DE69425903T2

DE69425903T2 - Verbindungen und verfahren zur ortsspezifischen mutation in eukaryotischen zellen

Info

Publication number: DE69425903T2
Application number: DE69425903T
Authority: DE
Inventors: Eric B. Kmiec
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 1993-12-09
Filing date: 1994-12-09
Publication date: 2001-02-15
Anticipated expiration: 2014-12-10
Also published as: ES2149962T3; CN1117866C; EP0733059A4; AU691550B2; CA2178729A1; WO1995015972A1; DK0733059T3; PT733059E; CN1048254C; ATE196311T1; US5871984A; AU1399595A; DE733059T1; CN1215755A; US5565350A; US5756325A; KR100386337B1; CN1142829A; NZ278490A; KR960706500A

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekulargenetik. Sie betrifft insbesondere Nucleinsäureverbindungen und Verfahren ihrer Verwendung zum Einführen spezifischer genetischer Änderungen in lebende Kulturen eukaryotischer Zellen. Genauer betrifft sie im wesentlichen Watson-Crick-gepaarte Duplexnucleinsäuren, worin ein Teil eines Duplexstranges eine Nucleotide enthaltende 2'-O- oder 2'-OMe-Ribose umfaßt und der Rest Desoxyribonucleotide umfaßt.

2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG

2.1. CHIMÄRE UND/ODER HYBRIDDUPLEXNUCLEINSÄUREN

Das Gebiet der Erfindung betrifft Nucleinsäuren. Nucleinsäuren sind Heteropolymere, d. h. Polymere aus nichtidentischen Untereinheiten, die durch gerichtete Phosphodiesterbindungen oder ihre Derivate zu Polymeren verknüpft sind. Duplexnucleinsäuren sind Nucleinsäuren, worin jede Base eines ersten Stranges des Duplex einer Base eines zweiten Stranges des Duplex gemäß dem Schema entspricht, bei dem Uracil oder Thymin und Adenin einander entsprechen und Cytosin und Guanin einander entsprechen. Von antiparallelen Duplexsträngen mit diesen Entsprechungen sagt man, daß sie Watson-Crick-gepaart sind. Duplexnucleinsäuren können zwei Haupttypen sein, Ribonucleinsäuren und Desoxyribonucleinsäuren. Jedes Ribonucleotid weist ein äquivalentes Desoxyribonucleotid, z. B. Adenosin und Desoxyadenosin, Cytidin und Desoxycytidin, Guanosin und Desoxyguanosin, Uridin und Thymidin, auf. Wie auf diesem Gebiet gebräuchlich wird eine Nucleinsäure, bei der sowohl Ribonucleotide als auch Desoxyribonucleotide im selben Strang vorliegen, eine gemischte oder chimäre (hierin nachstehend "chimär") Nucleinsäure genannt. Eine Du plexnucleinsäure, bei der Desoxyribonucleotide und Ribonucleotide einander entsprechen, wird ein Hybridduplex genannt. Wenn zwei Stränge über weniger als alle ihre Basen eine Duplexnucleinsäureregion bilden, wird das: sich daraus ergebende Molekül ein Heteroduplex genannt.
Am häufigsten sind die beiden Stränge einer Duplexnucleinsäure nicht kovalent gebunden, sondern sind nur durch Watson-Crick- Paarung miteinander verbunden. Die beiden Stränge eines Duplex können jedoch durch ein Oligonucleotid unter Bilden eines einzelnen Polymers verknüpft sein. Das verknüpfende Oligonucleotid ist nicht Watson-Crick-gepaart. Der Heteroduplex, bei dem der erste und zweite Strang Teile eines einzelnen Polymers sind, wird ein "Haarnadelduplex" oder eine "Pfannenstiel"-Struktur genannt. Hierin nachstehend wird der erste Ausdruck verwendet.
Hierin verwendet ist Chimärismus eine Eigenschaft eines Nucleinsäurepolymers und ist Hybridismus eine Eigenschaft eines Duplex. Zum Beispiel bilden eine mRNA und ihre Matrize einen Hybridduplex, obschon keine chimär ist, während zum Beispiel die chimären Octanucleotide 5'd(TTTT)-r(CCCC)3' und 5'r(GGGG)- d(AAAA)3' miteinander einen Watson-Crick-Duplex bilden, der sich daraus ergebende Duplex aber kein Hybridduplex ist. Eine Duplexnucleinsäure, die kein Hybridduplex ist, wird hierin nachstehend ein "Homoduplex" genannt. Solange sonst nicht anders angegeben bezieht sich eine Homoduplex-Nucleinsäure nur auf einen Desoxynucleotid-haltigen Duplex. Schließlich ist anzumerken, daß selbst wenn keine Hybridduplex-Nucleinsäuren vorliegen, sich die Fachleute bei der Bildung eines Watson-Crick- Duplex auf eine "Hybridisierung" beziehen.
Die sich für die Stabilität von Hybridduplex-Nucleinsäüren Interessierenden haben chimäre Oligonucleotide mit einer "Haarnadel"-Konformation und 12 Basenpaaren eines Hybridduplex synthetisiert; Roberts, R. W. & Crothers, D. M., 1992, Science 258 : 1463. Die sich für die Strukturuntersuchung chimärer und/oder Hybridduplex-Nucleinsäuren durch Röntgenbeugung und zweidimensionale NMR Interessierenden haben chimäre Nucleinsäuren und Hybridduplex-Nucleinsäuren zur Verwendung bei ihren Untersuchungen synthetisiert; siehe z. B. Salazar, M., et al., 1994, J. Mol. Biol. 241: 440-55, und Egli, M., et al., 1993, Biochemistry 32: 3221-37 (zweisträngiger, chimärer Hybridduplex der Form r&sub3;d&sub7;·d&sub1;&sub0;); Ban, C., et al., 1994, J. Mol. Biol. 236 : 275-85 (selbstkomplementärer, chimärer Hybridduplex der Form d&sub5;r&sub1;d&sub4;); Chou, S. HA, 1991, Biochemistry 30 : 5248-57 (selbstkomplementierende und nicht-selbstkomplementierende, chimäre Hybridduplexe der Form d&sub4;r&sub4;d&sub4;). Die komplementären Stränge dieser Duplexnucleinsäuren waren nicht kovalent an einander gebunden; sie waren nur durch Watson-Crick-Paarung verbunden.
Eine zweite Gruppe von Wissenschaftlern, die chimäre Nucleinsäuren synthetisiert haben, ist die der an der Untersuchung und Verwendung von Ribozymen Interessierten, d. h. RNA-Moleküle, die sich entweder selbst spalten oder andere RNA spalten; Perreault, J. P., et al., 1990, Nature 344 : 565; Taylor, N. R., et al., 1992, Nucleic Acids Research 20 : 4559-65; Shimaya, T., 1993, Nucleic Acids Research-21 : 2605. Aus diesen Forschungen ist gefunden worden, daß chimäre Ribozyme aktiv sind und gegenüber einem Nucleaseverdau beständiger als RNA-Ribozyme sind. Chimäre Ribozyme sind selbstkomplementär, d. h. die Watson- Crick-gepaarten Stränge sind kovalent verknüpft. Die während der Untersuchungen chimärer Ribozyme synthetisierten Verbindungen unterscheiden sich darin von den vorstehend erwähnten Hybridduplexmolekülen, die synthetisiert und zu Strukturuntersuchungen verwendet wurden, daß chimäre Ribozyme keine stabilen Hybridduplexe enthalten. So bindet ein chimäres Ribozym mit DNA-Bindungsarmen an sein Substrat und bildet einen Hybridduplex; Yang, J. H., et al., 1990, Biochemistry 29 : 11156-60; siehe auch Sawata, 5., et al., 1993, Nucleic Acids Research 21 : 5656-60; Hendry, P., et al., 1992, Nucleic Acids Research 20 : 5737-41; Shimayama, T., 1993, Nucleic Acids Research 21 : 2605. Das Ribozym katalysiert die Spaltung des RNA-Substrats und der Hybridduplex wird auf diese Weise aufgelöst:
Der Ersatz von 2'-OH-Ribonucleotiden in einem Ribozym durch 2'- Methoxy- und 2'-Allyloxyribonucleotide wird von Paolella, G., et al., 1992, The EMBO Journal 11: 13-1919, beschrieben.

2.2. ORTSGERICHTETE GENETISCHE-VERÄNDERUNG BEI EUKARYOTISCHEN ZELLEN.

Der Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie erkennt, daß häufig nicht nur gewünscht wird, eine neue Polynucleinsäuresequenz, d. h. ein neues Gen, in eine eukaryotische Zielzelle einzuführen, sondern vielmehr ein definiertes, bereits vorhandenes Gen in der Zielzelle zu verändern. Die Zielzelle kann in Kultur verwendet werden oder sie kann zum Aufbauen eines transgenen Tiers verwendet werden.
Eine breite Vielfalt von Techniken ist zum Einführen von DNA in kultivierte eukaryotische Zellen entwickelt worden. Diese Techniken schließen die Calciumphosphatfällung und DEAE-Dextranvermittelte Endozytose, Elektroporation, Liposomen-vermittelte Fusionierung und Transduktion mit replikationsinkompetenten Viren ein. Obschon derartige Techniken sehr oft funktionelle Gene in die eukaryotische Zelle einführen können, bewirken diese Techniken jedoch nicht leicht eine Veränderung (Mutation) in einem speziellen bestehenden Gen. Nach der Einführung wird die exogene DNA an einer zufälligen Stelle im Genom der Zelle durch irreguläre Rekombination, statt an einer speziellen Position durch homologe Rekombination isoliert.
Bis heute gibt es kein allgemein befriedigendes Schema zum Einführen einer ortsgerichteten oder ortsspezifischen genetischen Veränderung (Mutagenese) in einem höheren Eukaryoten, d. h. in Säuger- oder Vogelzellen. Die WO93/16177 an J. G. Seidman beschreibt Techniken zur Anwendung der homologen Rekombination zum Einführen von DNA in eine eukaryotische Zelle unter dem speziellen Umstand, daß die DNA einen selektierbaren Marker enthält. Obschon eine homologe Rekombination in höheren eukaryotischen Zellen durch die Einführung sehr langer (> 1 kb) Nucleinsäuren erhalten werden kann, erfordern diese Techniken die Anwendung sorgfältig ausgearbeiteter Selektionstechniken, da die Rate einer irregulären Rekombination bei höheren Eukaryoten die einer homologen Rekombination stark übersteigt; Thomas, K. R. & Capecchi, M. R., 1987, Cell 52: 503; siehe auch Valancius, V. & Smithies O., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 4389 (Vergleich der homologen Rekombination linearisierter und supergeknäulter Plasmide in eukaryotischen Zellen).
Ein Weg zum Erzielen einer vorwiegend ortsgerichteten Mutagenese ist die Einführung einzelsträngiger Oligodesoxynucleotide direkt in die Zelle. Diese Techniken sind bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae, bei der die homologe Rekombination bedeutend aktiver als bei höheren Eukaryoten ist, erfolgreich eingesetzt worden; Moerschell, R. P., et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85 : 524-28; Yamamoto, T., et al., 1992, Yeast 8: 935- 48. Bis heute gibt es jedoch keine Berichte über die erfolgreiche Transformation von Säuger- oder Vogelzellen durch einzelsträngige Oligonucleotide.
Eine Beziehung zwischen der Struktur der Ziel-DNA und der Rate der homologen Rekombination in Säugerzellen kann aus Untersuchungen abgeleitet werden, die zeigen, daß Regionen sich abwechselnder Purin- und Pyrimidinbasen, d. h. [d(TG)&sub3;&sub0;·d(AC)&sub3;&sub0;], eine erhöhte Rekombinationsrate zeigen. Diese Effekte wurden bei Untersuchungen nicht-replizierender Plasmide in kultivierten Säugerzellen gezeigt; Wahls, W. P., et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10: 785-93. Diese Versuche wurden nicht darauf ausgedehnt, die Rekombination zwischen einer exogenen Nucleinsäure und dem Genom der Zelle zu zeigen.
Es sind Versuche unternommen worden, RecA, ein Protein, das die homologe Rekombination im Bakterium E. coli fördert, zum Fördern der homologen Rekombination in eukaryotischen Zellen zu verwenden. Diese Versuche sind jedoch nicht eindeutig erfolgreich gewesen. Zum Beispiel offenbart das US-Patent Nr. 4 950 599 nach W. Bertling eine sehr niedrige Rate der ortsgerichteten Mutation und keine Erhöhung der Rate der homologen Rekombi nation durch die Verwendung von RecA in eukaryotischen Zellen. Die Patentveröffentlichung WO9.3/22443 an D. Zarling und E. Sena und die Veröffentlichung 94/04032 an D. C. Gruenert und K. Kunzelmann geben beide vor, einen genetischen Defekt bei einer kultivierten Zellinie, die mit zystischer Fibrose in Zusammenhang steht, zu korrigieren. Diese Veröffentlichungen offenbaren hauptsächlich Versuchsdaten, die das Prinzip zeigen, statt vielmehr Daten, die Beispiele von Arbeitsverfahren betreffen. So setzen zum Einführen eines Zuganges von Polynucleotid/RecA- Komplexen zum Kern Zarling und Gruenert Zellen ein, die membrandurchlässig waren, obschon derartige Zellen zu weiterem Wachstum unfähig sind. Selbst wenn weiter bewiesen wurde, daß in unversehrten Zellen eine RecA-geförderte homologe Rekombination stattgefunden hatte, liefern diese Veröffentlichungen keine quantitativen Abschätzungen ihrer Häufigkeit. Somit ist von der Verwendung von prokaryotem RecA nicht überzeugend gezeigt worden, daß sie zu einer Rate der homologen Rekombination in irgendeiner lebensfähigen eukaryotischen Zelle führt, die bedeutend größer als die Spontanrate der homologen Rekombination ist.

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt eine gemischte Ribodesoxynucleinsäure mit höchstens einem 3'-Ende und einem 5'-Ende bereit, wobei die Nucleinsäure weiter
a) wenigstens eine Region benachbarter, ungepaarter Basen, die so angeordnet sind, daß die ungepaarte Region die Nucleinsäure in einen ersten Strang und einen zweiten Strang teilt, die durch die Region der benachbarten, ungepaarten Basen verbunden sind, und
b) wenigstens eine Region Watson-Crick-gepäarter Nucleinsäure mit einer Länge von wenigstens 15 Basenpaaren umfaßt, wobei die Basen des ersten Stranges Basen des zweiten Stranges entsprechen, wobei
c) der erste Strang eine Region von wenigstens drei benachbarten, ribosehaltigen Basen umfaßt, die innerhalb der Re gion der Watson-Crick-gepaarten Nucleinsäure einen Hybridduplex bilden.
Eine derartige gemischte Ribodesoxynucleinsäure, die weiter zwei mit einer Zielsequenz homologe Regionen und eine heterologe Region umfaßt, die dazwischen angeordnet ist und die Änderung kodiert, kann zum Einführen einer vorbestimmten Änderung in eine Zielsequenz des Genoms einer kultivierten Zelle, wobei die Zelle einen Kern enthält, bei einem Verfahren verwendet werden, das das Erhalten der gemischten Ribodesoxynucleinsäure innerhalb des Kerns der kultivierten Zelle umfaßt, wodurch die Änderung in die Zielsequenz eingeführt wird. Es kann eine kultivierte Zelle mit veränderten Eigenschaften selektiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine Verbindung zum Einführen einer vorbestimmten Änderung in ein Zielgen bereit, wobei die Verbindung eine gemischte Desoxyribonucleinsäure mit einem ersten Strang und einem zweiten Strang ist, wobei der erste Strang
a) eine erste homologe Region und eine zweite homologe Region, deren Länge zusammen 20 bis 60 Nucleotide beträgt, wobei die Regionen mit dem Zielgen homolog sind und mit dem zweiten Strang einen Duplex bilden, wobei jede homologe Region des ersten Strangs einen Abschnitt von wenigstens 4 benachbarten Nucleotiden umfaßt, die einen Hybridduplex mit Desoxynucleotiden des zweiten Stranges bilden, und
b) eine heterologe Region umfaßt, die zwischen der ersten und zweiten homologen Region angeordnet ist und deren Länge 1 bis 20 Nucleotide beträgt, die mit dem Zielgen heterolog ist und die die vorbestimmte Änderung enthält, wobei
das Zielgen ein Gen einer eukaryotischen Zelle ist, die eine andere als die einer Hefe oder eines Pilzes ist.
Eine derartige gemischte Ribodesoxynucleinsäure kann zum Einführen einer vorbestimmten Änderung in eine Zielsequenz des Genoms einer anderen kultivierten Zeile als eine Hefe oder ein Pilz, wobei die Zelle einen Kern enthält, bei einem Verfahren verwendet werden, das das Erhalten der gemischten Ribodesoxynucleinsäure innerhalb des Kerns der kultivierten Zelle umfaßt, wodurch die Änderung in die Zielsequenz eingeführt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Verbindung zum Einführen einer vorbestimmten Änderung in ein Zielgen bereit, wobei die Verbindung eine gemischte Ribodesoxynucleinsäure mit höchstens einem 3'-Ende und einem 5'-Ende ist und die Nucleinsäure weiter
a) wenigstens eine Region benachbarter, ungepaarter Basen, die so angeordnet sind, daß die ungepaarte Region die Nucleinsäure in einen ersten Strang und einen zweiten Strang trennt, die durch die besagte Region aus benachbarten, ungepaarten Basen verbunden sind, und
b) wenigstens eine Region Watson-Crick-gepaarter Nucleinsäure mit einer Länge von wenigstens 15 Basenpaaren umfaßt, wobei Basen des ersten Stranges Basen des zweiten Stranges entsprechen und wobei
c) der zweite Strang eine Region von wenigstens neun Desoxyribonucleotiden umfaßt, die mit Nucleotiden des ersten Stranges einen Hybridduplex bilden, und
d) die 5'- und 3'-Enden mit angrenzenden Basen eines komplementären Stranges Watson-Crick-gepaarter Nucleinsäure Watson-Crick-gepaart sind.
Diese Verbindung kann zum Einführen einer vorbestimmten Änderung in eine Zielsequenz des Genoms einer kultivierten Zelle, wobei die Zelle einen Kern enthält, durch Erhalten der besagten gemischten Ribodesoxynucleinsäure innerhalb des Kerns der kul tivierten Zelle verwendet werden, wodurch die Änderung in die Zielsequenz eingeführt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft einzelne; kovalent verknüpfte Duplexoligonucleotide, die mit einem interessierenden Gen homolog sind, das sowohl Desoxyribonucleotide als auch Ribonucleotide aufweist. Zum Bewirken einer genetischen Änderung gibt es innerhalb der homologen Region ein oder mehr nichtkorrespondierende (hierin nachstehend "heterologe" oder "Mutator-") Basenpaare. Die normalen, grundlegenden Zellvorgänge homologer Rekombinanten bewirken, daß die Mutatornucleotide in die Zielgenomstelle inseriert werden. Die Duplexoligonucleotide der Erfindung (hierin nachstehend chimäre Vektoren) können zum spezifischen Verändern eines interessierenden Gens durch Einführen der heterologen Basenpaare in das Gen verwendet werden. Die heterologen Basenpaare können zu dem Gen von Interesse verschiedene Basenpaare oder Basenpaare außer den in dem Gen von Interesse vorhandenen sein (eine Insertion) oder schließlich können die heterologen Basenpaare die Abwesenheit in dem Gen von Interesse angetroffener Basenpaare sein (eine Deletion). Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf dem Befund, daß der Einschluß einer Region von zwischen etwa 15 und 50 Basenpaaren einer Hybridduplex-Nucleinsäure in den Vektor eine stark erhöhte Änderungsrate bei dem Gen von Interesse verursacht. Wenn die Region der heterologen Basenpaare zwischen 1 und 50 Basenpaaren ist, können die heterologen Basenpaare in den Vektoren der Erfindung entweder als ein Homo- oder ein Hybridduplex vorliegen. Wenn die heterologen Basenpaare in der Länge größer als 50 Basenpaare sind, ist es bevorzugt, daß sie als Homoduplex vorliegen.
Der Vektor kann durch jedes Verfahren, von dem bekannt ist, daß es die Einführung von Nucleinsäuren in eukaryotische Zellen erlaubt, in die Zielzelle eingeführt werden. Ohne Einschränkung was die Theorie betrifft wird von dem chimären Vektor angenommen, daß er an dem Mechanismus der Rekombination/erneuten Paarung (Reparatur) der Zielzelle beteiligt ist und die Änderung des Zielgens durch Genumwandlung oder durch homologe Rekombination steuert.

4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt die schematische Darstellung zweier chimärer Vektoren. Die folgenden sind besonders bezeichnet: 1, ein erster Strang; 2, ein zweiter Strang; 3, eine heterologe Region; 4, eine homologe Region; 5, ein Linker; 6, eine Ligationsstelle. Symbolschlüssel für Fig. 1
Fig. 1A ist ein ligierter chimärer Vektor in der R-D-R-Form.
Fig. 1B ist ein chimärer Haarnadelvektor in der R-D-R-Form mit einem einzelnen 3'- und 5'-Ende.

5. GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

5. 1. BESCHREIBUNG DER CHIMÄREN VEKTOREN DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfaßt Duplexnucleinsäuren, die sowohl Desoxyribose als auch Ribose enthaltende Basen enthalten. Somit enthalten sie sowohl DNA- als auch RNA-Regionen und werden daher als "chimäre Vektoren" bezeichnet. Das 2' -O der Ribonucleotide des chimären Vektors kann methyliert sein. Jeder Phosphodiester kann durch einen Phosphorothiodiester oder Methylphosphonodiester ersetzt sein.
Die chimären Vektoren der Erfindung sind ein einzelnes Nucleinsäurepolymer. Dementsprechend müssen die chimären Vektoren der Erfindung wenigstens eine Region zwischen wenigstens 1 Base und gebräuchlicher 3 oder 4 Basen enthalten, die nicht Watson- Crick-gepaart ist. Diese ungepaarten Regionen dienen als Ver knüpfungsgruppe zwischen den beiden Strängen Watson-Crickgepaarter Basen. Im Gegensatz zu anderen chimären Nucleotiden mit Regionen ungepaarter Nucleotide; die synthetisiert worden sind, weisen chimäre Vektoren keine enzymatische Aktivität auf, d. h. sie katalysieren chemische Reaktionen nicht oder gehen in Abwesenheit einer biologischen Energiequelle wie etwa ATP selbst keine chemischen Reaktionen ein.
Die Basen der Verknüpfungsgruppen sind in der bevorzugten Ausführungsform Desoxyribonucleotide. Ein chimärer Vektor mit zwei Verknüpfungsgruppen kann so aufgebaut werden, daß die 3'- und 5'-Enden des Polymers mit benachbarten Nucleotiden des komplementären Stranges Watson-Crick-gepaart sind. Sie können anschließend leicht ligiert werden, so daß der chimäre Vektor ein einzelnes, ununterbrochenes, kreisförmiges Nucleinsäurepolymer bildet.
Im wesentlichen alle restlichen Basen des chimären Vektors sind Watson-Crick-gepaart. Hierin verwendet ist die Aussage, daß Basen Watson-Crick-gepaart sind oder daß sie eine Duplexnucleinsäure bilden, so zu verstehen, daß sie unter passenden Temperatur- und Salzbedingungen Basenpaare oder eine Duplexnucleinsäure bilden können. Es versteht sich, daß unter einigen Bedingungen von wenig Salz und/oder erhöhter Temperatur die Watson- Crick-Basenpaare aufhören können, thermodynamisch stabil zu sein, so daß die Duplexnucleinsäure ausschmilzt oder denaturiert. Es versteht sich ferner, daß die Fehlpaarung eines oder zweier Basenpaare die Ausführbarkeit der Erfindung nicht beeinflußt.
Die chimären Vektoren der vorliegenden Erfindung sind für den Zweck des spezifischen Einführens von Änderungen (eine Mutation) in ein Zielgen vorgesehen. Die genetische Stelle der Änderung wird durch Auswählen eines Teils des chimären Vektors bestimmt, damit er dieselbe Sequenz wie die Sequenz der hierin nachstehend als eine homologe Region bezeichnete Zielstelle aufweist (dazu homolog ist). Das Gebiet der Unterschiede zwi schen der Sequenz des chimären. Vektors und des Zielgens wird als heterologe Region bezeichnet. Es ist anzumerken, daß der chimäre Vektor zu dem Zielgen heterolog ist, aber in dieser Region des Vektors kein Heteroduplex ist. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gibt es zwei homologe Regionen in jedem die dazwischen angeordnete heterologe Region flankierenden chimären Vektor, wobei alle drei Regionen in einer einzelnen ununterbrochenen Duplexnucleinsäure vorliegen. Weiter enthält gemäß der Erfindung jede homologe Region einen Teil einer Hybridduplex-Nucleinsäure. Der Teil jedes Hybridduplexes kann wenigstens 4 Basenpaare sein und ist vorzugsweise 8 Basenpaare und bevorzugter etwa 20 bis 30 Basenpaare. Die Funktion des chimären Vektors wird durch ein Dinucleotid-Basenpaar eines Homoduplex innerhalb einer Hybridduplexregion, die so angeordnet ist, daß sie die Ligation der 3'- und 5'-Enden mit einander erlaubt, nicht beeinflußt. Die Gesamtlänge der zwei homologen Regionen kann wenigstens 20 Basenpaare sein und ist vorzugsweise zwischen 40 und 60 Basenpaare.
Gemäß der Erfindung kann zwischen den Hybridduplex-/homologen Regionen des Vektors eine Homoduplex-Nucleinsäure-Region angeordnet sein. Der dazwischen angeordnete Homoduplex kann die heterologe Region enthalten. Wenn die heterologe Region weniger als etwa 50 Basenpaare und vorzugsweise weniger als etwa 20 Basenpaare aufweist, ist die Anwesenheit einer dazwischen angeordneten Homoduplexregion wahlfrei. Wenn die heterologe Region etwa 20 Basenpaare überschreitet, ist ein dazwischen angeordneter Homoduplex, der die heterologe Region enthält, bevorzugt.

5.2. AUFBAU DER CHIMÄREN VEKTOREN DER ERFINDUNG

Die chimären Vektoren der Erfindung können durch irgendein Verfahren synthetisiert werden. Die chimären Vektoren können am leichtesten durch eine Abänderung der bei der Festphasensynthese von DNA verwendeten Techniken synthetisiert werden; Übersicht von Caruthers, M. H., 1985, Science 230 : 281-85; Itakura, K., et al., 1984, Ann. Rev. Biochem. 53 : 523-56. Änderungen, um die Synthese von RNA und chimären Nucleinsäuren zu erlauben, werden bei Scaringe, S. A., et al., 1990, Nucleic Acids Research 18 : 5433-41; Usman, N., et al., 1992, Nucleic Acids Research 20 : 6695-99, und Swiderski, P. M. et al., 1994, Anal. Biochem. 216 : 83-88, offenbart. Über kürzliche, die Synthese chimärer Nucleinsäuren betreffende Fortschritte geben Usman, N. & Cedergren, R., 1992, Trends Bioch. Sci. 17 : 334-9, einen Überblick.
Chimäre Vektoren mit einer zwischen zwei Hybridduplexregionen angeordneten Homoduplexregion können mittels halbsynthetischer Techniken aufgebaut werden. Zwei synthetische chimäre Polynucleinsäuren mit einer Haarnadelkonformation müssen aufgebaut werden. Die freien 5'- und 3'-Enden der beiden chimären Nucleinsäuren werden mit einer Überlappung versetzter Enden aufgebaut, die zu der Überlappung von zwei unterschiedlichen Produkten des Restriktionsenzymverdaus komplementär sind. Eine Homoduplexregion mit den komplementären, restriktionsenzymverdauten Enden wird bereitgestellt. Das Anfügen einer Restriktionsenzymstelle an die Enden eines klonierten DNA-Fragments kann durch Techniken bewerkstelligt werden, die vom Fachmann wohlverstanden werden, z. B. ohne Einschränkung die PCR-Verstärkung mit verlängerten Primern oder die Ligation die Restriktionsstelle enthaltender Linker mit einem stumpfen Ende. Die beiden chimären Nucleotide und die Homoduplexregion können durch herkömmliche enzymatische Techniken ligiert werden. Das Produkt mit den an beide Enden ligierten chimären Oligonucleotiden kann von den unvollständig umgesetzten Substraten durch Elektrophorese in 6% Polyacrylamidgel in Tris-Borat-EDTA-Puffer unter nicht-denaturierenden Bedingungen getrennt werden. Die linearen, mit einer Endgruppe versehenen Moleküle sind starr und sind unter diesen Bedingungen bei der Elektrophorese langsamer.
Chimäre Vektoren, die nur natürlich vorkommende Nucleotide enthalten, können für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Von den chimären Vektoren mit Hybridduplexregionen aus etwa 20 Ribonucleotiden wird gefunden, daß sie in vitro gegenüber RNAse H resistent sind. Eine Resistenz gegenüber dem enzymatischen Abbau kann durch den Ersatz der Ribonucleotide durch 2'-O- methylierte Ribonucleotide erhalten werden. Zusätzlich oder wahlweise können die Phosphodiesterbindungen der Nucleinsäure durch Phosphorothiodiester ersetzt, werden; Shimayama, T. et al., 1993, Nucleic Acids Research 21 : 2605. Arabinose enthaltende Nucleotide können ebenfalls verwendet werden. Hierin verwendet soll der Ausdruck Nucleinsäure Nucleinsäuren mit diesen Änderungen umfassen.

5.3. DIE VERWENDUNG DER CHIMÄREN VEKTOREN DER ERFINDUNG

Die chimären Vektoren der vorliegenden Erfindung können zum Einführen einer Mutation in einen speziellen Ort im Genom einer Zielzelle verwendet werden. Der spezifische Ort des Zielortes ist durch seine Nucleinsäuresequenz, hierin nachstehend die Zielsequenz, definiert. Gemäß der Erfindung wird ein chimärer Vektor aufgebaut, bei dem außer der Anwesenheit einiger Hybridduplexregionen die Homologieregionen mit der Zielsequenz identisch sind. Die einzuführende Änderung wird durch die heterologe Region kodiert. Die Änderung kann eine Änderung bei einer oder mehr Basen der Sequenz oder das Anfügen einer oder mehr Basen sein. Wenn die Änderung bei der Zielsequenz das Anfügen von weniger als etwa 20 Basen ist, kann die Erfindung durch Verwenden einer oder zweier Hybridduplexregionen ausgeführt werden. Wenn die Änderung bei der Zielsequenz das Anfügen von mehr als etwa 50 Basen ist, ist es bevorzugt, daß die heterologe Region innerhalb einer Homoduplexregion enthalten ist.
Die Ausführung der Erfindung erfordert, daß der chimäre Vektor in den Kern der Zielzelle eingeführt wird. Jedes Verfahren, daß eine derartige Einführung bewirkt, kann verwendet werden. Derartige Verfahren schließen die Elektroporation, DEAE-Dextran, CaPO&sub4;-Fällung, Liposomen-vermittelte Fusion (LIPOFECTIN, Warenzeichen) und die direkte Injektion ein. Die Elektroporation ist besonders geeignet.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann der chimäre Vektor zum Aufbauen transgener Tiere verwendet werden. Der chimäre Vektor kann durch direkte Injektion gemäß dem bei Brinster, R. L. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86 : 7087, beschriebenen Verfahren in den Vorkern eines Eis eingeführt werden; siehe auch US-Patent Nr. 4 87 3 191 von T. E. Wagner und P. C. Hoppe. Wahlweise kann der chimäre Vektor. in eine embryonale Stammzelle eingeführt werden, chimäre Tiere können durch Aggregation der embryonalen Stammzelle mit normalen Blastozytenzellen erzeugt werden und transgene Tiere können gemäß dem Verfahren von Capecchi, M. R., 1989, Science 244 : 1288, als Nachkommen der chimären Tiere erhalten werden.
Mittels Elektroporation können bis zu 1 Zelle je 10 000 behandelte Zellen spezifisch an der Zielsequenz mutiert (hierin nachstehend "transformiert") werden. Die Ausführung der Erfindung schließt somit die Verwendung eines Verfahrens zum Selektieren der transformierten Zellen aus der großen Zahl nicht mutierter Zellen ein. In einer Ausführungsform verleiht die Transformation der Zellen einen Wachstumsvorteil. Nichtbegrenzende Beispiele derartiger Wachstumsvorteile schließen eine Wirkstoffresistenz, Änderungen bei der Wachstumsregulierung und Änderungen bei der Fähigkeit, Metaboliten zu verwenden, ein. Bei einer alternativen Ausführungsform kann das Selektionsverfahren eine negative Selektion sein, bei der die transformierten Zellen unter den Selektionsbedingungen wachstumsunfähig gemacht werden und die nicht-transformierten Zellen durch Aussetzen gegenüber Bedingungen entfernt werden, bei denen sich vermehrende Zellen selektiv zerstört werden.
Wahlweise können die transformierten Zellen einen antigenen Phänotyp mit veränderter Zelloberfläche aufweisen, der durch Immunfluoreszenz nachgewiesen werden kann, und die Selektion kann durch einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierer ausgeführt werden.
Wenn das Verfahren zum Einführen des chimären Vektors in die Zelle die direkte Injektion ist, wie zum Beispiel, wenn transgene Tiere durch Vorkerninjektion aufgebaut werden, kann die Transformationsrate größer als 1 je 10 000 Zellen sein. Die Notwendigkeit einer Selektion wird dadurch beträchtlich verringert.
Typischerweise brauchbare Mengen eines chimären Vektors sind zwischen 10 und 1000 ng chimärer Vektor je Million durch Elektroporation zu transformierende kultivierte Zellen.

6. BEISPIELE

6.1. Beispiel 1: In-vivo-Aktivität im Pilz Ustilago

Ustilago vom Wildtyp weist ein funktionierendes ura-3-Gen auf, dessen Produkt Teil des Uracil-Biosysntheseweges ist. Wenn Ustilago vom Wildtyp auf 5'-Fluororotsäuremedium (5FOA) angezüchtet wird; sterben die Zellen aufgrund des Einbaus der Säure in den Weg. Falls das ura-3-Gen mutiert ist, so daß keine ura-3- mRNA produziert wird, überleben die Zellen auf dem 5FOA-Medium. Die Sequenz des endogenen ura-3-Gens ist in der Technik bekannt. Bei einem Satz Versuche wurde Base 358 der Sequenz von einem Thymidin zu einem Adenin geändert, wobei die Mutation zu einem dysfunktionellen Protein führt.
Ein chimärer Vektor wurde wie folgt synthetisiert: Vektor zur Mutation an Base 358: (358-RNA-Vektor)
5' TGCCGATCGGCAACTTTGUUGCCGAUCGGCAAATTT 3' (SEQ. ID.: 1)
Der 358-Vektor nimmt Haarnadelkonformationen an. Die unterstrichenen Basen zeigen Ribonucleinsäurereste an. Die fett hervorgehobenen Buchstaben zeigen den Mutator (heterologe Region) an. Die kursiven "T" zeigen die ungepaarten Basen an.
Ein Vektor mit derselben Sequenz, der aber keine Ribonucleinsäuren enthält, wurde zur Verwendung als Kontrolle ebenfalls aufgebaut. In dem Vektor war Uracil durch Thymidin ersetzt.
Der Kontrollvektor zur Mutatioit an Base 358': (DNA-358-Vektor)
5' TGCCGATCGGCAACTITTGTTGCCGATGGGCAAATfT 3' (SEQ. ID.: 2) nimmt ebenfalls eine Haarnadelkpnfugüration an. Erneut ist der fett hervorgehobene Rest der Mutator.
Es wurde ein Transformationsversuch in vivo durchgeführt, bei dem U. maydis-Zellen (10&sup7;) mit einer Ausbeute von 10&sup6; Zellen in 50 ul einer Transformationspufferlösung zu Protoplasten gemacht wurden, indem in der Technik wohlbekannten Reaktionen gefolgt wurde, und mit unterschiedlichen Mengen der chimären Vektoren transfiziert wurden oder es wurde homogener (nur DNA) Vektor bei 37ºC mit den Protoplasten gemischt. Die Zellen wurden anschließend auf selektivem Medium ausplattiert und die Zahl der überlebenden Kolonien (Transformanten) wurde gezählt. Die Ergebnisse werden nachstehend in Tabellenform dargestellt:
Diese Daten zeigen, daß die Transfizierung von Zellen mit dem RNA-358-Vektor das Überleben der Zellen mit einer viel größeren Rate als die Transfizierung mit dem entsprechenden DNA-Vektor erhöht.

6.2. Beispiel 2: Transformation von NIH-3T3-Zellen

NIH-3T3-Zellen sind humane Zellen, die die Eigenschaft eines benignen (kontrollierten) Wachstums aufweisen. Eigenschaften eines malignen (unkontrollierten) Wachstums werden durch die Einzelpunktmutation in dem Onkogen H-ras verliehen, das Gly¹² durch Thr ersetzt. Somit führt dTh Mutation G→T¹² zu einer leicht selektierbaren Änderung beiden Wachstumseigenschaften; Taparowsky, E. et al., 1982, Nature 300 : 762; Sukumar S., et al., 1983, Nature 306 : 658.
Chimäre Vektoren wurden zum Steuern der G→T12-Mutation mit der folgenden Sequenz aufgebaut:
5'-CACACCGACGGCGCCCACCACTTTGTGGTGGGCGCCGTCGGTGTGGGTTTGCC-3'
(SEQ. ID.: 3)
Die Sequenz wird als herkömmlicher Einbuchstabenkode mit den zusätzlichen Merkmalen dargestellt, daß die RNA unterstrichen, die ungepaarten Basen kursiv und die Mutatorbase fett ist. Es ist anzumerken, daß der chimäre Vektor nach der Zirkularisierung durch die beiden Trithymidinylsequenzen in zwei im wesentlichen komplementäre Stränge geteilt wird und daß alle ribosehaltigen Nucleotide nur in einem der beiden Stränge vorliegen.
Zwei Formen des chimären Vektors wurden unter Verwenden von 2'- OMe-Ribosebasen mit einer ("R") beziehungsweise zwei ("R-D-R") Hybridduplexregionen synthetisiert, die vier Desoxyribosereste flankieren. Die R-D-R-Form wird vorstehend dargestellt, SEQ. ID.: 3, die R-Form ist identisch, außer daß die Basen 6-9 ("CGAC") Desoxynucleotide waren. Es ist anzumerken, daß die 5'- und 3'-Termini Desoxynucleotide sind. Dies erlaubt den chimären Vektoren nach der Synthese durch die Verwendung derselben DNA- Ligaseverfahren, wie sie gemeinhin bei rekombinanter DNA eingesetzt werden, zirkularisiert zu werden. Nach der Ligation wurden die zirkularisierten chimären Vektoren durch zwei Iterationen der präparativen Elektrophorese in D600-Gel (AT Biochem, Malvern, PA) aus dem Substrat isoliert.
Die Kontrollvektoren waren: 1) dieselbe Sequenz, der der Hybridduphex fehlt (als "Homoduplex" dargestellte Daten); 2) die ungepaarte DNA (als "sDNA" dargestellte Daten) mit der Sequenz 5'-GCCCACACCGACGGCGCCACCAC-3SEQ. ID. 4); 3) der chimäre Vektor ohne heterologe Region und somit ohne Mutatornucleotid (Daten nicht dargestellt).
Der Versuch wurde durch Transformieren von NIH-3T3-Zellen (1 · 10&sup6; Zellen) mittels eines Elektroporationsverfahrens ausgeführt. Nach der Elektroporation wurden die Zellen bei einer Einsaatdichte von 4 · 10³ Zellen/cm² ausplattiert und 14 Tage in Kultur wachsen lassen. Transformanten wurden durch Anfärben herdbildender Zellen mit Kristallviolett sichtbar gemacht. Als positive Kontrolle wurde das Plasmid pT24 eingesetzt, das die T12-Form von H ras kodiert. Diese Kontrolle wurde dazu verwendet, den Wert der irregulären Rekombination bei den transfizierten NIH-3T3-Zellen zu bestimmen. Der Versuch wurde fünf Mal wiederholt und eine Zusammenfassung der Ergebnisse wird nachstehend in Tabellenform dargestellt. Außer den nachstehend dargestellten Ergebnissen zeigten die Kontrollversuche, bei denen ein chimärer Vektor ohne Mutatorkodon verwendet wurde, keine transformierten Herde von NIH-3T3-Zellen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die chimären Vektoren durch homologe Rekombination eine spezifische Mutation einführten, um so Säugerzellen zu transformieren. Die Transformationsrate war bei diesem Versuch größer als die Transformationsrate bei der irregulären Rekombination, die durch Transfizierung mit pT24- positivem Kontrollvektor beobachtet wurde, der ein ganzes, mutiertes H-ras-Gen enthielt. Auf diese Weise wurde durch Verwendung chimärer Vektoren in eine Säugerzelle eine Rate der homologen Rekombination erzielt, die größer als die Rate der irregulären Rekombination war.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) AN MELDER: Kmiec, Eric
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Verbindungen und Verfahren für ortsgerichtete Mutationen in eukaryotischen Zellen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADDRESSAT: Pennie & Edmonds
(B) STRASSE: 1155 Avenue of the Americas
(C) STADT: New York
(D) STAAT: NY
(F) POSTLEITZAHL: 10036-2711
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIENTYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1,25
(vi) ALLGEMEINE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) ANWALTS-/VERTRETERDATEN:
(A) NAME: Friebel, Thomas E.
(B) REGISTRIERNUMMER: 29,258
(C) REFERENZ-/AKTEUNUMMER: 7991-009
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: (212) 790 = 9090
(B) TELEFAX: (212) 869-8864/9741
(2) INFORMATION ZU SEQ. ID. NR.: 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 37 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: selbstkomplementär
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA/RNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL:-
(B) ORT: 19..32
(D) WEITERE INFORMATION: /Markierung = a
/Anmerkung = "RNA"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR.: 1:
TGCCGATCGG CAACTTTTGU UGCCGAUCGG CAAATTT 37

(2) INFORMATION ZU SEQ. ID. NR.: 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 37 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: selbstkomplementär
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR.: 2:
TGCCGATCGG CAACTTTTGT TGCCGATCGG CAAATTT 37
(2) INFORMATION ZU SEQ. ID. NR.: 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 53 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: selbstkomplementär
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA/RNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: -
(B) ORT: 2..5
(D) WEITERE INFORMATION: /Markierung = b /Anmerkung = "RNA"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL:
(B) ORT: 10..21
(D) WEITERE INFORMATION: /Markierung = d /Anmerkung = "RNA"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL:
(B) ORT: 51..52
(D) WEITERE INFORMATION: /Markierung = f /Anmerkung = "RNAº
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR.: 3:
CACACCGACG GCGCCCACCA CTTTGTGGTG GGCCCGTCG GTGTGGGTTT GCC 53
(2) INFORMATION ZU SEQ. ID. NR.: 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: selbstkomplementär
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. ID. NR.: 4:
GCCCACCCG ACGCCCC CAC 23

Claims

1. Gemischte Ribo-Desoxyribonucleinsäure mit höchstens einem 3'-Ende und einem 5'-Ende, wobei die Nucleinsäure weiter

a) wenigstens eine Region benachbarter, ungepaarter Basen, die so angeordnet sind, daß die ungepaarte Region die Nucleinsäure in einen ersten Strang und einen zweiten Strang teilt, die durch die Region der benachbarten, ungepaarten Basen verbunden sind, und

b) wenigstens eine Region Watson-Crick-gepaarter Nucleinsäure mit einer Länge von wenigstens 15 Hasenpaaren umfaßt, wobei die Basen des ersten Stranges mit Basen des zweiten Stranges korrespondieren, wobei

c) der erste Strang eine Region von wenigstens drei benachbarten, ribosehaltigen Basen umfaßt, die innerhalb der Region der Watson-Crick-gepaarten Nucleinsäure einen Hybridduplex bilden.

2. Nucleinsäure des Anspruchs 1, wobei der zweite Strang keine ribosehaltigen Basen enthält.

3. Nucleinsäure des Anspruchs 1 oder Anspruchs 2, wobei die ribosehaltigen Basen 2'-O -methylierte Ribonucleotide sind und/oder die ein Phosphorthioat umfaßt, das einen Phosphodiester ersetzt und/oder die ein arabinosehaltiges Nucleotid umfaßt.

4. Nucleinsäure eines der Ansprüche 1-3, die zwischen 15 und 50 Hybridduplex-Basenpaare umfaßt.

5. Nucleinsäure wie in einem der Ansprüche 1-4 beansprucht, wobei das 5'- und 3'-Ende mit angrenzenden Basen eines komplementären Stranges in der Region der Watson-Crickgepaarten Nucleinsäure Watson-Crick-gepaart ist.

6. Nucleinsäure wie in einem der Ansprüche 1-5 beansprucht, wobei das 5'- und 3'-Ende mit angrenzenden Basen des ersten Stranges Watson-Crick-gepaart ist.

7. Nucleinsäure wie in einem der Ansprüche 1-6 beansprucht, die weiter eine zweite Region benachbarter, ungepaarter Basen umfaßt, die so angeordnet sind, daß die ungepaarte Region die Nucleinsäure in einen ersten Strang und einen zweiten Strang teilt, die durch die zweite Region benachbarter, ungepaarter Basen verbunden sind.

8. Nucleinsäure wie in einem der Ansprüche 1-7 beansprucht, wobei der erste Strang zwei Regionen ribosehaltiger Basen umfaßt, die zwei Hybridduplexregionen bilden, wobei jede Hybridduplexregion eine Länge von wenigstens 8 Basenpaaren aufweist, und eine Zwischenregion von wenigstens 4 Basenpaaren eines Homoduplex umfaßt, die zwischen den Hybridduplexregionen angeordnet ist.

9. Nucleinsäure wie in einem der Ansprüche 1-8 beansprucht, wobei die Zwischenregion aus einem Homoduplex aus zwischen 4 und 50 2'-Desoxyribosebasenpaaren besteht.

10. Verfahren zum Einführen einer vorbestimmten Änderung in eine Zielsequenz des Genoms einer kultivierten Zelle, wobei die Zelle einen Kern enthält, das die Schritte des

a) Bereitstellens der in einem der Ansprüche 1-9 beanspruchten gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure, die weiter zwei mit einer Zielsequenz homologe Regionen und eine dazwischen angeordnete, die Änderung kodierende, heterologe Region umfaßt, und

b) Erhaltens der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure in dem Kern der kultivierten Zelle umfaßt,

wodurch die Änderung in die Zielsequenz eingeführt wird.

11. Verfahren von Anspruch 10, wobei der erste Strang der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure zwei Regionen benachbarter Nucleotide, die zwei Hybridduplexregionen bilden, wobei jede Hybridduplexregion eine Länge von wenigstens 4 Basenpaaren aufweist, und eine zwischen den Hybridduplexregionen angeordnete Region aus wenigstens 1 Basenpaar eines Homoduplex umfaßt, der die heterologe Region umfaßt.

12. Verfahren wie in Anspruch 10 oder Anspruch 11 beansprucht, wobei die Zelle eine andere als die einer Hefe oder eines Pilzes ist.

13. Verfahren wie in einem der Ansprüche 10-12 beansprucht, das weiter einen Schritt des Einführens der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure in den Kern durch die Verwendung eines Liposoms umfaßt.

14. Verfahren wie in Anspruch 10 oder Anspruch 11 beansprucht, wobei der Kern ein Vorkern eines Eis ist und der Vektor aus der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure durch Injektion in den Vorkern eingeführt wird.

15. Verfahren wie in Anspruch 10 oder Anspruch 11 beansprucht, wobei der Kern ein Kern einer embryonalen Stammzelle ist und die Einführung durch Verwendung eines Liposoms oder durch Elektroporation erfolgt.

16. Verfahren zum Erhalten einer kultivierten Zelle mit geänderten Eigenschaften, das die Schritte des

a) Bereitstellens der in einem der Ansprüche 1-9 beanspruchten gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure, die weiter zwei mit einer Zielsequenz homologe Regionen und eine dazwischen angeordnete, die Änderung kodierende, heterologe Region umfaßt,

b) Erhaltens der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure in dem Kern der kultivierten Zelle, wodurch die gemischte Nucleinsäure und die Zielsequenz rekombinieren und die Zelle verändert wird, und

c) Selektierens einer veränderten Zelle umfaßt.

17. Verfahren von Anspruch 16, wobei der erste Strang der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure zwei Regionen benachbarter Nucleotide, die zwei Hybridduplexregionen bilden, wobei jede Hybridduplexregion eine Länge von wenigstens 4 Basenpaaren aufweist, und eine dazwischen angeordnete Region aus wenigstens 1 Basenpaar eines zwischen den Hybridduplexregionen angeordneten Homoduplex aufweist, die die heterologe Region umfaßt.

18. Verfahren wie in Anspruch 16 oder Anspruch 17 beansprucht, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.

19. Verfahren wie in Anspruch 16 oder Anspruch 17 beansprucht, wobei die Zelle eine andere als die einer Hefe oder eines Pilzes ist.

20. Verfahren zum Einführen einer vorbestimmten Änderung in ein Zielgen des Genoms einer kultivierten, eukaryotischen Zelle, die eine andere als die einer Hefe oder eines Pilzes ist, wobei die Zelle einen Kern enthält und das Verfahren die Schritte des

a) Bereitstellens einer gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure mit einem ersten Strang und einem zweiten Strang, wobei der erste Strang

i. eine erste homologe Region und eine zweite homologe Region, die zusammen von einer Länge von 20 bis 60 Nucleotiden sind, die mit dem Zielgen homolog sind und mit dem zweiten Strang einen Duplex bilden, wobei jede homologe Region des ersten Stranges einen Abschnitt aus wenigstens 4 benachbarten Nucleotiden umfaßt, die mit Desoxynucleotiden des zweiten Stranges einen Hybridduplex bilden, und

ii. eine heterologe Region umfaßt, die zwischen der ersten und zweiten homologen Region angeordnet ist und von einer Länge von 1 bis 20 Nucleotiden ist, die mit dem Zielgen heterolog ist und die die vorbestimmte Änderung enthält, und

b) Erhaltens der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure in dem Kern der kultivierten Zelle umfaßt, wodurch die Änderung in das Zielgen eingeführt wird.

21. Verfahren des Anspruchs 20, wobei jedes einen Hybridduplex bildende Nucleotid des ersten Stranges eine ribosehaltige Base ist.

22. Verfahren des Anspruchs 20, wobei ein einen Hybridduplex bildendes Nucleotid des ersten Stranges 2'-O-methyliert ist.

23. Verfahren des Anspruchs 20, wobei jedes einen Hybridduplex bildende Nucleotid des ersten Stranges 2'-O-methyliert ist.

24. Verfahren wie in einem der Ansprüche 20-23 beansprucht, wobei die heterologe Region aus Desoxyribonucleotiden besteht.

25. Verfahren wie in einem der Ansprüche 20-24 beansprucht, wobei die Länge der heterologen Region ein Nucleotid beträgt.

26. Verfahren wie in einem der Ansprüche 20-25 beansprucht, wobei die Änderung eine Insertion oder Deletion im Zielgen ist.

27. Verbindung zum Einführen einer vorbestimmten Änderung in ein Zielgen, wobei die Verbindung eine gemischte Ribo- Desoxyribonucleinsäure zum Einführen einer vorbestimmten Änderung in ein Zielgen ist, das einen ersten Strang und einen zweiten Strang aufweist, wobei der erste Strang

a) eine erste homologe Region und eine zweite homologe Region, deren Länge zusammen 20 bis 60 Nucleotide beträgt, wobei die Regionen mit dem Zielgen homolog sind und mit dem zweiten Strang einen Duplex bilden, wobei jede homologe Region des ersten Strangs einen Abschnitt von wenigstens 4 benachbarten Nucleotiden umfaßt, die einen Hybridduplex mit Desoxynucleotiden des zweiten Stranges bilden, und

b) eine heterologe Region umfaßt, die zwischen der ersten und zweiten homologen Region angeordnet ist und deren Länge 1 bis 20 Nucleotide beträgt, die mit dem Zielgen heterolog ist und die die vorbestimmte Änderung enthält, wobei

das Zielgen ein Gen einer eukaryotischen Zelle ist, die eine andere als die einer Hefe oder eines Pilzes ist.

28. Gemischte Ribo-Desoxyribonucleinsäure des Anspruchs 27, wobei jedes einen Hybridduplex bildende Nucleotid des ersten Stranges eine ribosehaltige Base ist.

29. Gemischte Ribo-Desoxyribonucleinsäure des Anspruchs 27, wobei ein einen Hybridduplex bildendes Nucleotid des ersten Stranges 2'-O-methyliert ist.

30. Gemischte Ribo-Desoxyribonucleinsäure des Anspruchs 27, wobei jedes einen Hybridduplex bildende Nucleotid des ersten Stranges 2'-O-methyliert ist.

31. Gemischte Ribo-Desoxyribonucleinsäure wie in einem der Ansprüche 27-30 beansprucht, wobei die heterologe Region aus Desoxyribonucleotiden besteht.

32. Gemischte Ribo-Desoxyribonucleinsäure wie in einem der Ansprüche 27-31 beansprucht, wobei die Länge der heterologen Region ein Nucleotid beträgt.

33. Gemischte Ribo-Desoxyribonucleinsäure wie in einem der Ansprüche 27-32 beansprucht, wobei die heterologe Region eine Insertion oder Deletion des Zielgens enthält.

34. Verbindung zum Einführen einer vorbestimmten Änderung in ein Zielgen, wobei die Verbindung eine gemischte Ribo- Desoxyribonucleinsäure mit höchstens einem 3'-Ende und einem 5'-Ende ist und die Nucleinsäure weiter

a) wenigstens eine Region benachbarter, ungepaarter Basen, die so angeordnet sind, daß die ungepaarte Region die Nucleinsäure in einen ersten Strang und einen zweiten Strang trennt, die durch die Region aus benachbarten, ungepaarten Basen verbunden sind, und b) wenigstens eine Region Watson-Crick-gepaarter Nucleinsäure mit einer Länge von wenigstens 15 Basenpaaren umfaßt, wobei Basen des ersten Stranges Basen des zweiten Stranges entsprechen und wobei

c) der zweite Strang eine Region von wenigstens neun Desoxyribonucleotiden umfaßt, die mit Nucleotiden des ersten Stranges einen Hybridduplex bilden, und

d) die 5'- und 3'-Enden mit angrenzenden Basen eines komplementären Stranges Watson-Crick-gepaarter Nucleinsäure Watson-Crick-gepaart sind.

35. Nucleinsäure des Anspruchs 34, wobei der erste Strang ein 2'-0-methyliertes Ribonucleotid umfaßt.

36. Nucleinsäure von Anspruch 34, die wenigstens neun benachbarte Hybridduplex-Basenpaare umfaßt.

37. Nucleinsäure wie in einem der Ansprüche 34-36 beansprucht, wobei der zweite Strang die 5'- und 3'-Enden umfaßt.

38. Nucleinsäure wie in einem der Ansprüche 34-37 beansprucht, die wenigstens fünfzehn Hybridduplex-Basenpaare umfaßt.

39. Nucleinsäure wie in einem der Ansprüche 34-38 beansprucht, wobei der erste Strang zwei Regionen benachbarter, die zwei Hybridduplexregionen bilden, wobei jede Hybridduplexregion eine Länge von wenigstens 4 Basenpaaren aufweist, und eine zwischen den Hybridduplexregionen angeordnete Zwischenregion aus wenigstens 1 Basenpaar eines Homoduplex umfaßt.

40. Verfahren zum Einführen einer vorbestimmten Änderung in eine Zielsequenz des Genoms einer kultivierten Zelle, wobei die Zelle einen Kern enthält, das die Schritte des

a) Bereitstellens der in einem der Ansprüche 33-38 beanspruchten, gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure, die weiter zwei mit einer Zielsequenz homologe Regionen und eine dazwischen angeordnete, die Änderung kodierende heterologe Region umfaßt, und

wodurch die Änderung in die Zielsequenz eingeführt wird.

41. Verfahren von Anspruch 40, wobei der erste Strang der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure zwei Regionen benachbarter Nucleotide, die zwei Hybridduplexregionen bilden, wobei jede Hybridduplexregion eine Länge von wenigstens 4 Basenpaaren aufweist, und eine zwischen den Hybridduplexregionen angeordnete Zwischenregion aus wenigstens 1 Homoduplex-Basenpaar umfaßt, die die heterologe Region umfaßt.

42. Verfahren wie in Anspruch 40 oder Anspruch 41 beansprucht, wobei die Zelle eine andere als die einer Hefe oder eines Pilzes ist.

43. Verfahren von Anspruch 42, das weiter einen Schritt des Einführens der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure in den Kern durch Verwendung eines Liposoms umfaßt.

44. Verfahren wie in Anspruch 40 oder Anspruch 41 beansprucht, wobei der Kern ein Vorkern eines Eis ist und der Vektor aus der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure durch Injektion in den Vorkern eingeführt wird.

45. Verfahren wie in Anspruch 40 oder Anspruch 41 beansprucht, wobei der Kern ein Kern einer embryonalen Stammzelle ist und die Einführung durch Verwendung eines Liposoms oder durch Elektroporation erfolgt.

46. Verfahren des Erhaltens einer kultivierten Zellpopulation mit veränderten Eigenschaften, das die Schritte des

a) Bereitstellens der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure des Anspruchs 34, die weiter zwei mit einer Zielsequenz homologe Regionen und eine dazwischen angeordnete, die Änderung kodierende heterologe Region umfaßt,

c) Selektierens einer veränderten Zelle umfaßt.

47. Verfahren des Anspruchs 46, wobei der erste Strang der gemischten Ribo-Desoxyribonucleinsäure zwei Regionen benachbarter Nucleotide, die zwei Hybridduplexregionen bilden, wobei jede Hybridduplexregion eine Länge von wenigstens 4 Basenpaaren aufweist, und eine zwischen den Hybridduplexregionen angeordnete Zwischenregion aus wenigstens 1 Homoduplex-Basenpaar umfaßt, die die heterologe Region umfaßt.

48. Verfahren wie in Anspruch 46 oder Anspruch 47 beansprucht, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.

49. Verfahren wie in Anspruch 46 oder Anspruch 47 beansprucht, wobei die Zelle eine andere als die einer Hefe oder eines Pilzes ist.

50. Gemischte Ribo-Desoxyribonucleinsäure wie in einem der Ansprüche 1 bis 9, 27 bis 33 oder 34 bis 39 definiert zur Verwendung bei der Herstellung eines transgenen Tieres.