DE19700327A1 - Protease- und amylasehaltiges Waschmittel - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft enzymhaltige Waschmittel, die neben üblichen Bestandteilen eine bestimmte Protease und eine bestimmte Amylase enthalten.

Enzyme, insbesondere proteolytische Enzyme, finden ausgedehnte Verwendung in Wasch-, Waschhilfs- und Reinigungsmitteln. Derzeit werden ausschließlich Proteasen aus der Subti­ lisinfamilie eingesetzt. Dabei handelt es sich um extrazelluläre Proteine mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 20 000 bis 45 000. Subtilisine sind relativ unspezifische Enzyme, die neben der hydrolytischen Wirkung auf Peptidbindungen auch esterolytische Eigenschaften aufweisen (M. Bahn, R.D. Schmidt, Biotec 1, 119 1987). Viele Vertreter der Subtilisine sind physikalisch und chemisch genau charakterisiert. Ihre räumliche Struktur ist durch Röntgenstrukturanalyse oft im Detail bekannt. Hierdurch sind die Voraussetzungen für molekulares Modelling und sogenanntes Protein Engineering in Form gezielter Mutagenese gegeben (Kraut, Ann. Rev. Biochem. 46, 331-358, 1977). Gentechnische Modifikationen von Proteasen sind vielfach beschrieben; so waren im Juni 1991 bereits 219 durch Protein Engineering erhaltene Proteinvarianten der Subtilisine bekannt (A. Recktenwald et al., J.Biotechnol. 28, 1-23, 1993). Die meisten dieser Varianten wurden erzeugt, um die Stabilität der Proteasen zu verbessern.

Eine unter stark alkalischen Bedingungen stabile und aktive Protease aus der Subtilisinfamilie kann wie in der internationalen Patentanmeldung WO 91/02792 beschrieben in Bacillus lentus (DSM 5483) produziert werden. Diese Bacillus lentus alkalische Protease (BLAP) kann durch Fermentation von Bacillus licheniformis produziert werden, der mit einem Expressionsplasmid transformiert wurde, welches das Gen für BLAP unter der Kontrolle des Promotors aus Bacillus licheniformis ATCC 53926 trägt. Die Zusammensetzung wie auch die räumliche Struktur von BLAP ist bekannt (D.W. Godette et al. J.Mol.Biol. 228, 580-595, 1992). Diese Protease ist durch die in der zitierten Literatur be­ schriebene Sequenz aus 269 Aminosäuren, ein rechnerisches Molekulargewicht von 26 823 Dalton und einen theoretischen isoelektrischen Punkt von 9,7 charakterisiert. Durch Mutation zugängliche Varianten dieser Bacillus lentus DSM 5483 Protease sind in der US- amerikanischen Patentschrift US 5 340 735 beschrieben. Unter diesen sind Proteaseenzyme, die bei insbesondere mehrfacher Waschbehandlung von Textilien aus proteinogenen Fasern, beispielsweise textilen Flächengebilden aus Naturseide oder Wolle, ohne Verlust an Reinigungsleistung zu besonders geringen Substanzschädigungen beziehungsweise Zerstörungen der Faserverbände führen.

Amylasen haben die Aufgabe, die Entfernung stärkehaltiger Anschmutzungen durch die katalytische Hydrolyse des Stärke-Polysaccharids zu erleichtern und werden zu diesem Zweck ebenfalls seit längerer Zeit in Reinigungsmitteln für Geschirr, aber auch in Wasch­ mitteln eingesetzt. Dabei ist beobachtet worden, daß die Leistung von Amylasen, die den in der Natur vorkommenden Enzymen entsprechen, durch in solchen Mitteln üblicherweise enthaltene Bleichmittel relativ stark beeinträchtigt wird. Neben der Erhöhung ihrer Leistungsfähigkeit hat die gentechnische Modifikation von Amylasen daher im wesentlichen die Stabilitätserhöhung gegen den Angriff von Oxdationsmitteln zum Ziel. Ein Ansatz zur Erreichung dieses Ziels, der in der internationalen Patentanmeldung WO 94/18314 vorgeschlagen wurde, besteht in der Entfernung besonders oxidationsanfälliger Aminosäuren, wie Methionin, Tryptophan, Cystein oder Tyrosin, aus der Aminosäuresequenz der Amylase, oder deren Austausch durch andere, oxidationsstabilere Aminosäuren. Ein ähnliches Vorgehen wird auch in der internationalen Patentanmeldung WO 95/21247 vorgeschlagen, die empfiehlt, in der Amylase-Aminosäuresequenz mindestens ein Methionin durch eine Aminosäure, die weder Methionin noch Cystein ist, auszutauschen.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Kombination aus einer oben beschriebe­ nen gentechnisch veränderten Protease und einer obengenannten gentechnisch veränderten Amylase zu unerwartetet synergistischen Leistungsverbesserungen führt, wenn man sie in Waschmitteln einsetzt.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein protease- und amylasehaltiges Textilwaschmittel, das neben üblichen mit derartigen Enzymen verträglichen Inhaltsstoffen eine Proteasemutante, bei der in Position 211 (BLAP-Zählung) die an dieser Stelle in der Wildtyp-Protease vorhandene Aminosäure Leucin gegen Asparaginsäure oder Glutamin­ säure ausgetauscht ist, und eine Amylasemutante, bei der mindestens ein in der Wildtyp- Amylase vorhandenes Methionin, Tryptophan, Cystein oder Tyrosin entfernt oder durch eine andere Aminosäure ausgetauscht ist, die insbesondere nicht Cystein oder Methionin ist, enthält.

Vorzugsweise weist das Mittel eine proteolytische Aktivität im Bereich von etwa 100 PE/g bis etwa 7500 PE/g, insbesondere 500 PE/g bis 5000 PE/g auf. Die Proteaseaktivität wird gemäß dem nachfolgend beschriebenen standardisierten Verfahren, wie in Tenside 2 (1970), 125 beschrieben, bestimmt: Eine Lösung, die 12 g/l Casein und 30 mM Natriumtripoly­ phosphat in Wasser des Härtegrades 15°dH (enthaltend 0,058 Gew.-% CaCl₂.2 H₂O, 0,028 Gew.-% MgCl₂.6 H₂O und 0,042 Gew.-% NaHCO₃) wird auf 70°C erwärmt, der pH-Wert wird durch Zugabe von 0,1 N NaOH auf 8,5 bei 50°C eingestellt. Zu 600 ml der Substratlösung werden 200 ml einer Lösung des zu testenden Enzyms in 2 gewichtsprozen­ tiger Natriumtripolyphosphat-Pufferlösung (pH 8,5) gegeben. Die Reaktionsmischung wird bei 50°C für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird danach durch Zugabe von 500 ml TCA-Lösung (0,44 M Trichloressigsäure und 0,22 M Natriumacetat in 3 volumenprozentiger Essigsäure) und Abkühlen (Eisbad bei 0°C, 15 Minuten) gestoppt. Das TCA-unlösliche Protein wird durch Zentrifugation entfernt, 900 ml des Überstandes werden mit 300 ml 2 N NaOH verdünnt. Die Absorption dieser Lösung bei 290 nm wird mit Hilfe eines Absorptionsspektrometers bestimmt, wobei der Absorptionsnullwert durch das Messen einer zentrifugierten Lösung, die durch Mischen von 600 ml der obengenannten TCA-Lösung mit 600 ml der obengenannten Substratlösung und anschließender Zugabe der Enzymlösung hergestellt wird, zu bestimmen ist. Die proteolytische Aktivität einer Proteaselösung, die unter den angegebenen Meßbedingungen eine Absorption von 0,500 OD bewirkt, wird zu 10 PE (Protease-Einheiten) pro ml definiert.

Das Mittel weist vorzugsweise eine amylolytische Aktivität von 50 NU/g bis 1000 NU/g, insbesondere 75 NU/g bis 750 NU/g, auf ("Novo-Units" pro Gramm gemäß der Standard- Methode der Firma Novo, wobei 1 Kilo-Novo-Unit die Enzymmenge ist, die 5,26 g Stärke bei pH 5,6 und 37°C abbaut, basierend auf der von P. Bernfeld in S.P. Colowick und N.D. Kaplan, Methods in Enzymology, Band 1, 1955, Seite 149 beschriebenen Methode).

Zu den erfindungsgemäß brauchbaren Proteasen zählen gentechnisch veränderte Proteasen des obengenannten BLAP-Typs, bei denen in Position 211 (BLAP-Zählung) die an dieser Stelle in der Wildtyp-Protease vorhandene Aminosäure Leucin (L im gebräuchlichen Ein- Buchstaben-Code) gegen Asparaginsäure (D) beziehungsweise Glutaminsäure (E) ausge­ tauscht ist (L211D beziehungsweise L211E). Diese können wie in der internationalen Pa­ tentanmeldung WO 95/23221 beschrieben hergestellt werden. Zusätzlich können weitere Veränderungen gegenüber der ursprünglichen Bacillus lentus-Protease, wie beispielsweise mindestens einer der Aminosäureaustausche S3T, V4I, R99G, R99A, R99S, A188P, V193M und/oder V199I, vorgenommen worden sein. Besonders bevorzugt ist die in der genannten internationalen Patentanmeldung als F49 aufgeführte Variante, bei welcher die Aminosäure­ austausche S3T + V4I + A188P + V193M + V1991 + L211D vorgenommen wurden. Bei der vorstehend beschriebenen Proteasenomenklatur über den Austausch einzelner Aminosäuren ist zu beachten, daß die Numerierung der Aminosäurepositionen in BLAP sich von der häufig anzutreffenden des Subtilisin BPN unterscheidet. Die Numerierung der Positionen 1 bis 35 ist identisch in Subtilisin BPNt und BLAP; aufgrund fehlender korrespondierender Aminosäuren entsprechen die Positionen 36 bis 54 in BLAP den Positionen 37 bis 55 in BPN', ebenso die Positionen 55 bis 160 in BLAP den Positionen 57 bis 162 in BPN und die Positionen 161 bis 269 denen von 167 bis 275 in BPN'.

Zu den erfindungsgemäß brauchbaren Amylasen gehören insbesondere gentechnisch verän­ derte Amylasen, die sich durch Austausch des Methionins in Position 197 durch eine andere Aminosäure, insbesondere Leucin, Threonin, Alanin, Glycin, Serin, Isoleucin, Asparagin oder Asparaginsäure, von der in Bacillus licheniformis vorkommenden α-Amylase (Wildtyp-Amylase) ableiten. Analog der oben für Proteasen beschriebenen Nomenklatur werden diese Amylasen als M197L, M197T, M197A, M197G, M197S, M197I, M197N und M197D bezeichnet. Die Entfernung sonstiger Aminosäuren, insbesondere an den Positionen 1 und/oder 2 (mit (1-2)* bezeichnet), und/oder weitere Aminosäureaustausche wie L3V, M15T, M15L, R23K, S29A, A30E, Y31H, A33S, E34D, H68Q, W138F, W138Y, R242P, H35I, E255P, T341P, Q374P, E458D, P459T, V461K, N463G und/oder E465D etc., die aus den obengenannten internationalen Patentanmeldungen bekannt sind, können vorgenommen werden. Auch entsprechend veränderte Wildtyp-Amylasen aus anderen Mikroorganismen, wie Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus stearothermophilus, deren Aminosäuresequenz-Homologie zur Amylase aus Bacillus licheniformis aus der internationalen Patentanmeldung WO 94/18314 bekannt ist, können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Handelsübliche gentechnisch veränderter Amylasen im Sinne der Erfindung sind zum Beispiel Duromyl® von Novo Nordisk und Purafect® OxAm von Genencor International.

Die erfindungswesentliche Kombination aus gentechnisch veränderter Protease und gentechnisch veränderter Amylase kann durch Einarbeitung der zwei separaten be­ ziehungsweise in bekannter Weise separat konfektionierten Enzyme oder durch gemeinsam in einem Granulat konfektionierte Protease und Amylase, wie zum Beispiel aus den interna­ tionalen Patentanmeldungen WO 96/00772 oder WO 96/00773 bekannt, in erfindungs­ gemäßen Waschmitteln eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Waschmittel, die als insbesondere pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können außer der erfindungsgemäß eingesetzten Enzymkombination im Prinzip alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten. Die erfindungs­ gemäßen Mittel können insbesondere Buildersubstanzen, oberflächenaktive Tenside, Bleichmittel auf Basis organischer und/oder anorganischer Persauerstoffverbindungen, Bleichaktivatoren, wassermischbare organische Lösungsmittel, zusätzliche Enzyme, Seque­ strierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und weitere Hilfsstoffe, wie optische Auf­ heller, Vergrauungsinhibitoren, Farbübertragungsinhibitoren, Schaumregulatoren, Farb- und Duftstoffe enthalten.

Die erfindungsgemäßen Mittel können Tenside enthalten, wobei insbesondere anionische Tenside, nichtionische Tenside und deren Gemische in Frage kommen. Geeignete nichtio­ nische Tenside sind insbesondere Alkylglykoside und Ethoxylierungs- und/oder Propoxy­ lierungsprodukte von Alkylglykosiden oder linearen oder verzweigten Alkoholen mit jeweils 12 bis 18 C-Atomen im Alkylteil und 3 bis 20, vorzugsweise 4 bis 10 Alkylether­ gruppen. Weiterhin sind entsprechende Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von N-Alkylaminen, vicinalen Diolen, Fettsäureestern und Fettsäureamiden, die hinsichtlich des Alkylteils den genannten langkettigen Alkoholderivaten entsprechen, sowie von Alkyl­ phenolen mit 5 bis 12 C-Atomem im Alkylrest brauchbar.

Geeignete anionische Tenside sind insbesondere Seifen und solche, die Sulfat- oder Sulfo­ nat-Gruppen mit bevorzugt Alkaliionen als Kationen enthalten. Verwendbare Seifen sind bevorzugt die Alkalisalze der gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren mit 12 bis 18 C- Atomen. Derartige Fettsäuren können auch in nicht vollständig neutralisierter Form eingesetzt werden. Zu den brauchbaren Tensiden des Sulfat-Typs gehören die Salze der Schwefelsäurehalbester von Fettalkoholen mit 12 bis 18 C-Atomen und die Sulfatierungs­ produkte der genannten nichtionischen Tenside mit niedrigem Ethoxylierungsgrad. Zu den verwendbaren Tensiden vom Sulfonat-Typ gehören lineare Alkylbenzolsulfonate mit 9 bis 14 C-Atomen im Alkylteil, Alkansulfonate mit 12 bis 18 C-Atomen, sowie Olefinsulfonate mit 12 bis 18 C-Atomen, die bei der Umsetzung entsprechender Monoolefine mit Schwefel­ trioxid entstehen, sowie alpha-Sulfofettsäureester, die bei der Sulfonierung von Fettsäure­ methyl- oder -ethylestem entstehen.

Tenside sind in den erfindungsgemäßen Waschmitteln in Mengenanteilen von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, enthalten.

Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält vorzugsweise mindestens einen wasserlöslichen und/oder wasserunlöslichen, organischen und/oder anorganischen Builder. Zu den wasser­ löslichen organischen Buildersubstanzen gehören Polycarbonsäuren, insbesondere Citronensäure und Zuckersäuren, monomere und polymere Aminopolycarbonsäuren, ins­ besondere Methylglycindiessigsäure, Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure sowie Polyasparaginsäure, Polyphosphonsäuren, insbesondere Aminotris(methylenphos­ phonsäure), Ethylendiamintetrakis(methylenphosphonsäure) und 1-Hydroxyethan- 1,1-di­ phosphonsäure, polymere Hydroxyverbindungen wie Dextrin sowie polymere (Poly-)car­ bonsäuren, insbesondere die durch Oxidation von Polysacchariden beziehungsweise Dextrinen zugänglichen Polycarboxylate der internationalen Patentanmeldung WO 93/16110 beziehungsweise der internationalen Patentanmeldung WO 92/18542 oder der europäischen Patentschrift EP 0 232 202, polymere Acrylsäuren, Methacrylsäuren, Maleinsäuren und Mischpolymere aus diesen, die auch geringe Anteile polymerisierbarer Substanzen ohne Carbonsäurefunktionalität einpolymerisiert enthalten können. Die relative Molekülmasse der Homopolymeren ungesättigter Carbonsäuren liegt im allgemeinen zwischen 5 000 und 200 000, die der Copolymeren zwischen 2 000 und 200 000, vorzugs­ weise 50 000 bis 120 000, jeweils bezogen auf freie Säure. Ein besonders bevorzugtes Acrylsäure-Maleinsäure-Copolymer weist eine relative Molekülmasse von 50 000 bis 100 000 auf. Geeignete, wenn auch weniger bevorzugte Verbindungen dieser Klasse sind Copolymere der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Vinylethern, wie Vinylmethylethern, Vinylester, Ethylen, Propylen und Styrol, in denen der Anteil der Säure mindestens 50 Gew.-% beträgt. Als wasserlösliche organische Buildersubstanzen können auch Terpo­ lymere eingesetzt werden, die als Monomere zwei ungesättigte Säuren und/oder deren Salze sowie als drittes Monomer Vinylalkohol und/oder einem veresterten Vinylalkohol oder ein Kohlenhydrat enthalten. Das erste saure Monomer beziehungsweise dessen Salz leitet sich von einer monoethylenisch ungesättigten C₃-C₈-Carbonsäure und vorzugsweise von einer C₃-C₄-Monocarbonsäure, insbesondere von (Meth)-acrylsäure ab. Das zweite saure Monomer beziehungsweise dessen Salz kann ein Derivat einer C₄-C₈-Dicarbonsäure, wobei Maleinsäure besonders bevorzugt ist, und/oder ein Derivat einer Allylsulfonsäure, die in 2- Stellung mit einem Alkyl- oder Arylrest substituiert ist, sein. Derartige Polymere lassen sich insbesondere nach Verfahren herstellen, die in der deutschen Patentschrift DE 42 21 381 und der deutschen Patentanmeldung DE 43 00 772 beschrieben sind, und weisen im allgemeinen eine relative Molekülmasse zwischen 1 000 und 200 000 auf. Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die in den deutschen Patentanmeldungen DE 43 03 320 und DE 44 17 734 beschrieben werden und als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Vinylacetat aufweisen. Die organischen Buildersubstanzen können, insbesondere zur Herstellung flüssiger Mittel, in Form wäßriger Lösungen, vorzugsweise in Form 30- bis 50-gewichtsprozentiger wäßriger Lösungen einge­ setzt werden. Alle genannten Säuren werden in der Regel in Form ihrer wasserlöslichen Sal­ ze, insbesondere ihre Alkalisalze, eingesetzt.

Derartige organische Buildersubstanzen können gewünschtenfalls in Mengen bis zu 40 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-% und vorzugsweise von 1 Gew.-% bis 8 Gew.-% enthalten sein. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in pastenförmigen oder flüssigen, insbesondere wasserhaltigen, erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt.

Als wasserlösliche anorganische Buildermaterialien kommen insbesondere Alkalisilikate und Polyphosphate, vorzugsweise Natriumtripolyphosphat, in Betracht. Als wasser­ unlösliche, wasserdispergierbare anorganische Buildermaterialien werden insbesondere kri­ stalline oder amorphe Alkalialumosilikate, in Mengen von bis zu 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht über 40 Gew.-% und in flüssigen Mitteln insbesondere von 1 Gew.-% bis 5 Gew.-%, eingesetzt. Unter diesen sind die kristallinen Natriumalumosilikate in Waschmittelqualität, insbesondere Zeolith A, P und gegebenenfalls X, bevorzugt. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in festen, teilchenförmigen Mitteln eingesetzt. Geeignete Alumosilikate weisen insbesondere keine Teilchen mit einer Korngröße über 30 µm auf und bestehen vorzugsweise zu wenigstens 80 Gew.-% aus Teilchen mit einer Größe unter 10 µm. Ihr Calciumbindevermögen, das nach den Angaben der deutschen Patentschrift DE 24 12 837 bestimmt werden kann, liegt in der Regel im Bereich von 100 bis 200 mg CaO pro Gramm.

Geeignete Substitute beziehungsweise Teilsubstitute für das genannte Alumosilikat sind kristalline Alkalisilikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können. Die in den erfindungsgemäßen Mitteln als Gerüststoffe brauchbaren Alkalisilikate weisen vorzugsweise ein molares Verhältnis von Alkalioxid zu SiO₂ unter 0,95, insbesondere von 1 : 1,1 bis 1 : 12 auf und können amorph oder kristallin vorliegen. Be­ vorzugte Alkalisilikate sind die Natriumsilikate, insbesondere die amorphen Natriumsili­ kate, mit einem molaren Verhältnis Na₂O:SiO₂ von 1 : 2 bis 1 : 2,8. Solche mit einem molaren Verhältnis Na₂O:SiO₂ von 1 : 1,9 bis 1 : 2,8 können nach dem Verfahren der europäischen Pa­ tentanmeldung EP 0 425 427 hergestellt werden. Als kristalline Silikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können, werden vorzugsweise kristalline Schichtsilikate der allgemeinen Formel Na₂Si_xO_2x-1.y H₂O eingesetzt, in der x, das soge­ nannte Modul, eine Zahl von 1,9 bis 4 und y eine Zahl von 0 bis 20 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Kristalline Schichtsilikate, die unter diese allgemeine Formel fallen, werden beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung EP 0 164 514 be­ schrieben. Bevorzugte kristalline Schichtsilikate sind solche, bei denen x in der genannten allgemeinen Formel die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl ß- als auch β- Natriumdisilikate (Na₂Si₂O₅.y H₂O) bevorzugt, wobei β-Natriumdisilikat beispielsweise nach dem Verfahren erhalten werden kann, das in der internationalen Patentanmeldung WO 91/08171 beschrieben ist. δ-Natriumsilikate mit einem Modul zwischen 1,9 und 3,2 können gemäß den japanischen Patentanmeldungen JP 04/238 809 oder JP 04/260 610 hergestellt werden. Auch aus amorphen Alkalisilikaten hergestellte, praktisch wasserfreie kristalline Alkalisilikate der obengenannten allgemeinen Formel, in der x eine Zahl von 1,9 bis 2,1 bedeutet, herstellbar wie in den europäischen Patentanmeldungen EP 0 548 599, EP 0 502 325 und EP 0452 428 beschrieben, können in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel wird ein kristallines Natriumschichtsilikat mit einem Modul von 2 bis 3 eingesetzt, wie es nach dem Verfahren der europäischen Patentanmeldung EP 0 436 835 aus Sand und Soda hergestellt werden kann. Kristalline Natriumsilikate mit einem Modul im Bereich von 1,9 bis 3,5, wie sie nach den Verfahren der europäischen Patentschriften EP 0 164 552 und/oder EP 0 293 753 erhältlich sind, werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungs­ form erfindungsgemäßer Mittel eingesetzt. Falls als zusätzliche Buildersubstanz auch Alka­ lialumosilikat, insbesondere Zeolith, vorhanden ist, beträgt das Gewichtsverhältnis Alumo­ silikat zu Silikat, jeweils bezogen auf wasserfreie Aktivsubstanzen, vorzugsweise 1 : 10 bis 10 : 1. In Mitteln, die sowohl amorphe als auch kristalline Alkalisilikate enthalten, beträgt das Gewichtsverhältnis von amorphem Alkalisilikat zu kristallinem Alkalisilikat vorzugsweise 1 : 2 bis 2 : 1 und insbesondere 1 : 1 bis 2 : 1.

Buildersubstanzen sind in den erfindungsgemäßen Waschmitteln vorzugsweise in Mengen bis zu 60 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 40 Gew.-%, enthalten.

Als geeignete Persauerstoffverbindungen kommen insbesondere organische Persäuren be­ ziehungsweise persaure Salze organischer Säuren, wie Phthalimidopercapronsäure, Perben­ zoesäure oder Salze der Diperdodecandisäure, Wasserstoffperoxid und unter den Waschbe­ dingungen Wasserstoffperoxid abgebende anorganische Salze, wie Perborat, Percarbonat und/oder Persilikat, in Betracht. Sofern feste Persauerstoffverbindungen eingesetzt werden sollen, können diese in Form von Pulvern oder Granulaten verwendet werden, die auch in im Prinzip bekannter Weise umhüllt sein können. Besonders bevorzugt wird Alkaliper­ carbonat, Alkaliperborat-Monohydrat oder Wasserstoffperoxid in Form wäßriger Lösungen, die 3 Gew.-% bis 10 Gew.-% Wasserstoffperoxid enthalten, eingesetzt. Falls ein erfindungs­ gemäßes Waschmittel Persauerstoffverbindungen enthält, sind diese in Mengen von vor­ zugsweise bis zu 50 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, vorhanden. Der Zusatz geringer Mengen bekannter Bleichmittelstabilisatoren wie beispielsweise von Phos­ phonaten, Boraten beziehungsweise Metaboraten und Metasilikaten sowie Magnesiumsal­ zen wie Magnesiumsulfat kann zweckdienlich sein.

Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C- Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro- 1,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glykolurile, insbesondere Tetraacetylglykoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n- Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- bzw. iso-NOBS), Carbonsäureannydride, insbesondere Phthalsäureahhydrid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglykoldiacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und die aus den deutschen Patentanmeldungen DE 196 16 693 und DE 196 16 767 bekannten Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren in der europäischen Patentanmeldung EP 0 525 239 beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zucker­ derivate, insbesondere Pentaacetylglukose (PAG), Pentaacetylfruktose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin und Gluco­ nolacton, und/oder N-acylierte Lactame, beispielsweise N-Benzoylcaprolactam, die aus den internationalen Patentanmeldungen WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 und WO 95/17498 bekannt sind. Die aus der deutschen Pa­ tentanmeldung DE 196 16 769 bekannten hydrophil substituierten Acylacetale und die in der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 770 sowie der internationalen Patentanmeldung WO 95/14075 beschriebenen Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch die aus der deutschen Patentanmeldung DE 44 43 177 bekannten Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Derartige Bleichaktivatoren sind im üblichen Mengenbereich, vorzugsweise in Mengen von 1 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 2 Gew.-% bis 8 Gew.-%, bezogen auf gesamtes Mittel, enthalten.

Zusätzlich zu den oben aufgeführten konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch die aus den europäischen Patentschriften EP 0 446 982 und EP 0 453 003 be­ kannten Sulfonimine und/oder bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe als sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein. Zu den in Frage kommenden Übergangsmetallverbindungen gehören insbesondere die aus der deutschen Patentanmeldung DE 195 29 905 bekannten Mangan-, Eisen-, Cobalt-, Ruthenium- oder Molybdän-Salenkomplexe und deren aus der deutschen Patentanmeldung DE 196 20 267 bekannte N-Analogverbindungen, die aus der deutschen Patentanmeldung DE 195 36 082 bekannten Mangan-, Eisen-, Cobalt-, Ruthenium- oder Molybdän- Carbonylkomplexe, die in der deutschen Patentanmeldung DE 196 05 688 beschriebenen Mangan-, Eisen-, Cobalt-, Ruthenium-, Molybdän-, Titan-, Vanadium- und Kupfer- Komplexe mit stickstoffhaltigen Tripod-Liganden, die aus der deutschen Patentanmeldung DE 196 20 411 bekannten Cobalt-, Eisen-, Kupfer- und Ruthenium-Amunimkomplexe, die in der deutschen Patentanmeldung DE 44 16 438 beschriebenen Mangan-, Kupfer- und Cobalt- Komplexe, die in der europäischen Patentanmeldung EP 0 272 030 beschriebenen Cobalt- Komplexe, die aus der europäischen Patentanmeldung EP 0 693 550 bekannten Mangan- Komplexe, die aus der europäischen Patentschrift EP 0 392 592 bekannten Mangan-, Eisen-, Cobalt- und Kupfer-Komplexe, die aus den internationalen Patentanmeldungen WO 96/23859, WO 96/23860 und WO 96/23861 bekannten Cobalt-Komplexe und/oder die in der europäischen Patentschrift EP 0 443 651 oder den europäischen Patentanmeldungen EP 0 458 397, EP 0 458 398, EP 0 549 271, EP 0 549 272, EP 0 544 490 und EP 0 544 519 beschriebenen Mangan-Komplexe. Kombinationen aus Bleichaktivatoren und Übergangsmetall-Bleichkatalysatoren sind beispielsweise aus der deutschen Patentanmeldung DE 196 13 103 und der internationalen Patentanmeldung WO 95/27775 bekannt. Bleichverstärkende Übergangsmetallkomplexe, insbesondere mit den Zentralatomen Mn, Fe, Co, Cu, Mo, V, Ti und/oder Ru, werden in üblichen Mengen, vor­ zugsweise in einer Menge bis zu 1 Gew.-%, insbesondere von 0,0025 Gew.-% bis 0,25 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,01 Gew.-% bis 0,1 Gew.-%, jeweils bezogen auf gesamtes Mittel, eingesetzt.

Als in den Mitteln zusätzlich zur erfindungswesentlichen Protease/Amylase-Kombination verwendbare Enzyme kommen solche aus der Klasse der Lipasen, Cutinasen, Pullulanasen, Hemicellulasen, Cellulasen, Oxidasen und Peroxidasen sowie deren Gemische in Frage. Ge­ gebenenfalls können auch andere als die erfindungswesentlichen Proteasen und/oder Amyla­ sen zusätzlich zu diesen vorhanden sein. Besonders geeignet sind aus Pilzen oder Bakterien, wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Streptomyces griseus, Humicola lanuginosa, Humicola insolens, Pseudomonas pseudoalcaligenes oder Pseudomonas cepacia gewonnene enzymatische Wirkstoffe. Die erfindungswesentlichen und die gegebenenfalls zusätzlich verwendeten Enzyme können, wie zum Beispiel in den internationalen Patentanmeldungen WO 92/11347 oder WO 94/23005 beschrieben, an Trägerstoffen adsorbiert und/oder in Hüllsubstanzen eingebettet sein, um sie gegen vorzeitige Inaktivierung zu schützen. Sie sind in den erfindungsgemäßen Waschmitteln vorzugsweise in Mengen bis zu 5 Gew.-%, insbe­ sondere von 0,2 Gew.-% bis 2 Gew.-%, enthalten.

Zu den in den erfindungsgemaßen Mitteln, insbesondere wenn sie in flüssiger oder pastöser Form vorliegen, neben Wasser verwendbaren organischen Lösungsmitteln gehören Alkohole mit 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere Methanol, Ethanol, Isopropanol und tert.- Butanol, Diole mit 2 bis 4 C-Atomen, insbesondere Ethylenglykol und Propylenglykol, sowie deren Gemische und die aus den genannten Verbindungsklassen ableitbaren Ether. Derartige wassermischbare Lösungsmittel sind in den erfindungsgemäßen Waschmitteln vorzugsweise in Mengen nicht über 30 Gew.-%, insbesondere von 6 Gew.-% bis 20 Gew.­ %, vorhanden.

Zur Einstellung eines gewünschten, sich durch die Mischung der übrigen Komponenten nicht von selbst ergebenden pH-Werts können die erfindungsgemäßen Mittel system- und umweltverträgliche Säuren, insbesondere Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure und/oder Adipinsäure, aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure, oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide, enthalten. Derartige pH-Regulatoren sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.

Zusätzlich können die Mittel weitere in Wasch- und Reinigungsmitteln übliche Bestandteile enthalten. Zu diesen fakultativen Bestandteilen gehören insbesondere Enzymstabilisatoren, zusätzliche Vergrauungsinhibitoren wie Carboxymethylcellulose, Farbübertragungsinhibito­ ren, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon oder Polyvinylpyridin-N-oxid, Schaumihhibitoren, beispielsweise Organopolysiloxane und/oder Paraffine, und optische Aufheller, beispielsweise Stilbendisulfonsäurederivate.

Die Herstellung erfindungsgemäßer fester Mittel bietet keine Schwierigkeiten und kann auf bekannte Weise, zum Beispiel durch Sprühtrocknen oder Granulation, erfolgen, wobei die Enzyme und eventuelle weitere thermisch empfindliche Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Bleichmittel gegebenenfalls später separat zugesetzt werden. Zur Herstellung erfindungsge­ mäßer Mittel mit erhöhtem Schüttgewicht, insbesondere im Bereich von 650 g/l bis 950 g/l, ist ein aus der europäischen Patentschrift EP 486 592 bekanntes, einen Extrusionsschritt auf­ weisendes Verfahren bevorzugt. Flüssige beziehungsweise pastöse erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel in Form von übliche Lösungsmittel enthaltenden Lösungen werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können, hergestellt.

Beispiele

Zur Bestimmung des Waschvermögens wurden mit standardisierten Testanschmutzungen verunreinigte Baumwollgewebe bei 40°C (Waschmitteldosierung 76 g; Wasserhärte 16°d; Beladung 3,5 kg, Kurzprogramm) in einer Haushaltswaschmaschine (AEG Öko Lavamat® 694) gewaschen. In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Waschergebnisse (in dE Anfangs­ wert minus dE nach dem Waschen, Meßgerät Minolta® CR 310) für ein Waschmittel V2, das 0,6 Gew.-% nicht erfindungsgemäßes Amylasegranulat (Termamyl® 60T) und 1,2 Gew.-% eines Proteasegranulats (Aktivität 200 000 PE/g) mit der gentechnisch veränderten Protease F 49 gemäß WO 95/23221 enthielt, für ein Waschmittel V1, das an­ sonsten gleich zusammengesetzt war, aber statt F 49 proteinaktivitätsgleiche Mengen BLAP enthielt, ein ansonsten wie V1 zusammengesetztes Waschmittel V3, das statt Termamyl® die proteinaktivitätsgleiche Menge der gentechnisch veränderten Amylase Duramyl® enthielt, ein ansonsten wie V1 zusammengesetztes Waschmittel V4, das statt Termamyl® die proteinaktivitätsgleiche Menge der gentechnisch veränderten Amylase Purafect® OxAm enthielt, und für erfindungsgemäße Waschmittel M1 beziehungsweise M2, die ansonsten wie V2 zusammengesetzt waren, aber statt Termamyl® die proteinaktivitätsgleiche Menge der gentechnisch veränderten Amylase Duramyl® beziehungsweise der gentechnisch veränderten Amylase Purafect® OxAm als Ergebnis von Doppelbestimmungen angegeben.

Waschergebnisse (dE AW - dE gewaschen)

Waschergebnisse (dE AW - dE gewaschen)

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Claims (10)

1. Protease- und amylasehaltiges Textilwaschmittel, dadurch gekennzeichnet, daß es neben üblichen mit derartigen Enzymen verträglichen Inhaltsstoffen eine Proteasemutante, bei der in Position 211 (BLAP-Zählung) die an dieser Stelle in der Wildtyp-Protease vorhandene Aminosäure Leucin gegen Asparaginsäure oder Glutaminsäure ausgetauscht ist, und eine Amylasemutante, bei der mindestens ein in der Wildtyp-Amylase vorhandenes Methionin, Tryptophan, Cystein oder Tyrosin entfernt oder durch eine andere Aminosäure ausgetauscht ist, die insbesondere nicht Cystein oder Methionin ist, enthält.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine proteolytische Aktivität im Bereich von 100 PE/g bis 7500 PE/g, insbesondere 500 PE/g bis 5000 PE/g aufweist.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine amylolytische Aktivität im Bereich 50 NU/g bis 1000 NU/g, insbesondere 75 NU/g bis 750 NU/g aufweist.

4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in der Protease­ mutante der Aminosäureaustausch L211D oder L211E vorgenommen worden ist.

5. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in der Proteasemutante zusätzlich mindestens einer der Aminosäureaustausche S3T, V4I, R99G, R99A, R99S, A188P, V193M und/oder V199I vorgenommen worden ist.

6. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß in der Proteasemutante die Aminosäureaustausche S3T + V4I + AI88P + V193M + V199I + L211D vorgenommen worden sind.

7. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in der Amylase­ mutante der Aminosäureaustausch M197L, M197T, M197A, M197G, M197S, M197I, M197N oder M197D vorgenommen worden ist.

8. Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß in der Amylasemutante die Aminosäuren an den Positionen 1 und/oder 2 entfernt worden sind.

9. Mittel nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß in der Amylasemutante zusätzlich mindestens einer der Aminosäureaustausche L3V, M15T, M15L, R23K, S29A, A30E, Y31H, A33S, E34D, H68Q, W138F, WI38Y, R242P, H35I, E255P, T341P, Q374P, E458D, P459T, V461K, N463G und/oder E465D vorgenommen wor­ den ist.

10. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere 8 Gew.-% bis 30 Gew.-% Tenside, bis zu 60 Gew.-%, ins­ besondere 5 Gew.-% bis 40 Gew.-% Builder, bis zu 50 Gew.-%, insbesondere 5 Gew.-% bis 30 Gew.-% Persauerstoffverbindungen, 1 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 2 Gew.-% bis 8 Gew.-% Bleichaktivatoren, bis zu 1 Gew.-%, insbesondere 0,0025 Gew.-% bis 0,25 Gew.-% bleichverstärkende Übergangsmetallkomplexe, bis zu 5 Gew.-%, insbesondere 0,2 Gew.-% bis 2 Gew.-% weitere Enzyme und/oder nicht über 30 Gew.-%, insbesondere 6 Gew.-% bis 20 Gew.-% wassermischbare Lösungsmittel enthält.