HU229566B1

HU229566B1 - Human monoclonal antibodies to ctla-4

Info

Publication number: HU229566B1
Application number: HU0104604A
Authority: HU
Inventors: Douglas Charles Hanson; Mark Joseph Neveu; Eileen Elliott Mueller; Jeffrey Herbert Hanke; Steven Christopher Gilman; C Geoffrey Davis; Jose Ramon Corvalan
Original assignee: Pfizer; Amgen Fremont Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2014-02-28
Also published as: NZ512553A; CA2356215C; DK2112166T3; IL143797A; CA2356215A1; WO2000037504A2; HRP20130077A2; CZ302706B6; AP2001002213A0; SK288274B6; IS8950A; TR200101831T2; EE05483B1; SK288057B6; HK1041274B; HUP0104604A3; BG65899B1; SG143018A1; AU2214900A; NO20013147L

Description

CTLÁ-4 elleni humán monoklonális ellenanyagok

A jelen találmány tárgyát teljesen, humán. a humán cítotoxíkus T~limibcita 4-es antigén (CTLA-4) elleni monoklonális ellenanyagok képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá, az immunglobulin molekulák nehéz- és könnyű láncának aminosav szekvenciái, valamint az ezeket kódoló nukleotíd szekvenciák, főleg az egybefüggő nehéz- és könnyű láncok, amik lefedik a komplementaritást meghatározó régiókat (CDR-eket), főleg az FRl-iőI és/vagy a. CDR 1-től a CDR3~on keresztül és/vagy az FR4-ben.

Az immunválasz szabályozása a betegekben számos humán betegség esetében egv elfogadott kezelési mód, ami a hatás olyan specifitását eredményezi, ami ritkán található meg a hagyományos gyógyszerekkel való kezelés során. Az immunrendszernek mind a serkentése, mind az elfojtása lehetséges lehet, A T- és Bsejtek szerepét alaposan tanulmányozták, és az immunválasz szabályozásával kapcsolatban jellemezték. Ezekből a vizsgálatokból az derült ki, hogy a T-sejtek szerepe számos esetben különösen lényeges a betegség megelőzésében és kezelésében.

A T-seífek, kölcsönhatásaik szabályozásához nagyon komplex rendszerekkel rendelkeznek. A T-sejtek közötti tások a folyamatban számos receptort, és oldható f< nálnak. Tehát az, hogy egy adott szignálnak milyen az immunválaszra, általában változó, és számos különböző van.

tortól, receptortól és ellen-receptortól függ. amik szerepet játszanak a bioszintézis útban. A válaszok elfojtását eredményező bioszintézis utak ugyanolyan fontosak, mint az aktiváláshoz vezető bioszintézis utak. A T-sejt toleranciához vezető csecsemőmirigy „nevelés” egy mechanizmus, ami megakadályozza, hogy immunválasz alakuljon ki egy adott antigén ellen. Más mechanizmusok is Ismertek, azaz például a. szunnresszív cítokinek szekréci

A T-sejtek aktiválásához nemcsak serkentésre van szükség az antigén receptoron (T-sejt receptor (TCR)} keresztül, hanem további jelátvitelre is, a ko-stimulátor felszíni molekulákon, azaz például a CD28-on keresztül. A CD28 ligandumai a R7-] és B7-2 (CD86) fehérjék, amik az antigént bemutató sejteken, azaz például a dendrites sejteken, aktivált B-sejteken vagy monocitákon expresszálódnak, amik kölcsönhatásba lépnek a CD28 vagy CTLA-4 T-sejttel, hogy eljuttassanak egy ko-stimulátor szignált. A ko-stimulátor jelátvitel szerepét kísérleti allergiás agyvelőgyulladásfoan (EABJ vizsgálták (Perein és mtsai: Immunoi. Rés. 14, 189-199 (1995)}. Az EAE egy autoimmun rendellenesség, amit a mielin antigének elleni Thl sejtek indukálnak, és ez egy in tévő .modell a BT által közvetített ko-serkentés tanulmányozására a patológiás immunválasz índukálá.sában, A B7 receptor elleni oldható fúziós fehérje ligandum, valamint a CD80~ra vagy CD86-ra specifikus monoklonális ellenanyagok használatával Perrin és munkatársai kimutatták, hogy a B7 kokimenetének meghatározásában.

Á B7 és a CD28 közötti kölcsönhatás az egyike a számos kö-stímulácíós jelátviteli hioszíntézís útnak, ami elegendőnek tűnik ahhoz, hogy beindítsa az -antigén-specifikus T-sejtek érését és szaporodását. A kő-stimuláció hiánya és az interleukin-2 termelés ezt kísérő elégtelensége megakadályozza a T-sejt ezt követő ít, és egy „anergíának* nevezett, nem-reagálási állatót indukál. Számos különböző vírus és tumor képes blokkolni a T-sejtek aktiválását és szaporodását, ami a gazdaszervezet immunrendszerének elégtelen aktivitását, vagy nem-reagálását eredményezi a fertőzött vagy transzformált sejtekkel szemben, A számos különböző T-sejt zavar között az anergia lehet legalább részben felelős azért, hogy a gazdaszervezet nem képes· eltakarítani a patogén vagy tumorigén sejteket.

A B7 fehérje használatát az antí-tumor immunitás befolyásolására Chen és munkatársai» valamint Töwnsend és Allison írták le ÍChen és mtsai: Cell 71, 1093-1102 (1992); Töwnsend és Allison: Science 259, 368 0.993}]. Sebwartz összefoglalja a CD28,. CTLA-4 és B7 szerepét az interleukin-2 termelésében és az immunterápiában [Schwartz: Cell 71, 1065 (1992)}. Harding és stimulálja a rágcsáló T-sejteket és megakadályozza az anergia indukcióját T-sejt kiónokban (5,434,131, 5,770,197 és 5,773,253 számú Amerikai Egyesült .Áliamok-beli szabadalmi leírás, valamint a WO 93/00431, WO 95/01994, WO 95/03408, WO 95/24217 és WO 95/33770 számú nemzetközi szabadalmi beje^f'ésl,

Az előzőkből világos, hogy a T-sejteknek két különböző típusú jelre van szükségük az antigént bemutató sejtből (APC) az aktiváláshoz és az eífektor funkció azt kővető diíferenciálödásához, Először is, van egy antigén-specifikus jel amit a T-sejteken levő TCR és az APC-n peptideket bemutató MHC molekulák közötti kölcsönhatás generál. Másodszor, van egy antigéntől független szignál, amit a CD28-nak a B7 család tagjaival (B7-1 (CDSÖ) vagy B7-2 (CD86)) való kölcsönhatása befolyásol. Pontosan ott, ahol a CTLA-4 illeszkedik az immun-reagálóképesség myezetébe, először elodázó hatású. A. rágcsáló CTLA-4-et először Brunet és munkatársai azonosították és klónozták [Brúnót és mtsai; Natúré 328, 267-270 (1987)], olyan molekulák keresése közben, amik preferenciálisan. expresszálódnak a citotoxíkus Tlimfocitákon. Röviddel ezután Dariavach és munkatársai azonosították és klónozták a humán CTLA-4-et (Dariavach és mtsai: Búr. J. Immunoi. 16, 1901-1905 (1988)1. A rágcsáló és humán CTLA-4 molekulák körülbelül 76%-os általános szekvencia-homolő-giát mutatnak, és a eítoplazmatikus dó-ménjeikben megközelítik a teljes szekvencia azonosságot (Dariavach és mtsai: Búr. J. Immunoi. 16, 1901-1905 (1988)]. A CTLA-4 a fehérjék immunglobulin (lg) szupercsaládjának egyik tagja. Az lg szupercsalád olyan fehérjék csoportja, amik az lg molekulák variábilis (V) vagy konstans (C) doménjéiben azonos strukturális kulcs-elemekkel rendelkeznek. Az lg szupercsalád tagiaí közé tartoznak, anélkül.

hogy ezekre korlátoznánk, magunkat, maguk az immunglobulinok, a fő hisztokompatíbilitásí komplex (MHC) osztály molekulái (azaz az I-es és H-es osztályú MHC) és a TCR molekulák.

1991-ben Linsey és munkatársai javasolták, hogy a CTLA-4 a BT egy második receptora [Linsey és mtsai; JL Exp. Med. 174, 561-569 (1991)], Hasonlóképpen, .Harper és munkatársai, valamint Balzano és munkatársai igazolták, hogy a CTLA-4 és a -CD28 molekulák egymással rokonságban vannak egérben és emberben, a szekvencia, a mRNS expressziója, a gén struktúrája és kromoszömális lokalizációja alapján (Harper és .mtsai; J, of Immunoi. 147, 1037-1044 (1991); Balzano és mtsai: Int. J. Cancer Suppl 7, 28-32 (1992)(. Ennek a szerepnek további bizonyítékai funkcionális vizsgálatokból származnak.. Például Lenschow és munkatársai igazolták, hogy a CTLA-4-lg indukálja s

iingy gra hosszú idejű [Lenschow és mtsai: Science 257, 789-792 (1992)]. Freeman és munkatársai vizsgálták a CTLA-4 szerepét BT deficiens egerekben [Freeman és mtsai: Science 262, 907-909 (1993)}. A CTLA-4 lígandumok vizsgálatát Lenschow és munkatársai írták le [Lenschow és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, VSA 90, 11054-11058 (1993)). Linsley és munkatársai imm.unszuppresszíót írnak le ín vívó a CTLA-4 oldható formájával [Linsley és mtsai: Science 257. 792-795 (1992)]. Linsley és munkatársai olyan ellenanyagokat készítettek, amik megkötik a CTLA-4-et, de nem adnak keresztreakciót a CD28-eal, és arra a következtetésre jutottak, hogy a CTLA-4 együtt expresszálódik a CD'28-cal az aktivált T-limfocítákon és ko-operatívan szabályozza a T-sejt tapadását és B7-tel való aktiválását [Linsley és mtsai: J. Exp. MedL 176, 1595-1604 (1992)]» Kuchroo és munkatársai kia B7-1 és a B7-2 ko-stimulátor molekulák diffe[Kuchroo és mtsai: Cell 80. 707-718 (1995)). Yiqun és munkatársai, valamint de Boer és munkatársai igazolták, hogy a pihenő és a frissen aktivált memória T-sejteknek különböző követelményei vannak a B7 család tagjaiból származó ko-stimulátor szignálokkal szemben, az oldható emlékező antigének felé (Yiqun és mtsai: Int. Immunoi. 8, 37-44 (1996); de Boer és mtsai: Eur, J. Immunoi. 23, 3120-3125 (1993)].

A CD28-cal összehasonlítva számos csoport javasolt alternatív vagy' eltérő receptor/ligandum kölcsönhatásokat a CTLA-4re, és még egy harmadik B-7 komplexet is javasoltak, amit egy BB1 ellenanyag felismer [Hathcock és mtsai: Science 262, 9(55907 (1993); Freeman és mtsai: Science 262, 907-909 (1993);

Freeman és mtsai: J. Exp, Med. 178, 2185-2192 (1993); Lenschow és mtsai: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 99, 11054-11058 (1993); Razi-Wolf és mtsai: Froceeáings of the National Academy of Sciences, USA 90,

11182-11186 x w ,.x V.<

1); Boussiotis és mtsai; Proceedíngs of the Na· tional Academy of Sciences, USA 90, 11059-11063 ('

Freeman és munkatársai egy másik publikációjuk figyelést tárgyalják, hogy a BB1 ellenanyag egy olyan, molekulát köt meg, ami azonos a CD74 sejtfelszíni formájával, és ennek következtében. a BB1 mAb a B7-1-től eltérő fehérjét köt meg, és ez az epitop jelen van a B7-1 fehérjén is [Freeman és mtsai: J. of o azt a megImmunoi. 161, 2708-2715 (1998)1, Tehát ez a meg!

ve arra újra keli gondolni azoxai a BB1 mAb-t használnak a CD8Ö expresszió és funkció elemzésé1993-ban kezdődően a kutatók elkezdték tovább vázolni a CTLA-4 szerepét a T-sejt serkentésében, és ez a folyamat 1995hen kulminált. Először, a CTLA-4 elleni monoklonális ellenanyagok használatával Walunas és munkatársai bizonyítékokat szolgáltattak arra vonatkozólag, hogy a CTLA-4 a T-sejt aktiválás negatív szabályozójaként képes működni [Walunas és mtsai: Immunity J, 405-413 (1994)]. Ezután Waterhouse és munkatársai igazolták, hogy a CTLA-4 deficiens egerek T-sejt blasztokat máikban és lépjeikben [Waterhouse és mtsai: Science 270, 985988 (1995)]. A blaszt-sejtek beszűrődnek a máj-, szív-, tüdő és hasnyálmirigy-szövetekbe is, és a szérum immunglobulin menynyisége megnőtt, T-sejtjeik spontán és erősen szaporodtak, ha a T-sejt receptoron keresztül serkentették őket, azonban érzékenyek voltak a sejtpusztulásra, amit a Fás receptor keresztkő·· lései és a gamma besugárzás okoz. Waterhouse és munkatársai arra a következtetésre jutottak, hogy a CTLA-4 a T-sejt aktiválás negatív szabályozója, és létfontosságú a límfocíta hemosztázís szabályozásához. Ugyanennek a számnak egy kommentárjában Allison és Krummel úgy tárgyalja Waterhouse és munkatársai munkáját, mint ami azt demonstrálja, hogy a CTLA-4 úgy hat, hogy elfojtja a T-sejt reagálőképességét, vagy gátió jelátviteli szerepe van a T-sejt aktiválásában és fejlődésében (Allison és Krummel: Science 270, 932-933 (1995)(. Tivol és munkatársai szintén létrehoztak egy CTLA-4 deficiens egeret, és demonstrálták, hogy az ilyen egerekben gyorsan kifejlődik limfoprolífetativ betegség, több szervet érintő limfocitás beszúrődéssel és szövetroncsolódással, különösen súlyos miokardítisszel és pankreatítisszel [Tivol' és misai: Immunity 3, 541-547 (1995)(. Azt a következtetést vonták le, hogy a CTLA-4 kulcsszerepet játszik a T-sejt aktiválás elfojtásában és az immunológiás hemosztázis fenntartásában.. Emellett Krummel és Allison azt is tisztázta, hogy a CD28 és a CTLA-4 ellentétes hatással van a. T-sej leknek a stimulálásra adott válaszára (Krummel és Allison: J. Exp, Med. 182, 459-465 (1995)). Ellenanyagot készítettek a CTLA-4 ellen, és vizsgálták a CTLA-4-hez való kötődésének hatását tisztított Tsejteket használó rendszerben. Leírásuk szerint kimutatták, hogy a B7-2 alacsony szinten való jelenléte a frissen explantált Tsejtekre olyan hatással van, hogy részlegesen gátolja a T-sejtek szaporodását, és ezt a gátlást a CTLA-4-gyel való kölcsönhatások befolyásolják. A CTLA.~4~n.ek a TCR-rel és CD28~cal kialakított keresztkötése erősen gátolja, a T-sejtek szaporodását és interleu a CD28 és a CTLA-4 ellentétes jeleket bocsát ki, amiket a T~ sejtek láthatóan integrálnak az antigénre adott válasz meghatározásánál. Tehát arra a következtetésre jutottak, hogy a T-sejt antigén stimuláció kimenetelét a CD28 ko-stímulációs jelek, valamint a CTLA-4 által kibocsátott gátié jelek szabályozzák (Krummel és mtsai; Int. Immunok 8, 519-523 (1996); 5,811,097 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás és WO 97/20574 számú nemzetközi szabadalmi leírás].

Számos különböző további kísérletet hajtottak végre, hogy tovább tisztázzák a CTLA-4 fenti funkcióját. Walunas és munkatársai például, az anti-CTLA-4 ellenanyagok használatával azt sugallják, hogy a CTLA-4 jeladás nem szabályozza a sejtek túlélését, vagy az interleukin-2-ré adott válaszadó képességét, de gátolja a CD28-dependens interleukin-2 termelést {Walunas és mtsai: d. Exp. Med. 183, 2541-2550 (1996)]. Emellett Perrin és munkatársai demonstrálták, hogy az anti-CTLA-4 ellenanyagok a kísérletes allergiás agyvelőgyuliadásban (EAE) súlyosbítják a betegséget és fokozzák a mortalitást (Perrin és mtsai: Immunoi. Rés. 14, 189-199 (1.995)], Á betegség súlyosbodása kapcsolatban volt az enkefalitogén citokinek, a TNF-alfa, az IFN-gamma és az interleukin-2 fokozott termelődésévek Tehát arra a következtetésre jutottak, hogy a CTLA-4 szabályozza az autoimmun válasz intenzitását EAE-ben, .gyengíti a gyulladásos citokín termelődést és a betegség klinikai megnyilvánulását [Hurwítz és mtsai: d. Neuroímmunok 73, 57-62 (1997); Cepero és mtsai: d. Exp. Med, 188, 199-204 (1998) (egy anti-CTLA-4 hajtú ribozim, ami specifikusan eltörli a CTLA-4 expresszióját, egy rágcsáló T-sejt modellbe való gén transzfer után)].

Emellett Blaír és munkatársai megbecsülték CTLA-4 monoklonálís ellenanyagok (mAb-ok) egy paneljének funkcionális hatásait nyugvó humán CD4+ sejtekre (Blair és mtsai: J. of Immunok 160, 12-15 (1998)]. Ezek az eredmények azt demonstrálták, hogy néhány CTLA-4 monoklonális ellenanyag képes gátolni a nyugvó CD4+ sejtek szaporodási válaszait, és a sejtciklus GO-bel GT-be való átmeneteiét. A CTLA-4 gátló hatásai evidensek 4 órán belül, abban az időpontban, amikor a sejtfelszíni CTLA-4 expresszié még kimutathatatlan. Más CTLA-4 monoklonális ellenanyagoknak azonban nincs kimutatható gátló hatásuk, jelezve, hogy a monoklonális ellenanyagoknak csak CTLA-4-hez való kötődése nem elegendő a T-sejt válaszok elfojtásához. Érdekes módon, miközben az interleukin-2 termelődést teljesen leállítják, a gátló anti-CTLA-4 monoklonális ellenanyagok lehetővé teszik a bel-XfL) sejt túlélési gén Indukcióját és expresszi óját. Ezzel a megfigyeléssel összhangban, a sejtek életképesek maradtak, és apoptozás nem volt megfigyelhető a CTLA-4 llgálás után.

Az anergíával kapcsolatban Perez és munkatársai, demonstrálták., hogy a T-sejt anergía indukcióját meg lehet akadályozni a CTLA-4 blokkolásával, és arra a következtetésre jutottak, hogy az antigén T-sejtek által való felismerését .meghatározza a Tsej teken. a CD28-nak. vagy a CTLÁ-4-nek a B7 molekulákkal való kölcsönhatása [Perez és mtsai: ímmuniiy 6, 411-417 (1997)1. Ezen kívül Van Parijs és munkatársai ín wo vizsgálták az interleukin-12 és a ko-stimulátorok szerepét a T-sejt anergiában, és azt találták, hogy ha gátolják a CTLA-4 működését az anergía indukálása során, akkor a T-sejt szaporodása blokkolva van és nincs támogatva a teljes Thl differenciálódás [Van Parijs és mtsai: J. Exp. Med, 186, 1119-1128 (1997)]. Azonban a tolerogén

ΙΟ φ

antigénnel ínterleukín~I2 és anti-CTLA-4 ellenanyag jelenlétében érintkezésbe hozott T-sejtek nem anergi'zálódtak, és ugyanúgy viselkedtek,. mint azok a T-sejtek, amik immunogén antigénnel találkoztak, Ezek az eredmények azt sugallják, hogy két folyamat járul hozzá az anergia in rioo indukciójához; a CTLA-4 működése, ami azt eredményezi, hogy a T-sejtek nem képesek szaporodni, és a prototípusos citokin, az interleukin-12· hiánya, ami megakadályozza, a T-sejtek T'fel effektor sejtekké való differenciálódását Az interleukin-12 és az anti-CTLA-4 ellenanyag kombinációja. elég ahhoz, hogy egy normális körülmények között tőlerogén stimulust immimogénné változtasson,

A fertőzésekkel kapcsolatban MeCoy és munkatársai demonstrálták, hogy az anti-CTLA-4 ellenanyagok erősen fokozzák és gyorsítják a. T-sejt immunválaszát Aipposfoonppfos brasdfonsis ellen, ami a felnőtt férgek szamának csökkenését és a parazita tojásrakás korai leállását eredményezi ÍMcCoy és mtsai; d. Exp. Med. 186, 183-187 {1997}; Murphy és mtsai: J. of Immunoi. 161, 4153-4160 (1998) (Lefonmcmfo donovanjj.

A rákkal kapcsolatban Kwon és munkatársai létrehoztak egy szingenikus rágcsáló prosztatarák modellt, és két eltérő manipulációt vizsgáltak, amikkel az volt. a céljuk, hogy anti-prosztatarák választ váltsanak ki a fokozott T-seit ko-stimuláláson. keresztül : i) direkt ko-stimuláció biztosítása prosztatarák, sejtekkel, amiket úgy tra.nszduká.ltak, hogy expresszálják a 87.1 ligándumot, és (ii) a T-sejt CTLA-4 ín two ellenanyag által közvetített blokádja, ami megakadályozza a T-sejtek elfojtását [Kwon és mtsai: Proceedings of tbe National Academy of Sciences, USA 94, 8099-8103 (1997)). Demonstrálták, hogy a CTLA-4 in vino, ellenany anti-prosztatarák π

immunválaszokat Emellett Yang és munkatársai azt vizsgálták, hogy a. CTLA-4 funkció blokádja vezet-e az antitumor T-sejt válaszok fokozásához a tumor növekedésének különböző fázisaiban [Yang és mtsai: Cancer Rés. 57, 4036-4041 (1997)], Az in vítro és ín wvo eredmények alapján azt találták, hogy a CTLA-4 blokkolása tumort hordozó «gyedekben. fokozza az an. ti tumor T-sejt válaszok kapacitását, de az ilyen fokozó hatás expressziója modelljökhen a tumor növekedés korai fázisaira korlátozódik.. Emellett Hurwitz és munkatársai vizsgálták, hogy' a T-sejt által befolyásolt antitumor válasz generálása függ-e attól, hogy a T-sejt remennyire lép kölcsönhatásba a fő hisztokompatibilitási í .

lex/ antigénnel, valamint a CD28 B7~tel való ligálásától [Hurwitz és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 10067-10071 (1998)}, Bizonyos tumorok, azaz emlőkarcmoma ellenáll az anti-CTLA-4 immunterápiának. Tehát CTLA-4 blokád és egy vakcina, ami granuloeita-makrofág telep serkentő faktort expresszáló SM.1 sej teket tartalmaz, kombinációjának használatával a kiindulási SM1 tumorok regressziója volt megfigyelhető, annak ellenére, hogy akármelyik: kezelés önmagában való alkalmazása hatástalan. Ez a kombináció az SM1 ellen hosszantartó immunitást eredménye«Ζ zett, és mind a CD4+, mind a. C.D8(+) T-sejtektől függ. Ezek a megfigyelések azt sugallták, hogy a CTLA-4 blokád egy gazdaszervezet eredetű antigén-bemutató sejt szintjén hat.

A cukorbetegséggel összhangban Luhder és munkatársai egy anti-CTLA-4 monoklonális ellenanyagot injekcióztak a cukorbetegség TCR transzgenikus egérmodelijébe, a betegség különböző fázisaiban [Luhder és mtsai: J. Exp. Med. 187, 427-432 (1998)], Azt találták, hogy a CTLA-4 részvétele abban az időpontbán, amikor a potenciálisan chabetogén T-sejtek először aktiválódnak, döntő fontosságú esemény; ha a részvétel engedélyezve van, alcKor iejatszodiK a szigetsejteR inváziója, de nőnapokig meglehetősen ártalmatlan marad. Ha sem, akkor az ínzulítísz sokkal aggresszívabb, és a cukorbetegség gyorsan bekövetkezik.

A vakcina immunizálással kapcsolatban Horspool és munkatársai azt találták, hogy az intakt anti-CTLA~4 monoklonáiis ellenanyag elnyomta a primer hurnorális választ a pCIA/beta. gal ellen, anélkül hogy érintenék a visszahívási válaszokat, míg a Fab fragniensek nem, jelezve, hogy a CTLA-4 aktiválás gátolta az ellenanyag' termelést, de a T-sejtek feltöltődését nem (Horspool és mtsai; J. of Immunoi. 160, 2706-2714 (1998)], A CD28 és CTLA4, CD80 (B7-1) és Cd86 (B7-2) ligandumainak blokkolása eltérő, és át nem fedő funkciót fedett fel. A CD80 blokádja a kiindulási immunizációs komplexnél teljesen megszüntette a primer és szekunder ellenanyag válaszokat, míg a CD86 blokád elnyomta a primer, de nem nyomta el a szekunder válaszokat. A CD80+CD86 szimultán blokádja kevésbé hatékony az ellenanyag válaszok elnyomásában, mint bármelyik önmagában. A kőstimuláció fokozása a B7-et expresszáló plazmidok ko-injektálásával erősítette a. C'TL válaszokat, de nem erősítette az ellenanyag válaszokat, és nincs bizonyíték arra, hogy a Thl ThS-vé torzulna. Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy a CD28, a CTLA4, a CD80 és a CD86 komplex különböző szerepet játszik a T-sejt ko-stimulálásban, a nukleinsav vakcináciőt kővetően.

Az allograft kilökődéssel kapcsolatban Markees és munkatársai a >gy az graft kilökődés azt az ÍFN-gamma, CTLA-4 és CD4(+) T~ sejtek jelenlététől függ (Markees és mtsai; J. Cliníe. in vés t. 101,

2446-2455 (1998}j. Ha anti-CTLA-4 vagy ant-IFN -gamma monoklonális ellenanyagot adunk a. protokollhoz, akkor ez kapcsolatba kerül a graft azonnali kilökődésével, míg az antx-ÍL-4 m-onoklonálís ellenanyagnak nincs hatása.

A CTLÁ-4-nek a CD28-eal kapcsolatban játszott szén kapcsolatban Fallari.no és munkatársai TCR transzgeníkus/rekombínáz aktiváló gén 2-defíciens/CD28~ vad-típusú, vagy CD28 deficiens egereket hoztak létre, amiket egy antigént expresszálő tumorral immunizáltak [Fa.lla.rino és mtsai: J. Exp. Med. 188,

205-210 (1998)}. Az egerek mindkét típusából származó, töltött T-sejtek termeltek citokineket, és szaporodtak B7 expressziöt nem mutató- stimulátor sejtekre- adott válaszként. Azonban, míg a CD28-+/4T sejtek válaszát erősíti a B7-l-gyel való ko-stimuláció, addig a CD28-/-T sejtek válaszát erősen gátolja. Ezt a gátlást

VlSSZí ia a i7~ 1 vagy CTLA-4 elleni monoklonális -eüenanyag. Tehát a CTLA-4 képes potenciálisan gátolni a T-sejt aktiválást CD28 távollétében, jelezve ezzel, hogy egy TCR által közvetített szignál antagonizmusa el ő ahhoz·, hogy megmagyarázzuk a CTLA-4 gátló hatását. Emellett Lin és munkatársai vizsgálták a szív allögraítok kilökődését CD28 deficiens egerekben [Lin és mtsai: J. Exp. Med, 188, 199-204 {1998}!. A graft kilökődése a vad-típusú egerekkel összehasonlítva késleltetve van a CD28-deíicíensben. A vad-típusú recipiensek kezelése

CTLA-4-immunglobuIínnal {lg), vagy anti-B7-l plusz antí-B7~2 monoklonális ellenanyagokkal szignifikánsan megnövelte az allögraítok túlélését. Ezzel szemben a CD28-deficíen.s egerek CTLA-4-lg-vel, antí.-B7-l plusz antí-B7-.2 monoklonális ellenanyaggal való kezelése, vagy az anti-CTLA-4 monoklonális ellenanyag blokkolása az allograft kilökődésének gyorsulását indukálja..

Μ

A graft kilökődésnek ez a megnövekedett sebessége sokkal súlyosabb sejt. beszűrődéssel, valamint a kezeletlen, vad-típusú és CTLA-4-lg- vagy antí-CTLA-4 monoklonális ellenanyaggal kezelt CD28~deficiens egerek donor szívében az interferon-gamma és az ínter.leukin-6 transzkríptumok megnőtt szintjével áll kapcsolatban, Tehát a CTLA-4 negatív szabályozó szerepe messze tűi terjed azon a potenciális képességén, hogy megakadályozza a CD28 aktiválását a ligandum kompetíción keresztül Még a CD28 távollétében is, a CTLA-4 gátló szerepet játszik az .allograft kilökődésében.

Emellett a CTLA-4 expressziőjának további jellemzését vizsgálták. Például Alegre és munkatársai azt javasolták, hogy a sejtfelszíni CTLA-4 gyorsan íntenializálődik, ami megmagyarázhatja a sejt felszínén általában kimutatott alacsony szintű expressziót [Alegre és mtsai: J, of Immunoi, 157. 4762-4770 (1.996)·). Arra a következtetésre jutottak, hogy mind a C.D28 mind az interleukin2 fontos szerepet játszik a CTLA-4 expresszié erősítésében. Emellett úgy tűnik, hogy a CTLA-4 sejtfelszíni akkumulációját elsődlegesen a gyors endocítözis szabályozza. Emellett Castan és munkatársai, a CTLA-4 expresszié immunhisztológíai elemzése alapján azt sugallták, hogy a esírázási centrum T- sejtek, amik CTLA4 pozitívak, fontosak lehetnek az immun szabályozásban [Castan és mtsai: bnmunology 90, 265-271 (1997)].

Ennek megfelelően, a CTLA-4 széles, és kulcs-szerepének fényében úgy tűnik, hogy a CTLA-4 immun-reagálőképességgel rendelkezik, és kívánatos lenne az immunterápiában hatékonyan használható CTLA-4 elleni ellenanyagokat generálni. Emellett az is kívánatos lenne, hogy olyan CTLA-4 elleni ellenanyagokat hoz15 zunk létre, ami olyan krónikus betegségekben használható, amikben az ellenanyagok ismételt beadása szükséges.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1, ábrán az immunglobulin molekulák nehéz lánca és kappa könnyű lánca nukleotid- és aminosav szekvenciáinak sorozatát mutatjuk be: 4.1.1 (IA. ábra), 4.8.1 (1B·. ábra), 4.14,3 (IC. ábra), 6.1.1 (1D. ábra), 3.1.1 (1E. ábra), 4.10.2 (1F. ábra),

2.1.3 (1G. ábra), 4.13.1 (1H. ábra), 11.2.1 (II ábra), 11.6.1 (1J. ábra), 11.7.1 (1K. ábra), 12.3.1.1 (1L. ábra) és 12.9,1.1 (1M. ábra).

A 2. ábrán szekvencia-illeszkedéseket mutatunk be, a

4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1,

11.7.1, 12,3.1.1 és 12.9.1.1 Időnokból származó, megjósolt nehéz lánc aminosav szekvenciák és a DP-50 (3-33) csíravonal aminosav szekvenciája között. A DP-50 csíravonal szekvencia és a kiónokban levő szekvenciák közötti különbségeket vastagítva. mutatjuk be, Az ábrán vastagítva mutatjuk be az ellenanyagok CDRL CDR2 és CDR3 szekvenciáinak pozícióit.

A 3. ábrán szekvencia-illesztést mutatunk be a 2.1.3 aminosav szekvenciája és a DP-65 (4-31) csiravonal aminosav •szekvenciája között., A DP-65 csíravonal szekvencia és a klánban levő szekvencia közötti különbségeket vastagítással emeljük ki. Az ábrán aláhúzva mutatjuk be az ellenanyag CDR1, CDR2 és CDR3 szekvenciáinak pozícióit.

A 4, ábrán a 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 és 4.13.1 klánok megjósolt kappa könnyű lánc aminosav szekvenciái és az A27 csíravonal aminosav szekvenciája közötti szekvencia-illeszkedést mutatjuk be. Az A27 csíravonal szekvencia és a klőnban levő szekvencia közötti különbségeket vastagítással emeljük ki.

p)

Az ábrán aláhúzva mutatjuk be az ellenanyag CDR1, CDR2 és CDR3 szekvenciáinak pozícióit. A 4.8.1, 4.14.3 és 6,1.1 klánokbán a nyilvánvaló deléciókat „(h’-kkal jelöljük.

Az 5. ábrán a 3.1.1, 11.2,1, 11,6,1 és 11,7.1 klőnok megjósolt kappa könnyű lánc aminosav szekvenciái és az 012 csiravonal aminosav szekvenciája közötti szekvencia-illeszkedést mutatjuk be. Az 012 csíravonal szekvencia és a kiónban levő szekvencia közötti különbségeket vástagítással emeljük ki. Az ábrán aláhúzva mutatjuk be az ellenanyag ODRI, CD.R2 és CDR3 szekvenciáinak pozícióit.

A 6. ábrán a 2.1,3 klón megjósolt kappa könnyű lánc aminosav' szekvenciái és az A10/A26 csíravonal aminosav szekvenciája közötti szekvencia-illeszkedést mutatjuk be. Az A10/A26 csíravonal szekvencia és a kiónban levő szekvencia közötti különbségeket vastagítással emeljük ki. Az ábrán aláhúzva mutatjuk be az ellenanyag. CDR1, GDR2 és C.DR3 szekvenciáinak pozícióit.

A 7, ábrán a 12.3.1 klón megjósolt kappa könnyű lánc aminosav szekvenciái és az A17 csíravonal aminosav szekvenciája közötti szekvencia-illeszkedést mutatjuk be. Az ΑΓ7 csíravonal szekvencia és a Mohban levő szekvencia közötti különbségeket vastagítással emeljük ki. Az ábrán aláhúzva mutatjuk be az ellenanyag CDR 1. CDR2 és CDR3 szekvenciáinak pozícióit,

A 8, ábrán a 12.9.1 klón megjósolt kappa könnyű lánc aminosav szekvenciái és az A3./A19 csíravonal aminosav szekvenciája közötti szekvencia-illeszkedést mutatjuk be. Az Α3/Ά19 csíravonal szekvencia és a kiónban, levő szekvencia közötti különbségeket vastagítással emeljük ki. Az ábrán aláhúzva mutatjuk be az ellenanyag CDR1, CDR2 és CDR3 szekvenciáinak pozícióit.

A 9. ábrán az ellenanyagok nehéz- és könnyű láncai közvetlen fehérieszekvenálásával generált N-terminális aminosav szekvenciáinak összefoglalását mutatjuk be.

A 10. ábrán néhány további jellemző információ látható az ellenanyagokról· A 1ÖA. ábrán a. 3.1.1, 4.1.1,. 4.8.1, 4.10,2,

4.14.3 és 6,1,1 Monokra vonatkozó adatokat foglaljuk össze, A koncentrációra, Izoefektromos fókuszálásra fi'EFj, SDS-PAGE-ra, méretkizárásos króm atográfiára, fclyadékkromatográfia / tömegspektroszkópiára (LCMSj, tömegspektroszkőpiára (MALDJ), könnyű lánc N -terminális szekvenciákra vonatkozó adatokat adunk meg. Az izoelektromos fókuszálásra vonatkozó további, részletes információkat a. 1ÖB. ábrán adjuk meg; az SDS-PAGEre vonatkozó adatokat a 10C, ábrán adjuk meg; és a 4,1,1 ellenanyag SEC-e a 10D.

A 11. ábrán a B7-1 és B7-2 expresszióját mutatjuk be Raji sejteken, anti--€B80-PE és antí-C.D86-FE monoklonális ellenanyagok használatával.

A 12. ábrán az interleukin-2 termelődés koncentrációfüggo antí-CTLA-4-et blokkoló ellenanyagok indukálnak (BNI3, 4.1.1,

4.8.1 és 6.1.1),

A 13. ábrán az interferon-gamma termelődés koncentrációfüggő fokozódását mutatjuk be a T-sejt blaszt/Raji esszében, amit az anti-CTLA-4-et blokkoló ellenanyagok indukálnak (BN13,

4.1.1, 4,8.1 és 6.1.1) (ugyanazok a donor T-sejtek).

A. 14. ábrán az interleukin-2 termelődés átlagos fokozódása látható 6 donorból származó T-sejtekben, amit a T-sejt blaszt /Raji esszében az anti-CTLA-4 blokkoló ellenanyagok indukál· nak.

r®

A 15. ábrán az interferon-gamma termelődés átlagos fokozódása látható 6 donorból származó T-sejtekben, amit a T-sejt biaszt /.Raji esszében az anti-CTLA-4 blokkoló ellenanyagok indukálnak.

A 16, ábrán az interleukin-2 termelődés átlagos fokozódása látható 5 donorból származó hPBMC-ben, amit anti-CTLA-4-et blokkoló monoklonálís ellenanyagok indukálnak, SEA-val való serkentés után 7.2 órával mérve.

í/án az interleukin-2 termelődés átlagos látható 5 donorból származó teljes vérben, amit anti-CTLA-4-et blokkoló monoklonálís ellenanyagok indukálnak, SEA-val v; serkentés után 72 és 96 órával mérve.

A 18, ábrán a tumor növekedés gátlása látható anti-rágcsálö C'TLA-4 ellenanyaggal, rágcsáló fibroszarkóma tumor modellA 1.9, ábrán az interleukin-2 termelődés fokozódása látható, amit az· anti-CTLA-4 ellenanyagok (4.1.1 és 11,2.1} indukálnak, 72 órás T blaszt/Raji és superantigen (teljes vér és perifériális vér mononukleáris sejtek 6 donorból) esszékben.

A 20. ábrán az interleukin-2 termelődés dózis-függő fokozódása látható, amit az anti-CTLA-4 ellenanyagok (4.1.1 és 11.2.1} indukálnak, 72 órás T blaszt/Raji esszében.

A 21, ábrán az interleukin-2 termelődés dózisfüggő fokozódása látható, amit az anti-CTLA-4 ellenanyagok (4.1.1 és 11.2.1) indukálnak, 72 órás superantigen teljes vér esszében, löö ng/ml

A 22. ábrán az alábbi anti-CTLA-4 ellenanyag láncok további nukleotid- és aminosav szekvenciáinak sorozata látható; teljes hosszúságú 4.1.1 nehéz lánc (cDNS 22(a), genomiálís 22 (hl

L9 és aminosav 22(c)}·, teljes hosszúságú aglikozílezeít. 4.1.1 nehéz lánc {cDNS 22(d| és aminosav 22(e)h 4.1.1 könnyű lánc (cDNS 22(i| és aminosav 22(g)), teljes hosszúságú 4,8.1 nehéz lánc (cDNS 22{h) és aminosav 22{i)), 4.8,1 könnyű lánc (cDNS 22(j) és aminosav 22(k)), teljes hosszúságú 6.1,1 nehéz lánc (cDNS 22(1) és as 22(m))_} 6.1.1 könnyű lánc (cDNS 22{n) és aminosav 2.2(o$, teljes hosszúságú 11.2.1 nehéz lánc (cDNS 22(p) és aminosav 22(qj), valamint 11,2.1 könnyű lánc (cDNS 22(r) és aminosav (s)j.

A jelen találmány tárgya olyan ellenanyag, ami képes kötődni a. CTLA-4-hez, melyet az igénypontokban jellemzünk.

A jelen találmány szerint teljesen humán, CTLA-4 elleni monoklonálís ellenanyagokat biztosítunk. Nehéz- és könnyű lánc immunglobulin molekulákat kódoló nukleotid szekvenciákat és azokat tartalmazó aminosav szekvenciákat biztosítunk, főleg olyan szekvenciákat, amik az FR1 és CDR 1-től a C.DR3 és FR4-.ig terjedő egybefüggő nehéz- és könnyű lánc szekvenciákat tartalmazó szekvenciák, A találmány tárgyát képezik továbbá az ilyen immunglobulin molekulákat és monoklonálís ellenanyagokat exoresszálő hibrid ómák is.

Hacsak külön nem jelezzük az eltérést, akkor a jelen találmány leírása során alkalmazott tudományos és technikai szakkifejezések jelentése megegyezik azzal, amit a. szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára jelentenek. Emellett, hacsak a szövegösszefüggés másként nem kívánja, az egyesszáés a többesszámú kifejezések magákban foglalják az égyesszámú a sejttenyésztéssel és szovettenyészal, valamint a fehérje és oiigo- vagy polinukleotíd kémiával és hibridizációval kapcsolatban használt léssel, molekuláris biolőg' és a szakterületen általánosan használtak. A rekombínáns DNS-hez, az oligOHukleotid szintézishez, valamint a szovettenyésztéshez és transzformációhoz (azaz például eleteoporációhoz, transzfekcíóhoz) standard technikákat használunk. Az enzimes reakciókat és a tisztítási technikákat a .gyártó utasításai szerint hajtjuk végre, vagy úgy, ahogy azt a szakirodalomban., vagy máshol általánosan végrehajtják. Az előzőkben említett technikákat és eljárásokat általában a szakterületen jól ismert, hagyományos módszerekkel hajtjuk végre, amiket a különböző általános és specifikusabb referenciákban ismertettek és ebben a leírásban tárgyaljuk fSámbrook és rritsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2.

, NX kiadás, Cold Spríng Harbor Press, (1989), amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk). Az analitikai kémiával, szintetikus szerves kémiával, valamint orvosi kémiával és gyógyszerkémiával kapcsolatos nevezéktan, valamint laboratóriumi technikák és eljárások jól ismertek, és általánosan használtak a szakterületen. A kémiai, szintézísekhez, kémiai elemzésekhez, gyógyszerészeti készítményekhez, kiszerelésekhez és beadásokhoz, valamint a betegek kezeléséhez standard technikákat használunk.

Amint azt a jelen találmányban, használjuk, az alábbi szakkifejezéseknek, hacsak külön nem. jelezzük az. eltéréseket, a jelentése az alábbi:

Az „izolált pölínukleöticr jelentése a továbbiakban egy genomiális, cDNS vagy szintetikus eredetű polinukieotíd, vagy ezek valamilyen kombinációja, ami annak következtében, hogy „izolált polinukieotíd” eredetű, (1) nem kapcsolódik egy polínukleotidhoz vagy annak egy részéhez, amiben az „izolált polínukleötid” a tér21 lueszeiben található, (2) működés szempontjából egy polínukleotidhoz kapcsolódik, amihez a természetben nem kapcsolódik, vagy (3) a természetben nem fordul elő egy nagyobb szekvencia

Az „izolált fehérje” szakkifejezés jelentése a továbbiakban cDNS, rekombínáns RNS vagy szintetikus eredetű fehérje, vagy ezek valamilyen kombinációja, ami eredete, forrása vagy származéka következtében, (1). nem kapcsolódik semmilyen, a. természetben található fehérjéhez, (2) mentes más, ugyanabból a forrásból származó fehérjéktől, azaz például mentes a rágcsáló fehérjéktől, (3) egy más fajba tartozó sejt expresszálja, vagy (4) nem fordul elő a természetben.

A „polipeptid” szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy generikus szakkifejezés, aminek a jelentése természetes fehérje, vagy egy polipeptid szekvencia fragmenseí vagy analógjai. Ennek következtében a jelen találmány szerinti természetes fehérje, fr&gmensek és analógok polipeptídek, A jelen találmány szerint előnyben részesített polipeptídek az 1. ábrán bemutatott humán nehéz lánc immunglobulin molekulákat és humán kappa könnyű lánc immunglobulin molekulákat tartalmaznak, valamint olyan ellenanyag molekulákat, amik nehéz lánc immunglobulin molekulák és könnyű lánc immunglobulin molekulák, azaz a kappa ű lánc immunglobulin molekulák (és víca vers&h v;

A „természetben előforduló” szakkifejezés jelentése a továbbiakban arra vonatkozik, hogy egy objektum megtalálható a természetben. Például egy szervezetben (beleértve a vírusokat is) jelenlevő polipeptid vagy polinukleotid szekvencia, ami egy termé szetes forrásból izolálható, és amit az ember a laboratóriumban nem módosított szándékosan vagy más módon, az természetben előforduló polipeptid vagy polínukleotid.

A „működés szempontjából kapcsolt* szakkifejezés jelentése a komponensek olyan pozíciójára vonatkozik, ami lehetővé teszi, hogy a szándékunk szerint működjenek. Egy kontroll szekvencia „működés szempontjából kapcsolt* egy kódoló szekvenciához,, ami oly módon van ligáivá, hogy a kódoló szekvencia expressztója a kontroll szekvenciákkal kompatíbilis körülmények között játszódik le,

A „kontroli szekvencia” szakkifejezés jelentése a továbbiakban olyan polínukleotid szekvencia, ami ahhoz szükséges, hogy biztosítsa, a hozzá ligáit kódoló szekvenciák expresszióját és processzálását. Az ilyen kontroll szekvenciák természete a gazdaszervezettől függően eltér; a prokariótákban az ilyen kontroll szekvenciák általában promoterek, riboszómálís kötőhelyek és transzkripciós fermínációs szekvenciák; az eukariótákhan az ilyen kontroll szekvenciák általában prom öterek és transzkripciós termínációs szekvenciák. A „kontroll szekvencia* szakkifejezés szándékaink szerint minimálisan tartalmazza az összes olyan komponenst, amiknek a jelenléte esszenciális az expressziőhoz és a processzáláshoz, és tartalmazhat további komponenseket: is, amiknek a jelenléte előnyös, mint amilyenek például a vezérszekvenciák és fúziós partner szekvenciák, kban nukleotidoknak legalább 10 bázisból álló polimer formája, amely nukleotidok lehetnek ribonukleotídok vagy dezoxiribonukleotidok, vagy bármelyik típusú nukleotid módosított formái. A szakkifejezés vonatkozik a DNS egyszálú és kétszálú formájára is.

Az «oligonukleotid” .szakkifejezés jelentése lehet a természetben előforduló, valamint módosított nukleotidok természetben előforduló, valamint nem-természetes oligonnkleotid kötéssel összekötött formája. Az oligonukleotidok a polmukleotidok egy alcsoportja, amik általában 2ÖÖ vagy kevesebb bázist tartalmaznak. Az oligonukleotidok előnyösen 10-60 bázist tartalmaznak, hosszuk előnyösen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 vagy 20-40 bázis. Az oligonukleotidok általában egyszálúak, mint például a. próbák; bár az oligonukleotidok lehetnek kétszálúak is, mint például a génmutánsok előállításában használt oligonukleotidok. Az oligonukleotidok lehetnek értelmes vagy aníiszensz oligonukleotídok.

A „természetes nukleotidok” szakkifejezés jelentése a továbbiakban dezoxiribonukleotidok és ribonukleotidok. A „módosított nukleotidok” szakkifejezés jelentése a továbbiakban olyan, nukleotidok, amik módosított vagy helyettesített cukorcsoportokat és hasonlókat tartalmaznak. Az „oligonukleotid kötések” szakkifejezés jelentése a továbbiakban oligonukleotid kötések, azaz például foszforotioát, íoszforoöítioát, foszíbroszelenoát.

foszforodiszelenoát, íoszíoroarklotíoáí, foszforaníladát, foszforamidát és hasonlók [LaPlance és mtsai: Nucleic Acíds Research 14, 9081. (1.986); Stec és mtsai: Journal of the American Chemical Society 106. 6066 (1984); Stein és mtsai: Nucleic Acíds Research 16. 3209 (1988); Zon és mtsai: Anti-Cancer Drug Design 6, 539 (1991); Zon és mtsai: Oligonuuleotídes and Analogues: .A Practieal Approach, 87-108. oldal, szerkz F. Eckstein, Oxford Universiiy Press, Oxford, Anglia (1991); Stec és mtsai: 5,151,510 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás; Uhlmann és Peyman: Chemical Revíews 90, 543 (1990); amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk]. Egy olígonukleotid a kimutatáshoz szükség esetén tartalmazhat egy jelölést.

A 'szelektíve híbrídizál” szakkifejezés jelentése a továbbiakban azt jelenti, hogy kimutathatóan és specifikusan kötődik. A jelen találmány szerinti polinukleotidok, olígonukleotidok és azok fragmensei szelektíve hibridizálódnak a nukleinsav szálakhoz, olyan hibridizációs és mosási körülmények között, amik minimalizállak az aspeciiikus nukleinsavak kimutatható kötődését.

Nagy szigorúság^· körülményeket lehet használni, hogy elérjük a szelektív hibridizációs körülményeket, amint az a szakterületen ismert, és az alábbiakban tárgyaljuk. A jelen találmány szerinti polinukleotidok, olígonukleotidok és fragmensek, valamint a számunkra érdekes nukleinsav szekvencia közötti nukleinsav szekvencia homológia legalább 80%, típikusabban előnyösen növekvő a homológia, legalább 85%, 90%, 95% és 100%. Két aminosav szekvencia homológ, ha szekvenciájukban részleges vagy teljes azonosság van. A 85%-os homológia például azt jelenti., hogy az aminosavak 85%-a azonos, ha a két szekvenciát maximális illeszkedést biztosítva egymás mellé illesztjük. Az illeszkedés maximalizásához engedélyezzük a réseket (a két illesztendő szekvencia közül bármelyikben); az 5 vagy kevesebb egység hosszúságú lukakat részesítjük előnyben, de még ennél is előnyösebb, ha. a rés nagysága 2 vagy kisebb.. Egy másik változat szerint, és előnyösen a két fehérjeszekvencía (vagy az ezekből származó polipeptid szekvenciák, amik legalább 30 amínosavbol állnak) homológ, a szakkifejezés itt használt értelmében, ha illeszkedési értékszámuk mint 5 is nacios egvs az ALTON program, valamint a mutációs adatmátrix és 6-os vagy nagyobb rés-büntetés használatával (Dayhoff, M.O.: /m Atlas of Protein

Sequence and Strueture, 5. kötet, 101-110. oldal, National Biomedical Research Foundation (1972)], valamint ennek a kötetnek 2. kiegészítése, 1-10. oldal A két szekvencia vagy azok részei még előnyösebben homológok, ha aminosavaík legalább 50%-ban azonosak, ha az ALIGN program használatával optimálisan illesztjük őket. A ..megfelel valaminek” szakkifejezés jelentése a továbbiakban az, hogy a poiinukleotid szekvencia homológ (azaz azonos, nem szigorúan, evolúciós rokonságban) egy referencia poiinukleotid szekvenciával vagy annak egy részével vagy egy polipeptid. szekvencia azonos egy referencia polipeptid szekvenciával Ezzel szemben a „komplementer valamiver szakkifejezés jelentése az, hogy a komplementer szekvencia homológ egy referencia poiinukleotid szekvenciával vagy annak egy részével. Illusztrációként, a „TATAC” nukleotid szekvencia megfelel a „TATAC” referencia, szekvenciának, és komplementer a „GTATA”

Az alábbi szakkifejezéseket arra használjuk, hogy két vagy több poiinukleotid vagy aminosav szekvencia közötti, szekvenciakapcsolatot leírjuk: „referencia szekvencia”, „összehasonlító ablak”, „szekvencia azonosság”, „a szekvencia azonosság százaléka” és „lényegi azonosság*.. A „referencia szekvencia” egy meghatározott szekvencia, amit. a szekvencia-összehasonlítás alapjaként használunk; egy referencia szekvencia lehet egy nagyobb szekvencia a, azaz

Cí iá megadott teljes hosszúságú cDNS vagy génszekvencia egy szegmense, vagy tartalmazhat egy teljes c'DNS-t vagy génszekvenciát. Általánosságban, egy referencia szekvencia legalább 18 nukleotídból vagy 6 aminosavból áll, gyakran legalább 24 nukleotidot vagy 8 amínosavat tartalmaz, és gyakran legalább 48 nukleotidof vagy 16 aminosavat tartalmaz. Mivel két polinuldeotíd vagy aminosav szekvencia (1) tartalmazhat egy szekvenciát (azaz a komplett polinukleotid vagy aminosav szekvencia egy részét), ami hasonlít a két molekulában, és (2) tartalmazhat továbbá egy olyan szekvenciát, ami eltér a két polinukleotid vagy aminosav szekvencia között,, ezért két (vagy több) molekula szekvencia-összehasonlítását általában úgy hajtjuk végre, hogy a két molekula szekvenciáját egy „összehasonlító ablakiban hasonlítjuk össze, hogy azonosítsuk és összehasonlítsuk a szekvencia-hasonlóság lokális régióit. Egy .„összehasonlító ablak*, ahogy azt a továbbiakban használjuk legalább 18 egybefüggő nnkleinsav pozíció vagy 6 aminosav konceptuális szegmense, amiben egy polinukleotid szekvenciát vagy egy aminosav szekvenciát, össze lehet hasonlítani egy legalább 18 egybefüggd nukleotidot vagy 6 aminosavat tartalmazó szekvenciával, és ahol az összehasonlító ablakban levő polinukleotid szekvencia egy része a. referencia szekvenciával (ami nem tartalmaz addícíókat vagy deléciókat) összehasonlítva 20 százalékban, vagy kisebb mértékben tartalmazhat addícíókat, deléciókat, helyettesítéseket és hasonlókat (azaz például réseket), a két szekvencia, optimális illesztéséhez. A szekvenciák optimális illesztése, egy összehasonlító ahlak illesztéséhez Smith és >ZX.’

Waterman lokális homólögia algoritmusával, Needleman és Wunsch homológia illesztési algoritmusával és Pearson és Lipman hasonlóságot kereső módszerével fSmith és Waterman: Adv. Appi. Math. 2, 482 (1981); Needleman és Wunsch; Journal of Molecular Biology 48, 443 (1970); Pearson és Lipman; Proceedings of the National Acaderny of Sciences, USA 85, 2444 (1.988)) hajtható végre, valamint ezeknek az algoritmusoknak a számítógépesített implementációival [GAP, 8BSTFIT, FASTA és

TFASTA a Wisconsin Genetics Software Paekage Release 7.0-ban (Genetics Computer Group, S7S Science Dr., Madison, Wis.}, •Geneworks vagy MacVector szoftvercsomagok}, vagy szemrevételezéssel* és kiválasztjuk a különböző módszerekkel generált legjobb illeszkedést (azaz· ami a legmagasabb százalékú homológiáf biztosítja az összehasonlító ablakban),

A „szekvencia azonosság” szakkifejezés azt jelenti, hogy két polinukleotíd vagy aminosav szekvencia azonos (azaz nukleotidonként vagy aminosav csoportonként) az összehasonlító ablakban. A „szekvencia azonosság százaléka” szakkifejezés azt jelenti, hogy a szekvencia azonosság százalékát úgy számítjuk ki, hogy két optimálisan illesztett szekvenciát összehasonlítunk az összehasonlító ablakban, meghatározva azoknak a pozícióknak a számát, amikben ugyanaz a nukleinsav bázis (azaz A, T, C, G, U vagy 1) vagy csoport fordul elő mindkét szekvenciában, ezzel megkapjuk az illeszkedő pozíciók számát, majd. az illeszkedő pozíciók számát osztjuk az összehasonlító ablakban levő pozíciók ossz-számával (azaz az ablak méretével), és az eredményt 100-zal szorozzuk, így kapjuk meg a szekvencia azonosság százalékát. A „lényegi azonosság” szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy polinukleotíd vagy aminosav szekvencia jellemzője, amely polinukleotid vagy aminosav szekvencia tartalmaz egy szekvenciát, ami legalább 85 százalék szekvencia-azonosságot, előnyösen legalább 90-95 százalék, szekvencia azonosságot, még általánosabb, ha legalább 99 százalék szekvencia azonosságot mutat egy referencia szekvenciával összehasonlítva, egy legalább 18 nukleotid (6 aminosav) pozícióból állő összehasonlító ablakban, gyakran egy legalább 24-48 nukleotid (8-16) aminosav pozícióból álló ablakban, aholis a szekvencia azonosságot úgy számítjuk ki, hogy’ a referencia szekvenciát egy olyan szekvenciával hasonlítjuk össze, ami tartalmaz deléciókat vagy addíeiókat, amik az összehasonlító ablakban a .referencia szekvencia maximum 20 százalékára terjednek ki. A referencia szekvencia egy nagyobb szekvencia alcsoportja lehet,

A továbbiakban a húsz hagyományos aminosav és rövidítésük jelölése hagyományos flmmunology - A Syníhesis, 2. kiadás, szerk.: E.S, Golub és D.R. Green, Sínauer Associates,

Sunderland, Mass. (1991), amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk]. A húsz hagyományos aminosav sztereoizomerei (azaz például D-ammosavak), a nem-természetes aminosavak, azaz például az σ-,α-kétszeresen .helyettesített aminosavak, N-alkil aminosavak, tejsav és más nem-hagyományos aminosavak is megfelelő komponensek lehetnek a jelen találmány szerinti polipeptídekben, A nem-hagyományos aminosavak közé tartoznak az alábbiak: 4~hídro.xíprolin, γ-karboxiglutamát, εΝ,Ν,Ν-tnmetiIlizín, E-N-aeetillízín, O-foszfoszerin, N-acetilszerin, N-formilmetionln, 3-m.etílhisztídín, S-hidroxilizin, o-N-metilarginin és hasonló aminosavak és iminosavak (azaz például a 4-hídroxíprolín). Az itt használt polipeptid jelölésben a baloldali irány az N-termmáhs irány, a jobboldali irány a C-terminális irány, a standard használat és konvenció szerint.

Hasonlóképpen, hacsak külön nem jelezzük, az egyszálű polinukleotid szekvenciák baloldali vége az 5 vég; a kétszálű polinukleotid. szekvenciák baloldali irányát 5' iránynak, nevezzük. A természetes RNS transzkriptumok 5'~3' hozzáadását transzkripciós iránynak nevezzük; a DNS szálon azokat a szekvencia régiókat, amiknek ugyanaz a szekvenciájuk, mint az RNS-nek, és amik 5' irányban vannak az RNS transzkriptum 5' végéhez viszo29 nyitva, „upstream szekvenciáknak” nevezzük; a DNS szálon azokat a szekvencia régiókat, amiknek ugyanaz a. szekvenciájuk, mint az RNS-nek, és amik 3' irányban- vannak, az RNS transzkriptum 3' végéhez viszonyítva, „downstream szekvenciáknak”

Amint azt a. polípeptidekre. alkalmazzuk, a „lényegi azonosság^::”szakkifejezés azt jelenti, hogy a két pepiid-szekvencia, ha isan egynn azaz a GAP vagy

BRSTF1T programmal az alapértékű rés-súlyozást használva, legalább 80 százalékos szekvencia-azonosságot, előnyösen, legalább 90 százalékos szekvencia-azonosságot, előnyösebben legalább 95 százalékos szekvencia-azonosságot, és legelőnyösebben legalább 99 százalékos szekvencia-azonosságot mutatnak.. A nem-azonos pozíciók előnyösen konzervatív aminosav helyettesítésekben térnek el egymástól. A konzervatív aminosav helyettesítések a hasonló oldalláncokkal rendelkező csoportok felcsereiére vonatkoznak. Például az alifás oldallánccal. rendelkező aminosav csoportok közé tartozik a glicin, az alanin, a valin, a leucin és az izoleucin; az álifás-hidroxil oldallánccal rendelkező aminosav csoportok közé tartozik a szerin és a íreonin; az amidet tartalmazó oldallánccal rendelkező aminosav csoportok közé tartozik az aszparagín és a glutamin; az aromás oldallánccal rendelkező aminosav csoportok közé tartozik a fenilalanin, a tirozin és a triptofán; a bázíkus oldallánccal rendelkező aminosav csoportok közé tartozik a lizín, az argmin és a hísztidin; a kéntartalmú oldallánccal rendelkező aminosav csoportok közé tartozik a cisztein és a metíonín. Az előnyben részesített aminosav helyettesítési csoportok az alábbiak: valín-leucm-izolenéin, fenilalahin-tirozin, fizin-arginin, alaoin-valín, glutaminsav-aszparagmsav és aszparagin-glutamin.

Amint azt az alábbiakban tárgyaljuk, az ellenanyagok vagy immunglobulin molekulák aminosav szekvenciáinak minor változásai is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak, azzal a feltétellel, hogy az- aminosav szekvencia legalább 90 százalékos azonosságot mutat. Pontosabban, a konzervatív aminosav helyettesítésekre gondolunk. Azokat nevezzük konzervatív helyettesítéseknek, amik a rokoxi oldallánccal rendelkező aminosav csoporton belül történnek meg. A genetikailag kódolt aminosavakat általában családokra osztjuk: (1) poláros- aszpartát, glutamát; (2) bázxkus-lizin, arginin, hisztidin; (3) apoláros^ alanín. valín, leucín, ízoleucin, prolin, fenilalanin, xsetionin, tríptofán; és (4) töltetlen poláros-glieín, aszparagm, glutamin, ciszteín, szerin, treonín, tirozin, A még inkább előnyben részesített családok a következők: a szerin és a treonín az alífás-bidroxi család; az aszparagin és a glutamin az amid-tartalmű család; az alanín, valín, feucin és izoleucin az alifás család; és a fenilalanin, tríptofán és tirozin az aromás család. Tehát például ésszerű az a várakozás, hogy⁷ ha egy leueínt izoláltan helyettesítünk egy' ízoleucínnal vagy valinnai, egy aszpartátot glutamáttal, egy' treonint szerlnnel helyettesítőnk, vagy egy aminosav hasonló helyettesítése egy'· strukturálisan rokon aminosavval nincs nagy hatással a kapott molekula kötődéseire vagy tulajdonságaira, főleg akkor, ha a helyettesítés nem a keret részben történik. Az, hogy egy aminosav csere funkcionális pepiidet eredményez-e, könnyen meghatározható, ha vizsgáljuk a peptid-származék specifikus aktivitását. Az eszszéket az alábbiakban ismertetjük. Az ellenanyagok vagy immunglobulin molekulák fragmenseit vagy analógjait a szakterüle31 ten jártas szakember könnyen előállíthatja. A fragmensek vagy analógok előnyben részesített N-terminálisai és C-terminálisai a funkcionális domének. határ-régióiban, vannak. A strukturális és funkcionális doméneket úgy azonosíthatjuk, hegy a nukleotíd és/vagy aminosav szekvencia adatokat Összehasonlítjuk a publikus, vagy védett adatbázisokkal. Előnyösen számítógépesített a szekvencia-motívumokat vagy megjósolt fehérje-konformációs doméneket, amik az ismert struktúrájú és/vagy funkciójú fehérjékben előfordulnak., ismertek azok a módszerek, amikkel egy ismert háromdimenziós struktúrát felvevő fehérje-szekvenciák azonosíthatók [Bowie és mtsai: Science 253, 164 (1991)/ Tehát az alább következő példák azt demonstrálják, hogy a szakterületen jártas szakember felismeri azokat a szekvencia motívumokat és strukturális konformációkat, amik alapján a jelen találmány szerinti strukturális és funkcionális domének meghatározhatók.

Az előnyben részesített, aminosav helyettesítések a következők: (1) amik csökkentik egy fehérje érzékenységét a. proteolízisre, (2) amik csökkentik az oxidációra való érzékenységet, (3) tési affinitást, (4) amik megváltoztatják a kötési affinitásokat és (5) az ilyen analógok más fizikokémíaí vagy funkcionális tulajdonságait változtatják meg vagy módosítják. Az analógok lehetnek egy szekvencia műfemjei, amik nem azonosak a természetben előforduló peptid-szekvenciával. Például a természetben előforduló szekvenciában egyszeres vagy többszörös aminosav helyettesítések. (előnyösen .konzervatív aminosav helyettesítések) tehetők (előnyösen a. polípeptidnek az mtennolekuláris kontaktusokat a eső részében). Sav konzervatív aminosav helyettesítésnek nem szabad lényegesen megváltoztatni a .kiindulási szekvencia strukturális jellemzőit (azaz például egy helyettesítő amínosav nem rendelkezhet azzal a hajlammal, hogy elrontja, a kiindulási szekvenciában levő hélixet, vagy más típusú, a kiindulási szekvenciára jellemző szekunder struktúrákat elront). A. polípeptidek ismert szekunder és tercier struktúráit a szakirodalomban ismertetik [Proteins, Struetures and Moleeuiar Principles, szerk.; Creighion, W. H. Freeman and Company, New York (1984); Introductíon to Protein Structure, szerk.; C. Branden és J. Tooze, Garland Publíshíng, New York, N.Y. (1991); Tbornton és mtsai; Natúré 354, 105 (1991); amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk).

A „polípeptid fragmens* szakkifejezés a továbbiakban olyan

C-termináKs delécíót, de amiben a megmaradt amínosav szekvencia azonos a természetes szekvenciában levő, megfelelő pozíciókkal, amiket például egy teljes hosszúságú cDNS szekvenciából lehet kikövetkeztetni. A fragmensek tipikus esetben 5, 6, 8 vagy 10 amínosav hosszúak, előnyösen legalább 14 aminosavat tartalmaznak, még előnyösebben legalább 20 aminosavat tartalmaznak, általában legalább 50 aminosavat tartalmaznák, és még ennél is előnyösebben legalább 70 aminosavat tartalmaznak.

Az „ellenanyag* vagy „ellenanyag pepiid szakkifejezés egy intakt ellenanyagra, vagy annak kötő fragmensére vonatkozik, ami verseng kötő fragmenseket rekombináns DNS technikával vagy intakt ellenanyagok enzimes vagy kémiai hasításával állítjuk elő. Kötő fragmens lehet az Báb, az Fab', az F(ab js, az Fv és az egyszálű ellenanyagok. Egy ellenanyagnak, ami nem „bispecifikus* vagy ,,hí funkciós” ellenanyag, a kötési helyei azonosak. Egy ellenanyag lényegesen gátolja egy receptor tapadását egy ellenreceptorhoz, ha az ellenanyag feleslege legalább körülbelül. 20 %-kal, 40 %kai, 60 %-kal vagy 80 %-^:kal vagy még jobb, ha több mint 85 kai csökkenti' az ellenreceptorhoz kötött receptor mennyiségét (egy in m'tm kompetitiv kötési esszével mérve).

Az „epítop” szakkifejezés jelentése bármilyen fehérje determináns, ami képes specifikusan kötődni egy immunglobulin vagy miailag. aktív felszíni molekulacsoportok, azaz például aminosavak vagy' cukor oldalláncok vannak, és általában specifikus háromdimenziós strukturális jellemzőik vannak, valamint specifikus töltés-jellemzőik. Egy ellenanyagról akkor mondjuk, hogy specifikusan megköt egy antigént, ha a disszocíáeiős konstans <1 pmol/l, előnyösen <100 nM és legelőnyösebben <10 nM.

Az ágens szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy kémiai vegyület, kémiai vegyületek keveréke, biológiai makromolekula, vagy biológiai anyagokból készített kivonat.

A továbbiakban a Jelölés” vagy Jelzett” szakkifejezés jelentése az, hogy egy kimutatható markert építünk be a molekulába, azaz például egy radioaktív izotóppal jelzett am.inosa.vat, vágj* egy polipeptid vagy biotínil egységet kapcsolunk hozzá, ami jelzett avidinnei kimutatható (azaz például egy fluoreszcens markert vagy .enzimaktivitást tartalmazó sztreptavidin, ami optikai vagy kolorimetriás módszerekkel kimutatható). Bizonyos helyzetekben gíikoproteínek jelölésének számos módszere ismert a szakirodalomban. és használható. A polípeptidek jelölései lehetnek például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alábbiak: rádió34 aktív izotópok (azaz-például ³H, ⁱ⁴C, ^iSN, ³⁵S_s ^9ÖY, Te, ^mIn, ^i2sI, ¹³ *1), fluoreszcens jelölések (azaz például PITC, rodamin, lantanid foszforok) - enzimatikus jelölések (azaz például tormaperoxidáz, β~ galaktozidáz, luciferáz, alkalíkus foszfatáz), kemilumineszcens-jelölések, híoüníl csoportok, egy szekunder riporter által felismert, előre meghatározott polipeptid epitop (azaz például leucin cíppzár pár szekvenciák, szekunder ellenanyagok kötési helyei, íémkőtö domének, epitop jelölések). Néhány megvalósítási mód szerint a jelölések különböző hosszúságú spacer karokon keresztül kapcsolódnak, hogy csökkentsék a lehetséges potenciális térbeli gátA “gyógyászati ágens vagy gyógyszer” szakkifejezés a továbbiakban egy olyan kémiai vegyöletet vagy készítményt jelent, ami képes egy kívánt terápiás hatást indukálni, ha egy betegnek megfelelő módon adják be. A többi kémiai elnevezést a szakterületen hagyományosan használtnak megfelelően használjuk [The McGraw-Hill Díctionary of Chemical Terms, szerk.: Parker, S.., biakhan referenciaként kezelünk).

Az „antineoplasztiás ágens” szakkifejezés jelentése a továbbiakban olyan ágens, ami olyan funkcionális tulajdonsággal rendelkezik, hogy gátolja egy neoplazma kifejlődését vagy· progresszióját emberben., főleg egy rosszindulatú, (rákos) lézióét, mint például egy karcínómáét, szarkómáét, limlomáét vagy leukémiáét, Az áttét gátlása gyakran jellemzi az- anüneoplasztíás ágenseket,

A továbbiakban a „lényegében tiszta” szakkifejezés azt jelenti, hogy a szóban forgó anyag a túlnyomó, többségben jelenlevő anyag (azaz moláris alapon sokkal több van jelen., mint a készít35 meny bármelyik más anyagából), és egy lényegében tisztított frakció egy olyan készítmény, amiben a. szóban forgó anyag legalább 50 százalékát teszi ki (moláris alapon) az összes jelenlévő makromolekuláris anyagnak. Egy lényegében tiszta készítmény általában több mint körülbelül 80 százalékát tesz ki a készítményben. jelenlévő összes makromolekuláris anyagnak, előnyösebben több mint körülbelül 85 százalékát, 90 százalékát, 95 százalékát és 99 százalékát. Az a legelőnyösebb, ha a szóban forgó anyagot lényegében homogenitásig tisztítjuk (a szennyező komponensek hagyományos kimutatási módszerekkel nem mutathatók ki a készítményben), és a készítmény lényegében egyetlen makromolekuláris anyagot tartalmaz.

A „beteg” szakkifejezés emberekre és állatokra is vonatko .Az ellenanyag alapvető struktúrájáról ismert, hogy létrámért tartalmaz. Mindegyik tetramer két azonos polipeptid láncból áll, és mindegyik párnak van egy „könnyű” (körülbelül 25 kDá) és egy „nehéz” (körülbelül 50-70 kDa) lánca. Az egyes láncok N-terminális része tartalmaz egy körülbelül 100-11.0 vagy még több aminosavból állő variábilis régiót, ami elsőlegesen felelős az antigén felismeréséért. Az egyes láncok C-terminális része egy konstans régiót definiál, ami elsődlegesen felelős az effektor funkcióért. A humán könnyű láncokat kappa és lambda könnyű láncokra osztjuk. A nehéz láncokat mu, delta, gamma, alfa. vagy epszilon nehéz láncokra osztjuk, és ez meghatározza az ellenanyag izotípusát is, azaz hogy IgM, IgD, IgG, IgA vagy IgE· izotípusú~e, A könnyű és nehéz láncokban a variábilis és konstans régiókat egy körülbelül 12 vagy több aminosavból álló „J” régió kapcsolja öszsze, és a nehéz lánc tartalmaz még egy ,,.D” régiót is, ami körűibelül 1 vagy több aminosavból áll [Fundamental Immunology, 7. fejezet, szerk.: Fául, W., 2. kiadás, Raven Press, N.Y. (1989), amely publikációt a továbbiakban teljes egészében referenciaként kezelünk]. Az egyes könnyű/nehéz lánc párok variábilis régiói alkotják az ellenanyag-kötő hetyek

Tehát egy intakt igö ellenanyagnak két kötőhelye van. A bifunkciós vagy bispecífikus ellenanyagok kivételével a két kötőhely azonos.

Mindegyik láncnak ugyanaz az· általános struktúrája, egy viszonylag konzervált keretrégiót (FR) három hipervariábilis régió kapcsol össze, amiket komplementaritást meghatározó régióknak vagy CDR-eknek neveznek, Az egyes párok két láncából származó CD.R-ek a keretrégióknál illeszkednek egymáshoz, ami lehetővé •a C-terminálisig mind a könnyű, mind a. nehéz láncok tartalmazzák az ERI, CDR1, FR2, CDR.2, FR3, CDR3 és FR4 régiókat. Az egyes aminosavaknak az egyes doménekhez való hozzárendelése összhangban van a szakirodalomban publikált definíciókkal [Kábát: Sequences of roteins of Immunological Interest, National Instítute of Health, Bethesda, Md (1987 és 1991); vagy Chothia és Lesk: Journal of Moíecular Biology 195, 90.1.-917 (1987); Chothia és mtsai: Natúré 342, 878-883 (1989)).

Egy bispecífikus vagy biiunkciős ellenanyag egy mesterséges hibrid ellenanyag, ami két különböző nehéz/konnyű lánc párt és két különböző kötőhelyet tartalmaz·. A bispecífikus ellenanyagok számos különböző módszerrel előállíthatok, beleértve a híbridómák fúzióját vagy az Fab* fragmensek kapcsolását (Songsivilai és tachman; Clín, Exp. Immunoi. 79, 315-321 (1990); Kostelny és mtsai: J. of Immunoi. 148, 1547-1553 and bispecific antibody fragments\Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 90, 6444-6443 (1993)) vagy „JanusinokaC [Traunecker és mtsai: „Bispecific single chain molecuíes (Janusins) target cytotoxic lymphoeyt.es on HÍV íníeeted eells”, EMBO Journal .10, 3655-3659 (1991); Traunecker és mtsai: „Janusin: new molecular design fór bispecific reagents»» Int. 3. Cancer Snppl. 7, 51-52 (1992)). A bispeeífikus ellenanyagok előállítása viszonylag munkaigényes eljárás, ha a hagyományos ellenanyagokkal hasonlítjuk össze, és a kitermelés, val.amint a tisztaság foka általában alacsonyabb a bispeeífikus ellenanyagok esetében. A bispeeífikus ellenanyagok nem léteznek egyetlen kötőhelyet tartalmazó fragmensek formájában (azaz Fab, Fab' és Fv).

A humán ellenanyagok megszüntetnek néhány problémát, amik az olyan ellenanyagokkal kapcsolatban lépnek fel, amik rágcsáló vágj’ patkány variábilis és/vagy konstans régiókat tartalmaznak. Az ilyen rágcsáló vagy patkány eredetű fehérjék jelenléte az ellenanyagok gyors kiürülését okozhatja, vagy a betegben az ellenanyag elleni immunválasz generálását okozhatja. Abból, a célból, hogy elkerüljék a rágcsáló vagy patkány eredetű ellenanyagok használatát, felvetették, hogy ki lehet .fejleszteni humanizált ellenanyagokat vagy teljesen humán ellenanyagokat is, ha •egy humán ellenanyag funkciót juttatunk be egy rágcsálóba, és a rágcsáló teljesen humán szekvenciákat tartalmazó ellenanyagokat termel.

Az képesség, hogy megabázís méretű humán lőkuszokat klónozunk és rekonstruálunk YAC-kben, majd egér csíravonalba juttatjuk be, nagyon jó megközelítést biztosít ahhoz, hogy kiderítsük a nagyon nagy, vagy durván térképezett lókuszok funkcionális komponenseit, valamint a humán betegség hasznos modelljét állítsuk elő. Emellett egy ilyen technológiának a használata az egér lókuszok humán ekvivalenseikkel való helyettesítésére egyedi betekintési lehetőségeket biztosít a humán géntermékek expressziójába és szabályozásába a fejlődés során, a más rendszerekkel való kommunikációba, valamint abba, hogy milyen szerepet játszanak a betegség indukciójában és progressziójában.

Egy ilyen stratégiának egy fontos gyakorlati alkalmazása az egér humorális immunrendszer ^humanizálása*. A humán immunglobulin (lg) lókuszok bejuttatása egerekbe, amikben az endogén lg géneket inaktiváltuk, lehetőséget biztosít, hogy tanulmányozzuk a programozott expresszié· mechanizmusát és az ellenanyagok összeállítását, valamint szerepüket a B-sejtek fejlődésében. Emellett egy ilyen stratégia ideális forrást biztosít a teljesen humán monoklonálís ellenanyagok (Mab-k) előállításához, ami egy fontos mérföldkő az ellenanyag terápia humán betegségekben való használata, felé, A teljesen humán ellenanyagoktól azt várjuk, hogy minimalizálják az egér vagy egér-eredetű monoklonális ellenanyagok természetből eredő immunogén és allergiás válaszokat, ezzel javítva a beadott ellenanyag hatékonyságát és biztonságosságát, A teljesen humán, ellenanyagok használatától az várható, hogy' lényeges előnyt biztosítanak a krónikus és újra előforduló betegségekben,, azaz például a gyulladásokban, az autoimmunitásban és a rákban, amik ismételt, ellenanyag beadást Igényelnek.

Ennek a célnak az elérésében egy további megközelítési mód az, hogy' a. humán. lg nagy fragmenseivel olyan egértórzseket állítunk elő, amik defieiensek az egér ellenanyag ettől azt várva, hogy az ilyen egerek az egér ellenanyagok távollétében a humán ellenanyagok széles repertoárját termelik. A nagy humán lg fragmensek megőrzik a széles variábilis géndiverzitást, valamint az ellenanyag termelés és expresszié megfelelő szabályozását. Kihasználva az egér szervezetét az ellenanyag diverzifikálására és szelekcióra, valamint a humán, fehérjékkel szembeni immunológia toleranciát, ezekben az egértőrzsekben a reprodukált humán ellenanyag repertoár nagy affinitású ellenanyagokat eredményez bármelyik számunkra érdekes ellenanyaggal szemben, beleértve a humán antigéneket is. A hibridóma technológia alkalmazásával a kívánt specífitású antigén-specifikus humán monoklonáiis ellenanyagok könnyen előállíthatok és szelektálhatok.

Ezt az általános stratégiát a. mi általunk generált első XenoMousé™ törzsekkel kapcsolatban demonstrálták [Green és mtsai: Natúré Genetics 7, 13-21 (1994)). A XenoMousé^yM törzseket a humán nehéz lánc lókusz és a kappa könnyű lánc lőkusz 245 kílobázis és 190 kilobázis méretű csíravonal konfigurációs fragmenseket tartalmazó mesterséges élesztő kromoszómákkal állítjuk elő, amik mag variábilis és konstans régió szekvenciákat tartalmaznak [Greene és mtsai; Natúré Genetics 7, 1321 (1994)]. A humán Ig-ket tartalmazó YAC-k kompatíbilisnek bizonyultak az egér-rendszerrel, az ellenanyagoknak mind az átrendeződése, mind az expressziója szempontjából, és képesek voltak helyettesíteni az inaktívált egér lg géneket. Ezt azzal lehetett demonstrálni, hogy képesek indukálni a B-sejtek fejlődését.

ezzel teljesen humán ellenanyagok felnőtt-szerű repertoárját

a, és antigén-specifikus humán monoklonáiis ellena40 nyagokat generálva. Ezek az eredmények azt sugallták, hogy a nagyobb számú V géni, további szabályozó elemeket és humán lg konstans régiókat tartalmazó humán lg fókuszok nagyobb darabjainak bevitele lényegében összegezi azt a teljes repertoárt, ami jellemző a fertőzésre és immunizálásra adott humán Immorális válaszra. Green és munkatársai munkája újabban kiterjedt arra, hogy' a humán ellenanyag repertoár több mint 80 százalékát lehessen bevinni, a humán könnyű lánc fókuszok, és kappa. konynyű lánc fókuszok megabázis méretű, csiravonal konfigurációjú YAC fragmenseivel, ezzel Xeno'Mouse™ geereket állítva elő· [Mendez és mtsai: Natúré Genetics 15, 146-156 (1997); Green és Jakobovits: J. Exp. Med. 188, 483-495 (1998); 08/759,620 számú Amerikai Egyesült Áliamok-beli szabadalmi leírás (benyújtva 1996. december 3-án); amely publikációkat a továbbiakban refereneíaként kezelünk] .

Ezt a megközelítési módot tovább tárgyalják és körvonalazzák. a 07/466,008 számú Amerikai Egyesült Áliamok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1990. január 12-én), a 07/610,515 számú Amerikai Egyesült Áliamok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1990, november 8-án), a 07/919,297 számú Amerikai Egyesült Államök-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1992. július 24-én), a 07/922,649 számú Amerikai Egyesült Áliamok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1992. július 30-án), 08/031,801 számú Amerikai Egyesült Áliamok-beli szabadalmi leírásban, (benyújtva 1993. március 15~én), 08/112,848 számú Amerikai Egyesült Áliamok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1993. augusztus 27-én); 08/234,145 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírásban (benyújtva 1994, április 28-án), 08/376,279 számú Amerikai Egyesült Áliamok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1995. január 20-án.), 08/430,938 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1995, április 27-én), 08/462,584 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1995. június 5-én), 08/464,582 számú Amerikai. Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1995, június 5-én), 08/463,191 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva

1995. június 5-én), 08/462,837 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1995, június 5-én), 08/486,853 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1995. június 5-én), 08/486,857 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva

1995. június 5-én), 08/486,859 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1995. június 5-én) 08/462,513 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1995. június 5-én), 08/724,752 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva

1996. október 2-án) és 08 /759,620 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (benyújtva 1996. december 3án). Más publikációk is foglalkoznak ezzel a témával (Mendez és mtsai: Natúré Geneiics 15, 146-156 (1997); Green és Jakobovits: J. Exp. Med. 188, 483-495 (1998); EP 0 463 151 Bi számú európai szabadalmi bejelentés (publikálva 1996. június 12-én); WO 94/02602 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés (publikálva 1994, február 3~án); 96/34096 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés (publikálva 1996. október 31-én); WO 98/24893 (publikálva 1998. június 11-én). Az előzőkben idézett szabadalmi bejelentések, alkalmazások és referenciák leírásait a továbbiakban teljes egészükben referenciának tekintjük.

Bgy alternatív megközelítési mód' szerint mások, beleértve a. GenPharm International Inc.-t is egy „rmnílókusz” .megközelítési módot használtak. A mírdlókusz megközelítési mód szerint egy exogén íg fókuszt utánozunk az lg lókuszból származó darabok (egyedi gének) beépítésével. Tehát egy vágj/ több Vh gént, egy vagy több Dk gént, egy vagy több Jh gént. egy mu konstans régiót és egy második konstans régiót (előnyösen egy gamma konstans régió) viszünk be egy konstrukcióba, hogy állatba, építsük be. Ezt a megközelítési módot az 5,545,807 számú .Amerikai Egyesült Államok-beh szabadalmi leírásban (Suraní és munkatársai), valamint az 5,545,806, 5.625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016,

5,770,429, 5789,650 és 5,814,318 számú Amerikai Egyesült Államók-beli szabadalmi leírásban (Lonberg és Kay), az 5,591,669 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírásban (Krimpenfort és Berns), az 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 számú Amerikai Egyesült Államok-beh szabadalmi leírásban (Berns és munkatársai), 5,643,763 számú Amerikai Egyesült Állam ok-beli szabadalmi leírásban (Choi és Dunn), GenPharm International Amerikai Egyesük Államok-beli szabadalmi bejelentés, sorozatszámai 07/574,748 (benyújtva 1990. augusztus 29.), 07/575,962 (benyújtva 1990. augusztus 31.), 07/810,279 (benyújtva 1991. december 17.)». 07/853,408 (benyújtva. 1992. március 18.), 07/904,068 (benyújtva 1992. június 23.), 07/990,860 (benyújtva 1992. december 16,), 08/053,131 (benyújtva 1993. április 26.), 08/096,762 (benyújtva 1993. július 22.), 08/155,301 (benyújtva 1993. november 18.), 08/161,739 (benyújtva 1993. december 3.), 08/165,699 (benyújtva 1993. december 10.), 08/209,741 (benyújtva 1994. március 9,), amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk. Lásd még a ö 546 073 B1 számú európai szabadalmi bejelentést, a WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670,. WO 93/1.2227, WO 94/00.569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 és WO 98/24884 számú nemzetközi bejelentéseket, amely publikációkat a továbbiakban teljes egészükben referenciaként kezelünk. Lásd még; Taylor és munkatársai: „ A transgenic mouse that expresses a. diversity of humán sequence heavy and iight chain immunglobulms,* Nueieíc Acids Research 20, 6287-6295 (1992); Chen és munkatársai: „Immunoglobulin gene rearrangemenl in B-cell deficient mice generated by targeted deletíon of the JH loeus* International Immunoíogy 5, 647-656 (1993); Tuaíllon és munkatársai; „ Humán immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice; .gene-segment use in μ and y transcripís.” Proceedings of the National Acaderny of Sciences, USA 90, 3720-3724 (1993); Choi és munkatársai.: „Transgenic mice containing a humán heavy chain immunoglobulin gene fragment cloned in a yeast aröfical chromosome* Natúré Genetics 4, Π 7-123 (1993); Lonberg és munkatársai: ,, Antígenspecific humán antíbodies from mice comprising four distinct genetic modificatíons” Natúré 368, 856-859 (1994); Taylor és munkatársai: „ Humán immunoglobulin transgen.es undergo rearra.nge.ment, somatic mulatton and eláss switching in mice that lack endogenous IgM.7 International Immunoíogy 6, 579-591. (1994); Tuaíllon és munkatársai: „Anaiysis of dírect and ínverted DJH rearrangements ín a humán lg heavy chain transgenic minilocus.” J. immunoi. 154

Fishwild és munkatársai: „Hígh-avidity humán IgGy monoclonal antibodies from a növel straln of minilocus transgenic mice.*

Natúré Biotech. 14, 845-851 (1996); amely publikációkat a továbbiakban teljes egészükben referenciaként kezelünk.

Az előzőkben idézett feltalálók (Surani és .munkatársai), amely találmánynak, a tulajdonosa a. Medícal Research Counsel (az „MRC’j, lg lőkusszal rendelkező transzgeníkus egeret hoztak létre a minilőkusz megközelítési mód alkalmazásával· A. GenPharm International munka feltalálói, az előzőkben idézett Lonberg és Kay, a jelen találmány szerzőinek irányítását követve javasolták az endogén egér lg lókusz inaktiválását, lényegében. Surani és munkatársai munkájának megismétlésével,

A minilőkusz megközelítési mód előnye az a. gyorsaság, amivel az lg lókuszt tartalmazó konstrukciók létrehozhatók és beiuttathatók állatokba. Azonban ezzel összemérhető a.

mínilókusz megközelítési mód jelentős hátránya, hogy elméletileg nem elegendő diverzítást viszünk be kis mennyiségű V, D és J gének bejuttatásával. Valóban, úgy tűnik, hogy a publikált munka alátámasztja ezt a megfontolást, A mínilókusz megközelítéssel előállított állatokban a B-sejtek fejlődése és az ellenanyag termelés elsatnyultnak tűnik, Ennek következtében a jelen, találmányt, körülvevő kutatómunka következetesen arra. irányult, hogy az lg lókusz nagy részét juttassuk be, azzal a céllal, hogy nagyobb diverzitást érjünk el, és erőfeszítéseket tettünk arra, hogy helyreállítsuk az állatok immun-repertoárját,

A humán anti-egér ellenanyag (HA'MA) válaszok az ipart oda vezették, hogy kiméra vagy más módon humanizált ellenanyagokat állítsanak elő. Miközben a kiméra. ellenanyagoknak van humán konstans régiójuk, és rágcsáló variábilis régiójuk, az várható, hogy bizonyos humán antí-kíméra ellenanyag (HAGA) válaszok lesznek megfigyelhetők, főleg az ellenanyag krónikus vagy multi-dözísos alkalmazásában. Tehát kívánatos lenne teljesen humán CTLA-4 elleni ellenanyagok biztosítása, azzal a céllal, hogy lerontsuk a MAMA vagy HACÁ válaszokat és/vagy hatásokat..

Amint azt az előzőkben a humán ellenanyag előállításával kapcsolatban tárgyaltuk, vannak annak előnyei, ha csökkent ímmunitású ellenanyagokat készítünk. Ezt egy bizonyos fokig a humanízációs és bemutatási technikákkal kapcsolatben érhetjük el, a megfelelő könyvtárakat használva.. Az nyilvánvaló, hogy rágcsáló ellenanyagok vagy más fajokból származó ellenanyagok humanizálhatok, vagy primatizálhatok, a szakterületen jól ismert technikák alkalmazásával (Winter és Harris: Immunology Today 14, 43-46 (1993); Wright és mtsai: Critical Reviews in

Immunology 12, 125-168 (1992)], A számunkra érdekes nyag rekombináns DNS technikákkal megváltoztatható, azzal a céllal, hogy a megfelelő humán szekvenciával helyettesítsük a CH1, CH2, CH3, csukló doméneket, és/vagy a keret doméneket (WO 92/02190, és 3,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350 és 5,777,085 számú Amerikai Egyesült Államoklenany

Procef

71:

i leírások). Emellett az lg cDNS használata kiméra elk előállítására ismert a szakterületen (Liu és mtsai; ngs of the National Academy of Sciences, USA 84, 3439 Liu és mtsai; d. of Immunoi, 139, 3521 (1987)], mRNS-t : egy hibrid urnából vagy más, az ellenanyagot termelő majd cDNS előállítására használjuk. A számunkra érdéS polimeráz láncreakcióval smplifikálható, specifikus pri~

mazasavs rínt ,195 és 4,683,202 számú Amerikai Allamok-belí szabadalmi leírás). Egy másik változat szekészítünk, majd átvizsgáljuk, hogy izoláljuk a

4δ számunkra érdekes szekvenciát. Az ellenanyag variábilis régióját kódoló DNS szekvenciát azután humán konstans régió szekvenciákhoz fúzión áltatjuk . A humán konstans régiók szekvenciáj a megtalálható a szakirodalomban {Kábát: Sequences of Proteins of Immunologie&i interest, 91~3242~es számú publikáció, National Institute of Health, Bethesda, Md (1991/. A humán C régió génjei könnyen hozzáférhetők az ismert klőnokhöl. Az izotípus megválasztását a kívánt effektor funkciók irányítják, azaz például a komplement fixálás, vagy az ellenanyag-dependens celluláris citotoxieitásban mutatott aktivitás. Az előnyben részesített izotípusok az IgGl, ígG2, JgG3 és IgG-4, A találmányban különösen előnyben részesített, ellenanyag izotípus az IgG2 és az IgG4. Bármelyik humán könnyű lánc konstans régió, a kappa vagy a lamfoda is használható. A kiméra, humanizált ellenanyagot azután hagyományos módszerekkel expresszáltatjuk.

.Az ellenanyag fragmenseket, azaz. például az Fv-t, az Pfablz-t és a Fab-ot az intakt fehérje hasításával állíthatjuk elő, azaz például proteázzal vagy kémiai hasítással. Egy másik változat szerint csonkított gént tervezünk. Például a Ffab'k fragmens egy részét kódoló kiméra gén tartalmazza a H lánc CH1 doménjét és csukló régióját, ezt követi egy transzlációs stopkodon, így kapjuk a. csonkított molekulát.

Az egyik megközelítési mód szerint a könnyű- és nehéz lánc J régiókat kódoló konszenzus szekvenciák használhatók olyan ölígonu-kleötidök tervezésére, amik primerként. használhatók arra, hogy hasznos restrikciós hasítási helyeket vigyünk' be a J régióba, hogy utána a V régió szegmenseket hozzá tudjuk kapcsolni a humán. C régió szegmensekhez, A C régió cDNS-e helyspecifikus mutagenezíssel módosítható, azzal a céllal, hogy restrikciós hasítási helyeket vigyünk be a humán, szekvencia analóg pozíciójába.

Az expressziős vektorok lehetnek plazmidok, retrovirusok. kozmidok, YAC-k, EBV eredetű epíszómák és hasonlók. Egy jól használható vektor egy funkcionálisan komplett humán CH vagy CL immunglobulin szekvenciát kódol, megfelelő restrikciós hasítási helyeket beépítve, amiknek segítségével bármilyen VH vagy VL szekvencia könnyen beépíthető és expresszálható. Az ilyen vektorokban a hasadás általában basadó donor helynél játszódik le a beépített d régióban, és a hasadó akceptor helynél, ami megelőzi a humán C régiót, valamint a humán CH exonokban elófortermináció a természetes kromoszómális helyeknél játszódik le, a kódoló régiók után. A. kapott kiméra ellenanyag bármilyen erős promoterhez kapcsolható, beleértve a retrovirális LTR-eket, azaz például az SV-40 korai promoterét (Okayama és mtsai; Möleeular & Cellular Bíology 3, 280 (1983)], a Rous szarkóma vírus LTR-t [Gorman és mtsai: Proceedings of the. National Acaderny of Sciences, USA 79, 6777 (1982)], és a Moloney rágcsáló leukémi vírus LTR-t' [Grosschedl és mtsai: Cell 41, 885 (1985)]. a természetes lg promotereket, stb.

Emellett humán ellenanyagok,, vagy más fejőkből származó ellenanyagok bemutatás-típusú technológiákkal állíthatók elő, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a Tág-bemutatást, a retrovirális bemutatást és más technikákat, a szakterületen jól ismert technikákat alkalmazva, és a kapott molekulákat további érési folyamatnak, vethetjük alá, azaz például affinitás érésnek, amint ezek a technikák a. szakterületen jól ismertek [Wright és mtsai: Critical Reviews in Imniunology 12, 125-168 (1992); Hanes és Ploethau: Proceedings of thé National Academy of Sciences, USA 94, 4937-4942 (1997) (riboszőmálís bemutatás)], Parmley és Smith: Gene 73, 305-318 (1988) (fág bemutatás)], Scott; Trends ín Biochem. Sci. 17, 241-245 (1992); Cwirla és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 87, 6378-6382 (1990); Russel és mtsai.: Nucleic Áoids Research. 21, 1081-1085 (1993); Höganböom és mtsai: Immunologícal Reviews 180, 43-68 (1992); Cbiswell és McCafférty: TIB'TECH 10, 80-84 (1992); 5,733,743 számú Amerikai Egyesült Államok-heli szabadalmi leírás]. Ha bemutatási technológiákat használunk nem-humán ellenanyagok előállítására, akkor az ilyen ellenanyagok az előzőkben ismertetett mádon, humanizálhatok.

Ezeknek a technikáknak az alkalmazásával ellenanyagok készíthetők CTLA-4-et expresszáló sejtek ellen, a CTLA-4 ellen, a CTLA-4,. epitopjai vagy peptídjei különböző formái, ellen, valamint ezek expressziős könyvtárai ellen (5,703,057 számú Amerikai Egyesült Államok-heli szabadalmi leírás), amik azután az előzökben ismertetett aktivitások szempontjából átvis

Amint az nyilvánvaló,, általában nem kívánatos a CTLÁ-4-et expresszálő sejtek elpusztítása. Ehelyett általában inkább arra van szükség, hogy egyszerűen gátolják a CTLA-4 kötődését a Ii.gandumaüioz, hogy csillapítsák, a. T-sejtek elfojtását. Az egyik fő mechanizmus, amivel az ellenanyagok elpusztítják a sejteket, a komplement fixálásán, keresztül és a CDC-ben való részvétellel játszódik le. Egy ellenanyag konstans régiója fontos szerepet játszik az ellenanyag azon képességében, hogy fixálja a komplementet és részt vegyen a CDC-ben. Tehát általában kiválasztják egy ellenanyag izotípusát, ezzel vagy biztosítva a komplement fixálási képességet, vagy nem. A. jelen találmány esetében általában, ahogy az előzőkben említettük, általában nem részesítjük előnyben, ha egy ellenanyag elpusztítja a sejteket. Az ellenanyagok számos ízotípusa létezik, amelyik képes a komplement fixálásra és a CDC-re beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alábbiakat* rágcsáló IgM, rágcsáló lgG2a, rágcsáló igG2b, rágcsáló ígG3, humán IgM., humán IgG 1, és humán IgG3. A nem ide tartozó ízotípus például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a humán IgG2 és a humán IgG4.

Az: nyilvánvaló, hogy a generált ellenanyagoknak nem szükséges a legelején egy bizonyos, kívánt izotípussal rendelkezniük, hanem ehelyett, a generált ellenanyag bármilyen izotípussal rendelkezhet, máj az ellenanyag Ízotípusát utána a szakterületen jól ismert hagyományos technikákkal megváltoztathatjuk. Ilyen technika például a direkt rekombináns technika (4,816,397 számú Amerikai Egyesült Államok-helí szabadalmi leírás), a sejt-sejt fúziós technikák (08/730,639 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás, 1996. október 11), többek között.

A sejt-sejt fúziós technikában, egy míelóma vagy más sejtvonalat készítünk, ami tartalmaz egy bármilyen izotipusű. nehéz láncot, és készítünk egy másik míelóma vagy más sejtvonalat, ami a könnyű láncot tartalmazza. Ezek a sejtek azután fűzzionáltat hatók, és az intakt ellenanyagot expresszáló sejtvonal izolálható.

Például az ebben a leírásban tárgyalt CTLA-4 ellenanyagok többsége humán anti-CTLA-4 lgG2 ellenanyag. Mivel az ilyen ellenanyagok a kívánt kofőképességgel rendelkeznek a CTLA-4 molekulához, bármelyik Ilyen ellenanyag ízotípusa könnyen megváltoztatható, hogy például egy humán IgG4 ízotípust állítsunk elő, ami viszont még a kívánt variábilis régióval rendelkezik (ami meghatározza az ellenanyag specifitását és valamennyire az affinitását).

Ennek megfelelően, mivel olyan ellenanyag jelölteket állítunk elő, amik megfelelnek az előzőkben tárgyeit, kívánt “strukturális” attribútumoknak, ezeket általánosságban legalább bizonyos további „funkcionális” attribútumokkal láthatjuk el, amik az. izotípus váltás során szükségesek.

Amint azt az előzőkben tárgyaltuk,, a találmány szerint ellenanyagok effektor funkciói IgG 1-re, IgG2-re, ígG3-ra, IgG4-re, ígD-re, IgA-ra, IgE-re vagy IgM-re való izotípus váltással megváltoztathatők, különböző terápiás célok elérése érdekében.

A fejlett ellenanyag terápiás szerek generálásával kapcsolatban, ahol a komplement fixálás egy kívánt jellemző, lehetséges lehet hogy kikerüljük a komplementtől való függést a sejtpusztításnál bíspecífikumok, immuntoxinok vagy például radioaktív jelölések használatával

A bispecífikns ellenanyagokkal kapcsolatban olyan bíspecifikus ellenanyagok generálhatók, amik a következőket tartalmazzák: (í) két ellenanyag, amik közül az egyik CTLA-4 specifikus, a másik egy második molekulára specifikus, és ezek konjugálva vannak, (ii) egyetlen ellenanyag, aminek az egyik lánca a CTLA-4re specifikus, a másik lanca egy második ellenanyagra specifikus, vagy (fii) egy egyláncú ellenanyag, ami mind a CTLA-4-re, mind más molekulára specifikus. Az ilyen, az- (i) és (ii) pontnak megfelelő bispecifikus ellenanyagokat jól ismert technikákkal lehet létrehozni (Fanger és mtsai: Immunoi Methods 4, 72-81 (1994): Wright és mtsai: Critical Reviews in Immunology 12, 125158 (1992)] és a (fii) pontnak megfelelő bispecifikus ellenanyagok előállítási technikáit is leírták (Traunecker és mtsai; Int. J. Cancer (Suppl.) 7, 51-52 (1992)].

and construction of a hybríd immunoglobulm domaín with properti.es of both heavy and light chain variable regions.” Protein Eng.. 10, 949-957 (1997)], „Mínibody-k” (Martin és munkatársai; „The afiinity-selectíon of a mínibody polypeptide inhibitor of humán interleukm-6.” EMBO Journal 13, 5303-5309 (1994)], „Diabody-k” (Holliger és mtsai: „Diabodíes; small hivalent and bispeeifie antibody íragmentsT Proceedings of the National Aeademy of Sciences, USA 90, 6444-6448 (1993)), vagy „Janusinok” (Traunecker és mtsai; „Bispeeifie single chain molecules (Janusins) target cytoíoxie lymphoeytes on HÍV infeeted cells”, EMBO Journal 10, 3655-3659 (1991); Traunecker és mtsai; „Janusin; n.ew molecular design fór bispeeifie reagents”, Int. J.

51-52

Az immuntoxinokkal kapcsolatban az ellenanyagok ügy módosíthatók. hogy Immuntoxinként hassanak, a szakterületen jól ismert technikákat alkalmazva (Vitetta; Immunology Today 14, 252 (1993); 5,194,594 számú. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás] . A radioaktív izotópokkal jelzett, ellenanyag készítésével kapcsolatban az Ilyen módosított ellenanyagok könynyen előállíthatok a szakterületen jől ismert technikák alkalmazásával (Junghaos és munkatársai In: Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 2. kiadás szerkesztők; Cafner és Lnngo, Lippíncott Raven. (1996); 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471 és 5,697,902 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás]. Mindegyik immuntoxin es ;izett.

v<

3.

ó sejteket, főleg azokat a sejteket, amikben

Az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti terápiás egységeket megfelelő hordozókkal, töltőanyagokkal, valamint más ágensekkel adjuk he, amiket beteszünk a készítményekbe, amikkel javított átvitelt, bevitelt toleranciát és hasonlókat biztosít. Számos különböző megfelelő készítmény található a győgyszervegyészek számára ismert gyógyszerkönyvekben: Remington’s Pharmaceuíical Sciences, 15. kiadás, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975), főleg a 87. fejezet, aminek szerzői Blang és Seymour. Ezek a készítmények lehetnek például porok, paszták, kenőcsök, gélek, viaszok, olajok, lipid ek lípidet (kationos vagy anionos) tartalmazó vezikulumok (azaz például Lipofectm™), DNS konjugátumok, vízmentes abszorpciós paszták, olaj-a-vízben vagy víz-az-ölajban emulziók, emulziós karbowaxok (különböző· molekulasúlyú polietílénglikoloki. féig szilárd gélek, és karbowaxot tartalmazó félig szilárd keverékek.. Bármelyik előzőkben említett keverék megfelelhet a jelen találmány szerinti kezelésekben és adalékanyagot nem inaktiváljuk a készítménnyel, és a készítmény fiziológiásán kompatibilis és tolerábilis a beadási móddal [Povvell és mtsaí: „Compendium of excipíents fór paren.tera.1. formulatíons” PDA d. Pharm. Sci. Technoi. .52, 238-311 (1998), valamint az ebben idézett további információk, amik a gyógyszervegyészek számára jól ismert töltőanyagokra és hordozókra vonatkoznak.

A jelen találmány szerinti ellenanyagokat előnyösen transzgenikus egerek alkalmazásával állítjuk elő, amik a humán ellenanyagot kódoló genom lényeges részét tartalmazzák genomjukha beépülve, és az endogén, rágcsáló ellenanyagok. termelésére képtelenné lettek téve. Az ilyen, egerek azután képesek humán immunglobulin molekulákat és ellenanyagokat termelni, és nem képesek rágcsáló immunglobulin molekulákat és ellenanyagokat termeink Az ugyanennek a célnak az eléréséhez használt technológiákat az ismertetett szabadalmi leírásokban, benyújtásokban és referenciákban ismertetjük. Pontosabban, a transzgeníkus egerek és a belőlük származó ellenanyagok előállításának egy előnyben részesített módszerét a szakirodalomban, megtalálhatjuk (08/759,620 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, benyújtva 1996. december 3-án; Mendez. és mtsai: Natúré Genetics 15, 146-156 (1997), amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk].

Az ilyen technológia használatával számos különböző antigén ellen állítottunk elő teljesen humán monoklonális ellenanyagokat. Lényegében XenoMouse™ egér vonalakat immunizálunk számunkra érdekes antigénnel, kinyerj ük a nyiroksejteket B-sejteket) az ellenanyagokat expresszálő egerekaz ilyen kinyert sejteket mieloid-típusú sejtvonallal fúzionáltatjuk, hogy halhatatlan hibridóma sejtvonalakat állítsunk elő elő, majd ilyen hibridóma sejtvonalakat átvizsgáljuk, és kiválasztjuk azokat a hibridóma sejtvonalakat, amik a számunkra érdekes antigén elleni ellenanyagot termelnek. Ezeket a technikákat a jelen találmány szerint használjuk a CTLA-4-re specifikus ellenanyagok előállítására. Az alábbiakban leírjuk a CTLA-4re specifikus ellenanyagokat termelő többszörös hibridóma sejtvonalak előállítására. Emellett biztosítjuk az ilyen sejtvonalak által termelt ellenanyag jellemzését, beleértve az ilyen ellenanyagok nehézig.

és könnyű láncainak nukleotid- és aminosav szekvenciáit

Az itt tárgyalt hibrídóma sejtvonalakbó! ellenanyagok jelzése: 3,1,1, 4-..1., 4,8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4-13.1, 4.14,3, 6.1.1,

11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 és 12.9.1.1. Mindegyik, az előzőkben említett sejtvonalak álta termelt. sejtvonal vagy teljesen humán IgG2, vagy teljesen humán IgG4 nehéz láncot tartalmaz, a humán kappa könnyű lánccal. A jelen találmány szerinti ellenanyagoknak nagyon nagy az affinitása, Kd értékük tipikusan körülbelül lö'- és körülbelül ΙΟ¹¹ M., ha szilárd fázisban vagy oldat fázisban mérjük.

Amint az nyilvánvaló, a jelen találmány szerinti ellenanyagokat a hibrídóma sejtvonalaktól eltérő sejtvonalakkal is expresszáltathatjuk. Egy adott ellenanyagot kódoló cDNS vagy ge.nomiális klón szekvenciát használhatók egy megfelelő emlős vagy nem emlős gazdasejt transzformálására. A transzformálást elvégezhetjük bármelyik ismert módszerrel, polinukleotidokat juttatva egy gazdasejtbe, beleértve például, a polinukleotid egy vírusba (vagy virális vektorba) való pakolását, majd egy gazdasejtet transzdukálunk a vírussal (vagy virális vektorral), vagy a szakterületen ismert transzfekcíós eljárást használunk erre a célra (4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 és 4,959,455 számú Amerikai Egyesült. Államok-beli szabadalmi leírás, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk), A használt transzformációs eljárás függ a transzformálandó gazdaszervezettől. A heterolőg polinukleotidok emlős sejtekbe való bejuttatására használt transzformációs eljárás függ a transzformálandó gazdaszervezettől. A heferolőg polinukleotidok emlős sejtekbe való bejuttatására használt transzformációs eljárások jól ismertek a szakirodalomban, és ide tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a dextránnal végzett transzfekció, a kalcium-foszfát kicsapás, a polibrénes transzfekció, a protoplaszt fúzió, az elektroporáció, a .részecske bombázás, a polínukleotid(ok) lipo~ szórnék ba való kapszulázása, pepiid konjugátumok, dendrimerek, és a DNS közvetlen mikroinjekciózása sejtmagokba.

Az expressziöhöz gazdaszervezetként használható emlős sejtvonalak jól ismertek a -szakterületen, és ide tartozik számos halhatatlanná, tett sejtvonal az American Type Culture Collection-íöl (ATCC), beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az aranyhórcsőg petefészek (CHO) sejteket, az MSÖo, HeLa sejteket, a bébihörcsög vesesejteket (BHK), a majomvese sejteket (COS), a humán hepatocelluláris karcinöma sejteket (azaz· például a Hep G2-t), valamint számos más sejtvonalat.. A nem-emlős sejtek, amik anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, bakteriális-, élesztő-, rovar-sejtek, és növényi, sejtek is lehetnek, szintén használhatók rekombínáns ellenanyagok expresszálására. Előnyben részesíthetjük az ellenanyag CH2 dóm énjének hely specifikus mutagenezísét, hogy elimínáljuk a glikozilezést, azzal eein megtűr az immunogenitásban, a farmakokinetikában és/vagy az eífektor funkciókban fellépő változásokat, amik a nem-humán glikozdezés eredményei lehetnek.. Az expressziós módszereket, úgy választjuk meg, hogy meghatározzuk, melyik rendszer generálja a legmagasabb expressziós szinteket, és konstitutív CTLA-4-kótő tulajdonságokkal rendelkező ellenanyagokat állítanak elő.

Emellett a jelen találmány szerinti ellenanyagok (vagy azokból származó más egységek) expressziója a termelő sejtvonalak56 bán számos ismert technikával fokozható. Például a glutamin szintetáz és díhidrofolát-reduktáz génexpresszíós rendszerek általános megközelítési módok az expresszió fokozására bizonyos körülmények között. Az erősen expresszálő sejt-klőnok hagyományos technikákkal azonosíthatjuk, azaz például limitált higítási klónozással és mikrocsepp technológiával. A GS rendszert részben vagy teljesen tárgyalják a 0 216 846, 0 256 055 és 0 323 997 számú európai szabadalmi leírásokban, és a. 89303964.4 számú

A jelen találmány szerinti ellenanyagokat előállíthatjuk transzgenikns úton is, olyan emlős vagy növény generálásával, amik a számunkra érdekes immunglobulin nehéz lánc és könnyű lánc szekvenciákra transzgenikusak. és belőlük kinyerhető mő~ termelik az ellenanyagot. Az emlősökben való transzgenikus kapcsolatban az ellenanyagok előállíthatok és kinyerhetők kecskék, szarvasmarhák vagy más emlősök tejéből. (5,827,690, 5/756,687, 5/750,172 és 5/741,957 számú Amerikai

Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás).

A jelen találmány szerinti ellenanyagokat strukturálisan és funkcionálisan elemeztük. Az ellenanyagok struktúrájával kapcsolatban a nehéz lánc és a kapna könnyű lánc aminosav szekvenciáit a hibridómák reverz transzkriptáz-pölimeráz láncreakciójával cDNS szekvenciák alapján jósoljuk meg (lásd a 3. és 4.

szekvenálását is elvégeztük, igazolva a 3. és 4.

eredményeket (lásd az 5. példát és a 9. ábrát). Az ellenanyagok kinetikai elemzését is elvégeztük, hogy meghatározzuk az affinitásokat (lásd a 2. példát). Emellett az ellenanyagokat izoelektromos fókuszálással (1EF), redukáló gélelektroforézíssel (S.DS45*»

PAGE), méretkizárásos. kromatográSával, folyadékkromatográfia/tömegspektroszkópiáva! és tömegspektroszkőpíával vizsgáljuk, valamint megbecsüljük, hogy a hxbridómák mennyi ellenanyagot termelnek (lásd a 6. és 10. példát).

A jelen találmány szerinti ellenanyag funkcionális elemzésével kapcsolatban, az ilyen ellenanyagokról kiderült, hogy hatékony inhibitorai a CTLA-4-nek, és gátolják kötődését a B7 molekulacsaládba tartozó ligandumaihoz. Például a jelen találmány szerinti ellen anyagokról igazoltuk, hogy blokkolják a CTLA-4 kötődését a B7- 1-hez vagy B7-2-höz (lásd a 7, példát). Valóban, a jelen találmány szerinti ellenanyagok közül számos rendelkezik: nanomoláris és sznbnanoxnoláris ICso-nel, a CTLA-4 B7-1 és B72-höz való kötöd esőnek gátlásával kapcsolatban. Emellett a jelen v szerinti e zmu szelektivitást mutatnak a CTLA-4-gyel szemben, a CD28-caI, CD44-gyel, B7-2-vel vagy hlgGl-gyel összehasonlítva (lásd a 8. példát). A szelektivitás egy olyan arány, ami tükrözi egy molekulának egy első ágenshez való preferenciális kötődése mértékét, olyan molekulákkal összehasonlítva, amik egy második és opcionálisan más molekulákhoz kötődnek. Az alábbiakban a szelektivitás a jelen találmány szerinti ellenanyag CTLA-4-hez való preferenciális kötődésének mér tékére utal, az ellenanyagnak más molekulákhoz, azaz például a CD28~hoz, CD44-hez, B7~2~höz vagy hlgG 1-hez való kötődésével ter/a.

gok oüü:b nél nagyobb szelektívitási értéke általános, A jelen, találmány szerinti ellenanyagokról. azt is kimutatták, hogy indukálják vagy fokozzák bizonyos cxtokmek (azaz például az interleukín~2 és az interferon-γ) expresszióját T-sejtekben, egy T-sejt blaszt modellben, (lásd a 9, és 10. példát, valamint a 12-17. ábrát). Emellett az vár58 ható, hogy a jelen találmány szerinti ellenanyagok gátolják tumorok növekedését megfelelő in író tumor modellekben. Ezeknek a modelleknek a tervezését all. és 12. példában, tárgyaljuk.

A jelen találmány szerinti eredmények azt jelzik, hogy a jelen találmány szerinti ellenanyagok olyan minőséget hordoznak, amik lehetővé teszik, hogy a jelen találmány szerinti ellenanyagok hatékonyabbak legyenek mint a CTLA-4 ellen jelenleg használt terápiás ellenanyagok..

a 4.1.1, 4.8.1 és 6,1.1 ellenanyagok nagyon előnyős tulajdonságokkal rendelkeznek. Strukturális jellemzőik, funkcióik vagy aktivitásuk olyan kritériumokat biztosít, amik megkönnyítik további ellenanyagok vagy más, előzőkben tárgyalt molekuléfc tervezését vagy szelekcióját. Ilyen kritérium lehet egy vagy több az alábbiak közük

Képes versengeni a CTLA-4-hez való kötődésért egy vagy több, a jelen találmány szerinti ellenanyaggal;

Ahhoz hasonló kötési specifitása van a CTLA-4-hez, mint egy vagy több jelen találmány szerinti ellenanyagnak;

A CTLA-4 kötési affinitása körülbelül IÖ'⁹ M vagy több, előnyösen körülbelül 10'vagy nagyobb;

gyei, beleértve előnyösen az egér, patkány vagy nyúl, és előnyösen az egér vagy patkány CTLA-4-et;

Keresztreakciót ad főemlős CTLA-4-gyel, beleértve a cynomolgus és rhesus CTLA-4-et;

A CTLA-4-re vonatkozó szelektivitása a CDCS-oal, B7-~2~vei, CD44-gyel vagy h'IgGl-gyel szemben legalább körülbelül 100:1 vagy nagyobb, előnyösen körülbelül 300, 400 v nagyobb.

500:1 vagy

A CTLA-4 B7-2-hóz való kötődésének blokkolásában ICso értéke körülbelül 100 n.M vagy kisebb, és előnyösen 5, 4, 3, 2, L 0,5 vag>^; 0,38 nM, vagy kisebb;

A CTLA-4 B7- 1-hez való kötődésének blokkolásában ICso értéke körülbelül 100 nM vagy kisebb, és előnyösen 5, 4, 3, 2, l_s0,5 vagy 0,38 n.M, vagy kisebb;

A eitokin termelés fokozása egy vagy több in vítro esszében, azaz például:

T-sejt blaszt/Raji esszében az interl.eukin-2 termelés fokozása körülbelül 500 pg/ml-rel vagy többel, előnyösen 75Ö, 1.000, 15Ό0, 2Ö0Ö, 3000 vagy 3846 pg/ml-rel vagy többel;

T-sejt blaszt/Raji esszében az interferon-γ termelés fokozása körülbelül 500 pg/ml-rel vagy többel, előnyösen 750, 1000, 1200, vagy 1233 pg/ml-rel vagy többel; vagy hPBMC vagy teljes vér supe.ran.hgen esszében az interleu,kin~2 termelés fokozása körülbelül 500 pg/ml-rel, vagy többel, és előnyösen 750, 1000, 1200 vagy 1.511 pg/ml-rel vagy többel. Másképpen kifejezve, az a kívánatos, ha az interleukin-2 termelést körülbelül .30, 35, 40, 45, 50 százalékkal vagy többel fokozzuk, az esszében levő kontrollal összehasonlítva.

Az várható, hogy azok az ellenanyagok (vagy a belőlük, tervezett vagy szintetizált molekulák), amik ezek közül a tulajdonságok közül egyet vagy többet tartalmaznak, hasonló hatékonysággal rendelkeznek, mint a .jelen találmányban ismertetett ellenanyagok.

Az előzőkben tárgyalt, kívánt tulajdonságok gyakran eredményeznek a CTLA-4 egy molekulához (azaz például ellenanyag, ellenanyag íragmens, pepiid vagy kis molekula) való kötődésétől a gátlásáig terjedő spektrumot, hasonló módon, mint a jelen ta6« lálmány szerinti, ellenanyagnál (azaz például a CTLA-4 molekula ugyanazon vagy hasonló epitopjához való kötődés).

Á molekulát beadhatjuk .közvetlenül (azaz például egy bete get közvetlenül kezelhetünk ilyen molekulákkal). Vagy, egy másik változat szerint a molekulát „beadhatjuk” közvetve is (azaz egy pepiidet, vagy hasonlót, ami immunválaszt generál egy betegben (a vakcinához hasonlóan), aholís az immunválasz magában foglalja olyan ellenanyagok generálását, amik ugyanahhoz vagy hasonló epitophoz kötődnek, vagy egy olyan ellenanyagot vagy fragmenst, ami m situ keletkezik a genetikai anyagok beadása után. amik ezeket az- ugyanahhoz vagy hasonló epitophoz kötődő ellenanyagokat, vagy fragmenseiket kódolják). Tehát az nyilvánvaló, hogy a CTLA-4 azon epitopjai, amikhez· a jelen találmány szerinti ellenanyag kötődnek, jól használhatók lehetnek a. jelen találmány szerinti terápiás, szerek készítésében esz vagy te gyógyszertervezésben a negatív információ is hasznos (azaz hasznos annak a ténynek az ismerete, hogy egy ellenanyag, ami kötődik a CTLA~4~hez, láthatóan nem kötődik egy olyan epitophoz, ami a CTLA-4 inhibitoraként hat). Tehát az az epitop, amihez a jelen találmány szerinti ellenanyagok kötődnek, és nem eredményezi a. kívánt funkcionalitást, szintén nagyon hasznos lehet). Ennek megfelelően a jelen találmányban olyan molekulákat (főleg ellenanyagokat) is megfontoltunk, amik ugyan ahhoz vagy hasonló epitophoz kötődnek, mint a jelen találmány szerinti ellenaAmellett a tény mellett, hogy a jelen találmány szerinti ellenanyagokat és epitopokat, amikhez kötődnek megfontoltuk a jelen találmányban, előzetes epitop térképezési vizsgálatokat vé~ geztünk néhány jelen találmány szerinti ellenanyagon, főleg a jelen találmány szerinti 4.1,1 és 11.2.1 ellen anyagon.

Első lépésként BIAcore kompetíciós vizsgálatokat végeztünk, hogy a kötődés durva térképét megkapjuk, néhány jelen találmány szerinti ellenanyagra, azzal a képességükkel kapcsolatban, versengenek a CTLA-4-hez való kötődésért. Ebből a célból a CTLA-4-et egy BIAcore chip-hez kötöttük, és ehhez egy első ellenanyagot kapcsolunk telítési körülmények között, és ezt követően mérjük a szekunder ellenanyagoknak a CTLA-4-hez való kötődését. Ez a technika, lehetővé teszi egy durva térkép elkészítését, amivel az ellenanyagok családjai osztályozhatók.

kategorizálható, és eszerint alábbi epítop kategóriákba esnek,

Versengés a CTLA-4 kötődésért Szabadon versengenek egymással keresztbe; keresztbe versengenek a B kategóriával; van valamennyi keresztversengés a D kategóriával

Szabadon versengenek egymással keresztbe; keresztbe versengenek az A,

C és D kategóriával

Szabadon versengenek egymással keresztbe; keresztbe versengenek a B és D kategóriával

1 D	\| 4.14.3	Keresztbe versengenek a C é góríával; van valamennyi versengés az A kategóriával	s B kate- kereszt-
E	4,9,1 RNI3***	A BN13 blokkolja a 4.9.1 köti CTLA-4-hez, de a fordítottját	idősét a nem

(*) (**} beszerezhető a Biostride-től (***) beszerezhető a Pharmíngen-tel

Kővetkező lépésként erőfeszítéseket tettunk arra, hogy meghatározzuk, hogy az ellenanyagok felismernek-e egy lineáris· epitopot a CTLA-4-en redukáló és nem-redukálő körülmények között, Western blotban. Megfigyeltük, hogy a 4.1.1, 3,1.1,

11.7.1, 11,0.1 vagy 11.1,1 ellenanyagok közül egyik sem ismeri fel a CTLA-4 redukált formáját Western blotban. Ennek megfelelően valószínűnek tűnt, hogy az epitop, amihez ezek az ellenanyagok kötődnek, nem lineáris epitop, hanem sokkal valószínűbb, hogy egy konformációs epitopja annak a struktúrának, amit valószínűleg eltöröltünk redukáló körülmények között.

Ennek megfelelően azt próbáltuk meghatározni, hogy megismerhetjük-e azokat a csoportokat a CTLA-4 molekulában, amik fontosak a jelen találmány szerinti ellenanyagokhoz való kötődésben. Az egyik, általunk használt módszer az az, hogy kínetikaílag becsültük az off-rate-eket a humán CTLA-4 és két erősen konzervált főemlős (cynomolgus és marmoset) CTLA-4 molekulák között, A BIAcore vizsgálatok azt demonstrálták, hogy a 4.1.1 ellenanyag ugyanazzal a sebességgel kötődik a humán, cynomolgus és marmoset CTLA-4-hez. Azonban, ami az off-rateeket (affinitás) illeti, a 4.1,1 ellenanyagnak a legnagyobb az affinitása (lassúbb oíf-rate) a humánhoz, gyorsabb az ofí-rate-je a cynomolgushoz és sokkal gyorsabb az oíí-rate-je a marmosethez. Viszont a jelen találmány szerinti 11.2.1 ellenanyag ugyanazzal a sebességgel kötődik a humán, a cynomolgus és marmoset CTLA4-hez, és körülbelül ugyanaz a relatív öfí-rate-je mind a háromhoz. Ez az információ azt is jelzi még, hogy a 4.1.1 és 11.2.1 ellenanyagok a CTLA-4 más epitopjaihoz kötődik.

Abból a célból, hogy vizsgáljuk az epitopot, amihez a jelen találmány szerinti B és C kategóriájú ellenanyagok kötődnek, elvégeztünk bizonyos helyspecifikus mutagenezist. A marmoset

CTLA-4 a humán. CTLA-4-.hez viszonyítva két fontos változást tartalmaz a 105-ös és 106-os pozícióban. Az ilyen változás egy leucin metionínra való- cseréje a 10 5-ös pozícióban és egy glicínszerin. csere a 106-os pozícióban. Ennek megfelelően a humán CTLA-4-et kódoló cDN'S-t elmutáltattuk, oly módon, hogy egy mutált CTLA-4-et kódoljon, ami tartalmazza az L1Ö5M és GT06S változásokat. A4 homológ helyettesítési mutánsa nem érinti a B7.2-ígGl fúziós fehérje kötődését. Emellett az ilyen molekula súlyosan gátolva van abban a képességében, hogy kötődjön a

4.1.1 ellenanyaghoz (a marmosethez hasonlóan). Ezután egy marmoset CTLA-4-et kódoló cDNS-t. mutáltattunk. hogy egy olyan mutáns marmoset CTLA-4-et kapjunk, ami tartalmazza az S1Ö6G változást. Az ilyen változás a stabil kötődés helyreállását eredményezi a 4.1.1 ellenanyag és a marmoset. CTLA-4 mutáns között. Emellett elmutáltattunk egy marmoset CTLA-4-et kódoló cDNS-t, ezzel egy olyan mutáns marmoset CTLA-4-et hozva létre, ami tartalmazza az M1Ö5L változást. Ez a. változás részlegesen helyreállította a 4.1,1 ellenanyag és a mutáns CTLA-4 közötti kö64 ♦ s

Ugv tűnik, hogy a jelen találmány szerinti B-D kategóriájú ellenanyagok hasonló funkcionális tulajdonságokkal rendelkeznek, és megvan a potenciáljuk, hogy erős anti-CTLA~4 terápiás ágensként hassanak. Emellett mindegyik molekula mutat kereszt-versengést a CTLA-4-hez való kötődésében. Azonban, amint az a fenti tárgyalásból megfigyelhető, mindegyik, különböző kategóriába tartozó molekula a CTLA-4 más-más konformációs

Az előzőkből nyilvánvaló, hogy az előzőkben tárgyalt epitop információ azt jelzi, hogy az ellenanyagok (vagy más molekulák, amint az előzőkben tárgyaltuk), amik kereszt-versengenek a jelen találmány szerinti ellenanyagokkal, valószínűleg rendelkeznek valamennyi jelen találmány szerinti terápiás potenciállal. Emellett az várható, hogy az ellenanyagok, (vagy más molekulák, amint az előzőkben tárgyaltuk), amik keresztbe versengenek a jelen találmány szerinti ellenanyagokkal (azaz keresztbe versengenek a B, C és/vagy D kategóriás ellenanyagokkal! ví további, jelen találmány szerinti terápiás keznek. Emellett, az várható, hogy az ellenanyagok, (vagy más molekulák, amint az előzőkben tárgyaltuk), amik keresztbe versengenek a jelen találmány szerinti ellenanyagokkal (azaz keresztbe versengenek a B, C és/vagy D kategóriás ellenanyagokkal) és amiknek (í) nem csökkent le a. marmoset CTLA-4hez (ami hasonló a 11.2,1 ellenanyaghoz) való kötődése, vagy (ii) lecsökkent a marmoset CTLA-4-bez (ami hasonló a 4.1.1 ellenanyaghoz) való kötődése, valószínűleg további, jelen találmány szerinti terápiás potenciállal rendelkeznek. Azok az ellenanyagok (vagy más molekulák, amint az előzőkben tárgyaltuk), amik ver65 sengenek az A és E kategóriával szintén rendelkeznek bizonyos

Az alábbi példákat, beleértve az elvégzett kísérleteket és a kapott eredményeket is, illusztrálás céljából adjuk meg, és szándékaink szerint nem korlátozzák a jelen találmánv oltalmi körét.

Ant.i~CTLÁ-4 ellenanyagot termelő hibridómák generálása

A jelen találmány szerinti, ellenanyagokat az alábbi példa szerint állítjuk elő, szelektáljuk és vizsgáljuk.

Három különböző ímmunogént készítünk a XenoMouse™ k Immunizálásához: (i) egy CTLA-4-IgG fúziós fehérjét, (ii)

-A~4 pepiidet és (iiij 300.19 rágcsáló nyiroksejteket, egy mutáns CTLA-4-gyeÍ (Y2Ö1V) transzíekt&lva, ami konstítutíve expresszálódlk a sejt felszínén.

CTLA-4-IgG fúziós fehérje:

A CTLA-4 érett extr&cellulárís doménjét polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk humán, csecsemőmirigy cDNS könyvtárból (Clontech), a publikált szekvencia alapján tervezett primereket. használva [Búr. J. Immunoi. 18, 1901-1905 (1988)]. A fragmenst irányítottan szubklőnozzuk p8R5~be_? egy Sindbís vírus expressziős plazmidba (Invitrogen), a humán onkosztaíin. M szignálpeptid és a humán IgG gamma 1 (IgGl) CG1/CH2/CH3 domének közé. a fúziós fehérje nem. tartalmaz csukló domént, de tartalmaz cisz66 ί«=»τη 1 a P’TT.A-4 #»xtrar^H ss dírnert képezzen. A kapott vektor neve CTLA-4~IgGl Z'pSRS. A vektorban levő komplett CTLA-4-IgGl oDNS mindkét szálát szekvenáljuk, ellenőrzés céljából A CTLA-4-l.g fehérje aminosav szekvenciáját az alábbiakban mutatjuk he. A CD44 érett extraeelluláris doménjét polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk anti-humán límfocita könyvtárból (Clontech), majd pSinRep5-be szubklónozzuk, hogy' azonos IgGl tarokkal rendelkező kontroll fehérjét generáliunk.

Az OM-CTLA-4-lgG 1 fúziós fehérje;

VIÖPEPCPDJSÖLEGAPSVFLFPPKPKDTLMLSRTPEVTCVWDVSHEDPE·

VKFNWYVDGVSVHRAKTKPREEQyRSTYRWSVLTVLHQDWbNGKE

YKCKVSNKALPTPIEKTISKAK.GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV'SLTCL

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSíaTVDKSR

WQQGWFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Aláhúzott; szignálpepiid

Vastagított; CTLA-4 extracelluláris dómén

A CD28 érett extracellulárís dómén cDNS-eket polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk humán limfodta könyvtárból (Clontech), majd szubklőnozzuk pCDM8-ba (J. of Immunoi. 151. 5261-5271. (1993)], így egy olyan humán Iggl fúziós fehérjét állítva elő, ami tartalmaz mind trombin hasítási helyet mind csukló régiót. Marmoset, Cynomolgus és Rhesus CTLA-4-et klónozunk PHAa-val stimulált FBMC-kből izolált mRNS-ről, a degenerált polimeráz láncreakció standard tecnniRajanaR alkatmazasavai. A szekvenálással igazolni lehetett, hogy a rhesus és a cynomolgus aminosav szekvencia azonos az érett humán CTLA-4 extraeelluláris doménjévek három különbség kivételével (S13N, Π.7Τ és L105M). A marm őseiben tíz aminosav eltérés van az érett humán CTLA-4 extraceliuláris doméntől (V21A, V33I, A41T, ASIG, 541, S71F, Q75K, T88M, L105M és G106S). A 'helyspecifikus mutagenezist használjuk, hogy pontmutációkat készítsünk mindegyik eltérő marmoset CTLA-4 aminosav pozícióban, hogy feltérképezzük azokat az aminosavakat, amik fontosak az ellenanyagok és a humán CTLA-4-IgG kölcsönhatásában. A humán és marmoset CTLA-4-IgG mutációkat az epitop térképezéshez „matchmaker” helyspecifikus mutagenezíssel (Promega) generáljuk. A IgG fúziós fehérjéket COS? sejtek tranziens transzfekcíójával állítjuk elő, majd standard Protein A technikákkal tisztítjuk. A mutáns CTLÁ4-IgG fehérjéket az ellenanyagokhoz való kötődés alapján értékeljük ki, immunblottolás és BIAcore elemzés felhasználóséval.

Rekombináns fehérje exnressziőZtisztítás A rekombináns síndbís vírust bébíhörcsög vesesejteket S.P6 in fetro átirt CTLA-4-IgGl/pSR5· mRNS-sel és DH-26 helper mRNS-sel való elektroporácíóval állítjuk elő (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), az Invürogen leírásának megfelelően. Negyvennyolc órával, később a rekombináns vírust összegyűjtjük, és mennyiségét meghatározzuk az- aranyhőrcsőg. petefészek sejtben (CHG-KI) való optimális fehérje-expresszíőhoz, A CHO-K1 sejteket szuszpenzíóban tenyésztjük, DMBM/T12 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) táptalajban, ami 10% hővel inaktivált borjúmagzat szérumot (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), nem-esszenciális aminosavakat (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 4 mmol/1 glu68 tamint (Gibco BRL, Gmthersburg, MD), penicillint/sztreptomicint (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), és löramol/l HEPES-t fpH-7,5) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) tartalmaz. A CTLA-4-IgG előállításához a. CHÖ-K1 sejteket 1 ^χ 10⁷ sejt/ ml sűrűségben szuszpendáljuk DMEM/F12 táptalajban, majd egy óra hosszat sindbis vírussal inkubáijuk szobahőmérsékleten, A sejteket azután 1 ^x10^ö /ml-re hígítjuk DMEM/F12-ben, .ami 1% boijümagzat szérumot tartalmaz, amiből, protein A Sepharose-zal kivonták a szarvasmarha IgG-t (Pharmacia), valamint tartalmaz nemesszenciális amínosavakat 4 mmol/1 glutamint, 12,5 mmol/1 HEPES-t (pB~7,S) és penicillin/sztreptomícmt.. A fertőzés után negyvennyolc órával a sejteket ülepítjük és a kondicionált táptalajt összegyűjtjük, majd komplett proteáz inhibitor tablettákkal egészítjük ki (Boehringer Man.nhe.im), a pH értékét 7,5-re állítjuk, majd. 0,2 μχη-es szűrőn (Nalgene) szüljük meg. FPLC-t (Pharmacia) használunk a fúziós fehérje affinitás-tisztítására, 5 ml protein. A HiTrap oszlopot (Pharmacia) használva., lö ml/perc áramlási sebességgel. Az oszlopot 30 oszloptérfogainyi foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, majd 0,1 mol/l glicín/HCl (pH~2,8) oldattal mossuk, 1 ml/perc sebességgel. 1 ml-es frakciókat szedünk, ezeket TRISZ-szel (pH~9) azonnal semlegesítjük (pH“7,5). A CTLA-4-lgG-t tartalmazó frakciókat SDS-PAGE-val azonosítjuk, majd centríplus 50-nel {Amícon) koncentráljuk, mielőtt Sepharose 200 oszlopra (Pharmacia) vinnénk, 1 ml/pere sebességgel, oldószerként foszfáttal puffereit sóoldatot használva.. A CTLA-4IgGT-et. tartalmazó frakciókat egyesítjük, 0,2 pm-es szűrővel (Millípore) sterilre szűrjük, alikvot részekre osztjuk, majd -80 °Cra. fagyasztjuk. A CD44~IgGl~et expresszáljuk és ugyanezekkel a mód szerekkel tisztítjuk. A CD28-IgG~í tranziensen transzfcktált

COS-7 sejtek kondicionált táptalajából tisztítjuk.

A CTLA-4 - IgG 1 jellemzése

A tisztított CTLA-4-IgGl egyetlen csíkként vándorol SDS~ PAGE-n, kolloid Coomassie blue festékkel (Novex) végzett festést használva, Nem-redukáló körülmények kozott a CTLA-4-ÍgGl dimer (100 kDa), ami 50 mmöl/1 dítiotreítollal való kezelésre egy 50 kBa-os monomert, ad. A tisztított CTLA-4-IgGl oldatban végzet aminosav szekvenálása igazolta, a CTLA-4 N-terminálisát (MHVAQPAWLAS), és azt, hogy az onkosztatín-M szignálpeptid lehasadt a.z érett fúziós fehérjéről.

A CTLA-4-IgG 1 koncentráció függő m ódon kötődik az immobílizált B7.1-fgG-hez. és a kötődést hörcsög-anti-hnmán antiCTLA-4 ellenanyaggal lehetett blokkolni (BNI3: PharMingenj. A steril CTLA-4-lgG e&dotoxm mentes, és mennyiségét az ODaso alapján határozzuk meg, 1,4-et használva extínkciós koefficiensként. A tisztított CTLA-4-IgG kitermelése 0/5-3 mg/liter CHO-K1

Az alábbi CTLA-4 pepiidet állítjuk elő, az alábbiakban ismertetett módon:

NH₂: MHVAQPAWLASSRG1ASFVCEYASPGKATEVRVTV1 QVTEVCAATYMMGNELTFL Y1CKVELMYPPFYYLG IGNGTOlWIDPEPC-CONBz.

Rövidítések./ Anyagok NMP: N-meül-pirrolídmon;

TF E; 2,2_} 2 -brifluor- etan ok

DCM; diklormetán;

FMOC; fiuorenil-metoxikarhonü;

Az összes reagenst a Perkin Blmer~lől vásároltuk, az alábbi kivétellel: TFE, Aldrich Chemical; FMOC-PAL-PEG gyanta, Perseptive Biosystems. Az Fmoc-Arg(PMC)-OH, FMOC-Asn(Trt)~ OH, FMOC-Asp(tBu)~OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)OH, FMOC-GlnfTrtj-OH), PMO€-Hís(Boc)-OH, PMOC-Lys(BOC)OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH és FMOC-TyiltBu)~ ÖH reagenseket azokhoz az aminosavakhoz használtuk, amiknek az oldalláncait védőcsoportokkal meg kellett védeni.

Peptldszintézis

A peptid szintézist egy Perkín Elmer 431A berendezéssel hajtottuk végre, amit utólag egy feedback ellenőrzéssel láttunk el, 301 nm-es UV abszorbancia alapján (Perkin Elmer Model 759A detektor). A peptíd-szekveneiát FMOC-PAL-PEG gyantán állítottuk össze, kondícionális dupla kapcsolási ciklusokat használva. Az erőltetett dupla kapcsolásokat a 10., 11., 18., 19., 20. és 28-33. ciklusokban használtuk. A gyantát DCM és TFE S0%os keverékével mossuk, mindegyik acilezési ciklus teljes végrehajtásánál, a nem-reagált aminosav csoportokat ecetsavanhidriddel lezárva NMP-ben, A gyantát a 49 ciklus teljes befejezése után eltávolítjuk a reaktorból, majd a maradványt a teljes befejezésig folytatjuk. A peptídnek a gyantáról való hasítását a Reagent K-val hajtjuk végre [King és mtsai; International Journal of Protein and. Peptíde Research 36, 255-266 (1990)(, 6 óra hnszszafc,: 41.5 mg gyantán, így kapunk 186 mg nyers CTLA-4 pepiidet kapunk.

A pepiid jellemzése

A nyers CTLA-4 pepiid 25 mg alikvot részét 5 ml 6 mol/1 Guanidin. HCI/IÖÖ mmol/1 K2PO3 oldatban (pH~6,4) oldjuk, majd egy Pharmacia Hí Load Superdex 75 16/60 oszlopon eluáljuk (16 mm * 600 mm, 120 ml agytérfogat), 2 mol/1 6 mol/1 Guanidin HC1/1Ö0 mmol/1 K2PÖ3 oldattal (pH«6,4), 180 percig, 5 ml-es frakciókat szedve, A frakciókat úgy elemezzük, hogy a frakcióból 1,7 μΙ-t viszünk egy NuPAGE Laemmli gélre, amit MES futtató pufferrel futtatunk, és Daichii ezüstfestéses protokollt használva a vizuálíe megjelenítésre, Azokat a frakciókat, amikben 12 kDa-nál nagyobb molekulasúlyű-anyag van, amit a standarddal szemben meghatározott molekulasúly alapján határozzuk meg, egyesítjük, és 4 ^öC-on tároljuk. A kombinált frakciókat UV-vel és gélelektroforézissel elemezzük. Az aminosav szekvenálást úgy hajtjuk végre, hogy 100 μΐ-es mintát egy ProSorb cartridge-re abszorbeáltatok (egy PVDF membránra abszorbeáltatva), majd mossuk, hogy a puífer-sókat eltávolítsuk A szekvenálást Applied Blosystems 420 berendezésen hajtjuk végre. A várt N-termínális szekvenciát (Μ Η V A Q P A V V L A) figyelhettük meg. Az immunblottöiássai azt demonstráltuk, hogy a pepiidet a SN13 antí-humán CTLA-4 CTLA-4 felismeri (PharMíngen). A sómentesítéshez 648 pg anyagot tartalmazó alikvot részt teszünk 3500 Da-os MWCO dialízis hüvelybe, majd 0,1% trihuorecetsav/víz elegy ellen díalízáljuk, 4 °C-on 9 napig, kevertetés közben. A dialízis hüvely teljes tartalmát porrá liofilezzűk.

(ii) CTLA4-.gyel IY201V) ira&szfektáit 3ÖÖJ.9 sejtek ?2

A teljes hosszúságú CTLA-4 cDNS-t polímeráz láncreakcióval amplifikáljuk humán csecsemőm irigy cDNS könyvtárból (Stratagene). majd. plRESneo plazmidba (Clontecb) szubklőnozzuk. A CTLA-4 mutációját, ami konstitutív sejtfelszíni expressziót eredményez, MatohMaker Mutagenesis System-mel (Promega) juttatjuk be, A tirozin (Y201) valinná való mutációja gátolja az adaptin AP450 fehérje kötődését, ami felelős a CTLA-4 gyors ínternalizáciöjáért {Chuang és mtsai: J. of Immunot 159, 144151 (1997)]. Mikoplaxma-mentes 300,19 rágcsáló limfőma sejteket tenyésztünk RPM1-1640-ben, ami 10% borjúmagzat szérumot, nem-esszenciális aminosavakat, penicillin/sztreptomicint, 2 nnnol/1 glutammt, 12,5 mmol/i HEPES-t (ρΗ^Τ,δ) és 25 μΐ βmerkaptoetanolt tartalmaz. A sejteket elektroporáljuk (3 * lö⁶/ö,4 ml szérummentes RPMI) egy 1 ml-es kamrában, 20 pg CTLA-4-Y201V/pIRESneo nukleinsavval, 2OÖV/118 ?P alkalmazásával (Gibeo CellPorator). A sejteket 10 percig hagyjuk állni, majd 8 ml előmelegített, komplett RPMI táptalajt adunk hozzá. Negyvennyolc óra elteltével a sejteket 1 mg/ml G418~at (Gibeo BRL, Gaithershurg, MD) tartalmazó komplett RPMI táptalajban 0,5 x lö⁶/.ml-re hígítjuk, A rezisztens sejteket elszaporítjuk,, majd fikoeritrínhez (PharMingen) konjugáít BN1.3 ellenanyaggal kimutatjuk róluk, hogy a CTLA-4 a sejtfelszínen expresszálődík. A magas szinten expresszálódö sejteket steril oszályozással izoláljuk.

XenoMouse egereket (8-10 hetes) immunizálunk (i) szubkután a farok tövénél, 1 ^x 10^? 300,19 sejttel, amit úgy transzfektáltunk, hogy az előzőkben ismertetett módon expresszálják a CTLA-4~et, majd reszuszpendáljuk komplett Freund féle adjuvarast tartalmazó foszfáttal puffereit sőoldatban, vagy (ii) szubkután., a farok tövében (a) 10 ug CTLA-4 fúziós fehérjével, vagy (b) 10 pg. CTLA-4 pepiiddel, amit komplett Freund féle adjuvárassaí emulgeálunk. Mindegyik esetben a dózist három-négy alkalommal megismételjük inkomplett Freund féle adjuvánsban. A fúzió előtt négy nappal az egerek az immunogén sejtek foszfáttal puffereit sőoldatban. készített végleges injekcióját kapják. .Az immunizált egerekből származó lép és/vagy nyirokcsomó limfocitákat fűzionáltatjuk a [rágcsáló nem-szekréciós mielóma P3 sejtvoraallal], majd az előzőkben ismertetett módon HAT szelekciónak vetjük alá [Galfre, G. és Müstéin, C.: „Preparáljon of monocloraal antibodíes: straiegies and proceduresL Metbods in Enzymology 73, 3-46 (1981)1. kinyerjük híbridómák egy nagy' paneljét, amik mind CTLA-4 specifikus humán IgGaP-t vagy IgG4?-t (az előzőkben kimutatva) szekretálnak.

ELJSA esszé

Az egér szérumban és hibridóma felúlűszókban az antigénspecifikus ellenanyagok ELlSA-val való meghatározását, a szakirodalomban ismertetett módon hajtjuk végre (Colígara és mtsai; Unit 2.1, „Enzyme-linked immunosorbent assays”. Current protocols in immunology (1994)], CTLA-4-Ig fúziós fehérjét használva az ellenanyagok befogására. Azokat az állatokat, amiket CTLA-4-Ig fúziós fehérjével immunizáltunk, tovább vizsgáljuk, hogy mutatnak-e aspeciíikus reaktivitást a. fúziós fehérj humán lg részével szemben. Ezt oéyan LIBA lemezekkel hajtjuk végre, amik a spocífitás negatív kontrolljaként humán IgGl-et tártál74

Egy előnyben részesített ELISA esszében, az alábbi technikákat használjuk;

Az ELISA lemezeket löö pl/luk antigénnel borítjuk, bevonó puííerrhen .(0,1 mol/1 karbonát, puffer, pH-9,6, és 8,4 g/liter NaHCOs (molekulasúlya 84)). A lemezeket azután éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. Az ínkubálás után a bevonó puffért eltávolítjuk, majd a lemezt 200 μΙ/luk blokkoló pufferrel (0,5% BSÁ, •0,1% Tween 20, 0,01% Thímerosal 1* foszfáttal puffereit sóoldatban) 1 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk. Egy másik változat szerint a lemezeket hűtőben tároljuk, blokkoló pufferrel és lemez-lezárókkal. A blokkoló puffért eltávolítjuk, és 50 pl/luk híhridómaa felülűszó, szérumot vagy más hibridőma. felülúszót (pozitív kontroll) és HAT táptalajt vágj/ blokkoló puffért (negatív kontroll) adunk hozzá. A lemezeket 2 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálás után a lemezt mosó pufferrel (IxPBS) mossuk. A kimutató ellenanyagot (azaz egér-antihumán IgG2-HRP (SB, #9070-05) az ígG2 ellenanyagok ellen, vagy az egér anti-humán IgG4-HRP-t(SB #9200-05) elleni ellenanyagot) 1ÖÖ μΙ/luk mennyiségben (egér anti-humán lgG2-HRP@. 1:2000 vag\^? egér anti-humán Igö4~.H'RP @. 1:1000 (mindegyik blokkoló pufferben hígítva) adjuk hozzá. A lemezeket 1 óra bőszszál szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd mosdpufferrel mossuk. Ezután 100 μΙ/luk írissen készített előhívó oldatot (10 ml szubsztráf puffer, 5 mg OPD-t (o-feniléndiamin, Sigma Cat No. P7288) és lö pl 3Ö% HsOa-t (Sigma) adunk a Inkákhoz. A lemezeket azután 10-20 percig előhívjuk, ameddig a negatív kontroll inkák éppen kezdenek átszíneződni. Ezután 100 μΙ/luk leállító oldatot (2 mol/1 H2SÖ4) adunk hozzá, és a lemezeket ELISA lemezleolvasóval olvassuk le, 490 nm-en.

A teljesen humán monoidonáHs ellenanyagok affinitás konstansainak meghatározása BIAcore-ral

Ά tisztított humán monoklonális ellenanyagok, Fah fragmensek vagy híbridőma felülúszők affinitás mérését plasmon rezonanciával BIAcore 2000 berendezéssel határozzuk meg, a gyártók által körvonalazott általános eljárásokkal.

Az ellenanyagok kinetikai elemzését a szenzor felszínére alacsony sűrűségben immobilízált antigénekkel hajtjuk végre. A BIAcore szenzorchip három felszínét CTLA-4-Ig fúziós fehérjével ziós fehérjét 20-50 pg/ml mennyiségben használva 10 mmol/1 nátrium-aeeiátban (pbfeo.ö), a gyártó (BIAcore Inc.) által biztosított amin kapcsoló kittel A BIAcore szenzorchip negyedik felszínét IgG l-gyei (900 RB) immobilizáljuk, és negatív kontroll felszínként az aspeciiikus kötődéshez, A kinetikai elemzést 25 vagy 50 mikroliter per perc áramlási sebességgel hajtjuk végre, és a disszocíációs (kd. vagy kog) valamint az asszociációs (ka vagy k_ön.) rátát a gyártó által biztosított számítógépes programmal (BIA evaluation 3.Ö) határozzuk meg, ami lehetővé teszi a globális illesztési szamúasoxaú . Példa

Az anti-CTIA-4 ellenanyagok affinitás mérése

Az alábbi táblázatban az ily módon kiválasztott néhány ellenanyag affinitás méréseit: mutatjuk be;

1. táblázat

	Szilárd fázis (BíAcore-ral)
Hibridó-	Asszociációs	Dísszödá-	Asszociációs	Dísszociá-	Felszí-
ma	ráták	ciős ráták	konstans	ciős kons-	ni sá-
	Ka	Kd	KA (l/Mri	tans	rá ség
	(M^!S ’Möb	ÍS'^10-’)	kx/kdxlO⁵⁰	KI) (M)~ Kd/KaXlO-θ	RÍJ
Moabö 1	0,68	1,01	0,67	1,48	873,7
	0,70	4,66	0,15	6,68	504,5
	0,77	6,49	0,19	8,41	457,2
	0,60	3,08	0,20	5,11	397,8
4.1.1	1,85	0,72	2,58	0,39	878,7
	1,88	1,21	1,55	0,64	504,5
	1,73	1,54	1,13	0,88	457,2
	1,86	1,47	1,26	0,79	397,8
4.8.1	0,32	0,07	4,46	0,22	878,7
	0,31	0,23	1,33	0,75	504,5
	0,28	0,06	4,82	0,21	397,8
4.14.3	2,81	3,04	0,92	1,08	878,7
	2,88	3,97	0,73	1,38	504,5
	2,84	: 6,66	0,43	2,35	457,2
	3,17	5,03	0,63	1,58	397,8

) Hibridó-·	Asszociációs	Disszodá	- Ι Asszociációs	Disszociá-	i Fsiszi- {
) ma	ráták	dós rátái	í 5 konstans	dós kons~	i ni sü- \|
	Ka	Kd	1 KA Π,/Μί-	tans	! i (rűség i
	(M-S-xí09	(S·⁵* ΙΟ-⁴)	í k&/kd^x10¹⁰	KD (M)~	I M 1
				Ka/K_ax 10'¹⁰	\|
j 6.1,1	0,43	0,35	1 1,21	0,83	1 878,7
í	0,46	0,90	5 0,51	1,98	] 504,5
t	0,31	0,51	[ 0,51	1,63	)457,2 \|
t	0,45	0,79	\| 0,57	1,76	)397,8 I
3,1.1	1,04	0,96	\| 1,07	0,93	\| 878,7
	\| 0,95	1,72	1 0,55	1,82	\| 504,5
	! 0,73	1,65	\| 0,44	2,27	457,2
	j 0,91	2,07	\| 0,44	I 2,28	397,8
4.9.1	5 1,55	13,80	0,11	1 8,94	878,7
	\| 1,43	19,00	0,08	\| 13,20	504,5
	1 1,35	20,50	0,07	1 15,20	397,8
j 4.10.2	j 1,00	2,53	0,39	\| 2,54	878,7 \|
	0,94	4,30	0,22	\| 4,55	504,5
	0,70	5,05	0,14	! 7,21	457.2
	1,00	5,24	1 0,19	1 5,25	397,8
\| 2.1,3	1,24	9,59	1 0,13	j 7,72	878,7
	1,17	13,10	1 0,09	11,20	504,5 \|
r	1,11	13,00	0,09	11,70	397.8 1 1________1_ΐ

	Szilárd fázis (BlAcore-raf)
Hibridé-	Asszociációs	Disszociá-	Asszociációs	Disszociá-	Felszí-
ma	ráták	dós ráták	konstans	dós kons-	ni sű-
	Ka	Kd	KA (1/M>	tans	ni ség
	(M· <84 χ Íö9	^;(S-*xlO-⁴)	k_a/káxlÖⁱ⁰	KD őri Kd/K_&xl0·^	[Rü]
4.13.1	1,22	5,83	0,21	4,78	878,7
	1.29	6,65	0,19	5,17	504,S
	1,23	7,25	0,17	5,88	397,8

Amint az megfigyelhető, a jelen találmány szerint készített ellenanyagok nagy affinitással és kötési állandóval rendelkeznek.

A jelen találmány szerint készített anti-CTLA-4 ellenanyagok

Az alábbi leírásban a jelen találmány szerint készített ellenanyagokra vonatkozó strukturális információkat adunk meg.

Ahhoz, hogy a jelen találmány szerint készített ellenanyag struktúráját elemezzük, egy adott híbridomából klónoztuk a a nehéz és könnyű lánc fragmenseket kódoló géneket. A gének klónozását és a szekvenálást az alábbiak szerint hajtottuk végre:

A pofii Ah mRNS-t körülbelül 2 χ I0⁵. immunizált

XenoMouse egerekből származó hibridóma sejtből izoláljuk, a Fast-Track kit (Invitrogen) alkalmazásával. A véletlenszerűen iniciált cD-NS generálását polimeráz láncreakció- követi. A humán Yh vagy humán Y_K család specifikus variábilis régió prímereket [Marks és mtsai: „Obgonucleotide primers fór polymerase chain reaction amplífication of humán immunoglobulin variable genes and design of femilv-spécibe olignucleotide probes”, Eur. J. Immunoi. 21, 985-991 (1991)1, vagy egy univerzális humán Vh prímért, az MG-30~at (ACGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) használjuk a humán Cy2 konstans régióra. (MG-40d; 5'GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3' vagy a Ck konstans régióra (hx:P2) specifikus primerekkel, Green és munkatársai leírása. szerint (Green és mtsai: Natúré Geneties 7, .13-21 (1994)1. A hihridómák nehéz- és kappa-iánc transzkríptumaiből származó humán monoklonális ellenanyagok szekvenciáit a poli(A*) RNSből az előzők ben ismertetett prímerekkel kapott polirneráz láncreakció termékek dírekt szekvenálásával kapjuk meg. A polímeráz láncreakció termékeit pCRU-be klónozzuk, egy TA klónozó kit (Invítrogen) alkalmazásával, és mindkét szálat Prism festék-terminátor szekvenálö kittekkel és ABI 377 szekvenálö berendezéssel szekvenáljuk, Minden szekvenciát elemzünk, a „V BASE sequence directo.ry*^:-hoz való illesztéssel [Tomlinson és mtsai: MRC Centre fór Protein Engineeríng, Cambridge, NagyBritannia), a MacVector and Geneworks szoftver programmal.

Emellett mindegyik ellenanyagot, azaz a 4.1.1-et, 4.8.1-et, 11.2.1-et és a 6.1.1-et teljes DNS szekvenálásnak vetjük alá. Az ilyen szekvenáláshoz polÍ(AÜ mRNS~t izolálunk körülbelül 4 * 1Ö⁶ mENS-t reverz transzkripciónak vetjük alá, oligo~dT(18)-at és az Advantage RT/ PCR kittet (Clontech, Palo Alto, CA) használva, A variábilis régió adatbázist (V Base) használjuk a nehéz lánc DP5Ö gén nehéz lánc ATG starthelynél kezdődő amplifikációs primerek (o'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3') és az IgG2 konstans régió stopkodonra specifikus.

amplifikációs primerek tervezésére. Egy optimális Kozák szekvenSÖ ciét (ACCGCCACC) adunk az ATG starthelyhez 5' irányban. Ugyanazt a módszert használjuk a kappa. lánc A27 génje ATG starthelyére specifikus primer (S'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3j és a kappa konstans régió stopkodonjára specifikus primer (S'-TTCTTTGÁTGAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGG31, és a kappa konstans régió stopkonra specifikus primer tervezésére. A nehéz lánc eDNS-eket is klónozzuk genomiális konstrukciókként, helyspecífikus .mutagenezíssel, hogy egy Nhel hasítási helyet adjunk a variábilis J donién végéhez, és &gy Nhel fragmenst szubklónozunk, ami, ami tartalmazza a genomiális IgG2 CH1 / csukló/CH2/CH3 régiókat. Az Nhel hasítási hely kialakításához szükséges pontmutáció nem változtatja mega. csíravonalból származó aminosav szekvenciát, A primer-párokat arra használjuk, hogy a cDNS-eket amplifikáljuk, az Advantage High Fideliíy PCR Kit-tel dírekt szekvenálással kapjuk meg, festék-termínátor szekvenálö kitteket és egy ÁBI szekvenálö berendezést használva. A polámeráz láncreakció terméket pEE glutamín szintetáz emlős expressziős vektorba (Lonza) klónozzuk, és három kiónt szekvenáltunk, hogy igazoljuk a szomatikus mutációkat. Minden egyes klón esetében a szekvenciát mindkét szálon igazoljuk, legalább három reakcióban. Egy aglíkozílezett 4.1.1 ellenanyagot generálunk az N294Q-nak a CH2 doménben levő helyspecifikus mutagenezísével. Rekombináns ellenanyagokat állítunk elő COS? sejtek tranziens íranszfekciójával, IgG mentesített FCS-ben, majd standard Protein A Sepharose technikákkal tisztítjuk. A stabil transziektánsokat rágcsáló NSO sejtek elektroporáeiójával generáljuk, glutamin-mentes táptalajban szelektálva. A rekombináns

SÍ

4.1..1, gjikozilezve vagy nem-glikozilezve, azonos specifitást és affinitást mutat a CFLA-4-hez az in rifro EL1SA és BlAcore esszékben.

Génhasznosítási elemzés

Az· alábbi táblázatban a jelen találmány szerinti ellenanyagok szelektált hibrídöma kiónjai által igazolt génhasznosítást mutatjuk be;

11.7.1	DP-50	D3-22 vagy D21-9	JH4	012	JK3
12.3.1.1	DP-50	D3-3 vagy DXP4	J'H6	A17	jk 1
12.9.1.1	DP-50	D6-19	JH4	A3/A19	JK4
4.9.1	DP-50	5- 24 és/vagy 6- 19	3H4	L5	JKl .. :

Amint az megfigyelhető, a jelen találmány szerinti ellenanyagokat úgy generáltuk, hogy erős hajlamot mutat a DP-50 nehéz lánc variábilis régió felhasználására. A DP-50 gént mint a Yh

3-33 géncsalád egyék tagjaként is említik. Csak egy ellenanyag, amit a CTLA-4 jötés és az előzetes in ritro funkcionális esszé szelektáltunk, mutatott a DF~5ö~tőI eltérő nehéz lánc génhasznosítást. Ez a klón, a 2.1.3, egy DP-65 nehéz lánc variábilis régiót, használ, és IgG4 izotipusű. A DP-65 gént mint a Vn 431 géncsalád egyik tagjaként is említik. Másrészt viszont a 4.9.1 klón, ami egy DP-47 nehéz lánc variábilis régióval rendelkezik, kötődik a CTLA-4-b.ez, de nem gátolja a B7~l~hez vagy B7-2-höz való kötődését. A. XenoMouse egerekben több mint 30 eltérő funkcionális nehéz lánc variábilis gén van, amikkel ellenanyagokat lehet generálni. A hajlam tehát arra jellemző, hogy az ellenanyag-antigén kölcsönhatásban van egy előnyben részesített kötési motívum, az antigénhez való kötődésre és a funkcionális aktivitás kombinált tulajdonságaira vonatkozóan.

Mutációs elemzés

Amint az nyilvánvaló, a génhasznosítási elemzés az ellenanyag struktúrájába csak korlátozott betekintést nyújt Mivel a Bsejtek a XenoMou.se .állatokban sztochasztikusan generálnak VD--J nehéz-, vagy V-J könnyű lánc transzkriptumokat, ezért van egy sor szekunder folyamat, amik például az alábbiak lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: szomatikus hipermutácíó, n-addícíók és CDR3 extenziók (Mendez és mtsai: Natúré Geneties 15, 146-156 (1997); 08/759,620 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1996. december 3-án]. Ennek megfelelően, abból a célból, hogy tovább vizsgáljuk az ellenanyag struktúráját, az ellenanyagok megjósolt aminosav szekvenciáját a klónokből kapott cDNS-ek alapján generáljuk. Emellett, az N- terminális aminosav szekvenciákat fehérje szekvenálássai is megkapjuk.

Az 1. ábrán a. 4.1.1 klón (1A, ábra), 4.8,1 klón (1B. ábra),

4.14.3 (IC. ábra), 6.1.1, klón (ID. ábra), 3.1.1 klón (1E. ábra), 4.10.2 klón (IP. ábra), 2.1.3 klón (1G. ábra), 4.13.1 klón (1H, ábra), 11,2,1 klón (II. ábra), 11.6.1 klón (1J. ábra), 11.7.1 klón (1K. ábra), 12.3.1,1 klón (II. ábra) és 12.9.1.1 klón (IM. ábra) nehézés könnyű lánc nukleotid- és megjósolt aminosav szekvenciáját adjuk meg. Az ΙΑ., 1B. és ID. ábrán a 4.1.1, 4,8.1 és 6.1.1 ellenanyagok kiterjedt szekvenciáit az előzőkben ismertetett cDNS-ek teljes hosszúságára kiterjedő klónozással kapjuk meg. Ezeken az ábrákon a szignálpeptid szekvenciát (vagy az azt kódoló bázisokat) vastagítással jelöljük, míg az 5' polímeráz láncreakcióban használt szekvenciákat aláhúzással felöljük.

A 2. ábrán szekvencia-illesztést adunk meg a 4,1,1, 4.8.1, 4,14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4,13.1, 11.2.1, 11,6.1, 11.7.1,

12,3.1,1 és 12.9.1.1 klónokből származó megjósolt nehéz lánc §4 aminosav szekvenciák és a csiravonal DP-SG (3-33) aminosav szekvencia között, A DP-50 csíravonal szekvencia és a klőnok szekvenciája közötti különbségeket vastagitással jelöljük. Az ábrán láthatók még az ellenanyagok CDR1, CDR2 és C.DR3 szekvenciáinak. pozíciói, árnyékolással jelölve.

A 3, ábrán a 2.1.3 klón. megjósolt aminosav szekvenciája és a csíravonal DP-65 (4-31) aminosav szekvenciája illesztését mutatjuk be, A DP-50 csiravonal szekvencia és a kiónok szekvenciája közötti különbségeket vas tágítássá! jelöljük. Az ábrán látha& még az ellenanyagok C'

R.3 szí pozíciói, alah nve.

A 4, ábrán a 4,1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4,10.2 és 4.13.1 kiónok kappa könnyű lánc aminosav szekvenciája és a csiravonal A27 aminosav szekvencia illeszkedését mutatjuk he, Az A27 csíravonal. szekvencia és a klőnok szekvenciája közötti különbségeket vastagitással jelöljük. Az ábrán láthatók még az ellenanyagok. ODRI, CDR2 és CDR3 szekvenciáinak pozíciói, aláhúzással jelölve. A 4.8.1, 4.14,3 és 6.1.1 klőnok CDR1-jelben látható deléciókat „0”-kai jelöljük..

Az 5. ábrán a 3.1,1, 11.2,1, 11.6.1 és 11.7.1 klőnok kappa könnyű, lánc megjósolt aminosav szekvenciája és a csíravonal 012 aminosav szekvencia illeszkedését mutatjuk be, A 012 csíravonal szekvencia és a kiónok szekvenciája közötti különbségeket vastagitással jelöljük, Az ábrán láthatók még az ellenanyagok és CDR3 szekvenciáinak pozíciói, aláhúzással jeA 6, ábrán a 2.1,3 klón kappa könnyű lánc megjósolt aminosav szekvenciája és a csíravonal A1Ö/A26 aminosav szekvencia illeszkedését mutatjuk: be,. Az A1Ö/A26 csíravonal szekvencia és a klönok. szekvenciája közötti különbségeket vastagitással jeAz ábrán láthatók még az ellenanyagok CDR1, CDR2 és szekvenciáinak pozíciói, aláhúzással jelölve,

A 7. ábrán a 12.3,1 klón kappa könnyű lánc megjósolt aminosav szekvenciája és a csíravonal A17 aminosav szekvencia illeszkedését mutatjuk he. Az A17 csíravonal szekvencia és a klönok szekvenciája közötti különbségeket vas-tartással jelöljük. Az ábrán láthatók: még az· eSenanyagok CBR1, CDR2 és CDR3 szekvenciáinak pozíciói, aláhúzással jelölve.

A 8. ábrán a 12.9.1 klón kappa könnyű lánc megjósolt aminosav szekvenciája és a csíravonal A3/A19 aminosav szekvencia, illeszkedését mutatjuk be. Az A3/Á19 csiravonal szekvencia és a kiónok -szekvenciája közötti különbségeket vastagitással jelöljük. Az ábrán láthatók még az ellenanyagok CDR1, CDR2 és CDR3 szekvenciáinak pozíciói, aláhúzással jelölve,

A 22. ábrán az alábbi anü~CTLA-4 ellenanyag láncok további nukleotid- és aminosav szekvenciák láthatok:

4.1.1:

teljes hosszúságú 4.1.1 nehéz lánc (cDNS, 22(a), genomiáüs 22(b) és aminosav 2:2(ej);

teljes hosszúságú aglíkozitezett 4.1.1 nehéz lánc (22(d'j és aminosav 22(e);

4,1.1 könnyű lánc (cDNS 22(1} aminosav 22(g));

4.8.1:

aminosav

4.8.1 könnyű

221 es aminosav §6

6.1,1:

teljes hosszúságú 6.1.1 nehéz lánc (cDNS 2: aminosav 22(m));

6.1.1 könnyű lánc (cDNS 22(n) és aminosav 22 es

11.2.1:

teljes hosszúságú 11.2.1 nehéz lánc (cDNS 22 (p) és aminosav 22(ql); és

11.2.1 könnyű lánc (cDNS 22(r): és aminosav 22{s)).

A szignálpeptid szekvenciákat vastagitva, széles szöveggel mutatjuk be, A teljes hosszúságú 4.1.1 genomlálís DNS szekvencia (22 (b). ábra) nyitott leolvasási kereteit aláhúzva mutatjuk be. Emellett a. mutációkat, amiket azzal a céllal vittünk be, hogy aglikozilezett 4.1.1 nehéz láncot kapjunk, és a kapott változásokat. (N294Q) dupla aláhúzással és vastagított szöveggel jelöljük (cDNS (22fb), ábra és aminosav (22(e), ábra).

4. Példa

A nehéz- és könnyű lánc aminosav helyettesítéesek elemzése

A 2, ábrán, amin a. 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2,

4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7,1, 12,3,1,1 és 12.9.1.1 ki származó, megjósolt nehéz lánc aminosav szekvenciák és a DP50 (3-33) csíravonal aminosav szekvencia közötti illeszkedést mutatjuk be, egy érdekes mintázat, jelentkezik. Amellett a tény mellett, hogy a klánok többségében megvan a hajlam a DP-5Ö nehéz láncának használatára., a csíravonal DP-SO génnel összehasonlítva viszonylag korlátozott a hipermutácíó az ellenanyagokban, Például a 3,1,1 és a 11.2.1 kíönokban. nincs mutáció, Továbbá, a többi klonban a. mutációk általában konzervatív s?

változások, ide értve az aminosavak hasonló tulajdonságú aminosavakkal való helyettesítését a csíra vonalban. Számos CDR1 és

CDR2 szekvenciában a mutációk különösen konzervatív természetűek. A 2. ábrán bemutatott nehéz láncok közül bárom, azaz a 4,10.2, 4,13.1 és a 4.14.3, esetében világosan látható, hogy egyetlen rekombinációs eseményből származnak (azaz egy azonos csíra-centrumból származnak), és szekvenciájuk közel azonos. Ha. ezi: a hármat egyetlen szekvenciának tekintjük, akkor a DF50 nehéz láncot, tartalmazó 10 különböző ellenanyagnál a CDR1 és CDR2: szegmensekben 3 pozíció van, amiben egy apoláros csoportot egy másik apoláros csoport helyettesít, van 12 olyan pozíció, amiben egy töltetlen poláros csoportot egy másik poláros telítetlen csoport helyettesít, és van 1 olyan pozíció, amiben egy poláros töltött csoportot egy másik, poláros töltött csoport helyettetúrájú csoport, azaz a glicin és az alanin helyettesíti egymást:. Azok a mutációk, amik nem szigorúan konzervatívak, csak 3 helyettesítésre terjednek ki, amiben egy poláros töltött csoportot egy poláros töltetlen csoport helyettesít, és egy apoláros csoportot egy poláros csoport helyettesít.

Ezeknek az ellenanyagoknak a könnyű láncai 5 különböző Vk génből származnak. Az A27 gén van leginkább reprezentálva, és ez a forrása. 6 különböző könnyű láncnak. Ennek a 6 szekvenciának az összehasonlításából két említésre méltó túl derül ki. Először is, közülük három, a 4.8.1, a 4.14,3 és a 6.1,1 tartalmazza egy vagy két csoport deléciőját a CDR 1-ben, ez egy ritka esemény. Másodszor, a csíravonal CDR3 hatos pozíciójában levő szerínnel szemben erős szelekció lehet, mível a szerin min8S den szekvenciában helyettesítve van. Ez azt sugallja, hogy a szerin ebben a pozícióban inkompatíbilis a CTLA-4 kötéssel.

Az nyilvánvaló, hogy számos, előzőkben említett aminosav helyettesítés a CDR-ben, vagy a CDR szoros közelségében található.

ügy tűnik, hogy az ilyen helyettesítések valamilyen hatással vannak az ellenanyagnak a CTLA-4 molekulához való kötődésére, Emellett, az ilyen helyettesítéseknek szisnifikáns hatással kell lenniük az ellenanyag affinitására,

5. Példa

A jelen találmány szerinti ellenanyagok N-terminálís aminosav ' venciáiának el

Finti ellenanyagok összetételét és struktúráját, az ellenanyagok közül néhánynak egy Perkin Elmer szekvenálóval meghatározzuk, a szekvenciáját. Az ellenanyagoknak mind a nehéz- mind a kappa. könnyű láncait .izoláljuk, majd tisztítjuk, preparatív gélélektroforézissel és elektroblottolással, majd a 6. példában ismertetett módon közvetlenül szekvenáljuk. A nehéz lánc szekvenciák többségének az H-terminálisa, blokkolva van. Ennek következtében, az ilyen ellen anyagokat először piroglutamát amínopeptidázzal kezeljük, majd szekvenáljuk.

Ennek, a kísérletnek az eredményeit a 9, ábrán mutatjuk be. A 9. ábrán látható a nel és könnyű tömegspektroszkópiával rozva.

8, Példa.

Az ellenanyagok további jellemzés*

A lö. ábrán, valamennyi további információ látható néhány, eilenanyagrőt Az ábrán a 3.1.1, 4.1,1, 4.8.1, 4,10.2, 4.14.3 és

6.1.1 kiónokra. vonatkozó adatok vannak összefoglalva. Az alábbi adatokat adjuk meg; koncentráció, ízoelektrornos fókuszálás (IEF), SDS-PAGE, méretkizárásos kromatográfia, RÁCS, tömegspektroszkópia (MALDQ, és könnyű lánc N-termínális szekvenciák.

Az adatokat általában az alábbiak szerint generáltuk;

Anyagok és módszerek

A fehérje-koncentrációt 280 nm-en határozzuk meg UV letapogatással (200-350 nm), ahol 1,58 elnyelési egység 28Ö nm-ea egyenlő 1 mg/ml-rel

Az SDS-PAGE-1 Novex NuPAGE elektroforézis rendszerrel hajtjuk végre, 1.0%-os NuPAGE géllel és MES futtató pufferrek A mintákat úgy állítjuk elő, hogy 3:1 arányban hígítjuk 4x NuPAGE mintafelvivö pufférrel (±) β-merkaptoetanol, melegítjük, majd körülbelül 5 pg fehérjét viszünk fel a gélre, A gélt azután Brillant Blue R festő oldattal (Sigma Cat. No.; B-6529) festjük, majd a molekulasúlyokat ügy becsüljük meg, hogy a. megfestett csíkokat összehasonlítjuk a „Perfect Protein Markers”~szel (Novagen Cat# 69149-3).

Az N - terminális szekvenáláshoz a m intákat az előzőkben említetteknek megfelelően futtatjuk NuPAGE géleken, Pro Biot ímmobílízációs membránra (Applied Biosystems) visszük át, majd Coomassi-e Blue R-250-nel festjük, A festett fehérje csíkokat kivágjuk, majd szekvencia-elemzésnek vetjük alá, automatizált

9<)

Edinán degradációvai, Applied Biosystems 494 Procise HT szekAz izoelektromes fókuszálást (1EF) Pharmacia íEF 3-9 pHast géleken (cat# 17-0543-01) hajtjuk végre. A mintákat 10%os glicerinben körülbelül 0,8 mg/ml-re hígítjuk, majd 1 μΙ-t gélre viszünk, és ezüsttel megfestünk. A pl becsléseket úgy végezzük el, hogy a megfestett csíkokat összehasonlítjuk a széles tartományú. (ρΗ3-Ι0) IEF standardokkal (Pharmacia) cat# 1.7-0471-öl).

A méret-kizárásos kromatográfiai (SEC) foszfáttal puffereit sőoldathan (PBS) hajtjuk végre, a Pharmacia SMART rendszerrel, a Superdex 75 PC 3.2/30 oszlopot használva. A molekulasúlyok becslését ügy hajtjuk végre, hogy a csúcsok retenciős idejét őszszehasonlítjuk a gél retenciős időkkel.

A FACS vizsgálatokhoz humán perifériális T-sejteket készítünk és 48 óra hosszat stimulálunk. A T-sejteket egyszer mossuk, FACS pufferben szuszpendáljuk 1 x 1Ö⁶ sejt/100 pl koncentrációban, majd 30 percig szobahőmérsékleten 10 pl antiCD3-EITC-vel (Immunotech, Marseille, Franciaország) festjük a CD3 sejtfelszíni expressziója szempontjából. A sejteket kétszer mossuk, majd fixáljuk, permeabilizáljuk (Fix and Perm, Caltag), majd 10 pl anü-CD152-PE-vel festjük az intracelluláris CTLA-4 expresszié szempontjából. Az áramlási eitometriát egy Beckton Dickinson FACSort-tal hajtjuk végre. A kvadránsokat a releváns izotípus kontroll ellenanyagok (Caltag) alapján határozzuk meg.

Amint azt az előzőkben tárgyaltuk, az antí-CTLA-4 ellenanyagokról demonstráltuk, hogy bizonyos erőteljes immunmoduláciös aktivitásokkal rendelkeznek. Az alábbi kísérleteket azzal a céllal hajtjuk végre, hogy meghatározzuk, miszerint a jelen, márty szerinti ellenanyagok rendelkeznek-e ilyan aktivitással. Általánosságban, a kísérleteket úgy terveztük meg, hogy megbecsüljük, hogy az ellenanyagok képesek-e gátolni a CTLA-4 és a B7 molekulák közötti kölcsönhatást, mutatnak-e szelektivitást a CTLA-4 és 87 molekulák és a C.D28 között, elősegítik-e a T-sejtek cítokin-termelését, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az interleukin-2 és/vagy interferon-γ expressziét. Emellett, megvizsgáltuk, hogy a jelen találmány szerinti ellenanyagoknak van-e kereszt-reaktivitása bizonyos humán szövetekkel és CTLA-4 molekulákkal más fajokban (azaz például egerekben és főemlősökben).

7, Példa

Kompetíciós ELISA: a CTLA-4/Β7-1 vagy B7-.2 kölcsönhatás gátlása a leien találmány szerinti ellenanyagokkal

Jn váró vizsgálatot hajtunk végre, hogy meghatározzuk, a jelen találmány szerinti ellenanyagok képesek-e gátolni a CTLA-4 kötődését a. B7- 1-hez vagy a B7-2-höz. Amint az nyilvánvaló, a jelen találmány szerinti ellenanyagok, amik képesek gátolni a CTLA-4 kötődését a .87 molekulákhoz, várhatóan jelöltek arra is, hogy szabályozzák az immunrendszert, a CTLA-4 bíoszintézis úton keresztül. A vizsgálatban az alábbi anyagokat, és módszereket használjuk;

Anyagok és módszerek nM, foszfáttal puffereit sóoldatban levő B7.1-Ig(Glj-et vagy B7.2-íg(Gl)-et (Repligen, Inc. Needham, MA) használunk 96-lukas MaxiSorp lemezek (Nunc, Dánia, #439454) béborítására, majd éjszakán át 4 °C~on tartjuk. A 2. napon a B7-Ig-t eltávo92

Htjuk, és a lemezeket 1% BSA. plusz 0,05% Tween-20 'D-PBS-ben készült oldatával két óra hosszat blokkoljuk. A lemezeket 3X mosőpufferrel (0,05% Tween-20 D-PBS-ben) mossuk. A megfelelő vizsgálati koncentrációjú ellenanyagot és CTLA-4 -Ig(G4)-et (0,3 n.M végkoncentráció) (RepEgen,. Inc. Needh&mj '15 percre előre elegyítjük, majd hozzáadjuk a B7-l~gyel borított lemezekhez (60 pl őssztérlbgat) majd szobahőmérsékleten 1,5 óra hosszat Inkubáljuk. A. lemezeket háromszor mossuk, majd HRP-vel jelzett egér anti-humán lgG4 ellenanyag (Zymed, San Francisco, CA, #05-3820) 1:1000 hígításából 50 pl-t hozzáadunk, és 1. óra hoszszat szobahőmérsékleten inkuháljuk. A lemezeket háromszor mossuk, és 50 μΐ TMB Miorowell peroxidáz szubsztrátot (Kírkegaard &. Perry, Ga.ithersbu.rg, MD, #50-76-40) adunk hozzá, 20 percig szobahőmérsékleten inkuháljuk, majd 50 ul 0,5 mol/l LhSCb-et adunk a lemezekhez. A lemezeket 450 nrn-en. olvassuk le, egy Molecular Devices lemezleolvasóval (Sunnyvale, CA). Minden mintát két párhuzamosban vizsgálunk. A maximális jelet úgy definiáljuk, mint a_; CTLA-4-ig kötösését a vizsgált ellenanyag tá~ vollétében. Az aspeeifikus kötődést úgy definiáljuk, int a CTLA4-I.g és a vizsgált ellenanyag távollétében mért elnyelést.

Az esszében kapott eredményeket a ΠΙΑ és ΙΠΒ táblázatban adjuk meg. A ΪΠΑ, táblázatban számos különböző, jelen találmány szerinti ellenanyaggal kapott eredményeket mutatunk be. A ΙΠΒ táblázatban azok az eredmények láthatók, amiket úgy kaptunk, hogy a 4.1.1 ellenanyagot a 11.2.1 ellenanyaggal hasonlítössze, amit egy külön kísérletben kaptunk.

IIIA. Táblázat

j Klón CTLA-4-íg	Izotípus	CTLA-4/B7.2 Komp, ELISA ICso (nM)	CTLA-4/B7.1 Komp. ELISA ICso (n.M)
CT3.1.1	lgG2	0,45 ± 0,07 01=3)	0,63 + 0,10 (n=2)
CT4.1.1	IgG2	0,38 ± 0,06 (n~5)	0,50 + 0,05 (n~2)
CT4.8.1	ígG2	0,57 ± 0,03 (n=3)	0,17 ± 0,28 (n=2) \|
Klón CTLA-4-Ig	; Izotípus	CTLA-4/B7.2 Komp, ELISA ICso (nM)	CTLA-4/B7.1 1 Komp. ELISA \| ICso (nM)
CT4.9.1	IgG2	nem .-.kampetitív (n^::::3)	nem-kompetitív (n=2)
CT4.10.2	IgG2	1,50 ± 0,37 (n=3)	3,39 ± 0,31 (n=2) \|
CT4.13.1	IgG2	0,49 ± 0,05 (0=3)	0,98 ± 0,11 (n=2) \|
CT4.14.3	IgG2	0,69 ±0,11 (n=3)	1,04 ± 0,1.5 (n-2)
CT6.1.I	igG2	0,39 ± 0,06 (n=3)	0,67 ± 0,07 (n.=2)

IIIB. Táblázat

1 Klón CTLA-4-Ig i } \|	Izotípus	CTLA-4/B7.2 Komp. ELISA ICso (nM)	CTLÁ-4/B7.1 I Komp. ELISA ICso (nM)
1 CT4.I.1	IgG2	0,55 + -0,08 (n^::::4)	0,87 ± 0,14 (n=2)
\| CT11.2.1	IgG2	0,56 + 0,05 (n~4)	0,81 ±0,24 (n=2)

8. Példa

Egv másik in rííro esszét is végrehajtottunk, hogy meghatároz a jelen találmány szerinti ellenanyagok szelektivitását CTLA4~re, versus CD28 vagy B7-2. Az alábbi anyagokat és módszereket használjuk ebben a kísérletben;

Egy 964ukas FluroNCNC lemezt (Nunc Cat No./475515) borítunk be 4 antigénnel; CTLA-4~lg, CD44/lg, CD28/Ig és B7,2/Ig (az antigéneket saját magunk készítettük). A lemezek antigénekkel való borítását éjszakán át 4 °C-o-n végezzük, 1 gg/mk 100 μΐ/luk, 0,1 mol/1 nátrium-hidrogénkarbonát pufferhen, pH~9,5. A lemezt azután háromszor mossuk PBST-vel (PBS + 0,1% Tween-20) , egy NUNC lemezmosót használva erre a célra. A lemezt PBST e 0,5% BSA-val blokkoljuk 150 pl/luk mennyiségben. A lemezeket 1 óra hosszat; szobahőmérsékleten xnkuháljuk, majd háromszor mossuk PEST-vek Ezután a jelen találmány szerinti an.ti-CTLA-4 ellenanyagokat blokkban hígítjuk 1 pg/ml-re, majd hozzáadjuk a lemezekhez. A lemezt 1 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd háromszor mossuk PBSTvel. A jelen találmány szerinti ellenanyagokat tartalmazó lukakat 100 μΐ/luk antí-humán ígG2-HRP-vel (Southern Biotech Cat No. 9070-05) kezeljük, 1:4000-es blokkban való hígítással. Emellett egy sort antí-humán IgG-vel (Jackson Cat No. 209-035-088) kezelünk, hogy' normalizáljuk a lemez heboritását Ezt az ellenanyagot 1:5000 arányban blokkban higítjuk, majd 100 μΐ/luk mennyiségben adjuk a lemezhez. Emellett egy sort antí-humán CTLÁ-4-HRP-vel (Pharmingen Cat No 345815/Custom HRP konjugálva) kezelünk, pozitív kontrollként. Ezt az ellenanyagot 0,05 pg/ml hígításban (blokk) használjuk. A lemezt 1 óra hosszat SZOLBA kemolumineszcens szubsztrátot (Pierce) adunk a lemezhez 100 μΐ/luk mennyiségben, majd a lemezt 5 percig egy lemezrázőn inkuháljuk. A lemezt azután egy lumi-imager-rel olvassuk le, kétperces expozíciót használva.

M-450 Dynabead-eket (Dvn&I A.S, Oslo, Norvégia #140.02) mosunk háromszor nátriumfoszfát puíferrel (pH=7,4)·, majd nátriumfoszfát púderben resztiszpendáljuk. 1,0 pg CTLA-4-Ig(Gl)-et, 1,0 CD28-lg(Gl)~et vagy 1,0-3,0 pg B7<2-!g(Gl)-et (Replígen, Inc. Needham, MA) adunk 100 μΐ gyöngyhöz, majd éjszakán át egy rotátoron. mkubáJjuk 4 °C~on. A második napon a gyöngyöket háromszor mossuk Dulheceo féle FBS-ben készített 1% BSA. plusz 0,05% Tween-20 oldattal mossuk, majd 30 percig blokkoljuk, A gyöngyöket 1-10 arányban hígítjuk blokkoló puíferrel, majd 25 μ.1, beborított gyöngyöt adunk 12><75 mm. polipropilén csövekhez. Minden mintát két párhuzamosban vizsgálunk, 50 μΐ vizsgált el(1 ug/ml végkoncentráció) vagy blokkoló punért adunk a csövekhez, majd 30 percig az Origen 1,5 analyzer karusszelen inkubáljuk (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD) szobahőmérsékleten, 100 per perc fordulatszámmal vortexelve. 25 μΐ rutenüezett rágcsáló antí-humán IgGl, IgG2 vagy lgG4 ellen anyagot (Zymed, Inc., San Francisco, CA #053300, 05-3500 és Ö5-38ÖÖ) (végkoncenírácíó 3 ug/ml 100 μΐ őssztérfogatban): adunk a csövekhez, A csöveket 30 percig szobahőmérsékleten inkuháljuk karusszelen vortexelve 100 per perc fordulatszámm&l, Csövenként 20-0 μΐ Origen esszé puffért (IGEN International, Inc,, Gaithershurg, MD #402-050-03) adunk hozzá, majd röviden extrabáljnk, és a csöveket Az· Origen Analyzerben számláljuk, és mindén csőre meghatározzuk az ECL(elektrokemilumineszcencia) egységeket. Meghatározzuk a normalizáeios faktorokat, hogy korrigáljuk a fúziós fehérjék Dynebead-ekhez való kötődését, és az ECL egységeket korrigáljuk az aspecífikus kötéshez, mielőtt kiszámítjuk a szeíektivitási zatfoan mutatjuk, be

IVA. táblázat

Klón	Izotí- pus	CTLA4/ CD28 ELISA	CTLÁ4Z B7.2 ELISA	CTLA4/ CD44 ELISA	CTLA4/ C.D28 IGEN	\| CTLA4/ ) .87.2 j IGEN $
3.1,1	IgG2	>500:1	>500:1	>500:1	>500:1	1 >500:1
		(n-3)	(xmS)	(n-3)	ln-2)	) (n~^:l) 1 195:1 j (n^l)
: 4.1,1.	IgG2	>500:1	>500:1	>500:1	>500:1	{ >500:1
		(n-3)	(n-2) 485:1 (η™ 1)	(n-3)	(n~l) 261:1 (n~l)	{ (n= 1) 1 107:1 \| (n=l)

9?

Klón	Izo típus	CTLA4/ CD23 ELISA.	CTLA4Z B7.2 ELISA	CTLA4/ CD44 ELISA	CTLA4Z CD28 IGEN	C7LA4/ B7.2 IGEN
4.8.1	lgG2	>500:1 244:1 \|n=2)	>500:1 (Π“2) 190:1 ín=l)	>500:1 (n=3)	>500:1 <n=2J	>500; I
4.9.1	IgG2	>500:1 fn=3l	>500:1 t'n=2) 33:1 (n-l)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=l)	>500; 1 (tv-1)
4.10.2	lgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3\|	>500:1 \|n=l)	>500:1 (n=I)
4.13.1	IgG2	>500:1 fn~2) 46:1 (n~ 1)	>500:1 (n=3) í	>500:1 \|n=2) 126:1 (n=l)	>500:1 (n=l) 329:1 fn= 1)	>500:1 (xi=2)
4.14.3	IgG2	>500:1	>500:1	>500:1	>413:1	>234:1
		ín~2) 80:1 (rml)	(n~2) 10:1 (n-l)	(n=3)	(n-l)	(n=l)
6.1.1	lgG2	>500:1 (n=2) 52:1 1 j	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=2)

IVB. Táblázat

Klón

Izotí- pus

CTLA4/CD28 ELISA

CTLA4/B7.2 ELISA

CTL.A4Z hlgG ELISA

! 4.1,1	IgG2 Ί	>500:	1 (n~3)	j >500:1 (n-2)	>500:1.	(n-3) j
1 11.2.1	lgG2 ί	>500:	1 (n-3)	1 >500:1 (n~3)	>500:1	(n-3; \|

j

Ahhoz, hogy tovább definiáljuk a jelen találmány szerinti ellenanyagok aktivitását, amik immun-regulatorként hatnak,, kifej lesztettünk T-sejt. vizsgálatokat, azzal a céllal, hogy mennyiségiig meghatározzuk a T-sejtek interleukin-S termelését, ha az ellenanyagokkal blokkoljuk a CTLA-4 szignálokat. Az alábbi anyagokat és módszereket használjuk a kísérletben:

Anyagok és módszerek

Frissen izolált humán. T~ sejteket készítünk Histopaque (Sigma, St. Louís, MO #A~7Ö543) és T-kwik (Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga. Park, CA, #LK-5O-T) felhasználásával, majd 1. ng/ml FHA-val serkentjük (Furified Fhytobemagglutínm, Murex Diagnostícs Ltd,, Dartford, Nagy-Britannia,. #HA) megfelelő közegben (RPM1 1640, ami L-glutamint, MÉM nem-esszenciális aminosavakat, penicillint, sztreptomicint, 25 mmol/1 HEPES-t és 1.0% FBS~f tartalmaz), 1 x 1Ó⁶ sejt/ml koncentrációban, majd 2 napig 37 °'C-on ínkubáljuk. A sejteket mossuk, majd a megfelelő közegben 2 x 10^ö sejt/ml-re hígítjuk. Raji sejteket (Burkitt limfóma, Humán ATCC No.: CCL 86 Class Π American Type Culture Collection Rockville, MD) 1 óra hosszat 37 °C-on mitomicín C-vel kezelünk {Sigma, St. Louis, MO, 4M-4287) (25 gg/ml). A Raji sejteket 4X PBS-se.l mossuk, majd 2 * lö⁶ sejt/ml sűrűségben reszuszpendáljuk. Humán T-sejt blasztokat (5 χ lö^s/ml). Raji sejteket (5 * 10⁵/ml), valamint antí-CTLA--4 ellena99

Lonböző ny&gö&at, vagy dó kontroll ellenanyagot adunk a 96-lukas mikrotiter lemezekhez, majd a lemezeket 72 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. Az össztérfogat 200 μΐ. A serkentés után hetvenkét órával a lemezeket lecentrifugáljuk, majd a felülűszókat eltávolítjuk és az in.terleukín-2 későbbi meghatározásához lefagyasztjuk #D2Ö5O). A cítokin erősödést úgy határozzuk meg, mint azt a különbséget a cítokin szintekben, ami egy anti-CTLA-4 blokkoló ellenanyagot tartalmazó tenyészet és egy izotípusára nézve illeszkedő kontroll ellenanyagot tartalmazó tenyészet között van. Az áramlási eitcmetriás kísérletekhez a Raji sejteket Ix FACS pufferrel mossuk (2% bővel inaktivált FCS~t, 0,025% nátrium-azídöt tartalmazó PBS). A sejtüledéket FACS pufferben reszuszpendáljuk, 1 χ lö⁶ sejt/10Ö μΐ sűrűségben, majd 30 percig szobahőmérsékleten ml anti-CD8Ö-PE-vel (Beckton

Dickinson, San Jose, CA) vagy antí~CD86--PE--veI (Pharmíngen, San Diego, CA). A sejteket kétszer mossuk, majd 1 ml FACS pufferben reszuszpendálj uk. Az áramlási citomefriát egy Becton

Dickinson FACSort berendezéssel bal végre. A hisztogramm markereket. a releváns ízotípus kontroll ellenanyagok elemzésével határozzuk meg (Caltag, Burlingame, CA).

Általánosságban, kifejlesztettünk egy olyan esszét, amit arra lehet használni, hogy gyorsan meghatározzuk a T-sejt interleukin-2 szabályozás erősödését. Amint az nyilvánvaló, a T-sejtek stimulálása. B7 és

Emellett a mosott T-sejt blasztok. nem termelnek kimutatható mennyiségű interleukin-2t, és a Raji sejtek nem termeinek kimutatható mennyiségű interleukln-2-t, mág akkor sem, ha LPS-sel vagy PWM-mel serkentik

1Ö0 őket. Azonban kombinációban, a Raji sejtekkel együtt tenyésztett T Másztok képesek modellezni a B7, CTLA-4 és CD28 jelátviteli eseményeket, és az ellenanyagoknak rájuk gyakorolt hatása felbecsülhető.

A 11. ábrán a B7-1 és B'7-2 expresszioját láthatjuk. Raji sej , antiíciímva. es <

-PB anti-€D86-PE monoklonális ellenanyagokat áramlási citometriát (FACs) alkalmazva, a 6. pél·

A 12. ábrán az interleukin-2 termelés koncentrácíőfüggő fokozódása látható T-sejt b!aszt/RajÍ esszében. CTLA~4~et blokkoló ellen anyagokkal indukálva (BN13 (Pharmingenj, és a. jelen találmány szerinti 4.1,1, 4,8,1 és 6.1,1 ellenanyagok).

A 13, ábrán az interferon-γ termelés koncentrációfüggő fokozódása látható T-sejt hlaszt/Raji esszében, CTLA-4-et blokkoló ellenanyagokkal indukálva (B.NI3 (Pharmíngen), és a jelen találmány szerinti 4.1,1, 4.8.1 és 6,1.1 ellenanyagok),

A 14. ábrán az ínterleukín-2 termelés átlagos fokozódása látható 6 donorból származó T-sejtekben, CTLA-4-et blokkoló ellenanyagokkal indukálva, T-sejt hlaszt/Raji esszében. Érdekes megfigyelni,. hogy a CT4.9.1 monoklonális ellenanyag kötődik a CTLA-4-hez, de nem blokkolja a B7 kötődését. Tehát a CTLA-4hez való kötődés nem elegendő önmagában ahhoz, hogy jelen találmány szerinti funkcionális ellenanyagot biztosítson,

A 15. ábrán az interferon-γ termelés átlagos fokozódása látható 6 donorból származó T-sejtekben, CTLA-4-et blokkoló ellenanyagokkal indukálva, T-sejt hlaszt/Raji esszében,

A 1.9. ábrán a találmány szerinti 4.1.1 és 11.2,1 ellenanyagok összehasonlítása. látható 30 pg/ml koncentrációban a hetvenkét, órás T-sejt hlaszt/Raji esszében, a 9. példában leírt módon, valamint a Superantigen esszében, a 10, példában leírt módon,

A 20. ábrán az interleukin-2 termelés átlagos fokozódása látható a T-sejt blaszt/Raji esszében, a jelen találmány szerinti

4,1.1 és 11.2.1 CTLA-4 ellenanyaggal indukálva.

Az alábbi, IVc. táblázatban a citokin válasznak a jelen találmány szerinti Raji és SEA esszékben való átlagos fokozódására, és a fokozódás tartományára vonatkozó információ látható. Az eredményeket adó mindegyik kísérlet 30^: gg/ml dózisú ellenanyagra alapul, és hetvenkét óra elteltével mérjük. A kísérletben használt donorok, számát és a válaszokat is bemutatjuk.

102

IV'c. Táblázat

Esszé : !	mAb	Cito· kin	Átlagos fokozó- dás pg/ml	SEM	A fokozódás mértéke pg/ml	n	Do- nor válasz
T-sejt ^: ! blaszt/Raji	4.1.1	IL-2	3329	408	0-8864	42	21- ből 19
T-sejt blaszt/ Raji	4.1.1	ΪΡΝ- 7	3630	980	600- 13939	17	13- bői 13
T-sejt blaszt/Raji	11.2,1	IL-2	3509	488	369- 6424	18	14- ből 14
SEA (PBMC)	4,1.1	IL-2	2800	312	330- 6699	42	17- bői 17
SEA (PBMC)	11,2.1	IL-2	2483	366	147- 8360	25	15- ből 15
SEA (Teljes vér)	4.1.1	IL-2	6089	665	-168- 18417	46	17- böl 13
SEA (Teljes vér)	11,2.1	IL-2	6935	700	-111- 11803	25	14- böl 12

10. Példa

103

Egy második celluláris esszét fejlesztettünk ki, azzal a céllal, hogy mennyiségileg meghatározzuk a T-sejtekben az interleukin-2 szahályozódásának erősségét, a CTLA-4 szignálnak az ellenanyagokkal való blokádjának hatására. Az alábbi anyagokat és esszéket használjuk a. kísérletben:

Humán PBMC-t állítunk elő Aceuspín-nel. Míkrotiter lemezeket előre beborítunk anti-CD3 ellenanyaggal (leu4, Becton Dickinson) (60 ng/ml), majd 2 óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on. hPBMC-t adunk a lukakhoz. 200,000 sejt per luk mennyiségben, Stqpte/lococeus enterotoxint (SEA) (Sígma, St Louis., ΜΌ) adunk a lukakhoz, 100 ng/ml mennyiségben. Ellenanyagokat adunk a lukakhoz, általában 30 pg/ml mennyiségben, A sejteket azután negyvennyolc, hetvenkét vagy kilencvenhat óra hosszat stimuláljuk. A lemezeket lecentrifugáljuk az előre megállapított időpontban, majd a felulüszökat eltávolítjuk a lukakből. Ezután a felülúszókban ELiSA-val (R&D- Systems) ellenőrizzük az interleukin-2 termelődését

Az. ezekből a kísérletekből származó eredményeket a 16., 17, és 21. ábrán mutatjuk be. A 16. ábrán azt mutatjuk be, ahogy 5 donorból származó hPBMC-ben az interleukin-2 termelődését mérjük a stimulálás után hetvenkét órával. A. 17. ábrán a teljes vérből kapott mérések eredményei láthatók, elemezve a kü lönbséget az interleukin-2 termelés indukálásában, 3 donor vérében, a. stimulálás után hetvenkét és kilencvenhat órával mérve..

A. 21, ábrán a teljes vérből kapott mérések eredményei láthatók, 2 donorból származó teljes vérben, a stimulálás után hetvenkét órával mérve.

104

Állati tumor-modell

Létrehoztunk egy állati tumor-modellt az anti-rágcsálóCTLA-4 ellenanyagok tumomövekedést gátló hatásának in vivő elemzésére. A modellben egy rágcsáló fíbroszarkőma tumort növesztünk, majd az állatokat anti-rágcsáló-CTLÁ-4 ellenanyagokkal kezeljük. A modell létrehozásához használt anyagokat és módszereket az alábbiakban adjuk meg;

Anyagok és módszerek

6-8 hetes nőstény A/J egereket injekciózunk szubkután a nyaj dorzális oldalán 0.2 ml SalN tumorsejttel (MÖ⁶) [Baskar és mtsai, 1995). .Anti-rágcsáló CTLA-4-et, vagy egy izo típusára nézve azonos kontroll ellenanyagot [Fharmingen, San Diego·, CA, 200 pg/állat) injekciózunk intraperitoneálisan a tumorsejtek beinjekclózása utáni 0,, 4., 7. és 14. napon. A tumor méréseket a 3-4 hetes kísérlet során végezzük, egy Starrett SFC F/as elektronikus mérőkészülékkel (AtboL MA), és a tumor méretét a tumor növekedés által borított felszín területeként (mm²) fejezzük ki.

A 18. ábrán a tumornövekedés gátlását, mutatjuk be egy anfi-rágcsáló CTLA-4 ellenanyaggal, egy rágcsáló fibroszarkóma tumor modellben, Amint az a 18. ábrán látható·, az anti-CTLA-4 ·· gyei kezelt állatokban a tumor növekedése csökken, az egy azonos ízotípusú kontroli ellenanyaggal kezelt állatokkal összehasonlítva. Ennek megfelelően az anti-rágcsálő CTLA-4 monoklonális ellenanyagok képesek gátolni a fibroszarkóma növekedését egy egér tumor modellben.

!ÖS

Az várható., hogy azok az ellenanyagok, amik keresztreakciót adnak a rágcsáló CTLÁ-4-gyel, hasonlóképpen, teljesítenek a modellben. Azonban a találmány szerinti ellenanyagok közül, amiknek ellenőriztük a keresztreaktívitását, egyik sem adott keresztreakciót a rágcsáló CTLA-4-gyel.

Állati tumor modell

Ah hoz, hogy tovább vizsgáljuk a jelen találmány szerin ti ellenanyagok aktivitását, xenograft SCID egér modellt terveztünk, hogy vizsgáljuk a létrehozott tumorok és a belőlük származó áttétek kiirtására, A modellben az SCID egerekbe humán Tsejteket ültetünk át, és mindegyiket betegből származó, nem kis sejtes (HSCL) vagy kolorektális (CC) sejtekkel ültetjük be, A beültetést a. SCID egerek gonadális zsírpárnájába ültetjük be. Hagyjuk a tumorokat növekedni, majd eltávolítjuk. Az egerekben, humán-szerű tumor és máj áttétek fejlődnek ki. Egy ilyen modellt Bumőers és munkatársai írtak, le [Bumpers és mtsai: J, Surgical Rés. 61, 282-28?

Az várható.

a jelen találmány szerinti ellenanyagok gátolják az ilyen egerekben keletkező tumorokat.

Referenciák:

Alegre és munkatársai: J. Immunoi, 157, 4762-70 (1996) Allison és Rrummmel: Science 270, 932-933 (1995)

Balzano és munkatársai: Int. J. Caneer Supp.l 7, 28-32 ( Blair és munkatársai: J. Immunoi. 160, 12-15 (19 e és Lítzi-Davis: Bíoconjugate Chem, 3, 510-513 (1992)

Boussíotis és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 90, 11059-63(1993)

Bowie és munkatársai:- Science 253, 164 (1991)

Bruggeman és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86, 6709-6713 (1989)

Bruggeman, M. és Neúberger, M.S.: In: Methods: A ccmpanion to Methods ín Enzymology 2, 159-1.65, szerk: Lerner és munkatárBruggeman és munkatársai: „Humán antibody productíon ín transgenic mice:expression írem löö kh of the humán IgH locusA Eur, J. Immunok 21, 1.323·· 1326 (1991)

Bruggeman, M„, Neúberger, M.Su „Strategies fór expressíng humán antibody repertoires in transgenic mice.” Immunology Today 17, 391-397 (1.996)

Brúnót és munkatársai: Natúré 328. 267-270 (1987)

Bumpers és munkatársai: J, Surgical Rés. 61, 282-288 (1996) Capsey és munkatársai: Genetically Engineered Humán Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988))

Castan és munkatársai: immunology 90, 265-271 (1997)

Cepero és munkatársai: J, Exp. Med. 188, 199-204 (1998)

Chen és munkatársai: „Immunoglohulín gene rearrangement ín B-eell deficient mice generated by targeted deletion of the Oh locus” International Immunology 5, 647 -656 (1993)

Chen és munkatársai: Cell 71, 1093-1102 (1992)

Chen és munkatársai: Humán Gene Therapy 5, 595-601 (1994) Chiswell és McCafferty: TIBTECH J0, 80-34 (1992)

Choi és munkatársai: „Transgenic mice containing a humán heavy Chain immunoglohuln gene fragment eloned in a yeast artincal citromosomé Natúré Geneti.cs 4, 117 -123 (1993)

107 f ,

Chothia & Lesk: J. Mól Biot 196, 901-917 (1987)

Chothia és munkatársai: Natúré 342.,. 878-883 (1989)

Chuang és munkatársai: J. Immunok 159, 144-151 (1997) Coíigan és munkatársai.: Unit 2,1, „Enzyme-linked ímmunosorbent asssys” In: Current protocois In immunology (1994) Cwirla és munkatársai: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 87, 6378-6382 (1990)

Dariavach és munkatársai: Búr. J. Immunot 18, 1901-1905

Dayhoff, M.O., In: Alias of Protein Sequence and Structure 1011.10 5, kötet, National Biomedical Research Foundation és 2. kiegészítés ehhez a kötethez .1-10 (1972)

De Boer és munkatársai: Eur„ J. Immunoi. 23, 3120-3125 (1993) Ecksteín, Ed.: Oxford Universiíy Press, Oxford England (1991) Evans és munkatársai: J. Med. Chem, 30, 1229 (1937)

Fallárino és munkatársai: J. Exp, Med, 188, 205-210 (1998) Fanger és munkatársai: Immunok. Methods 4, 72-81 (1994) Fauchere: d. Adv, Drug Rés. 15, 29 (1986)

FIshwild és munkatársai: „High-avidíty humán IgG-γ monoclonal antíbodies from a növel strain of mínilocus transgenic mice,” Natúré Bioteeh. 14, 345-851. (1996)

Freeman és munkatársai: d. Exp. Med, 1.78, 2185-2192 (1993) Freeman és munkatársai: J. Immunok 161, 2708-2715 (1998) Freeman és munkatársai: Science 262, 907-909 (1993) Fundamental Immunology 7. fejezet szerk.: Paul, W. 2. kiadás Raven Press N.Y. (1989)

Galfre, G. és Miistein., C.: ^Preparatíon of monoclonal antíbodies: strategies and proceduresA Methods Enzyniol. 73, 3-46 (1981)

108

Gorman és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 6777 (1982)

Green és Jakobovits: J. Exp. Med. 188, 483-495 (1998)

Green és munkatársai; Natúré Genetícs 7, 13-21 (1994) Grosschedl és munkatársai; Cell. 41, 885 (.1985)

Hanes és Fluc thau: Proceedíngs of the National Academy of Sciences USA 94, 4937-4942 (1997)

Harding és munkatársai: Natúré 356, 607-609 (1994)

Harper és munkatársak J. immunoi 147, 1037-1044 (1991) Hathcock és munkatársai: Science 262, 905-907 (1993) Hoganboom és munkatársai; Immunoi. Reviews 130, 43-68 (1992)

Horspool és munkatársai: J. Immunoi 160, 2708-2714 (1998) Houghten és munkatársai: Biotechniques 13, 412-421 (1992) Houghten: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 82, 5131-5135 (1985)

Hurwitz és munkatársai; J. Neuroimmunol 73, 57-62 (1997) Hurwitz és munkatársai: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 95, 10067-10071 (1998) immunology - A Synthesís, 2, kiadás szerkesztők: E.S, Golub és D.R. Gren, Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991) Introductíon to Protein Stucture, szerkesztők: C, Branden és J, Tooze, Garland Publíshíng, New York, N.Y. (1991)

Jakobovits és munkatársai: „ Germ-line transmission and expression of a human-derived yeasf artífical-chromosome.” Natúré 362, 255-258 (1993)

Jakobövits, A, és munkatársai: „ Analvsís of homozygous mutant chimeric mice: Deietion of the ímmunoglobulin heavy-chaín joining region blocks B-cell development and anübody

IÖ9 productíon.* Proceedings of the National Aeademy of Sciences, USA. 90, 2551-2555 (1993)

Jákobovits, A.: „ Humanizíng the mouse genome? Current Biology 4, 761-763 (1994}

Jákobovits, A: » Productíon of fully humán- antibodies by transgenic míce.” Current Opínion in Biotechnology 6, 561.-566 (1995)

Junghans é.s munkatársai In: Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 2, kiadás szerkesztők: Cafner és Longo, Lippincoft Raven (1996)

Kábát és munkatársai.: Sequences of Proteins of Immunologícal Interest, N.I.H. publikációs szám: 91-3242 (1991)

Kábát; Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health , Bethesda, Md. (1987 és 1991) Kostelny és munkatársai: J. Immunoi. 148, 1547-1553 (1992) Krummel és AUison: J. Exp. Med. 182, 459-465 (1995)

Krummel és munkatársai: Int. Immunoi. 8, 519-523 (1996) Kuehroo és munkatársai; Cell 80, 707-718 (1995)

Kwon és munkatársai:; Proceedings of the National Aeademy of Sciences, USA 94, 8099-8103 (1997)

LaPlanche és munkatársai: .Nueléic Acíds Research 14, 9081 (1986)

Lenschow és munkatársai; Proceedings of the National Aeademy of Sciences, USA 90, 11054-11058(1993}

Lenschow és munkatársai: Science 257, 789-792 (1992)

Lin és munkatársai; J. Exp. Med. 188, 199-204 (1993)

Linsley és munkatársai; J.Exp, Med. 176, 1595-1604 (1992) Linsley és munkatársai: J. Exp, Med, 174, 561-569 (1991)

Linsley és munkatársai: Science 257, 792-795 (1992) no

Liu és munkatársai: 3, Immunoi 139, 3521 (1937)

Liu és munkatársai: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 84, 3439 (1987)

Lonherg és munkatársai: „ Antigen-specihc humán antihodies írom mice comprising four distinct gén ette modifications” Natúré 368, 856-859 (1994)

Luhder és munkatársai: J. Exp. Med. 187, 427-432 (1998) Marasco: Gene Therapy 4, 11-15 (1997)

Markees és munkatársai: 3. Clin. Invest. 101, 2446-2455 (1998) M.arks és munkatársai: „ Oligonucleofide primers fór polymerase chain reaction. amplifícation of humán immunoglohulin variahle genes and design of fara ily- specíhe oligonucleofide probes.” Eur,

3. Immunoi. 24, 985-991 (1991)

McCoy és munkatársai: J. Exp, Med. 186, 183-187 (1997)

Mendez és munkatársai: Natúré Genetics 15. 146-156 (1997) Needleman és Wunsch: 3. Mól. Bioi. 48, 443 (1970)

Gkayama és munkatársai: Mól. Cell. Bio, 3, 280 (.1983)

Farmley és Smith; Gene 73, 305-318 (1988)

Pearson és Lípman: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 85, 2444 (1988)

Perez és munkatársai: Immunity 6, 4.11-417 (1997)

Peron és munkatársai: Immunot Rés. 14, 189-199 (1995)

Perrin és munkatársai: J. Immunot 157, 1333-1336 (1996) Pinalla és munkatársai: Biotechniques 13, 901-905 (.1992) Proteins, Structures and Moleeular Princíples szerk: Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1984)

Razi-Wolf és munkatársai: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 90, 11182- 11186 (1993)

Remington’s Pharmaceutical Sciences 15. kiadás, Mack Pubüshing Company, Easton, PA (1975), különösen a 87. fejezet Blaug, Seymour tollából

Rizo és Gieraseh; Ann. Rév. Biochem. 61, 387 (1992)

Russel és munkatársai: Nuct Acids Research 21, Γ081-1085 (1993)

Schwartz: Cell 71, 1065 (1992)

Scott: TIBS 17, 241-245 (1992)

Smith és Waterman: Adv. Appl, Math. 2, 482 (1981)

Songsívilai & Lachmann: Clin. Exp. Immunoi. 79, 315-321 (1990)

Stec és munkatársai: Journal of the American Chemical Soeiety 106, 6077 (1984)

Stein és munkatársai: Nueieíc Acids Research 16, 3209 (1988) Taylor és munkatársai: ,, A transgenic mouse that expresses a díversity of humán .sequence heavy and Iight chain immunglobulins,” Nueleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992) Taylor és munkatársai: „ Humán immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and eláss switching in mice that lack endogenous IgM.” International Immunoíogy 6, 579-591 (1994)

The McGr&w-HílI Dictionary of Chemical Terms szerk: Parker, S,, McGraw-Hill, San Francisco (1.985)

Thorton és munkatársai: Natúré 354, 105 (1991)

Tivol és munkatársai: Immunity 3, 541-547 (1995)

Townsend és Allison: Science 259, 368 (1993)

Trauneeker és munkatársai; Int, J. Cancer (Suppt) 7, 51-52 (1992)

Η.2

Tuaillon és munkatársai': „ Analysia of direct and. inverted DJm reaiTangements in a humán lg heavy chain transgenic minilocus.” 3, Immunot 1.54, 6453-6465 (1995)

Tuaiílon és munkatársai: „ Humán immunoglofeulin heaty-chaim. minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in μ and y transcripts.” Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 90, 3720-3724 (1993)

Uhlmann és Peyman: Chemical Reviews 90, 543 (1990)

Veber és Freídínger: T1.NS 392. oldal (1985)

Vitetta: Immunot Today 14, 252 (1993)

Walunas és munkatársai: Immuniiy L 405-413

Walunas és munkatársai; J. Exp. Med. 183, 2541-2550 (1996) Waterhouse és munkatársai: Science 270, 985-988 (1995)

Wínter és Harris: Immunot Today 14, 43-46 (1993)

Wright és munkatársai: Crít. Reviews in Immunot 12, 125-163 (1992)

Yang és munkatársai: Caneer Rés. 57, 4036-4041 (1.997)

Yi-qun és munkatársai: Int. Immunot 8, 37-44 (1996)

Zon és munkatársai: Anti-Caneer Drug Design 6, 539 (1991)

Zen és .munkatársai: Oligonucleotides and Analogues: A

Approach 87-108 oldal, szerk: F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford England (1991)

Fry és munkatársai: „ Spéciik., irreversible ínaebvation of the epidémia! growth faetor receptor and erbB2, hy a new eláss of tyrosine kinase inhibitor/'’ Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 12022-12027(1998) es ü.

catalvtlc domain «u. » A model ol Cdczo pnospnatase Cdk-inferaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain? J. Mól. Bioi. 282, 195-208 (1998)

Ginalski és munkatársai: » Modelling of active farms of protein kinases: p38—a case study? Acta, Biochim. Föl. 44, 557-564 (1997)

Jouko és munkatársai: _s Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important fór kínase domain structure? Bíochem. J. 322. 927-935 (1997)

Singh és munkatársai: „ Structure-based design of a potent, selective, and irreversifele inhibitor of the catalytie domain of the erbB .receptor subfamily of protein tyrosine kinases/'’ J. Med. Chem. 40, 1130-1135 (1997)

Mandél és munkatársai: „ ABGEH: a knowledge-based automated approacb fór antíbody structure modeling? Hat. Biotechnoi. .14, 323-328 (1996)

Monfardini és munkatársai: „. Ratlonal design, analysis. and poíential utilíty of GM-CSF antagonists? Froc. Assoc. Am. Fhvsicians 108, 420-431 (1996)

Fürét és munkatársai: Modelling stndy of protein kinase inhibitora: híndíng mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411.” J. Comput. Aided Moh Des. 9, 465472 (1995)

Ili és munkatársai: „ Design and construction of a hyhrid ímmunoglobulin domain wíth properties of botb heayy and light chain vari.able regíons? Protein Eng. lö, 949-957 (1997)

Martin és munkatársai: „ The affinity-selection of a miníbody polypeptide inhibitor of humán interieukín-6. EMBO. d. 13, 5303-5309 (1994)

07/466,008 sorozatszámű Amerikai Egyesült Államok-beli sza badalmi leírás, benyújtva 1990 január 12-én

07/574748 sorozatszámú Amerikai Egyesült Alii dalmí leírás, benyújtva 1990 augusztus 29-én éli szs

07/575,962 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1990 augusztus 31-én 07/610,515 sorosatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1990 november 8-án 07/810,279 sorozatszámű Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1991 december 17-én 07/853,408 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1992 március 18-án 07/904,068 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1992 június 23-án 07/919,297 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1992 július 24-én 07/922,649 sorozatszámű Amerikai Egyesült Allamok-belí szabadalmi leírás, benyújtva 1992 július 30-án 07/990,860- sorozatszámű. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1992 december 16-án 08/031,801 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1993 március 15-én 08/053,131 sorozatszámű Amerikai Egyesült Államok-beli sza badalmi leírás, benyújtva 1993 április 26-án 08/096,762 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli sza badalmi leírás, benyújtva 1993 július 22-én <38/112,848 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli sza badalmi leírás, benyújtva 1993 augusztus 27-én

08/155,30-1 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás., benyújtva 1993 november 18-án 08/161,739 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1993 december 3-án 08/165,699 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1993 december 10-én 08/209,741 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, benyújtva 1994 március 9-én 08/23-4,145 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli sza.· badalmi leírás, benyújtva 1994 április 28-án 08/724,752 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli sza badalmi leírás, benyújtva 1996 október 2-án 08/730,639 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli sza. badalmi leírás, benyújtva 1996 október 11-én 08/759,620- sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli sza. badalmi. leírás, benyújtva 1996 december 3-án 08/759,620 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli sza badalmi leírás, benyújtva 1996 december 3-án 4,399,216 számú. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le írás

4,681,581 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le írás

4,683,195 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le írás

4,683,202 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le írás

4,735,210 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le írás •X

116

4,740,461 számú Amerikai Esésűit Államok-beli szabadalmi leírás

4,816,397 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

4,912,040 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

4,959,455 számú Amerikai. Egyesült Államok-beli. szabadalmi leírás

5,101,827 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5,102,990 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás (RE 35,500)

5,151,510 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le5,194,594 számú Amerikai Egyesült Államok- beli szabadalmi leírás

5,434,131 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5,530,101 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5.545.806 számú Amerikai. Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5.545.807 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le.585,089 számú Amerikai Egy«

Államokle5,591,669 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5,612,205 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5,625,126 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5,625,625 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5,633,425 számú. Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás

5,643,763 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás·

5,648,471 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5,661,016 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5-,693,761 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le írás

5,693,792 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le írás

5,697,902 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le írás

5,703,857 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le

5,714,350 számú. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le

5,721,367 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi le írás

5,733,743 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi le írás

118

5,770,197 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5,770429 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5,773,253 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5,777,085 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5,789,215 számú Amerikai Egyesült Államok-beli. szabadalmi leírás

5,789,650 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

5.,811,097 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás

EP 0 546 073 B1 számú európai szabadalmi leírás

EP 0 463 151. B1 számú európai szabadalmi leírás, megadva

1996. június 12-én

WO 9.2/02190 szám ú nemzetközi szabadalmi leírás

WO 9.2/0391.8 számú nemzetközi szabadalmi leírás

WO 92/22645 számú nemzetközi szabadalmi leírás

WO 92 /22647 számú nemzetközi szabadalmi leírás

WO 92/22670 számú nemzetközi szabadalmi leírás

WO 93/00431 számú nemzetközi szabadalmi leírás

WO 93/12227 számú nemzetközi szabadalmi leírás

WÖ 94/00569 számú nemzetközi szabadalmi leírás

WO 94/02602 számú nemzetközi szabadalmi leírás megjelent 1994 február 3~án

WO 94/25585 számú nemzetközi szabadalmi leírás

WO 94/29444 számú nemzetközi szabadalmi leírás

JO

WO 95/01994 számú nemzetközi szabadalmi leírás WO 95/03408 számú nemzetközi szabadalmi leírás WO 95/24217 számú nemzetközi szabadalmi leírás WO 95/33770' számú nemzetközi szabadalmi leírás

WO '96/14436 számú nemzetközi szabadalmi leírás·

WO 96/34096 számú nemzetközi szabadalmi leírás, megjelent

WO 97/13352 számú nemzetközi szabadalmi leírás WO 97/20574 számú nemzetközi szabadalmi, leírás Wö 97/38137 számú nemzetközi szabadalmi leírás WO 98Z24884 számú nemzetközi szabadalmi leírás

WO 98/24893 számú nemzetközi szabadalmi leírás megjelent 1998, június 11-én

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett

120 «

< 11 ö> Harison, Douglas Charles Neveu, Mark Joseph Mueller, Eíleen Einott Hanke. Jeffrey Berbert Gilman, Steven Christopher Davis, C. Geoffrev <120> CTLA-4 elleni humán monoklonális ellenanyagok <130> ABX-PFl-PCT < 14ö> PCT /US99/30895 <141> 1999. 12. 23.

<150> US 60/113,647 <151> 1998. 12. 23.

<160> 147 <170> FastSEQ fór Windows Version 3,0 <210> 1 <211 > 463 <212> fehérje <213> Humán <400> 1

.Get

Gin

Lne

Oly

Len

Ser

Grp

Vei

P.ee

Len

Vei

Alá

íréi

T..í5^!n

Pr;j

i: i. V

1

s

10

15

Vei.

Gin

Gye

Gin

V;U.

Gin

Lee

Vei

Gin

Ser

Giy

e r y

Val

Vsl

Sin

23

25

30

Pro

Giy

Ary

Ser

Le a

lr<;

1:5:2

Ser

Gye

Vei

Pia

Ser

Giy

ahe

Thr

Phe

35

43^:

45

?2!

Ser- ein 65 Asp

Ser 55' Trp £ r

His Var Var:

Sry Ara Lys

Met Val Gry c. r

Pia: Trp 55 11 e -Trp

Val Tyr Thr

Arg Gin Ara

Pro 00 Asn Asp

Gly Lys Asn

Lys Tyr Ser'

Gry Tyr Lys fi c

Len Alá 80 Asn

Asp 11 e

Gly Ser

Arg 75: Arg

7 0 Arg

Phe

Thr

Len

Pae

hsa

Ό; s? Gin

í-íet

Asr

Se r

Len

Arg

Ars

Gin

Asp

Thr

Ara

'Val

305

105

115

Tyr

Syr

Cys

Alá

.Arg'

Gly

81.2

Phe

Gly

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Sin

Gr y

Sár

Len

Val

Thr

Val

Ser

Alá

Ser

Thr

Lys:

Gry

Pro

Ser

155

135

145

Val

Phe

Prr

Len

Alá

Pro

Cys

Ser

Ar g

Ser

Thr'

Ser

Gin

Se r

Thr

Alá

145

1 50

155

ISO

Alá

LS:O

Gly

Cys

Len

Var

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Gin

Pro

Var

Thr

Var

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

G r y

Alá

Len

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ara

Ipíl

135

130

Var

Len

Sin

Ser

Gry

Leír

Tyr

Ser

Len

Ser

Var

Val

Thr

Val

155

250

205

Pro

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

Kis

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Vár

Lys

Val

Age

Lys

Thr'

Va 1

Gin

Arg

Lys

Cys

225

230

235

240

Val

Sir

Cys

Pro

Cys

Pro

Alá

Pro

Pr o

Val

Al a

Gly

Pro

Ser

Var

245

250

255

2 ne

Le o

Phe

pv'c.

Pr o

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Len

Cet

Lle

Ser

Arg

Thr

260

265

27 0

Pro

Gin

Val

41. r

C y a

Val

Asp

Val

Ser

His

Gin

Asp

Pro

Gin

275

255

2 85

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Oly

Val

Gr λ;

Val

Kis

Asn

Ara

Lys

2 00

255

300

7'h z

Lys

Pro

Arg

Gin

G1 a

Gin

Phe

Lr.

Ser

Thr

Phe

.Arg

Val.

Val

Ser

305

310

315

-3 9Λ Η.·' -Z,. A·

Var

Len

Thr

Val

Var

'8 Is

Gin

Asp

Trp

Leír

.As n

Gly

Lys

Gin

Tyr

Lys

325

330

335

Cys

lys

Var

Ser

Asn

Lys

Gry

len

Pro

Alá

Pro

He

Gin

Lys

Thr

Lle

3 4 0

54 6

350

Ser

Lys

Tár

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

e r ír

Pr o

Gin

Val

Tyr

Thr

Len

Pro

355

36G

365

Pro

Ser

Arg

Gin

SÍ a

Hefc

Thr

Lys:

Asn

Gin

Var

Ser

Len

Thr

Cys

Lee

37 0

37 3

380

ί 22

Vei

Lys

Gry

Phe

Tyr

Pro

Ser

Aap

Ha

Aia

Vai

Gin

Trp

J.'4

Ser

Aan

38 5

300

305

4 00

el y

Sin

Pro

Gin

Asn

Ty ·:

Lys

Thr

Pro

Pra

Met

Leu

Asp

Ser

4 05

410

155

Asp

G.Í y

Se r

Phn í ’?n

The

Len

Tyr

Ser

Lys J '· F

Lan

Thr

Vai

Asp

Lys J F Γ:^:

Ser

Arg

Tvp

Gin

Sin

Giy

Asn

Vei

Pha

Ser

\· L. A •Cys

Ser

Vai

Te::

Kis

G i ίί

A,í. a

len

435

440

445

Kis

Ara

His

Tyr

Thr

Sin

Lys

Ser

.Lsu

Se r

Len.

Ser

Pro

GJ V

lys

50 455 4 60 <21ö>2 <211> 464 <212> FEHÉRJE

<213> Humán <400>2

Met 1

Gin

Pha

Giy

Lan 5

Ser

Trp

Vai

Phe

Len 10

Vai

Aia

Len

Arg 15

G.ly

Vei

Gin

Gye

Gin 30

Vai

Gin

Len

Vei

Gin 25

Ser

Giy

Oly

Giy

Vs i 30

Vai

Gin

Pro

el y

Arq 35

Ser

Leír

Ara

Le a

Ser 40

Cys

Thr

Ara

Ser

Giy 45

The

Thr

Pite

Ser

Asj'í 50

Tyr

G1 y

tia ΐ

His

Trp 53

Va.i.

Ara:

Gin

Ara:

Pro 6:0:

Giy

Lys

Giy

Len

Gin 65

Trp

Vai

Aia

Vai

lie V0

rrp

Tyr

Asp

Giy

Ser 35

Asn

nya

Pia

Tyr

Giy 00

Asp

Ser

Vai

Lya

vry 55

Arg

Phe

Thr

lie

Ser 30

Ser

Asp

Aan

Ser

Lys 95

Asn

Thr

Len

Tyr:

Len 100

Gin

Tér

Asn

Ser

Len 105

Arg

Alá

Gin

Asp

Thr Ilii

Aia

Vai

Tyr

Gye 115

Alá

Arg

Giy

Gin

Arg: ISO:

Len

ni y

Ser

Tyr

PL .8 125

Asp

Tyr

Trp

Sly

é i. :*í 130

Giy

Thr

Len

Vei

Thr 135

Vei

Ser

Aia

Ser 140

Thr

Lys

Giy

Pro

Ser 115

Vai

Phe

Pro

Len

Aia 150

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser 1.55

Thr

Ser

Gin

Ser

Thr 160

A Le.

Aia

Len

Giy

Cys^: 1 65

Lan

Vai

nya

Asp

Tyr 17 0

Phe

Pro

Gin

Pro

Va.i 175

Thr

Val Se?: T:cp Asa Ser Giy Alá Lea Tar Ser Giy Vad. Pis Tar Phe ?rc

ISO

LOS

190

Alá

Val.

Lea

Gia

Ser

er y

Leó

Tyr

Ser

Lea

Ser

Vad.

Va i

Thr

255

2:00

205

Val

Pro

Ser

Asa

Phe

Gd.y

Thr

e.'d. a.

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asa

Vei

Asp

210

215

220

His

Lys

Pro

Ser

.ÁSP

Thr

Lys

dSr

Asp

Lys

Th r

Val

Gi a

Ara

Lys

Gya

225

230

235

240'

Cys

Vei

Gia

Oys

Pro

Prrí

Cy s

Pro

Ara

Pro

Var

Ál a

Gl.y

Pro

Ser

2:45

250:

255

Vei

Sva

Leó

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Tar

Le·»

Két

ire

Ser

Ara

2 60

265

270

Thr

Pro

Gia

Ve i

Tar

Cys

Var

Vei

Asp

Vad.

Ser'

Kis

Gia

Asp

Pro

27:5

200

205

Gia

Vai

GT.a

Phe

ás a

Trp

Tyr

Ver.

Áar

Giy

Vs r

Gia

Vei

Pás

Asa

Ara:

Ágii

2 93

300

Lys·

The

Lys

Pro

Ara

Gia

Phe

As a

Ser

Tar

Phe

Arq

Val.

.Val

3öS

310

325

320

Ser

Vad.

Lee

Tar

Vei

Val

His

Gia

Asp

Td-p

Lea

Árra.

Giy

Lys

Gia

Tyr

325

533

335

Lvs

Gys

a ya

Val

5>^v3* D

Asa

Lys

Oly

lesd

Pro

Ád.a

Pro

2 is

Gia

Lys

Tar

34 Q

345

350

5 le

3e:r

Lys

Thr

Lys

Giy

Gia:

Pro

Árg

Sir

Pro

01a

Val

Tyr

Tar

Lea

255

.360

.365

Pro

Pxö

Se r

Arc

Gia

ele

Met

Tar

Lys

Asa

Gia

Veid

Ser

Lea

Thr

Gys

370

375

380

Lea

Val

Lys

e r y

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Tie

ad. a

Val

Gia

Trp

Gia

Ser

355

3 30

3 35

400:

Ást

Gl.y

Gia

Pro

Gl.a

Asa

Ága

Tyr

Lys

Tar

Thr

Pro

Met

Lea

Asp

405

410

415

Ser

Asp

Giy

Ser

Phe

Pae

Lee

Tyr

Ser

Lys

Le a

Vh:r

Vad.

Ás p

Ly:s

Ser

420

425

4 30

Ara

Trp

Gl.o

Gia

Giy

Ága

Val

.Phe

Ser

Cys

Ser

Var

Met

Pia

Gin

Ár a

435

440

445

Lea

Via

Ás:a

Kis

Tyr

Thr

Gi a

Lys

Ser

Lea

Ser

Lea

Ser

Pro

Giy

Lys

400 455 460 <210>3 <211> 163 <212> FEHÉRJE <213> Humán !24 <400>3

Pro

Gry

Arc

Ser

Len Ara

He

Ser

vys

Alá

Ara

Ser

er y

Phe

Thr

Phe

1

s

15

Ser

Alá

Gly

He

His

Trp

Val

Ara

illa

Al a

Pro

Gly

Lys

Gly

Le a

25

3ö

Gie

Trp

Val

Alá

Vei

He

rrp

lyr

Asp

Gry

Arg

Asn

Lys

Asp

Tyr

Ar a

35

4 5

ÁSp

Ser'

Val

Lys

Sly

Arg

Phe

Thr

He

Ser

Ara

Asp

Ara;

Ser

Lys

55

65

TLr

les

TW

Les

Gin

Kei?

Asn

Ser

Les

Ara

Alá

G.1 o

Asp

Thr

Alá

Val

55

75

80

Tyr

Cys

Alá

Arg

Vei.

Alá

Pro

Lee

Gly

P:i?O

I:ee

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

VS

55

G1 n

Gly

Ti!'

Ser;

Vei

Tar

Va 1

Ser

arra

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

155

115

Var

Píré

Pro

Len

Alá

Pro

Gye

Ser

Arg

Ser

Tar'

S e r

G!e_:

Ser'

Thr

Alá

115

120

125

Ara

Le a

Gr V

Gye

Len

Ver

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

G.lií

Pro

Var

Thr

Val

135

145

Ser

Trp

.Asn

Ser·

G1 y

Alá

Len

Tér

Ser

or y

Vei

His

Tar

Phe

Pro

Ara.

145

ISO

155

165

Val

Lee

Glo

<210>4 <211> 463 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 4

fSet

Gin Pae Gly

Lee

Ser

Trp

Vei

PhS:

Lee

Val

Ara

Lee

Arg

Gly

.1

5

H

15

Val

Gin Cys Gla

Ver.

ele

Lee.

Val

Gly

Ser

Gly

Gry

Gly

Val

var

6? X ti

20

25

35

Pro

Gry Arg Ser

Lee

Arg

Lee

Ser

Cys

Thr

Alá

Se r

Gly

Phe

Thr

Pina

35

A0

45

Se r

Ser Tyr' Gly

lset

His

Trp

vei

Ara

Gin

Ara

Pro

Gry

eys

Gi y

Lse

50

55

60

ele

Trp Val Ara

Vei

He

Tre

Τνί-

Asp

ery

Ser

Asn

Lys^:

His

Tyr

Ara.

65

70:

7 5

85

Asp

Ser^- Alá Lya

Gly

Ara

Phe

Την

He

Ser

.Arg

Asp

As a

Ser

Lys

Aso

125

Thr

Len

Gye

Lee

35 Cin

Mer

Asn

Ss; r

Len

90 Arg

Aia

Gin

Asp

Thr

SS e.ia

Var.

Tyr

Cys

100 Aia

Lrg

Aia

Giy

Tea

105 Lee

Giy

Tyr

Pae

Asp

ne Tyr

Trp

Giy

Gin

Giy

11.5 Thr'

Lee

7 a 1

Thr

Tel

120 Ser-

Ser

Alá

Ser

Thr

125 Lys

Giy

Pro

Ser

Vai

ISO Ph?s

P r o

Leó

Aia

Pro

135 Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

140 Ser

G1 a

Ser

Thr

Aia

145 Alá

Geo

Giy

Cys

Lea

150 Vei.

Lys

Asp

Tyr

Phe

155 Pro

Glu

Pro

Va 1

Thr

1.60 Vai

Ser

Trp

A 3&

Ser

155 Giy

u, a

Lee

T'h-.í:

S οχ-

170 Giy

Vei

h 13

Thr

Phe

1 75 Pro

.Alá

Vai.

Lee

Gin

ISO Ser

Ser

na y

Lee

Tyr

Ι 85 Ser

Lea

Ser

Vai

190 Vai

Thr

Ve 1

Pro

Sor

195 Ser

Asn

Phe

Giy

Thr

200 Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

20 5 As n

Vai

Asp

Kis

Lys

210 Pro

Ser

Asn ·

. T ar

Ly s

215 Vei

Asp

nys

Thr

V'al.

220 Gin

Arg

Lys

Cys

Gys

225 Vai

Gin

Cys

Pro

230 Cys

Pro

Ara

Pro

235 Vai

A1 a

G Ιο-

Pro

Ser

24 9 ve i

F h«s

Lee

Pbe

Pro

243 Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

250 Thr

L e a.

Μοί:

ί le

Se r

255 Arg

Thr

Pro

Gin

Vei

240 Thr

Cys

Vél

Vei

Var.

205 Asp

Ve i

Ser

His

Gin

27 0 Asp

Pro

Gin

Vai

Gin

27 3 Phe

Asn

Trp

Tyr

Vei

230 Asp

Giy

Vai

Gin

Vei

25 5 Kis

Asn

Aia

Lys

Tar

.2 90 Lys

Pro

Arg

Gin

295 Gin

Phe

Asn

5; ^Λ

Thr

500 Phe

Arg

Vai

Ser

SOS Vai.

Lea

Thr

Var

Vei

310 Kis

Gi n

Asp

Trp

Len

315 As a

Giy

rys

ma

Tyr

320 Lys

Gys

Lys

Vei

Ser

3.2 5 Asn

Lys?

G i y

Lóra

Pro

330 Ara

Pro

Lle

Gin

Lys

335 Thr

3 la

Ser

Lys

Thr

34 G Lys

Giy

CL tr

Pro·

Arg

345 Gin

Pro

Gin

Vai

Tyr

350 Thr

Lea

Pro

Ser

355 Arg

Gin

heh

Thr

3 6 0 Lys

Asn

Gin

Vai

Ser

365 Len

Thr

Cys

Len

V.3 1

370 Lys

ir i y

Phe

Tyr

Pro

375 Ser

Asp

He

Aia

Vei

530 Gin

Trp

Gin

Ser

Asn

3S5 Giy

Gin

Prc?

Gle

Asn.

390 Asn

Tyr

Lys

Thr

503 Pro

Pro

Mer

Lea

Asp

400 Ser

Asp

C r y

Ser

Phe

4 05 Phe

Lee

Tyr

Ser

Lys

410 Por

Thr

Vai.

Asp

Lys

415 Ser

Áru

Είό

			4 30
Trp	G!a	Cl a	Gr.y	A.aa	Val	The	Ser
		4 35					440
Hí s	Asa	Kis	Tyr	Tar	G1 a	Lye	Ser
	450					455

«25			4 30
Gys Ser bar	Met	Kis	Glo	Ara Lee
		4 45
Lee Ser Leó.	S-jr	Pro	Gly	L ys

6Q <21ö>5 <211> 169 <212> FEHÉRJE <213> Humán

Gly 1 Gly	<4G bal PLe	iö> ba.l Thr	5
Gla The 5 0	.Pro 5 Ser	Sir V Ser	Ara Tyr	Ser Oly
Gly	Lys	Gl	Lee	illa	Trp	vei	Alá
Lys	Tyr	35 Tyr	Alá	Asp	Ser	bal	40 Lys
Asn	50 Ser	Lys	Aso	Tar	Lee	53 Tyr	Leó
65 Asp	Tar	Alá	balt	Tyr	7 0 T yr	Tys	Alá
G ys	bel:	Asp	Val	35 T.rp	Λ;:.··. V	Gla	Gly
Sár	Thr	Ays	rOÖ Gry	Pro	Ser	bai	Pbe
Tar	Ser	115 Gr a	Ser	Ibr	A. la	Ara	120 Leó
Arc	ne GrO	Pro	bal	Tar	bal	135 Ser	Trp
145 Vei	H5.s	Tar	5? ti a	Pro	ISO Alá	bal	Lee

165

Le a	Arg lö	Le a	Ser	Cys	Alá	Alá 15	Ser
bíet 25	Kis	Trp	bal	Arg	Gla 30	Ara	Pro
bal	LIe	Trp	Tyr	Asp 45	Gry	Ser	Asa
Gly	Arg	Phe	Thr eo	11 e	Ser	Arg	Asp
Gl.a	Gél:	Asa 75	Ser	Leó	Arg	Aló	Gr a se
Ara	Gly Olt	Ara	Arg	He	Tre	Tar 35	Pro
Thr 105	Thr	bal	Tar	bal	Ser 110	3 a	A1 a
Pro	Tea	Alá	Pro	Cys .125	Ser	Arg	Ser
Gly	Cys	Leó	bal 140	Lys	Asp	Tér	Phe
Asa	Ser	o r y 155	Alá	Leó	Tar	Ser	Gly 160

Gin <210>6 <211> 167 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400>6

GlV 1.

Val

Gin

Ara í:

GLy

Arg Ser

Len

Ara 10

Lgh.

Ser

Cys

Val

Alá 15

Ser

Oly

Ahe

He

Fhe

Ser

Sis

Gly

He

His

ϊφ

Val

Ara

Sin

Alá

Pro

20

Z:

30

Gly

Lys

Sly

Le;;

Gin

Tr_P

Var

.ί-ΐ-Λ a

Val

He

Trp

Tyr

Aap

Gly

Arg

Asn

35

40

45

Lys

Asp

lyr

Alá

Asp

<> Θ 32

Va I

Lys

Glv

Arg

Fhe

Thr

He

Ser

Arg

Asp

50

55

60

Aen

Ser

Lys

A se

Thr

Le a

ayr

Le a

Gin

Lfet

Asn

Ser

Les

Ara

.Alá

Cin

65

VG

Va

50

Asp

Thr

Alá

Val

Tyr

Cys

Alá

Ar.g

Val

Alá

Arc·

Lee

Gly

Ara

Len

6 5

30

05

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gla

Gly

Thr

len

Val

Thr

Val

Ser

Alá

Ser

Thr

ISO

105

IH

Lys

Gly

Pro

Ser

Va.L

PhS

Aló

Le n

Alá

Ara

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

I 1 5

120

125

Gla

Ser

Tlnr

Ara

A1 a

Len

Gly

Gye

Len

Vei

Lys

A.sp

Tyr

Fhe

Ara

Gin

ISO

135

140

Pro

Val

Thr

Vei

Ser

T rp

Ase

Ser

el. y

Als

Les

Sir

Ser

ciy

Val

His

145

150

155

ISO

Thr

Phe

Arc

Alá

Val

Lee

Gin

I 65 <210 7 <211> 172 <212> FEHÉR <213> Humán <400> /

128

Ser 1

Gly

Pro

Sly

Leó. 5

Val

Lys

Pr©

Se r

Gla 10

He

psu

Ser

Lsa

Thr- 15

Sys

Thr

Val

Ser

Gly

H y

Ser

Ha

Ser

Sly

Gly

Pl s

Tyr

Trp

Ser

Trp

20

H

30

He

Arg

Glo

Sí s

Pro

Gly

LVS

Gly

les

GH

Trp

He

Sry

Tyr

rle

Tyr

35

40

45

Tyr

He

ee y

Asn

Thr

Tyr

Aarr

Pro

Ser

Lee

Lys

Ser

Arg

Ve 1

Thr:

50

55

60

i:l~

Ser

Pál

Asp

Thr

Ser

Lys

Aaa

Glo

Phe

Ser

Lee

lys

Lee

Ser

65

~0

'?©

80

Var

Tar

Ai a

Ara

Asp

Thr

Alá

Var

Tyr

Cys

Alá

Arg

Asp

Ser

Gly

S 5

55

35

Asp

Gyr

Tyr

Gly

He

Asp

Val

Trp

Gly

Sir

oly

Thr

Val

Thr

Var

10^:Q

US

no

Ser

Α.ί.

Ser'

Thr

Lys

Sly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Lee

Alá

P r o

Cys

115

re o

125

Ser

Arg

Se r

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Alá

Ara

Leó

Gly

Cys

Lee

Val

Lys

13G

13 5

14 0

Asp

Tyr

PAe

Pro

SÍ a

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asp

Ser

Gly

Alá

r,ea

145

2.50

ISA

1H

Thr

Ser

sry

Val.

his

Tar

Phe

Pro

Alá

Val

Lse

G la

105

10 0

<21O>8

<211>

153

<21

2> FEHÉRJE

<21

3>

Humán

<400>8

Pro

Gly

Arg

Ser

hsu

Arg

Lsa

Ser

Gye

Alá

A 2 a

Ser

Gly

Phe

Thr

PhS

1

c.

10

15

Ser

Pia

G1 y

1 le

Pia

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

Sry

lys

G1 y

Lau

20

é 0 Λ. Π

30

S'io.

Trp

Va r

Ara

Val

He

Trp

Tyr

Asp

ο χ y

Arg

Asa

Lya

Asp

Tyr

Ara

55

10

45

Asp

Ser

Val

l;y£

Gly

Arg

PÁS:

Thr

Ha

Ser

Arg

Asp

Aö o.

Ser

lys

A«h

55

so

Í29

Tör	Lee	Tyr	Lett	Gla	Oie 1	/ön	Ser
65					7 0
Tyr	lyr	Cyr	Alá	Árg	Val	Lle	P ro
				8 5
CSSLri	Gly	Te?:	Lee ·>···'	Vei	Tar:	Vei	Ser
Vei	Pöe	P ro	Π./Ί Lé’ü	Ál a	Pro	GyS	Ser
		HS					120
KiSi	Lse	Gry	Cys	Lee	Vei	Les	Asp
	ISO					135
Ser	Trp	ásh	S &r	Gly	Ál a	Lee	The
145					ISO

Ser

le a	Arg	Ál a	SÍ u	Lep	Tör	Alá	Val
		75					33
Lee	G-L-V	Pro	Lee	Ásp	Tyr	Trp Üú	Glp
Ser	Pl a	Ser	Tör	Lye	Gl y	-· Pro
105					110
Árg	Se r	Tör	Ser	Gla	Ser	Tör	Ára
				125
Tyr	Pöe	Pro	CL. a	Pro	Val	Tör	Vei

Ω <210>9 <211> 167 <212> FEHÉRJE <213> Humán.

<220>

<400> 9

Gly I	Vei	Vei	Gin	Pro, 5	Gly	Ára	Ser
Oly	Pöe	Tör	?he IC?	Ser	Ser	Tyr	Gly
elv	Lys.	Gly 35	Lee	Gitt.	Trp	Vei	A? a 40
Lys	l'yr 50	Tyr	ele	ásó	Ser	Val 11 c	Lys
Asa 65	Ser	Lys	ÁSS	Tar	Lee: 71	Tyr	Lee
Lap	Tar	Ál a	Vei	Tyr S5	Tyr	Cys	Ál a
Tér	Tyr	Tyr:	Tyr 101	Tyr	Ara	Xea	Ásp

105

Tea Áry Lee 10	Ser	Cye	Álé	Ál.a 15	Ser
Mer	Sás	Trp	t ' í V ÍJ ...	Árg	?Gla	Ara	Pro
25					30
Vei	He	Trp	Ty r	Aap	nly	Se r	Ám
				45·
Gly	Arg	Pöe	Tör	He	Ser	Árg	ÁSp
			50
Gla	Kel	Ás:e	Ser	Lea	Árg	Ál.a	Gla
		75					8G
Árg	ÁSD	Pro	Árg	C: i y	Ál a	Tör	Lea
	00					35
Vei	Trp	Gly	Gin	Gly	Tör	Tör	Val

110:

rhr

Var. Ser

Ser

Ara

Ser

Per

Lys

Cly

Pro

4· “· E

Vei

Phe

Pro

Lee

Alá

115

120

125

Pro

Cys: Ser

Arg

Ser:

Per

Ser

Gie

Ser

Per

Alá

Lee

Ό r y

Cys

Lee

leli

135

140

Var.

Lye Asp

Tyr

Lee

Pro

Sin

Pro

Vei

Pírt

Vei

Ser

Tre

Asn

Ser

Gry

145

150

155

100

A. la

Lee Ver

Ser

C1 y

Vei

Kis

111

<210>

10

<211>

151

<212>

FEfi

ÉB

JE

<213>

Humán

<400> 10

Giy

Var.

Var

Gle

Pro

Sly

Arg

Ser;

Lee

Ara

Lee

Se r

Cys

Alá

Aí a

Ser

1

5

10

15

Sry

Phe_:

Per

Phe

Ser

ryr

^:Gi.y

Vet:

Kis

V rp

Var

Arg

öle

Alá

Pro

20

25

3 0

b'i 7

Lye

51 y

Lee

SS a

Prp

Var.

Alá

Val.

Πε

Trp

Pyr

Asp;

ο ϊ y

Ser

Kis

35

40

45

Lys

Pyr

ryr

Ara

Asp

Ser

Var

Lys

Cly

Ar g

Phe

Phr

öle

S>?ür

Arg·

Asp

Só

55

QQ

Ase

Ser

Lys

Ase

Vftr

Lse

Tyr:

Lee

őre·

Vet

A.se

Ser

Lee

Arg

Alá

Gle

55

0

7 5

80

Asp

Ver

Var.

pyr

Pyr

cys

Ara

Arg

2 ΐ y

Alá

Var

Var.

Vei

Pro

Ai a

55

50

95

Ara

Vet

Asp

var.

Prp

oly

Cl a

oly

Ttrr

~P r

Var.

Pp r

Var

Ser

Alá

löO

100

110

Ser

Irr

Lys

oly

Pro

Ser

Val

Pfee

Pro

Lee

Ara

Pro

Cvg

Ser

.Arg

Ser

115

120

125

Thr

Ser'

Cl a

Ser

Var

Ara

La a

•Oly

Cys

Lee

Var

Lys

Asp

Tyr

PLe

Sir)

135

140

Pro

Cl a

Pro·

Vei

Var:

Val.

Ser

145

ISO

Ui <210> 1.1 <211> 146 <213> Humán <220>

<400> .11

Val n

Val

Gin

Pro

aly a.

Arp

Ser

Seri

Arq

Len. ·; .·>

Ser

Gya

Alá

Ara

Sö?,·? G £1

Gly

•X Phe

Thr

Phe

Ser

X.&CÍ

Gly

hat

His

··.·' Trp

var

Arp

Gin

Ara

. .·. sV Pro

Gly

20

.25

30

Lys

ery

Len

Gin

Trp

Var.

Alá

Val

He

Trp

Ser'

Sáp

Gly

Ser

.Ars

Sys

35

40:

45

Gr

Tyr?

Alá

Aap

Se ·;

var

Sva

Gly

Ar q

Phe

Thr

He

Ser

Ara-

Asp

Asn

5G

r o

GO

Ser

Ive

Asn

Thr

Len

r yr

Ser

i'JjTi

Cet

Asn

Ser

Sas

A re

Ara

Gre

Asp

65

70

75

80

Thr

Ara

var

Tyr

Gye

Sí a

Arg

Gly

Thr

Ple t

1 Is

var

Var.

Gly

Thr

85

90

95

ven

Asp

Vyr

Grp

Gly

Sir;

Gly

Thr

agg

Var

Thr

Val

Ser

Alá

Ser

190

105

110

Thr

Sys

Gly

Pro

Ser

Var

Phe

Pro

Ser

Alá

Pro

Gya

Ser

Ar ρ-

Ser

Thr

ria·

12. 0

125

Ser

Gin.

Ser

Thr

Aha

Alá

Len

Gly

Gye

Seri

Val

Gya

Aap

ινί'

Phe

Pro

13S Í3U 140

Giri Pro

145 <210> 12 <211 > 174 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 12

Ser Giy Gly Gly Val Var Gin Pro Gly Arg Ser len Arg Leu Ser Gye

1

5

lö

15

Alá

Ser Gly

PHe

Thr

Aha

Ser

Tyr

g i y

Val

His

••1

Vs.l

Ara

20

2. 5

30

Gin.

.Alit

Pro GIs-

Ays

Gr V

Lee

Gin

Trp

V a 1

Alá

Val

IJ.e

Trp

T y Ι-

Asp

ii

4 0

45

Gly

Ser

Asr· Lys

Tyr

Ur

AJ. a

A.sp

Ser

Var

Lys

Gly

Ar 0

Pi’ií:

ΤΟ r

He

50:

55

60

Ser

Ara

Asp Asn

Ser

Pys

Ser-

llhr

Len

lyr

Lee

Gra

Mer.

Asn

Ser

Len

6 5

IC-

7 5

0 0

Ary

AlS

Gin. Asp

Thr

AI a

ν' .3 1

Tyr

Cys

Alá

Ara

Asp

Ser

Tyr

05

00

35

Asp

Fhe

lep Se.::

Sly

Ara

Gly

Sly

He a

Asp

Val,

Trp

Gly

Gin.

Gly

Thr

100

1.05

110

Tar

Val

Thr Val

Ser

Alá

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Are

11.5

120

1715

Len

Al a

Pro Cys

.Ο·-::!-.'

Ary

Ser

Tar

Ser

Gin

Ser

Thr

Alá

rsa

Gly

13S

135

110

Cys

70 <33

Val Lys

Asp

lyr

Phe

Tre

Gin

Pro

Vei

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

14 5

ISO

155

160

Ser

Gly

Alá Leu

Thr

Ser

Gly

Val

H.:

Thr

Ohe

Pro

ara

Val·

165

17 0

<210> 13

<21

1> 163

<212> FEHÉRJE

<21

3 > Humán

<400> 13

Ara

A la

Ser

Giy 15

The

Vs71 1

Gin

Pro

Gly

Ara 5

Ser

Len

Arg

Let;

Ser 10

Cys

Thr

Pa e

Ser

A s a

Tyr

Alá

Mer

Hí 3

Trp

Val

Arg

Gin

A7is

P r o

Gly

Gye

20

2:5

7H

Gly

jle-'e

Gin

Trp

Ve 1

Val

He

Trp

His

Asp

Gly

Asn

A sn

Lys

Tyr

55

40

4 5

Tyr

Al a

Gin

Ser

V a 1

Lys

Gly

Arg

The

Tar

He

Ser

Ara

Asp

Asr

Ser

50

55

60

Lys

A.s a

Thr

Len

Tyr

Ler

Gin

Get

Asn.

Ser

:..ao

A r g

Alá

G7:.n

Asp

Tar

65

70

75

80

Alá

Var

Tyr

Gys

Alá

Arg

A sp

Gin

Gly

Tar

Gly

Trp

Tyr

Gly

5 δΟ 05

Phe

Asp

?h«:

Ho 105

Gly

Gin

Giy

Thr

Vau 135

Vei Tar

Val

Ser

Ser 113

Alá

Ser

Τηχ·

Lys

H y

Pro

Ser

Val

Lae

pro

Les

Alá

Pro

Gys

Sex?

Arc

Ser

Thr

115

:.2G

135

Sa-r

OTS

Ser

Thr

Alá

AH

Len

Gly

Cys

Lee

Val

Lys

Asp

H

Phe

Pro

135

14 6

Glx:

Pro

Val

Thr

Val

Se r:

Top

len

Ser

Gly

Alá

Len

TAr

Ser

Gly

val

145

136

155

150

SÓS

Tar

Pae

<210> 14

<211> 235

<212> FEHÉRJE

<213> Humán

<400> 14

Ifet

Gin Vhr Pro

Alá.

ΟόΓ?

Le n

Ven

Lse

Ven

Len

Les

Lea

Trp

Les

Pro

I

E

10

15

Asp

Thr Thr Gly

Gin

He

Val

Les

Tar

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Len

Ser

16

35

30

Len

Ser Pro Gly

ele

Arg

Ara

Thr

Les

Ser

Cys

Arg

Alá

Ser

Gin

Ser

35

46

45

He

Sex Ser Ser

Phe

Lexi

A x A

Trp

Tyr

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Ara

53

55

SS

Pro

Arg Lest Len

lle

Tyr

Gly

Alá

Ser

Arg

Alá

Thr

Gly

He

Pro

δ 5

76

75

Sü

Asp

Arg Phe: Ser

Gly

Ser

oly

Ser

Gly

Tar

Asp

Pae

Tar

Leüt

Var

He

85

56

95

S e r

Arg Lea Glx;

Pro

Gls

Asp

Pae

Alá

Val

Tyr

Gye

Gin

Tyr

100

165

llö

Oly

Ihr Ser Pm

rrp

Vfer

Ptxe

Gly

GLa

Gly

Tar

lye

Var

Gls

He

Lys

115

120

125

Arg

Tar Val Alá

Alá

Pro

Ser

Val

Phe

He

Lae

Pro

Ser

Asp

G1 o

130

155

140

134

Gin Len Lye 145

Ser

Gív

Thr 150

ma.

Ser Vei Vei

Cys 155

Len

Len;

Asn Aon

Phe 160

Tyr

Pro Arg

Gin

Ais

nys

Vái

Gin

Trp

Lys

Ve 1

Asp

Asn

Ais

Len

ein

Í65

110

115

Ser

Giy Asn

Ser

Gin

GO.P

Ser

Vai

Thr

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

130

LOS

1SÜ

Thr

Tyr Ser

Len

Ser

Thr

Lan

Thr

Len

Ser

Lys

3.1 a

Asp

Tyr

Gin

1S5

200

205

Lys

Kis Lys

Vali,

Tyr

Aia

Cys

Gin

Vei

Thr

His

Gin

Giy

Len

Ser

Se r:

210

SIS

220

Pro

vei Thr

oy*

Ser

Gin

Asr:

Arg

Giy

Gin

Cys

O ·'? c ώώΟ

533

235

<210

> 15

<211 >233

<212>

FEHÉRJE

<213>

Humán

<4C

?o>

15

ihat

Gi n

Thr

Pro

Ai a

Sin

Len

Phe

Len

Les

Len

Trp

Len

Pro

1

h;

10

15

Aep

Thr

Giy

Gin

iie

vei

Len

Thr

Gin

Ser

Pro

Giy

Thr

Len

Ser

20

25

30

Len

Ser;

Prcí

Giy

Gin

Arg·

Als

Thr

Len

Ser

Gye

Arg

The

Ser

Tel

Ser

35

10

45

Ser

Sex-

Tyr

Leu

Alá

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

G i y

Gin

Aia

Pro

Arg

50

55

00

Len

11 e

Tyr

Giy

Aie.

Ser

Arg

Alá

Thr

Giy

Pia

Pro

Asp

Arg

55

72

75

§0

Phe

Ser

Giy

Ser

Giy

Ser

Giy

r ar-

Asp

Phe

Thr

Len

Thr

11 a

Ser

Arg

SS

90

05

Len

Gin

Pro·

Gin

Asp

Pite

Ais

Val

Tyr

Cys

Gin

Tyr

Giy

T.ie

100

105

110

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Giy

Gey

Thr

Lys

Vei

Gin

ii©

Lys

Arg

Thr

115

120

125

Vei

Alá

Ais.

Pro

Ser

ve 1

Phe

ele

Phe

Pro

Ser

Asp

Gin

Len

130

135

140

Lys Ser	Gly 1:5’'	Aha	Ser	Val. val	Cys Fen	le a Asn	Asn Fhe	I va-	Pro
145			159			158			109
Arg Gin	SÓ. S LíV:>	val	Gin	Trp Fys	Val Asp	Asn Alá	Fen Gin	ler	G i y
		?l 65			179			175
Asn ver	Gint Gin	Ser	Val.	H 21a	Gin Asp	Ser lys	Asp Ser	T:hr	Tyr
	123				185		130
S e r Le a	Ser- Ser	Thr	Lee	Trr lse	Ser Fys	Alá Asp	Tyr Gin	Lys	His
	1 95			209			295
Lys Val.	Tyr Alá	Cys	Gin	Val Thr	Kis Gin	Gly Fen	Ser Ser	Pro	Val
210				.215		220
Tar Lys	Ser Fhe	Asn	Arg	Gly Gin	Cys
225			250
<210> 16
<211> 139
<21	. 2> FEHÉRJE
<213> Humán.

<4C

iÖ>

16

Oly

Tar

Len

Ser

Fen

Ser-

Pro

Gi y

Gin

Arg

Ara

Thr

ÍjÖEi

Ser

Cys

Arg

1

5

19

15

Alá

Ser

G.Fíi

Sa.r

Val

Ser

Tyr

Len

Ai s

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

20

39

Gly

Gin

Alá

Fro

Arg

Fen

Len

He

Tyr

Gin

AH

Ser

Se r

Arg

Alá

Thr

35

40

45

Gly

He

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

m y

Ser

Gly

Ser

ery

Thr

Asp

Fhe

Thr

50

55

90

Le a

Thr

He:

Ser

Arg

Len

Gin

Pro

Gin

.asp

Phe

a.r e

Val.

Tyr

Cys

65

70

7 7

SG

Gin

ni n

Tyr

Gly

Arg

Far

P r o

Fhe

Thr

Fhe

Gly

Pr o

Gly

Thr

nys

Val

55

30

95

Asp

He

Fys

Arg

Thr

vai

Alá

Pro

Ser

Val

Píré

He

Pha

F r o

Pro

100

FOS

110

Ser

Asp

Gin

Len

Fys

Ser

Gly

Thr

Alá

Ser

Val

val

Cys

Len

Far

13.5

12 0

125

Asn

As n

Phe

lyr

Fro

Arg

Gin

A i a.

Fys

Val.

Gin

135

<210> 17

Í36 <211> 234 <212> FEHÉRJE <213> Humán <40G> 17

Met 1

Gla

Thr

Arc

A Is 3

Gla

La

Lee

Ahe

Le a 10

Les

Lea

Trp

Lea 15

Are

Asp

Thr

Gly

Gla

He

Ser

Lee

Thr

Gin

Ser

Ara

G ly

Thr

Len

Ser

20

25

39

Le n

Ser

Arc

Gly

G la

Ars

Ara

Thr

Les

Ser

Cys

Arg

Alá

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Va 1

Ser

Se:

Tyr

Lee

Al.s

Hp

H

Gla

Gin

L ya

Arc

Gry

Gí a

Alá

Arc

55

60

Arg

Ara

Les

ele

Tyr

Gly

Vei

Ser

Arg

Ara

Thr

Gly

1'l.e

Arc

Asp

65

70

7 5

80

Ary

Lee

Ser

G i y

Ser

Gly

Se r

Gly

Thr

Asp

Ahe

Thr

Les

Thr

He

Se r

35

39

95

Arg

Les

G^:H

ere

Gin

Asp

Aha

Alá

Va.l

Tyr

Cys

Gin

Gr.!,

Tyr

Gly

sas

105

110'

He

Ser

Sre

Ahe

Thr

Ahe

er y

Arc

elv

Thr

Lys

Val

.Asp

Tle

Lys

Arg

115

12 0

125

Thr

Vei

A1 a

Alá

A r e

Ser

Va 1

Ahe

He

Ahe

A re

Ara

Ser

Asp

Gla

Gin

130

135

140

1:-=:1.:

:.//S

Ser

Gry

Thr

Ara

Ser

Vei

VsA

Cys

Lea

Lett

Ase

Ássa

Ahe

Tyr

145

150

15 5

ISO

Arc

Arg

Gr a

Aia

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Var

Asp

Asn

Alá

Lea

Gin

Ser

165

r0

175

Gly

Áss

Ser

Gin

G1 a

Sex'

Va 1

Thr

Gin

Asp

Ser

Lys?

Asp

S e r

Thr

ISO

12 5

1.20

Tyr

Ser

Les

Ser

Thr

Les

Thr

Les

Ser

Lys

Alá

Asp ·> C F

Tyr

Gr n

Lys

his

Lys

Val

Tyr

Alá

Cys

Gin

Val.

Thr

Ara

Grt

Gly

Z.. V-U Lee

Ser

Arc

210

215

220

Vsl

Thr

Lys

Ser

Ahe

Asn

Ara

Gly

illa

Gye

•y > £

230

<21G> 18 <211> 152 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 18

Gin

Ser

Pro Ser

S e r

Lee

Ser

Alá

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lie

1

10

15

Thr

Cys

Arg Alá

Sár

Sin

Ser

He

.Asn

Thr

Tyr

Len

He

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro Gly

Cys

Ale

Pro

Asn

Phe

Len

1 Le

Ser

Alá

TAr

S e r

1 le

55

4C

45

Le-u

Cin

Ser Gly

Vei

Pro

S e r

Arg

Phe

Arg

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

55

60

As n

Phe

Thr Lse

Thr

Ha

Asn

Ser

Len

Pás

Pro

Gin

Asp

Phe

Alá

Thr

65

70

75

80:

Tyr

Cys Gin

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

15

30

35

Thr

Cys

Val Asp

lls

Cys

Arg

Thr

Val

Ara

Alá

Pro

Ser

Val

Phe

He

r η o

105

110

Phe

Pro

Pro Sex^-

Asp

Gla

Gin

Les

cys

Ser

Gly

Thr

Ai a

Ser

Val

vei

115

ISO

125

Cys

Lee

Len A,«η

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Gin

Alá

Ly ^s

Ή

Gin.

Trp

r. ya

131)

13 5

140

y··:.

Asp

Asn Alá

Len

Gin

Ser

Gly

145

150

<210> 19

<21

. 1 > 142

<212> FEHÉRJE

<213> Humán

<4S0>:

IS

Ser

Pro Gly

Thr

Len

Ser

Len

Ser

Pro

Gly

Gin

Arg

Alá

Thr Len

Ser

1

5

10

15

Gye

Arg Alá

Ser

.1:0

Ser

He

Ser

Asn

Phe

Len

A), a

Trp Tyr

em

2:0

25

30

O ... n

Lys Pro

Gxy

Gin

Alá

Pro

Arg

Len

Tie

Tyr

Arg

Pro Ser

Ser

35

•10

45

Arg

.Ara The

Gly

Ha

Pro

Asp

Ser

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser Gly

Thr-

LG

5 S

60

.Asp

Pne

Tbr

Le®

Tbr

II®

Ser

Arg

Len.

Gin

Pro

Gin

As®

Pb®:

Alá

Lee

65

75

g 0

Ϊνϊ-

Tyr

Gye

Gin

Tyr

Gly

Tbr

Ser

Pro

Pb®

Tbr

Pb®

Gly

Pro

o ry

3o

30^

35

Tbr

Gye

V.e=0L

Asp

II®

Lys

Arg

Tbr

Sál

Alá

Pro

Ser

Val

Pbe

11®

10S

.155

11Q

Phe

Irs

Pro

Ser

Asp

Slu

Gin

Lee

Lys

Ser-

y

Tbr

Ars

Ser

Ve 1

Var

HL

no

125

Cys

Len

Asn

SÍI

Pb®

Tyr

Pro

Arg

Gin

Alá

Lys

Vei

Gin

13S 135 140 <210> 20 <211> 155 <2Ι.2> FEHÉRJE <213> Humán <400> 20

Ser 1

Pro

Asp

Pbe

Gin 5

Ser

Vei

Tbr

P:r í?)

Lys 10

Gin

Lys

Val

Tbr

He 15

Tbr

Gye

Arg

Alá

Ser

Gin

Ser

11®

Gly

Ser

Lee

Hls

Trp

Tyr

Gin

20

25

50

Lys

Pro

Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

ne®

Le®

He

Lys

Tyr

Alá

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Pb®

.Ser

Gly

Var

Pro

Ser

Arc?

Pb®

Ser

Gly

S ® r

Gly

Ser

Gly

Tbr

Asp

50

rr ·τ

60

Pb®

Tbr

Le®

Tbr

11®

As.fi. 5 .'A

Ser

Les.

Sin.

Ara

Glb '4

Asp

Ara

Alá

TÁV

Tyr :O :·'*>

·..··..* Tyr

Cys

His

Gin

Ser

V V S c r

Ser

hsa

Pro

Lee

.i> W

Pbe

Gly

U ’.J Air

SS

30

35

Lys

Var

Gin

11®

Lys

Arg

Tbr

Val

Ara

Pro

Ser

Var

Phe

He

Pb®

loö

10:5

115

Π9

Pro

Ser 115

Asp

Glo

Gin

Leó

Lys 120

Ser

Giy

Tar

A.ia

Ser 125

Vei

Var

Cys

Len

Leó.

Aon

A.an

Lhe

Tyr

Pro

.é.C. G

Gin

.Ai e

i.'Ve

Vei

Gin

5r_P

Lys

Var

ISO

135

140

Asp

Asn

Ara

Len

Gin

Ser

Giy

Aon

Ser

Gin

Glu

145

15S

155

<210> 21 <211> 146 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 21

e r n

Ser-

Pro

Giy

TAr

Len

Ser

len

Ser

Pro

G i y

Gr/o

Arik

Aie

Thr

Leó

1

5

10

15

Ser

Gye

Are

lila 20

Ser

Gin

Ser

Vai

Ser; 25:

Ser

Tyr

Leó

Aie

Orr SS

Tyr

Gr n

Gin

Lys

Pro 35

Giy

Gin

Alá

Pro

Arg 40

Len

Lea

He

Tyr

Giy 55

Ai a

Ser

Arg

Ai a 50

TAr

Giy

5 le

Prn

Asp· n 4

Arg

PAe

Ser

Gr y

Sér 00

Giy

Ser

Giy

TAr

.Asp 55

Phe

Thr

Len

Lhr

He 70

Ser

Arg

len

Glo

Pro 75

G k 0.

Asp

Pne

A.ia

Vai 50

Tyr

Cye

G r n

Gin ig

Tyr

Giy

Arg

Ser

Pro 50

ebe

Thr

rb.e

Giy

Pro 55

Giy

Thr

Lys

Vai

Asp 100

I re

Lys

Ar g

Thr

Vei 105

Ars.

Ara

Pro

Ser?

Vai r 10

pne

rls

Pbe

Pro

Pro 115

Ser

Asp

Gin

Leo 120

Lys

Ser

Giy

Thr

Ara 125

Ser

Vai

Gye

Lee 130

Len

Asn

Pne

ryr 135

Pro

Arg

Gi a

Alá

Lys 140^:

Vai

Gin

rrp

Lys

Giy Giy

5 <210> 22 <211> 139 <212> FEHÉRJE <213> Humán

140 <400> 22

Pro 1

Ser Ser

Len

Ser r

Ara

Ser

Val

ül y

Asp 10

Ara

Val

Thr

He

Thr 15

cys

Arg

Ma Ser

Gin

Ser

lle

Asn

Ser

Tyr

Len;

Asp

Trp

Tyr

Gin

Lys

e-;

··; v

7

v

-A

Pro

Sly .Lys

Alá

Pro

Lys

Len

He

Tyr

Alá

A1 a

Ser

Len

Gm

35

4 Q:

45

Ser

Gly Val

Pro

Ser

Arg

The

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

50

55

eo

Thr

Lee Thr

He

Ser

Len

Cl n

Pro

Gin

Aep

Phe

Alá

Thr

Tyr

05

70

15

50

Cys

Gin Gin

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Tar

Phe

Gly

Pro

ni y

Thr

Lys

S 5

00

35

ver

Gin Tln

Lys

Arg

Thr

Vai

Ar a:

Alá

Pr o

Ser

Val

Ph e

He

Phe

Pro

ICO

105

H0

Pro

Ser Asp

Gin

n m

Len

Lys

Se r

G.ly

Thr

Alá

Ser

Val

Cys

Len

115

12Q

12 5

Len

Asn Asn

The

Tyr

Pro

Arg

Gin

Alá.

Lys

Val

130

135

<210>

23

<21 1> 134

<212> FEHÉRJE

<213>3

Humán

<4ÖO> 23

TAr

Glo

Ser

Pro

Ser

Len

Ser

Alá

Ser

Val

G.ly

Asp

Arg

Val

Th.r

1

5

10

15

He

Thr

Cys

.Arg

Ara

Ser

Gin

Ase

He

Ser

Arc-

Tyr

Lan

Aso

Trp

Tyr

Hl

3Q

G j-Fi

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Alá

Pro

Lys

Ph e

len

T.i.e

Tyr

Vei

Alá

Ser

35

40

45

3 is

Le a 5ö

G la

Ser

Gly

bal

Pro 55

Ser

e 1. y

The

Ser

Ais 60

Ser

Gly

Ser

Gly

?-ro

Asp

PiiG

Tar

Tas

Thr

He

Ser

Len

Gin

Pro

Gih

Asp

Phe

Ala

65

73

75

§0

Tar

Tyr

Gys

G la

Gla

Ser

Tyr

Ser

Tar

Tre

Phe

TLr:

Pa a

Gly

Pro

35

90

55

Gly

Tar:

.LyS

bal

Asp

He

Lys

Arg

Tar:

Va 1

AH

Alá

Pro

Ser

bal

Phe

IGG

105

113

ae

The

Pro

Sár

Asp

Gla

Gin

Lse

Lys

Ser'

Gly

H

Aia

Ser

bal

115

125

bal

C ys:

Len

Las

Asa

ISO <210> 24 <211> 150 <212> FEHÉRJE <213> Humán

<400> :

24

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser'

Ser

Lee

Ser

Aha

Ser

bal

Gly

A.op

Arg

bal.

Thr

1

5

10

H

He

Thr

Gys

Arg

A. ha

Ser'

Gla

Se r

He

Cys

Asn

Tyr

Len

Aon

Trp

Tyr

20

25

30

Gla

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Aha

Pro

Arg

bal

Len

He

Tyr

Ais

Alá,

Ser

.33

40

4 5

Ser

Lee.

Gla

Gly

bal

Pro

Ser

Arg

Fiié

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

50

SS

60

He

Asp

Cys

Tar

Len

The

Ser

Len

Cin

Pro

Gin

Asp

Phe

Ais

05

73

: Z‘

30

Tar

Tyr

Gys

Gin

Cin

Ser

Tyr

He

Thr

Pro

Phe

Tar

Phe

Gly

Pro

3:5

90

35

G1 y

Thr

Arg

bal

Aep

1 le

Gin

Arg

Thr:

bal

;:i·

.Alá

Pro

Ser

bei

Phe

100

105

ne

He

Pás

Pro

Ser

Asp

Gla

Gin

Len

Lys

Ser

Gly

Thr

Alá

Ser

bal

US

120

.·. Z'

bal

Gys

Len

Asn

Asa

Phe

Tyr

Pro

Arg

Ara

Lys

bal

Gla

Trp

130

135

140

142

Lys Val Asp Asn Alá Tyr

145 ISO <21ö> 25 <211> 139 <212> FEHÉRJE <213> Humán <4öí>> 25

Pro

Les

Ser

Len

Pro

Val

Thr

Lee

Gly

Gin

Pro

Aha

Ser

The

5 e r

Gys

1

5

10

15

Arg

Ser

Gin

Ser

Lee

Vai

Tyr

Ser

Asp

Giy

Asn

Thr

Tyr

Len

Asn

20

·.' S', X. X

30

Trp

The

Gin

Arg

Pro

ί i y

Gin

Ser'

Pro

Arg

Le a

He

Tyr

Lya^:

35

Vő

4 5

Val

Ser

Asn

Trp

Asp

Ser

ciy

V a. i

Pro

Asp

Arg

Phe_:

Ser

Gly

Ser

Gly

SO

55

GO

S e r

Gly

Vhr

Asp

The

Thr

Len

ry s

He

Ser

Arg

Vai

Gin

Ara

Gin

As;p

65

TG

'7 5

SÓ

Val

Gly

Val.

Tyr

Cys

Let

Gin

Gly

Ser·

His

Trp

Pro

Thr

Phe

85

90

55

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Gin

Ti e

Lys

Arg

Thr

Val.

Alá

Pro·

Ser

löö

105

Ilii

Va 1

The

He

The

Pro

Ser

Asp

Gla

Gin

Lea

LyS:

Ser

Gly

Th.r

a i a

115

120

125

Ser

Val

Gys

Lea

Lee

As π

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

<210> 26 <211> 133 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 26 >43

Pro

Gly

Gin

Pro

Alá

Ser

He

Ser

Gys

Arg

Se r

Ser

Gin

Ser

Len

1

5

10:

15

Ars

Ser

Asn

Gly

Tyr

Asn

Tyr

Len

Asp

Trp

Tyr

Len

Gin

Lys

Pro

Gly

2Ö

25

30

Gin

Ser

Pro

Gin

Lan

Le n

He

Tyr

Len

Gly

Ser

Asn

Arg

Alá

Ser

Gly

30

10

15

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

:Se r

Gly

Ser-

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Len

52

SS

60

Lys

Lén

S eir

Arq

Val

Gin

Alá

Gin

Asp

Val

öj.y

Val

Tyr

Gye

Mer

65

70

75

80

,133

Alá

Len

Gin

Thr

Pro

Len

Tár

Phe

Gly

Thr

Lys

Var.

Gin

8 5:

50

55

lis

Lys

Arp

Thr

Val

Alá

el e

Pro

Ser

Val

Phe

He

Phe

Pro

Ser

löö

105

110

Asp

Gin

ói:’;

Len

Lys

Ser

i.T.í y

Thr

Alá

Ser

ee 1

Val.

Cya

Len

Asn.

1 IS:

120

125:

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arp

130

<2

10>

27

<21

1>

364

<21

2>

tERJE

<21

3>

Humán

<40Ö> 27

Két

Gly

Val

Lem

Thr'

Gin

Arg

Thr

Len

Ser

Len

Val

Len

Ar s.

1

5

10

15

Len

PliO:

Pro

Ser

Két

Ara

Ser

Kel

Alá

Mer.

Hi.s

Val

Ara

Gin

Pro

20

30

Ara

Var

Var a r

Len:

AI a

Ser

Arg .< a

Gly

1.8

Ara

Ser

Phe .«: r

Var.

Gya

Gin

Tyr

Ara

Ser

Pro

Gr y

Lys

AG.a

Thr

aló

Val

.Arg

Val

a a Thr

Var.

Len

Arg

50

55

60

Gin

Alá

Aap

Ser

Gin.

Val

Thr

Gin

Val

Gye

Ara

Alá

Thr

Tyr

Mát

heh

SS

70

75

80

Gly

Asn

Gin

Len

Thr

Phe

Lem

Aap

Asp

Ser

11 s

Gye

Thr:

Gly

Th r

Ser

SS 50 SS

144

Ser

Giy Aan

GI n 100:

Vei

Aan

Lei.;

Thr

lie 105

Gin

Giy

Len

.Arg:

Al.a no

Met

Asp

Thr

Giy

Len

Tyr

Tie

Gye

Lys

Var

Gin

Len

Mar

Tyr

Pro

Tyr

1 25

129

125

Tyr

Len

Giy

2 le

Giy

Asn

Gi y

Tin-

Gin

Ils

Tyr

Var

lie

Asp

Pro

Gin

130

235

1:1

Pro

Gye

Pro

Asp

Ser

Asp

Len

óin

Sly

Aia

Pro

Ser

Var

Phe

Len

Phe

14 5

150

155

169

Pro

Lys

Pr o

ry.s

Asp

Thr

Len

Get

Tia

Ser

Arg

Thr

Pro

Gin

Vai

165

170

175

Thr

Gye

Vai

Var

As p-

Vai.

Se r

Kis

Gin

Asp

pro

Gin

Van

Lys

Pha

130

155

199

Asn

Trp

Tyr

Vai.

Asp

Gry

Var

Gin

Var

Sis;

Asn

AT. a

Lys:

Thr

Lys

Pro

105

200:

205

Arg

Gin.

Gin

Tyr·

Aon

Sár

Thr

Tyr

Arg

Var

Ser

Var

Len

Thr

220

215

220

Vai

Lein

H i a

Gin

Asp

Trp

Len

Asn

Gi y

Lys

Gin

Tyr·

Lys

Cys

Lys

Vai

225

23 ö

235

24:0

Ser

Asn

rys

Ara

Len

Pro

T re-

Pro

Tle

Gi n

Lys

Thr

Tie

Ser

Lys

.ara

245

260^:

255

Lys

Sly

Gin

Pro

Arg;

Gin

pró

Lön

Vai

Tyr

Thr

Len

Pro·

Pro

Ser

Arg

269

265

270

As o

Gi.n

Le o.

Thr

Lys

Asn

Gin

Vai

Ser

Len

Thr

Cys

...ar

Vai

Lys

Giy

'2 4

230

28 5

Phe

Tyr

Pro

Gar

Asp

lla

Aia

V:3 L

Gin

Trp

Gin

Ser

A.s n

Giy

Orr. n

Pro

2 90

235

300

Gin

Asn

Aan

Tyr

Lys

Thr

Pro

v a r.

Len

Asp

Ser

.Asp

Giy

Ser

305

310

315

329

Phe

Len

Tyr

Ser

Lys

Len

Thx

Va.i

Asp

Lys

Se r.

Ara

Trp

Gin.

Gin

335

330

335

Giy

Asn

vei

Pre

Sex-

Cys

Ser

Vai

Mer.

His

Gr n

Aia

Lan

Kis

Aan

His

340

545

359

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Lan

Ser

Lan

Ser

Pro

Gry

Lys

355 360 <210> 28 <211> 12 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 28

Vet Pás Var ALa Glí: Pro· Alá Vei Val Lee Alá Ser 1 S 10 <21.0> 29 <211> 120 <2T2> FEHÉRJE <213> Humán <400> 29

Vet 1

Kis

Vs 1

Alá

G r a s

Pro

Aia

Var

Val

Lse lö

Ara

Ser

Ser' Arg

Gly L5

11®

Alá

Ser

PA®

Vei

Cys

Gto

Tyr

Als

Ser

Pro

Gly

Lys

Ara

Thr

Gle

Val

26·

25

30

Arg

Val

Tat:

Val

les

Arg

Gle

Aia

Ase

Ser

Gle

Val

Thr

Gle

Val

Cys

15

Aö

15

Alá

Ara

Thr

Tyr

Siet.

Vet;

Gly

Asa

ej. e

Lee

Thr

Phe

Lee

Asp

Aso

Ser

50

κ r.· ...· .j

<VJ

rie

ey a

Vfer

Gly

Thr

Se r

Ser

Gly

Asa

Gle

Var

Ase

Lee

Thr

Tle

Gla

SS

7 0'

7 5

80

oly

Lee

Aerg

Aia

Vet

Ase

Thr

Giy

Ii®e

Vyr

lle

Cys

Lys

Val

Gle

Lee·

85

50

95

Mer

Tyr

Px:o·

Pro

Tyr

Lee

Gly

11®

Gly

Ase

ciy

Thr

Gr a

Tle

LÖO

105

110

Tyr

Val

He

.Asp

Pro

ere

Pro

Cys

115

120

<210> 30 <211> 11 <2I2>FEHÉRJE <213> Humán <400> 30

14-6

Mefc öle Val Alá Gin Pro Ai* Vei Val Len Alá· 1 5 10 <210> 31 <211> 89 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 31

n i y

Vei.

Ve 1

Gin

Pro:

Gly

•Ír g

Ser

Len

Árg

Len

Ser

Gys

Ál a

öle

Ser

1

10

15

n 1 y

Pöe

Tör

Phe

Se r

Se ü

Tyr

Gly

Kér.

Kis

Trp

Vei

Árg

Ga.a

Alá

Pro

20

y -

20

Gly

í.í y a

Gly

Len

Gin

Tra

Val

Ál a

Val

He

Trp

Tyr

ÁSp

Gly

Ser

Ásn

IS

GO

4 r

Lys

Tyr

Ál a

ÁSp

Ser

Var

Lys

Gly

Árg

Pöe

Tör

Pia

Ser

Árg

ÁSp'

10

55

SQ

ás a

Ser

Lys

Asn

Tör

Len

Tyr

Len

Gin

P5er

ás n

Se r

Len

Árg

Ál a

Gin

65

70

75

Síi

A.rp

Tör

Áia

Tel

Tyr

Cys

Ál a

Árg

8 5

<210> 32 <211> 169 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 32

Gr y

Val

Gla

Pro

Gly

Árg

Ser

Len

Árg

Len

Ser

Cys

Álé.

Ál a

Ser

1

5

10

15

Gly

Pöe

Tör

Pöe

Ser

Tyr

Gly

Get

Öli?

Trp

Val

Arg

Gla

Ál*

Prn

20

25

20

Gly

Lys

Gly

Len

Gla

Trp

Vei

Ál a

Var

Tie

Trp

Tyr

Ásp

Gly

Ser

Ássa

25

40

4 5

Lys

Tyr

Áia

ásd

Ser

Var

Lys

el-Y

Árg

Pöe

Tar

r le

Sem

Arg

ÁSp

5 0

55

60

Asn	Ser	Lys .Asn Thr	Len	Tyr	Lee!	Gin Mer Asn	Ser	Len	Arg	Al a	Gin
65			73			75					>30
Asp	7h ·:	Alá Val Tyr	Tyr	Cys:	Ara	Arg Gly Alá.	Arq	He	1 le	Thr	Pro
		85				80				95
Gye	Cet	Asp val Trp	n r y	Gin	Gly	Thr Thr- Val	Tar	Val	Ser	Ser	Al £
		168				185			118
Ser	Thr	Lys Gly Pro	Ser	Val	The	Pro Lee; Alá	Pro	Cys	Ser	Arg	Se r
		11 5			188			125
The	Ser'	Gin Ser Thr:	A la	Alá	Leai	Gly Cys Len.	Vei	Lys	Asp	Tyr	The
	138			155			148
Pro	Gin	Pro Val Thr	Vei	Ser	Trp:	Asn Ser Gry	Alá	Len	Thr	Ser	ciy
14 5			158			155					158
Val	Ti. a	Thr' Phe 8re	Gla	Val	Len	Gin
		188
	<21Ö> 33
	<211> 167
	<212> FEHÉRJE
	<21	3> Humán

<4C

K)> ;

33

Gly

Val

Var

Gin

Lm

:. :cV

Arg

Ser.'

Len

Arg

Len

Ser

Cys

Val

Ara

Ser

1

5

18

15

Gly

The

Thr

The

Ser

S e r

his

Gry

liet

His

Trp

Val

Arg

Gin

Alá

Ha

28

25

30

Gly

Lys

Gly

Len

Gln

Tép

Val

AI,a

Val

1 le

Trp

Tyr

Asp

Gry

Arg

Asn.

35

70

15

Lys

Tyr

Alá

Asp:

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

The

Thr

1 le

Ser

Arg

.Asp

35

55

85

Asn

Ser'

Lys

A;; n

Thr

Laet

Phe

Lan

Gin

Mát

ÁSS

Ser

Len

Arg

Alá

Gin

85

78

75

3 0

Asp

Tfer

Alá

Val

Tyr

cys

Ara

Arg

Gly

Gr y

His

Lhe

Gry

Pro

He

SS

90

25

Asp

Tyr

Trp

Gry

Gin

Gly

Thr

Leír

Val

Thr

Val

Ser

Ara

Ser

Thr

180

185

118

Í48

Lys	Giy Pro	Per	Tál	Phe	Pro	Len
	115					130
Gin-	Ser Thr	Ara	Aia	Len	Giy	Cya
	130				135
re ο	Vei. Thr	Vai	Se r	Trp	Asr	Ser
145				i5íi
Thr	Phe Pro	Air	Vai	Len;	Gin
			165
	<210>	34
	<211>	166
	<2I2>	FEHÉRJE .í. A 3, ÜvJl\.K>· JLA>
	<213> Humán

Alá	Pro	Cys	Ser	Arg Ser 125	Thr	Ser
Len	Vai	Lys	Asp 140	Tyr Phe	Pro	Gin
Giy	Ara	Len 155	Thr	Ser Giy	Vai	Kis 160

Giy	<4ÖO> 34 Vei Vei Gin.	Pro a	Giy	Arg	Ser
Giy	Phe	Thr	Phe ·*? ;·>.	Ser'	Asn	Tyr	Gi y
Giy	Lys	Oly	c. v Len	Gin	Trp	v&i	Aia
Lys	Kis	35 Tyr	Giy	Asp	Ser-	Vei	40 Lys
Asn	55 Ser	lys	Asn	Thr	ien	55 Tyr	Len
•55 Asp	Thr	AÍS_:	Vei	ly: É F	70; Tyr	Cys	Aia
Phe	Asp	Tyr;	Trp	Oly	Gin	Giy	Thr
Thr	ry s	Giy	100 P ro	Ser	Vai	Phe	Pro
Ser	Gin	115 Ser	Thr	Alá	Aia	Lee	ISO Giy
Gin	130 Pro	Vei	Thr	Vei	Ser	135 Trp	Asn
115 H i i?	Tor	Phe	Pro	Alá 105	ISO Var

Len	Arg só	Len	Ser	Cys	Thr	Aia 1.5	Ser
íhei 25	55 s	Trp	Vai	Arg	Gin 50	Aia	Pro
Vai	11 e	Trp	Tyr	Asp 45	Giy	Ser-	Ami
La y	Arg	Phe	Thr a o	Tle	Ser	Ser	Asp
Gin	hét	Asn, 75	Ser	Len	Ar g	Ara	Gi a 80;
Arg	Giy 90	Lm	Arg	Len	G.i.y	S érné	Tyr
Len 105	Vai	Thr	Vei	Ser	Ser 11.0	Aia	Ser
Len	Alá	Pro	Cys	Ser 125	Ar g	Ser	Thr
Cys	Len	Vai	Lys 140	Asp	Tyr	Phe	Pre
Ser	Giy	Ais 155	Len	Thr	Ser	Giy	Vei 160

<210> 35

149 <2Π> 167 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 35

ö.i.y i

Val

Gin Fro 5

Gly

Arg

Ser

Len

Arg Lee Ser 10

Cys

Fal

Aia 5.5

3 ¾ 2?

Gly

Fhe

1 le

Fhe

Ser

Hls

Gly

He

Fis

Trp

Va 1

Arg

Sin

Aia

Fro

10

25

H

Gly

Lys

Oly

Len

Gin

Trp

Fel

Aia

Fal

He

Trp

Tyr

Asp

Gly

Arg

Asn

SS

40

4 5

Lys

Asp

Tyr

Al.a

Asp

Ser

Va 1

Lys

Gly

Arg

Fhe

Thr

Tle

Ser

Arg

Asp:

50

:r

00:

Asn

Ser

lys

Asn

Thr

Len

Tyr

Len

Gin

Lel

Asn

3 e r;

Lse:

Arg

A. la

Sin

SS

70

7:5

8 fi

Asp

Tár

Alá

Va 1

Tyr

Cys

Aia

Arg

Fai

Alá

Pre

Len

•Πλ-

Pro

Len

85

50

95

Asp

Tyr

Trp

V

Gin

Gly

Thr

Len

Fal

Thr

Fal

Ser

ΑΙ s

Ser

Thr

ISO

105

ne

Lys

Gly

Fre

Ser

Val

Phe

Frn

Len

Alá

Fen

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

115

120

125

Gin.

Ser

Thr

Alá

Len

Gly

Cys

Len.

Val.

Lys

Asp

Tyr

Fhe

Pro

Gin.

ISO

135

iifi

F r n

Fal

Thr

V.al

Ser

Trp

Asn

Ser

üi y

Alá

Len

Thr

Ser

Gly

Fai

Hrs

145

ISO:

155

160

Thr

Fhe

Frn

Alá

Val

Len

Gin

155

<210>

36

<211>

153

<21

:2>

FEHÉRJE

<213> Humán

<4ÖO> 36
Pro Gly Arg Ser	len	Arg	Len	Ser	Cys	Ara		Ser Gly Fhe	Thr- Fhe
1	5·					10:			15
Ser Ser Fis Gly	11 e	Fis	Trp	Fai	Arg	Gin	Aia	Fro Gly Lys	íny Len

150

20

25

30

Gia

Trp Vei Alá

Vai

ns

Trp

Tyr

Áap

Giy

Ás a

Lys

Asp

Tyr

Ara

35

40

15

Asp

Ser Val Lys

Giy

Arg

The

Tar

ire:

Ser

Arg

ÁS©

Asa

Ser

lys

ÁSS

50

55

59

Thr

Tea Tyr- Leu

G.io

Kel:

Asa;

Ser

Le u:

Ara

Áia

Gia.

Asp

Thr

Alá

Var

-65

70

7 5

00

Tyr

Tyr Cys Ara

Árg

Var

A! a

Lre

Lea

Giy

Trp

Lea

Asp

Tyr

Trp

Giy

55

90

05

Gia

Giy Thr' Lea

Val

Thr:

Val

Ser

Ara

Ser

Thr

Lys

Giy

Pro

Se r

Ϊ 00

la 5

119

Vai

The Trp Lea

Ara

Pro

Cys

Ser

Árg

Se r

Thr

Ser

Gi a

Ser

Thr

Alá

115

120

Aia

Lea Giy Cys

Lee

V S 3.

Lys

Asp

Tyr

The

Pro

Gr a

Trp

Vei

Thr

Vei

130

135

14 0

Ser

Trp Asa Ser

'v?- x y

Alá

Lea

Tar

Ser-

145

150:

<210> 37

<211> 163

<212> FEHÉRJE

<213> Humán

<4öö>;

37

Pro

Oly

Ara

Ser

Tea

Ara

Lea

Ser

Cys:

Áia

Ser

Giy

Phe

Tar

The

1

5

10

15

Ser

hl s

G.i.y

5 re

Kis

Trp

vai

Arg

Gia

Áia

Pro:

Giy

ays

Giy

Lea.

20

•p: 1Γ

SS

<.- ... a

Trp

Val

Ara

Val

ire

Trp

Tyr

ÁSp

a r y

Ara

ÁS:P.

Lys

ÁSP

Tyr

Gi a

35

40

4 5

Asp

Ser

Val

Lys

Giy

Árg

The

Thr

Tie

Ser'

A.r g

Asp

Ásr

Ser

Lys

lys

50:

05

60

Thr

Lea

Tyr

Lea

G:la

Kei:

Asa

Ser

Lea

Árg

Áia

Gia

ÁSp

Thr-

Alá

Vai

05

70

7 5

80

Tyr

Cys

Alá

Arg

Var

Alá

Pro

Len

Gly

Pm

Len

Asp

Tyr

Trp

Gly

85

10

95

Gin

Gly

Thr

Len

Vei

Thr

Val

Ser

Als

Ser

Thr

Lys

el y

Pro

Se r

100

105

110

Tel

Phe

Pro

Len

Ali:

Pm

Cys

Ser

Are

Ser

Thr

S er-

Cin

Ser

Thr

Alá

115

120

12 5

Alá

Len

Gly

Cys

Len

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pm

Gln

Pro

Var

Thr

ve .·.

13Q:

135

140

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Alá

Len

Thr

Ser

Gly

Val

5 Is

Th r

Phe

Pro

Alá

14 5

150

155

160

Vei

Len

Cin

<210>

38

<211>

138

<212>

FEHÉRJE

<213>

Humán

<400> 38

Gly

Gly Val

Vei

Gin

Pro

Gly Arg

Ser

Lel··

Ar::

Len

Ser

Cys

Thr

Alá

1

Cl

10

15

Ser

Gly Phe

Thr

Phe:

Ser

Tyr

Gly

Méh

Hl s

Trp

Val

Arg

Gin

Ara

20

25

30

Pro

Gly Lys

Gly

Len

Gin

Trp

Val

Ara

Var

He

Trp

Tyr

Asp

or y

Se r

35

4 5

45.

Asn

Lys His

Tyr

Alá

Asp:

Ser

Alá

Lys

Gly-

Arg

Phe

Thr

Tie

Ser

Arg

50

s; O J

60

Asp

Asn Ser

Lys

Asn

Thr

Len

Tyr

Len

Gin.

Mer

Asn

Ser

Len

Ar g

ar a

05

3 0

75

se

Gr n

Asp: Thr

Ar a

Val

Tyr

C y s

Ar a

Arg

Ars

G.i.y

Lee

Len

0:1. y

Tyr

85

10

o a

Phe

Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Len

Var

Thr

Var

Ser

Alá

Se r

100

105

110

Thr

Lys Gly

Pm,

Se r

Vei.

Phe

Pro

Le n

Als

P

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

120

12 5

Ser

Gin Ser

Thr

Alá

Ar e

Lsei

G.ry

Gye

Len

ISO

135

<210> 39

152 <211> 167 <212> FEHÉRJE <213> Humán <4Ö0> 39

Giy 1

Vai

Gin

Pro 3

Gry

Arg

Ser' Lee Ara Lee LG

Ser

Gys

Alá

Aia 15

Ser

Giy

The

Thr

rh.e

Ser

Tyr

Giy

Siet

Kl.S

Trp

Vai

.Ara

GLn

Aia

Pro

50

e 5

35

W

Lys

Giy

Lee

Glu

Trp

Var.

Aia

Vai

Be

Trp

Tyr

Asp

Giy

Ser

Asn

35

4 0

45

L.ys·

Tyr

Air?.

Asp

Ser

Vei

Lys

Giy

Arg

Phe

Thr

11 a

Ser

Ara

Asp

50

55

65

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Lea

Tyr

Lee

Gin

Kei:

Asn

Ser

Len

Arg

Aia

Glu

65

75

7 7

Síi

Asp

Thr

Aia

Var

Tyr

Gye

Aia

Arg

Asp

Pro

Arg

Giy

Aia

Thr

hsa

85

30

05

Tyr

Tyr'

Tyr

Arg

X.aa

Asp

Vei

Trp

Giy

Gin

Gl y

Thr

Vai

150

135

110

Tar

Vai.

Ser

Aia

Ser

Thr

Lys

el y

Pre

Ser

Vei

Phe

Pro

Len

Al,a

i n

1.20

125

Pro

Gys

Ser

Arg

Ser

The

Ser

Gin

Ser-

Thr

Alá

Aia

Lee

e i. y

Gys

Lea

130

135

14G

Vai

Lys

Axp

Tye

Phe

?·: o

Gin

Pro

Vai

Thr

Vai

Ser

Trp

Asn

Ser

Giy

145

155

160

A1 a

Le a

Thr

Ser

Giy

Vai

Kis

165 <210> 40 <211 > 150 <21.2> FEHÉRJE <213> Humán <400> 40

151

Gly

hal

Val

Gin

Pro

Gly

Ara

Sex:

Len

Arg

Len

Se r

Cys

Alá

Ser

1

5

10

15

eöy

Phe

Thr

Phe

Ser

Tyr

Gly

hot

Hl a

Trp

Val

Arg

Gifí

Alá

Pro

20

25

30

Gly

r y a

Gly

Len_:

Gin

Trp

Vall.

Alá

Va 1

He

Trp

Tyr

.Asp

na y

.Ser

Kis

35

4 0

45

Lys

Tyr

A la

e.sp

Ser

Var

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

He

Ser

Arg

Asp

50

5 5

60

Asn

Ser

Lys

Axn

Thr

Les

Tyr

Len

Gin

Mer.

Asn

Ser

Len

Arg

Als

Gin

65

70

75

30

Asp

Thr

Alá

Val

Tyr fi a

Tyr

Cys

Ars.

Arg

Gly n,·'··

Alá

Val

Vei

Val

Pro o -

Ara

Alá

hfet

Asp

Var

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Alá

100

105

110

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val.

The:

Pro

Len

Al.a

Pro

Cys

Sex·

Arg

Ser

1.15

I2h

125

Thr

Ser

Gle

Thr

Alá

Le^;a

Gly

Gya

Len.

Val.

Lys

Asp

Tyr

Phe

136

13 a

140

Pro

^:G1 a

Pro

vei

The

Val

145

150

<210>

41

<21

,1>

146

<21

.2>

PBH

LÜfX'v

JE

<21

,3>

Hun

ián

<4C

ÍO>'

41

Val.

Val

Gin

P:t:o

Gly

Arg

Ser

Len

Arg

Len

Ser

Cys

Alá

Ser

Gly

1

Lö

15

Phe

Thr

The

Ser

Cys

o x.y

Mát

Hl s

Trp

Var.

Arg

Gin

Alá

Pro

Gly

20

2 5

30

Lys

G r y

Len

Gin

Trp

Val

Alá

Val

He

Trp

Ser

Asp

Gly

Sex'

hxs

Lys

3s

49

4 5

Ty.r

Tyr

Al.a

Asp.

Ser:

Val

Lví:

Gly

Arg

Phe

Thr

He

Ser

Arg

Asp

Asn

50

55

60

Ser

Lys

Asn

Thr

Len

Tyr

Len

Gm

Mer

Asn

Ser

Len

Arg

Als

Gin

Asp

65

70

75

80

Thr

Alá

Vs.1

Tyr:

Tyr

Cys

AI a.

Arg

G j. y

Thr

Mát

He

Val

Gly

Thr

3 5

30

55

len

Asp

Tyr

Trp

Gly

G1 n.

Gr y

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Alá

Ser

TOO 105 115

Thr

Lys:

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

P r o

Lei Alá

Pro

cys

Ser

Arg

Sor Thr

115

120

12 5

£ er

Gl.a

Ser

Thr

Alá

Le a

Oly

Cys hon

val

Lys

Asp

Tyr

Phe Pro

130

135

119

Gin Pro

145 <2lö> 42 <211> 171 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 42

Gly

Val

Vei

Gin

Pro

Gly

Arg

Ssr

Les

Arg:

Len

S e r

Cys

Alá

Ais

Ser

1

5

10

3.5

oly

Phe

Thr

Phe

Sor

Ser

Tyr

Gly

Val

Sir

Trp

Val

Arg

Gin

Alá

Pro

20

25

30:

Gly

Lya

Gly

Ler

Gin:

Trp

Val

Alá

Var

He

iXp

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

35

40

45

Ays

Tyr

Tyr:

Alá

Asp

Ser

Var

Lys

Gly

Arg:

Phe

Thr

lle

Ser

Arg

Asp

50

feö

Asn

Ser

Lya

Se r

Thr

Le.r

Tyr

.Lee

Gin

List

Asn

Ser

Lee

Arg

Ara

Glu

65

7 0

'70

SS

Asp

Thr

Ara

Val

Tyr

Cys

Ara

Arg

Asp

Ser

Tyr

Asp

Phe

Trp

85

00

25

Ser

Gly

Arg

Gry

Gl.y

hét

Asp

Val

Trp

Gry

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

100

105

110

Val

Ser

Ara

Ser

Thr

lvs

er y

Pro

Ser

Vei

Phe

P ; o

Len

Alá

P r o

115 120 125 !5S

Gye

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Gin

Se r

TAr

Ara

Len

Giy lys

Len

Va.l

130

135

140

Lys

Asp

Ty·;

Aha

Pro

GAi

Pro

Var

TAr

Var

Ser

Trp

Asn Ser

Giy

Alá

745

15 0

155

ISO

Len

Tér

Ser

Gry

031

His

TAr·

Líra

Pro

Ara

Vai

&5. 5 7 Ο <210> 43 <211 > 163 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 43

Val

Gin

Pro

GéV

Arg-

Ser

lea

Arg

Lee.

Ser

Cys

Ara

Ars

Ser

er y

Phe

1

Γ Π

10^:

15

TAr

The

Ser

A.sxi ·>

Tyr

A.ia

Gat

His

Tre

Val

Arg

Gin

A.la

Pro er.

G1 y

Lye

Giy

Lein

Gin

u. ·..· Trp

Vai

V a r

Vai

iie

X.· Trp

8 is

Asp

Giy

Ai? n

Asn

Lys

Tyr

SS

40

45

Tyr

Ara 50

G ru

Ser

Vai

Lys

Giy na

Arg

PAe

Thr

He

Ser' Í4C

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

TAr

Len

Tyr

Len

Gin

Met

.Asn

Ser

Len

V V Arg

.éra

Gin

Asp

Thr

55

70:

7.5

58

A.ia

Val.

Tyr

Cys

Alá

Arg

Asp

Gin

Giy

Thr

Giy

Trp

Tyr

Giy

Gry

85

50

55

PAs

Asp

Pha

Pro

Giy

Gin

Gl. y

Thr'

Len

Val.

Thr

Var

Ser

Alá

Ser

100

185

110

Thr

Lye

Giy

Pro

Ser

Vai

The

Pro

Len

Ara

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

115

128

125

Ser

Gin

Ser

Thr

Ara

Len

Giy

Cys

Len

Va 1

Lys

Aap

Tyr

PAe

Pro

ISO·

135

140

Gin

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Giy

A.ia

Len

Thr

Ser

oly

Vai

145

150

155

ISO

His Thx PAe <21.0 >44 <211> 76

Ϊ56 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 44

val

Ser Gly Gly

S e r

He

Ser

n.r y

Gly

Tyr

Tyr Trp

Ser

Trp

He

1

5

10

15

Arg

Gin Hls Pre

G.i.y

lyr

Gly

Lan

GT a

Trp

He

Gly Tyr

He

Tyr

28

25

30

Ssr

Gly Tar Thr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Inas

lys

Ser: Arg

Val

Thr

He

35

40

45

Ser

Val Asp Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Aha

Ser

Len

Ly® Lse.

Sex^-

Ser

Val

50

5 5

60

Thr

Alá Alá Asp

Thr

Alá

Val

Tyr

Cys

Alá

Arg

65

70

7 5

<21O> 45

<211 > 172

<212> FEHÉRJE

<213> Humán

<400a 4 b

Sex·

Gly

Ara Gly

Len

Vsl

Lys

Pro

Ser

Gin

Π.Β

Lee

Sí: r

Len

Tar

Cys

1

10

15

Thr

Val

Ser Gly

Gly

Ser

Ha

Ser

Gly

Hy

Hír

Tyr

Trp

Ser

Trp

20

25

50

He

Arg

Gin Hl® T 5

Pro

e 1 y

Lys

Gly Λ

Len

Gin

Trp

Líra

G. χ y

Tyr

1 le

Tyr

He

Gly Asn

Thr

Tyr

rz Ά Asn

Ars

Ser

Len

Lys

•j J Ser

Arg

Vei

Thr

hí)

55

SO

He

Ser

Va 1 Asp-

Thr

Ser

Lys

Asri

Gin

Phe

Ser

Len

: y í -

Len

Ser

Ssr

65

H

75

50

Val

Thr

:-'.ra m. a

Asp

Thr

Alá

V íti

Tyr

Cys

Alá

Arg

Asp

Ser

Gly

0 6

00

95

ί $7

Asp

Tyr Tyr Gly

Ile

Asp

Val.

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Tfer

Val

Thr

Var

ICO

105

110

Ser

Ser Ara Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Se r

Val

Phe

Pro

Lei.;

Ara

Pro

cys

11.5

12 9

TAS

Ser

Arg Ser Tar

Ser

Gin

Ser

Thr

AT a

Alá

lAL

G1 y

Cvs

Le a

Vei

Lys

no

1.35

Hu

Asp

Tyr Phe Pro

Gin

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Alá

Len

145

150

155

150-

Tar

Ser Gly Val

&s

Tbr

Phe

Pro

Alá

Vei

Len

Gl.r·

105

ne

<210> 46

<211> 96

<212> FEF

<213> Humán

<

400

> 46

Gl.r.

Ile

Val

Lea

Thr

Sírt

Ser-

Pro

Gly

Tar

len

Ser

Lea

Ser

Pro

Gly

1

5

10

15

Gla

Arg

Aia

Tar

lea

3¾ 27

Cys

Arg

Alá

Ser

Gla

Sex·

Val

Se:r

Sex

Ser

20

2 5

30

Tyr

Lea

.Alá

Trp

Tyr

Gin

Gia

Lys

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Arg

Lea

Le a

35

10

15

He

Tyr

Gly

A1 a

Ser

Arxg

A1 a

Tbr

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

.Phe

Ser

50

55

69

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Tar

Asp

Pás

Thr

Len

Tar

Ile

Ser

Arg

len

Gin

6:5

n

75

80^:

Pro

Gin

Asp

Phe

Alá

Vei

Tyr

Gye

Gin

Sin

Tyr

Gly

Ser

Pro

SS SG 95 <210> 47 <211> 141 <213> Humán <4ÖO> 47

SS

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Len

Ser

Len

Ser

Pro

^;.·?:·2,Υ

Gin

Arg

Alá

Thr

1

5

10

15

Ser

Gye

Arg

Alá

Ser

Gia

Ser

He

Ser

The

len

Alá

Trp

Tyr

111

25

30

G1 n

Gl.n

Arg

Pro

Gly

Gin

Ara

Pro

Arg

Len

Tea

ne

Tyr

Gly

Alá

Ser

35

40

45

Ser

Arg

Als

Thr

Gl y

He

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

G.i y

Ser

Gly

50

55

60

Thr

Asp

Phe

Thr

Len

Thr

He

Ser

Arg

Leo

Gin

P r o

Gin

Asp

Phe

.Ara

65

70

7 5

80:

Val

Tyr

(lys

Gin

Tyr

Gly

Thr

Ser

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gin

8 5

SO

55

Gly

Thr

hys

val

Gin

He

Lys

Ar g

Thr

Val.

Alá.

Aj. &

Pro

Ser

Val

Phe

1.00

105

118

I le

The

Pro

Ser

Asp

Gin

óin

Lee

Lys;

S e r

Gly

Thr

Als

Ser

Val.

115

no

125.

Val

Cys

Lee

Len

Asn

Asr;

Phe

Tyr

Pro

Ar<j

Gin

Ara

Lys

118

135

140

<2

1O>

48

<21

.!>

1.41

<21

,2>

X .Í.ií .5..

ÉRJE

<21

3>

Humán

<4C

í0> ‘

48

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Len

Ser

Len

Ser

Pro

Gl y

Sin

Arg

Als

Thr

Len

1

5

10:

15

S e r

Cys

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

Ser-

Ser

Tyr

Len

A.La

Trp

Tyr

Gin

2 0

2 5

30:

Lys

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Arg

Len

He

Tyr

Gly

Alá

Ser

Arg

35

40-

4 5

Ara

Thr

Gly

He

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Giy

Ser

Gly

Ser

G i. y

Thr

Asp

50

55

:60

Phe

Thr

Len

Thr

He

Ser

Arg

Len

Gin

Pro

Gin

Asp

Phe

Alá

Val

Tyr

65

70:

7 5

SS

Tyr

Cys

Gin

Tyr

Gly

He

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Thr

85

00

05

Lys

Val

Gin

He

Lys

.Arg

Thr

Veri

Alá

Pro

Ser

Val

Phe

He

Phe

100

105

no

Pro

Ser

Asp

Gin

Len

Lys

Ser

Gly

Thr

Al a

Se r

Val

Cys

159 iih 120 125

Le;.; Lee Ase Asn Phe Tyr Pro Arg Gle Alá Lys Val Gin

130 135 l:

<210> 49 <211> 139 <212> FEHÉRJE <213> Humán.

<4ÖO> 49

Gly

Thr

Lee

Ser

Lee

Ser

Pro'

Gry

Gle

Arg

Ara

Thr

Lee

Ser

Cys

A.rg

1

ö

10

L

Alá

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Se:::

Tyr

Lee

Aia

lap

Tyr

Gla

Glr;

Lys

Pro

23

OS

30'

Gly

CG. a

Alá

Pro

Arg'

Lee

Le-e

Tle

Tyr

Gly

Als.

Ser

Arg

Ara

Thr

35

40

4 5

Gr y

Tle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

50

RE

00

Lee

Thr

lle

Ser

Arg

Lee

Gle

Pro

Gle

Asp

Phe

Alá

Val

Tyr

Cys

65

IQ

.·’ 3

8Ό

Gin

G.la

Tyr:

Gry

Arg

Sex:

F r o

Phe

Thr

Phe

el y

Pro

.Gry

Thr

Lys

Val

SS

Sö

25

Asp

Tle

Lys

Arg

Tor

Va 1

Ara

.Aia

Pro

Ser

vei

Phe

The

Phe

Pro

130'

105

110

Ser

Asp

Gre

Gin

Lee

Lys;

Ser

Gly

Thr

Alá

Ser

Val

Gye

Lee

115

120

12 5

Aso

Ase.

Phe

Tyr

Pro

Arg

Gle

Alá

Lys

Vél

Gin

130

135

<2IÖ> 50 <211> 142 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 50 •Gin Ser Pro Gly Thr Lee Ser Lee Ser Pro Gly Gin Arg Ara Tor Lee

160

1

5

10

15

Ser-

Cys

Arg Alá

Ser

Gin

Ser

Val

Ser

Tyr

Len

Alá

rrp

Tyr

Gin

20

25

3 0

ein

Lys

Pro Gly

Gin

Alá

Pro

Arg

Pro

Len

He

Tyr

Gly

Vai

Ser:

Ser

lő

4 0

4 5

Arg

Alá

Thr Gly

He

Pro

.Asn

Arg

The

Ser

oly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

50

SS

Η

Aap

phe

Thr Len

Thr

He

Ser

Arg

len

Gin

Pro

Gin

Asp

Phe

Alá

Vai

65

70

5

80

Tyr

Cys; Gin

ea.n

Tyr

Gly

He

Ser

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gi y

85

9O

95

Thr

Lys

Val Asp

11«

lys

Arg

Thr

Val

Alá

Ara

Pro

Ser

Vai

Phe

He

100

1S5

llö

Phe

Pro

Pro Sor

Asp

Gin

len

Lys

S e r

Gly

Thr

Alá

Ser

Vai

vai

115

120

125

Cys

Len

Írni Aon

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Gin

e.r a

Lys

vai

Gin

13ö

135

140

<21

0> 51

<21

1> 142

<21

2> FEHÉR

,JE

<21

3> Humán

<400>

51

Ser

Pro

Gly

Thr

Le a

Ser

Le a

Ser

Pro-

Gly

Gin

Arg

A..ia

Thr

Len

Ser

1

g

10

TS

Gys

Arg

Alá

Ser

Gin

Ser

He

Ser

Asn

Phe

Len

Alá

Trp

Tyr

Gin

20

25

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Arg

Len

He

Tyr

Arg

Pro

Ser

35

45

Arg

Alá

Thr

G.l.y

He

Pro:

Asp

Ser

Phe

Ser

Gl.y

Ser

G.i.y

Ser

Gly

Thr

50

55

6S

Asp

Phe

Thr

Len

Thr

He:

Ser

Arg

Len

Gin

Pro

ο χ. n

Asp

Phe:

Alá

Len

65

7ö

5

80

Tyr-

Tyr

Gys

Gin

Tyr

Gly

Thr

Sex:

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

n x y

6 5

90

95

Thr

Lys

Vai

Asp

He:

Lys

Arg

Thr

Vai

Alá

Aia

Pro

Ser

Val.

Phe

1 i.e

100

105

110

Phe

Pro

Ser

Asp

Gin

G in

Le a

Lys

Ser

Hy

Thr

Alá

Ser

Vs 1

Vai

i

115 120 105

Cys Len Len. .«síi Aso Phe: Tyr Pro Arg Gin Air Lys Val. Gin

130 135 140 <210> 52 <211> 146 <212> FEHÉRJE <2I3> Humán <40ö> 52

Gin 1

Ser

Pro

Gly

Thr 5

Lsa

Ser

Leó

Ser

Pro 10

Πν-

Gin

Arg

Ara

Thr: 15

LéL

Ser

Cys

Arg

Alá 20

Ser-

gt n

Ser

va i

Ser 25

Ser

ίγη

Len

Alá

Trp 30

Tyr

Gm

Gin

Lys

Pro 35

Gly

Gin

Alá

£' r o

Arg 40

Lan

Len

He

Tyr

ery 4 5

Alá

S e r

Ser

Arg

Lila 50^:

Thr

Gi y

1 le

Pro

Asp 55

Ar g

Phe

S e χ·

H.y

Ser GÖ

G1. y

Ser

Gly

Thr

A.sp 65

Phe

Thr

Len

Ter-

He 7 ÍI

Ser

Arg

Len

Gin

Pro 75

Gin

Asp

Phe

Ara

Var 80

Tyr

Cys

Gin

em SS

Tyr

Gry

Arg

Ser

Pro 30

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro H

Gly

Thr

lys

Va 1

Asp 100

1 le

lys

Arg

Tár

va.:. 105

Alá

A. la.

Pro

Ser:

Val 110

Phe

Tla

Phe

Pro

Pro 115

Ser

Asp

Geo.;

Gin

Len 120

Lys

Ser

Gly

Thr

A.l.a 125

Ser

Val

'Vei.

Cys

Len 130

Len

Asn

Phe

Tyr 5 05

Pro

Arg

Gin

Alá

Lys 140

Vél

Gin

Trp

Lys

Gly Gly 145 <210> 53 <211> 95 <212> FEHÉR <213> Humán

»3

162

ÁSp

He Gin Get Tör

Gin

Ser

Pro

Ser

Se χ-

Lee.

Ser

Alá

Ser

Val

Gly

1

5

ΙΌ

.15

ÁSS,

Árg Var Tör He

Tör

Cys:

Árg

Álé

Ser

Gm

Ser

He

Ser

Sex:

Ter-

26

25

50

Les

Asn Trp Tyr' Sin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys^:

Áia

Pro

Lys

Len

len

ire

35

40

4 5

Gyr

Ára Ára Ser Sex

Len

Sin

Sor

CJ.y

Val

Pro

Ser

Árg

Pöe

Ser

Gly

56

55

60

Ser

Gly Sex Gly Tör

ÁSP

Pös

Tör

Lee

Tör

He

Ser

Sex-

Len

Gin

Pro

65

70

75

S 0

Gin

Ásp- Pös? ÁJ. a H

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Ser

Tör

Pro

öö

90

95

<210> 54

<211> 152

<212> FEHÉRJE

<213> Humán

<4C

íO>

54

Gin

Ser

Pro

Ser

JHn

Ser

Alá

Ser-

Val

G ΐ y

Ásp

Árg

Var

Tör

I le

1

*.

10

15

Tör

Gys

Árg

Ára

Sex-

Gin

ΟV'

He

Ár:!-;

Tör

Tyr

l,e.o

He

Trp

Tyr

Gin

26

S K A. s·'

30

Gin

Lys

Pro

Gly

Gye

Áia

Pro

ÁSÓ

Pöe:

Lea

iie

Ser

Áia

Tör

Ser

He

35

41)

4 5

Lea

Gin

Ser

Gly

Vei

Pro·

Ser

Árg

Pös

Arg

G ΐ y

Ser

Gly

Se r

GJ.y

Tör-

56

55

66

163

Asn

Pb® Thr

Len

Thr

He

Asa.

Ser:

Len

Pia

P r o

Gin

Asp-

FLe

Alá

Thr

65

0

7,5

80

j,.;.

Tyr Cys

Gla

Gi n

Ser

Tyr

Ser

Thr

Pm

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

SS

39

35

Thr

Lys bal

Asp

He

Lys

Arg

Thr

bal

AH:

Alá

Pro

Ser

Hl

Phe

He

199

LOS

Hl

Pbe

Pro Pro

Ser

Asp

Gin

Len

Lys

Ser

Gly

Thr

Alá

Ser

bal

bei

115

129

12 5

Gys^;

Len Len

Áss

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Gin

Aha

Lys

bal

Gin

Trp

Lys

139

135

140

bal

Asp Asü

Ais

Len

Gla

Ser

Gly

14 :;·

115

<210> 55

<211>

139

<212> FEHÉRJE

<213>

Humán

<4ÖÖ>

r** P“ öo

Pro

Ser

Len

Ser

Alá

Ser

bal

Gly

Asp

Arg

bal

Thr

He

Thr

Cys

1

5

1:0

15

.Arg

Alá

Ser

Gla

Ser

He.

Asn

Ser

Tyr

Len

Asp

Trp

Tyr

Gin

Lila

Π

25

3n:

Pre<

Gly

Lys

A. Is

Pro

Lys

Len

Leu

Ti a

Tyr

Ara

Ser

Len

Gin

3 5

40·

45

Ser

Gly

bal

Pro

Se r

Arg

Phe^

Ser

Gly

Ser

ory

Ser

Gly

The

Asp

Phe

50

55

50

Thr

Len

Thr

He

Ser

Len

Gin

Pro

Gin

Asp

Phe

ALa

Thr:

Tyr

65

7 0

75

8 0

Gye

Gin

Gla.

Tyr

Ser

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

85:

50

35

bal

Gin

lle

Lys

Arg

Thr

bal.

Alá

Pro

Sarc:

bal

Phe

He

Phe

Pm

100

105

11.0

Pro

Ser

Asp

Gin

Gia

Len

Lys

Ser

Gly

Thr

Ara

Ser'

bal

Cys

Len

115:

12 ö

125

Lsu

Asa

Phe

Tyr

pvy\

Arg

δία

Ά1 ::

Lys

bal

130

135

<210> 56

164 <211> 134

<400> 56

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Len

Ser

Aia

Ser

Val.

Gly

Asp

Arg

Val.

Thr

i

e

1.0

IS

He

Thr

Cys:

Arg

Alá

Ser

Gin

Aon

He

Ser

Arg

Tyr

Len

As a

Trp

Tyr

20

25

50

Gin

Lys

Fro

Gly

cys

a.l.a

Pro

Lys

Fhe:

Len

He

Tyr

v’ 3 .1

Aia

Ser

35

10

15

He

Len

Sir?

Ser

Gly

Val.

Fro

Ser

Gly

Fhe:

Ser

Ali a

Ser

Gly

Ser

Gly

50

55

6G

He

As e

Fhe

Thr

Len

Thr

He

Ser

íren

Gin

ΡϊΑ

Gin

Asp

Fhe

Aia

65

TS

25

80

Thr

Tyr

Cys

aia

Gin

Ser

Tyr

Ser

Thr

Fro

Fhe

Thr

Phe:

Gly

Fro

85

90

95

Gr y

Thr

Lys

Val

Asp

He

Lys

Arg

Thr

Vei

Alá

Aia

Fro

Ser

Vsi

Fhe

100

105

110

He

Fiié

Fro

Pro

Sor

Asp

Gin

Len

Lys.

Ser

ar y

Tfe?:

Al a

Ser

Val.

5 55

12 0

125

Vei

Cys

lea

Les

Asn

130 <21.0> 57 <211> 150 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 57

Thr Gin Ser Fro Ser Ser Len Ser Aia Se?: Vei Giy Asp Arg Val Thr 5 0 15

165

He

Thr

Gye

Arg 20:

Alá

Ser

Gh

Ser

1 is .25

Cys Asn Tyr'

Len.

Asn 30

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

ο 1 y

Lys

Aha

Pro

Arg

Va 1

Leu

I Te

Tyr

Ara

Al a

Ser

35

40

45

Ser

Len

Gin

Gly

Vai

Pro:

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

30

1L.:L

60

11«

Asp

Cys

Thr

len

Thr

He

Ser:

Se r:

Leó

Gin

Pro

Gin

Asp

The

Ara

63

7 0

7 5

80

Thr

Tyr

Cya

GH

Gin

Ser

Tyr

He

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

85

9h

55

Gly

Thr

Ar·:;

Val

Asp

He

Gin

Arg

Thr

Val.

Alá

Ara

Pro^:

Ser

Val

Phe

100

105

110

He

The

Pro

Ser

Asp

Gin

Gi n

Len

Lys

Ser

Gly

Thr

He

Ser

Val

115

120

125

Vai

Cya

Lee.

hím

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Gin

Alá

Lys

var

Gin

Trp

1 30:

135

14 0

rys

Vei

Asp

.Asn

Alá

Tyr

145

ISO

<210>

58

<211>

96

<212> FEHÉRJE

<213>

Humán

<400> 58

Gin

He

Var

Len

Thr

Gin

Ser

Pro

As:o

Phe

Gin

Ser

Va 1

Tér

Pro

Lya

1

5

10

15

Gin

y s

Vai

Thr

He

Thr

Cys

Arg

Ara

Ser:

Gin

Ser

He

or. y

Ser

20

25

30

Len

hls:

Trp

Tyr

Gin

Gm

Lys

Pro

Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Len

He

35

40

45

Lys

Tyr

Alá

Ser

Gin

Ser

Phe

Ser

Gly

Var

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gr y

50

55

60

Ser

Gly

S'e r

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Len

Thr

He

Aon

Ser-

Len

Gin

Alá

65

7 0

75

50

Gin

Asp:

Alá

Thr

Tyr

Cys

his:

Gin

Ser

Len

Pro

Gin

8 5

36

95

<2Ι0> 59

166 <211> 155 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 59

Ser

Pro

Asp

Phe

Gin

Ser

Val

Thr

Pro

Lys

Glo

j.iV S

val

Thr

He

Thr

1

5

10

15

Cys

Arg

.AT a

He χ-

Gin

Ser

lle

Gly

Ser

Leó

His

Trp

Tyr

Gin

ΙΤ

25

30

Lys

Pro

Asp

Gin

Ser

Pro

Lys

Len

Leó

lle

Lys

Tyr

Alá

Ser-

Gin

Ser

35

40

45

Phe

S er-

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Pne

Ser

Gly

Ser

Gl y

Ser

Gi v

Thr

Aep

TC

ic í;

60

Phe

Thr

Lee

Thr

Lle

Asn

Sex-

Leó

Gin

Als

Glo

Asp

Ara

Alá

Thr

Tyr

fe 5

78:

75

80

Tyr

Cys

His

Gin

Ser

Lee

Pro

Leó

Thr

Phe

Gly

Th.x:

85

Sö

95

Lys

Vali

Gin

Tls

Lys

Arg

Thr

Val

Alá

Pro

Sex

Ve 1

Phe

Tie

Phe

ICO

105

110

Pro

Ser

Asp

Gin

Cin

Lee

Lys

Ser

Gly

Thr

Aia

Ser

Val

Vei

Cys

115

12C

.1.2 5

Len

ÁSS

Asn

The

Tyr

Pro

Arg

Glo

A1 a

Lys

Val

Gin

Trp

Lya

Vei

138

135

170

Asp

fen

Al a.

Len

sir

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

14 5

ISI)

153

<210> 60 <211> 100 <212> FEHÉRJE <213> Humán

16’?

Asp

Vai

Vai. Kei.

The

Gla

Ser

Pro

Le©

Ser

Lea

Pro

Val

Thr

Le©

Giy

1

K.

10

15

Gía

Pro

Aia Ser

11 e

Ser

Gys

A.rg

Ser

©i.©

Ser

Le©.

Val

Tyr

Ser

20

25

30

a S'P

Giy

Ás© Thr

Tyr

Les

ÁS©

Trp

PA©:

Gih

Gin.

Arg

Pro

Giy

Gin

Ser

35

40

4 5

Pro

Arg

Arg Lee

Tie

Tyr

Lys

Val

Ser

ÁS©

Arg

ÁS©

Ser

Giy

Val

Pro

50

55

60:

Asp

Árg

Phe Ser

Giy

Ser

©1 y

S e r

G'.i y

Thr

Á.SD

Phe

Tar

Le©

Lys

He

65

7 Cl

7G

5:0

Ser

Árg

Val Gi©

Alá

Gi©

ÁSp

Vai

Giy

Vai

Tyr

Gye

Kei.

Gin

©Ly

§5

90

95

Tár

Gi s;

Trp Pro

100

<21

0> 61

<21

1> 139

<21

2> FBg

ÍÉR<

JE

<21

3> Humán

<400>

61

Pro

Le©

Ser-

Le©

Pro

Vei

Thr

Le©

:.:1 V

Gin

Pro

Áia

Ser

He

Ser

Gvs

i

©

10

15

Ár©

Ser

Gi a

Ser

Le©

Vai

Tyr

Ser

Asp

Giy

ÁS©

Thr

Tyr

Le©

Asa

20

25

30'

Trp

Phe

Gin

©m

Árg

Pro

Giy

Gia

Sí: r

Pro

Ara

Arg

Le©

He

Tyr

Lys:

35

4:0

45

Val

Ser

ÁS©:

Tr©

Asp

Ser

Gi y

Val

Pro

Asp

Árg

Phe

Ser

Gl.y

Ser

Giy

50

f c - J o

60

Ser

Giy

T hr-

Ásp

Phe

'Thr'

Le©

Lys

He

Ser

Arg

Vai

Gia

Álí!

GI©

ÁSp

65

70

75

SG

V r

Gi y

Val

Tyr

Gys

Met

Gin

Giy

Ser

Kis

Trp

Pro

Thr

Phe

85

9Q:

95

Gl©

Giy

Thr

Lys

Val

Gr©

He

Lys

Arg

Thr

Var

Alá

Ara

Pro

Ser

100'

105

110

V« r

Phe

2 le

Phe

Pro

Ser

ÁSp

Gia

Gi©

Le©

Lys

Ser

siy

Thr

Ála

115

120

125

168

Ser Var Val. Cys Leu Len Asn Asn 135 135 <21Ü> 62 <2U> 100 <212> FEHÉRJE <21.3> Humán

Phe Tyr Pro <400> 62

Asp	lle	Val	Me t	T Αχ-	Gin	Ser	Pro
1				ό
61 u	Pro	Alá	Ser	lle	Ser	Cys	Arg
			25
Asn	Ily	Tyr	Asn	Tyr	Leír	Asp	Tr-p
		35					40
Pro	G1 n	Len	Le o	1 le	Tyr	Lee	Gly
	r n					V- _ς·
						s..·
Asp	Arg	Phe	Ser	Gly	Ser	foü y	Ser
65					71
Ser	Arg	Val	Glo	Ars 9 F	Gr a	Asp	Val·
len	Gin	Thr-	Pro

100

Lsu	Ser 10	Len	Pro	Val	Thr	Pro 15	Gly
Ser	Se r	Gin	Sex:	Lee	Len •IfV	Kis	Sor'
Tyr	Len:	Gin	Lys	Pro 45	G1 y	Gin	Ser
Ser	Asn	Arg	Alá 50	Ser	Gly	Var	Pro
Gly	Th r:	Asp 75	Phe	Thr:	Len.	n ys	lle P 0
Gly	Val 53	Tyr	Tyr	Cys	Mer	Gin 95	Alá

<210> 63 <211> 133 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 63

Pro 1	Gly	GIg	Pro	Ara: 11	Ser	lle	Sex:
Kis:	Sej;	Asn	Gly 20	Tyr	Asn	Tyr	Len
Gin	:S e x'	Pro 35	Gin	Ler	Len	rre	Tyr 40

Gye	Arg	Sex:	Ser	Gin	Ser	Len	Len
	15					15
Asp	Trp	Tyr	reá	Gin	Lys	Pro	oiy
25					30
Len.	Gly	Ser	Asn	Arg	Alá	Ser	Gly

169

Var

Pro

Asp

Ar g

The

Ser

Giy

Ser

Giy

Ser

Gry

Thr

Asp:

Phe

Thr

Lea

50

É 4

50

Lys

Lse

Ser

Arg

Vai

Gin

Aia

Glu

Asp

Vai

Giy

vai.

Tyr

Cys

Keh

05

70

7 5

50

Gin

Aia

Len

Gin

Thr

Pro

Lee

The

PLé

Giy

Thr

Lys

Vai

Gin

85

ÁS

95

lle

rys

Arg

Thr

Vai

.í. '6.

.Aia.

Pro

Ser

Vei

Phe

Lle

Phe:

Pro

Sex^-

10V

105

110

Asp

Glu

Gin

Len

Lys

Ser

Gr y

Thr

Aia

Ser

Vai

Vei

Gye

Lea

.Asn

115

120

•15

.Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

130 <210> 64 <21 !> 20 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 64

Asp He Gin Met Thr Sin Sér Pro Sér Ser 'Lea Ser Aia Ser Var Giy 1 S 10 15

Asp Ars Vai Thr 20 <210> 65 <211 >20 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 65

Gia rre Vai Lea Thr Gin Ser Pro Giy Thr Lea Ser írre Ser' Irc Giy 1 5 10 15

Gl.a Arg Ara Thr <210> 66 <21.1> 20 <212> FEHÉRJE ;78 <213> Humán <400> 66 <210> 67 <211> 20 <212> FEHÉRJE <213> Humán <4ÖÜ> 67

Asp He G.Le hfet Thr Gin

7· Q <210> 68 <211> 20 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 68

<210> 69

<213> Humán ♦· « <400> 69 ;?sr ere y.y mr Len Ser Len Ser Pro G

Gin Arg Aia rhr 'l· Λ <210> 70 <212>

<213>

<400> 70

GIu iie a η t u

-í / .1

Λ i<400> 71

Pre ί·?;.v ί jer h’ :211> 20

•J; ·γ.->

<400> 72

<213> Humán <400> 73

Len Arg Lan Sár 20:

<21ö> 74 <211> 5 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 74 <210> 75 <211 >20 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 75 ;73

-Í'aX <210> 76 <2i:i> 10 <212> FEHÉRJE <213> Humán.

> 76

Tvx: Vaj <210> 77 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 77 <210> 78 <211> 8

Pb <210> 79

S74 <211> 20 <213> Humán

<211> 20 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 80 ry Arg Ser <210> 81 <211> 10 <212 > FEHÉRJE <213> Humán <400> 81

Pro Gin Val Gin Phe Asn Trp Tyr Var A;

210> 82

211 > 20

175 <213> Humán <400> 82 <210> 83 <211>9 <212> FEHÉRJE <213> Humán.

<400> 33

Pro ülu Vai Gin Phe Asn Trp Tyx Vai <210> 84 <211> 20 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 84 .5

Len Arq Len Ser

Ό Λ <210> 85 <211>6 <212> FEHÉRJE <213> Humán {76 <400» 85 «210» 86 <211» 20 <212» FEHÉRJE <213» Humán <400» 86

Λ Η

Le.u Arg Le;4 Ser ’> λ <210» 87 <211> 10 <212» FEHÉRJE <213» Humán <400» 87 <210» 88 <211» 8 <212» FEHÉRJE <213 » Humán <400» 88 <210> 89 <2I1>8 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 89 <210> 90 <211> 8 <212> FEHÉRJE <213 > Humán <400> 90 <:;

<21I> 10 <212>

<213> Humán :400> 9 ;:*ir <210> 92 <211> 8 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 92

178

Gin Phe Vei Len Thr Gin Ser Lm 1 5 <210> 93 <211>8 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 93

Gin Lie val Len Thr Gin Ser Lm i 5 <21G> 94 <211>8 <213> Humán <400> 94

Gin Ile Val Len Thr Gin Ser h: 1 5 <210> 95 <211> 463 <212> FEHÉRJE <213> Humán <400> 95

Me t:

Gin

Phe

Gly

Len

Ser

Trp

Vei

Ghe

Len

Val

Alá

Len

Arg

Gly

1

5

10

15

Vei

Gin

Cvb

Gin

Val.

Gin

Len

vei

Gin

Gly

Val

Gin

20

25

30

lm

Giy

Arg

Ser

Len

Arg

Len

Ser

Cys

vei

Alá

Ser

G1 y

Phe

Thr

Phe

35

40:

45

Ser

Sex:

Les

Gly

Mer

Pia

Trp

Val

Arg

Gin

Alá

Pro

Gly

Lys

Gly

Len

179

50	55	60
Gin Trp Var Aia vai	iie Trp Tyr' Asp Giy Arg	Asn Lys Tyr Tyr Aia
6v o	70 75	30
Asp Sár vai Lys Giy	Arg Phe Thr iie Ser Arg	Asp Asn Ser Lys A sn.
85	30	35;
Thr Lan Phe Tea Gin	Get Asn Ser Len Arg Aia	Gin Aso Thr Aia Vai
LÓG	105	110
Tyr Tyr Cys Aia Arg	Giy Giy Pia Phe Giy Pro	Phe Asp Tyr Trp Giy
r15	120	125
Gin. Giy Thr Tan vai	Thr Var Ser Ser Aia Ser	Thr Lys Giy Pro Ser
130	135	5.4ö
vai The Pro Len Aia	Pro Gye Ser Arg Sex· Thr	Ser· Gin Ser Thr Aia
5 45	150 135	160
Aia Lan Giy Cys Len	Vai Lys Asp Tyr Phe Pro	Gin Pro Vai Thr Vai
165	170·	17g
Ser Trp Asn Ser Giy	Ara Len Thr Ser Giy Vali	Ars Thr Phe Pro Aia
180	135	ISO
Vai Lan Gin Ser Sár	Giy Len Tyr Ser Len. Ser	Ser Var Vai Thr Var
1 35	200	205
Pro Ser Ser Asn Phe	Giy Thr Gin Thr Tyr Thr	Cys Asn Vai Asp His
Gin	7 ·: ír	220
Lys Pro Ser Asn Thr	Lys Vai. Asp Lys Thr Vai	Gin Arg Lys Cys· Cys
v e o .c,· «r.	230; 2 35	240
Vai Gin Cys· Pro Pro	Cys· Pro Aia Pro Pro Val	Aia Giy Pro Ser Var
24 5	250
Phe Len Phe Pro Pro	Lys Pro Lys Asp Thr Lee	Get Tle' Ser Arg Thr
250	265	2V0
Pro Gin Vai Thr Cys	Vai Vai Vai Asn Var Ser	His Gin Asp Pro. Gin
275	280	235
Vai Gin Phe; Asn Trp	Tyr Vai Asp Giy Vai Gin	Vai Kis Asn Ara Lys
2 30	295	5 GO
Thr Lys Pro Arg Gin	Gin Gin Phe Asn Ser Thr	Phe Arg Vei Vai Ser
305	310 315	320
Vai Len Thr Vai Vei	His Gin Asp Trp Len Asn.	Giy Lys Gin Tyr Lys
325	330	335
Cys Lys vai Ser Asn	Lys Giy Len Pro Aia Pro	Üe Gin Lys Thr Tle
340	345	350
Ser Lys Thr Lys Giy	Gin Pro Arg Gla Pro Gin	Vai Tyr Thr Len Pro
355	3 60	365
Pro Ser Arg Gin Gin	Get Thr Lys Asn Gin Vai	Ser Len Thr Cys Len
37 g	375	330
Vai Lys Giy Phe Tyr	Pro Ser Asp öle Alá Vai	Gin Trp Gin Ser Asn

ΗΟ

335

350

395

4 80:

Gly

Gin

Pro Gin Asn Asn

Tyr

Lys^:

Thr

Pro

Mát

Les

Asp

Ser

405

413

415

Asp

Giy

Ser Phe Ffee Len

Tyr

Sas?

Ays

Lan

Thr

hal

ASJJ

Lys

Ser

Arg:

433

a r-

4 30:

Trp

Gin

Gin Giy Asn Val

The

Ser

cys

Ser

vei

heh

Hi.s

Gin

Alá

Len

4 35

4 4 0:

44 5

His

Asn

his Tyx- Thr Gin

Lys;

Ser

Tan

Ser

Len

Ser

Ar o

Gly

Lys

45 e

455

450

<21

0> 96

<211> 463

<21

.2» FEHÉRJE

<213> Humán

<40Ö>

96

Met

Gih

Phe;

X. V

Len

Ser

Trp

Val

Phe

Len

Val

Alá

Len

Arg

Gly

1

y

10

15

Vsl

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Len

Vei

Gin

Ser

Giy

Gly

Val

Val.

Gin.

3:0

25

33

Pro

Gly

Arg

Ser

Lan

Arg

Lan

Ser

Cys

Va 1

Aie

Ser

Gly

Phe

Thr

Ahe

35

48

45

Se r

Ser

his

Giy

Vet

Π

Trp

Ve. 1

A.rg

Gin

Alá

Pro

Giy

Lys

Giy

Len

58^:

55

03

Gin

Trp

val

exra

ar

He:

Trp

Tyr

Asp

G.:.y

Arg

As n

Lys

Tyr

Alá.

55

70

75

S3

Asp

Ser

Va 1

Lys

Giy

Arg

Phe

Thr

Ive

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Ash

35

90

95

Thr

Lan

Aha

Len

Gin

Két

As n

Se r

Len:

Arg

Alá

Gin

Asp

Thr

AH;

Val

100

135

110

Tyr

Cys

Alá

Arg

Giy

Gly

His

Phe:

G i y

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

G1 y

115

no

125

Gin

ex. y

Thr

Lan

Val

Thx-

Vei

Ser

Alá

Sex^-

Thr-

Lys

Giy

Pro

Ser

13G

135

1 4 0:

Val

Phe

Pro

Len

Alá

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser-

Gin

Sár

Thx·

Ara

145

153

155

1 50:

Alá

Len

Giy

Cys

Len

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Gin

Pro

Val

Thr

Val:

155

no

17 5

Ser

Trp

Asn

Ser

G1 y

Aie

Len

Thr

Ser

G1 y

Val

his

Thr

Ahe

Pro

Alá

188

1.65 ISO

Vai Leu Gin Ser Ser Sly Lsu Tyr Ser Len Ser Ser Vai Vai Thr Vei

135

200

205

Pro

Ser

Asn

Phe

Giy

Thr

Gin

The:

Tyr

Thr-

%

A:; n

Vai

Asp

His

21.5

215

220

Lys

Pr o

S a r

asn

Thr

Lys

Vai

Asp

Lys

Thr

Vai

Gin

Arg

Lys

Cys

225

230

235:

240

Vai

Gin

Cys

Pro

Gye

Pro

Aia

Pro

Vai

Aia

Gry

Pro

Ser

Vai

215

250:

255

Phe

Lee

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Th

Len

Mai

rie

Ser

Arg

Thr

z ot)

2255

27 G

Pro

Sin

Vai.

Thr

Gys

Vai

Asn

Vai

Ser

His

Gin

Asn

P r o

Gin

275

280

285

Vai

Sin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Vai

Asp

a a y

Vai

Gin

Vai

His

Asn

Aia

Lys

290

295

380

Ή

Lys

Pro

arg

Gin

The

Gin

Ser

Th.r

Phe

Arg

Vei

Vai

Ser

305

320:

33 5

32 0

Vai

Len

Thr

Vai

Mis

Gin

.Asp

Trp

léén

Asn

Gr y

Lys

Gin

Tyr

Lys

3.2 5

330

33 5

Cys

r y s

Vai

Se r

. :’·\ 5:7ϊ

Lys

Giy

Len

Pro

Aia

Pro

Pia

nm

Lys

Thr

Tie

.310

345

350

Se r

Lys:

Thr

Lys

Giy

Gin

Pro

Arg

Gis

Pro

Gin

Vai

Tyr

Thr

Len

Pro

355

352

365

Pre

Ser

Arg

Gin

Mer

Thr

Lys

Asn

Gin

Vai

Se r

Len

Thr

Cys

Lan

372)

375

3S0

Vai

Lys

Giy

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lie

Aia

Vai.

Gin

Trp

Gin

Ser

Aan

385

300

395

200

Giy

Gin

Pro

Gin

Asn

Tyr

Lys

Thr

Tar

Pro

Mai.

Len

Asp

Ser

105

110

115

Ase

Giy

Ser

Phe

Len

Tyr

Sex-

iys

Len

Thr

Vai

Aap

Lys

Ser

Arhy

120:

.8 Z‘

130

Trp

Gr n

Gin

Giy

Asn

Vai

Phe

Ser

Gys

Ser

Vai

lie fc

His

Gin

Aia

Len

135

110

415

His

As n

His

Tyr

Thr

Gin.

Lys

Ser

Len

Ser

Len:

Ser

Pro

Gry

Lys:

150

555

168

<210> 97 <211> 235 <212> FEHÉRJE <213> Humán

382

<400> 97

Mer..

Gin

Thr Pro Alá

mn

Lea

Len

Phe

lea

Lea

Len

Trp

Len

Pro

1

s;

10

15

Asp

Thr

Thr Gly Gla

Hs

Ve 1

Les

Thr

Gin

Sex:

Pro:

Gly

Th r

Len

Sex

LG

25

30

tó.:

Sex:

Pro G x y Sr.i.a

Arg

Alá

Tax-

Len

Ser

Cys

Arg

Ara

Ser

Gin

Ser

5 5

45

Ile

Ser

Ser Ser Phe

Len

Alá

Trp

Tyr

Gin

Arg

Pro

G1 y

Gin.

5

50

55

S0

Pro

Arg

Lea Lea He

Tyr

Gly

Ara

Sex:

Ser

Arg

Alá

Thr

Gly

rie

Pro

65

70

75

80

Asp

Arg

Phe Sár Gly

Ser

Gly

Se τ-

G.l.y

Thr

Asp

Phe

Thr

Lea

Thr

He

8 5

50

95

Ser

Arg

Len Gla Pro

Gla

Asp

ΡΡο

Ara

Val

Tyr

Gye

Gin

Tyr

150

155:

11.0

o.i.y

Thr

Ser Pro Trp

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Tax:

Lys

Var

G1 a

He

Lys:

115

125

Arg

Thr

Val Alá Alá

Pro

Sex’

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Gin

135

140

Gin

Len

Lys Sex' Gly

Thx-

Sin

Se r

Val

Var

Cys

Lea

Len

Asn

Phe_:

Π5

15 ö

15:8

Π5

Tyr

P r :>

A.xg Gla Alá

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asx·

Alá

Len

Gin

1S S

.170

175

Ser

V

Asn Ser Gla

Gin

Ser

Var

Thr

Gin

Asa

Ser

Lys

Asp

Ser

ISO

185

ISO

Thr

Tyr

Ser Leu Ser

Ser

Thr

Lea

Tar

Lea

Ser

Lys

Alá

Asp

Tyr

Gin

195

2 öö

205

Lys

ΚI s

Lys Val Tyr

Alá

Sva

Gia

Val

Thr

hl s

Gin

Gly

Lea

Se r

Ser

215:

215

220

Pro

Val

Thr Lys Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Gin

Gye

·> '> u .< 1- V.·

230

235

<21

0> 98

<211 > 464

<212> FEHÉRJE

<213 > Humán

<4ÖÖ> 98

γ_ν< .._νΊ·..

Ghi

Phe Gly Lea

Ser

Trp

Val

Phe

Len

Var

Alá

Len:

Lea

Ara

Gly

1S3

Η 15

Val

G xxx

Cys

Gin 20

Vei

Gin

Len

Val

Gin 25

Ser

Gly

Vei 30

Vei

Gin

Pro

Gly

Arg

Ser

Len

Arg

Len

Ser

Gye

Thx:

Alá

In

G.;.y

phe

Thr

Phe

3:5

40

45

S ex:

Art

Tyr

Gly

Moh

H.3.3

Trp

Vei

Ara

Gin

Alá

Pxo

Gly

X: y s

Gly

Len

Se

5 5

60·

Gin

Trp

Val

e.ia

Val

I is

Trp

Tyr

Asp

Gly

Sex

hsa

Lys

his

Tyr

Gly

65

10

15

8:0

.Asp

Ser

Vei

Lya

Gly

Ara

Phe

Thr

He

Sex'

Sex

Asp

Asn

Sex

Lys

Asn

8:5

00

95

Thr

Len

Tyr

Len

Geo:

Méh

Áss.

Ser

Len

Arg

Alá

Gin

Asp

Th r

AH

Val

100

105

110

Tyr

Cys

Alá

Arg

Gly

Gin

Αχ-g

Len

Giy

Sex:

Tax-

Phe-

Asp

Tyr

Trp

115

120

125

Gly

Gin

Gly

Thr

Lest

Vei

Thr

Val

Ser

Alá

áé r

Thx

Lys

Gly

Pro

13 Ö

135

140:

Ser'

vei.

Phe

Pro

Len:

Alá

Pro

Cys

S e x:

Arg

Sex

Thx:

Sex-

Gin

Sex:

Thr

145

150

155

160

Alá

Len

Giy

Gye

Len

Val

Lye

Asp

Tyr

Phe

•Pro

ein

Pro

Val

Thr

165

110

115

Val

Sex^-

Trp

As:s

Sex'

Gly

al a

Len

Thr

Ser

Gly

Val

Kis

Thr

Pne

Pro

ISO

105

150

AJ. a.

Ve x

Lex:

Gin

Se r

Ser

Gly

Len

Tyr

Sár

Len

Sex:

Sex-

Vei

Val

Thx-

x 55

250

205

Val

&Ö

Ser

Asn

Phe

G1 y

Thr

Gin

Thr

Gyv

Thr

Gys

Asn

Val

Asp

210

215

220:

his

,ry s

Pro

Sex

Aon

Thr

Gye

Val

Asp

Lys

Thr

Var

Gin

Arg

Lys

Gys

225

2GS

23 5

240

Gys

Val

el. n

Cys

Pro·

Pro

Cys

Pro

Aha

Pro·

Px:o

Val

AH

Gly

Pro

Sex-

2:45

250

255

Val

Phe

Pro·

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Len

Mát

He

Sex:

Arg

250

2:65

210

Thr

Pro

Gin

Val

Thr

Gye

Val

Vei

Asp

Val

Sex-

h.Ls

Gin

Asp

Pro

2:15

200

285

Gin

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

ciy

Val

ein

Val

Ars

As; n

Alá

2A0

205

ahO

Lys:

Thr

Lys

Pro

Arg

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Val

305

310

315

320

Ser

Val

Len

Thr

Val

Vei

His

G lx:

Asp

Trp

Len.

Asn

Gly

Lys

G i. n

Tyx:

525

330

335

Ly s

Gye

Lys

Va!

Ser

Asn

Lys

G1 y

Len

Pro

Alá

Pro

I le

G in

Lys

Thx-

Í&4

049

045

350

He

Ser

Lys Thr

Lys

Gi.y

Gla

F re

Arg

Gin

Fro

Gin

v ai

Tyr

Thr

Lan

·< ÍV JC 2 HU

OGG

365

Fro

Ser Arg

Gin

heh

Thr

CVS

Asn

Gin

Val

Ser

Len

Thr

Gye

370

57 5

5S0

Len

hal

nys oly

Fhe

Tyr

Fre

Ser

Asp

Ha?

Aia

Vei

Gin

Trp

Gin

S<3£

28 5

380

005

409

Asn

ni y

Gin Fro

Gin

As ra

Asn

Tyr

e-ys

Thr

Hr

Fro

Pro

Mar

Len

Asp

4 00

no

415

Ser

Asp

Gly Ser

Fhe

Len.

Tyr

San?

Lys

Len

Thr

Vei

Asp

cys

Ser

420

425

4 30

Arg

Trp

Gin Gin

Giy

Asn

H.I

Fhe:

Ser

Cys

Ser

Val

Kel.

Hls

Gin

Aia

4 05

440

4 45

Len

Fis

Asn Bís:

Tyr

Thr

Gin

Cys

Ser

Len

Ser

Len

Ser

Fro

Giy

Cys

4 50

455

460

<21

0> 99

<211 > 233

<212> FEHÉRJE

<21

3> Humán

<400>

99

Aer

Gin

Thr

B ro

Aia

Gin

Len

Len.

Fhe

Len

Les

La;n.

Len

Trp

Len

Fro

I

5

10

15

Asp

Thr

Gly

Gin

He

Val

Len.

Thr

Gin

Sarr

Pro

Giy

Thr

Len

Ser

20

25

38

Lee

Ser

Fro

Sly

Gi n

Arg

Ara.

Thr

La? o

Ser

Cys

Arg

Thr

Ser

Val

Ser

35

45

Ser

Tyr

Len

Ars

Trp

Tyr

Gin

e r n

Cys

Pro

nr y

Gin

Aia?

Pro

A kő

58

55

60

Len

He

Tyr

Giy

Aia

Ser

Arg

Aias

Thr

Giy

He

Pro

Asp

Arg

65

7 0

7 5

80

Fhe

Ser

Gly

Ser

Giy

Ser

Giy

Thr

Asp

Fhe

Thr

ΰβυ

Thr

1 le

Ser

Arg

85

50

06

Len. ‘

Gin

Pra; ;

Sin Aep

Fsa Ara- Vsi Tyr

Tyr ^:

Gye =

3.2ίΓί ^;;

3.5 :

iyr ?

Sly

Ha:

180

105

H0

Ser

Fro

Fhe

Thr

Fhe

Gly

Giy

Civ

Thr

Lys

Val

Gk:

52-®

cys

Arg

Ahr

115

120

125

Val

Alá

Aia

Fro

Ser

Η i

Fhe

He

Phe

F ro

Frc;

.Ser

Asp

Gin

Len

rss

ISO

I o

O

Lys

Ser Gly Thr Ál a

Sár

Val

val

Gys

Lee

ÁS tt

Asn

PLe

Tyx·

Pro

1«

156

155

ISO

Árg

Gla Aia Lys Val

Gitt

Trp

Lys

Va!

Ásp,

ás a

Áia

Lee

Gla

Ser

Gly

I 65

Ι7Ό

05

Asn

Sex' Gin Gitt; Sex'

Ott

Tör

Gitt

ÁSp

S e r

Lys

Ásp

Ser

Thr

Tyr

ISO

135

ISO

Ser

Len Ser Ser Thr

Lett

Ό

Lett

Ser

Lys

Áia

ÁSp

Tyr

Gitt

Lys

His

195

200

205

Lys

OI Tyx: Áia Gys

Gitt

Val

Tör

6 is

Gin

Gly

Lea

Ser

Sex:

Pro

Val.

.210

SIS

22 0

Tör

Lys Sex: Ptte Ám

Arg

Gly

Gitt

lys

225

<210> 100

236

<211 > 463

<2I2> FEHÉR

JE

<213> Humán

<4Í

>0>

100

Két

GI tt

PLe

Gly

Lee

ser

Tx'p OI

Phe

Lee.

Val

Ál a

Lee:

Lett.

Arg

Gly

I

10

15

Va i

Gin

Gys

Gitt

Val

Gitt

Lett Var

Gitt

Se r

Gly

Var

Val

Gitt

26

25

30

Pro

Gly

arg

Ser

Lett

Arg

Lett Ser

Gye

Thx:

Áia

Se x

Gly

Pitte

Tör

Phe

25

46

4 5

Sex^-

Se x'

Tyx·

Gly

Kel.

His

Trp Val

Ax'g

Gitt

Alá

Pro

Gly

Lys

Gly

Lee

56

51,

66

Gitt

Trp

Vsi

Ara

Val

He

Trp Tyr

Ásp

oiy

Sex:

ÁS tt

I..ys:

His

Tyr

Ál a

65

7 0

75

80

Ásp

Ser

Alá

Lys

Gly

Arg

The Thx'

He

Ser

Arg

Asp

ÁS.tt

Ser

Lys

Ás a

85

90

92

Tör '

Lett Tyr '

Lea í

Un Két ásx; Ser i

lett Árg Alá í

Lm Ásp ^r

Bír Áia ·

?al

160

105

116

Tyr

Gys

Alá

Árg

Ál a

Gly Lett

Len

Gly

Tyr

sitt!

Ásp

Tyr

Trp

Gly

115

120

125

Gin

Gly

Tör

I.er

Val.

Tx:.r

Val Ser

Sex'

Ara

Ser

rhr

Lys,

Gly

Pro

Sex-

ISO

135

14 0^:

Val

Phe

Pro

Lett

Áia

Pro

Gys Ser

Arg

Sex

Hír

S e x:

Gitt

Ser

Thr

Ál.a

145

156

155

160

Ar s

Lee

Gly

Cys

1:00 165

Va 1

Lys

Asp

Tyr

Phe 170

Pro

Gla:

Pro

Va 1

Thr 775

Val

Ser

Trp

Ase

Ser ISO

Gly

Aia

Lee

Thr

Ser 7S5

Gly

Val

Kis

Thr

Phe 780

Pro

Ara

Va.i.

Ls;e

Gla 1S0

Ser

Gly

Lea

Tyr 200

Ser

Lee

Se r

Ser

Val 2G5

Val

Thr

Var

Pro

Ser 2:13

Ser

Asn

Phe

VÍV

Thr 275

Gin

Thr

-m

Thr

Cys 220

Aon

Val

Asp

Hi s

Lys r 2 o

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys 23Ö

Var

Asp

Lys

Thr

Var 235

Gla

Arg

Lys

Cys

Cys 24 0

Va 1

ele

Cys

Pro

Pro 2 45

Cys

Pro·

Alá

Pro

Pro 2 5Θ

Var

Alá

Gly

Pro

Ser 255

Val

Phe

Lee

Phe

Pro 2;SS

Pro

Lys

Pro

lys

Asp 2 65

Thr

Lee

heh

Tle

Se r 270

Arg

Thr

Pro

Gla

Val 71 κ

Thr

Cys

Var

Val

var. 280

Asp

Var

Ser

Kis

Gla 265

Asp

Pro

Gle

Val

Grn 210

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 213

Asp

Gly

Va 7

Gla

Val 30Ö

Kis

Asn

Aia

Ly ⁸

Thr 305

Lys

Pro

Arg

Gle

ma 370

Glr

Phr?:

Aon

Ser

Thr 315

Phe

Arg

Var

Val

Ser 325

Vei

Lea

Thr

v a

Va 1 325

Kis

Gitt

Asp

Trp

Lea 330

Asn

Gly

Lys

Gin

Tyr 3 35

Lys

Cys

όν-

Val

Ser 34C

lse

Lys

Gly

Lse

Pro 345

Ara

Pro

r.iö

Gla

Lys 350

Thr

r re

Ser

ον:;

Thr 355

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 3 0ü

Gle

Pro

Gin

Val

Tyr 365

Thr

Lee

Pro

Ser 37 8

Arg

öle

Gla

Get:

Thr 375

.Lys

A.s n

Gin

Val

Ser 300

Lea

Thr

Gye

Isse

Var 385

'Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 3 SO

Ser

Asp

r r s

Alá

Val 315

Gin

Trp

Gin

Ser

Asn. 400

Őry

Gle

Pro

Gla

?.ST; 405

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 4 70

Pro

Let

Lea

Asp 115

Ser

Ase

Gl y

Ser

Pite 420

Phe

Le a

Tyr

Ser'

Lys 425

Lea

Thr

Val

Asp

Lys 4 3Ö

Ser

Arg

Trp

Glr

Sin 435

Gry

Ase:

Val

Phe

Ser 440:

Cys

Ser

V a 1

heh

Hí 3 4:4 5

Gle

Aia

Lee

Kis

A:s a 150

Pia

Tyr

Thr

Grn

Lys 4 55

Ser

Lett

Ser

Lea

Ser 4 6:0

Pro

Gly

Lys'

<210> 103 <211> 234

1S7 <212> FEHÉRJE <213> Humán

Get

<4ÖÖ> Gin: Thr

101 Pro

Alá

Gin.

Len

The

Len

Lan

Trp

Len

Pro

1 Asp

Thr

Giy

Gin

Lle

Val

Len

Thr

10 Gin

Ser

Pro

oly

Thr

LS Len

Ser

Lea

Ser

Pro

28 Giy

Gin

Arg

Al.a

Thr

25 Lan

Ser

Gye

Mg^-

Alá

ősi Ser

Hn:

Ser

Vai

Ser

55 Ser

Tyr

Len

Ai a

Trp

48 Tyr

Ilin

Gin

Lye

Pro

45 Giy

G ón

Alá

Pro

Arg

SS F r o

Len

He

Tyr:

Giy

55 Vai

Ser

Arg

Alá

50 Vhr

G.i y

He

P r o

Asp

05 Arg

The

Ser

í::J.y

Se r

7& Gry

Ser

Giy

Thr

Asp

75 Síre

Thr

Len

Thr

He

88 .Ser

Arg

Lan

Glu.

Pro

83 Gin

Asp

The

Aie

Vali.

00 Tyr

Tyr

Cys

Gin

55 Tyr

Giy

iie

Ser

Pro

1518 The

Thr

The

Gl.y

Pro

105 Giy

Thr

Lys

Val

Asp

110 He

Lys

Arg

Thr

Va 1

12,5 AH

Alá

Pro

Ser

Val

120 The

He

The

Pro

125 Ser

Asp

Gin

Gr a

ie-n

138 Lys

Ser-

Giy

Thr

Ara

135 Ser

Vai

Gye

Lan

140: Len:

Asn

Pne

Tyr

145 Pro

Arg

Gin

j. a

Lys;

150 Vei

Gin

Trp

Lys

Va 1

155 Asp

Asn

Alá

Len

Gin

188; Ser

ni y

Asn

Ser

Gin

185 Gin

Sár

Vai

Thr

Gin

IVÓ Gin

Asp

Sar

Lya

Asp

175 Ser

Tar

Tyr

Ser

Len

150 Ser

Ser

Thr-

Len

Thr-

185 Le:u

Ser

ny a

Al.a.

Asp

198 Tyr

Gin

Lys

105 iis Lys Vai ‘

Tyr Aia í

200 lys Gin Vai Thr ;

Sir Gin

Ily

285 Len ,

Ser ;

Ser

Pro

Vai

210 Thr

Lys

Ser

Aha

Asn

215 Arg

Giy

Gin

Cys

228

225 238 <21Ö> 102 <211>451 <212> FEHÉRJE

18$ <213 > Humán <40Ö> 102

Gin 1

Val

Gin

Leó

Val 5

Glo

Ser

GI y

G.sy

Sly IC

Va 1

Val

Sin

Pro

o ö y 15

Arg

Ser

La:.:

Arg

Leó 20

Ser

Cys

Alá

Ser 25

Sly

Phe

Thr

Phe

Sex 30

Ser

Tyx-

Gly

Sfet.

Kis 11

Trp

Val

Arg

Gin

Al a H

Pro

Gly

Lys

Gly

Lev 45

G.l a

Trp

Val

Ara

Val 50

1 le

Trp

Tyr

Aga

Gly 5 5

Ser

Aon

Lys

Tyr

Tyr 66

Sla

Asp

Sor

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

He 70

Ser

Arg

.Asp

As:n

Sex: 75

Lys

Aso

Thr

Le v

Tyr 80

Len

GI n

Kei

Asn

Ser 81

Leó

Arg

A.í a.

elv

Asp· PC

Thr

Alá

VO:1

Tyr

Tyr SS

Cys

Alá

Arg

Asp

Pro LQO

.Arg

Gly

Als

Thr

hév 105

Tyr

Tyj·: 11G

Gly

htot

Asp

Val

Pro 115

Gly

Go.:n

Sly

Thr

Thr 120

Val

Thr

v a i

Sor

Ser 125

Alá

Ser

Thr

Lys

Gly 130

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 12 h

Lev

Alá

Pro

Cys

Ser 140

Arg

Sex:

Thr

Ser⁷

elv 145

Ser

Thr

Ara

Leó 150

Gly

Cys

Leó

Val

Lys 155

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glv 160:

Pro

Val

Thr

Val.

Ser 165

Trp;

.Aso

Sex-

Gly

Alá 1 TG

Lov

Thr

Ser

v i y

Val 17 5

He

Tfer

Phe

Pro

Ara 180

V a 1

hév

Gi n

Ser

Ser 18 5

Gly

Leó

Tyr

Ser

1:OO: ISO

Ser

Val

Val.

Thr 195

Val

Pro

Se·:

Ser

As:o 260

Phe

Gly

Thr

GlXi

Thr 20 5

Tyr

Thr

Cys

Asn Val Asp 1 210

He Lys :

Pro :

Ser Aso '] 215

Ohr Lys '

7a1 Asp 220

lys: Thr ’

Va l í

31 v

Arg 225

.Lys

Cys

Val

Siv 210

Cys

Pro

Cys

Pro· 235

Ars.

Pro

Val

Ara 24 G

Gly

Pro:

Ser

Val.

Phe 24 5

Lev

Phe

Pro

Lys 250

Pro

Lys

Asp

Thr

Lea ··.· £ c. .<· x.'

Kel::

He

Ser

Arg

Thr 260

Pro

Glv

Val

Thr

Cys 265

Val

Asp

Val 210

Ser

Rí a

Glo

Asp

Pro 235

elv

Val

Glv

Phe

Asn 280

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly 283

Val

Siv

Val.

Rí s

Asn 260

Alá

LOS

Thr

Lys

Pro 285

Arg

elv

Glv

Gin

Phe 300

Asn

Ser

Thr

Phe

!:S9

Arg

Tel

Tál Ser

Vsa

Lea

Thr

Vei

Vai

Kis

Gin

Asp

Trp

Lea

Asn

Giy

305

310

325

320

Lys

Gia

Tyr Lys

Gye

Lys

Vai

S fi r

.Asn

Lys

Giy

Lea

Pro

Aia

Fr a

íie

7 2

330

335

Gin

Lys

Tar iie

Ser

Lys

Thr

Lys

<:;.Í.y

G1 tx

Pro

Ax'g

Gia

Pro

Sin

Vei

340

345

350

Tyr

Thr

Leu Pro

Pro

Ser

.Arg

Gru

Glu

heh

Thr

uys

Asn

Gin

Vai

Sex-

355

SCO

553

Le a

Tar

Cys Lee

Tar

Lys

Gry

The

Tyr

Pro

Se r

Asp

He

Ara

Vai

ei'.,

37 0

375

320

Trg

Gia

Ser Asn

Gry

Gr n

Pro

G.Í a

Asn

Tyx·

Lys

Thr

Pro:

Pro

38 5

330

305

420

Két

Lea

.Asp Ser

Asp

Giy

Sex'

Phe

Lea

Tyr

Ser

Lys

Lea

The

Vai

405

41.0

415

Asp

Lys

Ser Arg

Trp

.7 ir

Gin

Giy

Asn

Vei

The

Ser

C ys

Ser

Ve. r

Mer:

420

425

4 30

Kis

Glu

Alá Lea

Kis

Asn

Kis

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Lea

Ser

LfiU

Ser

4 35

4 40:

4 45

F x o

Giy

Lys

4 50:

<21.0> 1.03

<21

1> 214

<212> FEHÉRJE

<21

3> Humán

<400>

103

Asp

Lle

2 r n

Méh

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser:

Ser

Lea

Ser

AI,a

Ser

Vai

t? J. y

1

y

10

15

Asp

Arg

Vai

Thr

őre

Thr

Gys

Arg

ar—

Ser

Gin

Ser

Lle

Asn

Se x

Tyr

20

25

30^;

Lea

Asp

Tx-p

Tyr

Gin

Lys

Pro

Giy

Lys

Aia

Pro

Lys

Lea

Len

íie

35

4 0

45

Tyr

Ar a_:

Aia

Ser

Se x

Len

G1 a

Sex'

Gl y

Vai

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Giy

50

55

60:

Ser

Gry

Ser

u* r y

Thr

Asp

Phfi

Thr

Lea

Thr

Lle

Ser

Sex

Lsa

Glx;

F.xo

SS

7 0

7 5

£· 0

Gia

Asp.

Fhe

-la

Thr

Tyr-

Tyx:

Cys

Sir·

Gin

Tyr

Ser

Thr

Pro:

8 5

80

35

39(3

Thr

Phe

Gry

Tre ioo

Gly

Thr

Lys

bal

Gin 105:

lle

Lys

Arg

Thr

bal 110

Alá

Pra

3 e r

bei

Phe

Tle

P'LS

Tre

Pre

Ser'

Asp

Gin

Gla

Len

Lys

Ser

Gly

11.5

120

HS·

Thr

Ars

Se r

vei

bal

Cys

Len

Lse

Asa

Asn

Phe

Tyr

P

Arg

Gin

ála

130

133

140

Lys

bal

Gla.

Trp

Lys

bar

Asp

Λι Sí?

.ara

Len

.Gla

Ser

Gly

Asa

Ser

Gin

145

ICC

155

160

Gin

Ser

bal

Thr

Gin

Asp

Ser

a y s

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Len

Ser

1 65

170

175

Ser

Thr

Len

Thr

Len

Ser

l'VS

Ara

Asp

Tyr

Gin

Lys

Ais:

Lys

bel

Tyr

ISO

135

190

Alá

Cys

Gin

bar

Thr

his

Gla

Gly

Len.

Ser

Se r

Pro

bal

Thr

Lys

Ser

105

200

205

The

Asn 211

Ar g

Gly

Gla

Cys

<21ö> 104 <211> 22 <212> DNS <213> Humán <400> 104 eaggtgnage: r ggagcegs:;:: g <210> 105 <211> 24 <212> DNS <213> Humán <400> 105 gctgagggag tsgsgtscTg sgga <21 G> 106 <211>· 49 <212> DNS

19!

<213> Humán

X ggac <210> 107 <211> 46 <212> DNS <213> Humán <400> 107 <210> 108 <211>9

<400> 108 <210> 109 <211> 45 <212> DNS <400> 109 :atg aaaaccccag

1.10

192 <21I> 43 <212> DNS <213> Humán <400> llö ttctfctgatc ayaatectca ataa esetet aeeeegttga agc «210» 111 <211> 48 <212> DNS <213» Humán <4ÖO> 111

Oettcaaget tgccagegcc cgc:c:a:ccatg yacsrgaggy tceccgat <210> 112 <211> 1392 <212» DNS <213» Humán <400» 112 atggagtttg gyehyagctg ggttttaatc gfctgatcták t.aagaggtgt gtgaagctgg tggagtctgg gggsggegtg gtecagaatg: ygaggtccet tgkgtagegt etggattcac ettaagtsyc eafcggcatgc sctgggtceg ggcaayyagc tggagagggt ggcagttata tg-gfe&tgstg gaagasataa gaotccgfcga sgygaceaL: oaccarctcc· agagacaatt: ocaagaasac aaaatgaaca gactgagaga cgaggaaaag gcfcgtgtsfcfc. aatgtgagag fcfccggfccctt tfcgaatactg gggccagyys sceetygtcs ccgtctccfcc aagggcccat cggtottccc ccfcggcgccc ’lgctceagga gcaectcaga geactgggct gcotggtcaa ggaatacfcfca cccgaaaegg tgacggtgfcc ggcgatcfcga ccageggcgt: gaaaaacttc caagcfcgfcaa taoagtacco tccctcagca gaytgyáyaa cgfcgcoofcoc agcaacttcg gaacccagac a a. égte ysne acaageacag exaaeaecsa g gtgyaesags cagctgagey gtcgagtgcc c.accgtgccc agcaacacct gtggeaggae cgfceagtctt eeagtgtcag 60 gagactctecl20 eaaggH: aa-H80^:ataetatgeari0 gctgtfctetgSOO aggaggtcac3&0 agcet aaaceHl gagc.~ca.gag4 Sö •gtggaactca'S-4 0 aggaotctacGOO cfcacaccxgcO-ö-O· csaatgttgfc720 cetettceeeOSO

193

·1'Ο <13.	aggaesccct	eafcgatetec	eggaeeeerg	aggteargtg	e gt gg t ggé g S 4 0
gacgtgagee	acgaagaecc	cgaggfcecag	ttcaactggt	a.i.rghgg.3 egg	egaqgaggtgOOO
cataatgeca	agacaaagce	acgggaggag	cagtteaaca	gea egtfceeg	tgtggt: cagcOSö
gteet: eaecg	ttgfcgcaccs	ggsctggctg	aacggcaagg	agtacaagtg	esaggteteel020
aac&asggee	tX'ccsaocí:·:	eategagaaa	accatctecs	aaaeeaaagg	geageeccgalOgO
gaaecaeagg	tgtacacert:	yeeccatce	cgpgsggaga	teaeeaagaa	ccaggteagclliO
ctgacctgcc	tggteaaagg	eh í: cac *e c e	agegaeateg	ecgtggagtg	ggagageaat1200
gggyageegg	agaacsaeta	c aa gacca oa	e et.ee aa. tg c	tggacteega	cggetectte:.26O
;: tcci: ctaca	geaagrteae	egtggacaag	agcsggtgge	agcaggggaa	egtcttetealOSO
tgetecqfcga	tgcatgagge	tctgcacaac	eaetacacgc	sgaagageet	ctecetetct13S0
ccgggfcaaa::	g_;.				1092

<210 <211 <212 <213 <400	> 113 > 708 > DNS > Humán >113
atggaaaeee	cageqeaget	tel rt.fcccte	rt.gctsetrt.	ggetcccaga	tsccaecggs	eo
gaaattgtgt	tgacgcagte	tccagycacc	ctgt etttgt	ctccagggga	aaeagceaee	12«
ctcrtcdgca	cqgycggtca	gggtattagé	agcsgettet	t a geeteg:: a	ccagsaasga.	140
ectggccagg	cteeeaggct	ecteátChat	ggtgca::eca	gcagggceac	tggeateccs	2 40
gaegggrtca	qtggcsgcgg	gtetgggaea	ea e tt ea. c ί. e	t ::: a eea tea g	eagsctggag	000
cetgaags t:fc	ttgoagtgta	ttactgteag	cagtatggta	ccc cs ece tg	gaegtfcegge	000
eaagggacca	aggtggaaat	eaaaegaact	gtggctgeac	caletetett	eatettectg	42:0
eeatetgatg	ageagttgaa	atetggaact	gcetctgttg	tgtgcctyrt:	gaataae:: te	401:
tatceeagag	:á í: <<<?· L	aaagtggaag	gtggataacg	Cgyt C	gggi: aaetee:	04 0
eaggsgagtg	tcaeagagea	<í Cl a <73. Q <:	gacagcaeet	::: C <j g C e t Cst p	cagcsecety	600
scgctgagca	aagcagacta	ccíHiqsaacac:	asagtrt.acg	eetgegaagt	eaeceateag	600
ggeei: gaqct:	ogccegtcse	.3:3:&^:CT£iC} Ctt'C	a ács g gg g a g	agtgttsg		7Ö8

<210> 114 <211> 1395 <212> DNS <21.3> Humán <400> 114 atggaptltg ggctgageOg ggtti:tcctc gttgetet: t: t t&agsggtgt ccagtatcag 60 gtgeagetgg tggagtetgg gggaggegtg gteoagcetg gyaggtacrt: gagart:c:t:cc 120

194

tgtaeagegt	etggatteae	etteagtaae	tatggcatge	.<3 aggg i. e g	ccaggctcca 180
ggcaaggggc	tgeaetgggt	ggeagttata	tggtatgate	gaagtaatss	aeactatgga 240
gaetcegtga	agggeegatt	eseeatctoc	sqteacser :	eeaagaaeae	getgí.atetg 300
e-saatgaaea	qeetgagagc	egaggacseg	cetetgtatt	actgtgegag	aggsqagaga 360
etggggtcct	aott t gael. a	e: ggggcca g	ggaaoeetgg	tesccetctc	efccagcctce 420
a e ca a y g g e c	est egetett	ecccctggeg	eeetgetcca	ggageaeet e	egagageaes 480
G t.\,o	getgeetegt	eaaegaetae	tteeeegssc	eggtgaeggt	gtcgtggaae 540
t e a g gégét e	t gaccagegg	cgtgeaeaee	ttcccagctq	teetaeagte	cteaggaete 600
^:tact.ccet«a	gcagagtggí	gacegtgeec	tcesacaart	tcggeaceea	gaeetaeaee 66.0
tgeaaegtag	átesésagse	cagcaaeace	a a get aga ca	agseagttga	gegoasstgt 720
tgtgtcgagt	geceaecgtg	c c cs o c 3 cc 3.	eetgtggcag	gaecytcsgt	etteetcfctc_? 780
ccsccs3sac	ceaaggaeac	C C £· C 3. ΐ. Cí S tlC	reeeyyá eC o	ctgaggtcac	gtgcytggtg 045
gt ggaegega	geeacgaaga	eeeegaggte	eset t eaaet	ggtaegtgga	eegegtggsg 900
gtgcataatg	eeaagaeaaa	gceaegggag	cagcsqt t ea	aeageaegtt	cegtgtggte 860
ageetcetea	cegttgtgea	ccaggaetgg	etgeaegges	aggagtaeaa	gtgcaagete1020
tceaae&aag	geo i. cecsísc	eeacategag	aaaseea eet	CC 3 3.33 CCc: <5.	a gg g eagee cl0 8 0
egagaaccac	aggtgtaeac	cet g e e ee ea	teeegggagg	sciatgaccNSs	gaaecsggtel140
sgectgaeet	qeetggteaa	aggottcfcac	cccaeegaea	tegeegtgga	gtggg&gaccleOO
aatgggeage	eggagaaeaa	elaaasgsce	aeaeetecea	t. go a g g s e t. e	o gae qge t c el 2 6 0
é tetteetet	a. ea g easg e t	eaeegtggae	.a agago a ggt	ggoagcaggg	gaaoytoi: tol320
tea égeteeg	tgatgeatga	ggctetgcae	aaeeaeeaea	egeagaagag	c et et ecetg1300
tctcegggta	aatga				1335

<210> 1.15

<211	> 702
<212	> DNS
<213	> Humán
<400	> 115
atggaaaceo	eagcgeaget	tetettecte	getaei: et	yyefceccaga	t — e Ο·— Oegg	60
eaaattgtgt	tgaogoagtc	tocaggeacc	et gtctttgt	otooagggga	aagagoeaee	120
e t c t ect ee a	ggaeeagtgt	tagoagoagi	tacttagcet	ggéaccaqca	gaaaeetgge	180:
eaggctcccs	ggctcctoat	otstggtgoa	tceagcaggg	ccactgeoat	eeeagaeagg	240
ttc.agtg.gca	gtgggtctgg	g a ·::: ag ac 1t c	se-et eacce	teagoagset	ggageetgaa	300
gattt tgoag	cetattacég	tcagoagtst	ggcatct eae	oetteacttt	eggoggsggg	360
aceaaggtgg	agatoaageg	aaetetggct	y ea c ca e e l. g	tettestett	ό ί,. ea 3.o	420
qatgageagt	tgasatcégg	aactgcctct	gttytetgee	tyetgastsa	ettetateoe	480
aeagaggeea	aagtaeagtg	gaaggtggat	a a cgc ee t ee	aatcqggtaa	et eeoaggag	540
sgtgteaeag	sgoaggaoag	eaaggacage	aectaeagoo	teaycagcae	cetgaegetg	600
sgeasagcag	actacgagaa	scaoaaayte	taeeeotgeg	asgteaecea	tcagggectg	660
aye a cg eeeg	te a. e a a aga g	ettcaaeagg	ggagagtgtt	ae		702

Ϊ95 <210> 116 <211> 489 <212> DNS <213> Humán <4ÖÖ> 116

aatgggaggt	ookgagaot	otcctgkgea	gcgtotggat	tcacattoag	tsgk.oatgge 60^:
arc csak: agg	tcagcoaggc	tooaggcaag	gggatggagt	gggtggcagt	k atatggk.at	120
gatggasgaa	sí <. a a et g λ o.. a	tgaagaetac	gtga.agggcc	gattcaocat	etceagagac	ISO
aattccaaga	agacgetgts	ttkgaaaatg	a .a ·..: ag o ·.: i. ga	gagcegagga.	cacggotgtg	240:
tatfcsctgkg	cgagagrggc	cooactgggg	ecscttgacr.	set gggg;::ca	gggaagcetg	320:
gtcaccgtct	eetoagtctc	C::n:í-Q<«Q'C'	ccstcggfcct	tccaeetggc	gcooagctoo	3 60:
aggagoacct	aag 'a^;í a geat	agcggcaatg	ggatgcctgg	tesaggset-a	attcooogaa	428
ecggtgaagg	tgtcgtggsa	at-aggeget.	cfcgaoeagcg	g cg t g c a. a a c	cfc t c tea gat	ISO:
g 11 o t. a.cjeg						489

<210> 117 <211> 417 <212> DNS <213> Humán.

<400> 117 gycaaectgt atttgtattc aggggaaaga yacaaoek.ct octgcagggc cagtcagagt 60 gáesycayet acttagcctg gtaaaagcag aaacttggaa aggok cocag aatcctaatc 122 tatggtgcak. coagtagcjgc. cactggcakc ceagacaggt teagtggasg kgggtcrggg ISO acagacttca atetaaaaat cagcagactg gagcckgagg atkttgosgt gtakkactgk 240 cagcagtatg gasggtcaac atteacttta ggcoctggga. ccaaagtgga tateaagaga 300 aatgkggctg caaeatatgt attcstctte ccgccatatg atgagcaytt gaaafcccgga 360 acfcgectatg :: k.gt.gt.gcct gctgaataac. rtatstccaa gagaggccaa agtaasg 417 <210> 118 <21 !> 1392 <212> DNS <213> Humán <400> 118

196

atggagt t fcg	egetgagctg	ggttt ecete	gtt.gcfccfc.tfc	fcaagsggtgfc.	ccagtgtcsg 60
gtgcagctgg	tggsgfcctgg	SSgaggcgtg	gtoysgccfcg	ggaggtacet	g&gsctcfcec 129
fcg'fcacsgogfc:	etegattoac	cttoagfcagt	tstggeafcac	actgggfccég	c ca ggct.cc a 18 Q
ggcaaggggc	tggagtcay;:	ggcsgfc aaaa.	tegcatgatg	gangosa fcaa	scaetatgca. 240
gaeteogcga	agggcegafcfc	c a e Cd te... c e	agsg&csstfc	eesagancsé	gefcgfca.fcetg 332
caaatga&ca	gcctgagago	agaggaaaag	gcfcgfcgfcatt	aetgfcgegag	agecggacfcg 360
ctg.ggfc.tact'	tfcgactactg	gggecsggga	acet y g e ea	ecetet cete	a-gcetecaec; 4 20
aagggoceat	egetcfc fc ccc	cctggcgeee	tgcfcccagga	gescefc coca	gagcacaycg 480
gccctgggct	g c e.e gyt ess	g g a cfc a e e a e	eccgaaeegg	tgaegqtgfce	g fcggaacfcea. 59 0
ggcyetctga	aa o a g g o g a	gaaoaocfcfcc	eesgctgtcc	taeagtcctc	aggacfcefc.sc 600;
tceoícagca	gcgtggfcgae	egtgccefcoo	ageaaattcg	gcacccagac	cfcaeaccfcgc 660
aacgtagstc	acasgcccag	cssaaceaag	gfcggscaaga	cagttesgcg	caaatgttgt 720
gogagfcgcc	,.· <5.--.. C -.j ;. g .'-· ;.- ’·^	ageaeaacct	gtggcaggae	cgteagtcfct	ectctfcoccc 78Ö
CCSa OÜ3.	a g yae ac cet	cafc.g.stcücc	cggaccccfcg-	sggtescgfcg	ogfcggtgqfcg 890
gacgtgagc-c;	<3 í.f Delei <3 <3. Dö/C	cys g'gr.cmag	et esscfcggo	acgtggsegg	ggfcggaggtg 900
cafcaatgceá	agacaa-ügcc·	acgggsggag	csg fc fc.eascs	gcacgfctceg	tgtggteagc 960
go ce t a a cég;	ctgtgoaccs	ggaetggctg	aacggcaagg	agtacsagfc g	ca a ggtctcelOaO
sacaaaggee	fc eccsgeecc	cafc aga ga a a	... W&	swisC’v et ’.'i r.í o q	gcayccccgs 1 08 0
•o a a ecaea gg	a. e accc a	geeccea fcec	cggyaggsgs	fc.gaceaagas	ooa gg t ca g c 114 0
efc.yseefcgoe	tggte.aaa-gg	cfc t cfc-a ccc c	agegacatcg	ecgt;ggagfc;g	ggagagcsafc 12-00
gggcagoogg	agasesaefc.a	csegaooaca	cctcccatgc	tggacteega	egg cfc cet te12 50
ttcetetács	geaageteae	cgtggaeaag	ageaggtggc	agcaggggss	cgóccccfccal320^:
fcgefccegfcga	t.gaa fcgagyc	aefcgcseaac	cactacacge	a g a a g a g e e fc.	cfcecetetcfc1380
cegggtaaat	ga				1392

<210> 11.9
<211> 705
<2Í2> DNS
<213> Humán
<400> 1.19
a t g gaa a e c o ca g e gca g c t	tet caaeste	etgcfcacfcct	CM7CCC <j.CJ<3.	tsocacegga	59
gaa a fc fc. gt g t t g a cgcaefc c	fcecaggcace	efcgtefcfctgfc	ctccagggga	<3.323 CCfcS-CC	120
ctetcccgts gggccsgtca	aagtgttago	agetsefcfcag	cc'fcggtacca	:ú C <3 3- él O C 0	280
agccaggctc ccaggccccfc	catctatggfc	<3 u CC'-S§C-3.	gggccactgg	C-á ti CC 03 23 ;á C	249
a gg11 ca g t g gca g fcgggfce		ttcsctctca	ceateageag	fcfc 2 'tOtí S U>: O '·.J U	300
gssgattfc fc g cagtgtafc fca	cfcgfccagcag	taaggtaaefc	caceattcac	tttcggcccfc	359
g-ggaccaaag fcggafcátess	aegasctgfcg	get g ca·::: est	etetettest	efctccegeea	420
tcfcgafcgage ag fcfcgaaa fcc	fcgga.act.gcc	fcofcgttgfcgfc.	gcetgcfcgaa	taaet.fcctafc	489
eccagagagg ceaaagtaca	gtggaaggtg	fc? <1 <, ááfc- 'g CD'2	tccaateggg	tsscfceceag	34 9^:
gagagfcgfcca eagagcagga	O<3 QC';:iŐ:C.	agcaeefc. ács	gecteagese	eaeccfcgaeg	LÓG;

19?

t g α g c a a a g c a ga-c t-a cga e t g a g c t c g e -c c gt oa caaa	gaaacaeaas gsgctteása	gt ctacgcet aggggag&gt	gcgaagtesc gtfeag	eeates gygc	687; 7 05
<210> 120
<211> 507
<212> DNS
<213> Humán
<400> 120
ggcgtggtee agectgggag	gtecetagya	efectectgtg	cagcgt ct gg	atteacette	60
agtagctatg ga«:tgeactg	ggt ccgccag	get ccaggca	aggggetgga	gtgggtggea	129
gtt atatggt a 1: gatggaag	taataaatae	tstgeagaet	ecgtgssygy	eegattesee	ISO
a t c t c ca ga g a c a a t tea a a	gaacacgctg	tatétgcaaa	tgaacsgeet	.gagagccgag	24 0
gacacggctg tatatesetg	tgegsgaggg	geeegtataa	tsacccettg	tatggseete	509
t g ggg α ca a g ggaccacgg t	eacegtetee	tcsgcetccs	C3 5. SCCfC) 3 3 3'	ateggtette	2 60
cccctggcgc eet:get eeag	gagcacctcc	gags<g cseng	<3 <3 Q :C' 3 ί I-1. 3 <3 Q	ctgcet ggte	429
aaggactaet tccccgaa-cc;	ggtg a eggt g	tegt ggaaet	caggcgetet	gaccageggt	46 0
gtgcacscet tceeagetgt	cetatag				507
<210> 121
<211> 458
<212> DNS
<213> Humán
<40ö> 121
cagtctccat cctccctgtc	tgeateíyta	ggayacagsg	fccaccateac	tteccgggea	69
a g t e a g a g ca 11 a a e.a cc t a	tttaatttgg	tatesgeags	saecagcgaa	ege ecet a se	120
ttettgátét etgetaeat;;::	estt1 tgcas	agtggggtec	catcaaggtt	ccgt y y cagh	180
g g ctctggga caa a1tt esc	teteseeatc	a a ca a t. e 11 e	atcctgaaga	ttttgesset	249
t a et a.e t gt e a a ca ga gt t a	eagtaccccs	átesettheg	geeetgggae	casagtggat	30 0
a t e a a se gaa etgtggetgc	aecatetgtc	ttcatcttcc	egccaáetgs	á yagcagttg	360
sast ctggsa ctgcctctgt	tgtgtgeetg	ctgaataact	tetateeoag	sgaggccaaa	420
gt a c a gt gga aggtgg afcaa	ca- eee t.eca s	tcgggtaa			4 38

<210> 122 <211> 501 <212> DNS <400> 122

ggcgtggtcc	agectgggaq	qt ecet gaga	ctctcctgtg	taqegretqg	at teatette	60
agragtcatg	gcatccactg	ggtoegccag	getccaggcs	ággggctgga	gtgggtggca	120
gttatatggt	atgaéggaag	aaataaagac	fcafcgcagact	ecgtgaaggg	ccgatt-cac-c	ISO
atctccagaq	aeaattccaa	gaa.cacgct-g	tatt ageaaa	t.gaacagcct	•Q <$.C ;:t C C Cgi3 C	240
gacaaggétg	tetettsctg	tgegaqagtg	gccceaetgg	qgeeaettga	etactggggc	300
cagggaaccc	tggtcaccgt	ctccfccagee	tccaccaagg	gcccatcggt	cttcceectg	300
gegeretget	•ccaggagcac	eteegaeage	aeagcggecc	tgggetgcct	ggteaaggae	420
t a c te e. öreg	aaeeggtgae	qqrgtcgtgg	aacteaggcg	etetgaeea.g	eggegtgeae	480
a c c t <. ccc a q	ctgtc.ct.aca	g				501

<210> 123 <211> 426 <212> DNS <213> Humán <400> 123

tcLccaygca	ecetgtettt	g'fcCt eeaggg	.gaaagagcca	ecetetcetg	C í5.i	00
eagagtatta	gcagoaattt	ofcfcagccteq	taecsgcaga	aacctggcca	egetcetagg	120
cfcectcafcct	afccgteeafcc	cagcagggee	aeaggért.:::	caqaeaqttr	cagtggcagt	180
gggfcctggga	cagaettca c	tcteaceafcc	agcsgactgg	ageergagga	fcfctfcgcafcta	240
tatesetgte	agcagtatgg	tacgtcacca	ttcecrttcq	cjc c c ΐ <} < £ c< d c	eaaagtggat	300
afccaagegaa	etgtggctgc	aecat efcgte	ttcatettee	ceccatctga	tgsqeagttq	300
aaafcctggaa	gcctetq t	tgfcct q-cctg	ctgaafcaact	tctatcccag	<5 D<3Ö2C3<3 <3D	420
gt a rag						426

<210> 124
<211> 516 <212> DNS <213> Humán
<400> 124
t eggqeeeaq gaetggt.gaa	ecettcacag	<3 V CCtí<2teCC	t cacctgcac	tqtcfcctggt	00
g g c t c e a t ca g e a g t g q t gg	teact a.ct gg	:*t ',· v.· <- v·: <7D 2·	: g cc s g c-et ccc	agggaagg.gc	120
etggagtges fctgggfcacat	ctattacatt	9g9<:í2iCöC2;:t	actaeaacee	grcceteaag	ISO
agtegs-gtta ccatatcagt	agseaegtet	asgaacoagt	teteectgaa	getgagetet	240
g t g a c tgcc g cg g a c aegg.c	egtgtsttat	tgtgcgagag	atagtqggga	etaetaeggt	300
afcagscgr ct gggqceaagg	qa ee ae gqt e	<3 m g ΐ. C t CC t	cagcfc tccac	caagggceca	360

199

t c cg-fc ctt c c <: ccgg cgcc	etgctccagg	a ges: cet cc g	S. 2:3 QC 5k <5 C	egeee:: ggge	42©
fe ycctggtca aggactactt	CCCCQ etek C C 9·	ytgacggtgá	cgtggaactc	90 cg e cc ~ g	480
sccaycggcg tgeaeacctt	eeeggetgte	ctseaa			518
<210> 125
<21 í > 465
<212> DNS
<213> Humán
<400> 125
tctccagact ttcagtetgt	gactccaaag	gagasagtea	ceateaccag	ccgggttagt	88
ca gagca11g gtagtag11t	acattggtst	cagcagasae	tagattagte	tcisssgcti	120
ct e a t ca a g t a fc gt 11: <; cc a	g t o c 11 e a e a	ggggtcccct	cgaggtfccag	tggeagtgga	180
tetgggaeag atttcaccct	caccatcaat	agcctggaag	ct ga&gatgc	tgcaacgtat	840
i:set gt ea t e agagt a g t a.g	ttt-acegcr a	set 1 teggeg	gaaggattaa	ggtggagatc	800
a a a c g a ac c g t gg c t g ca cc	aa aa g ·:.?·;: c	atetteeege	catetgstgs	gcagttgaaa	580
t e t gg a ac t g cet c t gt t g t	gtgcctgctg	aataact föct.	ά te e ca g s g a	ggccsaagta	420
cagtggaagg aggstasegc	cet ccaat cg	ggt aact.ccc	aggag		4 65
<210> 126
<211> 459
<212> DNS
<213> Humán
<400> 126
cc t g gga g g t c cet ga ga c t	ctcctgtgea	gegteéggat	tcacettcag	tagteatgge	60
at: ceae::ggg teegccagge	teeaggcaag	gggctggagfc	gggtggcagt	tatatggtat	120
g atggaa gaa at a aagacta	t gcagsc;: cc	ytgaagggec	gattcaceat	ctceagagac	180
a a 11 cca a g a· a cac g e t g t a	tttgcaaat-g	a acageccga	gagccgagga	eaeggetgtg	240
tattactgtg cgagagtggc	cccactgggg	ecset tgsei:	actggggcca	g g ga.:Í eee ~. g	800
gtcsecytcc cecesgectc	ülőt kJ kJ 5i5i u Qü 0	ecat eggt ct	tecetetggt	gccctgttcc	388
aggagca.ctt ecgagageat	::1 <JCx3<JCGCt<k	ggetgcetgg	tcaaggacta	c t1 c c ccga a	420
c c gg t g a c g g t g t cgtgg a .a	O '’.’ iik’U kJ ClQ k?·				4 S 0

<21ö> 127 <211> 440 <212> DNS <213> Humán

208 <4Ö0> 127

cagtota tag	gaaaaatgta	t t:tetateca	ggggaaagag	tearratatc:	atecagggra	68
agtaagagtg	tasgeagata	cttagrctgg	i: arragaega	a a a a i.q gr ,.. a	g get. tat agg	120
a γ. a. r.a a a art	atratgasta	cagaaggaar	aatggrataa	aagsaeggtá	aagrggragt	ISO
gggtetgaga	aecjaattaea	tctcaccatc	agragsetgg	agacfegagga	ttátgaagác	218
tatt.aotgtc	aaaagtaá gr	taggátat te	trcactttcg	garataggat	aaaartagea	300
ateaagagaa	ctgfcggctgc	arratetgá a	ttaeaattac	aga tat a t. q a	tgagcagtt-g	360
aaatctggaa	·—· t g a ca a g t	tgágágtatg	aá gaates ct	tctatcccag	agagrácsaa	120
gtaaagtgga	.aaggtggafca					440

<210> 128 <211> 503 <212> DNS <213> Humán <400> 128

ggagtggtcc	— g a a a g gg a g	gtrratgaga	atct eet.rtx;	ca rte tat gr	et t aaart te	SO
agtsgrtatg	gaagraatg	ggtccgccag	gctrasggca	sggggrtgqa	gtgggtggta	128
gttatatggt	atgatgqaag	tastaaataa	tatgaagact	acgtgaaggg	tagattaaee	ISO
atct aaegag	e caatt ccss:	gaarecgctg	tattágraaa	t gaacagrrt.	aegagtageg	240
gaascggatg	tgtat tarta	tgrgagagat	aageggggag	etaarrfetta	rt.actaat.aa	SCO
taccggtkgg	aagtatgggg	rcsagggara	aaggtaatag	tatectcage	ara a a a aa<a a	260
ráceret cgr	tett. a a ecet	geagceetgc	tccaggagea	a e t. a a y a g a a	aeaagaagaa	4 20
atgggatrac	fcggtaaagga	ct art.t aaaa	gaaacggtga	cggtgtegtg	gaaataagga	528
gctatgaara	g t g g a g t. g ea	tat				503

<210> 129 <211> 417 <212> DNS <213> Humán <400> 129

a a a a a: a <. a e a	tgtettesta	á.qtaggaear	egagtascca	traettgcrg	egcaagteag	60
sarat taaaa	gátétt tara	tt ggt.atesq	earaeaersg	ggaaageece	teasetertg	120
atctatecáq	tat eraettt	gcaaegt grg	gt ecrateaa	ggttcagtgg	cagtggatct	120
gggeaagett	taaetatrae	eateageagt	atgeaarrtg	aagattttgr	eeattaatea	240
tgáraseagt	attecagtac	teeattaset	ttaggeectg	ggaacaasgt	ggass taaaa	300
cgasct-gtgg	ctgcaccsta	t?gt:at taatr	tteettccat	atgetgagaa	gttgaaetet	360

2Ö1

gg a at g e c t c t g t tgt gtg <210> 130 <211> 451 <2I2> DNS <213> Humán <400> 130	eefcgctgaat	aaattefcate	OO’S.OOD svCJCítO	eaaagta
ggegtggtee agcatgygag	gtaaatgaga	cfc atcetgfcg	eagegtetgg	atteaeette	60
sgtagctatg gaatgcaetg	gattagteag	get a aaggea	aggggatgga	gtggetggea	120
gtta k atggt atgaíggaag	testaaatac	fcatgeagaat	aagtgsaggy	cegatteaec	180
a t a t c t a g a g, a a a a t1 c t aa	gaacaagctg	tsfcctgcssa	tgaaaageet	gagagcegay	240
gacacggctg tgt att aetg	tgegagagge	gctgfc.sgtag	taccagetgc	tatggaegte	300?
tggggaaasg: ggacaacggt	caccgt ct a a	fc sageefc tea	ceaagggeee	ateggtette	360,
cecct gg age tat get e cag a a g C 3 a 6 aet O ag aa ee <210> 131 <211> 402 <212> DNS <213> Humán <220> <400> 131	gageaeetec ggtgaaggtg	Cf Q 3 '2 '.· ('<: L>: r	egetea-:gee	atgcetggte	426 451
sicccag ttt. ca.ec a 6	gtetgestefe	gtsggagaoa	gag L ea Gea. fc	caettaecgg	66:
ga a a g t a a g a a a a a i: a a a a g	gtatttaaat	tggtateaaa	agaaaecagg	g >33 a ga ecet	120
a a g 1tect ga t o t a tgt t g c	stetattttg	eaaagtgggg	teteateagg	gttcsgfcgec	186,
agtggatctg ggaaag&ttt	eaefc.atKaee	ateageagte	tgeaaeetga	agattttgea	240^:
a cfc t a e fc a ct gt e a a c ag a g	ttacsgtaac	eeatteaefcí.	tcggeectgg	gaeeaaagtg	330
g at a t. a a a a a g aaa t gt ege	fcgeaceatefc	gtefcteatct	te cég tea ae	fcgatgsgeag	366,
1fc g a a a t: ct g g a a c t g a a fc c	tgttgfcgtgc	etgergaata	<3 0		4 02

<210> 132 <211> 438 <212> DNS <213> Humán

202 <220» <400» 132

gtggtccag-c:	ctgqgaqgtc	cctgagactc	ceotgtgeag	eetotggstt	oseetteagt	5Ö
agcngtggea	tgcactgggk	eogcea-ggat	ceaggcaagg	ggetggagkg	gqtqgsagtt	120
atatggtctg	atggaagt.es	taaat.actat	kiét h.j «» '<.- U-C kJ'·»·'	tgaagggccg	a tt.cacea te	100
tecagagaca.	attccaagaa	cacgctgtat	ctgcaaatga	a c a g c c t g a g	a ge o g a g g a e	240
acggctxjtgt	st kaetetgo	gagaggaact	atgatagtag	kgggtaccct	tgactaetgg	300
g g c c s g g g s a	csctggfccac	cgtetcctca	go a c c s eea.	aqgqeséstc	ggtsttcces	360
gg .χ.- *<, t	gck ccacgag	a a occ e cga g	ageaeagcgg	ccat.ggqokg	cctqgt sasq	420
gactacttcc	cegasocg					cl·
<210	» 133
<211	> 451
<212	» DNS
<213	» Humán
<400	> 133
acccagtcte	GStCCtCCGt	gtet geatct	gtaggagaea	gagtca'tcat	caettgcogg	50
geaagfc eatga	geattt gcaa	ctatttaaat	tggtateago	agaaaccagg	aaaagccoet	120:
agggtcctga	tctatgctgc	atccsgca cg	casggtgggg	tcscgtcaag	gttoagtggc	280
agtggatct-g	ggacagattg	c de t o t a cc	a kcagoagka:	tgcaacctga	agatttagos	240:
aottactact	gkcaacs.gay	ttacactacc	eea t eesett	tcggeoetgq:	gaecagsgtg	300^:
gatategaac	gaactgtgge	tgcaccak ok	gtett: estet	teeegeeate	tgatgagesg	300
ttgaaatetg	gaactgcetc	tgtkgtgtgc	ctgctqaak.s	a ek k etatce	eagagaggce	420:
aaagtacagt	ggaagqtgga	fcascgeetat	t			45:1

<210> 134 <211» 562 <212» DNS

<213» Humán
<400» 134
tcctgtgcag eqtetggatt	eacsttcagk	t. sokat ggcq	ketggqqgsg	gegeggtses	00'
gectgggagg tccetga.gac	tctcetgtgc	agegtctgga	ttea cettea	gtagcratgg	120:
cgcgssekgg gt eegecagg	etccaggeaa	ggggetggag	tgggtggcag	ttaaatggta	180:
k g a t q ga a g c a a t a a a. t a e t	:at geagacte	egtgaaggge	cgacaesec a	tetccagays	240:
e3 a11eeaag agesegctgt	atetgeaaat	qaasagectg	sgagccgagg	aoacggctgt	'100
gt a k tat ·: gí. gegagagset	egtattsega	tttttggagt	ggicoaggcg	gtakggacgt	3 60

.203

atggggccaa ggcaccacgg	tcaccqiai a	ctcagcctcc	6 Ο’’-·& :3 0 Y	estegetct a	420
ccccctggcg ccot get cos	ggagcscctc	ccsgsgeacs	gcggccctgg	getgaategt	4 8 0
c a a ggaet s c 11cc c c gtac cgtg.cscacc t tcccsgctg	aggigaeggt te	gtcgtggaaa	YdCfQ Giji.’ !.. O	igaccsgegg	510 g 4?
<210> 135 <211> 419 <212> DNS <213> Humán <400> 135
ccsetet:góc tgcccgtesc	cettggscag	acggaataca	tctcctgcsg	gtetagaess	50
sgcctcgtat scagtgaigg	aaaaaaatac	ttgaattggt	ttcsgeagsg	<<í.· 6'CO
tctccasgga geofcaattta.	iaagetttea	aactgggact	atgcggtcac	sgacagatta	100
agcggeagtg ggtcsggcae	tgstítcacs	ai garastca	g c a g g g t g>ya	ggetgaggat	245
gt tegggLei. s aLset g aa i	gcasggttca	caatggeeta	egaegaiegg	cc angcg a c c.	SC Cí
aagg t ggaaa tcaaac ga a a	ictgqctgca	•testet gtet	tcatcttccc	geeatetgst	040
ga g a a g t tea aatctggaac	tgeetGtgtt	gigtgcctgc	tgastaacta	ctatcccac	415
<210 136 <211> 490 <212> DNS <213> Humán <400> 136
gteeagcctg ggaggtccct	gagactctec	tgtgaagcgt	ί.-· L- <- H	etteagtase	48
t a. t g cc a 1. gc a ct gggt cc g	ccsggatcca		tggagfcggga	ggtagttatt	120:
t gg a at ga t g g a a at aat a a	atactatgca	gagtcagtgs	agggeegatt	ga e aac ct cc	280
a c a g a a a a t ΐ a a: a a g a a c: a a:	gctgtatcag	eas&tgaaea	gaatgagaga	cgsggacacg	24 8
gccgt at a11 a.ct gt gcgs g	agat cacygc	setgyctggt	acggsggctt	tesettetcc	300
ggccagcgaa ccctggtcac	egactcet aa	g c ct a a ac.ca	agggcccatc	ggtcttcccc	340
ctggcgccct gctccaggag	cacctaccag		cccigggctg	eetggtcaag	42C
gacta ct1 aa ccgaaccggt	gsaggtgtcg	tggaaatcag	gegetGigáé	cagaggcgtg	480

eaesccttGC 438 <210> 137 <211> 419

204 <212> DNS <213> Humán <400> 137 cctggagagc cggcttccat tacasctat1 tggat tggta ttgggttcfca atcgggccte gat: t t fc a a a c t g a a a c t c a,g caagctctac saaotcctot gt g gc'fc gcac est ct gce11 g co t c t g fc fc g a g t g a c t: g ct <210> 138 <211> 1392 <212> DNS <213> Humán <400> 138 a t ggagfcfc.t g g:g ct ga g c t g gtgoaqctgg tggagfcctgg tgtgtagcgt ct ggatfc.es e ggcasggggc fcggagtgggt gsofcccgtga agggccgatfc oasatgasea gcctgagagc t:: cggtoett í: fcgacaact.g sagggccesfc. cggácttccc gccctgggct ccctggfccaa ggcgctofcga eesgcggcgt tccctcagca gcgl:ggtgse a acgta ga t c a ¢:: asgeccag gtcgagtgoo caocgtgcco ccsaaaccca aggacaccct g a. c g t ga gcc a cg a s g accc eata atgcca ag a caaagcc gtccteaeeq fcfc:gtgeaees a — oa asgq o e toocsgcooo g a a c ca cag-g. fc. g t a o a cc c t ctgacctgóc tggtcaaagg gggcagccgg agaacaacta tfccctcfcaca gcasgcfccsc

oocotgcagg cctgcagaag	tctsgtcaga o oa g q )oa g'..	gcctcctgca ctocaeagct	fcagtaatgga cctgstctat	66: 128
cg g g g <- ovo ~	gaeaggttca	gtggcagagg	aacaggcaca	186
cagagtggag	gctgaggatg	ttggggttta	ttactgcatg	2 40
ca ct t a cg ge	ggagggacca	aggtggagst	caaacgaact	36 G
oaacatccog	ocatctgatg	agcagttgaa	atccgga&ct	360:
gaataa.ct t a:	ta:: eccsgar	a gg c o aa a gt	acattccat	«9

ggttatcetc	gtfcgcfcctfct	t ss ga gg t gt	cesgtgfc cac?	Sö
gggsgqcgíg	gtceagcctg	ggaggtccct	gagactctcc	1.26
ofctcagLsgc	c :) oao 3: La o	aotgggtoeq	ccaggctcca	ISO
ggcagttsts	tggtatgatg	gssgaaataa	atactatgcs	2 40
escestetcc.	agagacsstfc	ccaagaacac	gctgtttctg	366
ogaggscsoo	gctgtgfc.att	actgtgogag	aggaggtoac	360:
gggccaggga	aecetg gt ca	ccgtctcctc	agcotccaco	4 20:
cctggcgccc	tgotccagga	gcaoctccga	gagcaoagcg	4S6
agait: a ette	C mC q .gi a CC uC	tgacggtgt c	gtggaactea	540:
gcaeacette	ecagctgtcc	tíscagteetc	aggaotetae	£ÖÖ
cgtgcccace	agesaccteg	gcacccagac	ctacacctgc	666:
Cc: <3 i?.<3.CC::: ·:%$	gtggscaaqa	cagttgagcg	csaaagttgt	20:
agcaooacet	g tg gca gg ac	egteagtett	cetetacocc	7 86:
catgatotoc	cggseccctg	aggtcaogfcg	cgtggtggtg	§46
cgaggtccag	ctca&ecggt	acgtggaogg	cgtggaggtg	900:
aogggaggag	csgctcaaea	gcacgtfcccg	tgtggtcagc	566
ggaetggctg	aacggcaagg	agtacsagcg	caaggtctcc:	tg 2 Q:
catcgagaaa	o c 3. Le L. o c a	:ii ci'H'C Ü· <5- ;:t2i Q Q	gcagocccgaiööO
gcccccatoo	cgggsggsgs	fcgaccaagaa	cca ggtcsgcL	11.46
cttctacccc	sgcgacsfccg	cog fcggagtg	ggagsgeaat1200
esagaeea oa	cetcocátgc	tggactccga	cggctocttc:	12 66
cg t ggacsag	ag C:s gg oga c	<3 qejv'F ¢3 q q &&	cgtcttctca1320

2(75 t g cta a q t g a t g ea t g a gg c t ct g aac a a eegggeaaat ga aaatseaaga agaagagect ctacctgi et:1330 1352

<210> 139 <211> 1999 <212> DNS <213> Humán <4ÖÖ> 139 atggagtttg ggctgagatg	ggt;: tteete	gttgctcttt	csagaggtgt	ccagfegtcac: 60
gtgcsgctgg	tggagtctgg	gggsggegtg	gtaaageetg	ggaggtaect	gagactatae 120
tctgásgcgt	etgyatteae	ettaagtage	catqgca.tyc	satgggtccg	eesygctccs 160
ggeaaggggc	agg te aggat	ggaagtfcata	tggtatgatg	gssgaaataa	afcactatyea 240
g a a a. e eg t g a	agg atagatá	caatatatcc	acagaeaatt	ccaagaacac	getytttety 330
casaágasaa	gectgagage	CQ 5 ű'ö^::3'C· S C'm	gctylgt afct	aefegtgcgag	aggaggtcaa 360
tfcaggtactt	tegactaetg	yggccaggga	aecetggtaa	eegietette	agetsgcaee 420
aagggeeaat	agytattacc	cctggcgeec	tgctcaagga	q o a e aa ag a	gagaaeagag 430
geec: qaqc::	gcetggtcaa	ggaet aette	GO G CSC C G 'G G	tgaaggtgta	gtggaaetca 340
aqcgca aa a a	ccaycggcgt	g a aca catea	ccsgctgtec	tacagt cctc	aggactctaa SCO
tccetesgea	gegtggtyae	aat.geae t ee	aycsaettcg	gcaeccagae	e t a ase cg a ο oe
aecgtagste	acsagaccag	cs a ca c aa ag	gtgyaeaaga	cagttggtga	gaggccaget 72:0
csgggag g ga	agg t gta <. g a	tggaagacag	gcteagceet	cetgcctgga	ageaceaagg ?Sö
etgtgaagca	tt agat;:: agg	g tag a a.ag ga	aygccceate	tgtatceten	caaggaggae 343
hetyccaqcc	acactcatgc	tcsgggagag	ggtettetgy	etttttecae	caggeteaag 306
geaggeacag	gai: gggtgac	ae t5: aec a ag	g ea a 11 a a c a	cscaqggycs	ggtycttgge 560
teagacgtga	tas a agat st	at eegyyagg	aecetqacec	tgaeetaaga	e ga a coca a a. 102 0
ggecaaa ctg	a aaaetcaat	tagat aggat	aeettctefca	etceeagate	agagtaaat:cj.020
ecaa tette::	etet yeagsg	egeaastgtt	gtgtegagtg	eeaaeegtyc	c a a g g t a a g a 114 ö
aagccaagga	ctageeetac	agataaagge	gygacsggtg	ecetsgsgta	geatgeataai20O
sgggacagge	caaagctggg	tcíctgaeaeg	tecaeeteca	tetetteeta	agcaceaaet3260
gtggaaggaa	egtaagtett	catettcccc	G::i .·:» <5 <$. G G .<1	sggacacech	catgatctaai 320
ag ga cccct g	aggtaacetg	cgtggaggtg	Cd G'Gt. Cd 9'C.C	: C Q o: G G G C C G	egaggtaaag1380
ttcaaetggt	acgtggaagg	cgtggaggtg	estcatgccc	sgscddsgcc	a agggaggagl440^:
cagttcaaaa	gaaeyt aceg	tgtggtcagc	C fc G Gt Cd 0 GG	ttgtgeaeca	ggaetgyetgla00
SS CG G GSd Q C.)	agtaaaaytg	aaayytctec	sscssaggcc	teecsgaeee	catcysgesal500
CG G S tCt'C' CS	3.&SCCd.<3 S-tJQ	tgggaeaeye	a ygq ·.:·:; ::yag	ggeeaeatgg	acayaggecgl620
getcggceaa	ecetatyccc	tgygagagac	cgeagtgeca.	acctctgtce	etacagggea1680
gacccgagaa	ceaccgyegt	%C:«'C GCCCCG	aecateaegy	gsgy&gaaya	ccaagaacoa1740
ggtaagcatg	sactgcetgy	ícsssggoít	ctaecccsge	g s aa;:. a g e a y	tggsgtgggaiSOö
gagaaatggg	esgeeggaga	aessctscaa	gíicaaeacct	a a a g a t g g	aat;::cgacg::!l360
CGCCtt ett e	etetseagas	SCO G G SCCCC	agacasgage	aggtggeage	sggggaaegt1020

2Öő

cttetcatgc. eetgtctcég	tcégtga ege ggtaaatga	atgaggatat	gcaeaaccac	taaacgcsgs	aga.gcct óta.'	1950 .30
<210	» 140
<211» 1392
<212	» DNS
<213	» Humán
<400» 140
atggagfctt.g	ggetgagata	ygitttacte;	gttgctattt	taagsggtgt	aaagtgfccag	6O
gtg aagatgg	tggagtctgg	gggaggeetg	g t c ea g a a t g	gg&ggceoct	gsgaatetea	'120
tgtqtagegt	etggatteac	etteagtage	eatggcatgc	aetaggtaeg	eeaggcteca	180·
ggcaaggggc	t ggag t gggt	ggaagttata	tggtatgstg	gaagaaatas	ataatatgaa	280
gaeteegtga	agggecgstá	caaaat atea	agagacaatt	o a a a g a a esc	gctgttteág	300
:;a3«:: gaaca	gcctgagagc	CCJ.S ??D:íÍ'·- 8:C-<1	getgtgaatt	actgtgcgag	aggsggtaac	380
t1 eget cet. t.	ttgactactg	yggeeaggga	aceetggtca	acgt ci ce t a	a geetcc3.ee	42Cf
aagggeecat	eggfccttccc	cetagcgeee	tgcteesgga	geaecteega	gageaaagcg	4 80
gccctrgggcs	gactggteaa	ggaataatte	caagaaeegg	tgacggtgte	gtggsaotea	S4.D
a g aga u c g a	ceagcggcgfc	gcseaeette	ccagatgtee^	tscagteate	aygactct.se	600^:
tccctcagca	gcgt ggtgac	í.·'gtg aaa i. a.	agcaacttcg	gcaaacagaa	et acaaotgc	660:
a&cgtagata:	a a a a gaa a a g	casaaaaaag	gí yyacsaga	aagttgagcg	aaaatgttgt	20;
gtagagtgaa	aa eeg.. geee	agcacea.aaa	gtggeaggae	agtesetett	cetettcaae	7 30
ccaaaaccca.	aggsaaacct	aatgatctca	eggaceect g	aggteaegtg	cgtggtggtg	840
gaegtgagee	s.egsagaaee	cgsggtcc&g	tteaactggt	aagl ggaagg	agtggsggtg	95>G^:
cá.fcaátgceá	a gaaaaagee	aagggaggag	eagtteeass	gaaegáttag	Igtggtcage	960
g taetaa a cg	ttgtgaaaca	ggactggctg	;:iCQO'C. 8. ;2 ,C^r Q	ag'tacaagtg	ca a g g t a <. a e.	1020:
aaaaaaggcc:	tea a a ga c a a	catcgagaaa	acc<sítc’t?cca	aaaceaaagg	g e a gee cég a158 0
gaaccacagg	tgtaeaccct	gceaccataa		t gaecaaga a	ce&ggtcayc:	1M0
ctgaactgee	tggtcaaagg	ett etaaaac	2 Oí C 9 & Ό 3 7 C C	eegtggaqtg	agagagaaat1200
aagaagaagg	agaaeasata	cssgaeaaaa	cetaaca tge	tggaetaags	aggatccttc	1200
ttccl: ctőca	gc.aagot.cac	cgtggacaag	agaaggtgge	c3:\> ;5iXj 3'··; tg 8ί	a gt a11 ctca1a 2 0
tgatcegtgs	ageatgagge	tctgesaaac	eseta ca age	agaagagcct	etceetgtctiaSö
ecgggtaaat	ga				1392

<210» 141 <211» 708 <212» DNS <213» Humán <4ÖO> 141

afc.gg.»-aaccc	cagegcsgct	tetei: tea te	etgetaetet	ggeteeaaga	tsccaccgga	60
gasattgtgr	tgaegeagte	tccaggeacc	etetcaétgt	eteeagggga	3—g a q a e Sec	128
ctetcctgea	gggeea.gtca	gagtattage	a g::: a get I: at	tageetggta	eeagcagsga	18 0
eetggecsgg	ctcccaqgct	cctcatetet	ggtgeatees	goaggqceac	tggeatecea	243
gaeaggttea	gtggeagtgg	gtctgggsea	gaettesete	t. e.s e e & t es q	eagsctggag	288
eetgaagatt	atge&gtgta	ttsctgfceag	cagtategta	eeteaceetg	gaegttegge	363
caagggscea	aggtggaaat	eaaaegsael:	gtggotgeae	carctqtett	catettecég	428
ceatetgatg	agcaqat;gaa	atetggaset	gcctetqti: g	tgtgeetgct	gaataaette	430
tatc-ccagag	sqgeeasaga	aeagtggaag	gtggataacg	ecet ces a a e	gggtaaetce	243
eaggagagte	teacagagca	g q: a e a ge a: a g	gacagcaeet	q e a t c ^q	aageaeeetg	688
aegetgagea	•sagcagseta	rgaqaa.arae	a aa.gtct.acg	eeegeesag	esc e -e v. c -—q	663
ggcctgagct	egecegtcse	saagagette	aaeaggggag	agigttag		786:

<210> 142 <2U> 1395 <212> DNS <213> Humán <40G> 142

atggsgtttq	egetgacctg	ggttttcccc	gttgetcttt	taagaggtgs	eeaqtgteag Sö
gtgeagetgg	tggagtcl: gg	gggaggegtg	gtceageetg	ggaggtecet	gagaetetee 1.28
tatacagegt	etggatteae	cttcsgtaac	tstggcstge	a.etgggteeg	eeaggeteea 188
ggcssgggqe	tggagtgggt	qgeagttsts	tggtstgatg	gaagt-aat-a a	scactatggs 248
gactecetga	sgggecqa11	eaceatetce	agteacasat	ceaagaaeac	qetgtsaetg 300
eaaatgaaea	-g c e t g a; g a g e	ogagqseaeg	getgtgtatt	a.ctgtgcgag	aggagagags 383:
etggggteet	aetttgaeta	etggggceag	ggaaccol: gg	teaeegtete	etcageetec -42O^:
aeaaaggqcc	ca: ::gg a et t	ecccctggcg	ecetgeteea	ggagcaoetc	cgagagcaca 433
geggecete q	getgcetggt	caaggacOac	ttceecgaae	cggtgaeqqfe	gtcgtggaae 540
teaggegete	i. q a -..:3:- e cg-g	cqtqe.a-cacc	aaeccagct.g	tcetseagte	etcagescte 600
taet eeetes	gcagegtggt	gaeegtgece	teeageaact	3 e g g c a c eea	gaeetaeaee 6<5Ö
r. g eaa cg t a g	atcacasgec	cageaacaee	aacgtggaea	aqscagttga	gegcaaatet 72C
tgtgt cgagt.	gcceaecqtg	eccagcaeea	eetgtggeag	gaeegteagt	etteetette 780:
eeeeesaaae		co a -e a t q a a e	teecggaecc	etgaggtesc	gtgegtggtg 240:
gtggaegtga		cccqq a.gqt e	ca gt.tca.act	ggtaegtgga	eggegtgqag 900
gtgcstaatq	C.' i J-Cl d U d í.· itt :U Π	gooacggqag	gaqcagttca	aesgcacgtt	ccqtgtggtc 860
agegteetea	eegttgtgea	eeaggaetgg	otgaaeqgea	agqagtacaa	gtgeaaggtclOOO
teeaaeaaag	geeteecage	ceceatcgag	assaecetet	<> C& ::i 2;·:: CCHS	a g g go a g eee 13 8 3^:
cgagaaeeae	aggtqaaeac	ectgeeceea	tecegggagg	sgatgaecsa	gascca.ggteÍ!40
ageetgaect	qcct ggtcaa	aggét actae	ceeagcgaea	tegecgtgga	gtgggaqsgciOOO:

2Q8

«afc.gggca.gc ttcfetccfccfc fcfi:scgc:tccg tcfcccgggfc.a	cggagaacaa acagcasgcl: fcgstgcafcgs aaí.gs	e t a ca a ga cc a ca cc t c c fi s fiatcgtggac ascsgaaggt	tgfitggafifc.fi: ggesgesggg egesgaagsg	cqa fi gg ce cc .fit xxx: gssfigtfitficI32G cetet c.eetg!380 1385
ggfitfitgfitfi	aaccscfiaca
<210	> 143
<21.1	> 702
<212	> DNS
<213	> Humán
<400> 143
a fc gg >s a.a:::c c	cag egeaget	Cfitfittfifitfi	fitgfitsfifcct	egefc tififisga	fi. sec a e c gg.a	68
gaaattgfcgt.	tgafigcagfco	rcos gfifififie	cfigtettfigt	ctccaggggs	:a aga g fi fi a cc	128
gtctcctgca	ggaccagfiefi	fcagcsgcagfc	tsfififiagcet	ggtaccagaa	gat set ege	188
caggct cccs	ggctccficat	etstggtges	tecagcaggg	ecsetggese	fififisgacagg	240
tfieagtcgea	cfcgggtctgg	gacsgacfctc:	S fi ü fi fi t CAfi.fid	fccagcagact	qgagcctgaa	388
gatcctgcsg	fcctafcfca.fi: tg	fc eagcsgt a fi	ggcstetc-ac	ccfcfccacttfc	eggeggag-gg	868
aecaaggfcgg	a ga t Cs « go g	fiafitgtggfifc	gc a. fi: fi ii t fi c g	tetceatctt	fi ο t g c fi a tt	420
g'aágagc.agfc	tgaaatctgg	sactecetet	gttgtgtgcc	tgfi:tcaafcaa	fitCCfiStCfifi	430
agagaggcca	aa-gtacagtg	g:;ag xtggfifi	aacgcccfccc	aafccgggtaa	c c fifie a. g g .3:	348
s.g fcgtcacag	a g -j g g a fi g	C &-&' C* C· H í> 8 Έ	acetacsgcc	tcsgoagcao	cetéacgctg	588
ci áj C-cs áá CíG i:íQ	acfcacgagaa	&·-&€£ aagt c	tacgectgcc	a ag.t esc:: fi a	tcagggcetg	868
<s: C; ts J '< U B- M	fccacaaagag	C l. . C.D.ölC li CK}	ggagsgcgtt	ag		782
<210> 144
<211> 1392
<212	> DNS
<213	> Humán
<400	> 144
scggagt.tfcg	g gctcsficcg	ggt Lttect c	gttgetefitt	taagsggtgt	fi:.fi ζ. <. casg	88
gtgcsgctgg	fcg.gagfcctgg	gggaggcqfcg	g t. c· g a g o t g	ggaggficfict	gagactctcc	128
tgtacagcgt	etagattcaa	fittoagtagt	fcatgccsfcgc	acfigggteeg	ccaggefce.cs	180:
ggcaaggggc	tggagtgggc	ggcagttafca	teqfcatgstq	gsagcaatas	acactatgca	248
fi a fi x. ’.. c g ·... g .·;:	agggeegatt	fia ficjt a fi <. fi fi	agagacaatt.	C G CG- Gf Öl 2 CG C	gefigtatccg	380
casafcgsaca	gcfitgagsgc	cgsggacacg	gctgtgtatfc	setetgegaq	agccggaetg	380:
Cfcgggtfcact	fctgaefcattg	gggccaggga	accccggtcs	ccgtcteefcc:	sgecetesc	428
aseggeteát	cggtctficcc	cet g gége:fi fi	cgctcfisgga	Ά- fi fi u- g	gagc«cagcg	480:
g '...ο <. g g 'Ά- a-	gcfifcggtcaa	g g a ...—fi -.. t. a	cfifigaaccgg	fcgacggtgfcc	gcgg&sctca	548

209

ggcgctctga	ccagcgycgt	gcacaecttc	.:.·': y c a c r c r.	tacagroírtc	agyactcrac	660
rxccteagcs	gcgtg gagae	egtgecctcc	agcaaottcg	gcacecsgao	etacacctge	666
aacgtagstc	eeaagcccag	caacaceaag	gtggacaaga	eegrtgagcg	eaaatgttgt	72 0
gtcgagtgoe	ceccgtgcce	a g ca í.o.. :xc c .	gtgycaggae	egtcaytett	cctcttcccc	786:
CC <5. cl :^:«3<.í 'G	aggacacect	eatgaccr cc	cggamcctg	aggteacgtg	egtggtggtg	8 46
gaegtgagco	::í OQ ;3;X'X::; CCe	egaggtccag	tteaser gye	acgrggacgg	cytggaggtg	SOG
eataatgcca	agacsaagcc	acgggaggsg	Cég'... ’..· *-..astCú	go a cg a r ccg	tgtygtcage	3:60:
0. :. Ι»:·’—	r tgtgcacca	ggactggcrg	aacggcaagg	agtaeaagrg	casggtctccTOOC
a&caaa-ggcc.	tcccagoccc	cá r. cg a g a a a	ae.ear et eca	aaaccaaagg	gcagccccga'i 080^:
gaaocacagg	tgtseeccct	gocccoar cr:	’-'gggaggaga	r gaccaagaa	ecaggtcagcll40
c t. c a c c t.g c c:	tgg r caaagg	c t a. c t — cc c c	ayegaeercg	ccgrggagrg	ggagagcaatl	2 CG
gggeayccgg:	agaaca a ct a	C-í: ΐ; CJ <5. £ C 5t Ccí	ecteecatgc	tggaccecga	cggctcctrel	260:
ttcetetaca	geaagctcsc	cctgyacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgterrőtesi	326:
tgctccgtga	tgcatgaggc	tcégcacaac	c a e r.a c a cg c	agsagayeet	ctccctgtctt	38 0
ccgggt a aat	ga				1	332

<210> 145 <211 > 705 <212> DNS <2!.3> Humán <400> 145
atgg&aaccc cagcgeagct	tetettcetc	cégetaetet	Cí £ C‘C CCCB <3 6	taccaccgga	60
g a a a t1 gt g 6: t gac g c a g 7 c	tceaggeace	ctgtetttge	ctccagggga	& 6 ga£<:c-ec	120: 160
ct ct cc t gt a y ggeca. gt cs	sagtgttsgc	agccaer tag	cctgytsccs	acagsaacet
ggeeaggetc ccaggcccct	catctar ggt	gáarccagca	gggccaotgg	catcccagac	346
agg16cag r g geagtgygr c	tyggacagac	ttcsctctca	ccatcagcag	acrggagcct	300
ga a g a 1111 g c a g t g t a fc fc a	crgtcagcag	r afcg.gr afcct	caccattcac	tttcggccct	3 fc C
gggaccaaag tggatatoaa	acgaacrgtg	<70 7 i/Tl O<76 l	etgtctteat	cttcecgcca	420
t ct g a t g e ge a gt fc g-asat c	tggaactgcc	éetgttgtgt	gectyctgaa	tsscctotat	460
eccag a gagg c r:a a a gt aca	grggaaygtg	gatascgccc	tccaatoggg	taactcccay	540
g a ga g t g t ca ca g a.gcag g a	cagcaaggac	agcacctsca	gcctcagcag	csccctgseg	680
C E £ pl C; O 3 5i 5i <-: i/ciCísdO í. c3.££::i	<76 6 6<:·51Ο66.6	φΐ.£Ε >:7<7<}‘££E	gcgaagtcac	ceateagggc	6 6 0
ctgagcccgc ccgtcacaaa	gagcttcaac	agggg&gsgr	gttsg		705
<210> 146
<2! 1> 1413
<212> DNS

210 <213> Humán <4ÖÖ> 1.46

atggagtttg	ggctgagcfcg	gettttectc	gt'tgctctt't	taagaggtgi:	cc&gtgfcc&g 30
gtgcagcigg	tggagtctgg	gggaggegtg	gfcccaqcety	gqaeg tetei:	gagactctet 130
tgcgcagcgfc	ct.ggaí: t.eae	cttcactagc	tatggeatge	se t: gg gt c cg	eeaggeteea 180
ggcaaggggc	fcggagtgggi:.	ggcagttafca	tggtatgatg	g a s g t. a a t a a	ataetatgea 230
gacitcgtga	agggceg&tt.	oa etetette	agagacsatc	ecaayaaeaa	qctytatéig 300
caaat gaaca	gcctga.gagc	cgaggacacg	getgtgtatt	aetgtgegag	agateegagg 360
ggagctsccc	tfcfc.actacfca	etactaeggt	afcggacgfccfc.	ggggeeaagg	eaccseggte 433
aecgtcetet	wy e c.. e ·... a t	eaa gggc tea	teggtettee	.... ......... y q Cl-	ctgcfcccagg 480
ageaccteeg	agagcacagc	gyccctgyyc	tgocfcggtca	aggactactt	acccgaaeay 340
gtgacggtgt	cgtggaactc	aqycgctctc	aeeagcggeg	tgeaeseett	cccagctgte 600:
qfcacagfccct	oagcíA ctcfca	e t c c c fcc ag c	agcgtggtga	ecytgceccc	cagcaacttc 660
ggeacecsga	cctacacctq	caacgtagafc.	GÖ <2dd7i OO OS,·	gesaeateaa	ggtggaeaag 72:0
acag-fctgagc	geeaatgttg	tctogaytgc	7' 7-íS.t-.M C-7?-	e&gcsecset	tgfcggcsgga 700
ccgteagétí:	tectcttccc	c cc s s s s ccc	a&g.oa caccc	é eatgatete	ecgeacccct 840
gaggfccacgfc	gccfcygtgqt	ggaegteaee	eaOTssigac'C	tcgaggfctca	ytfccaaccgy 900^:
fcacgtgg a cg	gegtggaggt	gcacasfcgct	:z ίά .·:: yfi?·	eacgggagga	gcagfctcaac 960
agcaegC cet	gt gtggtcag	cgtcctcacc	gttgfcgcatt	aggattgget	ga a eegeaa gi 0 2.0
gagtacaagt	ecaaggtctc	csataaagge	a. ~ a. t a aa e c e	teafccgagaa	a a te at e tt11:03(1
St Η H íá O C ZíS. & <4	(> •7 C'-iCj'C'CC C.'T	agaaecaaag	gtgtaeaeee	tgcceeeatc	cegegaggagl 1.4 0
afcgaccaaga	:3 O íNett 'fiái' Láld C]	cctgscctgc	etggteaaag	gcfctctscce	aagegaeateliöO
gecgfcggagt	ggg^gagesa	tgggcagccg	gagaaeaaet	aeaagaccac	steteeea·: g 12 03
etggactccg	^:3.C'3^:Q Cl O.C 7.7.	ettcetetae	agcaagctcs	ctgtqyataa	ga g e aggt g g132 ö
7^3. 7^:.’A M G? -g -g ··.',	ÜCgtCtt ctc	atyetcégig	atgeatgagg	et. ctg ca cs a	teacáacscgia®0
	7. 7* <. <?. É 7-	tcegggtaaa	iga		2413

<210> 147 <211> 714 <212> DNS <213> Humán <400> 147 afcggacatga gggtccccgc tcagcfcccfcg· ggyatcctge taetctgget ecgaggtgcc 60 agatgtgaea tecagatgae ceagtctecs tccfcccctgt etgcstctgt aggagacaga 120 gtcaccatca ctfcgccgggc' aagfccagagc attsaeaget afcfcfcagsttg gtatcsqeag 280 aaaocaggga aagccccfcaa actcctgafcc tatgcfcgcsfc ccagfcttgca aagfcggggte. 240 ccateatggt tcagtggeag tggatctggg· acagstttca cictcaccat eagcagtctg 300 caaccfcgaag attttgeaac teaetactgt caacagfca'fcfc -acagfc-actcc afctcacfctfec 3 60^:ggetctggga ccaaagtgga aatcaaacga actgfcggcfcg cacc.afc.ctgt otteatctie 420

ccgccatcág	aágsgcagáá	gesat-ággá	acfcgcaáctg	t ágág;: g-át	g-ágasaaac	400
χ. χ (73..::1t. (?. ma	gagaggocaa	agt.aeagtgg	aagggggaáa	aagocctcaa	::: i. ag gg <. a a g	540
ác c -. aggag a	gág;: oacaga	gcaggaeage	aaggscagca	cctasagect	cagcagcaec	500
cágíicyaága	0 Cü gg Q U.<$.í> ji.	cáacgagaaa	eaeaaagácá	a-gmá g-ga	agtcsicccat	660
aagggcmga	gcágg-ecyá	ca-nsagago	tt:caacagg.g	gagagáy á t: a	gá g a	71.4

$

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Hianán monoklonális ellenanyag, amely kötődik a CTLA-4hez vagy annak egy antigént kötő fragmense, ahol a nehéz lánc a 9. számú aminosav szekvenciát vagy azzal legalább 90%-ban azonos aminosav szekvenciát tartalmaz, és a könnyű lánc a 22, számú aminosav szekvenciái vagy azzal legalább 90%-ban azonos aminosav szekvenciát tartalmaz, ahol az antitest vagy fragmens a következő tulajdonságokkal rendelkezik:

(a) Kb⁹ M, vág)' nagyobb affinitással kötődik a humán CTLÁ-4cl gátolja a humán CTLA-4 és B7-2 kötődését 100 nM vagy kisebb ICso értékkel; és

d) 500 pg/ml, vagy annál nagyobb mértékben fokozza a citokintermelést humán T~sejt esszében.
2, Az 1, igénypont szerinti antitest vagy antigén-kötő fragmens, ahol a nehéz lánc aminosav szekvencia a 2, ábra szerinti 11,2,1 antitest CDR1, CDR2 és CDR3 aminosav szekvenciákat tartalmazza.
3, Az 1. vagy 2, igénypont szerinti antitest vagy' antigén-kötő fragmens, ahol a könnyű lánc aminosav szekvencia az 5, ábra. szerinti 11.2.1 antitest CDR1, CDR2 és CD.R3 aminosav szekvenciákat tartalmazza,
4, Az 1-3. Igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy antigénkötő fragmens, ahol a nehéz lánc a 2, ábra szerinti 11.2.1 antitest aminosav szekveneiáiát tartalmazza.

» .i
5, Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy antigénkötő fragmens, ahol a könnyű lánc a 22. számú aminosav szekvenciát tartalmazza.
6. Humán monoklonális antitest, amely kötődik a CTLA-4-hez, ahol a nehéz lánc a 2. ábra szerinti 11.2.1 antitest aminosav szekvenciáját tartalmazza, és a könnyű lánc az 5·. ábra szerinti 11,2,1 antitest .aminosav szekvenciáját tartalmazza.
7. Humán monoklonális antitest, amely kötődik a CTLA-4-hez, ahol a nehéz lánc a 70, számú aminosav szekvenciát tartalmazza, és a könnyű lánc a 71. számú aminosav szekvenciát tartalmazza.
8. Humán monoklonális antitest, amely kötődik a CTLA-4-hez vagy annak egy antigént kötő fragmenséhez, ahol az antitest nehéz lánca az S. számú aminosav szekvenciát tartalmazza, és az antitest könnyű lánca a 18 , számú aminosav szekvenciát tartalm azza.
9, Humán monoklonális antitest, amely kötődik a CTLA-4-hez vagy annak egy antigént kötő fragmense, ahol az .antitest nehéz lánca, a
10. számú aminosav szekvenciát tartalmazza, és az antitest könnyű lánca a 23. számú aminosav szekvenciát tartalmazza.

10, Gyógyászati készítmény, mely az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy antigén-kötő fragmenst és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz,
11, Sejtvonal, amely az 1-9. Igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagot vagy fragmenst termel

11. igénypont szerinti sejtvonal, mely emlős sqtvonal
13. A 12. igénypont szerinti sejivonal, mely CHO sejtvonal va^

M8Ö sejtvonal.
14. Nukleinsav, amely az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag vagy annak fragmenae könnyű láncát és/vagy nehéz láncát kódolja.
15. Gyógyászati készítmény, mely az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy antigén-kötő feagmenst és egy győgyásaatdag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz, rák kezelésére,
16. Eljárás az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti humán CTLA4 antitest vagy antigen-kűtő fragmens eláálhtására, azzal jellemezve, hogy az antitestet vagy antigén-kötö fragnwnot egy gazdasejt vonalban, kifejezzük és kinyerjük az antitestet vagy antigén-kötő feagmenst.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol a. sejtvonal emlős sejtvonal.
18, A 17, igénypont szerinti eljárás, ahol a sejtvonal CHO sejtvonal vagy NSO sejtvonal
19, Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy antigénkötő fntguiens rák keselésében történő alkalmazásra.