HU225800B1

HU225800B1 - Nucleic acid molecules encoding enzymes having fructosyl polymerase activity and methods for preparation of fructosyl-polymers

Info

Publication number: HU225800B1
Application number: HU0003600A
Authority: HU
Inventors: Arnd G Heyer; Elke Hellwege; Dominique Gritscher
Original assignee: Max Planck Gesellschaft
Priority date: 1997-03-04
Filing date: 1998-03-02
Publication date: 2007-09-28
Also published as: HUP0003600A2; WO1998039460A1; CN1249783A; CZ299374B6; CA2283375A1; BR9808154A; BRPI9808154B1; AU6825498A; EP0977876A1; US20030138927A1; CA2283375C; AR010124A1; PL335657A1; ES2275302T3; DE19708774A1; US6515203B1; JP4101304B2; CZ314099A3; EP0977876B1; DE69836267T2

Description

(54) Fruktozil-polimeráz-aktivitású enzimeket kódoló nukleinsavmoiekulák és eljárások fruktozilpolimerek előállítására (57) Kivonat

A találmány fruktozil-polimeráz-aktivitású enzimeket kódoló nukleinsavmolekulákra vonatkozik. Ezek az enzimek szacharózfüggő szacharóz fruktozil-transzferáz (SST) enzimek.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti nukleinsavmolekulákat tartalmazó vektorok és gazdasejtek, különösen transzformált növényi sejtek és az ezekből regenerált növények, melyek a leírt SST-ket expresszálják.

A találmány tárgyát képezik továbbá rövid láncú fruktozilpolimerek, így 1-kesztóz, nisztóz és/vagy fruktozil-nisztóz előállítására szolgáló eljárások a leírt gazdasejtek és/vagy az általuk termelt SST-k felhasználásával.

HU 225 800

A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 4 lap ábra)

HU 225 800

A jelen találmány szacharózfüggő szacharóz fruktoziltranszferázokat (SST) kódoló nukleinsavmolekulákra, továbbá az ilyen nukleinsavmolekulákat tartalmazó vektorokra és gazdaszervezetekre vonatkozik. A találmány továbbá transzgén növények előállítására szolgáló eljárásokra is vonatkozik rövid láncú fruktozilpolimerek szintetizálása céljából articsókából származó SST-t kódoló DNS-molekula bevezetésével. A jelen találmány tárgyát tehát rövid láncú fruktozil-polimerázok termelésére alkalmas SST előállítására szolgáló eljárások képezik különböző gazdaszervezetekben, valamint maga az SST, melynek segítségével rövid láncú fruktozilpolimereket termelhetünk különféle eljárások segítségével, így például fermentációs vagy más biotechnológiai módszerekkel.

A vízoldható, lineáris polimereknek számos különböző felhasználási területe van, így például alkalmazzák őket vizes rendszerek viszkozitásának növelésére, mint detergenseket, mint szuszpendálószereket vagy szedimentációs eljárásoknál gyorsítókként és komplexképzőkként, de víz megkötésére is. A szacharidalapú polimerek, például a fruktozil-poliszacharidok különösen érdekes nyersanyagok, mivel biológiailag degradálhatok.

Felhasználhatók részben mint regenerálható nyersanyagok az ipari termeléshez és feldolgozáshoz, de a fruktozilpolimerek érdeklődésre tartanak számot mint élelmiszer-adalékok is, például mint mesterséges édesítőszerek. Az alacsony polimerizációs fokú polimerek különösen alkalmasak erre a célra.

Egészen mostanáig csak hosszú láncú fruktán-poliszacharidok előállítási eljárásait írták le növényekben bakteriális eredetű enzimek expresszálásával, valamint olyan transzgén növények előállítását, amelyek Helianthus tuberosus eredetű fruktozil-transzferázt fejeznek ki. A rövid láncú fruktozilpolimerek termelésére alkalmas enzimek előállítási eljárásai eddig még nem ismertek. A WO 89/12386 számú nemzetközi közzétételi iratban szénhidrátpolimerek termelésének lehetőségét, különösen a dextránét vagy polifruktózét írják le transzgén növényekben, előnyösen transzgén növények gyümölcseiben. Az ilyen módosított növények előállításához javasolják mikroorganizmusokból, előnyösen Aerobacter levanicumból, Streptococcus salivariusból és Bacillus subtilisböl a leván invertázok (szacharózok) alkalmazását, vagy Leuconostoc mesenteroidesből a dextrán invertázok használatát. Azonban nem írták le sem az aktív enzimek, sem a leván vagy dextrán, sem a transzgén növények előállítását. A PCT/EP93/02110 számú szabadalmi bejelentés egy eljárást ismertet transzgén növények előállítására, melyek az Erwinia amylovora Gramnegatív baktériumból származó leván invertáz lse génjét expresszálják. A WO 94/14970 számú nemzetközi közzétételi iratban kiméra géneket hordozó növények transzformálását ismertetik, amelyek Bacillus subtilisbcA a sacB gént vagy Streptococcus mutánsból az ftf gént tartalmazzák. A sacB gén esetében a gén 5 nem transzlatált régiójában egy módosítást javasolnak abból a célból, hogy növeljék a transzgén növényekben az expresszió szintjét. A WO 96/21023 számú nemzetközi közzétételi iratban szénhidrátpolimereket szintetizáló enzimeket kódoló DNS-szekvenciákat, és ezeknek a DNSszekvenciáknak a segítségével transzgén növények előállítását ismertetik. A közölt DNS-szekvencia Helianthus tuberosusból származik. A WO 96/21023 számú nemzetközi közzétételi irat ismertetése szerint a leírt DNSszekvenciák nemcsak a fruktán profiljának módosítására alkalmasak, mint például a petúnia és burgonya, hanem magára a Helianthus tuberosuséra is. Ezért a WO 96/21023 számú irat leír többek között olyan transzgén burgonyanövényeket, melyek a Helianthus tuberostvsból származó SST-t expresszálják. Habár a transzgén növényekben expresszált SST aktivitását lehetett detektálni, a szubsztrát szacharóznak csak alacsony szintű konverzióját tudták elérni rövid láncú fruktozil-polimerázzá. Ezt különböző faktorokra lehet visszavezetni, mint például az enzim alacsony affinitása a szubsztrát irányába, vagy az enzim potenciális gátlása az előállított termék által.

Ezért a jelen találmány célja, hogy olyan szacharózfüggő szacharóz fruktozil-transzferázt (SST) kódoló nukleinsavmolekulákat bocsásson rendelkezésre, amelyek segítségével génsebészeti úton módosított szervezetek állíthatók elő, melyek rövid láncú fruktozilpolimerek megformálására képesek.

Ezt a problémát a találmánnyal sikerült megoldani (lásd igénypontokban leírt kiviteli módokat).

A fentiek alapján a találmány tehát SST biológiai aktivitású fehérjéket kódoló nukleinsavmolekulákra vonatkozik, melyeket az alábbi csoportok egyikéből választunk ki:

(a) nukleinsavmolekulák, melyek a SEQ ID NO. 2-ben és a SEQ ID NO. 4-ben bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó fehérjét kódolják;

(b) nukleinsavmolekulák, melyek a SEQ ID NO. 1-ben bemutatott nukleotidszekvenciát vagy egy ennek megfelelő ribonukleotidszekvenciát tartalmaznak;

(c) nukleinsavmolekulák, melyek a SEQ ID NO. 3-ban bemutatott nukleotidszekvenciát vagy egy ennek megfelelő ribonukleotidszekvenciát tartalmaznak;

(d) nukleinsavmolekulák, melyek az (a) vagy (b) pontban említett nukleinsavmolekulákkal hibridizálnak, és egy SST-t kódolnak, melynek aminosavszekvenciája legalább 90%-ban azonos a SEQ ID NO. 2-ben bemutatott aminosavszekvenciával; és (e) nukleinsavmolekulák, melyek nukleotidszekvenciája eltér az (a), (b) vagy (c) pontban említett szekvenciától a genetikai kód degeneráltsága miatt.

A jelen találmánnyal összefüggésben egy fruktozilpolimeráz-aktivitású enzimen egy olyan fehérjét értünk, amely képes a fruktózegységek között a p-2,1-glikozidos vagy a p-2,6-glikozidos kötések kapcsolódását katalizálni. Ezáltal egy fruktozilrész, amely eredetileg szacharózból vagy egy fruktánpolimerből származhat, át tud alakulni.

Egy rövid láncú fruktozilpolimeren egy olyan molekulát értünk, amely legalább kettő, de legfeljebb 100 fruktozilmaradékot tartalmaz, amelyek vagy β-2,1glikozidos kötéseken, vagy p-2,6-glikozidos kötéseken keresztül kapcsolódnak. A fruktozilpolimer glükózré2

HU 225 800 székét hordozhat a végeken, amelyek a glükóz C-1 OH-csoportján keresztül és a fruktozilmaradék C-2 OH-csoportján keresztül kapcsolódnak. Ebben az esetben a fruktozilpolimer egy szacharózmolekulát tartalmaz.

Egyik előnyös kiviteli módban a találmány szerinti nukleinsavszekvenciák articsókából származnak.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a találmány szerinti nukleinsavmolekulák expressziója során nagy mennyiségű fruktozilpolimer termelődik.

Amikor a találmány szerinti nukleinsavmolekulákat alkalmaztuk, a WO 96/21023 számú közzétételi iratban leírt burgonyanövényekkel ellentétben nagy mennyiségű oligofruktánt kaptunk, amely még nagyobb volt, mint a szubsztrát celluláris szacharóztartalma.

A találmány szerinti nukleinsavmolekulák mind DNS-, mind RNS-molekulák lehetnek. Megfelelő DNSmolekulák például a genomiális vagy cDNS-molekulák. A találmány szerinti nukleinsavmolekulákat természetes forrásokból, előnyösen articsókából izolálhatjuk, vagy ismert módszerekkel szintetizálhatjuk.

Szokásosan használt molekuláris biológiai eljárások (lásd például Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) segítségével lehetséges, hogy különböző mutációkat vezessünk be a találmány szerinti nukleinsavmolekulákba. Ennek eredményeképpen módosított biológiai tulajdonságokkal rendelkező fehérjéket szintetizálunk. Egyik lehetőség a deléciós mutánsok előállítása, melyekben a nukleinsavmolekulákat a kódoló DNS-szekvencia 5’- vagy 3’-terminálisának folyamatos deléciójával hozzuk létre, és ez megrövidített fehérjék szintéziséhez vezet. A nukleotidszekvencia 5'-terminálisán ilyen típusú deléciókkal lehetőség van arra, hogy azonosítsuk azokat az aminosavszekvenciákat, amelyek a plasztidokban (átmeneti peptidek) az enzimek transzlokációjáért felelősek. Ez lehetővé teszi olyan enzimek specifikus termelését, amelyek - a megfelelő szekvenciák eltávolításának köszönhetően - többé már nem a vakuólában helyezkednek el, hanem a citoszolban, vagy - amelyek más szignálszekvenciák hozzáadásának köszönhetően - más alkotórészekben helyezkednek el.

Egy másik lehetőség a pontmutációk bevezetése azokon a helyeken, ahol az aminosavszekvencia módosítása befolyásolja például az enzimaktivitást vagy az enzim szabályozását. Ezzel a módszerrel olyan mutánsokat állíthatunk elő, amelyek például módosított K_m-értékkel rendelkeznek, vagy amelyek többé már nincsenek kitéve azoknak a szabályozómechanizmusoknak, amelyek normálesetben a sejtben léteznek az alloszterikus regulációt vagy a kovalens módosítást tekintve.

Továbbá előállíthatunk olyan mutánsokat, amelyek módosított szubsztrát- vagy termékspecificitással rendelkeznek. Olyan mutánsok is előállíthatok, amelyek módosított hőmérsékletprofilt mutatnak aktivitásukat tekintve.

Prokarióta sejtekben történő manipulációhoz a találmány szerinti nukleinsavmolekulákat vagy ezeknek a molekuláknak a részeit génsebészeti eszközökkel bevezethetjük plazmidokba, lehetővé téve ezáltal a mutagenezist vagy egy szekvencia módosítását DNSszekvenciák rekombinációjával. Szokásos módszerek segítségével (vö. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) bázisokat kicserélhetünk, és természetes vagy szintetikus szekvenciákat adhatunk hozzá. Azzal a céllal, hogy a DNS-fragmenseket egymással összekapcsoljuk, adaptereket vagy linkereket adhatunk a fragmensekhez. Továbbá a manipulációkat kivitelezhetjük úgy, hogy alkalmas hasítási helyeket építünk be, vagy hogy a felesleges DNS-t vagy hasítási helyeket eltávolítjuk. Amennyiben inszerciók, deléciók vagy szubsztitúciók lehetségesek, megvalósíthatjuk az in vitro mutagenezist, primer-helyreállítást, hasítást és ligálást. Analitikai módszerként rendszerint szekvenciaanalízist, restrikciós analízist és más biológiai vagy molekuláris biológiai módszereket alkalmazunk.

A „hibridizáció kifejezésen ennek a találmánynak a leírásában a szokásos hibridizációs körülmények közötti hibridizációt értjük, előnyösen szigorú körülmények között, melyeket például Sambrook és munkatársai kézikönyvükben leírtak [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY].

A találmány szerinti molekulákhoz hibridizáló nukleinsavmolekulákat például genomiális vagy cDNSkönyvtárakból izolálhatunk, melyeket articsókából állítottunk elő.

Az ilyen nukleinsavmolekulák azonosítása és izolálása céljából a találmány szerinti molekulákat vagy ezeknek egy részét vagy ezekkel a molekulákkal ellentétes komplementereket használhatjuk fel, például hibridizálás segítségével a szokásos módszerek szerint (például Sambrook et al. - lásd fent).

Hibridizációs próbaként azokat a nukleinsavmolekulákat alkalmazhatjuk például, melyek pontosan vagy lényegében a SEQ ID NO. 1-ben bemutatott nukleotidszekvenciával rendelkeznek, vagy ezeknek a szekvenciáknak részeit. A hibridizációs próbaként használt fragmensek szintetikus fragmensek lehetnek, amelyeket konvencionális szintetikus módszerek segítségével állítunk elő, és szekvenciájuk lényegében megfelel a találmány szerinti nukleinsavmolekula szekvenciájának.

A találmány szerinti nukleinsavmolekulákhoz hibridizáló molekulák közé tartoznak a nukleinsavmolekulák fragmensei, származékai és allélvariánsai is, melyek egy, a fentiekben leírt találmány szerinti fehérjét kódolnak. „Fragmensek alatt a nukleinsavmolekulák olyan részeit értjük, amelyek elegendően hosszúak ahhoz, hogy a leírt fehérjék egyikét kódolják. A „származék” kifejezés az itt használt értelemben ezeknek a molekuláknak azokat a szekvenciáit jelenti, melyek a fentiekben leírt nukleinsavmolekulák szekvenciáitól egy vagy több pozícióban különböznek, ugyanakkor ezekkel a szekvenciákkal magas fokú homológiát mutatnak. A homológia ezáltal legalább 40%-os szekvenciaazonosságot jelent, előnyösen legalább 60% azo3

HU 225 800 nosságot, még előnyösebben több mint 80% és legelőnyösebben több mint 90% azonosságot. Az ilyen nukleinsavmolekulák által kódolt fehérjék olyan szekvenciával rendelkeznek, amely legalább 80%-ban azonos a SEQ ID NO. 2-ben bemutatott aminosavszekvenciával, előnyösen 85%-ban és legelőnyösebben több mint 90%, 95%, 97% és 99%-ban. A fent leírt nukleinsavmolekuláktól való eltéréseket delécióval, szubsztitúcióval, inszercióval vagy rekombinációval hozhatjuk létre.

A nukleinsavmolekulák, melyek a fent leírt molekulákkal homológok, és amelyek ezeknek a molekuláknak a származékait képviselik, rendszerint ezeknek a módosításokat reprezentáló molekuláknak a variánsai, melyek ugyanazzal a biológiai funkcióval rendelkeznek. Ezek a természetben előforduló variánsok, például más organizmusokból származó szekvenciák vagy a természetben előforduló mutációk, vagy specifikus mutagenezissel bevezetett mutációk lehetnek. Ezenkívül a variánsok szintetikusan előállított szekvenciák is lehetnek. Az allélvariánsok vagy a természetben előforduló variánsok vagy szintetikusan előállított variánsok, vagy rekombináns DNS-eljárásokkal létrehozott variánsok lehetnek.

A találmány szerinti nukleinsavmolekulák különböző variánsai által kódolt fehérjék bizonyos közös tulajdonságokat mutatnak, így például enzimaktivitás, molekulatömeg, immunológiai reaktivitás, vagy konformációs vagy fizikai tulajdonságok, mint az elektroforetikus mobilitás, kromatográfiás viselkedés, szedimentációs koefficiens, oldhatóság, spektroszkópiás tulajdonságok, stabilitás; pH-optimum, hőmérséklet-optimum.

A találmány egy másik előnyös kiviteli módja olyan nukleinsavmolekulákra vonatkozik, amelyek specifikusan hibridizálnak a nukleinsavmolekulák transzkriptumaihoz. Ezek a nukleinsavmolekulák előnyösen olyan oligonukleotidok, melyek legalább 10, előnyösen legalább 15 és legelőnyösebben legalább 50 nukleotidot tartalmaznak. A találmány szerinti nukleinsavmolekulákat és oligonukleotidokat felhasználhatjuk például primerekként egy PCR reakcióban. Továbbá antiszensz szerkezetek vagy alkalmas ribozimeket kódoló DNSmolekulák komponensei lehetnek.

A találmány továbbá a találmány szerinti nukleinsavmolekulákat hordozó vektorokra is vonatkozik. Ezek előnyösen plazmidok, kozmidok, vírusok, bakteriofágok vagy más, a géntechnológia területén szokásosan alkalmazott vektorok.

Előnyösen a találmány szerinti nukleinsavszekvenciát működőképesen kapcsoljuk a szabályozóelemekhez a találmány szerinti vektorban, hogy a transzkripciót és egy RNS szintézisét biztosítsuk a prokarióta és/vagy eukarióta sejtekben, melyeket a vektorral transzlatálhatunk.

A találmány szerinti expressziós vektorok lehetővé teszik olyan enzimek termelését, melyek rövid láncú fruktozilpolimereket szintetizálnak a különféle gazdaszervezetekben.

A kódolt enzimeket felhasználhatjuk a gazdaszervezeteken kívül is rövid láncú fruktozilpolimerek termelésére. Ekkor fermentációs és egyéb biotechnológiai módszereket alkalmazhatunk rövid láncú fruktozilpolimerek termelésére. Például az is elképzelhető, hogy fruktozilpolimereket immobilizált enzimek segítségével állítsunk elő.

A találmány szerint előnyösek a patatin B33 promoter szabályozóelemei. Egyéb előnyös promoterek a 35S CaMV promoter és az alkohol-dehidrogenáz gén promotere Saccharomyces cerevisiae-bő\.

A találmány szerinti vektorok további funkcionális egységeket hordozhatnak, melyek hatásosak a vektor stabilizálásában a gazdaszervezetben, így például egy bakteriális replikációs origót vagy 2-μ DNS-t Saccharomyces cerevísiae-ben történő stabilizáláshoz. Továbbá az agrobakteriális T-DNS „left bordér” és „right bordér” szekvenciáit tartalmazhatják, melyek a növények genomjába történő stabil integrációt teszik lehetővé.

Ezen túlmenően a találmány szerinti vektorok funkcionális terminátorokat is tartalmazhatnak, mint például az octopin szintáz gén terminátorát agrobaktériumokból.

Egy másik előnyös kiviteli módban a találmány szerinti nukleinsavmolekulákat egy funkcionális szignálszekvenciát kódoló nukleinsavmolekulán keresztül kapcsoljuk a találmány szerinti vektorhoz, hogy az enzimet a különböző sejtalkotórészekbe irányítsuk. Ezt a módosítást megvalósíthatjuk például egy N-terminális szignálszekvencia hozzáadásával a magasabb rendű növények sejtmembránjába történő szekrécióhoz, de bármely más módosítás is, amely egy szignálszekvencia és a kódolt fruktozil-transzferáz fúziójához vezet, a találmány oltalmi körébe tartozik.

A találmány egyik különösen előnyös kiviteli módja a pB33-cySST plazmidra vonatkozik, melynek megszerkesztését a példákban írjuk le (1. ábra).

A találmány szerinti nukleinsavmolekulák prokarióta sejtekben, például Escherichia coliban történő expressziója érdeklődésre tart számot, mivel ezen az úton lehetséges, hogy ezen molekulák által kódolt enzimek enzimatikus aktivitásait közelebbről jellemezzük.

A találmány egy további előnyös kiviteli módja olyan gazdasejtekre vonatkozik, melyek tranziensen (átmenetileg) vagy stabilan tartalmazzák a találmány szerinti nukleinsavmolekulákat vagy vektorokat. Gazdasejten egy olyan mikroorganizmust értünk, amely képes in vitro a rekombináns DNS-t felvenni, és ha lehetséges, a találmány szerinti nukleinsavmolekulák által kódolt fehérjéket szintetizálni.

Előnyösen ezek a sejtek prokarióta vagy eukarióta sejtek. A találmány különösen növényi sejtekre vonatkozik, melyek a találmány szerinti vektorrendszereket vagy ezek származékait vagy részeit tartalmazzák. Előnyösen ezek képesek enzimeket szintetizálni rövid láncú fruktozilpolimerek termelésére annak a ténynek köszönhetően, hogy felvették a találmány szerinti vektorrendszereket, ezek származékait vagy részeit. A találmány szerinti sejtek előnyösen azzal jellemezhetők, hogy a bevezetett, találmány szerinti nukleinsavmolekula vagy heterológ a transzformált sejttel, azaz természetesen nem fordul elő ezekben a sejtekben, vagy olyan helyen lokalizált a genomban, amely különbözik

HU 225 800 a megfelelő természetesen előforduló szekvencia helyétől.

A találmány még továbbá a találmány szerinti nukleinsavmolekulák által kódolt fehérjékre is vonatkozik, valamint ezek előállítási eljárásaira, melynek során egy találmány szerinti gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztünk, melyek lehetővé teszik a fehérje szintézisét, és ezt követően a fehérjét a tenyésztett sejtekből és/vagy tenyészközegből izoláljuk. A találmány továbbá SST-kre is vonatkozik, amelyek a találmány szerinti növényekkel termelhetők.

A találmány szerinti nukleinsavmolekulák kidolgozásával lehetővé vált, hogy a génsebészet segítségével bármely organizmusban rövid láncú fruktozilpolimereket termeljünk, míg egészen mostanáig arra volt lehetőség, hogy a növényeket konvencionális módszerekkel, például nemesítő módszerekkel úgy módosítsuk, hogy képesek legyenek fruktozilpolímereket szintetizálni. A találmány szerinti fehérjék aktivitásának fokozásával, például a megfelelő nukleinsavmolekulák intenzív expresszálásával, vagy olyan mutánsok létrehozásával, amelyek többé nincsenek alávetve a sejtspecifikus szabályozómechanizmusoknak, és/vagy amelyek módosított hőmérséklet-függőséggel bírnak aktivitásukat tekintve, lehetővé vált, hogy a génsebészeti úton módosított növényekben megnöveljük a hozamot.

Ezért most már lehetséges a találmány szerinti nukleinsavmolekulák expressziója növényi sejtekben abból a célból, hogy fokozzuk a megfelelő SST aktivitását, vagy bevezessük az SST-t ezt az enzimet normálisan nem expresszáló sejtekbe. Továbbá arra is lehetőség nyílt, hogy a találmány szerinti nukleinsavmolekulákat módosítsuk a területen jártas szakember számára ismert módszerekkel azzal a céllal, hogy olyan találmány szerinti SST-ket kapjunk, melyek többé már nem alanyai a sejtspecifikus szabályozómechanizmusoknak, vagy amelyek módosított hőmérséklet-függőséggel vagy szubsztrát- vagy termékspecificitással rendelkeznek.

Amikor a nukleinsavmolekulákat növényekben expresszáljuk, a szintetizált fehérje a növényi sejt bármely részében elhelyezkedhet. Annak elérésére, hogy a lokalizáció egy specifikus sejtalkotórészben következzen be, a vakuólában történő lokalizációt biztosító szekvenciát el kell távolítani, és - ha szükséges - a visszamaradó kódolórégiót hozzá kell kapcsolni a fehérje lokalizációját egy specifikus alkotórészben biztosító DNSszekvenciákhoz. Az ilyen szekvenciák ismertek [lásd például Braun et al.: EMBO J. 11, 3219-3227 (1992); Wolter et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 846-850 (1988); Sonnewald et al.: Plánt J. 1, 95-106 (1991)]. A találmány ennélfogva egy vagy több találmány szerinti nukleotidmolekulával transzformált transzgén növényi sejtekre, valamint az ilyen transzformált sejtekből származó transzgén növényi sejtekre is vonatkozik. Ezek a sejtek egy vagy több találmány szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaznak, hozzákapcsolva előnyösen olyan szabályozó DNS-elemekhez, melyek a növényi sejtben történő transzkripciót biztosítják, különösen egy promoterhez. Az ilyen sejtek eltérhetnek a természetesen előforduló növényi sejtektől azáltal, hogy legalább egy találmány szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaznak, amely természetesen nem fordul elő ezekben a sejtekben, vagy azáltal, hogy egy ilyen molekula beintegrálódik a növényi sejt genomjába, ahol az természetesen nem fordul elő, azaz egy másik genomiális régióban.

A transzgén növényi sejteket teljes növényekké regenerálhatjuk a szakember számára jól ismert módszerekkel. A találmány tárgyát képezik tehát azok a növények is, melyek a találmány szerinti transzgén növényi sejtek regenerációjával kaphatók meg. Továbbá a találmány tárgyát képezik a fent leírt transzgén növényi sejteket tartalmazó növények. A transzgén növények alapvetően bármilyen növényi fajok, azaz mind egyszikűek, mind kétszikűek lehetnek. Előnyösek a haszonnövények, különösen azok, melyek keményítőt szintetizálnak és/vagy raktároznak, mint például a búza, árpa, rizs, kukorica, cukorrépa, cukornád vagy burgonya. Különösen előnyösek a szacharózt raktározó növények.

A találmány a találmány szerinti növények szaporítóanyagaira és begyűjtött terméseire is vonatkozik, mint például gyümölcsök, magok, gumók, gyökértörzsek, csíranövények, dugványok stb.

A találmány szerinti transzgén növényi sejtek és növények rövid láncú fruktozilpolímereket szintetizálnak a legalább egy találmány szerinti nukleinsavmolekula expressziójának vagy hozzáadott expressziójának következtében.

A találmány tehát olyan rövid láncú fruktozilpolimerekre is vonatkozik, melyek a találmány szerinti transzgén növényi sejtekből vagy növényekből, valamint ezek szaporítóanyagából vagy terméseiből kaphatók meg.

A találmány szerinti transzgén növényi sejteket teljes növényekké regenerálhatjuk a szakember számára ismert módszerek segítségével. Ezért a találmány tárgyát képezik azok a növények is, melyek a találmány szerinti transzgén növényi sejteket tartalmazzák. Ezek a növények előnyösen gazdasági növények, különösen a szacharózt és/vagy keményítőt szintetizáló és/vagy tároló növények. Különösen előnyös növény a burgonya. A találmány vonatkozik a találmány szerinti növények szaporítóanyagára is, különösen a gumókra.

Annak érdekében, hogy a találmány szerinti nukleinsavmolekulát a növényi sejtekben szensz (értelmes) vagy antiszensz (értelmetlen) orientációban expresszáljuk, hozzákapcsoljuk olyan szabályozóelemekhez, melyek garantálják a transzkripciót a növényi sejtekben. Ezek előnyösen promoterek. Alapvetően bármely, növényi sejtekben aktív promoter alkalmas az expresszióhoz.

A promotert annak alapján szelektálhatjuk, hogy az expresszió konstitutív módon vagy csak egy bizonyos szövetben, a növény fejlődésének egy bizonyos fokán, vagy egy külső inger által meghatározott időpontban történik. A növényt tekintve a promoter homológ vagy heterológ lehet. Alkalmas promoterek például a karfiolmozaik-vírus 35S RNS promotere és a kukoricából

HU 225 800 származó ubiquitinpromoter a konstitutív expresszióhoz, különösen előnyös a patatin gén B33 promoter [Rocha-Sosa et al.: EMBO J. 8, 23-29 (1989)] a gyökérspecifikus expresszióhoz burgonyában, vagy egy promoter, amely az expressziót csak a fotoszintetikusán aktív szövetben biztosítja, mint például az ST-LS1 promoter [Stockhaus et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7943-7947 (1987)], vagy egy endospermiumspecifikus expresszióhoz a HMG promoterek búzából, az USP promoter, a Phaseolin promoter vagy kukoricából a zein gének promoterei.

Ezenkívül egy terminátorszekvencia is jelen lehet a transzkripció korrekt befejeződésének biztosítására, valamint egy poli-A farokrészt is hozzáadhatunk a transzkriptumhoz, amelynek szerepe a transzkriptumok stabilizálása. Ilyen elemek ismertek az irodalomból [vö. Gielen et al.: EMBO J. 8, 23-29 (1989)], és tetszés szerint kicserélhetők.

Abból a célból, hogy magasabb rendű növényekbe idegen géneket bevezessünk, nagyszámú klónozóvektor áll rendelkezésre, melyek egy replikációs szignált tartalmaznak E. colihoz és egy markergént a transzformáit bakteriális sejtek szelekciójához. Ilyen vektorok például a pBR322, pUC széria, M13 széria, pACYC184 és a többiek. A kívánt szekvenciát egy alkalmas hasítóhelynél vezethetjük be a vektorba. A kapott plazmid alkalmas az E. coli sejtek transzformálására. A transzformált E. coli sejteket ezután egy megfelelő tápközegben tenyésztjük, majd összegyűjtjük és lizáljuk. A plazmidot regeneráljuk. Rendszerint restrikciós analízist, gélelektroforézist és más biokémiai vagy molekuláris biológiai módszereket használunk a regenerált plazmid-DNS jellemzésére. Minden manipuláció után a plazmid-DNS-t hasíthatjuk, és a regenerált DNS-fragmenseket másik DNS-szekvenciákhoz kapcsoljuk. Minden egyes plazmid-DNS-szekvenciát klónozhatunk ugyanabba a plazmidba vagy más plazmidokba.

Nagyszámú eljárás áll rendelkezésre a DNS bevezetésére egy növényi gazdasejtbe. Ezek a módszerek magukban foglalják a növényi sejtek transzformálását T-DNS-sel, a transzformációhoz eszközként Agrobacterium tumefaciens vagy Agrobacterium rhizogenes felhasználását, a protoplasztok fúzióját, a beinjekciózást, a DNS elektroporációját, a DNS bevezetését biolisztikus módszerek segítségével, valamint további lehetőségeket.

A DNS beinjekciózásához és elektroporációjához a növényi sejtekbe nincs specifikus követelmény az alkalmazott plazmidokkal szemben. Egyszerű plazmidok, mint például a pUC-származékok, alkalmazhatók. Ha a teljes növényt akarjuk regenerálni az ilyen transzformáit sejtekből, egy szelektálható markert kell alkalmazni.

A kívánt gének növényi sejtbe történő bevezetésének módszerétől függően további DNS-szekvenciákra lehet szükség. Ha például a Ti- vagy Ri-plazmidot használjuk a növényi sejt transzformálására, legalább a Ti- és az Ri-plazmid jobb oldali szegélyezöszekvenciáját („right bordér), gyakran azonban a jobb és bal oldali szegélyezőszekvenciáját („right és „left bordér”) hozzá kell kapcsolni, mint farkazórégiókat, a bevezetni kívánt génekhez.

Ha agrobaktériumokat használunk a transzformáláshoz, a bevezetendő DNS-t specifikus plazmidokba kell klónozni, vagy egy átmeneti közbenső vektorba vagy egy bináris vektorba. Az átmeneti vektorokat homológ rekombinációval beintegrálhatjuk az agrobaktérium Ti- vagy Ri-plazmidjába azoknak a szekvenciáknak köszönhetően, amelyek homológok a T-DNS-ben lévő szekvenciákkal. A Ti- vagy Ri-plazmid továbbá tartalmazza a vir régiót, amely a T-DNS transzferjéhez szükséges. Az átmeneti vektorok nem képesek replikálódni az agrobaktériumokban. Egy helper plazmid segítségével az átmeneti vektort átvihetjük az Agrobacterium tumefaciensbe (konjugáció). A bináris vektorok képesek mind az E. coliban, mind az agrobaktériumokban replikálódni. A bináris vektorok tartalmaznak egy szelekciós markergént és egy linkért vagy egy polilinkert keretben a jobb oldali vagy bal oldali T-DNS szegélyrégióval. Ezeket közvetlenül transzformálhatjuk az agrobaktériumokba [Holster et al.: Mól. Gén. Génét. 163, 181-187 (1987)]. Ha az agrobaktérium gazdasejtként szolgál, akkor tartalmaznia kell egy vir régiót hordozó plazmidot. A vir régió a T-DNS növényi sejtbe történő beviteléhez szükséges. A T-DNS lehet hozzáadott T-DNS. Az ily módon transzformált agrobaktériumot használjuk a növényi sejtek transzformálására. A T-DNS alkalmazását a növényi sejtek transzformálására széleskörűen tanulmányozták és leírták az EP-A 120 516 számú közrebocsátási iratban és az alábbi irodalmi helyeken: Hoekema: The Binary Plánt Vector System, Offsetdrukkerij Kanters Β. V., Alblasserdam (1985) V. kötet; Fraley és munkatársai: Crit. Rév. Plánt Sci. 4, 1-46 és An és munkatársai: EMBO J. 4, 277-287(1985).

A DNS növényi sejtbe történő bevitelét megvalósíthatjuk az Agrobacterium tumefaciens és az Agrobacterium rhizogenes együttes tenyésztésével. A megfertőzött növényi anyagból (például egy levéldarab, szárszegmens, de szuszpenzióban tenyésztett protoplasztok vagy növényi sejtek is szóba jöhetnek) a teljes növényt regenerálhatjuk egy alkalmas tápközegben, amely antibiotikumokat vagy biocideket tartalmazhat a transzformált sejtek szelekciójához. Az így kapott növényeket megvizsgálhatjuk a bevezetett DNS jelenlétére. Az idegen DNS bevezetésének egyéb lehetőségei ismertek, melyek biolisztikus módszereket vagy protoplaszttranszformációt alkalmaznak [vö. például Willmitzer L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler szerk.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge],

Az egyszikű növények transzformálására szolgáló alternatív rendszerek közé tartozik a transzformáció kivitelezése biolisztikus megközelítés segítségével, a DNS elektromosan vagy kémiailag indukált bevezetése a protoplasztokba, a részlegesen permeabilizált sejtek elektroporációja, a DNS makroinjektálása a virágokba, a DNS mikroinjektálása a mikrospórákba és proemb6

HU 225 800 riókba, a DNS bejuttatása a csírázó pollenbe, és a DNS bejuttatása az embriókba hullámokkal [áttekintésre: Potrykus: Physiol. Plánt 269-273 (1990)].

Mivel a kétszikű növények transzformációja a Ti-plazmid-vektorrendszerek útján Agrobacterium tumefaciens segítségével jól kidolgozott, a közelmúltban végzett kutatások azt mutatják, hogy az egyszikű növények is hozzáférhetők az Agrobacteriumra alapozott vektorok segítségével végzett transzformáció számára [Chan et al.: Plánt Mól. Bioi. 22, 491-506 (1993); Hiei et al.: Plánt J. 6, 271-282 (1994); Bytebier et al.: Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 5345-5349 (1987); Raineri et al.: Bio/Technology 8, 33-38 (1990); Gould et al.: Plánt Physiol. 95, 426-434 (1991); Mooney et al.: Plánt, Cell Tiss. and Org. Cult. 25, 209-218 (1991); Li et al.: Plánt Mól. Bioi. 20, 1037-1048 (1992)].

A fent említett három transzformációs szisztémát alkalmazhatjuk a különféle gabonafélékre: a szövetek elektroporációját, a protoplasztok transzformálását és a DNS bejuttatását részecskebombázással a regeneratív szövetben és sejtekben [lásd Jáhne et al.: Euphytica 85, 35-44 (1995)].

A búza transzformálását ismételten leírták az irodalomban [áttekintésre lásd Maheshwari et al.: Critical Reviews in Plánt Science 14(2), 149-178 (1995)].

A jelen találmány tehát olyan növényekre vonatkozik, amelyek legalább egy, előnyösen több, a találmány szerinti vektorrendszereket vagy ezek származékát vagy részeit tartalmazó sejtet tartalmaznak, és képesek rövid láncú fruktozilpolimereket termelő enzimek szintetizálására a találmány szerinti vektorrendszerek vagy ezek származékai vagy részei bevezetésének köszönhetően. A találmány tehát rendelkezésre bocsát számos fajba, nemzetségbe, családba, rendre és osztályba tartozó növényt, amelyek képesek rövid láncú fruktozilpolimereket termelő enzimeket szintetizálni a bevezetett vektorrendszereknek vagy származékaiknak vagy részeiknek tulajdoníthatóan. Mivel az ismert növények nem képesek csak rövid láncú fruktozilpolimerek előállítására, azt könnyen ellenőrizhetjük, vajon az eljárást sikeresen kiviteleztük-e, például a fruktóztartalmú cukrok kromatográfiás analízisével. Előnyösek ezzel szemben azok a növények, melyek fruktozilpolimereket tartalmaznak, mivel a molekulaméret, azaz a rövid láncú fruktozilpolimer mérete meghatározott. Ezenkívül az elhelyezkedés a különböző sejtalkotórészekben és különféle szervekben, valamint az expressziós ráta megnövekedése, és ennek következtében magasabb hozam is lehetséges.

A találmány egy másik előnyös szempontja szerint rövid láncú fruktozilpolimerek, így 1-kesztóz, nisztóz és/vagy fruktozil-nisztóz termelésére szolgáló eljárásra vonatkozik, amely abban áll, hogy (a) szacharózt vagy ezzel ekvivalens szubsztrátot érintkeztetünk a találmány szerinti SST-vel olyan körülmények között, melyek lehetővé teszik az 1-kesztózzá, nisztózzá és/vagy fruktozil-nisztózzá történő konverziót; és (b) az ily módon előállított 1-kesztózt, nisztózt és/vagy fruktozil-nisztózt kinyerjük.

Az előállított fruktozilpolimerek természete függ a fruktozil-transzferáz enzimatikus specifitásától. Amikor a találmány szerinti SST-t alkalmazzuk, előnyösen kesztóz (kestose) termelődik, de nisztóz (nystose) és fruktozil-nisztóz nem termelődik.

Továbbá a találmány egy találmány szerinti növényi sejtből vagy növényből vagy szaporítóanyagból vagy a találmány szerinti növények vagy növényi sejtek összegyűjtött termékéből előállított vagy a fent leírt találmány szerinti eljárások valamelyikével kapott fruktozilpolimerekre is vonatkozik. Ezeket a fruktozilpolimereket előnyösen felhasználhatjuk élelmiszerek előállításához, mint például pékáruk vagy száraztészták. Előnyösen ezeket a fruktozilpolimereket vizes rendszerek viszkozitásának növelésére, detergensekként, szuszpendálószerekként vagy a szedimentációs eljárás gyorsítására és komplexképzőkként használjuk fel, de vízmegkötőként is felhasználhatjuk.

Az ábrák rövid ismertetése

1. ábra: bemutatja a pB33-cySST plazmid megszerkesztését.

Vektor: pBinB33 [a pBin19 származéka; Bevan: Nucl. Acids Rés. 12, 8711 (1984)]

Promoter: B33 promoter [Rocha-Sosa et al.:EMBOJ. 8, 23-29(1989)]

Donor: Solanum tuberosum Kódolórégió: SST gén a Cynare scolymusból

Orientáció: szensz (értelmes)

Terminátor: octopin szintáz gén poliadenilációs szignálja az A. tumefaciens pTiACH5 plazmidból [Gielen et al.: EMBO J. 3, 835-846 (1984)]

Donátor: Agrobacterium tumefaciens Rezisztencia: kanamicin

2. ábra: bemutatja az oldható cukrok analízisét transzgén növények gumójában, melyeket a pB33-cySST vektorrendszer alkalmazásával állítottunk elő. A genetikai módosítást, melynek következtében a rövid láncú fruktozilpolimerek (különösen az 1-kesztóz) termelődtek, jeleztük.

3. ábra: bemutatja az oldható cukrok analízisét transzgén növényekben, melyeket a pB33-cySST, illetve a p35S-cySST vektorrendszer segítségével állítottunk elő, összehasonlítva a vad típusú növényekkel.

Az alábbi példákkal részletesebben ismertetjük a találmányt, ezek azonban csak a találmány illusztrálására szolgálnak, és semmiképp sem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

1. példa: Szacharózfüggő szacharóz fruktoziltranszferázt kódoló cDNS azonosítása, izolálása és jellemzése articsókából (Cynare scolymus) Totális RNS-t izoláltunk articsóka virágtányérjaiból (Sambrook et al., lásd fent). A poli(A)⁺ mRNS-t a Po7

HU 225 800 lyATtract (Promega Corporation, Madison, Wl, USA) mRNS-izolációs rendszer segítségével izoláltuk. A komplementer DNS-t (cDNS) 5 pg ilyen RNS-ből ZAp-cDNA szintézis kit (Stratagene) segítségével a gyártó utasításait követve állítottuk elő. 2*10⁶ független rekombináns fágot kaptunk. Az amplifikált cDNSkönyvtárat szokásos módszerekkel egy ³²P-vel jelzett DNS-fragmenssel szűrtük, mely megfelelt a 6-SFT cDNS 3’-terminálisának [Sprenger et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11 652 (1995)]. Ezt a fragmenst a komplett RNS-ből nyertük RT-PCR segítségével (RTPCR Kit, Stratagene, Heidelberg, Németország) mátrix formájában a könnyen indukált (72 óra) elsődleges levelekből árpából. A pozitív kiónokat tovább vizsgáltuk.

2. példa: A pCy21 plazmid cDNS-inszartjeinek szakvenciaanallzise

A plazmid-DNS-t a pCy21 klónból izoláltuk. A cDNS-inszerció szekvenciáját szokásos módon didezoxinukleotid-módszerrel határoztuk meg [Sanger et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)].

A pCy21 klón inszertje egy 2055 bp méretű DNS. A nukleotidszekvenciát a SEQ ID NO. 1-ben mutatjuk be, és a megfelelő aminosavszekvenciát a SEQ ID NO. 2-ben adjuk meg.

A szekvenciaanalízis és egy összehasonlítás a már publikált szekvenciákkal azt mutatja, hogy a SEQ ID NO. 1-ben bemutatott szekvencia új, és tartalmaz egy kódolórégiót, amely homológiákat mutat már organizmusokból származó SST-kkel.

3. példa: A pB33-cySSTplazmid előállítása és a plazmid bevezetése a burgonya genomjába

A pB33-cySST plazmid három fragmenst, úgymint A, B és C, tartalmaz a pBin19 bináris vektorban [Bevan: Nucl. Acids Rés. 12, 8711 (1984), Becker szerint módosítva: Nucl. Acids Rés. 18, 203 (1990) - vö.

1. ábra]. Az A fragmens tartalmazza a burgonya b33 patatin génjének B33 promoterét. Az tartalmaz egy Dral fragmenst (a -1512 pozíciótól a +14 pozícióig) a B33 patatin génjéből [Rocha-Sosa et al.: EMBO J. 8, 23-29 (1989)], amelyet a pBin19-Hyg polilinkerének EcoRI és Sacl hasítási helyei közé inszertáltunk. A B fragmens tartalmazza a SEQ ID NO. 1-ben bemutatott szekvencia kódolórégióját. A B fragmenst a pBluescript SK vektorból kaptuk meg tompa végekkel Notl fragmensként, amelybe az EcoRI hasítási helyre inszertáltuk egy EcoRI/Notl llnkerszekvencia útján. A C fragmens tartalmazza a pTiCH5 [Gielen et al.: EMBO J. 835-846 (1984)] Ti-plazmid T-DNS 3 génjének poliadenilációs szignálját, a 11 749 és 11 939 pozíciók közötti nukleotidokat. A poliadenilációs szignált mint Pvull-Hindlll fragmenst izoláltuk a pAGV 40 plazmidból [Herrera-Estrella et al.: Natúré 303, 209-213 (1983)], és klónoztuk a pBin19-Hyg polilinkerének Sphl és Hindii! hasítási helyei közé, miután az Sphl linkereket hozzáadtuk a Pvull hasítási helyhez. A pB33-cySST plazmid mérete körülbelül 14 kb. Ezt a plazmidot bevezettük agrobaktériumokba [Höfgen és Willmitzer: Nucleic Acids Rés. 16, 9877 (1988)].

A pB33-cySST plazmidot bevezettük burgonyanövényekbe Agrobacterium által indukált géntranszfer útján a fentiekben leírt szokásos módszerek szerint. Intakt növényeket regeneráltunk a transzformált sejtekből. A regenerált növényekből enzimkivonatokat készítettünk, és megvizsgáltuk őket fruktozilpolimerek jelenlétére. Az analízist Röber által leírtak szerint végeztük (Planta 199, 528-536). Ezzel a vektorral transzformált nagyszámú növény gumójának analízisét elvégezve világosan látható a rövid láncú fruktozilpolimerek, különösen az 1-kesztóz jelenléte, amelyet a találmány szerinti SST gén expressziójának lehet tulajdonítani (vö.

2. ábra).

4. példa: Oldható cukrok analízise vad típusú és

SST-t tartalmazó transzgén növényekben

A pB33-cySST, illetve a 35S-cySST vektort (amely a SEQ ID NO. 1 kódolórégióját a 35S promoter kontrollja alatt tartalmazza) tartalmazó transzgén növényeket generáltunk a 3. példában leírtak szerint. Kivonatokat készítettünk a transzgén és vad típusú növényekből, és megvizsgáltuk ezeket a fruktozilpolimerek jelenlétére: lásd 3. példa. A HPAEC-analízis, melyet a 3. ábrán mutatunk be, bizonyítja az oligofruktánok termelését. A kapott eredményeket az 1. táblázatban összegeztük.

Claims

1. Nukleinsavmolekula, amely egy szacharózfüggő szacharóz fruktozil-transzferázt (SST) kódol, és az alábbi csoportokban megadott nukleinsavmolekulák egyike:

(b) nukleinsavmolekulák, melyek a SEQ ID NO. 1-ben bemutatott nukleotidszekvenciát vagy egy megfelelő ribonukleotidszekvenciát tartalmaznak;

(c) nukleinsavmolekulák, melyek a SEQ ID NO. 3-ban bemutatott nukleotidszekvenciát vagy egy megfelelő ribonukleotidszekvenciát tartalmaznak; és (d) nukleinsavmolekulák, melyek az (a)-(c) pontban említett nukleinsavmolekuláknak egy fragmensét tartalmazzák, amely egy olyan fehérjét kódol, amely képes a fruktózegységek közötti β-2,1 -glikozidos vagy p-2,6-glikozidos kötések kialakulását katalizálni.

2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amely egy DNS-molekula.

3. A 2. igénypont szerinti DNS-molekula, amely egy cDNS-molekula.

4. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amely egy RNS-molekula.

5. Vektor, amely egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaz.

6. Az 5. igénypont szerinti vektor, amelyben a nukleinsavmolekula működőképesen kapcsolódik olyan szabályozóelemekhez, melyek lehetővé teszik egy transzlatálható RNS transzkripcióját és szintézisét prokarióta és/vagy eukarióta sejtekben.

7. A 6. igénypont szerinti vektor, amelyben a szabályozóelemek a patatin B33 promoterből származnak.

8. Gazdasejt, amely egy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti heterológ nukleinsavmolekulát vagy egy 6-7. igénypontok szerinti vektort tartalmaz.

9. Eljárás az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula által kódolt SST termelésére, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti gazdasejtet az SST szintézisét lehetővé tevő körülmények között tenyésztjük, és az SST-t a tenyésztett sejtekből és/vagy tápközegből izoláljuk.

10. SST, melyet egy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula kódol, vagy a 9. igénypont szerinti eljárással előállítható.

11. Transzgén növényi sejt, amely egy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti heterológ nukleinsavmolekulát vagy egy 6-7. igénypontok szerinti vektort tartalmaz, amelyben a Cynara scolymusbó\ származó SST-t kódoló nukleinsavmolekula olyan szabályozóelemek kontrollja alatt áll, melyek lehetővé teszik egy transzlatálható mRNS transzkripcióját növényi sejtekben.

12. Növény, amely 11. igénypont szerinti növényi sejteket tartalmaz.

13. A 12. igénypont szerinti növény, amely búza, árpa, rizs, kukorica, cukorrépa, cukornád vagy burgonya.

14. A 13. igénypont szerinti növény, amely egy burgonyanövény.

15. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti növény szaporítóanyaga, amely 11. igénypont szerinti növényi sejteket tartalmaz.

16. A 12-14. igénypontok szerinti növény termése, amely 11. igénypont szerinti növényi sejteket tartalmaz, ahol az említett termés gyümölcsök, magok, gumók, gyökértörzsek, csíranövények és dugványok közül kerül kiválasztásra.

17. Eljárás 1 -kesztóz, nisztóz és/vagy fruktozil-nisztóz előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy 8. igénypont szerinti gazdasejtet vagy egy 11. igénypont szerinti növényi sejtet az 1. igénypont szerinti nukleinsav által kódolt SST képződését és konverzióját lehetővé tevő körülmények között tenyésztünk, és ha szükséges, külsőleg hozzáadunk szacharózt az 1-kesztózhoz, nisztózhoz és/vagy fruktozil-nisztózhoz; és (b) az így termelt 1-kesztózt, nisztózt és/vagy fruktozilnisztózt kinyerjük a tenyésztett sejtekből vagy a tápközegből.

18. Eljárás 1 -kesztóz, nisztóz és/vagy fruktozil-nisztóz előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) érintkezésbe hozunk szacharózt a 10. igénypont szerinti SST-vel az 1-kesztózzá, nisztózzá és/vagy fruktozil-nisztózzá való konverziót biztosító körülmények között; és (b) kinyerjük az így kapott 1 -kesztózt, nisztózt és/vagy fruktozil-nisztózt.

19. Eljárás 1-kesztóz, nisztóz és/vagy fruktozil-nisztóz előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) termesztünk egy 12-14. igénypontok szerinti növényt; és (b) kinyerjük az 1-kesztózt, nisztózt és/vagy fruktozilnisztózt ezekből a növényekből vagy a 15. igénypont szerinti szaporítóanyagukból vagy a 16. igénypont szerinti termésükből.