BRPI9808154B1 - Molécula de ácido nucléico, vetor, processos para a produção de sst e para produção de molécula contendo pelo menos dois, porém não mais do que cem resíduos de frutosila que são ligados de forma beta-2,1 glicosídica ou beta -2,6 glicosídicas e métodos para a produção in vitro da referida molécula e para a produção da referida molécula - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR, PROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE SST E PARA PRODUÇÃO DE MOLÉCULA CONTENDO PELO MENOS DOIS, PORÉM NÃO MAIS DO QUE CEM RESÍDUOS DE FRUTOSILA QUE SÃO LIGADOS DE FORMA BETA-2,1 GLICOSÍDICA OU BETA-2,6 GLICOSÍDICAS E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO IN VITRO DA REFERIDA MOLÉCULA E PARA PRODUÇÃO DA REFERIDA MOLÉCULA". A presente invenção refere-se às moléculas de ácido nucléico codificando as sacarose frutosiltransferases dependentes de sacarose (SST). Ademais, esta invenção refere-se aos vetores e hospedeiros contendo tais moléculas de ácido nucléico, assim como às células vegetais e plantas transformadas com as moléculas de ácido nucléico descritas. Além disso, os métodos para a produção de plantas transgênicas são descritos, que sintetizam os polímeros de frutosila de cadeia curta, devido à introdução de moléculas de DNA codificando uma SST de alcachofra. A presente invenção também relaciona-se aos métodos para a produção de SST, para produzir polímeros de frutosila de cadeia curta em diversos organismos hospedeiros, assim como à SST, com cujo auxílio os polímeros de frutosila de cadeia curta podem ser produzidos usando diversos métodos, por exemplo os métodos fermentativos ou outros métodos biotecnológicos.

Os polímeros lineares, solúveis em água, têm muitas aplicações diversas, por exemplo para aumentar a viscosidade de sistemas aquosos, como os detergentes, como os agentes de suspensão, ou para acelerar o processo de sedimentação e para a formação de complexos, porém também para a ligação de água. Os polímeros na base de sacarídeos, por exemplo os polissacarídeos de frutosila, são matérias-primas especialmente interessantes, uma vez que eles são biodegradáveis. À parte de sua aplicação como matérias-primas regenerativas para a produção e processamento industriais, os polímeros de frutosila são também interessantes como aditivos alimentícios, por exemplo como adoçantes artificiais. Os polímeros tendo um baixo nível de polimerização são particularmente adequados para este propósito.

Até agora somente foram descritos os processos para a produção de polissacarídeos de frutano de cadeia longa, em plantas, por expressão de enzimas de origem bacteriana, assim como um processo para a produção de plantas transgênicas, expressando as frutosiltransferases a partir de Helianthus tuberosus. Os processos para a produção de enzimas, para produzir polímeros de frutosila de cadeia curta, não são conhecidos. No relatório descritivo do PCT/USA89/02729, é descrita a possibilidade de produzir polímeros de carboidratos, em particular a dextrana ou a polifrutose, em plantas transgênicas, em particular nas frutas de plantas transgênicas. Para a produção de tais plantas modificadas, é sugerido o uso de levano sacara-ses a partir de microorganismos, em particular a partir de Aerobacter levani-cum, Streptococcus salivarias e BaciHus subtilis, ou a partir de dextrana sa-carases de Leuconostoc mesenteroides. Nem a produção das enzimas ativas, nem do levano ou da dextrana, nem das plantas transgênicas é descrita. O relatório descritivo do PCT/EP93/02110 divulga um processo para a produção de plantas transgênicas expressando o gene Isç de levano saca-rase a partir da bactéria gram-negativa Erwinia amylovora. No relatório descritivo do PCT/NL93/00279, é descrita a transformação de plantas tendo genes quiméricos, que contêm o gene sacB a partir de BaciHus subtilis, ou o gene ftf a partir de Streptococcus mutans. No caso do gene sacB. uma modificação na região 5' não traduzida do gene é recomendada, a fim de aumentar o nível de expressão nas plantas transgênicas. O relatório descritivo do PCT/NL96/00012 divulga sequências de DNA codificando as enzimas que sintetizam os polímeros de carboidratos, e a produção de plantas transgênicas com o auxílio destas sequências de DNA. As sequências divulgadas originam-se de Heliarithus tuberosus. De acordo com o PCT/NL96/00012, as seqüências divulgadas não são somente adequadas para modificar o perfil de frutano, por exemplo, da petúnia e da batata, como também do Helianthus tuberosus propriamente dito. Portanto, o relatório descritivo do PCT/NL96/00012 descreve inter alia plantas transgênicas de batata expressando uma SST de Helianthus tuberosus. Embora a atividade enzimática da SST expressa nas plantas transgênicas pudesse ser detectada, somente um baixo nível de conversão da sacarose substrato em polímeros de frutosila de cadeia curta poderia ser obtido. Isto pode estar relacionado a diversos fatores, tais como uma baixa afinidade da enzima pelo seu substrato ou uma inibição possível da enzima pelo produto produzido.

Portanto, o problema da presente invenção é proporcionar moléculas de ácido nucléico codificando uma sacarose frutosiltransferase dependente de sacarose (SST), com cujo auxílio é possível produzir organismos modificados por engenharia genética, que são capazes de formar polímeros de frutosila de cadeia curta.

Este problema é resolvido proporcionando-se as modalidades descritas nas reivindicações.

Portanto, a presente invenção relaciona-se às moléculas de ácido nucléico codificando as proteínas tendo a atividade biológica de uma SST, e sendo selecionadas a partir do grupo consistindo em (a) moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 4; (b) moléculas de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotídeos representada na SEQ ID N° 1 ou uma seqüência de ribonucleotídeos correspondente; (c) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos representada na SEQ ID N° 3 ou uma seqüência de ribonucleotídeos correspondente; (d) moléculas de ácido nucléico hibridizando para as moléculas de ácido nucléico mencionadas em (a) ou (b) e codificando uma SST, cujo aminoácido é até pelo menos 90% idêntico à seqüência de aminoácidos representada em SEQ ID N° 2; e (e) moléculas de ácido nucléico, cuja seqüência de nucleotídeos desvia-se da seqüência mencionada em (a), (b) ou (c) devido à degeneraçâo do código genético.

No contexto da presente invenção, uma enzima tendo a atividade de frutosil polimerase é entendida ser uma proteína que seja capaz de catalisar a união de ligações β-2,1 glicosídicas ou β-2,6 glicosídicas entre as unidades de frutose. Pela presente, um resíduo de frutosila a ser transferido pode originar-se a partir da sacarose ou a partir de um polímero de fru-tano.

Um polímero de fmtosila de cadeia curta é entendido ser uma molécula contendo pelo menos dois, porém não mais do que 100, resíduos de frutosila, que estão ligados de forma β-2,1 glicosídica ou β-2,6 glicosídi-ca. O polímero de frutosila pode carregar um resíduo de glicose em sua extremidade, que é ligado através do grupo OH do C-1 da glicose e do grupo OH do C-2 de uma frutosila. Neste caso, uma molécula de sacarose está contida no polímero de frutosila.

Em uma modalidade preferida, as seqüências de ácido nucléico da invenção são derivadas de alcachofra.

Foi surpreendentemente verificado que, durante a expressão das moléculas de ácido nucléico da invenção, grandes quantidades de polímeros de frutosila foram produzidos.

Em contraste com as batatas descritas no relatório descritivo do PCT/NL96/00012, uma grande quantidade de oligofrutano é obtida, que é ainda maior do que o teor celular da sacarose substrato quando as moléculas de ácido nucléico da invenção são usadas.

As moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser tanto moléculas de DNA quanto de RNA. As moléculas de DNA adequadas são, por exemplo, as moléculas genômicas ou de cDNA. As moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser isoladas a partir de fontes naturais, preferivelmente alcachofra, ou podem ser sintetizadas de acordo com métodos conhecidos.

Por meio de processos biológicos moleculares convencionais, é possível (ver, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2~ edição Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) introduzir diferentes mutações nas moléculas de ácido nucléico da invenção. Como um resultado, as proteínas com propriedades biológicas possivelmente modificadas são sintetizadas. Uma possibilidade é a produção de mutantes por deleção, em que as moléculas de ácido nucléico são produzidas por deleções contínuas a partir da extremidade 5' ou 3' da seqüência de codificação de DNA e que levam à síntese de proteínas que são encurtadas correspondentemente. Por tais deleções na extremida- de 5' da sequência de nucleotídeos é, por exemplo, possível identificar as seqüências de aminoácidos que são responsáveis pela translocação da enzima nos plastídios (peptídeos de transição). Isto permite a produção específica de enzimas que não estejam mais, devido à remoção das seqüências correspondentes, localizadas no vacúolo, porém no citossol, ou que estejam, devido à adição de outras seqüências de sinal, localizadas em outros compartimentos.

Uma outra possibilidade é a introdução de mutações de único ponto em posições onde uma modificação da seqüência de aminoácidos influencia, por exemplo, a atividade da enzima ou a regulação da enzima. Por este método podem ser produzidos mutantes, por exemplo, que possuam um valor de Km modificado ou que não estejam mais sujeitos aos mecanismos de regulação, que normalmente existem na célula com relação à regulação alostérica ou modificação covalente.

Ademais, podem ser produzidos mutantes mostrando uma especificidade de substrato ou de produto modificada. Também, podem ser produzidos mutantes mostrando um perfil modificado de atividade-temperatura.

Para a manipulação em células procarióticas, por meio de engenharia genética, as moléculas de ácido nucléico da invenção, ou partes destas moléculas, podem ser introduzidas em plasmídios, permitindo uma mutagênese ou uma modificação de uma seqüência por recombinação de seqüências de DNA. Por meio de métodos convencionais (comparar com Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EUA), as bases podem ser trocadas e as seqüências naturais ou sintéticas podem ser adicionadas. A fim de unir os fragmentos de DNA uns com os outros, adaptadores ou liga-dores podem ser adicionados aos fragmentos. Além disso, podem ser efetuadas manipulações que proporcionem sítios de divagem adequados ou que removam o DNA supérfluo ou os sítios de divagem. Se forem possíveis as inserções, as deleções ou as substituições, a mutagênese in vitro, a restauração do primer, a restrição ou a ligação pode ser efetuada. Como método de análise, normalmente a análise da seqüência, a análise da restrição e outros métodos bioquímicos ou biológicos moleculares são usados. O termo "hibridação", no contexto desta invenção, tem o significado de hibridação sob condições de hibridação convencionais, preferivelmente sob condições rigorosas, conforme descrito, por exemplo, em Sam-brook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2~ edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

As moléculas de ácido nucléico, que hibridam para as moléculas da invenção, podem ser isoladas, por exemplo, a partir de bibliotecas ge-nômicas ou de cDNA, que foram produzidas a partir da alcachofra. A fim de identificar e isolar tais moléculas de ácido nucléico, as moléculas da invenção, ou partes destas moléculas, ou os complementos invertidos destas moléculas, podem ser usadas, por exemplo, por meio de hibridação de acordo com métodos convencionais (ver, por exemplo, Sam-brook e outros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2~ edição Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Como uma sonda de hibridação, podem ser usadas as moléculas de ácido nucléico, por exemplo, que tenham exata ou basicamente a seqüência de nucleotídeos representada em Seq ID N° 1, ou partes destas sequências. Os fragmentos usados como sonda de hibridação podem ser fragmentos sintéticos, que foram produzidos por meio de métodos de síntese convencionais, e cuja sequência basicamente corresponde à seqüência de uma molécula de ácido nucléico da invenção.

As moléculas que hibridam para as moléculas de ácido nucléico da invenção também compreendem fragmentos, derivados e variantes aléli-cas das moléculas de ácido nucléico descritas acima, codificando uma proteína da invenção. "Fragmentos" são entendidos ser partes das moléculas de ácido nucléico, que são longas o suficiente para codificar uma das proteínas descritas. O termo "derivado", neste contexto, significa que as se-qüências destas moléculas diferem das seqüências das moléculas de ácido nucléico descritas acima em uma ou diversas posições, porém têm um alto nível de homologia àquelas seqüências. Homologia, pelo presente, significa uma identidade de seqüência de pelo menos 40%, em particular uma identi- dade de pelo menos 60%, preferivelmente de mais do que 80% e particularmente preferida de mais do que 90%. Estas proteínas codificadas pelas moléculas de ácido nucléico têm uma identidade de sequência, à seqüència de aminoácidos representada em SEQ ID N° 2, de pelo menos 80%, preferivelmente de 85% e particularmente preferida de mais do que 90%, 95%, 97% e 99%. Os desvios para as moléculas de ácido nucléico acima descritas podem ter sido produzidos por deleção, substituição, inserção ou re-combinação.

As moléculas de ácido nucléico que são homólogas às moléculas acima descritas, e que representam derivados destas moléculas, normalmente são variações destas moléculas que representam modificações tendo a mesma função biológica. Elas podem ser variações de ocorrência natural, por exemplo as seqüências a partir de outros organismos, ou mutações que podem ocorrer naturalmente ou que tenham sido introduzidas por mutagênese específica. Ademais, as variações podem ser seqüências sinte-ticamente produzidas. As variantes alélicas podem ser variantes de ocorrência natural, ou variantes sinteticamente produzidas, ou variantes produzidas por processos de DNA recombinante.

As proteínas codificadas pelas diversas variantes das moléculas de ácido nucléico da invenção mostram certas características comuns, tais como atividade da enzima, peso molecular, reatividade imunológica ou propriedades de conformação ou físicas, como a mobilidade eletroforética, o comportamento cromatográfico, os coeficientes de sedimentação, a solubili-dade, as propriedades espectroscópicas, a estabilidade; o pH ótimo, a temperatura ótima.

Em uma outra modalidade preferida, a invenção relaciona-se às moléculas de ácido nucléico, especificamente hibridando para transcritos das moléculas de ácido nucléico. Estas moléculas de ácido nucléico preferivelmente são oligonucleotídeos tendo um comprimento de pelo menos 10, em particular de pelo menos 15 e particuíarmente preferido, de pelo menos 50 nucleotídeos. As moléculas de ácido nucléico e os oligonucleotídeos da invenção podem ser usados, por exemplo, como primers para uma reação por PCR. Eles podem também ser componentes de construções sem sentido ou de moléculas de DNA codificando ribozimas adequadas. A invenção, além disso, relaciona-se aos vetores contendo as moléculas de ácido nucléico da invenção. De preferência, eles são plasmí-dios, cosmídios, vírus, bacteriófagos e outros vetores normalmente usados no campo de engenharia genética.

De preferência, a seqüência de ácidos nucléicos da invenção é ligada, de forma operativa, aos elementos reguladores no vetor da invenção, que garantem a transcrição e a síntese de um RNA em células procari-óticas e/ou eucarióticas que possam ser traduzidas.

Os vetores de expressão da invenção permitem a produção de enzimas, que sintetizam os polímeros de frutosila de cadeia curta em diversos organismos hospedeiros.

As enzimas codificadas podem ser usadas também fora dos organismos hospedeiros, para a produção de polímeros de frutosila de cadeia curta. Desse modo, podem ser usados os métodos fermentativos, ou outros métodos biotecnológicos, para a produção de polímeros de frutosila de cadeia curta. Por exemplo, é também imaginável produzir polímeros de frutosila por meio de enzimas imobilizadas.

De acordo com a invenção, os elementos reguladores do promotor B33 de patatina são preferidos. Os outros promotores preferidos são o promotor de 35S de CaMV e o promotor do gene para álcool desidrogena-se a partir de Saccharomyces cerevisiae.

Os vetores da invenção podem possuir unidades funcionais adicionais, que efetuam a estabilização do vetor no organismo hospedeiro, tal como uma origem de replicação bacteriana ou ο 2-μ DNA para o propósito de estabilização em Saccharomyces cerevisiae. Ademais, as seqüências de "borda da esquerda" e "borda da direita" do T-DNA agrobacteriano podem estar contidas, com o que uma integração estável no genoma de plantas é tornada possível.

Ademais, os vetores da invenção podem conter terminadores funcionais, tais como o terminador do gene para octopina sintase a partir de agrobactérias.

Em uma outra modalidade, a molécula de ácido nucléico da invenção é ligada ao vetor da invenção, por uma molécula de ácido nucléico codificando uma sequência de sinal funcional, a fim de transportar a enzima para diversos compartimentos celulares. Esta modificação pode ser, por exemplo, a adição de uma seqüência de sinal N-terminal para a secreção no espaço da membrana celular de plantas superiores, porém também qualquer outra modificação, que leve à fusão de uma seqüência de sinal à fruto-siltransferase codificada, pode ser a matéria da invenção.

Em uma modalidade particularmente preferida, a invenção relaciona-se ao plasmídio pB33-cySST, cuja construção é descrita nos exemplos (Figura 1). A expressão das moléculas de ácido nucléico da invenção em células procarióticas, por exemplo em Escherichia coli. é interessante porque, desta forma, é possível uma caracterização mais precisa das atividades enzimáticas das enzimas codificando estas moléculas.

Em uma modalidade adicional, a invenção relaciona-se às células hospedeiras contendo, de forma transiente ou estável, as moléculas de ácido nucléico ou os vetores da invenção. Uma célula hospedeira é entendida ser um organismo que seja capaz de absorver o DNA recombinante in vitro e, se puder ser o caso, sintetizar as proteínas codificadas pelas moléculas de ácido nucléico da invenção.

De preferência, estas células são células procarióticas ou euca-rióticas. Em particular, a invenção relaciona-se às células vegetais contendo os sistemas de vetores da invenção, ou os derivados ou as partes dos mesmos. De preferência, elas são capazes de sintetizar enzimas para a produção de polímeros de frutosila de cadeia curta, devido ao fato de que elas absorveram os sistemas de vetores da invenção, os derivados ou as partes dos mesmos. As células da invenção são preferivelmente caracterizadas pelo fato de que a molécula de ácido nucléico introduzida da invenção é heteróloga com relação à célula transformada, isto é, de que ela não ocorre naturalmente nestas células, ou está localizada em um local no ge- noma, diferente daquele da seqüência de ocorrência natural, correspondente.

Uma modalidade adicional da invenção relaciona-se às proteínas que são codificadas pelas moléculas de ácido nucléico da invenção, assim como aos métodos para a sua produção, com o que uma célula hospedeira da invenção é cultivada, sob condições que permitem a síntese da proteína, e a proteína é subseqüentemente isolada das células cultivadas e/ou do meio de cultura. Ademais, a invenção relaciona-se às SSTs que podem ser produzidas com as plantas da invenção.

Proporcionando-se as moléculas de ácido nucléico da invenção, é agora possível produzir polímeros de frutosila de cadeia curta em quaisquer organismos, por meio de engenharia genética, ao passo que até agora não tinha sido possível modificar as plantas por métodos convencionais, por exemplo os métodos de reprodução, de modo que elas fossem capazes de sintetizar polímeros de frutosila. Aumentando-se a atividade das proteínas da invenção, por exemplo superexpressando-se as moléculas de ácido nu-cléico adequadas ou proporcionando-se mutantes que não estejam mais sujeitos aos mecanismos de regulação específicos para as células, e/ou que tenham dependências de temperatura alteradas com relação à sua atividade é possível aumentar o rendimento em plantas modificadas por engenharia genética.

Portanto, é agora possível a expressão das moléculas de ácido nucléico da invenção em células vegetais, a fim de aumentar a atividade da SST correspondente ou a introdução em células que normalmente não expressam esta enzima. Ademais, é possível modificar as moléculas de ácido nucléico da invenção, de acordo com os métodos conhecidos para a pessoa versada na técnica, a fim de obter as SSTs da invenção, que não estão mais sujeitas aos mecanismos de regulação específicos para as células ou que tenham dependências de temperatura modificadas ou especificidades para o substrato ou o produto.

Quando as moléculas de ácido nucléico são expressas em plantas, a proteína sintetizada pode estar localizada em qualquer comparti- mento da célula vegetal. A fim de obter a localização em um compartimento específico, a sequência que garante a localização no vacúolo tem de ser suprimida e, se necessário, a região de codificação restante tem de ser ligada às seqüências de DNA, garantindo a localização no compartimento específico. Tais seqüências são conhecidas (ver, por exemplo, Braun e outros, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85 (1988), 846-850; Sonnewald e outros, Plant J. 1 (1991), 95-106). A presente invenção, portanto, também relaciona-se às células vegetais transgênicas que foram transformadas com uma ou diversas moléculas de nucleotídeos da invenção, assim como às células vegetais transgênicas que se originaram de tais células transformadas. Tais células contêm uma ou diversas moléculas de ácido nucléico da invenção, com ela/elas preferivelmente sendo ligada(s) aos elementos de DNA reguladores, garantindo a transcrição em células vegetais, em particular com um promotor. Tais plantas podem ser distinguidas das células vegetais de ocorrência natural pelo fato de que elas contêm pelo menos uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção, a qual não ocorre naturalmente nestas células, ou pelo fato de que uma tal molécula está integrada no genoma da célula, onde ela não ocorre naturalmente, isto é, em uma outra região genômica.

As células vegetais transgênicas podem ser regeneradas até plantas inteiras, usando métodos conhecidos para a pessoa versada na técnica. A matéria exposta da presente invenção relaciona-se às plantas obteníveis por regeneração das células vegetais transgênicas da invenção. Ademais, a matéria exposta da invenção relaciona-se às plantas contendo as células vegetais transgênicas descritas acima. As plantas transgênicas podem basicamente ser plantas de qualquer espécie vegetal, isto é, tanto plantas monocotiledôneas, quanto dicotiledôneas. De preferências, elas são culturas, em particular plantas que sintetizam e/ou armazenam amido, tais como o trigo, a cevada, o arroz, o milho, a beterraba sacarina, a cana-de-açúcar ou a batata. Particularmente preferidas são as plantas de armazenagem de sacarose. A invenção também relaciona-se ao material de propagação e produtos de colheita das plantas da invenção, por exemplo as frutas, as sementes, os tubérculos, os rizomas, as plantas novas, as mudas etc.

As células vegetais transgênicas e as plantas da invenção sintetizam polímeros de frutosila de cadeia curta, devido à expressão ou à expressão adicional de pelo menos uma molécula de ácido nucléico da invenção. A matéria exposta da invenção, portanto, também relaciona-se aos polímeros de frutosila de cadeia curta, obteníveis a partir de células vegetais transgênicas e plantas das invenção, assim como a partir do material de propagação e produtos de colheita.

As células vegetais transgênicas da invenção podem ser regeneradas até plantas inteiras, de acordo com métodos conhecidos para a pessoa versada na técnica. Portanto, a matéria exposta da invenção também relaciona-se às plantas contendo as células vegetais transgênicas da invenção. Estas plantas, preferivelmente, são culturas, em particular plantas que sintetizam e/ou armazenam sacarose e/ou amido. Particularmente preferida é a batata. A invenção também relaciona-se ao material de propagação das plantas da invenção, em particular os tubérculos. A fim de expressar as moléculas de ácido nucléico da invenção na orientação com sentido ou sem sentido, em células vegetais, elas são ligadas aos elementos de DNA reguladores, garantindo a transcrição em células vegetais. Estes são particularmente os promotores. Basicamente, qualquer promotor ativo nas células vegetais é adequado para a expressão. O promotor pode ser selecionado de modo tal que a expressão ocorra de maneira constitutiva, ou somente em um certo tecido, em um certo estágio do desenvolvimento da planta ou em um ponto de tempo determinado por estímulos externos. Com relação à planta, o promotor pode ser homólogo ou heterólogo. Os promotores adequados são, por exemplo, o promotor do RNA 35S do vírus do mosaico da couve-flor, e o promotor de ubi-quitina a partir do milho, para uma expressão constitutiva, particularmente preferido o promotor B33 do gene para patatina (Rocha-Sosa e outros, EM-BO J. 8 (1989), 23-29), para uma expressão específica para tubérculos, em batata, ou um promotor somente garantindo a expressão em tecido fotos-sinteticamente ativo, por exemplo o promotor ST-LS1 (Stockhaus e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus e outros, EM-BO J. 8 (1989), 2445-2451), ou para uma expressão específica para endos-perma, os promotores HMG a partir do trigo, o promotor USP, o promotor de Phaseolin ou os promotores a partir dos genes de zeína do milho.

Ademais, pode haver uma sequência de terminação servindo para a terminação correta da transcrição, assim como a adição de uma extremidade de poli-A ao transcrito, que é considerado como tendo uma função para a estabilização dos transcritos. Tais elementos são descritos na literatura (comparar com Gielen e outros, EMBO J. 8 (1989), 23-29) e podem ser trocados arbitrariamente. A fim de preparar a introdução de genes exógenos nas plantas superiores, há um grande número de vetores de clonagem disponíveis, contendo um sinal de replicação para a E.coli e um gene marcador para a seleção de células bacterianas transformadas. Os exemplos de tais vetores são o pBR322, a série pUC, a série M13mp, o pACYC184 etc. A seqüência desejada pode ser introduzida no vetor em um sítio de divagem adequado. O piasmídio obtido é adequado para a transformação de células de E.coli. As células de E.coli transformadas são cultivadas em um meio adequado, então coletadas e Usadas. 0 piasmídio é regenerado. Normalmente, as análises de restrição, as eletroforeses em gel e outros métodos bioquímicos ou biológicos moleculares são usados como os métodos de análise, para a caracterização do DNA do piasmídio regenerado. Após cada manipulação, o DNA do piasmídio pode ser clivado e os fragmentos de DNA regenerados ligados a outras seqüèncias de DNA. Cada seqüência de DNA do piasmídio pode ser clonada nos mesmos ou em outros plasmídios.

Para a introdução de DNA em uma célula hospedeira vegetal, um grande número de métodos está disponível. Estes métodos compreendem a transformação de células vegetais com T-DNA, usando Agrobacte-rium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como meios para a transformação, a fusão de protoplastos, a injeção, a eietroporação de DNA, a intro- dução de DNA por meio dos métodos bioiísticos, assim como possibilidades adicionais.

Para a injeção e a eletroporação de DNA em células vegetais, não há nenhuma exigência específica quanto aos plasmídios usados. Os plasmídios simples, tais como os derivados de pUC, podem ser usados. Se as plantas inteiras forem para ser regeneradas a partir de tais células transformadas, deve haver um marcador selecionável.

Dependendo do método para a introdução de genes desejados na célula vegetal, podem ser necessárias seqüências de DNA adicionais. Se, por exemplo, o plasmídio Ti ou Ri for usado para a transformação da célula vegetal, pelo menos a borda da direita, freqüentemente, entretanto, a borda da direita e da esquerda do T-DNA do plasmídio Ti e Ri tem de ser ligada, como região de flanco, aos genes a serem introduzidos.

Se as agrobactérias forem usadas para a transformação, o DNA a ser introduzido tem de ser clonado em plasmídios específicos, ou em um vetor intermediário ou em um vetor binário. Os vetores intermediários podem estar integrados no plasmídio Ti ou Ri das agrobactérias, devido às seqüências que são homólogas às seqüências no T-DNA por recombinação homóloga. O plasmídio Ti ou Ri, além disso, contém a região vir necessária para a transferência do T-DNA. Os vetores intermediários não podem replicar-se nas agrobactérias. Por meio de um plasmídio auxiliador, o vetor intermediário pode ser transferido para Agrobacterium tumefaciens (conjugação). Os vetores binários podem replicar-se tanto em E.coli quanto em agrobactérias. Eles contêm um gene marcador de seleção e um ligador ou poliligador composto pela região de borda da direita e da esquerda do T-DNA. Eles podem ser transformados diretamente nas agrobactérias (Holsters e outros, Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). A agrobactéria, que serve como uma célula hospedeira, deve conter um plasmídio carregando uma região vir. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA na célula vegetal. Pode haver T-DNA adicional. A agrobactéria transformada em tal grau é usada para a transformação de células vegetais. O uso de T-DNA para a transformação de células vegetais foi extensivamente examinado e descrito em EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukke-rij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Capítulo V, Fraley e outros, Crit. Rev. Plant. Sei., 4, 1-46 e An e outros, EMBO J. 4 (1985), 277-287. Para a transferência do DNA para a célula vegetal, os explantes de planta podem ser cultivados em conjunto com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. A partir do material de planta infectado (pór exemplo, pedaços de folha, segmentos do caule, raízes, porém também os protopiastos ou as células vegetais cultivadas por suspensão), as plantas inteiras podem ser regeneradas em um meio adequado, o qual pode conter antibióticos ou bio-zidas para a seleção de células transformadas. As plantas obtidas desta forma podem ser examinadas quanto à presença do DNA introduzido. São conhecidas outras possibilidades de introduzir o DNA exógeno, usando os métodos biolísticos ou por transformação de protopiastos (comparar, por exemplo, com Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. Em: Biotechnologhy, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).

Os sistemas alternativos para a transformação de plantas mo-nocotiledôneas são a transformação por meio do método biolístico, a introdução elétrica ou quimicamente induzida em protopiastos, a eletroporação de células parcialmente permeabilizadas, a macroinjeção de DNA em flores, a microinjeção de DNA em microesporos e pro-embriões, a introdução de DNA em pólen de germinação e a introdução de DNA em embriões por in-tumescimento (para revisão: Potrykus, Physioi. Plant (1990), 269-273).

Embora a transformação de plantas dicotiledòneas, através de sistemas de vetores de plasmídio Ti com o auxílio de Agrobacterium tumefaciens, seja bem estabelecida, um trabalho de pesquisa mais recente indica que também as plantas monocotiledôneas estão acessíveis para a transformação por meio de vetores baseados em Agrobacterium (Chan e outros, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei e outros, Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 84 (1987), 5345-5349; Raineri e outros, Bio/Technology 8 (1990), 33-38; Gould e outros, Plant Physioi. 95 (1991), 426-434; Mooney e outros, Plant, Cell Tiss & Org. Cult. 25 (1991), 209-218; Li e col, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048).

Três dos sistemas de transformação acima mencionados poderíam ser estabelecidos para diversos cereais: a eletroporação de tecidos, a transformação de protoplastos e a transferência de DNA por bombardeio de partículas em tecido regenerativo e células (para revisão: Jãhne e outros, Euphylica 85 (1995), 35-44). A transformação de trigo tem sido frequentemente descrita na literatura (para revisão: Maheshwari e outros, Criticai Reviews em Plant Science 14 (2) (1995), 149-178). A invenção também relaciona-se às plantas contendo pelo menos uma, preferivelmente diversas células contendo os sistemas de vetores da invenção, ou os derivados ou as partes dos mesmos, e sendo capazes de sintetizar enzimas para a produção de polímeros de frutosila de cadeia curta, devido à introdução dos sistemas de vetores, dos derivados ou das partes dos sistemas de vetores da invenção. A invenção também proporciona plantas de muitas espécies, gêneros, famílias, ordens e classes, que são capazes de sintetizar enzimas para a produção de polímeros de frutosila de cadeia curta, devido aos sistemas de vetores, ou derivados ou partes dos mesmos, introduzidos. Uma vez que as plantas conhecidas não são capazes de produzir somente os polímeros de frutosila de cadeia curta, é fácil checar se o método foi efetuado com êxito, por exemplo por análise croma-tográfica dos açúcares contendo frutose. Elas são vantajosas vis-à-vis as poucas plantas contendo polímeros de frutosila, uma vez que há um tama-. nho molecular definido, isto é, o tamanho do polímero de frutosila de cadeia curta. Ademais, é possível uma localização nos diversos compartimentos celulares e nos diversos órgãos, assim como um aumento da razão de expressão e, portanto, do rendimento.

Em uma outra modalidade, a invenção relaciona-se aos métodos para a produção de polímeros de frutosila de cadeia curta, compreendendo: (a) contatar a sacarose, ou um substrato equivalente, com uma SST da invenção, sob condições que permitam a conversão em polímeros de frutosila de cadeia curta; e (b) obter os polímeros de frutosila produzidos nesta forma. A natureza dos polímeros de frutosila produzidos depende da especificidade enzimática da frutosil transferase. Quando uma SST da invenção for usada, preferivelmente a cestose, porém também a nistose e a frutosil-nistose são produzidas.

Ademais, a invenção relaciona-se aos polímeros de frutosila produzidos a partir de uma célula vegeta! ou planta da invenção, ou a partir do material de propagação ou produto de colheita de plantas ou células vegetais da invenção, ou obtidos de acordo com o método acima descrito da invenção. Estes polímeros de frutosila podem preferivelmente ser usados para a produção de alimento, tal como mercadorias cozidas ou massa. De preferência, estes polímeros de frutosila podem ser usados para aumentar a viscosidade em sistemas aquosos, como os detergentes, como os agentes de suspensão, ou para acelerar o processo de sedimentação e a formação de complexos, porém também para a ligação de água.

As figuras mostram: Figura 1 mostra a construção do plasmídio pB33-cySST

Vetor: pBinB33 (derivado de pBin19; Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711) promotor: promotor B33 (Rocha-Sosa e outros, 1989, EMBO J 8: 23-29) doador: Solanum tuberosum região de codificação: gene para SST a partir de Cynars scolymus orientação: com sentido terminador: Sinal de poliadenilação do gene para octopina sin- tase a partir de plasmídio pTiACHõ de A. tumefaci-ens (Gielen e outros, 1984, EMBO J 3: 835-846) doador: Agrobacterium tumefaciens resistência: canamicina Fiaura 2 mostra a análise dos açúcares solúveis nos tubérculos de plantas transgênicas, que foram produzidas usando o sistema de vetores pB33-cySST. Os polímeros de frutosila de cadeia curta (em particular a 1-cestose), produzidos devido à modificação genética, foram marcados.

Figura 3 mostra a análise dos açúcares solúveis em plantas transgêni-cas, que foram produzidas usando o sistema de vetores pB33-cySST e p35S-cySST, respectivamente, em comparação com as plantas do tipo selvagem.

Exemplo 1: Identificação. Isolamento e Caracterização de um cDNA Codificando uma Sacarose-frutosiltransferase Dependente de Saca-rose a partir de Alcachofra fCvnare scoivmus1) 0 RNA total foi isolado de discos de flores de alcachofra (Sam-brook e outros, ver supra). O poli(A)+ mRNA foi isolado usando o sistema de isolamento de mRNA PolyATtract (Promega Corporation, Madison, Wl, EUA). O DNA complementar (cDNA) foi produzido a partir de 5 pg deste RNA, por meio do kit de síntese de ZAp-cDNA da Stratagene, de acordo com as instruções do fabricante. 2x10B fagos recombinantes independentes foram obtidos. A biblioteca de DNA amplificada foi examinada, por métodos convencionais, com um fragmento de DNA marcado com 32P e correspondendo à extremidade 3' do 6-SFT cDNA (Sprenger e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 92 (1995), 11652) tendo um comprimento de 392 bp. Este fragmento foi obtido a partir do RNA completo, por RT-PCR (Kit de RT-PCR, Stratagene, Heidelberg, Alemanha), como matriz a partir de folhas primárias induzidas por luz (72 horas) da cevada. Os clones positivos foram adicionalmente examinados.

Exemplo 2: Análise de Seoüência da Inserção de cDNA do Plasmídio pCv21 O DNA do plasmídio foi isolado a partir do clone pCy21. A se-qüência da inserção de cDNA foi determinada por métodos convencionais, por meio do método do didesoxinucleotídeo (Sanger e outros, Proc. Natl. Acad. Sei EUA 74 (1977), 5463-5467). A inserção do clone pCy21 é um DNA de 2055 bp. A sequência de nucleotídeos é representada em Seq ID N° 1, A seqüência de amtnoáci-dos correspondente é representada em Seq ID N° 2. A análise de seqüência e uma comparação com as seqüências já publicadas mostraram que a seqüência representada em Seq ID N° 1 é nova e compreende uma região de codificação mostrando homologias às SSTs a partir de outros organismos.

Exemplo 3: Produção do Plasmídio pB33-cvSST e Introdução do Plasmídio no Genoma da Batata O plasmídio pB33-cySST contém três fragmentos A, B e C no vetor binário pBin19 (Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711, modificado de acordo com Becker, 1990, Nucl Acids Res 18:203) (comparar com a Figura 1). O fragmento A contém o promotor B33 do gene para patatina b33 de batata. Ele contém um fragmento Dral (posição -1512 até a posição +14) do gene para patatina B33 (Rocha-Sosa e outros, 1989, EMBO J 8:23-29), o qual é inserido entre o sítio de divagem de EcoRI e o de Saci do poliligador de pBin19-Hyg. O fragmento B contém a região de codificação da seqüência representada em SEQ ID N° 1. O fragmento B foi obtido como fragmento Notl, com extremidades grossas, a partir do vetor pBluescript SK, no qual ele é inserido no sítio de divagem de EcoRI através de uma seqüência de ligador de EcoRI/Not I. O fragmento C contém o sinal de poliadenilação do gene 3 do T-DNA dos nucleotídeos 11749 - 11939 de plasmídio Ti pTi ACH 5 (Gielen e outros (1984); EMBO J. 3, 835-846), o qual foi isolado como fragmento de Pvu ll-Hind lll a partir do plasmídio pAGV 40 (Herrera-Estrella e outros (1983) Nature 303, 209 - 213) e clonado entre o sítio de divagem de Sphl e o de Hind lll do poliligador de pBin19-Hyg, após a adição de liga-dores de Sph I ao sítio de divagem de Pvu II. O plasmídio pB33-cySST tem um tamanho de aprox. 14 kb. O plasmídio foi introduzido nas agrobactérias (Hõfgen e Willmitzer, Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877). O plasmídio pB33-cySSt foi introduzido em plantas de batatas, através da transferência de gene induzida por Agrobacterium, de acordo com os métodos convencionais acima descritos. As plantas intactas foram regeneradas a partir das células transformadas. Os extratos de enzima foram obtidos a partir das plantas regeneradas e examinados quanto à presença de polímeros de frutosila. A análise foi efetuada conforme descrito em Rõber (Planta 199, 528-536). A análise dos tubérculos de diversas plantas transformadas, transformadas com este vetor, claramente mostrou a presença de polímeros de frutosila de cadeia curta, em particular a 1-cestose, o que pode ser atribuído à expressão do gene para SST da invenção (comparar com a Figura 2).

Exemolo 4: Análise de Acúcar Solúvel em Plantas do Típq Selvagem e Trans-gênicas contendo SST

As plantas transgênicas contendo os vetores pB33-cySST e 35S-cySST (tendo a região de codificação de SEQ ID N° 1, sob o controle do promotor de 35S) foram geradas conforme descrito no Exemplo 3. Os extratos foram obtidos a partir de plantas transgênicas e plantas do tipo selvagem, e examinados quanto à presença de polímeros de frutosila; ver o Exemplo 3. A análise de HPAEC mostrada na Figura 3 demonstra a produção de oligofrutanos. Os resultados são resumidos na Tabela 1, abaixo.

Tabela 1 Açúcares solúveis (sacarose e oligofrutano) em plantas do tipo selvagem e transgênicas Valores em g de carboidrato por kg de peso novo Conforme está evidente a partir da Figura 3 e da Tabela 1, supra, o teor de polímeros de frutosila, em particular a 1-cestose, excede o teor de sacarose. Assim, as experiências efetuadas de acordo com a presente invenção demonstram a utilidade das moléculas de ácido nucléico da invenção para a produção de polímeros de frutosila, em plantas transgèni-cas.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der Wis- senschaften e.V. (B) RUA: nenhuma (C) CIDADE: Berlim (E) PAÍS: DE

(F) ENDEREÇAMENTO POSTAL: NENHUM (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Moléculas de ácido nucléico codificando enzimas tendo atividade de frutosil polimerase (iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 4 (iv) FORMA LIDA PELO COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disco (disquete) flexível (B) COMPUTADOR: microcomputador IBM compatível (C) SISTEMA DE OPERAÇÃO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release n° 1.0, Versão n° 1.30 (EPA) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2226 pares de bases (B) TIPO: nucleotídeo (C) FILAMENTO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (vi) FONTE IMEDIATA: (A) ORGANISMO: Cynara Scolymus (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) POSIÇÃO: 8.. 1918 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: CCACCAC ATG GCT TCC TCT ACC ACC ACC CCA CTC CTC CCT CAC CAC CAC 49 Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Pro Leu Leu Pro His His His 15 10 CTT CAG AAC CCG CAA CAA CTC GCC GGA TCT CCG GCA GCT CAT CGT CTA 97 Leu Gin Aon Pro Gin Gin Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ala Hla Arg Leu 15 20 25 30 TCC CGA CCC ACA CTC CTT TCT GGG ATC CTT GTT TCG GTC CTA GTC ATC 145 Ser Arg Pro Thr Leu Leu Ser Gly Ile Leu Vai Ser Vai Leu Vai Ile 35 40 45 TGT GCT CTC GTT GCT GTA ATC CAC AAC CAA TCA CAG CAA CCC TAC CAT 193 Cys Ala Leu Vai Ala Vai Ile Hle Asn Gin Ser Gin Gin Pro Tyr Hla 50 ' 55 60 GAC GGC GGA GCT AAA CCC TCC TCC TCC GCC GCT ACC ACC ACC TTC CCA 241 Aep Gly Gly Ala Lye Pro Ser ser Ser Ala Ala Thr Thr Thr Phe pro 65 70 75 ACA GCG TCG CCA GAA GCT GGT TTG AAA CGG TTT CCC ATT GAG TTG AAA 289 Thr Ala Ser Pro Glu Ala Gly Leu Lye Arg Phe Pro Ile Glu Leu Lye 80 85 90 ACG AAT GCT GAG GTT GAG TGG CAA CGC TCG GCT TAC CAT TTT CAG CCC 337 Thr Asn Ala Glu Vai Glu Trp Gin Arg Ser Ala Tyr His Phe Gin Pro 95 100 105 110 GAT AAG AAC TAC ATT AGC GAT CCT GAT GGC CCA ATG TAT CAC ATG GGG 385 Aep Lye Asn Tyr Ile Ser Asp Pro Aep Gly Pro Met Tyr His Met Gly 115 120 125 TGG TAT CAT CTC TTC TAT CAG TAC AAT CCA GAG TCT GCC ATC TGG GGG 433 Trp Tyr Kie Leu Phe Tyr Gin Tyr Asn Pro Glu Ser Ala Ile Trp Gly 130 135 140 AAC ATC ACA TGG GGC CAC TCC GTA TCC AAA GAC ATG ATC AAC TGG TTC 481 Aen Ile Thr Trp Gly Ris Ser Vai Ser Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe 145 150 155 CAT CTC CCC TTC GCC ATG GTC CCT GAC CAA TGG TAC GAT ATC GAA GGT 529 Hie Leu Pro Phe Ala Met Vai Pro Asp Gin Trp Tyr Asp Ile Glu Gly 160 165 170 GTC ATG ACC GGC TCC GCC ACC GTC CTC CCT GAC GGT CAG ATC ATC ATG 577 Vai Met Thr Gly Ser Ala Thr Vai Leu Pro Asp Gly Gin Ile Ile Met 175 180 185 190 CTC TAC ACC GGC AAC GCG TAC GAT CTC TCG CAA CTG CAA TGC TTA GCA 625 Leu Tyr Thr Gly Asn Ala Tyr Asp Leu Ser Gin Leu Gin Cys Leu Ala 195 200 205 TAT GCC GTC AAC TCG TCT GAT CCC CTC CTC CTC GAT TGG AAA AAG TAC 673 Tyr Ala Vai Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Leu Asp Trp Lys Lys Tyr 210 215 220 GAG GGA AAT CCC ATC TTG TTC CCA CCT CCT GGG GTG GGA TAC AAG GAT 721 Glu Gly Asn Pro Ile Leu Phe Pro Pro Pro Gly Vai Gly Tyr Lye Asp 225 230 235 TTT CGG GAC CCA TCT ACA CTG TGG TTG GGT CCC GAT GGT GAA TAC AGA 769 Phe Arg Asp Pro Ser Thr Leu Trp Leu Gly Pro Asp Gly Glu Tyr Arg 240 245 250 ATG GTA ATO GGG TCC AAG CAT AAC GAG ACC ATC GGT TGT GCC TTG ATT 817 Met Vai Met Gly Ser Lya His Asn Glu Thr Ile Gly Cys Ala Leu Ile 255 260 265 270 TAC CAT ACC ACT AAT TTT ACG CAT TTC GAG CTC AAG GAA GAG GTG CTT 86S

Tyr His Thr Thr Asn Phe Thr His Phe Glu Leu Lys Glu Glu Vai Leu 275 280 285 CAC GCC GTT CCC CAC ACG GGT ATG TGG GAA TGT GTG GAT CTT TAT CCG 913 His Ala Vai pro His Thr Gly Het Trp Glu Cys Vai Asp Leu Tyr Pro 290 295 300 GTA TCC ACC ACG CAC ACA AAC GGG TTG GAC ATG GTG GAT AAC GGG CCG 961 Vai Ser Thr Thr His Thr Asn Gly Leu Asp Het vai Asp Asn Gly Pro 305 310 31S AAT GTG AAG CAT GTG TTG AAA CAA AGT GGG GAT GAA GAT CGA CAT GAT 1009 Asn Vai Lys His Vai Leu Lys Gin Ser Gly Asp Glu Asp Arg His Asp 320 325 330 TGG TAT GCG CTC GGG ACT TAT GAC GTC GTG AAT GAT AAG TGG TAT CCA 1057 Trp Tyr Ala Leu Gly Thr Tyr Asp Vai Vai Asn Asp Lys Trp Tyr Pro 335 340 345 350 GAT GAC CCT GAA AAC GAT GTG GGT ATC GGG TTA AGA TAC GAT TTC GGA 1105 Asp Asp Pro Glu Asn Asp Vai Gly Ile Gly Leu Arg Tyr Asp Phe Gly 355 360 365 AAG TTT TAT GCG TCA AAG ACG TTC TAC GAC CAA CAT AAG AAG AGA CGG 1153 Lys Phe Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Gin His Lys Lys Arg Arg 370 375 380 GTC CTT TGG GGT TAC GTT GGA GAA ACC GAT CCC CCT AAA TAC GAC GTT 1201 Vai Leu Trp Gly Tyr Vai Gly Glu Thr Asp Pro Pro Lys Tyr Asp Vai 385 390 395 TAC AAG GGA TGG GCT AAC ATT TTG AAC ATT CCA AGG ACC ATA GTT TTG 1249 Tyr Lys Gly Trp Ala Asn Ile Leu Asn Ile Pro Arg Thr Ile Vai Leu 400 405 410 GAC ACG AAA ACG AAT ACC AAT TTG ATT CAA TGG CCA ATT GCG GAA GTC 1297 Asp Thr Lys Thr Asn Thr Asn Leu Ile Gin Trp Pro Ile Ala Glu Vai 415 420 425 430 GAA AAC TTG AGA TCG AAT AAA TAC AAT GAA TTC AAA GAC GTG GAG CTG 1345 Glu Asn Leu Arg Ser Asn Lys Tyr Asn Glu Phe Lys Asp Vai Glu Leu 435 440 445 AAA CCG GGA TCA CTG ATT CCG CTC GAG ATA GGC ACA GCA ACA CAG TTG 1393 Lys Pro Gly Ser Leu Ile Pro Leu Glu Ile Gly Thr Ala Thr Gin Leu 450 455 460 GAT ATA ACT GCG ACA TTC GAA GTT GAT CAA ACG ATG TTG GAA TCG ACG 1441 Asp Ile Thr Ala Thr Phe Glu Vai Asp Gin Thr Met Leu Glu Ser Thr 465 470 475 CTT GAA GCC GAT GTT TTG TTC AAT TGT ACG ACC AGT GAA GGT TCA GCC 1489 Leu Glu Ala Asp Vai Leu Phe Asn Cys Thr Thr Ser Glu Gly Ser Ala 480 485 490 GGG AGA GGG GTG TTG GGG CCA TTT GGA CTG GTG GTT CTA GCT GAT GCC 1537 Gly Arg Gly Vai Leu Gly Pro Phe Gly Leu Vai Vai Leu Ala Asp Ala 495 500 505 510 GAA CGA TCT GAG CAA CTT CCT GTG TAT TTC TAT ATA GCA AAA GAC ACC 1585 Glu Arg Ser Glu Gin Leu Pro Vai Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asp Thr 515 520 525 GAT GGA TCC TCA AAA ACT TAC TTC TGT GCC GAT GAA TCA AGA TCA TCG 1633 Asp Gly Ser Ser Lys Thr Tyr Phe Cys Ala Asp Glu Ser Arg Ser Ser 530 535 540 AAC GAT GTA GAC ATA GGG AAA TGG GTG TAC GGA AGC AGT GTT CCT GTT 1681 Aen Asp Vai Asp Ile Gly Lys Trp Vai Tyr Gly Ser Ser Vai Pro Vai 545 550 555 CTA GAA GGC GAA AAA TTC AAC ATG AGG TTG CTG GTG GAT CAT TCA ATT 1729 Leu Glu Gly Glu Lys Phe Asn Met Arg Leu Leu Vai Asp Hls Ser Ile 560 565 570 GTC GAA GGC TTC GCA CAA GGA GGC AGA ACG GTG GTG ACA TCA AGA GTG 1777 Vai Glu Gly Phe Ala Gin Gly Gly Arg Thr Vai Vai Thr Ser Arg Vai 575 580 585 590 TAT CCG GCG AAG GCG ATC TAC GGC GCT GCA AAG TTA TTT TTG TTC AAC 1825 Tyr Pro Ala Lys Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Phe Leu Phe Asn 595 600 605 AAC GCC ACC GGA ATC AGC GTG AAG GCA TCT CTC AAG ATC TGG AAA ATG 1873 Asn Ala Thr Gly Ile Ser Vai Lys Ala Ser Leu Lys Ile Trp Lys Met 610 615 620 AAG GAA GCA CAA CTG GAT CCA TTC CCT CTT TCT GGA TGG AGT TCT 191S

Lys Glu Ala Gin Leu Asp Pro Phe Pro Leu Ser Gly Trp Ser Ser 625 630 635 TGATGATGAT GATGATTAAG AACTCATTTC ATGAAGATGA TGATTAAGAA CTCATTTCAT 1978 GATGATGATG ATGATTCCAG TTTATATGCG TACCCTGTTC CCTTTACCTG TATGTGGTGG 2038 TGGTGGTGAA ATATGGTTAG CATGATTCCG GGTTGGCGAG GGCAATATGG TAATTTACTA 2098 TCGCTGTAGT AGTACTCCAC TTGTGAGATT ATATTTCATA AATTCAATTA TTATTCCTGT 2158 TTACAACCTT TTTCATTGTA TCATACCACC CATTGAATCC CATCATGTTC AATTAGTGTT 2218 GCAAAAAA 2226 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 637 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 2: Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Pro Leu Leu Pro His His His Leu Gin 15 10 IS

Claims (9)

1. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que é selecionada dentre: - moléculas de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleo-tídeos representada em SEQ ID N° 1; e - moléculas de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleo-tídeos representada em SEQ ID N° 3, ligadas de forma operativa aos elementos de DNA reguladores heterólogos, garantindo a transcrição em células vegetais e codificando uma sacarose frutosiltransferase dependente de sacarose (SST).

2. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma molécula de DNA.

3. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que é uma molécula de cDNA.

4. Molécula de ácido nucléico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que os elementos reguladores de DNA heterólogos são promotor B33 de patatina, promotor de 35S de CaMV e promotor do gene para álcool desidrogenase a partir de Saccha-romyces cerevisiae.

5. Vetor, caracterizado pelo fato de que contém uma molécula de ácido nucléico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Processo para a produção de uma SST, caracterizado pelo fato de que compreende: - cultivar uma célula hospedeira transformada com uma molécula de ácido nucléico que codifica uma SST sob condições que permitem a síntese da SST; e - isolar a SST das células cultivadas e/ou do meio de cultura, sendo que a dita molécula de ácido nucléico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 é heteróloga em relação à dita célula hospedeira.

7. Processo para a produção de uma molécula contendo pelo menos dois, porém não mais do que 100 resíduos de frutosila que são liga- dos de forma β-2,1 glicosídica ou β-2,6 glicosídicas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma célula ou célula vegetal sob condições que permitem a produção de SST e a conversão de sacarose ou de um polímero de frutano em uma molécula contendo pelo menos dois, porém não mais do que 100 resíduos de frutosila que são ligados de forma β-2,1 glicosídica ou β-2,6 glicosídicas, sendo que a molécula de ácido nucléico codificando uma SST como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 é heteróloga em relação à dita célula hospedeira e célula de planta, respectivamente; e (b) obter os polímeros de frutosila produzidos desta forma a partir das células cultivadas ou a partir do meio.

8. Método para a produção in vitro de uma molécula contendo pelo menos dois, porém não mais do que 100 resíduos de frutosila que são ligados de forma β-2,1 glicosídica ou β-2,6 glicosídicas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar a sacarose ou um polímero de frutano com uma SST codificada por uma molécula de ácido nucléico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou produzida pelo processo como definido na reivindicação 6, sob condições que permitam a conversão em uma molécula contendo pelo menos dois, porém não mais do que 100 resíduos de frutosila que são ligados de forma β-2,1 glicosídica ou β-2,6 glicosídicas; e (b) obter os polímeros de frutosila assim produzidos.

9. Método para a produção de uma molécula contendo pelo menos dois, porém não mais do que 100 resíduos de frutosila que são ligados de forma β-2,1 glicosídica ou β-2,6 glicosídicas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar uma planta contendo as células vegetais transformadas com uma molécula de ácido nucléico que codifica uma SST; e (b) obter os polímeros de frutosila a partir destas plantas ou seu material de propagação contendo as ditas células vegetais, em que a dita molécula de ácido nucléico como definida nas reivindicações 1 a 4 é heteróloga em relação à dita célula hospedeira e célula de planta, respectivamente.