아는 엽록체에서의 아세토락테이트 합성을 억제시킨다. 아세토락테이트 신타제는 이소류신 및 발린 합성에 관여한다. 글리포세이트는 방향족 아미노산의 합성에 관여하는 효소인 5-에놀 피루빌-3-포스포시키메이트 신타제 (EPSPS)의 기능을 억제시킨다. 상기 효소들 모두 핵 게놈에 의해 코딩되지만, 이들은 실제 아미노산 합성이 이루어지는 엽록체로 전위된다.
대부분의 엽록체 단백질은 식물 세포의 핵에서 코딩되고, 세포질에서 보다 큰 전구체 단백질로서 합성되고, 번역 후에 엽록체로 이입된다. 외부 및 내부 외피 막을 가로질러 이루어지는 스트로마 내로의 이입은 스트로마, 틸라코이드 막, 및 틸라코이드 루멘으로 예정된 단백질 유입에 중요한 수단이다. 이입된 전구체 단백질을 틸라코이드 막 및 틸라코이드 루멘으로 국재화시키는 것은 박테리아 단백질 수송 시스템과 상동성인 두 기전을 포함하는, 4개의 독특한 기전에 의해 달성된다. 따라서, 엽록체에서 단백질 국재화를 위한 기전은 부분적으로는 원핵성 내공생체로부터 유래된 것이다 (문헌 [Cline and Henry (1996), Annu . Rev . Cell . Dev . Biol. 12:1-26]).
엽록체 발현으로 예정된 전구체 단백질은 엽록체 전이 펩티드 (CTP)로 알려져 있는 N-말단 연장부를 포함한다. 전이 펩티드는 엽록체 표면의 특이적인 인식에 중요하고, 엽록체 외피를 가로질러 거기서 엽록체 내의 다양한 서브구획 (예를 들어, 스트로마, 틸라코이드, 및 틸라코이드 막)으로 이루어지는 프리-단백질의 번역 후 전위를 매개하는 데 중요하다. 상기 N-말단 전이 펩티드 서열은 엽록체 단백질의 색소체 내로의 이입에 필요한 모든 정보를 포함하고: 전이 펩티드 서열은 색소체 이입을 위해 필수적이고, 충분하다.
그의 N-말단에 자연적으로 코딩된 전이 펩티드 서열을 가지는 것으로 보고된 식물 유전자로는 리불로스-1,5-비포스페이트 카르복실라제 (RuBisCo) (문헌 [de Castro Silva-Filho et al., (1996), Plant Mol . Biol . 30:769-80]; [Schnell et al., (1991), J. Biol . Chem . 266:3335-42]); EPSPS (예를 들어, 문헌 [Archer et al., (1990), J. Bioenerg . and Biomemb . 22:789-810] 및 미국 특허 6,867,293, 7,045,684, 및 Re. 36,449 참조); 트립토판 신타제 (문헌 [Zhao et al., (1995), J. Biol . Chem . 270:6081-7]); 플라스토시아닌 (문헌 [Lawrence et al., (1997), J. Biol . Chem . 272:20357-63]); 코리스메이트 신타제 (문헌 [Schmidt et al., (1993), J. Biol . Chem . 268:27447-57]); 집광 엽록소 a/b 결합 단백질 (LHBP) (문헌 [Lamppa et al., (1988), J. Biol . Chem . 263:14996-14999]); 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 엽록체 단백질 (문헌 [Lee et al., (2008), Plant Cell 20:1603-22])의 엽록체 작은 서브유닛을 포함한다. 미국 특허 공개 번호 US 2010/0071090은 클라미도모나스 종(Chlamydomonas sp .)으로부터의 특정 엽록체 표적화 펩티드를 제공한다.
그러나, 비록 독립된 구조적 모티프를 가지는 엽록체 표적화 펩티드의 독특한 서브군이 존재할 가능성도 있기는 하지만, 그의 서열 다양성 수준이 높고, 공통 또는 컨센서스 서열 모티프가 부족하기 때문에, 엽록체 표적화 펩티드에 의해 코딩되는 정보에 관한 구조상의 요건은 여전히 파악하기가 어려운 상태이다 (문헌 [Lee et al., (2008), 상기 문헌 동일). 추가로, 상기 서열 모두가 고등 식물에서 엽록체-표적화된 단백질의 이종성 발현에 유용한 것은 아니다.
발명의 개시내용
본원에서는 식물에서 폴리펩티드의 색소체 표적화를 위한 조성물 및 방법을 기술한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 합성 브라시카(Brassica)-유래 엽록체 전이 펩티드 (예를 들어, TraP12 펩티드 및 TraP13 펩티드)를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 핵산 분자는 단자엽 또는 쌍자엽 식물에서 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하고 표적화하는 데 유용할 수 있다. 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 합성 브라시카-유래 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가로 기술한다.
일부 실시양태에서, 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 브라시카 종 유전자(예를 들어, B. 나푸스(B. napus), B. 라파(B. rapa), B. 준세아(B. juncea), 및 B. 카리나타(B. carinata))로부터 수득된 참조 뉴클레오티드 서열에서 유래된, 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 브라시카 종 유전자로부터의 부분적인 CTP-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라(chimeric) 뉴클레오티드 서열 또는 그의 기능적 변이체일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 브라시카 종의 상이한 유전자, 상이한 브라시카 종, 또는 상이한 유기체(예를 들어, 식물, 원핵 생물, 및 하등 광합성 진핵 생물)로부터의 CTP 및 참조 브라시카 종 CTP 각각으로부터 수득된 인접한 뉴클레오티드 서열 또는 임의의 상술한 것의 기능적 변이체를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 인접한 뉴클레오티드 서열은 참조 브라시카 종 유전자의 상이한 유기체의 오르토로그(예를 들어, 상이한 브라시카 종 게놈)로부터 수득된 참조 브라시카 CTP의 이종상동성(orthologous) 뉴클레오티드 서열로부터 수득될 수 있다. 상기 및 추가의 실시양태에서, 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 1개 초과의 CTP-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
일부 일례에서, 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 B. 나푸스로부터의 부분적인 CTP 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 변이체일 수 있다. 특정 일례에서, 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 B. 나푸스로부터 수득된 인접한 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 변이체를 함유할 수 있다. 추가의 또 다른 일례에서, 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 브라시카 종 유전자로부터 수득된 인접한 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 변이체 및 아라비돕시스(Arabidopsis) 종 유전자로부터 수득된 인접한 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 변이체를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하는 1개 이상의 브라시카-유래 수단을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하기 위한 1개 이상의 브라시카-유래 수단을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자를 추가로 기술한다. 특정 실시양태에서, 상기 핵산 분자는 단자엽 또는 쌍자엽 식물에서 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하고 표적화하는 데 유용할 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하기 위한 브라시카-유래 수단은 특정 합성 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드를 엽록체로 표적화하기 위한 브라시카-유래 수단은 본원에서 TraP12 및 TraP13으로 지칭되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 군에서 선택된다.
본원에서는 또한 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 식물 물질(예를 들어 및 제한 없이, 식물, 식물 조직, 및 식물 세포)도 기술한다. 일부 실시양태에서, 식물 물질은 그의 게놈에 안정하게 통합되어 있는 상기 핵산 분자를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물 물질은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 생성물을 일과적으로 발현할 수 있다.
색소체-함유 세포의 색소체(예를 들어, 엽록체)에서 색소체-함유 세포(예를 들어, 식물) 중의 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 방법 또한 기술한다. 특정 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된, 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 사용하여 식물 세포를 형질전환시킴으로써 관심 뉴클레오티드 서열의 발현 생성물에 융합된 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 전구체 융합 폴리펩티드가 식물 세포의 세포질에서 제조된 후, 이어서, 융합 폴리펩티드가 생체내에서 식물 세포의 엽록체 내로 수송되도록 할 수 있다.
관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물의 제조 방법도 추가로 기술한다. 상기 트랜스제닉 식물로부터 제조된 식물 상용 생성물 (예를 들어, 종자)을 또한 기술한다.
상기 및 다른 특징은 첨부된 도면을 참조로 하여 진행되는, 수개의 실시양태에 관한 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 자명해질 것이다.
도 1은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 브라시카-유래 CTP-코딩 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, TraP12, 및 TraP13)의 특정 일례의 대표인 mRNA 분자를 도시한다. 일부 실시양태에서, mRNA 분자(예를 들어, 제시된 것)는 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 브라시카-유래 CTP-코딩 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 DNA 분자로부터 전사될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열은 관심 펩티드를 코딩하는 서열, 예를 들어 및 제한 없이, 색소체로 표적화되는 마커 유전자 생성물 또는 펩티드일 수 있다.
도 2는 브라시카 나푸스 (서열 2) 및 아라비돕시스 탈리아나 (서열 4)로부터의 EPSPS 단백질에 대한 예측 엽록체 전이 펩티드의 정렬을 포함한다. 별표 표시는 서열이 분할되고, 재조합되어 TraP12 및 Trap13을 형성한 위치를 나타내는 것이다.
도 3은 플라스미드 지도 pDAB101981를 도시한다.
도 4는 플라스미드 지도 pDAB101989를 도시한다.
도 5는 플라스미드 지도 pDAB101908을 도시한다.
도 6은 담배잎 조직 내로 침투된 TraP12-YFP가 담배잎 조직의 엽록체 내로 전위된 현미경 검사 영상을 포함한다.
도 7은 담배잎 조직 내로 침투된 TraP13-YFP가 담배잎 조직의 엽록체 내로 전위된 현미경 검사 영상을 포함한다.
도 8은 담배잎 조직 내로 침투된 비-표적화 YFP 대조군이 담배잎 조직의 엽록체 내로 도입되지 않은 현미경 검사 영상을 포함한다.
도 9는 옥수수 원형질체로 형질전환된 TraP12-YFP가 옥수수 원형질체의 엽록체 내로 전위된 현미경 검사 영상을 포함한다.
도 10은 pDAB105528의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 11은 pDAB105529의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 12는 pDAB107686의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 13는 pDAB107687의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 14는 pDAB112711의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 15는 pDAB11479의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 16은 pDAB112712의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 17은 pDAB112710의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 18은 pDAB017540의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 19는 pDAB107617의 플라스미드 지도를 도시한다.
발명의 수행 모드(들)
I. 수개의 실시양태에 관한 개요
엽록체 전이 펩티드 (CTP) (또는 색소체 전이 펩티드)는 번역과 동시에 또는 번역 후에 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 색소체(예를 들어, 엽록체)로 유도하는 작용을 한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 내인성 엽록체 단백질 또는 이종성 단백질은 CTP를 포함하는 보다 큰 전구체 폴리펩티드와 같은 단백질의 발현에 의해 엽록체로 유도될 수 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 및 제한 없이, 상이한 유기체로부터 수득된 이종상동성 유전자로부터의 1 개 이상의 인접한 서열, 또는 이의 기능적 변이체를 도입함으로써, CTP는 브라시카 종 유전자로부터 수득된 뉴클레오티드 서열로부터 유래될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 각각 CTP를 코딩하는 핵산 서열을 브라시카 나푸스로부터 수득된 EPSPS 유전자 서열 (NCBI 데이터베이스 수탁 번호 P17688)로부터 단리시켰다. EPSPS 유전자 서열을 클로로P (ChloroP) 예측 서버로 분석함으로써 CTP-코딩 핵산 서열을 단리시켰다(문헌 [Emanuelsson et al. (1999), Protein Science 8:978-84] (cbs.dtu.dk/services/ChloroP에서 이용가능)). 단리된 CTP-코딩 서열의 예측 단백질 생성물은 대략 60-70 개의 아미노산-길이 전이 펩티드이다. CTP-코딩 핵산 서열을 아라비돕시스 탈리아나로부터 수득된 이종상동성 EPSPS 유전자 (NCBI 데이터베이스 수탁 번호 NP_182055)로부터 단리시켰다. 본 일례에서, 천연 (native) B. 나푸스 CTP를 참조 서열로서 사용하여 B. 나푸스 CTP내 특정 위치에서 아라비돕시스 CTP로부터 인접한 서열을 융합하여 예시적인 합성 브라시카-유래 CTP를 디자인하였다. 이 디자인 과정은 일부 측면에 따르면, 브라시카 및 아라비돕시스 종 핵산 서열로부터의 신규한 합성 CTP의 발생을 도시한다. 상기 예시적인 합성 브라시카-유래 CTP는 본 개시내용을 통틀어, TraPs12 및 13으로 지칭한다. 상기 예시적인 합성 TraP를 색소체-표적화 기능에 대해 시험하였고, 적어도 개별적으로 천연 브라시카 서열에서 관찰되는 것만큼 유리한 색소체 표적화를 보이는 것을 발견하였다.
추가의 예시적인 실시양태에서, 각각 본 발명의 합성 TraP 펩티드를 코딩하는 것인 핵산 서열을 독립적으로 합성하고, 황색 형광성 단백질 (YFP)을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결하여 각각 키메라 TraP:YFP 융합 폴리펩티드를 코딩하는 합성 핵산 분자를 제조하였다. 각각 키메라 TraP:YFP 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산 분자를 각각 이원성 벡터 내로 도입함으로써 각각 TraP:YFP-코딩 핵산 서열을 AtUbi 10 프로모터로 작동가능하게 연결시켰다.
추가의 예시적인 실시양태에서, AtUbi 10 프로모터에 작동가능하게 연결된 TraP:YFP-코딩 핵산 서열을 포함하는 이원성 벡터를 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 각각 독립적으로, 일과적으로(transiently) 담배 (니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana))를 형질전환시켰다. 공초점 현미경 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 각각 TraP가 YFP를 담배 엽록체로 성공적으로 표적화시켰는지 확인하였다.
추가의 예시적인 실시양태에서, 각각 본 발명의 합성 TraP 펩티드를 코딩하는 것인 핵산 서열을 독립적으로 합성하고, 작물학상 중요한 유전자 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결시켰다. TraP 서열을 제초제 내성 형질 (예를 들어, dgt -28 및 dgt -14)에 융합시켜, 각각 키메라 TraP:DGT-28 또는 TraP:DGT-14 융합 폴리펩티드를 코딩하는 합성 핵산 분자를 제조하였다. 각각 키메라 TraP:DGT-28 또는 TraP:DGT-14 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산 분자를 각각 이원성 벡터 내로 도입하여 각 TraP:dgt-28 또는 TraP:dgt-14-코딩 핵산 서열을 프로모터 및 다른 유전자 조절 요소에 작동가능하게 연결시켰다. TraP:dgt-28 또는 TraP:dgt-14-코딩 핵산 서열을 함유하는 이원성체를 사용하여 다양한 식물 종을 형질전환시켰다. DGT-28 또는 DGT-14 효소의 발현 및 엽록체로의 전위의 결과로서 트랜스제닉 식물을 제초제 내성에 대하여 검정하였다.
추가의 예시적인 실시양태에서, 각각 본 발명의 합성 TraP 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 독립적으로 합성하고 작물학적으로 중요한 유전자 서열을 코딩하는 핵산 서열과 작동가능하게 연결하였다. TraP 서열을 곤충 내성 형질 (예를 들어, cry2Aa, vip3ab1 , cry1F , cry1Ac , 및 cry1Ca)과 융합하여, 각각 키메라 TraP:Cry2Aa, TraP:Vip3Ab1, TraP:Cry1F, TraP:Cry1Ac, 또는 TraP:Cry1Ca 융합 폴리펩티드를 코딩하는 합성 핵산 분자를 제조하였다. 각각 키메라 TraP:cry2Aa, TraP:vip3ab1, TraP:cry1F, TraP:cry1Ac, 또는 TraP:cry1Ca 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산 분자를 각각 이원성 벡터 내로 도입하여 각각 TraP:cry2Aa, TraP:vip3ab1, TraP:cry1F, TraP:cry1Ac, 또는 TraP:cry1Ca-코딩 핵산 서열을 프로모터 및 다른 유전자 조절 요소에 작동가능하게 연결시켰다. TraP:cry2Aa, TraP:vip3ab1 , TraP:cry1F, TraP:cry1Ac, 또는 TraP:cry1Ca-코딩 핵산 서열을 함유하는 이원성체를 사용하여 다양한 식물 종을 형질전환시켰다. Cry2Aa, Vip3Ab1, Cry1F, Cry1Ac, 또는 Cry1Ca 효소의 엽록체로의 발현 및 전위의 결과로서 트랜스제닉 식물을 내충성에 대하여 생물학적 검정하였다.
상기 상세히 설명된 실험 일례에 비추어, 본 발명의 합성 브라시카-유래 CTP 서열, 및 이를 코딩하는 핵산을 사용하여 광범위한 색소체-함유 세포에서 임의의 폴리펩티드를 색소체로 유도할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 의해 당업자에게 이용가능한 방법에 의해서 임의의 제2 펩티드 서열의 N-말단에 융합된 합성 브라시카-유래 CTP 서열을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 제2 펩티드 서열의 색소체 표적화를 위해 색소체-함유 숙주 세포 내로 도입(또는 발현)할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 TraP 펩티드는 천연 CTP와 비교할 때, 색소체 발현이 바람직한 펩티드의 이입 및 프로세싱 효율을 증가시킬 수 있다.
II . 약어
CTP 엽록체 전이 펩티드
Bt 바실러스 튜링겐시스 (bacillus thuringiensis)
EPSPS 3-에놀피루빌시키메이트-5-포스페이트 신테타제
YFP 황색 형광성 단백질
Ti 종양 유도성 (A. 투메파시엔스(A. tumefaciens)로부터 유래된 플라스미드)
T-DNA 전이 DNA
III . 용어
본 개시내용의 다양한 실시양태에 관한 리뷰를 용이하게 하기 위해, 구체적인 용어에 관한 설명을 하기에 제공한다:
엽록체 전이 펩티드: 본원에서 사용되는 바, "엽록체 전이 펩티드" (CTP) (또는 "색소체 전이 펩티드")라는 용어는 폴리펩티드의 N-말단에 존재할 때, 폴리펩티드의 색소체-함유 세포(예를 들어, 식물 세포, 예를 들어, 전체 식물 또는 식물 세포 배양에서)의 색소체로의 이입을 유도하는 아미노산 서열을 의미할 수 있다. CTP는 일반적으로 필요하며, 단백질을 숙주 세포의 색소체 (예를 들어, 1차, 2차, 또는 3차 색소체, 예를 들어, 엽록체) 내로의 이입을 유도하는 데 충분하다. 수개의 이용가능한 알고리즘(예를 들어, PSORT, 및 클로로P (cbs.dtu.dk/services/ChloroP에서 이용가능한)) 중 하나에 의해 추정 엽록체 전이 펩티드를 확인할 수 있다. 클로로P는 특히 CTP를 잘 예측할 수 있다 (문헌 [Emanuelsson et al., (1999), Protein Science 8:978-84]). 그러나, 기능성 CTP를 예측하는 데 있어서는 현존하는 어느 알고리즘으로도 100 % 효율을 달성하지 못한다. 그러므로, 예를 들어, 시험관내, 또는 생체내 방법으로, 확인된 추정 CTP가 실제로 의도된 바대로 작용하는지를 입증하는 것이 중요하다.
엽록체 전이 펩티드는 색소체가 이입되는 폴리펩티드의 N-말단에 위치할 수 있다. CTP는 번역과 동시에 또는 번역 후에 진행되는 CTP를 포함하는 폴리펩티드의 색소체로의 수송이 용이하게 이루어지도록 할 수 있다. 엽록체 전이 펩티드는 전형적으로 약 40 내지 약 100개의 아미노산을 포함하고, 상기 CTP는 특정의 공통된 특징, 예를 들어, CTP는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 또는 글루타민)이 존재할 경우에는 그를 극소수로 함유하고; CTP의 N-말단 영역에는 하전된 아미노산인 글리신, 및 프롤린이 존재하지 않고; CTP의 중앙 영역은 또한 매우 높은 비율로 염기성 또는 히드록실화된 아미노산 (예를 들어, 세린 및 트레오닌)을 함유할 가능성이 있고; CTP의 C-말단 영역은 아르기닌이 풍부하고, 양친매성 베타-시트 구조를 포함하는 능력을 가지는 것과 같은 특징을 포함하는 것으로 관찰되었다. 색소체 프로테아제는 CTP를 포함하는 폴리펩티드의 색소체 내로의 이입 후 상기 폴리펩티드의 나머지 부분으로부터 CTP를 절단할 수 있다.
접촉: 본원에서 사용되는 바, 핵산 분자와 관련하여 세포, 조직, 또는 유기체 (예를 들어, 식물 세포; 식물 조직; 및 식물)"와 접촉하다" 또는 그"에 의해 흡수되다"라는 용어는 핵산 분자의 유기체 내로의 내재화, 예를 들어, 제한 없이, 핵산 분자를 포함하는 조성물과 유기체를 접촉시키는 것; 및 핵산 분자를 포함하는 용액을 유기체에 흡수시키는 것을 포함한다.
내인성: 본원에서 사용되는 바, "내인성"이라는 용어는 물질 (예를 들어, 핵산 분자 및 폴리펩티드)이 특정의 유기체, 조직, 또는 세포내로부터 기원한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 식물 세포에서 발현된 "내인성" 폴리펩티드란 보통 비유전적으로 조작된, 같은 종의 식물로부터의 같은 유형의 세포에서 발현된 폴리펩티드를 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 브라시카 종으로부터의 내인성 유전자(예를 들어, EPSPS 유전자)를 사용하여 참조 브라시카 CTP 서열을 수득할 수 있다.
발현: 본원에서 사용되는 바, 코딩 서열 (예를 들어, 유전자 또는 트랜스진)의 "발현"이란, (예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함하는) 핵산 전사 단위의 코딩 정보가 세포의 작동적, 비-작동적, 또는 구조적 부분으로 전환되는 과정으로, 대개는 단백질의 합성을 포함하는 것인 과정을 의미한다. 유전자 발현은 외부 신호; 예를 들어, 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에의 세포, 조직, 또는 유기체 노출에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자 발현은 또한 DNA에서 RNA로, 이어서 단백질로 진행되는 경로 어디에서든 조절될 수 있다. 유전자 발현은 예를 들어, 중간 매개 분자, 예를 들어, mRNA의 전사, 번역, RNA 수송 및 프로세싱, 분해에 작용하는 제어를 통해, 또는 특이 단백질 분자가 제조된 이후에 진행되는 그의 활성화, 불활성화, 구획화, 또는 분해를 통해, 또는 그의 조합에 의해 조절된다. 유전자 발현은 예를 들어 및 제한 없이: 노던 블롯; RT-PCR; 웨스턴 블롯; 또는 시험관내; 계내; 및 생체내 단백질 활성 검정(들)을 비롯한, 당업계에 공지된 임의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
유전 물질: 본원에서 사용되는 바, "유전 물질"이라는 용어는 모든 유전자, 및 핵산 분자, 예를 들어, DNA 및 RNA를 포함한다.
이종성: 본원에서 사용되는 바, "이종성"이라는 용어는 물질 (예를 들어, 핵산 분자 및 폴리펩티드)이 특정의 유기체, 조직, 또는 세포내로부터 기원하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 식물 세포에서 발현된 "이종성" 폴리펩티드란 보통은 비유전적으로 조작된, 같은 종의 식물로부터의 같은 유형의 세포에서 발현되지 않는 폴리펩티드 (예를 들어, 같은 유기체의 다른 세포 또는 상이한 유기체의 세포에서 발현된 폴리펩티드)를 의미할 수 있다.
단리된: 본원에서 사용되는 바, "단리된"이라는 용어는 분자 (예를 들어, 핵산 분자 및 폴리펩티드)가, 상기 분자가 자연적으로 발생된 유기체의 세포에서 보통 분자와 회합되어 있는 같은 유형의 다른 분자 (예를 들어, 다른 핵산 분자 및 다른 폴리펩티드)로부터 실질적으로 분리되어 있거나, 또는 그로부터 정제되어 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 단리된 핵산 분자는 핵산 분자가 자연적으로 발생된 유기체의 세포에서 염색체 DNA 또는 염색체외 DNA로부터 실질적으로 분리되어 있거나, 또는 그로부터 정제되어 있는 것일 수 있다. 따라서, 상기 용어는 다른 핵산 분자, 폴리펩티드, 및 세포 성분이 제거되도록 생화학적으로 정제된 재조합 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 또한 재조합 핵산 분자, 화학적으로 합성된 핵산 분자, 및 재조합적으로 제조된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로 정제된"이라는 용어는 분자가 그의 천연 상태에서는 보통 그와 회합되어 있는 다른 분자로부터 분리되어 있다는 것을 의미한다. 실질적으로 정제된 분자는 조성물 중에 존재하는 우세한 종일 수 있다. 실질적으로 정제된 분자에는 천연 혼합물 중에 존재하는 용매 이외의 다른 분자가 예를 들어, 60 % 이상, 75 % 이상, 또는 90 % 이상 존재하지 않을 수 있다. "실질적으로 정제된"이라는 용어는 그의 천연 상태로 존재하는 분자를 의미하는 것은 아니다.
핵산 분자: 본원에서 사용되는 바, "핵산 분자"라는 용어는 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미하며, 이는 RNA, cDNA, 게놈 DNA의 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두, 및 상기의 합성 형태 및 혼합된 중합체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 상기 두 뉴클레오티드 중 어느 것이든 한 유형의 변형된 형태를 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 달리 언급되지 않는 한, 핵산 분자의 길이는 보통 10개 이상의 염기 길이이다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다. 핵산 분자는 이량체 (소위 탠덤) 형태, 및 핵산 분자의 전사 생성물을 포함한다. 핵산 분자는 자연적으로 발생된 뉴클레오티드, 및 자연적으로 발생된 뉴클레오티드 및/또는 비자연적으로 발생된 뉴클레오티드 결합에 의해 함께 연결된 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다.
당업자에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 상기 변형으로는 예를 들어, 표지, 메틸화, 자연적으로 발생된 뉴클레오티드 중 하나 이상의 것을 유사체로 치환, 뉴클레오티드간 변형(예를 들어, 비하전된 결합: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 카르바메이트 등; 하전된 결합: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 인터칼레이터: 예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등; 킬레이터; 알킬레이터; 및 변형된 결합: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등을 포함한다. "핵산 분자"라는 용어는 또한 단일 가닥, 이중 가닥, 부분적으로 이중체, 삼중체, 헤어핀, 환형, 및 패드록형(padlocked) 입체형태를 비롯한, 임의의 위상기하학적 입체형태도 포함한다.
본원에서 사용되는 바, DNA와 관련하여, "코딩 서열," "구조적 뉴클레오티드 서열," 또는 "구조적 핵산 분자"라는 용어는 궁극적으로는 적절한 조절 서열의 제어하에 배치되었을 때 전사 및 mRNA를 통해 폴리펩티드로 번역되는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. RNA와 관련하여 "코딩 서열"이라는 용어는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 코딩 서열의 경계는 5'-단부의 번역 출발 코돈 및 3'-단부의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 게놈 DNA; cDNA; EST; 및 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어, 분리 방법, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여; 분자 크기에 기초하거나, 또는 친화도에 의한 배제법에 의해; 상이한 용매 중의 용해도에 기초한 분별에 의해; 및 유전자 조작 방법, 예를 들어, 증폭, 클로닝 및 서브클로닝에 의해 단리, 정제, 또는 부분적으로 정제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
서열 동일성: 본원에서 사용되는 바, 두 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "서열 동일성" 또는 "동일성"이라는 용어는 구체화된 비교창에 걸쳐 최대로 일치하도록 정렬되었을 때, 두 서열내 잔기가 동일한 것을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "서열 동일성 비율(%)"은 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열 (예를 들어, 핵산 서열, 및 아미노산 서열)을 비교함으로써 측정된 값을 의미할 수 있으며, 여기서, 두 서열이 최적으로 정렬될 수 있도록 하기 위해 비교창내 서열 중 일부는 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 비율(%)은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 개수를 측정하여 매칭되는 위치의 개수를 구하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창 내의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과치에 100을 곱하여 서열 동일성 비율(%)을 구함으로써 산출된다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 예를 들어, 문헌 [Smith and Waterman (1981), Adv . Appl. Math . 2:482]; [Needleman and Wunsch (1970), J. Mol Biol . 48:443]; [Pearson and Lipman (1988), Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A. 85:2444]; [Higgins and Sharp (1988), Gene 73:237-44]; [Higgins and Sharp (1989), CABIOS 5:151-3]; [Corpet et al., (1988), Nucleic Acids Res . 16:10881-90]; [Huang et al., (1992), Comp . Appl . Biosci . 8:155-65]; [Pearson et al., (1994), Methods Mol Biol. 24:307-31]; [Tatiana et al., (1999), FEMS Microbiol Lett. 174:247-50]에 기술되어 있다. 서열 정렬 방법 및 상동성 산출에 관한 상세한 고려 사항은 예를 들어, 문헌 [Altschul et al., (1990), J. Mol . Biol . 215:403-10]에서 살펴볼 수 있다.
수개의 서열 분석 프로그램을 결부시켜 사용하기 위한 것으로 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)의 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool: BLAST™; Altschul et al. (1990))은 미국 국립 생물 정보 센터 (미국 메릴랜드주 베데스다)를 비롯한 여러 공급처로부터, 및 인터넷 상에서 이용가능하다. 상기 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 측정하는 방법에 관한 설명은 인터넷상에서 BLAST™에 대한 "도움말" 섹션에서 이용가능하다. 핵산 서열 비교를 위해, 파라미터를 디폴트하는 디폴트 BLOSUM62 매트릭스를 이용하는 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 함수가 사용될 수 있다. 참조 서열에 대해 더욱더 큰 유사성을 가지는 핵산 서열은 상기 방법으로 평가되었을 때 증가된 동일성 비율(%)을 보일 것이다.
특이적으로 하이브리드화할 수 있는/특이적으로 상보적인: 본원에서 사용되는 바, "특이적으로 하이브리드화할 수 있는" 및 '"특이적으로 상보적인"이라는 용어는 핵산 분자와 표적 핵산 분자 사이에 안정적이고, 특이적인 결합이 이루어질 수 있도록 하는 충분한 정도의 상보성을 나타내는 용어이다. 두 핵산 분자 사이의 하이브리드화는 두 핵산 분자의 핵산 서열 사이의 역평행 정렬 형성을 포함한다. 이어서, 두 분자는 반대 가닥 상의 상응하는 염기와 수소 결합을 형성하여, 충분히 안정적일 경우, 당업계에 주지된 방법을 사용하여 검출가능한 이중체 분자를 형성할 수 있다. 핵산 분자는 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 것이 되기 위해 그의 표적 서열에 대하여 100 % 상보적일 필요는 없다. 그러나, 특이적인 하이브리드화를 위해 존재하여야 하는 서열 상보성의 양은 사용되는 하이브리드화 조건과 함수 관계에 있다.
특정의 엄격도에 이르게 하는 하이브리드화 조건은 선택되는 하이브리드화 방법의 성질, 및 하이브리드화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 비록 세척 회수 또한 엄격성에 영향을 주기는 하지만, 일반적으로는 하이브리드화 온도 및 하이브리드화 완충제의 이온 강도 (특별히 Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 하이브리드화의 엄격성을 결정지을 것이다. 특정의 엄격도를 달성하는 데 필요한 하이브리드화 조건에 관한 산출은 당업계의 숙련가에게 알려져 있고, 이는 [Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11]; 및 [Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization , IRL Press, Oxford, 1985]에 논의되어 있다. 핵산의 하이브리드화에 관한 추가의 상세한 설명 및 가이드라인은 예를 들어, 문헌 [Tijssen, 'Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes , Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993]; 및 [Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995]에서 살펴볼 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "엄격한 조건"은 하이브리드화 분자와 표적 핵산 분자내의 상동성 서열 사이에 미스매치가 20 % 미만으로 존재하는 경우에만 오직 하이브리드화가 일어나게 되는 조건을 포함한다. "엄격한 조건"은 추가의 특별한 수준의 염격성을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, "중간 정도의 엄격한" 조건은 20 % 초과의 서열 미스매치를 포함하는 분자는 하이브리드화하지 못하게 되는 조건이고; "고도로 엄격한" 조건은 10 % 초과의 미스매치를 포함하는 서열은 하이브리드화하지 못하게 되는 조건이고; "초고도로 엄격한" 조건은 5% 초과의 미스매치를 포함하는 서열은 하이브리드화하지 못하게 되는 조건이다.
하기는 대표적인, 비-제한적 하이브리드화 조건이다.
(90 % 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출하는) 고도로 엄격한 조건: 65℃에서 16시간 동안 5x SSC 완충제 중에서 하이브리드화; 매회마다 실온에서 15분 동안 2x SSC 완충제 중에서 2회 세척; 및 매회마다 65℃에서 20분 동안 0.5x SSC 완충제 중에서 2회 세척.
(80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출하는) 중간 정도의 엄격한 조건: 65-70℃에서 16-20시간 동안 5x-6x SSC 완충제 중에서 하이브리드화; 매회마다 실온에서 5-20분 동안 2x SSC 완충제 중에서 2회 세척; 및 매회마다 55-70℃에서 30분 동안 1 x SSC 완충제 중에서 2회 세척.
(50% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출하는) 비-엄격한 대조군 조건: 55℃에서 16-20시간 동안 6x SSC 완충제 중에서 하이브리드화; 매회마다 55℃에서 20-30분 동안 2x-3x SSC 완충제 중에서 2회 이상 세척.
본원에서 사용되는 바, 인접한 핵산 서열과 관련하여 "실질적으로 상동성인" 또는 "실질적 상동성"이라는 용어는 인접한 뉴클레오티드 서열이 엄격한 조건하에서 참조 핵산 서열에 하이브리드화한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 참조 핵산 서열과 실질적으로 상동성인 핵산 서열은 엄격한 조건 (예를 들어, 상기 기재된 중간 정도의 엄격한 조건)하에서 참조 핵산 서열에 하이브리드화하는 핵산 서열이다. 실질적으로 상동성인 서열은 80% 이상의 서열 동일성을 가진다. 예를 들어, 실질적으로 상동성인 서열은 약 80% 내지 100% 서열 동일성, 예를 들어, 약 81%; 약 82%; 약 83%; 약 84%; 약 85%; 약 86%; 약 87%; 약 88%; 약 89%; 약 90%; 약 91%; 약 92%; 약 93%; 약 94%; 약 95%; 약 96%; 약 97%; 약 98%; 약 98.5%; 약 99%; 약 99.5%; 및 약 100%를 가질 수 있다. 실질적 상동성의 특성은 특이적인 하이브리드화와 밀접한 관련이 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 예를 들어, 특이적인 결합이 요구되는 조건, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 핵산의 비-표적 서열에의 비-특이 결합을 피할 수 있는 충분한 정도 상보성이 존재할 때에 특이적으로 하이브리드화할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "오르토로그" (또는 "이종상동성")라는 용어는 공통 조상 뉴클레오티드 서열로부터 진화하였고, 2개 이상의 종에서 같은 작용을 보유할 수 있는 2개 이상의 종 중의 유전자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 5' → 3' 방향으로 판독되었을 때, 서열의 모든 뉴클레오티드가 3' → 5' 방향으로 판독되었을 때, 다른 서열의 모든 뉴클레오티드와 상보적일 경우에 두 핵산 서열 분자는 "완전한 상보성"을 보인다라고 말할 수 있다. 참조 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열은 참조 뉴클레오티드 서열의 역 상보체 서열과 동일한 서열을 보일 것이다. 상기 용어 및 설명은 당업계에 잘 정의되어 있고, 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 이해된다.
아미노산 서열 사이의 서열 동일성 비율(%)을 측정할 때, 정렬에 의해 제공된 주어진 위치에서의 아미노산의 아이덴티티는 정렬된 서열을 포함하는 폴리펩티드의 원하는 특성에는 영향을 주지 않으면서 상이할 수 있다는 것은 당업계의 숙련가에게 주지되어 있다. 이러한 경우, 서열 동일성(%)은 보존적으로 치환된 아미노산 사이의 유사성을 고려하여 조정될 수 있다. 이러한 조정은 주지되어 있으며, 당업자에 의해 보편적으로 사용된다. 예를 들어, 문헌 [Myers and Miller (1988), Computer Applications in Biosciences 4:11-7]을 참조할 수 있다.
본 발명의 실시양태는 예시적인 색소체 전이 펩티드 아미노산 서열의 기능적 변이체 및 상기를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 예시적인 전이 펩티드 서열의 기능적 변이체는 예를 들어, 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열의 단편 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 단편), 또는 전장의 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열 또는 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열의 단편의 변형된 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 예시적인 전이 펩티드 아미노산 서열은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환의 도입으로 변형될 수 있다. "보존적" 아미노산 치환은, 아미노산 잔기가 유사한 작용성 측쇄, 유사한 크기, 및/또는 유사한 소수성을 가지는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 보존적 치환을 도입하기 위해 같은 패밀리의 또 다른 아미노산으로 대체하는 데 사용될 수 있는 아미노산 패밀리는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 아미노산 패밀리로는 하기를 포함한다: 염기성 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘); 산성 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산); (생리학적 pH에서 비하전된 극성 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 및 시토신); 비-극성 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 및 트립토판); 베타-분지형 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 및 이소류신); 및 방향족 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 및 히스티딘). 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., (Eds.), 상기 문헌 참조]; 및 [Innis et al., PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications , 1990, Academic Press, NY, USA]를 참조할 수 있다.
작동가능하게 연결된: 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열과 기능적으로 관련이 있을 때, 제1 뉴클레오티드 서열은 제2 뉴클레오티드 서열과 "작동가능하게 연결"되어 있는 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 번역에 영향을 준다면, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 재조합적으로 제조되었을 때, 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열은 같은 리딩 프렘임 내에서 일반적으로 인접해 있고, 필요할 경우, 두 단백질-코딩 영역은 결합을 통해 인접하게 된다. 그러나, 뉴클레오티드 서열은 작동가능하게 연결되도록 하기 위해 인접할 필요는 없다.
조절 서열 및 코딩 서열과 관련하여 사용될 때, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 조절 서열이 연결된 코딩 서열의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 서열," 또는 "제어 요소"란 전사의 시간 및 수준/양, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 회합된 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 조절 서열로는 프로모터; 번역 리더 서열; 인트론; 인핸서; 스템-루프 구조; 리프레서 결합 서열; 종결 서열; 폴리아데닐화 인식 서열 등을 포함한다. 특정 조절 서열은 그의 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 특정 조절은 이중 가닥 핵산 분자의 회합된 상보적인 가닥 상에 위치할 수 있다.
둘 이상의 아미노산 서열에 참조로 사용될 때, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 제1 아미노산 서열이 1 개 이상의 추가 아미노산 서열과 기능적 관계에 있음을 의미한다. 예를 들어, 전이 펩티드(예를 들어, CTP)가 폴리펩티드 또는 제2 아미노산 서열의 발현 또는 이동(trafficking)에 영향을 미칠 경우, 전이 펩티드는 제2 아미노산 서열과 두 서열 모두를 포함하는 폴리펩티드 내에서 작동가능하게 연결된다.
프로모터: 본원에서 사용되는 바, "프로모터"라는 용어는 전사 출발점으로부터 상류에 위치할 수 있고, RNA 폴리머라제, 및 전사를 개시하는 다른 단백질의 인식 및 결합에 관여할 수 있는 DNA 영역을 의미한다. 프로모터는 세포에서 발현시키기 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 프로모터는 세포에서 발현시키기 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터일 수 있다. 발생적 제어하에 있는 프로모터의 예로는 특정 조직, 예를 들어, 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 물관, 헛물관, 또는 후막 조직에서 전사를 우선적으로 개시하는 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 "조직-선호"인 것으로 지칭된다. 오직 특정 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이" 것으로 지칭된다. "세포 유형-특이" 프로모터는 하나 이상의 기관내 특정 세포 유형에서, 예를 들어, 뿌리 또는 잎 중 관다발 세포에서의 발현을 주로 구동시킨다. "유도성" 프로모터는 환경 제어하에 존재할 수 있는 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사를 개시할 수 있는 환경 조건의 예로는 혐기성 조건 및 빛의 존재를 포함한다. 조직-특이, 조직-선호, 세포 유형 특이, 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건하에서 활성을 나타낼 수 있는 프로모터이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 임의의 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 문헌 [Ward et al., (1993), Plant Mol . Biol . 22:361-366]을 참조할 수 있다. 유도성 프로모터의 경우, 유도제에 대한 반응으로 전사 속도는 증가하게 된다. 유도성 프로모터의 예로는 구리에 반응하는 ACEI 시스템으로부터의 프로모터, 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 대해 반응하는, 옥수수로부터의 In2 유전자; Tn10으로부터의 Tet 리프레서; 및 글루코코르티코스테로이드에 의해 활성 활성이 유도될 수 있는 것인, 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다 (문헌 [Schena et al., (1991), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:0421]).
구성적 프로모터의 예로는 식물 바이러스로부터의 프로모터, 예를 들어, CaMV로부터의 35S; 벼 액틴 유전자로부터의 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 옥수수 H3 히스톤 프로모터, 및 브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조적 유전자에 대해 5'쪽의 Xba1/NcoI 단편인 ALS 프로모터 (또는 상기 Xba1/NcoI 단편에 유사한 뉴클레오티드 서열) (국제 PCT 공개 번호 WO 96/30530)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
추가로, 본 발명의 일부 실시양태에서, 임의의 조직-특이 또는 조직-선호 프로모터가 사용될 수 있다. 조직-특이 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 식물은 특이적인 조직에서 배타적으로, 또는 우선적으로 코딩 서열의 생성물을 제조할 수 있다. 예시적인 조직-특이 또는 조직-선호 프로모터로는 뿌리-선호 프로모터, 예를 들어, 파세올린 유전자로부터의 것; 잎-특이 및 광-유도성 프로모터, 예를 들어, cab 또는 루비스코(rubisco)로부터의 것; 또 다른-특이 프로모터, 예를 들어, LAT52로부터의 것; 화분-특이 프로모터, 예를 들어, Zm13으로부터의 것; 및 소포자-선호 프로모터, 예를 들어, apg로부터의 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
형질전환: 본원에서 사용되는 바, "형질전환" 또는 "형질도입"이라는 용어는하나 이상의 핵산 분자(들)를 세포 내로 전달하는 것을 의미한다. 세포 내로 형질도입된 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 도입에 의해, 또는 에피솜 복제 의해 세포에 의해 안정적으로 복제될 때 세포는 상기 핵산 분자에 의해 "형질전환된다." 본원에서 사용되는 바, "형질전환"이라는 용어는 핵산 분자를 상기 세포 내로 도입할 수 있는 모든 기법을 포함한다. 그 예로는 바이러스 벡터를 이용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 이용한 형질전환; 전기천공 (문헌 [Fromm et al., (1986), Nature 319:791-3]); 리포펙션 (문헌 [Feigner et al., (1987), Proc . Natl. Acad . Sci . USA 84:7413-7]); 미세주입 (문헌 [Mueller et al., (1978), Cell 15:579-85]); 아그로박테리움-매개 전달 (문헌 [Fraley et al., (1983), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 80:4803-7]); 직접적인 DNA 흡수; 및 미세발사체 충돌 (문헌 [Klein et al., (1987), Nature 327:70])을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
트랜스진: 외인성 핵산 서열. 일부 예에서, 트랜스진은 1개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열일 수 있다. 특정 예에서, 트랜스진은 1개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP 및 1개 이상의 추가의 펩티드 서열 (예를 들어, 제초제 저항성을 부여는 펩티드 서열)을 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, 그를 위해서는 색소체 발현이 바람직할 수 있다. 상기 및 다른 예에서, 트랜스진은 트랜스진의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 유기체 (예를 들어, 식물)를 언급하는 데 사용될 때, "트랜스제닉"이라는 용어는 외인성 핵산 서열을 포함하는 유기체를 의미한다. 일부 예에서, 외인성 핵산 서열을 포함하는 유기체는 핵산 서열이 분자 형질전환 기법을 통해 그 안으로 도입되어 있는 유기체일 수 있다. 다른 예에서, 외인성 핵산 서열을 포함하는 유기체는 핵산 서열이 식물에서 예를 들어, 유전자 이입 또는 타가 수분에 의해서 그 안으로 도입되어 있는 유기체일 수 있다.
수송: 본원에서 사용되는 바, "수송(들)," "표적(들)," 및 "전달(들)"이라는 용어는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 숙주 세포의 핵으로부터 숙주 세포의 색소체로의 이동을 용이하게 하는 본 발명의 특정 아미노산 서열의 특성을 의미한다. 특정 실시양태에서, 상기 아미노산 서열 (즉, 합성 브라시카-유래 CTP 서열)은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 중 약 100%, 약 95% 이상, 약 90% 이상, 약 85% 이상, 약 80% 이상, 약 70% 이상, 약 60% 이상, 및/또는 약 50% 이상을 숙주 세포의 색소체로 수송할 수 있다.
벡터: 예를 들어, 형질전환된 세포를 제조하기 위해 세포 내로 도입되는 핵산 분자. 벡터는 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 허용하는 핵산 서열, 예를 들어, 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터의 예로는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드; 코스미드; 박테리오파지; 또는 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 벡터는 또한 하나 이상의 유전자, 안티센스 분자, 및/또는 선별가능한 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환, 또는 감소시킴으로써 세포가 벡터에 의해 코딩되는 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현할 수 있도록 할 수 있다. 벡터는 임의적으로 핵산 분자를 세포 내로 진입시키는 도움을 주는 물질 (예를 들어, 리포좀, 단백질 코팅 등)을 포함한다.
구체적으로 명시, 또는 암시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바 "하나"("a," "an") 및 "그"라는 용어는 "1개 이상의"라는 것을 의미한다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 당업계의 숙련가가 통상 이해하는 것과 같은 의미를 가진다. 분자 생물학상의 일반 용어에 관한 정의는 예를 들어, 문헌 [Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)]; [Kendrew et al., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology , Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference , VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 살펴볼 수 있다. 달리 언급되지 아는 한, 모든 백분율(%)은 중량%이고, 모든 용매 혼합물 비율은 부피%이다. 모든 온도는 섭씨도이다.
IV . 합성 브라시카 -유래 CTP -코딩 서열을 포함하는 핵산 분자
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 1 개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열은 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 특정 일례에서, TraP12, 또는 TraP13 서열이 관심 폴리펩티드의 N-말단에 융합되어 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단일 핵산 분자를 제공한다.
합성 브라시카-유래 CTP는 브라시카 EPSPS 유전자로부터 유래될 수 있다. 이러한 실시양태의 특정 일례에서, 브라시카 EPSPS 유전자는 서열 1로 기재된 핵산 서열, 상이한 EPSPS 유전자로부터의 상동 핵산 서열, 또는 서열 1로 기재된 핵산 서열을 포함하는 브라시카 EPSPS 유전자의 오르토로그를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 합성 브라시카-유래 엽록체 전이 펩티드는 키메라 브라시카-유래 CTP일 수 있다. 참조 브라시카 CTP 서열 내에 포함된 제1 인접한 아미노산 서열을 상이한 CTP 서열(예를 들어, 아라비돕시스 종으로부터 수득된 CTP 서열) 내에 포함된 제2 인접한 아미노산 서열에 연결하여 참조 브라시카 CTP 서열에서 합성 키메라 브라시카-유래 CTP가 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 참조 서열이 수득되는 브라시카 종(예를 들어, 상이한 브라시카 종, 브라시카 종 이외의 식물; 하등 광합성 진핵 생물, 예를 들어, 녹조류(Chlorophyte); 및 원핵 생물, 예를 들어, 시아노 박테리아 또는 아그로박테리움)의 게놈 이외의 게놈으로부터의 상동 유전자 서열로 제2 인접한 아미노산 서열을 포함하는 상이한 CTP 서열을 코딩할 수 있다. 따라서, 참조 브라시카 CTP 서열의 인접한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 참조 브라시카 CTP 서열의 나머지 부분에 상동성인 상이한 CTP 서열로부터의 인접한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합하여 참조 브라시카 CTP-코딩 유전자 서열로부터 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 유래될 수 있다. 상기 및 다른 일례에서, 참조 브라시카 CTP 서열의 인접한 아미노산 서열은 합성 브라시카-유래 CTP의 5' 단부 또는 3' 단부에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 한 브라시카 CTP 서열 내에 포함된 인접한 아미노산 서열을 상이한 브라시카 CTP 서열 내에 포함된 인접한 아미노산 서열과 연결하여 합성 키메라 브라시카-유래 CTP가 복수 개의 브라시카 CTP 서열(참조 브라시카 CTP 서열을 포함)로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상이한 브라시카 종 내 이종동종성 유전자 서열로 복수 개의 브라시카 CTP 서열을 코딩할 수 있다. 일부 일례에서, 복수 개의 브라시카 CTP 서열은 정확하게 두 브라시카 CTP 서열일 수 있다. 따라서, 하나의 브라시카 CTP 서열의 인접한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제1 브라시카 CTP 서열의 나머지 부분에 상동성인 브라시카 CTP 서열의 다른 하나로부터의 인접한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합하여 합성 키메라 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 두 상동성(예를 들어, 실질적으로 상동성) 브라시카 CTP-코딩 유전자 서열(예를 들어, 이종상동성 유전자 서열)로부터 유래될 수 있다. TraP12 및 TraP13은 상기 합성 키메라 브라시카-유래 CTP의 예시적인 일례이다.
일부 실시양태에서, 참조 브라시카 CTP 서열 내에 포함된 인접한 아미노산 서열을 상이한 유기체로부터 수득된 제2 CTP 서열 내에 포함된 인접한 아미노산 서열과 연결하여 합성 키메라 브라시카-유래 CTP가 참조 브라시카 CTP 서열로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상이한 유기체 내 이종상동성 유전자 서열로 제2 CTP 서열을 코딩할 수 있다. 참조 브라시카 CTP 서열의 인접한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 참조 브라시카 CTP 서열의 나머지 부분에 상동성인 상이한 유기체로부터의 CTP 서열로부터 상동성(예를 들어, 실질적으로 상동성) CTP-코딩 유전자 서열(예를 들어, 이종상동성 유전자 서열)로부터의 인접한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합하여 합성 키메라 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 참조 브라시카 CTP 서열로부터 유래될 수 있다. TraPs12 및 TraP13은 브라시카 및 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된 CTP 서열을 포함하는 상기 합성 키메라 CTP의 예시적인 일례이다.
당업자는 참조 브라시카 CTP 서열 내의 제1 인접한 아미노산 서열의 선별 다음에, 상술한 유래 과정에 따른 상동성 CTP 서열의 나머지 부분으로부터 인접한 아미노산 서열의 확인 및 선별이 모호하지 않으며, 자동적이라는 것을 이해할 것이다. 일부 일례에서, 제1 인접한 아미노산 서열은 약 25 내지 약 41 개의 아미노산 길이(예를 들어, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 및 42 개의 아미노산 길이)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 참조 브라시카 CTP 서열 내의 제1 인접한 아미노산 서열은 일부 브라시카 EPSPS 유전자 내에 보존되는 "SVSL"(서열 9) 모티프의 3' 단부에의 위치로 정의한다.
상술한 과정에 따른 합성 키메라 브라시카-유래 CTP 서열의 예는 서열 6 및 8로 나타난다. 유전자 코드의 축퇴성에 비추어, 상기 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 속(genus)은 당업자가 즉시 구상할 것이다. 상기 특정 일례는 B. 나푸스 ESPSP 유전자의 다수 ESPSP 오르토로그 중 하나로부터의 상동성 CTP로부터 인접한 서열을 도입함으로써 합성 키메라 브라시카-유래 CTP의 구조적 특징을 도시한다.
일부 실시양태는 합성 브라시카-유래 엽록체 전이 펩티드의 기능적 변이체 및/또는 이를 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 기능적 변이체는 예를 들어 및 제한 없이: 서열 1로 기재된 브라시카 CTP-코딩 서열의 호모로그 및/또는 오르토로그로부터 유래된 합성 브라시카-유래 CTP-코딩 서열 및/또는 이에 따라 코딩된 CTP; 서열 2 내에 인접한 아미노산 서열을 포함하는 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 핵산 및/또는 이에 따라 코딩된 CTP; 서열 5, 7, 11, 12, 13, 15, 17, 및 19 중 하나 내에 인접한 핵산 서열을 포함하는 절두된 합성 브라시카-유래 CTP-코딩 서열; 서열 5, 7, 11, 12, 13, 15, 17, 및 19 중 하나에 실질적으로 상동성인 인접한 핵산 서열을 포함하는 절두된 합성 브라시카-유래 CTP-코딩 서열; 서열 6 및 8 중 하나 내에 인접한 아미노산 서열을 포함하는 절두된 합성 브라시카-유래 CTP; 서열 6 및 8 중 하나 내에 인접한 아미노산 서열을 포함하는 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 핵산, 및/또는 이에 따라 코딩된 CTP; 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 가지는 서열 6 및 8 중 하나 내에 인접한 아미노산 서열을 포함하는 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 핵산, 및/또는 이에 따라 코딩된 CTP; 및 작동가능하게 연결된 펩티드를 색소체-함유 세포 중의 색소체로 유도하는 것으로 입증된, 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환을 가지는, 서열 6 및 8 중 하나 내에 인접한 아미노산 서열을 포함하는 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 핵산, 및/또는 이에 따라 코딩된 CTP를 포함한다.
따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 합성 키메라 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 상기 핵산 분자는 예를 들어, 분자 생물학 기법에서 본 발명의 CTP-코딩 서열의 조작을 용이하게 하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 CTP-코딩 서열은 서열을 발현 벡터로 서브-클로닝하는 데 적합한 벡터 내로 도입될 수 있거나, 또는 본 발명의 CTP-코딩 서열은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 CTP-코딩 서열을 포함하는 추가의 핵산 분자의 제조를 용이하게 하는 핵산 분자 내로 도입될 수 있다. 상기 및 추가 실시양태에서, 합성 키메라 브라시카-유래 CTP의 서열 중 하나 이상의 아미노산 위치가 삭제될 수 있다. 예를 들어, 합성 키메라 브라시카-유래 CTP의 서열을 개질하여 서열 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 위치에서의 아미노산(들)이 삭제될 수 있다. 상동성 CTP 서열의 정렬을 사용하여 합성 CTP의 기능에 영향을 미치지 않고 아미노산이 삭제될 수 있는 가이드라인을 제공할 수 있다.
특정 일례에서, 합성 브라시카-유래 엽록체 전이 펩티드는 80 개 미만의 아미노산 길이다. 예를 들어, 합성 브라시카-유래 CTP는 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60 개 이하의 아미노산 길이일 수 있다. 특정 일례에서, 합성 브라시카-유래 CTP는 약 65, 약 68, 약 72, 또는 약 74 개의 아미노산 길이일 수 있다. 상기 및 추가 일례에서, 합성 브라시카-유래 CTP는 서열 6 및 8중 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 상술한 것 중 임의의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 따라서, 합성 브라시카-유래 CTP는 서열 6 및 8 중 하나를 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 기능적 변이체를 포함할 수 있으며, 여기서, 합성 브라시카-유래 CTP의 길이는 80 개 미만의 아미노산 길이다. 특정 일례에서, 합성 브라시카-유래 CTP는 예를 들어, 서열 6 및 8 중 하나와 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 92 % 이상, 94 % 이상, 95 % 이상, 96 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 99 % 이상, 또는 100 % 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
임의의 특정 결실 및/또는 보존적 아미노산 치환을 포함하는, 특정 합성 브라시카-유래 CTP, 예를 들어, 서열 6의 TraP12 펩티드, 서열 8의 TraP13 펩티드 또는 상술한 것의 임의의 기능적 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전부는 본 개시내용에 비추어 당업자에 의해 인식될 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 특정 아미노산 서열에 대한 한정된 개수의 코딩 서열을 제공한다. 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 특정 서열을 선택하는 것은 실시자의 재량에 달려 있다. 상이한 적용에 있어서는 상이한 코딩 서열이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특정 숙주에서 합성 브라시카-유래 CTP의 발현을 증가시키기 위해서는 숙주의 코돈 사용 빈도 편향을 반영하는 코딩 서열이 선택될 수 있다. 일례로, 합성 브라시카-유래 CTP는 서열 5, 7, 11, 12, 13, 15, 17, 및 19 중 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서 제공되는 핵산 분자에서, 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈 및 관심 뉴클레오티드 서열의 첫번째 코돈은 예를 들어, 인트론 또는 "종결(STOP)"에 대한 코딩 없이, 임의 개수의 뉴클레오티드 트리플렛만큼 이격되어 있을 수 있다. 일부 예에서, 보통 천연 전구체 폴리펩티드에서 엽록체 전이 펩티드와 회합되어 있는 성숙한 단백질의 첫번째 아미노산을 코딩하는 서열은 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈과 관심 뉴클레오티드 서열의 첫번째 코돈 사이에 존재할 수 있다. 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 관심 뉴클레오티드 서열의 첫번째 코돈을 이격시키는 서열은 예를 들어, 임의의 서열로 구성될 수 있고, 이로써, 코딩된 아미노산 서열은 번역된 키메라 폴리펩티드, 및 그의 색소체로의 번역을 유의적으로 변경시킬 가능성은 없다. 상기 및 추가의 실시양태에서, 합성 브라시카-유래 엽록체 전이 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈은 상-레지스터에서, 그에 바로 인접한 관심 뉴클레오티드 서열의 첫번째 코돈과 융합될 수 있거나, 그로부터 단쇄 펩티드 서열에 불과한 것, 예를 들어, 합성 뉴클레오티드 링커 (융합을 달성하는 데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 링커)에 의해 코딩된 것만큼 이격되어 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 특정 숙주에서 코딩 서열의 발현을 증진시키기 위해 단일 코딩 서열 중 관심 뉴클레오티드 서열 및/또는 그에 융합된 합성 브라시카-유래 CTP-코딩 서열로 이루어진 뉴클레오티드를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 유전자 코드는 64 개의 가능한 코돈으로 중복되지만, 대부분의 유기체는 우선적으로 상기 코돈의 서브세트를 이용한다. 한 종에서 가장 자주 사용되는 코돈은 최적의 코돈이라고 명명되고, 그렇게 자주 사용되지 않는 것은 희귀 또는 사용 빈도가 낮은 코돈으로 분류된다 (문헌 [Zhang et al. (1991), Gene 105:61-72]). 코돈은 때때로 "코돈 최적화"로 지칭되는 과정에서 특정 숙주의 바람직한 코돈 사용 빈도를 반영하기 위해 치환될 수 있다. 특정 원핵성 또는 진핵성 숙주가 선호하는 코돈을 함유하는 최적화된 코딩 서열은 예를 들어, 번역률을 증가시키거나, 원하는 특성 (예를 들어, 비-최적화된 서열로부터 제조된 전사체와 비교하여 보다 장기간의 반감기)을 가지는 재조합 RNA 전사체를 생산함으로써 제조할 수 있다.
임의의 폴리펩티드는 합성 브라시카-유래 CTP 서열의 도입에 의해 색소체 함유 세포의 색소체로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 연결된 폴리펩티드-CTP 분자가 발현되는 세포에서 폴리펩티드를 색소체로 유도하기 위해 폴리펩티드는 합성 브라시카-유래 CTP 서열에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 합성 브라시카-유래 CTP 서열의 도입에 의해 색소체로 표적화되는 폴리펩티드는 예를 들어, 보통은 폴리펩티드가 천연적으로 발현되는 세포의 색소체에서 발현되는 것인 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 및 제한 없이, 합성 브라시카-유래 CTP 서열의 도입에 의해 색소체로 표적화되는 폴리펩티드는 제초제 저항성, 바이러스 저항성, 박테리아 병원체 저항성, 곤충 저항성, 선충 저항성, 또는 진균 저항성에 관여하는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,569,823; 5,304,730; 5,495,071; 6,329,504; 및 6,337,431을 참조할 수 있다. 별법으로, 합성 브라시카-유래 CTP 서열의 도입에 의해 색소체로 표적화되는 폴리펩티드는 예를 들어, 및 제한 없이, 식물 생장력 또는 수율에 관여하는 폴리펩티드(극한 온도, 토양 조건, 조도, 수위, 및 화학적 환경에 대한 내성에 관여하는 폴리펩티드 포함), 또는 관심 형질을 포함하는 식물을 확인하기 위한 마커로서 사용될 수 있는 폴리펩티드(예를 들어, 선별가능한 마커 유전자 생성물, 종자 색상에 관여하는 폴리펩티드 등)일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 합성 브라시카-유래 CTP 서열에 연결될 수 있는, 제초제 저항성에 관여하는 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 아세토락테이트 신타제(ALS), 돌연변이화된 ALS, 및 ALS의 전구체(예를 들어, 미국 특허 5,013,659 참조); EPSPS(예를 들어, 미국 특허 4,971,908 및 6,225,114 참조), 예를 들어, CP4 EPSPS 또는 부류 III EPSPS; 광합성, 및 지방산, 아미노산, 오일, 카로티노이드, 테르페노이드, 전분 등의 합성을 비롯한, 색소체에 발생하는 생리학적 과정을 변형시키는 효소를 포함한다. 특정 실시양태에서, 합성 브라시카-유래 엽록체 전이 펩티드에 연결될 수 있는 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 제아크산틴 에폭시다제, 콜린 모노옥시게나제, 페로킬라타제, 오메가-3 지방산 데세튜라제, 글루타민 신테타제, 전분 개질 효소, 필수 아미노산, 프로비타민 A, 호르몬, Bt 독소 단백질 등의 합성에 관여하는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 언급된 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에서 공지되어 있고, 상기 뉴클레오티드 서열은 합성 브라시카-유래 CTP에 연결된 관심 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드로 발현되도록 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 추가로, 상기 언급된 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 서열은(예를 들어, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 다른 유전자와 고도한 상동성을 가지는 유전자를 클로닝함으로써) 당업자에 의해 확인될 수 있다. 일단 상기 뉴클레오티드 서열이 확인되고 나면, 확인된 뉴클레오티드 서열, 또는 등가의 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 합성 브라시카-유래 CTP-코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 디자인하는 것은 간단한 과정이다.
V. 합성 브라시카 -유래 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 발현
일부 실시양태에서, 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP, 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1 개 이상의 핵산 분자(들)는 그 안에서 폴리펩티드를 발현시키기 위한 것인 세포, 조직, 또는 유기체 내로 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP 및 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 1 개 이상의 추가의 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 색소체 함유 숙주 세포, 조직, 또는 유기체(예를 들어, 식물 세포, 식물 조직, 및 식물) 내로 도입될 수 있고, 이로써, 폴리펩티드는 색소체 함유 숙주 세포, 조직, 또는 유기체에서 핵산 분자로부터 발현될 수 있으며, 여기서, 발현된 폴리펩티드는 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP 및 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 1 개 이상의 추가의 펩티드 서열을 포함한다. 특정 일례에서, 상기 발현된 폴리펩티드의 합성 브라시카-유래 CTP는 1 개 이상의 추가의 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 숙주 세포, 조직, 또는 유기체의 색소체로 표적화하는 것을 촉진시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 당업자에게 공지된 방법들 중 임의의 한 방법에 의해 색소체 함유 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자를 세포, 조직, 또는 유기체 내로 도입시키기 위해 숙주 세포, 조직, 또는 유기체를 핵산 분자와 접촉시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자를 세포 내로 도입시키고, 핵산 분자를 세포의 게놈 내로 안정하게 통합시키기 위해 세포를 핵산 분자로 형질전환시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 브라시카-유래 CTP를 코딩하는 1 개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 세포, 예를 들어, 색소체 함유 세포(예를 들어, 식물 세포)의 형질전환에 사용될 수 있다. 발현을 개시하거나, 증진시키기 위해, 핵산 분자는 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있으며, 상기 조절 서열은 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
핵산 분자는 예를 들어, 선형 또는 폐환형 플라스미드를 비롯한, 벡터 시스템일 수 있다. 특정 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 예를 들어, 벡터 내로 삽입될 수 있다. 많은 벡터들이 이러한 목적을 위해 이용될 수 있으며, 특정 벡터를 선택하는 것은 예를 들어, 벡터 내로 삽입시키고자 하는 핵산의 크기, 및 벡터로 형질전환되는 특정 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 벡터는 전형적으로 다양한 성분을 함유하며, 그의 아이덴티티는 벡터의 기능(예를 들어, DNA 증폭 및 DNA 발현), 및 벡터와 화합성인 특정 숙주 세포(들)에 따라 달라진다.
일부 실시양태는 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)에 작동적으로 연결된 상기 기술된 조절 서열 중 1 개 이상을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 형질전환 벡터를 포함할 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드 서열은 식물 세포, 조직, 또는 유기체에서 조절 서열(들)의 제어하에 발현됨으로써 폴리펩티드의 적어도 일부를 식물 세포, 조직, 또는 유기체의 색소체로 표적화하는 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 숙주 세포, 예를 들어, 핵산 분자가 증폭되는 박테리아 세포, 또는 핵산 분자가 발현되는 식물 세포에서 작용하는 프로모터일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 유도성, 바이러스성, 합성, 또는 구성적 프로모터를 포함하며, 이는 모두 당업계에 주지되어 있다. 본 발명의 실시양태에서 유용할 수 있는 프로모터의 비제한적인 일례는 미국 특허 번호 제6,437,217호호(옥수수 RS81 프로모터); 제5,641,876호(벼 액틴 프로모터); 제6,426,446호(옥수수 RS324 프로모터); 제6,429,362호(옥수수 PR-1 프로모터); 제6,232,526호(옥수수 A3 프로모터); 제6,177,611호(옥수수 구성적 프로모터); 제5,322,938호, 제5,352,605호, 제5,359,142호, 및 제5,530,196호(35S 프로모터); 제6,433,252호(옥수수 L3 올레오신 프로모터); 제6,429,357호(벼 액틴 2 프로모터, 및 벼 액틴 2 인트론); 제6,294,714호(광-유도성 프로모터); 제6,140,078호(염-유도성 프로모터); 제6,252,138호(병원체-유도성 프로모터); 제6,175,060호(인 결핍-유도성 프로모터); 제6,388,170호(양방향 프로모터); 제6,635,806호(감마-코익신 프로모터); 미국 특허 출원 시리얼 번호 제09/757,089호(옥수수 엽록체 알돌라제 프로모터)에 의해 제공되어 있다.
추가의 예시적인 프로모터로는 노팔린 신타제(NOS) 프로모터(문헌 [Ebert et al., (1987), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84(16):5745-9]); 옥토파인 신타제 (OCS) 프로모터(아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양 유도성 플라스미드로 운반); 칼리모바이러스 프로모터, 예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 19S 프로모터(문헌 [Lawton et al., (1987), Plant Mol . Biol. 9:315-24]); CaMV 35S 프로모터(문헌 [Odell et al., (1985), Nature 313:810-2]); 피그워트 모자이크 바이러스 35S-프로모터(문헌 [Walker et al., (1987), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84(19):6624-8]); 수크로스 신타제 프로모터 (문헌 [Yang and Russell (1990), Proc . NatL Acad . Sci . USA 87:4144-8]); R 유전자 복합체 프로모터 (문헌 [Chandler et al., (1989), Plant Cell 1:1175-83]); 엽록소 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV35S (미국 특허 번호 제5,322,938호, 제5,352,605, 제5,359,142호, 및 제5,530,196호); FMV35S (미국 특허 번호 제6,051,753호, 및 제5,378,619호); PC1SV 프로모터 (미국 특허 번호 제5,850,019호); SCP1 프로모터 (미국 특허 번호 제6,677,503호); 및 AGRtu.nos 프로모터 (진뱅크 수탁 번호 V00087; 문헌 [Depicker et al., (1982), J. Mol . Appl . Genet . 1:561-73]; [Bevan et al., (1983), Nature 304:184-7])를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 조직-특이 프로모터를 포함할 수 있다. 조직-특이 프로모터는 유기체의 다른 조직과 비교하여, 프로모터가 특이적인 조직에서 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 더 높은 수준으로 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 조직-특이 프로모터의 예로는 제한 없이, 융단 조직-특이 프로모터; 수술-특이 프로모터; 화분-특이 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 번호 제7,141,424호, 및 국제 PCT 공개 번호 WO 99/042587 참조); 배주-특이 프로모터; (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 2001/047525 A1 참조); 과실-특이 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 번호 제4,943,674호, 및 제5,753,475호 참조); 및 종자-특이 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 번호 제5,420,034호, 및 제5,608,152호 참조)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발생 단계-특이 프로모터 (예를 들어, 발생 후기 단계에서 활성을 가진 프로모터)가 본 발명의 조성물 또는 방법에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열로는 번역 리더 서열로서의 작용을 하는, 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치하는 5' UTR을 포함한다. 번역 리더 서열은 완전하게 프로세싱된 mRNA에 존재하고, 이는 1차 전사체의 프로세싱, 및/또는 RNA의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 번역 리더 서열의 예로는 옥수수 및 페튜니아 열 쇼크 단백질 리더 (미국 특허 번호 제5,362,865호), 식물 바이러스 외피 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Turner and Foster (1995), Molecular Biotech . 3(3):225-36]을 참조할 수 있다. 5' UTR의 비제한적인 일례는 GmHsp (미국 특허 번호 제5,659,122호); PhDnaK (미국 특허 번호 제5,362,865호); AtAntl; TEV (문헌 [Carrington and Freed (1990), J. Virol . 64:1590-7]); 및 AGRtunos (진뱅크 수탁 번호 V00087; 및 문헌 [Bevan et al., (1983), Nature 304:184-7])에 의해 제공된다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 조절 서열로는 3' 비번역 서열, 3' 전사 종결 영역, 또는 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 상기의 서열은 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는 유전 요소이며, 이는 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사 또는 mRNA 프로세싱에 영향을 줄 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드를 mRNA 전구체의 3' 단부에 부가하는 작용을 한다. 폴리아데닐화 서열은 다양한 식물 유전자로부터, 또는 T-DNA 유전자로부터 유래된 것일 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비-제한적인 일례로는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; 문헌 [Fraley et al., (1983), Proc . Natl . Acad . Sci. USA 80:4803-7])이 있다. 상이한 3' 비번역 영역의 사용에 관한 일례는 문헌 [Ingelbrecht et al., (1989), Plant Cell 1:671-80]에 제공되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비제한적인 일례로 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자로부터의 것 (Ps.RbcS2-E9; 문헌 [Coruzzi et al., (1984), EMBO J. 3:1671-9]) 및 AGRtu.nos (진뱅크 수탁 번호 E01312)를 포함한다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 형질전환된 세포, 예를 들어, 식물 세포에 선별가능한 표현형을 부여하는 선별가능한 마커선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 선별가능한 마커는 또한 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 세포를 선별하는 데에도 사용도리 수 있다. 마커는 살생물제 저항성, 항생제 저항성 (예를 들어, 카나마이신, 제네티신(Geneticin) (G418), 블레오마이신, 히그로마이신 등.), 또는 제초제 저항성 (예를 들어, 글리포세이트 등)을 코딩할 수 있다. 선별가능한 마커의 예로는 카나마이신 저항성을 코딩하고, 카나마이신, G418 등의 사용에 대하여 선별될 수 있는 neo 유전자; 비알라포스 저항성을 코딩하는 bar 유전자; 글리포세이트 저항성을 코딩하는 돌연변이체 EPSP 신타제 유전자; 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 니트릴라제 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 유전자 (ALS); 및 메토트렉세이트 저항성 DHFR 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 겐타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신, 스펙티노마이신, 리팜피신, 스트렙토마이신 및 테트라시클린 등에 대한 저항성을 부여하는 다중 선별가능한 마커가 이용가능하다. 상기 선별가능한 마커의 예는 예를 들어, 미국 특허 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708 및 6,118,047에 예시되어 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터는 또한 또는 별법으로 스크리닝이 가능한 마커를 포함한다. 스크리닝이 가능한 마커는 발현을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝이 가능한 마커로는 β-글루쿠로니다제 또는 그에 대한 다양한 발색성 기질이 알려져 있는 효소를 코딩하는 uidA 유전자 (GUS) (문헌 [Jefferson et al., (1987), Plant Mol Biol . Rep . 5:387-405]); 식물 조직에서 안토시아닌 색소 (적색)의 제조를 조절하는 생성물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (문헌 [Dellaporta et al., (1988) "Molecular cloning of the maize R- nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82]); β-락타마제 유전자 (문헌 [Sutcliffe et al., (1978), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 75:3737-41]); 그에 대한 다양한 발색성 기질이 알려져 있는 효소를 코딩하는 유전자 (예를 들어, 발색성 세팔로스포린인 PADAC); 루시퍼라제 유전자 (문헌 [Ow et al., (1986), Science 234:856-9]); 발색성 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (문헌 [Zukowski et al., (1983), Gene 46(2-3):247-55]); 아밀라제 유전자 (문헌 [Ikatu et al., (1990), Bio / Technol . 8:241-2]); 티로신을, 결국에는멜라닌으로 축합되는 DOPA 및 도파퀴논으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (문헌 [Katz et al., (1983), J. Gen . Microbiol 129:2703-14]); 및 α-갈락토시다제를 포함한다.
숙주 세포를 형질전환시키는 데 적합한 방법은 DNA를 예를 들어, 및 제한 없이, 원형질체의 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허5,508,184 참조); 건조/억제-매개 DNA 흡수에 의해 (예를 들어, 문헌 [Potrykus et al., (1985), Mol . Gen . Genet . 199:183-8] 참조); 전기천공에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,384,253 참조); 탄화규소 섬유를 이용한 교반에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765 참조); 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,563,055, 5,591,616, 5,693,512, 5,824,877, 5,981,840, 및 6,384,301 참조); 및 DNA 코팅된 입자의 가속화 등에 의해 (예를 들어, 미국 특허 5,015,580, 5,550,318, 5,538,880, 6,160,208, 6,399,861, 및 6,403,865) 세포 내로 도입시킬 수 있는 임의의 방법을 포함한다. 예를 들어, 상기와 같은 기법을 적용함으로써 사실상 임의 종의 세포를 안정하게 형질전환시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질전환 DNA는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 다세포 종일 경우, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 유기체로 재생될 수 있다. 상기 기법들 중 임의의 것을 사용하여 예를 들어, 트랜스제닉 식물의 게놈 중에 본 발명의 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 제조할 수 있다.
발현 벡터를 식물 내로 도입시키는 데 가장 널리 사용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. A. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 A. 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. A. 투메파시엔스 및 A. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적 형질전환을 담당하는 유전자를 보유한다. Ti (종양 유도성)-플라스미드는 T-DNA로 알려져 있는 큰 세그먼트를 포함하는데, 상기 세그먼트는 형질전환된 식물로 전달된다. Ti 플라스미드의 또 다른 세그먼트인 vir 영역은 T-DNA 전달을 담당한다. T-DNA 영역은 말단 반복부와 경계를 이룬다. 일부 변형된 이원성 벡터에서, 종양 유도성 유전자는 결실되어 있고, vir 영역의 작용을 이용하여 T-DNA 경계부 서열과 경계를 이루는 외래 DNA를 전달한다. T-영역은 또한 예를 들어, 트랜스제닉 식물 및 세포의 효율적인 회수를 위한 선별가능한 마커, 및 예를 들어, 합성 브라시카-유래 CTP-코딩 핵산과 같은, 전달용 서열을 삽입하기 위한 다중 클로닝 부위를 포함할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 식물 형질전환 벡터는 A. 투메파시엔스의 Ti 플라스미드(예를 들어, 미국 특허 번호 제4,536,475호, 제4,693,977호, 제4,886,937호, 및 제5,501,967호; 및 유럽 특허 EP 0 122 791), 또는 A. 리조게네스의 Ri 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 추가의 식물 형질전환 벡터는 예를 들어, 및 제한 없이, 문헌[Herrera-Estrella et al., (1983), Nature 303:209-13]; [Bevan et al., (1983), Nature 304:184-7]; [Klee et al., (1985), Bio / Technol. 3:637-42]; 및 유럽 특허 EP 0 120 516에 기술되어 있는 것; 및 상기 중 임의의 것으로부터 유래된 것을 포함한다. 천연적으로 식물과 상호작용하는 다른 박테리아, 예를 들어, 시노리조비움(Sinorhizobium), 리조비움(Rhizobium), 및 메조리조비움(Mesorhizobium)은 다수의 다양한 식물로의 유전자 전달을 매개하기 위해 변형될 수 있다. 상기의 식물-관련 공생 박테리아는 무장 해제된 Ti 플라스미드 및 적합한 이원성 벡터, 둘 모두를 획득함으로써 유전자 전달을 위한 능력을 가지게 될 수 있다.
외인성 DNA를 수용체 세포에 제공한 후, 일반적으로는 추가의 배양 및 식물 재생을 위해 형질전환된 세포를 확인한다. 형질전환된 세포를 확인할 수 있는 능력을 개선시키기 위해서는 형질전환체를 생성하는 데 사용되는 벡터와 함께, 앞서 기술된 바와 같은, 선별가능한 또는 스크리닝이 가능한 마커 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 선별가능한 마커가 사용되는 경우, 형질전환된 세포는 상기 세포를 선별제 또는 선별제들에 노출시킴으로써 잠재적으로 형질전환된 세포 집단 내에서 확인된다. 스크리닝이 가능한 마커가 사용되는 경우, 세포는 원하는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝될 수 있다.
선별제에의 노출에서 살아남은 세포, 또는 스크리닝 검정법에서 양성인 것으로 평가된 세포를 식물의 재생을 지지하는 배지 중에서 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지(예를 들어, MS 및 N6 배지)는 추가 물질, 예를 들어, 성장 조절 인자의 포함으로 개질될 수 있다. 조직은 식물 재생의 노력을 개시하는 데 충분한 조직이 이용될 수 있을 때까지, 또는 수동식 선별 라운드를 반복한 후, 조직의 형태가 재생에 적합한 형태가 될 때까지(예를 들어, 2 주 이상) 성장 조절 인자를 포함하는 기초 배지 상에서 유지시킨 후, 새싹 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨 놓는다. 충분한 새싹 형성이 일어날 때까지 주기적으로 배양물을 옮겨 놓는다. 일단 새싹이 형성되고 나면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮겨 놓는다. 일단 뿌리가 형성되고 나면, 추가 성장 및 성숙화를 위해 식물을 토양으로 옮겨 놓을 수 있다.
재생 식물 중 관심 핵산 분자(예를 들어, 1개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정법이 수행될 수 있다. 상기 검정법으로는 예를 들어, 분자 생물학 검정법, 예를 들어, 써던 및 노던 블롯팅, PCR, 및 핵산 서열 분석; 생화학적 검정법, 예를 들어, 면역학적 수단에 의해(ELISA 및/또는 웨스턴 블롯), 또는 효소 작용에 의해 단백질 생성물의 존재를 검출하는 것; 식물 일부에 대한 검정법, 예를 들어, 잎 또는 뿌리 검정법; 및 재생된 전체 식물의 표현형 분석을 포함한다.
일례로서, 관심 뉴클레오티드 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 통합 이벤트를 분석할 수 있다. PCR 유전형 분석은 제한하는 것은 아니지만, 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유할 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 폴리머라제-연쇄 반응 (PCR) 증폭에 이어서, PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 수행하는 것을 포함하는 것으로 이해된다. PCR 유전형 분석 방법은 잘 기술되어 있으며(예를 들어, 문헌[Rios, G. et al., (2002), Plant J. 32:243-53] 참조), 임의의 식물 중 (예를 들어, Z. 메이스(Z. mays) 또는 G. 맥스(G. max)) 또는 세포 배양물을 비롯한 조직 유형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다.
아그로박테리움-의존성 형질전환 방법을 사용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 한 염색체 내로 삽입된 단일 재조합 DNA 서열을 포함한다. 단일 재조합 DNA 서열은 "트랜스제닉 이벤트" 또는 "통합 이벤트"로 지칭된다. 상기 트랜스제닉 식물은 삽입된 DNA 서열에 대해 이형접합성이다. 일부 실시양태에서, 트랜스진과 관련하여 동형접합성인 트랜스제닉 식물은 단일 외인성 유전자 서열을 포함하는 독립 분리 개체 트랜스제닉 식물을 그 자신, 예를 들어, F0 식물과 유성적으로 교배시켜 (자가 수정시켜) F1 종자를 제조함으로써 수득할 수 있다. 제조된 F1 종자 중 1/4은 트랜스진과 관련하여 동형접합성일 것이다. F1 종자를 발아시킴으로써, 전형적으로 SNP 검정법, 또는 이형접합체와 동형접합체가 구별될 수 있게 하는 열 증폭 검정법(즉, 접합성 검정법)을 사용하여 이형접합성에 대해 시험될 수 있는 식물을 제조한다.
특정 실시양태에서, 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 1개 이상의 폴리펩티드의 카피는, 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 1개 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 1 개 이상의 핵산 분자(들)가 그 내부로 도입되어 있는 색소체 함유 세포에서 제조된다. 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 각 폴리펩티드는 상이한 형질전환 이벤트에 도입된 다중 핵산 서열로부터, 또는 단일 형질전환 이벤트에 도입된 단일 핵산 서열로부터 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수 개의 상기 폴리펩티드는 단일 프로모터의 제어하에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 복수 개의 상기 폴리펩티드는 다중 프로모터의 제어하에서 발현된다. 각각의 펩티드 서열이 색소체로 표적화되는 것인, 다중 펩티드 서열을 포함하는 단일 폴리펩티드가 발현될 수 있다.
재조합 핵산 분자를 이용한 식물의 직접적인 형질전환 이외에도, 트랜스제닉 식물은 1 개 이상의 트랜스제닉 이벤트를 가지는 제1 식물을 상기 이벤트를 포함하지 않는 제2 식물과 교배시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 쉽게 형질전환되는 제1 식물 계통 내로 도입함으로써 트랜스제닉 식물을 제조할 수 있고, 이 트랜스제닉 식물을 제2 식물 계통과 교배시켜 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제2 식물 계통으로 이입시킬 수 있다.
VI . 합성 브라시카 -유래 엽록체 전이 펩티드-유도된 폴리펩티드를 포함하는 식물 물질
일부 실시양태에서, 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 세포를 포함하는 것인 식물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 식물은 식물 조직 또는 식물 세포의 형질전환, 및 전체 식물의 재생에 의해 제조될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 식물은 상업적 공급원으로부터, 또는 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 생식질로의 유입을 통해 수득될 수 있다. 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 세포를 포함하는 식물 물질 또한 제공한다. 상기 식물 물질은 식물 세포를 포함하는 식물로부터 수득될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 식물 물질은 식물을 제조하는 재생 능력이 없는 식물 세포이다.
일부 실시양태에서, 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 물질은 하기 특징들 중 하나 이상의 것을 나타낸다: 식물의 세포에서 폴리펩티드 발현; 식물의 세포의 색소체에서 폴리펩티드의 일부를 발현; 식물 세포의 세포질부터 세포의 색소체로의 폴리펩티드 이입; 식물의 세포에서 폴리펩티드의 색소체-특이 발현; 및/또는 식물의 세포에서 폴리펩티드의 국재화. 상기 식물은 코딩된 폴리펩티드의 발현 이외에 하나 이상의 바람직한 형질을 추가로 가질 수 있다. 상기 형질로는 예를 들어, 곤충, 다른 해충, 및 질환 유발제에 대한 저항성; 제초제에 대한 내성; 안정성, 수율 또는 저장 기간 증진; 환경상의 내성; 제약 생산; 산업적 제품 생산; 및 영양상 증진을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 본 발명의 핵산 분자로 형질전환될 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 따라서, 식물은 쌍자엽 또는 단자엽일 수 있다. 본 방법에서 사용될 수 있는 쌍자엽 식물의 비제한적인 일례로 아라비돕시스, 알팔파, 콩류, 브로콜리, 양배추, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 배추, 목화, 오이, 가지, 양상치, 멜론, 완두콩, 고추, 땅콩, 감자, 호박, 무, 평지씨, 시금치, 대두, 애호박, 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토, 및 수박을 포함한다. 본 방법에서 사용될 수 있는 단자엽 식물이 비제한적인 일례로 옥수수, 브라시카, 양파, 벼, 수수, 소맥, 호밀, 기장, 사탕수수, 귀리, 라이밀, 스위치그라스, 및 잔디를 포함한다. 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물은 사용될 수 있거나, 임의 방식으로 재배될 수 있다.
일부 실시양태는 또한 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 일용품 제품, 예를 들어, 상기 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 함유하는 재조합 식물 또는 종자로부터 생산된 일용품 제품을 제공한다. 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 일용품 제품으로는 예를 들어, 및 제한 없이, 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물로 된 식제품, 밀, 오일, 또는 분쇄된 또는 전체 곡물 또는 종자를 포함한다. 하나 이상의 일용품 또는 일용품 제품 중에서 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 검출하는 것은 사실상 일용품 또는 일용품 제품은 적어도 부분적으로는 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물로부터 제조되었다는 것을 나타내는 증거가 된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 일용품 제품은 1개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 검출가능한 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 일용품 제품은 예를 들어, 트랜스제닉 식물을 수득하고, 그로부터 식품 또는 사료를 제조함으로써 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 1 개 이상의 합성 브라시카-유래 CTP를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 종자는 또한 그의 게놈 내에 제한 없이, 그로부터 iRNA 분자로 전사되는 트랜스제닉 이벤트; 살충 단백질(예를 들어, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 살충 단백질)을 코딩하는 유전자; 제초제 내성 유전자(예를 들어, 글리포세이트에 대해 내성을 제공하는 유전자); 및 트랜스제닉 식물에서 바람직한 표현형(예를 들어, 수율 중가, 지방산 대사 변경, 또는 세포질적 웅성 불임성의 복원)에 기여하는 유전자를 비롯한, 1 개 이상의 다른 트랜스제닉 이벤트를 그의 게놈 내에 포함할 수 있다.
VII . 합성 브라시카 -유래 엽록체 전이 펩티드를 매개로 한 유전자 생성물의 색소체로의 국재화
본 발명의 일부 실시양태는 유전자 생성물을 발현하고/거나, 그를 색소체 (예를 들어, 엽록체)로 국재화시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 유전자 생성물은 마커 유전자 생성물, 예를 들어, 형광성 분자일 수 있다. 합성 브라시카-유래 CTP 또한 포함하는 폴리펩티드의 일부로서 유전자 생성물의 발현은 특정 합성 브라시카-유래 CTP 서열의 색소체-국재화 능력을 평가하기 위한 시스템을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 브라시카-유래 CTP-포함 폴리펩티드의 일부로서 마커 유전자 생성물의 발현을 이용하여 마커 유전자 생성물의 발현을, 폴리펩티드가 발현되는 세포의 색소체로 표적화한다. 특정 실시양태에서, 상기 마커 유전자 생성물을 숙주 세포의 색소체(들)에서 국재화된다. 예를 들어, 마커 유전자 생성물은 숙주 세포의 세포질 또는 다른 세포소기관에서보다는 색소체(들) 중에서 더 높은 수준으로 발현될 수 있거나; 마커 유전자 생성물은 색소체(들) 중에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현될 수 있거나; 마커 유전자 생성물은 본질적으로 색소체(들)에서만 발현될 수 있거나; 또는 마커 유전자 생성물은 전체적으로 색소체(들)에서 발현될 수 있고, 따라서, 세포질 또는 비-색소체 세포소기관에서의 발현은 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드가 마커 유전자 생성물에 작동가능하게 연결된, 합성 브라시카-유래 CTP의 기능적 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 기능적 변이체 펩티드의 특징을 평가한다. 예를 들어, 1 개 이상의 보존적 돌연변이(들)를 합성 브라시카-유래 CTP 내로 도입함으로써 합성 브라시카-유래 CTP의 서열은 달라질 수 있고, 생성된 변이체 펩티드를 마커 유전자 생성물에 연결할 수 있다. 적합한 숙주 세포(예를 들어, 발현 구축물 중의 하나 이상의 조절 요소가 작동가능한 세포)에서 발현시킨 후, 마커 유전자 생성물의 발현을 측정할 수 있다. 참조 합성 브라시카-유래 CTP-마커 구축물과 변이체 펩티드-마커 구축물 사이의 마커 유전자 생성물의 세포하 국재화를 비교함으로써, 변이체 펩티드가 예를 들어, 더 큰 색소체 국재화, 또는 실질적으로 동일한 색소체 국재화를 제공하는지 여부를 측정할 수 있다. 상기 변이체는 기능적 변이체로 간주될 수 있다. 더 큰 소성의 국재화를 제공하는 합성 브라시카-유래 CTP의 기능적 변이체를 확인하기 위해, 상기 변이체 중의 돌연변이를 추가의 합성 브라시카-유래 CTP의 변이체 내로 도입할 수 있다. 다중 회차의 상기 평가 과정을 수행하고, 이어서, 순차적으로 합성 브라시카-유래 CTP 서열에 확인된 바람직한 돌연변이를 도입시킴으로써 합성 브라시카-유래 CTP 서열을 최적화시키기 위한 반복적인 과정을 얻을 수 있다. 상기 최적화된 합성 브라시카-유래 CTP 서열, 및 상기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 최적화된 합성 브라시카-유래 CTP 서열이 추가의 돌연변이에 의해 추가로 최적화될 수 있는지 여부와는 상관없이 본 발명의 일부인 것으로 간주된다.
본원에서 논의된 참고 문헌은 단지 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공하는 것이다. 본원의 어느 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 상기 개시내용보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
하기 실시예는 특정의 특별한 특징 및/또는 측면을 예시하기 위해 제공되는 것이다. 이러한 실시예는, 본 개시내용을 기술되는 특별한 특징 또는 측면으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 키메라 엽록체 전이 펩티드 ( TraP ) 서열의 디자인 및 제조
색소체는 고등 식물 종에서 관찰되는 세포질 세포소기관이며, 이는 모든 식물 조직에 존재한다. 엽록체는 필수적인 생리 작용을 담당하는 녹색 광합성 조직에서 관찰되는 특정 유형의 색소체이다. 예를 들어, 상기의 한 생리 작용으로는 식물이 필요로 하는 방향족 아미노산의 합성이 있다. 핵 코딩된 효소는 상기 생합성 경로에서 요구되며, 이는 세포질로부터 엽록체의 내부로 수송된다. 상기 핵 코딩된 효소는 보통 엽록체 막과 상호작용하는 N-말단 전이 펩티드를 가지며, 이를 통해 상기 펩티드의 엽록체의 스트로마로의 수송은 용이하게 이루어질 수 있다(문헌[Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolution. Trends Cell Bio . 10:440-447]). 이입시, 스트로마 펩티다제는 전이 펩티드를 절단하고, 이로써 성숙한 기능성 단백질이 엽록체 내에 이입된다(문헌[Richter S, Lamppa GK. (1999) Stromal processing peptidase binds transit peptides and initiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts. Journ . Cell Bio . 147:33-43]). 엽록체 전이 펩티드는 길이, 조성 및 구조에 있어 고도의 분기성을 띠는 가변 서열이다(문헌[Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolution. Trends Cell Bio. 10:440 - 447]). 엽록체 전이 펩티드의 서열 유사성은 다른 식물 종으로부터의 상동성 단백질 중에서 유의적으로 분기한다. 프로세싱된 성숙한 기능성 단백질과 비교하였을 때, 상이한 식물 종으로부터 수득된 상동성 단백질은 전형적으로 상대적으로 고수준의 서열 유사성을 공유한다는 점을 고려해 보면, 엽록체 전이 펩티드 사이의 분기량은 예측되지 못한다.
신규한 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열을 디자인하고, 제조하고, 플랜타(planta)내 시험을 수행하였다. 신규한 키메라 엽록체 전이 펩티드는 엽록체 내 작물학상 중요한 단백질의 이입을 위해 효과적인 전위 및 프로세싱 특성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 처음에는, http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/에서 이용가능한 클로로P™ 컴퓨터 프로그램을 통해 상이한 식물 종으로부터의 천연 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPS) 단백질 서열을 분석함으로써 추정 엽록체 전이 펩티드 서열을 확인하였다(문헌[Emanuelsson O, Nielsen H, von Heijne G, (1999) ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites, Protein Science 8; 978-984]). 천연 엽록체 전이 펩티드를 확인한 후, 제1 엽록체 전이 펩티드 서열을 제2 유기체로부터의 제2 엽록체 전이 펩티드 서열과 정렬하였다. 도 2에는 브라시카 나푸스(NCBI 수탁 번호 P17688) 및 아라비돕시스 탈리아나(NCBI 수탁 번호 NP182055)의 EPSPS 엽록체 전이 펩티드 서열의 정렬이 도시되어 있다. 엽록체 전이 펩티드 서열 정렬을 사용하여, 제1 유기체부터의 엽록체 전이 펩티드 서열의 제1 절반부를 제2 유기체로부터의 엽록체 전이 펩티드 서열의 제2 절반부와 함께 대략 1:1의 비로 조합함으로써 신규한 키메라 엽록체 전이 펩티드를 디자인하였다. 새로 디자인된 키메라 엽록체 전이 펩티드의 예시적인 서열은 TraP12(서열 6) 및 TraP13(서열 8)이다. 상기 신규한 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열은 브라시카 나푸스(NCBI 수탁 번호 P17688) 및 아라비돕시스 탈리아나(NCBI 수탁 번호 NP182055)의 EPSPS 단백질로부터 유래된다. TraP12(서열 6) 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열은 브라시카 나푸스로부터 유래된 N-말단, 및 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된 엽록체 전이 펩티드의 C-말단을 포함한다. TraP13(서열 8) 엽록체 전이 펩티드 서열은 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된 N-말단, 및 브라시카 나푸스로부터 유래된 엽록체 전이 펩티드의 C-말단을 포함한다. 키메라 엽록체 전이 펩티드를 다중 검정을 통해 시험한 결과, 이는 일과성 플랜타내 발현 시스템을 트랜스제닉 방식으로 작물학상 중요한 트랜스진 서열에 융합된 유전자 발현 요소를 포함하는 안정한 형질전환 이벤트로서 포함하였다.
실시예 2: 키메라 엽록체 전이 펩티드( TraP ) 서열에 대한 일과성 플랜타내 시험
담배 일과성( transient ) 검정:
일과성 식물체내(in planta) 검정을 통해 TraP12 및 TraP13 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열을 처음 시험하였다. TraP12(서열 5) 및 TraP13(서열 7) 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하였다. 링커 서열(서열 10)을 TraP 서열과 yfp 코딩 서열 사이로 도입하였다. 생성된 구축물은 두 식물 전사 단위(PTU)를 포함하였다. 제1 PTU는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터(AtUbi10 프로모터, 문헌[Callis, et al ., (1990) J. Biol . Chem ., 265: 12486-12493]), TraP-황색 형광성 단백질 융합 유전자(TraP-YFP, 미국 특허 출원 제2007/0298412호), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3'UTR, 미국 특허 제5,428,147호)으로 구성되었다. 제2 PTU는 카사바 베인 모자익 바이러스(Cassava Vein Mosaic Virus) 프로모터(CsVMV 프로모터, 문헌 [Verdaguer et al ., (1996) Plant Molecular Biology, 31:1129-1139]), 포스피노트리신 아세틸 트랜스페라제 (phosphinothricin acetyl transferase)(PAT, 문헌 [Wohlleben et al., (1988) Gene, 70: 25-37]), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 1 3' 비번역 영역(AtuORF1 3'UTR, 문헌[Huang et 　 al ., (1990) J. Bacteriol ., 172:1814-1822])으로 구성되었다. 구축물 pDAB101981은 TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드(도 3)를 포함한다. 구축물 pDAB101989은 TraP13 키메라 엽록체 전이 펩티드(도 4)를 포함한다. yfp 유전자의 엽록체 전이 펩티드 서열 상류를 포함하지 않는, 대조군 플라스미드 101908를 구축하였고 연구에 포함하였다(도 5). 제한 효소 분해 및 서열 분석을 통해 구축물을 확인하였다. 최종적으로, 아그로박테리움 투메페시엔스 내로 구축물을 형질전환하였고 글리세롤 스톡으로 저장하였다.
아그로박테리움 글리세롤 스톡으로부터, 14 ml 멸균관 내 2 ml의 YPD(100μg/ml 스펙티노마이신) 내로 냉동 배양물로 가득찬 루프를 접종하였다. 접종된 매개물을 200 rpm으로 교반하면서 28 ℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날 약 100 μl의 배양물을 사용하여 125 ml 멸균 트리-배플형 플라스크 내에 25 ml의 YPD (100 μg/ml 스펙티노마이신)를 접종하고, 200 rpm으로 교반하면서 28 ℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날 배양물을 멸균 ddH20(pH 8.0) 내 0.5의 OD600로 희석하였다. 희석한 아그로박테리움 균주를 P19 헬퍼 단백질을 포함하는 제2 아그로박테리움 균주와 1:1의 비로 혼합하였다. 문헌[Voinnet O, Rivas S, Mestre P, and Baulcombe D., (2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus, The Plant Journal, 33:949-956]의 방법을 통해 배양물을 담배잎 침투에 사용하였다. 검정될 때까지 3 일 이상 동안 24 ℃에서 16 시간의 광으로 설정된 컨비론™(Conviron™)에 침투된 담배 식물을 두었다.
현미경 검사 결과:
식물에서 아그로박테리움-침투된 담배잎을 얻어서 건조를 방지하기 위해 물이 담긴 페트리-접시에 두었다. 다크 리더 핸드 램프™(Dark Reader Hand Lamp™)(콜로라도주 덜로리스 소재의 클레어 케미컬 리서치 코포레이션(Clare Chemical Research Co.))를 사용하여 제자리에 고정된 롱-패스 필터 글래스로 청색 광 여기하에서 침투된 담배잎을 관찰하여 YFP 보고 단백질을 성공적으로 발현한 잎의 비손상 영역을 확인하였다. 분명하게 확인된 잎 영역을 입에서 절개하고 공초점 현미경(일리노이주 버팔로 그로브 소재의 레이카 TCS-SP5 AOBS™)으로 영상화하기 위해 수중에 두었다. 다중선 아르곤-이온 레이저를 사용하여, 514 nm 레이저 선으로 YFP 보고 단백질을 여기시켰다. 비-발현(어두움) 대조군 잎 샘플을 사용하여 검출 슬릿의 폭을 조정하여 배경 잎 자가형광을 배제하였다. 엽록체 국재화의 검출을 위한 형광성 보고 단백질 신호와 직접 비교를 위해 제2 채널에서 엽록체 자가형광을 동시에 수집하였다.
현미경 검사 영상화 결과는 담배 세포의 세포질의 엽록체 내로 전위하지 않았던 대조군 YFP 형광성 단백질과 비교하여 TraP12 또는 TraP13 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 YFP 형광성 단백질은 담배 세포의 세포질 내 위치된 엽록체 내에 축적됨을 나타냈다(도 6 및 도 7). 상기 현미경 검사 영상화 결과는 YFP 단백질의 엽록체 내로의 전위는 TraP12 또는 TraP13 엽록체 전이 펩티드의 결과였다는 것을 제안한다. 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 현미경 영상화 조건 하에서 자가-형광성으로 인해 또한 적색을 발하는 엽록체 내에 YFP 형광성 신호가 국재화된다. 비교하여, 도 8은 엽록체 전이 펩티드를 포함하지 않는 대조군 구축물 pDAB101908로 침투된 담배잎 조직의 현미경 이미지를 제공한다. 이 이미지의 엽록체는 현미경 영상화 조건 하에서 자가 형광성으로 인해 오직 적색만 발하며, TraP 침투된 담배 세포에 나타나는 어떠한 YFP 형광성 신호도 없다. 오히려, 담배 식물 세포의 세포질을 통틀어 대조군 담배 식물 세포의 YFP 형광성 신호가 산만하게 표현된다.
웨스턴 블롯 결과:
웨스턴 블롯팅을 통해 침투된 담배 식물의 샘플을 검정하였다. 잎 펀치를 수집하였고 비드-밀링하였다. 클레코™(Kleco™) 비드 밀에서 3 분 동안 약 100-200 mg의 잎 물질을 2 BBs(아칸소주 로저스 소재의 데이지(Daisy)) 및 500 ml의 PBST와 혼합하였다. 이어서 샘플을 4 ℃에서 14,000 x g로 원심분리기에서 스핀 다운하였다. 상청액을 제거하고, 웨스턴 블롯 또는 면역침강법으로 직접 분석하였다. 제조자의 프로토콜을 따라 피어스 다이렉트 IP 키트™(Pierce Direct IP kit)(일리노이주 락포드 소재의 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 면역침강을 수행하였다. 대략, 50 μg의 안티-YFP가 수지에 결합하였다. 샘플을 4 ℃에서 밤새도록 수지와 인큐베이션하였다. 다음으로, 다음날 아침 샘플을 세척하고 녹여서 분리하였고, 동일한 부피의 2X 8M 우레아 샘플 완충제와 조합한 다음 샘플을 5 분 동안 끓임으로써 분석을 준비하였다. 끓인 샘플은 40 분 동안 MOPS 완충제 내 4-12 % SDS-비스 트리스 겔로 진행하였다. 이어서 제조자의 프로토콜을 따라 인비트로겐 아이블롯™(Invitrogen iBlot™)(캘리포니아주 칼즈배드 소재의 라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 사용하여 겔을 블롯하였다. PBS-트윈(Tween) 용액 중 5 % 무-지방 건조 밀크를 사용하여 10 분 동안 블롯된 막을 차단하였다. 1 시간 동안 PBS-트윈 용액 중 5 % 무-지방 건조 밀크의 1:1000 희석에 사용되는 1차 항체(토끼의 단일클론 항-GFP)로 막을 조사하였다. 다음으로, 모든 언바운드(unbound) 1차 항체를 제거하기 위해 PBS-트윈으로 5 분 동안 3 회 막을 세척하였다. 60 분 동안, 1:1000 희석에 사용되는 염소 항체 중 제2 단일클론 항-토끼(라이프 테크놀로지스)로 막을 조사하였다. 상기 기술한 대로 막을 세척하고 써모(Themo) BCIP/NBT 기판을 첨가하여 성장시켰다. 비색 기판을 5-10 분 동안 성장하도록 한 다음, 블롯을 건조하기 전에 물로 헹궜다.
웨스턴 블롯 결과는 YFP 단백질이 침투된 담배 세포에서 발현되었다는 것을 나타냈다. pDAB101981 및 pDAB101989이 침투한 담배 식물 잎 조직 둘 모두는, YFP 대조군 구축물로 침투된 담배 식물 잎 조직으로부터 수득된 YFP 단백질 밴드와 크기가 동일한, YFP 항체와 반응하는 단백질 밴드의 존재가 나타내는 바와 같이 YFP 단백질을 발현하였다. 또한, 상기 결과는 TraP 키메라 엽록체 전이 펩티드를 제조하고 YFP 단백질로부터 절단하였음을 나타낸다. TraP12-YFP 및 TraP13-YFP 구축물은 대조군 YFP 단백질보다 분자량이 큰 예비-제조된 단백질 밴드를 발현한다. 대조군 YFP와 크기가 동일한 웨스턴 블롯 상의 밴드의 존재는 TraP12 및 TraP13 엽록체 전이 펩티드 서열을 프로세싱하고, 그렇게 함으로써 YFP의 크기를 YFP 대조군과 동일한 분자량 크기로 감소시킴을 나타낸다.
옥수수 원형질체 일과성 검정:
옥수수 원형질체 일과성 플랜타내 검정을 통해 시험하기 위해서 Trap12 키메라 엽록체 전이 펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드 서열(서열 5) 및 링커 서열(서열 10)을 황색 형광성 단백질 유전자의 상류에 클로닝하고, 구축물 내로 도입하였다. 생성된 구축물은 다음의 식물 전사 단위(PTU)를 포함하였다. 제1 PTU는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터(ZmUbil 프로모터, 문헌[Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689]), TraP-황색 형광성 단백질 융합 유전자(TraP12-YFP; 미국 특허 출원 제2007/0298412호), 및 제아 메이스 퍼옥시다제 5 3' 비번역 영역 (ZmPer5 3'UTR; 미국 특허 번호 제6384207호)으로 구성되었다. 제한 효소 분해 및 서열 분석을 통해 구축물을 확인하였다.
제아 메이스 변종 B104의 종자를 트윈 20을 2-3 방울 함유하는, 50 % 클로록스(Clorox)(3 % 차아염소산나트륨) 중에서 약 20 분 동안 왕성하게 진탕시켜 표면을 멸균시켰다. 종자를 멸균 증류수로 철저하게 세정하였다. 멸균 종자를 피타트레이스(Phytatrays) 또는 유사한 유형의 박스 중 ½ MS 배지 상에 플레이팅하고, 암실 (28 ℃)에서 12 내지 20일 동안 성장시켰다. 옥수수 원형질체 일과성 검정을 사용하여 B104-옥수수의 잎으로 옥수수 원형질체를 수득하고, 형질감염시켰다. 상기 옥수수 원형질체 검정은 문헌[Yoo, S.-D., Cho, Y.-H., and Sheen, J., (2007), Arabidopsis Mesophyll Protoplasts: A Versitile Cell System for Transient Gene Expression Analysis, Nature Protocols, 2:1565-1572]에 기술된 시스템의 변형법이다. 문헌[Yoo et al. (2007)]에 기술되어 있는 바와 같이 용액을 제조하되, 단, 예외적으로, 하기 실험에서 사용된 만닛톨의 농도를 0.6 M로 변경하였다.
실온에서 약 40 ㎍의 플라스미드 DNA(pDAB106597)를 함유하는 2 ml 미세원심분리관에 원형질체를 첨가함으로써 100 내지 500 ㎕의 원형질체(1-5x105)의 형질감염을 완료하였다. 바람직하게는 DNA의 부피를 원형질체 부피의 약 10 % 부피로 유지시켰다. 원형질체 및 DNA를 가끔씩 5분 간의 인큐베이션 기간 동안 혼합하였다. 동량의 PEG 용액을 원형질체 및 DNA에 한번에 2 방울씩 천천히 첨가하였고, PEG 용액을 적가하는 그 중간 시간에 혼합하였다. 가끔씩 온화하게 혼합해 주면서, 약 10 분 동안 상기 관을 인큐베이션시켰다. 이어서, 1 ml의 W5+ 용액을 첨가하고, 상기 관을 수회에 걸쳐 도립시켜 혼합하였다. 상기 관(들)을 4 ℃ 온도에서 75 x g로 5 분 동안 원심분리하였다. 최종적으로, 상청액을 제거하고, 펠릿을 1 ml의 WI 용액 중에 재현탁시키고, 원형질체를 소형 페트리 플레이트(35 x 10 mm) 또는 6웰 다중 웰 플레이트에 놓고, 암실에서 실온하에 밤새도록 인큐베이션시켰다. 12 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 현미경 검사에 의해 YFP의 형광성을 관찰하였다. 앞서 기술된 현미경 검사 조건을 영상화하는 데 사용하였다.
현미경 검사 영상화 결과, 담배 세포의 세포질의 엽록체 내로 전위되지 않은 대조군 YFP 형광성 단백질과 비교하여, TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 YFP 형광성 단백질은 담배 세포의 세포질에 위치하는 엽록체 내에 축적되어 있는 것으로 나타났다(도 9). 상기 현미경 검사 영상화 결과는 YFP 단백질의 엽록체 내로의 전위는 TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드의 결과였다는 것을 제안한다.
실시예 3: 아라비돕시스에서 작물학상 중요한 트랜스진을 발현시키기 위한 키메라 엽록체 전이 펩티드 ( TraP ) 서열
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 5-에놀피루빌시키메이트 3-포스페이트 신타제 효소(EPSP 신타제) 중 단일 아미노산 돌연변이(G96A)는 글리포세이트 비감응성을 유발할 수 있다(문헌[Padgette et al., (1991)]; [Eschenburg et al., (2002)]; [Priestman et al., (2005)]; [Haghani et al., (2008)]). 상기 돌연변이가 글리포세이트에 대한 내성을 부여하지만, 이는 또한 EPSP 신타제와 그의 천연 기질, 포스포에놀피루베이트(PEP)의 결합에 악영향을 주는 것으로 알려져 있다. 상기로부터 초래된 기재 결합 효율의 변화로 인해 돌연변이화된 효소는 글리포세이트에 대한 플랜타내 내성을 제공하기에는 부적합화될 수 있다.
NCBI 진뱅크 데이터베이스를 E. 콜라이(E. coli) 버전의 EPSP 신타제 효소 내로 도입된 G96A 돌연변이의 것과 유사한, EPSP 신타제 효소내 위치에 알라닌을 천연적으로 포함하는 EPSP 신타제 단백질 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 인실리코 스크리닝을 수행하였다(문헌[Padgette et al., (1991)]; [Eschenburg et al., (2002)]; [Priestman et al., (2005)]; [Haghani et al., (2008)]).
상기 위치에 천연 알라닌을 함유하는 것으로 확인된 한 효소는 스트렙토마이세스 스비세우스(Streptomyces sviceus) ATCC29083으로부터의 DGT-28(진뱅크 ACC 번호 ZP_06917240.1)였다. 추가의 인실리코 데이터 마이닝을 통해 DGT-28과 더 큰 상동성을 가지는, 3 가지 다른 독특한 스트렙토마이세스 효소: DGT-31(진뱅크 ACC 번호 YP_004922608.1); DGT-32(진뱅크 ACC 번호 ZP_04696613); 및 DGT-33(진뱅크 ACC 번호 NC_010572)이 밝혀졌다. 상기 효소들은 각각 E. 콜라이 버전의 EPSP 신타제 효소 내로 도입된 G96A 돌연변이의 것과 유사한, EPSP 신타제 효소내 위치에 천연 알라닌을 포함한다. 도 1.
상이한 유기체로부터의 EPSP 신타제 단백질의 길이는 상이하기 때문에, E. 콜라이 버전의 EPSP 신타제 효소에 대한 돌연변이의 번호 매김이 다른 유기체로부터의 EPSP 신타제 효소에 대한 돌연변이의 번호 매김과 반드시 일치하는 것은 아니다. 글리포세이트 내성 또는 PEP 기질 친화성과 관련하여 상기 확인된 EPSP 신타제 효소의 특징에 대해서는 앞서 규명되지 않았다. 추가로 상기 EPSP 신타제 효소는 신 부류의 EPSP 신타제 효소를 나타내며, 이는 앞서 기술된 부류 I(추가로 미국 특허 번호 RE39247에 기술된 식물 유래 서열), II(추가로 미국 특허 번호 RE39247에 기술된 박테리아 유래 서열), 및 III(추가로 국제 특허 출원 WO 2006/110586에 기술된 박테리아 유래 서열) EPSP 신타제 효소를 특징을 규명하는 데 사용된 어떤 서열 모티프도 포함하지 않는다.
부류 I EPSP 신타제 효소와 비교함으로써 신규한 DGT-14, DGT-28, DGT-31, DGT-32, 및 DGT-33 효소를 글리포세이트 내성 및 PEP 기질 친화성에 대하여 특징을 규명하였다. 하기 부류 I 효소; 글리신 맥스(Glycine max)로부터의 DGT-1, 브라시카 나푸스로부터의 DGT-3(진뱅크 ACC 번호 P17688), 및 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)(진뱅크 ACC 번호 EU977181)으로부터의 DGT-7(진뱅크 ACC 번호 EU977181)은 비교를 위한 것이었다. 부류 I EPSP 신타제 효소 및 그의 돌연변이체 변이체를 합성하고 평가하였다. 식물 EPSP 신타제 효소 내로 도입된 돌연변이는 E. 콜라이 버전의 EPSP 신타제 효소로부터의 G96A 돌연변이의 것과 유사한, EPSP 신타제 효소내 위치에서 이루어진 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이로 구성된다. 추가로, 문헌[Funke et al., (2009)]에 기술되어 있는 바와 같이, E. 콜라이의 EPSP 신타제 중 아미노산 97(T→I) 및 아미노산 101(P→S)의 것과 유사한, 상기 부류 I EPSP 신타제 효소내 위치에 트레오닌에서 이소류신으로의, 및 프롤린에서 세린으로의 돌연변이가 도입되었다.
DGT -14:
미국 특허 출원 번호 11/975,658에 기술되어 있는 바와 같이, dgt -14 트랜스진에 융합된 TraP12, 및 TraP13 키메라 엽록체 전이 펩티드를 포함하는 트랜스제닉 T1 아라비돕시스 식물을 제조하였다. 상이한 비율로 글리포세이트를 트랜스제닉 식물에 분무하였다. 상대적인 저항성 수준을 측정하기 위해 본 연구에서는 비율을 증가시키는 것을 비롯한, 다양한 농도의 글리포세이트 비율의 분포를 시용시켰다 (105, 420, 1,680 또는 3,360 g ae/ha). 글리포세이트의 전형적인 1X 필드 사용률은 1,120 g ae/ha이다. 본 연구에서 사용된 T1 아라비돕시스 식물은 dgt -14 트랜스진에 대한 카피수에 있어 가변적이었다. 카피수가 낮은 dgt -14 T1 아라비돕시스 식물은 분자적 확인 검정법을 사용하여 확인하고, 자가 수분시키고, 이를 사용하여 T2 식물을 제조하였다. 하기 표 1에는 글리포세이트 제초제 저항성 유전자인 dgt-1(미국 특허 출원 번호 12558351에 기술됨)을 포함하는 대조군 식물과 비교한, dgt-14 트랜스진 식물의 저항성이 제시되어 있다.
먼저, 글루포시네이트 선별 방식을 사용하여 비형질전환된 종자 배경으로부터 아라비돕시스 T1 형질전환체를 선별하였다. 3 개의 플랫, 또는 30,000 개의 종자를 각 T1 구축물에 대해 분석하였다. 선별된 T1 식물을 분자에 의해 특징을 규명하고, 이어서, 식물을 개별 포트에 이식시키고, 앞서 기술된 바와 같이 시판용 글리포세이트를 다양한 비율로 분무하였다. 처리 후 2 주째(WAT; 처리 후 경과 시간(주)(weeks after treatment))의 시각적 손상률(%)로 상기 식물의 용량 반응을 나타낸다. 데이터는 아래의 표에 나타나 있으며, 여기 표에는 손상을 거의 보이지 않거나, 전혀 보이지 않거나(< 20 %), 중간 정도의 손상을 보이거나(20-40 %), 심각한 손상을 보이는(> 40 %) 개별 식물이 제시되어 있다. 아라비돕시스 형질전환에 사용된 각 구축물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 아라비돕시스(재배종 콜롬비아(c.v. Columbia))가 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다.
T1 아라비돕시스 식물에서 식물 반응 수준은 다양하였다. 이러한 변동은 각 식물이 독립적인 형질전환 이벤트를 나타내고, 따라서, 관심 유전자의 카피수는 식물마다 다르다는 사실에 기인하는 것일 수 있다. 전체 집단의 평균 손상률이 표 1에 제시되어 있으며, 이를 통해 다양한 비율의 글리포세이트에 대해 TraP12 v2 또는 TraP13 v2 엽록체 전이 펩티드와 연결된 dgt-14 구축물 각각 대 dgt-1 및 비-형질전환된 야생형 대조군에 의해 제공되는 내성을 입증한다. 이벤트는 구축물 pDAB105528에 포함된 TraP12 v2(서열 11)(도 10) 및 구축물 pDAB105529에 포함된 TraP13 v2 (서열 12)(도 11)과 연결된 dgt-14을 포함하였다. T1 식물의 글리포세이트 선별의 데이터는 dgt-14가 상기 엽록체 전이 펩티드 연결될 때, 고수준의 글리포세이트에 대한 강력한 내성이 제공되는 것을 입증한다. 비교하여, 비-형질전환된(또는 야생형) 대조군은 유사한 비율의 글리포세이트와 처리될 때 고농도의 글리포세이트의 처리에 대한 내성을 제공하지 않았다. 또한, dgt-14의 3 개 이상의 카피를 포함하는 것을 나타내는 이벤트가 글리포세이트의 증가된 비율에 더욱 큰 감수성을 보이는 경우가 있었다. 표 1에 나타낸 시각적 손상 범위(%) 내에서 상기 경우가 입증된다. 아라비돕시스 식물 내에 트랜스진이 높은 카피수로 존재하면 트랜스진 침묵화가 일어나거나, 또는 dgt-14 트랜스진의 존재에도 불구하고, 글리포세이트에 대한 감수성을 초래하는 다른 후생적 효과가 일어날 가능성이 있다.
Figure 112014083517272-pct00001
트랜스진 삽입을 낮은 카피 수(1-3 카피)로 함유하는 것으로 확인된, 선별된 T1 아라비돕시스 식물을 자가-수정하여 글리포세이트 내성의 추가 평가를 위한 제2 세대를 제조하였다. TraP12 및 TraP13 키메라 엽록체 전이 펩티드와 융합된 dgt -14 트랜스진의 1-3 카피를 함유하는 제2 세대 아라비돕시스 식물(T2)을 글리포세이트 내성 및 글루포시네이트 내성(글루포시네이트 저항성은 PAT 발현 카세트가 온전하였고 T1 식물의 자가 수정 동안 재정렬을 겪지 않았음을 나타냄)에 대하여 추가로 특징을 규명하였다. T2 세대에서, 반접합성 및 동형접합성 식물을 각 이벤트에 대해 시험하는 데 이용할 수 있었으며, 따라서, 이를 각 비율의 글리포세이트를 시험하는데 포함시켰다. 한 유전가좌에 같은 2 개의 대립유전자를 포함하는 동형접합성 식물과 달리, 반접합성 식물은 한 유전자좌에 상이한 2 개의 대립유전자를 포함한다. 분자 분석 프로토콜을 사용하여 T2 식물의 카피수와 배수성(ploidy) 수준을 확인하였다. 마찬가지로, 상술한 바와 같은 방법 및 비율을 사용하여 글리포세이트에 적용하였다. 처리 후 2 주째(WAT)의 시각적 손상(%)으로 식물의 용량 반응을 나타낸다. 데이터는 손상을 거의 보이지 않거나, 전혀 보이지 않거나(< 20 %), 중간 정도의 손상을 보이거나(20-40 %), 또는 심각한 손상을 보이는(> 40 %) 개체에 대한 히스토그램으로 제시되어 있다. 아라비돕시스 형질전환에 사용된 각 구축물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 아라비돕시스(재배종 콜롬비아)가 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다. 또한, 글리포세이트 제초제 저항성 유전자, dgt -1(미국 특허 출원 번호 12558351에 기술됨)를 포함하는 식물을 양성 대조군으로 포함하였다.
T2 세대에서, 단일 카피 및 낮은 수-카피(2 또는 3 개 카피) dgt -14 이벤트, 둘 모두를 글리포세이트 내성에 대해 특징을 규명하였다. 전체 집단의 평균 손상률이 표 2에 제시되어 있으며, 이를 통해 다양한 비율의 글리포세이트에 대해 엽록체 전이 펩티드와 연결된 dgt-14 구축물 각각 대 dgt-1 및 비-형질전환된 야생형 대조군에 의해 제공되는 내성을 입증한다. T2 세대 이벤트는 TraP12 v2(pDAB105528) 및 TraP13 v2(pDAB105529)과 연결된 dgt-14을 포함하였다. 상기 이벤트 둘 모두는 글리포세이트에 대해 매우 내성이 있다. 결과는 T2 아라비돕시스 식물의 손상 범위가 시험되는 모든 농도의 글리포세이트에 대해 20 % 미만이었음을 나타냈다. 비교하여, 비-형질전환된(또는 야생형) 대조군은 유사한 비율의 글리포세이트로 처리될 때 고농도의 글리포세이트의 처리에 대한 내성을 제공하지 않았다. 종합하여, TraP12 및 TraP13 키메라 전이 펩티드 단백질과 융합된 DGT-14를 함유하며 발현하는 식물은 최대 3 배 필드율의 수준(1120 g ae/ha)에서 글리포세이트에 상업적 수준의 내성을 수득했음을 나타냈다.
Figure 112014083517272-pct00002
트랜스진 삽입을 낮은 카피 수(1-3 카피)로 함유하는 것으로 확인된, 무작위로 선별된 T2 아라비돕시스 식물은 자가-수정하여 글리포세이트 내성의 추가 평가를 위한 제3 세대를 제조하였다. 제3 세대(T3)로부터의 아라비돕시스 종자를 심었고, 상술한 동일한 프로토콜을 사용하여 글리포세이트 내성을 평가하였다. T3 세대에서 시험된 이벤트는 동형접합성인 각 계통으로부터의 복제물을 함유하였다(임의의 진행된 식물이 트랜스진의 분리를 보이는지를 확인하기 위한 글루포시네이트 내성 스크린을 사용하여 측정됨). LC-MS-MS를 통해 상기 이벤트를 검정하여 식물이 DGT-14 단백질을 발현하였음을 확인하였다. 글리포세이트의 전체 집단 평균 손상률에 대한 T3 세대의 결과가 표 3에 나타나며, 이는 다양한 비율의 글리포세이트에 대해 각각의 dgt-14 구축물에 의해 제공되는 글리포세이트에 대한 내성을 나타낸다. 예시적인 저항성 T3 이벤트는 TraP12 v2(pDAB105528) 및 TraP13 v2(pDAB105529)에 연결된 dgt-14를 포함하였다. 상기 이벤트 둘 모두는 글리포세이트에 대해 매우 저항성이 있다. 결과는 T3 아라비돕시스 식물의 손상 범위가 시험되는 모든 농도의 글리포세이트에 대해 20 % 미만이었음을 나타냈다. 비교하여, 비형질전환된(또는 야생형) 대조군은 유사한 비율의 글리포세이트와 처리될 때 고농도의 글리포세이트의 처리에 대한 내성을 제공하지 않았다. 종합하여, DGT-14를 함유하며 발현하는 식물은 최대 3 배의 필드율의 수준(1120 g ae/ha)에서 글리포세이트에 상업적 수준의 저항성을 수득했음을 나타냈다.
Figure 112014083517272-pct00003
DGT -28
새로 디자인된, 쌍자엽 식물의 최적화된 dgt -28 v5 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 18로 열거되어 있다. 새로 디자인된, 단자엽 식물의 최적화된 dgt -28 v6 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 19로 열거되어 있다; 제2 아미노산 위치에 알라닌을 포함하여 제한 효소 부위를 도입함으로써 상기 서열을 약간 변형시켰다. 생성된 DNA 서열은 바람직한 염기 조성인, 보다 고도한 코돈 다양성을 가지고, 전략상 배치된 제한 효소 인식 부위를 포함하며, 유전자의 전사, 또는 생성물 mRNA의 번역을 방해할 수 있는 서열은 포함하지 않았다.
추가 서열, 예를 들어, 6-프레임 종결(코딩 서열의 3' 단부에 첨가된, 6 개의 리딩 프레임 모두에 위치하는 종결 코돈), 및 클로닝을 위한 5' 제한 부위를 함유하는, 서열 18 및 서열 19를 포함하는 DNA 단편의 합성은 상업적 공급업체 (DNA2.0: 미국 캘리포니아주 멘로 파크)가 수행하였다. 이어서, 하기 실시예에 기술되는 바와 같이, 합성 핵산 분자를 발현 벡터로 클로닝하고, 식물 또는 박테리아를 형질전환시켰다.
유사한 코돈 최적화 전략법을 사용하여 dgt -1, dgt -3 v2 (G173A), dgt-3 v3 (G173A; P178S), dgt -3 v4 (T174I; P178S), dgt -7 v4 (T168I; P172S), dgt -32 v3 , dgt-33 v3, 및 dgt -31 v3을 디자인하였다. 코돈 최적화된 버전의 상기 유전자들을 각각 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 및 서열 27로서 열거한다.
식물 이원성 벡터 구축. 프레임내 융합체로서 dgt-28에 결합된 엽록체 전이 펩티드 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 진입 벡터의 구축에 표준 클로닝 방법을 사용하였다. 인-퓨전™ 어드벤티지 테크놀러지(IN-FUSION™ Advantage Technology)(클로테크(Clontech: 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰))를 이용하여 dgt-28에 융합된 전이 펩티드(TraP)를 포함하는 진입 벡터를 조립하였다. 융합의 결과로서, 제1 아미노산인 메티오닌을 dgt-28로부터 제거하였다. 전이 펩티드 TraP4 v2(서열 28), TraP5 v2(서열 29), TraP8 v2(서열 30), TraP9 v2(서열 31), TraP12 v2(서열 32), 및 TraP13 v2(서열 33)를 각각 DNA2.0(미국 캘리포니아주 멘로 파크)에 의해 합성하고, 독특한 AccI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 이하의, dgt-28의 5' 단부 단편에 융합시켰다.
다양한 TraP 및 dgt-28 발현 카세트를 포함하는 이원성 플라스미드를 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터(AtUbi10 v2; 문헌[Callis, et al., (1990) J. Biol . Che ., 265: 12486-12493])에 의해 구동시키고, 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 23 3' 비번역 영역(AtuORF23 3' UTR v1; 미국 특허 번호 제5,428,147호) 측면에 배치시켰다.
조립된 TraP 및 dgt-28 발현 카세트를 게이트웨이® 테크놀러지(GATEWAY® Technology)(인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 이용하여 조작하고, 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 통해 식물 내로 형질전환시켰다. 제한 엔도뉴클레아제를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs)(NEB: 미국 매사추세츠주 입스위치)로부터 입수하고, DNA 결찰을 위해 T4 DNA 리가제(인비트로겐)를 사용하였다. 선별가능한 마커 카세트 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터(CsVMV v2; 문헌[Verdaguer et al., (1996) Plant Mol . Biol ., 31: 1129-1139]) - DSM -2 (미국 특허 출원 번호 2007/086813) - 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 1 3' 비번역 영역(AtuORF1 3' UTR v6; 문헌[Huang et al., (1990) J. Bacteriol. 172:1814-1822])을 포함하는 단일 목적지 벡터 내로 한 진입 벡터를 조립하기 위해 게이트웨이® LR 클로나제®(GATEWAY® LR CLONASE®) 효소 믹스(인비트로겐)를 사용하여 게이트웨이 반응을 수행하였다. 뉴클레오스핀® 플라스미드 키트(NUCLEOSPIN® Plasmid Kit)(마슈레-나겔 인크.(Macherey-Nagel Inc.: 미국 펜실베이니아주 베슬리헴)) 또는 플라스미드 미디 키트(Plasmid Midi Kit)(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 공급업체의 설명서에 따라 플라스미드 제조를 수행하였다. 아가로스 트리스-아세테이트 겔 전기영동 후, 퀴아퀵™ 겔 익스트렉션 키트(QIAquick™ Gel Extraction Kit)(퀴아젠)을 사용하여 DNA 단편을 단리시켰다.
먼저, 조립된 플라스미드 모두의 콜로니를 미니프렙 DNA의 제한 분해에 의해 스크리닝하였다. 선별된 클론의 플라스미드 DNA를 상업적 서열 분석 업체(유로핀스™ MWG 오페론(Eurofins™ MWG Operon: 미국 앨라배마주 헌츠빌))에 의해 서열 분석하였다. 시퀀서™(SEQUENCHER™) 소프트웨어 (진 코즈 코포레이션(Gene Codes Corp.: 미국 미시건주 앤 아버))를 이용하여 서열 데이터를 조립하고, 분석하였다.
하기 이원성 구축물은 다양한 TraP:dgt-28 융합 유전자 서열을 발현하는데: pDAB107527은 TraP4 v2 dgt -28 v5(서열 34)를 포함하고; pDAB105530은 TraP5 v2:dgt-28 v5(서열 35)를 포함하고; pDAB105531은 TraP8 v2: dgt -28 v5(서열 36)를 포함하고; PDAB105532는 TraP9 v2:dgt -28 v5(서열 37)를 포함하고; pDAB105533은 TraP12 v2:dgt -28 v5(서열 38)를 포함하고; pDAB105534는 TraP13 v2:dgt -28 v5(서열 39)를 포함한다. 제1 코돈 (GCA)을 (GCT)로 변경하여 pDAB105534의 dgt -28 v5 서열을 변형시켰다.
추가의 식물 이원성 벡터 구축. 상기 기술된 것과 유사한 클로닝 전략법을 사용하여 dgt -31, dgt -32, dgt -33, dgt -1, dgt -3, 및 dgt -7을 함유하는 이원성 플라스미드를 구축하였다.
미생물 유래 유전자; dgt-31, dgt-32, 및 dgt-33을 앞서 기술된 상이한 엽록체 전이 펩티드와 융합시켰다. 하기 엽록체 전이 펩티드를 사용하였다; TraP14 v2 (서열 40), TraP23 v2(서열 41), TraP14 v2(서열 42). pDAB107532는 TraP14 v2에 융합된 dgt -32 v3(서열 43)을 함유하고, pDAB107534는 TraP14 v2에 융합된 dgt -33 v3(서열 44)을 함유하고, 마지막 구축물은 TraP23 v2에 융합된 dgt -31 v3(서열 45)을 함유하였다. dgt 발현 카세트를 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10 프로모터 v2)에 의해 구동시키고, 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 23 3' 비번역 영역(AtuORF23 3' UTR v1) 측면에 배치시켰다. 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터(CsVMV v2) - DSM -2 -아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임 1 3' 비번역 영역(AtuORF1 3' UTR v6)을 포함하는 DSM-2 선별가능한 마커 카세트 또한 이원성 벡터에 존재하였다.
dgt-31 v3, dgt-32 v3, 및 dgt -33 v3이 앞서 기술된 앞서 기술된 엽록체 전이 펩티드 서열에 융합되어 있는 추가의 이원성체를 구축하였다. 예를 들어, TraP8 v2 서열을 dgt-31 v3, dgt-32 v3, 및 dgt -33 v3에 융합시키고, 상기 기술된 바와 같이 이원성 벡터로 클로닝하였다.
부류 I 유전자(dgt -1, dgt -3, 및 dgt -7)를 포함하는 이원성 벡터를 구축하였다. 하기 이원성 벡터를 구축하고, 식물 내로 형질전환시켰다: 미국 특허출원 공개 번호 2009/0064376에 기술되어 있는 바와 같이 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 오스모틴(Osmotin) 서열 측면에 위치하는, 미국 특허출원 공개 번호 2011/0124503에 기술되어 있는 바와 같은 dgt -1 v4 서열을 포함하는 pDAB4104; pDAB102715; pDAB102716; pDAB102717; 및 pDAB102785. dgt -28, dgt -31, dgt -32, 및 dgt -33에 융합된 다양한 TraP 엽록체 전이 펩티드를 부류 I 유전자에 부가하지 않았는데, 그 이유는 상기 식물 유래 서열이 천연 식물 엽록체 전이 펩티드를 가지고 있기 때문이다. 상기 벡터는 하기 표 4에서 추가로 상세하게 기술된다.
Figure 112014083517272-pct00004
아라비돕시스 탈리아나 형질전환. 문헌[Clough and Bent (1998)]으로부터의 화아 침지(floral dip) 방법을 사용하여 아라비돕시스를 형질전환시켰다. 상기 기술된 이원성 플라스미드 중 하나를 포함하는 선별된 아그로박테리움 콜로니를 사용하여, 스펙티노마이신(100 mg/L) 및 카나마이신(50 mg/L)을 함유하는 하나 이상의 100 mL YEP 브로쓰 예비-배양물에 접종하였다. 배양물을 225 rpm으로 일정하게 교반하면서 28 ℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 세포를 실온에서 대략 5,000 x g으로 10 분 동안 펠릿화하고, 생성된 상청액은 폐기하였다. 세포 펠릿을 5 % (w/v) 수크로스, 10 ㎍/L 6-벤질아미노퓨린, 및 0.04% 실웨트(Silwet)™ L-77을 함유하는 400 mL 침투 배지에 온화하게 재현탁시켰다. 대략 1 개월된 식물을 온화하게 교반시키면서 5-10 분 동안 상기 배지에 침지시켰다. 식물을 측면으로 눕히고, 2-3 시간 동안 투명 또는 불투명 비닐 봉지로 덮은 후, 직립시켰다. 식물을 22 ℃에서 16 시간 명기/8 시간 암기인 광주기로 성장시켰다. 침지 후 대략 4 주 경과하였을 때, 종자를 수거하였다.
형질전환된 식물 선별. 새로 수거된 T1 종자[dgt 및 DSM -2 발현 카세트 포함]를 실온에서 7 일 동안 건조시켰다. T1 종자를 26.5 x 51 cm 발아 트레이에 파종하였는데, 상기 각각은, 앞서 40 mL의 0.1 % 아가로스 용액 중에 현탁시키고, 4 ℃에서 2 일 동안 보관하여 휴면 요건을 완료하고, 확실하게 동조 종자 발아가 이루어진, 200 mg 분취량의 계층화된 T1 종자 (~10,000 개의 종자)를 받았다.
선샤인 믹스 LP5(Sunshine Mix LP5)를 미세 질석으로 덮고, 습윤화될 때까지 호그랜드(Hoagland)의 용액을 이용하여 저면 관수를 수행한 후, 중력 배수시켰다. 피펫을 이용하여 각 40 mL 분취량의 계층화된 종자를 질석 상에 고르게 파종시키고, 4-5 일 동안 습도 유지용 돔으로 덮어 놓았다. (공동으로 형질전환된 DSM -2 유전자 선별을 위해) 발아 후 글루포시네이트 분무를 이용하여 1차 형질전환체 선별을 수행하기 1 일 전 돔을 제거하였다.
식재 후 7 일째(DAP: 식재 후의 경과일수: days after planting) 및 11 DAP에, T1 식물(각각 자엽 및 2-4-lf 단계)에 0.2 % 리버티(Liberty) 제초제 용액 (200 g ai/L 글루포시네이트, 바이엘 크롭 사이언시즈(Bayer Crop Sciences: 미국 미주리주 캔자스주))을 10 mL/트레이(703 L/ha)의 분무 부피로 데빌비스(DeVilbiss) 압축 공기 분무 팁을 이용하여 분무함으로써 글루포시네이트 1회 시용당 280 g ai/ha의 유효 비율로 전달하였다. 최종 분무 후 4-7 일이 경과하였을 때 생존 식물(활발하게 성장하는 식물)을 확인하고, 화분용 배지(메트로 믹스(Metro Mix) 360)로 제조된 3 인치(7.6 cms) 포트로 개별적으로 이식시켰다. 이식시킨 식물을 3-4 일 동안 습도 유지용 돔으로 덮어 놓고, 상기와 같이 22 ℃ 성장 챔버에 놓거나, 온실로 직접 옮겨 놓았다. 이어서, 돔을 제거하고, 식물을 온실 (22±5 ℃, 50±30 % RH, 14 h 명기: 10 암기, 최소 500 μE//㎡s1 자연광 + 보충광)에서 재배하였다. 글리포세이트 내성 유전자가 식물의 게놈 내로 안정하게 통합되었는지를 확인하기 위해 생존한 T1 식물에 대한 분자적 확인 분석을 완료하였다.
분자적 확인. pDAB107527, pDAB105530, pDAB105531, pDAB105532, pDAB105533, 또는 pDAB105534로 형질전환된 아라비돕시스 식물의 게놈 내에 dgt -28 및 DSM -2 트랜스진이 존재하는지를 확인하였다. 가수분해 프로브 검정법, 유전자 발현 카세트 PCR(식물 전사 단위 PCR - PTU PCR로도 기술된다), 써던 블롯 분석, 및 정량적 역전사 PCR 분석을 통해 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 존재를 확인하였다.
먼저 택맨™과 유사한 가수분해 프로브 검정법을 통해 T1 아라비돕시스 식물을 스크리닝하여 DSM -2 및 dgt -28 트랜스진의 존재를 확인하였다. 유전자 발현 카세트 PCR을 통해 이벤트를 스크리닝함으로써 dgt 발현 카세트가 재배열 없이 식물 게놈 내로 완전하게 통합되었는지 여부를 측정하였다. 상기 연구로부터 작성된 데이터를 사용하여 트랜스진 카피수를 측정하고, 자가 수정 및 T2 세대로의 진행을 위해 최상인 아라비돕시스 이벤트를 확인하였다. 진행된 T2 아라비돕시스 식물 또한 가수분해 프로브 검정법을 통해 스크리닝함으로써 식물 염색체내 DSM -2 및 dgt 유전자의 존재를 확인하고, 그의 카피수를 추정하였다. 최종적으로, 써던 블롯 검정법을 사용하여 T1 아라비돕시스 식물의 서브세트 상에서의 카피수 추정치를 확인하였다.
유사한 검정법을 사용하여 pDAB4101로 형질전환된 식물로부터의 dgt -1 트랜스진의 존재, pDAB107532로 형질전환된 식물로부터의 dgt -32 트랜스진의 존재, pDAB107534로 형질전환된 식물로부터의 dgt -33 트랜스진의 존재, pDAB102715로 형질전환된 식물로부터의 dgt -3 트랜스진의 존재, pDAB102716으로 형질전환된 식물로부터의 dgt -3 트랜스진의 존재, pDAB102717로 형질전환된 식물로부터의 dgt -3 트랜스진의 존재, 및 pDAB102785로 형질전환된 식물로부터의 dgt -3 트랜스진의 존재를 확인하였다.
가수분해 프로브 검정법. 하기 기술되는 가수분해 프로브 검정법을 이용하여 T1 및 T2 아라비돕시스 식물에서 카피수를 측정하였다. 다양한 개수의 트랜스진을 포함하는 식물을 확인하고, 후속 글리포세이트 내성 연구를 진행시켰다.
조직 샘플을 96웰 플레이트에 수집하고, 2 일 동안 동결건조시켰다. 클레코(KLECO)™ 조직 미분기 및 텅스텐 비드 (엔비론 메탈 인크.(Environ Metal INC.: 미국 오레곤주 스위트 홈)를 이용하여 조직 침연을 수행하였다. 조직 침연 후, 게놈 DNA를 바이오스프린트(Biosprint)™ 96 식물 키트 (퀴아젠™: 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 고처리량 포맷으로 단리시켰다. 게놈 DNA를 콴트-잇™ 피코 그린 DNA 어세이 키트(QUANT-IT™ PICO GREEN DNA ASSAY KIT) (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 정량화하였다. 가수분해 프로브 검정법을 수행하기 위해 바이오로보트3000™(BIOROBOT3000)™ 자동 액체 핸들러 (퀴아젠: 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 이용하여 정량화된 게놈 DNA를 약 2 ng/㎕로 조정하였다. 라이트사이클러(LIGHTCYCLER)®480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science: 미국 인디애나주 인디애나폴리스))을 이용하여 실시간 PCR에 의해 가수분해 프로브 검정법에 의한 트랜스진 카피수 측정을 수행하였다. DSM -2, dgt -28 및 내부 참조 유전자인 TAFII15 (진뱅크 ID: NC 003075; 문헌 [Duarte et al., (201) BMC Evol . Biol., 10:61])에 대한 검정법을 디자인하였다.
증폭을 위해, 라이트사이클러®480 프로브 마스터 믹스(LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix) (로슈 어플라이드 사이언스: 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를, 0.1 μM의, DSM -2 및 dgt -28에 대한 각 프라이머, 0.4 μM의, TAFII15에 대한 각 프라이머 및 0.2 μM의 각 프로브를 함유하는 10 ㎕ 부피의 멀티플렉스 반응물 중에서 1x 최종 농도로 제조하였다. 표 5. 60 ℃에서 40 초 동안 연장시키고, 형광성을 획득하는 2단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플을 진행시키고, 각 샘플 분석을 위해 사이클 역치 (Ct) 평균값을 사용하였다. 상대 콴트 모듈을 이용하여 라이트사이클러™ 소프트웨어 출시 1.5를 사용함으로써 실시간 PCR 데이터 분석을 수행하였는데, 이는 ΔΔCt 방법에 기초하는 것이다. 이를 위해 각 진행당 단일 카피 교정기 및 공지된 2 개의 카피 체크로부터 게놈 DNA의 샘플을 포함하였다. T1 및 T2 트랜스제닉 아라비돕시스 식물에 대해 가수분해 프로브 스크린의 카피수 결과를 측정하였다.
Figure 112014083517272-pct00005
써던 블롯 분석을 통한 dgt -28 통합 확인. 써던 블롯 분석을 사용하여 삽입된 T-가닥 DNA 단편의 통합 패턴을 확립하고, dgt -28을 포함한 이벤트를 확인하였다. 데이터를 작성하여 아라비돕시스 게놈 내의 트랜스진 삽입체의 통합 및 완전성을 입증하였다. 써던 블롯 데이터를 사용하여 T-가닥 DNA의 무손상 카피의 단순 통합을 확인하였다. dgt -28 유전자 발현 카세트에 특이적인 PCR 증폭 프로브를 사용하여 상세한 써던 블롯 분석을 수행하였다. 특이 제한 효소로 분해된 게놈 DNA와 프로브의 하이브리드화를 통해 특정 분자량의 게놈 DNA 단편을 확인하였으며, 특정 분자량의 패턴을 이용하여 다음 세대로의 진행을 위한 전장의 단순 삽입 T1 트랜스제닉 이벤트를 확인하였다.
조직 샘플을 2 mL 원뿔형 관 (에펜도르프(Eppendorf)™)에 수집하고, 2일 동안 동결 건조시켰다. 클렉코(KLECKO)™ 조직 미분기 및 텅스텐 비드를 이용하여 조직 침연을 수행하였다. 조직 침연 후, 게놈 DNA를 CTAB 단리화 방법을 사용하여 단리시켰다. 퀴아젠™ 게놈 팁스(Qiagen™ Genomic Tips) 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추가로 정제하였다. 게놈 DNA를 콴트-잇™ 피코 그린 DNA 어세이 키트 (몰레큘라 프로브스, 인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 정량화하였다. 일정한 농도로 유지시키기 위해 정량화된 게놈 DNA를 4 ㎍으로 조정하였다.
각 샘플에 대해 4 ㎍의 게놈 DNA를 제한 효소 SwaI (뉴 잉글랜드 바이오랩스: 미국 매사추세츠주 베벌리)로 완전하게 분해하고, 25℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, NsiI를 반응물을 첨가하고, 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 퀵 프리시피테이션 솔루션(Quick Precipitation Solution)™ (에지 바이오시스템즈(Edge Biosystems: 미국 메릴랜드주 게이더스버그)으로 침강시켜 분해된 DNA를 농축시켰다. 이어서, 게놈 DNA를 65℃에서 1시간 동안 25 ㎕의 물 중에 재현탁시켰다. 1 X TAE에서 제조된 0.8% 아가로스 겔 상에 재현탁된 샘플을 로딩하고, 1X TAE 완충제 중 1.1 V/cm로 밤새도록 전기영동시켰다. 겔을 순차적으로 30분 동안 변성 (0.2 M NaOH/0.6 M NaCl), 및 30분 동안 중화 (0.5 M 트리스-HCl (pH 7.5)/1.5 M NaCl)시켰다.
크로마토그래피용 종이 윅 및 종이 타올을 이용함으로써, 처리된 임모빌론(IMMOBILON)™ NY+ 전달 막 (밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주 빌러리카) 상의 겔을 통해 20 X SSC 용액을 밤새도록 수동적으로 위킹시킴으로써 DNA 단편을 나일론 막으로 전달하였다. 전달 후, 막을 2X SSC로 단시간 동안 세척하고, 스트라타링커(STRATALINKER)™ 1800 (스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야))과 교차 결합시키고, 80℃에서 3시간 동안 진공 베이킹시켰다.
모델 400 하이브리드화 인큐베이터 (로빈스 사이언티픽(Robbins Scientific: 미국 캘리포니아주 서니배일))를 사용하여 유리 롤러 병 중 65℃에서 1시간 동안 사전 하이브리드화 용액 (퍼펙트 Hyb 플러스(Perfect Hyb plus), 시그마(Sigma: 미국 미주리주 세인트 루이스))과 함께 블롯을 인큐베이션시켰다. 전체 코딩 서열을 포함하는 PCR 단편으로부터 프로브를 제조하였다. PCR 앰플리콘을, QIAEX™ II 겔 추출 키트를 사용하여 정제했고 랜덤 RT 프라임 IT™(Random RT Prime IT™) 표지화 키트 (스트라타진: 미국 캘리포니아주 라호야)를 통해 α 32P-dCTP로 표지화시켰다. 변성된 프로브를 1 ml당 1 블롯마다 대략 2 x 106개의 계수로 하이브리드화 완충제에 직접 첨가하면서 블롯을 65℃에서 밤새도록 하이브리드화시켰다. 하이브리드화시킨 후, 블롯을 65℃에서 40분 동안 0.1X SSC/0.1% SDS로 순차적으로 세척하였다. 최종적으로, 블롯을 보관 포스포르 영상화 스크린에 노출시키고, 몰레큘라 다이나믹스 스톰 860(Molecular Dynamics Storm 860)™ 영상화 시스템에 노출시켰다.
본 연구에서 완료된 써던 블롯 분석을 사용하여 카피수를 측정하고, 선택된 이벤트가 아라비돕시스의 게놈내에 dgt -28 트랜스진을 함유하였다는 것을 확인하였다.
PCR 분석을 통한 dgt -28 유전자 발현 카세트 확인. 종점 PCR 반응에 의해 T1 식물 이벤트에 포함되어 있는 dgt -28 유전자 발현 카세트의 존재를 검출하였다. dgt-28 유전자 발현 카세트의 AtUbi10 프로모터 v2 및 AtuORF23 3'UTR v1 영역에 특이적인 프라이머(하기 표 6)를 검출에 사용하였다.
Figure 112014083517272-pct00006
PCR 반응은 유전자 발현 카세트를 증폭시키기 위해 표준 3단계 PCR 사이클링 프로토콜을 필요로 하였다. PCR 반응 모두 하기 PCR 조건을 사용하여 완료하였다: 94℃에서 3분, 이어서, 94℃에서 30초 동안, 60℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 3분 동안 진행되는 사이클 35회. 제조사의 설명서에 따라 EX-TAQ™ PCR 키트 (다카라 바이오테크놀러지 인크.(TaKaRa Biotechnology Inc.: 일본 시가 오츠))를 이용하여 반응을 완료하였다. 마지막 사이클을 진행한 후, 반응물을 72℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. TAE 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 PCR 앰플리콘 크기를 측정하였다. 예상된 크기의 PCR 앰플리콘이 전자의 유전자 발현 카세트의 존재가 트랜스제닉 아라비돕시스 이벤트의 게놈 내에 존재하였다는 것으로 나타내었다.
정량적 역전사 PCR 분석을 통한 dgt -28 상대적인 전사 확인. dgt -28 트랜스제닉 식물의 조직 샘플을 96웰 플레이트에 수집하고, 80℃에서 냉동시켰다. 클레코™ 조직 미분기 및 텅스텐 비드 (엔비론 메탈 인크.: 미국 오레곤주 스위트 홈)를 이용하여 조직 침연을 수행하였다. 조직 침연 후, 전체 RNA를 퀴아젠™ Rneasy 96 키트 (퀴아젠™, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여, 칼럼 상에서의 임의적인 DnaseI 처리를 포함하는 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 고처리량 포맷으로 단리시켰다. 상기 단계에 이어서 용리된 전체 RNA를 추가의 DnaseI (암비온(Ambion)™: 미국 텍사스주 오스틴) 처리를 진행하였다. 올리고뉴클레오티드, TVN을 첨가하면서, 하이 케파시티 cDNA 리버스 트랜스크립션(High Capacity cDNA Reverse Transcription)™ 키트 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems: 미국 텍사스주 오스틴))를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 주형으로서 전체 RNA를 사용함으로써 cDNA 합성을 수행하였다. 가수분해 프로브 검정법에 의해 발현 정량화를 완료하였고, 이는 라이트사이클러®480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스: 미국 인디애나주 인디애나폴리스))을 이용하여 실시간 PCR에 의해 수행되었다. 라이트사이클러® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0(LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0)을 사용하여 dgt -28 및 내부 참조 유전자인 내부 참조 유전자 "비공지 단백질" (진뱅크 수탁 번호 AT4G24610)에 대한 검정법을 디자인하였다. 증폭을 위해 라이트사이클러®480 프로브 마스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를, 0.4 μM의 각 프라이머, 및 0.2 μM의 각 프로브를 함유하는 10 ㎕ 부피의 싱글플렉스 반응물 중에서 1X 최종 농도로 제조하였다. 표 7.
Figure 112014083517272-pct00007
60 ℃에서 40 초 동안 연장시키고, 형광을 획득하는 2단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플을 3중으로 진행시키고, 각 샘플 분석을 위해 사이클 역치 (Ct) 평균값을 사용하였다. 확실하게 어떤 gDNA 오염도 존재하지 않도록 하기 위해 각 샘플에 대한 (-) 역전사 반응을 진행하였다. ΔΔCt 방법에 기초하여 실시간 PCR 데이터 분석을 수행하였다. 반접합성 및 동형접합성인 것으로 측정된 트랜스제닉 아라비돕시스 이벤트 중의 dgt -28의 상대적인 발현을 상기 검정법을 사용하여 측정하였다. dgt -28 mRNA의 상대적인 전사 수준은 내부 대조군보다 2.5배 내지 207.5배 더 높은 범위였다. 상기 데이터는 dgt -28 트랜스제닉 식물이 작용성 dgt -28 유전자 발현 카세트를 포함하고, 식물은 dgt -28 트랜스진을 전사시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
웨스턴 블롯팅 분석. 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 식물로부터 수득한 잎 샘플에서 DGT-28을 검출하였다. dgt -28 트랜스제닉 식물로부터의 식물 추출물 및 DGT-28 단백질 표준을 90℃에서 10분 동안 DTT를 함유하는 뉴페이지(NUPAGE)® LDS 샘플 완충제 (인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)와 함께 인큐베이션시키고, 아크릴아미드 프리캐스트 겔에서 전기영동 방식으로 분리하였다. 이어서, 제조사의 프로토콜을 이용하여 단백질을 니트로셀룰로스 막 상에 전기 전달하였다. 웨스턴브리즈® 블록팅 믹스(WESTERNBREEZE® Blocking Mix) (인비트로겐)를 이용하여 차단시킨 후, 항-DGT-28 항혈청에 이어서, 염소 항-토끼 포스파타제에 의해 DGT-28 단백질을 검출하였다. 화학 발광 기질 BCIP/NBT 웨스턴 애널리시스 리에이젼트(Western Analysis Reagent) (KPL: 미국 메릴랜드주 게이더스버그)에 의해 검출된 단백질을 시각화하였다. 웨스턴 블롯을 통한 무손상 DGT-28 단백질의 제조는 검정된 dgt -28 트랜스제닉 식물이 DGT-28 단백질을 발현하였다는 것을 나타내었다.
dgt -28 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 T1 아라비돕시스 식물에 글리포세이트 비율을 달리하면서 분무하였다. 본 연구에서는 비율을 증가시키면서 시용시킴으로써 상대적인 저항성 수준을 측정하였다 (105, 420, 1,680 또는 3,360 g ae/ha). 글리포세이트의 전형적인 1X 필드 사용률은 1,120 g ae/ha이다. 본 연구에서 사용된 T1 아라비돕시스 식물은 dgt -28 트랜스진에 대한 카피수에 있어 가변적이었다. 카피수가 낮은 dgt -28 T1 아라비돕시스 식물은 자가 수분시키고, 이를 사용하여 T2 식물을 제조하였다. 하기 표 8에는 도출된 dgt -28 트랜스제닉 식물을 글리포세이트 제초제 저항성 유전자인 dgt-1, 및 야생형 대조군과 비교한 것이 제시되어 있다. 하기 표 9에는 도출된 dgt -32, 및 dgt -33을 글리포세이트 제초제 저항성 유전자인 dgt-1, 및 야생형 대조군과 비교한 것이 제시되어 있다. 하기 표 10에는 글리포세이트 비율이 1,680 g ae/ha일 때, 신규한 박테리아 EPSP 신타제 효소를 부류 I EPSP 신타제 효소 및 대조군과 비교한 것이 제시되어 있다.
형질전환된 dgt -28 아라비돕시스 식물의 글리포세이트 선별에 대한 결과
먼저, 글루포시네이트 선별 방식을 사용하여 비형질전환된 종자 배경으로부터 아라비돕시스 T1 형질전환체를 선별하였다. 3개의 플랫 또는 30,000개의 종자를 각 T1 구축물에 대해 분석하였다. 상기에서 선별된 T1 식물을 분자에 의해 특징을 규명하고, 이어서, 카피수가 높은 식물을 개별 포트에 이식시키고, 앞서 기술된 바와 같이 시판용 글리포세이트를 다양한 비율로 분무하였다. 처리 후 2주째(WAT)의 시각적 손상률(%)로 상기 식물의 반응을 나타낸다. 데이터는 표에 나타나 있으며, 여기 표에는 손상을 거의 보이지 않거나, 전혀 보이지 않거나(< 20 %), 중간 정도의 손상을 보이거나(20-40 %), 심각한 손상을 보이는(> 40 %) 개별 식물이 제시되어 있다. 아라비돕시스 형질전환에 사용된 각 구축물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 아라비돕시스(재배종 콜롬비아)가 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다.
식물 반응 수준은 다양하였다. 이러한 변동은 각 식물이 독립적인 형질전환 이벤트를 나타내고, 따라서, 관심 유전자의 카피수는 식물마다 다르다는 사실에 기인하는 것일 수 있다. 트랜스진을 함유하는 일부 식물은 글리포세이트에 대해 내성을 띠지 않았고; 상기 식물이 트랜스진을 발현하였는지 여부를 측정하는 철저한 분석은 완료되지 않았다는 점에 주의하였다. T1 아라비돕시스 식물 내에 트랜스진이 높은 카피수로 존재하면 트랜스진 침묵화가 일어나거나, 또는 dgt-28 트랜스진의 존재에도 불구하고, 글리포세이트에 대한 감수성을 초래하는 다른 후생적 효과가 일어날 가능성이 있다.
글리포세이트 비율 1,680 g ae/ha에 대한 전체 집단의 평균 손상률(%)이 표 10에 제시되어 있으며, 이를 통해 dgt -3, dgt -7, dgt -28, dgt -32, 및 dgt -33 대 dgt-1 및 야생형 대조군으로 형질전환된 식물들 사이의 유의적인 차이가 입증된다.
신규한 박테리아 EPSP 신타제에 의해 제공되는 내성은 특이적인 효소에 따라 달랐다. 예상외로, DGT-28, DGT-32, 및 DGT-33이 글리포세이트에 대하여 유의적인 내성을 제공하였다. dgt 유전자는 시험된 모든 전이 펩티드에 걸쳐 개별 T1 아라비돕시스 식물에 제초제 저항성을 부여하였다. 따라서, 추가의 엽록체 전이 펩티드 (즉, TraP8 - dgt -32 또는 TraP8 - dgt -33)를 사용하는 것이 주어진 처리 내에서 보고된 것과 유사한 손상 수준으로 글리포세이트에 대한 보호를 제공할 것이다.
Figure 112014083517272-pct00008
Figure 112014083517272-pct00009
Figure 112014083517272-pct00010
Figure 112014083517272-pct00011
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Figure 112014083517272-pct00013
선별가능한 마커로서의 dgt -28 . 상기 기술된 아라비돕시스로 형질전환된 식물을 이용하여 글리포세이트 선별제를 위한 선별가능한 마커로서의 dgt -28의 용도를 시험하였다. 대략 50 개의 T4 세대 아라비돕시스 종자(dgt -28에 대해 동형접합성)를 (글리포세이트에 감수성인) 대략 5,000 개의 야생형 종자에 스파이킹하였다. 종자를 발아시키고, 묘목에 선택 용량의 글리포세이트를 분무하였다. 여러 개의 글리포세이트 처리를 비교하였다; 각 트레이의 식물은 하기 처리 방식 중 하나로 1 또는 2 회의 시용 시간에 글리포세이트를 받았다: 7 DAP(식재 후의 경과일수), 11 DAP, 또는 7 이어서, 11 DAP. 모든 식물은 또한 같은 형질전환 벡터 중에 글루포시네이트 저항성 유전자를 함유하기 때문에, 글리포세이트로 선별되는 dgt -28 함유 식물을 글루포시네이트로 선별되는 DSM -2 또는 pat 함유 식물과 직접 비교할 수 있다.
앞서 기술된 바와 같이 데빌비스™ 분무 팁을 이용하여 글루포시네이트 처리를 시용시켰다. dgt -28을 함유하는 트랜스제닉 식물은 17 DAP에서 "저항성" 또는 "감수성"인 것으로 확인되었다. 식재 후 7 일째 및 11 일째(DAP) 26.25-1,680 g ae/ha로 글리포세이트 시용 처리하였을 때, dgt -28을 함유하는 트랜스제닉 아라비돕시스 식물이 효과적으로 선별되는 것으로 나타났다. 감수성 및 저항성 식물을 계수하였으며, 글리포세이트 내성 식물의 개수가, 식재된, dgt -28 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 종자의 원 개수와 상관 관계가 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 dgt -28이 형질전환된 아라비돕시스 집단에 대한 대안적 선별가능한 마커로서 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
유전가능성. 확인된 트랜스제닉 T1 아라비돕시스 이벤트를 자가 수분시켜 T2 종자를 수득하였다. 상기 종자는, 글루포시네이트(200 g ae/ha)를 함유하는 이그나이트(Ignite)™ 제초제를 100개의 무작위 T2 형제에 시용하여 시험된 자손이었다. (187 L/ha의 시용률로 트랙 분무기를 이용하여) 분무 시용하기 이전에 각각의 개별 T2 식물을 7.5 cm2 화분에 이식시켰다. T1 패밀리(T2 식물)는 카이 제곱 분석에 의해 측정된 바(P > 0.05), 멘델의 유전 법칙(Mendelian inheritance)에 따라 우성으로 유전되는 단일 유전자좌에 대해, 예상되는 바와 같이, 3 개의 저항성 모델:1 개의 감수성 모델로 분리되었다. 예상된 멘델의 유전 법칙에 따라 분리된 T1 패밀리의 비율은 하기 표 11에 도시되어 있으며, 이는 dgt -28 형질은 멘델의 유전 법칙을 통해 T2 세대로 계대된다는 것을 입증한다. 5 내지 15 개의 T2 개체(T3 종자)로부터 종자를 수집하였다. 3-4 개의 무작위로 선택된 T2 패밀리 각각으로부터의 25 개의 T3 형제는 앞서 기술된 바와 같이 시험된 자손이었다. 데이터에서는 어떤 분리도 나타나지 않았고, 따라서 dgt -28 및 dgt -3이 염색체 내에 안정하게 통합되어 있으며, 멘델 방식으로 3 세대 이상으로까지 유전된다는 것을 입증하였다.
Figure 112014083517272-pct00014
T 2 아라비돕시스 데이터. dgt -28 트랜스진을 낮은 카피수로 함유하는, 선별된 T1 아라비돕시스 이벤트의 제2 세대 식물(T2)을 글리포세이트 내성에 대하여 추가로 특징을 규명하였다. 앞서 기술된 바와 같이 글리포세이트를 시용하였다. 처리 후 2주째(WAT)의 시각적 손상률(%)로 식물의 반응을 나타낸다. 데이터는 손상을 거의 보이지 않거나 전혀 보이지 않거나(<20 %), 중간 정도의 손상을 보이거나(20-40 %), 또는 심각한 손상을 보이는(>40 %) 개체에 대한 히스토그램으로 제시되어 있다. 아라비돕시스 형질전환에 사용된 각 구축물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 아라비돕시스(재배종 콜롬비아)가 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다. T2 세대에서, 반접합성 및 동형접합성 식물을 각 이벤트에 대해 시험하는 데에 이용할 수 있었으며, 따라서, 시험된 글리포세이트의 각 비율에 포함되었다. 한 유전자좌에 같은 2 개의 대립유전자를 포함하는 동형접합성 식물과 달리, 반접합성 식물은 한 유전자좌에 상이한 2개의 대립유전자를 포함한다. 동형접합성 식물과는 비교하여 반접합성의 경우, 유전자량 차이에 따른 결과로서, T2 세대에서 글리포세이트에 대한 반응의 가변성이 예상된다. 글리포세이트에 대한 반응의 가변성은 반응의 표준 편차 및 범위에 반영된다.
T2 세대에서, 단일 카피 및 다중 카피 dgt -28 이벤트, 양자 모두를 글리포세이트 내성에 대해 특징을 규명하였다. 이벤트 내에서, 단일 카피 식물은 글리포세이트에 대하여 유사한 내성 수준을 보였다. 단일 카피 T2 이벤트에 대한 특징적인 데이터는 하기 표 12에 제시되어 있다. TraP5 v2와 연결된 dgt -28을 함유하는 이벤트는 다른 TraP 전이 펩티드를 함유하는 dgt -28 구축물과 비교하였을 때, 글리포세이트에 대하여 강력한 내성을 제공하지는 못했다. 그러나, dgt -28 TraP5 구축물은 비형질전환된 콜롬비아 대조군과 비교하였을 때에는 낮은 수준의 글리포세이트 내성을 제공하였다. dgt -28 카피를 2 개 이상 함유하는 것으로 나타난 이벤트가 글리포세이트 비율 증가에 대하여 더욱 큰 민감성을 보이는 경우가 존재하였다(데이터는 나타내지 않음). 글리포세이트에 대한 이러한 감수성 증가는, 또한 dgt -28 트랜스진을 높은 카피수로 함유하는 T1 식물에 대해 앞서 기술된 데이터와 유사하다. 아라비돕시스 식물 내에 트랜스진이 높은 카피수로 존재하면 트랜스진 침묵화가 일어나거나, 또는 dgt -28 트랜스진의 존재에도 불구하고, 글리포세이트에 대한 감수성을 초래하는 다른 후생적 효과가 일어날 가능성이 있다.
이러한 이벤트는 TraP5 v2(pDAB105530), TraP12 v2(pDAB105533) 및 TraP13 v2(pDAB105534)에 연결된 dgt -28을 함유하였다.
dgt -28 이외에도, dgt -3으로 형질전환된 T2 아라비돕시스 이벤트는 하기 표 13에 제시되어 있다. 표 12에서 dgt -28 이벤트에 대해 기술되어 있는 바와 같이, 데이터 표는 각 구축물의 글리포세이트에 대한 반응의 특징인 대표적인 이벤트를 포함한다. dgt -3의 특징 규명을 위해, AtUbi10 프로모터에 의해 구동되는, dgt -3 유전자와 함께 단일 PTU(식물 형질전환 단위)를 함유하는 구축물(pDAB102716 및 pDAB102715)을 같은 유전자를 포함하며, 2 PTU의 유전자를 함유하는 구축물 (pDAB102719 및 pDAB102718)과 비교하였다. 2 PTU를 함유하는 구축물은 한 카피의 유전자를 구동시키는 데에는 AtUbi10 프로모터를 사용하였고, 다른 한 카피를 구동시키는 데에는 CsVMV 프로모터를 사용하였다. 트랜스진 카피를 2 개 함유하는 dgt-28 트랜스제닉 식물과 dgt -3 트랜스제닉 식물을 비교하기 위해 이중 PTU 사용을 도입하였다. 오직 단일의 PTU만을 가지는 단일 카피의 T2 dgt -3 이벤트가 시험된 단일 카피 dgt -28 이벤트보다, 글리포세이트에 대하여 더욱 큰 민감성을 보였지만, 비형질전환된 대조군보다는 내성이 더 크다는 것이 데이터를 통해 입증되었다. 2 PTU의 dgt -3 유전자를 함유하는 T1 패밀리는 1 PTU 구축물에 비하여 글리포세이트에 대해 시각상 더 높은 수준의 내성을 제공하였다. 두 경우 모두에서, T1 패밀리를 dgt -1 및 야생형 대조군과 비교하였다. dgt -28이 단일 카피 이벤트만큼 강력한 내성을 제공한다는 것이 T2 데이터를 통해 입증되었다.
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T 3 아라비돕시스 데이터. dgt -28 트랜스진을 낮은 카피수로 함유하는, 선별된 T1 아라비돕시스 이벤트의 제3 세대 식물(T2)을 글리포세이트 내성에 대하여 추가로 특징을 규명하였다. 앞서 기술된 바와 같이 글리포세이트를 시용하였다. 처리 후 2주째(WAT)의 시각적 손상률(%)로 상기 식물의 반응을 나타낸다. 데이터는 손상을 거의 보이지 않거나 전혀 보이지 않거나(<20 %), 중간 정도의 손상을 보이거나(20-40 %), 또는 심각한 손상을 보이는(>40 %) 개체에 대한 히스토그램으로 제시되어 있다. 아라비돕시스 형질전환에 사용된 각 구축물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 아라비돕시스(재배종 콜롬비아)가 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다. T3 세대에서, 반접합성 및 동형접합성 식물을 각 이벤트에 대해 시험하는 데 이용할 수 있었으며, 따라서, 이를 시험된 글리포세이트의 각 비율에 포함시켰다. 한 유전자좌에 같은 2 개의 대립유전자를 포함하는 동형접합성 식물과 달리, 반접합성 식물은 한 유전자좌에 상이한 2 개의 대립유전자를 포함한다. 동형접합성 식물과는 비교하여 반접합성의 경우, 유전자량 차이에 따른 결과로서, T3 세대에서 글리포세이트에 대한 반응의 가변성이 예상된다. 글리포세이트에 대한 반응의 가변성은 반응의 표준 편차 및 범위에 반영된다.
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형질전환된 식물의 선별. 새로 수확된 T1 종자[dgt -31, dgt -32, 및 dgt -33 v1 유전자]를 실온에서 건조시키고, 시험하기 위해 인디애나폴리스로 발송하였다. T1 종자를 26.5 x 51 cm 발아 트레이(T.O. 플라스틱스 인크.(T.O. Plastics Inc.), 미국 미네소타주 클리어워터)에 파종하였는데, 이들 각각은, 앞서 40 mL의 0.1% 아가로스 용액 중에 현탁시키고, 4 ℃에서 2 일 동안 보관하여 휴면 요건을 완료하고, 확실하게 동조 종자 발아가 이루어진, 200 mg 분취량의 계층화된 T1 종자(~10,000 개의 종자)를 받았다.
선샤인 믹스 LP5(선 그로 호르티컬쳐 인크.(Sun Gro Horticulture Inc.), 미국 워싱턴주 벨뷰)를 미세 질석으로 덮고, 습윤화될 때까지 호그랜드의 용액을 이용하여 저면 관수를 수행한 후, 중력 배수시켰다. 피펫을 이용하여 각 40 mL 분취량의 계층화된 종자를 질석 상에 고르게 파종시키고, 4-5 일 동안 습도 유지용 돔 (코드™ 프로덕츠(KORD™ Products), 캐나다 온타리오주 브라말리)으로 덮어 놓았다. (공동으로 형질전환된 dsm -2 유전자 선별을 위해) 발아 후 글루포시네이트 분무를 이용하여 1차 형질전환체 선별을 수행하기 전에, 일단 식물이 발아되고 나면 돔을 제거하였다.
식재 후 6 일째(DAP) 및 다시 10 DAP일 때, T1 식물(각각 자엽 및 2-4-lf 단계)에 0.1% 이그나이트™ 제초제 용액(280 g ai/L 글루포시네이트, 바이엘 크롭 사이언시즈, 미국 미주리주 캔자스주)을 10 mL/트레이(703 L/ha)의 분무 부피로 데빌비스™ 압축 공기 분무 팁을 이용하여 분무함으로써 1 회 시용당 200 g ae/ha 글루포시네이트의 유효 비율로 전달하였다. 최종 분무 후 4-7 일이 경과하였을 때 생존 식물(활발하게 성장하는 식물)을 확인했다. 생존 식물을 화분용 배지(메트로 믹스(Metro Mix) 360™)로 제조된 3 인치(7.6 cms) 화분으로 개별적으로 이식시켰다. 카피수 분석을 위해 조직을 샘플링하기 적어도 1 일 전에 식물을 온실에서 재배하였다.
T1 식물을 샘플링하고, dgt -31, dgt -32, 및 dgt -33 v1 유전자에 대한 카피수 분석을 완료하였다. 이어서, 카피 범위가 각 비율 사이에 존재하도록 T1 식물을 다양한 비율의 글리포세이트로 배정하였다. 아라비돕시스의 경우, 26.25 g ae/ha 글리포세이트가 감수성 식물을, 의미있는 내성 수준을 가지는 것과 식별하는 데 효과적인 용량이다. 비율을 증가시키면서 시용시킴으로써 상대적인 저항성 수준을 측정하였다(105, 420, 1,680 또는 3,360 g ae/ha). 하기 표 16에는 도출된 것을 dgt -1과 비교한 것이 제시되어 있다.
모든 글리포세이트 제초제를 187 L/ha의 분무 부피로 트랙 분무기에 의해 시용하였다. 사용된 글리포세이트는 시판용, 두란고(Durango) 디메틸아민 염 제제 (480 g ae/L, 다우 아그로사이언시즈, LLC(Dow AgroSciences, LLC))였다. 글루포시네이트 또는 글리포세이트에 대하여 내성을 보이는 카피수가 낮은 T1 식물을 T2 세대에서 추가로 평가하였다.
dgt -31, dgt -32, 및 dgt -33 v1을 사용하여 제1 아라비돕시스 형질전환을 수행하였다. 먼저, 글루포시네이트 선별 방식을 사용하여 비형질전환된 종자의 배경으로부터 T1 형질전환체를 선별하였다. 3 개의 플랫 또는 30,000 개의 종자를 각 T1 구축물에 대해 분석하였다. 형질전환 빈도를 계산했고, T1 dgt -31, dgt -32, 및 dgt-33 구축물의 결과는 하기 표 15에 열거했다.
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이어서, 상기와 같이 선별된 T1 식물을 개별 화분에 이식시키고, 다양한 비율의 시판용 글리포세이트를 분무하였다. 하기 표 16에서는 아라비돕시스 T1 형질전환체에 대해 글리포세이트 저항성을 부여하는 dgt -31, dgt -32, 및 dgt -33 v1, 및 대조군 유전자의 반응을 비교하였다. 2 WAT의 시각적 손상률(%)로 반응을 나타낸다. 데이터는 손상을 거의 보이지 않거나 전혀 보이지 않거나(<20 %), 중간 정도의 손상을 보이거나(20-40 %), 또는 심각한 손상을 보이는(>40 %) 개체에 대한 히스토그램으로 제시되어 있다. 각 처리에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 아라비돕시스(재배종 콜롬비아)가 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다. 음성 대조군과 비교하여 전이 펩티드(TraP23)를 포함하는 DGT -31( v1 ) 유전자가 개별 T1 아라비돕시스 식물에 약간의 제초제 내성을 부여하였다. DGT-32 및 DGT-33, 둘 모두 그의 각 엽록체 전이 펩티드(각각 Tra14 및 TraP24)와 함께 시험된 비율의 글리포세이트에 대하여 강력한 내성을 보였다. 주어진 처리에서, 식물 반응 수준은 매우 달랐는데, 이는 각 식물이 독립적인 형질전환 이벤트를 나타내고, 따라서, 관심 유전자의 카피수는 식물마다 다르다는 사실에 기인하는 것일 수 있다. 중요하게는, 시험된 각 글리포세이트 비율에서 다른 것들보다 더 큰 내성을 보이는 개체가 존재하였다. 전체 집단의 평균 손상율은 하기 표 16에 제시되어 있으며, 이를 통해 dgt -31, dgt -32, 및 dgt -33 v1 대 dgt-1 vl 또는 야생형 대조군으로 형질전환된 식물들 사이의 상당한 차이가 입증되었다.
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옥수수 형질전환. 옥수수의 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환에 사용하기 위한 이원성 벡터를 구축하는 데 상기 기술된 바와 같은 표준 클로닝 방법을 사용하였다. 하기 표 17에는 옥수수 형질전환을 위한 것으로 구축된 벡터가 열거되어 있다. dgt -28을 함유하는 벡터에 하기 유전 요소가 사용되었다; 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터(ZmUbi1; 미국 특허 번호 제5,510,474호)는 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역(ZmLip 3'UTR; 미국 특허 번호 제7179902호) 측면에 위치하는 dgt -28 코딩 서열을 구동시키는 데 사용되었고, 선별가능한 마커 카세트는 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 aad -1 코딩 서열(미국 특허 번호 제7,838,733호)을 구동시키는 데 사용된 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터로 구성되었다. aad -1 코딩 서열은 페녹시 옥신 제초제, 예컨대, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)에 대한 내성 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트(AOPP) 제초제에 대한 내성을 부여한다.
dgt -28 구축물을 표준 이원성 벡터 및 아그로박테리움 초이원성 시스템 벡터 (재팬 토바코(Japan Tobacco), 일본 도쿄)로서 구축하였다. 표준 이원성 벡터는 pDAB107663, pDAB107664, pDAB107665, 및 pDAB107665를 포함하였다. 아그로박테리움 초이원성 시스템 벡터는 pDAB108384, pDAB108385, pDAB108386, 및 pDAB108387을 포함하였다.
황색 형광성 단백질(yfp; 미국 특허 출원 2007/0298412) 리포터 유전자를 포함하는 추가의 구축물을 완성하였다. pDAB109812는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고, 제아 메이스 per 5 3' 비번역 영역(Zm per5 3'UTR; 미국 특허 번호 제7179902호) 측면에 위치하는 yfp 리포터 유전자 카세트를 포함하고, 선별가능한 마커 카세트는 aad -1의 발현을 구동시키는 데 사용되고, 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 사탕수수 간상 바이러스 프로모터(SCBV; 미국 특허 번호 제5,994,123호)로 구성된다. pDAB101556은 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고, 제아 메이스 per 5 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 yfp 카세트를 포함하고, 선별가능한 마커 카세트는 aad -1의 발현을 구동시키는 데 사용되고 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터로 구성된다. pDAB107698은 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고, 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 dgt -28 카세트, 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고 제아 메이스 per 5 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 yfp 카세트를 포함하고, 선별가능한 마커 카세트는 aad -1의 발현을 구동시키는 데 사용되고 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역 측면에 위치하는 사탕수수 간상 바이러스 프로모터로 구성된다. 상기 3 가지 구축물은 모두 표준 이원성 벡터이다.
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이삭 멸균화 및 배 단리. 옥수수 미성숙한 배를 수득하기 위해, 제아 메이스 근교계주 B104의 식물을 온실에서 성장시키고, 자가 수분 또는 동계 수분시켜 이삭을 생산하였다. 수분 후 대략 9-12 일 경과하였을 때, 이삭을 수거하였다. 실험 당일, 이삭을 20 % 차아염소산나트륨(5 %) 용액 중에 침지시키고, 20-30 분 동안 진탕시킨 후, 멸균수 중에서 3 회 세정하여 표면을 멸균시켰다. 멸균 후, 미성숙한 접합성 배(1.5-2.4 mm)를 무균 방식으로 각 이삭으로부터 절개하고, 액체 감염 배지(LS 기초 배지, 4.43 gm/L; N6 비타민 용액[1000X], 1.00 mL/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 수크로스, 68.5 gm/L; D(+) 글루코스, 36.0 gm/L; 10 mg/ml의 2,4-D, 150 μL/L)를 함유하는 미세원심분리관에 무작위적으로 분포시켰다. 주어진 실험 세트에 대해, 각 형질전환을 위해 3 개의 이삭으로부터 풀링된 배를 사용하였다.
아그로박테리움 배양 개시:
상기 기술된 이원성 형질전환 벡터를 함유하는 아그로박테리움의 글리세롤 스톡을, 적절한 항생제를 함유하는 AB 최소 배지 플레이트 상에 스트레이킹하고(streaked), 20 ℃에서 3-4 일 동안 성장시켰다. 단일 콜로니를 채취하고, 같은 항생제를 함유하는 YEP 플레이트 상에 스트레이킹하고, 28 ℃에서 1-2 일 동안 인큐베이션시켰다.
아그로박테리움 배양 및 공동 배양. 아그로박테리움 콜로니를 YEP 플레이트로부터 채취하고, 50 mL 1회용 관 중 10 mL의 감염 배지에 현탁시키고, 분광광도계를 사용하여 세포 밀도를 OD600 nm = 0.2-0.4로 조정하였다. 배를 절개하면서, 아그로박테리움 배양물을 실온에서 125 rpm의 회전식 진탕기에 놓았다. 크기가 1.5-2.4 mm인 미성숙한 접합성 배를 멸균화된 옥수수 낟알로부터 단리시키고, 1 mL 감염 배지에 놓고, 같은 배지에서 1 회 세척하였다. 아그로박테리움 현탁액(2 mL)을 각 관에 첨가하고, 관을 10-15 분 동안 진탕기 플랫폼 상에 놓았다. 배를 공동 배양 배지(MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔(Gelzan)™, 3.00 gm/L; 개질된 MS-비타민[1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo3, 15.0 mg/L; DMSO, 100 μM) 상에 옮겨 놓고, 배반이 위로 향하게 배향시키고, 25 ℃에서 3 일 동안 50 μmole m-2 sec-1 조도로 24 시간 명기하에서 인큐베이션시켰다.
캘러스 선별 및 추정 이벤트의 재생. 공동 배양기 후, 배를 선별제를 함유하지 않는 휴지 배지(MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔 2.30 gm/L; 개질된 MS-비타민[1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮겨 놓고, 25 ℃에서 3 일 동안 50 μmole m-2 sec-1 조도로 24 시간 명기하에서 인큐베이션시켰다.
성장 억제량 반응 실험은, 0.25 mM 이상의 글리포세이트 농도가 비형질전환된 B104 옥수수 계통에서 세포 성장을 억제시키는 데에 충분하였다는 것을 제안하였다. 배를 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 선별 1 배지(MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; MES[(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔™ 2.30 gm/L; 개질된 MS-비타민[1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮겨 놓고, 28 ℃에서 7-14 일 동안 50 μmole m-2 sec-1 조도로 24 시간 명기하에서 및/또는 암실에서 인큐베이션시켰다.
증식성 배발생 캘러스를 1.0 mM 글리포세이트를 함유하는 선별 2 배지(MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; MES[(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔™ 2.30 gm/L; 개질된 MS-비타민[1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/mL AgNo3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L; R-할록시포프 산(Haloxyfop acid) 0.1810 mg/L) 상으로 옮겨 놓고, 28 ℃에서 14 일 동안 50 μmole m-2 sec-1 조도로 24 시간 명기하에서 및/또는 암실에서 인큐베이션시켰다. 상기 선별 단계를 통해 트랜스제닉 캘러스를 추가로 증식시키고, 분화시켰다. 캘러스 선별 기간은 3 내지 4 주간 지속되었다.
증식성, 배발생 캘러스를 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 PreReg 배지(MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; L-프롤린, 350.0 mg/L; MES[(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.250 gm/L; 카제인 효소 가수분해물 50.0 mg/L; NAA-NaOH 0.500 mg/L; ABA-EtOH 2.50 mg/L; BA 1.00 mg/L; 수크로스, 45.0 gm/L; 겔잔™ 2.50 gm/L; 개질된 MS-비타민[1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNo3, 1.00 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮겨 놓고, 28 ℃에서 7 일 동안 50 μmole m-2 sec-1 조도로 24 시간 명기하에서 배양하였다.
새싹과 유사한 눈이 있는 배발생 캘러스를 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 재생용 배지(MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100.0 mg/L; 수크로스, 60.0 gm/L; 겔란 검(Gellan Gum) G434™ 3.00 gm/L; 개질된 MS-비타민[1000X], 1.00 ml/L; 카르베니실린, 125.0 mg/L) 상으로 옮겨 놓고, 7 일 동안 50 μmole m-2 sec-1 조도로 24 시간 명기하에서 배양하였다.
주근이 있는 작은 새싹을 식물용 트레이(phytotray) 중의 발근용 배지(MS 염, 4.33 gm/L; 개질된 MS-비타민[1000X], 1.00 ml/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; 수크로스, 60.0 gm/L; 겔란 검 G434™ 3.00 gm/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮겨 놓고, 27 ℃에서 7 일 동안 140-190 μmole m-2 sec-1 조도로 16/8 시간의 명기/암기하에서 인큐베이션시켰다. 상기 기술된 프로토콜을 이용하여 추정 트랜스제닉 묘목을 트랜스진 카피수에 대해 분석하고, 토양으로 옮겼다.
옥수수 식물 내의 dgt -28 및 aad -1 트랜스진의 존재에 관한 분자적 확인. 가수분해 프로브 검정법을 통해 dgt -28 및 aad -1 폴리뉴클레오티드 서열의 존재를 확인하였다. 먼저 택맨(TAQMAN)™과 유사한 가수분해 프로브 검정법을 통해 단리된 T0 옥수수 식물을 스크리닝하여 aad -1 및 dgt -28 트랜스진의 존재를 확인하였다. 상기 연구로부터 작성된 데이터를 사용하여 트랜스진 카피수를 측정하고, 여교배 및 T1 세대로의 진행을 위한 트랜스제닉 옥수수 이벤트를 선별하였다.
조직 샘플을 96웰 플레이트에 수집하고, 퀴아젠™ RLT 완충제 중에서 클레코™ 조직 미분기 및 스테인리스 스틸 비드(후버 프리시젼 프로덕츠(Hoover Precision Products), 미국 조지아주 커밍)를 이용하여 조직 침연을 수행하였다. 조직 침연 후, 게놈 DNA를 바이오스프린트 96™ 식물 키트(퀴아젠, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 고처리량 포맷으로 단리시켰다. 게놈 DNA를 콴트-잇™ 피코 그린 DNA 검정 키트(몰레큘라 프로브스, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에 의해 정량화하였다. 가수분해 프로브 검정법을 수행하기 위해 바이오로보트3000™ 자동 액체 핸들러(퀴아젠, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 이용하여 정량화된 게놈 DNA를 약 2 ng/μL로 조정하였다. 라이트사이클러®480 시스템(로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)을 이용하여 실시간 PCR에 의해 택맨® 검정법과 유사한 가수분해 프로브 검정법에 의한 트랜스진 카피수 측정을 수행하였다. 라이트사이클러® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 사용하여 aad -1, dgt -28 및 내부 참조 유전자 인버타제(Invertase)(진뱅크 수탁 번호 U16123.1)에 대해 검정법을 디자인하였다. 증폭을 위해 라이트사이클러®480 프로브즈 마스터 믹스(로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를, 0.4 μM의, aad -1 및 dgt -28에 대한 각 프라이머, 및 0.2 μM의 각 프로브를 함유하는 10 μL 부피의 멀티플렉스 반응물에서 1X 최종 농도로 제조하였다(하기 표 18).
60 ℃에서 40 초 동안 연장시키고, 형광을 획득하는 2 단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플을 진행시키고, 각 샘플 분석을 위해 사이클 역치(Ct) 평균값을 사용하였다. 상대 콴트 모듈을 이용하여 라이트사이클러™ 소프트웨어 출시 1.5를 사용함으로써 실시간 PCR 데이터 분석을 수행하였는데, 이는 ΔΔCt 방법에 기초하는 것이다. 대조군은 각 진행에 포함된 단일 카피 교정기 및 공지된 2 개의 카피 체크로부터 게놈 DNA의 샘플을 포함하였다. 하기 표 19에는 가수분해 프로브 검정법의 결과가 열거되어 있다.
Figure 112014083517272-pct00026
Figure 112014083517272-pct00027
dgt -28 로 형질전환된 옥수수에서의 제초제 내성. 제아 메이스 dgt-28로 형질전환 이벤트(T0)를 온실에서 순응시키고, 식물이 조직 배양물로부터 온실 성장 조건으로 이행될 때까지(즉, 정상적으로 보이는, 2-4 개의 새잎이 윤생체로부터 출현할 때까지) 성장시켰다. 식물을 온실에서 27 ℃에서 16 시간 명기:8 시간 암기인 조건하에서 성장시켰다. 이어서, 2 % w/v 황산암모늄이 첨가된(제초제 글리포세이트를 함유하는) 시판용 두란고 DMA™ 제제로 식물을 처리하였다. 187 L/ha의 분무 부피로 트랙 분무기를 이용하여 50 cm의 분무 높이에서 제초제를 시용하였다. 비형질전환된 옥수수 계통에 유의적인 손상을 일으킬 수 있는, 280 - 4,480 g ae/ha 글리포세이트의 범위로 글리포세이트를 T0 식물에 분무하였다. 치사량은 B104 근교계에 >95 %의 손상을 유발하는 비율로서 정의된다.
T0 dgt -28 옥수수 식물의 결과를 통해, 최대 4,480 g ae/ha까지의 비율에서 글리포세이트에 대한 내성이 달성되었다는 것이 입증되었다. T0 세대에서는 특정 배지 유형을 사용하였다. 비형질전환된 대조군과 비교되는, 형질전환된 식물의 최소의 발육 저지 및 전반적인 식물 성장을 통해 dgt -28이 TraP5, TraP8, 및 TraP23 엽록체 전이 펩티드에 연결되었을 때, 글리포세이트에 대한 강력한 내성을 제공한다는 것이 입증되었다.
다음 세대에서 추가로 특징을 규명하기 위해 선별된 T0 식물을 자가 교배하거나, 여교배하였다. 100 개의 선별된 dgt -28 계통 함유 T1 식물에 140-1,120 g ae/ha 글루포시네이트 또는 105-1,680 g ae/ha 글리포세이트를 분무하였다. 선별가능한 마커 및 글리포세이트 저항성 유전자, 둘 모두를 같은 플라스미드 상에 구축하였다. 따라서, 제초제를 분무함으로써 그에 대해 한 제초제 내성 유전자가 선별되었다면, 상기 두 유전자가 존재하는 것으로 간주된다. 14 DAT일 때, 저항성 및 감수성 식물을 계수하여, 카이 제곱 분석에 의해 측정된 바, 단일 유전자좌로서 멘델의 우성 형질(3R:1S)로 분리된 계통의 비율을 측정하였다. dgt -28은 단자엽 종에서 강력한 글리포세이트 저항성 유전자로서 유전가능하다는 것이 상기 데이터를 통해 입증되었다. dgt -28 유전자에 의해 제공되는 내성 및 보호에 대해 추가로 특징을 규명하기 위해 T1 또는 F1 생존 식물에 글리포세이트의 비율을 증가시키면서 시용하였다.
dgt -28 로 형질전환된 T 0 옥수수에서의 발아 후 제초제 내성. TraP4, TraP5, TraP8 및 TraP23과 연결된 dgt -28의 T0 이벤트를 아그로박테리움 형질전환에 의해 생성하고, 정상적으로 보이는, 2-4 개의 새잎이 윤생체로부터 출현할 때까지, 조절식 성장 챔버 조건하에서 순응시켰다. 식물에 개별 식별 번호를 배정하고, dgt -28 및 aad -1, 둘 모두의 카피수 분석을 위해 샘플링하였다. 카피수 분석에 기초하여, 식물을 단백질 발현 분석을 위해 선별하였다. 새 성장 배지가 있는 더 큰 화분으로 식물을 이식시키고, 온실에서 27 ℃에서 16 시간 명기:8 시간 암기 조건하에 성장시켰다. 이어서, 단백질 발현을 위해 샘플되지 않은 나머지 식물은 2 % w/v 황산암모늄이 첨가된 시판용 두란고 DMA™ 제제(글리포세이트)로 처리하였다. 각 식물 집단이 다양한 카피수의 T0 이벤트를 포함하도록 처리를 분배하였다. 187 L/ha의 분무 부피로 트랙 분무기를 이용하여 50 cm의 분무 높이에서 제초제를 시용하였다. 비형질전환된 옥수수 계통에 유의적인 손상을 일으킬 수 있는, 280 - 4,480 g ae/ha 글리포세이트의 범위로 글리포세이트를 T0 식물에 분무하였다. 치사량은 B104 근교계에 >95 %의 손상을 유발하는 비율로서 정의된다. B104는 형질전환체의 유전적 배경이 되었다.
T0 dgt -28 옥수수 식물의 결과를 통해, 최대 4,480 g ae/ha까지의 비율에서 글리포세이트에 대한 내성이 달성되었다는 것이 입증되었다. 표 20. 비형질전환된 대조군과 비교되는, 형질전환된 식물의 최소의 발육 저지 및 전반적인 식물 성장을 통해 dgt -28이 TraP5, TraP8, 및 TraP23에 연결되었을 때, 글리포세이트에 대한 강력한 내성을 제공한다는 것이 입증되었다.
Figure 112014083517272-pct00028
표준 ELISA에 의한 단백질 발현 분석을 통해 시험된 구축물에 걸쳐 12.6 - 22.5 ng/cm2의 DGT-28 단백질의 평균 범위가 입증되었다.
온실 조건하의 F 1 세대에서의 글리포세이트 내성 확인. 다음 세대에서 추가로 특징을 규명하기 위해 분무를 받지 않은 단일 카피 T0 식물을 비형질전환된 배경 B104에 여교배하였다. T1 세대에서, 글리포세이트 내성을 평가하여 dgt -28 유전자의 유전성을 확인하였다. T1 식물의 경우, AAD-1 단백질에 대해 선별하기 위해 V1 성장 단계에서 시용하여 제초제 어슈어 II(ASSURE II)™(35 g ae/ha 퀴잘로포프-메틸)를 시용하였다. 선별가능한 마커 및 글리포세이트 저항성 유전자, 둘 모두를 같은 플라스미드 상에 구축하였다. 따라서, 한 유전자가 선별될 경우, 두 유전자 모두 존재하는 것으로 간주된다. 7 DAT 후, 저항성 및 감수성 식물을 계수하고, 널(null) 식물을 집단으로부터 제거하였다. dgt -28(v1)은 단자엽 종에서 강력한 글리포세이트 저항성 유전자로서 유전가능하다는 것이 상기 데이터를 통해 입증되었다. 표준 ELISA에 의한 DGT-28 단백질 및 RNA 전사체 수준에 대한 특징을 규명하기 위해 식물을 샘플링하였다. 앞서 기술된 바와 같이 560-4,480 g ae/ha 글리포세이트를 저항성 식물에 분무하였다. 데이터를 통해, 최대 4,480 g ae/ha 글리포세이트까지 엽록체 전이 펩티드 TraP4, TraP5, TraP8 및 TraP23에 연결된 dgt -28의 강력한 내성이 입증되었다. 표 21.
Figure 112014083517272-pct00029
단백질 발현 데이터를 통해, T1 세대에서의 단백질 발현이 확립됨과 동시에, 시험된 T1 이벤트 및 구축물에 걸쳐 42.2 - 88.2 ng/cm2의 DGT-28 단백질의 평균 범위가 입증되었다.
필드 조건하에서의 dgt -28 옥수수의 특징 규명. 단일 카피 T1 이벤트를 필드 위치로 보내어 추가의 특징 규명을 위한 하이브리드 반접합성 종자 및 근교계 동형접합성 종자, 둘 모두를 제조하였다. 옥수수 형질전환 계통 B104 중의 T1 이벤트를 근교계주 4XP811에 교배시켜 상기 이벤트에 대해 1:1(반접합성:널)로 분리되는 하이브리드 집단을 생성함으로써 하이브리드 종자를 제조하였다. 생성된 종자를 별개의 두 위치로 발송하였다. 구축물 1 개당 총 5 개의 단일 카피 이벤트를 3중으로 임의화 완전 블록 디자인으로 각 위치에 식재하였다. 필드는 V4 성장 단계에서 글리포세이트를 시용하고, V8 성장 단계에서 시용된 식물을 별개 집단으로 분류하는 것으로 디자인되었다. 4XP811/B104 종래 하이브리드가 음성 대조군으로서 사용된다.
실험 열을 184 g ae/ha 어슈어 II™(106 g ai/L 퀴잘로포프-메틸)로 처리하여 널 분리 개체를 제거하였다. 어슈어 II™ 시용과 관련하여 모든 실험 엔트리는 1:1(감수성:저항성)(p=0.05)로 분리되었다. 표준 ELISA에 의해 DGT-28 단백질을 정량화하기 위하여, 선별된 저항성 식물을 각 이벤트로부터 샘플링하였다.
퀴잘로포프-메틸 저항성 식물을 V4 또는 V8 성장 단계에서 2.5 % w/v 황산암모늄이 첨가된 시판용 제초제 두란고 DMA™(480 g ae/L 글리포세이트)로 처리하였다. 187 L/ha의 부피를 전달하도록 교정된 붐 분무기를 이용하여 50 cm의 분무 높이에서 제초제를 시용하였다. 비형질전환된 옥수수 계통에 유의적인 손상을 일으킬 수 있는, 1,120 - 4480 g ae/ha 글리포세이트의 범위로 글리포세이트를 식물에 분무하였다. 치사량은 4XP811 근교계에 >95 %의 손상을 유발하는 비율로서 정의된다. 7, 14 및 21 DAT일 때(처리 후 경과일수: days after treatment) 시각적 황백증 비율(%), 괴사 비율(%), 성장 억제율(%) 및 총 시각적 손상에 대해 시각적 손상 평가를 실시하였다. 평가를 각 계통에 대한 비처리된 체크 및 음성 대조군과 비교하였다.
모든 평가 시점에 대한 시각적 손상 데이터를 통해, 위치 및 시용 시점, 둘 모두에서 최대 4,480 g ae/ha까지의 두란고 DMA™에 대해 강력한 내성이 입증되었다. V4 시용에 대한 대표적인 이벤트는 한 위치에서 나타났고, 이는 다른 이벤트, 시용 시점 및 위치에서의 것과 일치하였다. 표 22. TraP23에 연결된 dgt -28을 함유하는 구축물(pDAB107665)로부터의 한 이벤트는 AAD-1 단백질에 대한 어슈어 II™ 선별에는 내성을 보였지만, 시용된 모든 비율의 글리포세이트에 대해서는 감수성을 띠었다.
Figure 112014083517272-pct00030
생식 성장 단계 동안 4,480 g ae/ha 글리포세이트 비율에 대한 추가의 평가를 수행하였다. 옥수수 수염, 수분 시점 및 이삭 충전(ear fill)에 대한 시각적 평가 결과는 모든 구축물, 시용 시점 및 위치에 있어 각 계통에 대한 비처리된 체크와 유사하였다. DGT-28 단백질에 대한 정량화 결과를 통해 186.4 - 303.0 ng/cm2 범위의 평균 단백질 발현이 입증되었다. 데이터를 통해, 최대 4,480 g ae/ha 글리포세이트까지 필드 조건하에서의 생식 성장 단계까지 계속된 dgt -28로 형질전환된 옥수수의 강력한 내성이 입증되었다. 데이터를 통해서는 또한 분무 내성 결과에 기초하여 DGT-28 단백질 검출 및 기능도 입증되었다.
동형접합성 상태에서 dgt -28 옥수수의 유전가능성 및 내성 확인. T1S2로부터의 종자를 앞서 기술된 바와 같은 온실 조건하에서 식재하였다. 필드 조건하에서 특징이 규명된 동일한 5 개의 단일 카피 계통을 동종 상태에서 특징을 규명하였다. V3 성장 단계까지 식물을 성장시키고, 1,120-4,480 g ae/ha 글리포세이트(두란고 DMA™) 범위의 3 가지 비율의 글리포세이트 및 각 처리당 4 개의 복제물로 나누었다. 앞서 기술된 바와 같이 트랙 분무기로 시용하였고, 시용물은 2.0 % w/v 황산암모늄 중에서 제제화되었다. 황산암모늄 시용물이 각 계통에 대한 비처리된 체크로서의 역할을 하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 처리 후 7 및 14 일째 시각적 평가를 수행하였다. 데이터를 통해, 시험된 모든 이벤트에 있어 최대 4,480 g ae/ha까지의 글리포세이트에 대해 강력한 내성이 입증되었다. 표 23.
Figure 112014083517272-pct00031
필드 조건하에서는 내성을 보이지 않았던 pDAB107665로부터의 계통은 글리포세이트에 대해 내성을 띠지 않았으며, 따라서, 이는 필드에서의 관찰 결과와 일치하는 것으로 나타났다(데이터는 나타내지 않음). 앞서 언급한 한 계통을 제외하면, 상기 계통으로부터의, 글리포세이트로 처리된 모든 복제물은 글리포세이트에 대해 감수성을 띠지 않았다. 그러므로, 본 데이터를 통해 멘델 방식으로 dgt -28 옥수수의 동종 집단으로의 유전가능성이 입증되었다. 표준 ELISA에 의한 DGT-28 단백질의 발현을 통해 글리포세이트에 대해 내성을 띠는 단일 카피 이벤트에 걸친 27.5 - 65.8 ng/cm2의 단백질 발현의 평균 범위가 입증되었다. 데이터를 통해 세대 간의 DGT-28 단백질의 기능적 단백질 및 안정성이 입증되었다.
선별가능한 마커로서의 글리포세이트의 발아 후 제초제 내성 사용. 앞서 기술된 바와 같이, T0 형질전환된 식물을 조직 배양물로부터 옮겨 온실에서 순응시켰다. 시험된 이벤트는 TraP5, TraP8, 및 TraP23 엽록체 전이 펩티드에 연결된 dgt -28을 포함하였다. 상기 T0 식물은 최대 4,480 g ae/ha까지의 글리포세이트에 대해 강력한 내성을 제공하고, 비형질전환된 식물은 280 g ae/ha 정도로 낮은 농도의 글리포세이트로 방제되었다는 것이 입증되었다. 상기 데이터를 통해 dgt -28은 280 - 4,480 g ae/ha 범위 농도의 글리포세이트를 사용하여 선별가능한 마커로서 사용될 수 있다는 것이 입증되었다.
dgt -28 트랜스진을 함유하는 고정 계통의 옥수수로부터의 다수의 종자를 다수의 비형질전환된 옥수수 종자에 스파이킹하였다. 종자를 식재하고, V1-V3 발생 단계까지 성장시키고, 상기 시점에서 280-4,480 g ae/ha 범위의 선택된 용량의 글리포세이트를 묘목에 분무하였다. 7-10 일 경과 후, 감수성 및 저항성 식물을 계수하였으며, 글리포세이트 내성 식물의 양은 식재된, dgt -28 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 종자의 원 개수와 상관 관계가 있었다.
dgt -28 옥수수의 적층. AAD-1 단백질이 연구 목적의 dgt -28로 형질전환된 옥수수에서 선별가능한 마커로서 사용된다. aad -1 유전자는 또한 작물에서 최대 V8 시용시까지 강력한 2,4-D 내성을 제공하는, 옥수수에서의 제초제 내성 형질로서 사용될 수 있다. 구축물 pDAB107663(TraP4::dgt -28), pDAB107664(TraP8::dgt -28) 및 pDAB107666(TraP5::dgt -28)으로부터의 4 개의 이벤트를 글리포세이트 및 2,4-D의 탱크 믹스 시용의 내성에 대하여 특징을 규명하였다. 온실 조건하의 F1 종자를 이용하여 특징 규명 연구를 완료하였다. 앞서 기술된 바와 같이 트랙 분무기를 이용하여 하기 비율로 시용하였다: 1,120-2,240 g ae/ha 글리포세이트(dgt -28 유전자에 대한 선별성), 1,120-2,240 g ae/ha 2,4-D(aad -1 유전자에 대한 선별성), 또는 기술된 비율의 두 제초제의 탱크 혼합물. 7 및 14 DAT일 때, 식물을 등급화하였다. 2,240 g ae/ha로 제초제를 시용하였을 때의 분무 결과는 하기 표 24에 제시되어 있다.
Figure 112014083517272-pct00032
본 결과를 통해, dgt -28은 aad -1과 함께 성공적으로 적층될 수 있고, 따라서, 관심 작물에 시용될 수 있는 제초제의 스펙트럼(dgt -28 및 aad -1 각각에 대해 글리포세이트 + 페녹시아세트산)은 증가된다는 것을 확인하였다. 생물형이 존재하는 광엽 잡초 또는 저항성 잡초를 방제하기가 어려운 경우의 작물 생산에 있어서, 적층이 관심 작물의 잡초 방제 및 보호를 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 추가의 투입 또는 산출 형질 또한 옥수수 및 다른 식물에서 dgt -28 유전자와 함께 적층될 수 있다.
대두 형질전환. 대두 자엽절 추출물의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 안정적으로 통합된 dgt -28 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 대두(글리신 맥스)를 생성하였다. 기능성 dgt -28을 함유하는 이원성 벡터를 보유하는 무장 해제된 아그로박테리움 균주를 형질전환을 개시하는 데 사용하였다.
문헌[Zeng et al.(Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep ., 22(7): 478-482)]의 변형된 ½ 자엽절 방법을 사용하여 아그로박테리움-매개 형질전환을 수행하였다. 요약하면, 대두 종자(재배종 매버릭(cv. Maverick))를 기초 배지 상에서 발아시키고, 자엽절을 단리시키고, 아그로박테리움으로 감염시켰다. 새싹 개시용, 새싹 신장용, 및 발근용 배지를 아그로박테리움 제거를 위해 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신으로 보충하였다. 제초제를 통한 선별을 사용하여 비형질전환된 새싹의 성장을 억제시켰다. 뿌리 발생을 위해, 선별된 새싹을 발근용 배지로 옮겨 놓은 후, 묘목을 순응시키기 위해 배합토로 옮겨 놓았다.
선별된 묘목의 정단 소엽을 제초제로 국소적으로(잎 페인트 기법으로) 처리하여 추정 형질전환체에 대해 스크리닝하였다. 스크리닝된 묘목을 온실로 옮겨 놓고, 순응시킨 후, 제초제로 잎 페인팅하여 내성에 대해 재확인하였다. 상기의 추정 형질전환된 T0 식물을 샘플링하고, 분자 분석을 사용하여 제초제를 통해 선별가능한 마커, 및 dgt -28 트랜스진의 존재를 확인하였다. T0 식물을 온실에서 자가 수정시켜 T1 종자를 생산하였다.
제2 대두 형질전환 방법을 사용하여 추가의 트랜스제닉 대두 식물을 생산할 수 있다. 기능성 dgt -28을 함유하는 이원성 벡터를 보유하는 무장 해제된 아그로박테리움 균주를 사용하여 형질전환을 개시하였다.
문헌[Paz et al.,(Paz ., Martinez J., alvig A., Fonger T., and Wang ., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213)의 변형된 ½ 종자 방법을 사용하여 아그로박테리움-매개 형질전환을 수행하였다. 간략하면, 염소 가스를 이용하여 성숙한 대두 종자를 밤새도록 멸균화시키고, 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 수행하기 전 20 시간 동안 멸균 H2O를 흡수시켰다. 종자를 제(hilum)를 따라 세로 방향으로 ½로 절단하여 종자를 분리하고 종자 껍질을 제거하였다. 배축을 절개하고, 자엽절로부터 임의 축의 새싹/눈을 제거하였다. 생성된 ½ 종자 추출물을 아그로박테리움으로 감염시켰다. 새싹 개시용, 새싹 신장용, 및 발근용 배지를 아그로박테리움 제거를 위해 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신으로 보충하였다. 제초제를 통한 선별을 사용하여 비형질전환된 새싹의 성장을 억제시켰다. 뿌리 발생을 위해 선별된 새싹을 발근용 배지로 옮겨 놓은 후, 묘목을 순응시키기 위해 배합토로 옮겨 놓았다.
선별된 묘목의 정단 소엽을 제초제로 국소적으로(잎 페인트 기법으로) 처리하여 추정 형질전환체에 대해 스크리닝하였다. 스크리닝된 묘목을 온실로 옮겨 놓고, 순응시킨 후, 제초제로 잎 페인팅하여 내성에 대해 재확인하였다. 상기의 추정 형질전환된 T0 식물을 샘플링하고, 분자 분석을 사용하여 제초제를 통해 선별가능한 마커, 및 dgt -28 트랜스진의 존재를 확인하였다. 수개의 이벤트가 트랜스진을 함유하는 것으로 확인되었다. 상기 T0 식물을 추가 분석을 위해 진행시키고, 온실에서 자가 수정시켜 T1 종자를 생산하였다.
dgt -28 의 T 1 세대로의 유전가능성 확인. DGT-28 단백질의 T1 세대로의 유전가능성을 2 가지 방식 중 하나의 방식으로 평가하였다. 첫번째 방법은 T1 종자를 메트로-믹스(Metro-mix) 배지에 식재하고, 1차 삼출엽 성장 단계에서 발아된 식물 상에 411 g ae/ha 이그나이트™ 280 SL을 시용하는 것을 포함하였다. 두번째 방법은 총 8 개의 복제물에 대한 종자를 볼 베어링 및 게노그라인더(genogrinder)를 이용하여 균질환시키는 것으로 구성되었다. 이어서, 선별가능한 마커가 dgt -28과 동일한 플라스미드 상에 존재하는 바, PAT 단백질을 검출하기 위한 ELISA 스트립 검사를 사용하여 유전가능한 이벤트를 검출하였다. 상기 방법 중 어느 경우에서든, 단일 식물이 글루포시네이트에 대해 내성을 띠거나, 또는 PAT ELISA 스트립 검사로 검출되었다면, 이벤트는 T1 세대로 유전가능한 것으로 입증되었다.
총 5 개의 구축물을 앞서 기술된 바와 같이 유전가능성에 대해 스크리닝하였다. 플라스미드는 TraP4, TraP8 및 TraP23과 연결된 dgt -28을 함유하였다. 구축물 간의 이벤트를 통해 PAT::DGT-28 단백질이 T1 세대로 유전될 유전가능성은 68 %인 것으로 입증되었다.
dgt -28 로 형질전환된 T 1 대두에서의 발아 후 제초제 내성. 앞서 기술된 스크리닝 방법에 의해 유전가능한 것으로 측정된, T1 이벤트로부터의 종자를 온실 조건하에서 메트로-믹스 배지에 식재하였다. 1차 삼출엽이 완전하게 만개할 때까지 식물을 성장시키고, 앞서 기술된 바와 같이 pat 유전자의 선별을 위해 411 g ae/ha 이그나이트™ 280 SL로 처리하였다. 각 이벤트로부터의 저항성 식물에 고유 식별자를 배정하고, dgt -28 유전자의 접합성 분석을 위해 샘플링하였다. 식물이 충분하게 존재하였을 때, 접합성 데이터를 사용하여, 시용되는 각 비율의 글리포세이트에 2 개의 반접합성 복제물 및 2 개의 동형접합성 복제물을 배정함으로써 처리당 총 4개의 복제물을 허용하였다. 상기 식물을 야생형 페타이트 하바나(Petite havana) 담배와 비교하였다. 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기를 이용하여 모든 식물에 분무하였다. 560-4,480 g ae/ha 범위로 두란고™ 디메틸아민 염(DMA)을 식물에 분무하였다. 모든 시용물은 2 % w/v 황산암모늄(AMS)이 첨가된 물 중에서 제제화되었다. 처리 후 7 및 14 일째 식물을 평가하였다. 전반적인 시각적 발육 저지, 황백증, 및 괴사에 관한 손상 등급을 식물에 배정하였다. T1 세대는 분리 세대이며, 따라서, 접합성 차이에 기인하는 일부 가변적 반응이 있을 것으로 예상되었다.
Figure 112014083517272-pct00033
Figure 112014083517272-pct00034
T 2 세대에서 글리포세이트 비율 증가에 대한 dgt -28 보호. 구축물당 2 내지 5 개의 dgt -28의 T2 계통에 대하여 45 개의 식물 자손 시험을 수행하였다. 이전 세대에서 완료된 접합성 분석에 기초하여 동형접합성 계통을 선별하였다. 앞서 기술된 바와 같이 종자를 식재하였다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이 pat 선별가능한 마커의 선별을 위해 411 g ae/ha 이그나이트 280 SL을 식물에 분무하였다. 3 DAT 후, 저항성 및 감수성 식물을 계수하였다.
dgt -28에 연결된 TraP4를 함유하는 구축물(pDAB107543 및 pDAB107548)의 경우, 시험된 12 개의 계통 중 9 개는 분리되지 않았으며, 이로써, T2 세대에서 동종 계통을 확인할 수 있었다. dgt -28에 연결된 TraP8을 함유하는 계통(pDAB107545)은 4 개의 계통 중 2 개에서 분리 개체가 없는 것으로 나타났고, 대두에서는 적어도 2 세대에 걸쳐 dgt -28이 멘델의 유전 법칙을 따르는 것으로 입증되었다. 저항성 식물로부터 조직 샘플을 채취하고, 표준 ELISA 방법에 의해 DGT-28 단백질을 정량화하였다. 데이터를 통해, 시험된 비-분리 T2 계통의 경우, 32.8 - 107.5 ng/cm2의 DGT-28 단백질 평균 범위가 입증되었다. 구축물 pDAB107553(TraP23::dgt -28)으로부터의 계통은 앞서 글루포시네이트로 선별되지 않았고, 글리포세이트의 용량 반응을 글리포세이트의 비율 증가에 대한 내성 및 동종성 둘 모두에 대해 시험하는 데에 사용하였다. 구축물 pDAB107553으로부터의 계통으로부터의 복제물은 560-4,480 g ae/ha 글리포세이트 범위의 비율에 대하여 내성을 보였고, 따라서, 이는 동종 집단이며, 적어도 2 세대로 유전가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
앞서 기술된 바와 같이 560-4,480 g ae/ha 글리포세이트 범위 비율의 두란고 DMA를 2-3 개의 삼출엽 대두에 시용하였다. 14 DAT일 때의 시각적 손상 데이터를 통해 T1 세대에서 입증된 내성 결과를 확인할 수 있었다.
Figure 112014083517272-pct00035
Figure 112014083517272-pct00036
dgt - 28 를 이용한 벼의 형질전환. 예시적인 형질전환 방법에서, 멸균화된 벼 종자의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 안정적으로 통합된 dgt -28 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 벼(오리자 사티바(Oryza sativa))를 생성하였다. 기능성 dgt-28을 함유하는 이원성 벡터를 보유하는 무장 해제된 아그로박테리움 균주를 형질전환을 개시하는 데에 사용하였다.
1 M KOH를 이용하여 배양 배지를 pH 5.8로 조정하고, 2.5 g/l 피타겔(Phytagel)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스)로 고형화시켰다. 배발생 캘러스를 30 ml 반고형 배지를 포함하는 100 x 20 mm 페트리 디쉬에서 배양하였다. 볏모를 마겐타(MAGENTA) 박스내 50 ml 배지 상에서 성장시켰다. 35 mL 액체 배지를 함유하는 125 ml의 삼각 플라스크 중에서 세포 현탁액을 유지시키고, 125 rpm으로 회전시켰다. 배발생 배양의 유도 및 유지를 25-26 ℃의 암실에서 수행하고, 식물 재생 및 전체 식물 배양은 16-h 광주기로 조광식 실내에서 수행하였다(문헌[Zhang et al., 1996]).
배발생 캘러스의 유도 및 유지를 앞서 기술된 바와 같이(문헌[Li et al., 1993]), 500 mg/L 글루타민을 함유하도록 적합화된, 개질된 NB 기초 배지 상에서 수행하였다. 말토스 대신 30 g/L 수크로스를 포함하는 SZ 액체 배지 중에서 현탁 배양을 개시하고 유지시켰다(문헌[Zhang et al., 1998]). 삼투압 배지(NBO)는 각각 0.256 M의 만닛톨 및 소르비톨이 첨가되어 있는 NB 배지로 구성되었다. 3-4 주 동안 제초제 저항성 캘러스를 적절한 제초제 선별제로 보충된 NB 배지 상에서 선별하였다. 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 1 mg/l α-나프탈렌아세트산(NAA), 5 mg/l 앱시스산(ABA) 및 선별용 제초제를 포함하는 NB 배지로 구성된 배지(PRH50) 상에서 1 주 동안 사전-재생을 수행하였다. 트랜스제닉 새싹이 재생된 것으로 추정될 때까지, 2,4-D, 0.5 mg/l NAA, 및 선별용 제초제를 포함하는 재생 배지(RNH50) 상에서 배양함으로써 모를 재생시켰다. 1 % 수크로스 및 선별용 제초제로 보충된, 강도를 절반으로 줄인 무라시게(Murashige) 및 스쿡(Skoog) 기초 염 및 갬보르그의(Gamborg's) B5 비타민을 포함하는 발근용 배지로 새싹을 옮겼다.
오리자 사티바 L. 자포니카 재배종 타이페이 309(japonica cv. Taipei 309)의 성숙한 건조된 종자를 문헌[Zhang et al., 1996]에 기술되어 있는 바와 같이 멸균화시켰다. 멸균된 성숙한 벼 종자를 암실에서 NB 배지 상에서 배양함으로써 배발생 조직을 유도하였다. 직경이 대략 1 mm인 1차 캘러스를 배반으로부터 제거하고, SZ 액체 배지 중에서의 세포 현탁을 개시하는 데 사용하였다. 이어서, 문헌[Zhang 1996]에 기술되어 있는 바와 같이 현탁물을 유지시켰다. 이전 계대 배양 후 3-5 일 경과하였을 때, 현탁물 유래 배발생 조직을 액체 배양물로부터 제거하고, 이를 NBO 삼투압 배지 상에 놓고 페트리 디쉬 전역에 걸쳐 약 2.5 cm의 환이 형성되도록 하고, 충격법 이전에 4 시간 동안 배양하였다. 충격법 이후 16 내지 20 시간이 경과하였을 때, 조직을 NBO 배지로부터 NBH50 선별 배지 상으로 옮기고, 충격 처리된 표면이 확실히 위로 향하게 하게, 암실에서 14-17 일 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 새로 형성된 캘러스를 원래의 충격 처리된 추출물로부터 분리하고, 동일 배지 상에 가깝게 놓았다. 추가로 8-12 일 경과 후, 상대적으로 조밀한, 불투명 캘러스를 시각적으로 확인할 수 있었으며, 이를 암실에서 7 일 동안 PRH50 사전-재생 배지로 옮겨 놓았다. 이어서, 더욱 조밀화되고 불투명해지는 성장 캘러스를 14-21 일 동안 16-h 광주기하에 RNH50 재생 배지 상에서 계대 배양하였다. 재생 새싹을 ½ MSH50 배지를 함유하는 마겐타 박스로 옮겨 놓았다. 단일 추출물로부터 재생된 다중 식물은 형제인 것으로 간주하였고, 한 독립 식물 계통인 것으로 처리되었다. 식물에서 굵고 흰색의 뿌리가 발생하고, ½ MSH50 배지 상에서 왕성하게 성장하였다면, 식물을 dgt -28 유전자에 대해 양성인 것으로 평가하였다. 일단 모가 마겐타 박스의 상단부까지 도달하고 나면, 이를 1 주일 동안 습도 100 %하에 6 cm 화분 중의 토양으로 옮겨 놓고, 이어서, 온실의 13 cm 화분으로 이식시키기 이전에 2-3 주 동안 30 ℃의 14-h의 명기를 가지는 성장 챔버 및 21 ℃의 암실로 옮겨 놓았다. 종자를 수집하고, 4 ℃에서 보관하기 전 1 주일 동안 37 ℃에서 건조시켰다.
dgt -28 벼의 T 0 분석. 아그로박테리움 형질전환을 통해 생산된, 이식시킨 벼 형질전환체를 배지에 이식시키고, 온실 조건에 순응시켰다. dgt -28의 PCR 검출을 위해 모든 식물을 샘플링하였고, 그 결과, pDAB110827(TraP8::dgt -28)의 경우, 22 개의 PCR 양성 이벤트, 및 pDAB110828(TraP23::dgt -28)의 경우, 최소 16 개의 PCR 양성 이벤트가 나타났다. PCR 양성 이벤트의 dgt -28에 대한 써던 분석을 통해 상기 두 구축물 모두에 대한 단순(1-2 개의 카피) 이벤트가 나타났다. 선별된 T0 이벤트의 단백질 발현을 통해 DGT-28 단백질 발현 범위는 검출 수준 이하 내지 130 ng/cm2인 것으로 입증되었다. 구축물 pDAB110828로부터의 선별된 T0 이벤트를 앞서 기술된 바와 같이 2,240 g ae/ha 두란고 DMA™로 처리하고, 처리 후 7 및 14 일째 평가하였다. 데이터를 통해 시용된 글리포세이트의 비율에 대한 강력한 내성이 입증되었다. 추가의 특징 규명을 위해 PCR 양성 식물 모두로부터 T1 종자를 생산하였다.
벼에서의 Dgt -28 유전가능성. 엽록체 전이 펩티드 TraP8을 함유하는 구축물 pDAB110827로부터의 4 개의 dgt -28의 T1 계통에 대하여 100 개의 식물 자손 시험을 수행하였다. 배지로 충전된 화분에 종자를 식재하였다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이 dgt -28 유전자 선별을 위해 560 g ae/ha 두란고 DMA™을 모든 식물에 분무하였다. 7 DAT 후, 저항성 및 감수성 식물을 계수하였다. 카이 제곱 분석에 의해 측정된 바, 각 구축물에 대하여 시험된 4 개의 계통 중 2 개가 단일 유전자좌로서 멘델의 우성 형질(3R:1S)로 분리되었다. Dgt -28은 다중 종에서 유전가능한 글리포세이트 저항성 유전자이다.
dgt -28 로 형질전환된 T 1 벼에서의 발아 후 제초제 내성. 자손 시험에 사용된 각 이벤트로부터의 T1 저항성 식물에 고유 식별자를 배정하고, dgt -28 유전자의 접합성 분석을 위해 샘플링하였다. 접합성 데이터를 사용하여, 시용되는 각 비율의 글리포세이트에 2 개의 반접합성 복제물 및 2 개의 동형접합성 복제물을 배정함으로써 처리당 총 4 개의 복제물을 허용하였다. 상기 식물을 야생형 키타아케(kitaake) 벼와 비교하였다. 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기를 이용하여 모든 식물에 분무하였다. 560-2,240 g ae/ha 범위로 두란고 DMA™를 식물에 분무하였다. 모든 시용물은 2 % w/v 황산암모늄(AMS)이 첨가된 물 중에서 제제화되었다. 처리 후 7 및 14 일째 식물을 평가하였다. 전반적인 시각적 발육 저지, 황백증, 및 괴사에 관한 손상 등급을 식물에 배정하였다. T1 세대는 분리 세대이며, 따라서, 접합성 차이에 기인하는 일부 가변적 반응이 있을 것으로 예상되었다.
분무 결과를 통해, 7 DAT(처리 후 경과일수)일 때, 글리포세이트의 비율 증가에 대한 최소의 식물 생장 손상이 검출되었다는 것이 입증되었다(데이터는 나타내지 않음).
Figure 112014083517272-pct00037
pDAB110827로부터 시험된 4 개의 T1 계통 모두로부터의 복제물에 대하여 DGT-28의 단백질 검출을 평가하였다. 데이터를 통해 DGT-28 평균 단백질 범위는 반접합성 복제물 및 동형접합성 복제물에 대하여 각각 20-82 ng/cm2 및 21-209 ng/cm2인 것으로 나타났다. 상기 결과는 T1 세대로의 안정적인 단백질 발현, 및 선별을 위해 사용된 560 g ae/ha 글리포세이트의 시용 후, 최대 2,240 g ae/ha까지의 글리포세이트에 대한 dgt -28 벼의 내성을 입증한다.
dgt - 28 를 이용한 담배의 형질전환. 담배(재배종 페타이트 하바나) 잎 조각을 dgt -28 트랜스진을 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하여 형질전환시켰다. dgt -28 트랜스진을 함유하는 플라스미드를 포함하는 단일 콜로니를 스펙티노마이신(50 μg/mL) 및 스트렙토마이신(125 μg/mL)을 함유하는 4 mL의 YEP 배지에 접종하고, 190 rpm으로 진탕기 상에서 28 ℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 4 mL 종자 배양물을 사용하여 125 mL 배플형 엘렌마이어 플라스크 중 25 mL의 동일 배지의 배양물에 접종하였다. OD600 = ~1.2에 도달할 때까지, 상기 배양물을 190 rpm으로 진탕시키면서 28 ℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 10 mL의 아그로박테리움 현탁액을 멸균 60 x 20 mm 페트리™ 디쉬에 놓았다.
피타트레이스™(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스) 중 30 g/L 수크로스를 포함하는 MS 배지(피토테크놀러지 랩스(Phytotechnology Labs), 미국 캔자스주 쇼니 미션) 상에서 무균 방식으로 성장시킨 식물로부터 새로 절단한 잎 조각(0.5 cm2)을 밤새도록 배양된 아그로박테리움 배양물 10 mL에 수분 동안에 걸쳐 침지시키고, 멸균 여과지 상에서 건식 블롯팅한 후, 1 mg/L 인돌아세트산 및 1 mg/L 6-벤질아미노 퓨린이 첨가된 동일 배지 상에 놓았다. 3 일 경과 후, dgt -28 트랜스진을 보유하는 아그로박테리움과 함께 공동 배양된 잎 조각을 5 mg/L 바스타(Basta)™ 및 250 mg/L 세포탁심을 포함하는 동일 배지로 옮겨 놓았다.
3 주 후, 개별 T0 묘목을 토양으로 이식시키고, 온실로 옮겨 놓기 전 추가로 3 주 동안 10 mg/L 바스타™ 및 250 mg/L 세포탁심을 포함하는 MS 배지로 옮겨 놓았다. (상기 기술된 분자 분석 프로토콜을 사용하여 확인된 것과 같은) 선별된 T0 식물을 자가 수분시키고, 종자가 완전히 건조되었을 때, 포장낭으로부터 종자를 수집하였다. T1 모종을 (하기 기술되는 바와 같이) 접합성 및 리포터 유전자 발현에 대해 스크리닝하고, dgt -28 트랜스진을 함유하는 선별된 식물을 확인하였다.
뿌리로부터 아가를 세척하고, 13.75 cm2 화분의 토양에 이식시키고, 상기 화분을 지퍼락(Ziploc)® 백(SC 존슨 & 손, 인크.(SC Johnson & Son, Inc.))에 놓고, 수돗물을 상기 백의 바닥쪽으로 배치시키고, 30 ℃ 온실에서 간접광하에 1 주 동안 놓음으로써 식물을 온실로 이동시켰다. 3-7 주 후, 백을 개봉하고; 식물을 수정시키고, 식물이 온실에 순응할 때까지 개봉된 백에서 성장시키고, 순응했을 때에는 백을 제거하였다. 식물을 일반 따뜻한 온실 조건(주: 27 ℃, 야: 24 ℃, 주: 16 시간, 최소 천연광 + 보충광 = 1,200 μE/m2s1)하에서 성장시켰다.
번식시키기 전에, DNA 분석을 위해 T0 식물을 샘플링하여 실시간 PCR로 삽입체 dgt -28 카피수를 측정하였다. 신선한 조직을 관에 넣고, 4 ℃에서 2 일 동안 동결건조시켰다. 조직을 완전하게 건조시킨 후, 텅스텐 비드(발레나이트(Valenite))를 관에 넣고, 샘플을 켈코(Kelco) 비드 밀을 사용하여 1 분 동안 건식 분쇄시켰다. 이어서, 표준 DNeasy™ DNA 단리 방법을 수행하였다(퀴아젠, DNeasy 69109). 이어서, 분취량의 DNA 추출물을 피코 그린(Pico Green)(몰레큘라 프로브스 P7589)으로 염색하고, 공지된 표준을 이용하여 형광계(바이오테크(BioTek)™)에서 판독함으로써 농도(ng/μL)를 수득하였다. 주형으로서 총 100 ng의 전체 DNA를 사용하였다. 샘플을 94 ℃에서 3 분 동안, 이어서, 94 ℃에서 30 초 동안, 64 ℃에서 30 초 동안, 및 72 ℃에서 1 분 45 초 동안 진행되는 사이클 35 회, 이어서, 72 ℃에서 10 분 동안으로 하여 9700 진앰프(Geneamp)™ 열순환 반응기(어플라이드 바이오시스템즈)에서 PCR 반응을 수행하였다. EtBr로 염색된 1 % 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 PCR 생성물을 분석하고, 써던 블롯에 의해 확인하였다.
상이한 엽록체 전이 펩티드 서열(TraP4, TraP8 및 TraP23)을 함유하는 3 개의 구축물로부터의 1-3 개의 dgt -28 유전자 카피를 가지는 5 내지 9 개의 PCR 양성 이벤트를 재생시키고, 온실로 이동시켰다.
표준 ELISA에 의해 DGT-28 단백질을 정량화하기 위해 PCR 양성 식물 모두를 샘플링하였다. DGT-28 단백질이 PCR 양성 식물 모두에서 검출되었고, dgt -28 카피수가 증가함에 따라 단백질 농도가 증가하는 경향이 있는 것으로 관찰되었다.
담배에서의 aad -12( v1 ) 의 유전가능성. 구축물당 5 개의 dgt -28의 T1 계통에 대하여 100 개의 식물 자손 시험을 수행하였다. 구축물은 엽록체 전이 펩티드 서열: TraP4, TraP8 또는 TraP23 중 하나를 함유하였다. 상기 예시된 아라비돕시스 방법의 것과 관련하여 매우 유사한 방식으로 종자를 계층화하고, 파종하고, 이식시키되, 단, 예외적으로, 이식하기 전 1차 선별에 의해 널 식물을 제거하지 않았다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이 pat 선별가능한 마커의 선별을 위해 280 g ae/ha 이그나이트 280 SL을 모든 식물에 분무하였다. 3 DAT 후, 저항성 및 감수성 식물을 계수하였다.
카이 제곱 분석에 의해 측정된 바, 각 구축물에 대하여 시험된 5 개의 계통 중 4 개가 단일 유전자좌로서 멘델의 우성 형질(3R:1S)로 분리되었다. Dgt -28은 다중 종에서 유전가능한 글리포세이트 저항성 유전자이다.
dgt -28 로 형질전환된 T 1 담배에서의 발아 후 제초제 내성. 자손 시험에 사용된 각 이벤트로부터의 T1 저항성 식물에 고유 식별자를 배정하고, dgt -28 유전자의 접합성 분석을 위해 샘플링하였다. 접합성 데이터를 사용하여, 시용되는 각 비율의 글리포세이트에 2 개의 반접합성 복제물 및 2 개의 동형접합성 복제물을 배정함으로써 처리당 총 4 개의 복제물을 허용하였다. 상기 식물을 야생형 페타이트 하바나 담배와 비교하였다. 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기를 이용하여 모든 식물에 분무하였다. 560-4,480 g ae/ha 범위로 두란고 DMA™를 식물에 분무하였다. 모든 시용물은 2 % w/v 황산암모늄(AMS)이 첨가된 물 중에서 제제화되었다. 처리 후 7 및 14 일째 식물을 평가하였다. 전반적인 시각적 발육 저지, 황백증, 및 괴사에 관한 손상 등급을 식물에 배정하였다. T1 세대는 분리 세대이며, 따라서, 접합성 차이에 기인하는 일부 가변적 반응이 있을 것으로 예상되었다.
분무 결과를 통해, 7 DAT(처리 후 경과일수)일 때, 글리포세이트의 비율 증가에 대한 최소의 식물의 생장 손상이 검출되었다는 것이 입증되었다(데이터는 나타내지 않음). 14 DAT일 때, 시각적 손상 데이터를 통해 TraP8 및 TraP23을 함유하는 구축물로부터의 단일 카피 이벤트와 비교하여 TraP4를 함유하는 구축물의 단일 카피 이벤트에 따라 손상이 증가하였다는 것이 입증되었다. 표 28.
Figure 112014083517272-pct00038
상기 결과를 통해 최대 4,480 g ae/ha까지의 글리포세이트에 대한 dgt -28의 내성 뿐만 아니라, dgt -28 유전자에 연결된 엽록체 전이 펩티드 서열에 의해 제공되는 내성의 차이도 입증되었다.
T 2 세대에서 글리포세이트 비율 증가에 대한 dgt -28 보호. 구축물당 2 내지 3 개의 dgt -28의 T2 계통에 대하여 25 개의 식물 자손 시험을 수행하였다. 이전 세대에서 완료된 접합성 분석에 기초하여 동형접합성 계통을 선별하였다. 앞서 기술된 바와 같이, 종자를 계층화하고, 파종하고, 이식시켰다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이 pat 선별가능한 마커의 선별을 위해 280 g ae/ha 이그나이트 280 SL을 모든 식물에 분무하였다. 3 DAT 후, 저항성 및 감수성 식물을 계수하였다. 각 구축물에 대해 시험된 모든 계통은 분리되지 않았으며, 이로써, T2 세대에서 동종 계통을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 담배에서는 적어도 2 세대에 걸쳐 dgt -28이 멘델의 유전 법칙을 따르는 것으로 입증되었다.
앞서 기술된 바와 같이 420-3,360 g ae/ha 글리포세이트 범위 비율의 두란고 DMA™를 2-3 개의 잎 담배에 시용하였다. 14 DAT일 때의 시각적 손상 데이터를 통해 T1 세대에서 입증된 내성 결과를 확인할 수 있었다. TraP4를 함유하는 구축물로부터의 2 개의 카피 계통으로부터 얻은 엽면 결과를 통해 TraP8 및 TraP23을 함유하는 단일 카피 계통의 것과 유사한 내성이 입증되었다(데이터는 나타내지 않음).
Figure 112014083517272-pct00039
데이터는 비형질전환된 대조군과 비교하여, 2 세대에 걸쳐 최대 3,360 g ae/ha까지의 글리포세이트에 대한 dgt -28 담배의 강력한 내성을 입증한다.
표준 DGT-28 ELISA에 의한 DGT-28 단백질의 분석을 위해, 글리포세이트 시용에 앞서 각 이벤트로부터 선별된 식물을 샘플링하였다. 데이터를 통해 구축물 간 단순(1-2 개의 카피) 계통의 DGT-28 평균 단백질 발현 범위는 72.8-114.5 ng/cm2인 것으로 입증되었다. 데이터를 통해 dgt -28이 형질전환된 담배의 T2 세대에서 단백질을 발현한다는 것이 입증되었고, 내성 데이터를 통해 기능성 DGT-28 단백질이 확인되었다.
제초제의 스펙트럼을 증가시키기 위한 dgt -28 의 적층. 동형접합성 dgt -28(pDAB107543 및 pDAB107545) 및 aad -12 v1(pDAB3278) 식물(후자에 대해서는 PCT/US2006/042133 참조), 둘 모두를 상반 교배시키고, F1 종자를 수집하였다. 각 유전자의 2 회의 상반 교배로부터 얻은 F1 종자를 계층화하고, 각 교배의 처리된 6 개의 대표를 1,120 g ae/ha 글리포세이트(dgt -28 유전자에 대한 선별성), 1,120 g ae/ha 2,4-D(aad -12 유전자에 대한 선별성), 또는 기술된 비율의 두 제초제의 탱크 혼합물로 처리하였다. 14 DAT일 때 식물을 등급화하였다. 분무 결과는 하기 표 30에 제시되어 있다.
Figure 112014083517272-pct00040
본 결과를 통해, dgt -28은 aad -12( v1 )와 함께 성공적으로 적층될 수 있고, 따라서, 관심 작물에 시용될 수 있는 제초제의 스펙트럼(dgt -28 및 aad -12 각각에 대해 글리포세이트 + 페녹시아세트산)이 증가된다는 것을 확인하였다. 생물형이 존재하는 광엽 잡초 또는 저항성 잡초를 방제하기가 어려운 경우의 작물 생산에 있어서, 적층이 관심 작물의 잡초 방제 및 보호를 위한 수단으로서 사용될 수 있다. 추가의 투입 또는 산출 형질 또한 dgt -28 유전자와 함께 적층될 수 있다.
소맥에서의 글리포세이트에 대한 저항성. DGT -28을 코딩하는 이원성 벡터의 제조. 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 기술 및 기법을 이용하여 DGT-28 발현 및 PAT 선별 카세트를 함유하는 이원성 벡터를 디자인하고, 조립하였다. 각 DGT-28 발현 카세트는 프로모터, 5' 비번역 영역 및 제아 메이스로부터의 유비퀴틴(Ubi) 유전자로부터의 인트론(문헌[Toki et al., Plant Physiology 1992, 100 1503-07]), 이어서, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 유전자(DGT-28)의 합성 버전의 5' 단부에 융합되어 있는 4 개의 전이 펩티드(TraP4, TraP8, TraP23 또는 TraP5) 중 하나로 구성된 코딩 서열을 함유하며, 이는 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것이다. DGT-28 발현 카세트는 Z. 메이스로부터의 리파제 유전자(Vp1)의 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' 비번역 영역(UTR)으로 종결되었다(문헌[Paek et al., Mol . Cells 1998 30;8(3) 336-42]). PAT 선별 카세트는 프로모터, 5' 비번역 영역 및 오리자 사티바로부터의 액틴 (Act1) 유전자로부터의 인트론(문헌[McElroy et al ., The Plant Cell 1990 2(2) 163-171])에 이어서, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로부터 단리된 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(PAT) 유전자의 합성 버전으로 구성되었으며, 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것이다. PAT 유전자는 포스피노트리신, 글루포시네이트, 및 비알라포스를 포함하는 글루타민 신테타제의 억제제에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩한다(문헌[Wohlleben et al ., Gene 1988, 70(1), 25-37]). 선별 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35s 유전자로부터의 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' UTR로 종결되었다(문헌[Chenault et al ., Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-1396]).
상업적 유전자 합성 업체(진아트(GeneArt), 라이프 테크놀러지스(Life Technologies))에 의해 선별 카세트를 합성하고, 게이트웨이에서 이용가능한 이원성 벡터로 클로닝하였다. DGT-28 발현 카세트를 pDONR221로 서브클로닝하였다. 생성된 ENTRY 클론을, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(PAT) 발현 카세트를 코딩하는 게이트웨이에서 이용가능한 이원성 벡터와 함께 LR 클로나제 II(LR Clonase II)(인비트로겐, 라이프 테크놀러지스)에서 사용하였다. 먼저 모든 조립된 플라스미드의 콜로니를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(NEB, 미국 매사추세츠주 입스위치) 및 프로메가(Promega)(프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 미국 위스콘신주)로부터 입수한 제한 엔도뉴클레아제를 이용하는 정제된 DNA의 제한 분해에 의해 스크리닝하였다. 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)(퀴아젠, 힐덴) 또는 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙 시스템(Pure Yield Plasmid Maxiprep System)(프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주)을 사용하여 공급업체의 설명서에 따라 플라스미드 DNA 제조를 수행하였다. ABI 생거 시퀀싱(ABI Sanger Sequencing) 및 빅 다이 터미네이터 v3.1(Big Dye Terminator v3.1) 사이클 서열 분석 프로토콜(어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀러지스)을 이용하여 선별된 클론의 플라스미드 DNA의 서열을 분석하였다. 시퀀서(SEQUENCHER)™ 소프트웨어(진 코드 코포레이션(Gene Codes Corporation), 미국 미시간주 앤 아버)를 이용하여 서열 데이터를 조립하고, 분석하였다.
생성된 4 개의 이원성 발현 클론: pDAS000122(TraP4-DGT28), pDAS000123(TraP8-DGT28), pDAS000124(TraP23-DGT28) 및 pDAS000125(TraP5-DGT28) 각각을 이용하여 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105를 형질전환시켰다.
dgt -28 발현 구축물을 포함하는 트랜스제닉 소맥 이벤트의 생산. 문헌[Wu et al ., Transgenic Research 2008, 17:425-436]과 유사한 프로토콜에 따라 도너 소맥 계통 밥화이트(Bobwhite) MPB26RH를 사용하여 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 4 개의 DGT-28 발현 구축물 중 하나를 발현하는 트랜스제닉 소맥 식물을 생성하였다. PAT 선별가능한 마커에 의해 부여되는 표현형인 포스피노트리신(PPT) 내성에 대해 추정 T0 트랜스제닉 이벤트를 선별하고 토양으로 옮겨 놓았다. T0 식물을 온실 억제 조건하에서 성장시키고, T1 종자를 생산하였다. 전반적으로, 각 DGT-28 발현 구축물에 대해 약 45 개의 독립 T0 이벤트가 생성되었다.
T 0 소맥 dgt -28 소맥 이벤트에서의 글리포세이트 저항성. T0 이벤트를 온실에 순응시키고, 정상적으로 보이는, 2-4 개의 새잎이 윤생체로부터 출현할 때까지(즉, 식물이 조직 배양물로부터 온실 성장 조건으로 이행될 때까지) 성장시켰다. 식물을 성숙화될 때까지 온실에서 12 시간의 보충광하에 25 ℃에서 성장시켰다. 글리포세이트 내성에 대한 1차 스크린 및 택맨 분석을 앞서 기술된 것과 동일한 조건하에서 성장시킨 T1 식물에서 완료하였다. 데이터를 통해 추가로 특징 규명하고자 하는 유전가능한 T1 이벤트를 측정할 수 있었다. 카피수가 낮은(1-2 개의 카피) 6 개의 T1 이벤트 및 다중 카피의 2 개의 T1 이벤트를 온실 조건하에서 재식재하고, 3 지엽기까지 성장시켰다. 비형질전환된 소맥 계통에 유의적인 손상을 일으킬 수 있는, 420 - 3,360 g ae/ha 범위의 시판용 글리포세이트 제제(두란고 DMA™)를 T1 식물에 분무하였다. 2 % w/v 황산암모늄 첨가를 시용에 포함시켰다. 치사량은 밥화이트 MPB26RH 비형질전환된 대조군에 >75 %의 손상을 유발하는 비율로서 정의된다. 제초제를 시용하였다.
본 실시예에서, 글리포세이트 시용은 T1 세대에서 dgt -28 유전자의 분리를 측정하는 데에 뿐만 아니라, 글리포세이트 수준 증가에 따른 내성을 입증하는 데에 사용되었다. 처리 후 21 일째(DAT)의 시각적 손상에 대한 등급으로 상기 식물의 반응을 나타낸다. 데이터는 25 % 미만의 시각적 손상률(4), 25 %-50 %의 시각적 손상률(3), 50 %-75 %의 시각적 손상률(2), 및 75 % 초과의 시각적 손상률(1)을 보이는 개체에 대한 히스토그램으로 제시되어 있다. 소맥 형질전환에 사용된 각 구축물에 대한 산술 평균 및 표준 편차가 제공되어 있다. 개별 반응의 점수화 범위 또한 각 비율 및 형질전환에 대한 마지막 열에 표시되어 있다. 야생형, 비형질전환된 소맥(재배종 밥화이트 MPB26RH)이 글리포세이트 감수성 대조군으로서의 역할을 하였다. T1 세대에서, 반접합성 및 동형접합성 식물을 각 이벤트에 대해 시험하는 데 이용할 수 있었으며, 따라서, 이를 시험된 글리포세이트의 각 비율에 포함시켰다. 반접합성 식물은 동형접합성 식물에서의 유전자량의 절반을 함유할 것이며, 따라서, T1 세대에서는 글리포세이트에 대한 반응의 가변성이 예상될 수 있다.
T1 dgt -28 소맥 식물의 결과를 통해, 엽록체 전이 펩티드 TraP4, TraP5, TraP8 및 TraP23을 포함하는 경우, 최대 3,360 g ae/ha까지의 비율에서 글리포세이트에 대한 내성이 달성되었다는 것이 입증되었다. 표 31. 데이터는 카피수가 낮은 T1 이벤트의 것이지만, 이는 각 구축물에 대한 집단을 대표하는 것이다.
Figure 112014083517272-pct00041
21 DAT일 때, 저항성 및 감수성 식물을 계수하여 카이 제곱 분석에 의해 측정된 바, 단일 유전자좌로서 멘델의 우성 형질(3R:1S)로 분리된 계통의 비율을 측정하였다. 표 32. dgt -28은 단자엽 종에서 강력한 글리포세이트 저항성 유전자로서 유전가능하다는 것이 상기 데이터를 통해 입증되었다.
Figure 112014083517272-pct00042
Cry2Aa :
아라비돕시스 탈리아나에서의 Cry2Aa 단백질 발현에 대한 TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드의 효과를 평가했다. Cry2Aa 단백질에 융합된 TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유하는 형질전환 아라비돕시스 식물을 대두 루퍼(SBL) 및 회색 담배 나방(TBW)에 대한 내충성에 대해 분석했다.
Trap12 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열은 식물 발현 pDAB107540 구축물 내로 클로닝되었고 아라비돕시스에서 시험되었다. Trap12 v3(서열 13) 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 합성되고 플라스미드 구축물로 도입되었다. 생성된 구축물은 2 개의 식물 전사 단위(PTU)를 포함했다. 제1 PTU는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터(AtUbi10 프로모터; 문헌[Callis, et al ., (1990) J. Biol . Chem ., 265: 12486-12493]), TraP-cry2Aa 융합 유전자(TraP-Cry2Aa), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 23 3' 비번역 영역(AtuORF23 3'UTR; 미국 특허 번호 제5,428,147호)를 포함한다. 제2 PTU는 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터(CsVMV 프로모터; 문헌[Verdaguer et al ., (1996) Plant Molecular Biology, 31:1129-1139]), dsm -2 유전자(DSM2; 미국 특허 번호 제2011/0107455호), 및 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 1 3' 비번역 영역(AtuORF1 3'UTR; 문헌[Huang et al ., (1990) J. Bacteriol ., 172:1814-1822])을 포함했다. 구축물 pDAB107540은 TraP12v3 키메라 엽록체 전이 펩티드(도 18)을 함유한다. cry2Aa 유전자의 상류에 엽록체 전이 펩티드 서열을 함유하지 않는 대조군 플라스미드, 107617를 구축하고 연구에 포함하였다(도 19). 구축물을 제한 효소 분해 및 서열 분석을 통해 확인했다. 최종적으로, 구축물은 아그로박테리움 투메파시엔스로 형질전환되고 글리세롤 스톡으로서 저장되었다.
pDAB107540 구축물은 아그로박테리움 투메파시엔스 매개 식물 형질전환을 통하여 아라비돕시스 탈리아나로 형질전환되었다. 간략히, 12 내지 15 개의 아라비돕시스 탈리아나 식물(콜롬비아 생태종, Col-0)을 25 ℃에서 250 μmol/m2의 조도로 18/6 시간의 명기/암기하에서 온실 내에서 4 인치(10.2 cm) 화분에서 재배했다. 1차 꽃 스템은 형질전환 1 주 전에 트리밍되었다. 아그로박테리움 접종물을, 재조합 아그로박테리움 글리세롤 스톡 10 μl를, 72 시간 동안 225 rpm으로 진탕시키면서, 28 ℃에서 100 ml LB 브로스(100 mg/L 스펙티노마이신, 50 mg/L 카나마이신)에서 인큐베이션시킴으로써 제조했다. 아그로박테리움 배양물의 양을 분광계로 측정했고, 세포가 OD 600 = 0.8에 도달했을 때, 원심분리에 의해 수거하였다. 다음으로, 세포를 3-4 부피의 5 % 수크로스 및 0.04 % 실웨트-L77 및 10 μg/L 벤자미노 퓨린(BA) 침윤 배지로 재현탁시켰다. 식물의 지상 부분을, 온화하게 교반시키면서 5-10 분 동안 아그로박테리움 용액에 침지시켰다. 이어서 식물을 종자가 정착할 때까지 규칙적인 급수 및 시비하면서 정상 성장을 위해 온실로 옮겨 놓았다.
대략 200 mg(s)의 벌크화된(bulked) T1 종자를 선별 트레이(10.5 인치(26.1 cms) x 21 인치(53 cms) x 1 인치(2.5 cms) 발아 트레이 T.O. 플라스틱 인크., 미국 미네소타주 클리어워터)에 균등하게 식재했다. 묘목에 글루포시네이트 제초제 (리버티)의 0.20 % 용액(20 μl/10 mL dH2O)을 10 ml/트레이(703 L/ha)의 분무 부피로 데빌비스 압축 공기 분무 팁을 이용하여, 파종후(post-sowing) 5 일째 및 다시 파종후 10일째에 분무하였다. 제2 글루포시네이트 시용 후 4 내지 7 일 사이에, 제초제 저항성 식물을 확인하고 T2 종자 생산에 대하여 이식했다. 생성된 T2 종자를 하기 설명한 연구에서 이용했다.
각 이벤트에 대해 T2 종자의 작은 분취량(대략 100-200 종자)을 40 mls의 0.1 % 아가로스 용액에 현탁시켰고, 24 시간 동안 4 ℃에서 냉 계층화시켰다(cold stratified). 이어서 계층화된 종자는 번식 플랫에서 4 개 플랫의 표면 상으로 10 ml 피펫에 의해 파종되었다. 플랫은 선샤인 #5 토양질(선 그로; 미국 워싱턴주 벨뷰)로 충전되었고 미세 질석으로 가볍게 덮어졌다. 트레이를 파종 전에 및 필요한 경우에는 그 후에도, 호그랜드의 비료에 적셨다. 파종 후, 습도 유지용 돔을 트레이를 덮기 위해 사용했고, 그리고 나서 16 시간 광 주기를 갖는 24 ℃에 설정된 콘비론(Conviron)™ 성장 챔버 내에 놓았다. 백열광 및 형광을 200 PAR의 조도로 제공했다. 5 일 후, 종자가 발아했고, 돔을 제거했다. 형질전환체의 제1 제초제 선별은 6 일째에, 제2 는 10 일째에 했다. 널을 제거하기 위하여 리버티 제초제(즉, 글루포시네이트-암모늄)을 데빌비스 아토마이저 수동 분무기를 이용하여 분무함으로써 200 g ai/ha의 비율로 시용하였다. 기대한 대로 대략 25 %가 널이었다. 야생형 체크의 열이 또한 선별에 포함되었고, 이들은 2 회의 제초제 시용 후에 100% 사망률을 가졌다. 14 일째에, 식물은 이식을 위하여 준비되었다. 12 개의 식물을 생물학적 검정을 위해 각 이벤트로부터 채취했고, 미세 질석의 가벼운 덮개를 갖는, 선샤인 #5 토양으로 충전된 3 인치(7.6 cms) 화분에 이식했다. 플랫은 이식 전에 및 필요한 경우에는 그 후에 호그랜드의 비료로 미리 담구어졌다. 이식은 14 시간의 추가 광으로, 25 ℃로 설정된 비공기(non-air) 조건의 온실에서 번식되었다. 실리크 성장은 가위로 트리밍함으로써 저해되어 시험을 위한 더 많은 식물 조직을 생성했다. 식물은 16-18 일째 DNA 샘플링을 위해 준비되었고, 약 23 일째 생물학적 검정을 위해 준비되었다. 추정 트랜스제닉 식물을 분자 확인 검정을 이용하여 스크리닝하였고, 확인된 이벤트는 단백질 분석 및 생물학적 검정 결과를 진행시켰다.
형질전환된 식물은 일반적으로 건강한 표현형을 나타내지만, 몇몇 식물은 야생형과 시각적으로 비교했을 때 크기가 더 작았다. 각 아라비돕시스 구축물에 대한 유전자 카피수의 분석은 모든 구축물에 대하여 비슷한 삽입 결과를 나타냈고, 약 50 %의 식물이 관심 cry2Aa 유전자의 ≥3의 카피를 가지고, 약 50 %가 유전자의 1-2 카피를 갖는다.
T1 아라비돕시스 이벤트의 Cry2Aa 단백질 발현 수준은 광범위하다. 단백질 검출은 Cry2Aa 단백질 발현을 정량화하기 위하여 ELISA 검정법을 사용하여 완료되었다. 일반적으로, 단백질 발현 수준은 각 이벤트에 대한 T-가닥 삽입의 카피수와 상관 관계가 있었다. 높은 T-가닥 카피수 이벤트(예컨대, >3 삽입 이벤트)는 일반적으로 아라비돕시스 형질전환 이벤트, 두 세트 모두(예컨대, TraP 없이 Cry2Aa를 발현하는 pDAB107617 이벤트 및 TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드를 이용하여 Cry2Aa를 발현하는 pDAB107540 이벤트)에 대한 낮은 T-가닥 카피수 이벤트보다 더 높은 평균 단백질 발현 수준을 생성했다.
아라비돕시스 식물의 T2 세대는, T1 아라비돕시스 식물의 발현 값과 비교하여 감소된 Cry2Aa 단백질 값을 발현했다. 이 결과는, 단백질 발현이 각 세트의 이벤트들 간에 가변적이라는 것을 나타낸다. 동형접합성 이벤트로부터 얻은 평균 단백질 발현 수준은 시험된 식물 이벤트 모두(예컨대, TraP[pDAB107617]이 없는 이벤트 및 TraP12 [pDAB107540]이 있는 이벤트)에 대해 반접합성 이벤트로부터 얻은 평균 단백질 발현 수준보다 더 컸다. 2 개 초과의 T-가닥 삽입 카피를 함유하는 아라비돕시스 이벤트는 단일의 카피만을 함유하는 아라비돕시스 이벤트보다 더 높은 발현 수준을 가졌다. T1에서 T2 세대로의 단백질 발현 수준의 감소에도 불구하고, 구축물 내의 TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드의 도입은 Cry2Aa 단백질을 발현한 트랜스제닉 아라비돕시스 이벤트를 생성했다.
T1 아라비돕시스 이벤트의 두 세트는 곤충 생물학적 검정 실험에서 시험되었다. 일반적으로, 더 큰 Cry2Aa 단백질 양을 발현시키는 높은 카피수 이벤트는 낮은 카피수 이벤트와 비교하여 더 낮은 잎 손상량을 가져온다. TraP 없이 Cry2Aa를 발현하는 아라비돕시스 이벤트(r2=0.49(SBL), 0.23(TBW)), 및 TraP 12를 사용하여 Cry2Aa를 발현하는 아라비돕시스 이벤트(r2=0.57(SBL), 0.30(TBW))에 대해 SBL 및 TBW 둘 모두에 대한 단백질 발현 및 잎 보호 간의 상관 관계가 있었다. 결과적으로, 단백질 발현의 증가는 잎 손상에 대하여 상당한 보호를 가져왔다(Pr<0.05).
아라비돕시스 식물은 TraP12 및 비(non) TraP 아라비돕시스 이벤트, 둘 모두에서 SBL로부터 보호되었다. TraP12를 사용한 및 사용하지 않은 Cry2Aa 발현은, TraP12:Cry2Aa 이벤트에 대해 약 0.75 ng/cm2, Trap를 사용하지 않은 Cry2Aa 이벤트에 대해 약 1.5 ng/cm2의 최소 단백질 발현에서 30 % 잎 손상보다 낮은 결과를 가져왔다. TraP12를 사용한 및 사용하지 않은 Cry2Aa의 아라비돕시스 이벤트 발현 평가는 TraP12 아라비돕시스 이벤트에 대해 약 1.1 ng/cm2, 비 TraP 아라비돕시스 이벤트에 대해 약 2.0-2.5 ng/cm2의 최소 단백질 발현에서 20 % 잎 손상보다 낮은 결과를 가져왔다.
아라비돕시스 식물은 TraP12 및 비 TraP 아라비돕시스 이벤트, 둘 모두에서 TBW로부터 보호되었다. TBW는 아라비돕시스 이벤트로부터 얻은 식물 물질을 공급했을 때 SBL보다 Cry2Aa 단백질에 대해 더 감수성이었다. Cry2Aa의 약 0.75 내지 1.5 ng/cm2 정도로 낮은 단백질 농도는, Cry2Aa 단백질이 각각 TraP12과 조합하여 및 TraP 없이 발현되었을 때 30 % 잎 손상보다 적은 결과를 가져온다. 20 % 잎 손상 컷-오프점에서, TraP12 아라비돕시스 이벤트로부터의 잎 보호는 약 1.1 ng/cm2의 Cry2Aa 단백질 수준으로부터 생겼지만, 2.0-2.5 ng/cm2의 발현된 Cry2Aa 단백질이 TraP를 포함하지 않는 아라비돕시스 이벤트에 요구되었다.
TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드는 아라비돕시스 탈리아나에서의 Cry2Aa 단백질 발현의 효과를 감소시켰다. Cry2Aa 단백질에 융합된 TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드를 함유하는 트랜스제닉 아라비돕시스 식물은 대두 루퍼(SBL) 및 회색 담배 나방(TBW)에 대한 내충성을 제공하는 높은 수준의 Cry2Aa 단백질을 발현시컸다.
실시예 4: 옥수수에서 작물학상 중요한 트랜스진을 발현시키기 위한 키메라 엽록체 전이 펩티드( TraP ) 서열
Cry2Aa :
바실러스 투린지엔시스로부터의 Cry2Aa 단백질은 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea )(CEW) 및 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis)(ECB)에 대한 활성을 입증하였다. cry2Aa 유전자(서열 14)의 단일 버전, 옥수수에 대해 편향된(biased) 코돈을 옥수수에서 시험하였다. 이 실험에서, Cry2Aa는 단독으로 및 옥수수 내의 TraP12v4 키메라 엽록체 전이 펩티드와 함께 평가되어 내충성 활성을 측정하고, 옥수수에서 TraP12v4 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열이 Cry2Aa 단백질의 발현에 대해 미칠 수 있는 효과를 평가하였다.
TraP12v4 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열(서열 15) 및 GCA 코돈 링커는 cry2Aa 유전자 상류에서 클로닝되었고, 옥수수 식물에서의 내충성 시험에 대해 구축물 pDAB107686(도 12) 내로 도입되었다. 생성된 구축물은 2 개의 식물 전사 단위 (PTU)를 함유했다. 제1 PTU는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터(ZmUbi1 프로모터; 문헌[Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689]), TraP12-cry2Aa 융합 유전자(TraP12 Cry2Aa), 및 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역(ZmLip 3'UTR; 미국 특허 번호 제7,179,902호)를 포함했다. 제2 PTU는 사탕수수 간상 바이러스 프로모터(SCBV 프로모터; 미국 특허 번호 제6,489,462호), MSV 리더 및 알코올 데히드로게나제 1 인트론 6을 함유하는 aad-1 제초제 내성 유전자(AAD-1; 미국 특허 번호 제7,838,733호, 및 MSV 리더 서열; 진뱅크 수탁 번호 FJ882146.1, 및 알코올 데히드로게나제 인트론; 진뱅크 수탁 번호 EF539368.1), 및 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역(ZmLip 3'UTR)을 포함한다. cry2Aa 유전자의 상류에 엽록체 전이 펩티드 서열을 함유하지 않는 대조군 플라스미드, pDAB107687를 구축하고 연구에 포함하였다(도 13). 플라스미드는 식물 형질전환을 위해 아그로박테리움 투멘파시엔스 내로 도입되었다.
제아 메이스 품종 B104의 이삭은 수분 후 10-12 일째 수거되었다. 수거된 이삭을 도정하고, 트윈 20을 2 방울 포함하는, 시판용 표백제(울트라 클로록스(Ultra Clorox)® 살균 표백제, 6.15 % 차아염소산나트륨) 20 % 용액 중에 20 분 동안 침지시키고, 층류 후드 내부의 멸균, 탈이온수 중에서 3 회 세정하여 표면을 멸균시켰다. 미성숙한 접합성 배(1.8-2.2 mm 길이)를 무균 방식으로 각 이삭으로부터 절개하고, 2 μl의 10 % 브레이크-스루(Break-Thru)® S233 계면활성제가 첨가된 아그로박테리움 현탁물을 2.0 ml를 함유하는 하나 이상의 미세원심분리관에 분포시켰다.
일단 배 단리 활성을 완료하면, 배의 관을 닫고 5 분 동안 락커 플랫폼에 놓았다. 이어서 관의 내용물을 공동 배양 배지의 플레이트 상으로 붓고, 액체 아그로박테리움 현탁물을 멸균, 일회용, 전달 피펫으로 제거했다. 배를 함유하는 공동 배양 플레이트를 30 분 동안 뚜껑을 조금 열어놓으면서 층류 후드의 후방에 놓았다; 그 후, 현미경을 이용하여 배반이 위로 향하게 배를 배향시켰다. 이어서 배가 있는 공동 배양 플레이트를 추가 15 분 동안 뚜껑을 조금 열어 놓으면서 층류 후드의 후방 쪽으로 되돌렸다. 이어서 플레이트를 닫고 3M 다공성 테이프로 실링하고, 대략 60 μmol m-2 s-1 조도에서 24 시간/하루의 광으로 25 ℃의 인큐베이터에 놓았다.
공동 배양 기간 다음에, 배를 휴지 배지로 옮겨 놓았다. 36 개 이하의 배를 각 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 3M 다공성 테이프로 랩핑하고 7-10 일 동안 대략 50 μmol m-2 s-1 조도로 24 시간/하루의 광으로 27 ℃에서 인큐베이션시켰다. 캘러스화된(Callused) 배를 선별 I 배지로 옮겨 놓았다. 18 개 이하의 캘러스화된 배를 선별 I 배지의 각 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 3M 다공성 테이프로 랩핑하고 7 일 동안 대략 50 μmol m-2 s-1 조도로 24 시간/하루의 광으로 27 ℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서 캘러스화된 배를 선별 II 배지로 옮겨 놓았다. 12 개 이하의 캘러스화된 배를 선별 II 배지의 각 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 3M 다공성 테이프로 랩핑하고 14 일 동안 대략 50 μmol m-2 s-1 조도로 24 시간/하루의 광으로 27 ℃에서 인큐베이션시켰다.
이 단계에서, 저항성 캘러스를 사전-재생 배지로 이동시켰다. 9 개 이하의 캘러스를 사전-재생의 각 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 3M 다공성 테이프로 랩핑하고 7 일 동안 대략 50 μmol m-2 s-1 조도로 24 시간/하루의 광으로 27 ℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서 재생 캘러스를 피타트레이스™ 내의 재생 배지로 옮겨 놓고 7-14 일 동안 또는 새싹이 형성될 때까지 대략 150 μmol m-2 s-1 조도로 하루당 16 시간의 명기/8 시간의 암기로 28 ℃에서 인큐베이션시켰다. 5 개 이하의 캘러스를 각 피타트레이스™ 내에 놓았다. 이어서 주근을 갖는 작은 새싹이 단리되었고, 새싹/뿌리 배지로 옮겼다. 약 6 cm 이상의 뿌리내린 묘목을 토양으로 이식했고, 튼튼하게(hardening off) 하기 위해 성장 챔버로 이동시켰다.
트랜스제닉 식물에 고유 식별자를 배정하고, 온실로 정기적으로 옮겨 놓았다. 식물을 피타트레이스™로부터 성장 배지(프리미어 테크 홀티컬쳐(Premier Tech Horticulture), 프로믹스(ProMix) BX, 0581 P)로 충전된 작은 화분으로 이식했고, 식물을 순응시키도록 돕기 위해 휴미돔(humidomes)으로 덮었다. 식물을 콘비론™ 성장 챔버(28 ℃/24 ℃, 16 시간 광주기, 50-70 %RH, 200 μmol 조도) 내에, V3-V4 단계에 도달할 때까지 놓아두었다. 이 단계는 식물이 토양 및 혹독한 온도에 순응하는 것을 돕는다. 이어서 식물을 온실(노광 유형: 광 또는 동화(Assimilation); 광 상한: 1200 PAR; 16 시간 광주기; 27 ℃ 낮/24 ℃ 밤)로 이동시켰고, 작은 화분으로부터 5.5 인치(14 cms)의 화분으로 이식시켰다. 더 큰 화분으로의 이식 후 대략 1-2 주 후에, 생물학적 검정을 위해 식물을 샘플링했다. 이벤트당 하나의 식물을 생물학적 검정하였다.
선별 이벤트는 다음 세대로의 진행을 위하여, 유전자의 카피수, 웨스턴 블롯에 의한 단백질 검출 및 생물학적 검정 곤충에 대한 활성에 근거하여 확인되었다. 스펙티노마이신 저항성 유전자를 함유하는 이벤트를 발견하였지만, 반드시 진행에서 생략되지는 않았다. 진행을 위해 선별된 이벤트는 5 갤런(19 L)의 화분으로 이식되었다. 임의의 비정상 표현형을 추적하기 위해 주기적으로 관찰을 행하였다. 새싹 백(bags)을 스트레이(stray) 꽃가루에 의한 교차 오염을 방지하기 위하여 실크(silk) 발아 전에 새싹 위에 놓았다. 덮기 전 실크를 생산하는 새싹을 발견했으며, 그러한 새싹을 제거하였다. 이어서 제2 새싹을 덮고, 수분을 위해 사용했다. 비정상 새싹을 생산했거나, 새싹을 생산하지 않은 식물을 데이터베이스에 기록했다. 수분 전날 실크를 잘라주어 꽃가루를 수용하기 위한 고른(even) 브러시를 제공했고, 식물은 자가 수분되었다.
T1 선별을 위한 식물에 파종 후 7 일째 분무했다. 이들은 플랫당 15 개의 화분들로, 메트로 360 화분용 토양의 4 인치(10.2 cms) 화분에서 성장했다. 묘목 성장 단계는 V1-V1.5였다. 열악한 발아의, 또는 매우 작은 식물이 있는 화분(윤생체는 여전히 닫혀있음)을 표시하여, 선별 평가에 포함시키지 않았다. 이어서 식물의 모든 플랫을, 트랙 분무기 시용을 위한 제2 캐리어 트레이에 놓았다. 8002E 플랫 팬 노즐(티 제트(Tee Jet))을 이용하여 대상 영역으로 부피 187 L/ha로 전달하도록 교정된 만델(Mandel) 트랙 분무기에 한 번에 트레이 2 개가 놓였다. 시용을 위하여 35 g ae/ha 어슈어 II(퀴잘로포프) + 1 % COC(크롭 오일 농축물)의 용액을 제제화하였다. 필요한 총 분무 용액을 계산하기 위하여 15 ml/분무의 부피를 사용하였다. 계산; (35 g ae/ha) x (1 ha/187L) x (1 L/ 97.7 g ae 어슈어 II) = 0.192 % 용액 또는 28.74 μl/15 ml H2O + 1% v/v). 시용 후, 이어서 식물은 온실로 돌아가기 전에 분무 실험실에서 한 시간 동안 건조되었다. 더 큰 화분으로의 이식 후 대략 1-2 주째에, 식물은 생물학적 검정을 위하여 샘플링되었다. 이벤트당 하나의 식물을 생물학적 검정하였다.
분자 분석 스크린을 통과한 모든 T0 이벤트를 Cry2Aa 단백질 발현 수준에 대해 분석하였다. TraP 없이 Cry2Aa를 포함하는 대조군 구축물, pDAB107687로부터의 이벤트는, TraP12를 함유하는 pDAB107686(1.4 ng/cm2)로부터의 이벤트와 비교하여 현저하게 높은 Cry2Aa의 평균 발현 수준(15.0 ng/cm2)를 가졌다. pDAB107686 이벤트의 감소된 발현 수준에도 불구하고, 이 이벤트는 여전히 Cry2Aa 단백질을 발현했다.
또한 T1 이벤트를 Cry2Aa 단백질 발현 수준에 대하여 분석했다. TraP 없이 Cry2Aa를 포함하는 대조군 구축물, pDAB107687로부터의 이벤트는, TraP12를 함유하는 pDAB107686(약 2 내지 3.7 ng/cm2)로부터의 이벤트와 비교하여 현저하게 높은 Cry2Aa의 평균 발현 수준(55 및 60 ng/cm2)를 가졌다. pDAB107686 이벤트의 감소된 발현 수준에도 불구하고, 이 이벤트는 여전히 Cry2Aa 단백질을 발현했다.
cry2Aa 유전자를 포함하는 T-가닥의 단일 카피를 함유하는 트랜스제닉 식물을 트랜스제닉 식물의 잎 위에서 신생 인시류 애벌레로 수행된 생물학적 검정에서 살충 활성에 대해 시험하였다. 검정된 인시류 종은 옥수수들명나방, 조명 나방(Huebner)(ECB), 및 큰담배밤나방의 유충, 헬리코베르파 제아(CEW)였다.
32웰 트레이(C-D 인터네셔날(International), 미국 뉴저지주 피트만)는 2 % 아가 용액으로 부분적으로 충전되었고, 아가가 고형화되도록 하였다. 잎 부분은 각 식물에서 대략 2 개마다 하나로(one in two) 채취되었고 32웰 트레이의 웰로 하나씩 놓여졌다. 1 개의 잎 조각을 각 웰 내에 놓았고, 식물당 및 곤충당 2 개의 잎 조각을 시험했다. 곤충은 페인트붓을 이용하여 대량으로 모아졌고(mass-infested), 10 마리의 신생 애벌레를 각 웰에 놓았다. 트레이를 시험 중에 통풍할 수 있게 하는 천공된 점성의 뚜껑으로 실링했다. 트레이를 28 ℃, 40 % RH, 16 시간의 명기: 8 시간의 암기에서 3 일 동안 두었다. 시험의 지속 후, 각각의 잎 조각에 대해 간단한 퍼센트 손상 점수를 얻었다. 각 테스트에 대한 손상 점수를 평균하고, 단백질 발현 분석과 함께 사용하여 상관 관계 분석을 수행하였다.
T0 및 T1 생물학적 검정의 결과는, TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열이 pDAB107686 이벤트가 생물학적 검정에서 시험된 곤충에 대한 보호를 제공하는 것과 같이 기능했다는 것을 나타냈다. T1 이벤트에서, TraP 없이 Cry2Aa 단백질을 발현하는 식물, (pDAB107687)이, 시험된 모든 곤충 종에 걸쳐서 TraP12를 사용하여 Cry2Aa 단백질을 발현하는 식물(pDAB107686)보다 현저하게 큰 평균 잎 손상을 가졌다. TraP12를 사용한 pDAB107686 이벤트는 TraP 없는 이벤트와 비교하여 더 많은 잎 손상을 가지지만, pDAB107686 이벤트는 생물학적 검정된 곤충에 대하여 보호를 제공했다.
VIP3Ab1 :
바실러스 투린지엔시스로부터의 Vip3Ab1 단백질은 헬리코베르파 제아(CEW) 및 밤나방(FAW) 및 저항성 밤나방(rFAW)에 대한 활성을 입증하였다. Vip3Ab1 v6(서열 16) 및 Vip3Ab1 v7(서열 17) 유전자가 발현되었고, 옥수수에서 내충성에 대해 시험하였다. 이 실험에서, Vip3Ab1v6 및 Vip3Ab1 v7은 단독으로 및 옥수수 내의 TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드와 함께 평가되어 내충성 활성을 측정하고, 옥수수에서 TraP12 v2 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열이 Vip3Ab1v6 및 Vip3Ab1 v7 단백질의 발현에 대해 미칠 수 있는 효과를 평가하였다.
pDAB112711(도 14) 구축물은 Trap12 v2 키메라 엽록체 전이 펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드 서열(서열 11) 및 옥수수 식물에서 내충성 시험에 대한 Vip3Ab1v6 유전자 상류에서 클로닝된 GCA 코돈 링커를 함유한다. 생성된 구축물은 2 개의 식물 전사 단위(PTU)를 함유했다. 제1 PTU는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터(ZmUbi1 프로모터; 문헌[Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689]), TraP12-Vip3Ab1v6 융합 유전자(TraP12-Vip3Ab1v6), 및 제아 메이스 퍼옥시다제5 3' 비번역 영역(ZmPer 5 3'UTR)을 포함했다. 구축물은 제한 효소 분해 및 서열 분석을 통하여 확인되었다. 제2 PTU는 사탕수수 간상 바이러스 프로모터(SCBV 프로모터; 미국 특허 번호 제6,489,462호), MSV 리더 및 알코올 데히드로게나제 1 인트론 6을 함유하는 aad-1 제초제 내성 유전자(AAD-1; 미국 특허 번호 제7,838,733호, 및 MSV 리더 서열; 진뱅크 수탁 번호 FJ882146.1, 및 알코올 데히드로게나제 인트론; 진뱅크 수탁 번호 EF539368.1), 및 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역(ZmLip 3'UTR)을 포함한다. Vip3Ab1v6 유전자의 상류에 엽록체 전이 펩티드 서열을 함유하지 않는 대조군 플라스미드, pDAB111479가 구축되고 연구에 포함되었다(도 15). 플라스미드는 식물 형질전환에 대해 아그로박테리움 투멘파시엔스 내로 도입되었다.
Trap12 v2 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열(서열 11) 및 GCA 코돈 링커를 함유하는 pDAB112712(도 16) 구축물은 Vip3Ab1v7 유전자의 상류에서 클로닝되고, 옥수수 식물에서 내충성 시험에 대해 시험되었다. 생성된 구축물은 2 개의 식물 전사 단위 (PTU)를 함유했다. 제1 PTU는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터(ZmUbi1 프로모터; 문헌[Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689]), TraP12-Vip3Ab1v7 융합 유전자(TraP12-Vip3Ab1v7), 및 제아 메이스 퍼옥시다제5 3' 비번역 영역(ZmPer 5 3'UTR)을 포함했다. 구축물은 제한 효소 분해 및 서열 분석을 통하여 확인되었다. 제2 PTU는 사탕수수 간상 바이러스 프로모터(SCBV 프로모터; 미국 특허 번호 제6,489,462호), MSV 리더 및 알코올 데히드로게나제 1 인트론 6을 함유하는 aad-1 제초제 내성 유전자(AAD-1; 미국 특허 번호 제7,838,733호, 및 MSV 리더 서열; 진뱅크 수탁 번호 FJ882146.1, 및 알코올 데히드로게나제 인트론; 진뱅크 수탁 번호 EF539368.1), 및 제아 메이스 리파제 3' 비번역 영역(ZmLip 3'UTR)을 포함한다. Vip3Ab1v7 유전자의 상류에 엽록체 전이 펩티드 서열을 함유하지 않는 대조군 플라스미드, pDAB112710가 구축되고 연구에 포함되었다(도 17). 플라스미드는 식물 형질전환을 위해 아그로박테리움 투멘파시엔스 내로 도입되었다.
옥수수 형질전환, 단백질 발현 및 곤충 생물학적 검정은 앞서 설명한 프로토콜을 따라서 완료하였고, 결과를 표 33에 나타낸다. 곤충 생물학적 검정의 결과는, TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열이 기능적이었고, pDAB112711 및 pDAB112712 이벤트가 생물학적 검정에서 시험된 곤충에 대한 보호를 제공했다는 것을 나타냈다. 시험된 이벤트에서, TraP 없이 Vip3Ab1 v6 단백질을 발현하는 식물 이벤트, (pDAB111479)트가, CEW 및 FAW 곤충 종, 둘 모두에 대하여, TraP12를 사용하여 Vip3Ab1 v6 단백질을 발현하는 식물 이벤트(pDAB112711)보다 높은 잎 손상 수준을 갖는다. 그러나, TraP 없이 Vip3Ab1 v7 단백질을 발현하는 식물(pDAB112710)은 TraP12를 사용하여 Vip3Ab1 v7 단백질을 발현하는 식물(pDAB112712)과 상당히 다르지 않는 평균 잎 손상을 갖는다. TraP 없는 Vip3Ab1 v7 단백질(pDAB112710), 및 TraP12가 있는 Vip3Ab1 v7 단백질(pDAB112712), 둘 모두는 CEW 및 FAW 종에 대하여 곤충 억제를 제공하는 식물 이벤트를 생성했다. 결과적으로, 웨스턴 블롯 및 생물학적 검정은 모든 시험된 이벤트가 Vip3 Ab1 단백질을 발현했다는 것을 나타냈다.
Figure 112014083517272-pct00043
실시예 5: 키메라 엽록체 전이 펩티드( TraP ) 서열의 식물체내 절단( Cleavage )
TraP12 및 TraP13 키메라 엽록체 전이 펩티드의 절단 부위를 MALDI 분광계 및 N-말단 에드만 분해 서열 분석을 통해서 측정했다. 식물 물질은 TraP12-dgt14, TraP12-dgt28, TraP13-dgt14, 및 TraP13-dgt28 융합 유전자를 함유한 트랜스제닉 식물로부터 수득했고, 엽록체 내의 전위 동안 생성된 키메라 엽록체 전이 펩티드의 절단 위치를 측정하기 위하여 검정했다.
MALDI 결과:
식물 샘플로부터의 반-정제된(semi-purified) 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되었다. YFP의 분자량과 등가인 크기의 단백질 밴드를 겔로부터 절개하고, 색을 제거하고 건조했다. 다음으로, 건조된 단백질 밴드를 37 ℃에서 밤새 25 mM 암모늄 비카르보네이트에서 트립신(프로메가; 미국 위스콘신주 매디슨)으로 겔내 분해했다. 펩티드는 C18 집팁(ZipTip)™(밀리포어; 미국 매사추세츠주 베드포드)에 의해 정제되었고 50 % 아세토니트릴/0.1 % TFA로 용출되었다. 샘플을 매트릭스 α-시아노-4-히드록시신남산과 1:1 비율로 혼합했고, 혼합물을 MALDI 샘플 플레이트 상에 스포팅(sported)하고 공기 건조시켰다.
보야져(Voyager) DE-PRO MALDI-TOF 질량 분석기™(어플라이드 바이오시스템즈; 미국 매사추세츠주 프래밍엄)을 사용하여 펩티드 질량 스펙트럼을 생성했다. 칼리브레이션 믹스쳐(Calibration Mixture) 2™(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용함으로써 외부 교정을 수행했다. 내부 교정은 m/z 842.508, 1045.564 및 2211.108에서의 트립신 자가분해 피크를 사용하여 수행했다. 모든 질량 스펙트럼을 양이온 반사계 모델에서 수집했다. 샘플이 표적 단백질인지를 확인하기 위하여 표적 단백질의 이론적 PMF와 샘플의 PMF를 매칭함으로써, 프로테오메트릭스(Proteometrics) LLC의 PAWS™(단백질 분석 워크시트) 프리웨어를 사용하여 펩티드 질량 지문(PMF) 분석을 수행했다. NCBI NR 단백질 데이터베이스에 대하여 MASCOT(매트릭스사이언스(MatrixScience), 영국 런던)를 사용하여 데이터베이스 검색함으로써 단백질 식별을 수행했다.
에드만 화학 분해를 통한 N-말단 서열 분석
N-말단 서열 분석을 어플라이드 바이오시스템(미국 캘리포니아주, 포스터 시티)의 프로시즈 프로틴 시퀀서(Procise Protein Sequencer)(모델 494)에서 수행했다. 단백질 샘플을 우선 SDS-PAGE에 의해 분리하였고, 이어서 PVDF 막 위로 블롯팅했다. 단백질 밴드를 막으로부터 절개하였고, 프로시즈 시퀀서에 로딩하였다. 8 회 사이클의 에드만 화학 분해를 각 샘플에 대해서 진행하여 N-말단에서 5 개의 AA 잔기를 얻었다. 20 PTH-아미노산(어플라이드 바이오시스템즈)의 표준 혼합을 각 샘플을 사용하여 진행했다. 각 에드만 분해에서 나온 아미노산 잔기를 표준에 대한 C-18 칼럼으로부터의 그들의 지연 시간에 기초하여 측정하였다.
MALDI 서열 분석의 결과는 DGT-28 및 DGT14 단백질이 발현되었고, TraP 키메라 엽록체 전이 펩티드 서열이 처리되었다는 것을 나타낸다. 표 34는 N-말단 에드만 분해 및 MALDI 서열 분석을 사용하여 얻은 처리된 서열을 열거한다.
Figure 112014083517272-pct00044
실시예 6: 키메라 엽록체 전이 펩티드( TraP ) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열의 적층
TraP12 키메라 전이 펩티드는 다중 PTU 플라스미드 구축물 내에 적층된 cry1Ac, cry1Ca, 및 cry1F 유전자 서열의 5' 단부에 융합되어, TraP12 키메라 전이 펩티드가 아라비돕시스 내의 단백질의 발현을 증가시켰는지 또는 감소시켰는지를 결정한다.
표 35에 열거된 구축물은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 조립되었다. 구축물은 이어서 앞서 설명한 아그로박테리움 매개 형질전환을 사용하여 아라비돕시스 탈리아나로 형질전환되었다. 트랜스제닉 아라비돕시스 식물을 얻었고, 단백질 발현을 웨스턴 블롯 및 ELISA 검정을 통해 측정했다.
Figure 112014083517272-pct00045
단백질 정량화의 결과는 TraP12가 Cry1Ac, Cry1Ca, 및 Cry1F의 발현의 총 발현 수준에 대한 변화하는 효과를 갖는다는 것을 나타냈다. TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드의 첨가는 Cry1F의 감소된 발현 수준, 및 Cry1Ca 및 Cry1Ac의 증가된 발현 수준을 가져왔다. 발현 수준의 가변성에 상관없이, 모든 시험된 식물 이벤트는 단백질을 발현시켰고, TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드는 트랜스진의 단백질 발현을 저해하지 않았다. 결과적으로, TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드는 엽록체 내로 발현된 단백질을 유도했다. 발현된 단백질의 엽록체로의 전위는 TraP12 키메라 엽록체 전이 펩티드가 있거나, 또는 없이 발현된 단백질에 대해 유사한 분자량 크기를 나타내는 웨스턴 블롯에 의해 증명되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Lira, Justin Cicchillo, Robert M. Yerkes, Carla Robinson, Andrew <120> SYNTHETIC BRASSICA-DERIVED CHLOROPLAST TRANSIT PEPTIDES <130> 2971-P10416US (69715) <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 207 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 1 Ala Thr Gly Gly Cys Gly Cys Ala Ala Thr Cys Thr Ala Gly Cys Ala 1 5 10 15 Gly Ala Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Gly Thr 20 25 30 Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Cys Cys Ala Thr Gly Thr Gly Thr Thr 35 40 45 Ala Thr Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Thr Cys Thr Cys Thr 50 55 60 Cys Cys Ala Ala Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Cys Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys 85 90 95 Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Gly Cys 100 105 110 Ala Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Gly Ala Gly Cys Thr Thr Cys 115 120 125 Thr Thr Cys Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ala Gly 130 135 140 Ala Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Ala Thr Gly Cys 145 150 155 160 Thr Ala Ala Ala Cys Gly Gly Thr Thr 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Leu 1 5 10 15 Ile Ser Asn Leu Ser Lys Ser Ser Gln Arg Lys Ser Pro Leu Ser Val 20 25 30 Ser Leu Lys Thr Gln Gln His Pro Arg Ala Tyr Pro Ile Ser Ser Ser 35 40 45 Trp Gly Leu Lys Lys Ser Gly Met Thr Leu Ile Gly Ser Glu Leu Arg 50 55 60 Pro Leu Lys Val Met Ser Ser Val Ser 65 70 <210> 5 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TraP12 chloroplast transit peptide <400> 5 atggctcaat cttctaggat ttgccacggt gttcaaaacc cttgcgtgat catctctaac 60 ctttccaagt ccaaccagaa caagtctcct ttcagcgttt ctcttaagac tcatcagcat 120 cctagagctt accctatctc ttctagctgg ggacttaaga aatctggaat gacccttatc 180 ggatctgaac ttaggcctct taaggttatg tcctctgtgt ct 222 <210> 6 <211> 74 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TraP12 chloroplast transit peptide <400> 6 Met Ala Gln Ser Ser Arg Ile Cys His Gly Val Gln Asn Pro Cys Val 1 5 10 15 Ile Ile Ser Asn Leu Ser Lys Ser Asn Gln Asn Lys Ser Pro Phe Ser 20 25 30 Val Ser Leu Lys Thr His Gln His Pro Arg Ala Tyr Pro Ile Ser Ser 35 40 45 Ser Trp Gly Leu Lys Lys Ser 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sequence <220> <223> Linker <400> 10 gcttcttct 9 <210> 11 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TraP12 v2 nucleotide sequence <400> 11 atggcacaat ctagcagaat ctgccacggt gtgcagaacc catgtgtgat catttcaaat 60 ctctcaaagt ccaatcagaa caaatcacct ttctccgtct ccctcaagac acaccagcat 120 ccaagggcat acccgataag cagctcatgg ggactcaaga agagcggaat gactctgatt 180 ggctctgagc ttcgtcctct taaggttatg tcctctgttt cc 222 <210> 12 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trap13 v2 nucleotide sequence <400> 12 atggcacaag ttagcagaat ctgtaatggt gtgcagaacc catctcttat ctccaatctc 60 tcaaagtcca gccaacgtaa gtctcccctc agcgtgtctc tgaaaactca gcagcccaga 120 gcttcttcat ggggtttgaa gaaatctgga acgatgctta acggctcagt cattcgtccg 180 gttaaggtga cagcctccgt ctcc 204 <210> 13 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Trap12 v3 nucleotide sequence <400> 13 atggcacaat ctagcagaat ctgccacggt gtgcagaacc catgtgtgat catttcaaat 60 ctctcaaagt ccaatcagaa caaatcacct ttctccgtct ccctcaagac acaccagcat 120 ccaagggcat acccgataag cagctcatgg ggactcaaga agagcggaat gactctgatt 180 ggctctgagc ttcgtcctct taaggttatg tcctctgttt cc 222 <210> 14 <211> 1902 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cry2Aa gene sequence <400> 14 atgaacaacg ttctcaactc tgggagaacc accatctgcg acgcgtacaa tgtggtggca 60 cacgacccat tctcatttga gcacaagagc ctggatacga tccagaaaga gtggatggaa 120 tggaaaagga cggaccattc cttgtacgtt gctccagtgg tgggcactgt gtcctcgttc 180 ctcctcaaga aagtggggtc gctgatcggg aagcggatac tctccgaact ctggggaatc 240 atctttccgt ctggctcaac aaacttgatg caagacatac tgagagagac tgagcagttc 300 ttgaatcaga ggctgaatac ggacacgctg gcgagggtga acgctgaact cattggcctc 360 caagcgaaca ttagagagtt caatcagcaa gttgataact ttctgaaccc cacacagaat 420 ccagtgcctc tgtccatcac atcatctgtg aacacaatgc agcagctgtt cttgaatagg 480 ctgccacagt ttcagattca aggctatcaa ctgcttcttc tgcctctgtt tgctcaagct 540 gcgaacatgc acctcagctt catcagagac gtgattctga acgcagatga gtggggaatc 600 agcgctgcca ctttgaggac ctacagagat tacttgagga actatacacg cgattactca 660 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ctacctgaag gataaaaaga acgagaactc catctacgag 1860 gaaataaata atgacctgga gggcttccag accgtgacca agaggttcat caccggcacc 1920 gactcctccg gcatccacct gatcttcacc tctcagaacg gcgagggcgc gttcggcggc 1980 aacttcatca tcagcgagat ccgcacctcc gaggagctgc tgtccccgga gctgatcatg 2040 tccgacgcct gggtgggcag ccaaggcacc tggatctccg gcaactccct gaccattaat 2100 agcaacgtga acggcacctt ccgccagaac ctgccgctgg agagctacag cacctactcc 2160 atgaacttca ccgtgaacgg gttcggcaag gtgacggtga ggaactcccg cgaggtgctg 2220 ttcgagaagt cctacccgca gctcagcccc aaggacatct cagagaagtt caccaccgcc 2280 gccaataata ccggcctgta cgtggagctg tcaaggagca ccagcggcgg cgcaataaac 2340 ttccgcgact tctcaattaa gtga 2364 <210> 18 <211> 1248 <212> DNA <213> Streptomyces sviceus <400> 18 atgagaggga tgccagcctt gtctttacct ggatcaaaga gtatcacagc tagggcactc 60 tttcttgctg ctgctgctga tggggttact actttggtga ggccattgag aagtgacgac 120 acagaaggat tcgctgaggg gttagttcgt ttaggctatc gtgtagggag gacacccgat 180 acttggcaag tcgatggcag accacaagga ccagcagtgg ctgaggctga cgtctactgt 240 agagacggag caaccaccgc tagattcttg ccaaccttag cagctgctgg tcacggaaca 300 tacagatttg atgcttcacc acagatgagg agacgtcctc ttttgccctt aagcagagcc 360 ttgagggatt tgggtgtcga tcttagacac gaagaagctg aaggtcatca ccctctgact 420 gtccgtgctg ctggggttga aggaggagag gttactttgg atgctggtca gtcaagtcag 480 tatctcactg ccttgttgct ccttggtccc cttacaagac aaggactgag gataagggtt 540 actgatttgg tgtcagcacc atacgtggag attacgcttg caatgatgag ggctttcgga 600 gttgaagtgg caagggaggg agatgtgttc gttgttccac ctggtggata tcgtgcaact 660 acgtatgcta tagaacccga cgcaagtact gcttcttact tcttcgcagc tgctgctttg 720 actcctggag ctgaagtgac tgtacctggg ttaggcacgg gagcacttca aggagatttg 780 ggatttgtag atgtcttaag gagaatggga gccgaggtgt ccgtaggagc tgatgcaacc 840 actgttagag gaactggtga attgcgtggc cttacagcca acatgagaga cataagtgat 900 acgatgccga ccctcgctgc aatagcaccc tttgctagtg ctccagttag aatcgaggat 960 gttgccaaca ctcgtgtcaa agaatgtgac agacttgagg cttgtgcaga gaaccttagg 1020 aggttgggag taagggttgc aacgggtccg gactggattg agatacaccc tggtccagct 1080 actggtgctc aagtcacaag ctatggtgat cacagaattg tgatgtcatt tgcagtgact 1140 ggacttcgtg tgcctgggat cagcttcgac gaccctggct gtgttcgtaa gacttttcct 1200 gggtttcacg aggctttcgc agaattgagg cgtggcattg ggagctga 1248 <210> 19 <211> 1251 <212> DNA <213> Streptomyces sviceus <400> 19 atggcaagag ggatgccagc cttgtcgctg cctggctcaa agtcgatcac ggctagagca 60 ctctttctcg cagcagcagc cgacggagtc accacgcttg tgagaccgct gcggtcagac 120 gacaccgagg gttttgcgga aggcctcgtc agactgggct atcgggttgg gaggactccc 180 gacacgtggc aagtggacgg aaggccacaa ggtccagcag ttgccgaggc tgatgtgtat 240 tgtagagacg gtgcaacaac ggctaggttc ctccccacac tcgcagctgc tggacacggg 300 acctacagat ttgatgcctc tccccagatg aggagaaggc cactgctgcc tctttctagg 360 gctttgaggg accttggcgt tgatcttcgc cacgaggaag cggaagggca ccaccccttg 420 accgtgagag ctgctggagt cgagggaggt gaggttacac tcgatgctgg acagtcctct 480 cagtacttga cggcactgct gctgctcggt ccgctcacac gccaagggct gcggattcgc 540 gtcactgatc tggttagcgc tccgtacgtg gagattacac ttgcgatgat gagagctttt 600 ggggtcgagg ttgcacgcga aggcgacgtt ttcgtggtgc 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tctttgcagc agctgccctc actggacgcg aggtgacggt ccctgggctg 960 ggaattggtg ctcttcaagg agaccttcgt tttgtggacg tgctgcgtga tatgggagca 1020 gaggtgtctg ttggaccaga tgccacgaca gtgcgctcaa ctggcagact ccgtggcatt 1080 acagttacta tgagagacat ttcagacacg atgccaacac tcgctgctat tgcacctcac 1140 gctgatggac ccgtccgtat tgaggacgtg gcaaacactc gtgtcaagga atgtgatagg 1200 cttgaggcat gtgctcaaaa ccttagagct atgggaatca cggtgcatac tgggcacgat 1260 tggattgaga ttctccctgg gactccaaag ccaacgggaa tagctacgca cggagatcac 1320 agaatcgtta tgtccttcgc agtggctggt ttgttgaccc ctgggctgac atacgatgat 1380 cctggctgcg tccgcaagac ttttccaagg ttccacgaag ttttcgctga ctttgctgca 1440 tcaccccaag cctga 1455 <210> 45 <211> 1431 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DGT-31 and TRAP23 construct <400> 45 atggcacaga tcaacaagtc tgctaatggg gttaggaacg cttcactgat aagcaacttc 60 tccaataccc gtcaagccaa atcccctttc tccctctcat gcggaacaag actgaagaac 120 agcagcagag gtttgaagaa ggtggcagtt aggctcattg gctcccgtgt caaagtgtct 180 gcctcaatga ctgtgattga catccctggc tcaaagtcag ttactgccag agcattgttc 240 ctcgcagcag ctgctgatgg cactacaact cttttgagac ctcttcacag cgatgacacg 300 gaaggcttca ctgagggtct cactcgtttg ggatacgcag tggttagaga acccgatagg 360 tggcacatag aaggacgtcc ctccggtcca gcagcagcag atgcagaagt tcactgtagg 420 gacggtgcta caactgctcg ctttcttcca acccttgcag ctgctgctgc ctccggaacg 480 tatcgtttcg acgcatcagc tcagatgagg cgtagacccc tcgctcccct cacggaagct 540 cttagaacac ttggagtgga ccttaggcat gatggagctg aaggccacca ccccttgaca 600 attcaagcct ctggtgttaa gggtggagga cttacgctcg acgctggtga gtcatctcag 660 tacttgacag ctctgctcat gcttggtcct ctgaccgcag agggactgag aatagaagtt 720 acggagcttg tctctgctcc ttatgtggag atcacccttg caatgatgag aggctttggt 780 gtggaggttg ttagggaggg gaatactttc actgtgcctc ctggaggtta cagagctaca 840 acttatgcca tagaaccgga cgcaagcaca gcttcctact tctttgcagc agcagccctc 900 actgggaggg aagtgacggt gcctggcttg ggcactggag cacttcaagg tgatcttagg 960 ttcacggagg tcctcagaag gatggacgct gatgttcgca caacgtccga ctctacaaca 1020 gtgcgctcag atggtcgcct tgctgggttg actgtcaaca 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primer sequence <400> 57 cgaagtcatg gaagccactt 20 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 58 cttcaaggag atttgggatt tgt 23 <210> 59 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 59 gagggtcggc atcgtat 17 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 60 tgttcggttc cctctaccaa 20 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide probe sequence <400> 61 cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 62 caacatccat caccttgact ga 22 <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide probe sequence <400> 63 cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 64 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 65 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 66 ttcagcaccc gtcagaat 18 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide probe sequence <400> 67 tgccgagaac ttgaggaggt 20 <210> 68 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide primer sequence <400> 68 tggtcgccat agcttgt 17

Claims (76)

  1. 합성 엽록체 전이 펩티드(CTP, chloroplast transit peptide)를 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자로서,
    합성 CTP는, 키메라 단백질이 발현될 때, 합성 CTP에 의해서 식물 세포의 엽록체로 수송되는 폴리펩티드와 프레임 내에서 연결된, 서열 6 또는 서열 8인,
    단리된 핵산 분자.
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  6. 제1항에 있어서,
    폴리뉴클레오티드가 식물 세포 내에서 기능성인 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 단리된 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 폴리펩티드가 형광성 폴리펩티드인, 단리된 핵산 분자.
  8. 제6항에 있어서, 폴리펩티드가 효소인, 단리된 핵산 분자.
  9. 제6항에 있어서, 폴리펩티드는,
    폴리펩티드가 천연적으로 발현되는 세포의 색소체에서 보통 발현되는 것인, 단리된 핵산 분자.
  10. 제6항에 있어서, 폴리펩티드는, 바이러스 저항성, 박테리아 병원체 저항성, 곤충 저항성, 선충 저항성, 진균 저항성, 식물 생장력, 식물 수율, 온도 내성, 토양 조건 내성, 저조도 내성(low light level tolerance), 저수위 내성(low water level tolerance), 고수위 내성(high water level tolerance), 화학적 환경 내성, 종자 색상, 전분 개질, 아미노산 합성, 광합성, 지방산 합성, 오일 합성, 카로티노이드 합성, 테르페노이드 합성, 전분 합성, 및 제초제 저항성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 과정에 관여하는 것인, 단리된 핵산 분자.
  11. 제6항에 있어서, 폴리펩티드는, 제아크산틴 에폭시다제, 콜린 모노옥시게나제, 페로킬라타제, 오메가-3 지방산 데세튜라제, 글루타민 신테타제, 프로비타민 A, 호르몬, 및 Bt 독소 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 핵산 분자.
  12. 제6항에 있어서, 폴리펩티드는, 폴리펩티드를 발현하는 식물 세포에 제초제 저항성을 부여하는 것인, 단리된 핵산 분자.
  13. 제6항에 있어서, 폴리펩티드는, 아세토락타제 신타제(ALS), 돌연변이화된 ALS, ALS의 전구체, 3-에놀피루빌시키메이트-5-포스페이트 신테타제(EPSPS), CP4 EPSPS, 및 부류 III EPSPS로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 핵산 분자.
  14. 제1항의 단리된 핵산 분자에 의해 코딩되는 키메라 단백질.
  15. 제6항에 있어서, 식물 발현 벡터인 단리된 핵산 분자.
  16. 제6항의 단리된 핵산 분자를 포함하며, 식물 물질의 엽록체 내의 폴리펩티드를 추가로 포함하는 것인, 트랜스제닉 식물 물질.
  17. 제16항에 있어서, 식물 물질이 식물 세포, 식물 조직, 식물 조직 배양물, 캘러스 배양물, 및 식물 일부로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 트랜스제닉 식물 물질.
  18. 제16항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 및 작동가능하게 연결된 프로모터가 식물 물질의 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는, 트랜스제닉 식물 물질.
  19. 제18항에 있어서, 식물 물질이 전체 식물 또는 종자인, 트랜스제닉 식물 물질.
  20. 제18항에 있어서, 식물 물질이 아라비돕시스, 알팔파, 브라시카, 콩류, 브로콜리, 양배추, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 배추, 목화, 오이, 가지, 양상치, 멜론, 완두콩, 고추, 땅콩, 감자, 호박, 무, 평지씨, 시금치, 대두, 애호박, 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토, 수박, 옥수수, 양파, 벼, 수수, 소맥, 호밀, 기장, 사탕수수, 귀리, 라이밀, 스위치그라스, 및 잔디로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물로부터의 것인, 트랜스제닉 식물 물질.
  21. 식물 물질을 제6항의 단리된 핵산 분자로 형질전환시키는 단계
    를 포함하는, 트랜스제닉 식물 물질의 제조 방법.
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  24. 제16항의 트랜스제닉 식물 물질로부터 제조된 트랜스제닉 식물 일용품(commodity) 제품.
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