HRP20000574A2

HRP20000574A2 - Meta-azacyclic amino benzoic acid compounds and derivatives thereof being integrin antagonists

Info

Publication number: HRP20000574A2
Application number: HR20000574A
Authority: HR
Inventors: Thomas E Rogers; Peter G Ruminski
Original assignee: Searle & Co
Priority date: 1998-03-04
Filing date: 1999-02-22
Publication date: 2001-08-31
Also published as: MY123908A; EE200000506A; AP1244A; EP1060164A1; IS5582A; NZ506598A; IL137653A0; OA11530A; AU753230B2; HUP0100865A2; SK13002000A3; HUP0100865A3; CA2322207A1; AR018139A1; AU3294799A; WO1999044994A1; TR200002542T2; NO20004316D0; AP2000001893A0; CN1291978A

Description

Područje izuma

Predloženi izum odnosi se na farmaceutska sredstva (spojeve) koji se mogu upotrijebiti kao αvβ3 integrin antoginisti i kao takovi se mogu upotrijebiti u farmaceutskim sastavima, te na metode za liječenje stanja posredovanih s αvβ3, inhibicijom ili antagoniziranjem αvβ3 integrina.

Pozadina izuma

Integrini su skupina glikoproteina stanične površine koji posreduju staničnu adheziju i stoga se mogu upotrijebiti kao posrednici interakcija stanične adhezije do koje dolazi tijekom raznih bioloških procesa. Integrini su heterodimeri sastavljeni od nekovalentno povezanih α i β polipeptidnih podskupina. Zasada je identificirano jedanaest različitih a podskupina i šest različitih β podskupina. Različite α podskupine se mogu kombinirati s različitim β podskupinama čime nastaju različiti integrini.

Integrin, identificiran kao αvβ3 (poznat također i kao vitronektin receptor), identificiran je kao integrin koji ima ulogu u raznim stanjima ili bolesnim stanjima, uključiv tumorske metastaze, rast tvrdih tumora (neplazija), osteoporozu, Pagetovu bolest, humoralnu hiperkalcemiju malignosti, angiogenezu, uključiv tumorsku angiogenezu, retinopatiju, uključiv makularnu degeneraciju, artritis, uključiv reumatoidni artritis, periodontalnu bolest, psorijazu i migraciju stanica glatkog mišća (npr. restenozu). K tome, nađeno je da se takova sredstva mogu upotrijebiti kao protuvirusna, kao protugljivična i kao protumikrobna sredstva. Stoga, dakle, spojevi koji selektivno inhibiraju ili antagoniziraju αvβ3 mogu biti korisni za liječenje takovih stanja.

Pokazano je da se αvβ3 integrin i drugi koji integrini koji sadrže αv vežu na brojne matrice makromolekula koje sadrže Arg-Gly-Asp (RGD). Spojevi koji sadrže sekvencu RGD oponašaju vanstanične ligande matriksa, tako da se vežu na receptore na staničnoj površini. Međutim, poznato je da RGD peptidi općenito nisu selektivni za integrine ovisne o RGD. Na primjer, većina RGD peptida koji se vežu na αvβ3, vežu se također i na αvβ5, αvβ1 αIIbβ3. Poznato je da antaginizam trombocitnog αIIbβ3 (koji je također poznat i kao fibrinogen receptor) blokira agregaciju trombocita kod ljudi. Da se izbjegnu sporedni učinci miješanja pri liječenju stanja ili bolesnih stanja povezanih s αvβ3 integrinom, korisno bi bilo razviti spojeve koji su selektivni antoginisti za αvβ3 kao suprotnost prema αIIbβ3.

Invazija tumorskih stanica odvija se procesom koji ima tri stupnja: 1) povezivanje tumorske stanice na vanstanični matriks; 2) proteolitičko otapanje matriksa; i 3) premještanje stanica kroz otopljen sloj. Taj se proces može odvijati brzo i može imati za posljedicu metastaze na mjestima koja su udaljena od izvornog tumora.

Seftor et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89 (1992) 1557-1561) su pokazali da αvβ3 integrin ima biološku funkciju u invaziji melanomnih stanica. Montgomery et al. , (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91 (1994) 8856-60) su

pokazali da integrin αvβ3 umnožen na stanicama humanog melanoma uzrokuje signal preživljavanja koji štiti stanice od apoptoze. Posredovanje metastazne staze tumorskih stanica interferencijom s receptorom stanične adhezije αvβ3 integrina, bilo bi korisno za sprečavanje metastaza.

Brooks et al. (Cell. Vol. '79, (1994) 1157-1164) su pokazali da antagonisti αvβ3 osiguravaju terapeutski pristup za liječenje neoplazije (inhibicija rasta tvrdog tumora), jer sistemsko davanje αvβ3 antagonista uzrokuje dramatičnu regresiju raznih histološki različitih ljudskih tumora.

Adhezijski receptor integrin αvβ3 identificiran je kao marker angiogenih krvnih žila kod djece i ljudi, i zbog toga takav receptor ima kritičnu ulogu u angiogenezi ili neovaskularizaciji. Angiogenezu karakterizira invazija, migracija i proliferacija stanica glatkog mišića i endotela. Antagonisti αvβ3 inhibiraju taj proces selektivnim uzrokovanjem apoptoze stanica u neovaskulaturi. Rast novih krvnih žila, ili angiogeneza, također doprinose patološkim stanjima kao što je dijabetska retinopatija i makularna degradacija (Adonis et al., Amer. J. Ophthal., Vol. 118, (1994) 445-450) i reumatoidni artritis (Peacock et al., J. Exp. Med., Vol. 175, (1992), 1135-1138). Zbog toga bi αvβ3 antagonisti bili korisna terapeutska sredstva za liječenje takovih stanja povezanih s neovaskularizacijom (Brook et al., Science, Vol. 264, (1994), 576-571).

Objavljeno je da je stanični površinski receptor αvβ3 glavni integrin na osteoklastima, odgovoran za hvatanje na kost. Osteoklasti uzrokuju koštanu resorpciju i kad je takovo djelovanje u smislu apsorpcije kosti jače od djelovanje u smislu stvaranja kosti, posljedica je osteoporoza (gubitak kosti), što dovodi do povećanog broja fraktura kosti, nesposobnosti i povećane smrtnosti. Pokazalo se je da su antagonisti αvβ3 jeki inhibitori osteoklastičkog djelovanja, kako in vltro [Sato et al., J. Cell. Biol., Vol. 111 (1990) 1713-1723], tako također i in vlvo [Fischer et al., Endocrinology, Vol. 132 (1993) 1411-1413]. Antagonizam αvβ3 dovodi do smanjenja koštane resorpcije i stoga uspostavlja normalnu ravnotežu stvaranja kosti i do djelovanja u smislu ponovnog stvaranja okolne podloge. Stoga bi dakle bilo korisno osigurati antagoniste osteoklasta αvβ3 koji su učinkoviti inhibitori resorpcije kosti i stoga se mogu upotrijebiti u liječenju ili prevenciji osteoporoze.

Uloga αvβ3 integrina u migraciji stanica glatkog mišića također ga čini terapeutskim sredstvom za prevenciju ili inhibiciju neointimalne heperplazije koja je vodeći uzrok restenoze nakon vaskularnih operacija (Choi et al., J. Vasc. Surg., Vol. 19(1) (1994) 125-34). Prevencija ili inhibicija neointimalne hiperplazije pomoću farmaceutskih sredstava bila bi korisna za sprečavanje ili inhibiciju restenoze.

White (Current Biology, Vol. 3(9) (1993) 596-599) je objavio da adenovirus koristi αvβ3 za praženjenje stanica domaćina. Čini se da je integrin potreban za endocitozu virusnih čestica i može biti potreban za prodiranje virusnog genoma u citoplazmu stanice domaćina. Tako će se spojevi koji inhibiraju αvβ3 pokazati korisnim kao antivirusna sredstva.

WO 97/08145 opisuje derivate meta-gvanidin-, urea-, tiourea- i azacikličke aminobenzojeve kiseline formule (I)

[image]

u kojoj A je

[image]

koji se mogu upotrijebiti kao αvβ3 integrin antagonisti.

J. Med. Chem. 40, 930 (1997), J. Med. Chem. 40, 920 (1997), i Antiv. Chem. Chemoher. 8, 463 (1997) se odnose na otkriće inhibitora HIV-1 integraze pomoću specifičnog farmakofornog istraživanja.

Exp. Opin. Ther. Patents 8, 633 (1988) je objavljen nakon prioriteta koji se sada traži i odnosi se na razvoj onih integrin antagonista koji se mogu upotrijebiti za inhibiciju metastaza.

Kratki opis izuma

Predloženi izum odnosi se na spojeve opće formule

[image]

u kojoj su X i Y jednake ili različite halogene skupine i na njihove farmaceutski prihvatljive soli.

Gore opisani spojevi mogu postojati u različitim izomernim oblicima i svi takovi izomerni oblici se smatraju obuhvaćeni predloženim izumom. Također su obuhvaćeni i tautomerni oblici, kao i farmaceutski prihvatljive soli takovih izomera i tautomera.

Pobliže, predloženi izum odnosi se na slijedeće spojeve:

[image]

gdje R predstavlja H ili alkil;

ili na njihove farmaceutski prihvatljive soli.

Drugim predmetom izuma dati su farmaceutski sastavi koji sadrže gore opisane spojeve. Takovi spojevi i sastavi mogu se upotrijebiti za selektivnu inhiciju ili antagoniziranje integrina i stoga se u drugoj izvedbi predloženi izum odnosi na metodu selektivne inhibicije ili antagoniziranja αvβ3 integrina. Izum nadalje uključuje liječenje ili inhibiciju s time povezanih patoloških stanja, kao što je osteoporoza, humoralna hiperkalcemija malignosti, Pagetova bolest, tumorske metastaze, rast tvrdog tumora (neoplazija), angiogeneza, uključiv tumorsku angiogenezu, retinopatija, uključiv dijabetsku retinopatiju i makularnu degeneraciju, artritis, uključiv reumatoidni artritis, periodontalna bolest, psorijaza, migracija stanica glatkog mišića i restenoza, kod sisavaca kojima je potrebno takovo liječenje. K tome, takova farmaceutska sredstva mogu se upotrijebiti kao antivirusna sredstva i kao antimikrobna sredstva.

Opis izuma u pojedinostima

Predloženi izum odnosi se na razred gore opisanih spojeva prikaznih formulama I-XVI.

Prednosne izvedbe predloženog izuma jesu spojevi slijedećih formula:

[image]

Izumom su nadalje dati farmaceutski sastavi koji sadrže terapeutski učinkovite količine gore opisanih spojeva.

Izum se također odnosi na metodu selektivne inhibicije ili antagoniziranja αvβ3 integrina, a pobliže izum se odnosi na metodu selektivne inhibicije koštane resorpcije, periodontalne bolesti, osteoporoze, humoralne hiperkalcemije malignosti, Pagetove bolesti, tumorskih metastaza, rasta tvrdog tumora (neoplazije), angiogeneze, uključiv tumorsku angiogenezu, retinopatije, uključiv dijabetsku retinopatiju i makularnu degeneraciju, artritisa, uključiv reumatoidni artritis, migracije stanica glatkog mišića i restenoze davanjem terapeutski učinkovite količine gore opisanog spoja, za postizanje takove inhibicije, zajedno s farmaceutski prihvatljivim nosačem.

U nastavku je dat popis definicija raznih pojmova koji se ovdje koriste.

Kako se ovdje rabe, pojmovi "alkil" ili "niži alkil" odnose se na ugljikovodične radikale ravnog ili razgranatog lanca koji imaju od 1 do 10 ugljikovih atoma, a povoljnije od 1 do 6 ugljikovih atoma. Primjeri takovih alkilnih radikala jesu metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, sek-butil, t-butil, pentil, neopentil, heksil, izoheksil i slično.

Kako se ovdje rabe, pojmovi "halo" ili "halogen" odnose se na brom, klor ili jod.

Kako se ovdje rabi, pojam "haloalkil" odnosi se na alkilne skupine, definirane kao gore, s jednim ili više jednakih ili različitih halo skupina na jednom ili više ugljikovih atoma. Primjer halolkilnih skupina uključuju trifluormetil, dikloretil, fluorpropil i slično.

Pojam "sastav", kako se ovdje rabi, znači proizvod koji se dobije miješanjem jednog ili više od jednog elementa ili sastojka.

Pojam "farmaceutski prihvatljiv nosač", kako se ovdje rabi znači farmaceutski prihvatljiv materijal, sastav ili vehikl, kao tekućinu ili kruto punilo, sredstvo za razrjeđivanje, pomoćno sredstvo, otapalo ili materijal za kapsuliranje, uključen u nosač ili prijenosno kemijsko sredstvo.

Pojam "terapeutski učinkovita količina" znači onu količinu lijeka ili farmaceutskog sredstva koja će izazvati biološku ili ljekovitu reakciju tkiva, sistema ili bića koju je želio istraživač ili kliničar.

Slijedi popis kratica i odgovarajućih značenja koje se ovdje koriste:

1H-NMR = protonska nuklearna magnetska rezonancija

AcOH = octena kiselina

Ar = argon

CH3CN = acetonitril

CHN analiza = elementarna analiza ugljika, vodika i dušika

CHNCl analiza = elementarna analiza ugljika, vodika, dušika i klora

CHNS analiza = elementarna analiza ugljika, vodika, dušika i sumpora

DI voda = deionizirana voda

DMA = N,N-dimetilacetamid

DMAP = 4-(N,N-dimetilamino)piridin

DMF = N,N-dimetilformamid

EDCl = 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorid

EtOAc = etil acetat

EtOH = etanol

FAB MS = masena spektroskopija bombardiranjem s brzin atomomima

g = gram (grami)

HOBT = 1-hidroksibenzotriazol hidrat

HPLC = tekućinska kromatografija visokog učinka

IBCF = izobutilkloroformat

KSCN = kalijev tiocijanat

L = litra (1)

LiOH = litijev hidroksid

MEM = metoksietoksimetil

MEMCl = metoksietoksimetil klorid

MeOH = metanol

mg = miligram

MgSO4 = magnezijev sulfat

ml = mililitra

mL = mililitra

MS = masena spektroskopija

MTBE = metil terc-butil eter

N2 = dušik

NaHCO3 = natrijev bikarbonat

NaOH = natrijev hidroksid

Na2SO4 = natrijev sulfat

NMM = N-metilmorfolin

NMP = N-metil pirolidinon

NMR = nuklearna magnetska rezonancija

P2O5 = fosforni pentoksid

PTSA = para-toluensulfonska kiselina

RP HPLC = visoko učinska tekućinska kromatografija reverzne faze

RT = sobna temperatura

TFA = trifluoroctena kiselina

THF = tetrahidrofuran

TMS = trimetilsilil

A = grijanje reakcijske smjese

Gore opisani spojevi postoje u raznim izomernim oblicima i svi takovi izomerni oblici se smatraju uključenim. Tautomerni oblici su također uključeni kao i farmaceutski prihvatljive soli takovih izomera i tautomara.

Ovdje u strukturama i u formulama, veza povučena preko prstena može ići prema bilo kojem raspoloživom atomu prstena.

Pojam " farmaceutski prihvatljiva sol" odnosi se na sol proizvedenu dovođenjem u dodir gore opisanog spoja s kiselinom čiji anion se općenito smatra prikladnim za ljudsku konzumaciju. Primjeri farmakološki prihvatljivih soli uključuju hidroklorid, hidrobromid, sulfat, fosfat, acetat, propionat, laktat, maleat, malat, sulcinat, tartaratne soli i slično. Sve farmakološki prihvatljive soli mogu se proizvesti na uobičajen način. (Za dodatne primjere farmaceutski prihvatljivih soli vidi Berge et al., J. Pharm. Sci., 66(1), 1-19 (1977)).

Za selektivnu inhibiciju ili antagonizam αvβ3 integrina, spojevi predloženog izuma mogu se dati oralno, parenteralno ili inhalacijskim sprejem, ili površinski u formulacijama jediničnog doziranja koje sadrže uobičajene farmaceutski prihvatljive nosače, dodatke i vehikla. Pojam parenteralno, kako se ovdje rabi, uključuje, na primjer, subkutanu, intravensku, intramuskularnu, intrasternalnu, infuzijsku ili intraperiotonealnu aplikaciju.

Spojevi predloženog izuma se daju na bilo koji prikladan način u obliku farmaceutskog sastava prilagodenog za takav način, i u dozi učinkovitoj za predviđeno liječenje. Terapeutski učinkovite doze spojeva, potrebne za prevenciju ili sprečavanje progresije ili za liječenje medicinskog stanja, stručnjak može lako utvrditi pomoću predkliničkih i kliničkih pokusa poznatih u medicini.

S tim u skladu, predloženim izumom data je metoda za liječenje stanja posredovanih selektivnim inhibiranjem ili antagoniziranjem αvβ3 staničnog površinskog receptora, koja metoda uključuje davanje terapeutski učinkovite količine spoja odabranog iz razreda gore opisanih spojeva, pri čemu se jedan ili više spojeva daje zajedno s jednim ili više netoksičnih, farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili sredstava za razrjeđivanje i/ili pomoćnih sredstava (koji se ovdje zajedno navode kao "noseći" materijali) i po želji drugih aktivnih sastojaka. Pobliže, predloženim izumom data je metoda za inhibiciju αvβ3 staničnog površinskog receptora. Najbliže, predloženim izumom data je metoda za inhibiciju koštane resorpcije, liječenje osteoporoze, inhibiciju humoralne hiperkalcemije ili malignosti, liječenje Pagetove bolesti, inhibiciju tumorskih metastaza, inhibiciju neoplazije (rasta tvrdog tumora), inhibiciju angiogeneze uključiv angiogeneze tumora, liječenje dijabetske retinopatije i makularne degeneracije, inhibiciju artritisa, psorijaze i periodontalne bolesti, i inhibiciju migracije stanica glatkog mišića, uključiv restenozu.

Na temelju standardnih laboratorijskih pokusa, poznatih postupaka i stručne ocjene, kao i usporedbama sa spojevima poznate neupotrebljivosti, gore opisani spojevi se mogu upotrijebiti za liječenje pacijenata koji pate od gornjih patoloških stanja. Stručnjak će priznati da izbor najprikladnijeg spoja izuma spada u okvir sposobnosti stručnjaka i ovisit će o raznim faktorima uključiv ocjenu rezultata dobivenih u standardnim pokusima i životinjskim modelima.

Liječenje pacijenta, pogođenog s nekim od patoloških stanja, uključuje davanje tom pacijentu količine gore opisanog spoja, koja količina je terapeutski učinkovita u suzbijanju stanja ili u produljenju preživljavanja pacijenta dulje nego što se očekuje u odsutnosti takovog liječenja. Kako se ovdje rabi, pojam "inhibicija" stanja odnosi se na usporavanje, prekid, sprečavanje ili zaustavljanje stanja i ne pokazuje nužno potpunu eliminaciju stanja. Vjeruje se da produljenje preživljavanja pacijenta nakon značajno korisnog učinka u i na njemu samom, također pokazuje da je stanje povoljno suzbijeno do određene mjere.

Kako je ranije rečeno, spojevi izuma mogu se upotrijebiti u raznim biološkim, profilaktičkim ili teraperuskim područjima. Smatra se da su ti spojevi korisni u prevenciji ili liječenju svakog bolesnog stanja u kojem

ulogu ima αvβ3 integrin.

Režim doziranja za spojeve i/ili sastave koji sadrže spojeve temelji se na raznim faktorima, koji uključuju tip, starost, težinu, spol i medicinsko stanje pacijenta; ozbiljnost stanja, način davanja i djelovanje dotičnog, upotrijebljenog spoja. Zbog toga se režim doziranja može široko mijenjati. Za liječenje gore navedenih stanja mogu se primijeniti razine doziranja reda veličine od pribl. 0,01 mg do pribl. 1000 mg po kilogramu tjelesne težine dnevno, još bolje od pribl. 0,01 mg do pribl. 100 mg po kilogramu tjelesne težine dnevno.

Aktivan sastojak koji se daje injekcijom formulira se kao sastav u kojem se kao prikladan nosač može upotrijebiti otopinu NaCl, desktroze ili voda. Prikladna dnevna doza je tipično pribl. 0,01 do 10 mg/kg tjelesne težine ubrizgano dnevno u višestrukim dozama, ovisno o gore navedenim faktorima.

Za davanje sisavcu kojem je potrebno liječenje, spojevi u farmaceutski učinkovitoj količini se obično kombiniraju s jednim ili više dodataka prikladnih za navedeni način davanja. Spojevi se mogu pomiješati s laktozom, sahazorom, škrobnim prahom, celuloznim esterima alkanskih kiselina, celuloznim alkil esterima, talkom, stearinskom kiselinom, magnezijevim stearatom, magnezijevim oksidom, natrijevim i kalcijevim solima fosforne i sumporne kiseline, želatinom, akacijom, natrijevim alginatom, polivinilpirolidonom, i/ili polivinil alkoholom, i tabletirati ili kapsulirati za uobičajenu aplikaciju. Alternativno, spojevi se mogu otopiti u vodi, polietilen glikolu, propilen glikolu, etanolu, kukuruznom ulju, pamučnom ulju, kikirikijevom ulju, sezamovom ulju, benzil alkoholu, natrijevom kloridu i/ili raznim puferima. Drugi dodaci i načini aplikacije dobro su i naširoko poznati u farmaceutskoj struci.

Farmaceutski sastavi, koji se mogu upotrijebiti u predloženom izumu, mogu se podvrgnuti uobičajenim farmaceutskim postupcima, kao sterilizaciji i/ili mogu sadržavati uobičajene farmaceutske dodatke kao što su konzervansi, stabilizatori, sredstva za kvašenje, emulgatori, puferi, itd.

Opće sekvence sinteze za pripravljanje spojeva, koji se mogu upotrijebiti u predloženom izumu, prikazane su u shemama I-III. Objašnjenje i pojedinačni postupci, te razni aspekti predloženog izuma opisani su tamo gdje je prikladno. Slijedeće sheme i primjeri predviđeni su za bolji prikaz predloženog izuma i ne ograničavaju ga ni smislom ni svrhom. Stručnjak će lako shvatiti da se poznate inačice uvjeta i postupaka, opisane u shemama i primjerima, mogu upotrijebiti za sintezu spojeva predloženog izuma.

Ako nije navedeno drugačije, svi polazni materijali i upotrijebljena oprema su komercijalno dostupni.

Shema 1

[image]

Shema I pokazuje metodologiju koju se može primijeniti za pripravljanje dijela tetrahidropirimidinbenzojeve kiseline predloženog izuma koji se može povezati s esterom gly-β-amino kiseline. Ukratko, u shemi I, 3,5-dihidroksi-benzojevu kiselinu prevede se . u 3-amino-5-hidroksi-benzojevu kiselinu primjenom postupka opisanog u Austr. J. Chem., 34(6), 1319-24 (1981). Proizvod reagira s amonijevim tiocijanatom u vrućoj razrijeđenoj solnoj kiselini, čime se, nakon normalne obrade, dobije 3-tiourea-5-hidroksi-benzojevu kiselinu. Ta intermedijarna tiourea se prevede u S-metil derivat reakcijom s metil jodidom u etanolu pod refluksom. 1,3-diamino-2-hidroksipropan reagira s tako dobivenim intermedijatom u vrućem DMA. Nakon hlađenja nastane talog i amfoterni proizvod se izolira filtracijom. HCl sol se može dobiti liofilizacijom iz razrijeđene solne kiseline. Alternativno, proizvod može se izolirati iz izvorne reakcijske smjese odstranjivanjem hlapljivog i koncentracijom. Dobiveni proizvod se preuzme u vodu i pH se namjesti na 5-7, pri čemu se taloži amfoterni proizvod i izolira filtracijom. HCl sol se može dobiti kako je prethodno navedeno ili jednostavno otapanjem u razrijeđenoj solnoj kiselini i koncentracijom do krutog i sušenjem.

Shema IA

[image]

Shema IA prikazuje metodologiju koja se može primijeniti za pripravljanje dijela tetrahidropirimidin-benzojeve kiseline predloženog izuma koji se može povezati na ester gly-β-amino kiseline. Ukratko, u shemi IA 1,3-diamino-2-hidroksipropan reagira s ugljikovim disulfidom u odgovarajućem otapalu, kao što je etanol-voda, refluktira se, ohladi, doda se solnu kiselinu, ponovno se refluktira, ohladi i proizvod, 5-hidroksitetrahidropirimidin-2-tion se skupi filtracijom i osuši. Ta intermedijarna ciklička tiourea se prevede u S-metil derivat reakcijom tiona i metil jodida u etanolu pod refluksom. Željeni 2-metil-tioeter-5-hidroksipirimidin hidrojodid se lako izolira odstranjivanjem hlapljivog pod smanjenim tlakom. Zatim, se 2-metiltioeter-5-hidroksipirimidin hidrojodid u metilen kloridu/DMA (pribl. 10:1) i ekvivalentu trietilamina ohlade otprilike na temperaturu ledene kupelji i doda se ekvivalent di-terc-butil dikarbonata (BOC anhidrid). Uobičajenom obradom dobije se BOC-2-metiltioeter-5-hidroksipirimidn kao ulje.

3,5-dihidroksibenzojevu kiselinu prevede se u 3-amino-5-hidroksi-benzojevu kiselinu primjenom postupka iz Aust. J. Chem., 34(6), 1319-24 (1981).

Krajnji željeni proizvod, 3-hidroksi-5-[(5-hidroksi-1,4,5,6-tetrahidro-2-pirimidinil)amino]benzojeva kiselina hidrokloridna sol, dobivena je reakcijom BOC-2-metil-tioeter-5-hidroksipirimidina i 3-amino-5-hidroksi-benzojeve kiseline u vrućem DMA. Nakon hlađenja nastane talog i amfoterni proizvod se izolira filtracijom. HCl sol se može dobiti, na primjer, liofilizacijom iz razrijeđene solne kiseline.

Shema II

[image]

Y i X su halo skupine.

Shema II prikazuje metodologiju koja se može primijeniti za dobivanje etil N-gly-amino-3-(3,5-dihalo-2-hidroksi)fenil propionatnog dijela predloženog izuma koji se može povezati na skupinu tetrahidropirimidinbenzojeve kiseline. Ukratko, 3,5-halo supstituirani salicilaldehidi mogu se dobiti izravno halogeniranjem kao, na primjer, u slučaju kad se 5-bromsalicilaldehid pomiješa u kašu u octenoj kiselini i doda se ekvivalent ili više klora, čime se dobije 3-klor-5-brom-2-hidroksibenzaldehid. Nešto proizvoda se istaloži i može se skupiti filtracijom. Ostatak se može skupiti tako da se filtrat razrijedi s vodom i talog se izolira. Sjedinjavanjem krutih tvar i sušenjem dobije se 3-klor-5-brom-2-hidroksibenzaldehid. 3-jod-5-klorsalicilaldehid može se proizvesti reakcijom 5-klorsalicilaldehida s N-jodsukcinimidom u DMF-u i podvrgavanjem reakcijske smjese uobičajenim uvjetima obrade. 3-jod-5-bromsalicilaldehid se može proizvesti reakcijom 5-bromsalicilaldehida u acetonitrilu s kalijevim jodidom i kloraminom T. Obradom se dobije materijal koji kad se pomiješa s heksanom daje željeni 3-jod-5-klorsalicilaldehid.

Kumarini su već proizvedeni iz salicilaldehida primjenom modificirane Perkinove reakcije (npr. Vogel: Textbook of Practical Organic Chemistry, 5. izdanje, 1989, str. 1040). Halo-supstituirani kumarini se prevedu u 3-aminohidrokumarine (vidi J.G. Rico, Tett. Let., 1994, 35, 6599-6602) koji se lako otvori u kiselom alkoholu, čime se dobiju esteri 3-amino-3-(3,5-halo-2-hidroksi)fenil-propionske kiseline.

Esteri 3-amino-3-(3,5-halo-2-hidroksi)fenilpropionske kiseline se prevedu u estere N-gly-3-amino-3-(3,5-halo-2-hidroksi)fenilpropionske kiseline reakcijom Boc-N-gly-N-hidroksisukcinimida, čime se dobiju esteri Boc-N-gly-3-amino-3-(3,5-halo-2-hidroksi)fenilpropionske kiseline koji se prevedu u HX soli estera Boc-N-gly-3-amino-3-(3,5-halo-2-hidroksi)fenilpropionske kiseline (gdje X predstavlja halo skupinu), na primjer, odstranjivanjem BOC zaštitne skupine upotrebom HCl i etanolu.

Aminokiselinski spojevi, upotrijebljeni za dobivanje spojeva predloženog izuma, mogu se proizvesti u skladu s postupcima prikazanim ovdje i u nastavku i u skladu s metodologijom opisanom i zatraženom u još nedovršenom USSN patentu pod brojem pravnog zastupnika 3076, koji je uložen istovremeno s ovim dokumentom i ovdje je ugrađen kao literaturni izvor.

Shema III

[image]

Y i X su halo skupine.

Shema III prikazuje metodologiju koja se može primijeniti za dobivanje raznih spojeva predloženog izuma.

3-hidroksi-5-[(1,4,5,6-tetrahidro-5-hidroksi-2-pirimidinil) amino]benzojevu kiselinu aktivira se za povezivanje poznatim metodama. Tako, nakon otapanja u prikladnom otapalu, kao što je DMA, doda se ekvivalent NMM. Reakcijsku smjesu se ohladi na temperaturu ledene kupelji i doda se IBCF. K miješanom intermedijarnom anhidridu doda se ester gly-p-amino kiseline i NMM. Po završetku reakcije proizvod se očisti preparativnom HPLC i ester hidrolizira u kiselinu obradom s bazom, kao što je LiOH, u prikladnom otapalu (dioksan/voda ili acetonitril/voda). Alternativno se može upotrijebiti prikladnu kiselinu, kao što je TFA. Proizvod se izolira pomoću preparativne HPLC ili izolacijom amfoternih iona pri pH 5-7 i pretvorbom u željenu sol standardnim postupcima.

Primjer A

Pripravljanje

[image]

Stupanj 1

Pripravljanje

[image]

U bocu od 2 litre s okruglim dnom, opremljenu s mehaničkom miješalicom i kondenzatorom, stavi se 3,5-diklor-salicilaldehid (200 g, 1,05 mola, 1 ekvivalent), octeni anhidrid (356 g, 3,49 mola) i trietilamin (95,0 g, 0,94 mola, 0,90 ekv.). Reakcijsku otopinu se grije preko noći pod refluksom. Tamno smeđu reakcijsku smjesu se ohladi na 50°C i uz miješanje se doda vodu (1 1) . Nakon jednog sata smjesu se profiltrira i filtrat se pomiješa s EtOH (1 1) . Tu mješavinu se grije jedan sat pri 45°C, ohladi se na sobnu temperaturu, profiltrira i krutu tvar (frakcija A) se ispere s EtOH (0,5 1). Sjedinjene otopine u EtOH se koncentriraju na rotacijskom isparivaču do ulja (frakcija B) . Krutu tvar iz frakcije A se otopi u metilen kloridu (1,5 1) i dobivenu otopinu se propusti kroz sloj silika gela (volumena 1300 ml) . Dobivenu tamno smeđu otopinu se koncentrira do ulja koje se triturira s heksanom (1,3 1), čime se dobije krutu tvar koju se izolira filtracijom i ispere (heksan), čime se dobije uglavnom čisti 6,8-diklor-kumarin (163 g) . Daljnji 31 g proizvoda dobije se obradom ulja, frakcija B, na sličan način; ulje se otopi u metilen kloridu (0,5 1), propusti kroz sloj silika gela (volumen 0,5 1) i triturira s heksanom. Ukupno izolirano iskorištenje bilo je 194 g ili 86% smede krute tvari.

MS i NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 2

Pripravljanje

[image]

U trogrlu tikvicu s okruglim dnom od 2 litre, s mehaničkom miješalicom, stavi se 6,8-diklorkumarin (160 g, 0,74 mola) (proizveden u stupnju 1) i suhi THF (375 ml, Aldrich Sure Seal). Dobivenu smjesu se ohladi na -40°C (kupelj suhi led/aceton) i doda se litijev bis(trimetil-silil)amid (0,80 mola, 800 ml 1M u THF-u) uz održavanje temperature ispod -40°C. Po završenom dodavanju odstrani se kupelj za hlađenje. Nakon pola sata smjesu se zagrije na -5°C. Reakciju se pogasi dodatkom otopine HCl (0,5 1 4M u dioksanu) u EtOH (1,25 1). Temperaturu se preko noći drži ispod 0°C. Reakcijsku smjesu se koncentrira na otprilike polovicu početnog volumena i podijeli između EtOAc (3 litre) i vode (2 litre) . Organski sloj se ispere s vodenom HCl (3 x 1 1 0,5N HCl). pH sjedinjenih vodenih slojeva se namjesti na pribl. 7 dodatkom 10%-tne vodene otopine NaOH i ekstrahira se s metilen kloridom (3x2 litre). Sjedinjeni organski slojevi se osuše (MgSO4), profiltriraju i uz miješanje se doda 4M HCl u dioksanu (210 ml). Po završenom taloženju krutu tvar se odstrani filtracijom. Filtrat se koncentrira na mali volumen i doda se metil t-butil eter. Dobivenu krutu tvar se sjedini s početno nastalom krutom tvari i sjedinjeni proizvod se ispere s metil t-butil eterom, izolira se filtracijom i osuši (u vakuumskoj peći tijekom vikenda), čime se dobije željeni proizvod (172 g, iskorištenje 74%).

MS i NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 3

Pripravljanje

[image]

U plamenom osušenu trogrlu tikvicu s okruglim dnom od 0,5 litre, opremljenu s magnetskom miješalicom stavi se ester N-t-Boc-glicin-N-hidroksisukcinimida (Sigma, 15,0 g, 0,055 mola) , suhi DMF, (200 ml, Aldrich Sure Seal) i proizvod iz stupnja 2 (21,67 g, 0,055 mola) u inertnoj atmosferi (Ar) . Reakcijsku smjesu se ohladi na približno 0°C (kupelj sol/led) i doda se N-metilmorfolin (5,58 g, 0,056 mola) i katalitičku količinu DMAP-a i reakciju se pusti odvijati preko noći. Rekacijsku smjesu se koncentrira do kaše i podijeli između EtOAc (0,4 1) i vodene lužine (2 x 0,2 1, vodeni zasićeni NaHCO3). Organski sloj se ispere uzastopce s vodenom limunskom kiselinom (2 x 0,2 1, 10% masa/v), ponovno s vodenim natrijevim bikarbonatom (2 x 0,2 1), zas. otopinom NaCl i osuši (Na2SO4). Hlapljivo se odstrani pod vakuumom pri 55°C, čime se dobije ulje (22,5 g, iskorištenje 92%) koje stajanjem skrutne.

MS i NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 4

Pripravljanje

[image]

Proizvod dobiven u stupnju 3 se deprotektira, čime se dobije amin hidrokloridna sol primjenom slijedećeg postupka. K proizvodu iz stupnja 3 (14,0 g, 0,032 mola) u plamenom osušenoj tikvicu s okruglim dnom (0,1 litre), sa šipkom za miješanje, doda se suhi dioksan (40 ml) . K tome se doda 4,ON HCl u dioksanu (2 ekv., 6,32 ml) pri 0°C i pusti se odvijati reakciju do prestanka razvijanja plina i završetka reakcije. Hlapljivo se odstrani pod vakuumom, a ostatak se triturira s dietil eterom (50 ml). Krutu tvar se skupi filtracijom, ispere s eterom i osuši, čime se dobije željeni proizvod (12,5 g).

MS i NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer B

Pripravljanje

[image]

Stupanj 1

Pripravljanje

[image]

K suspenziji 3-brom-5-klorsalicilaldehida (175,0 g, 743,2 mmola) u octenom anhidridu (280,5 ml, 3,0 mola) doda se trietilamin (103,6 ml, 743,2 mmola). Reakcijsku otopinu se grije 4,5 sata pod refluksom. Otopinu se ohladi i koncentrira u vakuumu. K smeđem ostatku se doda apsolutni etanol (730 ml) . Smjesu se miješa 14 sati pri 0°C. Smeđu krutu tvar se skupi filtracijom i ispere s hladnim etanolom. Krutu tvar se osuši u vakuumu, čime se dobije željeni proizvod (123,0 g, iskorištenje 64%).

1NMR je bila skladu s pretpostavljenom strukturom.

Stupanj 2

Pripravljanje

[image]

K suspenziji kumarina (40,0 g, 154,1 mmol) u THF-u (400 ml) pri -76°C doda se kap po kap i uz miješanje litijev bis(trimetilsilil)amid (154,1 ml 1M otopine u THF-u). Dodavanje se završi za 10 minuta. Reakcijsku smjesu se zatim miješa 5 minuta, zagrije na -20°C i miješa još 15 minuta. K toj otopini doda se tijekom 5 minuta octenu kiselinu (9,25 g, 154,1 mmol) u THF-u (28 ml) . Smjesu se zagrije na sobnu temperaturu i hlapljivo se odstrani u vakuumu. Ostatak se otopi u eteru (850 ml) , ispere sa zasićenom vodenom otopinom NaHCO3 (2 x 100 ml) , sa zas. otopinom NaCl (2 x 40 ml) i osuši (MgSO4). Etersku otopinu se koncentrira na otprilike 160 ml i ohladi na 0°C. K toj suspenziji doda se 4M HCl u dioksanu (56,3 ml, 225 mmolova) i smjesu se miješa 30 minuta pri 0°C. Suspenziju se profiltrira i filterski kolač se ispere s eterom. Krutu tvar se osuši u vakuumu, čime se dobije željeni proizvod kao HCl sol, dioksan solvat (45,0 g).

1NMR je bila skladu s pretpostavljenom strukturom.

Stupanj 3

Pripravljanje

[image]

K suspenziji laktona (142,2 g, 354,5 mmola) u apsolutnom etanolu (533 ml) doda se tijekpm 10 minuta 4M HCl u dioksanu (157,8 ml, 631,1 mmol). Reakcijsku smjesu se miješa 2,5 sata pri sobnoj temperaturi. Hlapljivo se odstrani u vakuumu. Ostatak se otopi u etil acetatu (450 ml) i otopinu se drži 15 sati pri 0°C. Zatim se talog skupi filtracijom i ispere s hladnim etil acetatom. Krutu tvar se osuši u vakuumu, čime se dobije željeni proizvod kao hidrokloridna sol (100,4 g, iskorištenje 79%).

1NMR je bila u skladu s pretpostavljenom strukturom.

Stupanj 4

Pripravljanje

[image]

U plamenom osušenu trogrlu tikvicu s okruglim dnom od 0,1 litre, opremljenu s magnestkom šipkom za miješanje, stavi se ester N-t-Boc-glicin N-hidroksisukcinimida (Sigma, 2,72 g, 0,010 mol), suhi THF, (50 ml, Aldrich Sure Seal) i proizvod iz stupnja 3 (3,10 g, 0,01 mola, koji je preko noći stajao u vakuumskom egzikatoru iznad P2O5) u inertnoj atmosferi (Ar). Reakcijsku smjesu se ohladi na približno 0°C (kupelj sol/led) i doda se trietilamin (1,01 g, 0,010 mola). Reakciju se pusti odvijati preko noći. Rekacijsku smjesu se koncentrira do polukrute tvari i obradi na isti način kao u primjeru A, stupanj 3. Iz organskog sloja se odstrani hlapljivo pod vakuumom pri 55°C, čime se dobije ulje (4 g, iskorištenje 83%) koje stajanjem skrutne.

MS i NMR su bilei u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 5

Pripravljanje

[image]

Proizvod dobiven u stupnju 4 se deprotektira, čime se dobije amin hidrokloridna sol primjenom slijedećeg postupka. K proizvodu iz stupnja 4 (4,0 g, 0,0084 mola) u plamenom osušenoj tikvicu s okruglim dnom (0,1 litre), sa šipkom za miješanje, doda se suhi dioksan (20 ml) . K tome se doda 4,ON HCl u dioksanu (20 ml) i pusti se odvijati reakciju do prestanka razvijanja plina i završetka reakcije (otprilike jedan sat). Hlapljivo se odstrani pod vakuumom, a ostatak se triturira s dietil eterom (50 ml). Krutu tvar se skupi filtracijom, ispere s eterom i osuši, čime se dobije svjetlo smedu krutu tvar (2,7 g, iskorištenje 78%).

MS i NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer C

Pripravljanje

[image]

Stupanj 1

[image]

K suspenziji 3,5-dibromsalicilaldehida (100 g, 357 mmolova) u octenom anhidridu (164,8 ml, 1,8 mola) doda se trietilamin (45 ml, 375 mmolova). Reakcijsku otopinu se grije preko noći pod refluksom i pod argonom. Otopinu se ohladi na sobnu temperaturu i nastane kruta masa. Tamno smeđu reakcijsku smjese se ispere s vrućim heksanom (3 x 300 ml) i s vodenim zasićenim natrijevim bikarbonatom. Dobivenu krutu tvar se otopi u EtOAc (2 1) i ispere s vodom. Organski sloj se osuši (natrijev sulfat) i koncentrira, čime se dobije smedu krutu tvar koju se skupi filtracijom. Krutu tvar se osuši u vakuumu, čime se dobije uglavnom čist 6,8-dibromkumarin (94,2 g, iskorištenje 87%).

MS i 1NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 2

[image]

K 6,8-dibromkumarinu (20,0 g, 0,066 mola) (proizveden u stupnju 1) u THF-u (100 ml) pri -78°C doda se uz miješanje, kap po kap, litijev bis(trimetilsilil)amid (66 ml, 1M otopina u THF-u). Dodavanje je gotovo za 10 minuta. Zatim se reakcijsku smjesu miješa još 15 minuta. K toj otopini doda se tijekom jedne minute octenu kiselinu (3,95 g). Smjesu se zagrije na sobnu temperaturu i hlapljivo se odstrani u vakuumu. Ostatak se otopi u heksanu (500 ml) , ispere sa zasićenom vodenom otopinom NaHCO3 (2 x 100 ml) i osuši (Na2SO4). Organsku otopinu se koncentrira, čime se dobije ulje koje se odmah preuzme u dietil eter (400 ml) i doda se 4M solnu kiselinu u dioksanu (30 ml) uz miješanje 30 minuta pri 0°C. Suvišak HCl se odstrani u vakuumu, suspenziju se profiltrira i filtarski kolač se ispere s eterom. Krutu tvar se osuši u vakuumu, čime se dobije željeni proizvod kao HCl sol, dioksan solvat (19,9 g).

MS i 1H NMR su bile u skladir sa željenom strukturom.

Stupanj 3

[image]

Laktom proizveden gore u stupnju 2 (15 g) otopi se u apsolutnom etanolu (400 ml) i kroz to se jednu minutu propušta bezvodni plin HCl. Reakcijsku smjesu se miješa 2,5 sata pri sobnoj temperaturi. RP HPLC pokazuje gotovu rekaciju. Hlapljivo se odstrani u vakuumu, čime se dobije tamni ostatak. Ostatak se triturira s dietil eterom (500 ml) i smjesu se miješa preko noći. Zatim se talog skupi filtracijom i ispere s dietil eterom. Krutu tvar se osuši u vakuumu, čime se dobije željeni proizvod kao hidrokloridna sol (15,2 g).

MS i 1NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 4

[image]

U plamenom osušenu tikvicu s okruglim dnom od 0,2 litre, opremljenu s magnestkom šipkom za miješanje, stavi se ester N-t-Boc-glicin N-hidroksisukcinimida (Sigma, 8,1 g, 0,030 mola) , suhi DMF, (50 ml, Aldrich Sure Seal) i proizvod iz stupnja 3 (12 g, 0,03 mola, držan preko noći u vakuumskom egzikatoru iznad P2O5) u inertnoj atmosferi (Ar). Reakcijsku smjesu se ohladi na približno 0°C (kupelj sol/led) i doda se N-metilmorfolin (3,03 g, 0,030 mola) i katalitičku količinu DMAP. Reakciju se pusti odvijati preko noći. Rekacijsku smjesu se koncentrira do polukrute tvari i obradi na isti način kao u primjeru A, stupanj 3. Iz organskog sloja hlapljivo se odstrani pod vakuumom pri 55°C, čime se dobije ulje (15,7 g, iskorištenje 93%) koje stajanjem skrutne.

MS i NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 5

[image]

Proizvod dobiven u stupnju 4 se deprotektira, čime se dobije amin hidrokloridna sol primjenom slijedećeg postupka. K proizvodu iz stupnja 4 (13,0 g, 0,0084 mola) u plamenom osušenoj tikvicu s okruglim dnom (0,1 litre), sa šipkom za miješanje, doda se suhi dioksan (40 ml). K tome se doda 4,ON HCl u dioksanu (30 ml) i pusti se odvijati reakciju do prestanka razvijanja plina i završetka reakcije (otprilike jedan sat). Hlapljivo se odstrani pod vakuumom, a ostatak se triturira s dietil eterom (50 ml) . Krutu tvar se skupi filtracijom, ispere s eterom i osuši, čime se dobije krutu tvar (10,6 g, iskorišfenje 93%).

MS i NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer D

Pripravljanje

[image]

Stupanj 1

Pripravljanje 3-klor-5-bromsalicilaldehida

[image]

U bocu od 5 litara s okruglim dnom, opremljenu s mehaničkom miješalicom i cijevi za dovod plina, stavi se 5-bromsalicilaldehid (495 g, 2,46 mmola) i octenu kiselinu pri sobnoj temperaturi, čime se dobije kašu. K toj mješavini se dodaje plinoviti klor umjerenom brzinom dok se otopi mali molarni suvišak klora (183 g, 1,05 mola) . Po završenom dodavanju reakciju se pusti odvijati preko noći. Nastane kruta tvar koju se skupi filtracijom i filtrat se razrijedi s vodom (2,5 litre). Smjesu se snažno miješa 20 minuta, proizvod se skupi filtracijom i ispere s vodom. Sjedinjene krute tvari se osuše, čime se dobije željeni 3-klor-5-bromcalicilaldehid (475 g, iskorištenje 82%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 2

Pripravljanje 6-brom-8-klorkumarina

[image]

U bocu od 5 litara s okruglim dnom, opremljenu s mehaničkom miješalicom i povratnim hladilom, stave se 3-klor-5-bromsalicilaldehid (554,1 g, 2,35 mmola, 1 ekv.) i octeni anhidrid (1203 g, 11,8 molova, 5 ekv.) i trietilamin (237,4 g, 2,35 mola, 1 ekv.). Reakcijsku otopinu se grije preko noći pod refluksom (131-141°C) . Tamno smeđu reakcijsku smjesu se ohladi na 50°C i uz miješanje se doda led (2 1) (hlađenje na ledenoj kupelji). Nakon jednog sata smjesu se profiltrira i filtrat se pomiješa s EtOH (1 1). K toj mješavini doda se EtOH (300 ml) i reakcijsku smjesu se miješa jedan sat. Tako nastali talog se skupi filtracijom i ispere s vodom i EtOH (3 x 1,3 litre) , osuši se u vakuumu i zatim u sušilici s vrtložnim dnom. Ukupno se izolira 563 g ili 92%).

MS i 1NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 3

Pripravljanje etil estera 3-amino-3-(2-hidroksi-3-klor-5-brom)fenil propionske kiseline

[image]

U trogrlu tikvicu od 5 litara s okruglim dnom, opremljenu s mehaničkom miješalicom, doda se 6-brom-8-klor-kumarina (300 g, 1,16 mola) (proizveden u stupnju 2) i suhi THF (900 ml, Aldrich Sure Seal) . Dobivenu smjesu se ohladi na ispod -45°C (kupelj suhi led/aceton) i uz održavanje temperature ispod -45°C tijekom 0,5 sata doda se litijev bis (trimetilsilil)amid (0,80 ml, 800 ml 1M u THF-u i 0,6 1 u heksanu, 1,2 ekv.). U posebnoj boci od 5 1 pri -15°C pomiješa se EtOH (2,5 1) i HCl (4 N HCl u dioksanu, 1 1). Kumarinsku reakciju se pogasi dodatkom hladne otopine HCl/EtOH. Nakon 0,5 sata dobivenu smjesa ima temperaturu -8,3°C. Reakcijsku smjesu se drži preko noći pri 0°C, koncentrira na pribl. 2,5 1 i podijeli između EtOAc (3 1) i vode (4 1). Organski sloj se ispere s vodenom HCl (4 x 1,3 1, 0,5 N HCl). pH sjedinjenih vodenih slojeva se namjesti na približno 8 dodatkom 10%-tne vodene otopine NaOH i ekstrahira se s metilen kloridom (1x7 l i3x2 l). Sjedinjeni organski slojevi se osuše (MgSO4, 900 g) , profiltriraju i uz miješanje se doda 4M HCl u dioksanu (400 ml). Po završetku taloženja krutu tvar se odstrani filtracijom. Smjesu se koncentrira na 2,5 litre, doda se heksan (2,5 litre) i talog se izolira filtracijom. Filterski kolač se ispere s metilen klorid/heksanom (1:2), osuši odsisavanjem i vakuumskoj sušilici pri 40°C, čime se dobije željeni proizvod (251 g, iskorištenje 60%).

MS i 1NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 5

Pripravljanje

[image]

Gornji spoj proizveden je primjenom uglavnom istog postupka i odgovarajućih količina kako je opisano za njegov izomer u primjeru B, stupanj 4.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 6

Pripravljanje

[image]

Ovaj spoj proizveden je primjenom uglavnom istog postupka i odgovarajućih količina kako je opisano za njegov izomer u primjeru B, stupanj 5.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer E

Pripravljanje

[image]

Stupanj 1

Pripravljanje 3-jod-5-klorsalicilaldehida

[image]

N-jodsukcinimid (144,0 g, 0,641 mola) doda se k otopini 5-klorsalicilaldehida (100 g, 0,638 mola) u dimetilformamidu (400 ml). Reakcijsku smjesu se miješa 2 dana pri sobnoj temperaturi. Doda se još N-jodsukcinimida (20 g) i miješanje se nastavi još 2 dana. Reakcijsku smjesu se razrijedi s etil acetatom (1 1), ispere sa solnom kiselinom (300 ml, 0,1N), vodom, (300 ml), otopinom tiosulfata (5%, 300 ml), zasi. otopinom NaCl (300 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira do suhog, čime se dobije željeni aldehid (162 g, iskorištenje 90%) kao blijedo žuta kruta tvar.

MS i 1N NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 2

Pripravljanje 6-klor-8-jodokumarina

[image]

Mješavinu 3-jod-5-klorsalicilaldehida (100 g, 0,354 mola), octenog anhidrida (300 ml) i trietilamina (54 ml) grije se 18 sati pod refluksom. Kad se ohladi, željeni kumarin se istaloži kao tamno smeđi kristaliničan materijal. To se odfiltrira, ispere s heksan/etil acetatom (4:1, 200 ml) i osuši zrakom. Iskorištenje: 60 g (55%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 3

Pripravljanje (R, S)-4-amino-3,4-dihidro-6-klor-8-jod-kumarina

[image]

Litijev heksametildisilazan (21,62 ml, 1M, 21,62 mmola) doda se k otopini 6-klor-8-jodokumarina (6,63 g, 21,62 mmola) u tetrahidrofuranu (100 ml) pri -78°C. Rekcijsku smjesu se miješa 30 minuta pri toj temperaturi i zatim još jedan sat pri 0°C. U reakcijsku smjesu se doda octenu kiselinu (1,3 g, 21,62 mmola). Reakcijsku smjesu se prelije u etil acetat (300 ml) i zasićenu otopinu natrijevog karbonata (200 ml). Organski sloj se odvoji, ispere sa zas. otopinom NaCl (200 ml) , osuši (MgSO4) i koncentrira, čime se dobije ostatak. Ostatak se doda u bezvodni eter (200 ml) i zatim se pri 0°C doda dioksan/HCl (4N, 30 ml). Reakcijsku smjesu se miješa 1 sat pri sobnoj temperaturi, profiltrira i osuši u vakuumu, čime se dobije željeni proizvod (4,6 g, iskorištenje 59%) kao prah. (RP HPLC: Rf 6,8 minuta; gradijent 10% acetonitril - 90% acetonitril tijekom 15 minuta i zatim 100% acetonitril tijekom slijedećih 6 minuta. Oboje, voda i acetonitril, sadrže 0,1% TFA. Vydac C 18 stupac za proteinske peptide, brzina protoka 2 ml/minuti, promatranje pri 254 nm).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 4

Pripravljanje (R,S)-etil-3~amino-3-(5-klor-2-hidroksi-3-jod)fenil propionat hidroklorida

[image]

Plinoviti klorovodik provodi se kroz otopinu 4-amino-3,4-dihidro-6-klor-8-jod-kumarin hidroklorida (22,0 g, 61,09 mmola) u etanolu (250 ml), uz održavanje reakcijske temperature pri 0-10°C, do zasićenje. Nakon 6 sati pod refluksom, glavninu otapala se odstrani destilacijom. Ohladeni ostatak se doda k bezvodnom eteru i miješa se još 2 sata. Početnu gumu pretvori se u kristaliničan materijal. Kristaliničan proizvod se osuši, čime se dobije željeni proizvod (20 g, iskorištenje 81%) kao bijeli kristaliničan prah. (Rf 7,52 minute, uvjeti kao u stupnju 3).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 5

Pripravljanje (R,S)-etil 3-(N-BOC-gly)-amino-3-(5-klor-2-hidroksi-3-jod)fenilpropionata

[image]

Mješavinu BOC-gly (2,16 g, 12;, 31 mmolova), HOBT (1,67 g, 12,31 mmolova) , EDCI (2,36 g, 12,31 mmolova) i DMF (50 ml) miješa se 1 sat pri 0°C. U reakcijsku smjesu se doda etil 3-amino-3-(5-klor-2-hidroksi-3-jod)propionat hidro-klorid (5,0 g, 12,31 mmolova) i zatim trietilamin (3,5 ml). Reakcijsku smjesu se miješa 18 sati pri sobnoj temperaturi. DMF se odstrani u vakuumu i ostatak se podijeli izmedu etil acetata (300 ml) i natrijevog bikarbonata (200 ml). Organski sloj se ispere sa solnom kiselinom (1N, 100 ml) , sa zas. NaCl (200 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira, čime se dobije željeni proizvod kao kruta tvar (6 g, iskorištenje 93%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 6

Pripravljanje (R,S)-etil-3-(N-gly)-amino-3-(5-klor-2-hidroksi-3-jod)fenilpropionat hidroklorida

[image]

Dioksan/HCl (4N, 20 ml) doda se k (R.S)-etil 4-(N-BOC-gly)-amino-3-(5-klor-2-hidroksi-3-jod)fenilpropionatu (6, 0 g, 11,39 mmolova) pri 0°C i miješa se 3 sata pri sobnoj temperaturi. Reakcijsku smjesu se koncentrira i još jednom se koncentrira nakon dodatka toluena (100 ml). Dobiveni ostatak se suspendira u eteru, profiltrira i osuši, čime se dobije željeni proizvod kao kristaliničan prah (5,0 g, iskorištenje 95%). (RP HPLC: Rf 8,3 minute, uvjeti kao u stupnju 3)

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer F

Pripravljanje

[image]

Stupanj 1

Pripravljanje 3-jod-5-bromsalicilaldehida

K otopini 5-bromsalicilaldehida (20,0 g, 0,1 mola) i kalijevog jodida (17 g, 0,1 mola) u acetonitrilu (150 ml) i vodi (50 ml), u boci od 500 ml s okruglim dnom i magnetskom miješalicom, doda se kloramin T (23 g, 0,1 mola). Smjesu se pusti reagirati jedan sat. Reakcijsku smjesu se podijeli izmedu solne kiseline (10%, 200 ml) i etil acetata. Organski sloj se osuši (Na2SO4), profiltrira i koncentrira u vakuumu. K ostatku se doda heksan i reakcijsku smjesu se grije 15 minuta pri 50°C. Neotopljeni materijal se odstrani filtracijom. Filtrat se koncentrira u vakuumu, čime se dobije svjetlo žut 3-jod-5-bromsalicilaldehid (26 g).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 2

[image]

Gornji spoj proizveden je primjenom uglavnom istog postupka kao u primjeru E, stupnjevi 2-6, pri čemu je u stupnju 2 ekvivalentna količina proizvoda iz stupnja 1, 3-jod-5-bromsalicilaldehida, zamijenjena s 3-jod-5-klor-salicilaldehidom.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer H

Pripravljanje

[image]

Stupanj 1

Etanol (375 ml) i deionizirana voda (375 ml) stave se u trogrlu tikvicu od 2 litre s okruglim dnom i opremljenu s magnetskom miješalicom, Claisenovim adapterom, dodatnim lijevkom, povratnim hladilom i termoparom. U reakcijsku posudu doda se 1,3-diamino-2-hidroksipropan (125,04 g, 1,39 mola) (Aldrich) i miješa se da se otopi. Kap po kap, kroz dodatni lijevak, pri 25-33°C i tijekom perioda od 35 minuta doda se ugljikov disulfid (84 ml, 1,39 mola), čime se dobije mliječno bijelu smjesu. Temperaturu se održava na ledenoj kupelji. Zatim se reakcijsku smjesu refluktira dva sata pri 73,4°C čime se dobije žutu otopinu. Reakcijsku smjesu se ohladi na ledenoj kupelji na 25°C i kap po kap, uz održavanje temperature pri 25-26°C, doda se koncentriranu HCl (84 ml). Reakcijsku smjesu se refluktira 21 sat pri 78,4°C. Reakcijsku otopinu se ohladi na 2°C i proizvod se skupi vakuumskom filtracijom. Bijelu krutu tvar se ispere 3 puta s etanolom ohladenim na ledenoj kupelji i vodom (1:1) (50 ml) i osuši u vakuumu pri 40°C, čime se dobije 5-hidroksitetrahidropirimidin-2-tion (63,75 g, iskorištenje 34,7%) kao bijela kruta tvar.

MS i NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 2

5-hidroksitetrahidropirimidin-2-tion (95 g, 0,72 mola), proizveden u stupnju 1, apsolutni etanol (570 ml) i metil jodid (45 ml, 0,72 mola) stave se u bocu od 2 litre s okruglim dnom i mehaničkom miješalicom i termoparom. Reakcijsku smjesu se refluktira pet sati pri 78°C i ohladi na sobnu temperaturu. Reakcijsku smjesu se koncentrira u vakuumu, čime se dobije bijelu krutu tvar (194,72 g) . Bijelu krutu tvar se triturira 3 puta s etil eterom (500 ml) i osuši u vakuumu, čime se dobije 2-metiltioeter-5-hidroksipirimidin hidroklorid (188,22 g, iskorišenje 95,4%) kao bijela kruta tvar.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 3

2-metiltioeter-5-hidroksipirimidin hidroklorid (150,81 g, 0,55 mola), metilen klorid (530 ml), dimetilacetamid (53 ml) i trietilamin (76,7 ml, 0,55 mola) stave se u bocu od 2 litre s okruglim dnom s povratnim hladilom, mehaničkom miješalicom i statičnom dušikovom atmosferom. Smjesu se ohladi na ledenoj kupelji i pri 40C doda se di-terc-butil dikarbonat (120,12 g, 0,55 mola). Reakcijsku smjesu se grije 18 sati pri 42,5°C, čime se dobije svjetlo žutu otopinu. Reakcijsku otopinu se prenese u lijevak za rastavljanje od 2 litre i ispere 3 puta s deioniziranom vodom (200 ml) , osuši s MgS04, profiltrira i koncentrira u vakuumu, čime se dobije Boc-2-metiltioeter-5-hidroksi-pirimidin (134,6 g, iskorištenje 99,35%) kao svjetlo žuto viskozno ulje).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 4

Boc-2-metiltioeter-5-hidroksipirimidin (50,3 g, 0,204 mola), 3-amino-5-hidroksibenzojeva kiselina (Aust. J. Chem. (1981) 34(6), 1319-24) (25,0 g, 0,1625 mola) i 50 ml bezvodnog DMA grije se uz miješanje 2 dana pri 100°C. Dobije se kašasti talog. Reakcijsku smjesu se ohladi na sobnu temperaturu i talog se odfiltrira, ispere sa CH3CN, zatim s etil eterom i osuši. Tu krutu tvar se promiješa u vodi i zakiseli s koncentriranom HCl, čime se dobije otopinu. To se smrzne i liofilizira, čime se dobije željeni proizvod kao bijela kruta tvar (14,4 g).

MS i 1H NMR su bile u skladu'sa željenom strukturom.

Primjer I

Pripravljanje

[image]

Stupanj 1

Pripravljanje Reformatsky reagenta

[image]

U bocu od 4 litre, opremljenu s povratnim hladilom, temperaturnom sondom i mehaničkom miješalicom, stavi se metalni Zn (180,0 g, 2,76 mola, 30-100 meša) i THF (1,25 1). Uz miješanje štrcaljkom se doda 1,2-dibrom-etan (4,74 ml, 0,05 mola) [alternativno, TMS Cl (0,1 ekvivalent) se može zamijeniti tijekom jednog sata pri sobnoj temperaturi]. Nakon čišćenja s inertnim plinom (3 ciklusa N2/vakuum) suspenziju cinka u THF-u se zagrije do refluksa (65°C) i tu temperaturu se drži 1 sat. Smjesu se ohladi na 50°C i zatim se tijekom 1,5 sata doda terc-butil bromacetat (488 g, 369 ml, 2,5 mola) kroz štrcaljku od 50 ml i s pumpicom za ubrizgavanje (koju se namjesti na isporuku 4,1 ml/minuti). Tijekom dodavanja održava se reakcijsku temperaturu od 50°C±5°C. Po završenom dodavanju reakcijsku smjesu se pusti miješati jedan sat pri 50°C. Zatim se smjesu pusti ohladiti na 25°C i izlučeni proizvod se pusti istaložiti. THF matičnicu se dekantira u bocu od 2 litre s okruglim dnom pomoću grubozrnatog filterskog umetka i djelomičnog (20 mmg Hg) vakuumskog prijenosa. Time se iz smjese odstrani otprilike 65% THF-a. Doda se l-metil-2-pirolidinon (NMP, 800 ml) i ponovno se miješa 5 minuta. Reakcijsku smjesu se može profiltrirati da se odstrani svaki ostatak cinka. Analiza pokazuje titar željenog Reformatsky reagenta od 1,57 M s molarnim iskorištenjem od 94%. Alternativno, kruti reagent se može izolirati filtracijom iz izvorne reakcijske smjese. Filterski kolač se može ispirti s THF-om da se dobije bijelu krutu tvar koju se osuši pod dušikom, čime se dobije željeni proizvod kao mono THF solvat koji se može pohraniti pri -20°C (ekzikator) kroz dulji period. Tipična iskorištenja su 85-90%.

Stupanj 2

2A. Pripravljanje

[image]

Kalijev karbonat (prah, osušen u vakuumu pri 100° C, 8,82 g, 60 mmolova) doda se k otopini 3,5-diklor-salicilaldehida (11,46 g, 60 mmolova) u DMF-u (40 ml) pri sobnoj temperaturi, čime se dobije jarku žutu kašu. Zatim se doda MEMCl (nerazrijeđen, 7,64 g, 61 mmol) uz održavanje temperature kupelji pri 20°C. Zatim se smjesu miješa 6 sati pri 22°C i doda se MEMCl (0,3 g, 2,4 mmola). Smjesu se miješa još 0,5 sata i reakcijsku smjesu se prelije u hladnu vodu (200 ml) da se proizvod istaloži. Kašu se odfiltrira na tlačnom filtru i kolač se ispere s vodom (2 x 50 ml) i osuši u N2/vakuumu, čime se dobije proizvod (14,94 g, 89%) kao bijela kruta tvar.

1H NMR (CDC13, TMS) 3,37 (s, 3H) ; 3,54 do 3,56 (m, 2H) ; 3,91 do 3,93 (m, 2H); 5,30 (s, 2H); 7,63 (d, 1H); 7,73 (d, 1H) ; 10,30 (s, 1H) ;

13C NMR (CDCl3, TMS) d (ppm) : 59,03; 70,11; 99,57; 126,60; 129,57; 130,81; 132,07; 135,36; 154\,66; 188,30.

DSC: 48,24°C (endo 90,51 J/g) .

Mikroanaliza:

izračunato za C11H12Cl2O4: C: 47,33%, H: 4,33%; Cl: 25,40%;

nađeno: C: 47,15%, H: 4,26%; Cl: 25,16%.

2B. Pripravljanje

[image]

Proizvod iz stupnja 2A (35,0 g, 0,125 mola) stavi se u trogrlu tikvicu od 1 litre s okruglim dnom, opremjenu s mehaničkom miješalicom i dodatnim lijevkom, i zatim se doda THF (200 ml). Otopinu se miješa pri 22°C i zatim se odjednom doda (S)-fenilglicinol (17,20 g, 0,125 mola). Nakon 30 minuta pri 22°C doda se MgSO4 (20 g) . Smjesu se miješa 1 sat pri 22°C i profiltrira kroz grubozrnati filter. Filtrat se koncentrira pod smanjenim tlakom. Nije vršeno nikakvo daljnje čišćenje i sirov imin je izravno upotrijebljen za reakciju povezivanja, stupanj 2C.

2C. Pripravljanje

[image]

U trogrlu tikvicu od jedne litre s okruglim dnom, opremljenu s mehaničkom miješalicom i dodatnim lijevkom, stavi se kruti reagent proizveden u stupnju 1 (91,3 g, 0,275 mola) i NMP (200 ml) pod argonom. Zatim se otopinu ohladi na -10°C i miješa se pri 350 rpm. Otopinu imina (proizvedenog u stupnju 2B) u NMP se pripravi pod dušikom i zatim se doda tijekom 20 minuta u gornju reakcijsku smjesu uz održavanje temperature pri -5°C (temperatura plašta -10°C). Po završenom dodavanju, smjesu se miješa još 1,5 sata pri -8°C i jedan sat pri -5°C. Kad se ohladi na -10°C u 10 minuta doda se mješavinu koncentrirane solne kiseline i zasićene otopine NH4Cl (8,1 ml/200 ml) . Doda se MTBE (200 ml) i smjesu se miješa 15 minuta pri 23°C i pri 200 okr./min. Miješanje se zaustavi i slojevi se rastave. Vodeni sloj se ekstrahira s MTBE (100 ml) . Dva organska sloja se sjedine, isperu uzastopce sa zasićenom otopinom NH4C1 (100 ml), vodom (100 ml) i zas. otopinom NaCl (100 ml). Otopinu se osuši s MgSO4 (30 g), profiltrira i koncentrira, čime se dobije narančasto ulje (66,3 g) (skrutne stajanjem), koje sadrži željeni proizvod kao jednostruki diastereoizomer (potvrdeno protonskom i ugljikovom NMR). Uzorak se očisti za analizu prekristalizacijom iz heptana, čime se dobije bijelu krutu tvar.

Protonska i ugljična NMR i IR spektar bili su u skladu sa željenom strukturom. [α]D25 = + 8,7 (c = 1,057, MeOH). Mikroanaliza:

izračunato za C25H33Cl2NO6:

C: 58,77%, H: 6,47%; N: 2,72%; Cl: 13,78%;

nađeno: C: 58,22%, H: 6,54%; N: 2,70%; Cl: 13,66%.

Stupanj 3

Pripravljanje

[image]

3A. Otopinu sirovog estera proizvedenog u stupnju 2 (17,40 g, 0,033 mola (teorijski)) i EtOH (250 ml) stavi se u trogrlu reakcijsku posudu s plaštem od 1 litre. Otopinu se ohladi na 0°C i odjednom se doda Pb(OAc)4 (14,63 g, 0,033 mola). Nakon 2 sata doda se 15%-tnu otopinu NaOH (30 ml) i etanol se odstrani pod smanjenim tlakom. Doda se drugi obrok 15%-tne otopine NaOH (100 ml) i smjesu se ekstrahira s MTBE (2 x 100 ml) , ispere s vodom (2 x 100 ml) i sa zas. otopinom NaCl (50 ml), osuši se preko Na2SO4, profiltrira na celitu i koncentrira pod smanjenim tlakom, čime se dobije narančasto ulje (12,46 g) . Prema tankoslojnoj kromatografiji (TLC) ulje je bilo homogeno i upotrijebljeno je bez daljnjeg čišćenja.

3B. Ulje iz 3A se razrijedi s EtOH (30 ml) i doda se p-toluensulfonsku kiselinu (1,3 ek. 0,043 mola, 8,18 g). Otopinu se grije 8 sati pod refluksom, ohladi pri sobnoj temperaturi i koncentrira pod smanjenim tlakom. Ostatak se pomiješa s THF (20 ml) i grije pod refluksom da se dobije otopinu. Otopinu se ohladi na sobnu temperaturu i spoj kristalizira. Dodaju se heptan (30 ml) i THF (10 ml) čime se dobije tekuću kašu koju se profiltrira. Kolač se ispere s THF/heptanom (40 ml, 1/1) i suši se 2 sata u vakuumu na tlačnom filteru pod dušikom, čime se dobije bijelu krutu tvar (7,40 g).

Protonska i ugljična NMR i IR spektar bili su u skladu sa željenim proizvodom uglavnom kao jednostrukim enantiomerom.

Mikroanaliza:

izračunato za C18H21Cl2NO6S, 0,25 C4H8O:

C: 48,73%, H: 4,95%; N: 2,99%; Cl: 15,14%;

nađeno: C: 48,91%, H: 4,95%; N: 2,90%; Cl: 14,95%.

Stupanj 4

Pripravljanje

[image]

U tikvicu s okruglim dnom od 500 ml, opremljenu s magnetskim stapićem za miješanje i cijevi za dovod dušika, stavi se slobodnu bazu proizvoda iz stupnja 3 (21,7 g, 0,065 mola), N-t-Boc-glicin N-hidroksisukcinimid ester (17,7 g, 0,065 mola) i DMF (200 ml) . Reakcijsku smjesu se mijeŠa pod dušikom 3,25 sata pri sobnoj temperaturi i dobije se blijedo narančastu otopinu. Reakcijsku smjesu se prelije u ledeno hladan etil acetat (1,2 1). Narančastu otopinu se ispere s 1M HCl (250 ml) i zatim sa zas. otopinom NaCl (500 ml) , osuši (MgSO4) i koncentrira pod vakuumom skoro do suhog, čime se dobije ulje koje se zatim osuši pri 50°C, čime se dobije proizvod kao bezbojno ulje (28,12 g, 99%). Kristalni zameci se priprave iz etil acetat/heksana. Proizvod (pribl. 28 g) se otopi u etil acetatu (35 ml) i heksanu (125 ml). U otopinu se stave klice kristala i nastane talog. Krutu tvar se odfiltrira i osuši preko noći u vakuumu pri 55°C, čime se dobije bezbojnu krutu tvar (27,0 g, 95%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 5

Pripravljanje

[image]

Boc-zaštićeni glicin amid, proizveden u stupnju 4 (27,0 g, 0,062 mola), osuši se preko noći iznad P205 i pilula NaOH. Krutu tvar se otopi u dioksanu (40 ml) i otopinu se ohladi na 0°C. Doda se ekvivalentan volumen od 4N HCl/dioksana (0,062 mola) i reakcija se odvija 2 sata. Tada je prema RP HPLC završeno 80% pretvorbe. Zatim se reakcijsku smjesu pusti zagrijati na sobnu temperaturu tijekom 4 sata. Reakcijsku smjesu se koncentrira pri 40°C u pjenu koju se triturira s eterom (200 ml) . Tako nastalu bijelu krutu tvar se odfiltira i osuši preko P205, čime se dobije željeni spoj glicin beta-amino kiselina etil ester, kao HCl sol (20,4 g, izolirano iskorištenje 88,5%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer J

Pripravljanje

[image]

Stupanj 1

Pripravljanje

[image]

MEM zaštićeni 3-brom-5-klorsalicilaldehid (129,42 g, 0,4 mola) , proizveden je u skladu s postupkom iz primjera I, stupanj 2A. Ekvivalentnu količinu 3-brom-5-klor-salicilaldehida zamijeni se s 3,5-diklorsalicilaldehidom, koji se stavi u trogrlu tikvicu od 2 litre s okruglim dnom, opremljenu s mehaničkom miješalicom, zatim se doda THF (640 ml) i (S)-fenilglicinol (54,86 g, 0,4 mola) . Nakon 30 minuta pri 22°C, doda se MgSO4 (80 g). Smjesu se miješa 2 sata pri 22°C i profiltrira na krupnozrnati filter. Filtrat se koncentrira pod smanjenim tlakom, čime se dobije blijedo žuto ulje (180,0 g) koje sadrži željeni imin. Nije vršeno daljnje čišćenje i sirov proizvod je upotrijebljen izravno za reakciju povezivanja, stupanj 2.

Mikroanaliza:

izračunato za C19H21BrClNO4:

C: 51,54%, H: 4,78%; N: 3,16%; Br: 18,04%; Cl: 8,00%;

nađeno: C: 50,22%, H: 4,94%; N: 2,93%; Br: 17,15%; Cl: 7,56%.

Stupanj 2

Pripravljanje

[image]

U trogrlu tikvicu s okruglim dnom od 3 litre opremljenu s mehaničkom miješalicom stavi se reagent iz primjera I, stupanj 1 (332,0, 0,8 mola) u NMP (660 ml) pod dušikom. Otopinu se zatim ohladi na -10°C. Otopinu imina iz stupnja 1 u NMP (320 ml) se pripravi pod dušikom i zatim se tijekom 30 minuta doda u gornju reakcijsku smjesu, pri čemu se temperaturu održava pri -5°C. Po završenom dodavanju, smjesu se miješa još jedan sat pri -8°C i 2 sata pri -5°C i zatim se ohladi na -10°C. Tijekom 10 minuta doda se mješavinu koncentrirane HCl i zasićene otopine NH4Cl (30 ml/720 ml). Doda se MTBE (760 ml) i smjesu se miješa 30 minuta pri 23°C. Miješanje se zaustavi i slojevi se rastave. Vodeni sloj se ekstrahira s MTBE (320 ml). Organski slojevi se sjedine, isperu uzastopce sa zasićenom vodenom otopinom NH4Cl (320 ml) , deioniziranom vodom (320 ml) i sa zas. NaCl (320 ml). Otopinu se osuši s MgS04 (60 g), profiltrira i koncentrira, čime se dobije žuto ulje (221,0 g) koje sadrži željeni proizvod kao jednostruki diastereoizomer, što je utvrđeno protonskom NMR.

DSC: 211,80°C (endo. 72,56 J/g), 228,34°C (98,23 J/g);

Mikroanaliza:

izračunato za C25H33BrClNO6:

C: 53,72%, H: 5,95%; N: 2,50%; Br: 14,29%; Cl: 6,33%;

nađeno: C: 52,11%, H: 6,09%; N: 2,34%; Br: 12,84%; Cl: 6,33%.

Stupanj 3

Pripravljanje

[image]

Otopinu sirovog estera, proizvedenog u stupnju 2 (-111 g) u etanolu (1500 ml) stavi se pod argonom u trogrlu tikvicu od 3 litre s okruglim dnom opremljenu s mehaničkom miješalicom. Reakcijsku smjesu se ohladi na 0°C i odjednom se doda olovni tetraacetat (88,67 g, 0,2 mola). Reakcijsku smjesu se miješa 3 sata pri 0°C i zatim se u reakcijsku smjesu pri temperaturi ispod 5°C doda 15%-tnu vodenu otopinu NaOH (150 ml) . Metanol se odstrani pod smanjenim tlakom na rotacijskom isparivaču. Doda se drugih 150 ml 15%-tne vodene otopine NaOH i reakcijsku smjesu se ekstrahira s etil acetatom (3 x 300 ml) i ispere s deioniziranom vodom (2 x 100 ml) i sa zas. otopinom NaCl (2 x 100 ml) i osuši preko bezvodnog MgSO4 (30 g) . Zatim se profiltrira preko celita i koncentrira pod smanjenim tlakom, čime se dobije željeni proizvod (103 g) kao crveno ulje.

Stupanj 4

Pripravljanje

[image]

Gornji spoj proizveden je u skladu s postupkom primijenjenim u primjeru I, stupnjevi 4 i 5, pri čemu je u stupnju 4 zamijenjena ekvivalentna. količina proizvoda iz stupnja 3 u primjeru I.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer K

Alternativna priprava spoja iz primjera J

Stupanj 1

Pripravljanje

[image]

K proizvodu iz primjera B, stupanj 3, (50,0 g, 139,2 mmola) i NaHCO3 (33,5 g, 398,3 mmolova) doda se CH2Cl2 (500 ml) i vodu (335 ml). Smjesu se miješa 10 minuta pri sobnoj temperaturi. Tijekom 20 minuta uz brzo miješanje doda se otopinu benzil kloroformata (38,0 g, 222,8 mmola) u CH2Cl2 (380 ml) . Nakon 50 minuta reakcijsku smjesu se prelije u lijevak za rastavljanje i skupi-se organski sloj. Vodenu fazu se ispere sa CH2Cl2 (170 ml) . Sjedinjeni organski slojevi se osuše (MgSO4) i koncentriraju u vakuumu. Dobivenu gumastu krutu tvar se osuši u vakuumu, čime se dobije racemični proizvod (61,2 g, iskorištenje 96%). Taj se materijal podvrgne HPLC reverzne faze upotrebom kiralnog stupca, čime se dobije čisti enantiomer. Upotrijebljeni stupac bio je Whelk-O (R,R), veličina čestica 10 mikrona uz upotrebu 90:10 heptan:etanola kao protočne faze. Pomoću analitičke HPLC upotrebom istog stupca i uvjeta otapala utvrđena je optička čistoća >98%.

MS i 1H NMR su bile u skladu" sa željenom strukturom.

Stupanj 2

[image]

K otopini spoja dobivenog u stupnju 1 (48,5 g, 106,2 mmola) u CH2Cl2 (450 ml) kroz cjevčicu se doda trimetilsilil jodid (25,5 g, 127,4 mmola) u CH2Cl2 (100 ml). Narančastu otopinu se miješa 1 sat pri sobnoj temperaturi. Kap po kap se doda metanol (20,6 ml, 509,7 mmolova) i otopinu se miješa 15 minuta. Reakcijsku otopinu se koncentrira u vakuumu, čime se dobije ulje. Ostatak se otopi u metil t-butil eteru (500 ml) i ekstrahira s 1N HCl (318 ml) i vodom (1 x 200 ml, 1 x 100 ml) . Vodeni ekstrakti se ponovno isperu s MTBE (100 ml). K vodenoj otopini doda se u malim obrocima kruti NaHCO3 (40,1 g, 478 mmolova). Zaluženu vodenu mješavinu se ekstrahira s MTBE (1x1 litra, 2 x 200 ml). Sjedinjenu organsku otopinu se ispere sa zas. Otopinom NaCl i koncentrira u vakuumu, čime se dobije željeni proizvod (23,3 g, iskorištenje 68%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa pretpostavljenom strukturom.

Stupanj 3

Pripravljanje

[image]

K otopini proizvoda iz stupnja 2 (23,3 g, 72,1 mmola) u DMF-u (200 ml) doda se N-t-Boc-glicin N-hidroksi-sukcinimid ester (17,9 g, 65,9 mmolova). Reakcijsku smjesu se miješa 20 sati pri sobnoj temperaturi. Smjesu se prelije u etil acetat (1,2 1) i ispere s 1M HCl (2 x 250 ml) , sa zasićenom vodenom otopinom NaHCO3 (2 x 250 ml) i sa zas. otopinom NaCl. Otopinu se osuši (MgSO4) i koncentrira, čime se dobije željeni proizvod (32,0 g, iskorištenje 100%). Mikroanaliza:

izračunato za C18H24BrClN2O6: C: 45,06%, H: 5,04; N, 5,84;

nađeno: C: 45,17%, H: 5,14; N, 6,12.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 4

[image]

K otopini proizvoda iz stupnja 3 (31,9 g, 66,5 mmolova) u apsolutnom etanolu (205 ml) doda se etanolnu otpinu HCl (111 ml 3M otopine, 332,4 mmola). Reakcijsku otopinu se grije 30 minuta pri 58°C. Otopinu se ohladi i koncentrira u vakuumu. Ostatak se otopi u etil acetatu (250 ml) i miješa 2 sata pri 0°C. Bijeli talog se skupi filtracijom i ispere s hladnim etil acetatom. Krutu tvar se osuši u vakuumu, čime se dobije željeni proizvod (23,5 g, iskorištenje 85%).

Mikroanaliza:

izračunato za C13H16BrClN2O4 + 1,0 HCl:

C: 37,53; H: 4,12; N, 6,73;

nađeno: C: 37,29; H: 4,06; N, 6,68.

MS i 1H H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer L

Pripravljanje

[image]

Stupanj 1

[image]

Kalijev karbonat (prah, osušen u vakuumu pri 100°C (22,1 g, 0,16 mmola) doda se k otopini 3-klor-5-brom-salicilaldehida (35,0 g, 0,15 mmolova) u DMF-u (175 ml) pri sobnoj temperaturi, čime se dobije jarku žutu kašu. Zatim se doda MEMCl (nerazrijeđen, 25,0 g, 0,2 mmol) uz održavanje temperature kupelji pri 20°C. Zatim se smjesu miješa 6 sati pri 22°C i prelije se u DI vodu (1200 ml) da se proizvod istaloži. Kašu se odfiltrira na tlačnom filtru i kolač se ispere s DI vodom (2 x 400 ml) i osuši u N2/vakuumu, čime se dobije proizvod (46,0 g, iskorištenje 95%) kao bijela kruta tvar.

1H NMR (CDCl3, TMS) 3,35 (s, 3H) ; 3,54 do 3,56 (m, 2H) ; 3,91 do 3,93 (m, 2H); 5,30 (s, 2H); 7,77 (d, 1H) ; 7,85 (d, 1H); 10,30 (s, 1H) ;

13C NMR (CDC13, TMS) (ppm) : 59,05; 70,11; 71,49; 99,50; 117,93; 129,69; 129,78; 132,37; 138,14; 155,12; 188,22. DSC: 48,24°C (endo 90,51 J/g).

Mikroanaliza:

izračunato za C11H12BrClO4:

C: 40,82%, H: 3,74%; Cl: 10,95%; Br, 24,69%;

nađeno: C: 40,64%, H: 3,48%; Cl: 10,99%; Br, 24,67%.

Stupanj 2

Pripravljanje

[image]

Proizvod iz stupnja 1 (32,35 g, 0,1 mola) stavi se u trogrlu tikvicu od 500 ml s okruglim dnom opremjenu s mehaničkom miješalicom i zatim se doda THF (160 ml) i (S)-fenilglicinol (13,71 g, 0,1 mola). Nakon 30 minuta pri 22°C doda se MgSO4 (20 g). Smjesu se miješa 1 sat pri 22°C i profiltrira kroz grubozrnati filter. Filtrat se koncentrira pod smanjenim tlakom, čime se dobije blijedo žute ulje (48,0 g) koji sadrži željeni imin. Nije vršeno nikakvo daljnje čišćenje i sirov proizvod je izravno upotrijebljen u slijedećoj reakciji.

Mikroanaliza :

izračunato za C19H21BrClNO4:

C: 51,54%, H: 4,78%; N, 3,16%; Br, 18,04%; Cl: 8,00%;

nađeno: C, 51,52%, H: 5,02%; N, 2,82%; Br, 16,31%; Cl: 7,71%.

Stupanj 3

Pripravljanje

[image]

U trogrlu tikvicu od pet litara s okruglim dnom, opremljenu s mehaničkom miješalicom, stavi se reagent iz primjera I, stupanj 1 (332 g, 0,8 mola) u NMP (600 ml) pod argonom. Zatim se otopinu ohladi na -10°C. Otopinu imina (proizvedenog u stupnju 2) u NMP (320 ml) se pripravi pod dušikom i zatim se doda tijekom 30 minuta u gornju reakcijsku smjesu uz održavanje temperature pri -5°C. Po završenom dodavanju smjesu se miješa još 1 sata i ohladi na -10°C. Tijekom 10 minuta doda se mješavinu koncentrirane solne kiseline i zasićene otopine NH4C1 (30 ml/720 ml). Doda se MTBE (760 ml) i smjesu se miješa 1 sat pri 23°C. Miješanje se zaustavi i slojevi se rastave. Vodeni sloj se ekstrahira s MTBE (320 ml). Dva organska sloja se sjedine, isperu uzastopce sa zasićenom otopinom NH4Cl (320 ml), DI vodom (320 ml) i zas. otopinom NaCl (320 ml) . Otopinu se osuši s MgSO4 (60 g) , profiltrira i koncentrira, čime se dobije žuto ulje (228 g) koje sadrži željeni proizvod kao jednostruki diastereoizomer. DSC: 227,54°C (endo. 61,63 J/g).

Mikroanaliza:

izračunato za C25H33BrCl2NO6:

C: 53,72%, H: 5,95%; N: 2,50%; Br: 14,29; Cl: 6,33%;

nađeno: C: 53,80%, H: 6,45%; N: 2,23%; Br: 12,85; Cl: 6,12%.

Stupanj 4

Pripravljanje

[image]

Otopinu sirovog estera proizvedenog u stupnju 3 (-111 g) u etanolu (1500 ml) u atmosferi dušika stavi se u trogrlu tikvicu od 3 litre opremljenu s mehaničkom miješalicom. Reakcijsku smjesu se ohladi na 0°C i u obrocima se doda olovni tetraacetat (88,67 g, 0,2 mola). Reakcijsku smjesu se miješa 3 sata pri 0°C i zatim se doda 15%-tnu otopinu NaOH (150 ml) u reakcijsku smjesu pri temperaturi ispod 50C. Etanol se odstrani pod smanjenim tlakom na rotacijskom isparivaču. Doda se drugi obrok 15%-tne otopine NaOH (600 ml) i smjesu se ekstrahira s etil acetatom (2 x 300 ml), MTBE (2 x 200 ml) i etil acetatom (2 x 200 ml) . Organski slojevi se sjedine i isperu s DI vodom (2 x 200 ml) i sa zas. otopinom NaCl (2 x 100 ml) , osuši se preko bezvodnog MgSO4 (30 g). Zatim se otopinu profiltrira preko celita i koncentrira pod smanjenim tlakom, čime se dobije narančasto ulje (96 g) , koje je upotrijebljeno je bez daljnjeg čišćenja. DSC: 233,60°C (endo. 67,85 J/g).

Mikroanaliza:

izračunato za C24H29BrCl2NO5:

C: 54,71%, H: 5,54%; N: 2,65%; Br: 15,16; Cl: 6,72%;

nađeno: C: 52,12%, H: 5,40%; N: 2,47%; Br: 14,77; Cl: 6,48%.

Stupanj 5

Pripravljanje

[image]

Sirov proizvod iz stupnja 4 (~94 g) preuzme se u apsolutni etanol (180 ml) i doda se para-toluensulfonsku kiselinu monohidrat (50,0 g, 0,26 mola). Zatim se reakcijsku smjesu grije 8 sati pod refluksom, nakon čega se otapalo odstrani pod smanjenim tlakom. Ostatak se preuzme u THF (100 ml) i THF se izvuče pod smanjenim tlakom. Ostatak se otopi u etil acetatu (500 ml) i ohladi na ~5°C. Krutu tvar se odfiltrira i ispere s heptanom (2 x 50 ml), čime se dobije bijelu krutu tvar. Zatim se krutu tvar osuši zrakom, čime se dobije željeni proizvod (38 g) kao jednostruki izomer.

NMR (DMSO, TMS) (ppm) 1.12 (t, 3H). 2.29 (s. 3H), 3.0 (m. 2H), 4.05 (q, 2H),4.88 (t. 1H). 7.11 (d, 2H), 7.48 (d, 2H), 7.55 (d, 1H). 7.68 (1H, d), 8.35 (br. s. 3H); "C NMR (DMSO. TMS) (ppm):13.82. 20.75. 37.13. 45.59. 60.59. 110.63. 122.47. 125.44. 127.87. 128.06. 129.51. 131.95. 137.77. 145.33,150.14, 168.98; DSC:69.86°C (end., 406.5 J/g). 165.72°C (end. 62.27 J/g), 211.24-C (exo. 20.56 J/g) [α]D25 = 4.2° (c =0.960.MeOH); IR (MIR) (cm-1)2922, 1726. 1621. 1591. 1494. 1471. 1413. 1376. 1324. 1286. 1237, 1207;.

Mikroanaliza: izračunato za C18H21BrClNO6S:

C: 43,69%, H: 4,27%; N; 2,83; Br: 16,15%; Cl: 7,16%; S: 6,48%;

nađeno: C: 43,40%, H: 4,24%; N; 2,73; Br: 16,40%; Cl: 7,20%; S: 6,54%.

Stupanj 6

Pripravljanje

[image]

Gornji spoj proizveden je u skladu s postupcima opisanim u primjeru I, stupnjevi 4 i 5, pri čemu je ekvivalentna količina intermedijata proizvedenog u stupnju 5 kao slobodna baza zamijenjena s intermedijatom iz primjera I, stupanj 4.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer M

Pripravljanje

[image]

Stupanj 1

Pripravljanje 3-jod-5-klorsalicilaldehida

N-jodsukcinimid (144,0 g, 0,641 mola) doda se k otopini 5-klorsalicilaldehida (100 g, 0,638 mola) u dimetilformamidu (400 ml). Reakcijsku smjesu se miješa 2 dana pri sobnoj temperaturi. Doda se još N-jodsukcinimida (20,0 g) i miješanje se nastavi još 2 dana. Reakcijsku smjesu se razrijedi s etil acetatom (1 1), ispere sa solnom kiselinom, 300 ml, 0,1N), vodom (300 ml), natrijevim tiosulfatom (5%, 300 ml), zas. otopinom NaCl (300 ml), osuši (MgSO4) i koncentrira do suhog, čime se dobije željeni aldehid kao blijedo žuta kruta tvar (162 g, iskorištenje 90%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 2

Pripravljanje 2-0-(MEM)-3-jod-5-klorsalicilaldehida

Kalijev karbonat (41,4 g, 0,30 mola) doda se u otopinu 3-jod-5-klorsalicilaldehida (84,74 g, 0,30 mola) u DMF-u (200 ml) pri 20°C. Time se dobije žutu kašu i zatim se doda MEM-Cl (38,2 g, 0,305 mola) uz održavanje reakcijske temperature. Nakon 2 sata, doda se ponovno MEM-Cl (1,5 g) . Miješa se 1 sat i zatim se reakcijsku smjesu prelije na mješavinu led-vode i promiješa se. Nastane talog koji se odfiltrira i osuši u vakuumu, čime se dobije željeni zaštićeni aldehid. Iskorištenje: 95 g (85%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 3

Pripravljanje

[image]

(S)-fenil-glicinol (15,37 g, 0,112 mola) doda se u otopinu 2-0-(MEM)-3-jod-5-klorsalicilaldehida (41,5 g, 0,112 mola) u THF-u (200 ml) pri sobnoj temperaturi. Nakon 1 sata miješanja doda se MgSO4 (16 g) i miješanje se nastavi još 2 sata. Reakcijsku smjesu se profiltrira, koncentrira i suši u vakuumu 2 sata, čime se dobije željeni intermedijarni imin. U dvogrlu tikvicu s okruglim dnom stavi se Reformatsky reagent iz primjera I, stupanj 1, (81,8 g, 0,2464 mola) i N-metilpirolidinon (300 ml) i miješa se pri -10°C. Polako se doda otopinu imina u N-metilpirolidinonu (100 ml) uz održavanje temperature pri -10°C. Smjesu se drži 2 sata pri toj temperaturi i 1 sat pri -5°C. Kad se ohladi na -10°C, doda se koncentriranu HCl u amonijevom kloridu (16 ml/200 ml). Doda se etil eter (500 ml) i miješa se 2 sata pri sobnoj temperaturi. Sloj u eteru se odvoji, a vodeni sloj se dalje ekstrahira s eterom (300 ml). Sjedinjeni eterski slojevi se isperu za zasićenim amonijevim kloridom (200 ml), vodom (200 ml), zas. otopinom NaCl (200 ml) , osuše (MgSO4) i koncentriraju, čime se dobije ulje (61,0 g, iskorištenje 90%).

1H NMR je pokazala da je željena struktura uglavnom jedan diastereomer, a MS je bila u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 4

Pripravljanje

[image]

Otopinu sirovog estera proizvedenog u stupnju 3 (48,85 g, 80,61 mmolova) otopi se u etanolu (500 ml) i ohladi na 0°C. Doda se olovni tetraacetat (35,71 g, 80,61 mmolova). Nakon tri sata u smjesu se doda 15%-tnu otopinu NaOH (73 ml). Glavninu etanola se odstrani pod smanjenim tlakom. K ostatku se doda 15%-tnu otopinu NaOH (200 ml) i to se zatim ekstrahira s eterom (400 ml). Sloj u eteru se ispere s vodm 100 ml), zas. otopinom NaCl (100 ml), osuši i koncentrira, čime se dobije narančasto ulje. Ulje se otopi u etanolu 100 ml) i doda se p-toluolsulfonsku kiselinu (19,9 g). Otopinu se grije 8 sati pod refluksom i koncentrira pod smanjenim tlakom. Ostatak se razrijedi s THF (60 ml) i zagrije do refluksa i ohladi. Talog se odfiltrira, ispere s eksan/THF-om (300 ml, 1:1) i osuši, čime se dobije željeni proizvod.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 5

S-etil-3-(N-BOC-gly)-amino-3-(S)-(5-klor-2-hidroksi-3-jod)-fenil propionat

K mješavini BOC-gly-OSu (9,4 g, 34,51 mmola), etil 3-(S)-amino-3-(5-klor-2-hidroksi-3-jod) propionat PTSA soli (17,0 g, 31,38 mmolova) u DMF-u (200 ml) doda se trietil-amin (4,8 ml). Reakcijsku smjesu se miješa 18 sati pri sobnoj temperaturi. DMF se odstrani u vakuumu i ostatak se podijeli između etil acetata (600 ml) i razrijedene solne kiseline (100 ml). Organski sloj se ispere s natrijevim bikarbonatom (200 ml) , zas. otopinom NaCl (200 ml) i osuši (MgSO4) i koncentrira, čime se dobije željeni proizvod kao kruta tvar (14,2 g, iskorištenje 86%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 6

S-etil-3-(N-gly)-amino-3-(5-klor-2-hidroksi-3-jod)fenil propionat hidroklorid

Dioksan/HCl (4N, 70 ml) doda se k 3-(S)-(N-BOC-gly)-amino-3-(5-klor-2-hidroksi-3-jod)fenil propionatu (37,20 g, 70,62 mmolova) pri 0°C i miješa se 3 sata pri sobnoj temperatri. Reakcijsku smjesu se koncentrira, doda se toluen (100 ml) i ponovno se koncentrira. Dobiveni ostatak se suspendira u eteru, odfiltrira i osuši, čime se dobije željeni proizvod kao kristaliničan prah (32,0 g, iskorištenje 98%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer N

Pripravljanje

[image]

Stupanj

Pripravljanje

[image]

Gornji spoj proizveden je u skladu s primjerom I, stupnja 2A, zamjenom ekvivalentne količine 2-hidroksi-3,5-dibrombenzaldehida s 3,5-diklorsalicilaldehidom. Iskorištenje 88%; blijedo žuta kruta tvar; talište 46-47°C,

Rf = 0,6 (EtOAc/heksan 1:1 v/v) ;

1H NMR (CDCla) d 3,37 (s, 3H) ; 3,56 (m, 2H); 3,92 (m, 2H) ; 5,29 (s, 2H); 7,91 (d, 1H, J=2,4 Hz); 7,94 (d, J=2,4 Hz) ;

10,27 (s, 1H) ;

FAB-MS m/z 367 (M+)

HR-MS izračunato za C11H12Br2O4 367,9083

nađeno 367,9077

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanje 2

[image]

Gornji spoj proizveden je primjenom postupka iz primjera I, stupanj 2B i stupanj 2C, zamjenom ekvivalentne količine spoja iz stupnja 1 u primjeru I, stupanj 2B. Iskorištenje 90%; žuta kruta tvar; talište 57-59°C,

Rf = 0,46 (EtOAc/heksan 1:1 v/v);

1H NMR (CDC13) d 1,45 (s, 9H) ; 2,1 (široko, 1H, zamjenljivo) ; 2,51 (d, 1H, Ji=9,9 Hz, J2=15,3 Hz) ; 2,66 (d, 1H, J1=4,2 Hz), J2=15,3 Hz) ; 3,02 (široko, 1H, izmjenljivo); 3,39 (s, 3H) ; 3,58-3,62 (m, 4H) ; 3,81 (m, 1H) ; 3.93 (m, 2H) ; 4,63 (dd, 1H, J=4,2 Hz); 5,15 (s, 2H); 7,17-7,25 (m, 6H); 7,49 (d, 1H);

FAB-MS m/z 602 (M+H)

HR-MS izračunato za C25H34NBr2O6 602,0753

nađeno 602,0749.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 3

Pripravljanje

[image]

Gornji spoj (p-toluensulfonatna sol) proizveden je u skladu s primjerom I, stupanj 3, ali zamjenom ekvivalentne količine proizvoda dobivenog u stupnju 2 u primjeru I, u stupnju 3A. Iskorištenje 62%; bijela kruta tvar;

1H NMR (DMSO-d6) d 1,09 (t, 3H, J=7,2 Hz); 2,27 (s, 3H) ; 2,97 (dd, 2H, J1=3,0 Hz, J2=7,2 Hz) ; 4,02 (q, 2H, J=7,2 Hz) ; 4,87 (t, 1H, J=7,2 Hz) ; 7,08 (d, 2H, J=4,8 Hz) ; 7,45 (m, 3H); 7,57 (d, 1H, J=2,4 Hz); 8,2 (široko, 3H) ;

FAB-MS m/z 365 (M+H)

HR-MS izračunato za C11H14NBr2O3 365,9340

nađeno 365,9311.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 4

Pripravljanje

[image]

Gornji spoj proizveden je primjenom postupka iz primjera I, stupanj 4 zamjenom spoja dobivenog u stupnju 3. Dobiveni BOC zaštićeni intermedijat preveden u željeni spoj primjenom postupka iz primjera I, stupanj 5.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer P

Pripravljanje

[image]

Gornji spoj proizveden je u skladu s postupkom iz primjera 1 zamjenom ekvivalentne količine 3-jod-5-brom-salicilaldehida proizvedenog u primjeru F, stupanj 1, s 3,5-diklorsalicilaldehidom iz primjera I, stupanj 2A.

Primjer 1

(±)-3-brom-5-klor-2-hidroksi-P-[[2-[[[3-hidroksi-5-[(1,4,5,6-tetrahidro-5-hidroksipirimidin-2-il)amino]fenil]karbonil]-amino]acetil]amino]benzenpropionska kiselina trifluoracetatna sol

Priprava

[image]

K proizvodu iz primjera H (0,4 g, 0,0014 mola), proizvodu iz primjera B (0,58 g, 0,0014 mola), trietilaminu (0,142 g, 0,0014 mola), DMAP (17 mg) i bezvodnom DMA (4 ml) doda se EDCl (0,268 g, 0,0014 mola) pri temperaturi ledene kupelji. Reacijsku smjesu se miješa preko noći pri sobnoj temperaturi. Dobiveni esterski intermedijat se izolira preparativnom HPLC reverzne faze. K tom esteru u vodi (10 ml) i CH3CN (5 ml) doda se LiOH (580 mg, 0,0138 mola) . Nakon miješanja 1 sat pri sobnoj temperaturi, pH se spusti na 2 s TFA i proizvod se očisti preparativnom HPLC reverzne faze, čime se (nakon liofilizacije) dobije željeni proizvod kao bijela kruta tvar (230 mg).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer 2

Priprava

[image]

Gornji spoj proizveden je u skladu s metodologijom iz primjera 1, zamjenom ekvivalentne količine proizvoda iz primjera A s proizvodom iz primjera B.

Iskorištenje nakon liofilizacije bilo je 320 mg bijele krute tvari.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer 3

Priprava

[image]

Gornji spoj proizveden je u skladu s metodologijom iz primjera 1, zamjenom ekvivalentne količine proizvoda iz primjera F s proizvodom iz primjera B. Iskorištenje, nakon liofilizacije, bilo je 180 mg bijele krute tvari.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer 4

Priprava

[image]

Gornji spoj proizveden je u skladu s metodologijom iz primjera 1, zamjenom ekvivalentne količine proizvoda iz primjera D s proizvodom iz primjera B. Iskorištenje, nakon liofilizacije, bilo je 180 mg bijele krute tvari.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer 5

Priprava

[image]

Gornji spoj proizveden je u skladu s metodologijom iz primjera 1, zamjenom ekvivalentne količine proizvoda iz primjera E s proizvodom iz primjera B. Iskorištenje, nakon liofilizacije, bilo je 250 mg bijele krute tvari.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer 6

Priprava

[image]

Gornji spoj proizveden je u skladu s metodologijom iz primjera 1, zamjenom ekvivalentne količine proizvoda iz primjera C s proizvodom iz primjera B. Iskorištenje, nakon liofilizacije, bilo je 220 mg bijele krute tvari.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer 7

Priprava

[image]

Proizvod iz primjera H (7,8 g, 0,027 mola) otopi se u bezvodnom DMA (50 ml) u plamenom osušenoj boci pod dušikom i pri temperaturi ledene kupelji polako se doda izobutil-kloroformat (3,7 g, 0,027 mola) i zatim N-metilmorfolin (2,73 g, 0,027 mola). Otopinu se miješa 15 minuta pri temperaturi ledene kupelji. U rekcijsku smjesu se doda proizvod iz primjera L (10,0 g, 0,024 mola) pri temperaturi ledene kupelji i zatim N-metilmorfolin (2,43 g, 0,024 mola). Reakcijsku smjesu se zatim miješa preko noći pri sobnoj temperaturi. Dobiveni intermedijarni ester se izolira preparatinom HPLC reverzne faze. K esteru u vodi (60 ml) i CH3CN (30 ml) doda se LiOH (10,0 g, 0,238 mola). Reakcijsku smjesu se miješa 1 sat pri sobnoj temperaturi. pH se spusti na 2 s TFA. Proizvod se očisti preparativnom HPLC reverzne faze, čime se (nakon liofilizacije) dobije željeni proizvod kao bijela kruta tvar (9,7 g).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer 8

(S)-3,5-diklor-2-hidroksi-P-[[2-[[[3-hidroksi-5-[(1,4,5,6-tetrahidro-5-hidroksipirimidin-2-il)amino]fenil]karbonil]-amino]acetil]amino]benzenpropionska kiselina trifluoracetatna sol

Priprava

[image]

Stupanj A

K proizvodu iz primjera H (9,92 g, 0,0345 mola) otopljenom u bezvodnom DMA (200 ml) doda se N-metilmorfolin (4,0 ml, 0,0362 mola) . Reacijsku smjesu se ohladi na -5°C (sol/ledena kupelj). Tijekom jedne minute doda se izobutil-kloroformat, IBCF (4,48 ml, 4,713 g, 0,0345 mola) i reakcijsku smjesu se miješa 12 minuta pri temperaturi ledene kupelji. Zatim se k reakci-jskoj smjesi doda proizvod iz primjera 1 (11,15 g, 0,030 mola) pri tmeperaturi ledene kupelji i zatim N-metilmoforlin (4,0 ml, 0,0362 mola). Reakcijsku smjesu se pusti zagrijati na sobnu temperaturu i nakon završetka reakcije se koncentrira u vakuumu pri 50°C, čime se dobije tamni ostatak. Ostatak se otopi u acetonitril/vodi (otprilike 50 ml) . pH se namjesti na kiselo dodatkom male količine TFA. Ostatak se stavi na stupac 10x500 cm C-18 (veličina čestica 50 [i) i izolira se ester željenog proizvoda. (Program otapala: 100% voda + 0,05% THA do 30:70 vode + 0,05% TFA : acetonitril + 0,05% TFA tijekom 1 sata, c = 100 ml/min: program otapala pokrenut je nakon ispiranja fronte otapala). Preparativnom RP HPLC i nakon liofilizacije dobivena je bijela kruta tvar (10,5 g, 50%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj B

Proizvod iz stupnja A (pribl. 11 g) otopi se u dioksan/vodi i pH otopine namjesti se na pribl. 11,5 (pH metar) dodatkom 2,5 N NaOH. Reakcijsku smjesu miješa se pri sobnoj temperaturi. Nakon 2-3 sata potpuna pretvorba estera u kiselinu bila je potvrdena pomoću RP HPLC. pH reakcijske smjese namjesti se na pribl. 6 i iz otopine se istaloži viskozno ulje. Ulje se izolira dekantiranjem i ispere s vrućom vodom (200 ml) . Dobivena vodena mješavina se pusti ohladiti i krutu tvar se skupi filtracijom, čime se, nakon liofilizacije iz HCl otopine, dobije gornji spoj (2,6 g). Ostatak, koji je tamno viskozno ulje, pomiješa se s vrućom vodom, čime se, nakon hlađenja, dobije smeđi prah (4,12 g nakon liofilizacije iz HCl otopine).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer 9

(S)-3-brom-5-klor-2-hidroksi-P-[[2-[[[3-hidroksi-5-[(1,4,5,6-tetrahidro-5-hidroksipirimidin-2-il)amino]fenil]karbonil]-amino]acetil]amino]benzenpropionska kiselina, tifluoracetatna sol

Stupanj 1 - Priprava

[image]

K suspenziji proizvoda iz primjera J (1,0 g, 2,4 mmola), proizvoda iz primjera H (0,75 g, 2,6 mmola) i 4-dimetilaminopiridina (40 mg) u N,N-dimetilacetamidu (10 ml) doda se trietilamin (0,24 g, 2,4 mmola). Smjesu se miješa 15 minuta pri sobnoj temperaturi i doda se 1-(3-dimetil-aminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorid (0,60 g, 3,1 mmola). Reakcijsku smjesu se miješa preko noći pri sobnoj temperaturi. Smjesu se koncentrira u vakuumu i očisti pomoću HPLC reverzne faze (početni gradijent 90:10 voda/TFA: MeCN, vrijeme zadržavanja 22 minute), čime se dobije željeni proizvod (1,6 g, iskorištenje 52%).

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 2

[image]

K otopini estera proizvedenog u stupnju 1 (800 mg, 1,2 mmola) u otopini 1:4 MeCN/voda (7 ml) doda se litijev hidroksid (148 mg, 6,2 mmolova). Reakcijsku smjesu se miješa 2 sata pri sobnoj temperaturi. Doda se TFA (0,71 ml, 9,2 mmolova) i smjesu se očisti pomoću HPLC reverzne faze (početni gradijent 95:5 voda/TFA: MeCN, vrijeme zadržavnja 24 minute), čime se dobije željeni proizvod (860 mg, iskorištenje 83%).

Mikroanaliza: izračunato za C22H23BrClN5O7:

C: 39,18; H: 3,20; N, 8,89;

nađeno: C: 39,11; H: 3,17; N, 9,07.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Stupanj 3

Priprava hidrokloridne soli

Proizvod iz stupnja 2 otopi se u prikladnom otapalu (acetonitril:voda) i otopinu se polako propusti kroz stupac za ionsku izmjenu Bio-Rad AG2 -8X (kloridni oblik, 200-400 meša, >5 ekvivalenata). Želj-eni proizvod dobije se liofilizacijom kao HCl sol.

Primjer 10

Priprava

[image]

Gornji spoj proizveden je primjenom postupka iz primjera 8 zamjenom proizvoda iz primjera N s proizvodom iz primjera 1 u primjeru 8, stupanj A. Proizvod je izoliran pomoću preparativne PR HPLC i liofilizacijom je dobiven željeni proizvod kao TFA sol.

MS i 1H NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer 11

Priprava

[image]

Gornji spoj proizveden je uglavnom primjenom postupka iz primjera 8 zamjenom proizvoda iz primjera M s proizvodom iz primjera 1 u primjeru 8, stupanj A. Proizvod je izoliran pomoću preparativne PR HPLC i liofilizacijom je dobiven željeni proizvod kao TFA sol.

MS i lH NMR su bile u skladu sa željenom strukturom.

Primjer 12

Priprava

[image]

Gornji spoj proizveden je primjenom postupka iz primjera 8 i zamjenom proizvoda iz primjera P s proizvodom iz primjera 1 u primjeru 8, stupanj A. Proizvod je izoliran pomoću preparativne PR HPLC i liofilizacijom je dobiven željeni proizvod kao TFA sol.

Primjer 13

Pripravljanje

[image]

Pripravljanje 2-0-(MEM)-3,5-dijodasalicilaldehida

[image]

Kalijev karbonat (18,5 g, 0,134 mola) doda se k otopini 3,5-dijodsalicilaldehida (50,0 g, 0,134 mola) u DMF-u (150 ml) pri 20°C. Time se dobije žutu kašu i zatim se doda MEM-Cl (15,8 ml, 0,134 mola) uz održavanje reakcijske temperature. Nakon 2 sata doda se još MEM-Cl (1,5 g). Miješa se 1 sat i zatim se reakcijsku smjesu prelije u led/vodu i promiješa. Nastane talog, koji se odfiltrira i osuši u vakuumu, čime se dobije željeni zaštićeni aldehid (61 g, iskorištenje 99%).

1R NMR je bila u skladu sa željenom strukturom

Stupanj 2

Pripravljanje

[image]

(S)-fenilglicinol (17,9 g, 0,13 mola) doda se u otopinu 2-0-(MEM)-3,5-dijodasalicilaldehida (41,5 g, 0,112 mola) u THF-u (150 ml) pri sobnoj temperaturi. Miješa se 1 sati i zatim se doda MgSO4 (20,7 g) i miješanje se nastavi još 2 sata. Reakcijsku smjesu se profiltrira i filtrat se koncentrira i suši u vakuumu 2 sata. U dvogrlu tikvicu s okruglim dnom stavi se Reformatsky reagent (96 g, 0,289 mola) i N-metilpirolidinon (250 ml) i miješa se pri -10°C. Polako se doda imin u N-metilpirolidinonu (100 ml) uz održavanje temperature pri -10°C. Smjesu se drži 2 sata pri toj temperaturi i zatim još jedan sat pri -5°C. Kad se ohladi na -10°C, doda se otopinu koncentrirane HCl u zasićenom amonijevom kloridu (16 ml/200 ml). Doda se etil eter (500 ml) i smjesu se miješa 2 sata pri sobnoj temperaturi. Eterski sloj se odvoji, a vodeni sloj se dalje ekstrahira s eterom (300 ml). Sjedinjeni eterski slojevi se isperu sa zasićenim amonijevim kloridom (200 ml), vodom (200 ml), zas. otopinom NaCl (200 ml) , osuše (MgSO4) i koncentriraju, čime se dobije ulje (90,0 g, iskorištenje 99%.)

NMR pokazuje željeni proizvod i jedan diastereomer.

Stupanj 3

Pripravljanje

[image]

Otopinu sirovog estera iz stupnja 2 (14,0 g, 20,1 mmolova) otopi se u etanolu (100 ml) i ohladi se na 0°C. Jednokratno se doda olovni tetracetat (9,20 g, 20,75 mmolova). Nakon 3 sata u reakcijsku smjesu se doda 15%-tnu otopinu NaOH (73 ml). Glavninu etanola se odstrani pod smanjenim tlakom. Ostatak se doda u 15%-tnu otpinu NaOH (200 ml) koju se ekstrahira s eterom (400 ml). Eterski sloj se ispere s vodom (100 ml), zas-. otopinom NaCl (100 ml), osuši i koncentrira, čime se dobije narančasto ulje. To se otopi u etanolu (100 ml) i doda se p-toluensulfonsku kiselinu (6,08 g). Otopinu se grije 8 sati pod refluksom i koncentrira pod smanjenim tlakom. Ostatak se razrijedi s THF-om (60 ml), zagrije do refluksa i ohladi. Nakon odlaganja nastane talog. Reakcijsku smjesu se koncentrira i očisti preparativnom HPLC, čime se dobije amino kiselinu kao PTSA sol. Dobivenu krutu tvar se otopi u etanolu i zasiti se s plinom HCl. Reakcijsku smjesu se grije 6 sati pod refluksom. Reakcijsku smjesu se koncentrira, čime se dobije PTSA sol željene amno kiseline (12,47 g).

Stupanj 4

Pripravljanje etil 3-(N-BOC-gly)-amino-3-(S)-(3,5-dijod-2-hidroksifenil)propionata

[image]

K mješavini BOC-gly-OSu (7,48 g, 27,04 mmolova), etil 3-(S)-amino-3-(3,5-dijod-2-hidroksifenil)propionata PTSA soli (12,47 g, 27,04 mmolova) u DMF-u (100 ml) doda se trietilamin (3,8 ml) . Reakcijsku smjesu se miješa 18 sati pri sobnoj temperaturi. DMF se odstrani u vakuumu i ostatak se podijeli između etil acetata (600 ml) i razrijeđene solne kiseline (100 ml). Organski sloj se ispere s natrijevim bikarbonatom (200 ml), zas. otopinom NaCl (200 ml) , osuši (MgSO4) i koncentrira, čime se dobije željeni proizvod kao krutu tvar (17,0 g, iskorištenje 96%).

1H NMR je bila u skladu sa željenim proizvodom.

Stupanj 5

Pripravljanje etil 3-(N-gly)-amino-3-(3,5-dijod-2-hidroksi-fenil)propionat hidroklorida

[image]

K dioksanu/HCl (4N, 40 ml) doda se etil 3-(N-BOC-gly)-amino-3-(S)-(3,5-dijod-2-hidroksifenil)propionat (17,0 g, 25,97 mmolova) pri 0°C i reakcijsku smjesu se miješa 3 sata pri sobnoj temperaturi. Reakcijsku smjesu se koncentrira, doda se toluen (100 ml) i ponovno se koncentrira. Dobiveni ostatak se osuši, čime se dobije željeni proizvod kao kristaliničan prah (8,0 g, iskorištenje 56%).

1H NMR je bila u skladu sa željenim proizvodom.

Stupanj 6

Otopinu m-(5-hidroksipirimidino)hipurne kiseline (3,74 g, 12,98 mmolova) u dimetilacetamidu (25 ml) se grije dok se sav materijal otopi. To se zatim ohladi na 0°C i u jednom obroku se doda izobutilkloroformat (1,68 ml) i zatim N-metilmorfolin (1,45 ml). Nakon 10 minuta u jednom obroku se doda etil 3-(N-gly)-amino-3-(3,5-dijod-2-hidroksifenil)-propionat hidroklorid (6,0 g, 10,82 mmolova) i zatim N-metilmorfolin (1,45 ml) . Reakcijsku smjesu se miješa 18 sati pri sobnoj temperaturi. Reakcijsku smjesu se koncentrira, ostatak se otopi u tetrahidrofuran/vodi (1:1, 20 ml) i kromatografira (reverzna faza, 95:5 voda: acetonitril tijekom 60 minuta do 30:70 voda:acetonitril koji sadrži 0,1% TFA). Sjedinjene frakcije se koncentriraju. Ostatak se otopi u acetonitril/vodi i doda se litijev hidroksid dok postane lužnato. Otopinu se miješa 2 sata. Reakcijsku smjesu se koncentrira i očisti kao gore pomoću HPLC, čime se dobije željenu kiselinu kao TFA sol. TFA sol se prevede u odgovarajuću hidrokloridnu sol prolaskom kroz stupac za ionsku izmjenu i zatim se liofilizira.

1H NMR je bila u skladu sa željenim proizvodom.

Primjeri 14-18

Spojevi formule VII, VIII, IX, XIII i XIV i njihovi izomeri mogu se proizvesti u skladu s ovdje opisanom metodologijom zamjenom odgovarajućih polaznih materijala i reagenata što će biti jasno prosječnom stručnjaku.

Djelovanje spojeva predloženog izuma ispitano je slijedećim pokusima. Rezultati ispitivanja prikazani su u tablici 1.

ISPITIVANJE ADHEZIJE VITRONEKTINA MATERIJALI

Humani vitronektin receptor (αvβ3) očišćen je iz humane placente, kao što je ranije opisano [Pytela et al., Methods in Enzymology, 144:475-489 (1987)]. Humani vitronektin očišćen je iz svježe smrznute plazme, kao što je ranije opisano [Yatohgo et al., Cell Structure and Function, 13:281-292 (1988)]. Biotinilirani humani vitronektin je pripravljen povezivanjem NHS-biotina tvrtke Pierce Chemical Company (Rockford, IL) na očišćeni vitronektin kako je prethodno opisano [Charo et al., J. Biol. Chem. 266(3): 1415-1421 (1991)]. Pufer za ispitivanje, OPD tablete za podlogu i BSA stupnja RIA, dobiveni su od tvrtke Sigma (St. Louis, MO). Anti-biotin antitijelo dobiveno je od Calbiochem (La Jolla CA). Linbro mikrotitarske pločice su dobivene od tvrtke Flow Labs (McLean, VA). ADP reagent je dobiven od tvrtke Sigma (St. Louis, MO).

METODE

Ispitivanja receptora na krutoj fazi

Ovo ispitivanje je uglavnom isto kao što je ranije opisano [Niiya et al., Blood, 70:475-483 (1987)]. Očišćen humani vitronektin receptor (αvβ3) razrijeđen je iz otopina zalihe na 1,0 μg/ml u tris-puferiranoj otopini natrijevog klorida koja je sadržavala 1,0 mM Ca++, Mg^ i Mg++ i Mn++, pH 7,4 (TBS++). Razrijeđeni receptor odmah je prenesen na Linbro mikrotitarske pločice koncentracijom od 100 μl/jamici (100 ng receptora po jamici). Pločice su zatvorene i inkubirane preko noći pri 4°C, čime je omogućeno vezanje receptora u jamicama. Svi preostali stupnjevi provedeni su pri sobnoj temperaturi. Pokusne pločice su ispražnjene i u blok izloženih plastičnih površina dodano je 200 μl 0,1% BSA stupnja RIA u TBS+++ (TBS+++/BSA). Nakon 2 sata inkubacije, pločice su isprane s TBS+++ sa sredstvom za ispiranje pločica s 96 jamica. Logaritamski niz razrjeđenja ispitnog spoja i kontrole napravljen je počevši od koncentracije iz zalihe od 2 mM i upotrebom 2 nM biotiniliranog vitronektina u TBS+++/BSA kao sredstvu za razrjeđivanje. To prethodno miješanje obilježenog liganda s ispitnim (ili kontrolnim) ligandom i zatim prijenos alikvota od 50 μl na pokusnu pločicu izvršeno je s CETUS Propette robotom; krajnja koncentracija obilježenog liganda bila je 1 nM, a najviša koncentracija ispitnog spoja bila je l,0xl0-4 M. Kompeticija je trajala dva sata, nakon čega su sve jamice isprane sa sredstvom za ispiranje pločica, kao ranije. Afinitetno pročišćeno kozje anti-biotin antitijelo, obilježeno s peroksidazom hrena, razrijeđeno je na 1:3000 u TBS+++/BSA i u svaku jamicu dodano je 125 μl. Nakon 30 minuta pločice su isprane i inkubirane s podlogom ODD/H2O u 100 mM/1 citratnog pufera, pH 5,0. Pločice su očitane pomoću čitača za mikrotitarske pločice pri valnoj duljini od 450 nm i kad je u kontrolnim jamicama dosegnuta apsorbancija maksimalnog vezanje od pribl. 1,0, za analizu je zapisana krajnja A450. Podaci su analizirani pomoću makro ispisa koji se upotrebljava s programom EXCEL proširene plohe. Prosjek, standardna devijacija i %CV određeni su za po dva uzorka koncentracija. Srednje A450 vrijednosti su normalizirane prema srednjoj vrijednosti od četiri kontrole maksimalnog vezanja (bez dodatka kompetitora) (B-MAX). Normalizirane vrijednosti su podvrgnute algoritmu pristajanja krivulji za četiri parametra [Rodbard et al., Int. Atomic Energy Agency, Beč, str. 469 (1977)], nacrtane na polulogaritamskoj skali i izračunata je koncentracija koja odgovara inhibiciji od 50% maksimalnog vezanja biotiniliranog vitronektina (IC50), a odgovarajući R2 je dat za one spojeve koji pokazuju inhibiciju veću od 50% pri najvišoj ispitanoj koncentraciji; inače je navedena vrijednost 1050 koja je veća od najveće ispitane koncentracije. Β-[[2-[[5-[(aminoiminometil)amino]-l-okso-pentil]amino]-l-oksoetil]amino]-3-piridinpropionska kiselina [USSN 08/375,338 primjer 1], koja je jaki αvβ3 antagonist (IC50 u području 3-10 nM) bila je uključena na svakoj pločici kao pozitivna kontrola.

ISPITIVANJE PROČIŠĆENOG IIb/III/a RECEPTORA

MATERIJALI

Humani fibrinogen receptor (αIIbβ3) očišćen je iz preostalih pločica. (Pytela, R., Pierschbacher, M.D., Argraves, S., Suzuki, S., i Rouslahti, E., "Arginine-Glycine-Aspartic acid adhesion receptors", Methods in Enzymology 144 (1987) 457-489). Humani vitronektin očišćen purification of vitronectin from human plasma by heparin affinity chromatography", Cell Structure and Function 13(1988); 281-292. Biotinilirani humani vitronektin pripravljen je povezivanjem NHS-biotina dobivenog od tvrtke Pierce Chemical Company (Rockford, IL) na očišćeni vitronektin, kako je ranije opisano (Char, I.F., Nannizzi, L., Phillips, D.R., Hsu, M.A., Scaround bottomorough, R.M., "Inhibition of fibrinogen binding to GP IIb/IIIa by GP IIIa peptide", J. Biol. Chem. 266(3) (1991): 1415-1421). Pufer za ispitivanje, tablete OPD za podlogu i BSA stupnja RIA dobiveni su od tvrtke Sigma (St. Louis, MO) . Anti-biotin antitijelo dobiveno je od tvrtke Calbiochem (La Jolla, CA). Linbro mikrotitarske pločice dobivene su od tvrtke Flow Labs (McLean, VA). ADP reagent je dobiven od tvrtke Sigma (St. Louis, MO).

METODE

Ispitivanje receptora na krutoj fazi

Ovaj pokus uglavnom je jednak kao i onaj kojeg su opisali Niiya, K. Hodson, E., Bader, R., Baers-Ward, V. Koziol, J.A., Plow, E.F. i Ruggeri, Z.M., "Increased surface axpression of the membrane glycoprotein IIb/IIIa complex induced by platelet activation: Relatonships to the binding of fibrinogen and platelet aggregation", Blood 70 (1987):475-483. Očišćeni humani fibrinogen receptor (αIIbβ3) razrijeđen je iz otopina zalihe na 1,0 μg/ml u tris-puferiranoj otopini natrijevog klorida koja je sadržavala 1,0 mM Ca++, Mg++ i Mn++, pH 7,4 (TBS+++). Razrijeđeni receptor odmah je prenesen na Linbro mikrotitarske pločice koncentracijom od 100 μl/jamici (100 ng receptora po jamici). Pločice su zatvorene i inkubirane preko noći pri 4°C, čime je omogućeno vezanje receptora u jamicama. Svi preostali stupnjevi provedeni su pri sobnoj temperaturi. Pokusne pločice su ispražnjene i u blok izloženih plastičnih površina dodano je 200 μl 0,1% BSA stupnja RIA u TBS+++ (TBS+++/BSA) . Nakon 2 sata inkubacije, pločice su isprane s TBS+++ sa sredstvom za ispiranje pločica s 96 jamica. Logaritamski niz razrjeđenja ispitnog spoja i kontrole napravljen je počevši od koncentracije iz zalihe od 2 mM i upotrebom 2 nM biotiniliranog vitronektina u TBS+++/BSA kao sredstvu za razrjeđivanje. To prethodno miješanje obilježenog liganda s ispitnim (ili kontrolnim) ligandom i zatim prijenos alikvota od 50 μl na pokusnu pločicu izvršeno je s CETUS Propette robotom; krajnja koncentracija obilježenog liganda bila je 1 nM, a najviša koncentracija ispitnog spoja bila je l,0xl0-4 M. Kompeticija je trajala dva sata, nakon čega su sve jamice isprane sa sredstvom za ispiranje pločica, kao ranije. Afinitetno pročišćeno kozje anti-biotin antitijelo, obilježeno s peroksidazom hrena, razrijeđeno je na 1:3000 u TBS+++/BSA i u svaku jamicu dodano je 125 μl. Nakon 30 minuta pločice su isprane i inkubirane s podlogom ODD/H2O u 100 mM/1 citratnog pufera, pH 5,0. Pločice su očitane pomoću čitača za mikrotitarske pločice pri valnoj duljini od 450 nm i kad je u kontrolnim jamicama dosegnuta apsorbancija maksimalnog vezanje od pribl. 1,0, za analizu je zapisana krajnja A450. Podaci su analizirani pomoću makro ispisa koji se upotrebljava s programom EXCEL proširene plohe. Prosjek, standardna devijacija i %CV određeni su za po dva uzorka koncentracija. Srednje A450 vrijednosti su normalizirane prema srednjoj vrijednosti od četiri kontrole maksimalnog veznja (bez dodatka kompetitora) (B-MAX). Normalizirane vrijednosti su podvrgnute algoritmu pristajanja krivulji za četiri parametra [Rodbard et al., Int. Atomic Energy Agency, Beč, str. 469 (1977)], nacrtane na polu-logaritamskoj skali i izračunata je koncentracija koja odgovara inhibiciji od 50% maksimalnog vezanja biotiniliranog vitronektina (IC50), a odgovarajući R2 je dat za one spojeve koji pokazuju inhibiciju veću od 50% pri najvišoj ispitanoj koncentraciji; inače je navedena vrijednost IC50 koja je veća od najveće ispitane koncentracije. β-[[2-[[5-[(aminoiminometil)amino]-l-okso-pentil]amino]-l-oksoetil]amino]-3-piridinpropionska kiselina [USSN 08/375,338 primjer 1], koja je jaki αvβ3 antagonist (IC50 u području 3-10 nM) , bila je uključena na svakoj pločici kao pozitivna kontrola.

Ispitivanje humane plazme bogate s trombocitima

Iz skupine dobrovoljaca odabran je zdrav darovatelj, koji nije uzeo aspirin. Skupljanje plazme bogate trombocitima i zatim podvrgavanje pokusu agregacije trombocita inducirane s ADP provedeno je kako je opisano u Zucker, M.B., "Platelet Aggregation Measured by the Photometric Method", Methods in Enzymology 169 (1989):117-133. Standardni postupak punkcije vene pomoću leptira omogućio je izvlačenje 45 ml cjelovite krvi u 60 ml štrcaljku koja je sadržavala 5 ml 3,8%-tnog trinatrijevog citrata. Nakon temeljitog miješanja u štrcaljci, nekoagulirana cjelovita krv je prenesena u koničnu polietilensku epruvetu od 50 ml. Krv je centrifugirana 12 minuta pri sobnoj temperaturi i pri 200 xg, da se istalože ne-trombocitne stanice. Plazma bogata trombocitima prenešena je u polietilenske epruvete i pohranjena do upotrebe pri sobnoj temperaturi. Plazma siromašna trambocitima dobivena je iz drugog centrifugiranja preostale krvi 15 minuta pri 2000 xg. Iznosi trombocita bili su tipično 300.000 do 500.000 po mikrolitri. Plazma bogata trombocitima (0,45 ml) stavljena je u alikvotima u silokonizirane kivete i miješana (1100 okr./min) 1 minutu pri 37°C prije dodavanja 50 μl prethodno razrijeđenog spoja. Nakon 1 minute miješanja, agregacija je inicirana dodatkom 50 μl 200 μM ADP. Agregacija je zapisana za 3 minute u Payton agrometru s dvostrukim kanalom (Payton Scientific, Buffalo, NY). Postotak inhibicije maksimalne reakcije (kontrolna otopina NaCl) za nizove razrjedenja ispitnih spojeva upotrijebljena je za određivanje krivulje doze reakcije. Svi spojevi su ispitani u duplikatu i koncentracije polumaksimalne inhibicije (1050) su izračunate grafički iz krivulje doze reakcije za one spojeve koji pokazuju 50%-tnu ili veću inhibiciju pri najvišoj ispitanoj koncentraciji; inače je navedena vrijednost 1050 koja je veća od najveće ispitane koncentracije.

[image]

Claims

1. Spoj formule [image] naznačen time, da su X i Y jednake ili različite halogene skupine; R je H ili C1-C10-cilkil; i njegove farmaceutski prihvatljive soli.

2. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da je odabran iz skupine koju čine: [image] [image] [image] [image] [image] [image] gdje R je H ili alkil; i njegove farmaceutski prihvatljive soli.

3. Spoj prema zahtjevu 1, naznačen time, da je odabran iz skupine koju čine: [image] [image] [image] [image] [image] [image] [image]

4. Farmaceutski sastav, naznačen time, da sadrži terapeutski učinkovitu količinu spoja prema zahtjevu 1 i farmaceutski prihvaljiv nosač.

5. Farmaceutski sastav, naznačen time, da sadrži terapeutski učinkovitu količinu spoja prema zahtjevu 2 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

6. Farmaceutski sastav, naznačen time, da sadrži terapeutski učinkovitu količinu spoja prema zahtjevu 3 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

7. Upotreba spoja prema zahtjevu 1, 2 ili 3, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje stanja koja se mogu liječiti s αvβ3 integrinom kod sisavaca kojima je potrebno takovo liječenje.

8. Upotreba spoja prema zahtjevu 1, 2 ili 3, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje tumorskih metastaza.

9. Upotreba spoja prema zahtjevu 1, 2 ili 3, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje rasta tvrdog tumora.

10. Upotreba spoja prema zahtjevu 1, 2 ili 3, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje angiogeneze.

11. Upotreba spoja prema zahtjevu 1, 2 ili 3r naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje osteoporoze.

12. Upotreba spoja prema zahtjevu 1, 2 ili 3, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje humoralne hiperkalcemije malignosti.

13. Upotreba spoja prema zahtjevu 1, 2 ili 3, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje migracije stanica glatkog mišića.

14. Upotreba spoja prema zahtjevu 1, 2 ili 3, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje reumatoidnog artritisa.

15. Upotreba spoja prema zahtjevu 1, 2 ili 3, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju lijeka za liječenje makularne degeneracije.