DE69427513T2

DE69427513T2 - Verfahren zur Rückgewinnung von natürlich auftretenden Makroliden, insbesondereei Verfahren zum Abtrennen eines neutralen Makrolids

Info

Publication number: DE69427513T2
Application number: DE69427513T
Authority: DE
Inventors: Constantine Gletsos
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2001-11-22
Anticipated expiration: 2014-11-04
Also published as: KR950014311A; PT652219E; FI945186L; IL111424A0; BR9404265A; CA2134844A1; CN1109058A; EP0652219B1; HU9403164D0; SG48919A1; UA41884C2; RU94039281A; US5508398A; GR3036207T3; DK0652219T3; DE69427513D1; KR100393952B1; ATE202356T1; SK130494A3; JPH07184674A

Description

Die Erfindung betrifft ein extraktives Verfahren zur Rückgewinnung von natürlich auftretenden Makroliden, insbesondere ein Verfahren zum Abtrennen eines neutralen Makrolids, welches Rapamycin oder ein natürlich vorkommendes Homolog oder Analog davon ist, wie 32-Desmethylrapamycin und 15-Deoxorapamycin, aus anderen natürlich vorkommenden Bestandteilen, die durch Fermentationsverfahren erhalten werden. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Rückgewinnung des tricyclischen Makrolids Rapamycin aus Fermentationsbrüheextraktkonzentrat und aus Stammlösungskonzentrat.
Die durch Rapamycin beispielhaft illustrierten tricyclischen Makrolide haben ebenso immunsuppressive Wirksamkeit wie antibiotische und weitere pharmakologische Wirksamkeiten und sind brauchbar bei der Behandlung von Graft- und Transplantatabstoßungen, Entzündungserkrankungen und Autoimmunerkrankungen wie Lupus, Rheumatoidarthritis, Diabetes Mellitus und Multiple Sklerose.
Die tricyclischen Makrolide Rapamycin, 32-Desmethylrapamycin und 15-Deoxorapamycin werden durch Fermentation verschiedener Stränge von Streptomyces unter den passenden Bedingungen hergestellt und sind neutral, da keine basische Amino-Gruppe, phenolische oder Carbonsäuregruppen vorhanden sind. Rapamycin wird durch Kultivieren von S. hygroscopicus NRRL 5491 in einem wässerigen Medium hergestellt. Myzel, welche das tricyclische Makrolid enthalten, werden aus dem Wachstumsmedium rückgewonnen und mit einem organischen Lösungsmittel wie Methanol extrahiert, um ein Gemisch zu erhalten, welches das gewünschte tricyclische Makrolid, verwandte Verbindungen, saure Verbindungen wie Fettsäuren, basische Verbindungen wie Alkaloide und Peptide und neutrale lipophile Verbindungen wie Fette umfasst. Typischerweise wird das Fermentationsbrüheextrakt konzentriert, um Transport und/oder Lagerung zu erleichtern, bis das Makrolid isoliert werden kann. Isolierung und Reinigung der tricyclischen Makrolide aus dem Fermentationsbrüheextrakt ist, vor dieser Erfindung, ein arbeitsaufwendiges, teures Verfahren gewesen, welches verschiedene chemische und chromatographische Techniken einbezog, um gereinigte Substanz zu erhalten. [US-5091389; US-3993749; WO- 93/11130; Sehgal, J. of Antibiotics, 28. (10) 727 (1975)]. Das Fermentationsbrüheextraktkonzentrat für Rapamycin enthält nur 5 bis 15% Rapamycin und bis zu etwa 50% saure Bestandteile beispielsweise, und Rapamycin muss aus den anderen Bestanteilen abgetrennt werden. Typischerweise beziehen Verfahren zur Rückgewinnung der tricyclischen Makrolide aus Fermentationsbrüheextrakten Adsorption auf und Desorption aus Aktivkohle, selektive Löslichkeitsverfahren und eines oder mehrere zeitaufwendige und teure chromatographische Verfahren unter Verwendung von Säulenchromatographie und/oder Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie ein. Bis jetzt sind saure oder basische Bedingungen vermieden worden, da tricyclische Makrolide wie Rapamycin als instabil unter sauren oder basischen Bedingungen angesehen werden. Rapamycin in mit Wasser mischbarer Lösung, also in Methanol oder Tetrahydrofuran, unterzieht sich Zersetzung durch anorganische Basen wie wässerigem Natriumhydroxid, organischen Basen wie 4-Dimethylaminpyridin (DMAP) oder 1, 8-Diazobicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) oder wässerigen Mineralsäuren wie Salzsäure und. Lewissäuren wie Zinkchlorid [Steffan et ah, Tetrahedron Letters, 34 (23), 3699-3702 (1993), D. Yohanes und 5. J. Danishefsky, Tetrahedron Letters, 33. (49), 7469-7472 (1992); Luengo et al., Tetrahedron Letters 34 (6), 991-994 (1993) und D. Yohannes et al., Tetrahedron Letters 34. (13), 2075-2078 (1993)].
Diese Erfindung sieht ein relativ schnelles und effizientes Verfahren zur Rückgewinnung von Rapamycin oder einem natürlich vorkommenden Homolog oder Analog davon aus Fermentationsbrüheextraktkonzentraten und Stammlösungen oder Konzentraten davon vor, welche aus Umkristallisationslösungsmitteln, Verreibungen und Produktwäschen erhalten werden, und vermeidet die zeitaufwendigen und teuren chromatographischen Abtrennungen, welche in US- 5091389; US-3993749; WO-93/11130; und Sehgal, J. of Antibiotics 28 (10) 727 (1975) beispielhaft illustriert werden.
Entsprechend sieht diese Erfindung ein Verfahren zum Abtrennen eines neutralen Makrolids, welches Rapamycin oder ein natürlich vorkommendes Homolog oder Analog davon ist, aus sauren, basischen und unpolaren neutralen Verunreinigungen, welche in einem Konzentrat aus Fermentationsbrüheextrakten oder Stammlösung vorhanden sind, welches besagtes neutrales Makrolid enthält, welches in beliebiger Reihenfolge Extraktionsschritt (a) und gegebenenfalls einen oder beide der Schritte (b) und (c) wie folgt umfasst:
(a) eine Lösung des besagten Konzentrats in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wird bei einer Temperatur von etwa -5ºC bis etwa 45ºC mit wässeriger Base extrahiert, um im wesentlichen alle sauren Verunreinigungen zu entfernen;
(b) eine Lösung des besagten Konzentrats in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wird bei einer Temperatur von etwa -5ºC bis etwa 45ºC mit wässeriger Säure extrahiert, um im wesentlich alle basischen Verunreinigungen zu entfernen;
(c) eine Lösung des besagten Konzentrats wird einem oder mehren des Folgenden unterworfen, um unpolare neutrale Verunreinigungen zu entfernen:
(i) Extraktion mit einem nicht aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, in welchem das Makrolid nichtlöslich ist,
(ii) Behandlung mit einer ausreichenden Menge eines mischbaren Makrolid-Nicht-Lösungsmittels, um das Makrolid zu veranlassen, in dem sich ergebenen Lösungsmittelgemisch unlöslich zu werden, und sich somit von der Lösung abzutrennen, wodurch das Makrolid aus dem Lösungsmittel abgetrennt werden kann;
(iii) Verreiben mit einem Makrolid kristallisierenden Lösungsmittel.
In einem Aspekt umfasst das Verfahren Abtrennen der sauren und gegebenenfalls basischen Bestandteile aus den neutralen Bestandteilen durch Lösen des Makrolid enthaltenden Konzentrats in einem geeigneten, mit Wasser nicht löslichen Lösungsmittel, und Extrahieren der sauren und gegebenenfalls basischen Bestandteile in wässeriger Base und, falls gewünscht, Säure, und Einsetzen selektiver Löslichkeits- oder Extraktionstechniken, um das Makrolid aus den in dem Konzentrat vorhandenen unpolaren neutralen Substanzen abzutrennen. Während das hierin beschriebene Verfahren besonders für Konzentrate aus Fermentationsbrüheextrakten oder Stammlösungen geeignet ist, kann die ganze Extraktlösung oder Stammlösungen in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, dass das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, welches für die Fermentationsbrüheextraktion oder Umkristallisation, Verreibung oder Waschungen verwendet wird, dem Verfahren zugänglich und das Volumen des Lösungsmittels nicht hinderlich ist. Das Lösungsmittelvolumen kann durch partielle Konzentration reduziert werden. Jede der Lösungen, auf welche das Verfahren dieser Erfindung angewendet werden kann, kann als eine Makrolid enthaltende Lösung oder Konzentrat bezeichnet werden.
Das durch besagtes Verfahren erhaltene Produkt kann durch den Fachleuten bekannte Standardverfahren zu akzeptabler Reinheit gereinigt werden.
Wie hierin verwendet ist ein unpolares Lösungsmittel ein nicht aromatisches Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, wie Cyclohexan, Cyclohexen, Hexan, Heptan und Pentan. Lösungsmittel, welche mit dem nicht aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel nicht mischbar sind, schließen ein aber sind nicht beschränkt auf Acetonitril und Dimethylformamid. Der Begriff Extraktion betrifft ein Verfahren des gründlichen Mischens einer Lösung mit einer anderen nicht mischbaren Lösung, was es den nicht mischbaren Lösungen erlaubt, sich voneinander zu trennen und eine Schicht oder Phase von der anderen physikalisch zu entfernen, und falls gewünscht wiederholt. Der Begriff Wäsche, wenn er sich auf eine Lösung bezieht, betrifft ein Extraktionsverfahren, und wenn er sich auf einen Feststoff bezieht bedeutet er, den Feststoff mit einem Lösungsmittel zu spülen, in welchem der Feststoff im wesentlichen unlöslich ist. Der Begriff Stammlösung betrifft organische Lösungmittellösungen, welche aus Kristallisationsfiltraten, Waschungen und Rückextraktionen von wässerigen Extrakten und Waschungen und Verreibungen von gesammelten Feststoffen erhalten werden. Ein Makrolid-Lösungsmittel ist ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, welches das Makrolid und begleitende Verunreinigungen, wie die sauren oder basischen Bestandteile, lösen wird. Ein Makrolid-Nicht-Lösungsmittel ist ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, in welchem das Makrolid im wesentlichen unlöslich ist, aber eines, in welchem neutrale Bestandteile wie Fette löslich sind. Ein Makrolid-Kristallisationslösungsmittel ist ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, aus welchem das Makrolid aus einem amorphen Zustand nach Verreibung umkristallisiert oder kristallisiert werden kann. Wo das Verfahren die Konzentration einer Lösung erfordert, wird es bevorzugt, dass das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch eine ausreichende Flüchtigkeit haben, um unter Nicht-Zerfallsbedingungen von Temperatur und Druck abzudestillieren.
Diese Erfindung sieht ebenfalls einen optionellen Schritt vor, wobei die unpolaren neutralen Bestandteile des Makrolid enthaltenden Fermentationsbrüheextraktkonzentrats oder Stammlösungskonzentrats durch Extraktion einer Lösung aus besagtem Konzentrat in einem ersten Lösungsmittel (z. B. Acetonitril, DMF) mit einem zweiten nicht aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, welches mit dem ersten Lösungsmittel nicht mischbar ist, und in welchem das Makrolid unlöslich ist (z. B. Cyclohexan, Cyclohexen, Hexan, Heptan oder Pentan) entfernt werden.
Ebenfalls vorgesehen wird ein optioneller Schritt, wobei die mit Wasser nicht mischbare Lösung, welche das Makrolid nach Extraktion von sauren und gegebenenfalls basischen Bestandteilen enthält, entweder:
(i) mit einer ausreichenden Menge eines mischbaren Makrolid- Nicht-Lösungsmittels behandelt wird, um das Makrolid zu veranlassen, in dem sich ergebenen Lösungsmittelgemisch unlöslich zu werden, und sich somit von der Lösung abzutrennen, wodurch das Makrolid aus dem Lösungsmittelgemisch abgetrennt werden kann, oder
(ii) konzentriert, und der Rückstand durch Vermischung mit einem Kristallisationslösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch kristallisiert wird.
Die mit Wasser nicht mischbare Lösung, welche das Makrolid nach Extraktion von sauren und, falls gewünscht, basischen Bestandteilen enthält, kann auch konzentriert, und der Rückstand in einem ersten Lösungsmittel gelöst werden, und mit einem zweiten nicht aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel extrahiert werden, welcher mit dem ersten Lösungsmittel nicht mischbar ist, und in welchem das Makrolid unlöslich ist, um die neutralen unpolaren Verunreinigungen zu entfernen.
Ein bevorzugtes Verfahren dieser Erfindung wird in dem Schema 1 unten skizziert: Schema 1.
Gemäß dem Verfahren wird das Makrolid enthaltende Konzentrat, entweder aus Fermentationsbrüheextraktkonzentrat oder Konzentraten aus Umkristallisations- und/oder Wäschelösungsmitteln, in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch gelöst, ausgewählt nach Fähigkeit, das Konzentrat zu lösen und Einfachheit der Entfernbarkeit, einschließend, aber nicht begrenzt auf Dichlormethan, t-Butylmethylether, Ethylacetat, Toluol, 1-Butanol, ein Ethylacetat/Toluolgemisch, ein Heptan/Ethylacetatgemisch oder ein Hexan/Methylenchloridgemisch. Wässerige Lösungen aus Base, einschließend Natriumhydroxid, Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat, Ammoniumhydroxid, vorzugsweise Natriumhydroxid, in Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 5 N, vorzugsweise von etwa 0,1 bis 1,0 N, bevorzugterweise 0,1 bis 0,5 N, sind zum Extrahieren der sauren Bestandteile brauchbar. Organische Basen wie Triethylamin sind beim Entfernen der sauren Bestandteile nicht so wirksam wie die stärkeren wässerigen anorganischen Basen. Wässerige Lösungen aus Mineralsäuren, einschließend Salzsäure, Monokaliumphosphat, Mononatriumsulfat, vorzugsweise Salzsäure, in Konzentrationen von 0,1 bis 5 N, sind zum Extrahieren der basischen Bestandteile brauchbar. Organische Säuren wie Trifluoressigsäure sind beim Entfernen der basischen Bestandteile nicht so wirksam wie die Mineralsäuren. Extraktionen von sauren und, falls gewünscht, basischen Bestandteilen aus der Lösung, welche das Makrolid enthält, werden bequem zwischen -5ºC und 45ºC, vorzugsweise -5ºC und 30ºC, bevorzugterweise im Bereich von -5 bis 10ºC ausgeführt. Um möglichen Zerfall des Makrolids durch die Säure oder Base zu vermeiden, sollte das Extraktionsverfahren ohne Verzögerung vollendet werden. Je nach Mengen an vorhandenen basischen Bestandteilen kann die Extraktion von Basen nicht notwendig sein, und Extraktion der sauren Bestandteile allein kann beim Entfernen von genügend Verunreinigung aus der Makrolid enthaltenden Lösung ausreichend sein, um Isolierung des tricyclischen Makrolids zu erlauben.
Es ist vorteilhaft, die sauren (oder falls gewünscht basischen) Bestandteile aus der Lösung von Makrolid enthaltendem Konzentrat in einem zeitsparenden Extraktionsschritt zu entfernen. Die benötigte Menge an wässeriger Base (oder Säure), so dass überschüssige Base (oder Säure) in dem Extraktionsverfahren verfügbar ist, kann durch Extrahieren einer Teilmenge, welche aus der Lösung des Makrolid enthaltenden Konzentrats entnommen wurde, mit wässeriger Base (oder Säure) und Bestimmen des benötigten Volumens an wässeriger Base (oder Säure), um ein Extrakt der Teilmenge mit einem solchen pH zu ergeben) dass ein stöchiometrischer Überschuss an Base (oder Säure) erhältlich ist, bestimmt werden. Der Überschuss an Säure oder Base wird durch Verwenden eines pH-Messgeräts oder anderen Mitteln zum Bestimmen von pH bestimmt. Das benötigte Volumen an wässeriger Base (oder Säure), um die Lösung zu extrahieren, aus welcher die Teilmenge entnommen wurde, ist dann proportional zum Verhältnis der Volumina an zu extrahierender, neutrales Makrolid enthaltender Lösung und der daraus entnommenen Teilmenge. So kann Extraktion von sauren (oder basischen) Bestandteilen eher in einem Arbeitsgang durchgeführt werden, statt durch Ausführen multipler Extraktionen mit weniger als ausreichenden Mengen an wässeriger Base (oder Säure). Offensichtlich werden, wo sowohl die sauren, als auch die basischen Bestandteile aus der Lösung des Makrolid enthaltenden Konzentrats entfernt werden müssen, separate Extraktionen mit wässeriger Base und wässeriger Säure ausgeführt werden müssen. Mit Lösungen aus Rapamycin enthaltendem Konzentrat zum Beispiel, ist eine Extraktion mit wässeriger Natriumhydroxidlösung, ausreichend, um einen pH von 12 zu haben, ausreichend, um im Wesentlichen alle sauren Bestandteile zu entfernen. Das unter Verwendung des obigen Verfahrens aus Lösung gewonnene Makrolid kann durch den Fachleuten bekannte, herkömmliche Reinigungstechniken zu dem gewünschten Reinigungsgrad gereinigt werden. Die Filtrate und Wäschen können erneut bearbeitet werden, um, falls gewünscht, zusätzliches Makrolid zu gewinnen.
Nach Durchführen der Extraktionsverfahren, um die sauren, und falls gewünscht, basischen Bestandteile aus der mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittellösung, welche das Makrolid enthält, zu entfernen, kann das Makrolid durch eines der folgenden Verfahren aus den unpolaren neutralen Bestandteilen abgetrennt werden:
(1) Ein Makrolid-Nicht-Lösungsmittel (oder Lösungsmittelgemisch), welches mit besagter Makrolid enthaltender, mit Wasser nicht mischbarer Lösungsmittellösung mischbar ist, aus welcher die sauren, und falls gewünscht, basischen Bestandteile extrahiert wurden, wird zu der Makrolid enthaltenden Lösung in ausreichender Menge zugegeben, um die Makrolid- und eventuell Makrolid verwandten Produkte in der sich ergebenden Lösung unlöslich zu machen und eine separate Phase zu bilden; entweder ein Öl oder einen Feststoff, welche dann durch den Fachleuten bekannte, gewöhnliche Abtrennungstechniken abgetrennt werden kann.
(2) Die mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittellösung, welche das neutrale Makrolid enthält, aus welchem die sauren und/oder polaren Bestandteile extrahiert wurden, wird konzentriert, und das rückständige Material, welches das Makrolid enthält, wird in einem Makrolid lösenden Lösungsmittel, wie Acetonitril oder Dimethylformamid gelöst und mit einem nicht aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel wie Cyclohexan, Hexan, Heptan oder Cyclohexen extrahiert. Die Makrolid lösende Lösungsmittelschicht wird abgetrennt und konzentriert. Der das Makrolid enthaltende Rückstand wird dann mit einem kristallisierenden Lösungsmittel verrieben, um das Makrolid zu erhalten, falls besagtes Makrolid ein Feststoff ist, oder durch den Fachleuten bekannte Techniken, wie Chromatographie gereinigt, falls das Makrolid ein Öl ist. Alternativ kann das Makrolid lösende Lösungsmittel nach Extraktion mit dem nicht aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel mit einem mischbaren, nicht Makrolid lösenden Lösungsmittel wie in Verfahren (1) oben behandelt werden.
(3) Die Makrolid enthaltende, mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittellösung, aus welcher die sauren, und falls gewünscht, basischen Bestandteile extrahiert wurden, wird konzentriert und das rückständige Material wird mit Makrolid kristallisierendem Lösungsmittel, wie Diethylether, Diisopropylether oder t-Butylmethylether verrieben.
Alternativ kann das Makrolid enthaltende Konzentrat zuerst gemäß den Methoden (1) bis (3) oben extrahiert werden, um unpolare Bestandteile zu entfernen, und dann der Rückstand, welcher das im einem mit Wassern nicht lösbaren Lösungsmittel gelöste Makrolid enthält, falls er sich nicht bereits in solch einem Lösungsmittel befindet, und mit wässeriger Base oder Base und Säure in beliebiger Reihenfolge extrahiert werden, um die sauren oder sauren und basischen Bestandteile zu entfernen.
Das obige Verfahren erlangt seinen Vorteil durch den unerwarteten Befund, dass Makrolide, wie das tricyclische Makrolid Rapamycin, sich nicht zersetzen, wenn sie wässerigen Säure- oder Base-Extraktionsverfahren unter passenden Temperaturbedingungen aus mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittellösungen von Makrolid enthaltenden Konzentraten unterworfen werden. Es wurde vorher geglaubt, dass Zerfall auftreten würde, basierend auf dem beobachteten Zerfall von Rapamycin, welcher sich aus einer Säure- oder Base-Aussetzung in Lösung ergibt.
Dieses Extraktionsverfahren verkürzt beträchtlich die Zeit, welche nötig ist, um Makrolide aus besagten Konzentraten zurückzugewinnen, und vermeidet zeitaufwendige und teure chromatographische Verfahren.
Das tricyclische Makrolid Rapamycin ist ein kristalliner Feststoff, welcher in Methanol, Aceton, Dimethylformamid löslich, in Diethylether leicht löslich und in Hexan oder Petroleumether spärlich löslich und in Wasser unlöslich ist. Rapamycin hat die unten gezeigte Struktur. Das Atom numerierende System ist jenes, welches durch Chemical Abstracts verwendet wird.
Die Strukturen von 32-Desmethylrapamycin und 15-Deoxorapamycin können leicht aus der obigen Struktur von Rapamycin erkannt werden.
Die folgenden Beispiele sind lediglich veranschaulichend für das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Isolieren von Rapamycin aus Fermentationsbrühe und Stammflüssigkeitskonzentraten und dürfen nicht als den Umfang dieser Erfindung in irgend einer Weise eingrenzend ausgelegt werden. In den folgenden Beispielen wurde die Identität des isolierten Produkts durch Vergleich von physikalischen, spektralen und chromatographischen Eigenschaften mit jenen von authentischem Rapamycin als Rapamycin bestätigt. Die Reinheit des Produkts (nicht umkristallisiert) wurde durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographieanalysebestimmt.

Beispiel 1

Eine Lösung aus konzentriertem Fermentationsbrüheextrakt (157,0 g, 10,4% Rapamycingehalt), aufgenommen in Methylenchlorid (600 ml) wurde mit drei 150 ml Portionen von 0,5 N NaOH-Lösung bei 0-5ºC gewaschen, mit Wasser gewaschen, bis die Wäsche neutral war und dann mit Kochsalzlösung gewaschen. Die Methylenchloridlösung wurde konzentriert und der Rückstand (70,5 g) mit Diethylether (140 ml) verrieben. Der kristalline Feststoff wurde gesammelt, mit Diethylether gewaschen und getrocknet, um Rapamycin (6,3 g, 91,7% Reinheit, 35,4% Ausbeute) zu erhalten. Konzentration des Diethyletherfiltrats ergab 63,5 g Öl mit einem 13,1% Rapamycingehalt.

Beispiel 2

Eine Lösung aus konzentriertem Fermentationsbrüheextrakt (206,0 g, 11,8% Rapamycingehalt), wurde in t-Butylmethylether (800 ml) aufgenommen und mit drei 400 ml Portionen von 0,5 N NaOH-Lösung bei 0-5ºC gewaschen und dann mit Wasser gewaschen, bis die Wäsche neutral war. Die t-Butylmethyletherlösung wurde konzentriert und der Rückstand (75,0 g) mit Diethylether (150 ml) verrieben. Der kristalline Feststoff wurde gesammelt, mit Diethylether gewaschen und getrocknet, um Rapamycin (11,4 g, 92,2% Reinheit, 43,3% Ausbeute) zu erhalten. Konzentration des Diethyletherfiltrats ergab 58,7 g Öl mit einem 11,3% Rapamycingehalt.

Beispiel 3

Eine Lösung aus konzentriertem Fermentationsbrüheextrakt (10,58 g, 10,4% Rapamycingehalt), aufgenommen in Acetonitril (23 ml) wurde mit zwei 23 ml Portionen Cyclohexan gewaschen und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst und aufeinanderfolgend mit drei 23 ml Portionen von 0,5 N NaOH-Lösung bei 0-5ºC, zwei 23 ml Portionen von 0,5 N HCl bei 0-5ºC und dann mit Wasser gewaschen, bis die Wäsche neutral war. Die Dichlormethanlösung wurde konzentriert und der Rückstand (4,07 g) mit Diethylether verrieben. Der kristalline Feststoff wurde gesammelt, mit Diethylether gewaschen und getrocknet, um Rapamycin zu ergeben (0,64 g, 8915% Reinheit, 58,2% Ausbeute). Die Diethyletherfiltrate wurden konzentriert, um 3,36 g eines Öls mit einem 9,8% Rapamycingehalt zu ergeben.

Beispiel 4

Eine Lösung aus konzentriertem Fermentationsbrüheextrakt (100,0 g, 11,8% Rapamycingehalt), aufgenommen in Ethylacetat (400 ml) wurde mit einer 200 ml Portion und zwei 100 ml Portionen von 0,5 N NaOH-Lösung bei 0-5ºC gewaschen und dann mit zwei 200 ml Portionen von 0,5 N Salzsäurelösung bei 0-5ºC und zum Schluss mit Wasser gewaschen, bis die Wäsche neutral war. Die wässerigen Waschungen wurden mit Ethylacetat (100 ml) rückextrahiert und die Ethylacetatlösungen vereinigt. Die Ethylacetatlösung wurde konzentriert und der Rückstand (43,2 g) mit Diisopropylether (45 ml) verrieben. Der kristalline Feststoff wurde gesammelt, mit Diisopropylether gewaschen und getrocknet, um 9,5 g Rapamycin (85,3% Reinheit, 68,7% Ausbeute) zu ergeben. Die Diisopropyletherfiltrate wurden konzentriert, um ein Öl (31,6 g) mit einem 6, 6% Rapamycingehalt zu ergeben.

Beispiel 5

Eine Lösung aus konzentriertem Fermentationsbrüheextrakt (25,2 g, 10,4% Rapamycingehalt), aufgenommen in einem Gemisch aus Toluol (120 ml) und Ethylacetat (25 ml) wurde aufeinanderfolgend mit drei 50 ml Portionen von 0,5 N NaOH-Lösung bei 0- 5ºC, zweimal mit zwei 50 ml Portionen von 0,5 N Salzsäure bei 0- 5ºC und dann mit Wasser gewaschen, bis die Wäsche neutral war. Die Toluol/Ethylacetatlösung (128 ml) wurde zur weiteren Behandlung durch die folgenden Verfahren in zwei gleiche Portionen aufgeteilt:
Verfahren A. Die Toluol/Ethylacetatlösung (64 ml) wurde konzentriert und der Rückstand (5,7 g) mit Diethylether (11 ml) verrieben. Der kristalline Feststoff wurde gesammelt, mit zusätzlichem Diethylether gewaschen und getrocknet, um 0,84 g Rapamycin (92,7% Reinheit, 64,1% Ausbeute) zu ergeben. Konzentration der Diethyletherfiltrate ergab 4,3 g eines Öls mit. einem 6,8% Rapamycingehalt.
Verfahren B. Die Toluol/Ethylacetatlösung (64 ml) wurde konzentriert und der Rückstand (9,0 g) wurde in Acetonitril (50 ml) gelöst. Die Acetonitrillösung wurde mit zwei 25 ml Portionen Cyclohexan gewaschen. Die Acetonitrillösung wurde dann konzentriert und der Rückstand (4,3 g) mit Diethylether (11 ml) verrieben. Der kristalline Feststoff wurde gesammelt, mit Diethylether gewaschen und getrocknet, um 0,81 g Rapamycin (94,6% Reinheit, 61,8% Ausbeute) zu ergeben. Konzentrationen der Diethyletherfiltrate ergaben 3,0 g eines Öls mit einem 5,9% Rapamycingehalt.

Beispiel 6

Stammlösungskonzentrat (996,0 g, 21,6% Rapamycingehalt) wurde mit t-Butylmethylether (4000 ml) verrieben. Der kristalline Feststoff wurde gesammelt, mit t-Butylmethylether (500 ml) gewaschen und getrocknet, um 36,2 g Rapamycin (95,1% Reinheit, 13,8% Ausbeute) zu ergeben. Die Filtrate wurden mit einer 2000 ml Portion und zwei 1000 ml Portionen von 0,5 N Natriumhydroxidlösung bei 0-5ºC gewaschen. Die vereinigten Baseextrakte wurden einmal mit t-Butylmethylether (500 ml) gewaschen. Das t-Butylmethyletherfiltrat und Extrakt wurden vereinigt und mit Wassergewaschen, bis die Wäsche neutral war. Die Wasserextrakte wurden vereinigt und mit t-Butylmethylether (500 ml) extrahiert. Die t- Butylmethyletherlösungen wurden vereinigt, konzentriert und der Rückstand (377,1 g) mit Diisopropylether (350 ml) verrieben. Die kristallinen Feststoffe wurden gesammelt, mit Diisopropylether gewaschen und getrocknet, um 126,7 g Rapamycin (82,4% Reinheit, 58,9% Ausbeute) zu ergeben. Somit betrug die Gesamtrückgewinnung von Rapamycin aus dem Stammflüssigkeitskonzentrat 162,9 g (72,7%). Konzentration des Diisopropyletherfiltrats ergab 157,9 g Öl mit einem 20,9% Rapamycingehalt.

Beispiel 7

Eine Lösung aus Stammlösungskonzentrat (562,1 g, 21,6% Rapamycingehalt), aufgenommen in Dichlormethan (2000 ml) wurde mit drei 500 ml Portionen von 0,5 N Natriumhydroxidlösung bei 0-5ºC gewaschen und die vereinigten wässerigen basischen Extrakte wurden mit einer 200 ml Portion Dichlormethan extrahiert. Die organischen Lösungen wurden vereinigt und mit zwei 500 ml Portionen von 0,5 N Salzsäurelösung bei 0-5ºC gewaschen. Die vereinigten wässerigen sauren Extrakte wurden mit einer 200 ml Portion Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser neutral war. Die organische Lösung wurde konzentriert und der Rückstand (255,0 g) wurde mit Diisopropylether (250 ml) verrieben. Die kristallinen Feststoffe wurden gesammelt, mit Diisopropylether gewaschen und getrocknet, um 108,6 g Rapamycin (86,6% Reinheit, 77,4% Rückgewinnung) zu ergeben. Konzentration des Diisopropyletherfiltrats ergab 100,2 g Öl mit einem 23,1% Rapamycingehalt.

Beispiel 8

Wässeriges 0,5 N Natriumhydroxid (400 ml) bei 0-5ºC wurde zu einer starkgerührten, gekühlten (0-5ºC) Lösung aus konzentriertem Fermentationsbrüheextrakt (198,5 g, 8,3% Rapamycingehalt), aufgenommen in 800 ml t-Butylmethylether in solch einer Geschwindigkeit zugegeben, dass die Temperatur bei 0-5ºC gehalten werden konnte. Nach starkem Rühren für 5 Minuten wurde die untere wässerige basische Schicht entfernt und bei 0-5ºC gelagert. Die organische Schicht wurde mit zwei 200 ml Portionen von 0,5 N Natriumhydroxidlösung bei 0-5ºC reextrahiert. Die wässerigen basischen Extrakte wurden vereinigt und mit t-Butylmethylether (200 ml) reextrahiert Die t-Butylmethyletherlösungen wurden vereinigt und mit Wasser gewaschen, bis die Wäsche neutral war (pH = 7). Dia wässerigen Wäschen wurden vereinigt und mit t- Butylmethylether (100 ml) extrahiert. Die t-Butylmethyletherlösungen wurden vereinigt, mit gesättigter, wässeriger Natriumchloridlösung gewaschen und unter Vakuum bei 40ºC konzentriert. Der Rückstand wurde mit Diisopropylether (85 ml) bei 20-25ºC für ein Minimum von einer Stunde verreiben und das Gemisch auf 0-5ºC über Nacht gekühlt. Der kristalline Feststoff wurde unter Verwendung eines gesinterten Glas-Buchner-Trichters gesammelt und mit einem 4 : 1 Gemisch aus Diisopropylether - t-Butylmethylether bei 20-25ºC gewaschen (5 · 20 ml oder bis das Filtrat farblos war). Der kristalline Feststoff wird auf ein konstantes Gewicht getrocknet, um 12,0 g Rapamycin (91,2% Reinheit, 66,4% Rückgewinnung) zu ergeben. Konzentration der t-Butylmethyletherfiltrate und Waschungen ergab 63,9 g eines Gummis mit einem 3,63% Rapamycingehalt.

Beispiel 9

Stammlösungskonzentrat (200 g, 25% Rapamycingehalt) wurde unter Rühren mit t-Butylmethylether (800 ml) bei Raumtemperatur gelöst. Die gerührte Lösung wurde auf 0-5ºC gekühlt und ohne Verzögerung mit 270 ml von 0,65 N Natriumhydroxidlösung, vorgekühlt auf 0-5ºC extrahiert, während die Temperatur des Gemisches bei 0-5ºC gehalten wurde. (Die notwendige Menge an wässerigem Natriumhydroxid, um einen End-pH von 12 in dem Extrakt zu ergeben, wurde an einer Teilmenge der konzentrierten Stammlösung bestimmt).
Die wässerige Baseschicht wurde bei 0-5ºC gelagert, während die organische Schicht mit 5% Natriumchloridlösung unter Beibehalten des Gemisches bei 0-5ºC gewaschen wurde. Das wässerige basische Extrakt wurde mit t-Butylmethylether (100 ml) rück-extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt und mit drei 200 ml Portionen von 5% Natriumchloridlösung gewaschen (pH der letzten Waschlösung betrug 7,4). Die organischen Lösungen wurden unter reduziertem Druck (60-130 mm Hg) bei einer Temperatur von 25-40ºC konzentriert. Cyclohexen (80 ml) wurde langsam über 30 Minuten zu dem Rückstand unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben und gerührt, bis Kristallisation vollständig war (3 Stunden). Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine weitere Stunde gerührt und das Gemisch auf 0-5ºC gekühlt und über Nacht gerührt. Der von weiß abweichende kristalline Feststoff wurde dann an einem Glas-Buchner-Trichter mit Fritte gesammelt. Der Feststoff wurde fünf Mal mit 40 ml Portionen eines 2 : 3 Gemisches von t-Butylmethylether und Cyclohexen gewaschen. Der Feststoff wurde auf ein konstantes Gewicht in einem Vakuumofen bei 35-40ºC getrocknet, um 22,7 g Rapamycin (90,6% rein, 41,4% Rückgewinnung) zu erhalten. Konzentrationen der Filtrate und Waschungen (t-Butylmethylether und Cyclohexen) ergaben 60,1 g eines Öls mit einem 37,5% Rapamycingehalt.

Claims

1. Verfahren zum Abtrennen eines neutralen Makrolids, welches Rapamycin oder ein natürlich vorkommendes Homolog oder Analog davon ist, aus sauren, basischen und nicht polaren neutralen Verunreinigungen, welche in einem Konzentrat aus Fermentationsbrüheextrakten oder Stammlösung vorhanden sind, welches besagtes neutrales Makrolid enthält, welches in beliebiger Reihenfolge Extraktionsschritt (a) und gegebenenfalls einen oder beide der Schritte (b) und (c) wie folgt umfasst:

(a) eine Lösung des besagten Konzentrats in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wird bei einer Temperatur von etwa -5ºC bis etwa 45ºC mit wässeriger Base extrahiert, um im Wesentlichen alle sauren Verunreinigungen zu entfernen;

(b) eine Lösung des besagten Konzentrats in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel wird bei einer Temperatur von etwa -5ºC bis etwa 45ºC mit wässeriger Säure extrahiert, um im Wesentlichen alle basischen Verunreinigungen zu entfernen;

(c) eine Lösung des besagten Konzentrats wird einem oder mehreren des Folgenden unterworfen, um unpolare neutrale Verunreinigungen zu entfernen:

(i) Extraktion mit einem nicht aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, in welchem das Makrolid nicht löslich ist,

(ii) Behandlung mit einer ausreichenden Menge eines mischbaren Makrolid-Nicht-Lösungsmittels, um das Makrolid zu veranlassen, in dem sich ergebenen Lösungsmittelgemisch unlöslich zu werden, und sich somit von der Lösung abzutrennen, wodurch das Makrolid aus dem Lösungsmittel abgetrennt werden kann;

(iii) Verreiben mit einem Makrolid kristallisierenden Lösungsmittel.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in Schritt (c) die Lösung des besagten Makrolids eine Lösung in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Extraktion von sauren und/oder basischen Verunreinigungen bei einer Temperatur von etwa -5ºC bis etwa 10ºC durchgeführt wird.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die unpolaren neutralen Bestandteile des neutralen, Makrolid enthaltenden Fermentationsbrüheextraktkonzentrats oder Stammflüssigkeitskonzentrats durch Extraktion einer Lösung aus besagtem Konzentrat in einem ersten Lösungsmittel mit einem zweiten, nicht aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel entfernt werden, welches mit dem ersten Lösungsmittel nicht mischbar ist und in welchem das neutrale Makrolid unlöslich ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die mit wasser nicht mischbare Lösung, welche das neutrale Makrolid nach Extraktion von sauren, und falls gewünscht basischen Bestandteilen enthält, mit einer ausreichenden Menge eines mischbaren Makrolid-Nicht-Lösungsmittels behandelt wird, um das Makrolid zu veranlassen, in dem sich ergebenden Lösungsmittelgemisch unlöslich zu werden und somit aus der Lösung abzutrennen, wobei das neutrale Makrolid aus dem Lösungsmittelgemisch abgetrennt werden kann.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die mit Wasser nicht mischbare Lösung, welche das neutrale Makrolid nach Extraktion von sauren, und falls gewünscht basischen Bestandteilen enthält, konzentriert wird, und der Rückstand durch Zusammenmischen mit einem kristallisierenden Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch kristallisiert wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Fermentationsbrüheextraktkonzentrat oder Stammflüssigkeitskonzentrat zuerst in einem ersten Lösungsmittel gelöst wird und mit einem zweiten, nicht aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, welches mit besagtem ersten Lösungsmittel nicht mischbar ist, extrahiert wird, um die unpolaren neutralen Verunreinigungen zu entfernen, die Lösung in dem ersten Lösungsmittel dann konzentriert und der Rückstand in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gelöst, und mit wässeriger Base oder Säure und Base in beliebiger Reihenfolge extrahiert wird, um saure oder saure und basische Verunreinigungen zu entfernen.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das nicht aromatische Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel Cyclohexan, Cyclohexen, Hexan, Heptan oder Pentan, oder ein Gemisch daraus ist.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel Dichlormethan, t-Butylmethylether, Ethylacetat, Toluol, 1-Butanol, ein Ethylacetat/Toluolgemisch, ein Heptan/Ethylacetatgemisch oder ein Hexan/Methylenchloridgemisch ist.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die wässerige Base Natriumhydroxid, Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat oder Ammoniumhydroxid ist.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die wässerige Säure Salzsäure, Monokaliumphosphat oder Mononatriumsulfat ist.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Makrolid Rapamycin, 32-Desmethylrapamycin oder 15-Deoxorapamycin ist.