CN108976245B - 一种雷帕霉素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种雷帕霉素的提取方法，包括将雷帕霉素发酵液调pH值，过滤，得滤饼；加入第一有机溶剂萃取，过滤，得滤液，浓缩回收第一有机溶剂，得第一浓缩物；加入第二有机溶剂萃取，降温，加入碳酸氢钠溶液，搅拌洗涤，静置分层；加入醋酸铵缓冲溶液，搅拌洗涤，静置分层，浓缩回收第二有机溶剂，得第二浓缩物；加入L‑乳酸甲酯，搅拌溶解，过滤；降温，搅拌下滴加第三有机溶剂，结晶，过滤，洗涤，减压烘干，得雷帕霉素。本发明提取雷帕霉素的方法工艺简单，成本低，克服了树脂吸附、解析，处理量大，占地面积小，提取收率可达81.16％，HPLC纯度可达98.13％，主体与异构体比例可达93.9:1。
Description
技术领域
本发明属于分离纯化技术领域，涉及一种提取制备雷帕霉素的方法。具体而言，涉及一种提取雷帕霉素的新方法，以及用该方法获得的雷帕霉素。
背景技术
雷帕霉素又名西罗莫司(Sirolimus、Rapamycin)，是新型大环内酯的抗排斥药物，是目前世界上最新的强效免疫抑制剂，临床上用于器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。它的免疫抑制活性比现行临床广泛使用的环孢素强数十倍，毒性低，用量小。它是科学家于1975年首次从智利复活节岛的土壤中发现的一种由土壤链霉菌分泌的次生代谢物，其化学结构属于“三烯大环内酯类”化合物。1999年方由美国家用化学品公司开发上市，并随后在欧美十几个国家陆续上市。雷帕霉素分子式：C51H79NO13，分质量914.18，CAS#52123-88-9，易溶于甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯，溶于乙腈；难溶于正己烷、乙醚、石油醚；不溶于水。
雷帕霉素是雷帕霉素B，其异构体为雷帕霉素C结构式如下：
中国专利文献CN102443012A公开了一种从发酵液中提纯雷帕霉素的方法，将雷帕霉素发酵液，过滤，滤饼抽提，减压浓缩，大孔树脂吸附，解析，真空浓缩，柱层析、洗涤、洗脱、真空浓缩、结晶、真空浓缩、重结晶得到雷帕霉素纯品，纯品纯度为99.5％～99.6％，单杂小于0.1％，收率最高可达60％。该方法采用两次柱分离可以有效提高雷帕霉素纯度，但是收率较低。
中国专利文献CN102070652A公开了一种从发酵液中分离提取西罗莫司的方法，将西罗莫司发酵液过滤或离心分离后得到菌丝体，萃取、脱色、减压浓缩，得到西罗莫司粗提物，高速逆流色谱分离，减压浓缩、干燥得到西罗莫司纯品。该方法需要采用价格昂贵的高速逆流色谱仪，导致生产成本较高，且纯度不到90％，较低。
美国专利公布说明书US20100029933A1公布了雷帕霉素的纯化方法，雷帕霉素发酵液中，加入有机溶剂，萃取，浓缩，经两次层析、两次结晶，纯化得到纯品纯度达到98.8％，总杂质含量小于1.2％，单杂低于0.15％，收率低。中国专利文献CN102372726A公开了一种从发酵液中分离提取西罗莫司的方法，西罗莫司发酵液过滤，滤饼用乙醇浸提液，加入固体吸附剂吸附、萃取、洗涤、浓缩、结晶、洗晶干燥等步骤，可获得纯度98.0％、主体与异构体比例23.8:1、含量84.1％的西罗莫司，收率为63.3％～72.3％。该方法采用硅藻土、硅胶等固体吸附剂进行吸附杂质，效果不佳，最终得到的西罗莫司含量和纯度均较低，收率也不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种雷帕霉素提取方法。
本发明的技术方案如下：
一种雷帕霉素的提取方法，包括：将雷帕霉素发酵液调pH值，过滤，得滤饼；加入第一有机溶剂萃取，过滤，得滤液，浓缩回收第一有机溶剂，得第一浓缩物；加入第二有机溶剂萃取，降温(一般降温至0-10℃，优选2-5℃)，加入碳酸氢钠溶液，搅拌洗涤，静置分层；加入醋酸铵缓冲溶液，搅拌洗涤(1h左右)，静置分层，浓缩回收第二有机溶剂，得第二浓缩物；加入L-乳酸甲酯，搅拌溶解，过滤；降温(一般降温至：-15～10℃，优选降温至：-8～5℃)，搅拌下滴加第三有机溶剂，结晶，过滤，洗涤，减压烘干，得雷帕霉素。
进一步地，上述雷帕霉素的提取方法，是将雷帕霉素发酵液调pH值4.4-6.0，优选pH值4.8-5.5，然后过滤。
进一步地，所用pH值调节剂选自盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、草酸等中的一种或多种，优选草酸。
进一步地，所述第一有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、二甲基亚砜、苯甲醇等中的一种或多种，优选乙醇。
进一步地，以g/mL计，所述滤饼与所述第一有机溶剂的重量体积比为1：(1.5-10)，优选为1：(2.0-5.5)。
进一步地，所述第二有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、丁醇、异丁醇、乙酸乙酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯等低级酯中的一种或多种；优选乙酸乙酯。
进一步地，以g/mL计，所述滤饼与所述第二有机溶剂的重量体积比为1：(0.6-10)，优选为1：(1.0-5.0)。
进一步地，以g/mL计，所述滤饼与所述碳酸氢钠溶液的重量体积比1：(0.2-5)，优选为1：(0.5-3)；所述碳酸氢钠溶液的质量分数为3％。
进一步地，所述碳酸氢钠溶液的温度为0-10℃，优选为2-5℃。
进一步地，以g/mL计，所述滤饼与所述醋酸铵缓冲溶液的重量体积比1：(0.2-5)，优选为1：(0.5-3)；所述醋酸铵缓冲溶液的质量分数为3％，pH值4.7-5.8，优选pH值4.8-5.5。
进一步地，以g/mL计，所述滤饼与所述L-乳酸甲酯的重量体积比1：(0.1-3)，优选为1：(0.15-1.0)。
进一步地，所述第三有机溶剂选自甲丁醚、甲戊醚、乙醚、乙丙醚、乙丁醚、丙醚、丙丁醚、丁醚、戊烷、己烷、庚烷、环己烷、环庚烷、甲基环戊烷、乙基环戊烷、甲基环己烷、乙基环己烷等中的一种或多种；优选乙丙醚。
进一步地，所述L-乳酸甲酯与所述第三有机溶剂的体积比为1：(1-5)，优选1：(2-4)。
具体地，上述雷帕霉素的提取方法，包括如下步骤：
1)将雷帕霉素发酵液调pH值4.4-6.0，过滤，得滤饼；加入第一有机溶剂进行萃取，过滤，得滤液；浓缩回收第一有机溶剂，得第一浓缩物；以g/mL计，所述滤饼与所述第一有机溶剂的重量体积比为1：(1.5-10)；
2)向上述所得第一浓缩物中加入第二有机溶剂萃取，降温至0-10℃，加入0～10℃的3％的碳酸氢钠溶液，搅拌洗涤(约0.5h)，静置分层；加入pH值4.7-5.8的3％醋酸铵缓冲溶液，搅拌洗涤(约1h)，静置分层，浓缩回收第二有机溶剂，得第二浓缩物；
以g/mL计，所述滤饼与所述第二有机溶剂的重量体积比为1：(0.6-10)，
以g/mL计，所述滤饼与所述碳酸氢钠溶液的重量体积比1：(0.2-5)，
以g/mL计，所述滤饼与所述醋酸铵缓冲溶液的重量体积比1：(0.2-5)；
3)上述所得第二浓缩物中，加入L-乳酸甲酯，搅拌溶解，过滤；滤液降温至-15～10℃，搅拌下滴加第三有机溶剂，结晶，过滤，洗涤，减压烘干，得雷帕霉素；
以g/mL计，所述滤饼与所述L-乳酸甲酯的重量体积比1：(0.1-3)，
所述L-乳酸甲酯与所述第三有机溶剂的体积比为1：(1-5)。
本发明所述雷帕霉素发酵液可按本领域常规方法制备。
本发明还包括上述方法所得雷帕霉素；其中雷帕霉素主体与异构体比例可达(87.6-93.9):1，HPLC纯度可达91.7％-98.13％。
本发明提取雷帕霉素的方法工艺简单，成本低，克服了树脂吸附、解析，处理量大，占地面积小，提取收率可达81.16％，HPLC纯度可达98.13％，主体与异构体比例可达93.9:1。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
通过微生物发酵培养出含雷帕霉素的发酵液10L，用草酸调pH值5.1，过滤，得滤饼461.30g；加入1.5L乙醇，萃取，过滤，得滤液；浓缩回收乙醇，混合物中加入0.6L乙酸乙酯萃取，降温至3℃，加入3℃、3％的碳酸氢钠溶液0.4L，搅拌洗涤，静置，分层；加入pH值5.2、3％醋酸铵缓冲溶液0.5L，搅拌洗涤1h，静置，分层，浓缩回收乙酸乙酯，得雷帕霉素粗品38.91g。HPLC纯度45.72％。
粗品中加入L-乳酸甲酯80ml，搅拌溶解，过滤；降温至0℃，搅拌下滴加乙丙醚300ml结晶，过滤，30ml乙丙醚洗涤，减压烘干，得雷帕霉素6.83g。收率81.16％，HPLC纯度98.13％，主体与异构体比例93.9:1。
实施例2
通过微生物发酵培养出含雷帕霉素的发酵液10L，用盐酸酸调pH值4.8，过滤，得滤饼450.84g；加入0.9L甲醇，萃取，过滤，得滤液；浓缩回收甲醇，混合物中加入2.3L乙酸丁酯萃取，降温至2℃，加入2℃、3％的碳酸氢钠溶液1.4L，搅拌洗涤，静置，分层；加入pH值5.5、3％醋酸铵缓冲溶液1.4L，搅拌洗涤1h，静置，分层，浓缩回收乙酸丁酯，得雷帕霉素粗品39.53g。HPLC纯度41.84％。粗品中加入L-乳酸甲酯65ml，搅拌溶解，过滤；降温至5℃，搅拌下滴加乙醚130ml结晶，过滤，30ml乙醚洗涤，减压烘干，得雷帕霉素6.52g。收率77.50％，HPLC纯度96.02％，主体与异构体比例92.5:1。
实施例3
通过微生物发酵培养出含雷帕霉素的发酵液10L，用磷酸调pH值5.5，过滤，得滤饼466.25g；加入2.6L异丙醇，萃取，过滤，得滤液；浓缩回收异丙醇，混合物中加入0.46L二氯甲烷萃取，降温至4℃，加入4℃、3％的碳酸氢钠溶液0.23L，搅拌洗涤，静置，分层；加入pH值4.8、3％醋酸铵缓冲溶液0.23L，搅拌洗涤1h，静置，分层，浓缩回收二氯甲烷，得雷帕霉素粗品37.21g。HPLC纯度46.73％。粗品中加入L-乳酸甲酯470ml，搅拌溶解，过滤；降温至-8℃，搅拌下滴加乙醚1880ml结晶，过滤，30ml乙醚洗涤，减压烘干，得雷帕霉素2.55g。收率30.30％，HPLC纯度93.85％，主体与异构体比例87.6:1。
实施例4
通过微生物发酵培养出含雷帕霉素的发酵液10L，用草酸调pH值5.2，过滤，得滤饼464.11g；加入0.5L乙醇和0.5L丙酮，萃取，过滤，得滤液；浓缩回收有机溶剂，混合物中加入0.6L乙酸丁酯和0.3L丁醇萃取，降温至3℃，加入3℃、3％的碳酸氢钠溶液0.4L，搅拌洗涤，静置，分层；加入pH值5.2、3％醋酸铵缓冲溶液0.5L，搅拌洗涤1h，静置，分层，浓缩回收有机溶剂，得雷帕霉素粗品38.34g。HPLC纯度43.52％。粗品中加入L-乳酸甲酯90ml，搅拌溶解，过滤；降温至0℃，搅拌下滴加乙醚200ml和180ml庚烷结晶，过滤，30ml乙醚洗涤，减压烘干，得雷帕霉素6.41g。收率76.17％，HPLC纯度98.25％，主体与异构体比例91.7:1。
实施例5
通过微生物发酵培养出含雷帕霉素的发酵液10L，用硫酸调pH5.0，过滤，得滤饼448.4g；加入2.0L正丙醇醇，萃取，过滤，得滤液；浓缩回收正丙醇，混合物中加入0.8L氯仿萃取，降温至4℃，加入4℃、3％的碳酸氢钠溶液1.4L，搅拌洗涤，静置，分层；加入PH5.3、3％醋酸铵缓冲溶液0.6L，搅拌洗涤，静置，分层，浓缩回收氯仿，得雷帕霉素粗品36.5g。HPLC纯度44.8％。粗品中加入乙酸乙酯100ml，搅拌溶解，过滤；降温至5℃，搅拌下滴加庚烷350ml结晶，过滤，30ml庚烷洗涤，减压烘干，得雷帕霉素4.5g。HPLC纯度76.72％，主体与异构体比例32.8:1。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种雷帕霉素的提取方法，其特征在于，包括：
将雷帕霉素发酵液调pH值至4.8-5.5，过滤，得滤饼；
加入第一有机溶剂萃取，过滤，得滤液，浓缩回收第一有机溶剂，得第一浓缩物；所述第一有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、二甲基亚砜、苯甲醇中的一种或多种；以g/mL计，所述滤饼与所述第一有机溶剂的重量体积比为1：(1.5-10)；
加入第二有机溶剂萃取，降温，加入碳酸氢钠溶液，搅拌洗涤，静置分层；加入醋酸铵缓冲溶液，搅拌洗涤，静置分层，浓缩回收第二有机溶剂，得第二浓缩物；所述第二有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、丁醇、异丁醇、乙酸乙酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯中的一种或多种；以g/mL计，所述滤饼与所述第二有机溶剂的重量体积比为1：(0.6-10)；以g/mL计，所述滤饼与所述碳酸氢钠溶液的重量体积比为1：(0.2-5)；所述碳酸氢钠溶液的质量分数为3％；
加入L-乳酸甲酯，搅拌溶解，过滤；降温至-15～10℃，搅拌下滴加第三有机溶剂，结晶，过滤，洗涤，减压烘干，得雷帕霉素；所述第三有机溶剂选自甲丁醚、甲戊醚、乙醚、乙丙醚、乙丁醚、丙醚、丙丁醚、丁醚、戊烷、己烷、庚烷、环己烷、环庚烷、甲基环戊烷、乙基环戊烷、甲基环己烷、乙基环己烷中的一种或多种；所述L-乳酸甲酯与所述第三有机溶剂的体积比为1：(1-5)；以g/mL计，所述滤饼与所述L-乳酸甲酯的重量体积比为1：(0.1-3)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以g/mL计，所述滤饼与所述第一有机溶剂的重量体积比为1：(2.0-5.5)；和/或，
以g/mL计，所述滤饼与所述第二有机溶剂的重量体积比为1：(1.0-5.0)；和/或，
所述L-乳酸甲酯与所述第三有机溶剂的体积比为1：(2-4)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所用pH值调节剂选自盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、草酸中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以g/mL计，所述滤饼与所述碳酸氢钠溶液的重量体积比为1：(0.5-3)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以g/mL计，所述滤饼与所述醋酸铵缓冲溶液的重量体积比为1：(0.2-5)；所述醋酸铵缓冲溶液的质量分数为3％，pH值为4.7-5.8。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以g/mL计，所述滤饼与所述醋酸铵缓冲溶液的重量体积比为1：(0.5-3)；所述醋酸铵缓冲溶液的pH值为4.8-5.5。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以g/mL计，所述滤饼与所述L-乳酸甲酯的重量体积比为1：(0.15-1.0)。
8.根据权利要1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将雷帕霉素发酵液调pH值4.4-6.0，过滤，得滤饼；加入第一有机溶剂进行萃取，过滤，得滤液；浓缩回收第一有机溶剂，得第一浓缩物；以g/mL计，所述滤饼与所述第一有机溶剂的重量体积比为1：(1.5-10)；
2)向上述所得第一浓缩物中加入第二有机溶剂萃取，降温至0-10℃，加入0-10℃的3％的碳酸氢钠溶液，搅拌洗涤，静置分层；加入pH值4.7-5.8的3％醋酸铵缓冲溶液，搅拌洗涤，静置分层，浓缩回收第二有机溶剂，得第二浓缩物；
以g/mL计，所述滤饼与所述第二有机溶剂的重量体积比为1：(0.6-10)，
以g/mL计，所述滤饼与所述碳酸氢钠溶液的重量体积比1：(0.2-5)，
以g/mL计，所述滤饼与所述醋酸铵缓冲溶液的重量体积比1：(0.2-5)；
3)上述所得第二浓缩物中，加入L-乳酸甲酯，搅拌溶解，过滤；滤液降温至-15～10℃，搅拌下滴加第三有机溶剂，结晶，过滤，洗涤，减压烘干，得雷帕霉素；
以g/mL计，所述滤饼与所述L-乳酸甲酯的重量体积比1：(0.1-3)，
所述L-乳酸甲酯与所述第三有机溶剂的体积比为1：(1-5)。
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