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Verfahren zur Gewinnung von corticosteroidartigen Verbindungen aus
Gärlösungen Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von bestimmten,
auf fermentativem Wege erhaltenen Steroidverbindungen aus Gärlösungen.
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Im Laufe der letzten Jahre sind viele Steroidverbindungen mit bestimmten
Mikroorganismen behandelt worden. So ist beispielsweise die Oxydation von Steroiden,
wie die Umwandlung der Verbindung S in Hydrocortison, mit einer Vielzahl von verschiedenen
Mikroorganismen durchgeführt worden. Auch hat man Hydrocortison mit verschiedenen
Mikroorganismen in Prednisolon umgewandelt. Ferner sind zahlreiche verwandte Verbindungen,
wie 14,15-Oxidohydrocortison, 14-Oxyprednisolon und 14-Oxyhydrocortison, auf mikrobiologischem
Wege hergestellt worden.
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Es wurde nun ein neues Verfahren zur Gewinnung von Verbindungen der
obengenannten Art aus diese enthaltenden Gärprodukten gefunden. Nach dem neuen Verfahren
wird das Steroid aus der Gärlösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen
Lösungsmittel in bekannter Weise extrahiert und der Extrakt bei einem basischen
pH-Wert durch Extraktion mit einer Puffersubstanz, die vorzugsweise ein Phosphat
ist, gereinigt. Der Lösungsmittelextrakt wird dann so stark konzentriert, wie es
für die Kristallisation des Produktes auf Grund seiner Löslichkeit in dem gewählten
organischen Lösungsmittel erforderlich ist, Zu dem Konzentrat wird noch Puffersubstanzlösung
hinzugefügt und das Gemisch zur Kristallisation des Produktes gekühlt und gerührt.
Dadurch wird nach einem einfacheren Verfahren als bisher ein kristallines Produkt
von hohem Reinheitsgrad gewonnen.
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Das kristalline Produkt kann durch Umkristallisation aus einem mit
Wasser nicht mischbaren, halogenierten Lösungsmittel, vorzugsweise aus Chloroform,
das eine kleine Menge eines niedrigen Alkanols mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen enthält,
weitergereinigt werden. Durch den Zusatz von Wasser zu diesem Gemisch wird das Steroid
dann ausgefällt. Man erhält hierauf ein Produkt von sehr großer Reinheit, dessen
Qualität sich in zufriedenstellender Weise für die Verwendung in pharmazeutischen
Präparaten eignet.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden erstaunlich hohe Ausbeuten
erzielt. Sie übersteigen im allgemeinen 70 °/o, bezogen auf das entsprechende, in
der Gärlösung vorhandene Steroid. Oft enthalten die Gärprodukte mehr als ein Steroid.
Das vorliegende Verfahren ermöglicht nun eine ausgezeichnete Reinigung von unerwünschten
Verunreinigungen mit sehr ähnlicher Konstitution.
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Bei einer Abänderung des oben dargelegten Verfahrens wird eine Steroidlösung,
die durch Extraktion einer Gärlösung mit einem halogenierten Lösungsmittel der nachstehend
beschriebenen Art erhalten wurde - vor der Kristallisation in Gegenwart von wäßriger
Puffersubstanzlösung -, mit einer kleinen Menge eines niedrigen Alkanols mit bis
zu 3 Kohlenstoffatomen behandelt. Diese Behandlang führt zur Erzielung eines Produktes
von hoher Reinheit.
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Wird die Gärlösung mit einem Keton der nachstehend beschriebenen Art
extrahiert, so wird die konzentrierte Ketonlösung - vor der Behandlung mit einem
Alkanol und der Kristallisation in Gegenwart wäßriger Pufferlösung - mit einer großen
Menge eines halogenierten Lösungsmittels der noch zu beschreibenden Art behandelt.
Im allgemeinen enthält die Ketonlösung nach der Behandlung mit dem halogenierten
Lösungsmittel etwa 30 Volumprozent Keton.
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Die Gärlösung wird vorzugsweise unter Verwendung eines Diatomeenerdefilters
bei einem schwach sauren pH-Wert, d. h. bei etwa 3 bis etwa 6, filtriert. Anschließend
wird das filtrierte Produkt mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert.
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Zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens verwendet
man als mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel für die erste Extraktion des Steroids
aus der Gärlösung vorzugsweise Methylisobutylketon, Methyläthylketon, Methylenchlorid,
Äthylenchlorid oder Chloroform. Die mit diesen Lösungsmitteln durchgeführte Extraktion
kann diskontinuierlich, d. h. durch Umrühren eines Voiumteils Lösungsmittel mit
der ein- bis fünffachen Menge Gärlösung und anschließendes Absetzenlassen und Trennen
der Phasen, erfolgen. Dieses Verfahren kann mehrmals wiederholt werden, um eine
vollständige Trennung zu gewährleisten. Die Extraktion
kann aber
auch in Füllkörpersäulen durchgeführt werden, in die die filtrierte Gärlösung und
das Lösungsmittel im Gegenstrom geleitet werden. Bevorzugt bei dieser Art der Extraktion
werden sogenannte Podbielniak-Exträktoren, da mit diesen die beste Extraktionswirkung
erreicht wird: Ist der das Steroid enthaltende Lösungsmittelextrakt von der wäßrigen
Phase abgetrennt, dann wird mit einer wäßrigen Lösung einer wasserlöslichen Puffersubstanz,
wie einem Gemisch aus Natriumphosphaten, bei einem pH-Wert von etwa 7,5 bis etwa
9,0, gewaschen. Das Volumenverhältnis von Puffersubstanz zu Lösungsmittelextrakt
kann etwa 1 : 3 bis etwa 2: 1 betragen. Der Puffer wird in Form einer verdünnten
wäßrigen Lösung verwendet. Ein Puffer kann z. B. dadurch hergestellt werden, daß
man eine 1 °/oige wäßrige Lösung von sekundärem Natriumphosphat mit so viel konzentrierter
Natriumhydroxydlösung versetzt, daß ein pH-Wert von 8 bis 8,5 erreicht wird. Andere
geeignete Puffersubstanzen sind Gemische aus Alkalimetallcarbonat und -bicarbonat,
Alkalimetallacetat und Essigsäure oder Alkalimetallhydroxydkombinationen (je nach
dem angestrebten pH-Wert). Fast jede wasserlösliche Kombination aus einer starken
Base und einer schwachen Säure, die auf einen geeigneten pH-Wert eingestellt ist,
erweist sich für diesen Zweck geeignet.
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Die Extraktion mit einem Puffer kann diskontinuierlich oder in dem
oben beschriebenen Gegenstromverfahren erfolgen. Der gereinigte Steroid-Lösungsmittelextrakt
wird dann vorzugsweise durch Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum auf etwa-100
bis etwa 300 mg Steroid je ccm Lösung konzentriert. Je nach der im einzelnen zu
gewinnenden Steroidverbindung variiert die günstigste Konzentration etwas. Für Prednisolon
und Hydrocortison ist eine Konzentration von etwa 250 mg/ccm völlig ausreichend.
Ist die erhaltene Konzentration zu hoch, so können sich vorhandene Verunreinigungen
bei der Kristallisation der erwünschten Verbindung ebenfalls abscheiden.
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Nach dem Einengen wird das Lösungsmittelkonzentrat mit etwa 1/2 bis
2 Volumteiien eines Puffers der oben beschriebenen Art bei einem pH-Wert von etwa
7,5 bis 9,0, vorzugsweise von 8 bis 8,5, behandelt. Das entstehende Zweiphasengemisch
wird dann gekühlt und mehrere Tage langsam gerührt. Im allgemeinen wendet man eine
Temperatur von 10° C oder darunter an. Temperaturen von wesentlich unter 0° C kommen
nicht in Frage. Nach mehrstündigem, d. h. nach etwa 3- bis 20stündigem Rühren kann
das kristalline Produkt aus dem flüssigen Zweiphasensystem entfernt werden. Dies
kann man durch Filtrieren, Zentrifugieren usw. erreichen. Das abgetrennte Produkt
wird darauf getrocknet.
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Obwohl das Produkt in hoher Reinheit anfällt, kann man es, falls dies
gewünscht wird, durch Kristallisation noch weiter reinigen. Zum Beispiel kann man
es in einem Gemisch aus einem der oben genannten halogenierten Lösungsmittel, das
eine kleine Menge (5 bis 35 °/o) eines niedrigen Alkanols mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen
enthält, lösen. Als Lösungsmittel wird vorzugsweise Chloroform, als Alkanol Methanol
verwendet, wobei auf etwa 30 bis 100 mg Kristalle je 1 ccm Lösungsmittel
kommt. Das umkristallisierte Produkt kann dann dadurch gewonnen werden, daß man
dem Gemisch nach und nach Wasser zusetzt, wobei man am zweckmäßigsten etwa 1/2 bis
3 Volumteile Wasser je Volumteil Lösungsmittel verwendet. Das Gemisch wird gerührt,
worauf sich das umkristallisierte Produkt abscheidet. Es kann durch Filtrieren oder
Zentrifugieren entfernt werden. Wird eine weitere Reinigung gewünscht, so kann man
den obigen Prozeß wiederholen. Durch Konzentrieren der Mutterlauge, d. h. des Filtrats
oder Zentrifugats aus dem oben beschriebenen Reinigungsverfahren, können weitere
Stoffe gewonnen werden, die unter Umständen jedoch sehr unrein sind, so daß sie
zu einer weiteren Reinigung zurückgeführt werden müssen.
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Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung des erfindungsgemäßen
Verfahrens: Beispiel 1 Durch Einwirkung von Mycobacterium smegmatis auf Hydrocortison
wurde eine Gärlösung hergestellt, die je 3,81 100 mg 41-Dehydrohydrocortison enthielt.
Die Gärlösung enthielt außerdem 41-Dehydrohydrocortison nicht umgewandeltes Hydrocortison
und strukturell verwandte Steroide. Die Gärlösung wurde mittels eines Diatomeenerdefilters
bei einem pH-Wert von 4,0 filtriert. Dann wurde sie in einem Podbielniak-Extraktor
mit Methylisobutyl keton extrahiert, wobei das Verhältnis von Lösungsmittel zu Gärlösung
1:3 betrug. Der Methyhsobutylketonextrakt wurde mit 1 Volumteil 1 °/oigem Dinatriumphosphat,
das mittels konzentriertem Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8 eingestellt war,
gewaschen. Die gewaschene Methylisobutylketonlösung des Steroids wurde durch Destillation
zu einer Lösung konzentriert, die je ccm 250 mg 41-Dehydrohydrocortison enthielt.
Dem Lösungsmittelkonzentrat wurde 1 Volumteil 1 °/aiges Dinatriumphosphat zugefügt,
dessen pH-Wert mit Hilfe von Natriumhydroxyd auf 8,5 eingestellt war. Dann wurde
das Gemisch auf 0° C gekühlt und 10 Stunden langsam gerührt. Das kristalline Produkt
wurde abfiltriert und die Kristalle im Vakuum unter Anwendung von etwas Wärme getrocknet.
Das getrocknete Produkt wurde darauf in einem Gemisch aus 90 Volumprozent Chloroform
und 10 Volumprozent Methanol gelöst, wobei je ccm Lösungsmittelgemisch 50 mg Feststoff
verwendet wurden. Das gereinigte Produkt wurde dadurch kristallisiert, daß man unter
ständigem Rühren nach und nach die gleiche Raummenge Wasser zufügte. Das 41-Dehydrohydrocortison
wurde bei einer Reinheit von über 900/,
in einer Ausbeute von über
700/, erhalten.
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Beispiel 2 Eine Gärlösung, die, wie in der USA.-Patentschrift 2 658
023 beschrieben, durch Züchtung von Curvularia lunata in einem Gärmedium hergestellt
worden war und je 3,81 Gärlösung etwa 200 mg Hydrocortison neben anderen Steroiden
enthielt, wurde bei einem pH-Wert von 4 filtriert. Das Produkt wurde anschließend
dreimal mit j e 2 Volumteilen Methylisobutylketon extrahiert. Dann wurden die vereinigten
Methylisobutylketonextrakte mit einem Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von
8 gewaschen und die Schichten getrennt. Die Ketonlösung wurde anschließend auf 250
mg Produkt je ccm Lösung konzentriert. Dem Lösungsmittelkonzentrat wurde 1 Volumteil
1 °/oiges, mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8,0 eingestelltes Dinatriumphosphat
zugefügt. Dann wurde auf 5° C gekühlt, 15 Stunden langsam gerührt und das ausgefällte
kristalline Produkt durch Filtrieren gewonnen. Das Hydrocortison wurde bei einer
Reinheit von über 80 % in einer Ausbeute von über 70 °/o erhalten.
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Beispiel 3 Eine Gärlösung; die durch Züchtung von Nocardia opaca in
einem Gärmedium hergestellt worden war und je 3,81 Gärlösung etwa 200 mg Prednisolon
neben anderen Steroiden enthielt, wurde bei einem pH-Wert von 4 filtriert. Das Produkt
wurde dann m einem mit voller Kapazität arbeitenden Podbielniak-Extraktor (Modell
6900) mit Chloroform extrahiert, wobei das Verhältnis
von Lösungsmittel
zu Gärlösung 1 : 2 betrug. Die Chloroformlösung wurde bei einem pH-Wert von 9,0
mit einen Natriumbicarbonatpuffer gewaschen. Dann wurde auf 250 mg Produkt je ccm
Lösung konzentriert. Zu dem Lösungsmittelkonzentrat wurde 1 Volumteil 1 °/oiges
Natriumcarbonat, dessen pH-Wert mittels Natriumhydroxyd auf 8,5 eingestellt war,
gegeben. Anschließend wurde das Gemisch auf 0° C gekühlt und 10 Stunden langsam
gerührt. Das kristalline Produkt wurde filtriert und die Kristalleim Vakuum unter
Anwendung von etwas Wärme getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in einem Gemisch
aus 90 Volumprozent Äthylenchlorid und 10 Volumprozent Äthanol gelöst, wobei je
ccm Lösungsmittelgemisch 50 mg Feststoff verwendet wurden. Das gereinigte Produkt
wurde durch allmählichen Zusatz der gleichen Raummenge Wasser unter ständigem Rühren
kristallisiert. Das kristalline abgeschiedene Produkt wurde filtriert und getrocknet.
Beispiel 4 Eine Gärlösung, die je 3,81100 mg Prednison enthielt, wurde durch die
Einwirkung von Micromonospora chalcea hergestellt. Die Gärlösung wurde bei einem
p,1-Wert von 4,0 durch ein Diatomeenerde-Filtrierhilfsmittel filtriert. Dann wurde
sie in einem mit Äthylenchlorid bei voller Kapazität arbeitenden Podbielniak-Extraktor
(Modell 6080) extrahiert, wobei das Verhältnis von Lösungsmittel zu Gärlösung 1,4:1
betrug. Der Äthylenchloridextrakt wurde mit 1 Volumteil Natriumacetat-Natriumhydroxyd-Puffer,
dessen p] ,-Wert auf 7,5 eingestellt war, gewaschen. Die gewaschene Äthylenchloridlösung
des Steröids wurde durch Destillation zu einer Lösung konzentriert, die je ccm 250
mg Prednison enthielt. Zu dem Lösungsmittelkonzentrat wurde 1 Volumteil 1 °/oiges,
mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7,5 eingestelltes Dinatriumphosphat gegeben.
Anschließend wurde das Gemisch auf 10° C gekühlt und 20 Stunden gerührt. Das kristalline
Produkt wurde abfiltriert und die Kristalle im Vakuum unter Anwendung von etwas
Wärme getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde anschließend in einem Gemisch aus
Methylenchlorid und Alkohol gelöst und durch allmählichen Zusatz von Wasser unter
ständigem Rühren ausgefällt. Beispiel 5 Eine Gärlösung, die, wie in der USA.-Patentschrift
2658023 beschrieben, durch Züchtung von Curvularia lunata in einem Gärmedium
hergestellt worden war und je 3,81 Gärlösung etwa 200 mg Hydrocortison neben anderen
Steroiden enthielt, wurde bei einem pH-Wert von 4 filtriert. Das Produkt wurde dann
in einem bei voller Kapazität mit Methyläthylketon arbeitenden Podbiel niak-Extraktor
(Modell 7500) extrahiert, wobei das Verhältnis von Lösungsmittel zu Gärlösung
1: 3 betrüg. Anschließend wurde das Methyläthylketon mit als Puffer dienendem Natriumphosphat
bei einem pH-Wert von 8 gewaschen. Die Methyläthylketonlösung wurde auf 250 mg Produkt
je ccm Lösung konzentriert. Darauf wurden 3 Volumteile Äthylenchlorid und 1/6 Volumteile
- bezogen auf die Äthylenchloridmenge - Methanol zugefügt. Dann wurde allmählich
so lange eine 1 °/oige Lösung von Natriumphosphat bei einem pH-Wert von 8,5 zugegeben,
bis das Produkt vollständig auskristallisiert war. Das Gemisch wurde während des
Zusatzes und noch einige Tage anschließend gerührt. Dann wurde filtriert, das Produkt
mit einer kleinen Menge Lösungsmittelgemisch gewaschen und getrocknet.
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Beispiel 6 Eine 100 mg Prednison je 3;81 enthaltende Gärlösung wurde
durch die Einwirkung von Micromonospora chalcea hergestellt und dann bei einem pH-Wert
von 4,0 durch ein Diatomeenerdefilter filtriert. Darauf wurde in einem Podbielniak-Extraktor
(Modell 6900), der bei voller Kapazität mit Methylenchlorid arbeitete, extrahiert,
wobei das Verhältnis von Lösungsmittel zu Gärlösung 1,4:1 betrug. Der Methylenchlorid-Extrakt
wurde mit 1 Volumteil Natriumacetat-Natriumhydroxyd-Puffer, dessen pH-Wert auf 7,5
eingestellt war, gewaschen. Die gewaschene Methylenchloridlösung des Steroids wurde
durch Destillation zu einer Lösung konzentriert, die je ccm 250 mg Prednison enthielt.
Zu dem Lösungsmittelkonzentrat wurde 1 Volumteil 1 °/oiges, mit Natriumhydroxyd
auf einen pH-Wert von 7,5 eingestelltes Dinatriumphosphat gegeben. Dann wurde das
Gemisch auf 10° C gekühlt und 20 Stunden gerührt. Das kristalline Produkt wurde
filtriert, und die Kristalle wurden im Vakuum unter Anwendung von etwas Wärme getrocknet.
Anschließend wurde das getrocknete Produkt in einem Gemisch aus Methylenchlorid
und Alkohol gelöst und durch den allmählichen, unter ständigem Rühren erfolgenden
Zusatz von Wasser ausgefällt.