MX2012000851A - Combinacion de anticuerpo de anti-antigeno 4 asociado al linfocito t citotoxico con diversos regimenes terapeuticos para tratamiento sinergistico de enfermedades proliferativas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos que son útiles para el tratamiento o prevención de los trastornos proliferativos. Tales composiciones comprende inter alia un agente de anti-CTLA-4, por ejemplo ipilimumab o tremelimumab en combinación con otros agentes quimioterapéuticos tales como dasatinib, imatinib, paclitaxel, gemcitabina, cisplatino o etopósido.

Description

COMBINACION DE ANTICUERPO DE ANTI -ANTIGENO 4 ASOCIADO AL LINFOCITO T CITOTOXICO CON DIVERSOS REGIMENES TERAPEUTICOS PARA TRATAMIENTO SINERGISTICO DE ENFERMEDADES PROLIFERATIVAS Campo de la Invención Esta invención se refiere a los campos de la oncología y a regímenes de terapia mejorados.

Antecedentes de la invención El Instituto Nacional del Cáncer ha estimado solo en los Estados Unidos de América, que 1 de 3 personas padecerán cáncer durante su tiempo de vida. Además, aproximadamente 50 % hasta .60 % de las personas que contraen cáncer eventualmente sucumbirán a la enfermedad. La presentación extendida de esta enfermedad subraya la necesidad de regímenes anticáncer mejorados para el tratamiento de malignidades.

Debido a la amplia variedad de cánceres observados actualmente, numerosos agentes anticáncer han sido desarrollados para destruir al cáncer dentro del cuerpo. Estos compuestos son administrados a los pacientes con cáncer con el objetivo de destruir o inhibir de otra manera el crecimiento de las células malignas mientras que se deja sin alterar a las células sanas, normales. Los agentes anticáncer han sido clasificados con base en su mecanismo de acción.

Un tipo de substancia quimioterapéutica es referida REF.226162 como un complejo de coordinación de un metal. Se cree que este tipo de formas quimioterapéuticas predominantemente retícula el ADN inter-hebra en los núcleos de las células por lo cual se previene la replicación celular. Como resultado, el crecimiento del tumor inicialmente es reprimido, y luego revertido. Otro tipo de substancia terapéutica es referida como un agente de alquilación. Estos compuestos funcionan por la inserción de composiciones o moléculas extrañas en el ADN de las células del cáncer que se están dividiendo. Como resultado de estas porciones extrañas, las funciones normales de las células del cáncer son alteradas y la profileración es prevenida. Otro tipo de substancia quimioterapéutica es un agente antineoplásico . Este tipo de agente previene, extermina, o bloquea el crecimiento y la dispersión de las células del cáncer. Todavía otros tipos de agentes anticáncer incluyen los inhibidores de la aromatasa no esteroidales , los agentes alquilantes bifuncionales , etc.

La quimioinmunoterapia, la combinación de agentes quimioterapéuticos e inmunoterapéuticos , es un enfoque novedoso para el tratamiento del cáncer el cual combina los efectos de los agentes que atacan directamente a las células tumorales que producen la necrosis o apoptosis de las células tumorales, y los agentes que modulan las respuestas inmunológicas del animal hospedero con respecto al tumor. Los agentes quimioterapéuticos podrían mejorar el efecto de la inmunotera ia por la generación de antígenos turaorales que van a ser presentados por las células que presentan el antígeno, creando una vacuna de las células tumorales "polivalente" , y por la distorsión de la arquitectura del tumor, facilitando así la penetración de los agentes inmunoterapéuticos así como una población inmunológica extendida .

El I ilimumab es un anticuerpo de CTLA-4 antihumano, humano, que bloquea la unión de CTLA-4 a CD80 y CD86 expresadas en las células que presentan el antígeno y por esto, bloquea la regulación descendente negativa de las respuestas inmunológicas producidas por la interacción de estas moléculas. Puesto que el ipilimumab no reconoce el CTLA-4 del ratón, un anticuerpo de CTLA-4 anti-ratón (clon UC10-4F10) fue utilizado en los estudios presentados aquí para investigar el efecto del bloqueo del CTLA-4 con agentes quimioterapéuticos .

El Dasatinib (SPRYCEL®) es utilizado comúnmente para el tratamiento de muchos tipos de cáncer y representa una clase atractiva de agentes para combinarse con el bloqueo del CTLA-4.

Los agentes estabilizantes de los microtúbulos, tales como ixabepilona (IXEMPRA™) y paclitaxel (TAXOL®) , son utilizados comúnmente para el tratamiento de muchos tipos de cáncer y representan una clase atractiva de agentes para combinarse con el bloqueo de CTLA-4.

Los análogos de los nucleósidos, tales como gemcitabina, también son utilizados comúnmente para el tratamiento de muchos tipos de cánceres. La gemcitabina es un análogo del nucleósido del antimetabolito (2',2'-difluorodesoxicitidina) que llega a ser activo después de la fosforilación intracelular por la desoxicitidina cinasa porque solamente sus formas de di y tri- fosfato poseen actividad citotóxica. Específicamente, la forma del trifosfato compite con el trifosfato de desoxicitidina para la incorporación en el ADN como una base inactiva, y la forma del disfosfato inhibe la ribonucleótido reductasa, una enzima que es esencial para la síntesis del ADN normal.

La gemcitabina ha sido estudiada en una amplia variedad de malignidades, tanto como un solo agente como en combinación con otros fármacos citotóxicos. Además la misma fue aprobada en muchos países para el tratamiento de una variedad de neoplasmas en el ser humano, incluyendo el carcinoma pancreático, de los ovarios, del pulmón de células no pequeñas, de la vejiga y de mama. Su uso terapéutico en estos tumores también está soportado por un perfil de toxicidad favorable.

Otro mecanismo común de inhibición de las células del cáncer es inducir rupturas del ADN de doble hebra. Tales rupturas del ADN exterminan específicamente las células que se dividen rápidamente tales como las células del cáncer. El etopósido es un fármaco contra el cáncer que induce rupturas de la hebra en el ADN celular por la inhibición de la religadura de la topoisomerasa II (topoll) de las células del ADN segmentadas. Aunque la segmentación del ADN por la topoisomerasa II siempre produce rupturas de la doble hebra (DSBs) del ADN enlazado a la topoisomerasa II, la acción del etopósido también conduce a rupturas de una sola hebra (SSBs) , puesto que la religadura de las dos hebras es inhibida independientemente por el etopósido.

En los estudios descritos aquí, la combinación de dasatinib, paclitaxel, etopósido, y gemcitabina individualmente con un inhibidor de CTLA-4 fue investigada en varios modelos tumorales con diferente sensibilidad a cada agente.

Los presentes inventores han descubierto por primera vez que el beneficio sinergístico de combinar un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína, tal como dasatinib, con un inhibidor de anti-CTLA-4 para el tratamiento de las enfermedades proliferativas . Además, los presentes inventores han descubierto por primera vez el efecto sinergístico de combinar un agente estabilizante de la microtubulina, tal como el paclitaxel, con un inhibidor de anti-CTLA-4 para el tratamiento de las enfermedades proliferativas . Además, los presentes inventores han descubierto por primera vez el beneficio sinergístico de combinar un análogo de un nucleósido, tal como la gemcitabina, con un inhibidor de anti-CTLA-4 para el tratamiento de las enfermedades proliferativas . Además, los presentes inventores han descubierto por primera vez el beneficio sinergístico de combinar un agente inductor de la doble hebra del ADN, tal como el etopósido, con un inhibidor de anti-CTLA-4 para el tratamiento de las enfermedades proliferativas . Es un objeto de la invención proporcionar regímenes de tratamiento quimioterapéutico combinados, eficaces, en donde uno o más de los siguientes: un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína, un agente estabilizante de la microtubulina, un análogo del nucleósido, o un agente inductor de la doble hebra del ADN, es combinado con uno o más agentes de anti-CTLA-4 para el tratamiento de las enfermedades proliferativas .

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un método sinergístico para el tratamiento de las enfermedades anti-proliferativas , incluyendo el cáncer, que comprende administrar a una especie de mamífero que tenga la necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva, sinergística, de: (1) un elemento del grupo que consiste de: un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína, tal como dasatinib; un agente estabilizante de la microtubulina, tal como paclitaxel; un análogo del nucleósido, tal como gemcitabina; o un agente inductor de la doble hebra del ADN, tal como el etopósido; y (2) un modulador de la ruta co-estimuladora, tal como un antagonista de anti-CTLA-4.

En un aspecto, la enfermedad proliferativa es uno o más tumores cancerosos sólidos, tales como el cáncer del pulmón, cáncer pancreático, cáncer del colon, cáncer de la próstata, y/o CML o leucemia. En otro aspecto, la enfermedad proliferativa es uno o más tumores refractarios. En todavía otro aspecto, el anticuerpo de CTLA-4 es ipilimumab o tremelimumab . En otro aspecto, el inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína es SPRYCEL®, GLEEVEC®, o nilotinib. En otro aspecto, el agente estabilizante de la microtubilina es el paclitaxel, TAXOL®, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, o ixabepilona. En otro aspecto, el análogo del nucleósido es gemcitabina. En otro aspecto, el agente inductor de la doble hebra es el etopósido, calicheamina, bleomicina, neocarzinostatina, sulforafano, o idarrubicina . En otro aspecto, un análogo de nucleósido es la gemcitabina, BCH-4556, clofarabina, fludarabina, cladribina, citarabina, puromicina, y fluorouracilo .

Los agentes antagonistas de anti-CTLA4 adecuados para su uso en los métodos de la invención incluyen, sin limitación, anticuerpos de anti-CTLA, anticuerpos de anti-CTLA humanos, anticuerpos de anti-CTLA de ratón, anticuerpos de anti-CTLA de mamífero, anticuerpos de anti-CTLA humanizados, anticuerpos de anti-CTLA monoclonales , anticuerpos de anti-CTLA policlonales , anticuerpos de anti-CTLA quiméricos, MDX-010 (ipilimumab) , tremelimumab, anticuerpos de anti-CD28, adnectinas de anti-CTLA4, anticuerpos del dominio de anti-CTLA4, fragmentos de anti-CTLA4 de una sola cadena, fragmentos de anti-CTLA4 de cadena pesada, fragmentos de anti-CTLA4 de cadena ligera, inhibidores de CTLA4 que tiene un efecto agonista sobre la ruta co-estimuladora , los anticuerpos descritos en la Publicación del PCT No. O 2001/014424, los anticuerpos descritos en la publicación del PCT No. WO 2004/035607, los anticuerpos descritos en la Publicación del PCT No. 2005/0201994, y los anticuerpos descritos en la patente europea otorgada No. EP 1212422 Bl . Los anticuerpos de CTLA-4 adicionales se describen en las patentes U.S. Nos. 5,811,097, 5,855,887, 6,051,227, y 6,984,720; en las publicaciones del PCT Nos. WO 01/14424 y WO 00/37504, y en las publicaciones U.S. Nos. 2002/0039581 y 2002/086014. Otros anticuerpos anti-CTLA-4 que pueden ser utilizados en un método de la presente invención incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en: WO 98/42752; las patentes U.S. Nos. 6,682,736 y 6,207,156; Hurwitz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95 ( 17 ) : 10067-10071 (1998); Camacho et al., J. Clin. Oncology, 22(145) : Abstract No. 2505 (2004) (anticuerpo CP-675206); Mokyr et al., Cáncer Res., 58:5301-5304 (1998), y las patentes U.S. Nos. 5,977,318, 6,682,736, 7,109,003, y 7,132,281.

Los antagonistas de anti-CTLA4 adicionales incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: cualquier inhibidor que sea capaz de alterar la capacidad del antígeno de CD28 para aglutinarse a su ligando asociado, para inhibir la capacidad del CTLA4 para aglutinarse a su ligando asociado, para aumentar las respuestas de las células T por medio de rutas co-estimuladoras, para alterar la capacidad de B7 para aglutinarse a CD28 y/o CTLA4, para alterar la capacidad de B7 para activar la ruta co-estimuladora, para alterar la capacidad de CD80 para aglutinarse a CD28 y/o a CTLA4, para alterar la capacidad de CD80 para activar la ruta co-estimuladora, para alterar la capacidad de CD86 para aglutinarse a CD28 y/o CTLA4, para alterar la capacidad de CD86 para activar la ruta co-estimuladora, y para alterar la ruta co-estimuladora, en general de que sea activada. Esto necesariamente incluye inhibidores de moléculas pequeñas de CD28, CD80, CD86, CTLA4 , entre otros elementos de la ruta co-estimuladora; los anticuerpos dirigidos a CD28, CD80, CD86, CTLA4, entre otros elementos de la ruta co-estimuladora; las moléculas antisentido dirigidas a CD28, CD80, CD86, CTLA4, entre otros elementos de la ruta co-estimuladora; las adnectinas dirigidas contra CD28, CD80, CD86, CTLA4, entre otros elementos de la ruta co-estimuladora, los inhibidores del ARNi (tanto de una sola hebra como de doble hebra) de CD28, CD80, CD86, CTLA4, entre otros elementos de la ruta co-estimuladora, entre otros antagonistas de anti-CTLA4.

Cada una de estas referencias son incorporadas específicamente aquí para referencia para los propósitos de descripción de los anticuerpos de anti-CTLA4. Un anticuerpo de CTLA-4 clínico preferido es el anticuerpo monoclonal humano 10D1 (también referido como MDX-010 e ipilimumab y disponible de Medarex, Inc., Bloomsbury, NJ) que se describe en WO 01/14424.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1A y la figura IB ilustran los resultados que muestran que el tratamiento concurrente con el CTLA-4 mAb y dasatinib produjo efectos sinergísticos en el modelo tumoral del fibrosarcoma SAIN. Dasatinib fue administrado diariamente durante 11 días ("A") o durante 15 días después de un programa intermitente (5 días de encendido/2 días de apagado) ("B").

La figura 2 ilustra los resultados que muestran que el tratamiento concurrente con dasatinib y CTLA-4 mAb produjo efectos sinergísticos en el modelo tumoral de CT-26.

La figura 3A, figura 3B y figura 3C ilustran los resultados que muestran que el tratamiento con dasatinib aumenta la actividad citolítica de CTLA-4 mAb. Los ratones que llevan tumores del colon CT26 subcutáneos fueron tratados con dasatinib (30 mg/kg, cldxl4, provisto, los días 4-18 después del implante de las células tumorales) , CTLA-4 mAb (20 mg/kg, c4dx3, provisto, los días 4, 8, 12 después del implante de las células tumorales) o la combinación de ambos agentes. Dos (A), 7 (B) y 14 (C) días después del tratamiento final, los ratones (n=5/grupo) fueron inyectados con esplenocitos singeneicos etiquetados con CFSE aplicando impulsos de péptidos específicos para CT26 (AH-1) . Dieciocho oras más tarde, los esplenocitos fueron aislados y la actividad citolítica fue determinada midiendo la relación de las células etiquetadas con CFSE (CFSE elevado = péptidos pulsantes, CFSE bajo = sin pulsaciones) . La combinación de dasatinib y CTLA-4 mostró une mejora de la lisis de esplenocitos con impulsos de péptidos que alcanzaron un significado estadístico por el día 14 (p=0.055) .

La figura 4A y la figura 4B ilustran los resultados que muestran que el tratamiento combinatorio con dasatinib y CTLA-4 mAb conduce a un incremento en la relación de las células T activadas con CD8 (CD8+CD69, células efectoras T) sobre A) células reguladoras T (CD4+CD25+FoxP3+, células supresoras T) y B) células CTLA+4 activadas en los nodos linfáticos de drenaje del tumor (TDLN) . Los ratones que llevan tumores del colon de CT26 subcutáneos fueron tratados con dasatinib (30 mg/kg, cldxl4, provisto, días 4-18 después del implante de las células tumorales), CTLA-4 mAb (20 mg/kg, c4dx3 , ofrecido, los días 4, 8, 12 después del implante de las células tumorales) o la combinación de ambos agentes. TDLN fueron colectados 2 días después del tratamiento final, y se sometieron a la caracterización inmunofenotípica por citometría de flujo.

La figura 5 ilustra que el tratamiento concurrente con SPRYCEL® y CTLA-4 mAb produjo efectos mejorados en un modelo del tumor P815. SPRYCEL® fue administrado P.O. los días 9-13, 16-20, 23-27 post-implante del tumor en donde el anti-CTLA-4 mAb fue dosificado IP los días 10, 14, 18.

La figura 6 muestra que la actividad de bloqueo de CTLA-4 no fue anulada por el tratamiento concurrente con etopósido, paclitaxel, o gemcitabina.

La figura 7 muestra que el mAb que bloquea CTLA-4 en combinación con gemcitabina produjo efectos sinergísticos . Los ratones que lograron una respuesta completa ( "CR" ) rechazaron un segundo estímulo con células CT-26 vivas, sugiriendo que este tratamiento combinado produjo una respuesta inmunológica de la memoria .

La figura 8 muestra que el mAb que bloquea CTLA-4 en combinación con etopósido produjo efectos sinergísticos.

La figura 9 muestra que el mAb que bloquea CTLA-4 en combinación con agente (s) estabilizante (s) de microtúbulos produjo efectos sinergísticos.

La figura 10 muestra el orden en el cual la combinación de mAb que bloquea el CTLA-4 y el agente quimioterapéutico son administrados, que tiene relevancia para la inhibición de la proliferación. Como es mostrado, la co-administración de gemcitabina concurrentemente con el mAb que bloque el CTLA-4 produjo el efecto anti-proliferativo más grande cuando se compara con la administración consecutiva.

La figura 11 muestra la expansión de las células CD8+ T citotóxicas por el tratamiento con CTLA-4 mAb e ixabepilona. CTLA-4 mAb + ixabepilona produjo la expansión de las células T citotóxicas (CD8+CD107+) en este modelo, pero no en combinación con paclitaxel .

La figura 12 muestra que la gemcibatina y el etopósido promueven la citotoxicidad in vivo.

La figura 13 muestra la expresión modulada por el bloqueo de Gemcitabina + CTLA-4 de los genes involucrados en la regulación inmunológica .

La Tabla A muestra que la gemcitabina modula la composición de las células imunológicas en los nodos linfáticos de drenaje del tumor.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un método sinergístico para el tratamiento de las enfermedades anti-proliferativas , incluyendo el cáncer, que comprende administrar a una especia de mamífero que tenga la necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de: (1) un elemento del grupo que consiste: un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína, tal como dasatinib, un agente estabilizante de la microtubulina , tal como paclitaxel; un análogo de nucleósido, tal como gemcitabina ; o un agente inductor de la doble hebra del ADN, tal como etopósido; y (2) un modulador de la ruta co-estimuladora, tal como un antagonista de anti-CTLA4.

La activación de las células T óptimas requiere la interacción entre el receptor de las células T y el antígeno específico (Bretscher, P. et al., Science, 169:1042-1049 (1970) ) y el acoplamiento de los receptores co-estimuladores sobre la superficie de las células T con los ligandos co-estimuladores expresados por la célula que presenta el antígeno (APC) (la segunda señal) . La falla de las células T para recibir una segunda señal puede conducir a anergia clonal (Schwartz, R.H. , Science, 248:1349-1356 (1990)). Dos receptores co-estimuladores de las células T importantes son CD28 y el antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico (CTLA-4, CD152) cuyos ligandos sobre el APC son B7-1 y B7-2 (Linsley, P. S. et al., J. Exp. Med. , 173:721-730 (1991); Linsley, P.S. et al., J" Exp. Med., 174:561-569 (1991)).

Aunque CD28 y CTLA-4 son elementos relacionados estrechamente de la superfamilia de Ig (Brunet, J.F. et al., Nature, 328:267-270 (1987)), los mismos funcionan antagonísticamente . CD28 es expresado constitutivamente sobre la superficie de las células T (Gross, J.A. et al., J. Immunol . , 149:380-388 (1992)), y durante el acoplamiento con B7-1 o B7-2, mejora la señal de MHC-péptido-célula receptora de las células T para promover la activación de las células T, la proliferación, y la producción de IL-2 (Linsley, P.S. et al., J". Exp. Med. , 173:721-730 (1991); Alegre, M.L. et al., Wat. Rev. Immunol., l(3):220-228 (diciembre 2001)). El CTLA-4 no es encontrado sobre las células T en reposo pero es regulado ascendentemente durante 2-3 días después de la activación de las células T (Lindsten, T. et al., J Immunol., 151:3489-3499 (1993); Walunas, T.L. et al., Immunity, 1, 405-413 (1994)). El CTLA-4 también se aglutina a B7-1 y B7-2 pero con mayor afinidad hacia CD28 (Linsley, P.S. et al., Immunity, 1:793-801 (1994)) y antagoniza la activación de las células T, interfiere con la producción de IL-2 y la expresión del receptor IL-2, e interrumpe la progresión del ciclo celular de las células T activadas (Walunas, T.L. et al., J. Exp. Med., 183:2541-2550 (1996); Krummel, M.F. et al., J. Exp. Med., 183:2533-2540 (1996); Brunner, M.C. et al., J". Immunol., 162:5813-5820 (1999); Greenwald, R.J. et al., Bur. J". Immunol., 32:366-373 (2002)). La respuesta total de las células T es determinada por la integración de todas las señales, estimuladoras e inhibidoras.

A causa de que CTLA-4 parece que menoscaba la activación de las células T, se han hecho intentos para bloquear la actividad de CTLA-4 en los modelos de murino de inmunoterapia contra el cáncer. En los ratones implantados con tumores inmunogénicos , la administración del anti -CTLA-4 Ab mejoró el rechazo del tumor (Leach, D.R. et al., Science, 271:1734-1736 (1996)), aunque se observó un efecto pequeño con los tumores pobremente inmunogénicos tales como el carcinoma mamario SM1 o el melanoma B16. Una inmunidad antitumoral mejorada fue observada cuando el anti-CTLA-4 Ab fue suministrado con la vacuna de las células B16 transducidas con el factor estimulante de las colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF) y estuvo asociada con la despigmentación, sugiriendo que al menos una parte de la respuesta antitumoral fue específica contra los antígenos de diferenciación de los melanocitos "propios" (van Elsas, A. et al., J. Exp. Med., 190:355-366 (1999); van Elsas, A. et al., J. Exp. Med., 194:481-489 (2001). En un modelo de murino transgénico del cáncer de la próstata primario, la administración del anti-CTLA-4 Ab más las células del cáncer de la próstata que expresan el GM-CSF redujo la incidencia y la severidad histológica del cáncer de la próstata y condujo a la prostatitis en ratones normales, que sugieren nuevamente una respuesta inmunológica específica para el antígeno contra los auto-antígenos en el rechazo del tumor (Hurwitz, A.A. , Cáncer Res., 60:2444-2448 (2000)). Además, a causa de que muchos antígenos de los tumores humanos son auto-antígenos normales, romper la tolerancia contra los mismos puede ser crítico para el éxito de la inmunoterapia contra el cáncer. Las respuestas tumorales favorables del bloqueo de CTLA-4 en conjunción con las vacunas contra el tumor en los modelos del murino condujo al interés en el uso del bloqueo del CTLA-4 en la inmunoterapia contra el cáncer humano.

La quimioinmunoterapia , la combinación de los agentes quimioterapéuticos e inmunoterapéuticos , es un método novedoso para el tratamiento del cáncer que combina los efectos de los agentes que atacan directamente las células tumorales que producen la necrosis o apoptosis de las células tumorales, y los agentes que modulan las respuestas inmunológicas del animal hospedero al tumor. Los agentes quimioterapéuticos podrían mejorar el efecto de la inmunoterapia por la generación de los antígenos tumorales que van a ser presentados por las células que presentan el antígeno creando una vacuna de las células tumorales "polivalentes", y por la distorsión de la arquitectura del tumor, facilitando así la penetración de los agentes inmunoterapéuticos así como la población inmunológica extendida .

Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para la administración de un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína en la(s) combinación (es) sinergística (s) con al menos un agente anti-CTLA4 para el tratamiento de una variedad de cánceres, incluyendo, pero sin estar limitado a, los siguientes: carcinomas incluyendo aquellos de la vejiga (incluyendo el cáncer de vejiga acelerado y metastático) , de mama, del colon (incluyendo el cáncer colorrectal) , del riñon, del hígado, del pulmón (incluyendo el cáncer de células pequeñas y no pequeñas y el adenocarcinoma del pulmón) , de los ovarios, de la próstata, de los testículos, del tracto genitourinario, del sistema linfático, del recto, de la laringe, del páncreas (incluyendo el carcinoma pancreático exocrino) , del esófago, del estómago, de la vesícula biliar, del cérvix, de la tiroides, y de la piel (incluyendo carcinoma de las células escamosas) ; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide incluyendo la leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, el linfoma de las células B, el linfoma de las células T, linfoma de Hodgkins, linfoma no de Hodgkins, linfoma de las células del cabello, linfoma histiocítico, y el linfoma de Burketts; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide incluyendo leucemias mielogenosas agudas y crónicas, síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide, y leucemia promielocítica ; tumores del sistema nervioso central y periférico incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, y schwannomas; los tumores de origen mesenquimal incluyendo fibrosarcoma , rabdomiosarcoma , y osteosarcoma ; otros tumores incluyendo melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular de la tiroides, y teratocarcinoma ; melanoma, melanoma maligno inoperable de las etapas III y IV, carcinoma de células escamosas, cáncer del pulmón de células pequeñas, cáncer del pulmón de células no pequeñas, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de los ovarios, cáncer del hígado, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer del riñon, cáncer de la próstata, cáncer de la tiroides, neuroblastoma, cáncer pancreático, glioblastoma multiforme, cáncer cervical, cáncer del estómago, cáncer de la vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma del colon, y cáncer del cuello y de la cabeza, cáncer gástrico, tumor de las células germinales, cáncer de los huesos, tumores de los huesos, el histiocitoma fibroso maligno de los huesos en la adultez; el histiocitoma fibroso maligno de los huesos en la niñez, el sarcoma, el sarcoma pediátrico, el exterminador natural sinonasal, neoplasmas, neoplasma de las células del plasma; síndromes mielodisplásicos ; neuroblastoma, tumor de las células germinales testiculares , melanoma intraocular, síndromes mielodisplásicos; enfermedades mielodisplásicas/ mieloproliferativas , sarcoma sinovial, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda del cromosoma Filadelfia (Ph+ ALL) , mielomas múltiples, leucemia mielogenosa aguda, leucemia linfoblástica crónica, mastocitosis y cualquier síntoma asociado con mastocitosis, y cualquier metástasis de las mismas. Además, los trastornos incluyen la urticaria pigmentosa, las mastocitosis tales como mastocitosis cutánea difusa, masticitoma solitario en el ser humano, así como el mastocitoma en el perro y algunas mastocitosis de subtipos raros semejantes a la mastocitosis bulosa, eritrodérmica y telangiectática, mastocitosis con un trastorno hematológico asociado, tal como un síndrome meiloproliferativo o mielodisplásico, o leucemia aguda, el trastorno mieloproliferativo asociado con la mastocitosis, leucemia de los mastocitos, además de otros cánceres. Otros cánceres también están incluidos dentro del alcance de los trastornos incluyendo, pero sin estar limitado a, los siguientes: carcinomas, incluyendo aquellos de la vejiga, carcinoma urotelial, de mama, del colon, del riñon, del hígado, del pulmón, de los ovarios, del páncreas, del estómago, del cérvix, de la tiroides, de los testículos, particularmente seminomas testiculares , y de la piel; incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores estromales gastrointestinales ("GIST"); tumores hematopoyéticos de linaje linfoide incluyendo la leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, el linfoma de las células B, el linfoma de las células T, linfoma de Hodgkins, linfoma no de Hodgkins, linfoma de las células del cabello, y el linfoma de Burketts; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide incluyendo leucemias mielogenosas agudas y crónicas y leucemia promielocítica ; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma y rabdomiosarcoma ; otros tumores incluyendo melanoma, seminoma, teratocarcinoma , neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, y schwannomas; los tumores de origen mesenquimal incluyendo fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, y osteosarcoma ; y otros tumores incluyendo melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoacantoma , seminoma, cáncer folicular de la tiroides, teratocarcinoma; tumores de las células germinales no seminomatosas refractarias a quimioterapia, y sarcoma de Kaposi, y cualquier metástasis de las mismas. Preferentemente, tales métodos de tratamiento del cáncer con los regímenes de tratamiento de la presente invención conducirán a una incidencia reducida de la colitis inducida por el agente anti-CTLA.

La combinación del inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína con al menos un modulador de la ruta co-estimuladora, preferentemente un agente anti-CTLA4, también puede incluir la adición de un agente antitóxico anti-proliferativo . Las clases de compuestos que pueden ser utilizados como agentes citotóxicos anti-proliferativos incluyen los siguientes.

Los agentes de alquilación (incluyendo, sin limitación, mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas y triacenos) : mostaza de uracilo, clorometina, ciclofosfamida (CITOXA ®, Ifosfamida, Melfalan, clorambucilo, pipobromano, trietilenmelamina , trietilentiofosforamida, busulfan, carmustina, lomustina, estreptozocina , dacarbazina, y temozolomida .

Los antimetabolitos (incluyendo, sin limitación, los antagonistas del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina desaminasa) : metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina , 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina, y gemcitabina.

Para los propósitos de la presente invención, un modulador de la ruta co-estimuladora abarca uno o más de los siguientes: un agente anti-CTLA4, un anticuerpo de anti-CTLA-4, ipilimumab, y tremelimumab .

Otros moduladores de la ruta co-estimuladora de la presente invención que pueden ser utilizados en combinación con un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína, ya sea solo o en combinación adicional con otros moduladores de la ruta co-estimuladora descritos aquí, o en combinación con otros compuestos descritos aquí incluyen, pero no están limitados a los siguientes: agatolimod, belatacept, blinatumomab, ligando CD40, anticuerpo de anti-B7-l, anticuerpo de anti-B7-2, anticuerpo de anti-B7-H4, AG4263, eritoran, anticuerpo de anti-OX40, ISF-154, y SGN-70; B/-1, B7-2, ICAM-1, ICAM-2, ICM-3, CD48, LFA-3, ligando de CD30, ligando de CD40, antígeno estable térmicamente, B7h, ligando OX40, LIGTH, CD70 y CD24.

En una modalidad preferida de esta invención, se proporciona un método para el tratamiento sinergístico de los tumores cancerosos. Ventajosamente, el método sinergístico de esta invención reduce el desarrollo de los tumores, reduce la carga tumoral, o produce una regresión del tumor en un animal hospedero mamífero.

La combinación de un inhibidor de tirosina cinasa de la proteírta, tal como dasatinib, un agente de estabilización de la microbutilina, tal como paclitaxel; un análogo de nucleósido, tal como gemcitabina ; o un agente inductor de la doble hebra del ADN, tal como etopósido; con al menos un agente de anti-CTLA4, también puede incluir la adición de un agente citotóxico anti-proliferativo ya sea solo o en combinación con una terapia de radiación.

Otros agentes citotóxicos anti-proliferativos son navelbeno, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida, y droloxafina.

Los productos naturales y sus derivados (por ejemplo, alcaloides vinca, antibióticos antitumorales, enzimas, linfocinas y epipodofilotoxinas , ) : Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Bleomicina, Dactinomicina, Daunorrubicina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Idarrubicina, Ara-C, paclitaxel (el paclitaxel está disponible comercialmente como TAXOL®) , Mitramicina, Desoxicoformicina, Mitomicina-C, L-Asparaginasa , Interferones (especialmente IFN-a) , Etopósido, y Tenipósido.

Otras combinaciones con al menos un modulador de una ruta co-estimuladora, preferentemente un agente anti-CTLA , puede incluir una combinación de un agonista de una ruta co-estimuladora (es decir, un inmunoestimulante) , un agente de estabilización de la tubulina (por ejemplo, pacitaxol, epotilona, taxano, etc.), IXEMPRA™, Dacarbazina, PARAPLATIN®, Docetaxel, una o más vacunas de péptidos, la Vacuna del Péptido de Melanoma MDX-1379, una o más vacunas del péptido gplOO, vacuna de la viruela aviar-PSA-TRICOM™, vacuna de vaccinia-PSA-TRICOM, antígeno MART-1, sargramostim, tremelimumab, Terapia por Ablación con Andrógenos Combinados; la combinación de ipilimumab y otro agonista de la ruta co-estimuladora; la combinación de ipilimumab y un agente estabilizador de la tubulina (por ejemplo, pacitaxol, epotilona, taxano, etc.); la combinación de ipilimumab e IXEMPRA , la combinación de ipilimumab con Dacarbazina, la combinación de ipilimumab con PARAPLATIN®, la combinación de ipilimumab con Docetaxel, la combinación de ipilimumab con una o más vacunas de péptidos, la combinación de ipilimumab con la Vacuna del Péptido de Melanoma MDX-1379, la combinación de ipilimumab con una o más vacunas del péptido gplOO, la combinación de ipilimumab con la vacuna de la viruela aviar-PSA-TRICOM™, la combinación de ipilimumab con la vacuna de vaccinia-PSA-TRICOM™, la combinación de ipilimumab con el antígeno MART-1, la combinación de ipilimumab con sargramostim, la combinación de ipilimumab con tremelimumab, y/o la combinación de ipilimumab con la Terapia por Ablación con Androgenos Combinados. Las combinaciones de la presente invención también pueden ser utilizadas en conjunción con otras terapias bien conocidas que son seleccionadas por su utilidad particular contra la condición que está siendo tratada.

La frase "terapia de radiación" incluye, pero no está limitada a, los rayos X o los rayos gamma los cuales son suministrados desde ya sea una fuente aplicada externamente tal como un haz o por el implante de las fuentes radioactivas pequeñas .

Cuando se utilice en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contenido lo indique claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a un "péptido" incluye una combinación de dos o más péptidos, y semejantes.

"Aproximadamente" cuando se utiliza aquí, hace referencia a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y semejantes, se entiende que abarca variaciones de + 20 % o + 10 %, más preferentemente + 5 %, aún más preferentemente ¦+ 1 %, y todavía aún más preferentemente +^ 0.1 % del valor especificado, porque tales variaciones son apropiadas para efectuar los métodos descritos .

Como se sabe en el arte, el dasatinib también es referido como N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida y describe un compuesto que tiene la siguiente estructura (I) : El compuesto (I) también puede ser referido como N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- ( (6- (4- (2 -hidroxietil ) -1-piperazinil) -2-metil-4-pirimidinil) amino) -1, 3-tiazol-5-carboxamida de acuerdo con la nomenclatura IUPAC. El uso del término "N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida" abarca (a menos que se indique de otra manera) los solvatos (incluyendo los hidratos) y las formas polimórficas del compuesto (I) o sus sales (tales como la forma del monohidrato de (I) descrita en USSN 11/051,208, presentada el 4 de febrero del 2005, incorporada aquí para referencia en su totalidad y para todos los propósitos) . Las composiciones farmacéuticas de la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- ( 2 -hidroxietil ) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida incluyen todas las composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2 -hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida y uno o más diluyentes, vehículos y/o excipientes, tales como aquellas composiciones descritas en USSN 11/402,502, presentada el 12 de abril del 2006, incorporada aquí para referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Un ejemplo de una composición farmacéutica que comprende la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2 -hidroxietil ) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida es SPRYCEL® (Bristol-Myers Squibb Company) . El SPRYCEL® comprende la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2 -metil -4 -pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida como el ingrediente activo, también referido como dasatinib, y como ingredientes o excipientes inactivos, lactosa monohidratada, celulosa microcristalina, croscarmelosa sódica, hidroxipropil celulosa, y estearato de magnesio en una tableta que comprende hipromelosa, dióxido de titanio, y polietilenglicol .

Se va a entender que esta invención no está limitada a métodos, reactivos, compuestos, composiciones, o sistemas biológicos particulares, los cuales, por supuesto, pueden variar. También se va a entender que la terminología utilizada aquí es con el propósito de descripción de los aspectos particulares solamente, y no está propuesta para que sea limitativa.

Como ya se sabe en el arte, el ipilimumab se refiere a un anticuerpo de anti-CTLA-4 , y es un anticuerpo de IgGiN totalmente humano derivado de los ratones transgénicos que tienen genes humanos que codifican las cadenas ligera y pesada para generar un repertorio humano funcional. El ipilimumab también puede ser referido por su Registro del CAS No. 477202-00-9, y se describe como el anticuerpo 10DI en la Publicación del PCT No. WO 01/14424, incorporada aquí para referencia en su totalidad para todos los propósitos. Específicamente, ipilimumab describe un anticuerpo monoclonal humano o una porción de aglutinación al antígeno del mismo que se aglutina específicamente al CTLA4 , que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada que tiene una región variable de la cadena ligera comprendida de la SEC ID NO: 1, y que comprende una región de la cadena pesada comprendida de la SEC ID NO: 2. Las composiciones farmacéuticas de ipilimumab incluye todas las composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden ipilimumab y uno o más diluyentes, vehículos y/o excipientes. Los ejemplos de una composición farmacéutica que comprende ipilimumab son provistos en la Publicación del PCT No. WO 2007/67959. El ipilimumab puede ser administrado por I.V.

Región variable de la cadena ligera para ipilimumab: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQ PGQAPRLLIYGAFS RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPW FGQGTKVEIK (SEC ID NO: 1) Región variable de la cadena pesada para ipilimumab: QVQLVESGGG WQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPG GLEWVTFIS YDG WKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAJYYCARTGWLG PFDYWGQGTLVTVSS ( SEC ID N0 : 2 ) Como se señaló aquí en otra parte, la administración de uno o más antagonistas de anti-CTLA4 pueden ser administrados ya sea solos o en combinación con un antígeno del péptido (por ejemplo, gplOO) , además de un agente anti -proliferativo descrito aquí. Un ejemplo no limitativo de un antígeno del péptido podría ser un péptido de gplOO que comprende, o que consiste alternativamente de, la secuencia seleccionada del grupo que consiste de IMDQVPFSV (SEC ID NO: 3), e YLEPGPVTV (SEC ID NO: 4) . Tal péptido puede ser administrado oralmente, o preferentemente por inyección s.c. a 1 mg emulsionado en el adyuvante de Freund incompleto (IFA) inyectado s.c. en una extremidad, y 1 mg de ya sea un péptido ya sea idéntico o diferente emulsionado en IFA puede ser inyectado en otra extremidad.

Como ya se sabe en el arte, paclitaxel se refiere a un compuesto que tiene la siguiente estructura (II) : El compuesto (II) también puede ser referido como el 13-éster de 2-benzoato y , 10 -diacetato de 5beta, 20-Epoxi-l, 2alfa,4, 7beta, lObeta, 13alfa-hidroxitax-ll-en-9-ona con ( 2R , 3 S ) -N-benzoi 1 - feni 1 i soserina de acuerdo con la nomenclatura IUPAC. El uso del término "13-éster de 2-benzoato y 4 , 10 - diacetato de 5beta,20-Epoxi-1, 2alfa,4,7beta,10beta, 13al fa-hidroxitax- 11 - en- 9 -ona con ( 2R, 3 S ) -N-benzoi 1 - fenil isoserina" abarca (a menos que se indique de otra manera) los solvatos (incluyendo los hidratos) y las formas polimórficas del compuesto (II) o sus sales, tales como las formas de (II) descritas en la Patente U.S. No. 5,504,102, expedida del 2 de abril de 1996, incorporada aquí para referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Las composiciones farmacéuticas del 13-éster de 2-benzoato y 4 , 10 -diacetato de 5beta, 20-Epoxi-1, 2alfa, 4, 7beta, lObeta, 13al fa -hidro itax- 11 - en- 9 -ona con ( 2R, 3S ) -N-benzoi 1 - feni 1 isoserina todas incluyen composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden el 13-éster de 2-benzoato y 4 , 10 -diacetato de 5beta, 20-Epoxi-l, 2alfa, 4 , 7beta, lObeta, 13alfa-hidroxitax-ll-en-9-ona con ( 2R , 3S ) -N-benzoi 1 - 3 - feni 1 isoserina y uno o más diluyentes, vehículos y/o excipientes. Un ejemplo de una composición farmacéutica que comprende el 13-éster de 2-benzoato y 4 , 10 -diacetato de 5beta , 20 - Epoxi -1, 2alfa, 4, 7beta, lObeta, 13al fa -hidroxitax- 11 - en- 9 -ona con (2R, 3S) -N-benzoil-3-fenilisoserina, es el TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Company) . El TAXOL® comprende el 13-éster de 2-benzoato y 4 , 10 -diacetato de 5beta, 20-Epoxi-1, 2alfa,4, 7beta, lObeta, 13alfa-hidroxitax- 11-en- 9 -ona con (2R, 3S) -N-benzoil - 3 - fenilisoserina como el ingrediente activo, también referido como el paclitaxel, para la infusión IV incluyendo los ingredientes inactivos en la forma de un diluyente que consiste de una inyección de cloruro de sodio al 0.9 %, USP, Inyección de Dextrosa al 5 %, USP, 0.9 % de cloruro de sodio y 5 % de Inyección de Dextrosa, USP, o 5% de Dextrosa en la Inyección de Ringer a una concentración final de 0.3 hasta 1.2 mg/ml.

Como se sabe en el arte, gemcitabina se refiere a un compuesto que tiene la siguiente estructura (III) : (111).

El compuesto (III) también puede ser referido como el monoclorhidrato de la 2 ' -desoxi-2 ' , 2 ' -difluorocitidina (isómero ß) de ac.uerdo con la nomenclatura de la IUPC. El uso del término "monoclorhidrato de la 2 ' -desoxi-2 ', 2 ' - difluorocitidina (isómero ß) " abarca (a menos que se indique de otra manera) los solvatos (incluyendo los hidratos) y las formas polimórficas del compuesto (III) o sus sales. Las composiciones farmacéuticas del monoclorhidrato de la 2'- desoxi-2 ', 2 ' -difluorocitidina (isómero ß) y uno o más diluyentes, vehículos y/o excipientes. Un ejemplo de una composición farmacéutica que comprende el monoclorhidrato de la 2' -desoxi-2' , 2' -difluorocitidina (isómero ß) es GEMZAR® (HCl de gemcitabina) . GEMZAR® comprende el monoclorhidrato de la 2 ' -desoxi -2 ' , 2 ' -difluorocitidina (isómero ß) como el ingrediente activo, para la infusión IV incluyendo los ingredientes activos en una forma estéril para uso intravenoso solamente. Los viales de GEMZAR® contienen ya sea 200 mg o 1 g de HCl de gemcitabina (expresado como la base libre) formulado con manitol (200 mg o 1 g respectivamente) y acetato de sodio (12.5 g o 62.5 mg, respectivamente) como un polvo liofilizado estéril. El ácido clorhídrico y/o el hidróxido de sodio pueden haber sido agregados para el ajuste del pH.

Como ya se sabe en el arte, el etopósido se refiere a un compuesto que tiene la siguiente estructura (IV) : (III).

El compuesto (IV) también puede ser referido como el 4' -(fosfato diácido) de 4 ' -desmetilepipodofilotoxina 9- [4 , 6-0- (R) -etilideno- -D-glucopiranósido] de acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC. El uso del término "4' -(fosfato diácido) de 4 ' -desmetilepipodofilotoxina 9- [4 , 6-0- (R) -etilideno^-D-glucopiranósido] " abarca (a menos que se indique de otra manera) los solvatos (incluyendo los hidratos) y las formas polimórficas del compuesto (IV) o sus sales. Las composiciones farmacéuticas del 4' -(fosfato diácido) de 4 ' -desmetilepipodofilotoxina 9- [4 , 6-0- (R) -etilideno- -D-glucopiranósido] y uno o más diluyentes, vehículos y excipientes. Un ejemplo de una composición farmacéutica que comprende el 4' -(fosfato diácido) de 4'-desmetilepipodofilotoxina 9- [4 , 6-0- (R) -etilideno^-D-glucopiranósido] es ETOP0PHOS (fosfato de etopósido) . ET0P0PH0S comprende el 4' -(fosfato diácido) de 4'-desmetilepipodofilotoxina 9- [4 , 6-0- (R) -etilideno- -D-glucopiranósido] como el ingrediente activo, para la infusión IV incluyendo los ingredientes inactivos en una forma estéril para uso intravenoso solamente, en viales de una sola dosis que contienen el fosfato de etopósido equivalente a 100 mg del etopósido, 32.7 mg de citrato de sodio USP, y 300 mg de dextrano 40.

Los agentes antiproliferativos adecuados para su uso en los métodos de la invención, incluyen, sin limitación, los taxanos, el paclitaxel (el paclitaxel está disponible comercialmente como TAXOL®) , docetaxel , discodermolida (DDM) , dictiostatina (DCT) , Pelorusida A, epotilonas, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, epotilona E, epotilona F, furanoepotilona D, desoxiepotilona Bl, [17]-deshidrodesoxiepotilona B, [18] -deshidrodesoxiepotilonas B, C12 , 13-ciclopropil-epotilona A, epotilona A unida con un puente de C6-C8, trans-9 , 10-deshidroepotilona D, cis-9,10-deshidroepotilona D, 16 -desmetilepotilona B, epotilona B10, discodermolida, patupilona (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, BMS-310705, ABJ-789, XAA296A (Discodermolida), TZT-1027 (soblidotina) , ILX-651 (clorhidrato de tasidotina) , Halicondrina B, mesilato de Eribulina (E-7389) , Hermiasterlina (HTI-286), E-7974, Criptoficinas , LY-355703, inmunoconjugados de Maytansinoide (DM-1) , MKC-1, ABT-751, Tl-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesib), SB-743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobina, 17beta-acetoxi-2-etoxi-6-oxo-B-homo-estra-1 , 3 , 5 (10) -trien-3-ol , cicloestreptina , isolaulimalida, laumalida, 4-epi-7-deshidroxi-14 , 16-didesmetil- (+) -discodermolidas , y criptotilona 1, además de otros agentes estabilizantes de microtubulina conocidos en el arte.

La frase "inhibidor de tirosina cinasa de la proteína" se entiende que se refiere a agentes que inhiben uno o más miembros de la familia de la tirosina cinasa de la proteína. Los ejemplos no limitativos de los inhibidores de tirosina cinasa de . la proteína incluyen, pero no están limitados a dasatinib, imatinib, nilotinib, PD180970, GGP76030, AP23464, SKI 606, NS-187, y/o AZD0530. Tales inhibidores de tirosina cinasa de la proteína pueden ser administrados ya sea solos o en combinación con otras moléculas, tales como inhibidores de T315I.

La frase "agente modulador de microtubilina" se entiende que se refiere a agentes que ya sea estabilizan la microtubulina o desestabilizan la síntesis y/o polimerización de microtubulina.

Cuando se haga referencia aquí, el al menos un agente anti-proliferativo puede ser un agente que afecta los microtúbulos . El agente que afecta los microtúbulos interfiere con la mitosis celular y es bien conocido en el arte por su actividad citotóxica anti -proliferativa . Los agentes que afectan los microtúbulos útiles en la invención incluyen, pero no están limitados a, alocolchicina (NSC 406042), Halicondrina B (NSC 609395), colchicina (NSC 757), derivados de colchicina (por ejemplo, NSC 33410), dolastatina 10 (NSC 376128) , maitansina (NSC 153858) , rixozina (NSC 332598), paclitaxel (TAXOL®, NSC 125973), derivados de TAXOL® (por ejemplo, derivados (por ejemplo, NSC 608832), tiocolchicina NSC (361792), tritil cisteína (NSC 83265), sulfato de vinblastina (NSC 49842) , sulfato de vincristina (NSC 67574) , epotilonas naturales y sintéticas incluyendo pero sin estar limitado a epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, desoxiepotilona A, desoxiepotilona B, [1S- [1R*,3R* (E) , 7R* , IOS* , 11R* , 12R* , 16S*] ] -7-11-dÍhÍdroxÍ-8, 8, 10, 12, 16-pentametil-3- [l-metil-2- (2-metil-4-tiazolil) etenil] -4 -aza-17 -oxabiciclo [14.1.0] heptadecano- 5 , 9-diona (descrita en la Patente US 6,262,094, expedida el 17 de julio del 2001), [1S- [IR* , 3R* (E) , 7R* , IOS* , 11 * , 12R* , 16S* ] ] -3 -[2- [2- (aminometil) -4-tiazolil] -1-metiletenil] -7, 11-dihidroxi-8,8,10,12, 16-pentametil-4-17-dioxabiciclo [14.1.0] heptadecano-5,9-diona (descrito en USSN 09/506,481 presentada el 17 de febrero del 2000, y los ejemplos 7 y 8 de aquí), y los derivados de los mismos; y otros agentes alteradores de los microtúbulos . Los agentes antineoplásicos adicionales incluyen, discodermolida (véase Service, Science, 274:2009 (1996) ) estramustina , nocodazol, MAP4 , y semejantes. Los ejemplos de tales agentes también son descritos en la literatura científica y de patentes, veáse por ejemplo, Bulinski, J. Cell Sci . , 110:3055-3064 (1997), Panda, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:10560-10564 (1997); Muhlradt, Cáncer Res., 57:3344-3346 (1997); Nicolaou, Nature, 387:268-272 (1997) ; Vasquez, Mol. Biol . Cell. 8:973-985 (1997); Panda, J". Biol. Chem. , 271:29807-29812 (1996).

En los casos en donde sea deseable mantener en silencio las células aberrantemente proliferativas en conjunción con o previo al tratamiento con los métodos quimioterapéuticos de la invención, las hormonas y los esteroides (incluyendo análogos sintéticos) : 17a-etinilestradiol , dietilestilbestrol , testosterona, prednisona, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, testolactona, acetato de megestrol, metilprednisolona , metil-testosterona, Prednisolona, Triamcinolona, Clorotrianiseno, hidroxioprogesterona, aminoglutetimida , Estramustina, acetato de Medroxiprogesterona, Leuprolida, Flutamida, Toremifeno, ZOLADEX® también pueden ser administrados al paciente.

También son adecuados para su uso en la combinación de los métodos quimioterapéutico de la invención los antiangiogénicos tales como los inhibidores de metaloproteinasa de la matriz, y otros inhibidores de VEGF, tales como los anticuerpos de anti-VEGF y las moléculas pequeñas tales como ZD6474 y SU6668 también están incluidos. Los anticuerpos de anti-Her2 de Genentech también pueden ser utilizados. Un inhibidor de EGFR adecuado es EKB-569 (un inhibidor irreversible) . También está incluido el anticuerpo C225 de Imclone inmunoespecífico para el EGFR, y los inhibidores de src .

También son adecuados para su uso como un agente citostático antiproliferativo es CASODEX® que vuelve a los carcinomas dependientes del andrógeno no proliferativos . Todavía otro ejemplo de un agente citostático es el antiestrógeno de Tamoxifeno que inhibe la proliferación o el crecimiento del cáncer de mama dependiente de los estrógenos. Los inhibidores de la transducción de las señales proliferativas celulares son agentes citostáticos . Los ejemplos son los inhibidores del factor del crecimiento epidérmico, los inhibidores de Her-2, los inhibidores de EK-1 cinasa, los inhibidores de MAP cinasa, los inhibidores de PI3, los inhibidores de Src cinasa, y los inhibidores de PDGF. · Como se mencionó, ciertos agentes anti-proliferativos son agentes anti-angiogénicos y antivasculares y, por la interrupción del flujo de sangre a los tumores sólidos, hacen que las células del cáncer se inmovilicen porque se les priva de la nutrición. La castración, que también vuelve a los carcinomas dependientes de los andrógenos no proliferativos , también pueden ser utilizados. El ayuno por medios diferentes que la interrupción quirúrgica del flujo de sangre es otro ejemplo de un agente citostático. Una clase particularmente preferida de agentes citostáticos antivasculares son las combretast inas . Otros agentes citostáticos ejemplares incluyen los inhibidores de MET cinasa, los inhibidores de MAP cinasa, los inhibidores de las tirosinas cinasas receptoras y no receptoras, los inhibidores de la señalización de integrina, y los inhibidores de los receptores del factor de crecimiento semejante a la insulina. La presente invención también proporciona métodos para la administración de un inhibidor de tirosina cinasa de la proteína, un agente estabilizante de la microtubulina , tal como paclitaxel; un análogo de nucleósido, tal como gemcitabina; o un agente inductor de la doble hebra del ADN, tal como un etopósido; en combinaciones sinergísticas con al menos un modulador de la ruta co-estimuladora , particularmente un agente de anti-CTLA4, para el tratamiento y la prevención de un trastorno proliferativo, además de un trastorno asociado con BCR-ABL, un trastorno asociado con BCR-ABL mutante, y/o un trastorno asociado con la tirosina cinasa de la proteína, y un trastorno asociado con la presencia de una mutación de BCR-ABL resistente a imatinib, una mutación de BCR-ABL resistente a dasatinib, CML, CML resistente a imatinib, y/o CML intolerante a imatinib.

El término "BCR-ABL" como se utiliza aquí es inclusivo del BCR-ABL tanto del tipo silvestre como mutante.

Los "trastornos asociados con BCR-ABL" son aquellos trastornos que resultan de la actividad de BCR-ABL, incluyendo la actividad de BCR-ABL mutante, y/o que son aliviados por la inhibición de BCR-ABL, incluyendo la expresión y/o la actividad del BCR-ABL mutante. Una translocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22 produce una proteína de fusión de BCR-ABL oncogénica. La frase "trastornos asociados con BCR-ABL" es inclusiva de "trastornos asociados con BCR-ABL mutante" .

Los trastornos incluidos en el alcance de la presente invención incluyen, por ejemplo, las leucemias, incluyendo, por ejemplo, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, y leucemia linfoblástica aguda positiva del cromosoma Filadelfia (Ph+ ALL) , carcinoma de células escamosas, cáncer del pulmón de células pequeñas, cáncer del pulmón de células no pequeñas, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de los ovarios, cáncer del hígado, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer del riñon, cáncer de la próstata, cáncer de la tiroides, neuroblastoma, cáncer pancreático, glioblastoma multiforme, cáncer cervical, cáncer del estómago, cáncer de la vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma del colon, y cáncer del cuello y de la cabeza, cáncer gástrico, tumor de las células germinales, el sarcoma pediátrico, el exterminador natural sinonasal, mielomas múltiples, leucemia mielogenosa aguda, leucemia linfocítica crónica, mastocitosis y cualquier síntoma asociado con la mastocitosis. Además, los trastornos incluyen la urticaria pigmentosa, las mastocitosis tales como mastocitosis cutánea difusa, masticitoma solitario en el ser humano, así como el mastocitoma en el perro y algunas mastocitosis de subtipos raros semejantes a la mastocitosis bulosa, eritrodérmica y telangiectásica, mastocitosis con un trastorno hematológico asociado, tal como un síndrome meiloproliferativo o mielodisplásico, o leucemia aguda, el trastorno mieloproliferativo asociado con la mastocitosis y la leucemia de los mastocitos. Varios cánceres adicionales también están incluidos dentro del alcance de los trastornos asociados con la tirosina cinasa de la proteína incluyendo, por ejemplo, los siguientes: carcinomas, incluyendo aquellos de la vejiga, de mama, del colon, del riñon, del hígado, del pulmón, de los ovarios, del páncreas, del estómago, del cérvix, de la tiroides, de los testículos, particularmente seminomas testiculares , y de la piel; incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores estromales gastrointestinales ("GIST"); tumores hematopoyéticos de linaje linfoide incluyendo la leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, el linfoma de las células B, el linfoma de las células T, linfoma de Hodgkins, linfoma no de Hodgkins, linfoma de las células del cabello, y el linfoma de Burketts; tumores hematopoyéticos del linaje mieloide, incluyendo leucemias mielogenosas agudas y crónicas y leucemia promielocítica ; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma y rabdomiosarcoma ; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, teratocarcinoma , neuroblastoma glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, y schwannomas; los tumores de origen mesenquimal incluyendo fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, y osteosarcoma; y otros tumores incluyendo melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular de la tiroides, teratocarcinoma; tumores de las células germinales no seminomatosas refractarias a quimioterapia, y sarcoma de Kaposi. En ciertas modalidades preferidas, el trastorno es la leucemia, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer del pulmón, cáncer del colon, melanoma, o tumores sólidos. En ciertas modalidades preferidas, la leucemia es la leucemia mieloide crónica (CML) , Ph+ ALL, CLM resistente a imitinib, CML intolerante a imatinib, CML acelerada, CML de la fase de linfoblastoide .

Un "tumor sólido" incluye, por ejemplo, sarcoma, melanoma, carcinoma, carcinoma de la próstata, carcinoma del pulmón, carcinoma del colon, u otro cáncer del tumor sólido.

El término "cáncer", "canceroso", o "maligno" se refiere a, o describe, la condición fisiológica en mamíferos que está caracterizada típicamente por el crecimiento celular no regulado. Los ejemplos del cáncer incluyen, por ejemplo, leucemia, linforna, blastoma, carcinoma y sarcoma. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen la leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda positiva del cromosoma Filadelfia (Ph+ ALL), carcinoma de células escamosas, cáncer del pulmón de células pequeñas, cáncer del pulmón de células no pequeñas, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de los ovarios, cáncer del hígado, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer del riñon, cáncer de la próstata, cáncer de la tiroides, neuroblastoma , cáncer pancreático, glioblastoma multiforme, cáncer cervical, cáncer del estómago, cáncer de la vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma del colon, y cáncer del cuello y de la cabeza, cáncer gástrico, tumor de las células germinales, el sarcoma pediátrico, el exterminador natural sinonasal, mielomas múltiples, leucemia mielogenosa aguda (AML) , y leucemia linfocítica crónica (CML) .

"Leucemia" se refiere a enfermedades malignas, progresivas, de los órganos formadores de la sangre, y generalmente está caracterizada por una proliferación distorsionada y del desarrollo de los leucocitos y sus precursores en la sangre y la médula ósea. La leucemia es clasificada clínicamente en general sobre la base de: (1) la duración y el carácter de la enfermedad - aguda o crónica; (2) el tipo de célula involucrada; mieloide (mielogenosa), linfoide ( linfogenosa) , o monocítica; y (3) el incremento o no incremento en el número de células anormales en la sangre leucémica o aleucémica ( sub- leucémica) . La leucemia incluye, por ejemplo, la leucemia no linfocítica aguda, la leucemia linfocítica crónica, la leucemia granulocítica aguda, la leucemia granulocítica crónica, la leucemia promielocítica aguda, la leucemia de las células T en el adulto, la leucemia aleucémica, una leucemia leucocitémica, leucemia basofílica, la leucemia de los mastocitos, la leucemia de los bovinos, la leucemia mielocítica crónica, la cutis leucémico, leucemia embrionaria, leucemia eosinofílica, leucemia de Gross, leucemia de las células del cabello, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia de los citoblastos, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopénica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfogenosa, leucemia linfoide, lucemia de las células del linfosarcoma, leucemia de los mastocitos, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica , leucemia mielocítica, leucemia granulocítica mieloide, leucemia mielomonocítica , leucemia de Naegeli, leucemia de las células del plasma, leucemia plasmacítica, leucemia promielocítica , leucemia de las células de Rieder, la leucemia de Schilling, la leucemia de los citoblastos, leucemia sub- leucémica, y leucemia de las células no diferenciadas. En ciertos aspectos, la presente invención proporciona el tratamiento de la leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda, y/o la leucemia linfoblástica aguda positiva del cromosoma Filadelfia (Ph+ ALL) .

Un "BCR-ABL imitante" abarca una tirosina cinasa de BCR-ABL con una secuencia de aminoácidos que difiere de la tirosina cinasa de BCR-ABL del tipo silvestre por una o más substituciones, adicionales o deleciones de aminoácidos. Por ejemplo una substitución del aminoácido en la posición 507 de la SEC ID NO: 2 con otro aminoácido podría conducir a una tirosina cinasa de BCR-ABL imitante.

El "trastorno asociado con BCR-ABL mutante" es utilizado para describir un trastorno asociado con BCR-ABL en el cual las células involucradas en el trastorno son o han llegado a ser resistentes al tratamiento con un inhibidor de cinasa utilizado para tratar el trastorno como un resultado de la mutación en BCR-ABL. Por ejemplo, un compuesto del inhibidor de cinasa puede ser utilizado para tratar una condición cancerosa, tal compuesto inhibe la actividad del BCR-ABL del tipo silvestre que inhibirá la proliferación y/o que induce la apoptosis de las células cancerosas. Durante el transcurso del tiempo, una mutación puede ser introducida en el gen que codifica la BCR-ABL cinasa, que puede alterar la secuencia de aminoácidos de la cinasa de BCR-ABL y para provocar que las células cancerosas lleguen a ser resistentes, o al menos parcialmente resistentes, al tratamiento con el compuesto. Alternativamente, una mutación ya puede estar presente dentro del gen que codifica la cinasa de BCR-ABL, ya sea genéticamente o como una consecuencia de un evento oncogénico, independientemente del tratamiento con un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína, que puede ser un factor que conduce a aquellas células propensas a la diferenciación en un estado canceroso o proliferativo, y también conduce a aquellas células que son menos sensibles al tratamiento con un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína. Tales situaciones se espera que conduzcan, ya sea directa o indirectamente, a un "trastorno asociado con la BCR-ABL cinasa imitante" y el tratamiento de tal condición requerirá un compuesto que es al menos parcialmente efectivo contra el BCR-ABL mutante, preferentemente contra tanto el BCR-ABL del tipo silvestre como el BCR-ABL mutante. En el caso en donde un individuo desarrolla una resistencia al menos parcial al inhibidor de cinasa de imatinib, el trastorno asociado con BCR-ABL mutante es uno que resulta de una mutación de BCR-ABL resistente a imatinib, o un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína resistente a la mutación del BCR-ABL. De manera semejante, en el caso en donde un individuo desarrolla una resistencia al menos parcial al inhibidor de cinasa de N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida , el trastorno asociado con BCR-ABL mutante es uno que resulta de una mutación de BCR-ABL resistente a la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida, o una mutación de BCR-ABL resistente al inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína. Los presentes inventores descubrieron que después del tratamiento con la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida, ciertos individuos desarrollaron mutaciones de E507G. La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos de tratamiento de los trastornos asociados con BCR-ABL mutante y métodos de identificación si un individuo tiene un trastorno asociado con BCR-ABL mutante.

Los "trastornos asociados con la tirosina cinasa de la proteína" de interés particular aquí son aquellos trastornos que resultan, al menos en parte, de la actividad de SRC o BCR-ABL (silvestre o mutante) aberrante y/o que son aliviados por la inhibición del SRC o BCR-ABL (silvestre o mutante) referidos aquí como "trastornos asociados con SRC", "cáncer asociado con SRC" , o "trastornos asociados con BCR-ABL" , "cáncer asociado con BCR-ABL" .

"Mutación de BCR-ABL resistente a imatinib" se refiere a una mutación específica en la secuencia de aminoácidos de BCR-ABL que confiere a las células que expresan la mutación, resistencia al tratamiento con imatinib. Como se describió aquí, tales mutaciones pueden incluir las mutaciones en la posición T315I de BCR-ABL. Las mutaciones adicionales que pueden volver a una proteína de BCR-ABL al menos parcialmente resistente a imitinib pueden incluir, , por ejemplo, E279K, F359C, F359I, L364I, L387M, F486S, D233H, T243S, M244V, G249D, G250E, G251S, Q252H, Y253F, Y253H, E255K, E255V, V256L, Y257F, Y257R, F259S, K262E, D263G, K264R, S265R, V268A, V270A, T272A, Y274C, Y274R, D276N, T277P, M278K, E279K, E282G, F283S, A288T, A288V, M290T, K291R, E292G, 1293T, P296S, L298M, L298P, V299L, Q300R, G303E, V304A, V304D, C305S, C305Y, T306A, F311L, I314V, T315I, T315A, E316G, F317L, F317I, M318T, Y320C, Y320H, G321E, D325H, Y326C, L327P, R328K, E329V, Q333L, A337V, V339G, L342E, M343V, M343T, A344T, A344V, 1347V, A350T, M351T, E352A, E352K, E355G, K357E, N358D, N358S, F359V, F359C, F359I , I360K, I360T, L364H, L364I, E373K, N374D, K378R, V379I, A380T, A380V, D381G, F382L, L387M, M388L, T389S, T392A, T394A, A395G, H396K, H396R, A399G, P402T, T406A, S417Y, F486S, y E507G. Las mutaciones de BCR-ABL resistentes a imatinib adicionales también pueden incluir otras mutaciones de BCR-ABL descritas aquí en otra parte .

La "mutación de BCR-ABL resistente a dasatinib" se refiere a una mutación específica en la secuencia de aminoácidos de BCR-ABL que confiere a las células que expresan la mutación al menos una resistencia parcial al tratamiento con dasatinib. Como se describió aquí tales mutaciones pueden incluir las mutaciones en las posiciones T315I, T315A, F317A, F317I, y E507G de BCR-ABL. Las mutaciones de BCR-ABL resistentes a dasatinib adicionales también pueden incluir otras mutaciones de BCR-ABL descritas aquí en otra parte .

"CIVIL resistente a imatinib" se refiere a CML en la cual las células involucradas en CML son resistentes al tratamiento con imatinib. En general es un resultado de una mutación en BCR-ABL.

"CML intolerante a imatinib" se refiere a CML en la cual el individuo que tiene el CML es intolerante al tratamiento con imatinib, es decir, los efectos secundarios tóxicos y/o perjudiciales de imatinib sobrepasan cualesquiera efectos terapéuticamente benéficos.

La combinación sinergística de un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína, un agente estabilizante de la microtubulina , tal como paclitaxel; un análogo de nucleósido, tal como gemcitabina; o un agente inductor de la doble hebra del ADN, tal como un etopósido con un modulador de la ruta co-estimuladora, también puede incluir la adición de uno o más compuestos adicionales, que incluyen pero no están limitados a los siguientes: un agente estabilizador de tubulina (por ejemplo, pacitaxol, epotilona, taxano, etc.), un inhibidor de la farnesil transferasa (por ejemplo, (R) -2,3,4, 5-tetrahidro-l- (lH-imidazol-4-ilmetil) -3- (fenilmetil) -4- (2-tienilsulfonil) -1H-1, -benzodiacepina-7 -carbonitrilo, en la forma de la sal de clorhidrato; otro inhibidor de tirosina cinasa de la proteína; un régimen incrementado de la frecuencia de dosificación de la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida; el inhibidor no competitivo de ATP ONO12380; el inhibidor de cinasa Aurora VX-680; el inhibidor de p38 MAP de BIRB-796; y cualquier otro régimen de combinación o dosificación que comprende la N- (2- cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] - 2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida descrita aquí, o cualquier otra combinación descrita aquí.

Un "inhibidor de la farnesil transferasa" puede ser cualquier compuesto o molécula que inhiba la farnesil transferasa. El inhibidor de farnesil transferasa puede tener la fórmula (II), la sal de clorhidrato de (R) -2,3,4,5- tetrahidro-1- (lH-imidazol-4-ilmetil) -3- (fenilmetil) -4- (2- tienilsulfonil ) -1H-1, 4-benzodiazepina-7-carbonitrilo. El compuesto de la fórmula (V) es un inhibidor de FT citotóxico que ya se sabe que extermina las células del cáncer no proliferativas preferentemente. El compuesto de la fórmula (V) puede ser útil además en las exterminación de los citoblastos .

El compuesto de la fórmula (V) , su preparación, y los usos de los mismos se describen en la Patente U.S. No. 6,011,029, que es incorporada aquí por la referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Los usos del compuesto de la fórmula (II) también son descritos en O 2004/015130, publicada el 19 de febrero del 2004, que es incorporada aquí por la referencia en su totalidad y para todos los propósitos.

La frase "tirosina cinasa de la proteína" cuando se utilice aquí incluye las enzimas que catalizan la transferencia del fosfato terminal del trifosfato de adenosina (ATP) a los residuos de tirosina en los substratos de proteína. Los ejemplos no limitativos de las tirosinas cinasas incluyen las tirosinas cinasas receptoras tales como EGFR (por ejemplo, EGFR/HERl/ErbBl , HER2/Neu/ErbB2 , HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), INSR (receptor de insulina), IGF-IR, IGF-II1R, IRR (receptor relacionado con el receptor de insulina) , PDGFR (por ejemplo, PDGFRA, PDGFRB) , c-KIT/SCFR, VEGFR- l/FLT- 1 , VEGFR-2/FL - 1/KDR, VEGFR-3/FLT-4 , FLT-3/FLK-2 , CSF-1R, FGFR 1-4, CCK4 , TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYR03, TIE, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, LTK (tirosina cinasa del leucocito) , ALK (cinasa del linfoma anaplásico) , ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, y RTK 106; y las tirosinas cinasas no receptoras tales como BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, y LI K. Una persona con experiencia en el arte conocerá otras tirosinas cinasas receptoras y/o no receptoras que pueden ser ubicadas como objetivo utilizando los inhibidores descritos aquí.

El término "inhibidor de la tirosina cinasa" incluye cualquiera de una variedad de agentes terapéuticos o fármacos que actúan como inhibidores selectivos o no selectivos de las tirosinas cinasas receptoras y/o no receptoras. Sin que desee que esté limitado a cualquier teoría particular, los inhibidores de tirosina cinasa generalmente inhiben las tirosinas cinasas objetivo por la aglutinación al sitio de aglutinación de ATP de la enzima. Los ejemplos de los inhibidores de las tirosinas cinasas adecuados para su uso en los métodos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, gefitinib (IRESSA®, sunitinib (SUTENT® ; SU11248), erlotinib (TARCEVA®; OSI-1774), lapatinib (GW572016; G 2016), canertinib (CI 1033), semaxinib (SU5416) , vatalanib (PTK787/ZK222584 ) , sorafenib (BAY 43-9006) , imatinib (GLEEVEC® ; ST1571) , dasatinib (BMS-354825), leflunomida (SU101) , vandetanib (ZACTIMA® ; ZD6474), nilotinib, derivados de los mismos, análogos de los mismos, y combinaciones de los mismos. Los inhibidores de la tirosina cinasa adicionales adecuados para su uso en la presente invención son descritos por ejemplo en las Patentes U.S. Nos. 5,618,829, 5,639,757, 5,728,868, 5,804,396, 6,100,254, 6,127,374, 6,245,759, 6,306,874, 6,313,138, 6,316,444, 6,329,380, 6,344,459, 6,420,382, 6,479,512, 6,498,165, 6,544,988, 6,562,818, 6,586,423, 6,586,424, 6,740,665, 6,794,393, 6,875,767, 6,927,293, y 6,958,340. Una persona con experiencia en el arte conocerá otros inhibidores de tirosina cinasa adecuados para su uso en la presente invención.

Los métodos para la administración segura y efectiva de la mayoría de estos agentes quimioterapéuticos ya son conocidos por aquellos expertos en el arte. Además, su administración es descrita en la literatura estándar.

Por ejemplo la administración de muchos de los agentes quimioterapéuticos se describe en Physicians ' Desk Reference (PDR) , por ejemplo, la edición 1996 (Medical Economics Company, ontvale, NJ 07645-1742, EUA) ; la descripción de la cual es incorporada aquí para referencia.

Las composiciones de la presente invención pueden comprender además uno o más ingrediente (s) adicionales farmacéuticamente aceptables tales como alumbre, estabilizadores, agentes antimicrobianos, amortiguadores, agentes colorantes, agentes saborizantes , adyuvantes, y semejantes. Las composiciones f rmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas de manera oral o parenteral incluyendo las rutas de administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal , subcutánea, rectal y tópica.

Para uso oral, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas, por ejemplo, en la forma de tabletas o cápsulas, polvos, gránulos dispersables , o sellos, o como soluciones o suspensiones acuosas. En el caso de las tabletas para uso oral, los portadores que son utilizados comúnmente incluyen lactosa, almidón de maíz, carbonato de magnesio, talco, y azúcar, y agentes lubricantes tales como el estearato de magnesio son agregados comúnmente. Para la administración oral en la forma de cápsulas, los portadores útiles incluyen lactosa, almidón de maíz, carbonato de magnesio, talco, y azúcar. Cuando las suspensiones acuosas son utilizadas para la administración oral, se agregan comúnmente agentes emulsionadores y/o de suspensión.

Además, los agentes endulzantes y/o saborizantes pueden ser agregados a las composiciones orales. Para uso intramuscular, intraperitoneal , subcutáneo e intravenoso, las soluciones estériles del (de los) ingrediente (s) activo (s) son empleados usualmente, y el pH de las soluciones debe ser ajustado y amortiguado adecuadamente. Para uso intravenoso, la concentración total del (de los) soluto (s) debe ser controlada para hacer a la preparación isotónica.

Para la preparación de los supositorios de acuerdo con la invención, una cera de punto de fusión bajo tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao es fundida primero, y el ingrediente activo es dispersado homogéneamente en la cera, por ejemplo por agitación. La mezcla homogénea fundida es vertida entonces en moldes dimensionados convenientemente y se deja que se enfríen y que por esto se solidifiquen.

Las preparaciones líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Tales preparaciones son ejemplificadas por el agua o soluciones de agua/propilenglicol para la inyección parenteral . Las preparaciones líquidas pueden incluir también soluciones para administración intranasal .

Las preparaciones en aerosol adecuadas para la inhalación pueden incluir soluciones y sólidos en forma de polvo, que pueden ser combinadas con un portador farmacéuticamente aceptable, tal como un gas comprimido inerte.

También están incluidas las preparaciones sólidas que están propuestas para la conversión, brevemente antes de su uso, a preparaciones líquidas para administración ya sea oral o parenteral. Tales formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones.

El modulador de la ruta co-estimuladora , preferentemente un agente anti-CTLA4 descrito aquí también puede ser suministrado transdérmicamente . Las composiciones transdérmicas pueden tomar la forma de cremas, lociones, aerosoles y/o emulsiones y pueden ser incluidas en un parche transdérmico de la matriz o del tipo de depósito como son convencionales en el arte para este propósito.

Si son formulados como una dosis fija, los ingredientes activos de las composiciones combinadas farmacéuticas de la presente invención son empleadas dentro de los intervalos de dosificación descritos posteriormente. Alternativamente, el modulador de la ruta co-estimuladora y el inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína pueden ser administrados separadamente en los intervalos de dosificación descritos posteriormente. En una modalidad preferida de la presente invención, el modulador de la ruta co-estimuladora es administrado en el intervalo de dosificación descrito posteriormente a continuación o simultáneamente con la administración del inhibidor de tirosina cinasa de la proteína en el intervalo de dosificación descrito posteriormente.

Lo siguiente describe combinaciones terapéuticas y dosificaciones ejemplares preferidas para su uso en los métodos de la presente invención. 1 Cada combinación listada aquí opcionalmente incluye la admnistración de una vacuna anti-cáncer desde aproximadamente 0.001- 100 mg Aunque esta tabla proporciona intervalos de dosificación ejemplares del inhibidor de tirosina cinasa de la proteína, preferentemente SPRYCEL®, un modulador de la ruta co-estimuladora, preferentemente el anticuerpo de anti-CTLA4, y/o agentes de vacuna contra el cáncer, cuando se formulan las composiciones farmacéuticas de la invención, el médico puede utilizar las dosificaciones preferidas como está garantizado por la condición del paciente que es tratado. El anticuerpo de anti-CTLA4 puede ser administrado preferentemente a aproximadamente 0.3 - 10 mg/kg, o la dosis tolerada máxima. En una modalidad de la invención, una dosificación de anticuerpo de anti-CTLA4 es administrada aproximadamente cada tres semanas. Alternativamente, el anticuerpo de anti-CTLA4 puede ser administrado por un régimen de dosificación de escalamiento que incluye la administración de una primera dosificación del anticuerpo de anti-CTLA4 en aproximadamente 3 mg/kg, una segunda dosificación del anticuerpo de anti-CTLA4 a aproximadamente 5 mg/kg, y una tercera dosificación de anticuerpo de anti-CTLA4 a aproximadamente 9 mg/kg.

De manera semejante, el inhibidor de tirosina cinasa de la proteína, preferentemente SPRYCEL®, puede ser administrado preferentemente a aproximadamente 2 veces por día a 70 mg. Alternativamente, el mismo puede ser dosificado a, por ejemplo, aproximadamente 50, aproximadamente 70, aproximadamente 90, aproximadamente 100, 110, o 120 BID, o 100, 140, o 180 una vez diariamente, o la dosis tolerada máxima. La dosis de un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína puede depender de un número de factores, incluyendo, la etapa de la enfermedad, la presencia de una o más mutaciones en la tirosina cinasa de la proteína etiquetada, las mutaciones de BCR-ABL, etc. La dosis específica que debe ser administrada con base en la presencia de uno o más de tales factores que están dentro de la experiencia del artesano.

De manera semejante, el etopósido puede ser administrado preferentemente a aproximadamente 50 mg hasta aproximadamente 900 mg por día. El etopósido está disponible para la infusión intravenosa como un liófilo estéril en viales de una sola dosis que contienen el fosfato del etopósido equivalente a 100 mg del etopósido, 32.7 mg de citrato de sodio USP, y 300 mg de dextrano 40. Alternativamente, el mismo puede ser dosificado, por ejemplo, a aproximadamente 50, aproximadamente 70, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800 o aproximadamente 900 diariamente, o la dosis máxima tolerada .

De manera semejante, la gemcitabina puede ser administrada preferentemente a aproximadamente 200 mg/m hasta aproximadamente 1250 mg/m por día por IV durante una infusión de 30 a 90 minutos. La gemcitabina está disponible para infusión intravenosa que contiene desde aproximadamente 200 mg hasta aproximadamente 1250 mg de HC1 de gemcitabina (expresada como la base libre) formulada con manitol (200 mg o 1 g, respectivamente) y acetato de sodio (12.5 mg o 62.5 mg, respectivamente) como un polvo liofilizado estéril. Alternativamente, la misma puede ser dosificada a, por ejemplo, a aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, o aproximadamente 900, aproximadamente 100, aproximadamente 1100, aproximadamente 1200 o aproximadamente 1250 diariamente, o la dosis máxima tolerada.

Las combinaciones de la presente invención también pueden ser utilizadas en conjunción con otras terapias bien conocidas que son seleccionadas para su utilidad particular contra la condición que está siendo tratada.

El anticuerpo de anti-CTLA4 puede ser administrado preferentemente a aproximadamente 0.3-10 mg/kg, o la dosis máxima tolerada. En una modalidad de la invención, una dosificación del anticuerpo de CTLA-4 es administrada aproximadamente cada tres semanas. Alternativamente, el anticuerpo de CTLA-4 puede ser administrado por un régimen de dosificación de escalamiento que incluye administrar una primera dosificación del anticuerpo de CTLA-4 a aproximadamente 3 mg/kg, una segunda dosificación del anticuerpo de CTLA-4 a aproximadamente 5 mg/kg, y una tercera 1 dosificación de anticuerpo de CTLA-4 a aproximadamente 9 mg/kg.

En otra modalidad específica, el régimen de dosificación de escalamiento incluye la administración de una primera dosificación del anticuerpo de CTLA-4 a aproximadamente 5 mg/kg y una segunda dosificación de anticuerpo de CTLA-4 a aproximadamente 9 mg/kg.

Además, la presente invención proporciona un régimen de dosificación de escalamiento, que incluye la administración de una dosificación creciente del anticuerpo de CTLA-4 alrededor de cada seis semanas.

En un aspecto de la presente invención, se proporciona un régimen de dosificación de escalamiento por etapas, que incluye la administración de una primera dosificación del anticuerpo de CTLA-4 de aproximadamente 3 mg/kg, una segunda dosificación de anticuerpo de CTLA-4 a aproximadamente 3 mg/kg, una tercera dosificación deL anticuerpo de CTLA-4 de aproximadamente 5 mg/kg, una cuarta dosificación de anticuerpo de CTLA-4 de aproximadamente 5 mg/kg, y una quinta dosificación de anticuerpo de CTLA-4 de aproximadamente 9 mg/kg. En otro aspecto de la presente invención se proporciona un régimen de dosificación de escalamiento por etapas, que incluye la administración de una primera dosificación de 5 mg/kg, una segunda dosificación de 5 mg/kg, y una tercera dosificación de 9 mg/kg.

La dosificación real empleada se puede hacer variar dependiendo de los requerimientos del paciente y la severidad de la condición que es tratada. La determinación de la dosificación apropiada para una situación particular está dentro de la experiencia del arte. Generalmente, el tratamiento es iniciado con dosificaciones más pequeñas que son menores de la dosis óptima del compuesto. Después de esto, la dosificación es incrementada en pequeñas cantidades hasta que se alcanza el efecto óptimo bajo las circunstancias. Por razones de conveniencia, la dosificación diaria total puede ser dividida y administrada en porciones durante el día si se desea. La terapia intermitente (por ejemplo, una semana de las tres semanas o tres de las cuatro semanas) también puede ser utilizada.

Cuando se emplean los métodos o composiciones de la presente invención, otros agentes utilizados en la modulación del crecimiento del tumor o la metástasis en un medio ambiente clínico, tales como antieméticos, también pueden ser administrados cuando se desee.

Las combinaciones de la presente invención también pueden ser co-adrainistradas con otros agentes terapéuticos bien conocidos que son seleccionados por su utilidad particular contra la condición que está siendo tratada. Las combinaciones de la presente invención pueden ser utilizadas alternativamente de manera consecutiva con agente (s) farmacéuticamente aceptable (s) , conocido (s), cuando una formulación de combinaciones múltiples es inapropiada.

El (los) agente (s) quimioterapéutico ( s ) y/o la terapia de radiación pueden ser administrados de acuerdo con los protocolos terapéuticos bien conocidos en el arte. Será evidente para aquellos expertos en el arte que la administración del (de los) agente (s) quimioterapéutico (s) y/o la terapia de radiación se puede hacer variar dependiendo de la enfermedad que es tratada y los efectos conocidos del (de los) agente (s) quimioterapéutico (s) y la terapia de radiación sobre esta enfermedad. También, de acuerdo con el conocimiento del especialista experto, los protocolos terapéuticos (por ejemplo, las cantidades de dosificación y los tiempos de administración) se pueden hacer variar en vista de los efectos observados de los agentes terapéuticos administrados (es decir, el (los) agente (s) anti-CTLA4 y el inhibidor de tirosina cinasa de la proteína) al paciente, y en vista de las respuestas observadas de la enfermedad a los agentes terapéuticos administrados.

En los métodos de esta invención, un inhibidor de tirosina cinasa de la proteína, tal como dasatinib, un agente de estabilización de microtubulina, tal como paclitaxel; un análogo del nucleósido, tal como gemcitabina, o un agente inductor de doble hebra del ADN, tal como el etopósido, es administrado de manera simultánea o consecutiva (antes o después) con un agente de anti-CTLA4. Por consiguiente, no es necesario que el (los) agente (s) terapéutico (s) de anti-CTLA4 y un agente de estabilización de microtubulina, tal como paclitaxel; un análogo del nucleósido, tal como gemcitabina; o un agente inductor de doble hebra del ADN, tal como el etopósido sea administrado de manera simultánea o esencialmente de manera simultánea. La ventaja de una administración simultánea o esencialmente simultánea o una administración consecutiva (antes o después) está muy adentro de la determinación del especialista experto.

Las combinaciones adicionales también abarcadas por la presente invención, incluyen, pero no están limitadas a las siguientes: Gemcitabina + cisplatina + ipilimumab; ipilimumab + carboplatino + paclitaxel; ipilimumab + etopósido + cisplatino o carboplatino; ipilimumab + pem (cisPlatino, Etopósido y Mitomicina) + cisplatino. Estas combinaciones pueden ser administradas ya sea consecutivamente (antes o después una de la otra) , al mismo tiempo, o en cualquier orden recomendado por un especialista experto .

También, en general, un agente estabilizante de microtubulina , tal como paclitaxel; un análogo del nucleósido, tal como gemcitabina; o un agente inductor de doble hebra del ADN, tal como un etopósido y el (los) agente (s) de anti-CTLA4 no tienen que ser administrados en la misma composición farmacéutica, y pueden, tener que ser administradas, a causa de las diferentes características físicas y químicas por diferentes rutas.

Si un agente estabilizador de microtubulina, tal como paclitaxel; un análogo del nucleósido, tal como gemcitabina; o un agente inductor de doble hebra del ADN, tal como el etopósido y el (los) agente (s) anti-CTLA4 no son administrados simultáneamente o esencialmente de manera simultánea, entonces el orden inicial de administración de un inhibidor de tirosina cinasa de la proteína, tal como dasatinib, un agente estabilizante de microtubulina, tal como paclitaxel; un análogo del nucleósido, tal como gemcitabina; o un agente inductor de doble hebra del ADN, tal como el etopósido y el (los) agente (s) anti-CTLA4 se puede hacer variar. Así, por ejemplo, un agente estabilizante de microtubulina, tal como paclitaxel; un análogo del nucleósido, tal como gemcitabina; o un agente inductor de doble hebra del ADN, tal como el etopósido puede ser administrado primero, seguido por la administración del (de los) agente (s) anti-CTLA4; o el (los) agente (s) anti-CTLA4 puede (n) ser administrado (s) seguido primero por la administración de un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína, un agente estabilizante de microtubulina, tal como paclitaxel; un análogo del nucleósido, tal como gemcitabina; o un agente inductor de doble hebra del ADN, tal como el etopósido. Esta administración alternativa puede ser repetida durante un solo protocolo de tratamiento. La determinación del orden de administración, y el número de repeticiones de la administración de cada agente terapéutico durante un protocolo de tratamiento, también está dentro del conocimiento del médico experto después de la evaluación de la enfermedad que es tratada y la condición del paciente.

Así, de acuerdo con la experiencia y el conocimiento, el médico especialista puede modificar cada protocolo para la administración de un componente (el agente terapéutico - es decir, un inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína, tal como dasatinib, un agente estabilizante de microtubulina, tal como paclitaxel; un análogo del nucleósido, tal como gemcitabina; o un agente inductor de doble hebra del ADN, tal como el etopósido, el (los) agente (s) anti-CTLA4, del tratamiento de acuerdo con las necesidades del paciente individual, cuando procede el tratamiento.

El especialista que proporciona la atención, en el juicio de que si el tratamiento es efectivo a la dosis administrada, considerará el bienestar general del paciente así como los signos más definidos tales como el alivio de los síntomas relacionados con la enfermedad, la inhibición del crecimiento del tumor, la contracción real del tumor, o la inhibición de la metástasis. El tamaño del tumor puede ser medido por los métodos estándares tales como los estudios radiológicos, por ejemplo, la exploración con CAT o MRI , y las mediciones sucesivas pueden ser utilizadas para juzgar si se ha retardado o no el crecimiento del tumor o aún se ha invertido. El alivio de los síntomas relacionados con la enfermedad tales como el dolor, y la mejora en la condición total también pueden ser utilizadas para ayudar a juzgar la efectividad del tratamiento.

Cuando se haga referencia aquí en otra parte, la dosis óptima para el inhibidor de tirosina cinasa de la proteína puede depender de varios factores, incluyendo, pero sin estar limitado a la presencia de una o más mutaciones en el inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína objetivo y/o en el BCR-ABL.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un inhibidor de una cinasa de BCR-ABL mutante puede ser una función de la mutación presente. Por ejemplo, Shah et al. describe que las líneas celulares con ciertas mutaciones de la cinasa de BCR-ABL son más sensibles a N- (2 -cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- ( 2 -hidroxietil ) -1-piperazinil] -2-metil-4 -pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida que las líneas celulares con diferentes mutaciones de la cinasa de BCR-ABL. Por ejemplo, las células que comprenden una mutación de F317L en la cinasa de BCR-ABL pueden requerir una concentración tres a cinco veces más elevada de la N- ( 2 -cloro- 6 -metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida que las líneas celulares que expresan una mutación de F317I. Un experto en el arte apreciará que la diferencia en la sensibilidad de las células de cinasa de BCR-ABL mutantes y determinará una dosis terapéuticamente efectiva de acuerdo con esto.

Los ejemplos de las dosis terapéuticamente efectivas de la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2 -metil -4 -pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida que pueden ser garantizadas con base en la sensibilidad relativa de los mutantes de la cinasa de BCR-ABL con respecto a la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida comparado con la cinasa de BCR-ABL del tipo silvestre, puede ser determinada utilizando varios ensayos bioquímicos in vitro incluyendo la proliferación celular, la fosforilación de la tirosina de BCR-ABL, la fosforilación del substrato del péptido, y/o los ensayos de autofosforilación. Por ejemplo, las dosis efectivas terapéuticamente aproximadas de la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida pueden ser calculadas con base en la multiplicación de la dosis típica por las veces del cambio en la sensibilidad en cualquiera uno o más de estos ensayos para cada mutante de la cinasa de BCR-ABL. O'Hare et al. (Cáncer Res., 65(11) :4500-4505 (2005) , que es incorporada por el presente para referencia en su totalidad y para todos los propósitos) efectuó el análisis de la sensibilidad relativa de la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] - 5 -tiazolcarboxamida con varios mutantes de la cinasa de BCR-ABL clínicamente relevantes. Por ejemplo, el mutante de E255V tiene un número de veces de cambio de "1" en el ensayo de la cinasa de GST-Abl, mientras que este mismo mutante tiene un número de veces de cambio de "14" en el ensayo de la proliferación celular. Por consiguiente, una dosis terapéuticamente relevante de la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida para los pacientes que incorporan esta mutación podría variar, por ejemplo, en cualquier parte desde 1 hasta 14 veces más elevada que la dosis típica. En consecuencia, las dosis terapéuticamente relevantes de la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida para cualquiera de los mutantes de la cinasa de BCR-ABL pueden ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, o 300, veces más elevada que la dosis prescrita. Alternativamente, las dosis terapéuticamente relevantes de la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida puede ser, por ejemplo, 0.9x, 0.8x, 0.7x, 0.6x, 0.5x, 04x, 0.3x, 0.2x, O.lx, 0.09x, 0.08x, 0.07x, 0.06x, 0.05x, 0.04x, 0.03x, 0.02x, o O.Olx de la dosis prescrita .

De acuerdo con O' Haré et al., el mutante de M244V tiene un número de veces de cambio de "1.3" en el ensayo de cinasa de GST-Abl, un número de veces de cambio de "1.1" en el ensayo de autofosforilación, y un número de cambio de "2" en el ensayo de proliferación celular; el mutante G250E tuvo un número de veces de cambio de "0.5" en el ensayo de cinasa de GST-Abl, un número de veces de cambio de "3" en el ensayo de autofosforilación, y un número de veces de cambio de "2" en el ensayo de proliferación celular; el mutante de Q252H tuvo un número de veces de cambio de "4" en el ensayo de proliferación celular; el mutante de Y253F tuvo un número de veces de cambio de "0.6" en el ensayo de la cinasa de GST-Abl, un número de veces de cambio de "4" en el ensayo de autofosforilación, y un número de veces de cambio de "4" en el ensayo de proliferación celular; el mutante de Y253H tiene un número de veces de cambio de "3" en el ensayo de cinasa de GST-Abl, un número de veces de cambio de "2" en el ensayo de autofosforilación, y un número de veces de cambio de "2" en el ensayo de proliferación celular; el mutante de E255K tiene un número de veces de cambio de "0.3" en el ensayo de la cinasa de GST-Abl, un número de veces de cambio de "2" en el ensayo de autofosforilación, y un número de veces de cambio de "7" en el ensayo de proliferación celular; el mutante de F317L tiene un número de veces de cambio de "1.5" en el ensayo de la cinasa de GST-Abl, un número de veces de cambio de "1.4" en el ensayo de autofosforilación, y un número de veces de cambio de "9" en el ensayo de proliferación celular; el mutante de M351T tiene un número de veces de cambio de "0.2" en el ensayo de la cinasa de GST-Abl, un número de veces de cambio de "2" en el ensayo de autofosforilación, y un número de veces de cambio de "1.4" en el ensayo de proliferación celular; el mutante de F359V tiene un número de veces de cambio de "0.8" en el ensayo de la cinasa de GST-Abl, un número de veces de cambio de "2" en el ensayo de autofosforilación, y un número de veces de cambio de "3" en el ensayo de proliferación celular; el mutante de H396R tiene un número de veces de cambio de "1.3" en el ensayo de la cinasa de GST-Abl, un número de veces de cambio de "3" en el ensayo de autofosforilación, y un número de veces de cambio de "2" en el ensayo de proliferación celular.

Para los pacientes que presentan la mutación de T315I, ya sea solos o en combinación con otra mutación de BCR-ABL descrita aquí, la administración de dosis más elevadas de N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida, o las combinaciones de N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4 -pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida e imatinib; una combinación de N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2 -metil-4 -pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida y un agente estabilizante de tubulina (por ejemplo, pacitaxol, epotilona, taxano, etc.); una combinación de N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida y un inhibidor de la farnisil transferasa ; una combinación de la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2 -metil-4 -pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida y otro inhibidor de la tirosina cinasa de la proteína; cualquier otra combinación descrita aquí; un régimen de dosificación incrementado en la frecuencia de N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4 -pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida; y cualquier combinación o régimen de dosificación que comprende la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida descrita aquí, puede ser garantizada. Alternativamente, las combinaciones de N- ( 2 -cloro-6 -metilfenil ) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2-metil-4-pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida con un inhibidor de T315I pueden ser también garantizadas.

Los regímenes de dosificación que involucran la N- (2-cloro-6-metilfenil) -2- [ [6- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] -2 -metil-4 -pirimidinil] amino] -5-tiazolcarboxamida útil en la práctica de la presente invención se describen en la patente U. S. No. de Serie 10/395,503, presentada el 24 de marzo del 2003; y Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2004, Volumen 104; Abstract 20, "Hematologic and Cytogenec Responses in imatinib-Resistant Accelerated and Blast Phase Chronic Myeloid Leukemia (CML) Patients Treated with the Dual SRC/ABL Kinase Inhibitor N- (2-chloro-6-methylphenyl) -3- [ [6- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] -2-methyl-4-pyrimidinyl] amino] -5-thiazolecarboxamide : Results from a Phase I Dose Escalation Study", por Moshe Talpaz, et al.; que es incorporada aquí para referencia en su totalidad y para todos los propósitos.

Composiciones Anti-CTLA4 Adicionales La presente invención también abarca agentes anti-CTLA-4 adicionales incluyendo, pero sin estar limitado a, un anticuerpo de anti-CTLA-4, una adnectina de anti-CTLA-4, un ARNi de anti-CTLA-4; fragmentos de anticuerpos de anti-CTLA-4 de una sola cadena, los fragmentos del anticuerpo de anti- CTLA-4 del dominio, y una molécula de antisentido de anti-CTLA-4.

Una agente de anti-CTLA4 preferido de la presente invención es el anticuerpo de anti-CTLA4 de ipilimumab. Otros anticuerpos de anti-CTLA4 y fragmentos de los mismos están abarcados por la presente invención que se aglutinan inmunoespecíficamente a un polipéptido, el fragmento de polipéptido, o la variante de CTLA4 , y/o un epítopo de CTLA4 (como se determinó por los inmunoensayos bien conocidos en el arte para el ensayo de la aglutinación del antígeno-anticuerpo específico) . Los anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos policlonales , monoclonales , monovalentes, biespecífieos , un heteroconjugado, multiespecífico, humano, humanizado o quimérico, anticuerpos de una sola cadena, fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab'), los fragmentos producidos por la biblioteca de la expresión de Fab, los anticuerpos anti- idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de anti -Id para los anticuerpos de la invención) , y fragmentos de aglutinación al epítopo de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo" como se utiliza aquí, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, es decir las moléculas que contienen un sitio de aglutinación del antígeno que se aglutina inmunoespecíficamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier de tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgAl e IgA2) o subclase de la molécula de inmunoglobulina. Además el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) se entiende que incluye moléculas intactas, así como, fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos de Fab y fragmentos de F(ab')2) que son capaces de aglutinarse específicamente a la proteína. Los fragmentos de Fab y F(ab')2 carecen del fragmento de Fe del anticuerpo intacto, se despejan más rápidamente de la circulación del animal o de la planta, y pueden tener menos aglutinación al tejido no específico que un anticuerpo intacto ( ahl et al., J". Nucí. Med., 24:316-325 (1983)). Por consiguiente, estos fragmentos son preferidos, así como los productos de un Fab u otra biblioteca de la expresión de la inmunoglobulina. Además, los anticuerpos de anti-CTLA4 incluyen anticuerpos quiméricos, de una sola cadena, y humanizados.

Los anticuerpos de anti-CTLA4 pueden ser producidos por cualquier método conocido en el arte para la síntesis de los anticuerpos, en particular, por la síntesis química o preferentemente, por técnicas de expresión recom inante .

Las adnectinas de la presente invención se pueden hacer de acuerdo con los métodos descritos en las publicaciones U.S. co-poseídas Nos. 2007/0082365 y 2008/0139791.

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (Patente U. S. No. 4,946,778; Bird, Science, 242:423-442 (1988); Houston et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 85:5879-5883 (1988); y Ward et al., Nature, 334:544-554 (1989)) pueden ser adaptados para producir anticuerpos de una sola cadena. Los anticuerpos de una sola cadena son formados por el enlace de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región de Fv por medio de un puente de aminoácido, conduciendo a un polipéptido de una sola cadena. Las técnicas para el ensamblaje de los fragmentos de Fv funcionales en E. coli también pueden ser utilizados (Skerra et al., Science, 242:1038-1041 (1988)).

La expresión recombinante de un anticuerpo de anti-CTLA4 , o un fragmento, derivado o análogo del mismo, (por ejemplo, una cadena ligera o pesada de un anticuerpo de la invención o un anticuerpo de una sola cadena de la invención) , requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que un polinucleótido que codifica una molécula del anticuerpo de anti-CTLA4 o una cadena ligera o pesada de un anticuerpo, o porción del mismo (que contiene preferentemente el dominio variable de cadena ligera o pesada) , ha sido obtenido, el vector para la producción de la molécula del anticuerpo de anti-CTLA4 puede ser producida por la tecnología de ADN recombinante utilizando las técnicas bien conocidas en el arte. Por consiguiente, los métodos para la preparación de una proteína por la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo, son descritos aquí. Los métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en el arte pueden ser utilizados para la construcción de los vectores de expresión que contienen las secuencias de codificación del anticuerpo y las señales transcripcionales y traduccionales apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, las técnicas del ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y la recombinación genética in vivo. Así, la invención proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia del nucleótido que codifica un anticuerpo de anti-CTLA4, o una cadena ligera o pesada del mismo, o un dominio variable de la cadena ligera o pesada, enlazada operativamente a un promotor. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT Nos. WO 86/05807 y WO 89/01036; y la Patente U. S. No. 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo puede ser clonado en tal vector para la expresión de la cadena ligera o pesada completa.

El vector de expresión es transferido a una célula hospedera por técnicas convencionales y las células transfectadas son cultivadas entonces por técnicas convencionales para producir un anticuerpo de anti-CTLA4. Por consiguiente, la invención incluye células hospederas que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo de anti-CTLA4, o una cadena ligera o pesada del mismo, o un anticuerpo de una sola cadena de la invención, enlazado opera ivamente a un promotor heterólogo. En las modalidades preferidas para la expresión de los anticuerpos de una doble cadena, los vectores que codifican las cadenas tanto ligera como pesada pueden ser co-expresados en la célula hospedera para verificar la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla posteriormente.

Una variedad de los sistemas del vector de expresión del animal hospedero pueden ser utilizados para expresar las moléculas del anticuerpo de anti-CTLA4. Tales sistemas de expresión en el animal hospedero representan vehículos por los cuales las secuencias de codificación de interés pueden ser producidas y purificadas subsiguientemente, pero también representan células que cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias de codificación del nucleótido apropiadas, pueden expresar una molécula del anticuerpo de la invención in situ. Estas incluyen pero no están limitadas a microorganismos tales como las bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con el ADN del bacteriófago recombinante , los vectores de expresión del ADN del plásmido o del ADN del cósmido que contienen las secuencias de codificación del anticuerpo; las levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con los vectores de expresión de la levadura recombinantes que contienen las secuencias de codificación del anticuerpo; los sistemas celulares de los insectos infectados con vectores de expresión del virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias de codificación del anticuerpo; los sistemas de las células de las plantas infectados con los vectores de expresión del virus recombinante (por ejemplo, el virus de mosaico de la coliflor, Ca V; el virus de mosaico del tabaco, TMV) o transformados con los vectores de expresión del plásmido recombinante (por ejemplo el plásmido Ti) que contiene las secuencias de codificación del anticuerpo; o sistemas de las células del mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BH , 293, 3T3) que presentan las construcciones de expresión recombinante que contienen los promotores derivados del genoma de las células de mamífero (por ejemplo, el promotor de metalotioneína) o de los virus del mamífero (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus, el promotor del virus 7.5K de vaccinia) . Preferentemente, las células bacterianas tales como Escherichia coli, y más preferentemente, las células eucarióticas , especialmente para la expresión de la molécula del anticuerpo recombinante total, son utilizados para la expresión de una molécula del anticuerpo recombinante . Por ejemplo, las células de mamífero tales como las células de los ovarios del hámster chino (CHO) , en conjunción con un vector tal como el elemento del promotor del gen temprano, intermedio, principal, del citomegalovirus humano es un sistema de expresión efectivo para los anticuerpos (Foecking et al., Gene, 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).

En los sistemas bacterianos, varios de vectores de expresión pueden ser seleccionados venta osamente dependiendo del uso propuesto para la molécula del anticuerpo que es expresada. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de tal proteína va a ser producida, para la generación de las composiciones farmacéuticas de una molécula del anticuerpo, los vectores que dirigen la expresión de niveles elevados de los productos de la proteína de fusión que son purificados fácilmente, pueden ser deseables. Tales vectores incluyen, pero no están limitados, al vector de expresión E. coli pU 278 (Ruther et al., EMBO J., 2:1791 (1983)), en los cuales la secuencia de codificación del anticuerpo puede ser ligada individualmente en el vector en la estructura con la región de codificación lac Z de modo que se produzca una proteína de fusión; los vectores pIN (Inouye et al., Nucleic Acids Res., 13:3101-3109 (1985); Van Heeke et al.; J. Biol . Chem. , 24:5503-5509 (1989)); y semejantes. Los vectores pGEX pueden también ser utilizados para expresar los polipéptidos extraños como proteínas de fusión con la glutationa S-transferasa (GST) . En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser purificadas fácilmente a partir de las células lisadas por la adsorción y aglutinación a las perlas de glutationa-agarosa de la matriz seguido por la elución en la presencia de glutationa libre. Los vectores de pGEX son diseñados para incluir la trombina o los sitios de segmentación de la proteasa del factor Xa de modo que el producto del gen objetivo clonado pueda ser liberado de la porción de GST.

En un sistema de insecto, se utilizó el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar los genes extraños. El virus crece en las células de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación del anticuerpo puede ser clonada individualmente en las regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y colocadas bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo el promotor de polihedrina) .

En las células hospederas de mamífero, un número de sistemas de expresión de base viral puede ser utilizado. En los casos en donde un adenovirus es utilizado como un vector de expresión, la secuencia que codifica el anticuerpo de anti-CTLA4 puede ser ligada a unn complejo de control de la transcripción/traducción del adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia delantera tripartita. Este gen quimérico puede ser insertado entonces en el genoma del adenovirus por la recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, las regiones El o R3) conducirán a un virus recombinante que es viable y es capaz de la expresión de la molécula del anticuerpo en las células hospederas infectadas (véase, por ejemplo Logan et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 81:355-359 (1984)). Las señales de inicio específicas también pueden ser requeridas para la traducción eficiente de las secuencias de codificación del anticuerpo insertado. Estas señales incluyen el codón de inicio de ATG y las secuencias adyacentes. Además, el codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control traduccional exógenas y los codones de inicio pueden ser de una variedad de orígenes, tanto natural como sintético. La eficiencia de la expresión puede ser mejorada por la inclusión de los elementos mej oradores de la transcripción apropiados, los terminadores de la transcripción, etc. (véase Bitter et al., Meth. Enzy ol . , 153 :516-544 (1987) ) .

Además, una cepa de la célula hospedera puede ser elegida, la cual module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto del gen del modo específico deseado. Tales modificaciones (por ejemplo, la glucosilación) y el procesamiento (por ejemplo, la escisión) de los productos de la proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Las células hospederas diferentes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación post-traduccional de las proteínas y los productos del gen. Las líneas celulares o los sistemas hospederos apropiados pueden ser elegidos para asegurar la modificación y el procesamiento correcto de la proteína extraña expresada. Para este fin, las células hospederas eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glucosilación, y la fosforilación del producto del gen, pueden ser utilizadas. Tales células hospederas de mamífero incluyen pero no están limitadas a CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, y en particular, las líneas celulares del cáncer de mama tales como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, y la línea celular de la glándula mamaria normal tal como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst.

Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo, de las proteínas recombinantes , se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente la molécula del anticuerpo de anti-CTLA4 pueden ser diseñadas. En lugar de utilizar los vectores de expresión que contengan orígenes virales para la replicación, las células hospederas pueden ser transformadas con el ADN controlado por los elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, el promotor, el mej orador, las secuencias, los terminadores de la transcripción, los sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable . Después de la introducción del ADN extraño, las células diseñadas se puede dejar que crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego son cambiadas a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar sitios los cuales a su vez pueden ser clonados y expandidos en las líneas celulares. Este método puede ser utilizado ventajosamente para diseñar líneas celulares que expresan la molécula del anticuerpo. Tales líneas celulares diseñadas pueden ser particularmente útiles en la selección y evaluación de los compuestos que interactúan directa o indirectamente con la molécula del anticuerpo de anti-CTLA4.

Se pueden utilizar varios sistemas de selección, incluyendo pero sin estar limitado a la timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell, 11:223 (1977)), la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 48:202 (1992)), y los genes de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell, 22:817 (1980)) pueden ser empleados en las células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También, la resistencia del antimetabolito puede ser utilizada como la base de la selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metrotexato ( igler et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78:1527 (1981)); gp , que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 Clinical Pharmacy, 12 (7) : 488-505 (1993) Wu et al., Biotherapy, 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol, 32:573-596 (1993); Mulligan, Science, 260:926-932 (1993); y Morgan et al., Ann. .Rev. Biochem. , 62:191-217 (1993); TBI TECH, 11 ( 5 ) : 155-215 (mayo 1993)); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene, 30:147 (1984)). Los métodos conocidos comúnmente en el arte de la tecnología del ADN recombinante pueden ser aplicados rutinariamente para seleccionar el clon recombinante deseado, y tales métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al., eds . , Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los capíulos 12 y 13, Cracopoli et al., eds., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol . , 150:1 (1981), que son incorporadas aquí para referencia en sus totalidades.

Los niveles de expresión de una molécula del anticuerpo de anti-CTLA4 pueden ser incrementados por la amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington et al., "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" en DNA Cloning, Vol . 3, Academic Press, NY (1987)). Cuando un marcador en sistema de vectores que expresan el anticuerpo es amplificable, el incremento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedera incrementará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también se incrementará (Crouse et al., Mol. Cell. Biol . , 3:257 (1983)).

La célula hospedera puede ser co-transfectada con dos vectores de expresión, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de una cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de una cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que hacen posible la expresión idéntica de los polipéptidos de cadena ligera y pesada. Alternativamente, un solo vector puede ser utilizado el cual codifica, y es capaz de expresar, los polipéptidos tanto de cadena ligera como pesada. En tales situaciones, la cadena ligera debe ser colocada antes de la cadena pesada para evitar un exceso de la cadena pesada libre, tóxica (Proudfoot, Nature, 322:52 (1986); Kohler, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:2197 (1980)). Las secuencias de codificación para las cadenas pesada y ligera puede comprender el ADNc o el ADN genómico.

Una vez que una molécula del anticuerpo de la invención ha sido producida por un animal, sintetizada química, o expresada recombinantemente , la misma puede ser purificada por cualquier método conocido en el arte para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, por intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad hacia el antígeno específico después de la Proteína A, y dimensionamiento por cromatografía en columna) , centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de anti-CTLA4 o los fragmentos de los mismos pueden ser fusionados a las secuencias de polipéptidos heterólogos descritas aquí o conocidas de otra manera en el arte, para facilitar la purificación.

La presente invención incluye además las composiciones que comprenden los polipéptidos o conjugados con respecto a los dominios del anticuerpo de anti-CTLA4 diferentes de las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser fusionados o conjugados a una región de Fe del anticuerpo, o una porción del mismo. La porción del anticuerpo de anti-CTLA4 fusionado a un polipéptido puede comprender la región constante, la región de articulación, el dominio de CH1, el dominio de CH2 , y el dominio de CH3 o cualquier combinación de los dominios completos o porciones de los mismos. Los polipéptidos también pueden ser fusionados o conjugados a las porciones del anticuerpo anteriores para formar multímeros. Por ejemplo, las porciones de Fe fusionadas a los polipéptidos de la presente invención pueden formar dímeros por medio de la unión del disulfuro entre las porciones de Fe. Las formas multiméricas más elevadas se pueden hacer por la fusión de los polipéptidos a las porciones de IgA e IgM. Los métodos para la fusión o conjugación de los polipéptidos de la presente invención a las porciones del anticuerpo ya son conocidas en el arte. Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, y 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; Publicaciones del PCT Nos. O 96/04388 y O 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:10535-10539 (1991); Zheng et al., J. Immunol . , 154:5590-5600 (1995); y Vil et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341 (1992) (las referencias incorporadas para referencia en sus totalidades) .

Además, un anticuerpo de anti-CTLA4 o fragmento del mismo puede ser conjugado hasta una porción terapéutica tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocídico, un agente terapéutico o un ion de metal radioactivo, por ejemplo, los emisores alfa tales como, por ejemplo, 213BÍ. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen paclitaxol, citochalasina B, gramacidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides , procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no están limitados a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina , 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina) , agentes de alquilación (por ejemplo, mecroretamina , tiotepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclofosfamida , busulfan, dibromomanitol , estreptozocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino) , antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina ( inicialmente daunomicina) y doxorrubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (inicialmente actinomicina) , bleomocina, mitramicina, y antramicina (AMC) ) , y agentes anti-micóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) .

Los conjugados de la invención pueden ser utilizados para la modificación de una respuesta biológica dada, el agente terapéutico o la porción del fármaco no va a ser interpretada como limitada a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción del fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o la toxina de la difteria; una proteína tal como el factor de la necrosis del tumor, el interferón a, el interferón ß, el factor del crecimiento de los nervios, el factor del crecimiento derivado de las plaquetas, el activador del plasminógeno del tejido, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta, AIM I (Véase la Publicación del PCT No. WO 97/33899), AIM II (Véase la Publicación del PCT No. WO 97/34911), el Ligando Fas (Takahashi et al., Int. Immunol., 6:1567-1574 (1994)), VEGI (Véase la Publicación del PCT No. 99/23105), un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina ; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina 1 ("IL-1"), interleucina 2 ("IL-2"), interleucina 6 ("IL-6"), el factor de estimulación de la colonia de macrófagos de los granulocitos ("GM-CSF"), el factor estimulante de la colonia de los granulocitos ("G-CSF"), u otros factores del crecimiento.

Las técnicas para la conjugación de tal porción terapéutica a los anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cáncer Therapy" , en Monoclonal Antijbodies and Cáncer Therapy, Reisfeld et al., eds . , pp. 243-256, Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies for Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery, 2/a. Ed. , Robinson et al., eds., pp . 623-653, Marcel Dekker, Inc. (1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Citotoxic Agents in Cáncer Therapy: en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al., eds., pp . 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Raliolabeled Antibody in Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy, Baldwin et al., eds., pp. 303-316, Academic Press (1985), y Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol . Rev. , 62:119-158 (1982).

Alternativamente, un anticuerpo de anti-CTLA4 puede ser conjugado a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado del anticuerpo como se describe por Segal en la Patente U.S. No. 4,676,980, que es incorporada aquí para referencia en su totalidad.

Un anticuerpo de anti-CTLA4, con o sin una porción terapéutica conjugada con el mismo, administrada sola o en combinación con el (los) factor (es) citotóxico (s) y/o la(s) citosina(s) pueden ser utilizados como una substancia terapéutica .

La presente invención también abarca la creación de anticuerpos sintéticos dirigidos contra los polipéptidos de la presente invención. Un ejemplo de los anticuerpos sintéticos se describe en Radrizzani, M., et al., Medicina (Aires), 59 (6) : 373-758, (1999)). Recientemente, una nueva clase de anticuerpos sintéticos ha sido descrita y es referida como los polímeros impresos molecularmente (MIPs) (Semorex, Inc.). Los anticuerpos, péptidos, y enzimas son utilizados frecuentemente como elementos de reconocimiento molecular en los sensores químicos y biológicos. Sin embargo, su falta de estabilidad y los mecanismos de transducción de la señal limitan su uso como dispositivos de detección. Los polímeros impresos molecularmente (MIPs) son capaces de imitar la función de los receptores biológicos pero con menos restricciones de la estabilidad. Tales polímeros proporcionan una sensibilidad y selectividad elevadas mientras que se mantiene una excelente estabilidad térmica y mecánica. Los MPIs tienen la capacidad de aglutinarse a las moléculas pequeñas y a las moléculas objetivo tales como substancias orgánicas y proteínas con una potencia idéntica o más grande que aquella de los anicuerpos naturales. Estos "super" MIPs tienen afinidades más elevadas hacia su objetivo y por consiguiente requieren concentraciones inferiores para una aglutinación eficaz.

Durante la síntesis, los MIPs sin imprimidos para que tengan un tamaño, forma, carga y grupos funcionales complementarios del objetivo seleccionado por el uso de la propia molécula objetivo (tal como un polipéptido, anticuerpo, etc.), o una substancia que tiene una estructura muy semejante, como su "huella" o "molde". Los MIPs pueden ser derivados con los mismos reactivos producidos para los anticuerpos. Por ejemplo, los "super" MIPs fluorescentes pueden ser recubiertos sobre perlas o cavidades para su uso en las separaciones o ensayos altamente sensibles, o para el uso en la selección total de las proteínas.

Se pueden emplear varios métodos para crear los MIPs hasta un receptor, ligando, polipéptido, péptido, molécula orgánica, específico. Varios métodos preferidos son descritos por Esteban et al. en J. Analytical Chem. , 370 (7) : 795-802 (2001), que es incorporada por el presente aquí para referencia en su totalidad o además de cualesquiera referencias citadas allí. Los métodos adicionales ya son conocidos en el arte y están abarcados por la presente invención, tal como por ejemplo, Hart, B.R. et al., J. Am. Chem. Soc, 123 (9) :2072-2073 (2001); y Quaglia, M. et al., J". Am. Chem. Soc, 123 ( 10 ): 2146 -2154 (2001); que son incorporadas aquí para referencia en su totalidad aquí.

Los oligonucleótidos antisentido pueden ser de una sola hebra o de doble hebra. Los ARNs de doble hebra pueden ser diseñados con base en las enseñanzas de Paddison et al., Proc. Nat. Acad. Sci . , 99:1443-1448 (2002); y las Publicaciones del PCT Nos. O 01/29058, y WO 99/32619; las cuales son incorporadas aquí para referencia.

El ARN de doble hebra también puede tomar la forma de un inhibidor del ARN ("ARNi") de tal modo que los mismos sean competentes para la interferancia del ARN. Por ejemplo, las moléculas de ARNi del anti-CTLA4 pueden tomar la forma de las moléculas descritas por Mello y FIRE en las publicaciones del PCT Nos. WO 1999/032619 y WO 2001/029058; las Publicaciones U.S. Nos. 2003/0051263, 2003/0055020, 2003/0056235, 2004/265839, 2005/0100913; 2006/0024798, 2008/0050342, 2008/0081373, 2008/0248576, y 2008/055443; y/o las Patentes U.S. Nos. 6,506,559, 7,282,564, 7,538,095, y 7,560,438. Las enseñanzas de esta patente y las solicitudes de patente son incorporadas aquí para referencia en su totalidad .

Por ejemplo, las moléculas de anti-CTLA4 ARNi pueden ser de ARN de doble hebra, y entre aproximadamente 25 hasta 400 nucleótidos de longitud, y complementarias con respecto a la secuencia de nucleótidos de codificación de CTLA4. Tales moléculas de ARNi pueden ser de aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 45 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En este contexto, el término "aproximadamente" es interpretado para que sea de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, o 6 nucleótidos más largo en la dirección ya sea 5' o 3', o ambos .

Alternativamente, las moléculas de anti-CTLA4 ARNi de la presente invención pueden tomar la forma para que sean las moléculas de ARNi de doble hebra descritas por Kreutzwer en las Patentes Europeas Nos. EP 1144639, y EP 1214945. Las enseñanzas de estas patentes y solicitudes de patente son incorporadas por el presente para referencia en su totalidad. Específicamente, las moléculas de anti-CTLA4 ARNi de la presente invención pueden ser de ARN de doble hebra que es complementaria con la región de codificación de CTLA , y está entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 49 nucleótidos de longitud, y preferentemente entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 21 nucleótidos de longitud. En este contexto, el término "aproximadamente" se interpreta que va a ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos más largos en ya sea la dirección 5' o 3', o ambas. Tales moléculas de anti-CTLA4 pueden ser estabilizadas por el enlace químico de las hebras de ARN únicas.

Alternativamente, las moléculas de anti-CTLA4 ARNi de la presente invención pueden tomar la forma de las moléculas de ARNi de doble hebra descritas por Tuschl en la Patente Europea No. EP 1309726. Las enseñanzas de estas patentes y solicitudes de patentes son incorporadas aquí por el presente para referencia en su totalidad. Específicamente, las moléculas de anti-CTLA4 ARNi de la presente invención pueden ser de ARN de doble hebra que es complementaria con la región de codificación del CTLA4 , y está entre aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos de longitud, y son ya sea de extremos romos o contienen ya sea uno o más elementos colgantes sobre el extremo 3' o el extremo 5' de una o ambas de las hebras con cada elemento colgante que es de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, o más nucleótidos de longitud. Los extremos de cada hebra pueden ser modificados por fosforilación, hidroxilación, u otras modificaciones. Además, los enlaces de internucleótidos de uno o más de los nucleótidos pueden ser modificados, y pueden contener 2' -OH. En este contexto, el término "aproximadamente" es interpretado para que sea de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos más largos en la dirección ya sea 5' o 3', o ambas. Tales moléculas de anti-CTLA4 pueden ser estabilizadas por enlace químico de las hebras de ARN único.

Alternativamente, las moléculas de anti-CTLA4 ARNi de la presente invención pueden tomar la forma de las moléculas de ARNi de doble hebra descritas por Tuschl en las Patentes U.S. Nos. 7,056,704 y 7,078,196. Las enseñanzas de estas patentes y solicitudes de patentes son incorporadas aquí para referencia en su totalidad. Específicamente, las moléculas de anti-CTLA4 AR i de la presente invención pueden ser de ARN de doble hebra que es complementaria con la región de codificación de CTLA4 , y está entre aproximadamente 19 hasta aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, y son ya sea de extremos romos o contienen ya sea uno o más elementos colgantes sobre el extremo 3' o el extremo 5' de una o ambas de las hebras con cada elemento colgante que es de aproximadamente 1, 2, 3, 4, o 5, o más nucleótidos de longitud. Los extremos de cada hebra pueden ser modificados por fosforilación, hidroxilación, u otras modificaciones. Además, los enlaces de internucleótidos de uno o más de los nucleótidos pueden ser modificados, y pueden contener 2' -OH. En este contexto, el término "aproximadamente" es interpretado para que sea de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos más largos en la dirección ya sea 5' o 3', o ambas. Tales moléculas de anti-CTLA4 pueden ser estabilizadas por enlace químico de las hebras de ARN único.

Adicionalmente , las moléculas de anti-CTLA4 ARNi de la presente invención pueden tomar la forma de las moléculas de ARN descritas por Crooke en las Patentes U.S. Nos. 5,898,031, 6,107,094, 7,432,249, y 7,432,250, y la Solicitud Europea No. EP 0928290. Las enseñanzas de estas patentes y solicitudes de patentes son incorporadas aquí por el presente para referencia en su totalidad. Específicamente, las moléculas de anti-CTLA4 pueden ser de ARN de una sola hebra, que contienen un primer segmento que tiene al menos una subunidad del nucléósido de ribofuranosilo que es modificado para mejorar la afinidad de aglutinación del compuesto al objetivo de ARN preseleccionado cuando se compara con la afinidad de la aglutinación de un oligorribonucleótido no modificado al objetivo del ARN; y un segundo segmento que comprende al menos cuatro subunidades del nucléósido de ribofuranosilo consecutivas que tiene porciones de 2'-hidroxilo sobre las mismas; las subunidades del nucléósido del compuesto oligomérico están conectadas por los enlaces del internucleósido que son modificados para estabilizar los enlaces de la degradación cuando se compara con los enlaces del fosfodiéster . Preferentemente, tales moléculas de ARN son de aproximadamente 15 hasta 25 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 17 hasta aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Preferentemente tales moléculas son competentes para activar una enzima de RNAse de doble hebra para efectuar la escisión del ARN de CTLA . En este contexto, el término "aproximadamente" es interpretado para que sea de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos más largos en la dirección ya sea 5' o 3', o ambas. Tales moléculas de anti-CTLA4 pueden ser estabilizadas por enlace químico de las hebras de ARN único.

Los reactivos de SiARN son contemplados específicamente por la presente invención. Tales reactivos son útiles para la inhibición de la expresión de los polinucleótidos de la presente invención y pueden tener eficacia terapéutica. Varios métodos ya son conocidos en el arte para el tratamiento terapéutico de los trastornos por la administración de los reactivos de siR A. Uno de tales métodos se describe por Tiscornia et al. (Proc. Nati. Acad. Sci., 100 (4) : 1844-1848 (2003)); O 04/09769, presentada el 18 de julio del 2003, y Reich, S.J. et al., Mol. Vis., 9:210-216 (30 mayo del 2003), que son incorporados aquí para referencia en su totalidad.

Para facilitar un entendimiento adicional de la invención, los siguientes ejemplos son presentados principalmente con el propósito de ilustrar los detalles más específicos de los mismos. El alcance de la invención no se debe considerar limitado por los ejemplos, pero abarca la materia objeto completa definida por las reivindicaciones.

Ejemplos Ejemplo 1 - Método de evaluación del efecto de la combinación de un inhibidor de tirosina cinasa de la proteína con un modulador de la ruta co-estimuladora sobre el crecimiento del tumor en tres modelos de tumor del murino El efecto de dasatinib sobre la función imunológica ha sido el objeto de recientes investigaciones. Algunos reportes demostraron que in vitro, el dasatinib (concentraciones de 10-50 nM) , inhibe la función de las células T, como se mide por la inhibición de la secreción y desgranulación de la citosina ( eischel et al., 2008) que se postuló que va a ser el resultado de la inhibición de Lck. Otros reportes demostraron que dasatinib produjo el bloqueo de la activación de las células T (Schade et al., 2007). Sin embargo, el tratamiento con dasatinib podría también tener efectos moduladores basado en su inhibición potente de STAT3 , que puede conducir a la maduración de las células dendríticas y la modulación de las respuestas de las células T (Yu H, et al., 2007), y la sensibilidad diferencial de los efectores T y las células reguladoras T para la inhibición de la señalización de las células T (Siggs et al., 2007). Además, los linfocitos granulares grandes han sido detectados en las efusiones pleurales de los pacientes tratados con dasatinib y de interés, la totalidad de estos pacientes tuvieron al menos un alelo HLA-A2 (Mustojski et al., 2008). Se tiene la hipótesis de que la infiltración de LGL podría ser el resultado de la inmunoestimulación . Por consiguiente, existe un interés en la determinación de que si una potenciación de la respuesta inmunológica del antitumor podría ser lograda por la combinación de un mAb y dasatinib de bloqueo de CTL4 en modelos en donde dasatinib tiene un efecto mínimo.

Los estudios de la eficacia fueron llevados a cabo en 3 modelos: fibrosarcoma SAIN, carcinoma del colon CT26 y carcinoma del pulmón M109. Los primeros 2 modelos son sensibles al efecto del bloqueo de CTLA-4, mientras que dasatinib mostró una actividad antitumoral modesta en el modelo de SAIN pero una actividad mínima contra los modelos de CT 26 y M109. Como se muestra en las figuras 1A-1B y la figura 2, el tratamiento concurrente con CTLA-4 mAb + dasatinib condujo a efectos sinergísticos . La sinergia fue observada cuando dasatinib fue administrado a 30 mg/kg ya sea en un régimen de dosificación diaria o siguiendo un programa intermitente (5 días encendido/2 días apagado) . Ninguna sinergia fue observada en el modelo del tumor M109.

Los estudios adicionales fueron llevados a cabo en el modelo del tumor de CT26 para determinar si el efecto de la combinación fue debido a una expansión de las células citotóxicas T y para determinar si los tratamientos estuvieron alterando la composición de las células inmunológicas en los nodos linfáticos de drenaje del tumor. La actividad citolítica incrementada fue observada en los animales tratados con el tratamiento combinado comparado con los animales tratados con tratamientos únicos (FIG. 3A-3C) . Adicionalmente , cuando la relación de las células efectoras T/células reguladoras T (población supresora) fue medida, el tratamiento combinado y el grupo tratado con dasatinib mostrado en la relación mejorada, indicando un número más elevado de células efectoras T sobre las células reguladoras T. Basado en los resultados obtenidos en el modelo de CT-26 es probablemente que la adición de dasatinib a la terapia de CTLA-4 reduce el número de las células reguladoras T mientras que la expansión del porcentaje de las células efectoras T conduce a una mejora de la respuesta inmunológica del antitumor producida por la monoterapia de anti-CTLA-4.

Ejemplo 2 - Método de evaluación del efecto de la combinación de un inhibidor de tirosina cinasa de la proteína con un modulador de la ruta co-estimuladora sobre el crecimiento del tumor en un modelo de tumor del murino con mastoeitoma P815 El tratamiento concurrente con SPRYCEL® Y el anticuerpo de CTLA-4 fue evaluado en el modelo del tumor de murino con mastocitoma P815. Los métodos utilizados fueron esencialmente como se describió en el Ejemplo 1 de aquí.

SPRYCEL® mostró una actividad antitumoral modesta en el modelo P815. Como se muestra en la figura 5, el tratamiento concurrente con CTLA-4 mAb + SPRYCEL® condujo a efectos sinergísticos . La sinergia fue observada cuando SPRYCEL® fue administrado a 30 mg/kg ya sea sobre un régimen de dosificación diaria o siguiendo un programa intermitente (5 días encendido/2 días apagado).

Estos resultados fueron consistentes con los resultados observados en los modelos del tumor de SAIN y CT26 (véanse las figuras 1A-1B y 2), y confirma la administración de un inhibidor de tirosina cinasa de la proteína en combinación con un anticuerpo de CTLA-4 condujo a la reducción sinergística en la proliferación del tumor.

Ejemplo 3 - Método de evaluación de la actividad antitumoral del bloqueo del antígeno 4 del linfocito T citotoxico (CTLA- 4) solo o combinado con paclitaxel (PAC) , etopósido (ETO) , o gemcitabina (GEM) en los modelos de tumor del murino Para determinar si la actividad antitumoral de un anticuerpo monoclonal de anti-CTLA-4 (CTLA-4 mAb) es sinergizada o inhibida por la adición de los agentes quimioterapéutico, el CTLA-4 mAb fue evaluado solo y en combinación con Pac, Eto, o Gem en los modelos del tumor de murino. Los modelos del carcinoma del pulmón M109, fibrosarcoma SAIN, y carcinoma del colon CT26 fueron elegidos con base en una sensibilidad diferente a los agentes quimioterapéuticos y el bloque de CTLA-4.

Todos los compuestos fueron probados a su dosis y programación óptimas. Cuando se utilizan en combinación, CTLA-4 mAb fue iniciado un día después de la primera dosis de quimioterapia. La inhibición del crecimiento del tumor y el número de días para alcanzar el tamaño del tumor objetivo fueron utilizados para evaluar la eficacia. La actividad antitumoral fue evaluada como: regresión completa (CR; tumor no palpable para ^ 2 evaluaciones) o la regresión parcial (PR; 50 % de reducción en el volumen del tumor para > 2 evaluaciones) . La sinergia fue definida como una actividad antitumoral significativamente superior (p<0.05) a la actividad de la monoterapia con cada agente.

En el modelo del tumor subcutáneo MIO9, que es insensible al bloqueo de CTLA-4 y modestamente sensible a Pac, Eto, y Gem, la sinergia de la línea de límite fue evidente con la combinación de CTLA-4 mAb y Pac, mientras que ningún efecto fue observado con Eto. La monoterapia con Gem no produjo una actividad antitumoral de M109 significativa; sin embargo, la combinación de Gem con CTLA-4 mAb condujo a sinergia. En el modelo de metástasis del pulmón M109, la sinergia fue detectada para CTLA-4 mAb combinada con Eto, la sinergia de la línea de límite fue encontrada con Gem, y Pac no mejoró la actividad.

El fibrosarcoma de SAIN es sensible al bloqueo de CTLA-4 y a la totalidad de las tres quimioterapias. Pac, Eto, y Gem mejoraron la actividad de CTLA-4 mAb en este modelo, pero la sinergia solamente fue observada con Eto. CTLA-4 mAb y Pac fueron ineficaces contra los tumores del carcinoma del colon CT26 establecidos, pero sinergísticos cuando la carga del tumor fue mínima. Tanto Eto como Gem fueron ineficaces como agentes únicos en este modelo y la actividad de ambos fue energizada significativamente por CTLA-4 mAb.

En resumen, la adición de CTLA-4 mAb a Eto, Gem, o Pac condujo a actividades sinergísticas dependientes del modelo. La sinergia fue observada sin importar la inmunogenicidad del tumor y solamente cuando al menos una de las terapias fue activa. Todos los regímenes combinados fueron bien tolerados y las quimioterapias no parece que inhiban la actividad de CTLA-4 mAb en el modelo del tumor de SAIN. Como asunto de importancia particular, se observó una sinergia en los tumores sin respuesta a CTLA-4 mAb solo, sugiriendo que los agentes quimioterapéuticos podrían haber inducido la muerte celular inmunogénica . Estos descubrimientos proporcionan soporte para la evaluación de combinaciones quimioinmunoterapéuticas en los ensayos clínicos. Los datos para las combinaciones en cada modelo de murino son descritas individualmente en los siguientes ej emplos .

Ejemplo 4 - Método de evaluación de la actividad an itumoral del bloqueo del antígeno 4 del linfocito T citotóxico (CTLA- 4) solo o combinado con paclitaxel (PAC) , etopósido (ETO) , o gemcitabina (GEM) en los modelos del tumor de murino 109 subcutáneo El efecto de paclitaxel, Etopósido y Gemcitabina en combinación con el bloqueo de CTLA-4 fue evaluado en un modelo de tumor del carcinoma del pulmón M109 subcutáneo para establecer la eficacia de cada combinación de tratamiento .

Los tumores de M109 son insensibles al bloqueo de CTLA-4 y modestamente sensibles a paclitaxel, Etopósido y Gemcitabina. La combinación de CTLA-4 + paclitaxel produjo una actividad antitumoral mejorada comparado con cada agente solo, mientras que ninguna mejora fue observada con el Etopósido. Por otra parte, aún cuando la Gemcitabina como el único agente no produjo una actividad antitumoral significativa, la Gemcitabina más CTLA-4 mAb produjo efectos sinergísticos (Tabla 1) .

Tabla 1 Actividad antitumoral de CTLA-4 mAb en combinación con paclitaxel, etopósido y gemcitabina en el modelo del tumor subcutáneo del carcinoma del pulmón 109 TVDT = 5.4 días Ejemplo 5 - Método de evaluación de la actividad antitumoral del bloqueo del antígeno 4 del linfocito T citotoxico (CTLA- 4) solo o combinado con paclitaxel (PAC) , etopósido (ETO) , o gemcitabina (GEM) en un modelo del tumor de murino M109 de la metástasis del pulmón, experimental El efecto de paclitaxel, Etopósido y Gemcitabina en combinación con el bloqueo de CTLA-4 fue evaluada en un modelo de tumor de la metástasis del pulmón M109 experimental para establecer la eficacia de cada combinación de tratamiento.

En el modelo de metástasis del pulmón M019, el etopósido y CTLA-4 mAb mostró actividad sinergística mientras que la combinación con Gemcitabina fue sinergística en la línea de límite (Tabla 2) .

Tabla 2 Efecto de CTLA-4 mAb en combinación con agentes quimioterapéuticos en el modelo del carcinoma del pulmón M019 de la metástasis pulmonar experimental Ejemplo 6 - Método de evaluación de la actividad antitumoral del bloqueo del antígeno 4 del linfocito T citotoxico (CTLA-4) solo o combinado con paclitaxel (PAC) , etopósido (ETO) , o gemcitabina (GEM) en un modelo del tumor de marino subcutáneo de fibrosarcoma SAIN El efecto de paclitaxel, Etopósido y Gemcitabina en combinación con el bloqueo de CTLA-4 fue evaluado en un modelo de tumor del murino subcutáneo de fibrosarcoma SAIN para establecer la eficacia de cada combinación de tratamiento.

SAIN es una línea del tumor inmunogénico sensible a CTLA-4 mAb y quimioterapia. Aunque los 3 agentes quimioterapéuticos probados mejoraron la actividad de CTLA-4 mAb, la sinergia solamente fue observada con Etopósido (Tabla 3) .

Tabla 3 Actividad antitumoral de CTLA-4 mAb en combinación con paclitaxel, etopósido y gemcitabina en el modelo del tumor subcutáneo del fibrosarcoma de SAIN TVDT = 8.2 (1000 mm3) Ejemplo 7 - Método de evaluación de la actividad antitumoral del bloqueo del antígeno 4 del linfocito T citotóxico (CTLA- 4) solo o combinado con paclitaxel (PAC) , etopósido (ETO) , o gemcitabina (GEM) en un modelo del tumor de murino del carcinoma del colon CT26 El efecto de paclitaxel, Etopósido y Gemcitabina en combinación con el bloqueo de CTLA-4 fue evaluado en un modelo de tumor del murino del carcinoma del colon CT26 para establecer la eficacia de cada combinación de tratamiento.

CTLA-4 mAb y paclitaxel son terapias ineficaces contra los carcinomas del colon CT26; su combinación fue ineficaz contra los tumores establecidos, pero sinergística contra una carga mínima del tumor. Como se muestra en la Tabla 4, tanto el etopósido como gemcitabina fueron eficaces como agentes solos, pero su actividad fue potenciada significativamente por la adición de CTLA-4 mAb.

Tabla 4 Actividad antitumoral de CTLA-4 mAb en combinación con paclitaxel, etopósido y gemcitabina en el modelo del tumor subcutáneo del carcinoma del colon CT26 Tabla 4 (Cont . ) En resumen, la adición de CTLA-4 mAb a los agentes quimioterapéuticos tales como Etopósido, Gemcitabina, Paclitaxel, e Ixabepilona, condujo a actividad sinergística en los modelos de tumores múltiples. Todos los regímenes combinados fueron bien tolerados. Se debe señalar que la sinergia fue observada en los tumores que no responden a CTLA-4 solo, sugiriendo que los agentes quimioterapéuticos podrían haber inducido la muerte celular inmunogénica . La gemcitabina, el etopósido, el paclitaxel, y la ixabepilona parece que inducen una asignatura inmunogénica y la modulación de la respuesta inmunológica . De manera importante, los resultados sugieren que, debido a su vida media corta, estos agentes no afectarán la función de las células T efectoras. Además, la sinergia de la gemcitabina, el etopósido, el paclitaxel, y la ixabepilona en combinación con el bloqueo de CTLA-4 fue observada en las instalaciones en donde el agente quimioterapéutico no induce la regresión. Al menos para la gemcitabina, la temporización de la administración fue crítica para el efecto sinergístico solamente con el tratamiento concurrente con gemcitabina que es efectivo. Estos resultados sugieren que la coadministración de los agentes quimioterapéuticos con la inhibición de CTLA-4 puede ser óptima para el efecto sinergístico. Por último, los ratones con una respuesta completa ( "CR" ) fueron capaces de rechazar una reestimulación del tumor sugiriendo que la generación de una respuesta inmunológica de la memoria no fue alterada por los agentes quimioterapéuticos.

En conclusión, estos descubrimientos proporcionan evidencia de que la combinación de los agentes quimioterapéuticos y un mAb de bloqueo del anti-CTLA-4 homólogo de ipilimumab produce efectos antitumorales efectivos y a largo plazo, y que la investigación de ipilimumab en combinación con un agente quimioterapéutico en el agente quimioterapéutico en los ensayos clínicos está garantizada .

La presente invención no está limitada a las modalidades descritas específicamente arriba, pero es capaz de variación y modificación sin apartarse del alcance de las reivindicaciones anexas.

Será evidente que la invención puede ser practicada de otra manera que la descrita particularmente en la descripción y los ejemplos precedentes. Son posible numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención en vista de las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

La descripción completa de cada documento citado (incluyendo las patentes, solicitudes de patente, artículos anuales, resúmenes, manuales de laboratorio, libros, números de acceso del GENBANK®, números de acceso de SWISS-PROT®, u otras descripciones) en los Antecedentes de la Invención, la Descripción Detallada, la Breve Descripción de las Figuras, y los Ejemplos, es incorporada aquí para referencia en su totalidad. Además, las copias impresas del Listado de Secuencias presentada con el presente, además de su forma descifrable por computadora correspondiente, son incorporadas aquí para referencia en sus totalidades.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Uso de un un anticuerpo anti-CTLA-4 con un agente quimioterapéutico, el cual es un agente inductor de la doble hebra del ADN, para la manufactura de un medicamento para tratar el cáncer.

2. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde ELagente quimioterapéutico es un inhibidor de topoisomerasa II .

3. Uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde un agente quimioterapéutico es 4' -(fosfato diácido) de 4 ' -desmetilepipodofilotoxina 9- [4 , 6-0- (R) -etilideno-p-D-glucopiranósido] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un hidrato del mismo.

4. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde un anticuerpo anti-CTLA-4 es seleccionado del grupo que consiste de: ipilimumab y tremelimumab.

5. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde un anticuerpo anti-CTLA-4 es ipilimumab.

6. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el cáncer es un tumor sólido.

7. Uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde el tumor sólido se selecciona de un grupo que consiste de: cáncer de pulmón, sarcoma, fibrosarcoma, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de colón.

8. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde un agente quimioterapéutico es para el tratamiento de un tumor refractario.

9. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde un agente quimioterapéutico se administra antes de la administración del anticuerpo anti-CTLA-4.

10. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde un agente quimioterapéutico se administra esencialmente de manera simultánea con la administración del anticuerpo anti-CTLA-4.

11. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el tratamiEnto del cáncer comprende además un agente citotóxico antiproliferativo ya sea solo o en combinación con radioterapia.

12. Uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde un agente citotóxico antiproliferativo es cisplatino.

13. Uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde un agente citotóxico antiproliferativo es carboplatina.

14. Uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde un agente quimioterapéutico se adminsitra en dosis de aproximadamente 50 mg.

15. Uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde un agente quimioterapéutico se administra en dosis equivalentes a 100 mg de etopósido.

16. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde un agente quimioterapéutico se administra diariamente.

17. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde un anticuerpo anti-CTLA-4 se administra cada tres semanas aproximadamente .