FI122406B - Farmaseuttisia koostumuksia IL-6:n tuoton aiheuttamien sairauksien hoitoon, jolloin sairaus on nefriitti eli munuaistulehdus - Google Patents

Description

Farmaseuttisia koostumuksia IL-6:n tuoton aiheuttamien sairauksien hoitoon, jolloin sairaus on nefriitti eli munuaistulehdus - Farmaceutiska kompositioner för behandling av sjukdomar förorsakade av IL-6-produktion, varvid sjukdo-men är nefrit dvs. njurinflammation 5

Tekninen alue Tämä keksintö koskee farmaseuttisia koostumuksia sellaisten sairauksien estämi-10 seen tai hoitoon, joita interleukiini-6:n (IL-6) tuotto aiheuttaa, jolloin sairaus on nefriitti eli munuaistulehdus, ja mainitut koostumukset sisältävät vasta-aineen interleukiini-6:n reseptoria (IL-6R) kohtaan (anti-IL-6R-vasta-aine).

Keksinnön tausta 15 IL-6 on monifunktionaalinen sytokiini, jonka uskotaan toimivan immunologisten, hematologisten ja akuutin faasin reaktioiden eri tasoilla Taga, T. et ai., Critical Rewiews in Immunol. 11:265 - 280, 1992] sekä esittävän tärkeitä rooleja multippelissa mye-loomassa kasvutekijänä sekä sairauksissa, joihin plasmasytoosi liittyy, kuten reuma-20 tismissa [Hirano, T. et ai., Eur. J. Immunol. 18:1797 - 1801, 1988; Houssiau, F. A. et ai., Arth. Rheum. 31:784 - 788, 1988], Castlemanin taudissa [Yoshizaki, K. et ai., Blood 74:1360 - 1367, 1989; Brant, S. J. et ai., J. Clin. Invest. 86:592 - 599, 1990], nefriitissä eli munuaistulehduksessa, jossa mesangiaalisolut lisääntyvät [Ohta, K. et ai., Clin. Nephrol. (Saksa) 38:185 - 189, 1992; Fukatsu, A. et ai., Lab. Invest. 65:61 -25 66, 1991; Horii, Y. et ai., J. Immunol. 143:3949 - 3955, 1989], kakeksiassa, johon liittyy kasvaimen kasvu [Strassmann, G. et ai., J. Clin. Invest. 89:1681 - 1684, 1992], 5 jne..

(M

S ri . Sellaisissa transgeenisissä H-2 L hlL-6 -hiirissä (IL-6 Tgm), joissa geenitekniikan 30 avulla on ilmennetty liiallisia määriä ihmisen IL-6:tta, on havaittu lgG1-plasmasytoosi, | nefriitti, jossa mesangiaalisolut lisääntyvät, anemia, trombosytopeniaa eli veri- ^ hiutaleniukkuutta, autovasta-aineiden esiintymistä jne. [Miyai, T. et ai., esitys Japan j» Immunology Societyn 21. kokouksessa, "Hematological Change in H-2 Ld hlL-6 ? transgenic mice with age", 1991], mikä viittaa siihen, että IL-6 liittyy suureen määrän o ™ 35 sairauksia. Ei tiedetä kuitenkaan, että interleukiini-6-reseptorin vasta-aine on tehokas sairauksissa, joita interleukiinin tuotto aiheuttaa.

2

Keksinnön kuvaus Tämän keksinnön mukaan annetaan täten käyttöön farmaseuttinen koostumus sellaisten sairauksien estämiseen ja hoitoon, joita interleukiini-6:n tuotto aiheuttaa, jol-5 loin sairaus on nefriitti eli munuaistulehdus.

Edellä esitettyjen ongelmien ratkaisemiseksi tämä keksintö saa aikaan farmaseuttisia koostumuksia sellaisten sairauksien estämiseksi tai hoitoon, joita interleukiini-6:n tuotto aiheuttaa, ja mainitut farmaseuttiset koostumukset sisältävät interleukiini-6-10 reseptorin vasta-ainetta.

Piirrosten lyhyt selitys

Kuvio 1 on graafinen esitys, joka osoittaa muutoksen kunkin ryhmän eläinten ruu-15 miinpainon lisääntymisessä.

Kuvio 2 on graafinen esitys, joka osoittaa muutoksen virtsaproteiinin positiivisessa suhteessa kullakin ryhmällä. Virtsan proteiinin positiivinen suhde oli nolla muissa ryhmissä kuin ensimmäisessä ja kolmannessa.

20

Kuvio 3 on graafinen esitys, joka osoittaa hemoglobiinitason muutoksen kullakin ryhmällä.

Kuvio 4 on graafinen esitys, joka osoittaa punasolujen lukumäärän muutoksen kulla-25 kin ryhmällä.

5 Kuvio 5 on graafinen esitys, joka osoittaa verihiutaleiden lukumäärän muutoksen ™ kullakin ryhmällä, o i

CD

30 Kuvio 6 on graafinen esitys, joka osoittaa valkoisten verisolujen lukumäärän muutakin sen kullakin ryhmällä.

oo Kuvio 7 on graafinen esitys, joka osoittaa seerumin lgG1:n pitoisuuden muutoksen ° kullakin ryhmällä, o ™ 35

Kuvio 8 on graafinen esitys, joka osoittaa humaani IL-6-pitoisuuden muutoksen ryh millä 1-5.

3

Kuvio 9 esittää tuloksen solulajittelusta, joka on toteutettu fluoresenssivasta-ainetekniikalla, jossa käytettiin kontroilivasta-ainetta IgG ja Gr-1 ryhmissä 1 ja 2.

Kuvio 10 edustaa tulosta solulajittelusta, joka toteutettiin fluoresenssivasta-5 ainetekniikalla, jossa käytettiin kontroilivasta-ainetta IgG ja Gr-1 ryhmässä 6 ja 7.

Kuvio 11 on graafinen esitys, joka osoittaa kunkin ryhmän eläinten pernan painon kokeen lopussa.

10 Kuvio 12 on graafinen esitys, joka osoittaa eläinten ruumiinpainon muutoksen kussakin ryhmässä.

Kuvio 13 on graafinen esitys, joka osoittaa triglyseridipitoisuuden hiirien veressä 11. koepäivänä.

15

Kuvio 14 on graafinen esitys, joka osoittaa glukoosipitoisuuden hiirien veressä 15. koepäivänä.

Kuvio 15 on graafinen esitys, joka osoittaa ionisoidun kalsiumin pitoisuuden hiirien 20 veressä 11. koepäivänä.

Kuvio 16 on graafinen esitys, joka osoittaa sellaisten henkiinjääneiden kontrollihiirien määrän, joissa on kasvain.

25 Kuvio 17 on graafinen esitys, joka osoittaa hiirien ruumiinpainon 10. ja 12. päivänä kokeen alusta.

o

CNJ

^ Kuvio 18 on graafinen esitys, joka osoittaa ionisoidun kalsiumin pitoisuuden hiirien ° veressä 10. ja 12. päivänä kokeen aloittamisesta.

<J> w 30 | Yksityiskohtainen selvitys g lnterleukiini-6:n tuoton aiheuttamiin sairauksiin kuuluvat esimerkiksi plasmasytoosi, ? kuten reumatismi, ja Castlemanin sairaus; hyperimmunoglobulinemia; anemia; nef- ™ 35 riitti, jossa mesangiaalisolut lisääntyvät, kakeksia, jne.

Interleukiini-6:n reseptorin vasta-aine, jota on käytettävä tässä keksinnössä, voi olla mitä tahansa alkuperää tai tyyppiä (monoklonaalinen, polyklonaalinen), sikäli kuin se 4 voi estää signaalitransduktion, joka tapahtuu IL-6:n avulla, ja inhiboi IL-6:n biologisen aktiivisuuden. Se on kuitenkin mieluummin monoklonaalinen vasta-aine, joka on peräisin nisäkkäästä. Vasta-aine estää signaalitransduktion, joka tapahtuu IL-6:n avulla, ja se inhiboi IL-6:n biologisen aktiivisuuden, siten että se inhiboi IL-6:n sitoutumisen 5 IL-6R:ään.

Monokionaalista vasta-ainetta tuottava solu voi olla minkä tahansa sellaisen eläinlajin solu, joka kuuluu nisäkkäisiin, tai vasta-aine voi olla ihmisen vasta-aine tai se voi olla peräisin eläimestä, muusta kuin ihmisestä. Muusta eläimestä kuin ihmisestä peräisin 10 olevat monoklonaaliset vasta-aineet ovat mieluummin sellaisia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat peräisin kaniinista tai jyrsijästä, koska tällaisten vasta-aineiden tuottaminen on helppoa. Termiin jyrsijä kuuluu mieluummin hiiriä, rottia, hamstereita jne., mutta termi ei rajoitu niihin.

15 Termiin interleukiini-6-reseptorin vasta-aine kuuluvat esimerkiksi MR16-1 -vasta-aine (Tamura, T. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90:11924-11928, 1993), PM-1-vasta-aine (Hirata, Y. et ai., J. Immunol. 143:2900-2906,1989), jne.

Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan tuottaa olennaisesti tekniikan tason mukaisin, 20 tunnetuin menetelmin seuraavasti. Täten niitä voidaan tuottaa, siten että käytetään IL-6R:ää immunisoivana antigeeninä, jolla immunisoidaan tavanomaista menetelmää käyttämällä, ja saatuihin immunosyytteihin käytetään sitten solufuusiomenetelmää vasta-aineita tuottavien solujen seulomiseksi tavanomaisella seulontamenetelmällä.

25 Yksityiskohtaisemmin esitettynä tuotetaan monoklonaalisia vasta-aineita seuraavalla menetelmällä. Mainittu immunisoiva antigeeni voidaan saada esimerkiksi siten, että £ käytetään humaani IL-6R:n geenisekvenssiä, joka esitetään Eurooppalaisessa pa- ^ tenttihakemuksessa EP 325474. Sen jälkeen kun ihmisen IL-6R:n geenisekvenssi on 9 insertoitu tunnettuun ekspressiovektorijärjestelmään sopivan isäntäsolun transfor- σ> <m 30 mointia varten, puhdistetaan haluttu IL-6R-proteiini isäntäsoluista tai niiden Vilit jelmäsupernatantista mainitun puhdistetun IL-6R-proteiinin käyttöä varten immuni- ^ soivana antigeeninä.

00

LO

? Mainittu immunisoiva antigeeni, joka on peräisin hiirestä, voidaan tämän lisäksi saa- o ^ 35 da siten, että käytetään hiiren IL-6R:n geenisekvenssiä, joka kuvattiin Japanilaises sa, tutkimattomassa patenttijulkaisussa 3 (1991)-155795, samalla menetelmällä, kuin käytettiin humaani IL-6R:n edellä mainitulle geenisekvenssille.

5

Koska IL-6R:ää niiden lisäksi, jotka ilmentyvät solumembraanilia, niitä (sll_-6R), jotka ovat mahdollisesti erillään solumembraanista, voidaan käyttää antigeeninä. sll_-6R koostuu pääasiassa solun membraaniin sidotun IL-6R:n solunulkopuolisesta do-meenista, ja se eroaa membraaniin sidotusta IL-6R:stä siinä, että ensiksi mainitulta 5 puuttuu transmembraanidomeeni eli kalvodomeeni tai sekä transmembraanidomeeni että solunsisäinen domeeni.

Sellaisten nisäkkäiden piirissä, jotka on immunisoitu immunisoivalla antigeenillä, on suotavaa ottaa huomioon nisäkkään yhteensopivuus solufuusioon käytetyn isän-10 täsolun kanssa, ja tavallisesti käytetään hiiriä, rottia, hamstereita, kaniineja jne., mutta niihin ei ole välttämättä rajoituttava.

Eläimen immunisointi immunisoivalla antigeenillä voidaan saada aikaan ammattimiehen tuntemin menetelmin. Yleisessä menetelmässä annetaan mainittua immuni-15 soivaa antigeeniä nisäkkäälle vatsaonteloon tai ihonalaisesti. Immunisoiva antigeeni tarkemmin sanottuna laimennetaan tai lietetään sopivaan tilavuuteen PBS:ää (fosfaatilla puskuroituun keittosuolaliuokseen), fysiologista keittosuolaliuosta jne. ja sekoitetaan, jos niin halutaan, sopivan määrän kanssa täydellistä Freundin adjuvanttia sekä emulgoidaan ja sitten mainittu emulsio annetaan nisäkkäälle, mieluummin usei-20 ta kertoja, joka neljäs - 21. päivä. Immunisoinnin yhteydessä voidaan tämän lisäksi immunisoivan antigeenin kanssa käyttää sopivaa kantajaa.

Sen jälkeen kun eläin on immunisoitu edellä kuvatulla tavalla ja on varmistettu, että seerumin vasta-ainetaso on noussut halutulle tasolle, immunosyytit poistetaan nisäk-25 käästä ja ne käytetään solufuusioon. Edullisena immunosyyttinä mainitaan erityisesti pernasolu.

δ ^ Sellaisiin edullisiin myeloomasoluihin, joita käytetään tässä tutkimuksessa kantasolu- 05 9 jen partnerina, joka yhdistetään mainitun immunosyytin kanssa, kuuluu erilaisia tun- 30 nettuja solulinjoja, esimerkiksi P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. 123:1548, 1978), p3-| U1 (Curren Topics i Micro-biology and Immunology 81:1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Im- ^ munol. 6:511-519, 1976), MPC-11 (Cell 8:405-^15, 1976), SP2/0 (Nature 276:269- j» 270, 1978), FO (J. Immunol. Meth. 35:1 - 21, 1980), S194 (J. Exp. Med. 148:313- ? 323, 1978), R210 (Nature 277:131-133, 1979), jne.

O

w 35

Mainittu immunosyytti voidaan sulauttaa myeloomasolun kanssa olennaisesti tunnetun menetelmän mukaan, jota Milstein et ai. kuvaavat (Milstein et ai., Methods En-zymol. 73:3-46, 1981), jne.

6

Mainittu solufuusio voidaan toteuttaa tarkemmin sanottuna esimerkiksi solufuusiota kiihdyttävän agenssin läsnä ollessa tavallisessa ravintoalustassa. Solufuuusiota jouduttavana agenssina voidaan käyttää polyetyleeniglykolia (PEG), Sendai-virusta 5 (HVJ) jne. ja solufuusion tehokkuuden lisäämiseksi voidaan lisätä suoraan adjuvant-tia, kuten dimetyylisulfoksidia.

Immunosyyttien suhde käytettyihin myeloomasoluihin on mieluummin yhdestä kymmeneen kertaa enemmän immunosyyttejä kuin myeloomasoluja. Edellä esitettyyn 10 solufuusioon käytettynä nestemäisenä viljelyalustana mainitaan esimerkiksi nestemäinen RPMI 1640 -alustaja nestemäinen MEM-alusta, jotka sopivat parhaiten mye-loomasolulinjan kasvatukseen, sekä tavalliset soluviljelyyn käytettävät viljelyliemet, ja tämän lisäksi voidaan käyttää seerumitäydennystä, kuten vasikan sikiön seerumia (FCS) jne.

15

Halutut sulautetut solut (hybridoomat) voidaan muodostaa siten, että sekoitetaan annettu määrä edellä mainittuja immunosyyttejä myeloomasolujen kanssa edellä mainitussa ravintoliemessa ja lisätään PEG-liuosta, joka on edeltä käsin lämmitetty 37 °C:seen, esimerkiksi PEG-liuosta, jonka keskimääräinen molekyylipaino on alu-20 eella 1000-6000, 30-60 prosentin (paino/tilavuus) pitoisuutena. Sitten, sen jälkeen kun peräkkäin on lisätty sopivaa viljelyalustaa ja tämän jälkeen on poistettu superna-tantti, voidaan poistaa solunsulauttamisagenssit jne., jotka eivät ole suotavia hybri-dooman kasvun kannalta.

25 Mainittu hybridooma voidaan valita viljelemällä tavanomaisessa valinta-alustassa, kuten nestemäisessä HAT-viljelyalustassa (nestemäisessä viljelyalustassa, joka si-5 sältää hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä). Jatketaan viljelyä mainitussa ^ HAT-alustassa ajan verran, joka on riittävä siihen, että muut solut (sulautumattomat 9 solut), kuin halutut hybridoomasolut, kuolevat, tavallisesti joistakin päivistä muuta- cn 30 maan viikkoon. Tämän jälkeen toteutetaan tavanomainen rajalaimennusmenetelmä | haluttua vasta-ainetta tuottavan hybridooma seulomiseksi ja monokloonausta varten.

sj- oo Hybridoomaa, joka tuottaa täten valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita, voidaan 2 alaviljellä tavanomaisessa, nestemäisessä alustassa ja säilyttää nestetypessä pit- ^ 35 kähköjä ajanjaksoja.

Jotta monoklonaalinen vasta-aine saadaan mainitusta hybridoomasta, käytetään esimerkiksi menetelmää, jossa mainittua hybridoomaa viljellään tavanomaisen me- 7 netelmän mukaan, jotta saadaan viljelysupernatantti, tai menetelmällä, jossa hybri-dooma siirretään nisäkkääseen, joka on hybridooman kanssa yhteensopiva, ja viljellään tässä nisäkkäässä, jotta saadaan vasta-aine askitesnesteenä tai muuna sen tapaisena nesteenä. Edellinen menetelmä soveltuu erittäin puhtaan vasta-aineen 5 saantiin, kun taas viimeksi mainittu menetelmä sopii vasta-aineen suurten määrien tuottoon.

Edellä mainituilla menetelmillä saadut monoklonaaliset vasta-aineet voidaan tämän lisäksi puhdistaa tavanomaisilla puhdistusmenettelytavoilla, kuten suolautuksella irti 10 liuoksesta, geelisuodatuksella, affiniteettikromatografialla, jne.

Täten valmistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden kyky tunnistaa antigeeni suurella affiniteetilla ja erittäin tarkasti voidaan varmistaa tavanomaisilla immunologisilla menetelmillä, kuten radioimmunologisella määritysmenetelmällä, entsyymi-15 immunologisella määritysmenetelmällä (EIA, ELISA), menetelmällä, jossa käytetään fluoroivaa vasta-ainetta (immunofluoresenssianalyysillä) jne.

Tässä kokeessa käytetty monoklonaalinen vasta-aine ei rajoitu hybridooman tuottamaan monoklonaaliseen vasta-aineeseen, ja se voi olla keinotekoisesti muutettu 20 vasta-aine, jonka tarkoituksena on vähentää heteroantigeenisyyttä ihmistä kohtaan. Voidaan käyttää esimerkiksi kimeeravasta-ainetta, jossa on hiiren monoklonaalisen vasta-aineen vaihtelevia alueita ja ihmisen vasta-aineen muuttumattomia alueita. Tällainen kimeeravasta-aine voidaan valmistaa siten, että käytetään tunnettua ki-meeravasta-aineiden tuottamismenetelmää, erityisesti geenitekniikkamenetelmää.

25 Tämän lisäksi tässä keksinnössä voidaan käyttää uudelleen muotoiltua ihmisen vas-5 ta-ainetta. Tämä on vasta-aine, jossa ihmisen vasta-aineen komplementaarisuutta , määräävät alueet on korvattu nisäkkään vasta-aineen, muun kuin ihmisen vasta- 05 9 aineen, esimerkiksi hiiren vasta-aineen, komplementaarisuutta määräävillä alueilla, o 30 ja yleiset menetelmät sitä varten ovat tekniikan tason mukaan tunnettuja. Tällaista | menetelmää käyttämällä voidaan saada uudelleen muodostettu ihmisen vasta-aine, ^ joka on tässä keksinnössä käyttökelpoinen.

't 00 tn 9 Kun on välttämätöntä, voidaan korvata vasta-aineen vaihtelevan alueen runkoalueis- o ^ 35 sa (FR) aminohapot siten, että ihmisen uudelleen muodostetun vasta-aineen komp lementaarisuutta määräävä alue voi muodostaa sopivan, antigeeniä sitovan kohdan (Sato et ai., Cancer Res. 53:1-6,1993). Tällaisen uudelleen muodostetun humaanin 8 vasta-aineen esimerkkinä voidaan esittää edullisesti humanisoitu PM-1 (hPM-1) (katso Kansainvälinen patenttihakemus WO 9219759).

Voidaan muodostaa sellaisia geenejä, jotka koodittavat vasta-aineen fragmentteja, 5 esimerkiksi Fab:tä tai Fv:tä, yksinkertaista ketjua Fv (scFv), jossa Fv:n Fl- ja L-ketju on yhdistetty sopivalla linkkerillä, ja ne voidaan ilmentää sopivissa isäntäsoluissa, sikäli kuin fragmentit sitoutuvat antigeeniin ja inhiboivat IL-6:n aktiivisuutta (katso esimerkiksi julkaisua Bird et ai., Tibtech 9:132-137, 1991; Huston et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:5879-5883, 1988). Tämän lisäksi scFv:n tekemiseen voidaan 10 käyttää vasta-aineen uudelleen muodostettua V-aluetta H- ja L-ketjun Fv-aluetta varten.

Tässä keksinnössä voidaan käyttää sellaisia farmaseuttisia koostumuksia IL-6:n tuoton aiheuttamien sairauksien estämiseen ja hoitoon, joissa on tämän keksinnön mu-15 kainen IL-6-reseptorin vasta-aine, sikäli kuin mainitut koostumukset estävät IL-6:n signaalitransmission ja ovat tehokkaista IL-6:n tuoton aiheuttamia sairauksia vastaan.

Farmaseuttisia koostumuksia IL-6:n aiheuttamia sairauksien estämiseen ja hoitoon 20 voidaan antaa mieluummin parenteraalisesti, esimerkiksi ruiskeena laskimoon, lihakseen, vatsaonteloon tai ihon alle jne., sekä systeemisesti että paikallisesti. Ne voivat olla tämän lisäksi farmaseuttisen koostumuksen tai pakkauksen muodossa yhdistettyinä ainakin yhteen farmaseuttiseen kantajaan tai laimentimeen.

25 Vaikka tämän keksinnön farmaseuttisten koostumusten annos voi vaihdella potilaan sairauden tilan, iän tai antomenetelmän mukaan, on välttämätöntä valita sopiva mää-o rä soveltuvalla tavalla. Niitä voidaan antaa vaihtoehtoisesti määränä, joka on 1-1000

CM

^ mg potilaan painon kilogrammaa kohti viikossa. Tämän keksinnön farmaseuttisia ° koostumuksia ei rajoiteta kuitenkaan edellä mainittuihin annoksiin.

™ 30 £ Tämän keksinnön farmaseuttiset koostumukset voidaan formuloida tavanomaisella ^ menetelmällä. Parenteraaliset valmisteet voidaan valmistaa esimerkiksi siten, että g puhdistettu IL-6R-vasta-aine liuotetaan liuottimeen, esimerkiksi fysiologiseen keit-

O

g tosuolaliuokseen, puskuriliuokseen jne., johon lisätään adsorption estävää ainetta, ™ 35 esimerkiksi Tween 80:tä, gelatiinia, ihmisen seerumin albumiinia (HSA), jne., tai ne voivat olla lyofilisoidussa muodossa, joka voidaan muodostaa uudelleen liuottamalla se ennen käyttöä. Lyofilisoinnin lisäaineisiin sisältyvät esimerkiksi sokerialkoholi, kuten mannitoli, glukoosi, jne. tai sakkarideja.

9

ESIMERKIT

Keksintöä kuvataan nyt yksityiskohtaisemmin esimerkkien avulla viittaamalla seuraa-5 viin viite-esimerkkeihin ja esimerkkeihin, joita ei ole tarkoitettu rajoittamaan tämän keksinnön piiriä.

Viite-esimerkki 1. Transgeenisen B6Ld-IL-6-hiiren konstruointi 10 Sellainen 3,3 kbp:n suuruinen fragmentti (Ld-IL-6), jossa oli ihmisen IL-6-cDNA kytkettynä H-2Ld-promoottoriin (Suematsu et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:7547, 1989), ruiskutettiin C57BL/6J (B6) -hiiren (Nihon Clea) hedelmöitetyn munan esitumaan mikroinjektion avulla, menetelmän mukaan, jota kuvataan julkaisussa Yamu-ara et ai., J. Biochem. 96:357,1984.

15

Hedelmöitetty muna siirrettiin sellaisen naaraspuolisen hiiren munanjohtimeen, joka oli saanut hoitoa valeraskauden vuoksi. Tämän jälkeen tutkittiin vastasyntyneestä hiirestä hlL-6-cDNA:n integroituminen Southern blot - analyysin avulla, joka toteutettiin EcoRUIä pilkotulle häntä-DNA:lle, siten että käytettiin koettimena 32P:llä leimattua 20 ihmisen IL-6-cDNA:n Taql-Banll-fragmenttia. Sellaiset eläimet, joissa tutkimuksen mukaan integraatio oli toteutunut, käytettiin siitokseen B6-hiirien kanssa, jotta saatiin aikaan hiirisuku, jolla oli sama genotyyppi.

Viite-esimerkki 2. Rotan anti-IL-6R-vasta-aineen valmistus 25 CHO-soluja tuottavaa hiiren liukoista IL-6R:ää valmistettiin tavalla, jota Saito et ai. 5 kuvaavat julkaisussa J. Immunol. 147:168-173, 1991. Soluja inkuboitiin aMEM:ssä, C\| ^ joka sisälsi viisi prosenttia härän sikiön seerumia (FBS), 37 °C:ssa, kostutetussa il- 9 massa, joka sisälsi viisi prosenttia C02:a. Ilmastoitu alusta otettiin talteen ja käytettiin σ> ™ 30 hiiren slL-6R:n valmistukseen. Hiiren slL-6R:n pitoisuus alustassa määritettiin ker- | roksittaisella eli "sandwitch"-ELISAIIa, siten että käytettiin monoklonaalista anti-hiiri- ^ IL-6R-vasta-ainetta RS15 (Saito et ai., J. Immunol. 147:168 - 173, 1991) sekä kanii- °o nin polyklonaalista anti-hiiri-IL-6R-vasta-ainetta.

o δ ^ 35 Hiiren slL-6R puhdistettiin hiiren slL-6R-valmisteesta siten, että käytettiin affiniteetti- pylvästä, johon oli adsorboitu monoklonaalista hiiren anti-hiiri-IL-6R-vasta-ainetta (RS12). Puhdistettua hiiren slL-6R:ää, joka oli Freundin adjuvantissa, ruiskutettiin Wistar-rotan ihon alle ja eläimelle annettiin kahden viikon kuluttua ihonalle neljä ker 10 taa kerran viikossa tehosterokotus, joka oli 50 pg hiiren slL-6R:ää Freundin epätäydellisessä adjuvantissa. Viikon kuluttua ensimmäisestä tehosterokotuksesta annettiin rotille laskimoon 50 pg hiiren slL-6R:ää, joka oli 100 plitrassa fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta (PBS).

5

Kolme päivää myöhemmin rotista poistettiin perna ja niiden splenosyyteille eli pernasoluille toteutettiin fuusiokäsittely hiiren p3U1-myeloomasolujen kanssa siten, että solujen suhde oli 10:1. Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa, yön ajan, 100 plitrassa RPMI 1640 -alustaa, joka sisälsi 10 prosenttia FBS:ää 96-kammioisten levyjen kammioissa 10 (Falcon 3075), ja sitten niihin lisättiin 100 plitraa alustaa, joka sisälsi hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä (HAT). Puolet alustasta korvattiin HAT-alustalla päivittäin, neljän päivän ajan.

Seitsemän päivää myöhemmin valittiin hiiren slL-6R:ää sitovalla määrityksellä (ELI-15 SA) hybridooma, joka tuotti anti-hiiri-slL-6R:ää. Lyhyesti sanottuna inkuboitiin 100 plitraa hybridooman viljelmäsupernatanttia levyssä, joka aiemmin oli päällystetty kaniinin polyklonaalisella rotan anti-lgG:n vasta-aineella (1 pg millitrassa). Levy pestiin ja sitten sitä inkuboitiin hiiren s!L-6R:n kanssa (100 pg millitrassa). Pesun jälkeen lisättiin kaniinin polyklonaalista anti-hiiri-IL-6R-vasta-ainetta 2 pg:aan saakka millit-20 rassa, levy pestiin ja sitten sitä inkuboitiin alkaliseen fosfataasiin konjugoidun, vuohen polyklonaalisen anti-kaniini-IgG-vasta-aineen kanssa (Tago) 60 minuutin ajan.

Lopuksi pesun jälkeen levyä inkuboitiin alkalisen fosfataasin substraatin kanssa (Sigma 194; p-nitrofenyylifosfaatti) ja se luettiin 405 nnrssä levylukijaa käyttämällä 25 (Toso). Hybridooma, joka tunnistaa hiiren slL-6R:n, kloonattiin kaksi kertaa raja-laimennusmenetelmällä. Askitesnesteiden valmistusta varten ruiskutettiin BALB/c 5 nu/nu -hiireen kaksi kertaa 0,5 millilitraa pristaania ja kolme päivää myöhemmin ruis- ^ kutettiin sen vatsaonteloon 3x10 hybridoomasolua, jotka oli saatu aikaan. Kymme- ° nen - kaksikymmentä päivää myöhemmin koottiin askitesneste ja siitä puhdistettiin

CD

^ 30 monoklonaalinen vasta-aine MR16-1 siten, että käytettiin proteiini G -pylvästä (On- | cogene Science).

si- °° Neutraloiva vaikutus MR16-1 :Ilä tuotettuun IL-6:n vasta-aineeseen tutkittiin liittämällä ? 3H-tymidiiniä MH60.BSF2-solujen avulla (Matsuda et ai., Eur. J. Immunol. 18:951 - ^ 35 956, 1988). MH60.BSF2-soluja annosteltiin 96-kammioisen levyn kammioihin 1 x 104 solua 200 pl:ssa kammiota kohti ja sitten kammioihin lisättiin hiiren IL-6:tta (10 pg/ml)ja kammioihin lisättiin MR16-1- tai RS12-vasta-ainetta, minkä jälkeen soluja inkuboitiin 37 °C:ssa, 5-prosenttisessa CC^ssa, 44 tunnin ajan. Tämän jälkeen lisät 11 tiin kuhunkin kammioon 3H-tymidiiniä (yksi mCi/kammio) ja neljä tuntia myöhemmin niistä tutkittiin 3H-tymidiinin liittyminen.

Esimerkki 1 5

Kokeessa yksi käytettiin 31 transgeenistä hiirtä, joissa oli ihmisen IL-6-cDNA:ta ja jotka oli lisätty transgeenisestä B6 IL-6 -hiiristä (B6 IL-6 Tgm), ja käytettiin 11 normaalia poikueen jälkeläistä, joissa ei ollut ihmisen IL-6 cDNA:ta (molemmat olivat neljän viikon ikäisiä; koiraspuolisia). B6 IL-6 Tgm;t jaettiin viiteen ryhmään (ryhmä 1 -10 ryhmä 5), joissa kussakin oli kuusi eläintä ja joista vain ryhmä 1 koostui seitsemästä eläimestä. Normaalit poikueen jälkeläiset jaettiin viiden hiiren muodostamaan ryhmään kuusi ja ryhmään seitsemän, jossa oli kuusi hiirtä.

Anto-ohjelma oli seuraava: 15

Ryhmä 1 (B6 IL-6 Tgm): Neljän viikon ikäiselle hiirelle (kokeen ensimmäinen päivä) ruiskutettiin laskimoon rotan lgG1-vasta-ainetta (KH5) (kontrollivasta-aine) annoksena, joka oli 2 mg 0,2 millilitrassa, ja viiden viikon ikäiselle (kokeen kahdeksas päivä) ja sitä vanhemmalle hiirelle ruiskutettiin ihon alle 100 pg KH5-vasta-ainetta kahdesti 20 viikossa (joka kolmas ja neljäs päivä).

Ryhmä 2 (B6 IL-6 Tgm): neljän viikon ikäisille hiirille ruiskutettiin laskimoon MR16-1-vasta-ainetta annoksena, joka oli 2 mg 0,2 millilitrassa, ja viiden viikon ikäisille sekä sitä vanhemmille hiirille ruiskutettiin ihon alle 100 pg MR16-1:htä kaksi kertaa viikos-25 sa.

5 Ryhmä 3 (B6 IL-6 Tgm): Neljän viikon ikäisille hiirille ruiskutettiin laskimoon 0,2 milli- C\] ^ litraa fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta ja viiden viikon ikäisille ja sitä vanhem- 9 mille hiirille ruiskutettiin ihon alle 100 pg MR16-1:htä kaksi kertaa joka viikko.

σ> ^ 30 | Ryhmä 4 (B6 I-6 Tgm): Neljän viikon ikäisille hiirille ruiskutettiin laskimoon MR16- ^ 1:htä 2 mg 0,2 millilitrassa ja viiden viikon ikäisille ja sitä vanhemmille hiirille ruisku ut °° tettiin ihon alle 400 pg MR16-1 :htä kerran joka toinen viikko, o δ ^ 35 Ryhmä 5 (B6 IL-6 Tgm): Neljän viikon ikäisille hiirille Ruiskutettiin laskimoon MR16- 1:htä 2 mg 0,2 millilitrassa ja viiden viikon ikäisille ja sitä vanhemmille hiirille ruiskutettiin ihon alle 1 mg MR16-1:htä joka toinen viikko.

12

Ryhmä 6 (normaaleita B6-poikueen jälkeläisiä): Neljän viikon ikäisille hiirille ruiskutettiin laskimoon kontroliivasta-ainetta KH5 2 mg 0,2 millilitrassa ja viiden viikon ikäisille ja sitä vanhemmille hiirille ruiskutettiin ihon alle 100 pg KH5:ttä kaksi kertaa joka viikko.

5

Ryhmä 7 (normaaleita B6-poikueen jälkeläisiä): Neljän viikon ikäisille hiirille ruiskutettiin laskimoon MR16-1:htä 2 mg 0,2 millitlirassa ja viiden viikon ikäisille ja sitä vanhemmille hiirille ruiskutettiin ihon alle 100 pg MR16-1:htä kaksi kertaa joka viikko.

10 Tässä yhteydessä käytetyt koemenetelmät olivat seuraavat:

Ruumiin painon mittaus ja virtsan proteiinin määrittäminen: Joka viikko mitattiin ruumiin paino ja määritettiin virtsan proteiini virtsanproteiinitestipaperilla (Combistics Sa-kyo). Virtsan proteiinin lukemat, jotka olivat kolme plussaa (100-300 mg desilitrassa) 15 tai sitä enemmän, otettiin positiivisiksi arvoiksi.

Veren keräys: Veri koottiin silmäkuopantakaisesta veriviemäristä joka toinen viikko kokeen alusta lähtien (neljän viikon ikäisiltä hiiriltä) ja kokonaisveri koottiin alaontto-laskimosta kokeen lopussa (18 viikon ikäisiltä hiiriltä).

20

Verisolujen laskemiset: Mikrosolulaskijaa (Sysmex F-800) käyttäen määritettiin veren valkosolut (WBC), punasolut (RBC) sekä verihiutaleet (PLT) samoin kuin hemoglobiinin (HBG) määrä. Kokeen lopussa valmistettiin tiettyjä ryhmiä vastaavat (ryhmä 1, 2, 6 ja 7) mikroskoopin tippamaiset preparaatit ja toteutettiin valkoisten verisolujen 25 erittelylaskenta prosentteina.

5 lgG1-pitoisuuden määrittäminen verestä: Se mitattiin hiiren lgG1:lle spesifisellä ELI- C\] ^ SAIIa, siten että standardina käytettiin myeloomaproteiinia.

o O) ^ 30 Veren IL-6:n pitoisuuden määritys: Se mitattiin hlL-6:lle spesifisellä ELISAIIa.

X

CC

CL

^ Rotan anti-lgG:n vasta-aineen (IgG-luokka) tiitterin määrittäminen verestä: Koska °° annettu vasta-aine on hiirelle heterogeeninen vasta-aine, vasta-aineen tuotto annet- 2 tua vasta-ainetta vastaan mitattiin ELISAIIa siten, että antigeeninä käytettiin rotan ^ 35 lgG:tä. Tulos ilmaistiin yksiköinä siten, että standardina käytettiin aikuisen eläimen IL-6-Tgm-seerumia, joka oli annettu, rotalla kehitetty vasta-aine.

13

Veren kemiallisten parametrien määritys: Ryhmien 1, 2, 3, 6 ja 7 hiirien seerumeista määritettiin kokeen lopussa kokonaisproteiini (TP), albumiini (Alb), glukoosi (Glu), triglyseridi (TG), kreatiniini (CRE), veren ureatyppi (BUN), kalsium (Ca), alkalinen fosfataasi (ALP), glutamiini-pyruvaattitransaminaasi (GOT) sekä glutamaattipyruvaat-5 titransaminaasi (GTP) siten, että käytettiin autoanalysaattoria (COBAS FARA II, Roche).

Luuytimen ja splenosyyttien FACS-analyysi: Kokeen lopussa analysoitiin solun pinta-antigeenit FACScanillä (Beckton Dickensian) luuytimestä ja splenosyyteistä, jotka oli 10 saatu yhdeltä eläimeltä kustakin ryhmistä 1, 2, 6 ja 7. Käytetyt vasta-aineet ovat vasta-aineita (Pharmingen), jotka on kohdistettu vastaavasti Gr-1:hteen (luuydinsolut), CD4:ään, CD8:aan sekä B220:een (splenosyytit).

Autopsia eli ruumiinavaus: Kokeen lopussa toteutettiin autopsia ja mitattiin pernan 15 paino ja pääelimet tutkittiin visuaalisesti.

Ruumiinpainot: Kunkin ryhmän ruumiinpainojen muutokset esitetään kuviossa 1. Ryhmissä 1 ja 3 ruumiinpainot kasvoivat. Muiden ryhmien piirissä ei havaittu mitään eroa ruumiinpainojen muutoksissa.

20

Virtsan proteiini: Ryhmässä 1, 13 viikon iästä lähtien, eläimillä alkoi ilmetä virtsan proteiinin positiivisuutta (kuvio 2), neljä (kaksi 16 viikon ikäistä ja kaksi 17 viikon ikäistä) eläintä seitsemästä kuoli ruumiinavaukseen mennessä. Kuolemia ei kuitenkaan ilmennyt muissa ryhmissä. Myös ryhmässä 3 kahdella kuudesta eläimestä virt-25 san proteiini tuli positiiviseksi kokeen lopussa, mutta tutkimusten perusteella positii-vista virtsan proteiinin tulosta ei ollut yhdelläkään eläimellä muissa ryhmissä, o

(M

^ Hematologiset havainnot: Ryhmässä 1 havaittiin vähenemistä hemoglobiinin mää- ^ rässä (kuvio 3) ja RBC-lukumäärissä (kuvio 4), ja aste tuli vakavammaksi iän myötä.

^ 30 Verihiutaleiden lukumäärä (kuvio 5) lisääntyi ohimenevästi, mutta laski nopeasti sen £ jälkeen. Ryhmässä 3 havaittiin samanlainen suuntaus, vaikka se viivästyi vähän ^ ryhmään 1 verrattuna. Toisaalta hemoglobiinin taso eikä RBC vähentyneet, eivätkä $ verihiutaleet lisääntyneet eivätkä vähentyneet myöhemmin missään ryhmissä 2, 4 ja

O

5 5. Verinäytteiden mikroskooppisessa solujen erittelylaskennassa ilmeni, että ryh- ^ 35 mässä 1 neutrofiilit ja monosyytit lisääntyivät ja lymfosyyttijakeessa ilmeni merkityk sellistä vähenemistä, mutta ryhmällä 2 on ilmennyt normaaliarvoja (taulukko 1). Myös ryhmien 6 ja 7 välillä ei ollut mitään merkittävää eroa.

CO CM

-i—I Is·- O) =s o o o LO co o cm oo o cd

O O O in LO_ O v-_ CM O CM CO

2 o" ö o" o" o' o" o" o" o" o" I Is·"· C LP § M- S CM O 2 CO 2 CM ? E *», °„ LO co o X. o cd o ij s? S <*>" 5 o 5 S ^ o *-< CT) M" CM Μι Sr· COCO O OO T- O M- 00 o co O g CO CD O CM_ O CO O LO -M T- 2 c O) M"" cm" cm" o" T-" T-" o" o" o" Ä L= ω S o o o o o o oo o co

(0 OOOO O O O CM CO

CO o" o" o" o" o" o" o" o" o” ~4~* u= O h- -r- C LO o Τλ COCOCOCOLOOt-CMK-c-

0 CO LO co^ o_ o_ C» CD_ CD LO

LLJ T-" o" cm" T-" o" cm" o" cm" o" o" « j= $ CD S ^ o ° O ©CM? O. O ” s T- o - CO H CO r

^ C CO £2 M"" o" ^ M·" ° CM O

1 O

3 φ CO M"

O C ^ Is- CO

1- Lr d= OO CO CM CO OLO CM 00 Xf-

° O C ~ OO CO .O O COM- ^ CO (O

^ Z CD 2 CM cm" o" o' o" o" o" o" o" o" CD----- 2 ® CD § ^ OOOO φ

X £ 2 S £ -X

£ .<5 * .5 * ro * =g ia Q ^ o ti ^ Q i2Q« S- φ(/)0ε/3Φφ(/)φ(θα) T3 00 -g £ O c 2 * -2 o ΐ £ co c\j χ:

3 >> T- CVJ CD Q

<5 £ CO

r |> . .1 I ................................................1.............................................. t . J| * 15 lgG1-pitoisuus veressä: On osoitettu, että ryhmässä 1 lgG1-pitoisuus lisääntyy huomattavasti, välittömästi kokeen alun jälkeen, ja se saavuttaa lopulta noin 100-kertaisesti pitoisuuden, joka on normaalilla hiirellä (kuvio 7). lgG1:n pitoisuuden nousu huomattiin ryhmässä 3 vähän myöhemmin kuin ryhmässä 1. Ryhmissä 2, 4 ja 5 5 lgG1:n pitoisuus ei sitä vastoin noussut yhtään, ja se pysyi lähes samalla tasolla kokeen ajan. Toisaalta normaalissa hiiressä ei havaittu mitään muutosta, joka liittyi vasta-aineen antoon.

Veren hlL-6-pitoisuus: Veren hlL-6-pitoisuus vaihteli samalla tavalla kuin lgG1, siten 10 että se osoitti lisääntyvän ryhmissä 1 ja 3, kun taas se pysyi lähes samana muissa ryhmissä kokeen ajan.

Anti-rotta-IgG-vasta-aineen tiitteri veressä: Vasta-aine rotan lgG:n vasta-ainetta vastaan havaittiin ryhmissä 1, 3 ja 6 (taulukko 2). Kaikilla eläimillä ryhmissä 1 ja 3 on 15 osoitettu suuri tiitteri, kun taas ryhmässä 6 vain kahdella viidestä eläimestä osoitettiin tiitterin suurentuneen. Toisaalta muissa ryhmissä ei havaittu mitään merkittävää lisäystä.

δ cv 05

O

05

CV

T

CC

CL

Sfr oo

LO

O

δ cv

V S h- 00 ΙΩ O

ooog^imcMiocN

^ o o 5: o" °" ^ °" v ^ ...

cdoS^QQQQ

-r-O1·!'^····

T- o T- Z Z Z Z

8 J § ? S o Q Q Q

ω ^τ-ο'Μ-ζζζζ I-------- E cMg^^qqdq

:Rj r- CO CM Z Z Z Z

!ö-------- Jä£ «Ξ? ^ ri ri rl ri

“ ^ h-- o' o Z Z Z Z

________ Έ 1 ooS^Sqqqq φ T-" o o" z z z z JS________ w > - § S2$£dqdq g Φ 0“ o O z z z z o) "ro 9 3 ? ™ ra o' I j§ ^ . ^g^dcidd >, ^ o g o o o z z z z § ^ ~________% 00 cm -ra

go I

>- £; :ra __ £ 3 E w (M Jä r- . .

3 >* x-CNCO^lOCDh- (~\ g| * I I I IMI z 17

Veren kemiallisten parametrien määritys: TP lisääntyi ja Alb väheni ryhmissä 1 ja 3. TG ja ALP vähenivät ryhmissä 1 ja 3 ja vieläpä Glu väheni ryhmässä 1. Ryhmässä 2 ei havaittu mitään tällaisia muutoksia.

o

(M

σ> o O)

(M

X

cc

CL

sj- 't 00 m o δ

(M

£0> CO M" 00 CM τ- 00

m ^ CD_ 00 h- CD CO ΙΛ O

^ ci cd T - to" T-" cd T-" σΓ m" cd" co" I— CC $ys CD If-J CM CO (x| i rx 05

oi - CO - CM - ω o 05 ~ CO

Oo n «CO “ oi « CO ® n ^

t'"- CTi LO ro CO

a. sr ?- ® S 2 2 5 2

10 ^2 T- S O- CM ^2 CM

5 CO h-- 00 CM CO "M* 00 CM

CO 03 CD CO CD 1X500 OOC35 05 00

O E, CO CD 00 θ' 05 θ' CO CD CO CD

ξ! ® ^ « s +. 8 °> s s 8- ^ c ^ CO OO CO ,0- h- to" S 10

CD CO CM CM ^ CM ^5 CM CO CM

... ^ T- CMt- h- h- CMCX5

LU-i;^· CM LO CM CD V- OO CMC- CM

K c o" o" o" o" o" o" o" o" o" o" O 3 5 h- S2 OO 05 CO 00 P r o oo" CM" θ' x- CO o O0" 'sf o

h- .5, CM 03 CD x- M- T-^£ CM 05 CM

5^10 CO CM 05 CO

f; r N ^ 05 05 CO o" g cd g to"

O E h- T- CM (D ^ 05 g CM

^ r- T- 05 M" MT CD CO -Μι- L5 p -sf COCO CM CM CD 00 'M' CD CO

q < 3 CM" Ö CO O” CNl" CD CO CD CO CD

CM ^_____ 05

O

' „00- ΰ S (Λ (D S® COCO CO

05 Q_ P M- n- ^ (xf - O CD 00 ΙΟ h~ ^ v- v- co O CM to" O" CO" O" X ^ cc------

CL

^+. ω ^ to Q ^ ώ co sJ_ ^ Λ ΰ _ 3 ω ro o Q φ ,j_ ω ro 0 Q .Q .SS o 9 og oo eo > (/) ^ λ; ro CO > CO .*: > CO > (/) LO O------ 5 ä 1 ° 1 -ro 3 >> V- CM CO CD h-

« LL

19 FACS-analyysi: Ryhmien 1, 2, 6 ja 7 luuydinsolujen (BM) ja splenosyyttien (sp) analyysi paljasti, että voimakas lisäys oli Gr-1:n sellaisten positiivisten solujen suhteessa, jotka olivat granulosyyttien esiastesoluja, ryhmän 1 BM-soluissa (kuvio 9 ja kuvio 10), mutta ryhmän 2 solujen arvot olivat samanlaiset kuin normaalien poikueiden jälkeläi-5 sillä. Ryhmien 6 ja 7 välillä ei ollut mitään olennaista eroa. Mitä tulee CD4-, CD8- ja B220-positiivisten solujen suhteeseen splenosyyteissä, ei ollut mitään eroa ryhmien välillä, paitsi että ryhmässä 1 CD8- ja B220-positiiviset solut vähenivät, mikä johtui plasmasolujen lisääntymisestä (taulukko 4).

10 Taulukko 4

Splenosyyttien pinta-antigeenien analyysi

Ryhmä CD4+ CD8+ B220+ _ % % _%_ 1 __13^2_ 5,4 23,1_ 2 18,5 14,3 50,0_ 3 19,9 15,0 53,1 4 13,9 10,6 57,3 15

Ruumiinavaushavainnot: Systeemisten lymfasolmukkeiden turpoaminen ja pernan suurentuminen olivat selviä ryhmissä 1 ja 3 (kuvio 11), ja samoin munuaisten värin r- poistuminen oli helposti havaittavissa. Havaittiin myös osittaisesti maksan laajenet tumista. Näitä muutoksia ei havaittu muissa ryhmissä, eikä ollut mitään huomattavia g 20 muutoksia paitsi, että havaittiin vähäistä pernan laajentumista ryhmissä 2, 4 ja 5 g> normaaleihin poikueiden jälkeläisiin verrattuina.

X

CC

“ Tämän kokeen tulokset selitetään nyt seuraavalla tavalla. IL-6 Tgm:ssä (ryhmä 1), ^ jolle oli annettu kontrollivasta-ainetta, havaittiin moninaisia oireita, kuten lgG1- g 25 plasmasoluverisyys eli plasmasytoosi, anemia, verihiutalerunsaus, verihiutale-o niukkuus, munuaisvika, veren epänormaaleja kemiallisia parametreja, jne.. Tuli kui tenkin ilmeiseksi, että MR16-1 voi tukahduttaa täydellisesti nämä oireet.

20

On tunnettua, että IL-6 aiheuttaa sen, että B-solut erilaistuvat lopuksi plasmasoluiksi [Muraguchi, A. et ai., J. Exp. Med. 167:332-344, 1988], ja IL-6 Tgm:n tapauksessa IL-6:n tuotto aiheutti lisääntymisen veren lgG1-pitoisuudessa ja seerumin TP:n pitoisuus pieneni ja Alb:n pitoisuus väheni. Nämä seikat osoittavat, että lgG1-5 plasmaverisyys on puhjennut.

Tämän aiheuttama systeemisten lymfakudosten, kuten lymfasolmukkeiden ja pernan, laajentuminen voisivat olla vastuussa siitä, että ruumiinpaino lisääntyy huolimatta yleisen tilan huononemisesta, jonka sairauden jatkuva paheneminen aiheuttaa 10 ryhmissä 1 ja 3. MR16-1 ei vain tukahduttanut täydellisesti tällaisia tiloja, vaan se esti myös veren IL-6-pitoisuuden lisääntymisen. Täten varmistuttiin siitä, että veren IL-6-pitoisuuden lisääntyminen iän mukana, kuten havaittiin IL-6 Tgm:n yhteydessä, liittyy suoraan plasmasoluverisyyden jatkuvaan pahenemiseen. Uskottiin sen tähden, että lisääntyneet plasmasolut tuottavat itse aktiivisesti IL-6:tta, joka lisää edelleen plas-15 masolujen kasvua, josta seuraa, että IL-6:tta tuotetaan suuria määriä.

Kuten IL-6:n vaikutukset hemosyytteihin, lisääntyvien verihiutaleiden vaikutus [ishi-bashi, T. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:5953-5957, 1989; Ishibashi, T. et ai., Blood 74:1241-1244, 1989] ja indusoituvan makrosytaarisen (isopunasoluisen) 20 anemian vaikutus [Hawley, R. G. et ai., J. Exp. Med. 176:1149-1163, 1992] ovat tunnettuja. Sen lisäksi, mitä edellä esitettiin IL-6 Tgm:stä, havaitaan verihiutaleniuk-kuutta, joka liittyy ikääntymiseen ja jonka uskotaan liittyvän autoimmuniteetin kautta polyklonaalisen B solun aktivoitumiseen [Miyai, Tatsuya et ai., samassa julkaisussa].

25 MR16-1 inhiboi täydellisesti IL-6:n suorat ja epäsuorat vaikutukset hemosyyttiin, mut ta se ei vaikuttanut normaalien poikueiden jälkeläisten verisolujen lukumäärään. Tä-5 ten varmistuttiin siitä, että IL-6-reseptorin vasta-aineen vasta-aine ei vaikuttanut oi-

C\J

^ lenkaan hematosyytteihin. IL-6 Tgnrrssä havaittiin lisääntymistä Gr-1-positiivisten 9 solujen suhteessa, joita soluja pidetään granulosyyttien prekursorisoluina, sekä peri- 05 w 30 feeristen neutrofiilien suhteessa. Vaikka tiedetään, että IL-6 lisää neutrofiilejä, sen | yksityiskohtaista mekanismia ei vielä tunneta. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että ^ tämä vaikutus on ilmiö, joka tapahtuu luuytimessä prekursorisolujen tasolla. Tässä °o tutkimuksessa havaittiin myös, että MR16-1 tukahdutti IL-6:n vaikutukset täydellises- ° ti, mutta sillä ei ollut vaikutusta neutrofiilien tasoon luuytimessä eikä perifeerisessä ^ 35 veressä.

M16-1 tukahdutti myös nefriitin puhkeamisen, joka havaittiin IL-6 Tgm:ssä. On raportoitu, että IL-6 liittyy läheisesti mesangiumsoluja tuottavaan nefriittiin mesangiumsolu- 21 jen autokriinisenä kasvutekijänä. Vaikka nefriitti IL-6 Tgm:ssä on varmistettu myös mesangiumsoluja tuottavaksi nefriitiksi, ei voida kieltää, että immuunijärjestelmän voimistuminen IL-6:lla liittyy mainittuun nefriittiin [Katsume, Asao et ai., A presentation at the 21 st Meeting of Japan Immunology Society, "Characterization of 5 SCID x (SCID x H-2ld hlL-6 transgenic mice"), 1991], Joka tapauksessa, koska virtsan proteiinin ilmestyminen ja kuolemat tukahtuivat, tehtiin selväksi, että anti-IL-6-reseptorivasta-aine on tehokas tukahdutettaessa sellaisen nefriitin puhkeamista, jonka IL-6:n tuottaminen aiheuttaa.

10 IL-6 Tgm:ssä havaittiin merkittävä väheneminen seerumin Glu- ja Tg-pitoisuuksissa, jotka ovat kakeksian indikaattoreita. Tässä kokeessa havaittiin, että MR16-1-vasta-aineen anto oli tehokasta kakeksian parantamiseksi, koska Glu- ja Tg-arvot pienenivät ryhmässä 1, kun taas ryhmässä 2 nämä arvot pienenivät lähes normaalien arvojen tasolle.

15

Koska MR16-1 on rotan lgG1, joka on hiirelle heteroproteiini, on helposti otaksuttavissa, että annettua vasta-ainetta vastaan voidaan tuottaa sellaisia vasta-aineita, jotka tekisivät annetut vasta-aineet tehottomiksi.

20 Kun yritettiin saada aikaan immunologinen sietokyky siten, että kokeen ensimmäisessä herkistyksessä asetettiin alttiiksi suurelle antigeenimäärälle, muodostettiin ryhmiä, joille ensimmäisessä annossa annettiin laskimoon vasta-ainetta 2 mg hiirtä kohti. Sellaisten ryhmien joukossa, joille annettiin MR16-1 :htä, tälle hoidolle alistetut ryhmät (ryhmä 1, 4 ja 5) eivät tuottaneet yhtään havaittavaa rotan anti-lgG:n vasta- 25 ainetta antovälistä ja käytetystä annoksesta huolimatta. Mutta ryhmällä 3 on lopulta esiintynyt samoja oireita kuin ryhmällä 1, joka on ryhmä, jolle annetaan kontrollivas-5 ta-ainetta, vaikka rotan IgG-vasta-aineen vasta-aineen on tässä ryhmässä havaittu ^ lisääntyvän ja sairauden puhkeamisen on havaittu vähän viivästyvän ryhmään 1 ver- 9 rattuna.

05 30 | Uskotaan sen tähden, että hoito oli tehokasta immunologisen sietokyvyn aikaan- ^ saamiseksi, mutta rotan anti-lgG:n vasta-ainetta havaittiin myös kaikissa ryhmän 1 og eläimissä ja kahdella viidestä ryhmän 5 eläimistä, joille annettiin kontrollivasta-ainetta ? saman ohjelman mukaan. Koska plasmasoluverisyyden jatkuva paheneminen saa ^ 35 aikaan polyklonaalisen B-solun aktivoitumisen IL-6 Tgm:ssä, ei voida päätellä, että ryhmissä 1 ja 3 havaittu rotan anti-lgG:n vasta-aine on annetulle vasta-aineelle spesifinen vasta-aine. Tehtiin kuitenkin johtopäätös, että immunologisen vastustuskyvyn aikaansaava vaikutus, kun on altistettu suurelle määrälle antigeeniä ryhmien 2, 4 ja 5 22 ensimmäisessä herkistyksessä yhdistettynä spesifisten vasta-aineiden tuoton inhiboivaan vaikutukseen, johtuu suuren määrän annosta MR16-1:htä, joka oli käytössä täydellisen vastustuskyvyn aikaansaamiseksi.

5 Tässä kokeessa selvitettiin, että IL-6-reseptorin vasta-aineen vasta-aine on erittäin tehokas erilaisia, sellaisia sairauksia vastaan, joita IL-6:n tuotto aiheuttaa, vaikuttamatta normaaliin tasoon.

Esimerkki 2 10

Tutkittiin hiiren IL-6-reseptorivasta-aineen vaikutusta kooloni 26:n indusoimaan ka-keksiamalliin. Kokeeseen käytetyt hiiret olivat kuuden viikon ikäisiä, koiraspuolisia BALB/c-hiiriä, joihin implantoitiin kylkeen ihon alle kooloni 26:n muodostama kahden millimetrin este kokeen ensimmäisenä päivänä. Hiiren IL-6:n reseptorin vasta-ainetta 15 MR16-1:htä (katso viite-esimerkki 2) annettiin laskimoon annoksena, joka oli 2 mg hiirtä kohti, ensimmäisenä koepäivänä, välittömästi ennen kooloni 26:n implantaatio-ta ja sitten ihon alle annoksena, joka oli 0,5 mg hiirtä kohti seitsemäntenä, 11., 14. ja 18. päivänä (n=7). Aiemmassa kokeessa on jo varmistettu, että neutraloivat hetero-proteiinin vasta-aineet eivät tule esiin tällä menetelmällä. Rotan lgG1-kontrollivasta-20 ainetta (KH5) annettiin kasvainta kantavalle kontrolliryhmälle saman ohjelman mukaan (n=7). Muodostettiin ryhmä, jolle annettiin PBS:ää, sellaisena kontrolliryhmänä (n=7), jolla oli kasvain. Kokeen alun jälkeen ruumiinpaino mitattiin joka päivä ja kokeen alusta 11. ja 15. päivänä mitattiin veren kemialliset parametrit ja ionisoidun kalsiumin määrä.

25

Sellaisessa ryhmässä, jolla oli kasvain, ruumiin paino laski huomattavasti kymme-ς nentenä päivänä ja sen jälkeen, kun verrattiin ryhmään, jossa ei ollut kasvainta, kun ^ taas ruumiin painon vähenemistä tukahduttava vaikutus ilmaistiin ryhmässä, jolle 9 annettiin MR16-1:tä. Veren triglyseridipitoisuus 11. päivänä ja veren glukoosipitoi- O) 30 suus 15. päivänä esitetään vastaavasti kuvioissa 13 ja 14. Nämä arvot vähenivät | huomattavasti kontrolliryhmässä, jossa oli kasvain verrattuna sellaiseen kontrolliryh- ^ mään, jolla ei ollut kasvainta, kun taas ryhmässä, jolle annettiin MR16-1:tä, havaittiin S glukoosia tukahduttava taipumus ja triglyseridejä merkittävästi tukahduttava taipu- ° mus.

o ™ 35

Ionisoituneen kalsiumin pitoisuus nousi huomattavasti 11. päivänä kontrolliryhmässä, jossa oli kasvain, verrattuna sellaiseen kontrolliryhmään, jossa ei ollut kasvainta, kun 23 taas ryhmässä, jolle annettiin MR16-1:tä, havaittiin merkittävä tukahduttava vaikutus (kuvio 15).

Toteutettiin koe eloonjäämisaikaan kohdistuvan vaikutuksen varmistamiseksi ja käy-5 tettiin samaa ohjelmaa kuin edellä on esitetty (n=10). Tulos oli, että havaittiin eloonjäämisaikaan kohdistuva vaikutus ryhmässä, jolle annettiin MR16-1:tä.

Esimerkki 3 10 Tutkittiin IL-6-reseptorivasta-aineen vaikutus occ-1:llä indusoituun kakeksiamalliin, johon liittyi hyperkalsemia eli veren liiallinen kalsiumpitoisuus. Kokeeseen käytetyt hiiret olivat kuuden viikon ikäisiä, koiraspuolisia, karvattomia hiiriä. Ensimmäisenä koepäivänä implantoitiin suomuista karsinoomasolulinjaa occ-1 hiiren kylkeen ihon alle. Ensimmäisenä koepäivänä, Välittömästi ennen occ-1 :n implantaatiota annettiin 15 kullekin hiirelle laskimoon 2 mg:n annos hiiren IL-6-reseptorin vasta-ainetta MR16-1 ja sitten sitä annettiin 100 pg hiirtä kohti ihon alle seitsemäntenä ja kymmenentenä päivänä (n=6). Aiemmassa kokeessa on jo varmistettu, että heteroproteiinin, rotan vasta-aineen vastaiset, neutraloivat vasta-aineet eivät tule helposti esiin tässä menetelmässä. Kontrolliryhmälle, jonka koe-eläimillä oli kasvain, annettiin rotan lgG1:n 20 kontrollivasta-ainetta (KH5) saman ohjelman mukaan (n=6). Tämän lisäksi annettiin PBS:ää sellaiselle muodostetulle kontrolliryhmälle, jonka koe-eläimillä ei ollut kasvainta (n=7). Kokeen alun jälkeen mitattiin ruumiin paino ja ionisoituneen kalsiumin pitoisuus veressä 10. ja 12. päivänä kokeen aloittamisesta.

25 Ruumiin paino laski ryhmässä, jonka jäsenillä oli kasvain, mutta MR 16-1 :tä saaneessa ryhmässä ei ilmennyt ruumiin painon muutosta kuin kontrolliryhmässä, jonka jä-o senillä oli kasvain, mikä ilmaisee, että ruumiin painon väheneminen tukahtui (kuvio C\l A 17>-

O

CD

™ 30 Veren ionisoidun kalsiumin pitoisuus lisääntyi huomattavasti kontrolliryhmällä, jolla oli | kasvain, verrattuna sellaiseen kontrolliryhmään, jonka jäsenillä ei ollut kasvainta, kun tj- taas MR16-1 :tä saaneessa ryhmässä ruumiin painon lisääntyminen tukahtui voimak- $ kaasti (kuvio 18).

o δ

CM

Claims (5)

1. Användning av en antikropp av interleukin-6-reseptor för framställning av en farmaceutisk komposition för att förhindra och värda sädana sjukdomar som produktion av interleukin-6 förorsakar, varvid sjukdomen är nefrit dvs. njurinflammation. ^ 25 2. Användning enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den nämnda antikroppen ° är en monoklonal antikropp. CD ° 3. Användning enligt patentkrav 2, kännetecknad av att den nämnda antikroppen CD ™ är en PM-1-antikropp, en kimerisk antikropp eller en omarbetad human antikropp. X tr

1. Interleukiini-6-reseptorin vasta-aineen käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistukseen sellaisten sairauksien estämiseksi ja hoitamiseksi, joita interleukiini- 5 6:n tuotto aiheuttaa, jolloin sairaus on nefriitti eli munuaistulehdus.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine on PM-1-vasta-aine, kimeerinen vasta-aine tai uudelleen muodostettu humaani vasta-aine.

4. Användning enligt patentkrav 3, kännetecknad av att den nämnda antikroppen ^ 30 är en omarbetad human PM-1-antikropp. LO o

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine 15 on uudelleen muodostettu humaani PM-1-vasta-aine.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että nefriitti on nefriitti, jossa mesangiaalisolut lisääntyvät. 20

5. Användning enligt patentkrav 1, kännetecknad av att nefriten är en nefrit, i vil- ken mesangiocyter utökas.