MX2008014804A - Anticuerpos de afinidad elevada a receptor de il-6 humano. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humano o un fragmento de enlace de antígeno que enlace receptor IL-6 humano (hIL-6R) con un KD de alrededor de 500 pM o menos y bloquea actividad de IL-6 con un IC50 de 200 pM o menos. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo hIL-6R con una afinidad de cuando menos 2 veces más elevada con relación a su enlace a IL-6R de mono.

Description

ANTICUERPOS DE AFINIDAD ELEVADA A RECEPTOR DE IL-6 HUMANO DECLARACIÓN DE RAMO RELACIONADO La interleucina-ß (IL-6) es una citosina pleiotrópica producida por células inmunes y no inmunes que juega un papel crucial en la regulación de respuesta inmune, reacciones de fase aguda, y hematopoyesis. Se enlaza a soluble y el enlace de membrana de célula (L-6R (cadena a) formando un complejo binario y este complejo es capaz de interactuar con gpl30 de enlace de membrana de célula (cadena ß) , induce la formación de complejo de señalización que comprende dos de cada uno de IL-6, IL-6R y gpl30. Los anticuerpos a hIL-6R se describen en US 5, 670,373, 5,795, 965, 5, 817,790, 6, 410, 691, y EP 409 607B1. Los métodos terapéuticos se describen en US 5,888,510 t 6, 723, 319. BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la invención proporciona anticuerpos humanos, de preferencia anticuerpos humanos recombinantes, que se enlazan específicamente a receptor de interleucina-6 humano (hIL-6R) . Estos anticuerpos se caracterizan por enlazarse a hIL-6R con afinidad elevada y cinética de disociación lenta y por la capacidad de neutralizar la actividad de IL-6. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgGl o IgG4) y pueden comprender solamente una porción de enlace de antigeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab' )2 o scFv) , y se pueden modificar para efectuar funcionalidad, v.gr., para eliminar funciones de efector residual (Reddy y col. (2000) J. Immuinol, 164:1925-1933). En una modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo, que se enlaza a receptor de IL-6 humano (SEC ID NO: 1) con un KD de alrededor de 500 pM o menos, como se mide mediante resonancia de plasmón superficial. En una modalidad más especifica, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno tiene un KD de menos de 300pM, o menos de 200 pM, o aún menos de 100 pM. En diversas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo bloquea la actividad de hIL-6 con un IC50 de 250 pM o menos, como se mide mediante bioensayos de luciferasa. En modalidades más especificas, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo exhibe un IC50 de 150 pM o menos. En aspectos relacionados, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de la invención enlaza hIL-6R con una afinidad de cuando menos 2 veces mayor de la que enlaza IL-6R de mono. En modalidades preferidas, el anticuerpo o fragmento de enlace de proteina hIL-6R (SEQ ID NO: 1) con una afinidad que es hasta alrededor de 3 veces superior con relación a su enlace a IL-6R de mono (Macaca fascicularis dominio extracelular mostrado en SEC ID NO: 251) . En una modalidad, el anticuerpo o porción de enlace de antigeno del anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 227, 19 231, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 239, 241, 163, 179, 235, 195 Y 211, o secuencia substancialmente similar al mismo. En una modalidad más especifica, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo comprende además una región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 11, 229, 27, 233, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 237, 203 Y 219, o una secuencia similar de la misma. En modalidades especificas, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo comprenden pares de HCVR/LCVR seleccionados del grupo que consiste en SEC ID NO: 3/11; 227/229; 19/27, 231/233; 35/43; 51/59; 67/75; 83/91, 99/107; 115/123; 131/139; 147/155; 239/155; 241/155; 163/171; 179/187; 235/237; 195/203; y 211/219, o secuencias substancialmente similares de la misma. En un segundo aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de un anticuerpo de la invención. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de la invención codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un HCVR como se describe arriba. En modalidades especificas, la molécula de ácido nucleico que codifica el HCVR se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 2, 226, 18, 230, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 238, 240, 162, 178, 234, 194 y 210, o una secuencia substancialmente idéntica de las mismas. En un aspecto relacionado, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un LCVR como se describe arriba. 'En modalidades especificas, la molécula de ácido nucleico que codifica el LCVR es una secuencia de . nucleótido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 10, 228, 26, 232, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 236, 202 y 218, o una secuencia substancialmente idéntica de las mismas . En un tercer aspecto, la invención comprende un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno, que comprende un dominio de región 3 de determinación complementaria de cadena pesada (CDR3) y un dominio de CDR3 de cadena ligeran, en donde el dominio de CDR3 de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 -X6 - X7 - X8- X9 - X10 - X11 - x12 - x13 - x14 - x15 - x26 - x17-X18 - X19 (SEC ID NO: 247) en donde X1 = Ala, X2 = Lys, X3 = Gly, X4 = Arg, X5 = Asp, Xs = Ser o Ala, X7 = Phe, X8 = Asp; X9 = lie, X10 = Pro o ausente, X11 = Phe o ausente, X12 = Val o ausente, X13 = Tyr o ausente, X14 = Tyr o ausente, X15 = Tyr o ausente, X16 = Gly o ausente, X17 = Met o ausente, X18 = Asp o ausente, y X19 = Val o ausente; y el dominio CDR3 de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2- X3 - X4 - X5 -X6 - X7 - X8 - X9 (SEC ID NO: 250) en donde X1 = Gln, X2 = Gln o His, X3 - Ala, X4 = Asn o Tyr, X5 = Ser, X6 = Phe, X7 = Pro, X8 = Pro, y X9 = Thr. En una modalidad más especifica, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno comprende además un dominio de CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2. - X3 - X4 -X5 - X6 - X7 - X8 (SEC ID NO: 245) en donde X1 = Gly o Arg, X2 = Phe, X3 = Thr, X4 = Phe, X5 = Asp, C6 = Asp, X7 = Tyr, y X8= Ala; un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 -X6 - X7 - X8 (SEC ID NO: 246) en donde x1 = Gly o Val, X2 = Phe, X3 = Trp, X4 = Asn, X5 = Ser, X6 = Gly, X7 = Ser, y X8 = lie; un dominio CDRl de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 -X6 - X7 - X8 (SEC ID NO:248), en donde X1 = Gln, X2 = Gly, X3 ¿ lie, X4 = Ser, X5 = Ser, y X6 = Trp; y un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 (SEC ID NO:249), en donde X1 = Gly o Ala, X2 = Ala, y X3 = Ser. En un cuarto aspecto, ' la inve4nción presenta un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno, que comprende: un dominio CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25, 153, 9, 185, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 169, 201 y 217; y un dominio CDR3 de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en SEC ID NO: 33, 161, 17, 193, 49, 85, 81, 97, 113, 129, 145, 177, 209 y 225. En una modalidad más especifica, el anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno comprende además: un dominio CDRl de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 21, 149, 5, 181, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 165, 197 Y 214; un dominio CDR2 de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 23, 151, 7, 183, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 167, 199 y 215; un dominio CDR1 de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en SEC ID NO: 29, 157, 13, 189, 45, 651, 77, 93, 109, 125, 141, 173, 205 Y 221; y un dominio CDR2 de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 31, 159, 15, 191, 47, 63, •79, 95, 111, 127, 143, 175, 207 Y 223.** En modalidades especificas, el antigeno o fragmento de enlace de antigeno comprende secuencias de CDR de cadena pesada SEC ID NO: 21. 23, 25 y secuencias de CDR de cadena ligera SEC ID NO: 29,, 31, 33; secuencias de CDR de cadena pesada SEC ID NO: 149, 151, 153 y secuencias de CDR de cadena ligera SEQ ID NO: 157, 159, 161; secuencias CDR de cadena pesada SEC ID NO: 5, 7, 9 y de cadena ligera SEC ID NO: 13, 15, 17; y secuencias de CDR de cadena pesada SEC ID NO: 181, 183, 185 y secuencias de CDR de cadena ligera SEC ID NO: 189, 191, 193. En un quinto aspecto, la invención presenta moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo o fragmentos de enlace de antigeno de la invención, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un dominio de CDR3 de cadena pesada codificado por una secuencia de nucleótido selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 24, 152, 8, 184, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 168, 200 y 216; y un dominio de CDR3 de cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 32, 160, 16, 192, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 176, 208 y 224; así como secuencias de ácido nucleico substancialmente idénticas del mismo. En una modalidad más específica, moléculas de ácido nucleico aisladas se proporcionan que codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno de la invención, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un CDR2 de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 20, 184, 4, 180, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 164, 196 y 212; un dominio de CDR2 de cadena pesada codificado por una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 22, 150, 6, 182, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 166, 198 y 214; un dominio de CDR1 de cadena ligera codificado por una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 28, 156, 12, 188, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 172, 204 y 220; y Un dominio de CDR2 de cadena ligera codificado por una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 30, 158, K 14, 190, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 174, 206 Y 222; asi como secuencias de ácido nucleico substancialmente idénticas del mismo. La invención abarca anticuerpos anti-hIL-6R o fragmentos de enlace de antigeno de los mismos que tiene un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones, la modificación para remover sitios de glicosilación no deseables puede ser útil, o un anticuerpo que carece de fracción de mucosa en una cadena de oligosacáridos, por ejemplo, para aumentar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (ver Shield y col. (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, la modificación de una galactosilación se puede hacer a fin de modificar la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . En aspectos adicionales, la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que llevan las moléculas de ácido nucleico de la invención, y células huésped hacia las cuales dichos vectores se han introducido, como son métodos para hacer los anticuerpos o fragmentos de enlace de antigeno de la invención obtenidos cultivando las células huésped de la invención. La célula huésped puede ser una célula procariótica o eucariótica, de preferencia la célula huésped es una célula de E. coli o una célula de mamífero, tal como una célula CHO. En un aspecto adicional, la invención presenta una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano o fragmento de enlace de antígeno de un anticuerpo que enlaza específicamente hIL-6R y un portador farmacéuticamente aceptable . En aspectos adicionales, la invención presenta métodos para inhibir la actividad de IL-6 humana usando un anticuerpo, o porción de enlace de antígeno del mismo, de la invención. En una modalidad, la invención abarca un método terapéutico que comprende administrar un anticuerpo de la invención, o un fragmento del mismo, a un sujeto humano que padece de un desorden que se trata o mejora mediante inhibición de actividad de IL-6. El desorden puede ser, por ejemplo, artritis, incluyendo colitis ulcerativa; eritematosis de lupus sistémico; y enfermedades inflamatorias. En aspectos adicionales, la invención provee el uso de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno de un anticuerpo como se define arriba en la fabricación de un medicamento para uso para atenuar o inhibir una enfermedad o desorden mediado por IL-6 en un humano. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de un anticuerpo como se define arriba para uso en la atenuación o inhibición de una enfermedad o desorden mediado por IL-6 en un humano. Otros objetos y ventajas e harán evidentes de una revisión de la descripción detallada que sigue. DESCRIPCIÓN DETALLADA Antes de que se describan los métodos presentes, se debe entender que esta invención no está limitada a métodos particulares y condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También se debe entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se pretende que sea limitativa, puesto que el alcance de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones anexas. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por uno de experiencia ordinaria en el ramo al que pertenece esta invención. Aún cuando cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden usar en la práctica y prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora . El término "IL6R humano" (hIL-6R) , como se usa en la presente, se pretende para hacer referencia a un receptor de citosina humana que enlaza específicamente interleucina-6 (IL-6) . El dominio extracelular de hIL-6$ se muestra en SEC ID NO: 1. El término "anticuerpo" como se usa en la presente, se pretende que se refiera a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CHI1, GH2 y CH34. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (apreviada en la presente comoLCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio (CL1) , las regiones VH y VL pueden estar subdivididas además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones de determinación complementaria ¦ (CDR) , interdispersas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de bastidor (FR) , Cada VH y VL está compuesto de tres CDERs y cuatro FRs, dispuestos de amino-término a carboxi-término en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. El término "porción de enlace de antigeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo o "fragmento de anticuerpo") , como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que3 retienen la capacidad de enlazarse específicamente a un antígeno (v.gr., hIL-6R) . Se ha mostrado que la función de enlace de antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término "porción de enlace de antígeno2 de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de dominios VL, VH, CL1 Y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo (v) un fragmento dAb (Ward y col. (1989) Nature 241:544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región de determinación complementaria aislada (CDR) . Adicionalmente, aún cuando los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden ser unidos, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite hacerse como una sola cadena contigua en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv) ; ver v.gr., Bird y col. (1988) Science 242:423-426; y Huston y col. (19°88) Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 85:5879-5883). Estos anticuerpos de cadena sencilla también se pretende que estén abarcados dentro del término "porción de enlace de antigeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como diacuerpos, también están abarcados (ver, v.gr., Holiger y coi. (1993) Proc. Nati. Acad Sci. EUA 90:6444-6448). Un anticuerpo de "neutralización" o "bloqueo", como se usa en la presente, se pretende para hacer referencia a un anticuerpo cuyo enlace a hIL-6R resulta en inhibición de la actividad biológica de hIL-6. Esta inhibición de la actividad biológica de hIL-6 se puede determinar midiendo uno o más indicadores de actividad biológica de hIL-6 conocidos en el ramo, tal como activación celular inducida por hIL-6 y enlace de hIL-6 a hIL-6R) (ver ejemplos abajo) .

Una "CDR" o región de determinación complementaria es una región de hipervariabilidad interdispersa dentro de regiones que están más conservadas, denominadas "regiones de armazón" (FR) . En modalidades diferentes del anticuerpo anti-hIL-6R o fragmento de la invención, las FRs pueden ser idénticas a las secuencias de linea de germen humano, o pueden ser modificadas natural o artificialmente. Un grupo de CDRs se puede definir como una secuencia de consenso de aminoácido; por ejemplo, en una modalidad, el anticuerpo anti-hIL-6R o fragmento de enlace de antigeno de la invención se puede describir como comprendiendo dominio de CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 -X12 - X13 - X14 - X15 - X16 - X17 - X18 - X19 (SEC ID NO: 247) en donde X1 = Ala, X2 = Lys, X3 = Gly, X4 = Arg, X5 = Asp, X6 = Ser o Ala, X7 = Phe, X8 = Asp, X9 = lie, X10 = Pro o ausente, X11 = Phe o ausente, X12 = Val o ausente, X13 = Tyr o ausente, X14 = Tyr o ausente, X15 = Tyr o ausente, X16 = Gly o ausente, X17 = Met o ausente, X18 = Asp o ausente, y X19 = Val o ausente; y un dominio de CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 -X5 - X6 - X7 - X8 - X9 (SEC ID NO: 250) en donde X1 = Gln, X2 = Gln o His, X3 = Ala, X4 = Asn o Tyr, X5 = Ser, X6 = Phe, X7 = Pro, X8 = Pro, y X9 = Thr. El término "resonancia de plasmón superficial" como se usa en la presente, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones en tiempo real mediante detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo usando el sistema BIAcoreMR (Pharmacia Biosensor AB) . El término "epítope" es un determinante antigénico que interactúa con un sitio de enlace de antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátope. Un solo antígeno puede tener más de un epítope. Los epítopes pueden ser de conformación o lineales. Un epítope de conformación se produce mediante aminoácidos espacialmente yuxtapuestos de diferentes segmentos de la cadena de polipéptido lineal. Un epítope lineal es uno producido mediante residuos de aminoácido adyacentes en una cadena de polipéptido. En ciertas circunstancias, un epítope puede incluir fracciones de sac ridos, grupos fosforilo, o grupos sulfonilo en el antígeno. El término "identidad substancial" o "substancialmente idéntico", cuando se hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de manera óptima con inserciones de nucleótido apropiadas u omisiones con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria) , hay una identidad de secuencia de nucleótido en cuando menos alrededor de 95%, y más preferentemente cuando menos alrededor de 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de nucleótido, como se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, PLAST o Gap, como se discute arriba. Como se aplica a polipéptidos, el término "similaridad substancial" o "substancialmente similar" significa que dos secuencias de péptido, cuando están alineadas de manera óptima, tales como mediante los programas GAP o BASTFIT usando pesos de espacio de falla, comparten cuando menos 95% de identidad de secuencia, aún más preferentemente cuando menos 98% o 99% de identidad de secuencia. De preferencia, las posiciones de residuo que no son idénticas difieren mediante substituciones de aminoácido conservativas. Una "substitución de aminoácido conservativa" es una en la que un residuo de aminoácido se substituye por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (v.gr., carga o hidrofobicidad) . En general, una substitución de aminoácido conservativa no cambiará substancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos en donde dos o más secuencias de aminoácido difieren una de la otra mediante substituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia o grado de similaridad . se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la substitución. Medios para hacer este ajuste son bien conocidos a aquellos de experiencia en el ramo. Ver, v.gr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifático: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina, y triptofán; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadenas laterales ácidas : aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Los grupos de substitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, y asparagina-glutamina. Alternativamente, una reposición conservativa es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad de log PAM250 descrita en Gonnet y col. (1992) Science 256: 1443 45. Una reposición "moderadamente' conservativa" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de log-probabilidad PAM250. La similaridad de secuencia para polipéptidos, que también se refiere como identidad de secuencia, se mide típicamente usando software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteína coincide secuencias similares usando medidas de similaridad asignadas a diversas substituciones, omisiones y otras modificaciones, incluyendo substituciones de aminoácido conservativas. Por ejemplo el software GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que se pueden usar con parámetros de falla para determinar la homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Ver, v.gr., GCG Versión 6.1. Las secuencias de polipéptido también se pueden comparar usando FASTA usando parámetros de falla o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (v.gr., FASTA 2 y FASTA3) proporciona alineamientos y por ciento de identidad de secuencia de las regiones del mejor traslape entre las secuencias de pregunta y búsqueda (Pearson (2000) arriba) . Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un número grande de secuencias de diferentes organismos es el programa de computadora BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parámetros de falla. Ver, v.gr., Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 y Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402. Preparación de Anticuerpos Humanos Los métodos para generar anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo, tecnología VelocimmuneMR (Regeneron Pharmacueticals) , XenoMouseMR (Green y col. (1994) Nature Genetics 7:13-21; Abgenix) , el acercamiento "minilocus", una presentación de fago (y ver, por ejemplo, EUA 5,545,807, EUA 6,787,637). La tecnología VelocimmuneMR (US, 6,596,5219 abarca un método para generar un anticuerpo completamente humano de especificidad elevada a un antígeno seleccionado. Esta tecnología involucra generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas operablemente enlazadas a ubicaciones de región constante de ratón endógeno de modo que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta al estímulo antigénico. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se asilan y enlazan operablemente a ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas. El ADN luego se expresa en una célula capaz de expresar el anticuerpo completamente humano. En modalidad especifica, la célula es una célula CHO. Los anticuerpos pueden ser terapéuticamente útiles al bloquear una interacción de receptor de ligando o inhibir interacción de componente receptor, más que que para exterminar células a través de fijación de complemento (citotoxididad dependiente de complemento) (CDC) y citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo de participación (ADCC) . La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar la citotoxicidad dependiente de célula de complemento y mediada. De esta manera, el isotipo de un anticuerpo se puede seleccionar sobre la base, de si es deseable que el anticuerpo medie la citotoxicidad. Las inmunoglobulinas humanas pueden existir en dos formas que están asociadas con heterogeneidad de articulación. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dimeros se mantienen juntos mediante un enlace de disulfuro de cadena pesada de intercadena. En una segunda forma, los dimeros no están enlazados a través de enlaces de disulfuro de intrcadena y una molécula de alrededor de 75-80 kDa se forma compuesta de una cadena ligera y pesada acoplada covalentementé (medio anticuerpo) . Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, aún después de purificación de afinidad. La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intactos se debe, pero no está limitada a, diferencias estructurales asociadas con el isotipo de región de articulación del anticuerpo. De hecho, una sola substitución de aminoácido en la región de articulación de la articulación IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal y col. (1993) Molecular Immunology 30:105) a niveles típicamente observados usando una articulación IgGl humana. La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la articulación, región CH2 o CH3 que puede ser deseable, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada. Los anticuerpos de la invención se preparan de preferencia con el uso de tecnología VelocimmuneMR. Un ratón transgénico en el que las regiones variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena se reemplazan con regiones variables humanas correspondientes es retado con el antígeno de interés, y las células linfáticas (tales como células B) se recuperan de los ratones que expresan anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fundir con una línea de célula de mieloma para preparar líneas de célula de hibridoma inmortal, y dichas líneas de célula de hibridoma se tamizan y seleccionar para identificar líneas de célula de hibridoma que producen anticuerpos específicos al antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera se puede aislar y enlazar a regiones constantes isotópicas deseables de la cadena pesada y cadena ligera. Esta proteína de anticuerpo se puede producir en una célula, tal como una célula CHO. Alternativamente, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligera y pesada se pueden aislar directamente de linfocitos específicos de antígeno. En una modalidad, el ratón transgénica comprende hasta 18 genes de cadena pesada variables hgumanos funcionales y 12 genes de cadena ligera kappa variables humanos funcionales. En otra modalidad, el ratón transgénico comprende hasta 39 genes de cadena pesada variable humanos y 30 genes de cadena ligera kappa variables humanos. En todavía otra modalidad, el ratón transgénico comprende hasta 80 genes de cadena pesada variables humanos y 40 genes de cadena ligera kappa variables humanos. En general, los anticuerpos de la presente invención poseen afinidades muy elevadas, típicamente que poseen KDs de alrededor de 10"9 a alrededor de 10~12 M, cuando se miden enlazando a antígeno ya sea inmovilizado en fase sólida o en fase de solución. Inicialmente, los anticuerpos quiméricos de alta afinidad se aislan teniendo una región variable humana y una región constante de ratón. Como se describe abajo, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para características deseables, incluyendo afinidad de enlace a hIL-6R, capacidad de bloquear hIL-6, y/o selectividad para la proteína humana. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo totalmente humano de la invención, por ejemplo IgG4 o IgGl tipo salvaje o modificado (por ejemplo, SEC ID NO: 242, 243, 244) . Mientras que la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, enlace de antígeno de afinidad elevada y características de especificidad de meta residen en la región variable. Mapeo de Epítope y Tecnologías Relacionadas Para tamizar para anticuerpos que se enlazan a un epítope particular, se puede realizar un ensayo de bloque transversal de rutina, tal como se describe en Antibodies: A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, Harlo and Lañe, eds. Otros métodos incluyen mutantes de exploración de alanina, manchas de péptido (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), o análisis de separación de péptido como se describe en los ejemplos abajo. Además, métodos tales como escisión de epítope, extracción de epítope y modificación química de antígenos se pueden emplear (Tomer (2000) Protein Sciende: 9: 487-496) . La Perfilación Asistida por Modificación (MAP) , también conocida como Perfilación de Anticuerpo basada en Estructura de Antígeno (ASAP) es un método que pone en categorías grandes números de anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdocon similaridades del perfil de enlace de cada anticuerpo a superficies de antígeno química o enzimáticamente modificadas (Publicación de Solicitud de Patente de EUA No. 2004/0101920) . Cada categoría puede reflejar un epítope único ya sea distintivamente diferente a o traslapándose parcialmente con un epítope representado por otra categoría. Esta tecnología permite filtración rápida de anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización se puede enfocar en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica a tamizado de hibridoma, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridoma raros con características deseadas. MAP puede usarse para escoger los anticuerpos de hIL-6R de la invención en grupos de anticuerpos que enlazan diferentes epítopes. Los agentes útiles para alterar la estructura del antígeno inmovilizado son enzimas, tales como, por ejemplo, enzimas proteolíticas y agent.es químicos. La proteína de antígeno se pueden inmovilizar en ya sea superficies de chip de biosensor o cuentas de poliestireno . Las últimas se pueden procesar con, por ejemplo, en ensayo tal como un ensayo de detección múltiple LuminexMR (Luminex Corp., TX) . Debido a la capacidad de LuminexMR de manejar múltiples análisis con hasta 100 tipos diferentes de cuentas, LuminexMR proporciona superficies de antígeno casi ilimitadas con diversas modificaciones, resultando en resolución mejorada de perfilación de epítope de anticuerpo sobre un ensayo de biosensor. Administración Terapéutica y Formulaciones. La administración de entidades terapéuticas de conformidad con la invención se administrarán con portadores, excipientes, y otros agentes apropiados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar transferencia, entrega, tolerancia y lo semejante mejorados. Una multitud de formulaciones apropiadas se pueden encontrar en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington' s Pharmaceutical Sciences (15a ed. Mack Publishing Company, Easton, Pa . , 1975), particularmente el Capítulo 87 por Balug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, vesículas (tales como LipofectinMR) , conjugados' de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semi-sólidos, y mezclas semi-sólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de conformidad con la presente invención, siempre que el ingrediente activo en la formulación no se inactive por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la ruta de administración. Ver también Powell y col. PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52:238-311 y las citaciones en el mismo para información adicional relacionada con excipientes y portadores bien conocidos a los químicos farmacéuticos. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se exponen de manera de proporcionar a aquellos de experiencia ordinaria en el ramo con una exposición y descripción completa de cómo hacer y usar los métodos y composiciones de la invención, y no se pretenden para limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a números usados (v.gr., cantidades, temperatura, etc.) pero algunos errores experimentales y desviaciones se deben considerar. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular el peso molecular promedio, la temperatura está en grados Centígrados, y la presión está en o cerca de la atmosférica. Ejemplo 1. Generación de Anticuerpos Humanos a Receptor IL-6 Humano La inmunización de roedores se puede hacer mediante cualesquiera métodos conocidos en el ramo (ver, por ejemplo Harlow and Lañe (1988) arriba; Malik y Lillehoj, Antibody techniques: academic Press, 1994, CA) . En una modalidad preferida, el antígeno hIL-6R se administra directamente a ratones que comprenden ubicaciones de ADN que codifican tanto región variable de cadena pesada de Ig humano como región variable de cadena ligera Kappa (VelocimmuneMR, Regteneron Pharmaceuticals, Inc.; US 6,596,541), con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Dicho adyuvante incluye adyuvante de Freund completo e incompleto, sistema adyuvante MLP+TDM (Sigma) , o RIBI (dip'éptidos de muramilo) (ver O'Hagan, Vaccine Adjuvant, por Human Press, 2000, BJ) . Dicho adyuvante puede impedir la dispersión rápida de polipéptido secuestrando el antigeno en un depósito local, y puede contener factores que pueden estimular respuesta inmune de huésped. En una modalidad, el hIL-6R se administra indirectamente como plásmido de ADN quecontiene gene de hlL-6R y expresa hIL-6R usando una maquinaria de expresión de proteina celular huésped para producir polipéptido de antigeno en vivo. En ambos acercamientos, el programa de inmunización requiere varias administraciones espaciadas por unas pocas semanas. La respuesta inmune de anticuerpo se supervisa mediante inmunoensayo especifico de antigeno convencional. Cuando los animales alcanzaron su respuesta inmune máxima, el anticuerpo que expresa células V se cosecharon y fundieron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad, formando células de hibridoma. Para seleccionar los anticuerpos monoclonales funcionalmente deseables, medios acondicionados de las células de hibridoma o células transíectadas se tamizaron para especificidad, afinidad de enlace de antigeno, y potencia en bloquear enlace de hIL-6 a hIL-6R (abajo descrito) . Ejemplo 2. Anticuerpos anti-hIL6R generados a través de aislamiento directo de esplenocitos El ADN que codifica dominios VH y VL se puede aislar directamente de una célula B positiva de antigeno sencillo. Brevemente, el ratón transgénico inmunizado hIL-6Ra se terminó y los esplenocitos se cosecharon. Las células de células rojas se removieron mediante lisis seguida por granulación de los esplenocitos cosechados. Los esplenocitos resuspéndidos primero se incubaron con una mezcla de IgG humano, FITC-anti-mFc, y tiobin-IL6Ra durante 1 hora. Las células manchadas se lavaron dos veces con PBS, luego se mancharon con unamezcla de IgG humano y de rata, APC-anti-migM y SA-PE durante una hora. Las células manchadas se lavaron una vez con PBS y se analizaron mediante citometria de flujo en un MoFlo (Citomación) . Cada IgG positivo, IgM negativo, y célula B positiva de antigeno se clasificó y se colocó en placa en un pozo separado en una placa de 96 pozos. RT-PCR de genes de anticuerpo de estas células B se realizó de conformidad con un método descrito por Wang y col. (2000) (J Immunol Methods 244:217-225). Brevemente, los cADNs para cada célula B única se sintetizaron a través de RT5-PCR.

Cada producto RT resultante luego se dividió y transfirió en dos pozos correspondientes en dos placas de 96 pozos. Un juego de los productos RT resultantes primero se amplificó mediante PCR usando un imprimador de degenerar 5' especifico para secuencia principal de región variable de cadena pesada de IgG humano y un imprimador 3' especifico para región constante de cadena pesada de ratón, para formar un amplicón. El amplicón luego se amplificó nuevamente mediante PCR usando un imprimador 5' de degenerar especifico para armazón 1 de secuencia de región variable de cadena pesada de IgG humano y un imprimador 3' encajado especifico para región constante de cadena pesada de ratón. El otro juego de los productos de RT resultantes primero se amplificó mediante PCR usando un imprimador 5' de degeneración especifico para secuencia delantera de región variable de cadena ligera kappa humana y un imprimador 3' especifico para región constante de cadena ligera kappa de ratón para formar un amplicón. El amplicón luego se amplificó nuevamente mediante PCR usando un juego de imprimador 5' de degenerar especifico para armazón 1 de secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana y un imrpimador 3' encajado especifico para región constante de cadena ligera kappa de ratón. Los productos de PCR de cadena pesada y cadena ligera se clonaron en vectores de anticuerpo Sap 1-alineados que contienen región constante de cadena pesada de IgGl y región constante de cadena ligera kappa, respectivamente. El plásmido de cadena pesada tuvo un sitio lox2272 y un sitio lox511 que flanquean los cassettes de expresión de cadena pesada. Además, inmediatamente corriente abajo del lox2272 en el plásmido de cadena pesada hay un gene de resistencia a higromicina que carece de un promotor y un ATG de inicio. El gene de resistencia a higromicina también se enlaza de manera de transcripción a un gene eGFP de corriente abajo a través de una secuencia de IRES. El plásmido de cadena ligera tiene un sitio loxP y un sitio lox2272 que flanquean al cassette de expresión de cadena ligera. Además, el plásmido de cadena ligera tiene un promotor SV40 inmediatamente antes de un ATG en el sitio lox2272, de modo que durante la integración en una célula huésped apropiada el promotor SV40 próximo de lox2272 y ATG de inicio del plásmido de cadena ligera se lleva adyacente al gene de resistencia a higromicina en el plásmido de cadena pesada en un marco de lectura apropiada para permitir la transcripción y traslación de los genes de resistencia a hidromicina y a eGFP. Los plásmidos recombinantes purificados que tienen una secuencia de región variable de cadena pesada y los plásmidos que tienen una secuencia de región variable de cadena ligera de la misma célula B se combinaron luego y se transfectaron, junto con un plásmido que expresa la recombinasa Cre, hacia una linea de célula huésped CHO modificada. La linea de célula huésped CHO modificada contiene, de 5' a 3' , un sitio loxP, uno eCFP, un sitio lox2272, DsRed, y un sitio lox511 en una ubicación transcripcionalmente activa. Consecuentemente, la célula CHO huésped se puede aislar mediante citometria de flujo como una célula positiva azul, positiva roja y negativa verde. Cuando los plásmidos recombinantes que expresan genes de cadena pesada y de cadena ligera se transfectaron junto con un plásmido que expresa la recombinasa Cre, la recombinación especifica de sitio mediada por la recombinasa Cre resulta en la integración de los plásmidos de anticuerpo en la ubicación de cromosoma que contiene los sitios lox y reposición de los genes Ecfp Y dSrED. Los recombinantes pueden entonces aislarse como células azul negativas, rojo negativas, y verde positivas mediante citometria de flujo. Consecuentemente, las células CHO transfectadas con plásmidos recombinantes que tienen una secuencia de región variable de cadena pesada y los plásmidos que tienen una secuencia de región variable de cadena ligera de la misma célula B se clasificaron mediante citometria de flujo, y los recombinantes apropiados que muestran fenotipo azul negativo, rojo negativo y verde positivo se aislaron, y las lineas de célula CHO que expresan anticuerpo recombinante estable se establecieron de los clones aislados. Ejemplo 3. Determinación de Afinidad de Enlace de Antigeno El KD del antigeno que se enlaza a los anticuerpos seleccionados arriba descritos se determinaron mediante cinéticas superficiales en un ensayo de resonancia de plasmón superficial de biosensor de tiempo real (BIAcoreMR) . Más específicamente, la afinidad de los anticuerpos para IL-6R humano se midió usando un BIAcore® 2000 o BIAcore® 3000. El anticuerpo se capturó en una superficie de IgG contra ratón y se expusa a varias concentraciones de proteína hIL-6R recombinante, ya sea en forma monomérica o dimérica. El análisis cinético usando software BIAevaluationMR se realizó para obtener las constantes de régimen de asociación y disociación. Las afinidades de enlace de los anticuerpos a hlL-6R también se midió para ya sea medio acondicionado con hibridoma o proteínas purificadas mediante inmunoensayo de competencia basada en placa. Las proteínas de anticuerpo se purificaron usando cromatografía de afinidad de Proteína G de medio de acondicionamiento de célula de hibridoma que fue IgG-agotado bovino (Invitrogen) . Para la competencia ELISA, brevemente, cantidades constantes de anticuerpo a diferentes niveles se mezclaron previamente con diluciones en serie de proteina de antigeno, hIL-6R-hFc, que varía de 0 a 10 ug/ml, y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente para alcanzar el equilibrio de pseudo enlace entre el anticuerpo y el antígeno. Estas soluciones luego se transfirieron a placas previamente revestidas con hIL-6R-hFc de 96 pozos para permitir que el anticuerpo libre en las mezclas se enlazara a placa revestida con hIL-6R-hFc. Las placas se revistieron típicamente con 1 a 2 ug/ml de proteína de hIL-6R-hFc en solución de PBS durante la noche a 4°C seguido por bloqueo no específico de BSA. Después de eliminar por lavado el exceso de anticuerpo en solución, los anticuerpos ligados a placa se detectaron con IgG contra ratón de cabra conjugada con HRP o reactivo de anticuerpo policlonal IgA y se desarrollaron usando ya sea substratos colorimétricos o de quimiluminiscencia. La dependencia de las señales en ' las concentraciones de antígeno en solución se analizó con un análisis de ajuste de 4 parámetros usando software PrismMR (Graph Pad) y se reportaron como IC5o. El inmunoensayo de competencia también se llevó a cabo usando instrumento KinexaMR de fase de solución de estado constante (Sapidyne Inc. ) . Los resultados se muestran en el cuadro 1 (control: anticuerpo monoclonal humanizado a IL-6r humano (Patente de EUA No. 5,817,790 SEC ID NO: 69 y 71). Anticuerpo (secuencias de aminoácido HCVR y LCVR) : VQ8A9-6 (3, 11); VQ8F11-21 (19,27); W7G4-1 (35, 43); W7G4-10 851, 59) W6C10-1 (67, 75); W6C10-3 (83, 91); W6C10-4 (99, 107); W6F12-11 (115, 123); W9A6-11 (131, 139); W6A9-5 (147, 155), W3D8-4 (163, 171); W1G4-7 (179, 187); 248982-13-1-E5 (195, 203); 248982-13-2-A9 (211, 219) . KD de monómero y dímero determinado mediante BIAcoreMR; KD de solución mediante KinexaMR, IC50 mediante ensayos ELISA (n.d. = no determinado) . Cuadro 1, Afinidad de Enlace de Antigeno Anticuerpo KD Monómero KD Dimero KD Monómero IC50 Dimero (nM) (nM) en SoluELISA (nm) ción (nM) VQ8A9-6 0.222 0.101 0.120 0.004 VQ8F11-21 0.087 0.023 0.009 0.008 W3D8-4 2.410 0.172 1.910 0.013 W6A9-5 0.097 0.146 0.032 0.005 W1G4-7 0.225 0.070 0.197 0.041 W6C10-1 0.287 0.032 2.050 0.010 W6F12-11 n.d. n.d. n.d. 0.033 W7G4-10 n.d. n.d. n.d. 1.980 W9A6-11 n.d. n.d. n.d. 0.347 W5C10-3 n.d. n.d. n.d. 0.009 248982-13- 0.987 0.785 n.d. 0.380 1-ES 248982-13- 2.870 n.d. n.d. 0.054 2-A9 Control 1.790 n.d. 1.980 n.d.

Ejemplo 4. Neutralización de Actividad de hIL-6 Actividades de bloqueo de hIL-6 de los anticuerpos-anti-hIL-6R de la invención se3 tamizaron mediante inmunoensayos de bloqueo de hIL-6, inmunoensayos de cre3cimiento de célula dependiente de hIL-6 in Vitro, y resonancia de plasmón superficial (BIAcoreMR) . El inmunoensayo se usó para tamizar la capacidad del anticuerpo probado para bloquear enlace de hIL-6 a hIL-6R, y el bioensayos in Vitro se usó para determinar la potencia de los anticuerpos al neutralizar transducción de señal celular mediada por hIL-6R. Para el inmunoensayo, proteina recombinante de hlL-6 se revisitó en una placa de 96 pozos en tampón de PBS durante la noche a 41C. Est5a placa se usó para capturar hlL-6R-hFc libre de soluciones de muestra de anticuerpo, y la cantidad de hIL-6R-hFc capturada se cuantificó de conformidad con la curva convencional. Las soluciones de muestra estuvieron compuestas de una cantidad constante de proteina recombinante de hIL-6R-hFc (100 pM) y cantidades variables de anticuerpo, ya sea en medio de condición de hibridoma cruda o como una proteina de anticuerpo purificada, variando de 0 a alrededor de 50 nM en diluciones en serie. Las mezclas de antigeno de anticuerpo se incubaron a temperatura ambiente durante -2 horas para permitir que el antigeno de anticuerpo se enlacen para alcanzar equilibrio. Las soluciones de muestra equilibradas luego se transfirieron a las placas revestidas con hIL-6 para medición del hIL-6R-hFc libre. Después de 1 hora de enlace, la placa se lavó y el hIL-6R-hFc enlazado se detectó usando anticuerpos policlonales anti-hFc de cabra conjugados con HRP ( Jackson Immuno Research) , y se desarrollaron usando substrato de TMB (BD Pharmigen) ) . Se determinaron ICsos como la cantidad de anticuerpo requerida para reducir 50% de IL-6R-hFc detectable a ligando de hIL-6 enlazado a placa. Los resultados se muestran en la primera columna del Cuadro 2. Adicionalmente, la capacidad del anticuerpo de prueba para bloquear hlL-y enlazándose al receptor hIL-6R se determinó usando resonancia de plasmón superficial. Moléculas de hIL-6R-hFc de antígeno purificadas se capturaron mediante anticuerpos policlonales de IgG anti-humano de cabra inmovilizadas en superficie de CM-5 a través de acoplamiento de amina a una densidad de 250 RU. La solución de hIL-6 (0.25 mi, 50 nM) se inyectó sobre la superficie receptora y el hlL-6 enlazado se registró (primera inyección de IL-6) . El hIL-6 enlazado luego se removió con un impulso de 3 de MgCl2 seguido por tampón de acondicionamiento. El anticuerpo anti-hIL6R en medio acondicionado de hibridoma se inyectó sobre la superficie receptora capturada seguido por segunda inyección de hIL-6. El por ciento de reducción en enlace de hL-6 que resulta del anticuerpo preformado y el complejo receptor se usó como una marca para definir bloqueadores de hIL-6 de no bloqueadores (segunda columna, Cuadro 2) . Cuadro 2. Neutralización de Enlace de hIL-6 Anticuerpo Inhibición Inhibición Inhibición Actividad de Enlace de Enlace de Prolide Lucife- de de feración rasa hIL6R/hIL6 hIL6/hIL6R de célula HepG2/Stat3 IC50 (nM) (%) XG-1 IC5o IC50 (nM) (nM) VQ8A9-6 0.39 68 0.40 0.097 VQ8F11-21 0.12 98 0.62 0.135 W3D8-4 0.61 93 >100 n.d. W6A9-5 0.35 100 1.10 0.188 W1G4-7 1.10 34 1.80 0.578 W6C10-1 4.60 61 >6.90 n.d. W6F12-11 2.20 n.d. n.d. n.d. W7G4-10 13.00 n.d. n.d. n.d. W9A6-11 0.50 n.d. n.d. n.d. W8C10-3 0.06 n.d. n.d. n.d. Control 2.20 91 1.50 0.854 La capacidad de anticuerpos de hIL-6R de bloquear actividad de hIL-6 in Vitro se midió en la linea XG-1 de mieloma dependiente de hIL-6. Células de XG-1 mantenidas en medio que contiene hIL-6 se lavaron dos veces con medio libre de hIL-6 y se cultivaron durante -24 horas en medio libre de hIL-6 para agotar el hIL-6 residual. Las células en ayunas luego se hilaron y se resuspendieron en el medio a 4 x 105 células por mi y se colocaron en placa 20,000 células por pozo en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. Las proteínas de anticuerpo purificadas se diluyeron en serie en medio y se añadieron a las células en placa a concentraciones que varían de 0 a 50 nM. Subsecuentemente, hIL-6 recombinante se añadió a los pozos a una concentración final de 8 pM. Las células se dejaron crecer durante -72 horas a 37 °C en una incubadora de 5% de C02 humidificado . Al final del periodo de crecimiento, las células vivas se midieron usando juego CCK-8 (Dojindo, Japón) . Los IC50s se determinaron como se describe arriba, y se reportan en la tercera columna del Cuadro 2. La capacidad de los anticuerpos de hIL-6R para bloquear actividad de hIL-6 también se midió in Vitro en la linea de célula de hematoma humana que responde a hIL-6, HepG2. Las células HepG2 se transfectaron con un plásmido de reporte que contiene un' elemento de respuesta STAT3 (Transductor de Señal y Activador de Transcripción 3) enlazado a un gene de luciferasa. Las células transfectadas se tripsinizaron, se hilaron abajo y se resuspendieron en el medio a aproximadamente 2.5 x 105 células por mol y s4e colocaron en placas a 10,000 células por pozo en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. Las proteínas de anticuerpo purificadas se diluyeron en serie en medio y se añadieron a las celas en placa a concentraciones que varían de 0 a 100 nM. Subsecuentemente, el hIL-6 recombinante se añadió a los pozos a una concentración final de 50 pM. La respuesta se midió después de incubar las células durante 6 horas a 3 °C en una incubadora de CO2 al 5% humedecida. La actividad de luciferasa se midió en el sistema de ensayo de luciferasa Steady-GloMR (Promega) . Los IC50S se determinaron como se describe arribha y se reportan en la cuarta columna del Cuadro 2. Ejemplo 5. Diversidad de Epitope de Enlace Un inmunoensayo de competencia de enlace de anticuerpo se realizó usando como un control anticuerpo humanizado a IL-6R humano. Brevemente, una placa inmunosorbente de 96 pozos se revistió con 20 ng por pozo de proteina recombinante hIL-6R durante la noche a 4°C. Después de bloquear enlace no especifico con BSA, los sitios de enlace de hIL-6R en una mitad de la placa se saturaron con enlace del anticuerpo de control mediante adición de 500 ng del control por pozo, y a la otra mitad de la placa se añadió tampón de enlace solamente. Después de tres horas de enlace a temperatura ambiente, los anticuerpos purificados se clavaron a una concentración final de 50 ng/ml con y sin el anticuerpo de control previamente existente en el pozo. Después de una hora de enlace adicional, el anticuerpo libre se eliminó por lavado y el anticuerpo enlazado a placa se detectó con IgG o IgA contra ratón de cabra conjugado con HRP, el anticuerpo policlonal y la placa se revelaron usando substratos de HRP cromáticos y absorción a 450 nm se registró. Las deducciones de porcentaje del enlace de los anticuerpos anti-hIL6R mediante la presencia del anticuerpo de control se enumeran en el cuadro 3 abajo. Un experimento similar se condujo usando tecnología de resonancia de plasmón superficial (Cuadro 3) . Ambos métodos generaron resultados consistentes. Los anticuerpos VQBF11, W3D8, W6A9, W6C10-1 enlazaron epítopes traslapándose con el anticuerpo de control; mientras que los anticuerpos VQ8A9, W1G4, W6F12, W7GR, W9A6, y W6C10-3 parecieron enlazar epítopes distintos ya que el enlace de antígeno no se bloqueó por el anticuerpo de control. La competencia parcial puede resultar de impedimento estérico del primer anticuerpo enlazado, aún cuando los epítopes pueden no estar traslapando. Cuadro 3. Competencia de Enlace de Antígeno con Anticuerpo de Control Anticuerpo BIAcoreMR (% de Inmunoensayo (% de reducción reducción) VQ8A9-6 26 3 VQ8F11-21 96 79 W3D8-4 97 84 W6A9-5 96 84 W1G4-7 12 3 W6C10-1 90 80 W6F12-11 n .d. 3 W7G4-10 n.d. 26 W9A6-11 n.d. 18 W6C10-3 n.d. 1 Ejemplo 6. Propiedad de Enlace de Especie Cruzada Se probaron cuatro anticuerpos para reactividad cruzada a proteina recombinante IL-6R$ de mono usando tecnología BIAcoreMR. Brevemente, un chip biosensor en el qu3e anticuerpo policlonal Fe de anti-ratón de cabra se inmovilizó y se usó para presentar anticuerpos monoclonales anti-hIL-6R a una densidad de alrededor de 75 RU. Proteína IL-6R monomérica humana recombinante o de mono (Macaca fascicularis, dominio extracelular : SEC ID NO:251), a una escala de concentración entre 1.25 - 40 nM, se inyectó sobre la superficie de anticuerpo. El enlace del reedeptor al anticuerpo y la disociación del complejo enlazado se supervisaron en tiempo real. Tanto la constante de régimen de asociación (ka) como la constante de régimen de disociación (kd) se obtuvieron, y6 se calculó el KD (Cuadro 4) . Cuadro 4. Comparación de Afinidad de,. Enlace a IL-6R Humano y de Mono Anticuerpo Antígeno ka (M_1S_1) kd (S"1) KD (nM) Control IL6R 1.74E+05 1.67E-04 0.963 Humano ¦ IL6R de 1.44E+05 1.68E-04 1.170 Mono VQ8F11-21 IL6R 8.51E+05 4.38E-05 0.051 Humano IL6R · de 3.39E+05 4.88E-05 0.051 mono W1G4-/ IL6R 2.57E+05 6.18E-05 0.240 Humano IL6R de No se mono enlaza W6A9-5 IL6R 5.18E+05 8.41E-05 0.162 Humano IL6R de 5.00E+05 7.70E-05 0.154 mono VA8A9-6 IL6R 7.32E+05 2.76E-04 0.377 Humano IL6R de 7.31E+05 4.16E-04 0.569 mono Entre los cuatro anticuerpos probados, VQ8F11, W6A9 y VQ8A9 reaccionaron fuertemente al receptor de mono con valores KD que fueron diferentes hasta alrededor de 1.5- a alrededor de 3 veces del enlace de receptor humano, respectivamente, W1G4, que no se bloqueó por el anticuerpo de control (Cuadro 3) , no mostró enlace a receptor de mono a pesar del enlace al receptor humano con KD de 241 pM. Ejemplo 7. Efecto de Región Constante en Afinidad de Enlace La afinidad de enlace a hIL-6R monomérico de cuatro anticuerpos que tienen IgG de ratón, IgGl humano o IgG4 humano (tipo silvestre y modificado) se determinaron usando BIAcoreMR como se describe arriba, excepto que una superficie de anticuerpo policlonal Fe anti-humano de cabra se usó para capturar anticuerpos de hlgG. El hIL-6$ monomérico se inyectó a concentraciones de 12.5, 6.25, 3.12, y 1.56 nM. La capacidad de los anticuerpos para neutralizar transduccion de señal de HepG2/STATS dependiente de hIL-6 también se determinó en un ensayo de luciferasa (IC50) . IC50S para diferentes isotipos de IgG fueron similares, sugiriendo ningún efecto de isotipo sobre afinidad de anticuerpo para antigeno . Cuadro 5. Comparación de Dsotipos de IgG Anticuerpo IgG ka (M-1S~ kd (S~ KD (nM) IC50 (nM) hlgGl 6.22E+05 5.54E-05 0.073 0.150 hIgG4 7.17E+05 5.22E-06 0.073 0.228 VQ8F11-21 mIgG2a 7.66E+05 5.27E-06 0.067 0.135 modhIgG4 8.81E+05 4.705-05 0.053 0.249 VQ8A9-6 hlgGl 1.09E+06 2.60E-04 0.238 0.130 hIgG4 1.17E+06 2.35E-04 0.201 0.185 mlgl 9.95E+05 2.21E-04 0.222 0.097 W6A9-5 hlgGl 7.12E+05 8.87E-05 0.125 0.204 hIgG4 5.67E+05 7.64E-05 0.136 0.343 mIgG2a 7.72E+05 7.52E-05 0.097 0.188 VQ1G4-21 hlgGl 3.34E+05 7.92E-05 0.237 0.767 hIgG4 2.73E+05 9.18E-05 0.336 0.528 mIgG2a 3.41E+05 7.66E-05 0.225 0.578

Claims (1)

1. • REIVINDICACIONES 1. - Un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo, que enlaza específicamente receptor de interleucina-6 humano (hIL-6R) con un KD de aproximadamente 500 mP o menos, y 300 pM o menos, como se mide mediante resonancia de plasmón de su7perficie. 2. - Un anticuerpo o fragmento de enlace de ¦antígeno de conformidad con la reivindicación 1, que enlaza hIL-6R con una afinidad por lo menos 2 veces superior con relación a su enlace a IL-6R de mono. 3. - Un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1 o 2, que comprende un dominio de región 3 de determinación complementaria de cadena pesada (CDR3) y un dominio de CDR3 de cadena ligera, en donde el dominio CDR3 de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 - X13 - X14 - X15 - X16 - X17 - X18 - X19 (SEC ID NO: 247) en donde X1 = Ala, X2 = Lys, X3 = Gly, X4 = Arg, X5 = Asp, X6"= Ser o Ala, X7 = Phe, X8 = Asp; X9 = lie, X10 = Pro o ausente, X11 = Phe o ausente, X12= Val o ausente, X13 = Tyr o ausente, X14 = Tyr o ausente, X15 = Tyr o ausente, X16 = Glyo ausente, X17 = Met o ausente, X18 = Asp o ausente, X19 = Val o ausente; y el dominio de CDR3 de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 -X6 - X7 - X8 - X9 (SEC ID NO: 250) en donde X1 = Gln, X2 = Gln o Hls, X3 = Ala, X4 = Asn o Tyr, X5 = Ser, X6 = Phe, X7 = Pro, X8 = Pro, y X9 = Thr. 4.- Un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de conformidad con la reivindicación 3, que comprende además un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 -X6 - X7 - X8 (SEC ID NO: 245) en donde X1 = Gly o Arg, X2 = Phe, X3 = Thr, X4 = Phe, X5 = Asp, X6 = Asp, X7 = Tyr, y X8 = Ala; un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 -X6 - X7 - X8 (SEC ID NO: 246) en donde X1 = lie o Val, X2 = Ser, X3 = Trp, X4 - Asn, X5 = Ser, X6 = Gly, X7 = Ser, -y X8 = lie; un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 -X6 - X7 - X8 (SEC ID NO: 248) en donde X1 = Gln, X2 = Gly, X3 = lie, X4 = Ser, Xs = Ser, y X8 = Trp; y un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido de la fórmula X1 - X2 - X3 (SEC ID NO: 249), en donde X1 = Gly o Ala, X2 = Ala, y X3 = Ser. 5. - Un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de 'conformidad con la reivindicación 1 o 2, que comprende : un dominio CDR3 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 25, 153, 9, 185, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 169, 201 Y 217, Y un dominio CDR3 de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en SEC ID NO:33, 181, 17, 193, 49, 65, 81. 97, 113, 129, 145, 177, 209 y 225. 6. - Un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de conformidad con la reivindicación 5, que comprende además : un dominio CDR1 de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en SEC ID NO: 21, 149, 5, 181, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 165, 197, y 213; un dominio CDR2 de cadena pesada seleccionado del grupo que consite en SEC ID NO:23, 151, 7, 183, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 167, 199 y 215; un dominio CDR1 de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en SEC ID NO: 29, 157, 13, 189, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 173, 205 y 221; y un dominio CDR2 de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en SEC ID NO: 31, 159, 15, 191, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 175, 207 y 223. 7. - Un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de conformidad con la reivindicación 5 o 6, en donde los CDRs de cadena pesada y los CDRs de cadena ligera comprenden : SEQ ID NO:21, 23, 25 y SEC ID NO:29, 31, 33; SEC ID NO:149, 151°, 153 y SEC ID NO:157, 159, 161; SEC ID NO: 5, 7 9 y SEC ID NO: 13, 15, 17; y SEC ID NO: 181, 183, 185 y SEC ID NO: °189, 191, 193, respectivamente. 8.- Un anticuerpo o fragmento de enlacde de antigeno de conformidad con la reivindicación 1 o 2, que comprende : una región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 19, 147, 3, 179, 227, 231, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 239, 241, 1°63, 235, 195 y 211; y una región variable de cadena ligera 8LCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 27, 155, 11, 187, 229, 233, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 171, 237, 203 y 219. 9. - Un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de conformidad con la reivindicación 8, que comprende pares de HCVR/LCVR seleccionados del grupo que consiste en SEC ID NO: 19/27; 147/155; 3/11; 179/187; 227/229; 2317233, 35/43, 51/59; 67/75; 83/91; 99/107, 115/123; 131/139; 239/155; 241/155; 163/171; 235/237; 195/203 y 211/219. 10. - Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores . 11. - Un vector que comprende la secuencia de nucleótido de conformidad con la reivindicación 10. 12. - Un sistema de huésped-vector para la producción de un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de un anticuerpo que enlaza específicamente receptor IL-6 humano, que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 11, en una célula huésped apropiada. 13. - Un sistema de huésped-vector de conformidad con la reivindicación 12, en donde la célula huésped es una célula procariótica o eucariótica seleccionada de uno de una célula de E. coli o una CHO. 14. - Un método para producir un anticuerpo anti-IL-6R o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que comprende desarrollar células de un sistema de huésped-vector de conformidad con la reivindicación 12 o 13 bajo condiciones que permiten la producción del anticuerpo o fragmento del mismo y recuperar el anticuerpo o fragmento asi producido. 15- El uso de un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la' fabricación de un medicamento para uso atenuar o inhibir una enfermedad o desorden mediado por IL-6 en un humano. 16.- Un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para uso en la atenuación o inhibición de una enfermedad o desorden mediado por IL-6 en un humano. 17.- Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. 18.- Un método para atenuar o inhibir una enfermedad o desorden mediado por 11-6 en un paciente humano, el método comprendiendo administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 a un paciente humano. 19.- Un método de conformidad con la reivindicación 18, en donde la enfermedad o desorden mediado por IL-6 es artritis, tal como artritis reumatoide crónica; una enfermedad de intestino inflamatorio, tal como enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa; o eritematosis sistémica.