HUP0500286A2 - Új alkalikus proteáz Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből és az ezeket tartalmazó mosó- és tisztítószerek - Google Patents

Abstract

A találmány a Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből nyerhető, új,szubtilizin típusú alkalikus proteázra vonatkozik, valamint e fehérjeváltozataira és származékaira. A mosó- és a tisztítószerekben történőalkalmazásaikon túl ezek a szubtilizin típusú, új, alkalikusproteázok, fehérjeváltozataik és származékaik, további technikaialkalmazási lehetőségekben is megtalálják helyüket. Ó

Description

700031/SZE

S.B.G.&K.

Szabadalmi Ügyvivői Iroda

Új alkalikus proteáz Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből és az ezeket tartalmazó mosó és tisztítószerek

A találmány a Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből nyerhető új, szubtilizin típusú alkalikus proteázra vonatkozik, valamint ezen fehérje változataira és származékaira. A mosó- és a tisztítószerekben történő alkalmazásaikon túl ezek a szubtilizin típusú új alkalikus proteázok, fehérje változataik és származékaik, további technikai alkalmazási lehetőségekben is megtalálják helyüket.

A szubtilizin típusú proteázok (szubtilázok, szubtilopeptidázok, EC 3.4.21.62) katalitikus hatású aminosavaik alapján a szerin proteázok közé tartoznak. Természetes körülmények között mikroorganizmusok, különösen Bacillus fajok termelik és szekretálják. Nem specifikus endopeptidázként hatnak, azaz tetszés szerinti savamidkötést hidrolizálnak, melyek főleg a peptidekben vagy a fehérjékben fordulnak elő. pH-optimum értékük legtöbbször a lúgos tartományban található. A szakirodalomban ezek áttekintése megtörtént [Siezen: Subtilases: Subtilisin-like Proteases 75-95 Subtilisin enzymes, kiadó: R. Bott és C. Betzel, New York, (1996)]. A szubtilizin számos technikai alkalmazási lehetőséggel rendelkezik, így kozmetikumokban, és különösen a mosó- és tisztítószerek aktív alkotójaként szerepelhet.

Az enzimek a mosó- és tisztítószerek aktív alkotórészét adják. A proteázok képesek a tiszítandó termékek, mint például a textíliák, vagy szilárd felületek fehérje tartalmú szennyezéseinek lebontására. Kedvező esetben az enzimek és a szer szokásos alkotói szinergista kölcsönhatásba lépnek. Erről a szakirodalomban beszámoltak [60008178 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés]. A mosó- és tisztító szer proteázok között a szubtilizin kedvező enzimatikus tulajdonságai miatt, mint például stabilitás vagy pH optimum, kiemelkedő helyet foglal el. A továbbiakban ezek közül a legfontosabbakat, és technikai továbbfejlesztésük legfontosabb stratégiáit mutatjuk be.

A mosószer-proteázok fejlesztése alapvetően mikrobiálisan kialakuló enzimekből indul ki. Ezeket ismert mutagén hatást okozó eljárásokkal, például pontmutációval, delécióval, inszercióval vagy fúzióval, más fehérjékkel vagy fehérje részekkel, vagy más módon módosítjuk a mosó- és tisztítószerekbe adagolás optimalizálásához.

Ezt tehetjük a szakirodalomban leírtak alapján [WO 93/07276 számú szabadalmi bejelentés], ebben a szabadalmi bejelentésben közzétették (Firmen Chemgen Corp., Gaithersburg, MD, USA, és Vista Chemical Company, Austin, TX, USA), hogy a Bacillus 164-Al fajból nyerhető proteáz 164-A1 mosó- és tisztítószerekben felhasználható. Az alkalikus proteázok további példái, és forrásaik a következők: Bacillus sp-böl származó PD138, NCIMB 40338 (Fa), Novozymes [WO 93/18140 számú szabadalmi bejelentés], melyet Bacillus fajból fermentációval nyertek, a BP3376 törzsből származó proteináz K-16 (Fa. Kao Corp., Tokyo, Japan) [5.344.770 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés], és a pszichrofil szervezetekből nyert (Flavobacterium balustinum) proteáz [Fa, Procter & Gamble, Cincinatti, OH, USA: WO 96/25489 számú szabadalmi bejelen tés]. A további mikrobiális eredetű proteázok, melyek a mosó- és tisztító szerekbe megfelelnek, a szabadalmi irodalomban megtalálhatók, például Pseudomonas-ból [WO 00/05352 számú szabadalmi bejelentés], Metarrhizium-bó\ [EP 601005 számú szabadalmi bejelentés], Bacillus alkalophilus DSM 6845 vagy DSM 5466 törzsekből [DE 4411223 számú szabadalmi bejelentés] és más további mikroorganizmusból [WO 95/07350 számú szabadalmi bejelentés, EP 1029920 számú szabadalmi bejelentés, EP 578712 számú szabadalmi bejelentés, WO 01/00764 számú szabadalmi bejelentés, 6197740 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, WO 01/16285 számú szabadalmi bejelentés].

A szubtilizin BPN', mely a Bacillus amyloliquefaciens-ből nyerhető, előnyösebben B. subtilis törzsekből, Vasantha és munkatársai, valamint Wells és mtsai munkái nyomán ismert [Vasantha és mtsai: J. Bacteriol., 159, 811-819(1984) Wells és mtsai: Nucleic Acids Research, 11, 7911-7925(1983)]. A szubtilizin BPN' elsősorban a szubtilizin számozás referencia enzimeként ismert. A szakirodalomban leírták [CA 2049097 A1 számú szabadalmi bejelentés] ezen molekulák többszörösen mutált formáit is, különösen figyelembe véve ezek stabilitását mosó- és tisztítószerekben. Az enzimek loop-régióiban pontmutációkkal olyan változatokat kapunk, melyek a szubsztráthoz kisebb mértékben kapcsolódnak, miközben a hidrolízis sebessége nagyobb, ahogy ezt a szakirodalomban leírták [WO 95/07991 és WO 95/30010 számú szabadalmi bejelentések]. Ilyen BPN' változatokat tartalmazó mosószereket a szakirodalomban közzétettek [WO 95/29979 számú szabadalmi bejelentés].

A szubtilizin Carlsberg proteázt a szakirodalomban bemutatták [Smith és mtsai: J. Biol. Chern., 243, 2184-2191(1968); és Jacobs és mtsai: Nucl. Acids Res., 13. kötet, 8913-8926(1985)]. Ezek természetes körülmények között a Bacillus licheniformisban épülnek fel, és például Maxatase® márkanéven forgalmazzák (Genencor International Inc., Rochester, New York, USA), valamint Alcalase® márkanéven (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dánemark) kapható. A pontmutációval nyerhető, szubsztráthoz csökkent mértékben kötődő, de egyidejűleg nagyobb hidrolízis sebességű változatok a szakirodalomból ismertek [WO 96/28566 számú szabadalmi bejelentés]. Itt azokra a változatokra gondolunk, mely molekulák loop-régiójában egy vagy több kicserélés fordul elő.

A PB92 proteáz természetes körülmények között az alkalofil Bacillus nov. 92 törzsben képződik, és a Fa cég Maxacal® néven forgalmazza (Gist-Brocades, Delft, Niederlande). Ennek eredeti szekvenciáját a szakirodalomban leírták [EP 283075 számú szabadalmi bejelentés]. Az enzim pontmutációval nyerhető változatait, melyek mosó- és tisztítószerekben alkalmazhatók, a szakirodalomban közzétették [WO 94/02618 és EP 328229 számú szabadalmi bejelentések],

A szubtilizin 147 és 309 kereskedelmi neve Esperase®, illetőleg Savinase®, ezeket a Novozyme cég forgalmazza. Eredetileg Bacillus törzsekből származnak, melyeket a szakirodalomban közzétettek [GB 1243784 számú szabadalmi bejelentés]. Ezen enzimek pontmutációval továbbfejlesztett változatait, melyek mosó- és tisztítószerekben alkalmazhatók, a szakirodalomban közzétették [WO 94/02618, WO 89/06279, WO 95/30011 és WO 99/27082 számú szabadalmi bejelentések], A WO 89/06279 számú szabadalmi bejelentés szerzői a következő célokat tűzték maguk elé: nagyobb stabilitás biztosítása oxidációval szemben, megnövelt proteolízis sebesség és javított mosási teljesítmény. Kiderült, hogy bizonyos helyzetekben végzett kicserélés a szubtilizin 147 vagy 309 molekulák fizikai vagy kémiai stabilitását képes megváltoztatni. A WO 95/30011 számú szabadalmi bejelentés a szubtilizin 309 változatait mutatja be, melyeket a molekulák loop-területén pontmutációkkal alakítottak ki, így a szubsztrát-abszorpció csökken, miközben a hidrolízis sebessége nő. A WO 99/27082 számú szabadalmi bejelentés példája a szubtilizin 309 változatok fejlesztését mutatja be, mellyel a mosási teljesítmény javult, miközben az aktív loop-ot inszercióval legalább egy aminosawal megnövelték.

A Bacillus lentus-ból nyert alkalikus proteázok a Bacillus fajok nagymértékben alkalikus proteázai. A vadtípusú enzim egy alkalofil Bacillus törzsből származik, és stabilitása az oxidáció és a detergensek hatásaival szemben figyelemre méltó mértékben nagy. Ezt a törzset a szakirodalomban leírták [WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés; EP 493398 számú szabadalmi bejelentés, és 5352604 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés] és DSM 5483 számon letétbe helyezték. A fenti bejelentések alapján az enzim a Bacillus licheniformis gazdában heterológ módon kifejeződhet. Háromdimenziós felépítését a szakirodalomban szintén leírták [Goddette és mtsai: J. Mól. Bioi., 228, 580-595(1992): The crystal structure of the Bacillus lentus alkaline protease, Subtilisin BL, at 1.4 A resolution]. Ezen enzim pontmutációkkal kapott változatai mosó- és tisztítószerekben alkalmazhatók [WO 92/21760 számú szabadalmi bejelentés; 5340735, 5500364 és 5985639 számú

Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentések, és WO 95/23221 számú szabadalmi bejelentés; valamint a 5691295, 5801039 és 5855625 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentések]. A WO 95/23221 számú szabadalmi bejelentésben alapul vett stratégia a raktározás érdekében a szuszbtrát-kötöhely közelében lévő rész megváltoztatását célozta meg, ezt világítja meg a 6197589 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés is. E proteáz további változatait még nem tették nyilvánossá [DE 10121463 és DE 10153792 számú szabadalmi bejelentések].

A szubtilizin DY-t eredetileg Nedkov és munkatársai írták le [Nedkor és mtsai: Biol. Chem Hoppe-Seyler, 366, 421-430(1985)]. Például a WO 96/28557 számú szabadalmi bejelentés szerint a mosó- és tisztítószerekben történő optimalizáláshoz a megcélzott pontmutációk az aktív loop-ban szerepelhetnek. Ide tartoznak a csökkentett adbszorpciójú és növelt hidrolízis sebességű változatok.

A Thermoactinomyces vulgárisban természetes körülmények között képződő termitázt a szakirodalomban leírták [Meloun és mtsai: FEBS Lett., 195-200(1983). A csökkentett abszorpciójú és megnövelt hidrolízis sebességű változatokat a loop-régióban végzett szubsztitúciókkal nyerték [WO 96/28558 A2 számú szabadalmi bejelentés]. A fentieken kívül olyan termitáz molekulák is vannak, melyekben a szekvenciák a többi szubtilizinektől jelentősen eltérnek.

A proteináz K is egy szubtilizin, mely például a Bacillus lentus alkalikus proteázhoz képest kisebb homológiát mutat. A proteináz K-t eredetileg a Tritirachium album Limber mikroorganizmusban írták le [Jany és Mayer: Bioi. Chem. Hoppe-Seyler,

366, 485-492(1985)]. A WO 96/28556 számú szabadalmi bejelentésben a proteináz K-ban pontmutációkkal számos aminosavcserét végeztek, mely változatok a szubsztráthoz kevésbé abszorbeálódnak, és a hidrolízis sebességük nagyobb.

Végül a WO 88/07581 számú szabadalmi bejelentésben egymáshoz nagyon hasonló TW3 és TW7 proteázokat tettek közzé, melyeket a mosó- és tisztítószerekben alkalmaztak.

A megfelelő proteázok további technikai alkalmazását, különösen mosó- és tisztítószerekben, a szakirodalomban közzétették [EP 199404, EP 251446, WO 91/06637 és WO 95/10591 számú szabadalmi bejelentések]. Az EP 199404 számú szabadalmi bejelentés proteázai különböző BPN' változatok, melyek EP 130756 számú szabadalmi bejelentésen alapulnak. A WO 91/06637 számú szabadalmi bejelentés szerint a proteáz C-k a BPN' pontmutációi a 123. és/vagy 274. helyzetekben. Elsősorban a Bacillus lentus-bói nyerhetők változatok, melyeket a WO 95/10591 számú szabadalmi bejelentésben írtak le, valamint a 76. helyzet mutációi, és ezen kívül más helyzetek is érintettek.

A további ismert proteázok kereskedelmi nevei a következők: Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® és Ovozymes® (melyek a Novozymes cégtől szerezhetők be), Maxapem®, Purafect®, Purafect OxP® és Properase® (melyek a Genencor-tól vásárolhatók), Protosol® (Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien) és Wuxi® (Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China).

A szubtilizin mosási teljesítményének egyik javítási stratégiája abban áll, hogy statisztikusan, vagy az egyes aminosavak ismert funkciói alapján, az ismert molekulákban pontmutációkat alakítunk ki, és a kapott változatok mosási teljesítményre gyako rolt hozzájárulását ellenőrizzük. A stratégia megvalósulhat például a fentiekben említett szabadalmi bejelentésekben közzétett módon [EP 130756 számú szabadalmi bejelentés]. Például a W0 99/49056, WO 99/49057 és WO 01/07575 számú szabadalmi bejelentések szerint az enzimek bizonyos aminosavkicserélésekkel vagy elvételekkel kisebb allergenitású formák kialakításához vezethetnek.

A szubtilizin mosási teljesítményének javítására, melyet az aktív loopba történő további aminosav beépítéssel kísérelték meg elérni, a fentieken kívül [WO 99/27082 számú szabadalmi bejelentés] számos bejelentést és stratégiát tettek közzé, ezek például a következő bejelentésekben találhatók meg: WO 00/37599, WO 00/37621-töl WO 00/37627-ig és WO 00/71683-től WO 00/71691-ig. Ezen alapelv alapján lehet az összes szubtilizint alkalmazni, melyek egyik alcsoportja az I-Sl (igazi szubtilizin), míg a másik az I-S2 (nagymértékben alkalikus szubtilizin).

A teljesítmény növelésének egy másik stratégiája abban áll, hogy a molekula felületi töltése és/vagy izoelektromos pontja, és így kölcsönhatása a szubsztráttal megváltoztatható. Az ilyen változatokat a szakirodalomban leírták [5665587 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés; EP 405901 számú szabadalmi bejelentés, WO 91/00334 számú szabadalmi bejelentés, és WO 91/00345 számú szabadalmi bejelentés], A pH-értéktől kevésbé függő molekula változatokat a WO 92/11348 számú szabadalmi bejelentésben tették közzé. A WO 00/24924 számú szabadalmi bejelentés ezen elv alapján a változatok azonosítási eljárásához vezetett, melyek alkalmazása a mosó- és tisztítószerekben megfelelő lehetne; bár az összes közzétett változat legalább egy a 103. helyzetben végzett kicserélésre vonatkozik, előny ben részesítve a többszörös változatokat, amikor is a szóban forgó bejelentés a releváns kicseréléseket nem adja meg. A WO 96/34935 számú szabadalmi bejelentés szerint a teljesítmény javítását a mosó- és tisztító szerekben a molekula hidrofób jellege is megnövelheti, ami az enzim stabilitására befolyással lehet.

A WO 99/20727 számú szabadalmi bejelentésből a szubtilizin változatokat ismerhetjük meg, melyek a WO 00/24924 számú szabadalmi bejelentés eljárásával előállíthatok: ezek mindegyike legalább egy kicserélést tartalmaz a 103. helyzetben, kombinálva sok más lehetséges kicseréléssel. Az ilyen mutánsokat a WO 99/20723 és a WO 99/20726 számú szabadalmi bejelentésekben közzétették mosó- és tisztítószerben történő alkalmazásokhoz, amit amilázzal, előnyösen fehérítővel egészítettek ki.

Egy másik eljárás a proteázok teljesítményének változtatására a fúziósfehérjék kialakításéin alapul. így például a WO 98/13483 és a WO 00/01831 számú szabadalmi bejelentések proteázokból és inhibitorból fúziós fehérjék létrehozását teszik közzé, mint például a Streptomr/ces-szubtilizin-inhibitor fúziós fehérjét. Egy további lehetőség a WO 97/28243 vagy a WO 99/57250 számú szabadalmi bejelentések szerint a cellulázokból nyerhető cellulóz kötődőmén (CBD) kapcsolása az aktív enzimhez, így növelve az aktív enzim koncentrációját a szubsztrátkötőhely közelében. A WO 99/48918 számú szabadalmi bejelentés szerint peptid-kapcsolók segítségével kapcsolt polimerekkel az allergenitás, előnyösen az immunogenitás csökkenthető.

A statisztikusan kialakított aminosavcserékkel és kiválasztással teljesítményükben javított változatokat nyerhetünk például fág bemutatási rendszeren alapuló eljárással [WO

99/20769 számú szabadalmi bejelentés], ezek alkalmazását mosó- és tisztítószerekben a szakirodalomban leírták [WO 97/09446 számú szabadalmi bejelentés].

Az enzimfejlesztés egy modern iránya, melynek elemei ismertek, az új enzimek statisztikus előállítását egymással rokon fehérjék kombinálásával éri el, melyek a mai napig nem ismert tulajdonságokat mutatnak. Az ilyen eljárások tekinthetők irányított evolúciónak. Ide tartoznak például a következő eljárások: a StEP módszer [Zhao és mtsai: Nat. Biotechnoi., 16, 258-261 (1998)], a random priming rekombináció [Shao és mtsai: Nucleic Acids Res., 26, 681-683(1998)], a DNS-shuffling [Stemmer: Nature, 370, 389-391(1994)], vagy rekurzív szekvencia rekombináció (RSR) [WO 98/27230, WO 97/20078, WO 95/22625 számú szabadalmi bejelentések], vagy a RACHITT [Coco és mtsai: Nat. Biotechnoi., 19, 354-359(2001)]. Ezek áttekintése a szakirodalomban megtalálható [Powell és mtsai: Gerichtete Evolution und Biokatalyse, Angew. Chem., 113, 4068-4080(2001)].

Egy további, különösen kiteljesített stratégia abban áll, hogy a kérdéses proteázok stabilitását és ezzel hatékonyságukat is megnövelik. Polimer csatolásával stabilizált proteázok kozmetikumokban alkalmazhatók, ahogy azt a szakirodalomban leírták [5230891 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés]; ez lehetővé teszi a termék jobb elviselhetőségét a bőrön. Különösen a mosó- és tisztító szereknél közismertek a pontmutációkkal végzett stabilizálások. így a 6087315 és 6110884 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentések szerinti proteázok úgy stabilizálhatok, hogy bizonyos tirozinokat más aminosavakra cserélünk. A WO 89/09819 és a WO 89/09830 számú szabadalmi bejelentésekben termostabilis BPN' változatokat írtak le. A pontmutációkkal végzett stabilizálásra további leírt lehetőségek például a következők:

- Bizonyos aminosavak kicserélése prolinra [WO 92/19729 számú szabadalmi bejelentés, EP 583339 számú szabadalmi bejelentés és 5858757 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, valamint EP 518200 számú szabadalmi bejelentés];

- A molekula felületére polárosabb vagy töltöttebb csoportok felvitele [EP 525610 számú szabadalmi bejelentés, EP 995801 számú szabadalmi bejelentés és 5453372 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés];

- A fémionok kötésének megerősítése, különösen a kalciumkötőhely mutagenezisével [WO 88/08028 és WO 88/08033 számú szabadalmi bejelentések];

- Az autolízis blokkolása módosítással vagy mutagenezissel [WO 98/20116 számú szabadalmi bejelentés; 5543302 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés].

- Az EP 398539 számú szabadalmi bejelentésben több stabilizáló stratégia kombinációját tették közzé.

- Az 5340735, 5500364, 5985639 és 6136553 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentések szerint a stabilizáláshoz releváns helyzetek a háromdimenziós felépítés analízisével kideríthetők.

Például az EP 755999 és WO 98/30669 számú szabadalmi bejelentésekből tudjuk, hogy a proteázok, különösen a mosó- és tisztító szerekben használt javított teljesítményű proteázok, előnyösen a mosó- és tisztító szerekben a tisztítási teljesítmény növelésére α-amilázzal és további mosószer enzimekkel együtt alkalmazhatók. Például az EP 791046 számú szabadalmi bejelentésben lipázos kombinációkat tettek közzé. A WO 95/10592 számú szabadalmi bejelentés példáiban, a már a WO 95/10591 számú szabadalmi bejelentésben mosószerekhez alkalmazott változatokhoz adott fehérítő szerek alkalmazhatóságát teszik közzé. A 6,121,226 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentésben proteázok és talajt-kiszedő hatóanyagok egyidejű alkalmazását tették közzé mosószerekhez.

Például a WO 97/07770 számú szabadalmi bejelentésből ismert, hogy ezek közül néhányat korábban mosószer proteázként használtak, de akár kozmetikai célokra is alkalmazhatók. A proteázok egyik további alkalmazási lehetőségét a szakirodalomban leírták [EP 380362 számú szabadalmi bejelentés]. Ezek szintetikusan előállított formákra vonatkoznak, és ezért a fenti bejelentések szerint azok a szubtilizinek felelhetnek meg, melyeket pontmutációkkal stabilizáltak.

Az itt példákon keresztül bemutatott, különböző technikai felhasználási területek olyan proteázokat igényelnek, melyek különböző tulajdonságaik, például reakciókörülményeik, stabilitásuk vagy szubsztrát specifitásuk révén, hozzájárulnak alkalmazhatóságukhoz. Viszont a proteázok technikai alkalmazhatósága, például a mosó- és tisztító szerek receptjeinek tekintetében további tényezőktől függnek, mint például magas hőmérséklettel szemben mutatott stabilitásuk, az oxidáló szerekkel szemben mutatott ellenállóképességük, tenzides denaturálhatóságuk, kicsapó hatásuk, vagy elvárt szinergizmusuk más alkotórészekkel.

így nagyobb igény mutatkozik olyan technikailag alkalmazható proteázokra, melyek több alkalmazási területen, tulajdonsá gaik széles spektruma alapján, igen kifinomult teljesítmény különbségeket eredményeznek.

Ehhez alapul szolgál azon proteázok továbbfejlesztése, melyeknél speciális felhasználási területeket célozhatunk meg.

A találmány előtt áll az a feladat is, hogy még további, eddig nem ismert, proteázokat találjon. A vadtípusú enzim előnyösen azzal emelhető ki, hogy a szerben az adott célnak megfelelő formát leginkább megközelíti. Különösen azokra a felfedezésekre van szükség, melyek a mosó- és előnyösen a tisztítószerekben jobb teljesítményt biztosítanak.

A további részfeladatok olyan nukleinsavak biztosításával állnak kapcsolatban, melyek az ilyen proteázokat kódolják, valamint vektorokkal, gazdasejtekkel és ezek előállítási eljárásainak biztosításával az ilyen proteázok kialakításához. Továbbá a megfelelő anyagok biztosítására is kiterjed, különösen mosó- és tisztítószerek alkalmazási lehetőségeinek bővítésére szolgáló proteázokra. Végül a talált proteázok technikai alkalmazási lehetőségeit meg kell határoznunk.

A találmány előtt álló feladatot a szubtilizin típusú proteázokkal úgy oldottuk meg, hogy az a 2. szekvencia számon megadott aminosav szekvenciával legalább 98,1 %-ban azonos.

Különösen jó megoldást jelentenek azok a proteázok, melyek a Bacillus sp. (DSM 14392) új alkalikus proteázzal fokozott mértékben megegyeznek.

A részfeladatok és a találmány egyes tárgyköreinek további megoldása azok a nukleinsavak, melyek szekvenciáját az 1. számon adtunk meg, melyek a találmány szerinti proteázokat kódolják, valamint vektorokat; gazdasejteket és előállítási eljárásokat biztosítunk, melyek az ilyen proteázok nyeréséhez szükségesek. Továbbá az ilyen proteázok részére megfelelő szereket, különösen mosó- és tisztítószerekhez, megfelelő mosóés tisztítószer eljárásokat, valamint megfelelő alkalmazási lehetőségeket alakítunk ki. Végül meghatároztuk a talált proteázok technikai alkalmazási lehetőségeit.

A találmány szellemében fehérje alatt természetes aminosavakból álló, főleg lineáris építőelemekből felépülő, hatását elsődlegesen háromdimenziós struktúrája révén kifejtő polimert értünk. A találmányban a 19 fehérjét felépítő, természetben előforduló L-aminosav nemzetközileg szokásos egy- és hárombetűs kódjait használjuk. Az ilyen elnevezések kombinációja egy számmal arra a fehérjére utal, melyben a szóban forgó aminosav a megjelölt helyzetben fordul elő. A pontmutációknál analóg jelölést alkalmazunk. A helyzeteket, ha azt másképpen nem adtuk meg, a szóban forgó fehérje érett formájára vonatkoznak, annak szignálpeptid nélküli formájára (lásd lejjebb).

A találmány szellemében enzim alatt olyan fehérjét értünk, mely meghatározott biokémiai funkciót mutat. Proteolítikus enzimek vagy proteolítikus funkcióval rendelkező enzimek alatt azokat értjük, melyek a fehérjék savamid-kötéseit hidrolizálják, különösen azokat, melyek a fehérjék belsejében találhatók, és ezért ezeket endopeptidázoknak is nevezhetjük. A szubtilizin proteázok endopeptidázok, melyeket a természetben előforduló Gram-pozitív baktériumok állítják elő, és szekretálják, vagy ezekből, például molekuláris biológiai eljárásokkal előállíthatjuk; és részegységekből állnak, melyek strukturálisan vagy funkcionálisan elkülöníthetők, miközben a természetes szubtilizin proteázokkal homologizálhatók. Ezeket a szakirodalomban leírták [Siezen: Subtilases: Subtilisin-like

Proteases, 75-95, Subtilisin enzymes, kiadó: R. Bott und C. Betzel, New York, (1996)].

Számos fehérje úgynevezett előpeptidként, tehát egy szignál-peptiddel együtt keletkezik. Ez a fehérjék N-terminálisán foglal helyet, melynek funkciója legtöbbször a termelő sejtből a képződő fehérje periplazmába vagy a tenyészközegbe juttatása, és/vagy a fehérje szabályos hajtogatódásának garantálása. Végül a szignál-peptid természetes körülmények között szignálpeptidáz hatására a fehérjéről lehasad, teszi ezt a képződő új N-terminális megsértése nélkül.

A technikai alkalmazáshoz az enzimatikus aktivitás az érett peptidhez kötött, így a megcsonkított előfehérje termelését előnyben részesítjük.

Az előfehérjék a fehérjék inaktív alakjai. Ezek előhírnökét a szignálszekvenciával pre-pro-fehérjének nevezzük.

A találmány szellemében nukleinsavak alatt természetesen a nukleotidokból felépülő információt hordozó molekulákat értjük, melyek a fehérje vagy enzim lineáris aminosavsorrendjét kódolják. Előfordulhatnak egyszálú formában, és ehhez az egyszálú formához komplementerként kötődő másik szállal kettősszálú formában. A természetesen tartósan megmaradandó, információt hordozó DNS-t a molekuláris biológiai munkákhoz előnyben részesítjük. Ezzel szemben a találmány megvalósítása során természetes környezetben, mint például egy kísérleti sejtben, RNS alakul ki, ezért az RNS molekula szintén a találmány megvalósítási formájába tartozik. Ezekből például fordított átírással ismét cDNS vezethető le.

A találmány szellemében a fehérjének megfelelő információ egységet génnek nevezzük. A DNS-nél mindkét komplementer szál mindhárom lehetséges olvasási keretére figyelemmel vagyunk. Továbbá arra is tekintettel vagyunk, hogy az aminosavakat különböző kodon-hármasok is kódolhatják, így egy meghatározott aminosav sorrend több különböző, és viszonylag csak kis azonosságot mutató, nukleotid szekvenciából vezethető le (a genetikai kód degenerált). Ezen kívül ismeretes, hogy a különböző mikroorganizmusok eltérő kodonokat használnak. Ez alapján az oltalmi kört mind az aminosav szekvenciákra, mind a nukleotid szekvenciákra ki kell terjeszteni, és a megadott nukleotid szekvenciákat mindig csak egy meghatározott aminosav szekvencia példa sorrendjének kell tekinteni.

A szakirodalomban jártas szakemberek számára ismert, hogy a teljes gén előállításához például a kémiai szintézis vagy a polimeráz láncreakció eljárások (PCR) molekuláris biológiai és/vagy proteinkémiai standard módszerekkel együtt végezhetők az ismert DNS és/vagy az aminosav szekvenciáknak megfelelő nukleinsav szekvenciáik alkalmazásával. Az ilyen eljárásokat a szakirodalomban közzétették [Lexikon dér Biochemie, Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1. kötet, 267-271 és 2. kötet 227-229(1999)]. Ez különösen akkor lehetséges, amikor a letétbe helyezett törzsért a törzsgyújteménybe visszanyúlhatunk. Például PCR-primerekkel az ismert szekvencia és/vagy izolált mRNS molekula alapján az ilyen törzsekben előforduló gén problémamentesen szintetizálható, klónozható és kívánt esetben tovább alakítható, például mutagén kezelésnek vethető alá.

A nukleotid szekvencia megváltoztatását, amelyet például az itt ismertetett molekuláris biológiai módszerekkel elvégezhetünk, mutációnak nevezzük. A változtatások típusa szerint megkülönböztetünk deléciós, inszerciós vagy helyettesítéses mutá ciót; azt a folyamatot amikor a különböző géneket vagy a gének részeit fuzionáltatjuk (shuffling) génmutációnak nevezzük. Az így kialakított szervezeteket mutánsoknak nevezzük. A mutált nukleinsavból levezethető fehérjét változatnak nevezzük. így például a deléciós, inszerciós vagy szubsztituciós mutációk deléciós, inszerciós vagy szubsztituciós mutáns fúziósgén változatokhoz és deléciós, inszerciós és szubsztituciós fehérje, illetve fúziós fehérje változatokhoz vezetnek.

A találmány szellemében vektor alatt olyan nukleinsav elemeket tartalmazó konstrukciót értünk, mely kritériumai alapján a kérdéses gént tartalmazza. Ez a fajban vagy a sejtvonalban több generáción vagy sejtosztódáson keresztül képes a befogadó genomjától függetlenül stabilis genetikai elemként fennmaradni. A bakteriális fajoknál a vektorok kiváltképpen plazmidok, azaz cirkuláris genetikai elemek. A géntechnikában egyrészt megkülönböztetünk olyan vektorokat, melyek tárolásra és bizonyos tekintetben a genetikai feladatok ellátására szolgálnak, ezek az úgynevezett klónozó vektorok, másrészt, melyek a gazdasejtben a kérdéses gén funkcióit megvalósítják, azaz a szóban forgó fehérjék kifejezését lehetővé teszik. Ezeket a vektorokat expressziós vektoroknak nevezzük.

Mind a bakteriális sejteket, mint az eukarióta sejteket, melyek a megnevezett vektorokat tartalmazzák, mindezek ellenére általánosan megkülönböztetés nélkül sejteknek nevezzük. Az ilyen sejtek, melyek vektort, különösen expressziós vektort tartalmaznak, és ezzel egy transzgén kifejezését megindíthatják, gazdasejtnek nevezzük, mivel lehetőséget biztosítanak a szóban forgó genetikai rendszer fenntartásához.

A homologizálás nem más, mint a nukleinsav szekvencia vagy az aminosav szekvencia egybevetése ismert génnel vagy fehérjével. Ez például adott elrendezés alapján történhet. A homológia mértékét százalékos azonosságként a szakirodalomban leírt módon határozhatjuk meg [Lipman és Pearson: Science, 227, 1435-1441(1985)]. Ez az adat tükrözheti a teljes fehérjét, de annak egy részét is. A homológia fogalom egy további jelentése az a hasonlóság, mely a konzervatív változatokra is vonatkozik, tehát ahol az aminosavak hasonló kémiai aktivitásúak, mivel a fehérjében legtöbbjük azonos kémiai aktivitást fejt ki. Nukleinsavak esetében csak százalékos azonosságról beszélünk.

A homologizálással, azaz ismert enzimmel történő összehasonlítással, például megadott elrendezésben, a kérdéses enzim aminosav vagy a nukleotid szekvenciáinak enzimatikus aktivitása kikövetkeztethető. A különböző fehérjék homológia területei összehasonlítható funkciók esetében felismerhetők, amennyiben azonos vagy hagyományos kicseréléseket végeztek primer aminosav szekvenciájukban. Ez felöleli az egyes aminosavakat, kisebb területeket, úgynevezett boxokat, melyek néhány aminosav hosszúságúak, valamint kiterjed az elsődleges aminosav szekvencia nagyobb területekre is. A homológ területek funkciói alatt a szóban forgó fehérje legkisebb részfunkcióit is értjük, mint például egyes hidrogénhíd kötések kialakulását a szubsztrátokkal vagy átmeneti komplexekkel. A fehérjék más területei, melyek az adott enzimatikus reakcióban nem vesznek részt, minőségileg vagy mennyiségileg módosíthatók. Ezek például az enzimstabilitásra, aktivitásra, reakciófeltételekre vagy a szubsztrátspecifitásra kihatással vannak.

A proteolítikus enzimek vagy proteázok szakkifejezés alatt így a katalitikusán aktív központokban lévő néhány aminosav mindazon funkcióit értjük, melyek a teljes fehérje megmarad többi részének vagy egyes részeinek, vagy a megmaradt fehérje több részének, tulajdonképpen az aktív területét adják. A találmány szellemében proteolítikus aktivitásnak tekintjük magukat az ilyen módosított funkciókat vagy részaktivitásokat is, amennyiben proteolítikus funkciót támogatnak. Az ilyen segédfunkciók vagy részaktivitások például egyes szubsztrátok, közti vagy végtermékek kötésére, valamint a hidrolítikus aktivitást befolyásoló szabályozók aktiválására vagy gátlására vagy közbelépésére szolgálnak. így például bizonyos strukturális elemek kiépítése az aktív centrumtól távol is elvégezhető. A második feltétel, hogy a találmány szerinti proteolítikus fehérjének megfeleljen, valójában az, hogy a tulajdonképpen aktív csoport kémiai viselkedése magában vagy a módosított rész hatásával együtt a peptidkötés hidrolízisét adja. Ez alapján az is lehetséges, hogy egyéb proteázok aktivitásai egy vagy több rész bevonásával, például a találmány szerinti fehérje, minőségileg vagy mennyiségileg módosítva legyen. A proteolítikus aktivitásnál egyéb tényezők befolyását ugyancsak figyelembe vesszük. A proteolítikusan aktív enzimek közé tartoznak azok is, melyek aktivitását adott időpontban bizonyos anyagokkal gátolhatjuk. Döntő ezek alapvető képessége az adott proteolízis reakcióban.

Fragmensnek nevezzük az összes fehérjét vagy peptidet, mely kisebb mint a természetes fehérje, vagy azokat, melyek a teljesen átíródott génnek felelnek meg, és például szintetikusan is megkaphatok. Aminosav szekvenciájuk alapján a megfelelő teljes láncú fehérjévé rendezhetők. Például azonos struktúrát vehetnek fel, vagy proteolítikus vagy más részaktivitást mutathatnak. A kiindulási fehérjék fragmensei és hiányváltozatai lényegében egyet jelentenek, mivel akár fragmensek, akár a deléciós mutánsok, amelyeknél csak kis darabok hiányoznak, csak egyes részfunkciókat jeleníthetnek meg.

A találmány szellemében kimérák vagy hibrid fehérjék alatt azokat a fehérjéket értjük, melyek olyan természetes elemekből épülnek fel, melyek ugyanabból a szervezetből vagy különböző szervezetekből származnak. Az ilyen folyamatot shuffling-nak vagy fúziós mutagenezisnek nevezik. Az ilyen fúziók jelentősége, hogy például a találmány szerinti fehérjerészek fúziójának segítségével enzimatikus funkció jöhet létre vagy módosulhat.

Inszerciós mutációval nyerhető fehérjék alatt azokat a változatokat értjük, melyek ismert eljárásokkal, az egyes nukleinsavak, előnyösebben fehérje fragmensek egybekapcsolásával a kiindulási szekvenciában alakíthatók ki. Ezek lényegében azonosak a kialakított kiméra fehérjékkel. Megkülönböztetésként csupán a fehérje részek méretében térnek el a teljes fehérjétől. Az ilyen inszerciósan mutált fehérjékben az idegen fehérje kevesebb mint a kiméra fehérjékben.

Az inverziós mutagenezis, azaz a részleges szekvencia megfordítás, a deléció egyik eltérő formája, inszerciónak is tekinthető. Ez csak az eredeti aminosav sorrenddel rendelkező, de különböző molekularészek új csoportosulására érvényes. Ezek az eredeti fehérjék, deléciós változatainak, inszerciós változatainak, valamint shuffling változatainak tekinthetők.

A találmány szellemében származékok alatt olyan fehérjéket értünk, melyek aminosav lánca kémiailag módosított. Az ilyen származék képzés például biológiailag, fehérje szintézissel kapcsoltan a gazdaszervezetben elvégezhető. Ehhez molekuláris biológiai eljárásokat alkalmazhatunk, mint például ko-transzformáció génnel, mely a szóban forgó mutációt hordozza. A származékok képzése kémiailag is elvégezhetők, akár az oldallánc aminosav kémiai átalakításával, akár a fehérjén más kovalens kötéssel. Az ilyen kötéseknél például más fehérjéket használunk, melyek például a találmány szerinti fehérjéhez bifunkciós kémiai vegyületekkel kapcsolhatók. Az ilyen módosításokkal például a szubsztrátspecifitás vagy a kötés erőssége a szubsztráton befolyásolható, vagy az itt említett enzimatikus aktivitás átmenetileg blokkolható, amennyiben a kapcsolt anyag inhibitor. Ennek például a tárolási idő alatt lehet értelme. Hasonlóan, a makromolekuáris hordozó kovalens kötésének módosítását származékképzésnek tekintjük.

A találmány szellemében minden enzimet, fehérjét, fragmenst és származékot, amennyiben azt másképpen nem jelezzük, a fehérje fogalomba egyesítjük.

Az enzim teljesítménye alatt az adott technikai területen kifejtett hatékonyságát értjük. Ez az enzimaktivitáson alapul, de az adott folyamat egyéb releváns tényezőitől is függ. Ide tartozik például a stabilitás, a szubsztrátkötés, kölcsönhatása a szubsztrátot hordozó anyaggal, vagy kölcsönhatása más alkotórészekkel, és elsősorban a szinergista hatások.

A találmány szellemében mosószer teljesítmény vagy tisztítószer teljesítmény alatt azokat a hatásokat értjük, melyek a szóban forgó szennyezett anyagon, mint például textíliákon, vagy adott esetben szilárd felületeken, fejtenek ki. Az ilyen anyagok egyik komponense például az enzim, melyet a mosó- és tisztítószerekhez hatása miatt alkalmazásra érdemesnek tartunk.

Ennek megfelelően az enzim enzimatikus sajátságai alapján nem minden további nélkül alkalmazhatók egyes szerekben a mosási teljesítmény elősegítésére. Itt például olyan további tényezők játszanak szerepet, mint a stabilitás, szubsztrátkötés, a tisztítandó dologgal vagy a szer egyéb alkotórészeivel kialakuló kapcsolódás, különösen a szennyezés eltávolításában megmutatkozó szinergizmus.

A találmány alapja a természetes úton keletkező szubtilizin típusú alkalikus proteáz, amelyet a példákat követve Bacillus sp. DSM 14392 törzsből tényészkörülmények között izoláltunk.

Ezt a törzset a mikroorganizmusok letétbe helyezésének Budapesti Egyezménye alapján (1977) a német törzsgyújteménybe letétbe helyeztük [Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de)]. Ott a ID 01-193 elnevezést és a DSM 14392 számot kapta. Ezen biológiai anyag főbb jellemzőit meghatározták (DSMZ, 2001), melyeket az 1. táblázatban foglaltunk össze.

A találmány azon stratégián alapul, hogy természetes körülmények között élő, proteázt előállító mikroorganizmusokat tanulmányoz, és ezzel olyan, a természetben kialakuló enzimet keres, mely a megadott követelményeknek a lehető legnagyobb mértékben megfelel.

Az ilyen enzimet, ahogy azt a találmány példáiban leírtuk, a Bacillus sp. (DSM 14392) alkalikus proteázként találtuk meg.

Ahogy azt a német törzsgyüjtemény vizsgálatai állították (Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) ez a törzs proteolítikus aktivitást szekretál (az 1. táblázat 1. példájában). Ezt a találmány megvalósítási formái szerint megvizsgáltuk, és a következőkben ismertetjük. SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel kiderült, hogy ez egy 26 kD-os fehérje, és izoelektrofókuszálással megállapítottuk, hogy izoelektromos pontja 11. Az AAPF szubsztrátra nézve specifikus aktivitása 9 ^egység/mg.

A találmány szerinti új alkalikus proteáz nukleotid szekvenciáját, mely a Bacillus sp. DSM 14392-ből származik, az 1. számon adtuk meg. Ez 1125 bázispárból áll. Ez ebből levezetett aminosav szekvenciát szintén megadtuk (a szekvencia száma: 2). Ez 374 aminosavat jelent, melyet stopkodon követ. Az első 105 aminosav az érett fehérjén valószínűleg nem található meg, így előrelátható, hogy az érett fehérje hossza 269 aminosav.

Ahogy azt a 2. példában leírtuk, a kapott szekvenciát az általános adatbankokban lévő proteáz szekvenciákkal összehasonlítottuk (Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http://www.genebio.com/sprot.html) és GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)).

DNS szinten a teljes gén legközelebbi hasonlóságot három génnel mutatott: (1.) alkalikus elasztáz Bacillus Ya-B-vel (ID ELYA_BACSP) ez 98 %-os azonosságot jelent, (2.) Bacillus alkalophilus-ból izolált szubtilizin P92-vel (ID ELYA_BACAO), ez 69 %-os azonosságot, (3.) szubtilizin Sendai-val, melyet a Bacillus Sendai-ből (ID Q45522) mutattak ki, 66 %-os az azonosság).

Aminosav szinten a legközelebbi hasonlóságot a pre-proteinnel a következők mutatták: (1.) Bacillus Ya-B (1D ELYA_BACSP) alkalikus elasztázzal, 98 %-os azonosság, (2.) Bacillus atkalophilus-bó]. izolált szubtilizin P92-vel (ID

ELYA_BACAO), ez 80 %-os azonosságot, (3.) Bacillus Sendai (ID Q45522) szubtilizin Sendai-val 69 %-os mértékben.

Aminosav szinten az érett fehérjével a legközelebbi hasonlóságot a következők mutatták: (1.) Bacillus Ya-B (ID ELYA_BACSP) alkalikus elasztázzal, 99 %-os azonosság, ez azt jelenti, hogy csak három aminosavban tértek el a kódoló területen (2.) mindkét szubtilizin: a szubtilizin P92 a Bacillus alkalopnilus-ből (ID ELAYA_BACLE) és a szubtilizin 309 (Savinase®) a Bacillus lentus-ból (ID SUBS_BACLE), 83 %-os azonosságot mutat, (3.) a B. lentus alkalikus proteáz a Bacillus lentus-ból (DSM 5483) (ID SUBB_BACLE), melynél az azonosság 82 %.

A további hasonló enzimeket a 2. táblázatban (2. példa) foglaltuk össze, és az 1. ábra szerinti elrendezésben az érett fehérje aminosav szekvenciájával hasonlítottuk össze, amelyet a találmány szerinti a Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből nyertünk.

A megadott többi szubtilizineknél felismert összhang és rokonság alapján az alkalikus proteázokat szubtilizinnek tekintjük.

A találmány egyik tárgyköre ezért azokkal az aminosav szekvenciával rendelkező szubtilizin típusú proteázokkal foglakozik, melyek a 2. szekvenciaszámon megadott aminosav szekvenciával legalább 98,1 %-ban azonosak.

Ide előnyösen azok tartoznak, melyek aminosav szekvenciája a 2. számon megadott aminosav szekvenciával legalább a következő mértékben azonosak: 98,2-100 %-ig tizedszázalékonként.

Ezért elvárható, hogy ezek tulajdonságai a Bacülus sp. (DSM 14392) alkalikus proteázzal nagymértékben azonosak.

Ahogy azt már említettük, az N-terminális szekvenciák összehasonlítása alapján az 1-105. aminosavak valószínűleg a vezető-szekvenciát adják, míg az érett fehérje a 2. szekvencia 106-374. helyzetéig terjed. A 375. helyzetben stopkodon található, mely nem kódol aminosavat. Mivel az egyes kódoló területek végei is az aminosav szekvencia fontos területei lehetnek, ezért ezek a helyzetek a találmány szerinti érett fehérje részei.

A találmány egyik megvalósítási formája ezért mindazokra a szubtilizin típusú alkalikus proteázokra vonatkozik, melyek aminosav szekvenciája a 2. számon megadott szekvencia 106375-ig terjedő helyzeteiben legalább 98,9 %-ban megegyezik.

Ennek megfelelően különösen előnyösek azok a proteázok, melyek a 2. szekvencia 106-375. aminosavaival a következő százalékokban megegyeznek: 99-100 %-ig tizedszázalékonként.

Például a Bacillus sp. (DSM 14392) in vivo felszabadult proteolítikus fehérjéinek N-terminális szekvenálásával lehetővé válik olyan forma előállítása, mely nem a 2. szekvencia 105. és 106. helyzeteinél tartalmaz hasítóhelyet, hanem más helyeken, melyek a ténylegesen érett fehérje adatainak megfelel.

A találmány egyik tárgyköre szubtilizin típusú alkalikus proteáz, melynek nukleotid szekvenciája legalább 98,1 %-ban azonos az 1. számú szekvenciával, különösen a 2. szekvencia 106-375. helyzeteinek részterületén.

így különösen előnyösek, melyek az 1. számú nukleotid szekvenciával legalább a következő százalékokban megegyeznek: 98,2-100 %-ig tizedszázalékonként, különösen a 2. szekvencia 106-375. helyzeteinek részterületén.

Ezért elvárható, hogy azok a fehérjék, melyeket a fenti nukleinsavak kódolják, tulajdonságaikban a Bacillus sp. (DSM

14392) alkalikus proteázával, különösen érett formájával, megegyeznek. A következő megvalósítási formákra az is jellemző, hogy ezek a ténylegesen érett fehérjékre vonatkoznak, abban az esetben is, ha a fehérje hasítási helye a fentiekben megadottól eltér.

A találmány tárgyköreinek legtöbb előnyben részesített megvalósítási formájában valamennyi szubtilizin típusú alkalikus proteáz, melyek aminosav szekvenciáját egészében a 2. számon adtuk meg, előnyösen a 106-375 helyzetekben azonos, és/vagy ezek aminosav szekvenciája összességben a 1. nukleotid szekvenciából levezethető, előnyösen a 106-375 aminosavakat kódoló helyzetekben azonos.

így az újonnan talált és a találmánnyal biztosított Bacillus sp. (DSM 14392) alkalikus proteázzal foglakozunk.

Ez a technika jelenlegi állása szerint nem ismert. Ahogy azt a példákban megadtuk ez izolálható, előállítható és alkalmazható. Ahogy azt a példákban is dokumentáltuk, ez abban mutatkozik meg, hogy alkalmazása megfelelő szerben az erre a célra kialakított enzimek teljesítményét megközelíti, előnyösen ezen részben még túl is tesz.

A fejlesztéshez, különösen a mosószerekben alkalmazható proteázoknál, természetes, mikrobiálisan létrehozott enzimként szolgálnak ismert mutagén eljárásokhoz, mint például pontmutáció, fragmentképzés, deléció, inszerció vagy más fehérjékkel vagy fehérje részekkel való fúzió, vagy egyéb az alkalmazáshoz optimalizált kívánt módosítások. Az ilyen optimalizálás a technikai alkalmazási területeken releváns lehet, például a hőmérséklet a pH ingadozások, a redox állapot és/vagy egyéb behatások befolyásolásában. Szükség lehet például az oxidációval, a denaturáló szerekkel vagy a proteolítikus lebontással, vagy a savakkal, erősen lúgos feltételekkel szembeni ellenállóképesség befolyásolására, a kalciumionok vagy más faktorokkal mutatott érzékenység megváltoztatására, az immunogenitás vagy más allergén hatások csökkentésére.

Ehhez például megváltoztathatók a felületi töltést vagy a katalízist, vagy a szubsztrátkötésben résztvevő loopokat megcélzó pontmutációk [WO 00/36069 számú szabadalmi bejelentés]. Az utóbbiakról a szakirodalomban részletesen olvashatunk [WO 95/30011, WO 99/27082, WO 00/37599, WO 00/37621-től WO 00/37627-ig és WO 00/71683-tól WO 00/71691-ig]. Továbbá, különösen a genetikai módosítások eljárásai a következő szabadalmi bejelentésekben megtalálhatók [WO 92/21760 és WO 95/23221 számú szabadalmi bejelentések]. Ehhez kiindulást jelent az 1. ábrán feltüntetett elrendezés. Ez lehetővé teszi ismert enzimekből az érdeklődésre számot tartó a Bacillus sp-re (DSM 14392) vonatkozó helyzetek levezetését, és ismert eljárásokkal történő változtatásukat.

A mutagenezis eljárások azokon a nukleotid szekvenciákon alapulnak, melyet az 1. számon adtunk meg, ami előnyösen a találmány egyes tárgyköreiben bemutatott hasonló nukleotid szekvenciára vonatkozik. A megfelelő molekuláris biológiai eljárások a szakirodalomból ismertek [Fritsch és mtsai: Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, (1989)].

A különösen előnyben részesített megvalósítási formákban a pontmutációk a szóban forgó proteázok teljesítményének növeléséhez vezetnek, különösen a megfelelő szerben a mosó vagy tisztító teljesítmény tekintetében. A találmány példáiban megmutattuk, hogy a Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből izolált találmány szerinti fehérje jobb teljesítményű, mint a Savinase® enzim, vagy mint a Bacillus lentus alkalikus proteáza.

Ahogy az 1. ábra elrendezéséből levezethető, a Bacillus sp. (DSM 14392) proteáz a Bacillus Ya-B alkalikus elasztáztól három helyzetben eltér (melyről még nem írták le, hogy mosószerben vagy tisztítószerben alkalmazták volna): az 1. helyzetben (a találmány szerinti 1. szekvencia számozása alapján) M található, a 65. helyzetben Q helyett H, és 182. helyzetben T helyett S. így különösen előnyben részesítjük a fentiekben megadott oltalmi' területbe eső azon proteázokat, melyek egy vagy több ilyen aminnsav helyzetben a Bacillus sp (DSM 14392) proteázának megfelel.

A találmány további megvalósítási formáiban az összes fentiekben leírt, találmány szerinti szubtilizin típusú alkalikus proteáz, melyet fragmentálással vagy deléciós mutagenezissel vezettünk le, legalább a kiindulási molekula 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 343, 350 és

360 aminosavával megegyezik, az aminosav szekvencia elején közepén vagy végén, vagy amelyek kiindulási molekulával 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 343 és 360 aminosavban megegyeznek, az 1. szekvencia 1., 65. és/vagy 182. helyzetének megfelelő aminosav számozásnál.

Az 1. ábra elrendezéséből következik, hogy a Bacillus sp (DSM 14392) törzsből nyert érett proteáz aminosav szekvenciája a 2-22., 68-187. és 187-189. helyzeteiben a Bacillus Ya-B alkalikus elesztázanak szekvenciájával azonos. A találmány szerinti fragmentálással vagy deléciós mutagenezissel levezetett '**· * *”· lb **. - · · ·· ··! * .ί.. *T ·..· - I fehérje vagy fragmens tehát nagyobb, ismert proteázokkal nem azonos területekkel rendelkezik, vagy olyan, mely az 1., 65., előnyösen a 182 helyzetekben (az 1. szekvencia számozásának megfelelően) Μ, H és/vagy S aminosavakban eltér. Ezért az utóbbinak, ahogy azt a Bacillus alkalophilus (ELYA_BACAO) szubtilizinnal összevetettük, legalább 40 aminosav hosszúnak kell lennie. Mivel a legközelebb álló proteáz a 188. helyzetben az elrendezés számozása alapján S-t tartalmaz, ezért összességében 36 helyzetében a Bacillus sp. (DSM 14392) proteázával azonos.

A megnevezett fragmensek és deléciós változatok közül azok előnyösek, melyek a 2. szekvencia 106-375. aminosavaiban az érett fehérjével megegyeznek.

Ezért a 2. szekvencia fehérjéjéből vagy fragmenséből fragmentálással vagy deléciós mutagenezissel levezetett változatok közül azok különösen előnyösek melyek szekvencia azonossága százalékban a következők: 98,9 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %,99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, 99,9 % és 100 %.

A találmány szerinti fragmensek alatt értjük az összes olyan fehérjét vagy pepiidet, melyek kisebbek, mint a homológ fehérje, melyek szekvenciája a 1. vagy a 2. számon megadott szekvenciának megfelel, de amelyek megfelelő részszekvneciája egybe-vág. Ezek a fragmensek lehetnek például azok a dómén vagy töredék részek, melyek a doménnal nem egyeznek meg. Az ilyen fragmensek kedvező költséggel előállíthatok, melyek adott esetben a kiindulási molekula bizonyos hátrányos tulajdonságaival a továbbiakban nem rendelkeznek, melyek esetleg aktivitásukat csökkentik, vagy szabályozó mechanizmusukat., kedvező aktivitás-profiljukat kibontják. Az ilyen fehérje fragmensek nem csak bioszintetikusán, hanem z*. : .··. <· ’”· ³⁰ i például kémiailag is előállíthatok. A kémia szintézis például akkor előnyös, ha a szintézis elvégzése kémiai módosítással kapcsolt.

A fragmenseket alapvető hasonlóságuk miatt a deléciós mutációval kapott fehérjékhez is hozzárendelhetjük. A deléciós mutagenezis különösen jól alkalmazható a gátló területek eltávolítására. Eredményképpen a deléciók együtt járnak mind specializálódással, mind a fehérje felhasználási területének kiszélesedésével.

A természetes úton képződő fragmensek, előnyösen a deléciós mutációval kialakított fehérjék, megvizsgálhatok, a pre-profehérjékből kapott fehérje N-terminális aminosavainak és a szignál-peptidjének lehasításával. Az ilyen hasítási mechanizmust arra lehet például felhasználni, hogy segítségével bizonyos szekvencia tartományt, melyet a szignál-peptidázok felismernek, felismerjünk, ezzel a rekombináns fehérjékben specifikus hasítási helyet nyújtsunk. Ezzel a találmány szerinti fehérje in vitro aktiválását vagy dezaktiválását lehetővé tehetjük.

A találmány további megvalósítási formáinak mindegyike a fentiekben leírt találmány szerinti szubtilizin típusú alkalikus proteázokra vagy azok fragmenseikre vonatkozik, melyeket helyettesítéses mutagenezissel és/vagy legalább egy további fehérjével vagy fehérje fragmessel történő fúzióval állítunk elő.

A találmány szerinti kiméra fehérje legszélesebb értelemben proteolítikus aktivitással rendelkezik. Ez kialakítható a találmány szerinti fehérjéből származtatható molekularésszel vagy annak módosításával. A kiméra fehérje a fehérje teljes hosszát és a fentiekben igénybe vett területeket is magában foglalhatja. Az ilyen fúzió értelme például az, hogy a találmány szerint fuzionált fehérje részek segítségével egy adott funkciót vagy részfunkciót a fehérjébe bejuttathatunk vagy módosíthatunk. A találmány szempontjából lényegtelen, hogy a kiméra fehérje egyetlen polipeptid lánc vagy több alegységből áll. Az utóbbi alternatíva kivitelezése például transzláció utáni módosítással, vagy az első tisztítási lépésben az egységet alkotó kiméra polipeptid lánc több részre darabolásának elvégzésével lehetséges.

így például a szakirodalomban leírták [WO 99/57254 számú szabadalmi bejelentés], hogy a találmány szerinti fehérje vagy fehérje rész peptid-kapcsolóval vagy közvetlenül fúziós fehérjeként más fehérjékből származó kötődoménekkel, mint például cellulózkötő doménnel kialakítható, és ezzel a szubsztrát hidrolízise hatásosabban elvégezhető. Az ilyen kötődőmén proteáz törzsből is származhat a találmány szerinti fehérjék fehérje szubsztráton történő kötésének megerősítésére. Ez a helyi proteáz koncentrációt megnöveli, mely egyes alkalmazásban, például a nyersanyagok kezelésénél, előnyös lehet. Hasonlóképpen a találmány szerinti fehérjék más enzimekkel együtt, mint például amilázokkal vagy cellulázokkal kapcsolhatók, kettős funkció kialakítása érdekében.

Inszerciós mutációval nyerhető találmány szerinti fe-hérjék alatt azokat értjük, melyek lényegében azonosak a találmány szerint kialakított kiméra fehérjékkel. Ide tartoznak a szubsztitúciós változatok is, valamint azok is, melyeknél a molekula egyes területei más fehérjékből származnak.

Az inszerciós és helyettesítéses mutagenezis értelme a hibridképzésben mutatkozik meg, mivel így a találmány szerinti fehérje egyes tulajdonságai és funkciói más fehérje <ι · ' ** ·'”» ³² ** tulajdonságaival és funkcióival kombinálódnak. Ide tartoznak például a különböző proteázokból nyert részszekvenciák shuffling-jával vagy új kombinációival nyerhető változatok is. Ezzel olyan fehérjék nyerhetők, melyeket még ez idáig nem írtak le. Az ilyen technikák igen alapvető aktivitás módosításokat tesznek lehetővé.

Előnyösen az ilyen mutációs megoldások statisztikus jellegű helyspecifikusan irányított evolúciós eljárásokat jelentenek, mint például a StEP módszer [Zhao és mtsai: Nat. Biotechnoi., 16, 258-261 (1998)], a random priming rekombináció [Shao és mtsai: Nucleic Acids Res., 26, 681683(1998)], a DNS-shuffling [Stemmer: Nature, 370, 389391(1994)]; vagy rekurzív szekvencia rekombináció (RSR) [WO 98/27230, WO 97/20078, WO 95/22625 számú szabadalmi bejelentések], vagy a RACHITT [Coco és mtsai: Nat. Biotechnoi., _19, 354-359(2001)]. Célirányosan az ilyen eljárások a mutagenezist követő kifejezés után szelekcióval és szűréssel társulnak, a kívánt tulajdonságú változások felismeréséhez. Mivel ezek DNS szintű technikák, ezért a biológiai termeléshez kiindulási pontként a megfelelő géneket kell biztosítanunk.

Az inverziós mutagenezis, azaz egy részleges szekvencia megfordítása, a deléció egyik eltérő formája, mind deléciónak, mind inszerciónak is tekinthető. Az ilyen változatok ugyancsak célirányosan vagy véletlen módon hozhatók létre.

A mai napig előnyösek mindazok a fehérjék, fehérje fragmensek vagy fúziós fehérjék, melyek azzal jellemezhetők, hogy a fehérjék hidrolízisére képesek.

Ezeket a hivatalos enzim nómenklatúra szerint peptidázoknak nevezzük (Enzyme Nomenclature, (1992) IUBMB 3.4). Az ide

tartozó előnyös enzimek a következők: endopeptidázok, különösen a 3.4.21 csoportba tartozó szerin-proteinázok, a 3.4.22 cisztein-proteinázok, a 3.4.23 aszpartát-proteinázok és 3.4.24 metallo-proteinázok. Különösen előnyben részesítjük a szerin-proteinázokat (3.4.21), ide tartoznak a szubtilázok és különösen a szubtilizin [Siezen: Subtilases: Subtilisin-like Proteases, 75-95, Subtilisin enzymes, kiadó: Bott és Betzel, New York, (1996)]. Másrészt előnyös az IS-2 csoportba tartozó szubtilizin, az erősen alkalikus szubtilizin.

Itt az aktív molekula az inaktívval szemben előnyösebb, mivel például az alábbiakban megadott alkalmazási területeken különösen a kifejtett proteolízis fontos.

Szélesebb értelemben a fentiekben megvalósított fragmensek is proteolítikus aktivitással rendelkeznek, mintegy a szubsztráttal komplexet képeznek, vagy a hidrolízishez szükséges strukturális elemeket biztosítják. Előnyösek azok, melyeknél a hidrolízishez más fehérjéket is figyelembe kell venni, anélkül, hogy más további fehérje komponensek jelenlétét biztosítani kellene. Ez érinti az aktivitást, melyet a proteáz kifejthet; ami esetleg pufferanyagok, ko-faktorok stb. szükséges egyidejű jelenlétében érintetlen marad.

A fehérjék hidrolíziséhez a különböző molekula részek összjátéka a deléciós mutánsokban természetes körülmények között korábban fellép mint a fragmensekben és ez különösen a fúziós fehérjék esetében van így, mindenek előtt azoknál, melyek shuffling-gal megváltoztatott fehérjéből származnak. Amennyiben ezzel szélesebb értelemben a proteolítikus funkciót megőrizzük, módosítjuk, felbontjuk vagy előbb el is érjük, akkor deléciós változatokról van szó, ahogy a találmány szerinti fehérje fúziós ** I ·· ·· ³⁴ ι változatainál. A találmány tárgykörében ezek előnyben részesített képviselői lehetővé teszik a fehérje-szubsztrát hidrolízisét további fehérje komponensek jelenléte nélkül.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formába azok a kialakított fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy változatok tartoznak, melyek azzal jellemezhetők, hogy pótlólag származékká alakították.

Származék alatt azokat a fehérjéket értjük, melyek a kialakított fehérjék pótlólagos módosításával vezethetők le. Az ilyen módosítások például a következőkre hathatnak: stabilitás, szubsztrát specificitás vagy szubsztráton való kötődés erőssége, vagy enzimatikus aktivitás. Ezek arra is szolgálhatnak, hogy a fehérjék allergenitását és/vagy immunogenitását csökkentsék és ezzel például a bőr-összeférhetőségét növeljék.

Az ilyen származékképzés például történhet biológiai úton, a fehérje bio szintézise során a termelő gazdaszervezetben. Ennél a kis molekulatömegü vegyületek, mint például a lipidek vagy oligoszacharidok kapcsolása kiemelt jelentőségű.

A származékképzést azonban kémiai módszerekkel is elvégezhetjük, például az oldallánc átalakításával, vagy kovalens kötések kialakításával, mint például a fehérjéhez makromolekulák kapcsolásával. A kémiai módosításokat a szakirodalomban leírták [DE 4013142 számú szabadalmi bejelentés]. Például az enzim karboxil csoportjaihoz aminokat kapcsoltak, ezzel megváltoztatták a fehérje izoelektromos pontját [WO 95/26398 számú szabadalmi bejelentés], A találmány szerinti fehérjékhez bifunkciós makromolekulát kapcsolhatunk, mint például fehérjét. Például a szakirodalomban leírták [WO 99/57154-től WO 99/57159-ig, WO 00/18865 és WO 00/57155 számú szabadalmi bejelentések], hogy lehetőség van a találmány szerinti fehérje kapcsolón keresztül specifikus kötődoménnel látható el. Az ilyen származék mosó- és tisztítószerekbe különösen jól megfelel. Analóg módon [WO 00/01831 számú szabadalmi bejelentés] kapcsolón keresztül, különösen aminosav kapcsolón át, a találmány szerinti fehérjéhez proteáz inhibitor kapcsolható. Egyéb makromolekuláris vegyületek, mint például polietilénglikol kapcsolásával, a molekula tulajdonságai, mint például stabilitása, vagy bőr elviselhetősége, javíthatók. Az ilyen módosításokat kozmetikai alkalmazásokhoz a szakirodalomban leírták [5230891 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés].

A találmány szerinti fehérje származékok alatt széles értelemben ezen enzimek előállítását is értjük. A fehérjék kinyerése, feldolgozása, vagy elkészítése különböző más anyagokkal társulhat, például, melyek a termelő mikroorganizmusok tenyészetéből származnak. Például, a tárolási stabilitás növelésére fehérje adagolható bizonyos más anyagokkal együtt. A találmány tárgykörébe tartozik ezért a találmány szerinti összes fehérje előállítása is. Ez független a kérdéses készítmény kifejtett enzimatikus aktivitásától, vagy annak hiányától. Szükség lehet arra, hogy tárolás során az aktivitás kis mértékű, vagy ne legyen, és a proteolítikus aktivitás csak az alkalmazás időpontjában fejlődjön ki. Ez például a megfelelő kiegészítő anyaggal szabályozható. A szakirodalomban kiváltképp a proteáz készítmény proteáz inhibitoros formája ismert [WO 00/01826 számú szabadalmi bejelentés].

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában az összes fentiekben kivitelezett fehérje, fehérje fragmens vagy fúziós fehérje, azzal jellemezhető, hogy pótlólag stabilizált.

Ezzel a tárolás és/vagy az alkalmazás során, például a mosási folyamatban, a stabilitását úgy növeljük, hogy az aktivitás tovább fennmaradjon és ezzel erősödjön. A találmány szerinti proteázok stabilitása például polimer kapcsolásával növelhető. Az ilyen eljárásokat a szakirodalomban leírták [5230891 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés]. Ez azt igényli, hogy a fehérje, a megfelelő szerbe történő beadagolása előtt, kémiai kapcsolási lépésben az ilyen polimerrel kapcsolódjon.

Előnyösek azok a változtatások, melyek a stabilitást a molekula pontmutációival teszik lehetővé, mivel ez a fehérje kinyeréshez csatoltan további feldolgozási lépést nem igényel. Az ehhez megfelelő pontmutációk a szakirodalomban ismertek. így a 6087315 és a 6110884 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentések szerint a proteázok úgy stabilizálhatok, hogy bizonyos tirozincsoportokat más aminosavra kicserélünk. A további lehetőségek például a következők:

- Bizonyos aminosavak kicserélése prolinra [EP 583339 számú szabadalmi bejelentés];

- A molekula felületére polárosabb vagy töltöttebb csoportok felvitele [EP 995801 számú szabadalmi bejelentés];

- A fémionok kötésének megerősítése, különösen a kalciumkötőhely mutagenezisével [WO 88/08028 és WO 88/08033 számú szabadalmi bejelentések];

Az első leírás szerint egy vagy több kalcium-kötésben résztvevő aminosavat negatívan töltött aminosavra kell kicserélni; a

WO 88/08033 számú szabadalmi bejelentés szerint a kalciumkötő stabilizálásához legalább egy, az arginint/glicint követő pontmutációt kell kialakítani.

- Az 5453372 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés szerint a fehérje bizonyos mutációkkal a felületen ható denaturáló szerekkel szemben, mint például tenzidekkel szemben, megvédhető.

A további összehasonlítható lehetőségeket a szakirodalomban megadták [5340735, 5500364, 5985639 és 6136553 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentések].

A magas hőmérséklettel és a tenzidek hatásával szembeni stabilizálás egy másik lehetősége megtalálható a szakirodalomban [WO 92/21760 számú szabadalmi bejelentés], valamint stabilizálásra alkalmazzák az aminosavkicseréléseket is az N-terminális közelében [DE 10121463 és DE 10153792 számú szabadalmi bejelentések] a nem kovalens kölcsönhatások ellen a globuláris struktúra védelme érdekében.

Előnyösek azok a megvalósítási formák, melyeknél a molekula több módon stabilizált. Például a szakirodalomból megtudható [WO 89/09819 számú szabadalmi bejelentés], hogy több stabilizáló mutáció együttesen additív hatást fejt ki.

Az előnyben részesített megvalósítási formákba tartoznak mindazok a fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék vagy származékok, melyek azzal jellemezhetők, hogy legalább egy antigén determinánsa megegyezik a találmány szerinti fentiekben megadott fehérjével, fehérje fragmenssel, fúziós fehérjével vagy származékkal.

Mivel az enzimatikus aktivitást a fehérjék másodlagos felépítése és háromdimenziós tekeredése határozza meg, ezért elsőd leges struktúrájának egymástól nyilvánvalóan eltérő doménjei térbelileg messzemenő egybehangolt struktúrát építenek ki, és ezzel azonos enzimatikus viselkedést tesznek lehetővé. A másodlagos felépítés ilyen együtteseit rendszerint az antiszérumok egybehangolt antigén determinánsai vagy tiszta vagy monoklonális ellenanyagok ismerik fel. így immunkémiai keresztreakcióval az egymáshoz hasonló fehérjéket vagy származékaikat képesek vagyunk kimutatni, és egymáshoz hozzárendelni. Ezért a találmány oltalmai köre az olyan fehérjékre is vonatkozik, melyek elsődleges felépítésének homológiai értékei nem megfelelőek, ellenben immunológiai tulajdonságaik a fentiekben meghatározott találmány szerinti fehérjékhez, fehérje fragmensekhez, fúziós fehérjékhez vagy származékokhoz hozzárendelhetők.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában az összes fentiekben kivitelezett fehérje, fehérje fragmens vagy fúziós fehérje vagy származék, azzal jellemezhető, hogy természetes forrásból származik; előnyösen mikroorganizmusokból nyerhetők.

Ezek lehetnek például egysejtű élesztők, vagy baktériumok, mivel ezek többnyire sokkal egyszerűbben nyerhetők és kezelhetők mint a soksejtű szervezetek vagy a soksejtúekből levezetett sejttenyészetek; jóllehet ezek a specifikus megvalósítási formákban értelmet nyernek, és ezért a találmány oltalmi köréből elvileg nem zárhatók ki.

Bár lehetséges, hogy a természetben előforduló termelők a találmány szerinti enzimet képesek előállítani, mégis a továbbiakban meghatározott körülmények között csak kisebb tömegben fejezik ki, és/vagy a táptalajba bocsátják. De nem zárható ki, hogy a megfelelő környezeti körülmények vagy a további faktorok kísérletileg kiderítetők, ami a találmány szerinti fehérjék ipari termelésének befolyásolására ösztönözhet. Az ilyen szabályozó mechanizmus a biotechnológiai termelést célozhatja meg. Még ha ez nem is lehetséges, akkor is a hozzátartozó gén izolálására szolgálhat.

Ehhez különösen előnyben részesítjük a Gram-pozitív baktériumokat.

Mivel ezek külső membránnal nem rendelkeznek és a szekretált fehérjét közvetlenül a környező táptalajba adják le.

Különösen előnyösek a Gram-pozitív bélbaktériumok, a bacillusok.

A Bacillus proteázok kedvező tulajdonságaik miatt eleve különböző technikai alkalmazási lehetőségeket nyernek. Ide tartozik a magas hőmérséklettel szembeni bizonyos stabilitás, valamint az oxidáló és denaturáló szerekkel szemben kialakuló bizonyos stabilitás. Ezzel társul a mikrobiális proteázok biotechnológiai termelésében megmutatkozó nagy tapasztalat, mely például a kedvező klónozóvektorokra, a gazdasejt és a fertmentációs körülmények kiválasztására vagy a kockázatok mérlegelésére vonatkozik, mind például az allergiát kiváltó hatásra. Termelő szervezetként ehhez bacillusokat alakítottak ki, melyek különösen magas termelékenységet mutatnak az ilyen technikai folyamatokban. A tapasztalat, melyet a proteázok előállításában és alkalmazásában megszereztünk, a találmány szerinti további fejlesztések javára van. Ide tartozik például ezek kompatibilitása más kémiai vegyületekkel, mint például a mosóés tisztító szerek alkotórészeivel.

A bacillus fajok közül előnyben részesítjük a Bacillus sp-t, különösen a Bacillus sp. (DSM 14392) törzset.

Ezekből a találmány szerinti megvalósítási formák eredeti enzimei megkaphatok. Ezek szekvenciáit megadtuk és enzimatikus tulajdonságaikat a példákban leírtuk. Ezekből vagy ezen törzsek felhasználásával a változatok molekuláris biológiai standard módszerekkel, mint például PCR és közismert pontmutációs eljárásokkal kialakíthatók.

A feladat egy további megoldása, és ezzel a találmány tárgykörének egyik sajátja, a nukleinsavakat érinti, melyek a találmány fejlesztését szolgálják.

A nukleinsavak majdnem mindegyik jelenleg folyó molekuláris biológiai kutatás és fejlesztés, valamint fehérje termelés, kiindulási pontja. Ide tartozik kiváltképp a gének szekvenálása és a hozzájuk tartozó aminosav szekvenciák levezetése, ahogy a mutagenezis (lásd fenn) és a fehérjék kifejezése is.

A meghatározott tulajdonságú fehérjék fejlesztéséhez a mutagenezist fehérje tervezésnek is hívjuk. A tulajdonságok optimalizálásához további példákat csatoltunk. Az ilyen mutagenezis célirányos vagy véletlenszerű eljárásokkal valósítható meg, például a klónozott gén felismerésével és/vagy kiválasztásával (szűrés és szelekció) nukleinsav szondákkal történő hibridizáláson keresztül, vagy a géntermékek, fehérjék aktivitásának megállapításával. A találmány szerinti proteázok fejlesztése a szakirodalomban leírtaknak megfelelően végezhető [Bryan: Protein engineering Biochim. Biophys. Acta., 1543, 203-222(2000)].

így a találmány egyik tárgyköre azokra a szubtilizin típusú alkalikus proteázokra vonatkozik, melyek nukleotid szekvenciája az 1. számon megadott szekvenciával legalább 98,1 %-ban azonos, különösen a nukleinsav szekvencia 316-1125. aminosavainak területén.

Ide előnyösen azok tartoznak, melyek aminosav szekvenciája a 2. számon megadott aminosav szekvenciával legalább a következő mértékben azonosak: 98,2-100 %-ig tizedszázalékonként, különösen a 316-1125. helyzeteknek megfelelő nukleotidok területén. Az érett fehérjék helyzetei és a stopkodon helyzete a fentieknek megfelel.

Ezért elvárható, hogy ezeknek a nukleinsavak által kódolt fehérjéknek a tulajdonságai a Bacillus sp. (DSM 14392) alkalikus proteáz tulajdonságaival nagymértékben azonosak.

Ezen tárgykör további képviselői mindazon nukleinsavak, melyek a fentiekben leirt találmány szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot kódolják.

A nukleinsavak, melyek a fentieknek megfelelően kidolgozott, előnyös formákat kódolják, különösen jól alkalmazhatók, még mutagenezissel nyert nukleinsavaknál is.

Különösen azok a nukleinsavak tartoznak a találmány oltalmi körébe, melyek fehérje fragmenst kódolnak. Az ilyen oligonukleotidokat mindhárom olvasási keretben, valamint szensz és antiszensz irányban figyelembe vesszük. Ezek különösen polimeráz láncreakciónál (PCR) az alkalmazott nukleinsavak szintéziséhez kiindulási termékként alkalmazhatók, például a természetes szervezetből származó, rokon gén sokszorozásához. Ezek a PCR alapú shuffling eljárások a kimérák létrehozását is szolgálhatják. Oligonukleotidokon alapulnak más shuffling eljárások is, mint például a rekombináló ligálási reakció (RLR) [WO 00/09679 számú szabadalmi bejelentés], ami a véletlen vagy célra irányított fehérje fragmensek kiválasztásának felel meg. Anti * ·····» * ·· * ' · 4 ·♦ · szensz oligonukleotidok például a kifejezés szabályozásához is alkalmazhatók.

A fenti állításnak megfelelően a fentiekben leírt találmány szerinti nukleinsavak a következő esetekben előnyösek:

- Ha azzal jellemezhetők, hogy természetes forrásból nyerhetők, különösen mikroorganizmusokból.

- Ha azzal jellemezhetők, hogy a szóban forgó mikroorganizmus Gram-pozitív baktérium.

- Ha azzal jellemezhetők, hogy a szóban forgó Gram-pozitív baktérium bélbaktérium; és

- Ha azzal jellemezhetők, hogy a szóban forgó bacillus faj Bacillus sp., előnyösebben Bacillus sp. (DSM 14392) törzs.

A találmány egyik tárgya vektorok kialakítása, melyek az előzőekben említett nukleinsav területeket tartalmazzák, és különösen olyan nukleinsav területeket fognak át, melyek a megnevezett fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot kódolják

A találmánynak megfelelő nukleinsav felhasználásához, és ezzel különösen a találmány szerinti fehérje termelés előkészítéséhez a nukleinsavat megfelelő módon vektorokba ligáljuk. Ezeket a szakirodalomban korábban kimerítően leírták, és nagy számban és változatban mind klónozáshoz, mind kifejezéshez a kereskedelemben beszerezhetők. Ide tartoznak például a bakteriális plazmidok, a vírusokból vagy bakteriofágokból levezetett vektorok, vagy a túlnyomó részben szintetikus vektorok. Továbbá a sejttípusok szakirodalma szerint megkülönböztetünk különböző területekre kialakított vektorokat, például a Gramnegatív, Gram-pozitív baktériumok, gombák vagy magasabb rendű eukarióta vektorokat. Ezek például a molekuláris biológiai és biokémiai kutatásokhoz, valamint a szóban forgó gének vagy a hozzájuk tartozó fehérjék kifejezéséhez megfelelő kiindulási pontot jelentenek.

A találmány egyik megvalósítási formájában a találmány szerinti vektorok klónozó vektorok.

A klónozó vektorok a tárolás mellett, a biológiai sokszorozási, vagy a kérdéses gének szelekcióját biztosítják, a szóban forgó gének molekuláris biológiai jellemzését elősegítve. Egyidejűleg a szóban forgó nukleinsavak transzportálható és tárolható formáit adják és kiinduló pontot jelentenek azokhoz a molekuláris biológiai technikákhoz, melyek nem köthetők sejtekhez, mint például a PCR vagy az in vitro mutagenezis eljárások.

Hasonlóan előnyös a találmány szerinti expressziós vektorok alkalmazása.

Az ilyen expressziós vektorok alapja a megfelelő nukleinsavak biológiai termelő rendszerben történő realizálása, és ezzel a hozzátartozó fehérje termelése. Az előnyben részesített megvalósítási formákban ezek olyan expressziós vektorok, melyek a kifejezéshez szükséges valamennyi genetikai elemet magukon hordozzák, például a természetes, eredeti helyen lévő promotert, vagy olyan promotert, mely más szervezetből származik. Ezek az elemek például az úgynevezett expressziós kazettába rendezhetők. Alternatívaként, az egyes vagy mindegyik szabályozó elemet, mindig az adott gazdasejtnek megfelelően lehet kialakítani. Különösen előnyösek azok az expressziós vektorok, melyek a további tulajdonságokkal rendelkeznek, mint például optimális kópiaszám, a kiválasztott expressziós rendszerhez, különösen az, amely a gazdasejtnek legjobban megfelel (lásd lejjebb).

Előnyösen a magas kifejezési arányhoz a továbbiakban az szükséges, hogy a szóban forgó inszertált gén ne tartalmazzon nagyobb 5'- vagy 3'- nem kódoló területeket. Ilyen inszerteket például úgy kaphatunk, ha a kiindulási törzs kromoszómális DNS-ét statisztikusan kezeljük restrikciós enzmmel, majd a kapott fragmenseket szekvenálás után megfelelően felhasított expressziós vektorba integráljuk.

A találmány szerint kialakított expressziós vektor egyik példáját 2. ábrán mutattuk be, ami a 2. példa szerinti pAWA22. A további vektorok a szakirodalomban jártas szakemberek számára rendelkezésre állnak, és nagy számban a kereskedelemben vásárolhatók.

A találmány tárgykörének megfelelő sejtek, melyeket az előzőekben megneveztünk, a találmány szerinti nukleinsav területeket tartalmazzák, különösen azokat, melyek a találmány szerinti fehérjéket, fehérje fragmenseket, fúziós fehérjéket, vagy származékokat kódolják, előnyösen a fentiekben megnevezett találmány szerinti vektorokon.

Mivel ezek a sejtek a találmány szerinti fehérjék szintéziséhez szükséges genetikai információt tartalmazzák, ezért például a szóban forgó gének sokszorozása lehetővé válik, de biztosítja a mutagenezisét vagy transzkripcióját és transzlációját is, valamint a szóban forgó fehérje biotechnológiai előállítását. Ez a genetikai információ vagy extrakromoszómálisan vagy egyedi genetikai elemként, azaz bakteriális plazmidon helyezkedhet el, illetőleg a kromoszómába integráltan fordulhat elő. A megfelelő rendszer kiválasztása a következő tényezőktől függ, mint például a gének tárolásának módjától és időtartamától, előnyösen a szervezettől, vagy a mutagenezis vagy szelekció módjától. A technika jelenlegi állása szerint például a bakteriofágokat és ezek specifikus gazdasejtjeit - mutagenezistől függően - és a szelekciós eljárásaikat mosó szer-enzim fejlesztéséhez, a szakirodalomban leírták [WO 97/09446 számú szabadalmi bejelentés].

Előnyben részesítjük azokat a gazdasejteket, melyek az előzőekben leírt találmány szerinti fehérjét, fehérje fragmenseket, fúziós fehérjéket vagy származékokat képesek kifejezni, vagy ezek kifejezését képesek szabályozni, különösen az előzőekben leírt, találmány szerinti nukleinsav területeknél, miután ezeket a megnevezett expressziós vektorba beépítettük.

Mivel ezek a fehérjéket képző sejtek a biotechnológiai termelést lehetővé teszik, ezért a fentiekben leírt vektorok egyikének a szóban forgó gént megfelelő módon tartalmaznia kell, és ezek transzkripciójára, transzlációjára, valamint pótlólagos módosítására alkalmassá kell tenni.

Gazdasejtként a fehérje kifejezéséhez alapjában véve az összes szervezet megfelel, így prokarióta, eukarióta vagy Cyanophyta organizmus. Előnyben részesítjük azokat a gazdasejteket, melyek genetikailag jól kezelhetők, például expressziós vektorral végzett transzformálásuk után stabilan fennmaradnak, ilyenek például az egysejtes gombák vagy baktériumok. Ide tartoznak előnyösen azok a gazdasejtek, melyek jó mikrobiológiai és biotechnológiai kezelhetőséget mutatnak. Ez például vonatkozhat könnyű tenyészthetőségükre, jó szaporodó képességükre, táptalajjal szembeni igénytelenségükre és az idegen fehérje jó termelésére és kibocsátására. Előnyösen olyan laboratóriumi törzset választunk, melynek kifejezése jól szabályozható. Az ilyen törzsek a kereskedelemben vásárolhatók, vagy törzsgyújteményekből beszerezhetők. Elméletileg az összes találmány szerinti fehérje számos gazdaszervezetből kinyerhető. A technika jelenlegi állása szerinti széles választékból az optimális expressziós rendszert kell kiválasztanunk.

Különösen előnyösek azok a gazdasejtek, melyek maguk proteáz negatívok, és így a proteázokat nem bontják le. Ilyen a 2. példában alkalmazott Bacillus subtilis DB 104 törzs.

Az előnyben részesített megvalósítási formákban az ilyen gazdasejt aktivitása a megfelelő genetikai elem segítségével szabályozható, például kémia anyagok adagolásával, a tenyésztési körülmények megváltoztatásával, vagy a mindenkori sejtsürúségtől függően. Ez a szabályozható kifejezés a kérdéses fehérje igen gazdaságos termelését lehetővé teszi. Megfelelő esetben a gén, az expressziós vektor és a gazdasejt összhangban van egymással, így például a kifejezéshez szükséges genetikai elemek (riboszóma kötőhely, promotorek, terminátor szekvenciák) rendelkezésre állnak, illetve a kodonhasználat kielégítő. Például az utóbbi úgy optimalizálható, hogy a gén minden kodonját, melyek a szóban forgó gazdában csak nehezen transzlálódnak, olyanra cseréljük ki, mely a gazdában a leghatékonyabb.

így előnyben részesítjük azokat a gazdasejteket, melyek azzal jellemezhetők, hogy baktériumok, különösen olyanok, melyek az elkészített fehérjét a környezetbe kibocsátják.

A baktériumok generációs ideje rövid, és a tenyésztési körülményekkel szembeni igényük kicsi. így olcsó eljárások alakíthatók ki. Ehhez olyan baktériumokkal rendelkezünk, melyek fermentációs tapasztalata gazdag. A speciális termeléshez többféle Gram-negatív vagy Gram-pozitív szervezet megfelel, melyeknél a tápanyagforrásokat, termelési paramétereket, termelési időigényt kísérletileg kiderítették.

A Gram-negatív baktériumok, mint például E. coli, számos fehérjét a periplazmatikus térbe juttatnak. Ez speciális alkalmazásoknál előnyös lehet. A Gram-pozitív baktériumok, mint például a bacillusok, ezzel szemben a fehérjéket a környező táptalajba juttatják, melyből másik előnyben részesített megvalósítási formák alapján a találmány szerinti fehérjék tisztíthatok.

A WO 01/81597 számú szabadalmi bejelentésben olyan eljárást tettek közzé, mellyel elérték, hogy a kifejezett fehérjék a Gram-negatív baktériumokból is kijussanak. Az ilyen rendszerek a találmány szerinti fehérjék előállítására alkalmasak. így gazdasejtként előnyben részesítjük a következő fajokat Escherichia coli vagy Klebsiella, különösen a következő törzseket: E. coli JM 109, E. coli DH 100B, E. coli DH 12S vagy Klebsiella planticola (Rf). Ezek megfelelő mikrobiológiai módosításokat igényelnek, és/vagy megfelelő, a találmány szerinti vektorokba beépíthetők, a keletkező fehérje kibocsátása érdekében.

Gazdasejtként előnyösek azok a baktériumok, melyek azzal jellemezhetők, hogy Gram-pozitív típusúak, elsődlegesen a Bacillus nemzetségbe tartoznak, főleg a következő fajok: Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis vagy Bacillus alcalophilus.

A találmány egyik megvalósítási formája a Bacillus sp-t használja, különösen a Bacillus sp. (DSM 14392) törzset, a találmány szerinti fehérjék (homológ) kifejezéséhez. Mégis előnyben részesítjük a heterológ kifejezést. Ehhez előnyösek a bélbaktériumok, mivel termelési szempontból a Gram-pozitív baktériumok közül a legjobban jellemzett baktériumok. Ide tartoznak elsődlegesen a következő fajok: Bacillus licheniformis,

Bacillus amy [cliquefaciens, Bacillus subtilis vagy más fajok és a törzsek, valamint a Bacillus alcalophilus törzsei. Ezekkel a fajokkal például proteázok előállítását kezdték meg [WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés]. Ebben a szabadalmi bejelentésben számos lehetséges expressziós vektort tettek közzé. Ezek és az alkalmazott fajok azonos kodonhasználattal rendelkeznek, és hasonló szubtilizineket alakítanak ki, így a fehérjeszintézis lépései megfelelően szabályozhatók.

A további előny, hogy ezekkel az eljárásokkal a találmány szerinti fehérjék a gazdasejtben endogén úton keletkező szubtilizinekkel együtt nyerhetők. Az ilyen együttes kifejeződést a szakirodalomban leírták [WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés]. Adott esetben nincs szükség arra, hogy a gazdasejtet a természetesen előforduló proteáz génnel adott ideig vagy azzal egy időben inaktiválni kelljen (lásd fenn).

A további előnyben részesített gazdasejtek azok, melyek ügy jellemezhetők, hogy eukarióták, különösen azok, melyek a készülő fehérjét transzláció után képesek módosítani.

A megfelelő eukarióták a gombák, mint például az Actinomyceták vagy élesztők, mint például a Saccharomyces vagy a Kluyveromyces. A termofil gombák expressziós rendszerét a szakirodalomban leírták [WO 96/02653 számú szabadalmi bejelentés], Az ilyen rendszerek főleg a hőmérséklettúrő változatok kifejezésére felelnek meg. Az ilyen rendszerek módosításaihoz, különösen a fehérje szintézissel kapcsolatban, például a kis molekulatömegü vegyületek, mint például membrán horgonyzó részek, vagy oligoszacharidok kapcsolása tartozik. Az ilyen oligoszacharid módosítások például az allergiás hatás csökkentésében előnyösek lehetnek. Az ilyen sejtek természetes úton kialakí tott enzimeivel együtt történő kifejezése is előnyös lehet, mint például cellulázokkal.

A találmány egyik tárgyköre a találmány szerinti fehérjék előállítási eljárásaira vonatkozik.

így igényt formálunk a fentiekben leírt találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék vagy származékok előállításához alkalmazható minden egyes eljárásra, miután a fentiekben leírt, találmány szerinti nukleinsavakat a fentiekben leírt találmány szerinti vektorokba beépítettük és/vagy a fentiekben leírt találmány szerinti sejtekbe bejuttattuk.

Ide tartoznak például a kémiai szintézis eljárások, melyek különösen a rövid fragmensek esetében gazdaságosak.

Ezzel szemben, mégis előnyben részesítjük, a technika jelenlegi állása alapján kialakított, a fenti követelményeknek megfelelő molekuláris biológiai, mikrobiológiai, előnyösen biotechnológia előállítási eljárásokat. Ennélfogva a példák alapján a fentiekben megnevezett DNS és aminosav szekvenciák esetében, mint például, amelyek a megadott szekvencia protokollokból levezethetők, előnyösen az 1. és a 2. szekvenciákból, előnyösnek tartjuk a megfelelő oligonukleotidok és oligonukleotidoktól teljes génig terjedő szekvenciák, valamint fehérjék ismert molekuláris biotechnológiai módszerekkel történő szintézisét.

Kiindulva ismert szubtilizin termelő mikroorganizmusokból például a találmány példáira támaszkodva, további természetes szubtilizin termelők azonosíthatók és izolálhatok, melyek szubtilizin-gén- és/vagy aminosav szekvenciáját levezethetjük, és az itt megadott előírásoknak megfelelően továbbfejleszthetjük. Az ilyen baktériumfajok a megfelelő előállítási eljárásokkal tenyészthetők és alkalmazhatók. Analóg modellt, mely vektorok és új expressziós vektor fejlesztésére vonatkozik, a szakirodalomban leírtak [WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés]. A találmány megvalósítási formái, a hozzátartozó nukleinsav szekvenciák alapján, sejtmentes expressziós rendszerben is megvalósíthatók, melynél a fehérje bioszintézise in nitro elfogadható. A fentiekben már csatolt elemek mindegyike egymással kombinálható, a találmány szerinti fehérje előállítása érdekében. A találmány szerint elképzelhető, mindegyik fehérje több kombinációs lehetősége miatt, az előállítási lépések során, kísérletekkel az optimális eljárást mindegyik konkrét esetben ki kell dolgozni.

A találmány egyik sajátos tárgyköre olyan szerekre vonatkozik, melyek azzal jellemezhetők, hogy a fentiekben leírt, találmány szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot tartalmazzák.

Ezért az összes szer, különösen keverékek, receptúrák, oldatok, stb., ezek alkalmazhatósága a fentiekben leírt, találmány szerinti fehérjék fejlesztéséhez a találmány oltalmi körébe tartoznak. Az alkalmazási területnek megfelelően ezek lehetnek szilárd keverékek, például porok fagyasztva szárított vagy kapszulázott fehérjékkel, vagy gélképző, vagy folyékony formák. Előnyben részesítjük azokat a receptúrákat, melyek például pufferanyagokat, stabilizátorokat, reakciópartnereket, és/vagy proteáz kofaktorokat tartalmaznak, és/vagy más a proteázokkal szinergizmusba lépő alkotórészeket. Különösen azokra a szerekre gondolunk, melyek az alábbi csatolt alkalmazási területeken alkalmazhatók. A technika jelenlegi állását tükröző további felhasználási területeket a szakirodalomban leírták [Uhlig: Handbuch Industrial Enyzmes and their Applications, WileyVerlag, New York, (1998)].

Ezek a tárgykörök a mosó- és tisztítószerek előnyben részesített megvalósítási formáinak számítanak, melyek azzal jellemezhetők, hogy az előzőekben leírt találmány szerinti fehérjéket, fehérje fragmenseket, fúziós fehérjéket, vagy származékokat tartalmazzák.

Ahogy azt a találmány kiviteli példáiban bemutattuk, meglepetésünkre az állapítható meg, hogy különösen előnyös a Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből származó alkalikus proteáz, azaz mely a vadtípusú enzimtől abban különbözik, hogy a megfelelő mosó- és tisztítószer alkalmazásánál az ilyen célra kialakított enzimet mosó-, előnyösen tisztítószer teljesítményében megközelíti, vagy részben felül is múlja.

A találmány tárgykörében az összes elképzelhető tisztítószer fajtára gondolunk, mind koncentráltakra, mind hígítatlanul alkalmazott szerekre: ipari méretekben, mosógépbe vagy kézi- illetve tisztítómosáshoz adagolva. Ide tartoznak például a textíliákhoz, szőnyegekhez, vagy természetes rostokhoz adott találmány szerinti mosószerek. Ide tartoznak például a mosogatógépek mosogatószerei, vagy a manuális mosogatószerek, vagy a kemény felületek, mint például fém, üveg, porcelán, kerámia, csempe, vas, lakkozott felületek, műanyagok, fa vagy bőr, mosószerei, amennyiben a találmány szerinti tisztítószerben alkalmazzák. Mindegyik tisztítószer típus a találmány megvalósítási formáját jelenti, amennyiben a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék vagy származékok gazdagítják.

A találmány megvalósítási formái felölelik az összes napjainkban ismert technikát és/vagy az összes a találmány szerint nyújtott formát. Ide tartoznak például a szilárd, por, folyékony vagy pasztaszerú szerek, adott esetben akár többfázisban présel vagy nem préselt szerek, valamint ide tartoznak az extrudátumok, szemcsék, tabletták, valamint pouch-ok, akár nagy csomagokban, akár kisebb adagokban csomagolták.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti szer 1 grammjára nézve a találmány szerinti fehérjéből, fehérje fragmensből, fúziós fehérjéből vagy származékból 2 pg-160 mg-ot tartalmaz, előnyösen ez 5 pg-140 mgot, 20 pg-120 mg-ot, legelőnyösebben 50 pg-80 mg-ot.

Az ilyen szer proteáz aktivitását a szakirodalomban leírtaknak megfelelően meghatározhatjuk [Tenside, 7, 125-132 (1970)]. Ezt ennek megfelelően PE-ben (proteáz egységben) adjuk meg.

A találmány szerinti fehérje, fragmens, fúziós fehérje vagy származék mellett a találmány szerinti mosó- és tisztító szerben további alkotórészek fordulnak elő, mint például enzimstabilizálók, tenzidek, mint például nem ionos, anionos és/vagy amfoter tenzidek, és/vagy fehérítő anyagok, és/vagy kötőanyagok, és adott esetben további szokásos alkotórészek találhatók, melyeket a következőkben ismertetünk.

A nem-ionos tenzidek előnyösen az alkoxilezett, előnyösen etoxilezett, különösen a 8-18 szénatomos primer alkoholok és átlagban 1-12 mól etilén-oxid (EO) per mól alkohol felhasználásával készülnek, melyekben az alkoholcsoport lineáris vagy előnyösen a 2. helyzetben metilesen elágazó lehet, illetve a lineáris és a metilesen elágazó csoportúak keverékét tartalmazhatja, így szokásosan az oxoalkoholcsoportokban találhatók. Mégis különösen előnyösek az alkoholetoxilátok, melyek természetes eredetű 12-18 szénatomos lineáris alkoholokat tartalmaznak, mint például kókusz-, pálma-, faggyúzsír vagy oleilalkohol, és átlagban 2-8 mól alkoholból állnak. Az előnyben részesített etoxilezett alkoholok közé tartoznak például a 12-14 szénatomos alkoholok 3 EO-val vagy 4 EO-val, a 9-11 szénatomos alkoholok 7 EO-val, a 13-15 szénatomos alkoholok 3 EO-val, 5 EO-val, 7 EO-val vagy 8 EO-val, a 12-18 szénatomos alkoholok 3 EO-val, 5 EO-val vagy 7 EO-val és ezek keverékei, mint például a 12-14 szénatomos alkoholok 3 EO-val és a 12-18 szénatomos alkoholok 5 EO-val alkotott keverékei. A megadott etoxilezési fokok statisztikai középértékeket jelentenek, melyek a speciális termékeknél egy egész vagy egy törtszám lehet. Előnyösen az alkoholetoxilát egy bizonyos homológmegoszlást mutat (szűk tartományú etoxilátok, NRE). Ezeken a nem-ionos tenzideken kívül a zsíralkoholok több mint 12 EO-val is alkalmazhatók. Ezekre példák a faggyúzsíralkoholok 14 EO-val, 25 EO-val, 30 EO-val vagy 40 EO-val.

A nem ionos tenzidek egy további előnyben részesített osztálya, melyek vagy csak a magukban lévő nem ionos tenzidek vagy más nem ionos tenzidekkel kombinációban adagolhatok, a következők: alkoxilezett, előnyösen etoxilezett vagy etoxilezett és propoxilezett zsírsavalkilészterek, előnyösen az alkilláncban 1-4 szénatommal, ilyenek elsősorban a zsírsavmetilészterek.

A nem ionos tenzidek egy további osztálya, melyek előnyösen adagolhatok, az alkilpoliglikozidok (APG). Az alkalmazható alkilpoliglikozidok általános képlete: RO(G)_Z, ahol R jelentése primer egyenesláncú vagy metilesen elágazó, különösen a 2. helyzetben metilesen elágazó 8-22 szénatomos, előnyösen 12-18 szénatomos alifás csoport, és G jelentése 5-6 szénatomos glükozidegység, előnyösen glükóz. Az oligomerizáció foka, mely a monoglükozidok és oligoglükozidok megoszlását adja, 1-4,0 .::. Μ· o / között elfogadható, előnyösen 1,0 és 2,0 között és legelőnyösebben 1,1-1,4 között van. Az előnyben részesített alkilpoliglikozidiok lineárisak, tehát olyan alkilpoliglikozid, melyben a poliglikozilmaradék egy glukózán és az alkilcsoport az n-alkilcsoporton van.

Az aminoxid típusú nem-ionos tenzidek, például az N-kókuszalkil-N,N-dimetil-aminoxid és az N-faggyúalkil-N,N-dihidroxietil-aminoxid, valamint a zsírsavalkanolamidok is megfelelnek. Az ilyen nem-ionos tenzidek mennyisége előnyösen nem több mint az etoxilezett zsíralkoholokké, adott esetben nem több mint ezek fele.

A további megfelelő tenzidek a (II) általános képletü polihidroxizsírsavamidok:

R¹

R-CO-N-[Z] (II) ahol az RCO jelentéses 6-22 szénatomos alifás acilcsoport, R¹ jelentése hidrogén, 1-4 szénatomos alkil- vagy hidroxilalkilcsoport és [Z] jelentése egyenes vagy elágazó 3-10 szénatomos polihidroxialkilcsoport és 3 - 10 hidroxilcsoportból áll. A polihidroxizsírsavamidok esetében ismert anyagokról van szó, amelyek általában egyes redukáló cukrok ammóniával, alkilaminnal vagy alkanolaminnal reduktív aminálásával, és ezt követően zsírsavalkilészterrel vagy zsírsavkloriddal végzett acilezéssel megkaphatok.

A polihidroxizsírsavamidok csoportjához a következő általános képletú vegyületek tartoznak:

* · · %> ;*

R-CO-N-[Z] (III) ahol R jelentése egyenes vagy elágazó 7-12 szénatomos alkilvagy alkenilcsoport, R¹ jelentése egyenes vagy elágazó vagy ciklikus 2-8 szénatomos alkilcsoport vagy arilcsoport és R² jelentése egyenes vagy elágazó 1-8 szénatomos egyenes vagy elágazó vagy ciklikus alkilcsoport vagy arilcsoport vagy oxialkilcsoport, ahol Ci-4-alkil- vagy fenilcsoport előnyös, és [Z] jelentése lineáris polihidroxialkilcsoport, melynek alkillánca legalább két hidroxilcsoporttal szubsztituált, vagy ezen csoportok alkoxilezett, előnyösen etoxilezett vagy propoxilezett származékai.

Előnyösen [Z] egyes redukáló cukrok, mint például glükóz, fruktóz, maltóz, laktóz, galaktóz, mannóz vagy xilóz reduktív aminálásával kapható meg. Az N-alkoxi- vagy N-ariloxiszubsztituált vegyületek úgy állíthatók elő, hogy a zsírsavmetilészterekkel alkoxid katalizátorok jelenlétében a kívánt polihidroxizsírsavamiddá átalakítjuk.

Anionos tenzidként például a szulfonát és a szulfát típusúak használhatók. A szulfonát tenzidek közül előnyben részesítjük például a C₉.₁₃-alkilbenzolszulfonátokat, az oleinszulfonátokat, azaz az alkén- és a hidroxialkánszulfonátokat, mint például a diszulfonátokat, amelyeket például 12-18 szénatomos monoolefinekből, melyek a láncvégeken vagy annak belsejében kettőskötést tartalmaznak, gázformájú kéntrioxiddal történő szulfonálással, majd ezután a szulfonált termék lúgos vagy savas hidrolízisével kapunk. Azok az alkánszulfonátok is megfelelnek, melyeket például 12-18 szénatomos alkánokból szulfoklórozással vagy szulfoxidálással és végül hidrolízissel, illetve neutralizálással nyerhetünk. Hasonlóképpen az a-szulfozsírsav (észterszulfonát) észterek, például a kókusz- pálmamag- vagy faggyúzsírsavak α-szulfonált metilészterei, is megfelelnek.

Egy további alkalmas anionos tenzid a szulfatált zsírsav-glicerinészter. A zsírsavglicerinészterek alatt a mono-, di- és triésztereket, valamint ezek keverékeit értjük, amit monoglicerinből 1-3 mól zsírsav segítségével észterezéssel állítunk elő vagy a trigliceridek 0,3-2 mól glicerinnel történő átészteresítésével kapunk. Ráadásul az előnyben részesített szulfatált, 6-22 szénatomos telített zsírsavakból, mint például a kapronsav, a kaprilsav, a kaprinsav, a mirisztinsav, a laurinsav, a palmitinsav, a sztearinsav vagy a behénsav (dokozánsav) indulnak ki,.

Alk(én)ilszulfátként 12-18 szénatomos zsíralkoholok kénsav-félészterek alkáli, és különösen nátriumsói, például kókuszzsíralkohol, faggyúzsíralkohol, lauril-, mirisztil-, cetil- vagy sztearilalkohol vagy 10-20 szénatomos lánchosszúságú oxoalkoholok és ezek szekunder alkohollal alkotott félészterei előnyösek. Továbbá a megnevezett lánchosszúságú alk(én)ilszulfátok, melyek szintetikus, petrolkémiai alapokon előállított, egyenesláncú alkilcsoportot tartalmaznak, a zsírkémiai nyersanyagok vegyületeivel analóg lebontási gátlást mutatnak. Mosástechnikai szempontból a 12-16 szénatomos alkilszulfátok és a 12-15 szénatomos alkilszulfátok, valamint a 14-15 szénatomos alkilszulfátok érdekesek, és előnyben részesítettek. A 2,3-alkilszulfát is a megfelelő anionos tenzidek közé tartozik.

Azok a kénsavmonoészterek is előnyösek, melyeket 1-6 mól etilén-oxiddal etoxilezett egyenes vagy elágazó láncú 7-21 szénatomos alkoholokból, mint például a 2-metilesen elágazó 9-11 szénatomos alkoholokból, átlagban 3,5 mól etilén-oxiddal, vagy a

12-18 szénatomos esetében 1-5 mól EO-val készülnek. A kis mennyiségben már megmutatkozó magas habzási képességük miatt a tisztítószerekben csak kis mennyiségben, 5 tömeg%-ig, például 1-5 tömeg%-ban alkalmazzák.

A további alkalmas anionos tenzidek azok az alkilszulfoborostyánkősav-sók, melyeket szulfoszukcinátnak vagy szulfoborostyánkősavészternek is neveznek, és amelyek a szulfoborostyánkősav alkoholokkal, előnyösen zsíralkoholokkal alkotott monoésztereiből és/vagy diésztereiből és adott esetben etoxilezett zsíralkoholokból állítanak elő. Az előnyben részesített szulfoszukcinát 8-18 szénatomszámos zsíralkoholokat vagy ezek keverékét tartalmazzák. A különösen előnyben részesített megvalósítási formában a szulfoszukcinát egy zsíralkoholcsoportot tartalmaz, amelyet etoxilezett zsíralkoholokból vezethetünk le, amelyek maguk a nem-ionos tenzidek közé számítanak (leírásukat lásd lejjebb). Ráadásul, ezzel szemben, a szulfoszukcinát, melynek zsíralkoholcsoportja etoxilezett zsíralkoholból korlátozott homológmegosztással vezethető le, különösen előnyös. Épp úgy az is lehetséges, hogy előnyösen 8-18 szénatomos alk(én)illáncos alk(én)ilborostyánkősavat vagy annak sóját alkalmazzuk.

Anionos tenzidekként különösen a szappanok jönnek szóba. A megfelelők közé a telített zsírsavszappanok, mint például a laurilsav, mirisztilsav, palmintinsav, sztearinsav, hidrogénezett erukasav és a behénsav sói, valamint különösen a természetes zsírsavakból, mint például a kókusz-, pálmamagvagy faggyúsavakból levezetett szappankeverékek tartoznak.

Az anionos tenzidek, beleértve a szappanokat is, nátrium-, kálium- vagy ammóniumsó formákban, valamint oldható szerves bázisokként, mint például a mono-, di- vagy trietanol-amin, fordulhatnak elő. Előnyösen az anionos tenzidek nátrium- vagy káliumsó formákban, különösen nátriumsó formákban fordulnak elő.

A találmány szerinti mosó- és tisztítószerekben a tenzidek a kész szerre viszonyítva előnyösen 5-50 tömeg%-ban, előnyösebben 8-50 tömeg%-ban, és legelőnyösebben 8-30 tömeg%-ban fordulnak elő.

A találmány a következő fehérítőszereket tartalmazhatja. Fehérítő anyagként, a vízben H₂O₂-t szolgáltató vegyületek közül a következők különös jelentőséggel bírnak: nátrium-perkarbonát, nátrium-perborát-tetrahidrát és a nátrium-perborát-monohidrát. A további alkalmazható fehérítő szerek a következők: peroxopirofoszfát, citrátperhidrát, valamint a H₂O₂-t szolgáltató persav-sók vagy persavak, mint például a perszulfát, illetve a perkénsav. Alkalmazható a karbamid-preroxohidrát-perkarbamid, ami a következő képlettel írható le: H₂N-CO-NaH₂*H₂O₂. A szilárd felületek tisztításához elsősorban, például a gépi mosogatáshoz, a fehérítő szert a szerves fehérítő szerek csoportjából választják, ezek a textíliák esetében is alkalmazhatók. A tipikus szerves fehérítő anyagok közé a diacilperoxidok, mint például a dibenzoilperoxid, tartoznak. További tipikus szerves fehérítő szerek a peroxisavak, ahol például különösen az alkilperoxisavak és az arilperoxisavak nevezhetők meg. Az előnyben részesített képviselők a peroxibenzoesavak és ennek gyűrűben helyettesített származékai, mint például alkilperoxibenzoesavak, de a következők is ide tartoznak: peroxi-a-naftoesav és a magnézium-monoperftalát, az alifás vagy szubsztituált alifás peroxisavak, mint például a peroxilaurinsav, peroxisztearinsav, ε-ftálimidoperoxikapronsav (ftálimidoperoxi hexánsav, PAP), o-karboxibenzamidoperoxikapronsav, N-nonenilamidoperadipinsav és N-nonenilamidoperszukcinát, és az alifás és arilalifás peroxidikarbonsavak, mint például 1,12-diperoxikarbonsav, 1,9-diperoxiazelainsav, diperoxiszebacinsav, diperoxibrasszilsav, a diperoxiftálsavak, 2-decildiperoxibután-l,4-disav, N,N-tereftaloil-di(6-aminoperkapronsav).

A fehérítőszer mennyisége a mosó- és tisztító szerben 1-40 tömeg% és előnyösen 10-20 tömeg%, ahol előnyösen perborátmonohidrátot vagy perkarbonátot alkalmazunk.

A 60 °C -on vagy a felett végzett mosásoknál a jobb fehérítés elérése érdekében kizárólagos alkotórészként fehérítést biztosító aktivátorokat alkalmazhatunk. A fehérítést aktiválóként olyan vegyületet alkalmazhatunk, amelyek előnyösen 1-10 szénatomos, előnyösebben 2-4 szénatomos alifás peroxokarbonsavakat aa perhidrolízisnek megfelelő körülmények között, és/vagy adott esetben a szubsztituált perbenzoesavak adnak hozzá. A megfelelő anyagok azok, amelyek a megadott szénatomszámú O- és/vagy N-acilcsoportokat és/vagy adott esetben szubsztituált benzolcsoportot hordoznak. Előnyben részesítjük a többszörösen acilezett alkiléndiaminokat, különösen a tetraacetil-etiléndiamint (TAED), az acilezett triazinszármazékokat, különösen az l,5-diacetil-2,4-dioxo-hexahidro-l,3,5-triazint (DADHT), az acilezett glükolurileket, különösen a tetraacetilglükolurilt (TAGÚ), az N-acilimideket, különösen az N-nonanoilszukcinimidet (NOSI), az acilezett fenolszulfonátokat, különösen az n-nonanoil- vagy izononanoil-oxibenzolszulfonátot (n- illetve izo-NOBS), az acilezett hidroxikarbonsavakat, mint például a trietilO-acetilcitrát (TEOC), a karbonsavanhidrideket, különösen a ftálsavanhidridet, izatosavanhidridet és/vagy borostyánkősav anhidridet, karbonsavamidok, mint például N-metildiacetamid, glikolid, acilezett többértékű alkoholok, különösen triacetin, etilénglikoldiacetát, izopropenilacetát, 2,5-diacetoxi-2,5dihidrofurán és az egyik német szabadalomból [DE 196 16 693 és DE 196 16 767 számú szabadalmi bejelentések] ismert enolészterek, mint például acetilezett szorbitol és mannitol, előnyösen az EP 0 525239 szabadalmi bejelentésben közzétett keverékek (SORMAN), acilezett cukorszármazékok, különösen pentaacetilglükóz (PAG), pentaacetilfruktóz, tetraacetilxilóz és oktaacetlilaktóz, valamint acetilezett, adott esetben N-alkilezett glukamin, illetve glukonolakton, triazol, illetve triazolszármazékok és/vagy farokképző kaprolaktámok és/vagy kaprolaktámszármazékok, előnyösen N-acilezett laktámok, például N-benzoilkaprolaktám és N-acetilkaprolaktám, melyek a szakirodalomból ismertek [WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 és WO 95/17498 számú szabadalmi bejelentések]. A német DE 196 16 769 számú szabadalmi bejelentésből ismertek a hidrofilen szubsztituált acilacetálok, és a német DE 196 16 770 számú szabadalmi bejelentésben, valamint a WO 95/14075 számú szabadalmi bejelentésben leírt acillaktámok, melyeket szintén előnyben részesítünk. A német DE 4443 177 számú szabadalmi bejelentésből a hagyományosabb fehérítők kombinációi szintén alkalmazhatók. Hasonlóan a nitrilszármazékok, mint a cianopiridin, nitrilquat-ok, mint például az N-alkil-ammóniumacetonitrilek, és/vagy cianamidszármazékok alkalmazhatók. Az előnyben részesített fehérítő aktivátorok a következők: nátrium-4-(oktanoiloxi)-benzolszulfonát, nnonanoil- vagy izononanoiloxibenzolszulfonát (n- ill. izo-NOBS), undecenil-oxibenzolszulfonát (UDOBS), nátriumdodekanoiloxi benzolszulfonát (DOBS), dekanoil-oxibenzoesav (DÓBA, OBC 10) és/vagy dodekanoiloxibenzolszulfonát (OBS 12), valamint Nmetilmorfolinum-acetonitril (MMA). Az ilyen fehérítő aktivátorok szokásos módon a teljes összetételre nézve 0,01-20 tömeg%-ban, előnyösen 0,1-15 tömeg%-ben, még előnyösebben 1-10 tömeg%ban fordulhatnak elő.

A hagyományos fehérítő-aktiválókhoz vagy azok helyett úgynevezett fehérítő-katalizátorok adhatók a formatestekbe. Ezek közé a fehérítést erősítő átmeneti fémsók illetőleg átmeneti fémkomplexek tartoznak, mint például Μη-, Fe-, Co-, Ru- vagy Mosókomplexek vagy -karbonilkomplexek. Fehérítő-katalizátorként felhasználhatók a következők is: Μη-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, Vés Cu-komplexek N-t tartalmazó tripodális-ligandok, valamint Co-, Fe-, Cu- és Ru-amminkomplexek, amely vegyületeket a szakirodalomban közzétették [DE 197 09 284 A1 számú szabadalmi bejelentés]. A szakirodalom szerint acetonitril származékok [WO 99/63038 számú szabadalmi bejelentés] és fehérítő aktiváló átmenetifém-komplex vegyületek az amilázzal kombinációban fehérítő hatást fejtenek ki [WO 99/63041 számú szabadalmi bejelentés].

Rendszerint a találmány szerinti szer egy vagy több kötőanyagot tartalmaz, különösen zeolitot, szilikátot, karbonátot, szerves kötőanyagot, és ha alkalmazásuk ökológiai problémákkal nem jár, akkor a foszfátokat is tartalmazhat. Végül, az utóbbiak tisztítószerekbe a gépi mosogatáshoz előnyösen állományanyagok adhatók.

Az alkalmas kristályok a réteges nátriumszilikátok, melyek általános képlete a következő: NaMSi_xO_2x+1 H₂O, ahol M jelentése nátrium vagy hidrogénatom, x értéke 1,9 - 4 és y értéke 0 - 20 és előnyösen x értéke 2, 3 vagy 4. Az ilyen kristályos rétegszilikátokat például az EP 164514 szabadalmi bejelentésben leírták. Az előnyben részesített kristályos rétegszilikátok formájában M jelentése nátrium és x értéket 2 vagy 3. Mind a β-, mind az δ-nátriumdiszilikátot, Na₂Si₂Os yH₂O, előnyben részesítjük. A kereskedelemben például ilyen termék az SKS® (Fa. Clariant). Az SKS6® túlnyomó részben δ-nátrium-diszilikát, melynek képlete: Na2SÍ2O5*yH2O, míg az SKS-7® túlnyomó részben β-nátriumdiszilikát. Savval reagáltatva (például citromsav vagy szénsav) a δ-nátrium-diszilikátból kanemit keletkezik (NaHSÍ2Os*yH2O, amelynek kereskedelmi neve SKS-9® illetve SKS-10® (Fa. Clariant). Előnyös lehet ezen rétegszilikátok kémiailag módosított változatainak alkalmazása is. így például a rétegszilikát lúgossága megfelelően befolyásolható. A foszfáttal, illetve karbonáttal dotált rétegszilikát kristályfelépítése a δ-nátriumdiszilikáthoz viszonyítva más, gyorsabban oldódik és a δnátrium-diszilikáthoz képest kalcium-kötő képessége nagyobb, így a x Na2O * y S1O2 * z P2O5 összegképletü vegyületeket, melyekben az x és y tartalom arányában 0,35-0,6-ig, a x és z tartalom 1,75-1200 arányban és a y és z tartalom 4-2800 arányban változhat, a szakirodalomban közzétették [DE 19601 063 számú szabadalmi bejelentés]. A rétegszilikátok oldékonysága növelhető, különösen finomrészecskés rétegszilikátok alkalmazásával. A kristályos rétegszilikátok összetevői más alkotórészekkel együtt alkalmazhatók. Ide tartoznak különösen a cellulózszármazékok, melyek előnyösen szétesést biztosító hatást mutatnak és különösen mosószer tablettákban alkalmazhatók, valamint a polikarboxilezett vegyületek, mely közül például a cit romsavakat, illetve polimer polikarboxilátokat, például az akrilsavak kopolimereket nevezzük meg.

Az amorf nátriumszilikátok is alkalmazhatók, melyek Na₂O : SiO₂ arányszáma 1:2 és 1:3,3, előnyösen 1:2 és 1:2,8, és különösen előnyösen 1:2 - 1:2,6 között van, melyeknek oldódási késleltetésük van és másodlagos mosási tulajdonságokat mutatnak. Az oldódási késleltetés a hagyományos amorf nátriumszilikátokkal szemben különbözőképpen, például felületi kezeléssel, kompaundálással, kompaktálással/tömörítéssel vagy tülszárítással idézhető elő. A találmány tárgykörében amorf' alatt röntgenamorfot is értünk. Ez azt jelenti, hogy a szilikát a röntgendiffrakciós kísérletekben éles röntgenvisszaverődést nem ad, ami a kristályos anyagokra egyébként tipikus, hanem éppenséggel a szórt röntgensugár egy vagy több maximumot mutat, melyek szélessége a diffrakciós szög többszöröse. Mégis egészen jó képtulajdonságokhoz vezet, ha a szilikátrészecske az elektron-diffrakciós kísérleteknél elmosódott, de még éles diffrakciós maximumot ad. Ezt úgy magyarázhatjuk, hogy a mikrokristályos termék nagysága 10-től néhány száz nm-ig terjed, és ezek az 50 nm-es, és különösen a 20 nm-es maximumig előnyösnek számítanak. Az ilyen úgynevezett röntgenamorf szikilátokat, amelyek a hagyományos vízüveggel szemben lassabb oldódásúak, előnyben részesítjük. Különösen előnyben részesítjük a tömörített/kompaktált amorf szilikátokat, a kompaundált amorf szilikátokat és a túlszárított röntgenamorf szilikátokat.

Az alkalmazott finomkristályos, szintetikus és kötött vizet tartalmazó zeolit előnyösen a zeolit A és/vagy P. Zeolit P-ként a Zeolith MAP® (a Crosfield cég gyártmánya) különösen előnyös.

Megfelelő még a zeolit X is, vagy mint például az A, X és/vagy P keverékek. A kereskedelemben kapható és a találmányban előnyösen alkalmazható példák a következők: a zeolit X-ből és a zeolit A-ból a Co-kristályosított termék (körülbelül 80 tömeg% zeolit X), ez a CONDEA Augusta S.p.A. cég terméke, amelyet VEGOBOND AX® márkanéven forgalmaznak és a következő általános képlettel jellemezhető:

nNa₂0 (l-n)K₂0 · A1₂O₃ (2 - 2,5)SiO₂ · (3,5 - 5,5) H₂O

A megfelelő zeolit közepes részecskemérete kisebb, mint 10 pm (térfogati megoszlás; mérési módszer: Coulter Counter) és előnyösen 18-22 tömeg%, adott esetben 20 - 22 tömeg% kötött vizet tartalmaz.

Magától értetődő az is, hogy az általánosan ismert foszfátok mint kötőanyagok alkalmazása addig lehetséges, míg azok környezetvédelmi problémákat nem okoznak. A sok, kereskedelemben kapható foszfát közül a következők játszanak jelentős szerepet a mosó- és tisztítószerek ipari előállításánál: alkalifémfoszfátok, különösen a pentanátrium- illetve a pentakáliumtrifoszfát (nátrium, illetve kálium-polifoszfát).

Az alkálifémfoszfátok a foszforsavak különböző alkálifém(különösen a nátrium- és kálium-) sóinak összefoglaló elnevezése, amelyeknél a metafoszforsavak (HPO₃)_n és az ortofoszforsavak H3PO4 mellett nagyobb molekulatömegú képviselőket különböztethetünk meg. A foszfátok több előnnyel rendelkeznek. Alkáli hordozóként működnek, a mészkőlerakódást a különböző géprészekbe, illetve a mészkő inkrusztációt a szövetekbe gátolják és ezen kívül a tisztításban hatékonyak.

A nátrium-dihidrogénfoszfát, NaH₂PO₄, dihidrátként (sűrűsége 1,91 g/cm3, olvadási pontja 60 °C) és monohidrátként (sűrűség 2,04 g/cm³) fordul elő. Mindkettő fehér só, vízben könnyen oldódó por, melyek kristályvizüket hevítéssel elveszítik, és 200 °C-on gyenge savban difoszfátot adnak (dinátriumhidrogén-difoszfát, Na2H2P2O7), magasabb hőmérsékleten nátrium-trimetafoszfáttá (Na3P3O9) és Maddrell-féle sókká (lásd lejjebb) átalakulnak. A NaH2PO4 savas reakcióban akkor alakul ki, mikor a foszforsavat nátronlúggal pH 4,5 értékre állítják és a levet porlasztják. A kálium-dihidrogénfoszfát (primer vagy egybázisú kálium-foszfát, káliumbifoszfát, KDP), a KH2PO4, fehér só melynek sűrűsége 2,33 g/cm³, és olvadáspontja 253 °C [a kálium-polifoszfát szétesése és képződése (KPO3)x] és vízben könnyen oldódik.

A dinátrium-hidrogénfoszfát (szekunder nátrium-foszfát), Na₂HPO₄, színtelen vízben könnyen oldódó kristályos só. Vízmentes formában létezik, és vízben 2 mólnál (sűrűség 2,066 g/cm³, vízvesztés 95 °C-on), 7 mólnál (sűrűség 1,68 g/cm³, olvadáspont 48 °C, 5 H2O vesztéssel) és 12 mólnál (sűrűség 1,52 g/cm³, olvadáspont 35 °C, 5 H2O vesztés után), 100 °C-on vízmentessé válik és magasabb hőmérsékleten difoszfáttá alakul (Na₄P₂O₇). A dinátrium-hidrogénfoszfát foszforsav szódaoldatos semlegesítésével, fenolftalein indikátor jelenlétében, előállítható. A dikálium-hidrogénfoszfát (másodlagos vagy kétbázisú kálium-foszfát), K₂HPO₄, amfoter tulajdonságú fehér só, mely vízben könnyen oldódik.

A trinátrium-foszfát, tercier nátrium-foszfát, Na₃PO₄, színtelen kristály, dihidrátkánt sűrűsége 1,62 g/cm³ és olvadáspontja 73-76 °C (szétesik), dekahidrátként (ez megfelel 19-20 % P₂Os-nek) olvadáspontja 100 °C és vízmentes formában (ez megfelel 39-40 % P₂Os-nek) sűrűsége 2,536 g/cm³. A trinátrium-foszfát vízben alkalikus reakcióban könnyen oldódik, és pontosan 1 mol dinátrium-foszfát oldatból bepárolva előállítható. A trikálium-foszfát (tercier vagy hárombázisú kálium-foszfát), K3PO4, fehér, elfolyosodó szemcsés por, melynek sűrűsége 2,56 g/cm³, olvadáspontja 1340 °C, és vízben alkalikus reakcióval könnyen oldódik. Például a Thomas salak szénnel és kálium-szulfáttal történő melegítésével jön létre. Magas ára miatt a tisztítószer iparban a könnyebben oldódó, mégis nagyhatású kálium-foszfátot részesítik előnyben a nátriumvegyületekkel szemben.

A tetranátrium-difoszfát (nátrium-pirofoszfát), Na₄P₂O₇, vízmentes formában (sűrűsége 2,534 g/cm³, olvadáspontja 988 °C, de 880 °C-ot tüntetnek fel) és dekahidrátként fordul elő (sűrűsége 1,815-1,836 g/cm³, olvadáspontja vízvesztés után 94 °C). Mindkét anyag színtelen, vízben alkalikus reakcióban a kristályok oldódnak. A Na₄P2O₇ a dinátrium-foszfát 200 °C feletti hőmérsékletre hevítésével nyerhető, vagy foszforsavat szódával sztöchiometrikus arányban egyesítünk, és az oldatot porlasztással víztelenítjük. A dekahidrát komplexben lévő nehézfémsót tartalmaz és a víz keménységét csökkenti. A kálium-difoszfát (kálium-pirofoszfát), K₄P₂O₇, trihidrát formában létezik, színtelen higroszkópos porként, melyen sűrűsége 2,33 g/cm³, vízben oldódik, így pH értéke 1 %-os oldatban 25 °C-on 10,4.

A NaHaPO₄, illetőleg a KH2PO₄ kondenzációjával keletkező magas molekulatömegű nátrium- és kálium-foszfát, melynek ciklikus képviselője a nátrium- illetőleg a kálium-metafoszfát, és a láncképzö típusok, melyek esetében nátrium- illetve a kálium-polifoszfát különböztethető meg. Különösen az utóbbinál számos megnevezés ismeretes: olvadó vagy glükofoszfát, Graham-féle só,

Kurrol és Maddrel-féle só. Itt az összes magasabb nátrium és kálium-foszfátot együttesen kondenzált foszfátnak nevezzük.

A technikailag fontos pentanátrium-trifoszfát, Na₅P₃Oi₀ (nátrium-tripolifoszfát), vízmentes vagy 6 vizet tartalmazó, kristályosodó, nem higroszkópos, fehér vízben oldható só, melynek általános képlete a következő: NaO-[P(O)(ONa)-O]_n-Na, ahol n=3. Száz gramm vízben szobahőmérsékleten körülbelül 17 g, 60 °Con körülbelül 20 g, 100 °C-on körülbelül 32 g kristályvízmentes só oldódik; az oldat 100 °C kétórás melegítés után 8 %-ban hidrolízissel keletkező ortofoszfátot és 15 % difoszfátot tartalmaz. A pentanátrium-trifoszfát előállításánál a foszforsavat a szódaoldattal vagy nátronlúggal sztöchiometrikus arányban reakcióba hozzuk, és az oldatot porlasztással vízmentesítjük. A Graham-féle sóhoz és a nátrium-difoszfáthoz hasonlóan a pentanátrium-trifoszfát több oldhatatlan fémvegyületet tartalmaz (kálisókat stb.). A pentanátrium-trifoszfát K5P3O10 (káliumtripolifoszfát) például 50 tömeg%-os oldatban kerül forgalomba (> 23 % P2O5, 25 % K2O). A kálium-polifoszfátot a mosó- és tisztítószer iparban széles körben felhasználják. Továbbá nátrium-kálium-tripolifoszfátként is léteznek, melyeket éppen a találmány tárgykörében alkalmazunk. Ezek például akkor keletkeznek, ha a nátrium-trimetafoszfátot KOH-val hidrolizáljuk: (NaPO₃)₃ + 2 KOH Na₃K₂P3Oi₀ + H₂O.

Ezek a találmány szerint mint nátrium-tripolifoszfát, kálium-tripolifosztát vagy ezek keverékeként pontosan adagolhatok; a nátrium-tripolifoszfát és a nátrium-kálium-tripolifoszfát keverékek, a kálium-tripolifoszfát és a nátrium-kálium-tripolifoszfát keverékek, vagy a nátrium-tripolifoszfát és a kálium-tripolifoszfát és náttrium-kálium-tripolifoszfát keverékek szintén alkalmazhatók.

Szerves kötőanyagként a találmány szerinti mosó- és tisztítószerekbe különösen a polikarboxilátok vagy a polikarbonsavak, polimer polikarboxilátok, poliaszparaginsavak, poliacetálok, adott esetben oxidált dextrinek, továbbá szer kötőanyagok (lásd lejjebb), mint például foszfonátok adagolhatok.

A használható szerves vázanyagok példái a nátriumsó formában alkalmazható polikarbonsavak, mint például a citromsav, az adipinsav, a borostyánkősav, a glutársav, a borkösav, a cukorsavak, az aminokarbonsavak, a nitrilotriecetsav (NTA), hacsak az ilyen alkalmazások ökológiai szempontból nem kifogásolhatók, valamint az ezekből készült keverékek. Előnyben részesítjük a polikarbonsavak sóit, mint például a citromsavat, az adipinsavat, a borostyánkősavat, a glutársavat, a borkősavat, a cukorsavakat és az ezekből készül keverékeket.

Savak is adagolhatok. Kötőanyag hatásuk mellett tipikusan savasító komponensként szerepelhetnek, ezzel nemcsak a mosóés tisztítószereknél az alacsonyabb és közepes pH tartományok beállítását biztosítják, hanem a szokásos komponensek pH-értékét is. Ehhez különösen a rendszerre és a környezetre ártalmatlan savak alkalmasak, mint például citromsav, ecetsav, bórsav, almasav, tejsav, glikolsav, borostyánkősav, glutársav, adipinsav, glukonsav és ezek előnyös keverékei. De az ásványi savak is, mint például kénsav, vagy a lúgok, különösen ammonium- vagy alkálihidroxid, pH szabályozóként szolgálhatnak. Az ilyen szabályozók a találmány szerinti szerekben előnyösen nem több mint 20 tömeg%-ban, különösen 1,2-17 tömeg%-ban fordulhatnak elő.

C. *A *

Kötőanyagként további polimer polikarboxilátok is megfelelnek, melyek például a poliakrilsavak vagy a polimetakrilsavak alkálifémsói, például melyek viszonylagos molekulatömege 50070000 g/mol.

A polimer polikarboxilátnál megadott moltömegek a találmány szellemében a mindenkori savforma tömegközép értékére vonatkoznak, melyet alapvetően gélpermeabilitási kromatográfiával (GPC) határozunk meg UV detektálás mellett. A meghatározás belső poliakrilsav standarddal történik, mely strukturálisan a vizsgált polimerekkel rokonságban van, és közel megegyező molekulatömegü. Ezek lehetővé teszik, hogy a polisztirolszulfonsav standardként szolgáljon. Rendszerint a polisztirolszulfonsavakkal szemben mért moltömegek magasabbak mint a leírásokban megadottak.

A megfelelő polimer elsődlegesen poliakrilát, melynek molekulatömege előnyösen 2000-20000 g/mol. Kitűnő oldékonysága miatt a csoportból a rövidláncú poliakrilátok előnyösek, melyek moltömege 2000-10000 g/mol, és különösen előnyösen 3000-5000 g/mol.

Megfelelnek továbbá azok a kopolimer polikarboxilátok is, melyek különösen az akrilsavak metakrilsavakkal és az akrilsavak vagy metakrilsavak maleinsawal alkotott vegyületei. Különösen előnyös az akrilsav kopolimere maleinsawal, melyben az akrilsav 50-90 tömeg% és a maleinsav 50-10 tömeg%. Viszonylagos molekulatömege a szabad savra nézve általában 2000-70000 g/mol, előnyösen 20000-50000 g/mol, és különösen előnyösen 30000-40000 g/mol. A (ko)polimer polikarboxilátok vagy porban, vagy vízben kialakított oldatban adagolhatok. A szerben a (ko)po f · ·<κ

Λ u* * limer polikarboxilátok mennyisége 0,5-20 tömeg%, különösen 110 tömeg% lehet.

A vízoldékonyság javításához a polimerek allilszulfonsavakat, mint például alliloxibenzolszulfonsavakat és metallilszulfonsavakat monomerként tartalmazhatnak.

Különösen előnyben részesített, ha a biológiailag lebomló polimerek két eltérő monomer egységet tartalamaznak, például melyek az akrilsavak monomer sói, és a maleinsav, valamint a vinilalkohol, illetve a vinilalkohol származékai vagy az akrilsavak monomer sói, és a 2-alkilallilszulfonsavat, valamint cukorszármazékot tartalmaznak.

A további előnyben részesített kopolimerek monomerként előnyösen akroleint és akrilsavat/akrilsavsókat, illetve akroleint és vinilacetátot tartalmaznak.

Hasonlóan a további előnyben részesített kötőanyagok közé tartoznak a polimer aminodikarbonsavak, ezek sói vagy az ezekből levezethető vegyületek. Különösen előnyösek a poliaszparaginsavak, illetve ezek sói és származékai.

A további megfelelő kötőanyagok közé tartoznak a poliacetálok, melyek a dialdehidek polikarbonsavakkal adott reakciójában keletkeznek, melyek 5-7 szénatomosak, és legalább 3 hidroxilcsoporttal rendelkeznek. Az előnyben részesített poliacetálok dialdehideket, mint például glioxát, glutáraldehid, tereftálaldehid, valamint ezek keverékeit és polikarbonsavakat, mint például glükonsav és/vagy glukoheptonsav, tartalmaznak.

A további megfelelő szerves kötőanyagok a dextrinek, például a szénhidrátok oligomerjei, illetve polimerjei, melyek a keményítő részleges hidrolízisével állíthatók elő. Rendszerint a hidrolízist például savval vagy enzimmel katalizálhatjuk. Előnyösen a hidrolízis termék közepes moltömegű, 400-500000 g/mol. Ráadásul a poliszacharid dextróz ekvivalense (DE) előnyös, mivel DE értéke a 0,5-40, különösen a 2-30 tartományban található, ahol a DE az a szükséges tömeg, mely a poliszacharidok redukáló hatásához szükséges, összevetve a dextrózzal, melynél a DE = 100. Használható mind maltodextrin, melynek DE tartománya 320 közé esik, mind szárított glükózszirup, melynek DE tartománya 20-37 közé esik, mind az úgynevezett sárgadextrin és fehérdextrin, magasabb moltömegnél 2000-30000 g/mol között.

Az ilyen dextrinek oxidált származékait olyan oxidációs anyagokkal alakíthatjuk ki, melyek a karbonsavas reakciónál az oxidáláshoz a szacharidgyúrü legalább egy alkoholcsoportját biztosítják. Különösen előnyös szerves kötőanyagok a találmány szerinti szerekhez az oxidált keményítők, illetve ezek származékai, melyeket a szakirodalomban közzétettek [EP 472042, WO 97/25399 és EP 755944 számú szabadalmi bejelentések].

Az oxidiszukcinátok és a diszukcinátok más származékai is, előnyösen az etiléndiamindiszukcinát, megfelelő kötőanyagok. Ehhez előnyösen az etiléndiamin-N,N'-diszukcinát (EDDS) nátrium- vagy magnéziumsó formában fordul elő. Továbbá ebből a szempontból előnyös a glicerindiszukcinát és a glicerintriszukcinát is. Az adagolás megfelelő mennyisége a zeolittartalmúaknál és/vagy a szilikáttartalmúaknál 3-15 tömeg%.

A további alkalmazható szerves kötőanyagok közé tartoznak például az acilezett hidroxikarbonsavak, illetve ezek sói, melyek adott esetben lakton formában fordulhatnak elő, és amelyek legalább 4 szénatomot és legalább egy hidroxilcsoportot, valamint maximálisan két savcsoportot tartalmaznak.

A kötőanyagok további képviselői a foszfonátok alcsoportjába tartoznak. Ezek közül különösen előnyösek a hidroxialkán-, illetve az aminoalkánfoszfonátok. A hidroxialkánfoszfonátok közül az l-hidroxietán-l,l-difoszfonát (HEDP) különös jelentőséggel bíró kötőanyag. Ezt előnyösen nátriumsó formában adagoljuk, ahol a dinátriumsó semleges és a tetranátriumsó lúgos (pH 9). Aminoalkánfoszfonátként előnyösek a következők: etiléndiamintetrametilénfoszfonát (EDTMP), dietiléntriaminpentametilénfoszfonát (DTPMP), valamint ezek magasabb rendú homológjai. Ezeket előnyösen semlegesen reagáló nátriumsó formában adagoljuk, például az EDTMP hexanátriumsójaként, illetve a DTPMP hepta- és okta-nátriumsójaként. A foszfonátok osztályából ezért kötőanyagként előnyösen HEDP-t alkalmazunk. Az aminoalkánfoszfonátok ehhez kiemelkedő nehézfém kötési képességgel rendelkeznek. Ennek megfelelően, különösen ha a szer fehérítőt is tartalmaz, előnyösek lehetnek az aminoalkánfoszfonátok, különösen a DTPMP alkalmazása, vagy a megnevezett foszfonátok keverékeinek adagolása.

A fenti összes vegyület alkáliföldfémekkel komplexben kialakíthatók és kötőanyagként így alkalmazhatók.

Adott esetben a találmány szerinti szerekben a kötőanyagok 90 tömeg%-ig lehetnek jelen. Előnyösen 75 tömeg/o-ot tartalmaznak. A találmány szerinti mosószer kötőanyag tartalma 5-50 tömeg%. A találmány szerinti kemény felületek tisztítására szol-gáló tisztítószerekben, különösen a gépi mosogatógépeknél alkalmazottaknál, 5-88 tömeg% kötőanyag szerepelhet, amikor is az ilyen szerekben előnyösen vízben oldhatatlan kötőanyagot nem alkalmazunk. Egy előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti szer különösen az edények gépi tisztításához 20-40 tömeg% vízben oldódó szerves kötőanyagot, így 5 tömeg% alkalicitrátot, 5-15 tömeg% alkalikarbonátot és 20-40 tömeg% alkalidiszilikátot tartalmaz.

Az oldószer, mely a folyékony-gélképző mosó- és tisztítószer összetételekben szerepelhet, például a következőkből származhat: többértékú alkoholok csoportja, alkanolaminok vagy glikoléter, amennyiben a megadott koncentráció tartományban vízzel elegyíthető. Előnyösen az oldószert a következők közül választjuk ki: etanol, n- vagy i-propanol, butanolok, etilénglikolmetiléter, etilénglikoletiléter, etilénglikolpropiléter, etilénglikolmonon-butiléter, dietilénglikol-metiléter, dietilénglikoletiléter, propilénglikolmetil-, -etil- vagy -propil-éter, dipropilénglikolmonometil, vagy - etiléter, di-izopropilénglikolmonometil-, vagy -etiléter, metoxi-, etoxi- vagy butoxitriglikol, l-butoxietoxi-2-propanol, 3metil-3-metoxibutanol, propilén-glikol-t-butiléter valamint ezek elegyei.

A találmány szerinti folyékony-gélképzö mosó- és tisztítószerekben az oldószer mennyisége 0,1-20 tömeg%, előnyösen 15 tömeg%-nál kevesebb, és előnyösebben 10 tömeg%-nál kevesebb.

A találmány szerinti összetételek viszkozitásának beállítására töményítőszert, illetve töményítő rendszert adagolunk. Ezek a nagy molekulatömegű anyagok, melyek duzzasztó szerként ismertek, a folyadékot beszívják és megduzzadnak, és így végül sűrűn folyó valódi vagy kolloid oldatot alakítanak ki.

A megfelelő töményítőszer szervetlen vagy szerves polimer vegyület. A szervetlen töményítőszerek közé számítanak például a pohkieselsavak, agyagásványok, mint például zeolit,

4 kieselsavak és a bentonit. A szerves töményítőszerek a természetes polimerekből vezethetők le, melyek változtatható természetes polimerek és teljesen szintetikus polimerek lehetnek. Az ilyen természetes eredetű polimerek példái a következők: agar-agar, carrageen, tragantmézga, gumiarábikum, alginát, pektin, poliozok, guar-liszt, szentjánoskenyérfa magjának lisztje, keményítő, dextrin, zselatin és kazein. A változtatható természetes anyagok, melyek töményítőszerként alkalmazhatók, mindegyike a keményítők és a cellulózok módosított változatai. Például a következők ismertek: karboximetilcellulóz és más cellulózéterek, hidroxietil- és -propilcellulóz, valamint a maglisztéter. A teljesen szintetikus töményítőszerek példái a következők: polimerek, mint például poliakril- és polimetakril-vegyületek, vinilpolimerek, polikarbonsavak, poliéterek, poliiminek, poliamidok és poliuretánok.

A kész összetételre vonatkoztatva a töményítőszerek mennyisége 5 tömeg%, előnyösen 0,05-2 tömeg%, és legelőnyösebben 0,1-1,5 tömeg%.

A találmány szerinti mosó- és tisztítószerek adott esetben további szokásos alkotórészeket tartalmazhatnak: kibocsátószereket, elektrolitokat és további segédanyagokat, mint például optikai derítőszereket, fakulásgátló anyagokat, ezüstkorrózió gátlókat, színváltozást gátló anyagokat, habgátlókat, dörzsanyagokat, színanyagokat és/vagy illatanyagokat, valamint mikrobiális hatóanyagokat, és/vagy UV abszorbeáló anyagokat.

A találmány szerinti, texíliákat mosó szereket optikai derítőkkel, a diaminosztilbéndiszulfonsav származékokkal, illetve ezek alkálifém sóival, egészíthetjük ki. Megfelel például a 4,4'bisz(2-amino-4-morfolino-l,3,5-triazinil-6-amino)sztilbén-2,2'-di szulfonsav sója, vagy ezzel egyenértékű vegyület, ahol a morfolinocsoport helyett dietanolaminocsoport, metilaminocsoport, anilinocsoport vagy 2-etoxietilaminocsoport található. A további derítők típusai lehetnek a szubsztituált difenilsztirilek, például a 4,4'-bisz(2-szulfosztiril)-difenilek, a 4,4'-bisz(4-klór-3-szulfosztiril)-difenilek, vagy a 4-(4-klórsztiril)-4'-(2-szulfosztiril)-difenilek alkáli sói. Az előzőekben megnevezett optikai derítők elegyei is alkalmazhatók.

A szürkülésgátló anyagok feladata a textilrostokról lemosott szennyeződés szabadon úszó fázisba juttatása és ott tartása. Ide vízben oldódó kolloidok, legtöbbször természetes eredetű anyagok felelnek meg, mint például keményítő, enyv, zselatin, keményítő, cellulóz éterkarbonsavainak vagy éterszulfonsavainak sói vagy a cellulóz vagy keményítő kénsavészterei. A vízben oldható savas csoportú poliamidok alkalmazhatók erre a célra. Továbbá a fentiekben megnevezett keményítöszármazékok, mint például az aldehidkeményítők, is felhasználhatók. Az előnyben részesített cellulózéterek a következők: karboximetilcellulóz (Nasó), metilcellulóz, hidroxialkilcellulóz és kevert éterek, mint például metilhidroxietilcellulóz, metilhidroxipropilcellulóz, metilkarboximetilcellulóz és ezek keverékei, például a szerre vonatkoztatva 0,1-5 tömeg%-ban.

Az ezüstkorrózió védelem érdekében a találmány szerinti tisztítószerekben edény ezüstkorrózió gátlókat alkalmazunk. Ezek a szakirodalomban jártas szakemberek számára ismertek, ilyen például a benzotriazol, a vas(III)-klorid vagy a CoSO₄. A szakirodalomból ismert [EP 0 736 084 B1 számú szabadalmi bejelentés] az is, hogy az enzimek mangán-, titán-, cirkónium-, hafnium-, vanádium-, kobalt-, vagy cériumsóival és/vagy komp lexeivel együtt jól használhatók ezüstkorrózió elleni védelemre, ahol a megnevezett fémek II, III, IV, V vagy VI oxidációs fokúak. E vegyületekre példák a MnSO₄, V₂O₅, V₂O₄, VO₂, TiOSO₄, K₂TiF₆, Kr₂ZrFee, Co(NOs)₂, Co(NO3)3, valamint ezek keverékei.

A földet kiűző hatóanyagok vagy a földet kitaszító anyagok főleg polimerek, melyek mosószerben való használatukkor a fehérnemű rostoknak szennytaszító tulajdonságot kölcsönöznek, és/vagy a szokásos mosószer alkotórészek szennyleoldó képességét támogatják. Hasonló hatás érhető el tisztítószerekben alkalmazva a szilárd felületeken is.

Különösen hatékonyak és már régóta ismertek a földet kitaszító hatóanyagok, melyek a dikarbonsavak-, alkilénglikol- és polialkilénglikol-egységek kopoliészterei. Ide például a polietiléntereftalát és a polietilénglikol kopolimerei vagy kevert polimerei tartoznak [DT 16 17 141, és DT 22 00 911 számú szabadalmi bejelentések]. A szakirodalomban [DT 22 53 063 számú szabadalmi bejelentés] savas szerek ismertek, melyek többek között dibázisos karbonsavak és alkilén- vagy cikloalkilénpoliglikolt tartalmaznak. Ismeretesek etiléntereftalát és polietilénoxidtereftalát polimerek, melyeket mosószerekben alkalmaznak [DE 28 57 292, DE 33 24 258 és EP 0 253 567 számú szabadalmi bejelentések]. Az EP 066 944 számú szabadalmi bejelentés olyan szerre vonatkozik, mely etilénglikol, polietilénglikol, aromás dikarbonsavak és szulfonált aromás dikarbonsavak meghatározott arányú kopoliésztereit tartalmazza. A szakirodalomban [EP 0 185 427 számú szabadalmi bejelentés] ismertek végükön metilvagy etilcsoportokat tartalmazó poliészterek etilén- és/vagy propilén-tereftalát- és polietilénoxid-tereftalát-egységekkel, és olyan mosószerek, melyek az ilyen földet kitaszító polimert tartalmazzák. Az EP 0 241 984 számú szabadalmi bejelentés poliészterre vonatkozik, mely az oxietilén-csoportok és a tereftálsav egységek mellett szubsztituált etilénegységeket, valamint glicerinegységeket tartalmaz. A szakirodalomból [EP 0 241 985 számú szabadalmi bejelentés] ismert olyan poliészter mely az oxietilén-csoportok és tereftálsav egységeken kívül 1,2-propilén-, 1,2-butilén- és/vagy 3-metoxi-l,2-propiléncsoportokat, valamint glicerinegységeket tartalmaz és láncai C1-C4 alkilcsoportokkal záródnak. A szakirodalomból [EP 0 272033 számú szabadalmi bejelentés] ismeretesek 1-4 szénatomszámos alkil- vagy acilcsoporttal zárt poliészterek, melyek polipropiléntereftalát- és polioxietiléntereftalát egységeket tartalmaznak. Az EP 0 274 907 számú szabadalmi bejelentés szulfoetil végcsoporttal zárt tereftalát tartalmú földkibocsátó poliésztert ismertet. Az EP 0 357 280 számú szabadalmi bejelentés szerint a földkibocsátó poliészterek előállíthatok telítetlen végcsoportos szulfonálással terefthalát-, alkilénglikol- és poli-C2-4-glikol egységek segítségével. A WO 95/32232 számú szabadalmi bejelentés aromás szennyleoldó képességű poliészterekre vonatkozik. A szakirodalomból [WO 97/31085 számú szabadalmi bejelentés] ismert, hogy a pamuthoz nincs olyan több funkciós csoportot tartalmazó polimer, mely földkitaszító hatású lenne. Az első egység például kationos lehet a pamut felületi adszorpciójához, elektrosztatikus kölcsönhatásban, és a második egység hidrofób területet alakít ki, mely a hatóanyag megmaradását biztosítja a pamut-víz határfelületen.

A találmány szerinti, textíliákhoz használható szerekhez szmfakulást gátló anyagok adagolhatok, elösorban a következők:

polivinilpirrolidon, polivinilimidazol, polimer N-oxidok, mint például poly-(vinilpiridin-N-oxid) és a vinil-pirrolidon vinilimidazollal alkotott kopolimere.

A gépi tisztítóeljárásokhoz előnyös lehet a habgátlók alkalmazása. Habzásgátlóként alkalmasak például a természetes vagy szintetikus eredetű szappanok, melyek nagy része 18-24 szénatomszámos zsírsavak. A megfelelő nem tenzidszerű habzásgátlók például a szerves polisziloxánok és ezek mikrofinom, adott esetben szilánozott kieselsavaival adott keverékei, valamint paraffin, viasz, mikrokristályos viasz és ezek keverékei szilánozott kieselsavakkal vagy biszteariletiléndiamiddal. A különböző habzásgátlók keverékei is előnyösen alkalmazhatók, mint például a szilikonokból, paraffinokből vagy viaszokból állók. Előnyösen a habzásgátlók, különösen a szilikon és/vagy paraffin tartalmú habzásgátlók, szemcsések, vízben oldódnak, illetőleg a hordozóanyaghoz kötötten diszpergálhatók. Különösen a paraffinekből és biszteriletiléndiamidekből álló keverékek előnyösek.

A találmány szerinti kemény felületek tisztítására alkalmas tisztító szerek dörzshatású alkotórészeket tartalmazhatnak, különösen a következő csoportokból: kvarcliszt, faliszt, múanyagliszt, kréta és mikroüveggömbök, valamint ezek keverékei. A dörzsanyagok a találmány szerinti tisztítószerekben előnyösen nem több mint 20 tömeg%-ban, előnyösebben 5-15 tömeg%-ban fordulnak elő.

A szín- és illatanyagokat a mosó- és tisztító szerekbe a termék esztétikai hatásának javítására adagolunk, és a felhasználó számára a termék tipikus és összetéveszthetetlen látványának, valamint érzeteiének biztosítására. Parfümolajként, illetőleg illat anyagként szaganyag vegyületek, mint például észter, éter, aldehid, keton és szénhidrogén típusú szintetikus termékek, alkalmazhatók. Az észter típusú illatanyag vegyületek például a következők: benzilacetát, a fenoxi-etilizobutirát, p-terc-butil-ciklohexilacetát, linalilacetát, dimetil-benzil-karbanilacetát, fenil-etilacetát, linalil-benzoát, benzilformiát, etil-metil-fenilglicinát, allil-ciklohexilpropionát, sztirallilpropionát és benzilszalicilát. Az éterekhez számítanak például a benzil-etiléter és az Ambroxan, az aldehidekhez számítanak például a 8-18 C-atomos lineáris alkanálok, citrál, citronellál, citronellil-oxi-acetaldehid, ciklámenaldehid, Lilial és Bourgeonal, a ketonok közé tartoznak például a Jonone, α-izometilionon és metil-cedrilketon, az alkoholok közé például az anetol, citronellol, eugenol, geraniol, linalool, fenil-etilalkohol és a terpineol, a szénhidrogének közé főleg a terpének mint például a limonén és Pinen tartoznak. Mégis előnyben részesítjük a különböző illatanyagok keverékeinek használatát, melyek közösen vonzó, egyéni illatot biztosítanak. Az ilyen parfümolajokat természetes illatanyag keverékekből is megkaphatjuk, mint például növényi forrásokból, így fenyő-, citrus-, jázmin-, Patchouly-, rózsa- vagy Ylang-Ylang-olajból. Hasonlóképpen alkalmasak a muskotályzsája-olaj, kamillaolaj, szekfüolaj, mézfúolaj, mentaolaj, fahéjlevél-olaj, hársvirág-olaj, borókaolaj, vetive-olaj, olibanum-olaj, galbanum-olaj és labdanum-olaj, valamint naracs-olaj, neroliol, narancshéj-olaj és szantálfa-olaj. Általában a találmány szerinti fehérítő és színanyagok a teljes kiszerelés több mint 0,01 tömeg%-át, míg az illatanyagok legfeljebb 2 tömeg%-át alkothatják.

Az illatanyag közvetlenül beépíthető a találmány szerinti szerbe, de az is előnyös lehet, ha az illatanyagot a hordozóra hordjuk fel, mellyel a parfümök felületi tapadását a fehérneműn megerősítjük és ezzel a textíliából hosszabb illat-felszabadulást érünk el. Az ilyen hordozó anyagok közé például a ciklodextrin választható, ahol a ciklodextrin-parfüm komplex pótlólagosan még további segédanyagokkal rétegezhető. Egy további illatanyag hordozó a későbbiekben leírt zeolit X, melynek alkalmazása a tenzides keverékekkel és az illatanyagokkal egyaránt lehetséges.

Az előnyben részesített színanyagok, azok kiválasztása a szakirodalomban jártas szakemberek számára minden nehézség nélkül megtehető, melyek közül előnyös azok kiválasztása, melyek tárolási stabilitása és érzékenysége a szokásos alkotórészekhez képest magas, és a texilrostokat érő fénnyel, valamint behatásokkal szemben ellenállóak, miközben nem színező hatásúak.

A mosó- és tisztítószerek a mikroorganizmusok ellen antimikrobiális hatóanyagokat tartalmazhatnak. Itt a hatásmechanizmus és spektruma alapján megkülönböztetünk bakteriosztatikus és baktericid anyagokat, fungisztatikumokat és fungicideket és így tovább. E csoport fontos anyagai például a következők: benzalkoniumklorid, alkilarilszulfonát, halogénezett fenol és fenolmerkuriacetát. Az antimikrobiális hatás és az antimikrobiális hatóanyagok jelentése a találmányban a szakirodalomban jártas szakemberek számára nyilvánvaló [Wallháufter: Praxis dér Sterilisation, Desinfektion -Konservierung: Keimidentifizierung Betriebshygiene (5. kiadás) Stuttgart; New York : Thieme, (1995)], melyben leírt összes antimikrobiális hatású vegyületet alkalmazása a találmányban elképzelhető. A megfelelő antimikrobiális hatóanyagot előnyösen a következő csoportokból választjuk ki: alkoholok, aminok, aldehidek, antimikrobiális savak, illetőleg ezek sói, karbonsavészterek, savamidok, fenolok, fenolszármazékok, difenilek, difenilalkánok, karbamidszármazékok, oxigén- és nitrogén-acetálok, valamint formiátok, benzamidin, izotiazolin, ftálimidszármazékok, piridinszármazékok, antimikrobiális felületaktív vegyületek, guanidin, antimikrobális amfoter vegyületek, kinolinok, l,2-dibróm-2,4-dicianobután, jód-2-propilbutil-karbamát, jód, jodoforok, peroxo-vegyületek, halogénvegyületek, valamint az előzőek keverékei.

Az antimikrobiális hatóanyagokat a következők közül választhatjuk ki: etanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butándiol, fenoxietanol, 1,2-propilénglikol, glicerin, undecilénsav, benzoesav, szalicilsav, dihidroecetsav, o-fenilfenol, N-metilmorfolinacetonitril (MMA), 2-benzil-4-klórfenol, 2,2'-metilén-bisz-(6-bróm4-klórfenol), 4,4'-diklór-2'-hidroxidifeniléter (Dichlosan), 2,4,4'triklór-2'-hidroxidifeniléter (Trichlosan), klórhexidin, N-(4klórfenil) - N- (3,4 - diklórfenil) -karbamid, N, Ν' - (1,10- dekán-diildi-1 piridinil-4-ilidén)-bisz-(l-oktánamin)-dihidroklorid, N,N'-bisz-(4klórfenil)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradekándiimidamid, glukoprotaminok, antimikrobiális felületaktív kvaterner vegyületek, guanidinek, beleértve a bi- és poliguanidineket, mint például l,6-bisz-(2-etilhexil-biguanido-hexán)-dihidroklorid, 1,6di-(Ni,Ni'-fenildiguanido-N₅,N₅’)-hexán-tetrahidroklorid, 1,6-di(Ni, N i '-fenil-N i, Ni '-metildiguanido-N₅, N₅')-hexán-dihidroklorid, l,6-di-(Ni,Ni'-o-klórfenildiguanido-N5,N₅')-hexán-dihodroklorid, l,6-di-(Ni,Ni'-2,6-diklórfenildiguanido-N5,N₅jhexán-dihidroklorid, l,6-di-[Ni,Ni'-béta-(p-metoxifenil)diguanido-N5,N5']-hexán-dihidroklorid, l,6-di-(Ni,Ni'-alfa-metil-béta-fenildiguanido-N5,Ns')hexán-dihidroklorid, l,6-di-(Ni,Ni'-p-nitrofenildiguanidoN₅, N₅ jhexán-dihidroklorid, omega: omega-di- (Ni, N i '-fenildigua nido-N₅,N₅')-di-n-propiléter-dihidroklorid, omega:omega'-Di(Ni,Ni'-p-klórfenildiguanido-N5,N5j-dhn-propiIéter-tetrahidroklorid, l,6-di-(Ni,Ni'-2,4-diklórfenildiguanido-N₅,N5’)hexán-tetrahidroklorid, l,6-di-(Ni,Ni'-p-metilfenildiguanido-N5,N5jhexán-dihidroklorid, l,6-di-(Ni,Ni'-2,4,5-triklórfenildiguanido-N5,Ns')hexántetrahidroklorid, l,6-di-(Ni,Ni'-alfa-(p-klórfenil)etildiguanidoN5, Ns')hexán-dihidroklorid, omega: omega-di-(N1,N1' -p-klórfenildiguanido-N5,N5')m-xilén-dihidroklorid, l,12-di-(Ni,Ni'-p-klórfenildiguanido-N5,N5') dodekán-dihidroklorid, 1,10-di-(Ni,Ni'-fenildiguanido-N5,NsJ-dekán-tetrahidroklorid, 1,12-di-(Ni,Ni'-fenildiguanido- Ns,Ns')-dodekán-tetrahidroklorid, l,6-di-(Ni,Ni'-oklórfenildiguanido-N₅,N₅')-hexán-dihidroklorid, l,6-di-(Ni,Ni'-oklórfenildiguanido-NsjNsj-hexán-tetrahidroklorid, etilén-bisz-(ltolil-biguanid), etilén-bisz- (p-tolil-biguanid), etilén-bisz- (3,5-dimetilfenilbiguanid), etilén-bisz-(p-terc-amilfenilbiguanid), etilénbisz- (nonilfenilbiguanid), etilén-bisz- (fenilbiguanid), etilén-bisz(N-butilfenilbiguanid), etilén-bisz(2,5-dietoxifenilbiguanid), etilénbisz(2,4-dimetilfenilbiguanid), etilén-bisz(o-difenilbiguanid), etilén-bisz(kevert amil naftilbiguanid), N-butil-etilén-bisz(fenilbiguanid), trimetilén-bisz(o-tolilbiguanid), N-butil-trimetilbisz-(fenilbiguanid) és ezek mefelelő sói, mint például acetát, glukonát, hidroklorid, hidrobromid, cifrát, biszulfit, fluorid, polimaleát, N-kokozalkilszarkozinát, foszfit, hipofoszfit, perfluorooktanoát, szilikát, szorbát, szalicilát, maleát, tartrát, fumarát, etiléndiamin tetraacetát, iminodiacetát, cinnamát, tiocianát, arginát, piromellitát, tetrakarboxibutirát, benzoát, glutarát, monofluorfoszfát, perflorpropionát, valamint kívánt keverékei. A további megfelelő anyagok a következők lehetnek: halogénezett xilol- és krezolszármazékok, mint például p klórmetakrezol vagy p-klór-metaxilol, valamint természetes növényi eredetű antimikrobiális hatóanyagok (például fűszerekből vagy lágyszárúakból), állati, valamint mikrobiális eredetűek. Előnyösen az antimikrobiálisan ható felületaktív kvaterner vegyületek természetes növényi eredetű antimikrobiális és/vagy természetes állati eredetű antimikrobiális anyagok, ahol különösen előnyben részesítjük azokat a növényi eredetű antimikrobiális hatóanyagokat, melyek a következő csoportba tartoznak: koffein, teobromin és teofillin, valamint éterezett olajok, mint például eugenol, timol és geraniol, és/vagy legalább egy természetes állati eredetű antimikrobiális hatóanyagot tartalmaznak, mely a következő csoportba tartozik: tejből nyert fehérje, lizozim és laktoperoxidáz, és/vagy legalább egy antimikrobiálisan ható felületaktív kvaterner vegyületet tartalmaznak, mint például ammonium-, szulfónium-, foszfónium-, jodónium- vagy arzóniumcsoportal rendelkeznek, peroxovegyületek és klórvegyületek. A mikrobiális eredetű, úgynevezett bakteriocin vegyületek szintén alkalmazhatók.

Antimikrobiális hatóanyagként megfelelő kvaterner ammonium vegyületek általános képlete a következő (R¹)(R²)(R³)(R⁴)N⁺X-, ahol R!-R⁴ jelentése azonos vagy eltérő 1-22 szénatomszámos alkilcsoport, 7-28 szénatomszámos ar alkilcsoport vagy heterociklikus csoport, ahol két vagy aromás kötés, mint például piridin esetében akár három csoport a heterociklus nitrogénjével kapcsolódik, a piridinium- vagy imidazolvegyüleknél, és X jelentése halogenidionok, szulfátionok, hidroxiionok vagy hasonló anionok. Az optimális antimikrobiális hatást előnyösen 8-18, különösen 12-16 szénatom közül legalább egy csoporttal biztosítjuk.

A QAV tercier aminná alakítható alkilezőszerrel, mint például metilklorid, benzilklorid, dimetilszulfát, dodecilbromid, de etilénoxiddal is előállítható. A tercier aminek alkilezése hosszabb alkilcsoporttal és két metilcsoporttal különösen könnyen elvégezhető, a tercier aminok kvaternerizálása pedig hosszabb csoportokkal és metilcsoporttal, metilkloriddal, enyhe reakciókörülmények között is elvégezhető. Aminok, melyek három hosszú alkilcsoporttal vagy hidroxi-szubsztituált alkil csoporttal rendelkeznek, kevésbé reaktívak, és előnyösen dimetilszulfáttal kvaternerizálhatók.

A megfelelő QAV-ok például a következők: benzalkóniumklorid (N-alkil-N,N-dimetil-benzil-ammóniumklorid, CAS No. 8001-54-5), Benzalkon B (m,p-diklórbenzil-dimetil-C12-alkilammóniumklorid, CAS No. 58390-78-6), Benzoxoniumklorid (benzil-dodecil-bisz-(2-hidroxietil)-ammónium-klorid); Cetrimoniumbromid (N-hexadecil-N,N-trimetil-ammóniumbromid, CAS No. 57-09-0), Benzetoniumklorid (N,N-dimetil-N-[2-[2-[p-(l, 1,3,3tetrametilbutil)-fenoxi]etoxi]etil]-benzilammóniumklorid, CAS No. 121-54-0), dialkildimetilammónium-klorid, mint például di-ndecil-dimetil-ammóniumklorid (CAS No. 7173-51-5-5), didecil-dimetilammóniumbromid (CAS No. 2390-68-3), dioktil-dimetilammóniumklorid, 1-cetilpiridiniumklorid (CAS No. 123-03-5) és Thiazoliniodid (CAS No. 15764-48-1) valamint ezek keverékei. Különösen előnyben részesítjük azok a QAV-okat, melyeknél a benzalkóniumklorid 8-18 szénatomszámos alkilcsoportokkal rendelkeznek, így különösen előnyös a 12-14 szénatomszámos alkilb enzil- dimetil- ammóniumklorid.

A benzalkóniumhalogenideket és/vagy a szubsztituált benzalkóniumhalogenideket a kereskedelemben beszerezhetjük, ilyenek például a következők: Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/ Sherex és Hyamine® ex Lonza, valamint Bardac® ex Lonza. További kereskedelemben kapható antimikrobiális hatóanyagok az N-(3-klórallil)-hexaminiumklorid, mint például a Dowicide® és a Dowicil® ex Dow, a benzetóniumklorid, mint például a Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, a metilbenzetóniumklorid, mint például a Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, a cetilpiridiniumklorid, mint például a Cepacolchlorid ex Merrell Labs.

Az antimikrobiális hatóanyagokat 0,0001-1 tömeg%-ban, előnyösen 0,001-0,8 tömeg%-ban, előnyösebben 0,005-0,3 tömeg%-ban, és legelőnyösebben 0,01-0,2 tömeg%-ban adagoljuk.

A szer UV abszorbeálókat tartalmazhat, melyek a kezelt textíliákat bevonják, és a rostok és az egyéb alkotórészek fénnyel szembeni tartósságát, vagy fénnyel szembeni tűrését javítják. Az UV-t abszorbeáló szerves anyagok (fényvédő szűrők) alatt azokat értjük, melyek az ultraibolya sugárzást abszorbeálják és a felvett energiát hosszabb hullámhosszon kibocsátják, például meleget, hőt sugároznak.

Az ilyen kívánt tulajdonságokkal rendelkező vegyületek például a benzofenonok sugárzással dezaktiváló hatású vegyületei és származékai, melyek 2- és/vagy 4-helyen szubsztituáltak. Továbbá a szubsztituált benzotriazolok is alkalmazhatók, melyek 3-as helyzetben fenilszubsztituált akrilátok, (fahéjsavszármazékok, adott esetben a 2-es helyzetben cianocsoportokkal), valamint a szalicilátok, szerves Ni-komplexek, valamint természetes anyagok, mint például umbelliferon és testsaját urokánsavak. Különös jelentőséggel bírnak a bifenil-, és mindenek előtt a sztilbénszármazékok, melyeket a szakirodalomban leírtak [EP

0728749 számú szabadalmi bejelentés] és a kereskedelemben Tinosörb® FD vagy Tinosorb® FR ex Ciba márkanéven megvásárolhatók. UV-B-abszorbeáló anyagként a következőket nevezzük meg: 3-benzilidénkámfor, illetve 3-benzilidénnorkámfor és ezek származékai, például 3-(4-metilbenzilidén)kámfor [EP 0693471 B1 számú szabadalmi bejelentés], 4-aminobenzoesavszármazékok, előnyösen 4-(dimetilamino)benzoesav-2-etilhexilészter, 4-(dimetilamino)benzoesav-2-oktilészter és 4-(dimetilaminojbenzoesav-amilészter, a fahéj sav észterei, előnyösen a 4metoxifahéj sav-2-etilhexilészter, 4-metoxifahéjsavpropilészter, 4metoxifahéjsavamilészter, 2-ciano-3,3-fenilfahéjsav-2-etilhexilészter (Octocrylene), a szalicilsavak észterei, előnyösen a szalicilsav-2-etilhexilészter, szalicilsav-4-izopropilbenzilészter, szalicilsavhomomentilészter, a benzofenonok származékai előnyösen a 2-hidroxi-4-metoxibenzofenon, 2-hidroxi-4-metioxi-4’-metilbenzofenon, 2,2’-dihidroxi-4-metoxibenzofenon, a benzmalonsavak észterei, előnyösen a 4-metoxibenzmalonsav-di-2-etilhexilészter, triazinszármazékok, mint például a 2,4,6-trianilino-(p-karbo-2’etil-l’-hexiloxi)-l,3,5-triazin és oktil-triazon, ahogy azt a szakirodalomban leírták [EP 0818450 számú szabadalmi bejelentés] vagy dioktil-butamido-triazon (Uvasorb® HEB), propán-1,3-dion, mint például az l-(4-terc-butilfenil)-3-(4’-metoxifenil)propán-1,3dion, ketotriciklo(5.2.1.0)dekán-származékok, mint például a szakirodalomban leírt vegyületek [EP 0694521 B1 számú szabadalmi bejelentés]. Továbbá megfelelnek: 2-fenilbenzimidazol-5-szulfonsav és ezek alkáli-, alkáliföldfém-, ammonium-, alkilammónium-, alkanolammónium- és glukammóniumsói, a benzofenonok szulfonsav származékai, előnyösen a 2-hidroxi-4metoxibenzofenon-5-szulfonsav és sói, a 3-benzilidénkámforok szulfonsavszármazékai, mint például 4-(2-oxo-3-bornilidénmetil)benzol-szulfonsav és 2-metil-5-(2-oxo-3-bornilidén)szulfonsav és ezek sói.

A tipikus UV-A szűrők közé tartoznak a benzoilmetán származékok, mint például l-(4’-terc-butilfenil)-3-(4’-metoxifenil)propán-l,3-dion, 4-terc-butil-4’-metoxidibenzoilmetán (Parsol 1789), 1 -fenil-3-(4’-izopropilfenil)-propán-1,3-dion, valamint Enamin-vegyületek, mint például azok, melyeket a szakirodalomban leírtak [DE 19712033 A1 számú szabadalmi bejelentés] (BASF). Az UV-A és az UV-B szűrők természetesen keverten is adagolhatok. A megnevezett oldódó anyagokon kívül erre a célra a fényvédő pigmenteket említjük, melyek finoman diszergált, előnyösen nanométeres tartományba eloszlatott megfelelő fémoxidok, különösen cink-oxid és titán-oxid, és amelyek lehetnek vas, cirkónium, szilícium, mangán, alumínium és cérium oxidok és ezek keverékei. Sóként szilikátok (talkum), bárium-szulfát vagy cink-sztearát alkalmazható. Az oxidok és a sók pigment formában már a bőrápoló és bőrvédő emulziókban és szépítőszerekben alkalmazhatók. A részecskék közepes átmérője kevesebb mint 100 nm, előnyösen 5-50 nm és még előnyösebben 15-30 nm között található. Lehetnek gömb formában, de azok a részecskék is adagolhatok, melyek ellipszoid alakúak, vagy egyéb göbszerú formában vannak. A pigmentek felületkezeltek is lehetnek, azaz hidrofil vagy hidrofób formává alaki to ttan. A tipikus példák a burkolt titándioxid, mint például a Titandioxid T 805 (Degussa) vagy az Eusolex® T2000 (Merck; hidrofób burokként előnyösen szilikon és előnyösebben trialkoxioktilszilánok vagy Simethicone, jöhet szóba. Előnyösen mikrokristályos cink-oxidot alkalmazunk. A • ί · ·* ··♦ · — Γ ·..· .· :

további UV-védőanyagokról a szakirodalomban áttekintést kaphatunk [Finkel: SÖFW-Journal, 122, 543(1996)].

Az UV-abszorbeálók rendszerint 0,01-5 tömeg%-ban, előnyösen 0,03-1 tömeg%-ban adagolhatok.

A mosó- és tisztító szerek szokásos alkotórészei közé tartoznak az általánosan használt mosó- és tisztító hatású enzimek.

Egyidejűleg a találmány megvalósítási formáiban a mosóés tisztítószer a találmány szerinti fehérjén, fehérje fragmensen, fúziós fehérjén vagy származékon kívül további ismert enzimeket is tartalmazhat. Ide tartoznak például a további proteázok, amilázok, cellulázok, hemicellulázok, mint például a β-glukanáz, oxidoreduktázok, mint például a lakkázok, kutinázok, és/vagy lipázok, de az észterázok, és további enzimek is szóba kerülhetnek, melyek a technika jelenlegi állása alapján ismertek.

Az enzimek, mint például proteázok, amilázok vagy cellulázok évtizedek óta a mosó- és tisztító szerekben alkalmazott komponensek. Mindenkori alkalmazásukat mosási teljesítményük, illetve a szóban forgó anyagok tisztítását biztosító hatékonyságuk szabja meg, így fehérje tartalmú szennyeződések lebontásához proteázokat, keményítő tartalmú szennyeződések eltávolításához amilázokat és zsírtartalmú szennyeződésekhez pedig lipázokat alkalmazunk. A mosószerekben a cellulózokat különösen akkor alkalmazzuk, ha azok másodlagos hatása a mosószerekben előnyös, valamint jelenlétük a textíliák rostjaira kedvező. A mindenkori hidrolízis termékeket a megmaradt mosó- és tisztítószer alkotók megtámadják, feloldják, emulgeálják vagy szuszpendálják, vagy nagyobb oldékonyságuk miatt a mosófürdővel kimossák, tehát az enzimek a többi alkotórésszel szinergizmusba lépnek.

* i . .. ,· — * ’Γ *>.· :

A másodlagos mosási teljesítmény cellulázzal összehasonlítható mértékű hozzájárulása miatt, a proteázok a természetes rostokra különösen a gyapjúra és a selyemre képesek hatásukat kifejteni. Az ilyen szövetek felszínén kifejtett hatásukkal az anyagon fényesítő hatást fejtenek ki, és ezzel a nemezeié hatás ellen hatnak.

A további enzimek a szóban forgó tisztítószer teljesítményét tovább emelik specifikus enzimatikus képességeikkel. Ide tartoznak például a hemicellulázok, mint például a β-glukanázok [WO 99/06515 és WO 99/06516 számú szabadalmi bejelentés] az oxidoreduktázok mint például a Laccasen [WO 00/39306 számú szabadalmi bejelentés] vagy a pektinoldó enzimek [WO 00/42145 számú szabadalmi bejelentés], amelyek speciális anyagként adagolhatok.

A találmány szerinti szerekben történő felhasználáshoz első vonalban a mikroorganizmusokból kivont enzimek jönnek szóba, melyek például a baktériumokból vagy gombákból nyerhetők. Ezek az alkotók ismert módon fermentációval a megfelelő mikroorganizmusból kinyerhetők, ahogy azt például a szakirodalomban közzétettek [DE 1940488 és DE 2121397 számú szabadalmi bejelentés, 3623957 számú Amerikai Egyesült Államok beli szabadalmi bejelentés és 4264738 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, EP 006638, valamint WO 91/02792 számú szabadalmi bejelentés].

A találmány szerinti fehérjét, különösen tárolás során, stabilizálókkal, például denaturálással, széteséssel vagy inaktiválással szemben, valamilyen fizikai behatással, oxidációval vagy proteolítikus hasítással megvédjük.

A stabilizátorok egyik csoportjába a reverzibilis proteáz inhibitorok tartoznak, mint például a benzamidin-hidroklorid és a leupeptin, melyeket erre a célra alakítottak ki. Gyakran a következőket használják: borax, bórsavak, boronsavak, ezek sói és észterei, mindenek előtt aromás csoportokkal alkotott származékaik, mint például orto-szubsztituált [WO 95/12655 számú szabadalmi bejelentés], meta-szubsztituált [WO 92/19707 számú szabadalmi bejelentés], para-szubsztituált [5972873 számú Amerikai Egyesült Állam ok-beli szabadalmi bejelentés] fenilboronsavak, előnyösek ezek sói vagy észterei is. A WO 98/13460 számú szabadalmi bejelentésben és az EP 583534 számú szabadalmi bejelentésben peptidaldehidet tettek közzé, azaz C-terminálisán redukált oligopeptidet, és ezek 2-50 monomeres változatait a mosó- és tisztítószer proteázok reverzibilis gátlásához. A reverzibilis proteáz inhibitorok közé tartoznak az ovomukoid néven ismert anyagok [WO 93/00418 számú szabadalmi bejelentés]. Például a WO 00/01826 számú szabadalmi bejelentésben specifikus, reverzibilis peptidinhibitorokat tettek közzé, melyek a proteázokat tartalmazó szerekben a szubtilizin proteázt gátoljá, és ez megfelel a WO 00/01831 számú szabadalmi bejelentésben közzétett proteázból és inhibitorból álló fúziós fehérjének.

A további közismert enzimstabilizátorok a következők: aminoalkoholok, mint például mono-, di-, trietanol- és propanolamin és ezek keverékei, alifás karbonsavak tizenkét szénatomig, mint például, ahogy az a EP 378261 és WO 97/05227 számú szabadalmi bejelentésekből ismert, borostyánkösav, más dikarbonsavak és a megnevezett savak sói. A DE 19650537 számú szabadalmi bejelentés erre a célra végcsoportjában zárt zsírsavamidalkoxilátokat tett közzé. Az alkotóelemként alkalmazott bizonyos szerves savakat a szakirodalomban közzétették [WO 97/18287 számú szabadalmi bejelentés], melyet az adagolt enzim stabilizálására alkalmaztak.

Az alacsonyabb rendú alifás alkoholok, valamint mindenek előtt a poliolok, mint például a glicerin; etilénglikol, propilénglikol vagy szorbit, gyakran alkalmazott enzim-stabilizátorok. Éppen így kalciumsókat is használhatunk, mint például a kalciumacetát, vagy az EP 028865 számú szabadalmi bejelentésben leírt kalcium-formiát, és magnéziumsókat, különböző polimereket [EP 378262 számú szabadalmi bejelentés],

A szakirodalomban közzétették a poliamid-oligomereket [WO 99143780 számú szabadalmi bejelentés] vagy polimer vegyületek, mint például lignint [WO 97/00932 számú szabadalmi bejelentés], vízoldékony vinil-kopolimereket [EP 828762 számú szabadalmi bejelentés] vagy a következőket [EP 702712 számú szabadalmi bejelentés]: cellulóz-éter, akril-polimer és poliamid, melyek enzim készítmények az enzimek előállításához a fizikai hatások vagy a pH-érték ingadozásai ellen stabilizátorként szolgálnak. A poliamin-N-oxid tartalmú polimer [EP 587550 és EP 581751 számú szabadalmi bejelentések] egyszerre enzimstabilizálóként és színátvivő képesség gátlójaként használható. A további polimer stabilizátorokat a szakirodalomban közzétették [WO 97/05227 számú szabadalmi bejelentés] más alkotórészek mellett, kiegészítve lineáris, C₈-Ci₈ polioxilkalkilénekkel. Az alkilpoliglükozidok, ahogy azt a WO 97/43377 és WO 98/45396 számú szabadalmi bejelentésekben közzétették, a találmány szerinti szerek enzimatikus komponenseit stabilizálják, és ezzel teljesítményüket fokozzák. A hálózatos N-tartalmú vegyületek [WO

98/17764 számú szabadalmi bejelentés] kettős funkciót töltenek be, így földet-kiúzö szernek és enzimstabilizátornak tekintik. A hidrofób nem ionos polimerek más stabilizátorokkal együtt a WO 97/32958 számú szabadalmi bejelentés szerint a cellulázokat stabilizálják, így ilyen és hasonló szerek a találmány szerinti szer enziméhez is szerepelhetnek.

A re dukáló szerek és az antioxidánsok, ahogy azt a szakirodalomban többek között leírták [EP 780466 számú szabadalmi bejelentés], az enzimeket az oxidatív szétesés ellen stabilizálják. A kéntartalmú redukálószerek a szakirodalomból ismertek [EP 0080748 és EP 0080223 számú szabadalmi bejelentések]. További példák a nátrium-szulfit [EP 533239 számú szabadalmi bejelentés] és a redukáló cukrok [EP 656058 számú szabadalmi bejelentés].

A stabilizátorok sokféle kombinációja alkalmazható, például poliolokból, bórsavból és/vagy boraxból álló kombinációk [WO 96/31589 számú szabadalmi bejelentés], bórsavból vagy borátból, redukáló sókból és borostyánkő savból vagy más dikarbonsavakból álló kombinációk [EP 126505 számú szabadalmi bejelentés] vagy bórsavból más borátokból poliolokkal vagy poliamin vegyületekkel és redukáló sókkal adott kombinációk [EP 080223 számú szabadalmi bejelentés]. A peptid-aldehid stabilizátorok hatása a WO 98/13462 számú szabadalmi bejelentés szerint bórsavval kombinációban és/vagy bórsavszármazékokkal és poliolokkal kombinációban fokozható és kalciumionok hozzáadásával ez tovább fokozható [WO 98/13459 számú szabadalmi bejelentés].

A stabilizált enzimaktivitású szerek a találmány előnyben részesített megvalósítási formájába tartoznak. Különösen előnyös u * ·“ ·“· *

-· £ olyan enzimekkel, melyek több, fentiekben ismertetett módon stabilizáltak.

Mivel a találmány szerinti szer minden elképzelhető formában ajánlható, ezért a találmány szerinti enzimet, előnyösen fehérjét, a mindenkori szerbe adáshoz célirányosan, a találmány megvalósítási formájának megfelelően kiszerelt formában állítjuk elő. Ide tartoznak a folyékony, szilád, szemcsézet vagy kapszula formák.

A kapszulázott forma az enzim és a többi alkotórészek, mint például fehérítő szerek, védelmére vagy szabályozott kibocsátására szolgálhat. A kapszula mérete alapján megkülönböztetünk milli-, mikro- és nanokapszulákat, ahol az enzimek részére különösen a mikrokapszulák felelnek meg. Ilyen kapszulákat a szakirodalomban leírtak [WO 97/24177 és DE 19918267 számú szabadalmi bejelentés]. Egy további kapszulázási eljárásban a mosó- és tisztítószerekhez megfelelő enzimeket az enzimoldattal keményítőt vagy a keményítő származékot tartalmazó oldatból keményítőbe, előnyösen keményítő származékba kapszulázzuk. A szakirodalomban ilyen kapszulázási eljárást leírtak [WO 01/38471 számú szabadalmi bejelentés].

A fehérjék szilárd szernél például szárított, szemcsézett, kapszulázott, vagy kapszulázott és végül szárított formába helyezhetők. Lehetnek elkülönítetten, azaz fázisonként, vagy más alkotórészekkel együtt azonos fázisban, kompaktálással vagy anélkül végzett hozzáadással. A mikrokapszulázott enzimeket a szilárd formában úgy kell kialakítani, hogy a víz a jelenlegi technikákkal a vizes oldatokból eltávolítható legyen, például poriasz fással, centrifugálással vagy oldószermentesítéssel. Az ilymódon kapott részecskék átlag mérete 50 és 200 pm között található.

A találmány szerinti szerekben az enzim és a találmány szerinti fehérje is, folyékony, gélképzö vagy pasztás kiszerelésben is előfordulhat, ami a technika mai állása szerinti eljárással nyert fehérjéből indul ki, és az elkészítés koncentrált vizes vagy nem vizes oldatban, például folyékony formában, folyadékként, szuszpenzióként vagy emulzióként történik, de lehet gél formában is, vagy kapszulázott szárított porként is adagolni. Az ilyen találmány szerinti mosó- és tisztítószereket folyadékként a szokásos oldószerekkel együtt rendszerint az alkotórészek egyszerű összekeverésével állítják elő, ahol az anyagba, vagy oldatként az automatikus keverőbe adható.

A primer mosási teljesítmény mellett a mosószerekben lévő proteázok további funkciókat is betölthetnek, az egyéb enzimatikus alkotórészeket proteolítikus hasítással aktiválhatják vagy megfelelő hatástartam után inaktiválhatják, ahogy azt a szakirodalomban leírták [WO 94/29426 vagy EP 747471 számú szabadalmi bejelentések]. Összehangolható szabályozó funkciók a találmány szerinti enzim esetében is lehetségesek. A találmány egyik megvalósítási formájában a fentieken kívül olyan szerek találhatók a proteázra érzékeny anyagból készített kapszulában, melyek például a találmány szerinti fehérjéket a megadott időpontban hidrolizálják, és így tartalmuk kiszabadul. Hasonló összehangolható hatás más többfázisú szereknél is elérhető.

A találmány egy további megvalósítási formájában olyan szereket állít elő a textil nyersanyagok kezeléséhez vagy a textilápoláshoz, melyek azzal jellemezhetők, hogy magukban vagy együtt más aktív alkotórészekkel a fentiekben leírt proteolítikus fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék egyikét tartalmazzák, különösen természetes rostoknál vagy textíliáknál és különösen gyapjú és selyem esetében.

A természetes rostok, mint például a gyapjú vagy selyem, jellegzetes mikroszkópos felépítéssel rendelkeznek. Az eljárások például a gyapjú szakirodalmában leírtaknak megfelelően végezhetők [Breier: Melliand Textilberichte, 1.4. 263(2000)], de ez hosszan tartó kedvezőtlen hatásokhoz, így összecsomózódáshoz, vezet. Az ilyen hatások elkerülésére a természetes nyersanyagokat a találmány szerinti szerrel kezeljük, mely például hozzájárul, hogy a fehérje felépítésében az uralkodó pikkelyes felszíni struktúrák elsimuljanak, és ezzel összecsomózódásuk ellenében hatnak.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a proteázt tartalmazó szert úgy dolgoztuk ki, hogy a szokásos kezelési anyagok alkalmazhatók, például amit a mosó folyamatban alkalmazunk, vagy az után, függetlenül attól, hogy a mosáskor már alkalmaztuk. A kívánt hatás a textíliák felületi struktúrájának elsimítására irányul, és/vagy a szövetek károsodásának megelőzésére és/vagy csökkentésére.

A találmány egyik megvalósítási formájában a textíliák vagy a szilárd felületek gépi tisztításához eljárást biztosítunk, melyben a találmány szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje, vagy származék mennyisége legalább az egyik eljárási lépésben alkalmanként 40 pg- 96 g, és előnyösen 50 pg- 72 g, 100 pg- 48 g, és különösen előnyösen 200 pg- 24 mg.

Ide tartoznak mind a kézi, mind a gépi eljárások, amikor is a gépi eljárások pontosabb szabályozhatósága alapján például az adagolt mennyiség és a hatásidő tekintetében előnyben részesítettek.

A textíliák gépi tisztításának eljárásait általánosságban azzal jellemezhetjük, hogy több eljárási lépésben különböző tisztításban aktív anyagot alkalmazunk a tisztítandó dolgon, és a hatás-idő után lemossuk, vagy hogy a tisztítandó dolgot egyéb módon a tisztító szerrel vagy ennek oldatával kezeljük. Ez igaz a gépi tisztítások eljárásaira is, mindenek előtt egyéb anyagokra, így azokra a textíliákra, melyeket kemény felszíneken összefognak. Az összes ilyen szóba jöhető eljárás legalább egyik eljárási lépésében a találmány szerinti fehérjével gazdagítható, és ezek a találmány megvalósítási formáit jelentik.

Mivel a találmány szerinti enzim fehérjeoldó képességgel már rendelkezik, és ezt a közegben fejti ki, másképpen tisztítóereje nincs, mint például a fenék-pufferben, ezért a textíliák gépi tisztításánál az ilyen eljárás egyik részlépése az lehet, hogy a kívánt esetekben a stabilizáló vegyületek mellett sók vagy pufferanyagok alkalmazhatók, a találmány szerinti enzim egyedüli tisztításban aktív komponenseként. Ez a találmány különösen előnyben részesített megvalósítási formáját jelenti.

Egy további előnyben részesített megvalósítási formában az ilyen eljárások a találmány szerinti enzim a fentiekben megadott receptúráinak keretében, előnyösen a találmány szerinti mosó-, előnyösen tisztítószert biztosítják.

A találmány egyik előnyben részesített megvalósítási formájában a textil nyersanyagok kezeléséhez vagy textilápoláshoz eljárást biztosítunk, mely azzal jellemezhető, hogy a találmány szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék legalább az egyik eljárási lépésben aktív, különösen azokon a textil nyersanyagokon, rostokon vagy texíliákon, melyek természetes alkotójú textil nyersanyagok, különösen a gyapjún és a selymen.

Ez például olyan eljárással érhető el, melynél a textíliákat a feldolgozásához előkészítjük, mintegy az anti-csomosodás ellen, vagy például olyan eljárással, mely a bevitt textíliák tisztítását a kezelő komponensben gazdagítja. A proteázok fentiekben leírt hatása ellen a kijelölt szövetet az előnyben részesített megvalósítási forma szerint kezeljük, így a textil nyersanyagot vagy a természetes alkotójú textil nyersanyagot, különösen a gyapjút és selyemet.

A találmány egyik sajátos tárgykörében a találmány szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét, vagy származékot textíliák vagy kemény felületek tisztításához állítjuk elő.

Előnyösen ezek az alkalmazások a fentiekben megadott koncentrációtartományban érvényesek.

így a találmány szerinti fehérjék különösen a fentiekben leírt tulajdonságok alapján a fentiekben leírt eljárásokban a textíliák és a szilárd felszínek fehérje tartalmú szennyeződéseinek eltávolítására szolgálnak. Az előnyben részesített megvalósítási formákban a találmány a gépi eljárásokon kívül például a háztartási mosásokkal vagy a textíliák foltjainak kézi eltávolításával vagy szennyezett felületek tisztításával foglalkozik.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában ez az alkalmazás az érintett találmány szerinti enzim, a fentiekben csatolt receptúrák keretében, a találmány szerinti szerhez, előnyösen mosó-, előnyösebben tisztítószerekhez történő biztosítását jelenti.

Egy további megvalósítási forma a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék, vagy származékok alkalmazásával foglalkozik, ami a mosó- és tisztító szerek alkotórészeinek aktiválására vagy deaktiválására szolgál.

Amint az ismeretes, a mosó- és tisztító szerek fehérje alkotói proteázokkal inaktiválhatók. Ezeket egyébként inkább a nem kívánt hatások megcélzására adagolták, mégis a találmány tárgykörébe tartoznak. Az is lehetséges, hogy először egy másik komponenst proteolízissel aktiválnak, amikor a tulajdonképpeni hibrid-fehérje enzimből és ennek megfelelő inhibitorból áll, ahogy azt a szakirodalomban leírták [WO 00/01831 számú szabadalmi bejelentés]. Egy további példa az ilyen szabályzásra vonatkozik, az aktív komponens enzimaktivitásának védelmére, ami szabályozáshoz kapszulába zártan fordul elő, amikor is hatását a proteolízis megkezdésével fejti ki. A találmány szerinti fehérjék így inaktiválási, aktiválási és felszabadulási reakciókban alkalmazhatók, különösen többfázisú szerekben.

A továbbiakban, a mosó- és tisztító problematika technikai eljárásain, alkalmazásain és a hozzátartó szerein kívül, az összes többi eltérést a találmány tárgykörének megfelelően összegezzük, amennyiben azokat a találmány szerinti fehérjék határozzák meg. Ezt az összeállítást nem tekintjük végleges felsorolásnak, hanem csak a legfontosabbakat állítottuk össze, melyeket jelenleg a találmány szerinti proteázok adagolásából felismertünk. A továbbiakhoz kiindulási alapot, és további alkalmazási lehetőséget nyújt a szakirodalom [Uhlig: Hanbuch Industrial Enyzmes and their Applications, Wiley-Verlag, New York, (1998)]. Meg kell állapítani, hogy a további technikai területek a találmány szerinti proteázok alkalmazásainál tovább fejleszthetők, így ezek a találmány oltalmi körébe tartoznak.

A találmány tárgyköreinek egyik megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék vagy származékok alkalmazásaira vonatkozik, melyeket a kis molekulatömegú vegyületek vagy fehérjék biokémiai analízisében vagy szintézisében felhasználhatunk.

A találmány és a szakirodalom szerint [Römpp, Lexikon Chemie (Version 2.0, Stuttgart/ New York: Georg Thieme Verlag, (1999)] enzimatikus analízis alatt minden olyan biokémiai analitikai műveletet értünk, mely specifikus enzimet vagy szubsztrátot kezel, egyrészről a szubsztrát azonosítására, vagy koncentrációjának megállapítására, másrészről az enzim azonosítására vagy koncentrációjának kiderítésére. Az alkalmazási területek az összes biokémiai alkalmazásokra kiterjednek, különösen a molekuláris biológiaiakra, és fehérje-kémiaiakra. Ez az alkalmazás előnyösen az analitikai eljárások keretében történik. Ezen tárgykör egyik előnyben részesített megvalósítási formája a szekvencia analízis keretében végzett végcsoport meghatározás.

A tárgykör egy további megvalósítási formája a találmány szerinti, fentiekben leírt fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék vagy származékok alkalmazására vonatkozik, a természetes anyagok tisztításához vagy a biológiailag értékes anyagok előállításához.

Előnyösen ez a megfelelő szerrel vagy eljárás keretében történik. így a természetes anyagok vagy biológiailag értékes anyagok tisztítási folyamatában jelentős lehet a fehérjeszennyezésektől való megszabadításnál. így például a kis molekulatömegű ve

100 gyületek, az összes sejtalkotó, vagy a raktározó anyagok kezelésére használható. Ez mind laboratóriumi méretekben, mind ipari méretekben, például értékes anyagok biotechnológiai előállításában végrehajtható.

A találmány szerinti proteolítikus enzimek felhasználása a fehérjék vagy kis molekulatömegü vegyületek szintézisénél a természetes katalitikus reakció átalakító képessége alapján valósul meg, például amikor fehérje fragmenseket kell összekapcsolnunk, vagy amikor a nem túlsúlyban lévő, fehérjéből álló vegyület aminosavait össze kell kapcsolni. Az ilyen alkalmazási lehetőségeket a szakirodalomban javasolták [EP 380362 számú szabadalmi bejelentés].

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjékkel, fehérje fragmensekkel, fúziós fehérjékkel vagy származékokkal a természetes nyersanyagok kezelését biztosítja, amikor ezeket felületi kezelésnek kell alávetni, elsősorban a bőrkikészítésnél.

Előnyösen ez a találmány szerinti szerrel vagy eljárás keretében történik. Erre például akkor van szükség, amikor a természetes nyersanyagot fehérje szennyeződésétől kell megszabadítani. Elsősorban ide tartoznak a mikrobiológiai szennyeződéseket nem tartalmazó nyersanyagok, melyeken itt mezőgazdasági eredetúeket értünk, de ide értjük a biotechnológiailag, fermentációval előállított anyagokat, mint például az antibiotikumokat.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási forma a felületi kezelések alkalmazására, és különösen a gazdasági jelentőségű bőr nyersanyagok kezelésére vonatkozik. így a cserzési eljárások folyamatában, különösen a lúgos puhításnál [Römpp, Lexikon Chemie, Version 2.0, Stuttgart/ New York: Georg Thieme Verlag,

101 (1999)] a vízben oldódó fehérjék proteolítikus enzimek segítségével a bőr-anyagból kioldhatok. Ehhez a találmány szerinti proteázok alkalmazhatók, különösen lúgos körülmények között és denaturáló szerek jelenlétében.

A tárgykör további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék vagy származékok alkalmazására vonatkozik, amennyiben azokat a textíliák előállításához a nyersanyagok kinyerésénél vagy kezelésénél, vagy a közti termékek kialakításánál használják fel, különösen a védőrétegek eltávolítására.

Előnyösen ez a találmány szerinti szerrel vagy eljárás keretében történik. A nyersanyagok nyerésének vagy kezelésének, vagy a textíliák előállításánál közti termék létrehozásának egyik példája a gyapot feldolgozása, ahol a lesimításnak nevezett folyamatban a tok alkotórészeitől meg kell szabadulni, egy másik ^a gyapot kezelése; de hasonló érvényes a nyersselyem feldolgozására is. Az enzimatikus eljárások összevethetők a kémiai eljárásokkal, különösen a környezeti összeegyeztethetőségük tekintetében.

Az egyik előnyben részesített megvalósítási formában a találmány szerinti fehérje felhasználható a textíliák védőrétegénél, különösen a közti vagy az értékes termék eltávolításánál, vagy a felületeik lesimításában, mielőtt egy következő feldolgozási lépésben ezeket tovább alakítják.

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék, vagy származékok felhasználását a textil nyersanyagok kezelésénél, ápolásánál érvényesíti, különösen a gyapjú vagy

102 selyem vagy más, főleg selymet tartalmazó kevert textíliák felszíni kezelésénél.

Előnyösen ez a találmány szerinti szerrel vagy eljárás keretében történik. A fentieknek megfelelően a szóban forgó textil nyersanyagok szennyeződéseiktől proteázokkal megszabadíthatok; ezen kívül a fehérjéből álló anyag legalább egy részén a proteolítikus enzim felület lesimító és ápoló tulajdonsága jót tesz. Ennek alapján a szóban forgó anyagok ápolását is felöleljük. Különösen a gyapjú vagy selyem, vagy a gyapjút vagy selymet tartalmazó anyagok felületi kezelésére formálunk igényt. Ez érvényes mind az ilyen textíliák előállítására, mind alkalmazásuk során ápolásukra, például a textíliák tisztításakor (lásd fenn).

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék, vagy származékok felhasználását a fotófilmek kezelésénél érvényesíti, különösen a zselatint tartalmazó vagy hasonló védőrétegek eltávolításánál.

Előnyösen ez a találmány szerinti szerrel vagy eljárás keretében történik. Az ilyen védőrétegek, különösen az ezüstsókat tartalmazó zselatin emulziók a filmeken találhatók, mint például a röntgenfilm egyik rétege, melyet a hordozóanyag megvilágítása után el kell távolítani. Az itt uralkodó lúgos vagy gyengén denaturáló reakciókörülmények miatt a találmány szerinti proteázok különösen jól alkalmazhatók.

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék, fehérje fragmensek, fúziós fehérjék, vagy származékok felhasználását élelmiszerek vagy takarmányok előállításánál érvényesíti.

103

Előnyösen ez a találmány szerinti szerrel vagy eljárás keretében történik. így a proteázok az élelmiszerek előállításában, azok megváltoztatásában alkalmazhatók. Erre példák a sajtok érési folyamatában vagy más tejtermékek kialakításában végzett alkalmazások. Az ilyen folyamatok a találmány szerinti fehérjével gazdagíthatok, vagy ezekkel teljes egészében végrehajthatók. A nem táplálkozási célú szénhidrátot tartalmazó élelmi-szerek vagy élelmiszer nyersanyagoknál, mint például a liszt vagy a dextrin, a szóban forgó proteázok a kisérő fehérjék eltávolítására is felhasználhatók. A találmány szerinti proteázok az ilyen felhasználásokhoz is megfelelnek, különösen abban az esetben, amikor ezek lúgos vagy gyengén denaturáló körülmények között történnek.

Ez érvényes a takarmányok előállítására is. Itt a teljes fehérjementesítés mellett az is érdeklődésre tarthat számot, hogy a fehérjét tartalmazó kiindulási anyagot vagy anyagkeveréket a proteázokkal csak kis ideig kezelik, azért, hogy a háziállatok számára könnyebben emészthetővé tegyék. Az ilyen kezelés például a táptalajok előállítására is felhasználható, amit a mikroorganizmusok fermentációjánál felhasználhatunk.

A találmány ezen tárgykörének egy további megvalósítási formája a találmány szerinti fehérjék felhasználását kozmetikai célra érvényesíti.

Az igény a találmány szerinti fehérjéket, fehérje fragmenseket, fúziós fehérjéket, vagy származékokat tartalmazó kozmetikai szerekre, eljárásokra is kiterjed, melyek a találmány szerinti fehérjéket, fehérje fragmenseket, fúziós fehérjéket, vagy származékokat alkalmazzák kozmetikai célokra, különösen az ehhez megfelelő eljárásban vagy szerekben.

104

Mivel a proteázok az emberi bőr sejtmegújulási folyamatban is szerepet játszanak (dezkvamáció), ezért ezek meghatározó szerepét a szakirodalomban leírták [Egelrud és mtsai: Acta Derm. Vénéről., 71, 471-474(1991)]. Ennek megfelelően a proteázok a bőrápolószerekben bioaktív anyagként felhasználhatók, a száraz bőr leépülésekor a dezmoszóma struktúrák gyarapításával védelmi célra [WO 95/07688 vagy WO 99/18219 számú szabadalmi bejelentés], A szubtilizin proteázok alkalmazását a szakirodalomban kozmetikai célra leírták [WO 97/07770 számú szabadalmi bejelentés]. A találmány szerinti proteázok is, különösen a mutagenezissel kialakított változatok, vagy amelyek aktivitása megfelelő növekedésre ható anyagokkal szabályozható, bőr- vagy haj tisztító vagy ápoló szerekbe adagolhatok. Különösen előnyösek azok az enzim készítmények, melyek, ahogy azt a fentiekben leírtuk, például makromolekuláris hordozóhoz kapcsolva stabilizáltak [5230891 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés] és/vagy a nagyon allergén régiókban pontmutációval megváltoztatott származékok, mellyel az emberek számára nagyobb bőrtúrést biztosít.

Ennek megfelelően a proteolítikus enzimek alkalmazása kozmetikai célra is a találmány oltalmi körébe tartozik, különösen a megfelelő szerekben, mint például sampon, szappan, vagy vizek, vagy ápolószerek, melyek például krém formában ajánlhatók. Ezek a bőrrétegeket eltávolító gyógyszerekben is alkalmazhatók, így ezek szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Példák

05 j

Az összes molekuláris biológiai munkalépés standard módszerek követésével történik, amelyek a szakirodalomban megtalálhatók [Fritsch és mtsai Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, (1989)], vagy ahogy azt az ide vágó művekben közölték. Az enzimeket és a készleteket a gyártó cég utasításainak megfelelően használtuk.

1. Példa

A proteolítikusan aktív bakteriális törzsek izolálása és azonosítása

A talajpróba (0,1 g) 1 ml-ét steril 0,9 %-os NaCl oldatba szuszpendáltuk és tejport tartalmazó agar lemezekre szélesztettük (1,5 % agar, 0,5 % NaCl, 0,1 % K2HPO4, 0,1 % élesztőkivonat, 2 % pepton (ICN, Eschwede, Art.-Nr. 104808), 1 % tejpor (fölözött tej; Difco, Heidelberg, Art.-Nr. 232100), pH = 10). Miután a lemezeket 72 óráig 30 °C-on inkubáltuk a telepek a tejes agaron tisztulási zónát mutattak. A lemezekről egyedül álló kolóniákat izoláltunk és Horikoshi táptalajban (0,1 % K₂HPO₄, 0,5 % élesztőkivonat, 1 % pepton, 0,02 % MgSO₄, 0,3 % Na₂CO₃, pH = 9) Erlenmeyer lombikban 37 °C-on tenyésztettük, miközben 200 rpm-mel rázattuk.

Az egyik ilyen kiónt letétbe helyeztük, száma: 1.3.2001 (Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (DSMZ)). Ott a ID 01-193 megnevezést kapta, míg hozzáférési száma: DSM 14392. Ezen biológiai anyag jellemvonásainak mérvadó adatait meghatározták és az 1. táblázatban összegezését megadtuk. Ennek megfelelően ez alkalikus bacillus.

106

1. Táblázat

A Bacillus sp. mikrobiológiai jellemzői (DSM 14392)(megegyezik DSMZ-vel (2001))

Tulaj donságok	Eredmény
Sejtforma	Pálcikák
szélessége (pm)	0,8- 1,0
hossza (pm)	2,0 - 3,0
Spórák	pozitív, ovális
Sporangium duzzadás	negatív
Növekedés CASO, pH = 7	pozitív
Növekedés DSM táptalaj 31, pH = 9,7	pozitív
Alkalikus vizsgálat
NaCl 2 %	pozitív
5 %	pozitív
7 %	pozitív
10 %	pozitív
12 %	pozitív
14 %	pozitív
16 %	pozitív
Hidrolízise
Tween 40-ből	negatív
Tween 60-ból	negatív
Tween 80-ból	negatív
A celluláris zsírsavak mintázata	a Bacillus nemzetségre jellemző

107

A	részleges	16	S-rDNS	a Bacillus sp-vel (DSM 8717)
szekvenálás			98,3 %-os hasonlóságot mutatott [Microbiology, 141, 1745-1761 (1995)]

2. Példa

Az érett proteázok klónozása és szekvenálása

A Bacillus sp. (DSM 14392) kromoszómális DNS-t standard eljárással kinyertük, Sau3A restrikciós enzimmel kezeltük, és a kapott fragmenseket a pAWA22 vektorba klónoztuk. Ez egy pBC 16-ból levezetett expressziós vektor, mely Bacillus fajokban alkalmazható [Bernhard és mtsai: J. Bacteriol., 133(2), 897-903 (1978)]. Ezt a vektort Bacillus subtilis DB 104 proteáz negatív gazda törzsbe transzformáltuk [Kawamura és Doi: J. Bacteriol., 160(1), 442-444(1984)].

A transzformánsokat ezek után DM3 táptalajban regeneráltuk (8 g/1 agar, 0,5 M borostyánkősav, 3,5 g/1 K2HPO4, 1,5 g/1 KH2PO4, 20 mM MgCb, 5 g/1 kazaminosavak, 5 g/1 élesztőkivonat, 6 g/1 glükóz, 0,1 g/1 BSA) és TBY-Skimmilk lemezekre (10 g/1 pepton, 10 g/1 tejpor (lásd fenn), 5 g/1 élesztő, 5 g/1 NaCl, 15 g/1 agar) leoltottuk. A proteolítikusan aktív kolóniákat lízisük mértéke alapján azonosítottuk. A kapott, proteolítikusan aktív kolóniákat kiválasztottuk (p/Al), melyekből a plazmidot izoláltuk és az inszertet standard eljárással szekvenáltuk.

A körülbelül 3,1 kb nagyságú inszert egy körülbelül 1 kb nagyságú nyitott olvasási keretet tartalmazott. Ennek szekvenciáját megadtuk (a szekvencia száma: 1). Ez 1125 bp-t foglal magában. Az ebből levezetett 374 aminosav szekvenciáját stop-kodon követi. Ezt is megadtuk (a szekvencia száma: 2). Ebből 105

108 aminosav valószínűleg nem az érett fehérjét tartalmazza, így az érett fehérje előreláthatóan 269 aminosavat ad.

Ennek szekvenciáját 2001. augusztusában a mindenki által hozzáférhető Swiss-Prot adatbankban (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz;

http://www.genebio.com/sprot.html) és a GenBank-ban (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) kapott proteáz szekvenciákkal összehasonlítottuk. így a legközelebb álló hasonló enzimeket a következő, 2. táblázatban feltüntettük.

2. Táblázat

A homológia bemutatása a Bacillus sp. (DSM 14392) alkalikus proteázhoz legközelebb álló fehérjéknél Jelmagyarázat:

ID: A Genbank adatbázis és a Swiss-Prot bejegyzési számai;

Ident. DNS: Azonosság DNS szinten %-ban;

Ident. Prepro.: Azonosság aminosav szinten, a preprofehérjére vonatkoztatva, %-ban;

Ident. mat. Prot.: Azonosság aminosav szinten, az érett fehérjére vonatkoztatva, %-ban, n Az adatbázisban nem adták meg.

Enzim	Szervezet	ID	Ident.	Ident.	Ident.
			DNS	Prepro	mat.
					Prot
Alkalikus	Bacillus Ya-B	ELYA_BACSP	98	98	99
elasztáz
Szubtilizin	Bacillus	ELYA_BACAO	69	80	83

109

P92	alkalophilus
Szubtilizin 309 (Savinase®)	Bacillus lentus	SUBS_BACLE	n.	59	83
Bacillus lentus alkalikus proteáz	Bacillus lentus DSM 5483	SUBB_BACLE	n.	59	82
Szubtilizin Sendai	Bacillus Sendai	Q45522	66	69	79
Szubtilizin AprQ	Bacillus sp.	Q45523	56	48	60
Szubtilizin Carlsberg	Bacillus licheniformis	SUBT_BACLI	54	48	58
Szubtilizin Novo BPN'	Bacillus amyloliquefacie ns	SUBT_BACAM	n.	46	56
Szubtilizin DY	Bacillus subtilis DY	SUBT_BACSD	n.	41	56
Szubtilizin AprN	Bacillus subtilis var natto	SUBN_BACNA	54	46	55
Szubtilizin	Bacillus amylosacchariti cus	SUBT_BACSA	54	46	55
Szubtilizin	Bacillus pumilis	SUBT_BACPU	n.	40	55
Szubtilizin J	Geobacillus stearothermophilus	SUBT_BACST	54	45	55

110

Szubtilizin Bacillus subtilis SUBT_BACSU 54 46 55

E

E proteázok aminosav szekvenciáit az 1. ábrán egymással egybevetve megadtuk.

3. Példa

Az alkalikus proteázok tisztítása és jellemzése

Egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikba, melybe 100 ml Horikoshi táptalajt helyeztünk (lásd fenn) a 2. példa szerint transzformált Bacillus törzset oltottunk, és 72 óráig 37 °C-on tenyésztettük, amíg a stacioner növekedési fázist nem értük el.

A tenyészet felülúszójából a következő tisztítási lépésekkel egyedi proteolítikus enzimet nyertünk: A felülúszó dialízisét 20 mM HEPES/NaOH-pufferrel szemben végeztük, (pH = 7,6); a negatív anioncserélő kromatográfia Q-Sepharose® oszlopon történt (Pharmacia-Amersham Biotech, Schweden); a kationcserélő kromatográfiát S-Sepharose® oszlopon (Pharmacia-Amersham), az elúciót HEPES/NaOH gradienssel végeztük, 0-1 M NaCl, pH = 7,6. A proteázt 0,2 M NaCl-nál eluáltuk, melyet kationcserélő kromatográfiás oszlopra vittünk, nevezetesen: Resource S®-re (Pharmacia-Amersham) és HEPES/NaOH-val (pH 7,6) eluenssel koncentráltuk.

Ily módon az SDS gélelektroforézis és a Coomassie festés szerint fehérjét nyertünk.

4. Példa

Az SDS poliakrilamid gélelektroforézis és izoelektromos fókuszálás

Ill

A denaturáló SDS poliakrilamid gélelektroforézist PHAST® rendszerben végeztük (Pharmacia-Amersham Biotech, Schweden), a 2. példa alapján, a 3. példában kapott alkalikus proteázon, amit Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből nyertünk, 26 kD molekulatömeg adódott.

Az izoelektromos fókuszálás szerint (PHAST® rendszer, Pharmacia-Amersham Biotech) a Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből nyert alkalikus proteáz izoelektromos pontja 11.

5. Példa

Enzimatikus tulajdonságok

Specifikus aktivitás:

A 2. és a 3. példa alapján előállított alkalikus proteáz specifikus aktivitását, melyet Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből nyertünk, a Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid szubsztráttal (AAPF; Bachem Biochemica GmbH, Heidelberg) határoztuk meg. Az ötperces inkubálás alatt (pH = 8,6 és 25 °C-on) az aktivitás 9 egység/mg. Ez percenként megfelel 1 egység/μmol hasított szubsztrátnak.

6. Példa

Kisebb aktivitások hozzájárulása a mosási teljesítményhez

Ebben a példában standard módon szennyezett textíliákat alkalmaztunk, melyek a szövetségi szabályoknak megfeleltek (Eidgenössischen Material-Prüfungs- und -Versuchsanstalt, St. Gallen, Schweiz (EMPA)), vagy a mosási kutatóintézet szabályait vettük figyelembe (Wáschereiforschungsanstalt, Krefeld). Ezeknél a vizsgálatoknál a texiliák szennyezéséhez a következőket alkalmazzák: A (vér/tej/korom pamuton), B (vér/tej/tus pamuton), C (vér/tej/tus pamuton), és D (vér pamuton).

112

Ezzel a vizsgálati anyaggal különböző mosószer recepteket mosási teljesítményük szempontjából megvizsgáltunk. Ehhez a mosófürdő tartalma mindig 1:12 arányú és a mosást 30 percig 40 °C-on végeztük. A dózisok közötti különbség az egyes mosásokban 5,88 g-onként változott. A víz keménysége 16 német fok.

A kontroll mosószer a mosószerrecept alapjául szolgált, melynek összetétele a következő (minden adat tömegszázalékban): 4 % lineáris alkilbenzolszulfonát (nátriumsó), 4 % 12-18 szénatomszámos zsírsavalkoholszulfát (nátriumsó), 5,5 % 12-18 szénatomszámos zsíralkohol 7 EO-val, 1 % nátrium szappan, 11 % nátrium-karbonát, 2,5 % amorf nátrium-diszilikát, 20 % nátrium-perborát tetrahidrát, 5,5 % TAED, 25 % Zeolith A, 4,5 % polikarboxilát, 0,5 % foszfonát, 2,5 % habgátló szemcse, 5 % nátrium-szulfát, maradék: víz, optikai derítő, só. A különböző kísérletsorozatokhoz a következő proteázokat adagoltuk, melyek mosásonként mindig 2250 PE proteolítikus aktivitást adtak végkoncentrációban: Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 (WO 95/23221 számú szabadalmi bejelentés]; előállító: Biozym, Kundl, Österreich), Savinase® (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dánemark), előnyösen a találmány szerinti proteáz, melyek Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből nyertünk.

Mosások után a mosott textíliák fehérség! fokát báriumszufáttal hasonlítottuk össze, amit 100 %-ra nomináltunk. A méréseket spektrofotométerrel 460 nm-en végzetük (Datacolor SF500-2) (UV-Sperrfilter 3), 30 mm-es blende, fényesítés nélkül, fényforrás D65, 10°, d/8°. A kapott eredményeket a remisszió százalékában adtuk meg, azaz százalékos értékekben, ahogy az a következő táblázatban látható. Az adatok mindig 4 mérés átlagát

113 tükrözik. Ez a vizsgált enzimnél az alkalmazott szerek mosási teljesítményében megnyilvánuló hozzájárulásának közvetlen visszakö vetkeztető st teszi lehetővé.

3. Táblázat

Alap mosószer a következőkkel:	A	B	C	D
kiindulási érték	15,8	14,3	11,8	19,9
kontroll (proteáz nélkül)	21,7	22,2	14,7	67,9
a találmány szerinti proteáz, melyet Bacillus sp. DSM 14392 törzsből izoláltunk	29,9	40,1	32,0	73,0
Bacillus lentus alkalikus proteáz F49	29,3	30,2	25,2	70,8
Savinase®	30,0	32,1	29,1	68,8
szórás	1,0	1,1	1,2	0,5

Felismerhető, hogy a találmány szerinti Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből nyert proteáz minden vizsgált szennyezőnél mosási teljesítményében megközelítette, és részben még túl is szárnyalta a következő proteázokat: Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 és Savinase®.

7. Példa

A kisebb aktivitású szer befolyása a tisztító teljesítményre

A kemény, sima felületű edényeket standardizált módon szennyeztük kevert-keményítővel (E) és tejjel (F), és ezt a kereskedelemben vásárolható háztartási mosogató géppel öblítettük. Az E próbán a normál programot 45 °C-on végeztük el (Miele® G 676 mosogatógép), és az F-et 55 °C-on normál programmal

114 vizsgáltuk gépi mosogatógéppel (SGS 4002 Bosch®). Öblítő programonként mindig 20 g öblítőszert alkalmaztunk. A víz keménysége 16 német fok.

Öblítő szerként a következő alapreceptek szolgáltak: (az összes érték tömegszázalékot jelent): 55 % nátrium-tripolifoszfát (vízmentesnek tekinthető), 4 % amorf nátrium-diszilikát (vízmentesnek tekinthető), 22 % nátrium-karbonát, 9 % nátriumperborát, 2 % TAED, 2 % nem ionos tenzid, maradék: víz, színező, parfüm. Ezzel az alap recepttel különböző aktivitású különböző proteázokat vizsgáltunk, ezek a következők: Bacillus lentus alkalikus proteáz F49, Properase®, előnyösen a találmány szerinti Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből izolált proteáz, öblítőprogramokként mindegyiket 10000 PE-ben alkalmaztuk. Ez a tisztítási folyamatban a tisztítószer 1 grammjára nézve megfelel minden esetben körülbelül 0,1 mg proteáz fehérjének.

Öblítés után a szennyezés eltávolításának mértékét E-nél gravimetriásán határoztuk meg. Ehhez a szennyezett és az öblített edény tömegének különbségét, valamint az edény kiindulási tömegét meghatároztuk. Ezek arányát százalékban fejeztük ki. A F szennyezésnél az öblítés után vizuális skálán, O-tól (változatlan, igen erős szennyeződés) 10-ig (szennyezés nem figyelhető meg) állapítottuk meg a hatást. A kapott eredményeket a következő, 4. táblázatban foglaltuk össze. Az adatok 8 mérés átlagát adják. Ez a vizsgált enzimnél az alkalmazott szerek mosási teljesítményében megnyilvánuló hozzájárulásának közvetlen visszakövetkeztetést teszi lehetővé.

4. Táblázat

Alap mosószer a következőkkel E F

115 a találmány szerinti proteáz, melyet Bacillus 58,18,1 sp. DSM 14392 törzsből izoláltunk

Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 60,67,8

Properase® . 56,58,2

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből nyert proteáz minden vizsgált szennyezőnél gépi mosogatóban mosási teljesítményében részben még túl is szárnyalta a kontroll proteázokat, vagy legalább azzal egyenértékűnek mutatkozott, és ez a hatás már kisebb aktivitásnál is fellép.

8. Példa

A nagyobb aktivitású enzim befolyása a tisztítási teljesítményre

A 7. példában leírtaknak megfelelően a következő szennyezett edényeket használtuk: tojásfehérje (G), tojás/tej (H) és tej (I), melyeket az előzőekben leírtaknak megfelelően öblítettük. A G és H próbákat 55 °C-on normál-programmal gépi mosogatóban vizsgáltuk (Bosch®, típus: SGS4002) és az I próbát 45 °C-on (Miele® G 676 mosogatógép). Az egyetlen különbség az, hogy mindegyik proteázból 20000 PE-t adtunk. Ez megfelel minden esetben körülbelül 0,2 mg proteáz tisztítószer koncentrációnak.

A G és H sorozatok eredményeit az előző példában leírtaknak megfelelően gravimetriásán határoztuk meg. Az I szennyezés értékeit vizuális skálán értékeltük, O-tól (változatlan, igen erős szennyeződés) 10-ig (szennyezés nem figyelhető meg). A kapott eredményeket a következő, 5. táblázatban foglaltuk össze. Az adatok 8 mérés átlagát adják.

116

5. Táblázat

Alap mosószer a következőkkel G Η I találmány szerinti proteáz, melyet Bacillus 19,7 21,0 6,6 sp. DSM 14392 törzsből izoláltunk

Bacillus lentus alkalikus proteáz F49 52,4 81,0 6,1

Properase® 17,3 16,9 6,1

Magasabb proteáz aktivitásoknál is magasabb, de legalább is összevethető hatást kaptunk a találmány szerinti Bacillus sp. (DSM 14392) törzsből izolált proteázzal, mosogatógépi tisztításnál, mint a Bacillus lentus alkalikus proteáz F49-cel és a Properase® szerrel.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat

Az 1. ábrán a találmány szerinti Bacillus sp (DSM 14392) törzsből izolált proteáz aminosav szekvenciáját a legközelebbi és legfontosabb, a 2. táblázatban összefoglalt ismert szubtilizinekkel együtt mutatjuk be, mindig a érett azaz feldolgozott formában.

A következő számok ezeket a proteázokat adják meg (a zárójelben az adatbanki azonosítót is megadtuk, vö. a 2. példa 2. táblázatával).

szám	neve	forrás	adatbanki azonosító
1	Találmány szerinti	Bacillus sp. (DSM 14392)
2	Alkalikus elasztáz	Bacillus. YA-B	(ELYA_BACSP)
3	Szubtilizin P92	Bacillus alkalophilus	(ELYA_BACAO)
4	Savinase®	Bacillus lentus	(SUBS_BACLE)

117

5	Szubtilizin BL	Bacillus lentus	(SUBS_BACLE)
6	Szubtilizin Sendai AprS	B. sp.	(Q45522)
7	Szubtilizin AprQ	B. sp.	(Q45523)
8	Szubtilizin Carlsberg	B. licheniformis	(SUBT_BACLI)
9	Szubtilizin Novo BPN'	B. amyloliquefaciens	(SUBT_BACAM)
10	Szubtilizin DY	Bacillus subtilis DY	(SUBT_BACSD)
11	AprN	B. subtilis var. natto	(SUBN_BACNA)
12	Szubtilizin	B. amylosacchariticus	(SUBN_BACSA)
13	Szubtilizin	B. pumilus	(SUBT.BACPU)
14	Szubtilizin J	Geobacillus stearothermophilus	(SUBT_BACST)
15	Szubtilizin E	B. subtilis	(SUBT_BACSU)

2. ábra: A pBC 16-ból levezetett pAWA22 expressziós vektor, melynek promotere a B. licheniformis-ból (PromPLi) származik, és 5' irányban egy Bell restrikciós hasítási helyet tartalmaz, (vö. 2. példával) [Bernhard és mtsai: J. Bacteriol., 133(2), 897-903 (1978)].

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat, és számítógéppel olvasható formában is megadjuk.

SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE <110> Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktién

118 < 120> Új alkalikus proteáz Bacillus sp-ből (DSM 14392), valamint használata mosó- és tisztítószerekben <130> H5389PCT <I40>

<141>

< 150> DE 10163884.1 < 151> 2001-12-22 < I60> 2 < 170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1125 <212> DNS < 213> Bacillus sp. (DSM 14392) <220>

< 221> CDS < 222> (1)..(1125) <220>

< 221> mat_peptid < 222> (316)..(1125) < 400> 1 atg ggg aaa att gtt gcc gga aca gca

Met Gly Lys lie Vai Ala Gly Thr Alá

-105 -100 agt tea teg ate gca caa gca gcc gag

Ser Ser Ser lie Ala Gin Ala Alá Glu att ggc ttr aaa qaa caa gaa gtt atg lie Gly Phe Lys Glu Gin Glu Vai Met

-65-60 gat ggc gat gag tat tet att tettet

Asp Gly Asp Glu Tyr Ser Ile SerSer

-55-50 cta att ata tea gta gca ttt 48

Leu Ile Ile Ser Val Alá Phe

-95-90 gaa gca aag gaa aaa tac ctc96

Glu Alá Lys Glu Lys TyrLeu

-80-75 tet caa ttt gtt gac caa att144

Ser Gin Phe Val Asp GinIle caa gcg gaa gat gtt gaa att 192

Gin Alá Glu Asp Val Glu Ile

119 gat etc ett cat gaa ttt gat ttt att cct gtt tta tet gtt gaa ett240

Asp Leu Leu His Glu Phe Asp Phe Ue Pro Vai Leu Ser Vai GluLeu

-40 -35-30 gat cca gaa gat gtc gat get tta gag ett gat cca gca ate gee tat288

Asp Pro Glu Asp Vai Asp Ala Leu Glu Leu Asp Pro Ala lie AlaTyr

-25 -20 -15-io att gag gaa gat get gag gta acg aca atg caa act gtt cca tgg ggc336 lie Glu Glu Asp Ala Glu Vai Thr Thr Met Gin Thr Vai Pro TrpGly

-5 -115 att aac cgt gta caa get cog att gee caa age aga gga ttc aca ggt384 lie Asn Arg Vai Gin Ala Pro Ue Ala Gin Ser Arg Gly Phe ThrGly

1520 act gga gtt cgt gtt get gtc tta gac aca ggg ate tea aat cac get432 hr Gly Vai Arg Vai Ala Vai Leu Asp Thr Gly Ue Ser Asn HisAla

3035 gat tta aga att cgt ggc ggt geg agt ttt gta cca gga gag ccg aac480

Asp Leu Arg lie Arg Gly Gly Ala Ser Phe Vai Pro Gly Glu ProAsn

45 5055 att agt gat gga aac ggt cat ggt acc cac gtt get ggt aca att gca528

Ue Ser Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Vai Ala Gly Thr UeAla

6570 geg tta aac aat tea ate ggt gta ett ggc gta gca cct aac gtt gat576

Ala Leu Asn Asn Ser Ue Gly Vai Leu Gly Vai Ala Pro Asn VaiAsp

8085 tta tat ggg gtt aaa gtg eta gga gca agt ggc tet ggg tea ate agt624

Leu Tyr Gly Vai Lys Vai Leu Gly Ala Ser Gly Ser Gly Ser lieSer

95100 ggt att gca caa ggt tta caa tgg get gca aat aat ggc atg cat att672

Gly Ue Ala Gin Gly Leu Gin Trp Ala Ala Asn Asn Gly Met HisUe

105 110115 get aac atg agt tta gga agt agt get gga tet get aca atg gaa caa720

Ala Asn Met Ser Leu Gly Ser Ser Ala Gly Ser Ala Thr Met GluGin

120 125 130135 get gtt aac caa gca aca gca agt ggc gtt ett gta gtc gca get tet768

Ala Vai Asn Gin Ala Thr Ala Ser Gly Vai Leu Vai Vai Ala AlaSer

HO 145150 ggt aac tea ggt gca gga aat gtt gga ttc cca gca ege tat gca aat816

Gly Asn Ser Gly Ala Gly Asn Vai Gly Phe Pro Ala Arg Tyr AlaAsn

155 160165 geg atg get gtt ggt gca aca gat caa aac aac aac ege get age ttt864

Ala Met Ala Vai Gly Ala Thr Asp Gin Asn Asn Asn Arg Ala SerPhe

HO 175180

120

Let cag tac gga Ser Gin Tyr Gly 185 caa agt acg gtt Gin Ser Thr Vai 200 atg get aca cog Met Ala Thr Pro aat cet tet Lgg Asn Pro Ser Trp

235 gca aca aac tta Ala Thr Asn Leu

250 gca gaa geg gca Ala Glu Ala Ala 265 gca ggt ett gac Ala Gly Leu Asp 190 cct ggc aat gga Pro Gly Asn Gly 205 cac gtt get ggt His Vai Ala Gly 220 tea aat gtt caa Ser Asn Vai Gin gga aat acg act Gly Asn Thr Thr 255 aca cgt taa

Thr Arg

270 att gtc gca cca He Vai Ala Pro

195 tac gca age ttc Tyr Ala Ser Phe 210 gtt get geg tta Vai Ala Ala Leu 225 att cgt aac cac He Arg Asn His 240 caa ttc gga agt Gin Phe Gly Ser ggt gta ggt gta Gly Vai Gly Vai aat ggt aca tet Asn Gly Thr Ser

215 gtg aag caa aag Vai Lys Gin Lys

230 ett aaa aat acg Leu Lys Asn Thr 295 ggt ett gtt aac Gly Leu Vai Asn 260

912

960

1008

1056

1104

1125 <210> 2 < 211> 374 < 212> PRT < 213> Bacillus sp. (DSM 14392) < 400> 2

Met Gly Lys Tie 1

Ser Ser Ser He

He Gly Phe Lys 35

Asp Gly Asp Glu 5 0

Asp Leu Leu His 65

Asp Pro Glu Asp

He Glu Glu Asp

100

He Asn Arg Vai

Vai Ala Gly Thr 5

Ala Gin Ala Ala

Glu Gin Glu Vai

Tyr Ser He Ser 55

Glu Phe Asp Phe 70

Vai Asp Ala Leu 85

Ala Glu Vai Thr

Gin Ala Pro He

Ala Leu He He 10

Glu Glu Ala Lys 25

Met Ser Gin Phe

Ser Gin Ala Glu

He Pro Vai Leu 75

Glu Leu Asp Pro 90

Thr Met Gin Thr 105

Ala Gin Ser Arg

Ser Vai Ala Phe 15

Glu Lys Tyr Leu 30

Vai Asp Gin He 45

Asp Vai Glu He

Ser Vai Glu Leu 80

Ala He Ala Tyr 95

Vai Pro Trp Gly 110

Gly Phe Thr Gly

121

115

Thr Gly Vai Arg 130

Asp Leu Arg lie 145 lie Ser Asp Gly

Ala Leu Asn Asn

180

Leu Tyr Gly Vai 195

Gly lie Ala Gin 210

Ala Asn Met Ser 225

Ala Vai Asn Gin

Gly Asn Ser Gly 260

Ala Met Ala Vai

275

Ser Gin Tyr Gly 290

Gin Ser Thr Vai 305

Met Ala Thr Pro

Asn Pro Ser Trp 340

Ala Thr Asn Leu 355

Ala Glu Ala Ala

370

120

Vai Ala Vai Leu

135

Arg Gly Gly Ala 150

Asn Gly His Gly 165

Ser lie Gly Vai

Lys Vai Leu Gly

200

Gly Leu Gin Trp 215

Leu Gly Ser Ser 230

Ala Thr Ala Ser 245

Ala Gly Asn Vai

Gly Ala Thr Asp 280

Ala Gly Leu Asp 295

Pro Gly Asn Gly 310

His Vai Ala Gly 325

Ser Asn Vai Gin

Gly Asn Thr Thr

360

Thr Arg

Asp Thr Gly lie 140

Ser Phe Vai Pro

155

Thr His Vai Ala

170

Leu Gly Vai Ala 185

Ala Ser Gly Ser

Ala Ala Asn Asn

220

Ala Gly Ser Ala 235

Gly Vai Leu Vai 250

Gly Phe Pro Ala 265

Gin Asn Asn Asn lie Vai Ala Pro

300

Tyr Ala Ser Phe 315

Vai Ala Ala Leu

330 lie Arg Asn His 345

Gin Phe Gly Ser

125

Ser Asn His Ala

Gly Glu Pro Asn

160

Gly Thr lie Ala 175

Pro Asn Vai Asp 190

Gly Ser lie Ser 205

Gly Met His lie

Thr Met Glu Gin

240

Vai Ala Ala Ser

255

Arg Tyr Ala Asn 270

Arg Ala Ser Phe 285

Gly Vai Gly Vai

Asn Gly Thr Ser 320

Vai Lys Gin Lys 335

Leu Lys Asn Thr 350

Gly Leu Vai Asn 3 65

Claims (51)

122

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Szubtilizin típusú alkalikus proteáz, mely a 2. számon megadott aminosav szekvenciával legalább 98,8 %-ban azonos.

2. Szubtilizin típusú alkalikus proteáz, mely a 2. számon megadott aminosav szekvenciával legalább 99,6 %-ban azonos.

3. Szubtilizin típusú alkalikus proteáz, mely a 2. számon megadott aminosav szekvenciának 106-374-ig terjedő szakaszával legalább 267 aminosavban azonos.

4. Szubtilizin típusú alkalikus proteáz, mely a 2. számon megadott aminosav szekvenciának 106-374-ig terjedő szakaszával legalább 268 aminosavában azonos.

5. Szubtilizin típusú alkalikus proteáz, mely az 1. számon megadott nukleotid szekvenciával legalább 98,6 %-ban azonos.

6. Szubtilizin típusú alkalikus proteáz, mely az 1. számon megadott nukleotid szekvenciával legalább 99 %-ban azonos.

7. Szubtilizin típusú alkalikus proteáz, mely az 1. számon megadott nukleotid szekvenciával az adott területen, mely a 2. számon megadott aminosav szekvencia 106-374. helyzeteit jelenti, legalább 99,4 %-ban azonos.

8. Szubtilizin típusú alkalikus proteáz, mely a 2. számon megadott aminosav szekvenciával teljes egészében, előnyösen a 106-374. helyzetekben azonos, és/vagy az 1. számon megadott nukleotid szekvenciából levezethető aminosav szekvenciával teljes egészében, előnyösen a 2. szekvencia 106-374. helyzeteivel azonos.

9. Szubtilizin típusú alkalikus proteázból vagy az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti fehérjéből vagy fragmensből in

123 szerciós mutagenezissel, szubsztitúciós mutagenezissel és/vagy legalább egy másik fehérje vagy fehérje fragmens fúziójával levezetett fehérje.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens vagy fúziós fehérje, azzal jellemezve, hogy a fehérjék hidrolízisét lehetővé teszi.

11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék, melyhez pótlólag kis molekulatömegú vegyületet kapcsoltunk az oldallánc kémiai átalakításával, bifunkciós kémiai vegyület és/vagy makromolekulák kovalens kapcsolásával, és/vagy társult kisérő anyaggal származékot képeztünk belőle.

12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék, melyet pótlólag stabilizáltunk, különösen polimer kapcsolásával és/vagy p ontmutáció val.

13. Fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék, azzal jellemezve, hogy az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék legalább egy antigén determinánsában közös.

14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék, mely természetes forrásból, különösen mikroorganizmusból nyerhető.

15. A 14. igénypont szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék, mely esetében a mikroorganizmus Gram-pozitív baktérium.

16. A 15. igénypont szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék, mely esetében a Gram-pozitív baktérium bél-bacillus.

124

17. A 16. igénypontok szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék, mely esetében a Bacillus faj a következő lehet: Bacillus sp, különösen a Bacillus sp. (DSM 14392).

18. Szubtilizin típusú alkalikus proteázt kódoló nukleinsav, melynek szekvenciája az 1. számon megadott nukleotid szekvenciával legalább 98,6 %-ban azonos.

19. Szubtilizin típusú alkalikus proteázt kódoló nukleinsav, melynek szekvenciája az 1. számon megadott nukleotid szekvenciával legalább 99,4 %-ban azonos, különösen az 1. szekvencia 316-1125 helyzeteinek megfelelő területen.

20. Szubtilizin típusú alkalikus proteázt kódoló nukleinsav, melynek szekvenciája az 1. számon megadott nukleotid szekvenciával azonos, különösen az 1. szekvencia 316-1125. helyzeteinek megfelelő területen.

21. Nukleinsav, mely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot kódolja.

22. A 18-21. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav, mely természetes forrásból származik, különösen mikroorganizmusból nyerhető.

23. A 22. igénypont szerinti nukleinsav, mely esetében a mikroorganizmus Gram-pozitív baktérium.

24. A 23. igénypont szerinti nukleinsav, mely esetében a Gram-pozitív baktérium bél-bacillus.

25. A 24. igénypontok szerinti nukleinsav, mely esetében a Bacillus faj a következő lehet: Bacillus sp, különösen a Bacillus sp. (DSM 14392).

26. Vektor, mely a 18-25. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav területet tartalmazza, különösen az, mely az 1-17.

125 .;λ ^:4· <· L”· Γ igénypontok bármelyike szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot kódolja.

27. A 26. igénypont szerinti klónozó vektor.

28. A 26. igénypont szerinti expressziós vektor.

29. Sejt, melyben a 18-25. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav területet tartalmazza, különösen az, mely az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot kódolja, előnyösen a 26-28. igénypontok bármelyike szerinti vektoron.

30. Gazdasejt, mely az 1-17, igénypontok bármelyike szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot kifejezi, vagy ezek kifejezését szabályozza, különösen a 18-25. igénypontok bármelyike szerint megnevezett nukleinsav terület bevitele után, különösen a 28. igénypont szerinti expressziós vektor bejuttatását követően.

31. A 30. igénypont szerinti gazdasejt, mely baktérium, különösen, mely képes a felépített fehérjét a táptalajba juttatni.

32. A 31. igénypont szerinti baktérium, mely Gram-pozitív, különösen bél-bacillus, elsődlegesen a következő fajok közül választható: Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis vagy Bacillus alcalophilus.

33. A 29. vagy a 30. igénypont szerinti sejt, mely eukarióta, különösen az, mely képes a fehérje transzlációt követő módosítására.

34. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerint megnevezett fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék előállítási eljárása, miután a 18-25. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavat, és/vagy a 26-28. igénypontok bármelyike

12 6 szerinti vektort és/vagy a 29-33. igénypontok bármelyike szerinti sejtet az eljárásba bevonjuk.

35. Szer, mely az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot tartalmazza.

36. Mosó- és tisztítószer, mely az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot tartalmazza.

37. A 36. igénypont szerinti szer, mely grammonként a fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot 2 pg 160 mg, előnyösen 5 pg - 140 mg, különösen előnyösen 20 pg 120 mg, előnyösebben 50 pg - 80 mg mennyiségben tartalmazza.

38. A 36. vagy a 37. igénypont szerinti szer, mely további enzimet, főleg más proteázt, amilázt, cellulázt, hemicellulázt, oxireduktázt és/vagy lipázt tartalmaz.

39. Szer textil nyersanyagok kezeléséhez, vagy textíliák ápolásához, mely magában vagy más aktív alkotórészekkel együtt az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot tartalmazza, különösen természetes alapú rostokhoz, vagy a textíliákhoz, úgymint gyapjúhoz vagy selyemhez.

40. Eljárás textíliák vagy szilárd felületek gépi tisztításához, azzal jellemezve, hogy legalább az egyik eljárási lépésben az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét, fehérje fragmenst, fúziós fehérjét vagy származékot alkalmanként 40 pg - 32 mg, előnyösen 50 pg - 24 mg, különösen 100 pg - 16 g, előnyösen 200 pg - 8 mg mennyiségben tartalmazza.

41. Eljárás textil nyersanyagok kezeléséhez vagy textíliák ápolásához, azzal jellemezve, hogy legalább az egyik eljárási lé

Υ2.Ί pésben az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék aktív, különösen természetes alapú rostokhoz, vagy a textíliákhoz, úgymint gyapjúhoz vagy selyemhez.

42. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti proteolítikusan aktív fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék alkalmazása textíliák vagy szilárd felületek tisztításához, különösen alkalmanként 40 pg - 32 mg, előnyösen 50 pg - 24 mg, előnyösebben 100 pg - 16 mg, különösen előnyösen 200 pg - 8 mg mennyiségben.

43. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék alkalmazása a mosó- és tisztítószerek alkotórészeinek aktiválásához vagy deaktiválásához.

44. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék alkalmazása biológiai analízisben vagy kis molekulatömegű vegyületek vagy fehérjék szintézisében.

45. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék alkalmazása természetes anyagok vagy biológiailag értékes anyagok előállításához, tisztításához vagy szintéziséhez.

46. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék alkalmazása a természetes nyersanyagok kezeléséhez, különösen felszíni kezeléséhez, elsődlegesen a bőrfeldolgozási eljárásokban.

47. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék alkalmazása a nyersanyagok vagy a textíliák előállításában a közti termékek

128 *4 <? 7'* g⁴ nyerésében vagy kezelésében, a szövetek védőrétegeinek eltávolítása érdekében.

48. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék alkalmazása a textil nyersanyagok kezeléséhez vagy a textíliák ápolásához, különösen a gyapjú vagy a selyem vagy a selymet tartalmazó kevert textíliák kezeléséhez.

49. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék alkalmazása fotófilmek kezeléséhez, különösen a zselatint tartalmazó vagy hasonló védőrétegek eltávolítására.

50. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék alkalmazása élelmiszerek vagy takarmányok előállításához.

51. Kozmetikum, az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérjével, fehérje fragmenssel, fúziós fehérjével vagy származékkal, vagy olyan kozmetikum, mely az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, fehérje fragmens, fúziós fehérje vagy származék egybedolgozásával alakul ki, kozmetikai célra, különösen a szóban forgó eljárás vagy szer keretében.

tagja

H-1062 Budapest, Andrássy út 113. Telefon: 461-1000 Fax: 461-1099