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CN1328571A - 抗ctla－4的人单克隆抗体 - Google Patents

抗ctla－4的人单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

根据本发明,提供了抗人细胞毒性T－淋巴细胞抗原4(CTLA－4)的全人单克隆抗体。且提供了编码包含重链和轻链免疫球蛋白分子之氨基酸序列的核苷酸序列,特别是跨越互补性决定区(CDR)的连续重链和轻链序列,特别是从FR1内和/或CDR1到CDR3和/或FR4内。还提供了与本文揭示的抗体具有相似结合特性的抗体及具有相似功能的抗体(或其它拮抗物)。

Description

抗CTLA-4的人单克隆抗体
本发明背景
1.相关申请的交叉参考
本发明要求1998年12月23日申请的美国临时专利申请系列号60/113，647的优先权，其说明书作为整体在本文中引用。
2.本发明小结
根据本发明，提供了抗人细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4)的全人单克隆抗体。且提供了编码含有重链和轻链免疫球蛋白分子之氨基酸序列的核苷酸序列，特别是跨越互补性决定区(CDR)的连续重链和轻链序列，且特别是从FR1内和/或CDR1到CDR3和/或FR4内。还提供了与本文揭示的抗体具有相似结合特性的抗体及具有相似功能性的抗体(或其它拮抗物)。
3.技术背景
对病人免疫反应的调节可对许多人类疾病提供所需的治疗，该治疗可能导致通过使用常规药物很少发现的作用特异性。上调和下调免疫系统的反应都是可能的。T细胞和B细胞的的作用已被广泛研究且其特征在于与免疫反应的调节相联系。根据这些研究，在许多情况下，T细胞的作用在疾病的预防和治疗中似乎是特别重要的。
T细胞具有非常复杂的系统以控制其相互作用。T细胞间的相互作用过程中利用了许多受体和可溶性因子。因此在该免疫反应中任何具体信号可能具有的效应一般是变化的且依赖于在该途径中涉及的具体因子，受体和反受体。下调反应的途径与激活所需的途径同样重要。导致T-细胞耐受性的胸腺驯育是防止对特定抗原发生免疫反应的一种机制。其它机制，如抑制性细胞因子的分泌也是已知的。
T细胞的激活不仅需要通过抗原受体(T细胞受体(TCR))的刺激，而且还需要通过诸如CD28的共同刺激表面分子的信号。CD28的配体是B7-1(CD80)和B7-2(CD86)蛋白质，它们在诸如树突细胞，激活的B-细胞或单核细胞的抗原呈递细胞上表达且与T细胞CD28或CTLA-4相互作用以传递共同刺激信号。Perrin等在免疫学研究14：189-99(1995)中用实验性变应反应性脑脊髓炎(EAE)研究了共同刺激信号的作用。EAE是由Th1细胞针对髓鞘抗原诱导的自身免疫疾病，它在病理学免疫反应诱导中提供了研究B7-介导的共同刺激作用的体内模型。使用B7受体的可溶性融合蛋白配体，以及CD80或CD86特异性的单克隆抗体，Perrin等证实了在EAE中B7共同刺激在决定临床结果中起显著的作用。
B7和CD28之间的相互作用是几个共同刺激性信号途径之一，这些途径似乎足以触发抗原特异性T-细胞的成熟和增生。缺乏共同刺激及伴随的IL-2生产不足阻止了T细胞随后的增生并诱导一种称为“无变应性”的无反应性状态。各种病毒和肿瘤可能阻断T细胞激活和增生，导致宿主免疫系统对感染的或转化的细胞活性不足或无反应性。在许多可能的T细胞障碍中，无反应性可能至少部分地对宿主不能清除病原性或肿瘤原性细胞负责。
Chen等，细胞，71：1093—1102(1992)和Townsend及Allison，科学259：368(1993)已描述了B7蛋白质介导抗肿瘤免疫性的用途。Schwarts，细胞71：1065(1992)对CD28，CTLA-4和B7在IL-2生产和免疫治疗中的作用进行了综述。Harding等，自然，356：607—609(1994)证实了CD28介导的信号共同刺激鼠T细胞并防止在T细胞克隆中诱导无反应性。也参见美国专利号5,434,131,5,770,197和5,773,253及国际专利申请号WO93/00431,WO95/01994,WO95/03408,WO95/24217和WO95/33770。
从上述情况，很清楚T-细胞需要2类来自抗原呈递细胞(APC)的信号以激活并随后分化效应器功能。首先，要有由T-细胞上的TCR与APC上的MHC分子呈递肽之间的相互作用产生的抗原特异性信号。其次，要有由CD28与B7家族的成员(B7-1(CD80)或B7-2(CD86))相互作用介导的抗原非依赖性信号。确切地说，CTLA-4所适合的免疫反应环境起始是含糊的。Brunet等，自然328：267—270(1987)首先鉴定并克隆了鼠CTLA-4，作为寻找在细胞毒性T淋巴细胞上优选表达的分子的部分内容。随后很快由Dariavach等，欧洲免疫学杂志，18：1901—1905(1988)鉴定并克隆了人CTLA-4。鼠和人CTLA-4分子具有大约76％的总体序列同源性且在其胞质区内具有接近完全的序列相同性(Dariavach等，欧洲免疫学杂志，18：1901—1905(1988))。CTLA-4是免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白质中的一员。Ig超家族是均具有Ig分子可变区(V)或恒定区(C)的关键结构特征的一组蛋白质。Ig超家族的成员包括但不限于免疫球蛋白本身，主要组织相容性复合物(MHC)类分子(即，MHC I和II型)，和TCR分子。
1991年，Linsley等，实验医学杂志，174：561—569(1991)认为CTLA-4是B7的第二种受体。类似地，Harper等，免疫学杂志，147：1037—44(1991)证实在小鼠和人类中，CTLA-4和CD28分子在序列，信息表达，基因结构和染色体定位方面密切相关。也参见Balzano等，国际癌症杂志增刊，7：28—32(1992)。这一作用的进一步证据通过功能研究获得。例如，Lenschow等，科学257：789—792(1992)证实CTLA-4-Ig诱导胰岛移植物的长期存活。Freeman等，科学，262：907—909(1993)检查了CTLA-4在B7缺陷型小鼠中的作用。在Lenschow等，美国国家科学院院报，90：11054—11058(1993)中描述了对CTLA-4配体的检查。Linsley等，科学，257：792—795(1992)描述了用可溶形式的CTLA-4进行的体内免疫抑制。Linsley等，实验医学杂志，176：1595—604(1992)制备了结合CTLA-4的抗体且它不与CD28交叉反应，推论出CTLA-4与CD28在激活的T淋巴细胞上共同表达且共同协作调节T细胞粘附和由B7引起的激活。Kuchroo等，细胞80：707—18(1995)证实B7-1和B7-2共同刺激分子有区别地激活Th1/Th2发育途径。Yi-qun等，国际免疫学8：37—44(1996)证实静息的与针对可溶性回忆抗原最近激活的记忆T细胞对于来自B7家族成员的共同刺激信号存在不同的要求。也参见de Boer等，欧洲免疫学杂志，23：3120—5(1993)。
一些小组认为与CD28相比，CTLA-4是另一种或不同的受体/配体相互作用，甚至认为是由BB1抗体识别的第三种B-7复合物。例如，参见，Hathcock等，科学，262：905—7(1993)，Freeman等，科学，262：907—9(1993)，Freeman等，实验医学杂志：178：2185—92(1993)，Lenschow等，美国国家科学院院报，90：11054—8(1993)，Razi-Wolf等，美国国家科学院院报，90：11182—6(1993)，和Boussiotis等，美国国家科学院院报，90：11059—63(1993)。但是，参见Freeman等，免疫学杂志，161：2708—15(1998)，其中讨论的发现是，BB1抗体结合与CD74的细胞表面形式相同的分子，因此，BB1单克隆抗体结合与B7-1不同的蛋白质，且该表位也存在于B7-1蛋白质上。因此，这一观察结果需要本领域重新考虑在分析CD80表达和功能中使用BB1 mAb的研究。
始于1993年且在1995年达到高潮，研究者开始进一步描绘CTLA-4在T-细胞刺激中的作用。首先，通过使用抗CTLA-4的单克隆抗体，Walunas等，免疫学，1：405—13(1994)提供的证据是CTLA-4可作为T细胞激活的负调节物而起作用。随后，Waterhouse等，科学270：985—988(1995)证实CTLA-4缺陷型小鼠在其淋巴结和脾中积累带有上调激活标记的T细胞母细胞。当通过T细胞受体刺激时，该母细胞也渗入肝脏，心脏，肺和胰组织，且血清免疫球蛋白的量上升，其T细胞自发且强烈增生，然而，它们对由Fas受体的交联和由γ照射诱导的细胞死亡敏感。Waterhouse等推论CTLA-4充当T细胞活化的负调节物且对控制淋巴细胞内环境稳定是必不可少的。在相同文献的评论中，Allison和Krummel，科学，270：932—933(1995)认为Waterhouse等的工作指出了CTLA-4用于下调T-细胞反应性或在T-细胞活化和发育中具有抑制信号作用。Tivol等，免疫，3：541—7(1995)也生产了CTLA-4-缺陷性小鼠并证实该小鼠迅速形成具有多器官淋巴细胞渗入和组织破坏的淋巴增生性疾病，特别是具有严重心肌炎和胰腺炎。他们推论出CTLA-4在下调T细胞活化和维持免疫学内环境稳定中起关键作用。另外，Krummel和Allison，实验医学杂志：182：459—65(1995)进一步阐述了CD28和CTLA-4在T细胞刺激反应中具有相反的作用。他们产生了抗CTLA-4的抗体且使用高度纯化的T细胞研究了其在系统中结合CTLA-4的效力。在其报道中，他们表明在新鲜移出的T细胞上低水平B7-2的存在可部分抑制T细胞增生，且这种抑制受与CTLA-4相互作用的介导。CTLA-4与TCR和CD28的交联强烈抑制增生和T细胞分泌IL-2。最后，这些结果表明在测定对抗原的反应中，CD28和CTLA-4传递似乎由T细胞整合的相反信号。因此，他们得出的结论是T细胞抗原受体刺激的结果由CD28共同刺激信号，以及来自CTLA-4的抑制信号调节。也参见Krummel等，国际免疫学，8：519—23(1996)和美国专利号5811097及国际专利申请号WO97/20574。
已进行的各种其它实验进一步阐明了CTLA-4的上述功能。例如，Walunas等，实验医学杂志，183：2541—50(1996)，通过使用抗-CTLA-4抗体表明CTLA-4信号不能调节细胞存活或对IL-2的反应，但能抑制CD28依赖性IL-2生产。另外，Perrin等，免疫学杂志，157：1333—6(1996)证实抗-CTLA-4抗体在实验性变应反应性脑脊髓炎(EAE)中恶化该疾病且增大死亡率。疾病恶化与致脑炎的细胞因子TNF-α，IFN-γ和IL-2的生产增强相联系。因此，他们推断CTLA-4调节EAE中自身免疫反应的强度，减弱发炎性细胞因子生产和临床疾病症状。也参见Hurwitz等，神经免疫学杂志，73：57—62(1997)和Cepero等，实验医学杂志，188：199—204(1998)(在基因转移进鼠T-细胞模型后特异性消除CTLA-4表达的抗-CTLA-4发夹核酶)。
另外，Blair等，免疫学杂志，160：12—5(1998)评价了一组CTLA-4单克隆抗体(mAbs)对静息人CD4+T细胞的功能性影响。他们的结果证实一些CTLA-4 mAb可抑制静息CD4+细胞的增生反应且细胞周期从G0转变为G1期。CTLA-4的抑制效应在4小时内较明显，此时细胞表面CTLA-4的表达检测不到。然而其它CTLA-4 mAbs检测不到抑制效应，表明mAbs单与CTLA-结合不足以介导T细胞反应的下调。令人感兴趣的是，尽管IL-2生产关闭，但抑制性抗-CTLA-4 mAb允许诱导和表达细胞存活基因bcl-X(L)。与这一观察结果一致，细胞仍然存活且CTLA-4连接后检测不到细胞程序死亡。
与无反应性相联系，Perez等，免疫，6：411—7(1997)证实了经过阻断CTLA-4防止诱导T细胞无反应性且推断CD28或T细胞上的CTLA-4与B7分子的相互作用决定T细胞抗原识别的结果。另外，VanParijs等，实验医学杂志，186：1119—28(1997)检查了白细胞介素12和共同刺激物在体内T细胞无反应性中的作用并发现在无反应性诱导期间通过抑制CTLA-4接合，抑制T细胞增生，且不能启动完全的Th1分化。然而，在IL-12和抗CTLA-4抗体存在下与耐受原性抗原接触的T细胞不发生无反应性，且行为与遇到免疫原性抗原的T细胞相同。这些结果表明，有两种方法帮助诱导体内无反应性：CTLA-4结合导致阻断T细胞增生的能力，和缺乏原型性炎症细胞因子IL-12，它防止T细胞分化成Th1效应器细胞。IL-12与抗-CTLA-4抗体的组合足以将正常耐受原性刺激物转变为免疫原性刺激物。
与感染相联系时，McCoy等，实验医学杂志，186：183—7(1997)证实抗CTLA-4抗体极大地增强和加速对Nippostrongylusbrasiliensis的T细胞免疫反应，导致成虫数显著减少且较早地终止寄生虫卵的生产。也见Murphy等，免疫学杂志，161：4153—4160(1998)(Leishmania donovani)。
对于癌症，Kwon等，PNAS USA 94：8099—103(1997)建立了同源鼠前列腺癌模型并检查了2种不同的操作以通过增强的T细胞共同刺激诱导抗前列腺癌反应：(i)经过转导表达B7.1配体的前列腺癌细胞提供直接共同刺激和(ii)体内抗体介导的T细胞CTLA-4阻断，它防止T细胞下调。已证实体内抗体介导的CTLA-4阻断增强抗前列腺癌免疫反应。另外，Yang等，癌症研究，57：4036—41(1997)研究了CTLA-4功能的阻断是否在肿瘤生长的各个阶段导致抗肿瘤T细胞反应的增强。根据体外和体内结果，他们发现在携带肿瘤的个体中CTLA-4阻断增强了产生抗肿瘤T-细胞反应的能力，但在其模型中这种增强效应的表达局限于肿瘤生长的早期。另外，Hurwitz等，美国国家科学院院报，95：10067—71(1998)研究了T细胞介导的抗肿瘤反应的产生依赖于由主要组织相容性复合物/抗原与T细胞受体的结合以及CD28与B7的结合。某些肿瘤，如SM1乳腺癌对抗-CTLA-4免疫治疗无反应性。因此，通过使用CTLA-4阻断并结合由表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的SM1细胞组成的疫苗，观察到原发性SM1肿瘤消退，尽管单独使用的一种治疗无效。这种结合治疗导致对SM1的长期免疫并依赖于CD4(+)和CD8(+)T细胞。这些发现表明CTLA-4阻断在宿主产生的抗原呈递细胞水平上起作用。
对于糖尿病，Luhder等，实验医学杂志，187：427—32(1998)在疾病的不同阶段将抗-CTLA-4 mAb注射进糖尿病的TCR转基因小鼠模型中。他们发现首先激活潜在的致糖尿T细胞时CTLA-4的结合是关键性事件；如果发生结合，则胰岛发病，但仍有几个月是良性的。如果不结合，则胰岛炎更恶化，且很快接着发生糖尿病。
对于疫苗免疫，Horspool等，免疫学杂志，160：2706—14(1998)发现完整的抗-CTLA-4 mAb而不是Fab片段抑制对pCIA/β-gal的初级体液反应而不影响回忆反应，表明CTLA-4激活抑制Ab生产而不抑制T细胞引发。CD28和CTLA-4，CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的配体阻断揭示了不同的且无重叠的功能。在起始免疫时CD80的阻断完全取消了初级和次级Ab反应，而CD86阻断抑制初级而不是次级反应。同时阻断CD80＋CD86比单独阻断后一个对于抑制Ab反应具有较小的影响。经过共同注射表达B7的质粒增强共同刺激可增大CTL反应而不是Ab反应，且没有由Th1向Th2倾斜的证据。这些发现表明CD28，CTLA-4，CD80和CD86在核酸接种后的T细胞共同刺激中具有复杂的且不同的作用。
至于同种异体移植排斥，Markees等，临床研究杂志，101：2446—55(1998)发现在皮肤同种异体移植排斥的小鼠模型中，接受最初依赖于存在IFN-γ，CTLA-4和CD4(+)T细胞。在该方法中加入抗CTLA-4或抗-IFN-γ mAb与迅速移植排斥相联系，而抗IL-4 mAb无影响。
至于与CD28相关的CTLA-4的作用，Fallarino等，实验医学杂志，188：205—10(1998)产生了用表达抗原的肿瘤免疫的TCR转基因/重组酶激活基因-2缺陷型/CD28-野生型或CD28-缺陷型小鼠。来自两种类型小鼠的引发的T细胞产生细胞因子且与缺乏B7表达的刺激细胞反应而增生。然而。当CD28+/+T细胞的反应被B7-1的共同刺激增大时，CD28-/-T细胞的反应被强烈抑制。这种抑制可被抗B7-1或CTLA-4的单克隆抗体逆转。因此，缺乏CD28时，CTLA-4有效地抑制T细胞激活，这表明TCR介导的信号的拮抗作用足以解释CTLA-4的抑制效应。另外，Lin等，实验医学杂志，188：199—204(1998)研究了CD28缺陷型小鼠中心脏同种异体移植的排斥。H-2(g)心脏移植进同种异体野生型或CD28-缺陷型小鼠(H-2(b))。与野生型小鼠相比，在CD28-缺陷型中移植排斥延迟。用CTLA-4-免疫球蛋白(Ig)，或用抗B7-1加抗-B7-2 mAb处理野生型受体明显延长同种异体移植的存活。相反，用CTLA-4-Ig，抗-B7-1加抗B-7-2 mAb处理CD28-缺陷型小鼠或者阻断抗-CTLA-4 mAb诱导加速同种异体移植排斥。这种移植排斥速率的增加与更严重的单核细胞浸入和未处理的野生型和CTLA-4-Ig-或抗-CTLA-4mAb-处理的CD28-缺陷型小鼠供体心脏中IFN-γ和IL-6转录子水平的增加相关。因此，CTLA-4的负调控作用超过了通过配体竞争阻止CD28激活的潜力。即使在缺乏CD28时，CTLA-4在同种异体移植排斥的调节中起抑制作用。
另外，已研究了CTLA-4表达的进一步鉴定。例如，Alegre等，免疫学杂志，157：4762—70(1996)认为表面的CTLA-4被迅速内吞，这可解释在细胞表面一般检测到低水平的表达。他们推断CD28和IL-2在CTLA-4表达的上调中均起重要作用。另外，CTLA-4的细胞表面积累似乎主要由其迅速的内吞来调节。此外，Castan等，免疫学，90：265—71(1997)根据CTLA-4表达的原位免疫组织学分析表明CTLA-4阳性的胚中心T细胞对于免疫调节是重要的。
因此，鉴于CTLA-4似乎具有免疫反应性的广泛且关键的作用，需要产生可有效用于免疫治疗的抗CTLA-4的抗体。而且，需要产生可用于需重复施用抗体的慢性疾病的抗CTLA-4的抗体。
附图的简要描述
图1提供了根据本发明的一系列重链和κ轻链免疫球蛋白分子的核苷酸和氨基酸序列：4.1.1(图1A)，4.8.1(图1B)，4.14.3(图1C)，6.1.1(图1D)，3.1.1(图1E)，4.10.2(图1F)，2.1.3(图1G)，4.13.1(图1H)，11.2.1(图1I)，11.6.1(图1J)，11.7.1(图1K)，12.3.1.1(图1L)和12.9.1.1(图1M)。
图2提供了来自克隆4.1.1,4.8.1,4.14.3,6.1.1,3.1.1,4.10.2,4.13.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1预测的重链氨基酸序列与种系DP-50(3-33)氨基酸序列的序列比较。DP-50种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还显示了抗体CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图3提供了克隆2.1.3预测的重链氨基酸序列与种系DP-65(4-31)氨基酸序列之间的序列对比。DP-65种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图4提供了克隆4.1.1,4.8.1,4.14.3,6.1.1,4.10.2和4.13.1的κ轻链氨基酸序列与种系A27氨基酸序列之间的序列对比。A27种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。该图还以下划线显示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。克隆4.8.1，4.14.3和6.1.1的CDR1中明显的缺失以“0”表示。
图5提供了克隆3.1.1,11.2.1,11.6.1和11.7.1的预期κ轻链氨基酸序列与种系012氨基酸序列之间的序列对比。012种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图6提供了克隆2.1.3预测的κ轻链氨基酸序列和种系A10/A26氨基酸序列之间的序列对比。A10/A26种系序列与克隆中的序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图7提供了克隆12.3.1的预测κ轻链氨基酸序列与种系A17氨基酸序列之间的序列对比。A17种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图8提供了克隆12.9.1的预测的κ轻链氨基酸序列与种系A3/A19氨基酸序列之间的序列对比。A3/A19种系序列与克隆中的序列之间的差异以黑体字表示。该图中还以下划线表示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图9提供了通过对抗体的重链和轻链进行直接蛋白质测序产生的N-端氨基酸序列的总结。
图10提供了根据本发明的某些抗体的某些其它鉴定信息。在图10A中，概括了与克隆3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.14.3和6.1.1相关的数据。提供的数据涉及浓度，等电聚焦(IEF)，SDS-PAGE，大小排阻色谱，液体色谱/质谱(LCMS)，质谱(MALDI)，轻链N-端序列。在图10B中提供了与IEF相关的其它详细信息；10C中提供了与SDS-PAGE相关的数据；10D中提供了4.1.1抗体的SEC。
图11显示了使用抗-CD80-PE和抗-CD86-PEmAb在Raji细胞上表达B7-1和B7-2。
图12显示了用抗-CTLA-4阻断抗体(BNI3，4.1.1，4.8.1和6.1.1)诱导的T细胞母细胞/Raji测定中IL-2生产的浓度依赖性增强。
图13显示了用抗-CTLA-4阻断抗体(BNI3，4.1.1，4.8.1和6.1.1)诱导的T细胞母细胞/Raji试验中IFN-γ生产的浓度依赖性增强(相同供体T细胞)。
图14显示了在T细胞母细胞/Raji测定中以抗-CTLA-4阻断抗体诱导的来自6个供体的T细胞中IL-2生产的平均增强值。
图15显示了在T细胞母细胞/Raji测定中抗-CTLA-4阻断抗体诱导的来自6个供体的T细胞中IFN-γ生产的平均增强值。
图16显示了用SEA刺激后在72小时时测量的以抗-CTLA-4阻断mAbs诱导的来自5个供体的hPBMC中IL-2生产的增强。
图17显示了用SEA刺激后在72和96小时时测量的以抗-CTLA-4阻断mAbs诱导的来自3个供体的全血中IL-2生产的增强。
图18显示了在鼠纤维肉瘤肿瘤模型中用抗鼠CTLA-4抗体抑制肿瘤生长。
图19显示了在72小时T母细胞/Raji和超级抗原(来自6个供体的全血和外周血单核细胞)测定中以本发明的抗CTLA4抗体(4.1.1和11.2.1)诱导的IL-2生产的增强。
图20显示了在72小时T母细胞/Raji测定中以本发明的抗-CTLA4抗体(4.1.1和11.2.1)诱导的IL-2生产的剂量依赖性增强。
图21显示了在用100ng/ml超抗原刺激的72小时超抗原全血测定中以本发明的抗-CTLA4抗体(4.1.1和11.2.1)诱导的IL-2生产的剂量依赖性增强。
图22提供了在抗-CTLA-4抗体链后一系列增加的核苷酸和氨基酸序列：全长4.1.1重链(cDNA22(a)，基因组22(b)，和氨基酸22(c))，全长无糖基化的4.1.1重链(cDNA 22(d)和氨基酸22(e))，4.1.1轻链(cDNA 22(f)和氨基酸22(g))，全长4.8.1重链(cDNA 22(h)和氨基酸22(i))，4.8.1轻链(cDNA 22(j)和氨基酸22(K))，全长6.1.1重链(cDNA 22(1)和氨基酸22(m))，6.1.1轻链(cDNA 22(n)和氨基酸22(o))，全长11.2.1重链(cDNA 22(p)和氨基酸22(q))，以及11.2.1轻链(cDNA 22(r)和氨基酸22(s))。
本发明概述
根据本发明的第一个方面，提供了能结合CTLA-4的抗体，它包含的重链可变区的氨基酸序列包含由人VH3-33家族基因编码的从FR1序列内到FR3序列的连续氨基酸序列且在CDR1序列，CDR2序列或图2所示的构架序列中包含至少一个氨基酸取代。在优选的实施方案中，该氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，和SEQ ID NO：70的序列。在另一优选的实施方案中，该抗体还包含轻链可变区氨基酸序列，该序列包含选自SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：71。
根据本发明的第二个方面，提供了一种抗体，它包含含有SEQ IDNO：1的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO：14的轻链可变氨基酸序列。
根据本发明的第三个方面，提供了一种抗体，它包含含有SEQ IDNO：2的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO：15的轻链可变氨基酸序列。
根据本发明的第四个方面，提供了一种抗体，它包含含有SEQ IDNO：4的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO：17的轻链可变氨基酸序列。
根据本发明的第五个方面，提供了一种分离的人单克隆抗体，它能结合CTLA-4。在优选的实施方案中，该抗体能与选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1的抗体竞争结合CTLA-4。在另一优选的实施方案中，该抗体与选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1的抗体对CTLA-4具有基本上相似的结合特异性。在另一优选的实施方案中，该抗体选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1。在另一优选的实施方案中，该抗体与来自低等哺乳动物种类，优选包括小鼠，大鼠和兔的低等哺乳动物种类且更优选小鼠和大鼠的CTLA-4无交叉反应性。在另一优选的实施方案中，该抗体与来自灵长类，优选包含Cynomolgous和猕猴的灵长类的CTLA-4交叉反应。在另一优选的实施方案中，该抗体对CTLA-4具有比CD28，B7-2，CD44和hIgG1高大约100∶1且优选大约500∶1或更高的选择性。在另一优选的实施方案中，该抗体的结合亲和性是大约10-9M或优选大约10-10M或更大。在另一优选的实施方案中，该抗体以低于大约100nM且优选低于大约0.38nM的IC50抑制CTLA-4与B7-2之间的结合。在另一优选的实施方案中，该抗体以低于大约100nM或更大且优选低于大约0.50nM的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合。在另一优选的实施方案中，在T细胞母细胞/Raji测定中该抗体使IL-2生产增加到大约500pg/ml或更高且优选增加到大约3846pg/ml或更高。在另一优选的实施方案中，在T细胞母细胞/Raji测定中该抗体使IFN-γ生产增加到大约500pg/ml或更高且优选大约1233pg/ml或更高。在另一优选的实施方案中，在hPBMC或全血超抗原测定中该抗体使IL-2生产增加到大约500pg/ml或更高。在另一优选的实施方案中，该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中使IL-2生产增加到大约500pg/ml或优选1500pg/ml或更高或相对于对照高大约30％或优选高50％。
根据本发明的第六个方面，提供了一种人源化抗体，它与选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1的抗体具有基本上相似的对CTLA-4的结合特异性。在优选的实施方案中，该抗体与来自低等哺乳动物种类，优选包括小鼠，大鼠和兔的低等哺动物种类且更优选小鼠和大鼠的CTLA-4无交叉反应性。在另一优选的实施方案中，该抗体与来自灵长类，优选包括cynomolgous和猕猴的灵长类的CTLA-4交叉反应。在另一优选的实施方案中，该抗体对CTLA-4的选择性比CD28，B7-2，CD44和hIgG1高大约100∶1且优选大约500∶1或更高。在另一优选的实施方案中，该抗体的结合亲和性是大约10-9M或更大且优选大约10-10M或更大。在另一优选的实施方案中，该抗体以低于大约100nM且优选低于大约0.38nM的IC50值抑制CTLA-4和B7-2之间的结合。在另一优选的实施方案中，该抗体以低于大约100nM或更大且优选低于大约0.50nM的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合。在另一优选的实施方案中，该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IL-2生产增加到大约500pg/ml或更大且优选增加到大约3846pg/ml或更大。在另一优选的实施方案中，该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IFN-γ生产增加到大约500pg/ml或更高且优选增加到大约1233pg/ml或更高。在另一优选的实施方案中，该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中诱导的IL-2生产为大约500pg/ml或更高。在另一优选的实施方案中，该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中使IL-2生产增加到大约500pg/ml或优选1500pg/ml或更高或相对于对照高大约30％或优选50％。
根据本发明的第7个方面，提供了结合CTLA-4的抗体，它包含在构架上与CDR1，CDR2和CDR3序列有效连接的含有由人VH3-33基因家族编码的人FR1，FR2和FR3序列的重链氨基酸序列，其中CDR1，CDR2和CDR3序列独立地选自图2所示的CDR1，CDR2和CDR3。在优选的实施方案中，权利要求32的抗体进一步包含对图2所示的FR1，FR2和FR3序列的任意体细胞突变。
根据本发明的第8个方面，提供了结合CTLA-4的抗体，它包含在构架上与CDR1，CDR2和CDR3序列有效连接的含有由人VH3-33基因家族编码的人FR1，FR2和FR3序列的重链氨基酸序列，该抗体具有下列特征：对CTLA-4具有大约10-9或更高的结合亲和性，以大约100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合；以大约100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4与B7-2之间的结合；在人T细胞测定中使细胞因子生产增加到500pg/ml或更高。
根据本发明的第9个方面，提供了结合CTLA-4的抗体，它包含在构架上与CDR1，CDR2和CDR3序列有效连接的含有FR1，FR2和FR3序列的重链氨基酸序列，其中CDR1，CDR2和CDR3独立地选自图2和3所示的CDR1，CDR2和CDR3序列，该抗体具有下列特征：对CTLA-4具有大约10-9或更高的结合亲和性；以大约100nM或更低的IC50抑制CTLA-4和B7-1之间的结合；以大约100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4和B7-2之间的结合；在人T细胞测定中使细胞因子生产增加到500pg/ml或更高。
根据本发明的第10个方面，提供了一种测定T细胞刺激的细胞培养系统，包括将人T细胞母细胞的培养物与Raji细胞系共同培养。在优选的实施方案中，在与Raji细胞系培养前洗涤T细胞母细胞。
根据本发明的第11个方面，提供了一种测量T细胞刺激的测定法，包括：提供人T细胞母细胞和Raji细胞系的培养物；将该培养物与一种试剂接触；和测量由该培养物产生的细胞因子。
根据本发明的第12个方面，提供了筛选T细胞刺激功能部分的功能测定法，包括：提供人T细胞母细胞和Raji细胞系的培养物；将该培养物与该部分接触并评估由该培养物产生的细胞因子。
根据本发明的第13个方面，提供了一种用于CTLA-4抑制功能的T细胞刺激测定法，包括将含有人T细胞母细胞和Raji细胞系的培养物与一种试剂接触并评估该培养物的细胞因子生产。
根据本发明的第14个方面，提供了一种筛选试剂T细胞刺激活性的方法，包括将该试剂与含有人T细胞母细胞和Raji细胞系的细胞培养物接触；并评估该培养物的细胞因子生产。
在本发明的第10到第14方面的每一个方面中，在优选的实施方案中，在用Raji细胞系培养前洗涤T细胞母细胞。在另一优选的实施方案中，该细胞因子是IL-2或IFN-γ。在优选的实施方案中，在从培养物分离的上清中测量细胞因子生产。在优选的实施方案中，该试剂是一种抗体且优选与CTLA-4结合。
根据本发明的第15个方面，提供了一种测定T细胞刺激的测定法，包括：提供用葡萄球菌肠毒素A刺激的人外周血单核细胞的群体或人全血；将该培养物与一种试剂接触并测量由该细胞群体产生的细胞因子。
根据本发明的第16个方面，提供了一种筛选T细胞刺激功能部分的功能测定法，包括：提供人外周血单核细胞的群体或用葡萄球菌肠毒素A刺激的人全血；将该培养物与该部分接触，并评价该细胞群体的细胞因子生产。
根据本发明的第17个方面，提供了CTLA-4抑制功能的T细胞刺激测定法，包括将人外周血单核细胞群体或用葡萄球菌肠毒素A刺激的人全血与一种试剂接触并评估该细胞群体的细胞因子生产。
根据本发明的第18个方面，提供了一种筛选一种试剂的T细胞刺激活性的方法，包括：将该试剂与人外周血单核细胞的群体或用葡萄球菌肠毒素A刺激的人全血接触；并评估该细胞群体的细胞因子生产。
在本发明的第15到第18方面中的每一个方面，在优选的实施方案中，细胞因子是IL-2。在另一优选的实施方案中，在从该培养物分离的上清中测量细胞因子生产。在一个优选的实施方案中，该试剂是抗体且优选与CTLA-4结合。
优选实施方案的详细描述
根据本发明，提供了抗人CTLA-4的全人源单克隆抗体。提供了包含重链和轻链免疫球蛋白分子的编码核苷酸序列和氨基酸序列，特别是相应于从FR1和CDR1到CDR3和FR4的连续重链和轻链序列。还提供了具有相似结合特性的抗体和与本文公开的抗体具有相似功能的抗体(或其它拮抗剂)。还提供了表达该免疫球蛋白分子和单克隆抗体的杂交瘤。
定义
除非本文另有限定，本发明中所用的科技术语具有本领域的普通技术人员通常理解的意义。而且，除非说明书另有需要，单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。一般来说，用于本文的命名法和本文所述的技术，细胞和组织培养，分子生物学，和蛋白质及寡聚或多聚核苷酸化学和杂交是众所周知的且是本领域中常用的。重组DNA，寡核苷酸合成和组织培养及转化(例如，电穿孔，脂转染)均使用标准技术。酶反应和纯化技术按厂家说明书进行或按本领域常规完成或按本文所述进行。上述技术和方法一般按本领域熟知的常规方法进行且按本说明书中引用和讨论的各种普通和更专业的参考文献中所述进行。例如，参见，Sambrook等，分子克隆：实验室手册(第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(1989))，本文引用以供参考。用于本文的命名法，本文的实验方法和技术，及本文所述的分析化学，合成有机化学，和药物及制药化学是熟知的且是本领域中常用的。化学合成，化学分析，药物制备，配制和传递及病人的治疗均使用标准技术。
用于本说明书时，下面的术语，除非另有说明，应理解为具有如下含义：
本文使用的术语“分离的多核苷酸”是指基因组，cDNA或合成来源的多核苷酸或其某种组合，相对于其来源，该“分离的多核苷酸”(1)与天然情况下发现该“分离的多核苷酸”的全部或部分多核苷酸不相联，(2)与天然情况下不与其相连的多核苷酸有效连接，或(3)天然情况下不以更大序列的一部分出现。
本文提及的术语“分离的蛋白质”指cDNA，重组RNA或合成来源的蛋白质或其某种组合，相对于其来源，或衍生来源，该“分离的蛋白质”(1)与天然发现的蛋白质不相联，(2)游离于相同来源的其它蛋白质，例如，游离于鼠蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在天然状况下不出现。
本文使用的术语“多肽”作为泛指术语是指天然蛋白质，片段，或多肽序列的类似物。因此，天然蛋白质，片段和类似物是多肽类中的种。根据本发明优选的多肽包含图1所示的人重链免疫球蛋白分子和人κ轻链免疫球蛋白分子，以及由含有重链免疫球蛋白分子与诸如κ轻链免疫球蛋白分子的轻链免疫球蛋白分子组合，和相反组合形成的抗体分子，以及其片段和类似物。
本文使用的术语“天然存在的”用于某物质时是指该物质可在自然界找到的事实。例如，存在于生物(包括病毒)中的，可从天然来源分离出的且未经实验人员或其它人员有目的修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
本文使用的术语“有效连接”是指所述成份的位置关系使其以目的方式发挥功能。与编码序列“有效连接的”调控序列是指其连接方式使得在与调控序列相适应的条件下实现编码序列的表达。
本文所用的术语“调控序列”指对实现与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。该调控序列的特性依赖于宿主生物而有所区别；在原核生物中，该调控序列一般包括启动子，核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，一般来说，该调控序列包括启动子和转录终止序列。术语“调控序列”最少打算包括其存在对表达和加工是必需的所有成份，且也可包括其存在是有益的其它成份，例如，先导序列和融合配偶体序列。
本文提及的术语“多核苷酸”指至少10个碱基长的核苷酸的多聚体形式，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。
本文提及的术语“寡核苷酸”包括以天然存在和非天然存在的寡核苷酸键连接起来的天然存在的和修饰的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的亚群，一般包括200个碱基长或更短。优选的寡核苷酸是10至60个碱基长，更优选12,13,14,15,16,17,18,19或20至40个碱基长。寡核苷酸通常是单链的，例如，用于探针；但寡核苷酸也可以是双链的，例如，用于构建基因突变体。本发明的寡核苷酸可以是有义或反义的寡核苷酸。
本文提及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代糖基的核苷酸及类似物。本文提及的术语“寡核苷酸键”包括诸如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯，phosphoroanilothioate，phoshoraniladate，酰胺磷酸等的寡核苷酸键。例如，参见，LaPlanche等，核酸研究，14：9081(1986)；Stec等，美国化学协会杂志，106：6077(1984)；Stein等，核酸研究，16：3209(1988)；Zon等，抗癌药设计，6：539(1991)；Zon等，寡核苷酸和类似物：实践探讨，第87—108页(F.Eckstein编辑，牛津大学出版社，英国牛津(1991)；Stec等，美国专利号5,151,510；Uhlmann和Peyman化学回顾90：543(1990)，本文引用其公开内容以供参考。如果需要，寡核苷酸可包括检测标记。
本文提及的术语“选择性杂交”指可检测地且特异性地结合。根据本发明的多核苷酸，寡核苷酸及其片段在使与非特异性核酸可检测的结合的可见量最小化的杂交和洗涤条件下与核酸链选择性地杂交。高度严格条件可用于实现本领域已知的和本文所讨论的选择性杂交条件。一般来说，本发明的多核苷酸，寡核苷酸及其片段与目的核酸序列之间的核酸序列同源性至少为80％，更典型地优选至少85％，90％，95％，99％和100％的逐渐增加的同源性。两个氨基酸序列如果其序列之间具有部分或完全的相同性，则它们是同源的。例如，85％的同源性是指当两序列进行对比达到最大匹配时85％的氨基酸是相同的。缺口(在匹配的任意两个序列之间)允许达到最大匹配；缺口长度优选5个或更少，更优选2个或更少。择一且优选的是，当本文使用该术语时，如果使用具有突变数据矩阵和6或更大的缺口罚分的程序ALIGN它们具有至少5分的对比值(标准偏差单位)时，2个蛋白质序列(或其衍生的至少30个氨基酸长的多肽序列)是同源的。参见，Dayhoff，M.O.，蛋白质序列和结构图表，第101—110页(第5卷，国家生物医学研究基金(1972))及该卷的增刊，第1—10页。两个序列或其部分如果使用ALIGN程序最佳对比时其氨基酸大于或等于50％的相同性时是更优选的具有同源性。本文使用的术语“相应于”是指一个多核苷酸序列与对照多核苷酸序列的全部或部分是同源的(即，是相同的，在进化上不严格相关)，或指一个多肽序与一个对照多肽序列是相同的。相反，本文所用的术语“互补于”是指互补序列与对照多核苷酸序列的全部或部分是同源的。例如，核苷酸序列“TATAC”相应于对照序列“TATAC”且互补于对照序列“GTATA”。
下面的术语用于描述2个或多个核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系：“对照序列”，“比较窗口”，“序列相同性”，“序列相同性百分数”和“基本相同”。“对照序列”是用作序列比较基础的确定序列；对照序列可以是更大序列的亚群，例如，在序列表中给出的全长cDNA或基因序列的片段或可包含完整cDNA或基因序列。一般来说，对照序列是至少18个核苷酸或6个氨基酸长，通常是至少24个核苷酸或8个氨基酸长，且通常是至少48个核苷酸或16个氨基酸长。由于2个多核苷酸或氨基酸序列分别可能(1)含有两分子之间相似的序列(即，全部多核苷酸或氨基酸序列的一部分)，和(2)还含有2个多核苷酸或氨基酸序列之间有差异的序列，因此，2个(或多个)分子之间的序列比较一般经过在一个“比较窗口”内比较两个分子的序列以鉴定和比较局部区域的序列相似性来进行。本文所用的“比较窗口”指至少18个连续的核苷酸位置或6个氨基酸的概念性片段，其中一个多核苷酸序列或氨基酸序列可与至少18个连续的多核苷酸或6个氨基酸序列的对照序列进行比较且其中在比较窗口中的多核苷酸序列的位置与对照序列(不包含添加或缺失)相比可含有20％或更少的添加，缺失，取代等(即，缺口)以实现两序列的最佳对比。用于对比比较窗口的序列最佳对比可用Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，分子生物学杂志，48：443(1970)的同源性对比算法，Pearson和Lipman，美国国家科学院院报，85：2444(1988)的相似性检索方法，这些算法的计算机补充(Wisconsin遗传软件包释放7.0中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA(遗传计算机集团公司，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，Geneworks或MacVector软件包)，或经过检查并选择由各种方法产生的最佳序列比较法来进行。
术语“序列相同性”指在比较窗中两个多核苷酸或氨基酸序列是相同的(即，根据核苷酸与核苷酸或残基与残基)。术语“序列相同性百分数”是经过比较在比较窗口中的2个最佳对比序列，测定在两序列中均存在的相同核酸碱基(即，A，T，C，G，U或I)或残基的位置数以获得匹配位置的数目，用匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)并将结果乘以100得到序列相同性的百分数来计算的。本文所用的术语“基本上相同”指多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中，多核苷酸或氨基酸包括与对照序列相比在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口中，通常是在至少24—48个核苷酸(8—16个氨基酸)位置的窗口中有至少85％序列相同性，优选至少90—95％序列相同性，更通常是至少99％序列相同性的序列，其中序列相同性百分数经过比较在比较窗口中的对照序列与该序列来计算，该序列在占对照序列总共20％或较少的序列中可包括缺失或添加。对照序列可以是更大序列的亚序列群。
本文所用的20个常规氨基酸及其缩写按常规用法。参见，免疫学—合成(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren，编辑，SinauerAssociates，Sunderland，Mass.(1991))，本文引用以供参考。20个常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸，如α-，α-双取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其它非常规氨基酸也可以是本发明多肽的合成组份。非常规氨基酸的例子包括：4-羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰赖氨酸，O-磷酰丝氨酸，N-乙酰丝氨酸，N-甲酰甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，σ-N-甲基精氨酸和其它相似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文使用的多肽标记中，按照标准用法和常规左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。
同样，除非另有所说，单链多核苷酸序列的左手端是5′端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5′方向。新生RNA转录子5′向3′的添加方向称为转录方向；与RNA具有相同序列的DNA链上的序列区且其5′端位于RNA转录子的5′端称为“上游序列”；与RNA具有相同序列的DNA链上的序列区且其3′端位于RNA转录子的3′端称为“下游序列”。
应用于多肽时，术语“基本相同”指使用诸如程序GAP或带错误缺口权重的BESTFIT进行最佳序列对比时两个肽序列具有至少80％的序列相同性，优选至少90％序列相同性，更优选至少95％序列相同性，且最优选至少99％的序列相同性。优选的是，不相同的残基位置区别在于有保守氨基酸取代。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基互换。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的氨基酸组是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸基团是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸基团是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所述，本发明预期包含在抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中进行轻微的变化，只要该变化能使氨基酸序列保留至少75％，更优选至少80％,90％,95％且更优选99％。特别是包括保守氨基酸取代。保守取代是在其侧链相关的氨基酸家族中进行的取代。遗传编码的氨基酸一般分成下列家族：(1)酸性二谷氨酸，天冬氨酸；(2)碱性二赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性二丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不带电极性二甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。更优选的家族是：丝氨酸和苏氨酸是脂肪族羟基家族；天冬酰胺和谷安是含酰胺家族；丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸是脂肪族；苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸是芳香族。例如，预期用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸，用谷氨酸取代灭冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸是合理的，用结构相关的氨基酸对氨基酸的相似取代对所得分子的结合或特性不会有显著的影响，特别是如果该取代不涉及构架位点内的氨基酸时更是如此。经过测定多肽衍生物的特定活性可较容易地测定氨基酸改变是否会产生功能性肽。本文详细描述了该测定法。本领域的普通技术人员可较容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。优选的片段或类似物的氨基和羧基端靠近功能域的边界。经过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公众的或专卖的序列数据库可鉴定结构和功能域。优选的是，使用计算机比较方法鉴定在已知结构和/或功能的其它蛋白质中出现的序列基序或预期的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等，科学，253：164(1991)。因此，上述例子证实本领域的技术人员可认识序列基序和结构构象以用于限定根据本发明的结构和功能域。
优选的氨基酸取代是那些(1)降低对蛋白水解敏感性；(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和性，(4)改变结合亲和性和(4)赋予或修饰该类似物的理化或功能特性的取代。类似物可包括非天然存在的肽序列的各种序列突变体。例如，可在天然存在的序列上(优选在形成分子内接触的结构域外的肽部分)进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代应基本上不改变亲本序列的结构特征(例如，取代氨基酸应不会断裂在亲本序列中存在的螺旋、或破坏作为亲本序列特征的其它类型的二级结构)。本领域认识到的肽二级和三级结构的例子在下列文献中描述：蛋白质，结构和分子原理(Creighton编辑，W.H.Freeman和Company，纽约(1984))；蛋白质结构引言(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing，纽约(1991))；和Thornton等，自然354：105(1991)，分别作为参考文献在本文中引用。
本文使用的术语“多肽片段”指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但其中剩下的氨基酸序列与从，例如，全长cDNA序列推出的天然存在的序列中的相应位置相同。片段一般是至少5,6,8，或10个氨基酸长，优选至少14个氨基酸长，更优选至少20个氨基酸长，通长至少50个氨基酸长，且甚至更优选至少70个氨基酸长。本文所用的术语“类似物”指由至少25个氨基酸的片段组成的多肽，该氨基酸与推断的氨基酸序列的一部分基本上相同且其具有至少一种下列特性：(1)在合适的结合条件下与CTLA-4特异性结合，(2)阻断CTLA-4与其它受体结合的能力，或(3)在体外或体内抑制表达CTLA-4的细胞生长的能力。一般来说，多肽类似物相对于天然存在的序列包括保守的氨基酸取代(或添加或缺失)。该类似物一般是至少20个氨基酸长，优选至少50个氨基酸长或更长且通常与全长的天然存在的多肽一样长。
肽类似物通常用于制药工业，作为与模板肽具有类似特征的非肽药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”或“模拟肽”。Fauchere，药物研究进展杂志，15：29(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；和Evans等，药物化学杂志，30：1229(1987)，本文作为参考文献引用。该化合物通常借助于计算机化的分子模型来形成。结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可用于产生相当的治疗或预防效果。一般来说，肽模拟物在结构上相似于模板肽(即，具有生化特征或药物学活性的肽)，如人抗体，但有一个或多个肽键以本领域熟知的方法任选被由下列基团组成的键取代：-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(顺式和反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-，和CH2SO-。共有序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸系统取代(例如，D-赖氨酸代替C-赖氨酸)可用于产生更多稳定的肽。另外，含有共有序列或基本上相同的共有序列变异的约束肽可用本领域已知的方法产生(Rizo和Gierasch，生化年鉴，61：387(1992)，本文引用以供参考)；例如，经过增加能形成分子内二硫键以环化多肽的内部半胱氨酸残基。
“抗体”或“抗体肽”指完整抗体或与完整抗体竞争特异性结合的其结合片段。结合片段以重组DNA技术，或经过酶或化学裂解完整抗体产生。结合片段包括Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，和单链抗体。非“双特异性”或“双功能”抗体的抗体理解为其各个结合位点相同。当过量抗体使结合反受体的受体量减少至少大约20％,40％,60％或80％且更通常是大于大约85％(在体外竞争结合试验中测量)时，抗体显著抑制受体与反受体的附着。
术语“表位”包括能特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何蛋白决定族。表位决定族通常由分子的具有化学活性的表面集合，如氨基酸或糖侧链组成并通常具有特定的三维结构特征，以及特定的带电特性。当解离常数为≤1μM，优选≤100nM且最优选≤10nM时，认为抗体特异性地结合抗原。
本文使用的术语“试剂”指化合物，化合物的混合物，生物学大分子，或从生物学材料制备的提取物。
本文使用的术语“标记”或“标记的”指掺入可检测的标记，例如，经过掺入放射性标记的氨基酸或将可用标记的抗生物素蛋白检测的生物素部分附着在多肽上(例如，可用光学或比色法检测的含荧光标记或酶活性的链霉抗生物素蛋白)。在某些情况下，标记或标记物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的且均可使用。多肽标记物的例子包括但不限于：放射性同位素或放射性核素(例如，3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I)，荧光标记(例如，FITC，罗丹明，镧磷光体)，酶标记(例如，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶)，化学发光物，生物素基团，被第二报道基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，第二抗体的结合位点，金属结合结构域，表位标记)。在有些实施方案中，标记以各种长度的间隔臂附着以减小潜在的空间障碍。
本文使用的术语“药用试剂或药品”指当适当施用给患者时能诱导所需治疗效果的化合物或组合物。本文的其它化学术语按本领域的常规用法使用，例如见，McGraw-Hill化学术语词典(Parker，S.Ed.，McGraw-Hill，San Francisco(1985)，本文作为参考文献引用)。
本文使用的术语“抗肿瘤剂”指具有抑制人体肿瘤，特别是恶性(癌)病变，如癌，肉瘤，淋巴瘤，或白血病的发育或进展的功能特性。抑制癌转移通常是抗肿瘤剂的一个特性。
本文使用的“基本上纯”是指物质种类以占优势的种类存在(即，按摩尔计算，它比组合物中的任何其它种类更丰富)，且优选基本上纯化的馏份是一种组合物，其中该物质种类占所存在的所有大分子种类的至少大约50％(按摩尔算)。一般来说，基本上纯的组份含有在组合物中存在的所有大分子种类的至少大约80％，更优选超过大约85％,90％,95％和99％。更优选的是，该物质种类纯化成基本上匀质(在组合物中以常规检测方法检测不到污染物种类)，其中该组合物基本上由单一大分子种类组成。
术语患者包括人和兽医受试者。抗体结构
基本抗体结构单位已知包含四聚体。各四聚体由2个相同的多肽链对组成，每对具有一个“轻链”(大约25kDa)和一个“重链”(大约50—70kDa)。各链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的大约100到110或更多氨基酸的可变区。各链的羧基末端部分限定了一个主要负责效应器功能的恒定区。人轻链分类的κ和λ轻链。重链分类为μ，δ，γ，α或ε，且分别将抗体同种型限定为IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区以大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，该重链也包括大约10多个氨基酸的“D”区。一般参见，基础免疫学，第7章(Paul，W.编辑，第二版，Raven出版社，纽约(1989))(将其全文作为参考文献引用用于所有目的)。各轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。
因此，完整的IgG抗体具有2个结合位点。除了双功能或双特异性抗体外，2个结合位点是相同的。
所有这些链显示出相同的相当保守的构架区(FR)的一般结构，该构架区由3个外部可变区，也称为互补性决定区域CDR连接。每对中两条链的CDR经构架区排列，能与特异性表位结合。从N端到C端，轻链和重链均包含结构域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。各结构域中氨基酸的排列按Kabet，免疫学目的的蛋白质的序列，(国家卫生组织，Bethesda，Md.(1987和1991))或Chothia & Lesk，分子生物学杂志，196：901—917(1987)；Chothia等，自然，342：878—883(1989)的限定。
双特异性或双功能抗体是一种人工杂交抗体，它具有两种不同的重/轻链对和2个不同的结合位点。双特异性抗体可经过各种方法生产，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。例如，参见Songsivilai和Lachmann，临床实验免疫学，79：315—321(1990)，Kostelny等，免疫学杂志，148：1547—1553(1992)。此外，双特异性抗体可形成“diabodies”(Holliger等，“‘Diabodies’：小的双价和双特异性抗体片段”，PNAS USA，90：6444—6448(1993))或“Janusins”(Traunecker等，“在HIV感染的细胞上双特异性单链分子(Janusins)靶向细胞毒性淋巴细胞”，EMBO J10：3655—3659(1991)和Traunecker等，“Janusin：双特异性试剂的新分子设计”，国际癌症杂志增刊7：51—52(1992))。双特异性抗体的生产与常规抗体的生产相比是劳动强度更高的过程，且双特异性抗体的产量和纯度一般更低。双特异性抗体不以具有单个结合位点的片段的形式(例如，Fab，Fab′和Fv)存在。
人抗体和抗体的人源化
人抗体避免了与具有鼠或大鼠可变和/或恒定区的抗体相关的某些问题。存在该鼠或大鼠来源的蛋白质可能导致该抗体的迅速清除或可导致患者产生抗该抗体的免疫反应。为了避免使用鼠或大鼠产生的抗体，有人假定可通过将人抗体功能引入啮齿类使得啮齿类可产生具有全人序列的抗体，以此形成人源化抗体或产生全人抗体。
人抗体
在YAC中克隆和重建兆碱基大小的人基因座并将它们导入小鼠种系的能力提供了解释极大型或粗略定位的基因座的功能成份以及产生有用的人类疾病模型的有力方法。而且，将该技术用于以其人类等价物取代小鼠基因座可提供对发育期间人基因产物表达和调节，其与其它系统的联系和其涉及的疾病诱导和进展的独特认识。
该策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座导入内源性Ig基因已被灭活的小鼠提供了研究抗体的程序化表达和装配的机制以及其在B-细胞发育中的作用的机会。而且，该策略可提供生产全人单克隆抗体(Mab)的理想来源，它是实现人类疾病的抗体疗法的重要里程碑。预期全人抗体可使体内对小鼠或小鼠产生的Mab的免疫原性和过敏反应减到最小并因此增加了施用抗体的效力和安全性。预期使用全人抗体在需要重复抗体用药的慢性和复发性人类疾病，如炎症，自身免疫和癌症的治疗中提供显著的优势。
针对这一目的的一种方案是用人Ig基因座的大片段改造小鼠抗体生产缺陷型的小鼠品系预期该小鼠在缺乏小鼠抗体的情况下会产生大型人抗体库。大量人Ig片段可保存大量的可变基因多样性以及抗体生产和表达的适当调节。经过研究小鼠抗体多样化和选择及对人蛋白质缺乏免疫学耐受性的机制，在这些小鼠品系中再生的人抗体库应产生针对包括人抗原的任何目的抗原的高亲和性抗体。使用杂交瘤技术，容易产生和筛选具有所需特异性的抗原特异性人Mab。
我们于1994年公开的所生产的首例XenoMouseTM品系证实了这种一般策略。见Green等，自然遗传学，7：13—21(1994)。用含核心可变和恒定区序列的分别含人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系表形片段的酵母人工染色体(YAC)改造XenoMouseTM品系，如上所述。含人Ig的YAC被证实与小鼠抗体重排和表达的系统相容且能取代灭活的小鼠Ig基因。其诱导B-细胞形成的能力，产生类似成人的全人抗体库的能力和产生抗原特异性人Mab的能力证实了这一点。这些结果也表明导入更大部分的含更大数目的V基因，其它调控元件和人Ig恒定区的人Ig基因座可基本上重演针对感染和免疫的特征性人体液反应的全部组成成份。最近，Green等的工作通过导入兆碱基大小的分别含人重链基因座和κ轻链基因座的种系表形YAC片段导入超过大约80％的人抗体库以产生XenoMouseTM小鼠。参见，Mendez等，自然遗传学，15：146—156(1997)，Green和Jakobovits，实验医学杂志，188：483—495(1998)，和1996年12月3日申请的美国专利申请系列号08/759,620，本文分别作为参考文献引用。
在下列文献中进一步讨论和描绘了该方案：1990年1月12日申请的美国专利申请系列号07/466,008，1990年11月8日申请的07/610,515，1992年7月24日申请的07/919,297，1992年7月30日申请的07/922,649，1993年3月15日申请的08/031,801，1993年8月27日申请的08/112,848，1994年4月28日申请的08/234,145，1995年1月20日申请的08/376,279，1995年4月27日申请的08/430,938，1995年6月5日申请的08/464,584，1995年6月5日申请的08/464,582，1995年6月5日申请的08/463,191，1995年6月5日申请的08/462,837，1995年6月5日申请的08/486,853，1995年6月5日申请的08/486,857，1995年6月5日申请的08/486,859，1995年6月5日申请的08/462,513，1996年10月2日申请的08/724,752，1996年12月3日申请的08/759,620。也参见Mendez等，自然遗传学，15：146—156(1997)和Green及Jakobovits，实验医学杂志，188：483—495(1998)。也参见1996年6月12日授权公开的欧洲专利号EP0463151B1，1994年2月3日公开的国际专利申请号WO94/02602，1996年10月31日公开的国际专利申请号WO96/34096，和1998年6月11日公开的WO98/24893。上面引用的各专利，申请和参考文献的公开内容以其全文在本文中作为参考文献引用。
在一个可供选择的方案中，包括GenPharm国际有限公司的其他人使用了“小基因座”方案。在小基因座方案中，通过包括来自Ig基因座的片段(单个基因)模仿外源性Ig基因座。因此，一个或多个VH基因，一个或多个DH基因，一个或多个JH基因，μ恒定区，第二恒定区(优选γ恒定区)形成插入动物中的构建体。该方案在下列文献中有描述：Surani等的美国专利号5,545,807，均属于Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5625825,5625126,5633425,5661016,5770429,5789650和5814318，Krimpenfort和Berns的美国专利号5591669，Berns等的美国专利号5612205,5721367,5789215，Choi和Dunn的美国专利号5643763，GenPharm国际公司的1990年8月29日申请的美国专利申请系列号07/574,748，1990年8月31日申请的07/575,962，1991年12月17日申请的07/810,279，1992年3月18日申请的07/853,408，1992年6月23日申请的07/904,068，1992年12月16日申请的07/990860，1993年4月26日申请的08/053,131,1993年7月22日申请的08/096762，1993年11月18日申请的08/155,301，1993年12月3日申请的08/161,739，1993年12月10日申请的08/165,699，1994年3月9日申请的08/209741，本文引用其公开内容作为参考。也参见欧洲专利号0546073B1，国际专利申请号WO92/03918，WO92/22645，WO92/22647，WO92/22670，WO93/12227，WO94/00569，WO94/25585，WO96/14436，WO97/13852和WO98/24884，其说明书作为整体在此引用以供参考。还参见Taylor等，1992，Chen等，1993，Tuaillon等，1993，Choi等，1993，Lonberg等(1994)，Taylor等，(1994)，和Tuaillon等，(1995)，Fishwild等，(1996)，其公开内容作为整体在此引用以供参考。
上面引用的Surani等且转让给医学研究顾问(“MRC”)的发明人通过使用小基因座研究产生了具有Ig基因座的转基因小鼠。上面引用的GenPharm国际公司的工作的发明人，Lonberg和Kay在本发明人的领导下建议灭活内源性小鼠Ig基因座并结合大量复制Surani等的工作。
小基因座方案的优势是其快速，可产生包括Ig基因座部分的构建体并导入动物。然而，相对应的是，小基因座方案的明显缺点在于，理论上，通过包括少数V，D，和J基因导入的多样性不够。事实上，已公开的工作似乎支持了这一观点。通过使用小基因座方案产生的动物B-细胞形成和抗体生产似乎受到阻碍。因此，围绕本发明的研究一般是针对导入大部分的Ig基因座以实现更大的多样性且努力重建动物的免疫库。
人抗小鼠抗体(HAMA)反应产生了制备嵌合或其它人源化抗体的工业。由于嵌合抗体具有人恒定区和小鼠可变区，因此预期可观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)反应，特别是在慢性病或多剂量使用抗体的情况下。因此，需要提供抗CTLA-4的全人抗体以消除这些顾虑和/或HAMA或HACA反应的影响。
人源化和展示技术
正如上面关于人抗体产生所讨论的，产生具有免疫原性降低的抗体具有优势。在一定程度上，使用合适的文库及人源化技术和展示技术可实现这点。预期使用本领域熟知的技术可人源化或灵长类化鼠抗体或来自其它物种的抗体。例如，参见Winter和Harris，当今免疫学，14：43—46(1993)和Wright等，Crit.Reviews in Immunol.12125—168(1992)。经过重组DNA技术用相应的人序列取代CH1，CH2，CH3，铰链区，和/或构架区可改造目的抗体(见WO92/02190和美国专利号5,530,101,5,585,089,5693.761,5693792,5714350，和5777085)。另外，使用Ig cDNa构建嵌合免疫球蛋白基因在本领域中是已知的(Liu等，PNAS，84：3439(1987)和免疫学杂志，139：3521(1987))。从杂交瘤或其它产生抗体的细胞中分离mRNA并用于产生cDNA。目的cDNA可使用特异性引物经聚合酶链反应扩增(美国专利号4683195和4683202)。另外，可制备并筛选文库以分离目的序列。然后将编码抗体可变区的DNA序列融合到人恒定区序列上。人恒定区基因的序列可参见Kabat等(1991)，免疫学目的的蛋白质序列，N.I.H.公开号91—3242。人C区域基因可容易从已知克隆获得。以所需效应器功能，如补体固定，或在抗体依赖性细胞毒性中的活性来指导同种型的选择。优选的同种型是IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。本发明抗体的特别优选的同种型是IgG2和IgG4。可使用人轻链恒定区中的任一种，κ或λ。然后用常规方法表达嵌合的，人源化抗体。
经过裂解完整蛋白，例如，经蛋白酶或化学裂解可制备抗体片段，如Fv，F(ab′)2和Fab。另外，可设计截短的基因。例如，编码部分F(ab′)2片段的嵌合基因包括编码CH1结构域和H链铰链区的DNA序列，后面是翻译终止密码子以产生截短的分子。
在一个方案中，可使用编码重链和轻链J区的共有序列以设计用作引物的寡核苷酸以便将有用的限制性位点导入J区域用于随后将V区域片段连接到人C区域片段上。经定点诱变可修饰C区cDNA以便在人序列的类似位置放入限制性位点。
表达载体包括质粒，逆转录病毒，质粒，YAC，EBV来源的附加体等。常规载体是编码功能完全的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体，它具有合适的限制性位点以便可容易地插入和表达任意VH或VL序列。在该载体中，通常在插入的J区的剪接供体位点和人C区前的剪接受体位点之间发生剪接，也在人CH外显子内出现剪接区。多聚腺苷酸化和转录终止在编码区下游的天然染色体位点处出现。所得的嵌合抗体可与任何强启动子连接，包括逆转录病毒LTR，例如，SV-40早期启动子(Okayama等，分子细胞生物学，3：280(1983))，劳氏肉瘤病毒LTR(Gorman等，PNAS，79：6777(1982))，和莫洛尼鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等，细胞，41：885(1985))；天然Ig启动子等。
而且，可使用本领域熟知的技术通过展示-类型技术产生人抗体或来自其它物种的抗体，该技术包括，但不限于噬菌体展示，逆转录病毒展示，核糖体展示和其它技术，所得的分子可经历其它的成熟过程，如亲和性成熟，该技术是本领域中熟知的。Wright和Harris，出处同上，Hanes和Plucthau，PNAS USA，94：4937—4942(1997)(核糖体展示)，Parmley和Smith，基因，73：305—318(1998)(噬菌体展示)，Scott TIBS，17：241—245(1992)，Cwirla等，PNAS USA，87：6378—6382(1990)，Russel等，核酸研究，21：1081—1085(1993)，Hoganboom等，免疫学研究：130：43—68(1992)，Chiswell和McCafferty，TIBTECH，10：80—84(1992)，和美国专利号5733743。如果使用展示技术产生非人抗体，则可按上述方法将该抗体人源化。
使用这些技术，可产生抗表达CTLA-4的细胞，CTLA-4本身，CTLA-4形式，其表位或肽的抗体，且可按上述筛选其表达文库的上述活性。
抗体治疗的其它标准
正如所预期的，一般不需要杀死表达CTLA-4的细胞。相反，人们一般希望仅仅是抑制CTLA-4与其配体的结合以缓解T细胞下调。抗体杀死细胞的一个主要机制是通过补体的固定并参与CDC。抗体的恒定区在抗体固定补体和参与CDC方面起重要作用。因此，一般来说，可选择提供补体固定的能力或无此能力的抗体同种型。对于本发明，一般来说，如上所述，一般不优选利用杀死该细胞的抗体。有许多能固定补体和CDC的抗体同种型，包括，但不限于，鼠IgM，鼠IgG2a，鼠IgG2b，鼠IgG3，人IgM，人IgG1和人IgG3。这些同种型不包括，人IgG2和人IgG4等。
预期产生的抗体不必开始就具有特定的所需同种型，而且该抗体在产生时可以是任何同种型且该抗体可以是随后使用本领域熟知的常规技术转换的同种型。该技术包括使用直接重组技术(例如，参见，美国专利号4816397)，细胞-细胞融合技术(例如，参见，1996年10月11日申请的美国专利申请号08/730639)及其它技术。
在细胞-细胞融合技术中，制备具有任意所需同种型的重链的一种骨髓瘤细胞或其它细胞系并制备具有轻链的另一骨髓瘤或其它细胞系。随后可融合两细胞并分离表达完整抗体的细胞系。
例如，本文讨论的大多数CTLA-4抗体是人抗-CTLA-4 IgG2抗体。由于该抗体具有与CTLA-4分子的所需结合，因此可容易地对任一该抗体进行同种型转换以产生人IgG4同种型，例如，同时还具有相同的可变区(它限定抗体的特异性和一些亲和性)。
因此，由于产生的抗体候选物满足了上文讨论的所需“结构”特性，因此它们一般需要通过同种型转换提供至少某些其它的“功能”特性。
其它治疗法的设计和产生
根据本发明并根据本文产生和鉴定的抗CTLA-4抗体的活性，容易设计其它的治疗模式，包括其它抗体，其它拮抗剂，或非抗体的化学半分子。该模式包括但不限于具有相似结合活性或功能性的抗体，先进的抗体疗法，如双特异性抗体，免疫毒素，和放射标记的治疗法，肽疗法的产生，基因疗法，特别是体内的，反义疗法和小分子。而且，如上文所讨论的，经过同种型转换成IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgD，IgA，IgE或IgM可改变本发明的抗体的效应器功能用于各种治疗用途。
至于先进的抗体疗法的产生，如果补体固定是所需的特性，可通过使用，例如，双特异性分子，免疫毒素或放射标记回避细胞杀伤对补体的依赖性。
至于双特异性抗体，可产生的双特异性抗体包括：(i)连接在一起的一个对CTLA-4具有特异性且另一个对第二种分子具有特异性的两种抗体，(ii)具有对CTLA-4特异性的一条链和对第二种分子特异性的第二条链的单个抗体，或(iii)对CTLA-4和另一分子均具有特异性的单链抗体。可使用熟知的技术生产该双特异性抗体，例如，对于(i)和(ii)，参见，例如，Fanger等，免疫学方法，4：72—81(1994)和Wright和Harris，出处同上，对于(iii)，参见例如，Traunecker等，国际癌症杂志(增刊)，7：51—52(1992)。
另外，也可制备“Kappabodies”(I11等，“具有重链和轻链可变区特性的杂交免疫球蛋白结构域的设计和构建”，英国蛋白质，10：949—57(1997))，“Minibodies”(Martin等，人白介素6的minibody多肽抑制剂的亲和性选择；，EMBO J，13：5303—9(1994))，“Diabodies”(Holliger等，“‘Diabodies’：小的双价和双特异性抗体片段”PNAS USA，90：6444—6448(1993))，或“Janusins”(Traunecker等，“HIV感染的细胞上的双特异性单链分子(Janusins)靶细胞毒性淋巴细胞”，EMBO J.10：3655—3659(1991)和Traunecker等，“Janusin：双特异性试剂的新分子设计”，国际癌症杂志增刊，7：51—52(1992))。
对于免疫毒素，可使用本领域熟知的技术将抗体修饰成免疫毒素。例如，参见，Vitetta，当今免疫学，14：252(1993)。也参见美国专利号5194594。至于放射性标记的抗体的制备，使用本领域熟知的技术也容易制备这类修饰的抗体。例如，参见Junghans等，癌症化疗和生物疗法，655—686(第2版，Chafner和Longo编辑，LippincottRaven(1996))。也参见美国专利号4681581,4735210,5101827,5102990(RE35500),5648471和5697902。各免疫毒素和放射性标记的分子很可能杀死表达CTLA-4的细胞，特别是那些本发明的抗体有效的细胞。
至于治疗性肽的产生，通过利用与CTLA-4及其抗体，如本发明的抗体(在下文小分子中讨论)相关的结构信息或筛选肽文库，可产生抗CTLA-4的治疗性肽。肽疗法的设计和筛选在Houghten等，生物技术，13：412—421(1992)，Houghten，PNAS USA 82：5131—5135(1985)，Pinalla等，生物技术，13：901—905(1992)，Blake和Litzi-Davis，生物连接物化学，3：510—513(1992)中讨论。也可以按上文讨论的肽半分子和抗体相似的方式制备免疫毒素和放射性标记的分子。
关于抗体与抗原结合的重要信息可通过噬菌体展示实验来发现。该实验一般通过淘选表达随机肽的噬菌体文库与本发明抗体的结合以确是否分离结合的肽来实现。如果能成功，就可以结合的肽发现某些表位信息。
一般来说，以噬菌体M13系统为基础的表达随机肽的噬菌体文库可购自新英格兰生物实验室(7-聚体和12-聚体文库，分别为Ph.D.-7肽7-聚体文库试剂盒和Ph.D.-12肽12-聚体文库试剂盒)。7-聚体文库代表了各种大约2.0×109个独立的克隆，它代表了大多数，如果不是全部的话，207＝1.28×107个可能的7-聚体序列。12-聚体文库含大约1.9×109个独立的克隆，且代表了2012＝4.1×1015个12聚体序列的仅极小取样的潜在序列空间。按厂商建议淘选或筛选各7-聚体和12-聚体文库，其中用抗体覆盖平板以捕获合适的抗体(例如，捕获IgG抗体的山羊抗人IgG Fc)，随后洗涤。用0.2M甘氨酸-HC1，pH2.2洗脱结合的噬菌体。在恒定严格条件(0.5％Tween)下选择/扩增3轮后，通过使用DNA测序，可鉴定来自该文库的与一种或多种抗体反应的克隆。经ELISA测定肽的反应性。关于肽的表位分析的其它讨论也可参见Scott，J.K，和Smith，G.P.科学249：386—390(1990)；Cwirla等，PNAS USA87：6378—6382(1990)；Felici等，分子生物学杂志，222：301—310(1991)，和Kuwabara等，自然生物技术，15：74—78(1997)。
通过本发明也有助于通过常规技术设计基因和/或反义疗法。该模式可用于调节CTCA-4的功能。至于本发明的抗体，它有助于设计和使用与之相关的功能测定。一种反义疗法的设计和策略在国际专利申请号WO94/29444中详细讨论。基因治疗的设计和策略是熟知的。然而，特别是可证明使用涉及体内的基因治疗技术是特别具有优势的。例如，参见，Chen等，人类基因治疗，5：595—601(1994)和Marasco，基因治疗，4：11—15(1997)。与基因治疗相关的一般设计和考虑在国际专利申请号WO97/38137中讨论。编码本发明抗体的遗传材料(如4.1.1，4.8.1或6.1.1或其它)可包含在合适的表达系统中(病毒，减毒的病毒，非病毒，裸病毒，或其它)并施用给宿主以便在宿主体内产生抗体。
根据本发明也可预料小分子疗法。可根据本发明设计药物来调节CTLA-4的活性。从CTLA-4分子的结构和其与根据本发明的其它分子，如本发明的抗体，CD28，B7，B7-1，B7-2及其它分子相互作用获得的知识可用于合理设计其它的治疗模式。在这一方面，可使用诸如X-射线晶体学，计算机辅助(或帮助)分子模型(CAMM)，定量或定性结构活性关系(QSAR)和类似技术的合理药物设计技术致力于药物发现。合理的设计允许预言可与该分子或其特定形式相互作用的蛋白质或合成结构，它可用于修饰或调节CTLA-4的活性。可化学合成该结构或在生物学系统中表达。这一方案已在Capsey等，遗传改造的人治疗性药物(Stockton出版，纽约，(1988))中作了综述。事实上，根据已知的或描绘的与其它分子(如根据本发明的抗体)的结构-活性关系合理设计分子(肽，肽模拟物，小分子等)已成了常规技术。例如，参见，Fry等，“用一类新的酪氨酸激酶抑制剂特异性地，不可逆地灭活表皮生长因子受体和erbB2”，美国国家科学院院报，95：12022—7(1998)；Hoffman等，“硫氰酸生成酶同源结构域存在时的Cdc25磷酸酶催化结构域和Cdk-相互作用表面的模型”，分子生物学杂志，282：195—208(1998)；Ginalski等，“蛋白激酶活性形式的模型-案例研究”，Acta Biochim Pol，44：557—64(1997)；Jouko等，“csk酪氨酸磷酸化位点和激酶结构域结构上重要的酪氨酸残基的鉴定”，生化杂志，322：927—35(1997)；Singh等，“根据结构设计蛋白质酪氨酸激酶erbB受体亚族催化结构域的有效的，选择性的和不可逆的抑制剂”，医学化学杂志：40：1130—5(1997)；Mandel等，“ABGEN：抗体结构模型自动研究知识”，自然生物技术，14：323—8(1996)；Monfardini等，“GM-CSF拮抗剂的合理设计，分析和潜在应用”，美国医生协会学报：108：420—31(1996)；Furet等：“蛋白激酶抑制剂的模型研究：星形孢菌素的结合模型及CGP52411的选择性起点”，计算机辅助的分子设计杂志，9：465—72(1995)。
而且，在筛选程序中可设计和合成及使用组合文库，如高生产率的筛选努力。
治疗性用药和配制品
可以预料根据本发明的治疗实体的用药可用掺入配制品中以提供改进的转移、传递、耐受等的合适载体，赋形剂和其它试剂进行施用。在所有药物化学家已知的药典中可发现多种合适的配制品：Remington的药物科学(第15版，Mack出版公司，Easton，PA(1975))，其中特别是Blaug，Seymour的第87章。这些配制品包括，例如，粉末，糊状物，软膏，胶状物，蜡，油，脂类，含脂(阳离子或阴离子)载体(如LipofectinTM)，DNA连接物，无水吸收糊，水包油和油包水乳剂，聚乙二醇乳剂(各种分子量的聚乙二醇)，半固态凝胶，和含聚乙二醇的半固态混合物。在根据本发明的治疗和疗法中任何上述混合物都可以是合适的，只要配制品中的活性成份不被配制失活且该配制品在生理学上与用药途径是相容的和可耐受的。也参见Powell等，“肠胃外配制品的赋形剂简编”，PDA药物科学技术杂志，52：238—311(1998)和其中的引文，它们涉及与药物化学家熟知的赋形剂和载体相关的其它信息。
求抗体的制备
求根据本发明的抗体优选通过利用转基因小鼠来制备，该小鼠具有插入的大部分产人抗体的基因组，但引起内源性鼠抗体生产的缺陷。于是，该小鼠能产生人免疫球蛋白分子和抗体且在鼠免疫球蛋白分子和抗体生产上为缺陷型。实现该目的所用的技术在本文背景技术部分公开的专利，申请和参考文献中公开。然而，特别是，转基因生产小鼠及由其产生抗体的优选实施方案在1996年12月3日申请的美国专利申请系列号08/759,620中公开，本文引用其说明书以供参考。也参见Mendez等，自然遗传学，15：146—156(1997)，本文引用其说明书以供参考。
通过使用该技术，我们生产了抗各种抗原的全人单克隆抗体。基本上，我们用目的抗原免疫小鼠的XenoMouseTM品系，从表达抗体的小鼠回收淋巴细胞(如B细胞)，将该回收的细胞与骨髓瘤类型的细胞系融合以制备永生的杂交瘤细胞系，筛选并选择该杂交瘤细胞系以鉴定产生对目的抗原特异性的抗体的杂交瘤细胞系。我们使用根据本发明的这些技术以制备对CTLA-4特异性的抗体。文中，我们描述了产生CTLA-4特异性的抗体的多个杂交瘤细胞系的生产。而且，我们提供了对由该细胞系产生的抗体的鉴定，包括该抗体重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。
从本文讨论的杂交瘤细胞系产生的抗体命名为3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1，和12.9.1.1。由上述细胞系产生的各抗体均是具有人κ轻链的全人IgG2或IgG4重链。一般来说，根据本发明的抗体具有极高的亲和性，当用固相或液相测量时，典型地具有从大约10-9到大约10-11M的Kd值。
正如所预料的，根据本发明的抗体可在非杂交瘤细胞系的细胞系中表达。可使用编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的序列转化合适的哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞。可用将多核苷酸导入宿主细胞的任意已知方法进行转化，包括，例如，在病毒中(或病毒载体中)包装多核苷酸并用该病毒(或载体)转导宿主细胞或用本领域已知的转染方法，例如，参见美国专利号4399216,4912040,4740461和4959455(本文引用这些专利以供参考)。使用的转化方法取决于所要转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域熟知的且包括，但不限于葡聚糖介导的转染，磷酸钙沉淀，Polybrene介导的转染，原生质融合，电穿孔，微粒轰击，多核苷酸包装进脂质体，肽连接物，树状聚体(dendrimer)和直接将DNA显微注射进细胞核。
可作为表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域中熟知的，且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生细胞，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NSO0，Hela细胞，小仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)，人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)和许多其它细胞系。非哺乳动物细胞包括但不限于细菌，酵母，昆虫和植物也可用于表达重组抗体。优选定点诱变抗体CH2结构域以消除糖基化，以便防止由于非人源糖基化引起的免疫原性，药物动力学和/或效应器功能改变。经过确定产生最高表达水平和产生具有固有CTLA-4结合特性的抗体的系统来选择表达方法。
另外，从生产细胞系表达本发明的抗体(或来自于它的其它半分子)可使用许多已知技术来增强。例如，在某些条件下谷氨酰胺合成酶和DHFR基因表达系统是增强表达的常用方法。可使用常规技术，如限制性稀释克隆和微滴技术来鉴定高表达细胞克隆。在欧洲专利号0216846，0256055，和0323997及欧洲专利申请号89303964.4中全部或部分地讨论了GS系统。
本发明的抗体也可经过转基来生产，对免疫球蛋白重链和轻链目的序列进行转基因产生转基因哺乳动物或植物并从其中以可回收的方式产生抗体。对于哺乳动物的转基因生产，可从山羊，奶牛或其它哺乳动物的奶中产生并回收抗体。
已在结构和功能上分析了根据本发明的抗体。对于抗体的结构，根据通过杂交瘤RT-PCR获得的cDNA序列预测了重链和κ轻链的氨基酸序列。见实施例3和4及图1—8。为证实实施例3和4所讨论的结果还进行了抗体的N-端测序。见实施例5和图9。对抗体的动力学进行了分析以测定亲和性。见实施例2。根据本发明的抗体(特别是本发明的4.1.1，4.8.1和6.1.1抗体)具有高亲和性(4.1.1：1.63×1010l/M；4.8.1：3.54×1010l/M；和6.1.1：7.2×109l/M)。而且，经过等电聚胶(IEF)，还原凝胶电泳(SDS-PAGE)，大小排阻色谱，液相色谱/质谱法，和质谱法分析了抗体，并评估了杂交瘤的抗体生产。参见实施例6和图10。
对于根据本发明的抗体的功能分析，证明了该抗体是CTLA-4的有效抑制剂且它与B7家族分子的配体结合。例如，已证实根据本发明的抗体抑制CTLA-4与B7-1或B7-2的结合。见实施例7。事实上，根据本发明的许多抗体在抑制CTLA-4与B7-1和B7-2的结合方面具有纳摩尔和低于纳摩尔的IC50值。而且，本发明的抗体与CD28，CD44，B7-2或hIgG1相比对CTCA-4具有极好的选择性。见实施例8。选择性是指反映一种分子与第一试剂的优先结合程度与该分子结合第二试剂，任选其它的分子相比的比率。本文中，选择性是指本发明的抗体与CTLA-4的结合与该抗体结合其它分子，如CD28，CD44，B7-2或hIgG1相比的优先结合程度。本发明的抗体的选择性值一般大于500∶1。经过在T细胞母细胞模型中培养的T细胞已证实本发明的抗体诱导或增强了某些细胞因子(如IL-2和IFN-γ)的表达。见实施例9和10及图12-1)。而且，预期本发明的抗体在体内肿瘤模型中适当抑制肿瘤的生长。该模型的设计在实施例11和12中讨论。
根据本发明的这些结果证实本发明的抗体所具有的某些特性使得该抗体比常规抗CTLA-4的治疗性抗体更有效。
特别是，本发明的4.1.1，4.8.1和6.1.1抗体具有高度所需特性。其结构特征，功能或活性提供了帮助设计或选择上文所讨论的其它抗体或其它分子的标准。该标准包括一个或多个下列特征：
与本发明的一种或多种抗体竞争结合CTLA-4的能力；
与本发明的一种或多种抗体相似的对CTLA-4的结合特异性；
对CTLA-4的结合亲和性为大约10-9M或更大且优选大约10-10M或更大；
不与低等哺乳动物的CTLA-4，优选包括小鼠，大鼠或兔且优选小鼠或大鼠CTLA-4发生交叉反应；
与灵长类CTLA-4，优选包括cynomolgous和猕猴CTLA-4发生交叉反应；
对CTLA-4的选择性相对于CD28，B7-2，CD44或hIgG1至少为大约100∶1或更高且优选大约300，400或500∶1或更高；
抑制CTLA-4与B7-2结合的IC50值为大约100nM或更低且优选5,4,3,2,1,0.5或0.38nM或更低；
抑制CTLA-4与B7-1结合的IC50值为大约100nM或更低且优选5,4,3,2,1,0.5或0.50nM或更低；
在一种或多种体外试验中增强细胞因子的生产，例如：
在T细胞母细胞/Raji测定中将IL-2生产增强到大约500pg/ml或更高且优选750,1000,1500,2000,3000，或3846pg/ml或更高；
在T细胞母细胞/Raji测定中将IFN-γ生产增强到大约500pg/ml或更高且优选750，1000，或1233pg/ml或更高；或
在hPBMC或全血超抗原测定中将IL-2生产增强大约500pg/ml或更高且优选750,1000,1200，或1511pg/ml或更高。换一种表达方式，即需要将IL-2生产相对于对照测定增强大约30％,35％,40％,45％,50％或更高。
预期具有一种或多种这些特征的抗体(或从其设计或合成的分子)与本发明所述的抗体具有相似的效果。
上述所需的功能特征以与本发明的抗体相似的方式(即，与CTLA-4分子相同或相似的表位结合)从一个分子(即，抗体，抗体片段，肽，或小分子)对CTLA-4的结合和抑制获得。该分子可直接用药(即，直接给患者施用该分子)。或者，可间接“施用”该分子(即，在患者中产生免疫反应的肽或类似物(类似于疫苗)，其中免疫反应包括产生与相同或相似表位结合的抗体或者在施用编码结合相同或相似表位的该抗体或其片段的遗传物质后原位产生抗体或片段)。因此，预期CTLA4上结合本发明抗体的表位可用于制备和/或设计根据本发明的疗法。在药物设计中，阴性结果的信息通常也是有用的(即，结合CTLA4的抗体似乎不结合作为CTLA4抑制剂的表位的事实是有用的)。因此，本发明的抗体所结合的表位不导致所需的功能性也是极有用的。因此，根据本发明也包含与本发明的抗体相同或相似的表位结合的分子(特别是抗体)。
除了根据本发明包含本发明的抗体及其所结合的表位的事实外，我们还对根据本发明的某些抗体且特别是本发明的4.1.1和11.2.1抗体进行了一些初步的表位定位研究。
第一步，我们进行了BIAcore竞争研究以产生本发明的某些抗体与其竞争结合CTLA-4的能力之间的粗略结合图谱。随后，将CTLA4结合到BIAcore芯片上，在饱和条件下将第一抗体结合到其上并测量随后的第二抗体与CTLA4的竞争结合。该技术能产生一个粗略的图谱，抗体家族可在其上进行分类。
通过该方法，我们确定根据本发明的某些抗体可按如下表位类型进行分类：
类型 抗体 对CTLA4的竞争结合
A BOIM* 互相自由交叉竞争；与B型交叉竞争；与D型有一定的交叉竞争
B02M**
B 4.1.1 互相自由交叉竞争；与A，C和D型交叉竞争
4.13.1
C 6.1.1 互相自由交叉竞争；与B型和D型交叉竞争
3.1.1
4.8.1
11.2.1
11.6.1
11.7.1
D 4.14.3 与C和B型交叉竞争；与A型有一定的交叉竞争
E 4.9.1  BNI3抑制4.9.1与CTLA4的结合但反之无抑制
BNI3***
(*)(**)从Biostride获得
(***)从Pharmingen获得
下一步，我们测定了在Western印迹中在还原和非还原条件下本发明的抗体是否识别CTLA4上的线型表位。我们观察到本发明的4.1.1,3.1.1,11.7.1,11.6.1或11.2.1抗体中没有一个识别Western印迹上还原形式的CTLA4。因此，似乎很可能与各抗体结合的表位不是线型的表位而更可能是在还原条件下其结构被消除的构象性表位。
因此，我们试图确定是否能认识到CTLA-4分子内对结合本发明的抗体重要的残基。我们使用的一种方式是对人CTLA4和两种高度保守的灵长类CTLA4分子(cynomologous和狨CTLA4)之间的解离率进行动力学评价。BIAcore研究证实本发明的4.1.1抗体以相同的速率与人，cynomologous和狨CTLA4结合。然而，对于解离率(亲和性)，4.1.1抗体对人具有最高的亲和性(最慢的解离率)，与cynomologus具有较快的解离率，对狨具有快得多的解离率。另一方面，本发明的11.2.1抗体以大约相同的速率与人，cynomologous和狨CTLA4结合且对三种中的每一种具有大约相同的相对解离率。这一信息进一步表明本发明的4.1.1和11.2.1抗体结合CTLA4上的不同表位。
为了进一步研究与本发明的B和C型抗体结合的表位，我们进行了某些定点诱变研究。狨CTLA4相对于人CTLA-4在残基105和106处具有2个重要的改变。该差别是残基105由亮氨酸变为甲硫氨酸且在残基106位由甘氨酸变为丝氨酸。因此，我们将编码人CTLA4的cDNA突变成编码具有L105M和G106S改变的突变CTLA4。同源取代的突变体CTLA4不影响B7.2-IgG1融合蛋白的结合。而且，与本发明的11.2.1抗体的结合不受影响。然而，该分子与本发明的4.1.1抗体的结合能力受到明显抑制(类似于狨)。接着，我们突变了编码狨CTLA4的cDNA以产生具有S106G改变的突变体狨CTLA4。该改变导致4.1.1抗体与狨CTLA4突变体之间的稳定结合恢复。另外，我们突变了编码狨CTLA4的cDNA以产生具有M105L改变的突变体狨CTLA4。该改变部分恢复了4.1.1抗体与突变体CTLA4之间的结合。
本发明的B到D型抗体中的每一种似乎具有相似的功能特性且似乎具有充当强抗-CTLA4治疗剂的潜力。而且，各分子在其与CTLA4的结合中交叉竞争。然而，正如从上述讨论所观察到的，不同类型的各分子似乎结合CTLA4上的不同构象性表位。
根据上面所述，可预料到上面讨论的表位信息表明与本发明的抗体交叉竞争的抗体(或其它分子，如上所述)很可能具有根据本发明的某些治疗潜力。而且，预期与本发明的抗体交叉竞争(即，与B，C和/或D型抗体交叉竞争)的抗体(或其它分子，如上所述)很可能具有根据本发明的某些其它治疗潜力。另外，预期与本发明的抗体交叉竞争(即，与B，C和/或D型抗体交叉竞争)的抗体(或其它分子，如上所述)且(i)其与狨CTLA4的结合不减少的抗体(相似于11.2.1抗体)或(ii)其与狨CTLA4的结合减少的抗体(相似于4.1.1抗体)很可能具有根据本发明的某些其它治疗潜力。与A和E型竞争的抗体(或其它分子，如上所述)也可能具有某些治疗潜力。
                      实施例
下面提供的实施例，包括进行的实验和获得的结果仅仅是说明性的目的而不构成对本发明的限制。
                      实施例1
          生产抗-CTLA-4抗体的杂交瘤的制备
根据本实施例制备，选择和测定本发明的抗体。
抗原的制备：制备了3种不同的免疫原以免疫XenoMouseTM小鼠：(i)CTLA-4-IgG融合蛋白，(ii)CTLA-4肽，和(iii)用在细胞表面组成型表达的CTLA4(Y201V)突变体转染的300.19鼠淋巴瘤细胞。
(i)CTLA-4-IgG1融合蛋白：
表达载体的构建：
使用针对公开的序列(欧洲免疫学杂志，18：1901—1905(1988))设计的引物从人肠腺cDNA文库(Clontech)PCR扩增编码CTLA-4成熟胞外区的cDNA。将该片段直接亚克隆进pSR5，一种Sindbis病毒表达质粒(Invitrogen)的人制癌蛋白M信号肽和人IgGγ1(IgG1)CH1/CH2/CH3区之间。融合蛋白不含铰链区但含有CTLA-4胞外区的半胱氨酸120以形成共价二聚体。所得的载体称为CTLA-4-IgG1/pSR5。在两条链中经序列证实载体中完整的CTLA-4-IgG1 cDNA。CTLA4-Ig蛋白质的氨基酸序列显示如下。从人淋巴细胞文库(Clontech)PCR扩增CD44的成熟胞外区并亚克隆进pSinRep5以产生具有相同IgG1尾的对照蛋白。
OM-CTLA4-IgG1融合蛋白：
MGVLLTORTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVC
EYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICT
GTSSGNQVNLTIQCLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIY
VIDPEPCPDSDLEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE
YKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL
VKGFYPSDLAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
下划线：信号肽
黑体字：CTLA4胞外域。
从人淋巴细胞文库(Clontech)PCR扩增CD28成熟胞外域的cDNA并然后亚克隆进pCDM8(免疫学杂志，151：5261—71(1993)以产生含凝血酶裂解和铰链区的人IgGl融合蛋白。使用简并PCR的标准技术从PHA刺激的PBMC分离的mRNA克隆狨，Cynomologous和猕猴CTLA4。测序证实猕猴和cynomologous氨基酸序列相同，与成熟的人CTLA4胞外域有3区不同(S13N，I17T和L105M)。狨显示出与成熟人CTLA4胞外域有10处氨基酸差异(V21A，V33I，A41T，A51G，54I，S71F，Q75K，T88M，L105M和G106S)。使用定点诱变在狨CTLA4中所有不同的氨基酸处产生单点突变以确定各氨基酸在抗体与人CTLA4-IgG相互作用中的重要性。用匹配标记定点诱变(Promega)产生用的表位描绘的人和狨CTLA-IgG突变。经瞬时转染cos7细胞生产IgG融合蛋白并使用标准蛋白质A技术纯化。经免疫印迹和使用BIAcore分析评价突变的CTCA4-IgG蛋白与抗体的结合。
              重组蛋白的表达/纯化：
用体外转录CTLA-4-IgGl/pSR5 mRNA和DH-26S辅助mRNA的SP6按Invitrogen所述经电穿孔(Gibco)小仓鼠肾细胞产生重组新培斯病毒。48小时后收获重组病毒并滴定在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的最佳蛋白表达。CHO-K1细胞在含10％加热灭活的胎牛血清(Gibco)，非必需氨基酸(Gibco)，4mM谷氨酰胺(Gibco)，青霉素/链霉素(Gibco)，10mM Hepes pH7.5(Gibco)的DMEM/F12(Gibco)中悬浮培养。为了产生CTLA-4-IgG，CHO-K1细胞在DMEM/F12中以1×107细胞/ml重悬浮并用新培斯病毒在室温下培养1小时。然后细胞在含使用蛋白A琼脂糖(Pharmacia)减少了牛IgG的1％胎牛血清，非必需氨基酸，4mM谷氨酰胺，12.5mM Hepes pH7.5和青霉素/链霉素的DMEM/F12中稀释至1×106/ml。感染48小时后沉淀细胞并收获条件培养基，用完全蛋白酶抑制剂片(Boehringer Mannheim)补充，pH调至7.5，并以0.2μ(Nalgene)过滤。使用10ml/分流速的5ml蛋白A HiTrap柱(Pharmacia)用FPLC(Pharmacia)亲和纯化融合蛋白。用30倍柱体积的PBS洗涤柱并用0.1M甘氨酸/HCl pH2.8以1ml/分洗脱。用Tris pH9立即中和馏份(1ml)至pH7.5。经SDS-PAGE鉴定含CTLA-4-IgG1的馏份，然后使用Centriplus 50(Amicon)浓缩，之后使用PBS作溶剂以1ml/分过琼脂糖200柱(Pharmacia)。合并含CTLA-4-IgG1的馏份，无菌过滤通过0.2μ(Millipore)，分成等份试样并在-80℃冷冻。使用相同的方法表达和纯化CD44-IgG1。从瞬时转染的cos7细胞的条件培养基纯化CD28-IgG。
                  鉴定CTCA-4-IgG1
使用胶体考马斯染色(Novex)纯化的CTLA-4-IgG1在SDS-PAGE上以单条带迁移。在非还原条件下，CTLA-4-IgG1是二聚体(100kDa)，当用50mM DTT处理时还原成50kDa的单体。溶液中纯化的CTCA-4-IgG1的氨基酸测序证实了CTCA-4的N末端(MHVAQPAVVLAS)，且从成熟的融合蛋白裂解制癌蛋白-M信号肽。
CTLA-4-IgG1以浓度依赖的方式结合固定的B7.1-IgG且该结合受仓鼠抗人抗CTLA-4抗体(BNI3：PharMingen)抑制。该无菌CTLA-4-IgG不含内毒素且使用1.4的消光系数以OD280定量。纯化的CTLA-4-IgG的产量范围为0.5-3mg/升CHO-K1细胞。
(ii)CTLA-4肽
下面的CTLA-4肽按如下所述制备：
NH2：MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVT
EVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICK
VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC-CONH2
缩写/材料：
NMP，N-甲基吡咯烷酮；TFE，2，2，2-三氟乙醇；DCM，二氯甲烷；FMDC，芴基甲氧羰基。所有试剂均由Perkin Elmer提供，下列除外：TFE，来自Aldrich Chemical，FMOC-PAL-PEG树脂，来自PerseptiveBiosystems。Fmoc-Arg(PMC)-OH，FMOC-Asn(Trt)-OH，FMOC-Asp(tBu)-OH，FMOC-Cys(Trt)-OH，FMOC-Glu(tBu)-OH，FMOC-Gln(Trt)-OH，FMOC-His(Boc)-OH，FMOC-Lys(BOC)-OH，FMOC-Ser(tBu)-OH，FMOC-Thr(tBu)-OH和FMOC-Tyr(tBu)-OH用于那些需要侧链保护基团的氨基酸。
                    肽合成：
在翻新改进为带有在301nm下经紫外吸收反馈监测(Perkin-E1mer759A型指示器)的Perkin-Elmer431A上进行肽合成。使用条件加倍偶合循环在FMOC-PAL-PEG树脂上装配肽序列。在10,11,18,19,20和28到33个循环时进行加强双倍偶合。在完成各酰化循环时用50％的DCM和TFE混合物洗涤树脂，随后用NMP中的乙酸酐给未反应的氨基基团加帽。在完成49个循环后从反应器中取出树脂，残留物继续完成。使用试剂K(King等，蛋白质和肽研究的国际杂志，36：255—266(1990))从树脂上裂解肽6小时，在415mg树脂上产出186mg粗制CTLA-4肽。
                    肽鉴定：
将25mg等份试样的粗制CTLA-4肽溶于5ml pH6.4的6M盐酸胍/100mM K2PO3并在Pharmacia Hi Load Superdex75 16/60柱(16mm×600mm，120ml柱体积)上用pH6.4的2M盐酸胍/100mM K2PO3以2ml/分洗脱180分钟收集5ml馏份。经过将1.7μl的馏份上样到NuPAGELaemeli凝胶上用MES运行缓冲液过柱并经Daichii银染方法观察来分析馏份。将对照分子量标准判断时表现出12kDa分子量的那些馏份合并起来并贮存于4℃。经紫外和凝胶电泳分析合并馏份。经过将100μl样品吸入到ProSorb柱体(吸收到PVDF膜上)并洗涤去掉缓冲盐进行氨基酸测序。在应用生物系统420上进行测序。观察预期的N-端序列(MHVAQPAVVLA)。免疫印迹证实BNI3抗人CTLA-4(PharMingen)识别该肽。为了脱盐，将含648μg等份试样的材料放入3500Da MWCO透析袋中并在0.1％TFA/H2O中4℃搅拌透析9天。将该透析袋中的全部内容物冻干成粉末。
(ⅲ)用CTLA-4(Y201V)转染300.19细胞
从人胸腺cDNA文库(Stratagene)PCR扩增全长CTLA-4 cDNA并亚克隆进pIRESneo(Clontech)。使用匹配标记诱变系统(Promega)导入引起组成型细胞表面表达的CTLA-4突变。酪氨酸Y201突变成缬氨酸抑制了负责CTLA-4迅速内吞的衔接蛋白AP50的结合(Chuang等，免疫学杂志，159：144—151(1997)。在含10％胎牛血清，非必需氨基酸，青霉素/链霉素，2mM谷氨酰胺，12.5mM Hepes pH7.5和25uM β-巯基乙醇的RPMI-1640中培养无支原体的300.19鼠淋巴细胞。使用200V/1180uF(Gibco Cell Porator)以20μg CTLA-4-Y201V/pIRESneo在1ml室中电穿孔细胞(3×106/0.4ml无血清RPMI)。细胞静置10分钟，然后加入8ml预热的完全RPMI培养基。在48小时时，在含1mg/ml G418(Gibco)的完全RPMI培养基中将细胞稀释成0.5×106/ml。抗性细胞展平且使用与藻红蛋白(PharMingen)连接的BNI3抗体时显示出在细胞表面表达CTLA-4。经无菌分拣分离高水平表达的细胞。
免疫和杂交瘤生产：XenoMouse小鼠(8至10周大)按如下方式免疫：(ⅰ)在尾巴基部皮下注射带完全弗氏佐剂的重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中的上述转染表达CTLA-4的1×107个300.19细胞，或(ⅱ)在尾巴基部皮下注射用完全弗氏佐剂乳化的(a)10μg CTLA-4融合蛋白或(b)10μg CTLA-4肽。在每种情况下，在不完全弗氏佐剂中将该剂量重复3到4次。融合前4天，小鼠接受在PBS中的免疫原或细胞的最终注射。来自免疫小鼠的脾和/或淋巴结淋巴细胞与[鼠非分泌型骨髓瘤P3细胞系]融合并按以前所述进行HAT选择(Galfre，G.和Milstein，C.，”单克隆抗体的制备：策略和方法”，酶学方法，73：3-46(1981))。回收所有分泌CTLA-4特异性人IgG2K或IgG4K(按下面检测)抗体的杂交瘤。
ELISA测定：
测定小鼠血清和杂交瘤上清中抗原特异性抗体的ELISA按(Coligan等，2.1单元，“酶联免疫吸附测定”，免疫学常规方法(1994))所述使用捕获抗体的CTLA-4-Ig融合蛋白进行。对于用CTLA-4-Ig融合蛋白免疫的动物，我们还筛选了抗融合蛋白的人Ig部分的非特异性活性。使用以人IgG1覆盖的ELISA平板作为阳性特异性对照进行测定。
在优选的ELISA测定中，使用下面的技术：
在覆盖了缓冲液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6和NaHCO3(MW84)8.4g/l)的平板上用100μl/孔的抗原覆盖ELISA平板。然后平板在4℃培养过夜。培养后，去掉覆盖缓冲液，用200μl/孔封闭缓冲液(0.5％BSA，0.1％Tween 20，0.01％溶于1×PBS中的硫抑汞)封闭平板并在室温下培养1小时。另外，平板在带封闭缓冲液和平板密封情况下贮存于冰箱。去掉封闭缓冲液，加入50μl/孔的杂交瘤上清，血清或其它杂交瘤上清(阳性对照)和HAT培养基或封闭缓冲液(阴性对照)。平板在室温下培养2小时。培养后，用洗涤缓冲液(1×PBS)洗涤平板。以100μl/孔(小鼠抗人IgG2-HRP@1∶2000或小鼠抗人IgG4-HRP@1∶1000(均在封闭缓冲液中稀释))加入检测抗体(即，针对IgG2抗体的小鼠抗人IgG2-HRP(SB，#9070-05)或针对IgG4抗体的小鼠抗人IgG4-HRP(SB#9200-05))。平板在室温下培养1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤。随后，向各孔中加入100μl/孔新鲜制备的显色溶液(10ml底物缓冲液，5mg OPD(邻苯二胺，Sigma目录号P-7288)和10μl 30％H2O2(Sigma))。使平板显色10—20分钟，直到阴性对照孔刚开始显色。随后，加入100μl/孔的终止溶液(2M H2SO4)并在490nM波长下在ELISA平板阅读器上读数。
以BIAcore测定全人Mab的亲和性常数：
经胞质基因共振对纯化的人单克隆抗体，Fab片段或杂交瘤上清进行的亲和性测量使用BIAcore2000仪器并使用厂家列出的一般方法。
抗体的动力学分析使用以低密度固定在传感器表面的抗原进行。BIAcore传感器芯片的3个表面用密度范围大约为390—900的CTCA-4-Ig融合蛋白和在pH5.0的10mM乙酸钠中以20或50μg/ml溶解的CTLA-4-Ig融合蛋白及厂商提供的胺偶联试剂盒(BIAcore.Inc.)固定。BIAcore传感器芯片的第4个表面用IgG1(900RU)固定并用作非特异性结合的阴性对照表面。以每分钟25或50微升的流速进行动力学分析并使用允许总体匹配计算的厂商提供的软件(BIA评估3.0)测定解离(kd或koff)及缔合(ka或kon)率。
                        实施例2
              抗-CTLA-4-抗体的亲和性测量
在下表中，提供了以该方式选择的某些抗体的亲和性测量：
表I
固相(以BIAcore)
杂交瘤 结合率Ka(M-1S-1×106) 解离率Kd(S-1×10-4) 解率常数KA(1/M)＝Ka/Kd×1010 解离常数KD(M)＝Kd/Ka×10-10 表面密度[RU]
Moab01 0.680.700.770.60 1.014.666.493.08  0.670.150.190.20  1.486.688.415.11  878.7504.5457.2397.8
4.1.1 1.851.881.731.86 0.721.211.541.47  2.581.551.131.26  0.390.640.880.79  878.7504.5457.2397.8
4.8.1 0.320.310.28 0.070.230.06  4.461.334.82  0.220.750.21  878.7504.5397.8
4.14.3 2.812.882.843.17 3.043.976.665.03  0.920.730.430.63  1.081.382.351.58  878.7504.5457.2397.8
6.1.1 0.430.460.310.45 0.350.900.510.79  1.210.510.610.57  0.831.981.631.76  878.7504.5457.2397.8
3.1.1 1.040.950.730.91 0.961.721.652.07  1.070.550.440.44  0.931.822.272.28  878.7504.5457.2397.8
4.9.1 1.551.431.35 13.8019.0020.50  0.110.080.07  8.9413.2015.20  878.7504.5397.8
4.10.2 1.000.940.701.00 2.534.305.055.24  0.390.220.140.19  2.544.557.215.25  878.7504.5457.2397.8
2.1.3 1.241.171.11 9.5913.1013.00  0.130.090.09  7.7211.2011.70  878.7504.5397.8
4.13.1 1.221.291.23 5.836.657.25  0.210.190.17  4.785.175.88  878.7504.5397.8
正如所观察到的，根据本发明制备的抗体具有高亲和性和结合常数。
                      实施例3
        根据本发明制备的抗-CTLA-4-抗体的结构
在下面的讨论中，提供了涉及根据本发明制备的抗体的结构信息。
为了分析根据本发明产生的抗体的结构，我们克隆了编码来自特定杂交瘤的重链和轻链片段的基因。基因克隆和测序按如下方法完成：
使用Fast-Track试剂盒(Invitrogen)从来自免疫的XenoMouse小鼠的大约2×105个杂交瘤细胞分离Poly(A)+mRNA。经PCR产生随机引发的cDNA。使用人VH或人VK家族特异性可变区引物(Marks等，“人免疫球蛋白可变基因聚合酶链反应扩增的寡聚核苷酸引物及家族特异性寡核苷酸探针的设计”欧洲免疫学杂志，21：985—991(1991))或通用人VH引物，MG-30(CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG)并结合人Cp2恒定区特异性引物(MG-40d；5′-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3′)或CK恒定区(hkp2；以前在Green等，1994中所述)。来自杂交瘤的人Mab来源的重链和κ链转录子的序列经过对使用上述引物从poly(A+)RNA产生的PCR产物直接测序获得。也使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物克隆进pCRII，并使用Prism染料终止子测序试剂盒和ABI377测序机测序两条链。使用Mac Vector和Geneworks软件程序经过与“V BASE序列名录”(Tomlinson等，MRC蛋白质工程中心，英国剑桥)进行序列对比分析全部序列。
另外，对4.1.1，4.8.1，11.2.1，和6.1.1各抗体进行了全长DNA测序。为进行该测序，使用mRNA Direct试剂盒(Dynal)从大约4×106个杂交瘤细胞分离了Poly(A)+mRNA。使用寡聚-dY(18)和AdvantageRT/PCR试剂盒(Clonetech)逆转录mRNA。使用可变区数据库(V Base)设计在重链DP50基因ATG起始位点开始(5′-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGG CTGAGC TG-3′)和到IgG2恒定区终止密码子(5′-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-3′)的扩增引物。向ATG起始位点的5′端添加最佳Kozak序列(ACCGCCACC)。使用相同的方法设计κ链A27基因ATG起始位点的引物(5′-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCG CAG-3′)和κ恒定区终止密码子的引物(5′-TTCTTTGATCAGAA TTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3′)。经过使用ATG起始位点的引物(5′-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGACATGAGGG TCCCCGCT-3′)和上述κ恒定区终止密码子引物克隆012cDNA。重链cDNA也被克隆为基因组构建体，经过定点诱变在可变J区末端添加NheI位点并亚克隆含基因组IgG2CH1/Hinge/CH2/CH3区的NheI-片段。点突变产生NheI位点不改变来自种系的氨基酸序列。使用优势高可信度PCR试剂盒(Clonetech)用引物对扩增cDNA。使用染料终止子测序试剂盒和ABI测序机经直接测序获得PCR序列。将PCR产物克隆进pEE谷氨酰胺合成酶哺乳动物表达载体(Lonza)且测序了3个克隆以证实体细胞突变。对于每个克隆，在至少3个反应中在两条链上证实了该序列。经定点诱变CH2区中的N294Q产生无糖基化的4.1.1抗体。在清除IgG的FCS中经瞬时转染cos7细胞产生重组抗体且使用标准蛋白A琼脂糖技术纯化。经过电穿子鼠NSO细胞并在无谷氨酰胺的培养基中选择产生稳定的转染子。带有或不带糖基化的重组4.1.1在体外ELISA和BIAcore测定中对CTLA4表现出相同的特异性和亲和性。
                     基因利用分析
下表提供了以选择的根据本发明的抗体的杂交瘤克隆证实的基因利用：
表II
重链和轻链基因利用
    克隆                         重链        κ轻链
      VH             D    JH     VK    JK
    4.1.1     DP-50       DIR4 or DIR3   JH4     A27   JK1
    4.8.1     DP-50            7-27   JH4     A27   JK4
    4.14.3     DP-50            7-27   JH4     A27   JK3
    6.1.1     DP-50       DIR5 or DIR5rc   JH4     A27   JK3
    3.1.1     DP-50            3-3   JH6     012   JK3
    4.10.2     DP-50            7-27   JH4     A27   JK3
    2.1.3     DP-65            1-26   JH6   A10/A26   JK4
    4.13.1     DP-50            7-27   JH4     A27   JK3
    11.2.1     DP-50           D1-26   JH6     012   JK3
    11.6.1     DP-50         D2-2 or D4   JH6     012   JK3
    11.7.1     DP-50       D3-22 or D21-9   JH4     012   JK3
    12.3.1.1     DP-50       D3-3 or DXP4   JH6     A17   JK1
    12.9.1.1     DP-50           D6-19   JH4   A3/A19   JK4
    4.9.1     DP-47       5-24 and/or 6-19   JH4     L5   JK1
正如所观察到的，根据本发明的抗体的产生偏向于利用DP-50重链可变区。DP-50基因也称为VH3-33家族基因。只有根据CTLA-4结合和初步体外功能测定选择的一种抗体显示出利用重链基因而非DP-50。该克隆2.1.3利用DP-65重链可变区且是IgG4同种型。DP-65基因也称为VH 4-31家族基因。另一方面，克隆4.9.1具有DP-47重链可变区，它结合CTLA-4但不抑制与B7-1或B7-2结合。在XenoMouse小鼠中，有30种以上的用于产生抗体的不同功能性重链可变基因。因此，这种偏向表明了对于结合抗原的结合特性和功能活性方面抗体-抗原相互作用的优选结合基序。
突变分析
正如所预料的，基因利用分析仅提供了有限的抗体结构概况。由于XenoMouse小鼠B细胞随机产生V-D-J重链或V-Jκ轻链转录子，因此存在许多次级加工，包括但不限于，体细胞超变，N-添加，和CDR3延伸。例如，参见Mendez等，自然遗传学，15：146-156(1997)和1996年12月3日申请的美国专利申请系列号08/259620。因此，为了进一步检查抗体结构，从该克隆获得的cDNA产生了该抗体预测的氨基酸序列。另外，通过蛋白质测序获得了N-端氨基酸序列。
图1提供了克隆4.1.1(图1A)，4.8.1(图1B)，4.14.3(图1C)，6.1.1(图1D)，3.1.1(图1E)，4.10.2(图1F)，2.1.3(图1G)，4.13.1(图1H)，11.2.1(图1I)，11.6.1(图1J)，11.7.1(图1K)，12.3.1.1(图1L)，和12.9.1.1(图1M)重链和κ轻链的核苷酸和预测的氨基酸序列。在图1A，1B和1D中，经过上述cDNA的全长克隆获得抗体4.1.1，4.8.1和6.1.1的延伸序列。在该图中，信号肽序列(或编码它的碱基序列)以黑体字表示，用于5′PCR反应的序列下划线。
图2提供了来自克隆4.1.1,4.8.1,4.14.3,6.1.1,3.1.1,4.10.2,4.13.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1的预期重链氨基酸序列与种系DP-50(3-33)氨基酸序列之间的序列对比。DP-50种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以阴影表示了抗体CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图3提供了克隆2.1.3预测的重链氨基酸序列和种系DP-65(4-31)氨基酸序列之间的序列对比。DP-65种系序列和克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体CDR1，CDR2，和CDR3序列的位置。
图4提供了克隆4.1.1,4.8.1,4.14.3,6.1.1,4.10.2和4.13.1的预测κ轻链氨基酸序列与种系A27氨基酸序列之间的序列对比。A27种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。克隆4.8.1，4.14.3和6.1.1CDR1中明显的缺失以“0”表示。
图5提供了克隆3.1.1,11.2.1,11.6.1和11.7.1预测κ轻链氨基酸序列与种系012氨基酸序列之间的序列对比。012种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线显示了抗体CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图6提供了克隆2.1.3预测的κ轻链氨基酸序列和种系A10/A26氨基酸序列之间的序列对比。A10/A26种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图7提供了克隆12.3.1预测的κ轻链氨基酸序列和种系A17氨基酸序列之间的序列对比。A17种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线显示了抗体CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图8提供了克隆12.9.1预测的κ轻链氨基酸序列与种系A3/A19氨基酸序列之间的序列对比。A3/A19种系序列和克隆序列之间的差别以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图22提供了下列抗-CTLA-4抗体链的一系列另外的核苷酸和氨基酸序列：
4.1.1：
全长4.1.1重链(cDNA22(a)，基因组22(b)和氨基酸22(c))；
全长无糖基4.1.1重链(cDNA22(d)和氨基酸22(e))；
4.1.1轻链(cDNA22(f)和氨基酸22(g))；
4.8.1
全长4.8.1重链(cDNA22(h)和氨基酸22(i))；
4.8.1轻链(cDNA22(j)和氨基酸22(k))；
6.1.1：
全长6.1.1重链(cDNA22(l)和氨基酸22(m))；
6.1.1轻链(cDNA22(n)和氨基酸22(o))；
11.2.1：
全长11.2.1重链(cDNA22(p)和氨基酸22(q))；
11.2.1轻链(cDNA22(r)和氨基酸22(s))。
信号肽序列以黑体大型字表示。全长4.1.1基因组DNA序列的阅读框(图22(b))下划线。而且，导入以产生去糖基化4.1.1重链的突变及所得的改变(N294Q)以下划双线和黑体字表示(cDNA(图22(b))和氨基酸(图22(c)))。
                     实施例4
            重链和轻链氨基酸取代分析
在图2中提供了克隆4.1.1,4.8.1,4.14.3,6.1.1,3.1.1,4.10.2,4.13.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1预期的重链氨基酸序列和种系DP-50(3-33)氨基酸序列的序列对比，出现了令人感兴趣的情况。除了大多数克隆偏向重链DP-50的事实外，抗体相对于种系DP-50基因具有相当有限的超变。例如，克隆3.1.1和11.2.1无突变。而且，在其它克隆中的突变一般是保守改变，包括用具有相似特性的氨基酸取代种系中的氨基酸。许多CDR1和CDR2序列内的突变在自然情况下特别保守。在图2中所示的3条重链，4.10.2，4.13.1和4.14.3明显来自单个重组事件(即，来自相同的生发中心)且序列几乎相同。如果这3条被认定为单个序列，那么，在含DP50重链的10个不同抗体中，在其CDR1和CDR2中，有3个位置非极性残基被另一非极性残基取代，有12个位置极性不带电荷残基被另一极性不带电荷残基取代，有1个位置极性带电荷残基被另一极性带电荷残基取代。而且，有2个位置中结构极相似的两个残基，甘氨酸和丙氨酸互相取代。不严格保守的突变仅涉及了处极性带电残基取代极性非带电残基和1处非极性残基取代极性残基。
这些抗体的轻链来自5个不同的VK基因。A27基因是最重要的代表且是6个不同轻链的来源。比较这6个序列揭示出2个值得注意的特征，首先，其中的3个，4.8.1，4.14.3和6.1.1在CDR1中含有1个或2个残基的缺失，这是一种稀少的事件。其次，对CDR3中第6位的种系丝氨酸存在强烈的排斥，在每个序列中该丝氨酸均被取代。这表明在该位置的丝氨酸与CTLA4结合不相容。
可预料到许多上面鉴定的氨基酸取代在与CDR极相邻的位置或CDR内存在。该取代似乎对于抗体与CTLA-4分子的结合具有一定的影响。而且，该取代对于抗体的亲和性具有显著的影响。
                       实施例5
        根据本发明的抗体的N-端氨基酸序列分析
为了进一步证实上面鉴定的根据本发明的抗体的组成和结构，我们使用Perkin-Elmer测序仪测序了某些抗体。通过使用预制凝胶电泳和电印迹技术分离和纯化抗体的重链和κ轻链，随后按实施例6所述直接测序。大多数重链序列在其氨基末端被封闭。因此，首先用焦谷氨酸氨肽酶处理该抗体并随后测序。
来自该实验的结果在图9中显示。图9还提供了以质谱法(MALDI)测定的重链和轻链的分子量。
                     实施例6
           进一步鉴定根据本发明的抗体
图10提供了关于根据本发明的某些抗体的某些进一步鉴定的信息。在图中，总结了与克隆3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.14.3和6.1.1相关的数据。提供了下列数据：浓度，等电聚焦(IEF)，SDS-PAGE，大小排阻色谱，FACS，质谱法(MALDI)，和轻链N-端序列。
一般来说，数据按如下方法获得：
材料和方法：
蛋白浓度从紫外扫描(200—350nm)在280nm处测定，其中280nm下1.58吸光度单位等于1mg/ml。
SDS-PAGE使用以10％NuPAGE凝胶和MES运行缓冲液的NovexNuPAGE电泳系统进行。用4×NuPAGE样品缓冲液(+/-)β-巯基乙醇以3∶1稀释制备样品，加热并将～5μg蛋白质上样到凝胶上。然后用亮蓝R染色溶液(Sigma目录号B-6529)染色凝胶，经过比较染色带与“完美蛋白质标记”(Novagen目录号69149-3)进行分子大小估计。
对于N-端测序，样品按上述在NuPAGE凝胶上运行，转移到蛋白印迹固定膜(Applied Biosystems)上，然后用考马斯兰R-250染色。切下染色的蛋白质带并用自动Edman降解法在应用生物系统494Procise HI测序仪上进行序列分析。
等电聚焦(IEF)使用Pharmacia IEF3-9pHast凝胶(目录号17-0543-01)进行。在10％甘油中将样品稀释成～0.8mg/ml并将1μl上样到凝胶上，然后银染。经过比较染色带与大范围(pH3-10)的IEF标准品(Pharmacia目录号17-0471-01)进行pI评估。
大小排阻色谱(SEC)使用Superdex75PC 3.2/30柱在PharmaciaSMART系统上以磷酸盐缓冲液(PBS)进行。经过比较峰值滞留时间与凝胶滞留时间进行分子大小评估。
对于FACS研究，制备人外周T细胞并刺激48小时。T细胞洗涤一次，以1×106个细胞/100μl重悬于FACS缓冲液中并用10μl抗-CD3-FITC(Immunotech，Marseille，法国)在室温下染色30分钟得到CD3表面表达情况。洗涤细胞2次，然后固定，透化处理(Fix and Perm，Caltag)，并用10μl抗CD152-PE(Pharmingen)染色细胞内CTLA-4表达。使用Becton Dickinson FACSort进行流式细胞计量。经过分析相关同种型对照抗体(Caltag)确定四分体。
如上所述，已证实抗-CTLA-4抗体具有某些有力的免疫调节活性。为了确定根据本发明的抗体是否具有该活性进行了下面的实验。一般来说，设计该实验来评估该抗体抑制CTLA-4和B7分子间的相互作用的能力，在CTLA-4和B7分子和CD28之间的选择性和启动T细胞细胞因子生产的能力，包括，但不限于IL-2和/或IFN-γ表达。而且，对本发明的抗体与某些人组织和其它物种(例如，小鼠和灵长类)的CTLA-4分子的交叉反应性进行了检查。
                     实施例7
         竞争ELTSA：以根据本发明的抗体抑制
           CTLA-4/B7-1或B7-2的相互作用
进行体外试验以确定根据本发明的抗体是否能抑制CTLA-4与B7-1或B7-2的结合。如所预期，可期望能抑制CTLA-4与B7分子结合的本发明的抗体作为通过CTLA-4途径进行免疫调节的候选物。在该试验中，使用下列材料和方法：
求材料和方法：
求将在Dulbecco’s PBS中的3nM B7.1-Ig(G1)或B7.2-Ig(G1)(Repligen，Inc.Needham，MA)覆盖到96孔MaxiSorp平板(Nunc，丹麦，#439454)上并在4℃培养过夜。第2天，去掉B7-Ig并用加有在D-PBS中的0.05％Tween-20的1％BSA封闭2小时。用洗涤缓冲液(在D-PBS中的0.05％Tween-20)洗涤平板3次。将适当试验浓度的抗体与CTLA-4-Ig(G4)(0.3nM终浓度)(Repligen，Inc.Needham，MA)预混合15分钟，然后加到B7-Ig覆盖的平板(60μl总体积)上并在室温下培养1.5小时。将平板洗涤3次并加入50μl 1至1000稀释度的HRP-标记的小鼠抗人IgG4抗体(Eymed，San Francisco，CA，#05-3820)且在室温下培养1小时。将平板洗涤3次并加入50μl TMB微孔过氧化物酶底物(Kirkegaard&Perry，Gaithersburg，MD，#50-76-04)并在室温下培养20分钟，然后向平板中加入50μl 1N H2SO4。使用分子装置平板阅读器(Sunnyvale，CA)在450nM下阅读平板。所有样品以一式两份进行试验。最大信号定义为在缺乏试验抗体时CTLA-4-Ig的结合。非特异性结合定义为在缺乏CTLA-4-Ig和试验抗体时的吸光度。
试验结果在表IIIA和IIIB中提供。在表IIIA中，显示了根据本发明的各种抗体的结果。在表IIIB中，显示了在分开的实验中本发明的4.1.1抗体与本发明的11.2.1抗体的比较结果。
表IIIA
  克隆CTLA-4-Ig 同种型     CTLA4/B7.2竞争ELISAIC50(nM)    CTLA4/B7.1竞争ELISAIC50(nM)
CT3.1.1  IgG2  0.45±0.07(n＝3) 0.63±0.10(n＝2)
CT4.1.1  IgG2  0.38±0.06(n＝5) 0.50±0.05(n＝2)
CT4.8.1  IgG2  0.57±0.03(n＝3) 0.17±0.28(n＝2)
CT4.9.1  IgG2  无竞争性(n＝3) 无竞争性(n＝2)
CT4.10.2  IgG2  1.50±0.37(n＝3) 3.39±0.31(n＝2)
CT4.13.1  IgG2  0.49±0.05(n＝3) 0.98±0.11(n＝2)
CT4.14.3  IgG2  0.69±0.11(n＝3) 1.04±0.15(n＝2)
CT6.1.1  IgG2  0.39±0.06(n＝3) 0.67±0.07(n＝2)
表IIIB
  克隆CTLA-4-Ig 同种型     CTLA4/B7.2竞争ELISAIC50(nM)     CTLA4/B7.1竞争ELISAIC50(nM)
CT4.1.1  IgG2  0.55±0.08(n＝4) 0.87±0.14(n＝2)
CT11.2.1  IgG2  0.56±0.05(n＝4) 0.81±0.24(n＝2)
                    实施例8
本发明的抗体对CTLA-4与CD28或B7-2的选择性比率
进行另一体外测验以确定本发明的抗体对CTLA-4与对CD28或B7-2的选择性。实验中使用下面的材料和方法：
求CTLA-4选择性ELISA：材料和方法：
96孔FluroNUNC平板(Nunc不号475515)用4种抗原：CTLA-4/Ig，CD44/Ig，CD28/Ig和B7.2/Ig(国产抗原)覆盖。抗原以1μg/ml，100μl/孔在0.1M碳酸氢钠缓冲液pH9.6中覆盖平板+4℃下过夜。然后将平板使用NUNC平板洗涤器以PBST(PBS＋0.1％Tween-20)洗涤3次。用PBST＋0.5％BSA以150μl/孔封闭平板。将平板在室温下培养1小时，然后用PBST洗涤3次。接着将本发明的抗-CTLA-4抗体在封闭液中以1μg/ml稀释并加入到平板上。平板在室温下培养1小时，然后用PBST洗涤3次。然后用以1∶4000在封闭液中稀释的100μl/孔抗人IgG2-HRP(Southern Biotech目录号9070—05)处理含有本发明抗体的孔。另外，用抗人IgG(Jackson目录号209-035-088)处理一排以标准化平板覆盖。该抗体在封闭液中稀释成1∶5000并以100μl/孔加入。另外，用抗人CTLA-4-HRP(Pharmingen目录号345815/常规HRP连接的)处理一排作为阳性对照。该抗体在封闭液中以0.05μg/ml稀释后使用。平板在室温下培养1小时，然后用PBST洗涤3次。以100μl/孔加入LBA化学发光底物(Pierce)且平板在平板摇床上培养5分钟。然后使用光成像仪接触2分钟阅读平板。
IGEN CTLA-4-Ig选择性结合试验：材料和方法
用磷酸钠缓冲液pH7.4洗涤M-450Dynabeads(Dynal A.S.，Oslo，Norway#140.02)3次并重悬于磷酸钠缓冲液中。向100μl小珠中加入1.0μg CTLA-4-Ig(G1)，1.0μg CD28-Ig(G1)或1.0至3.0μg B7.2-Ig(G1)(Repligen，Inc.Needham，MA)并在摇床中4℃培养过夜。在第2天，用1％BSA加溶于Dulbecco’s PBS中的0.05％Tween-20洗涤珠子3次并封闭30分钟。用封闭缓冲液将珠子稀释1至10倍并将25μl包被的珠子加入12×75mm聚丙烯试管中。所有样品以一式二份试验。向试管中加入50μl试验抗体(1μg/ml终浓度)或封闭缓冲液并在Origen 1.5分析仪转子(IGEN国际公司，Gaithersburg，MD)上室温下以100rpm旋转培养30分钟。向试管中加入25μl钌标记的鼠抗人IgGl，IgG2或IgG4(Zymed，Inc.San Francisco，CA#05-3300，05-3500和05-3800)(在100μl总体积中终浓度为3μg/ml)。将试管在转子上以100rpm旋转室温下培养30分钟。向每管中加入200μl的Origen测定缓冲液(IGEN国际公司，Gaithersburg，MD#402-050-03)并简单转动，然后在Origen分析仪中计数试管，测定每管的ECL(电化学发光)单位。测定标准化系数以校正融合蛋白与Dynabeads结合的差异，在计算选择性比率前校正ECL单位的非特异性结合。
表IVA和IVB提供了测定的结果。
表IVA
克隆 同种型 CTLA4/CD28ELISA CTLA4/B7.2ELISA  CTLA4/CD44ELISA  CTLA4/CD28IGEN  CTLA4/B7.2IGEN
3.1.1  IgG2 ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝2) ＞500∶1(n＝1)195∶1(n＝1)
4.1.1  IgG2 ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝2)485∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝1)261∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝1)107∶1(n＝1)
4.8.1  IgG2 ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝2)190∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝2) ＞500∶1(n＝2)
4.9.1  IgG2 ＞500∶1(n＝2)244∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝2)33∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝1)
4.10.2  IgG2 ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝1)
4.13.1  IgG2 ＞500∶1(n＝2)46∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝1)329∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝2)
4.14.3  IgG2 ＞500∶1(n＝2)80∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝2)10∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝2)126∶1(n＝1) ＞413∶1(n＝1) ＞234∶1(n＝1)
6.1.1  IgG2 ＞500∶1(n＝2)52∶1(n＝1) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝2) ＞500∶1(n＝2)
表IVB
克隆 同种型   CTLA4/CD28ELISA   CTLA4/B7.2ELISA  CTLA4/hIgGELISA
4.1.1  IgG2 ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝2) ＞500∶1(n＝3)
11.2.1  IgG2 ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝3) ＞500∶1(n＝3)
                       实施例9
                  人T-细胞信号模型
为了进一步限定根据本发明的抗体用作免疫调节剂的活性，我们建立了一些T-细胞测定以定量用该抗体阻断CTLA-4信号时T-细胞IL-2生产的增强。实验中使用了下列材料和方法：
求材料和方法：
求经过使用Histopaque(Sigma，St.Louis，MO#A-70543)和T-Kwik(Lympho-Kwik，One Lambda，Canoga Park，CA，#LK-50-T)制备新分离的人T细胞并用PHA(1μg/ml)(纯化的植物凝集素，MurexDiagnostics Ltd.Dartford，英国，#HA16)在培养基(含L-谷氨酰胺，MEM非必需氨基酸，青霉素，链霉素，25mM Hepes和10％FBS的RPMI1640)中以1×106个细胞/ml的浓度进行刺激并在37℃培养2天。洗涤细胞并在培养基中稀释至2×106个细胞/m1。在37℃下用丝裂霉素C(SigmaSt.Louis，MO，#M-4287)(25μg/ml)处理Raji细胞(Burkitt淋巴瘤，人ATCC号：CCL86 ClassII，美国典型培养物保藏中心Rockville，MD)1小时。在PBS中洗涤Raji细胞4次并以2×106个细胞/ml重悬。向96孔微量滴定平板中加入人T细胞母细胞(5×105/ml)，Raji细胞(5×105/ml)和各种浓度的抗-CTLA-4抗体或同种型匹配的对照抗体，平板在37℃下培养72小时。每孔总体积为200μl。刺激72小时后，平板离心沉淀并取出上清冷冻用于随后测定IL-2(Quantikine IL-2ELISA试剂盒，R&D系统，Minneapolis，MN，#D2050)和IFN-γ(Quantikine IFN-g ELISA试剂盒，R&D系统)。细胞因子增强定义为含抗CTLA-4抑制mAb与含同种型匹配的对照抗体的培养物中细胞因子水平之间的差异。对于流式细胞计量实验，用FACS缓冲液(含2％加热灭活的FCS，0.025％叠氮化钠的PBS)洗涤Raji细胞一次。细胞沉淀以1×106个细胞/100μl重悬于FACS缓冲液中并用10μl抗-CD80-PE(Becton Dickinson，San Jose、CA)或抗-CD86-PE(Pharminger，SanDiego，CA)在室温下培养30分钟。将细胞洗涤2次并重悬于1ml FACS缓冲液中。使用Becton Dickinson FACSort进行流式细胞计量。经过分析相关同种型对照抗体(Caltag，Burlingame，CA)标出直方图标记。
一般来说，我们确立的测定法可用于迅速测定T细胞IL-2上调。如所预期，T细胞的刺激是B7和CD28依赖型的。而且，洗涤的T母细胞不产生可检测的IL-2且Raji细胞也不产生可检测的IL-2，即使以CPS或PWM刺激也是如此。然而，结合时，与Raji细胞共同培养的T母细胞可模拟B7，CTLA-4和CD28信号传递事件并可评估其上的抗体效应。
图11显示了按实施例6所述使用流式细胞计量术(FAC)时使用抗-CD80-PE和抗-CD86-PE mAb在Raji细胞上B7-1和B7-2的表达。
图12显示了在以CTLA-4抑制抗体(BNI3(PharMingen)和本发明的4.1.1，4.8.1和6.1.1抗体)诱导的T细胞母细胞/Raji测定中IL-2生产的浓度依赖性增强。
图13显示了在以CTLA-4抑制抗体(BNI3(ParMingen)和本发明的4.1.1，4.8.1和6.1.1抗体)诱导的T细胞母细胞/Raji测定中IFN-γ生产的浓度依赖性增强(相同的供体T细胞)。
图14显示了在T细胞母细胞/Raji测定中以CTLA-4阻断抗体诱导的来自6个供体的T细胞中IL-2生产的平均增强值。令人感兴趣的是可认为mAb，CT4.9.1结合CTLA4但不阻断B7结合。因此，与CTLA-4的简单结合本身不足以提供本发明的功能性抗体。
图15显示了在T细胞母细胞/Raji测定中以CTLA-4阻断抗体诱导的来自6个供体的T细胞中IFN-γ生产的平均增强值。
图19显示了在本实施例9中所述的72小时T细胞母细胞/Raji测定中和实施例10所述的超抗原测定中浓度为30μg/ml的本发明的4.1.1和11.2.1抗体的比较。
图20显示了在以本发明的4.1.1和11.2.1 CTLA4抗体诱导的T细胞母细胞/Raji测定中IL-2生产的浓度依赖性增强。
下面表IVC提供了在本发明的Raji和SEA测定中细胞因子反应的平均增强值和增强范围方面的信息。结果中包括的各实验以30μg/ml的抗体剂量为基础且在72小时时测量。显示了实验中所用的供体数及反应。
表IVC
测定法  mAb  细胞因子 平均增强值pg/ml  SEM  增强范围pg/ml  n 供体反应
T细胞母细胞/Raji  4.1.1  IL-2  3329  408  0至8861  42  19/21
T细胞母细胞/Raji  4.1.1  IFN-γ  3630  980  600至13939  17  13/13
T细胞母细胞/Raji  11.2.1  IL-2  3509  488  369至6424  18  14/14
sEA(PBMC)  4.1.1  IL-2  2800  312  330至6699  42  17/17
SEA(PBMC)  11.2.1  IL-2  2438  366  147至8360  25  15/15
SEA(全血)  4.1.1  IL-2  6089  665 -168至18417  46  15/17
SEA(全血)  11.2.1  IL-2  6935  700 -111至11803  25  12/14
                       实施例10
                  人T-细胞信号模型
为了定量用抗体阻断CTLA-4信号时T-细胞IL-2上调的增强，我们确立了第二种细胞测定法。实验中使用下面的材料和方法：
求材料和方法：
求使用Accuspin制备人PBMC。用抗-CD3抗体(Leu4，BectonDickinson)(60ng/ml)预覆盖微量滴定平板并在37℃下培养2小时。以每孔200,000个细胞向各孔中加入hPBMC。以100ng/ml向孔中加入葡萄球菌肠毒素A(SEA)(Sigma)。向各孔中加入通常为30μm/ml的抗体。刺激细胞48，72或96小时。在所需时间点离心平板并从孔中取出上清。随后，使用ELIS(R&D系统)检查上清中的IL-2生产。
这些实验的结果在图16，17和21中表示。在图16中，刺激72小时后测量来自5个供体的hPBMC中IL-2生产的诱导。在图17中，显示了来自全血测量的结果，分析了刺激后72和96小时时测量的3个供体血液中IL-2生产的诱导差异。
在图21中，在刺激后72小时时测量的2个供体全血中IL-2生产的增强。
                      实施例11
                    肿瘤动物模型
我们建立了动物肿瘤模型用于抗鼠CTLA-4抗体在抑制肿瘤生长中的体内分析。在该模型中，鼠纤维肉瘤肿瘤生长且用抗鼠-CTLA-4抗体处理动物。建立模型的材料和方法提供如下：
求材料和方法：
求用0.2ml SalN肿瘤细胞(1×106个)(Baskar 1995)在颈部背侧皮下注射雌性A/J小鼠(6—8周大)。在注射肿瘤细胞后的第0，4，7和14天腹膜内注射抗-鼠CTLA-4或同种型匹配的对照抗体(PharMingen，San DTego，CA，200μg/动物)。使用带电卡尺的Starrett SPC(Athol，MA)在3—4周实验过程中进行肿瘤测量且肿瘤大小表示为肿瘤生长覆盖的表面积(mm2)。
图18显示了在鼠纤维肉瘤肿瘤模型中抗鼠CTLA-4抗体对肿瘤生长的抑制。如图18所示，用抗-CTLA-4处理的动物与用同种型对照抗体处理的动物相比肿瘤生长减少。因此，抗-鼠CTLA4 mAb在小鼠肿瘤模型中能抑制纤维肉瘤的生长。
预期与鼠CTLA-4交叉反应的抗体可在该模型中起相似的作用。然而，在已检查交叉反应性的本发明的抗体中，没有一个与鼠CTLA-4交叉反应。
                      实施例12
                    肿瘤动物模型
为了进一步研究根据本发明的抗体的活性，设计了一种异种移植SCID小鼠模型以试验对已形成的肿瘤及其产生的转移进行根除。在该模型中，给SCID小鼠供应移植的人T细胞并用来自患者的非小细胞肺细胞(NSCL)或结肠癌(CC)细胞进行移植。移植进SCID小鼠的生殖腺脂肪垫中。使肿瘤生长并随后取出。小鼠形成人样肿瘤和肝癌转移。该模型在Bumper等，外科研究杂志，61：282—288(1996)中描述。
预期本发明的抗体可抑制该小鼠中形成的肿瘤的生长。
                   引用的参考文献
本文引用的所有参考文献，包括专利，专利申请，论文，教科书等及其中引用的参考文献在本说明书中全部作为参考文献引用。另外，本文还作为参考文献全部引用下列参考文献，包括在这些参考文献中引用的文献：Alegre等，免疫学杂志，157：4762—70(1996)。Allison和Krummel，科学，270：932—933(1995)。Balzano等，国际癌症杂志增刊7：28—32(1992)。Blair等，免疫学杂志，160：12—5(1998)。Blake和Litzi-Davis，生物连接物化学，3：510—513(1992)。Boussiotis等，美国国家科学院院报，90：11059—63(1993)。Bowie等，科学，253：164(1991)。Bruggeman等，PNAS USA，86：6709—6713(1989)。Bruggeman，M.和Neuberger，M.S.方法：酶学方法比较，2：159—165
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                      等价形式
上文的描述和实施例详细描述了本发明某些优选的实施方案且描述了本发明人预期的最佳方式。然而可预料到在说明书中记载的上文无论如何详细，本发明仍可按许多方式进行实施，因此应根据所附的权利要求书及其任意等价形式来组成本发明。

Claims (104)

1.一种能结合CTLA-4的抗体，包括含有由人VH3-33家族基因编码的从FR1序列内到FR3序列的连续氨基酸序列的重链可变区氨基酸序列且在图2所示的CDR1序列，CDR2序列，或者构架序列中含有至少一个氨基酸取代。
2.权利要求1的抗体，其中氨基酸序列含有选自如下的序列：SEQID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：70。
3.权利要求1的抗体，还包含轻链可变区氨基酸序列，其含有选自如下的序列：SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：71。
4.权利要求2的抗体，还包含轻链可变区氨基酸序列，其含有选自如下的序列：SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：71。
5.一种含有SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO：14的轻链可变氨基酸序列的抗体。
6.一种含有SEQ ID NO：2的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO：15的轻链可变氨基酸序列的抗体。
7.一种含有SEQ ID NO：4的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO：17的轻链可变氨基酸序列的抗体。
8.一种能结合CTLA-4的分离的人单克隆抗体。
9.权利要求8的抗体，其中该抗体能与选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1的抗体竞争结合CTLA-4。
10.权利要求8的抗体，其中该抗体与选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1的抗体具有基本上相似的对CTLA-4的结合特异性。
11.权利要求8的抗体，其中该抗体选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1。
12.权利要求8的抗体，其中该抗体不与来自低等哺乳动物物种的CTLA-4交叉反应。
13.权利要求12的抗体，其中该低等哺乳动物物种包括小鼠，大鼠和兔。
14.权利要求8的抗体，其中该抗体与来自灵长类的CTLA-4交叉反应。
15.权利要求14的抗体，其中该灵长类包括cynomolgous和猕猴。
16.权利要求8的抗体，其中该抗体相对于CD28，B7-2，CD44和hIgG1对CTLA-4具有大于大约100∶1的选择性。
17.权利要求16的抗体，其中选择性为大约500∶1或更大。
18.权利要求8的抗体，其中该抗体的结合亲和性是大约10-9M或更大。
19.权利要求18的抗体，其中该抗体的结合亲和性是大约10-10M或更大。
20.权利要求8的抗体，其中该抗体以低于大约100nM的IC50值抑制CTLA-4与B7-2之间的结合。
21.权利要求20的抗体，其中该抗体以低于大约0.38nM的IC50值抑制CTLA-4与B7-2之间的结合。
22.权利要求8的抗体，其中该抗体以低于大约100nM或更大的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合。
23.权利要求22的抗体，其中该抗体以低于大约0.50nM的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合。
24.权利要求8的抗体，其中该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IL-2生产增强到大约500pg/ml或更高。
25.权利要求24的抗体，其中该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IL-2生产增强到大约3846pg/ml或更高。
26.权利要求8的抗体，其中该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IFN-γ生产增强到大约500pg/ml或更高。
27.权利要求26的抗体，其中该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IFN-γ生产增强到大约1233pg/ml或更高。
28.权利要求8的抗体，其中该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中诱导的IL-2生产为大约500pg/ml或更高。
29.权利要求26的抗体，其中该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中诱导的IL-2生产为大约1500pg/ml或更高。
30.权利要求26的抗体，其中该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中诱导的IL-2生产相对于对照高大约30％。
31.权利要求26的抗体，其中该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中诱导的IL-2生产相对于对照高大约50％。
32.一种人源化的抗体，它与选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1的抗体具有基本上相似的对CTLA-4的结合特异性。
33.权利要求32的抗体，其中该抗体不与来自低等哺乳动物物种的CTLA-4交叉反应。
34.权利要求33的抗体，其中该低等哺乳动物物种包括小鼠，大鼠和兔。
35.权利要求32的抗体，其中该抗体与来自灵长类的CTLA-4交叉反应。
36.权利要求35的抗体，其中该灵长类包括cynomolgous和猕猴。
37.权利要求32的抗体，其中该抗体相对于CD28，B7-2，CD44和hIgGl对CTLA-4具有大于大约100∶1的选择性。
38.权利要求37的抗体，其中选择性为大约500∶1或更大。
39.权利要求32的抗体，其中该抗体的结合亲和性是大约10-9M或更大。
40.权利要求39的抗体，其中该抗体的结合亲和性是大约10-10M或更大。
41.权利要求32的抗体，其中该抗体以低于大约100nM的IC50值抑制CTLA-4与B7-2之间的结合。
42.权利要求41的抗体，其中该抗体以低于大约0.38nM的IC50值抑制CTLA-4与B7-2之间的结合。
43.权利要求32的抗体，其中该抗体以低于大约100nM或更大的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合。
44.权利要求43的抗体，其中该抗体以低于大约0.50nM的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合。
45.权利要求32的抗体，其中该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IL-2生产增强到大约500pg/ml或更高。
46.权利要求45的抗体，其中该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IL-2生产增强到大约3846pg/ml或更高。
47.权利要求32的抗体，其中该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IFN-γ生产增强到大约500pg/ml或更高。
48.权利要求47的抗体，其中该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IFN-γ生产增强到大约1233pg/ml或更高。
49.权利要求32的抗体，其中该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中使IL-2生产增强大约500pg/ml或更高。
50.权利要求49的抗体，其中该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中使IL-2生产增强到大约1500pg/ml或更高。
51.权利要求32的抗体，其中该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中使IL-2生产相对于对照增强大约30％。
52.权利要求50的抗体，其中该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中使IL-2生产相对于对照增强大约50％。
53.一种结合CTLA-4的抗体，包括在构架中与CDR1，CDR2和CDR3序列有效连接的含有由人VH3-33基因家族编码的人FR1，FR2和FR3序列的重链氨基酸序列，其中CDR1，CDR2和CDR3序列独立选自图2所示的CDR1，CDR2和CDR3序列。
54.权利要求32的抗体，还包括对图2所示的FR1，FR2和FR3序列的任意体细胞突变。
55.一种结合CTLA-4的抗体，包括在构架中与CDR1，CDR2和CDR3序列有效连接的含有由人VH3-33基因家族编码的人FR1，FR2和FR3序列的重链氨基酸序列，其中该抗体具有下列特性：
对CTLA-4的结合亲和性为大约10-9M或更大；
以大约100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合；
以大约100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4与B7-2之间的结合；和
在人T细胞测定中使细胞因子生产增强到大约500pg/ml或更高。
56.一种结合CTLA-4的抗体，包括在构架中与CDR1，CDR2和CDR3序列有效连接的含有FR1，FR2和FR3序列的重链氨基酸序列，该CDR1，CDR2和CDR3序列独立选自图2和3所示的CDR1，CDR2和CDR3序列，其中该抗体具有下列特性：
对CTLA-4的结合亲和性为大约10-9M或更大；
以大约100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合；
以大约100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4与B7-2之间的结合；和
在人T细胞测定中使细胞因子生产增强到大约500pg/ml或更高。
57.用于测定T细胞刺激的细胞培养系统，包括与Raji细胞系共同培养的人T细胞母细胞的培养物。
58.权利要求57的细胞培养系统，其中在与Raji细胞系培养前洗涤T细胞母细胞。
59.一种测量T细胞刺激的测定法，包括：
提供人T细胞母细胞和Raji细胞系的培养物；
将该培养物与一种试剂接触；和
测量该培养物的细胞因子生产。
60.权利要求59的测定法，其中在与Raji细胞系培养前洗涤T细胞母细胞。
61.权利要求59的测定法，其中该细胞因子是IL-2。
62.权利要求59的测定法，其中该细胞因子是IFN-γ。
63.权利要求59的测定法，其中该细胞因子生产在从培养物分离的上清中进行测量。
64.权利要求59的测定法，其中该试剂是抗体。
65.权利要求59的测定法，其中该抗体与CTLA-4结合。
66.一种筛选半分子的T细胞刺激功能的功能测定法，包括：
提供人T细胞母细胞和Raji细胞系的培养物；
将该培养物与该半分子接触；和
测量该培养物的细胞因子生产。
67.权利要求66的测定法，其中在与Raji细胞系培养前洗涤T细胞母细胞。
68.权利要求66的测定法，其中该细胞因子是IL-2。
69.权利要求66的测定法，其中该细胞因子是IFN-γ。
70.权利要求66的测定法，其中该细胞因子生产在从培养物分离的上清中进行评估。
71.权利要求66的测定法，其中该半分子是抗体。
72.权利要求66的测定法，其中该抗体与CTLA-4结合。
73.一种对CTLA-4抑制功能的T细胞刺激测定法，包括：
将含有人T细胞母细胞和Raji细胞系的培养物与一种试剂接触；和
评估该培养物的细胞因子生产。
74.权利要求73的测定法，其中在与Raji细胞系培养前洗涤T细胞母细胞。
75.权利要求73的测定法，其中该细胞因子是IL-2。
76.权利要求73的测定法，其中该细胞因子是IFN-γ。
77.权利要求73的测定法，其中该细胞因子生产在从培养物分离的上清中进行评估。
78.权利要求73的测定法，其中该试剂是抗体。
79.权利要求73的测定法，其中该抗体与CTLA-4结合。
80.一种筛选一种试剂的T细胞刺激活性的方法，包括：
将含有人T细胞母细胞和Raji细胞系的培养物与该试剂接触；和
评估该培养物的细胞因子生产。
81.权利要求80的方法，其中在与Raji细胞系培养前洗涤T细胞母细胞。
82.权利要求80的方法，其中该细胞因子是IL-2。
83.权利要求80的方法，其中该细胞因子是IFN-γ。
84.权利要求80的方法，其中该细胞因子生产在从培养物分离的上清中进行评估。
85.权利要求80的方法，其中该试剂是与CTLA-4结合的抗体。
86.一种测量T细胞刺激的测定法，包括：
提供人外周血单核细胞群体或用葡萄球菌肠毒素A刺激的人全血；
将该培养物与一种试剂接触；和
测量该细胞群体的细胞因子生产。
87.权利要求86的测定法，其中该细胞因子是IL-2。
88.权利要求86的测定法，其中该细胞因子生产在从该细胞群体分离的上清中进行测量。
89.权利要求86的测定法，其中该试剂是抗体。
90.权利要求86的测定法，其中该抗体与CTLA-4结合。
91.一种筛选半分子的T细胞刺激功能的功能测定法，包括：
提供人外周血单核细胞群体或用葡萄球菌肠毒素A刺激的人全血；
将该培养物与该半分子接触；和
评估该细胞群体的细胞因子生产。
92.权利要求91的测定法，其中该细胞因子是IL-2。
93.权利要求91的测定法，其中该细胞因子生产在从该细胞群体分离的上清中进行评估。
94.权利要求91的测定法，其中该半分子是抗体。
95.权利要求91的测定法，其中该抗体与CTLA-4结合。
96.一种用于CTLA-4抑制功能的T细胞刺激测定法，包括将人外周血单核细胞群体或用葡萄球菌肠毒素A刺激的人全血与一种试剂接触并评估该细胞群体的细胞因子生产。
97.权利要求96的测定法，其中该细胞因子是IL-2。
98.权利要求96的测定法，其中该细胞因子生产在从该细胞群体分离的上清中进行评估。
99.权利要求96的测定法，其中该试剂是抗体。
100.权利要求96的测定法，其中该抗体与CTLA-4结合。
101.一种筛选一种试剂的T细胞刺激活性的方法，包括：将该试剂与人外周血单核细胞群体或用葡萄球菌肠毒素A刺激的人全血接触；和
评估该细胞群体的细胞因子生产。
102.权利要求101的方法，其中该细胞因子是IL-2。
103.权利要求101的方法，其中该细胞因子生产在从该细胞群体分离的上清中进行评估。
104.权利要求101的方法，其中该试剂是与CTLA-4结合的抗体。
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