MX2011000778A

MX2011000778A - Plantas con caracteristicas modificadas de crecimiento y un metodo para obtenerlas.

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Publication number: MX2011000778A
Application number: MX2011000778A
Authority: MX
Inventors: Christophe Reuzeau; Kristina Himanen; Maria Van Lijsebettens; Tommaso Matteo Boccardi
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2011-03-15
Also published as: WO2010012760A3; AU2009275889A1; DE112009001860T5; EP2318535A2; AR075545A1; US20160017358A1; CN102144033A; EP2669379A2; BRPI0916530A2; CA2731038A1; US20110162109A1; WO2010012760A2; EP2669379A3; BRPI0916530A8; US9074006B2

Abstract

Un método para mejorar varias características de crecimiento importantes económicamente en las plantas. Más específicamente, a un método para modificar las características de crecimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 (Monoubiquitinación de la Historia 1) o que codifica otra proteína útil en dichos métodos. Las características modificadas de crecimiento comprenden una modificación de fenotipos regulados por la luz, tales como reloj circadiano modificado y/o respuestas del reloj circadiano, o arquitectura modificada de la planta.

Description

PLANTAS CON CARACTERÍSTICAS MODIFICADAS DE CRECIMIENTO Y UN MÉTODO PARA OBTENERLAS La presente invención se relaciona en general con el campo de la biología 5 molecular y se refiere a un método para modificar varias características de crecimiento de la planta mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una HUB1 (Monoubiquitinación de la Histona 1) ó que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención. La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que 10 codifica una HUB1 o de un ácido nucleico que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención, donde dichas plantas tienen características modificadas de crecimiento con respecto a las correspondientes plantas de tipo silvestre u otras plantas de control. La invención también provee ácidos nucleicos que codifican HUB1 desconocidos hasta el momento, y constructos útiles en los métodos 15 de la invención.

El aumento creciente de la población mundial y la provisión cada vez menor de tierra arable disponible para la agricultura, incentivan a investigar la posibilidad de incrementar la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para mejorar los cultivos y la horticultura emplean técnicas de cultivo selectivo para identificar las 20 plantas con las características deseables. Sin embargo, tales técnicas de cultivo selectivo tienen diversos inconvenientes, a saber, que dichas técnicas típicamente son laboriosas y dan como resultado plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre resultarán en que un rasgo deseable sea heredado de las plantas progenitoras. Los avances en la biología molecular han 25 permitido que el hombre modifique el germoplasma de animales y plantas. La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento y la manipulación del material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de tal material genético en una planta. Dicha tecnología tiene la capacidad de suministrar cultivos o plantas con diversos rasgos económicos, agronómicos o de horticultura 30 mejorados.

Un rasgo de particular interés económico es el mayor rendimiento. El rendimiento se define normalmente como el producto mensurable de valor económico de un cultivo. Esto se puede definir en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de diversos factores, por ejemplo, del número y tamaño de los 35 órganos, la arquitectura de las plantas (por ejemplo, la cantidad de ramas), la producción de semillas, la senescencia de las hojas y otros. El desarrollo de las raíces, la captación de nutrientes, la tolerancia al estrés y el vigor temprano también pueden ser factores importantes en la determinación del rendimiento. La optimización de los factores mencionados previamente puede entonces contribuir a incrementar de los cultivos.

El rendimiento de las semillas es un rasgo particularmente importante, dado que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrición humana y de animales. Los cultivos tales como mafz, arroz, trigo, cañóla y soja representan más de la mitad de la ingesta calórica total de humanos, ya sea por consumo directo de las propias semillas o por consumo de productos de carne obtenidos de semillas procesadas. También constituyen una fuente de azúcares, aceites muchos tipos de metabolitos usados en los procesos industriales. Las semillas contienen un embrión (fuente de nuevos brotes y raíces) y un endosperma (fuente de nutrientes para él crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de las plántulas). El desarrollo de una semilla comprende muchos genes y requiere de la transferencia de metabolitos desde las raíces, hojas y tallos hasta la semilla en crecimiento. El endosperma, en particular, asimila los precursores metabólicos de carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para rellenar el grano.

Otro rasgo importante para muchos cultivos es el vigor temprano. Mejorar el vigor temprano constituye un objetivo importante de los programas modernos de cultivo de arroz en cultivares de arroz de climas tanto templados como tropicales. Las raíces largas son importantes para un anclaje apropiado al suelo en el arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos inundados, y las plantas deben emerger rápidamente a través del agua, los brotes más largos se asocian con el vigor. Cuando se emplea la siembra mediante máquina sembradora, los mesocotilos y coleoptilos más largos son importantes para una buena emergencia de las plántulas. La capacidad de brindarles a las plantas vigor temprano mediante ingeniería genética sería de gran importancia en la agricultura. Por ejemplo, el escaso vigor temprano ha sido una limitación para la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) basados en el germopiasma del cinturón maizero en la zona atlántica europea.

Un rasgo interesante adicional es el momento de floración de una planta. El tiempo de vida de una planta se puede dividir en fases como germinación, crecimiento vegetativo, crecimiento reproductivo y senescencia. El momento de floración es el tiempo transcurrido entre la siembra y el comienzo del crecimiento reproductivo. Es un momento crucial en la vida de una planta que determina la transición de crecimiento vegetativo a reproductivo, que en algunas plantas coincide con el comienzo de la senescencia. En muchas plantas, este es el punto en el tiempo en el cual el meristema del ápice del brote deja de producir hojas y comienza a producir flores que tiene un mayor impacto sobre la morfogénesis afectando, por ejemplo, el número de órganos formados y el tamaño y forma general de la planta. El momento de floración también impacta sobre otros rasgos relacionados con el rendimiento en plantas. Típicamente una variedad de floración temprana muestra menor ramificación o retoños y por lo tanto es menos tupido. Tales rasgos pueden ser ventajosos para el agricultor para, por ejemplo, simplificar la manipulación del cultivo. Por otro lado, la floración demorada puede resultar en plantas con mas órganos vegetativos, por ejemplo mas hojas que es un rasgo deseable en muchos cultivos, particularmente en cultivos donde se cosechan los órganos vegetativos, como lechuga. La duración relativa de la fase vegetativa y reproductiva de una planta afecta directamente su rendimiento de semillas. En algunas plantas, el control del momento de floración es un mecanismo utilizado para evitar el impacto negativo de estreses como sequía. El momento de floración también puede afectar rasgos de calidad del cultivo, por ejemplo calidad del herbage en cultivos forrajeros, donde la demora de la floración puede resultar en mayor digeribilidad. El momento de floración afecta la longitud de la temporada de cultivo. La modificación del momento de floración de un cultivo puede resultar en la posibilidad de extender el área geográfica de cultivación y por lo tanto aumentar las hectáreas cultivadas. También puede resultar en plantas que son mas receptivas a la agricultura en un ambiente dado, por ejemplo la floración temprana puede permitir sembrado tardío en áreas donde el establecimiento del cultivo puede estar afectado negativamente por bajas temperaturas o puede permitir una cosecha temprana para evitar presiones bióticas y abióticas al final de la temporada, resultando, por lo tanto en un aumento del rendimiento del cultivo. Por lo tanto, la habilidad de controlar el momento de floración es un factor importante con muchas aplicaciones industriales en el campo agrícola.

También es importante para plantas de cultivo responder adecuadamente al ritmo diario a los cuales están expuestas. Anticiparse a cambios regulares en el ambiente provee a las plantas una ventaja de crecimiento al acortar la demora entre el cambio ambiente y su respuesta fisiológica. Por ejemplo, la activación de las vías de fotosíntesis antes del amanecer permite el uso óptimo del período lumínico, o la activación a tiempo de la respuesta al estrés por sequía protege las plantas de la escasez de agua durante la tardes calurosas del verano.

Otro rasgo importante es una mejor tolerancia al estrés abiótico. El estrés abiótico es una causa principal de pérdida de cultivos en todo el mundo, lo cual reduce el rendimiento promedio de la mayoría de las plantas de cultivo principales en más de un 50% (Wang et al., Planta (2003) 218: 1-14). Los distintos tipos de estrés abiótico pueden deberse a sequía, salinidad, temperaturas extremas, toxicidad química y estrés oxidativo. La capacidad para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés abiótico sería una gran ventaja económica para los granjeros en todo el mundo y permitiría el cultivo durante condiciones adversas y en territorios donde de otra manera no sería posible dicho cultivo.

En consecuencia, se puede aumentar el rendimiento de los cultivos mediante la optimización de uno de los factores mencionados previamente.

Según el uso final, se puede favorecer la modificación de ciertos rasgos del rendimiento sobre otros. Por ejemplo, para aplicaciones tales como la producción de forraje o madera, o recursos de biocombustible, puede ser deseable un incremento en las partes vegetativas de una planta, y para aplicaciones tales como producción de harina, almidón o aceite, puede ser particularmente deseable un incremento de los parámetros de las semillas. Aún entre los parámetros de las semillas, es posible favorecer a algunos sobre otros, según la aplicación. Varios mecanismos pueden contribuir a aumentar el rendimiento de las semillas, ya sea en forma de mayor tamaño de las semillas o de mayor cantidad de semillas.

Un enfoque para incrementar el rendimiento (rendimiento de semillas y/o biomasa) en plantas puede ser a través de la modificación de los mecanismos de crecimiento inherentes de una planta, tal como el ciclo celular, ritmo circadiano o distintas vías de señalización involucradas en el crecimiento de las plantas o en los mecanismos de defensa.

El ritmo circadiano controla muchos aspectos del metabolismo, fisiología y desarrollo vegetal. Las plantas hacen uso de las señales ambientales tales como el ciclo diario luz-oscuridad o las variaciones de temperatura regulares para mantener un mecanismo biológico cronometrado. Este mecanismo, conocido como el reloj circadiano, está representado comúnmente como un así denominado oscilador que consiste en un conjunto de proteínas que interactúan en un patrón complejo de bucles de retroalimentación de transcripción positiva y negativa, para reseñar ver McCIung (Plant Cell 18, 792-803, 2006) y Gardner et al (Biochemical Journal 397, 15-24, 2006). El oscilador está calibrado por señales externas (como luz, percibido por fitocromos y criptocromos) que son transmitidos mediante la "vía de entrada" al oscilador. El oscilador a su vez controla un número de vías (la "vía de salida") que regula los procesos fisiológicos que están influenciados por los cambios ambientales diarios. Se da una reseña en Barak et al. (Trends in Plant Science 5, 517-522, 2000) e incluye por ejemplo la inducción de la floración, la abertura de pétalos, la abertura o el cierre de estomata, crecimiento del hipocótilo, movimiento de cotiledones y hojas, movimiento de cloroplastos, expresión de genes asociados con la fotosíntesis y procesos bioquímicos y fisiológicos relacionados, las concentraciones de calcio citoplasmático y el estado de fosforilación de las proteínas como fosfoenol piruvato carboxilasa.

Ahora se ha descubierto que se pueden modificar varias características de crecimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una HUB1 (Monoubiquitinación de la Histona 1 ) en una planta.

Antecedentes La ubiquitinación desempeña un rol central en la regulación de la producción de proteínas. La ubiquitina es una proteína altamente conservada de 76 aminoácidos y una de la proteínas mas abundantes en las células. Las proteínas de ubiquitina se encuentran enlazadas a otras proteínas como modificaciones post-traducción. Poliubiquitinación, unión de mas de 4 ubiquitinas han mostrado dirigir proteínas a la degradación. La conjugación de ubiquitina requiere la acción en secuencia de tres enzimas o complejos proteicos, es decir enzima activadora de ubiquitina (E1), enzima conjugadora de ubiquitina (E2), y proteína ubiquitina ligasa (E3). La ubiquitina está inicialmente unida a la enzima E1 en una reacción dependiente de ATP. Después de activar la ubiquitina, es transferida a la enzima E2 vía enlace tiolester. Finalmente, la enzima ligasa E3 junta el sustrato y E2 con ubiquitina unida. Una vez que se monta una cadena de poliubiquitina en un sustrato, el sustrato es capturado y degradado por proteasomas 26S. El paso del reconocimiento del sustrato es mediado por ligasas E3, que contiene típicamente un dominio RING como un 'sitio de amarre' para E2s. Las proteínas ligasas E3 aparecen en dos formas: como E3s de cadena simple que se une directamente a E2 y sus sustratos, y como complejos de multisubunidades en donde una proteína de dedo de RING es un componente esencial. La clasificación de E3 ligasas se basa en la presencia de dominios tipo C-terminal E6-AP, caja U o el dominio del gen realmente interesante (RING). El dominio de RING es un tipo particular de dominio de dedo de zinc que une dos átomos de zinc y que está involucrado en interacciones proteína-proteína. La degradación de la proteína dependiente de ubiquitina ha sido reconocido como un medio regulador importante del ciclo celular, reparación de ADN, transcripción, control de calidad de proteínas y respuesta inmune.

El mutante hub1 {monoubiquitinación de la histona 1), también conocido como hub1-1, ang4-1 o rdo4, pertenece a la clase angusta de mutantes recesivos caracterizados por un tamaño de hoja reducido y lámina angosta (Berná et al., Genetics 152, 729-742, 1999), y vida latente reducida de la semilla (Peeters et al., Physiol. Plant. 115, 604-612, 2002; Liu et al., Plant Cell 19, 433-444, 2007). Los ensayos de germinación (en donde el porcentaje de semillas germinadas se registraron después de 7 días) mostraron que este porcentaje era mas alto comparado con las semillas de tipo silvestre. Sin embargo, el crecimiento de las plántulas dependía de la presencia de sacarosa en el medio (Liu et al., 2007). Las plantas mutantes son pequeñas comparadas con las de tipo silvestre y tienen hojas angostas, y el crecimiento radicular está afectada negativamente (Fleury et al., Plant Cell 19, 417-432, 2007). La sobreexpresión del gen HUB1 bajo el control del promotor fuerte Ca V35S en Arabidopsis resultó en plantas con tamaño de hoja aumentada (Cnops et al., WO 2006/027310). Se postula (Liu et al., 2007 y Fleury et al., 2007) que HUB1 está involucrado en la remodelación de cromatina, pero HUB1 puede también estar involucrado en la degradación de proteínas: BRE1 , el homólogo en levaduras de HUB1 , se muestra que interactúa con RAD6 y la proteasoma (Xiao et al., Mol. Cell. Biol. 25, 637-651 , 2005) y HUB1 o HUB2 además se alinean con Staring, una proteína que también está involucrada en la degradación de proteínas (Chin et al., J. Biol. Chem. 277, 35071-35079, 2002).

Sumario Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que modulando la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 provee a las plantas con características modificadas de crecimiento, en particular fenotipos modificados regulados por la luz, rendimiento aumentado de semillas, resistencia aumentada al estrés, vigor temprano aumentado con relación a plantas de control.

De acuerdo con una realización, se provee un método para modificar las características de crecimiento de una planta con relación a plantas de control, que comprende modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 en una planta. Las características modificadas de crecimiento comprende rendimiento aumentado de semilla, resistencia aumentada al estrés, vigor temprano aumentado y fenotipos modificados regulados por la luz con relación a plantas de control, pero no comprende biomasa vegetativa aumentada.

La invención también abarca la construcción de un mutante positivo dominante de HUB1 ; por lo tanto, en otra realización, se provee una forma de mutante positivo dominante de HUB1 y su uso para mejorar las características de crecimiento de plantas.

Definiciones Polipéptido(syProteina(s) Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan en forma indistinta en la presente y se refieren a aminoácidos en forma polimérica de cualquier longitud, ligados por enlaces peptídicos.

Polinucleótido(s)/Ácido(s) nucleico(s)/Secuencia(s) de ácidos nucleicos/Secuenciafs) de nucleótidos Los términos "polinucleótido(s)", "secuencia(s) de ácidos nucleicos", "secuencia(s) de nucleótidos", "ácido(s) nucleico(s)", "molécula de ácido nucleico" se usan en forma indistinta en la presente y se refieren a los nucleótidos, sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en forma polimérica no ramificada de cualquier longitud.

Planta(s) de control La elección de plantas de control adecuadas es una parte rutinaria de un montaje experimental y puede incluir las correspondientes plantas de tipo silvestre o las correspondientes plantas sin el gen de interés. La planta de control es típicamente de la misma especie de planta o incluso la misma variedad que la planta a evaluar. La planta de control también puede ser un nulicigota de la planta a evaluar. Los nulicigotas son individuos que carecen del transgen por segregación. Una "planta de control" como se usa en la presente se refiere no solo a las plantas completas, sino también a las partes de las plantas, incluso a las semillas y las partes de las semillas. Homóloqo(s) Los "homólogos" de una proteína comprenden péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos con respecto a la proteína en cuestión no modificada y que tienen actividad biológica y funcional similares a la proteína no modificada de la cual derivan.

Una eliminación se refiere a la supresión de uno o más aminoácidos de una proteína.

Una inserción se refiere a la introducción de uno o más residuos de aminoácidos en un sitio predeterminado de una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones N-terminal y/o C-terminal, además de inserciones intrasecuencia de aminoácidos únicos o múltiples. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones N- o C-terminal, en el orden de aproximadamente de 1 a 10 residuos. Los ejemplos de péptidos o proteínas de fusión N- o C-terminal incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador de la transcripción como se usa en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de revestimiento del fago, (histidina)-6-tag, glutatión S-transferasa-tag, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, epitopo Tag«100, epitopo c-myc, epitopo FLAG®, lacZ, C P (péptido de unión a calmodulina), epitopo HA, epitopo de proteína C y epitopo VSV.

Una sustitución se refiere al reemplazo de los aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, tendencia similares a formar o romper estructuras a-helicoidal o estructuras de lámina ß). Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos únicos, pero se pueden agrupar de acuerdo con las restricciones funcionales del polipéptido; las inserciones usualmente estarán en el orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las tablas de sustituciones conservadoras son muy conocidas en el arte (ver, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds) y la siguiente Tabla 1 ).

Tabla 1 : Ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos Las sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos se pueden realizar fácilmente mediante técnicas de síntesis de péptidos muy conocidas en el arte, tales como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o mediante manipulación del ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir vanantes de substitución, inserción o eliminación de una proteína son muy conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados del ADN son muy conocidas por los expertos en el arte e incluyen a mutagénesis de M13, mutagénesis de T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

Derivados Los "derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma natural de la proteína tal como la proteína de interés, comprenden sustituciones de aminoácidos con residuos de aminoácidos no naturales o adiciones de residuos de aminoácidos no naturales. Los "derivados" de una proteína también abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos alterados naturales (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, etc.) o residuos de aminoácidos alterados no naturales en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes o adiciones que no sean de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cual deriva, por ejemplo una molécula informadora u otro ligando, unido en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula informadora que se une para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos no naturales con respecto a la secuencia de aminoácidos de una proteína natural. Además, los "derivados" también incluyen fusiones de la forma natural de la proteína con péptidos de marcación tales como FLAG, HIS6 o tiorredoxina (para una revisión de los péptidos de marcación, ver Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

Ortólogo(sVParáloqo(s) Los ortólogos y parálogos abarcan los conceptos de evolución que se utilizan para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los parálogos son genes de la misma especie que se originaron mediante duplicación de un gen ancestral; los ortólogos son genes de organismos diferentes que se originaron mediante especiación y también derivan de un gen ancestral común.

Dominio El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a largo de un alineamiento de secuencias proteicas relacionadas durante la evolución. Si bien los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre los homólogos, los aminoácidos que están muy conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que posiblemente sean esenciales en cuanto a la estructura, estabilidad o función de una proteína. Los dominios identificados por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, se pueden usar como ¡dentificadores para determinar si algún polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos previamente identificada.

Motivo/Secuencia de consenso/Distintivo El término "motivo" o "secuencia de consenso" o "distintivo" se refiere a una región corta conservada en la secuencia proteica relacionada durante la evolución. Con frecuencia, los motivos son partes muy conservadas de los dominios, pero también pueden incluir sólo una parte del dominio o pueden estar localizados fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo se encuentran fuera de un dominio definido).

Hibridación El término "hibridación" como se define en la presente es un proceso en el cual las secuencias de nucleótidos complementarias sustancialmente homólogas se aparean entre sí. El proceso de hibridación puede ocurrir totalmente en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El proceso de hibridación también puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz, tal como esferas magnéticas, esferas de Sepharose o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede ocurrir además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o nylon o inmovilizados, por ejemplo, por fotolitografía, por ejemplo, en un soporte de vidrio de silíceo (este último es conocido como matrices de ácidos nucleicos o micromatrices o como chips de ácidos nucleicos). Con el fin de permitir que se produzca la hibridación, las moléculas de ácidos nucleicos generalmente se desnaturalizan en forma térmica o química para fusionar una cadena doble en dos cadenas simples y/o eliminar las horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos de cadena simple.

El término "rigurosidad" se refiere a las condiciones en las cuales tiene lugar la hibridación. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como temperatura, concentración de sal, fuerza iónica y composición del buffer de hibridación. Generalmente, las condiciones de baja rigurosidad se seleccionan para que la temperatura sea aproximadamente 30 °C más baja que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media son aquellas en que la temperatura es 20 °C más baja que Tm, y las condiciones de alta rigurosidad tienen lugar cuando la temperatura es 10 °C más baja que Tm. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad se usan típicamente para aislar secuencias de hibridación cuyas secuencias son muy similares a la secuencia de ácidos nucleicos blanco. Sin embargo, los ácidos nucleicos se pueden desviar de la secuencia y aún codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. En consecuencia, las condiciones de hibridación de rigurosidad media algunas veces pueden ser necesarias para identificar tales moléculas de ácidos nucleicos.

La Tm es la temperatura a una fuerza iónica y pH definidos, a la cual el 50% de la secuencia blanco se híbrida a una sonda perfectamente apareada. La Tm depende de las condiciones de la solución y la composición base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas mayores. La tasa máxima de hibridación se obtiene desde aproximadamente 16 °C hasta 32 °C por debajo de Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos cadenas de ácidos nucleicos, fomentando de este modo la formación del híbrido; este efecto es visible en las concentraciones de sodio de hasta 0,4 M (en concentraciones superiores, este efecto se puede ignorar). La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 a 0,7°C para cada porcentaje de formamida y la adición de 50% de formamida permite que la hibridación se realice de 30 a 45 °C, aunque se reducirá la tasa de hibridación. La falta de apareamiento de los pares de bases reduce la tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio, y para sondas grandes, la Tm disminuye aproximadamente 1°C por % de falta de apareamiento de las bases. La Tm se puede calcular mediante las siguientes ecuaciones, según los tipos de híbridos: 1 ) Híbridos de ADN-ADN ( einkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984): Tm= 81 ,5oC+16,6xlog10[Na+]a+0,41x%[G/Cb]-500x[L -0,61x% de formamida 2) Híbridos de ADN-ARN o ARN -ARN: Tm= 79,8+18,5(log10[Na+]a)+0,58(%G/C )+ 1 1 ,8(%G/C )2-820/L° 3) Híbridos de oligo-ADN u oligo-ARNd: Para <20 nucleótidos: Tm= 2 (ln) Para 20-35 nucleótidos: Tm= 22 + 1 ,46 (ln) a o para otro catión monovalente pero solo exacto en el rango 0,01-0,4 M. 6 solo exacto para el % de GC en el rango de 30% a 75% c L = longitud del dúplex en pares de bases. d oligo, oligonucleótidos; l„, = longitud efectiva del cebador = 2?(??. de G/C)+(no. de A T).

La unión no específica se puede controlar mediante cualquiera de las numerosas técnicas conocida tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteínas, adiciones de ARN, ADN y SDS heterólogos al buffer de hibridación y tratamiento con Rnasa. En las sondas no homologas, se puede realizar una serie de hibridaciones mediante la variación de uno de los siguientes (i) reducir progresivamente la temperatura de apareamiento (por ejemplo de 68°C a 42°C) o (ii) reducir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo de 50% a 0%). El experto en el arte conoce los diversos parámetros que se pueden alterar durante la hibridación y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de hibridación generalmente también depende de la función de los lavados pos-hibridación. Para eliminar el fondo que resulta de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de dichos lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: a menor concentración salina y mayor temperatura de lavado, se obtiene mayor rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente con la rigurosidad de la hibridación o con una rigurosidad inferior ella. Una hibridación positiva brinda una señal que es por lo menos el doble de la del fondo. Generalmente, las condiciones de rigurosidad adecuadas para los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos o procedimientos de detección de amplificación génica son como se expusieron anteriormente. También se pueden seleccionar condiciones más o menos rigurosas. El experto en el arte conoce los diversos parámetros que se pueden alterar durante el lavado y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación típicas de alta rigurosidad para los híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos comprenden hibridación a 65 °C en 1 x SSC o a 42 °C en 1x SSC y 50% de formamida, seguida por lavado a 65 °C en 0,3x i SSC. Los ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos comprenden hibridación a 50 °C en 4x SSC o a 40 °C en 6x SSC y 50% de formamida, seguida por lavado a 50 °C en 2x SSC. La longitud del híbrido es la longitud prevista para el ácido nucleico de hibridación. 5 Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridan, se puede determinar la longitud del híbrido por el alineamiento de las secuencias y la identificación de las regiones conservadas descritas en la presente. 1 *SSC es NaCI 0.15M y citrato de j sodio 15mM; la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir adicionalmente reactivo de Denhardt 5x, 0,5-1 ,0% de SDS, 100 pg/ml de ADN de 10 esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, 0,5% de pirofosfato de sodio.

A los fines de definir el nivel de rigurosidad, se puede hacer referencia a Sambrook et al. (2001 ) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 y actualizaciones anuales). 15 Variante de empalme El término "variante de empalme" como se usa en la presente abarca las I variantes de una secuencia de ácidos nucleicos en las cuales se han escindido, í reemplazado, desplazado o agregado los intrones y/o exones seleccionados, o en las cuales los intrones han sido acortados o alargados. Dichas variantes serán aquellas en 20 las que la actividad biológica de la proteína está sustancialmente retenida; esto se puede obtener mediante la retención selectiva de los segmentos funcionales de la proteína. Dichas variantes de empalme se pueden hallar en la naturaleza o pueden ser realizadas por el hombre. Los métodos para predecir y aislar dichas variantes de empalme son muy conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Foissac and Schiex (2005) 25 BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante alélica Los alelos o las variantes alélicas son formas alternativas de un gen determinado, ubicado en la misma posición del cromosoma. Las variantes alélicas abarcan los Polimorfismos de nucleótido único (SNP), además de Polimorfismos de 30 eliminación/inserción pequeños (INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente menor de 100 pb. Los SNP e INDEL forman el mayor conjunto de variantes de secuencias en las cepas polimórficas naturales de la mayoría de los organismos.

Transposición génica/Evolución dirigida La transposición génica o evolución dirigida consiste en iteraciones de la 35 transposición de ADN seguida por la identificación y/o selección apropiada para I generar variantes de ácidos nucleicos o porciones de éstos que codifican proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; patentes estadounidenses 5.811.238 y 6.395.547).

Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" se usan en forma indistinta en la presente y se deben interpretar en un contexto amplio para referirse a la secuencias de ácidos nucleicos reguladoras capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las cuales están ligadas. El término "promotor" típicamente se refiere a una secuencia de control de ácidos nucleicos ubicada corriente arriba del comienzo de la transcripción de un gen y que participa en el reconocimiento y la unión de ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo de este modo la transcripción de un ácido nucleico ligado operativamente. Los términos antes mencionados abarcan a las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariota clásico (que incluye la caja TATA necesaria para la iniciación de una transcripción precisa con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias de activación corriente arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a los estímulos del desarrollo y/o externos, o en forma específica de tejido. El término también incluye una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de la caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de la caja -10. La expresión "elemento regulador" también abarca una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácidos nucleicos en una célula, tejido u órgano.

Un "promotor de planta" comprende elementos reguladores que median la expresión de un segmento de una secuencia codificadora en las células vegetales. Por consiguiente, un promotor de planta no necesita ser de origen vegetal, sino que se puede originar a partir de virus o microorganismos, por ejemplo a partir de virus que atacan las células vegetales. El "promotor de planta" también se puede originar a partir de una célula de planta, por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácidos nucleicos expresada en el proceso de la invención y descrita en la presente. Esto también se aplica a otras señales reguladoras de "planta", tales como los terminadores de "planta". Los promotores corriente arriba de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de la presente invención se pueden modificar por una o más sustitución(es), inserción(es) y/o eliminación(es) de nucleótidos sin interferir con la actividad o funcionalidad de cualquiera de los promotores, el marco de lectura abierto (ORF) o la región reguladora 3' tal como los terminadores u otras regiones reguladoras 3' que se ubican fuera de la ORF. Además, es posible que la actividad de los promotores aumente por la modificación de su secuencia o que estos sean reemplazados por completo por promotores más activos, incluso promotores de los organismos heterólogos. Para la expresión en las plantas, la molécula de ácidos nucleicos, como se describió anteriormente, debe estar ligada operativamente o comprender un promotor adecuado que exprese el gen en el momento correcto y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de los promotores funcionalmente equivalentes, la potencia del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato se pueden analizar, por ejemplo, por la unión operativa del promotor a un gen informante y la evaluación del nivel de expresión y el patrón del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Los genes indicadores conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad del promotor se determina por la medición de la actividad enzimática de beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La potencia del promotor y/o el patrón de expresión luego se pueden comparar con los de un promotor de referencia (tal como el que se usa en los métodos de la presente invención). De modo alternativo, la potencia del promotor se puede evaluar mediante la cuantificación de los niveles de mARN o por comparación de los niveles de mARN del ácido nucleico usado en los métodos de la presente invención, con niveles de ARNm de genes housekeeping tales como rARN 18S, mediante los métodos conocidos en el arte, tales como transferencia Northern con análisis densitométrico de autorradiogramas, PCR cuantitativa de tiempo real o RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Generalmente, por "promotor débil" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificadora a un nivel bajo. Por "nivel bajo" se entiende los niveles de aproximadamente 1/10.000 transcripciones a aproximadamente 1/100.000 transcripciones, a aproximadamente 1/500.0000 transcripciones por célula. Por el contrario, un "promotor fuerte" dirige la expresión de una secuencia codificadora a un nivel alto o de aproximadamente 1/10 transcripciones a aproximadamente 1/100 transcripciones a aproximadamente 1/1000 transcripciones por célula. En general, por "promotor de potencia mediana" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificadora a un nivel más bajo que un promotor fuerte, en particular a un nivel que, en todos los casos, es inferior al obtenido bajo el control de un promotor de 35S CaMV.

Liqado operativamente El término "ligado operativamente" como se usa en la presente se refiere a la unión funcional entre la secuencia del promotor y el gen de interés, de modo tal que la secuencia del promotor puede iniciar la transcripción del gen de interés Promotor constitutivo Un "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es activo en la transcripción durante la mayoría, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y desarrollo y en la mayoría de las condiciones ambientales, en por lo menos una célula, tejido u órgano. La siguiente Tabla 2a provee ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2a: Ejemplos de promotores constitutivos Promotor ubicuo Un promotor ubicuo es activo sustancialmente en casi todos los tejidos o células de un organismo.

Promotor regulado por el desarrollo Un promotor regulado por el desarrollo es activo durante ciertas etapas del desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios en el desarrollo.

Promotor inducible Un promotor inducible ha inducido o aumentado la iniciación de la transcripción en respuesta a un estímulo químico (para una reseña ver Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), ambiental o físico o puede ser "inducible por estrés", es decir, activado cuando una planta se expone a varias condiciones de estrés, o "inducible por patógeno" es decir, activado cuando una planta se expone a diversos patógenos.

Promotor específico de órgano/específico de tejido Un promotor específico de órgano o específico de tejido es uno capaz de iniciar la transcripción preferentemente en ciertos órganos o tejidos, tales como hojas, raíces, tejido de semilla, etc. Por ejemplo, un "promotor específico de raíz" es un promotor que es activo en la transcripción predominantemente en las raíces de las plantas, excluyendo sustancialmente cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite alguna filtración de expresión en estas otras partes de la planta. Los promotores capaces de iniciar la transcripción sólo en ciertas células se denominan en la presente "específicos de célula".

Los ejemplos de promotores específicos de raíz se enumeran en la siguiente Tabla 2b: Tabla 2b: Ejemplos de promotores específicos de raíz Un promotor específico de semilla es activo en la transcripción predominantemente en el tejido de las semillas, pero no necesariamente en forma exclusiva en el tejido de las semillas (en casos de filtración de expresión). El promotor específico de semilla puede ser activo durante el desarrollo de la semilla y/o durante la germinación. El promotor específico de las semillas puede ser específico de endosperma, de aleurona y/o de embrión. Los ejemplos de promotores específicos de semillas se muestran en la siguiente Tabla 2c. Otros ejemplos de promotores específicos de semilla se indican en Qing Qu and Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004), cuya descripción se incorpora a la presente por referencia como si se estableciera en su totalidad.

Tabla 2c: Ejemplos de promotores específicos de semilla Fuente génica Referencia Genes específicos de semilla Simón et al., Plant Mol. Biol. 5: 191 , 1985; Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.; Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

Albúmina Brazil Nut Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.

Legumina Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.

Glutelina (arroz) Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa et al., FEBS Letts. 221 : 43-47, 1987.

Zeína Matzke et al Plant Mol Biol, 14(3):323-32 1990 napA Stalberg et al, Planta 199: 515-519, 1996.

Glutenina-1 LMW y H W de Mol Gen Genet 216.81-90, 1989; NAR 17:461-2, trigo 1989 SPA de trigo Albani et al, Plant Cell, 9: 171-184, 1997 gliadinas a, ß, ? de trigo EMBO J. 3:1409-15, 1984 Promotor Itr1 de cebada Díaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8 Hordeína, B1 , C, D de cebada Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996 DOF de cebada Mena et al, The Plant Journal, 116(1 ): 53-62, 1998 blz2 EP99106056.7 Promotor sintético Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998.

Prolamina NRP33 de arroz Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998 Fuente génica Referencia a-globulina de arroz Glb-1 Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998 OSH1 de arroz Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117- 8122, 1996 a-globulina REB/OHP-1 de Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997 arroz ADP-glucosa pirofosforilasa Trans Res 6:157-68, 1997 de arroz Familia del gen ESR de maíz Plant J 12:235-46, 1997 a-kafirina de sorgo DeRose et al., Plant Mol. Biol 32:1029-35, 1996 KNOX Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71 , 1999 Oleosina de arroz Wu et al, J. Biochem. 123:386, 1998 Oleosina de girasol Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992 PRO0117, proteína WO 2004/070039 ribosómica putativa 40S de arroz PRO0136, alanina no publicado aminotransferasa de arroz PRO0147, inhibidor ITR1 de no publicado tripsina (cebada) PRO0151 , WSI18 de arroz WO 2004/070039 PRO0175, RAB21 de arroz WO 2004/070039 PRO005 WO 2004/070039 PRO0095 WO 2004/070039 a-amilasa (Amy32b) Lanahan et al, Plant Cell 4:203-211 , 1992; Skriver et al, Proc Nati Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991 gen tipo catepsina ß Cejudo et al, Plant Mol Biol 20:849-856, 1992 Ltp2 de cebada Kalla et al., Plant J. 6:849-60, 1994 Chi26 Leah et al., Plant J. 4:579-89, 1994 Maíz B-Perú Selinger et al., Genetics 149; 1125-38, 1998 Un promotor específico de tejido verde como se define en la presente es un promotor activo en la transcripción predominantemente en el tejido verde, excluyendo sustancialmente cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite alguna filtración de expresión en estas otras partes de la planta.

En la siguiente Tabla 2d se exponen ejemplos de promotores específicos de tejido verde que se pueden utilizar para llevar a cabo métodos de la invención.

Tabla 2d: Ejemplos de promotores específicos de tejido verde Otro ejemplo de un promotor específico de tejido consiste en un promotor específico de meristema, que es activo en la transcripción predominantemente en tejido meristemático, excluyendo sustancialmente cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite alguna filtración de expresión en estas otras partes de la planta. En la siguiente tabla 2e se exponen ejemplos de promotores específicos de meristema verde que se pueden utilizar para llevar a cabo los métodos de la invención.

Tabla 2e: Ejemplos de promotores específicos de meristema Terminador El término "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad de transcripción que señala el procesamiento en 3' y la poliadenilación de una transcripción primaria y la terminación de la transcripción. El terminador se puede derivar del gen natural, a partir de una variedad de otros genes de planta o de T-ADN. El terminador agregado puede derivar, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente de otro gen de planta o, con menor preferencia, de cualquier otro gen eucariótico.

Modulación El término "modulación" significa, en relación con la expresión o expresión génica, un proceso en el que el nivel de expresión es modificado por dicha expresión génica en comparación con la planta de control, se puede aumentar o disminuir el nivel de expresión. La expresión original no modulada puede ser de cualquier clase de expresión de un ARN (rARN, tARN) o mARN estructural con traducción posterior. El término "modulación de la actividad" significa cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención o proteínas codificadas, que conducen a mayor rendimiento y/o mayor crecimiento de las plantas.

Expresión El término "expresión" o "expresión génica" significa la transcripción de un gen específico o genes específicos o construcción genética específica. El término "expresión" o "expresión génica" en particular significa la transcripción de un gen o genes o construcción genética en ARN (rARN, tARN) o mARN estructural con o sin traducción posterior de la última en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y el procesamiento del producto de mARN resultante.

Mayor expresión /sobreexpresión El término "mayor expresión" o "sobreexpresión" como se usa en la presente significa cualquier forma de expresión adicional al nivel de expresión de tipo silvestre original.

Los métodos para aumentar la expresión de genes o productos génicos están documentados en el arte e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por promotores apropiados, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados que actúan como elementos promotores o potenciadores se pueden introducir en una posición apropiada (típicamente corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido a fin de regular en forma ascendente la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos se pueden alterar in vivo por mutación, eliminación y/o sustitución (ver, Kmiec, US 5.565.350; Zarling et al., W09322443), o se pueden introducir promotores aislados en una célula de planta en la orientación y distancia apropiadas de un gen de la presente invención a fin de controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión de un polipéptido, generalmente es preferible incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región de codificación de polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de planta, o de T-ADN. La secuencia del extremo 3' agregada puede derivar, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente de otro gen de planta o, con menor preferencia, de cualquier otro gen eucariótico.

También se puede agregar una secuencia intrón a la región 5' no traducida (UTR) o la secuencia codificadora de la secuencia codificadora parcial para aumentar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha demostrado que la inclusión de un intrón que se puede empalmar en la unidad de transcripción de las construcciones de expresión vegetales y animales aumenta la expresión génica tanto al nivel del mARN como de las proteínas hasta 1000 veces (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1 :1183-1200). Tal potenciación de la expresión génica por el intrón es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de intrones de maíz intrón Adh1-S 1 , 2 y 6, el intrón Bronze-1 son conocidos en el arte. Para información general ver: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Gen endógeno La referencia en la presente a un gen "endógeno" no se refiere sólo al gen en cuestión hallado en una planta en su forma natural (es decir, sin que haya intervención humana), sino que también se refiere al mismo gen (o un gen/ ácido nucleico sustancialmente homóloga) en una forma aislada posteriormente (re)introducida en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene dicho transgén puede comprender una reducción sustancial de la expresión del transgén y/o una reducción sustancial de la expresión del gen endógeno. El gen aislado se puede aislar de un organismo o puede ser preparado por el hombre, por ejemplo por síntesis química. Menor expresión La referencia en la presente a "menor expresión" o "reducción o sustancial eliminación" de la expresión significa una disminución de la expresión del gen endógeno y/o de los niveles de poiipéptidos y/o actividad de poiipéptidos con respecto a las plantas de control. La reducción o sustancial eliminación es, en orden creciente de preferencia, al menos 10%, 20%, 30%, 40% ó 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ó 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más reducida en comparación con la de las plantas de control.

Para la reducción o sustancial eliminación de la expresión de un gen endógeno en una planta, es necesario que los nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos tengan suficiente longitud. A fin de realizar el silenciamiento génico, ésta puede tener tan pocos como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 , 10 o menos nucleótidos, alternativamente ésta puede ser igual al gen entero (incluso UTR 5' y/o 3', ya sea total o parcialmente). La porción de nucleótidos sustancialmente contiguos puede derivar del ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gen blanco) o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés. Preferentemente, la porción de nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar uniones de hidrógeno con el gen blanco (ya sea cadena sentido o antisentido), más preferentemente, la porción de nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidad de secuencia con el gen blanco (ya sea cadena sentido o antisentido). Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido (funcional) no es un requisito de los diversos métodos analizados en la presente para la reducción o sustancial eliminación de la expresión de un gen endógeno.

Esta reducción o sustancial eliminación de la expresión se puede lograr mediante herramientas y técnicas de rutina. Un método preferido para la reducción o sustancial eliminación de la expresión del gen endógeno es mediante la introducción y expresión en una planta de una construcción genética en la cual el ácido nucleico (en este caso una porción de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, paralogo u homólogo de cualquiera de la proteína de interés) se clona como una repetición invertida (en parte o completamente), separada por un espaciador (ADN no codificador).

En dicho método preferido, la expresión del gen endógeno se reduce o se elimina sustancialmente mediante el silenciamiento mediado por ARN utilizando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte de éste (en este caso una porción de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, paralogo u homólogo de la proteína de interés), preferentemente capaz de formar una estructura de horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende secuencias de control. Una secuencia de ácido nucleico de ADN no codificador (un separador, por ejemplo un fragmento de la región de unión a matriz (MAR), un intrón, un poliligador, etc.) se ubica entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Luego de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura autocomplementaria (parcial o completa). Esta estructura de ARN de cadena doble se denomina ARN horquilla (hpARN). El hpARN es procesado por la planta en siARN que se incorpora en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El RISC además diva las transcripciones de mARN, reduciendo sustancialmente de este modo la cantidad de transcripciones de mARN a ser traducidas en polipéptidos. Para más detalles generales ver, por ejemplo, Grierson et al. (1998) WO 98/53083; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050).

La realización de los métodos de la invención no depende de la introducción y expresión en una planta de una construcción genética en la cual se clona el ácido nucleico como una repetición invertida, sino que se pueden utilizar uno o más de los diversos métodos de "silenciamiento génico" conocidos para lograr los mismos efectos.

Uno de dichos métodos para reducir la expresión del gen endógeno es el silenciamiento de la expresión génica mediado por ARN (regulación descendente). En este caso, el silenciamiento es activado en una planta por una secuencia de ARN de cadena doble (dsARN) que es sustancialmente similar al gen endógeno blanco. Este dsARN es procesado adicionalmente por la planta en alrededor de 20 a alrededor de 26 nucleótidos denominados ARN corto de interferencia (siARN). Los siARN se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que escinde la transcripción de mARN del gen endógeno blanco, reduciendo sustancialmente de este modo la cantidad de transcripciones de mARN a ser traducidas en un polipéptido. Preferentemente, la secuencia de ARN de cadena doble corresponde a un gen blanco.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN incluye introducir secuencias de ácidos nucleicos o sus partes (en este caso, una porción de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, paralogo u homólogo de la proteína de interés) en una orientación sentido en una planta. "Orientación sentido" se refiere a una secuencia de ADN que es homóloga a una transcripción de mARN de ésta. Por lo tanto, se introducirá en una planta al menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos adicional reducirá la expresión del gen endógeno, generando un fenómeno conocido como cosupresión. La reducción de la expresión génica será más pronunciada si se introducen varias copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos en la planta, ya que existe una correlación positiva entre los altos niveles de transcripciones y la activación de la cosupresión.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de A N incluye el uso de secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Una secuencia de ácidos nucleicos "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos "sentido" que codifica una proteína, es decir, complementaria de la cadena codificadora de una molécula de cADN de cadena doble o complementaria de una secuencia de transcripciones de mARN. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido es preferentemente complementaria del gen endógeno a ser silenciado. La complementariedad puede estar ubicada en la "región codificadora" y/o en la "región no codificadora" de un gen. El término "región codificadora" se refiere a una región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos. El término "región no codificadora" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificadora que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (también denominadas regiones 5' y 3' no traducidas).

Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido se pueden diseñar de acuerdo con las normas de formación de pares de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede ser complementaria de toda la secuencia de ácidos nucleicos (en este caso, una porción de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, paralogo u homólogo de la proteína de interés) pero también puede ser un oligonucleótido que es antisentido sólo con respecto a una parte de la secuencia de ácidos nucleicos (incluyendo UTR 5' y 3' de mARN). Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser complementaria de la región que rodea al sitio de inicio de la traducción de un transcripto de mARN que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos antisentido adecuada es conocida en el arte y puede comenzar desde alrededor de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 ó 10 nucleótidos de longitud o menos. Se puede construir una secuencia de ácidos nucleicos antisentido de acuerdo con la invención mediante síntesis química y reacciones de ligadura enzimáticas utilizando los métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido) se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos naturales o nucleótidos modificados de distinta manera diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos sentido y antisentido, por ejemplo, se pueden utilizar derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar las secuencias de ácidos nucleicos antisentido son muy conocidos en el arte. Las modificaciones de nucleótidos conocidas incluyen metilación, ciclación y "capuchón" (caps) y sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo tal como inosina. Otras modificaciones de nucleótidos son conocidas en el arte.

La secuencia de ácidos nucleicos antisentido se puede producir de forma biológica usando un vector de expresión en el cual se ha subclonado una secuencia de ácidos nucleicos en orientación antisentido (es decir, el ARN transcripto desde el ácido nucleico insertado tendrá orientación antisentido con respecto al una secuencia de ácidos nucleicos blanco de interés). Preferentemente, la producción de secuencias de ácidos nucleicos antisentido en las plantas ocurre por medio de una construcción de ácido nucleico integrada de forma estable que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido ligado operativamente y un terminador.

Las moléculas de ácidos nucleicos utilizadas para el silenciamiento en los métodos de la invención (ya sea introducidas en una planta o generadas in situ) se hibridan o se unen a transcriptos de mARN y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir de este modo la expresión de la proteína, por ejemplo, mediante la inhibición de la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ocurrir mediante complementariedad convencional de nucleótidos para formar un dúplex estable o, por ejemplo en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos antisentido que se une a dúplex dé ADN, mediante interacciones específicas en la cavidad principal de la hélice doble. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido se pueden introducir en una planta mediante transformación o inyección directa en un sitio de tejido específico. Alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido se pueden modificar para que se dirijan a células seleccionadas y luego administrarlas de forma sistémica. Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido se pueden modificar de manera tal que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados en una superficie celular seleccionada, por ejemplo, mediante la unión de la secuencia de ácidos nucleicos antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a antígenos o receptores de la superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también se pueden dirigir a las células utilizando los vectores descritos en la presente.

De acuerdo con otro aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos antisentido es una secuencia de ácidos nucleicos a-anomérica. Una secuencia de ácidos nucleicos a-anomérica forma híbridos específicos de cadena doble con ARN complementario en los cuales, a diferencia de las unidades b habituales, las cadenas corren de forma paralela entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucí Ac Res 15: 6625-6641 ). La secuencia de ácidos nucleicos antisentido también puede comprender un 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucí Ac Res 15, 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).

La reducción o sustancial eliminación de la expresión del gen endógeno también se puede realizar utilizando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalítico con actividad de ribonucleasa capaces de clivar una secuencia de ácidos nucleicos de cadena simple, tal como un mARN, con la cual tienen una región complementaria. De este modo, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas hammerhead (descritas en Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) se pueden utilizar para clivar de forma catalítica transcriptos de mARN que codifican un polipéptido, reduciendo sustancialmente de este modo la cantidad de transcriptos de mARN a ser traducidos en un polipéptido. Se puede diseñar una ribozima con especificidad para una secuencia de ácidos nucleicos (ver, por ejemplo: Cech et al. Patente estadounidense No. 4.987.071 ; y Cech et al. Patente estadounidense No. 5.1 16.742). Alternativamente, se pueden utilizar transcriptos de mARN que corresponden a una secuencia de ácidos nucleicos para seleccionar un ARN catalítico que tiene actividad de ribonucleasa específica de un conjunto de moléculas de ARN (Bartel and Szostak (1993) Science 261 , 141 1-1418). La utilización de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas es conocido en el arte (por ejemplo, Atkins et al. (1994) WO 94/00012; Lenne et al. (1995) WO 95/03404; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 y Scott et al. (1997) WO 97/381 16).

El silenciamiento génico también se puede lograr mediante mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de T-ADN o inserción de transposón) o mediante estrategias como las que describen, entre otros, Angelí and Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083) o Baulcombe (WO 99/15682).

El silenciamiento génico también puede ocurrir si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un ácido nucleico/gen aislado que se introducen posteriormente en una planta. La reducción o sustancial eliminación puede ser causada por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, el polipéptido puede unirse a varias proteínas interactuantes; por lo tanto, una o más mutaciones y/o truncamientos pueden generar un polipéptido que aún es capaz de unirse a proteínas interactuantes (tales como proteínas receptoras) pero que no puede exhibir su función normal (tal como un ligando de señalización).

Otro enfoque del silenciamiento génico consiste en hacer blanco en secuencias de ácidos nucleicos complementarias de la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o potenciadores) para formar estructuras helicoidales triples que evitan la transcripción del gen en las células blanco. Ver Helene, C, Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991 ; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; y Maher, L.J. Bioassays 14, 807-15, 1992.

Otros métodos, tal como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la vía de señalización en la cual participa un polipéptido, son bien conocidos por el experto en el arte. En particular, puede preverse que las moléculas obtenidas por el hombre pueden ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido blanco o para interferir con la vía de señalización en la que participa el polipéptido blanco.

Alternativamente, se puede establecer un programa de control para identificar en la población de una planta las variantes naturales de un gen, cuyas variantes codifican polipéptidos con actividad reducida. Dichas variantes naturales también se pueden utilizar, por ejemplo, para realizar recombinación homóloga.

Se puede utilizar microARN (miARN) artificial y/o natural para realizar el knock out de la expresión génica y/o la traducción de mARN. Los miARN endógenos son ARN pequeños de cadena simple que generalmente tienen 19-24 nucleótidos de longitud. Su función consiste principalmente en regular la expresión génica y/o la traducción de mARN. La mayoría de los microARN (miARN) vegetales tienen una complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias blanco. Sin embargo, existen blancos naturales con hasta cinco faltas de coincidencias. Se procesan a partir de ARN no codificadores más largos con estructuras de replegamiento características mediante RNasas específicas de cadena doble de la familia Dicer. Luego del procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) mediante la unión a su componente principal, una proteína Argonauta. MiARN sirve como componente de especificidad de RISC, debido a que forma pares de bases con los ácidos nucleicos blanco, en su mayoría mARN, en el citoplasma. Los posteriores eventos reguladores incluyen la escisión y destrucción del mARN blanco y/o la inhibición de la traducción. De este modo, los efectos de la sobreexpresión de miARN a menudo se ven reflejados en niveles más bajos de mARN de genes blanco.

Los microARN artificiales (amiARN), que típicamente tienen 21 nucleótidos de longitud, se pueden modificar mediante ingeniería genética específicamente para regular de forma negativa la expresión génica de un único o de múltiples genes de interés. Los determinantes de la selección del blanco de microARN vegetal son bien conocidos en el arte. Los parámetros empíricos para el reconocimiento del blanco ya han sido definidos y se pueden utilizar para ayudar en el diseño de amiARN específico, (Schwab ef al., Dev Cell 8, 517-527, 2005). Las herramientas adecuadas para el diseño y la generación de amiARN y sus precursores también se encuentran disponibles al público (Schwab er a/., Plant Cell 18, 1121-1133, 2006).

Para un rendimiento óptimo, las técnicas de silenciamiento génico utilizadas para reducir la expresión de un gen endógeno en una planta requiere el uso de secuencias de ácidos nucleicos provenientes de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y provenientes de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferentemente, se introduce una secuencia de ácidos nucleicos de cualquier especie vegetal determinada en esa misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos del arroz es transformada en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito indispensable que la secuencia de ácidos nucleicos a ser introducida se origine a partir de la misma especie vegetal que la planta en la cual será introducida. Es suficiente que haya homología sustancial entre el gen endógeno blanco y el ácido nucleico a ser introducido.

Anteriormente se describieron ejemplos de diversos métodos para la reducción o sustancial eliminación de la expresión de un gen endógeno en una planta. Un experto en el arte podrá adaptar fácilmente los métodos de silenciamiento antes mencionados a fin de lograr la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta entera o en sus partes, por ejemplo mediante el uso de un promotor adecuado. (Gen) Marcador seleccionable /Gen indicador "Marcador seleccionable", "gen marcador seleccionable" o "gen indicador" incluyen cualquier gen que confiere un fenotipo en una célula en la cual se expresa para facilitar la identificación y/o selección de las células que se transfectan o transforman con una construcción de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de ácidos nucleicos por medio de una serie de principios diferentes. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar a partir de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Los ejemplos de genes de marcadores seleccionabas incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptll que fosforila neomicina y canamicina, o hpt que fosforila higromicina o genes que confieren resistencia, por ejemplo, a bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo, bar que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporciona resistencia al glifosato, o los genes que confieren resistencia, por ejemplo, a imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tales como manA que le permite a las plantas usar mañosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de los genes marcadores visuales produce la formación de color (por ejemplo, ß-glucuronidasa, GUS o ß-galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tal como el sistema de luciferina/luciferasa) o fluorescencia (proteína fluorescente verde, GFP y sus derivados). Esta lista representa sólo una pequeña cantidad de posibles marcadores. El trabajador experto está familiarizado con tales marcadores. Se prefieren diferentes marcadores según el organismo y el método de selección.

Se sabe que después de la integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en las células de plantas, sólo una minoría de las células capta el ADN extraño y, si se desea, lo integra en su genoma, según el vector de expresión usado y la técnica de transfección usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce usualmente un gen codificador de un marcador seleccionable (tal como los descritos con anterioridad) en las células huésped junto con el gen de interés. Esos marcadores se pueden usar, por ejemplo, en mutantes en los cuales estos genes no son funcionales, por ejemplo, por eliminación con los métodos convencionales. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable se puede introducir en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usada en los métodos de la invención, o sino en un vector separado. Las células que se han transfectado en forma estable con el ácido nucleico introducido se pueden identificar, por ejemplo mediante selección (por ejemplo, las células que han integrado el marcador seleccionable sobreviven mientras que las otras células mueren).

Debido a que los genes marcadores, en particular los genes para la resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no son necesarios o no son deseados en la célula huésped transgénica una vez que se han introducido éxitosamente los ácidos nucleicos, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos utiliza ventajosamente técnicas que permiten retirar o escindir estos genes marcadores. Uno de dichos métodos es conocido como cotransformación. El método de cotransformación emplea simultáneamente dos vectores para la transformación, un vector que porta el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo que porta el/los gen(es) marcador(es). Una gran proporción de transformantes recibe o, en el caso de las plantas comprende (hasta 40% o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de la transformación con Agrobacterias, los transformantes usualmente reciben sólo una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el T-ADN, que usualmente representa el cásete de expresión. Los genes marcadores posteriormente se pueden retirar de la planta transformada mediante la realización de cruzas. En otro método, los genes marcadores integrados en un transposón se usan para la transformación junto con un ácido nucleico deseada (conocido como tecnología Ac/Ds). Los transformantes se pueden cruzar con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con una construcción del ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, en forma transitoria o estable. En algunos casos (aprox. 10%), el transposón sale del genoma de la célula huésped una vez que se ha producido la transformación con éxito y se pierde. En otros casos, el transposón salta a un lugar diferente. En estos casos, el gen marcador debe ser eliminado mediante la realización de cruzas. En microbiología, se desarrollaron técnicas que posibilitan o facilitan la detección de dichos eventos. Un método ventajoso adicional consiste en lo que se conoce como sistemas de recombinación, cuya ventaja consiste en que se puede prescindir de la eliminación por cruza. El sistema más conocido de este tipo es el denominado sistema Cre/lox. La Creí es una recombinasa que elimina las secuencias ubicadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador está integrado entre las secuencias loxP, se lo elimina por expresión de la recombinasa una vez que se ha producido éxitosamente la transformación. Otros sistemas de recombinación son los sistemas HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Es posible la integración específica de sitio en el genoma de la planta de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Obviamente, estos métodos también se pueden aplicar en microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias.

Transgénico/T ransgen /Recombinante A los fines de la invención, "transgenico", "transgen" o "recom binante" significa, con respecto por ejemplo a una secuencia de ácidos nucleicos, un cásete de expresión, una construcción génica o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con las secuencias de ácidos nucleicos, casetes de expresión o vectores de acuerdo con la invención, todas esas construcciones se producen por métodos recombinantes en los cuales (a) las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas útiles en los métodos de la invención, o (b) secuencia(s) de control genético que está(n) ligada(s) operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o (c) a) y b) no están ubicadas en su entorno genético natural o han sido modificadas por métodos recombinantes, siendo posible que la modificación adopte la forma, por ejemplo, de una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. Por entorno genético natural se entiende el locus genómico o cromosómico natural en la planta original o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el entorno genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos es preferentemente retenido, por lo menos en parte. El entorno flanquea la secuencia de ácidos nucleicos por lo menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de por lo menos 50 pb, preferentemente por lo menos 500 pb, con especial preferencia por lo menos 1000 pb, con máxima preferencia por lo menos 5000 pb. Un cásete de expresión natural - por ejemplo la combinación natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido útil en los métodos de la presente invención, como se definió anteriormente -se convierte en un cásete de expresión transgénico cuando este cásete de expresión es modificado por métodos sintéticos no naturales ("artificiales") tales como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Los métodos adecuados se describen, por ejemplo, en US 5.565.350 o WO 00/15815.

Por lo tanto, a los fines de la invención, por planta transgénica se entiende, como se indicó anteriormente, que los ácidos nucleicos usados en el método de la invención no están en su locus natural en el genoma de dicha planta, lo cual posibilita que los ácidos nucleicos se expresen en forma homóloga o heteróloga. Sin embargo, como se mencionó, transgénico también significa que, mientras los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o usadas en el método de invención están en su posición i í natural el genoma de una planta, la secuencia ha sido modificada con respecto a la secuencia natural y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales han sido modificadas. Por transgénico se entiende preferentemente la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en un locus no natural del genoma, es 5 decir, se produce la expresión homóloga, o preferentemente heteróloga, de los ácidos nucleicos. En la presente se mencionan las plantas transgénicas preferidas.

Transformación El término "introducción" o "transformación" como se menciona en la presente abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, 10 independientemente del método usado para la transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal posterior, sea por organogénesis o embriogénesis, se puede transformar con una construcción genética de la presente invención y una planta completa regenerada a partir de ella. El tejido particular elegido variará de acuerdo con los sistemas de propagación clonal disponibles y más adecuados para la especie 15 particular a transformar. Los ejemplos de tejidos específicos incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, brotes axilares y meristemas de raíz), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocotilo). El polinucleótido se puede introducir en forma transitoria o 20 estable en una célula huésped y se puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, se lo puede integrar en el genoma del huésped. La célula de planta transformada resultante luego se puede usar para regenerar una planta transformada de la manera conocida por los expertos en el arte.

La transferencia de genes extraños al genoma de una planta se denomina 25 transformación. La transformación de especies de planta es en la actualidad una técnica bastante rutinaria. Ventajosamente, se puede usar cualquiera de los diversos métodos de transformación para introducir el gen de interés en una célula ancestral adecuada. Los métodos descritos para la transformación y regeneración de las plantas a partir de los tejidos de planta o células de planta se pueden utilizar para la 30 transformación transitoria o estable. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, sustancias químicas que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación mediante virus o polen y microproyección. Los métodos se pueden seleccionar del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. 35 et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material de planta (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo con partículas recubiertas de ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrativo) o similares. Las plantas transgénicas, que incluyen plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente por medido de transformación mediada por Agrobacterium. Un método de transformación ventajoso es la transformación in planta. Con este fin, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen en las semillas de la planta o inocular el meristema de la planta con las agrobacterias. De acuerdo con la invención, se ha demostrado que es particularmente oportuno permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe en la planta intacta o por lo menos en los primordios de la flor. Luego se cultiva la planta hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los métodos para la transformación de arroz mediada por Agrobacterium incluyen métodos bien conocidos para la transformación de arroz, tales como los descritos en alguna de las siguientes: solicitud de patente europea EP 1198985 A1 , Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan por referencia a la presente como si se expusieran en su totalidad. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es el que se describe en Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129(1 ): 13-22, 2002), cuyas descripciones se incorporan por referencia a la presente como si se expusieran en su totalidad. Dichos métodos también se describen a modo de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Planta transgénicas, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991 ) 205-225). Los ácidos nucleicos o la construcción a ser expresada se clona preferentemente en un vector que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al., Nucí. Acids Res. 12 (1984) 8711 ). Las agrobacterias transformadas por dicho vector se pueden usar de la manera conocida para la transformación de plantas, tales como las plantas usadas como modelo, como Arabidopsis (dentro del alcance de la presente invención, Arabidopsis thaliana no se considera una planta de cultivo), o plantas de cultivo tales como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo mediante la inmersión de hojas machacadas u hojas picadas en una solución de agrobacterias y el posterior cultivo en un medio adecuado.

La transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens se describe, por ejemplo, en Hófgen and Willmitzer in Nucí. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce ínter alia de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Planta transgénicas, Vol. 1 , Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Además de la transformación de células somáticas, que luego se han de regenerar en plantas intactas, también es posible transformar las células de los meristemas de las plantas y, en particular, las células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando origen a plantas transgénicas. De este modo, por ejemplo, las semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y las semillas se obtienen a partir de las plantas en desarrollo, de las cuales se transforma una cierta proporción y de este modo son transgénicas [Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289], Los métodos alternativos se basan en la eliminación reiterada de las inflorescencias y la incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con las agrobacterias transformadas, por la cual las semillas transformadas también se pueden obtener en un momento posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un método especialmente efectivo es el método de infiltración al vacío con sus modificaciones, tal como el método de "inmersión floral". En el caso de infiltración al vacío de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión de agrobacterias [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], mientras que en el caso del método de "inmersión floral" el tejido floral en desarrollo se incuba durante poco tiempo con una suspensión de agrobacterias tratada con tensioactivos [Clough, SJ and Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. En ambos casos se cosecha una proporción determinada de semillas transgénicas, y estas semillas se pueden distinguir de las semillas no transgénicas cultivándolas en las condiciones selectivas descritas anteriormente. Además, la transformación estable de los plástidos es ventajosa porque los plástidos se heredan por vía materna en la mayoría de los cultivos, lo cual reduce o elimina el riesgo de flujo del transgén mediante el polen. La transformación del genoma del cloroplasto se obtiene generalmente por un proceso que exhibe en forma esquemática Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. En resumen, las secuencias a transformar se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre las secuencias flanqueadoras homologas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueadoras homólogas dirigen la integración específica de sitio en el plastoma. Se ha descrito la transformación de los plástidos para diferentes especies de plantas y se brinda un análisis general en Bock (2001 ) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21 ; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21 , 20-28. Recientemente se han informado más avances biotecnológicos en forma de transformantes de plástidos libres de marcador, que se pueden producir con un gen marcador cointegrado transitorio (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225- 229).

Rotulado de activación de T-ADN El rotulado de activación de T-ADN (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353) comprende la inserción de T-ADN, que generalmente contiene un promotor (también puede ser un potenciador de la traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb secuencia arriba o abajo de la región codificadora de un gen de manera tal que el promotor dirige la expresión del gen blanco. Generalmente, la regulación de la expresión del gen blanco es alterada por su promotor natural y el gen cae bajo el control del promotor recién introducido. El promotor generalmente está insertado en un T-ADN. Este T-ADN se inserta aleatoriamente en el genoma vegetal, por ejemplo, por infección de Agrobacterium y conduce a la expresión modificada de los genes cerca del T-ADN insertado. Las plantas transgénicas obtenidas muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de genes cercanos al promotor introducido.

TILLING El término "TILLING" es una abreviatura de "Lesiones locales dirigidas inducidas en genomas" [Targeted Induced Local Lesions In Genomes] y se refiere a una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificada. TILLING también permite la selección de plantas que portan tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir expresión modificada, tanto en relación a la potencia o localización o duración (por ejemplo, si las mutaciones afectan al promotor). Estas variantes mutantes pueden exhibir mayor actividad que la exhibida por el gen en su forma natural. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con métodos de detección de alto rendimiento. Las etapas que típicamente se siguen en TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei GP and Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91 -104); (b) preparación de ADN y agrupación de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización y apareamiento para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, donde se detecta la presencia de un heterodúplex en una agrupación como un pico extra en el cromatograma; (0 identificación del individuo mutante; y (g) secuenciación del producto de PCR mutante. Los métodos para TILLING son bien conocidos en el arte (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; reviewed by Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Recombinación homóloqa La recombinación homologa permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homologa es una tecnología estándar usada en forma rutinaria en las ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levaduras o musgo Physcomitrella. Se han descrito métodos para realizar la recombinación homóloga en plantas, no sólo para plantas modelo (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8) y hay enfoques que se pueden aplicar de manera general independientemente del organismo blanco (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).

Rendimiento El término "rendimiento" significa en general un producto medible de valor económico, típicamente relacionado con un cultivo específico, un área y un período de tiempo. Cada una de las partes de la planta contribuye directamente al rendimiento sobre la base de su cantidad, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por metro cuadrado para un cultivo y año, que se determina dividiendo la producción total (incluye la producción cosechada y tasada) por metros cuadrados plantados. El término "rendimiento" de una planta se puede relacionar con la biomasa vegetativa (biomasa de raíz y/o brote), con los órganos reproductores y/o con los propágulos (tales como semillas) de esa planta.

Vigor temprano "Vigor temprano" se refiere al crecimiento equilibrado, saludable y activo, en especial durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta, y puede ser el resultado de una mayor aptitud de la planta debido, por ejemplo, a que las plantas se adaptan mejor a su ambiente (es decir, optimización del uso de los recursos de energía y distribución entre brote y raíz). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran mayor supervivencia de las plántulas y un mejor establecimiento del cultivo, lo que con frecuencia da como resultado campos muy uniformes (en donde el cultivo crece en forma uniforme, es decir, la mayoría de las plantas alcanzan los diversos estadios de crecimiento casi al mismo tiempo), y con frecuencia mejor y mayor rendimiento. En consecuencia, el vigor temprano se puede determinar midiendo diversos factores, tales como peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de la plántula, altura de la plántula, longitud de la raíz, biomasa de la raíz y del brote, entre otros.

Incrementar/meiorar/potenciar Los términos "incrementar", "mejorar" o "potenciar" son indistintos y significan, en el sentido de la solicitud, al menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%, preferentemente al menos 15% o 20%, más preferentemente 25%, 30%, 35% o 40% más rendimiento y/o crecimiento en comparación con las plantas de control como se definen en la presente.

Rendimiento de la semilla Un mayor rendimiento de la semilla se puede manifestar como uno o más de los siguientes: a) un aumento de la biomasa de la semilla (peso total de la semilla) que puede ser en base a cada semilla y/o planta y/o metro cuadrado, b) mayor cantidad de flores por planta; c) mayor cantidad de semillas (llenas); d) mayor tasa de llenado de la semilla (que se expresa como la relación entre la cantidad de semillas llenas dividido por la cantidad total de semillas); e) mayor índice de cosecha, que se expresa como la relación entre el rendimiento de las partes cosechables, tales como semillas, dividido por la biomasa total; y f) mayor peso de mil granos (TKW), que se extrapola a partir de la cantidad de semillas llenas contadas y su peso total. Un mayor TKW puede ser el resultado de un mayor tamaño de la semilla y/o peso de la semilla, y también puede ser el resultado de un mayor tamaño del embrión y/o endosperma.

Un aumento del rendimiento de la semilla también se puede manifestar como un aumento del tamaño de la semilla y/o volumen de la semilla. Además, un aumento del rendimiento de la semilla también se puede manifestar como un aumento del área de la semilla y/o longitud de la semilla y/o ancho de la semilla y/o perímetro de la semilla. El mayor rendimiento también puede dar como resultado una arquitectura modificada o puede producirse a causa de la arquitectura modificada. índice de verdor El "índice de verdor" como se usa en la presente se calcula a partir de las imágenes digitales de las plantas. Por cada píxel perteneciente a la planta objeto en la imagen, se calcula la relación del valor verde versus el valor rojo (para codificar el color en el modelo RGB). El índice de verdor se expresa como el porcentaje de píxeles para el cual la relación entre verde y rojo excede en un umbral determinado. En condiciones normales de crecimiento, en condiciones de crecimiento con estrés salino y en condiciones de crecimiento con disponibilidad reducida de nutrientes, el índice de verdor de las plantas se mide en la última toma de imágenes antes de la floración. Por el contrario, en condiciones de crecimiento con estrés por sequía, el índice de verdor de las plantas se mide en la primera toma de imágenes después de la sequía.

Planta El término "planta" como se usa en la presente abarca plantas completas, ancestros y progenie de las plantas y partes de las plantas, que incluyen semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluso tubérculos), flores y tejidos y órganos, donde cada uno de los anteriores comprende el ácido nucleico/gen de interés. El término "planta" también abarca células de planta, cultivos en suspensión, tejidos de callos, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas, donde cada uno de los anteriores comprende el ácido nucleico/gen de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen forraje o legumbres forrajeras, plantas ornombrentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. Cpor ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. Cpor ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [cañóla, semilla de aceite de colza, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucúrbita spp., Cucumis spp., Cy ara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., E/ae s (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleífera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japónica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo, O/yza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Púnica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Sa//x sp., Sambucus spp., Sécale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otros.

Descripción detallada de la invención Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que modulando la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 provee plantas con características modificadas de crecimiento con relación a plantas de control. De acuerdo a una primera realización, la presente invención provee un método para alterar las características de crecimiento en plantas con relación a plantas de control y en particular para modificar fenotipos regulados por la luz, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 o su parte. En una realización particular, en donde HUB1 está expresada con errores, el fenotipo modificado regulado por la luz abarca una modificación del reloj circadiano de la planta, una modificación de las vías corriente abajo del reloj circadiano, como una capacidad fotosintética (ejemplificada por pigmentos fotosintéticos reducidos, defectos en las estructuras de los plástidos), un patrón de expresión modificada de genes del desarrollo, y/o desarrollo modificado de la planta, ejemplificado por momentos alterados de la floración o una arquitectura modificada de la planta (incluyendo morfología de la hoja, morfología de la flor o longitud del hipocótilo). De acuerdo con otra realización, la presente invención provee un método para mejorar las características de crecimiento en plantas, en particular vigor temprano aumentado, vigor de germinación aumentado y/o rendimiento aumentado (biomasa y/o rendimiento de semilla) con relación a plantas de control, que comprende modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 en una planta, y/o que comprende modular la expresión de genes que codifican proteínas objetivas de HUB1 y/o proteínas que interactúan con HUB1.

Un método preferido de modulación (aumentando o disminuyendo) la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 es al introducir y expresar en la planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 o su parte. El término "expresión por error" de un gen como se usa en la presente invención comprende la expresión regulada descendentemente del gen así como actividad reducida de la proteína codificada por el gen al por ejemplo reducir la concentración de la proteína (síntesis reducida o degradación aumentada) o al introducir mutaciones en la proteína para la disminución de la actividad intrínseca o la capacidad de interactuar con ligandos, cofactores u otros interactuantes. Los métodos para regular descendentemente la expresión se proveen en la sección de definiciones.

Cualquier referencia de aquí en adelante hecha en la presente a una "proteína útil en los métodos de la invención" debe interpretarse como que significa un polipéptido HUB1 como se definió en la presente. Cualquier referencia de aquí en adelante hecha en la presente a un "ácido nucleico útil en los métodos de la invención" debe interpretarse como que significa un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido HUB1 o una parte de ésta. El ácido nucleico que va a introducirse en una planta (y por lo tanto son útiles en la realización de los métodos de la invención) es cualquier ácido nucleico que codifica el tipo de proteína que se describirá a continuación, también denominada a continuación en la presente "un ácido nucleico HUB1" o "un gen HUB1".

Un "polipéptido HUB1" como se define en la presente se refiere a una proteína ubiquitina ligasa (E3 ligasa) que comprende un dominio RING. Las E3 ligasas intervienen en la ubiquitinación de proteínas sustrato. Con preferencia, el polipéptido HUB1 pertenece a la clase RING HCa de las proteínas E3 ligasa (Stone et al., Plant Physiol. 137, 13-30, 2005). El dominio RING es un tipo especial de dominios de dedo de Zn y está involucrado en las interacciones proteína-proteína. Con preferencia, el dominio RING es un dominio RING tipo C3HC4 y corresponde a Pfam entrada PF00097. Los dominios C3HC4 tiene la siguiente secuencia de consenso (Lorick et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96, 11364-11369, 1999): C-X2-C-X(9-39)-C-X(1-3)-H-X(2-3)-C-X2-C-X(4-48)-C-X2-C (los residuos de coordinación del cofactor están indicados en negrita subrayado, ver además el alineamiento múltiple en la Figura 2). Con preferencia, la secuencia de consenso es C-X2-C-X11-C-X-H-X2-C-X2-C-X11-C-X2-C. Los dominios C3HC4 se informa que enlazan 2 cofactores metálicos, en particular zinc; el primer cofactor está enlazado putativamente por los primeros cuatro residuos de coordinación (números 1 a 4 en la Fig.1 B(i) y el segundo cofactor está enlazado putativamente por los últimos cuatro residuos de coordinación (números 5 a 8 en la Fig.1 B(i)).

El término "polipéptido HUB1" como se usa en la presente invención también abarca formas mutantes con autopoliubiquitinación reducida pero con actividad de ubiquitinación del sustrato normal, reducida o eliminada completamente (formas dominantes positivas de un polipéptido HUB1). En uno de tales formas dominantes positivas, los residuos Cys nr 1 y 2 del dominio C3HC4 (Fig. 1 B(i)) se mutaron a residuos Ser (Fig. 1B(ii) y (iii)).

Alternativamente, el homólogo de una proteína HUB1 tiene en orden ascendente de preferencia al menos 18%, 19%, 20%, 21 %, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31 %, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia total con el aminoácido representado por SEQ ID NO: 2, siempre que la proteína homologa comrpenda los motivos conservados como se delinearon anteriormente. La identidad de secuencia total se determina utilizando un algoritmo de alineamiento global, tal como el algoritmo Needleman Wunsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), preferentemente con parámetros predeterminados. En comparación con la identidad de secuencia total, la identidad de secuencia generalmente será mayor cuando sólo se consideran los dominios o motivos conservados (tal como el dominio RING, ver el Ejemplo 3).

Con preferencia, la secuencia de polipéptidos que cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con el grupo de polipéptidos HUB1 que comprenden la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 (At2g44950) más que con cualquier otro grupo de proteínas que comprenden un dominio RING.

Los términos "dominio", "distintivo" y "motivo" están definidos en la sección "Definiciones" de la presente. Existen bases de datos especializadas para la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucí. Acids. Res. 31 , 315-318), Prosite (Bucher and Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61 , AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucí. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)), o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1 ): 276-280 (2002)). Se dispone de un conjunto de herramientas para el análisis in silico de secuencias de proteínas en el servidor ExPASy Proteomics (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31 :3784-3788(2003)). También se pueden identificar dominios o motivos usando técnicas de rutina, tal como alineamiento de secuencias.

Los métodos para el alineamiento de secuencias para su comparación son conocidos en el arte, y dichos métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar el alineamiento global (es decir, que abarca las secuencias completas) de dos secuencias que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de brechas. El algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403- 10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está disponible al público a través del National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Los homólogos se pueden identificar con facilidad mediante, por ejemplo, el algoritmo ClustalW de alineamiento de secuencia múltiple (versión 1.83), con los parámetros de alineamiento apareado predeterminado y un método de calificación en porcentaje. Los porcentajes globales de similitud e identidad también se pueden determinar mediante uno de los métodos disponibles en el paquete de software atGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences ). Se puede realizar edición manual menor para optimizar el alineamiento entre motivos conservados, como sería evidente para un experto en el arte. Además, en lugar de utilizar secuencias de longitud total para la identificación de homólogos, también se pueden usar dominios específicos. Los valores de identidad de secuencia se pueden determinar para la totalidad de la secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos, o para dominios seleccionados o motivo(s) conservado(s), utilizando los programas antes mencionados con los parámetros predeterminados. Para el alineamiento local, es particularmente útil el algoritmo de Smith-Waterman (Smith TF, Waterman MS (1981 ) J. Mol. Biol 147(1 ); 195-7).

Además, los polipéptidos HUB1 (al menos en su formas nativa) típicamente interviene en la monoubiquitinación de Histona H2B. Las herramientas y técnicas para medir la ubiquitinación ¡n vitro son muy conocidas en el arte, ver por ejemplo Fleury et al (2007) o Liu et al (2007). Se proveen detalles adicionales en el Ejemplo 6.

Además, los polipéptidos HUB1 , cuando se expresan en arroz o Arabidopsís de acuerdo con los métodos de la presente invención se desarrollan en la sección de Ejemplos, producen plantas con entre otros, fenotipos modificados regulados por la luz, vigor temprano aumentado, vigor de germinación aumentado y/o rasgos relacionados con el aumento de rendimiento de semillas, incluyendo (pero no limitado a) número total de semillas, número de semillas llenas o peso total de semillas.

La invención además provee formas dominantes positivas de un polipéptido HUB1. En una forma dominante positiva (HUBI pm), el residuo Cys nr 1 y 2 del dominio C3HC4 (Fig. 1 B(i)) se mutaron a residuos Ser (Fig. 1 B(ii) y (iii)). Sorprendentemente, la monoubiquitinación de H2B no fue influenciada por estas mutaciones puntuales (Figura 5, HA-Ab) mientras que la actividad de autopollubiquitinación de HUB1 fue afectada negativamente. Además la presencia del sustrato redujo la actividad de autopoliubiquitinación, sugiriendo que en ausencia de sustrato la proteína HUB1 puede ser retirada a través de degradación de la proteína. Esta autoregulación reducida puede llevar a la estabilización de la proteína, por lo cual creando una forma dominante positiva de la proteína con actividad aumentada.

La sobreexpresión de HUB1 de tipo silvestre tiene influencia positiva sobre el crecimiento vegetal, por lo tanto se espera que un forma dominante positiva o estabilizada de HUB1 puede permitir mejoras adicionales sobre los efectos de crecimiento (Ver Ejemplo 16). También se postula que otras mutaciones que evitan sustancialmente la unión del cofactor en uno o ambos sitios de unión al Zn tendrán un efecto comparable sobre la función de las proteínas; estas otras mutaciones abarcan cualquier tipo de mutación(es), incluyendo mutagénesis por inserción para desorganizar o aumentar el cuadro de lectura abierta. El término "polipéptido HUB1" como se utiliza en la presente invención por lo tanto también abarca formas mutantes con autopoliubiquitinación reducida pero con actividad de ubiquitinación de sustrato normal, reducida o eliminada completamente.

Por lo tanto, de acuerdo con una realización adicional de la presente invención, se provee un polipéptido aislado seleccionado de: (i) Una secuencia de polipéptidos que codifican una proteina HUB1 como se definió antes, que comprende en su dominio RING una o mas mutaciones que evitan sustancialmente la unión del cofactor en los sitios de unión de Zn y en donde dicha una o mas mutaciones reducen la autopoliubiquitinaciónsin afectar la ubiquitinación del sustrato; (ii) una secuencia de polipéptidos de HUB1 representada por SEQ ID NO: 28; (iii) una secuencia de polipéptidos con, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 28, y que comprende un dominio RING, cuyo dominio RING comprende una o mas mutaciones como se definió en (i); (iv) fragmentos funcionales de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dados en (i), (ii), o (iii) antes, siempre que el fragmento funcional comprenda un dominio RING, cuyo dominio RING comprende una o mas mutaciones como se definió en (i).

Con preferencia, la secuencia de polipéptidos HUB1 como se definió en (i) antes es un polipéptido HUB1 en donde la unión de un cofactor está impedido sustancialmente, mas preferentemente la unión del primer cofactor está impedido.

De acuerdo con una realización adicional de la presente invención, también se provee una molécula ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido HUB1 como se definió en (i) a (iv) antes, o un ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones rigurosas con el complemento de un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido HUB1 como se definió en (i) a (iv) antes; con preferencia el ácido nucleico aislado como representado por SEQ ID NO: 49.

En una realización adicional, la invención provee genes con niveles de expresión alterados en plantas que sobreexpresan un polipéptido HUB1 con relación a los niveles de expresión en las correspondientes plantas de tipo silvestre. Además, la presente invención provee medios para modular la expresión de estos genes, que a su vez permiten la modulación de los procesos biológicos que ellos controlan. La presente invención provee métodos pata imitar el nivel y/o actividad del polipéptido HUB1 al manipular factores corriente abajo involucrados en las vías reguladas por el polipéptido HUB1. Esta estrategia permite ajusfar los efectos del polipéptido HUB1. Mientras que la sobreexpresión o regulación descendente de un polipéptido HUB1 puede ser pleiotropico y/o puede tener efectos pleiotropicos, la invención provee métodos para alterar las características de las plantas de una manera mas controlada y dirigida, al usar los genes objetivo del polipéptido HUB1 como se definió en la presente invención. Ahora es posible la modulación de procesos biológicos particulares y puede dar lugar a plantas con características alteradas, que pueden tener aplicaciones útiles particularmente en agricultura y horticultura, como rasgos mejorados relacionados con el rendimiento para plantas que crecen en condiciones normales o bajo estrés.

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar uno o mas rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende modificar en una planta la expresión de uno o mas ácidos nucleicos y/o modificar el nivel y/o la actividad de una o mas proteínas, cuyos ácidos nucleicos o proteínas son similares esencialmente a cualquiera de los genes de las listas en la Tablas G a K, y en donde dichos uno o mas rasgos relacionados con el rendimiento están alterados con relación a correspondientes plantas de tipo silvestre. Además, la presente invención provee métodos para modificar el reloj circadiano en plantas, para modificar la capacidad fotosintética y/o para modificar el desarrollo de las plantas.

La presente invención se ilustra mediante la transformación de plantas con la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 1 , que codifica la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2 y con las plantas que comprenden una mutación en el gen HUB1 (hub1-1 , Fleury et al, 2007). Sin embargo, la realización de la invención no se encuentra restringida a estas secuencias; los métodos de la invención pueden llevarse a cabo ventajosamente utilizando cualquier ácido nucleico que codifica HUB1 o polipéptido HUB1 como se definió en la presente, o cualquier mutante dominante positivo de HUB1. Alternativamente, las plantas se puede someter a mutagenesis para generar una forma mutante del gen HUB1 endógeno que tiene las mismas características funcionales como el mutante dominante positivo o el mutante hub1 -1. La técnicas para generar dicho tipo de mutaciones se conocen en el arte (tal como TILLING o recombinación específica a sitio (Thomson and Ow, Génesis 44, 465-476, 2006)). Además, cualquiera de los genes enumerados en las Tablas G a K (que incluyen SEQ ID NO: 50 a SEQ ID NO: 243), o el ortólogo de dichos genes, se pueden usar en los métodos de la presente invención.

Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 se indican en la Tabla A del Ejemplo 1 de la presente. Dichos ácidos nucleicos son útiles para llevar a cabo los métodos de la invención. Las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 son ejemplos de secuencias de ortólogos y parálogos del polipéptido HUB1 representadas por SEQ ID NO: 2, en donde los términos "ortólogos" y "parálogos" son como se definen en la presente. Se pueden identificar fácilmente ortólogos y parálogos adicionales al llevar a cabo la denominada búsqueda blast recíproca. Típicamente, esto incluye un primer BLAST que implica someter a BLAST una secuencia incógnita (por ejemplo, usando cualquiera de las secuencias enumeradas en la Tabla A del Ejemplo 1 ) contra cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos disponible al público NCBI. En general, se utiliza BLASTN o TBLASTX (con valores predeterminados estándar) cuando se comienza desde una secuencia de nucleótidos, y BLASTP o TBLASTN (con valores predeterminados estándar) cuando se comienza desde una secuencia de proteínas. Opcionalmente, se pueden filtrar los resultados de BLAST. Las secuencias de longitud total de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados luego se somenten de nuevo a BLAST (segundo BLAST) contra secuencias provenientes del organismo del cual deriva la secuencia incógnita (cuando la secuencia incógnita es SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, el segundo BLAST sería, por lo tanto, contra secuencias de Arabidopsis). Luego se comparan los resultados del primer y segundo BLAST. Se identifica un parálogo si una coincidencia de alto rango en el primer BLAST proviene de la misma especie de la cual deriva la secuencia incógnita, entonces una nueva búsqueda BLAST idealmente da como resultado que la secuencia incógnita se encuentre entre las mayores coincidencias; se identifica un ortólogo si una coincidencia de alto rango en el primer BLAST no proviene de la misma especie de la cual deriva la secuencia incógnita, y preferentemente da como resultado que la nueva búsqueda BLAST en la secuencia incógnita se encuentre entre las mayores coincidencias.

Las coincidencias de alto rango son las que tienen bajo valor E. Cuanto más bajo es el valor E, más significativa es la calificación (o, en otras palabras, menor la probabilidad de hallar la coincidencia por azar). El cálculo del valor E es bien conocido en el arte. Además de los valores E, las comparaciones también se califican por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere a la cantidad de nucleótidos idénticos (o aminoácidos) entre las dos secuencias comparadas de ácidos nucleicos (o polipéptidos) en una longitud particular. En el caso de grandes familias, se puede usar ClustalW, seguido de un árbol de unión cercano, para contribuir a visualizar la agrupación de genes relacionados e identificar ortólogos y parálogos.

Ejemplos de proteínas involucradas en el reloj circadiano, en la respuesta de salida del reloj circadiano y/o desarrollo se proveen en las Tabla G, H e I. Ejemplos de proteínas que interactúan con HUB1 están en las listas de las Tablas J, K y L. Todas las otras proteínas (incluyendo ortólogos) son útiles en los métodos de la presente invención, en adelante denominadas "otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención".

Las variantes de ácido nucleico también pueden ser útiles para practicar los métodos de la invención. Los ejemplos de dichas variantes incluyen ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o de otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención, siendo los términos "homólogo" y "derivado" como se definen en la presente. También son útiles en los métodos de la invención los ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de ortólogos o parálogos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o de otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención. Los homólogos y derivados útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica y funcional como la proteína no modificada a partir de la cual se derivan.

Otras variantes de ácido nucleico útiles para practicar los métodos de la invención incluyen porciones de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 , ácidos nucleicos que hibridan con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 , variantes de empalme de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 , variantes alélicas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 y variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 , obtenidos por transposición génica. Los términos secuencia de hibridación, variante de empalme, variante alélica y transposición génica son como se describen en la presente. También las variants de ácido nucleico de ácidos nucleicos que codifican otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención, ácidos nucleicos que hibridan con ácidos nucleicos que codifican otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención, variantes de empalme de ácidos nucleicos que codifican otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención, variantes alélicas de ácidos nucleicos que codifican otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención, y variantes de ácidos nucleicos que codifican otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención obtenidos por transposición génica son útiles para practicar los métodos de la invención.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 u otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención no necesitan ser ácidos nucleicos de longitud total, dado que la realización de los métodos de la invención no depende del uso de secuencias de ácidos nucleicos de longitud total. De acuerdo con la presente invención, se provee un método para modificar las características de crecimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una porción de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K, o una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K .

Una porción de un ácido nucleico se puede preparar, por ejemplo, al hacer una o más eliminaciones al ácido nucleico. Las porciones se pueden usar en forma aislada o se pueden fusionar con otras secuencias codificadoras (o no codificadoras), por ejemplo, a fin de producir una proteína que combine varias actividades. Cuando se fusiona con otras secuencias codificadoras, el polipéptido resultante producido tras la traducción puede ser más grande que el previsto para la porción de proteína.

Las porciones útiles en los métodos de la invención, codifican un polipéptido HUB1 como se define en la presente, y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K. Con preferencia, la porción es una porción de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A del Ejemplo 1 , o es una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Con preferencia la porción tiene al menos 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1 100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000 nucleótidos consecutivos de longitud, siendo los nucleótidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K, o de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en la Tablas G a K. Con máxima preferencia la porción es una porción del ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o de un ácido nucleico que codifica una proteína indicado en las Tablas G a K. Preferentemente, la porción codifica un fragmento de una secuencia de polipéptidos HUB1 el cual cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con el grupo de polipéptidos HUB1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 (At2g44950) más que con cualquier otro grupo de proteínas que comprenden un dominio RING.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es un ácido nucleico capaz de hibridarse, en condiciones de rigurosidad reducida, con preferencia en condiciones rigurosas, con un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 , como se define en la presente o con un ácido nucleico que codifica una proteína tal como se indica en cualquiera de las Tablas G a K, o con una porción como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para modificar las características de crecimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K, o que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K.

Las secuencias de hibridación útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido HUB1 como se define en la presente, que tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K. Con preferencia, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K, o con una porción de cualquiera de estas secuencias, siendo una porción como se definió anteriormente, o la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K. Con máxima preferencia, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con el complemento de un ácido nucleico como se representa por SEQ ID NO: 1 o con una porción de ésta.

Para HUB1 , la secuencia de hibridación preferentemente codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que cuando es de longitud total y se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con el grupo de polipéptidos HUB1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 (At2g44950) más que con cualquier otro grupo de proteínas que comprenden un dominio RING. Preferentemente, la secuencia de hibridación codifica una proteína que tiene un dominio RING tipo C3HC4.

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es una variante de empalme que codifica un polipéptido HUB1 , como se definió anteriormente en la presente o que codifica otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención, siendo una variante de empalme como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para modificar las características de crecimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de empalme de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K.

Las variantes de empalme preferidas son variantes de empalme de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1 , o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 2. Con preferencia, la secuencia de aminoácidos HUB1 codificada por la variante de empalme, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con el grupo de polipéptidos HUB1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 (At2g44950) más que con cualquier otro grupo de proteínas que comprenden un dominio RING. Preferentemente, la variante de empalme codifica una proteína que tiene un dominio RING tipo C3HC4.

Otra variante de ácido nucleico útil para realizar los métodos de la invención es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 como se definió anteriormente en la presente o que codifica otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención, siendo una variante alélica como se define en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para modificar las características de crecimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K.

Los polipéptidos codificados por variantes alélicas útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica como el polipéptido HUB1 de SEQ ID NO: 2 y cualqueira de los aminoácidos representados en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K. Las variante alélicas existen en la naturaleza, y el uso de estos alelos naturales está comprendido en los métodos de la presente invención. Preferentemente, la variante alélica es una variante alélica de SEQ ID NO: 1 o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 2 o de una proteína indicada en las Tablas G a K. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos HUB1 codificada por la variante alélica, al ser usada en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con el grupo de polipéptidos HUB1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 (At2g44950) más que con cualquier otro grupo de proteínas que comprenden un dominio RING. Preferentemente, la variante alélica codifica una proteína que tiene un dominio RING tipo C3HC4.

La transposición génica o evolución dirigida también se puede usar para generar variantes de de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 como se definió anteriormente o que codifica otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención; el término "transposición génica" es como se definió en la presente.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para modificar las características de crecimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1 o en las Tablas G a K, donde dicha variante de ácido nucleico se obtiene por transposición génica.

Preferentemente la secuencia de aminoácidos HUB1 codificada por la variante de ácido nucleico obtenido por transposición génica, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con un grupo de polipéptidos HUB1 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 (At2g44950) más que con cualquier otro grupo de proteínas que comprenden un dominio RING.

Asimismo, las variants de ácidos nucleicos también se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida a sitio. Hay diversos métodos disponibles para lograr mutagénesis dirigida a sitio, siendo los más comunes los métodos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 u otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención pueden derivar de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico se puede modificar de su forma nativa en composición y/o medio genómico mediante manipulación humana deliberada. Preferentemente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 o ácidos nucleicos que codifican otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención son de una planta, con más preferencia de una planta dicotiledónea o de una planta monocotiledónea. El ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 de una planta dicotiledónea es con preferencia de la familia Brassicaceae, con mayor preferencia de Arabidopsis thaliana.

La realización de los métodos de la invención proporciona plantas con características modificadas de crecimiento. En particular la realización de los métodos de la invención proporciona plantas con fenotipos modificados regulados por la luz, vigor de germinación aumentado, vigor temprano aumentado, resistencia al estrés aumentado, forma alterada del fruto y/o rendimiento de semilla aumentada con relación a las plantas de control. El término "rendimiento de semillas" se describe en mayor detalle en la sección de "definiciones" de la presente. Nótese que los términos "características modificadas de crecimiento" o "rendimiento" como se utiliza en la presente invención no abarcan la biomasa vegetativa (como raíces, hojas, tallos) excepto donde se utiliza un mutante dominante positivo de HUB1 en los métodos de la presente invención.

La referencia en la presente a características modificadas de crecimiento también abarca una modificación del fenotipo regulado por la luz, que incluye, pero no se limita a, una alteración del reloj circadiano, y una modificación de la vías corriente abajo del reloj circadiano (las respuestas de salida del reloj circadiano). Las vías modificadas corriente abajo abarcan una o mas de una capacidad fotosintética modificada, expresión alterada de los genes involucrados en el desarrollo de las plantas y desarrollo modificado de la planta. La modificación del reloj circadiano comprende la expresión modificada de los genes de entrada al reloj circadiano así como genes oscilantes y genes de salida. La "respuesta de salida modificada del reloj circadiano" o las "vías modificadas corriente abajo" como se utilizan en la presente invención abarcan una modificación de la capacidad fotosintética, tal como una modificación en la concentración de pigmentos fotosintéticos (clorofila a y b y carotenoides totales) en una célula vegetal, estructura modificada del plástido, o estructura modificada del cloroplasto. La "respuesta de salida modificada del reloj circadiano" o las "vías modificadas corriente abajo" como se utilizan en la presente invención también abarcan expresiones alteradas de genes involucrados en el desarrollo de las plantas y modificaciones en el desarrollo de las plantas como arquitectura alterada (incluyendo longitud reducida de hipocótilo, morfología modificada de la hoja, morfología alterada de la flor) y/o momento de floración alterado.

Por lo tanto la presente invención provee un método para modificar la expresión de los genes de entrada del reloj circadiano, de genes oscilantes, de genes de salida y/o de genes de desarrollo, cuyo método comprende con preferencia modular la expresión de un polipéptido HUB1. Algunos de estos genes están ubicados cercanos uno de otro en el cromosoma. Por lo tanto, se puede utilizar HUB1 como un regulador de la transcripción para sincronizar la transcripción de genes que forman un agrupamiento. Ejemplos de dichos agolpamientos son genes fotosintéticos, genes del reloj circadiano o genes del desarrollo. La expresión modificadas de los genes de entrada del reloj circadiano, genes oscilantes, genes de salida, genes del desarrollo y/o genes en las listas de las Tablas G a K (o sus ortólogos) como resultado de la modulación de la expresión de HUB1 puede a su vez resultar en características mejoradas de crecimiento en plantas como rendimiento aumentado o tolerancia aumentada al estrés. Por lo tanto la presente invención provee un método para mejorar las características de crecimiento en plantas cuyo método comprende modular la expresión de los genes de entrada del reloj circadiano, genes oscilantes, genes de salida y/o genes del desarrollo como resultado de la modulación de la expresión de HUB1. La presente invención también provee un método para mejorar las características de crecimiento que comprende modular la expresión de cualquiera de los genes en las listas de las Tablas G a K, o el ortólogo de dicho gen. Los métodos para identificar el ortólogo de un gen como se describió antes. La expresión modulada puede ser una expresión aumentada o disminuida.

La presente invención también provee un método para alterar el desarrollo de las plantas, en particular para alterar el momento de floración y/o para modificar la arquitectura de la planta.

El momento de floración es el tiempo transcurrido entre el sembrado y el comienzo del crecimiento reproductivo. Los métodos convencionales para determinar el comienzo de la floración incluye la disección de plantas bajo magnificación para determinar la presencia de una estructura vegetativa o una reproductiva en el meristema: para controlar la emergencia de la inflorescencia, conocida de otro modo como momento de "emergencia" o "momento del capítulo", o para controlar antesis. Un método utilizado ampliamente para determinar el comienzo de la floración en cultivos en el campo Involucra repetidas inspecciones visuales de los lotes para estimar el número de plantas en floración presentes en un lote. Se acepta convencionalmente en agronomía que un lote esta "floreciendo" cuando el 50% de las plantas en un lote exhiben inflorescencia emergida. Se describe aún otro método en WO 2007/093444, este método se basa en el análisis con computadora de imágenes digitales tomadas de las plantas en crecimiento.

El término arquitectura de las plantas abarca la apariencia o morfología de una planta, incluyendo cualquier una o mas características estructurales o la combinación de sus características estructurales. Tales características estructurales incluyen forma, tamaño, número, posición, textura, disposición y patrones de cualquier célula, tejido u órgano o grupos de células, tejidos u órganos de una planta, incluyendo la raíz, hoja, brote, tallo o retoños, pecíolo, tricoma, flor, inflorescencia (para plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), panículas, pétalo, estigma, estilo, estambre, polen, óvulo, semilla, embrión, endosperma, recubrimiento de semilla, aleurona, fibra, cambium, madera, duramen, parénquima, aerenquima, elementos de tamiz, floema o tejido vascular, entre otros. Por lo tanto la arquitectura modificada incluye todos los aspectos del crecimiento modificada en la planta.

Con preferencia, las plantas de acuerdo con la invención exhiben arquitectura modificada, cuya arquitectura modificada incluye uno mas de crecimiento atrofiado, morfología modificada de la hoja, morfología modificada del hipocótilo, morfología alterada de la flor, con relación a plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para modificar la arquitectura de plantas, particularmente uno o mas de crecimiento atrofiado, morfología modificada de la hoja, morfología modificada del hipocótilo, morfología alterada de la flor, cuyo método comprende modular la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido HUB1 como se definió en la presente. El término "crecimiento atrofiado" como se usa en la presente significa una reducción el la altura de la planta sin afectar el tamaño de los órganos, aportando a la planta un fenotipo tupido, en contraste a enanismo o crecimiento en miniatura en el cual las proporciones se mantiene pero el crecimiento total de la planta está reducida.

El dominio RING en las proteínas HUB1 se conoce que está involucrada en las interacciones proteína-proteína. En la presente invención, se muestra que HUB1 interacciona con diversas proteínas (Ejemplo 22). Además de homodimerisación y dimerisación con su parálogo HUB2, HUB1 también interactúa con GCN5, una enzima de acilación de histona que está involucrada en la respuesta al estrés, defensa, señal del transdución, transcripción, metabolismo, transporte. GCN5 está involucrada también en el desarrollo floral al afectar la expresión de WUSCHEL y AGA OUS. El factor de transcripción At1g58220 de MYB, otro ¡nteractor de HUB1 , está involucrado en respuestas al estímulo hormonal de plantas (como ácido abscisico, ácido jasmónico y ácido salicílico). Por lo tanto la presente invención también provee un método para alterar las respuestas a una o mas de las respuestas al estrés, respuestas defensivas, transducción de señal hormonal, y desarrollo floral, dicho método que comprende la modulación de la expresión de HUB1.

La referencia que se haga en la presente a las características mejoradas de crecimiento debe interpretarse como que significa un aumento en la biomasa (peso) de una o más partes de una planta, en particular, tales partes cosechables son semillas, y la realización de los métodos de la invención da como resultado plantas que tienen mayor rendimiento de las semillas con respecto al rendimiento de las semillas de las plantas de control. Las características mejoradas de crecimiento también abarca al aumento del vigor de germinación (mayor velocidad de germinación), mayor vigor temprano, y mayor resistencia al estrés, en particular al estrés abiótico. Además se observó que el tamaño de la célula fue aumentado en comparación con las plantas de control, particularmente de las hojas.

Si se toma al maíz como ejemplo, un mayor rendimiento se puede manifestar como uno o más de los siguientes: aumento de la cantidad de plantas establecidas por metro cuadrado, aumento de la cantidad de mazorcas por planta, aumento de la cantidad de hileras, cantidad de granos por hilera, peso del grano, peso de mil granos, longitud/diámetro de la mazorca, aumento de la tasa de llenado de semillas (que es la cantidad de semillas llenas dividido por la cantidad total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Si se toma al arroz como ejemplo, un mayor rendimiento se puede manifestar como aumento de uno o más de los siguientes: cantidad de plantas por metro cuadrado, cantidad de panojas por planta, cantidad de espículas por panoja, cantidad de flores (inflorescencias) por panoja (que se expresa como la relación entre la cantidad de semillas llenas y la cantidad de panojas primarias), aumento de la tasa de llenado de semillas (que es la cantidad de semillas llenas dividido por la cantidad total de semillas y multiplicado por 100), aumento del peso de mil granos, entre otros.

La presente invención provee un método para aumentar el rendimiento, especialmente el rendimiento de las semillas de las plantas, con respecto a las plantas de control, donde dicho método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 como se define en la presente o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención.

Dado que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen mayor rendimiento, es probable que estas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (durante al menos parte de su ciclo de vida), en relación con la tasa de crecimiento de las plantas de control en una etapa correspondiente de su ciclo de vida.

El aumento de la tasa de crecimiento puede ser específico de una o más partes de una planta (incluso de semillas), o puede estar sustancialmente en toda la planta. Las plantas con mayor tasa de crecimiento pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede significar el tiempo necesario para crecer desde la semilla madura seca hasta el estadio en el cual la planta produjo semillas maduras secas, similar al material de inicio. Este ciclo de vida puede estar influenciado por factores tales como velocidad de germinación (vigor de germinación), vigor temprano, tasa de crecimiento, índice de verdor, tiempo de floración y velocidad de maduración de la semilla. El aumento de la tasa de crecimiento puede ocurrir en uno o más estadios en el ciclo de vida de una planta o durante sustancialmente todo el ciclo de vida de la planta. El aumento de la tasa de crecimiento durante las etapas tempranas del ciclo de vida de una planta puede reflejar incremento del vigor. El aumento de la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta lo cual permite sembrar más tarde las plantas y/o cosecharlas antes de lo que sería posible de otro modo (se puede obtener un efecto similar con tiempo de floración más temprano). Si se incrementa lo suficiente la tasa de crecimiento, permitiría la siembra adicional de semillas de la misma especie vegetal (por ejemplo, la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido de la siembra y cosecha de otras plantas de arroz, todo ello dentro de un período de crecimiento convencional). De modo similar, si se incrementa lo suficiente la tasa de crecimiento, permitiría la siembra adicional de semillas de distinta especie vegetal (por ejemplo, la siembra y cosecha de plantas de maíz seguido de, por ejemplo, la siembra y opcional cosecha de soja, papa o cualquier otra planta adecuada). También pueden ser posibles las cosechas adicionales de los mismos troncos en el caso de algunas plantas de cultivo. La alteración del ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un aumento de la producción de biomasa anual por metro cuadrado (debido a un aumento de la cantidad de veces (por ejemplo, un año) que cualquier planta particular se puede cultivar y cosechar). Un aumento de la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en una zona geográfica más amplia que sus contrapartidas de tipo silvestre, dado que las limitaciones territoriales para cultivar una planta de cultivo a menudo están determinadas por condiciones ambientales adversas en el momento de la siembra (estación temprana) o en el momento de la cosecha (estación tardía). Dichas condiciones adversas se pueden evitar si se acorta el ciclo de cosecha. La tasa de crecimiento se puede determinar al derivar diversos parámetros de curvas de crecimiento, en donde dichos parámetros pueden ser: T-Mid (el tiempo que tardan las plantas en alcanzar el 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que tardan las plantas en alcanzar el 90% de su tamaño máximo), entre otros.

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la realización de los métodos de la invención produce plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento con respecto a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar la tasa de crecimiento de las plantas, en donde dicho método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 como se define en la presente o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención.

Un aumento en el rendimiento y/o en la tasa de crecimiento tiene lugar si la planta está en condiciones sin estrés o si la planta está expuesta a diversos tipos de estrés en comparación con las plantas de control. Las plantas generalmente responden a la exposición al estrés con un crecimiento más lento. En condiciones de estrés severo, la planta incluso puede detener su crecimiento por completo. Por otra parte, el estrés leve se define en la presente como cualquier estrés al que está expuesta una planta y que no da por resultado que la planta cese de crecer por completo sin la capacidad de reiniciar el crecimiento. En el sentido de la invención, el estrés leve conduce a una reducción del crecimiento de las plantas estresadas de menos de 40%, 35% o 30%, preferentemente menos de 25%, 20% o 15%, con mayor preferencia menos de 14%, 13%, 12%, 11 % o 10% o menos en comparación con la planta de control en condiciones sin estrés. Debido a los adelantos en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con pesticidas) a menudo las plantas de cultivo no están sometidas a distintos tipos de estrés severos. Como consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés leve es a menudo una característica indeseable en la agricultura. El estrés leve es el estrés biótico y/o abiótico (ambiental) cotidiano al cual está expuesta una planta. El estrés abiótico se puede deber a sequía o exceso de agua, estrés anaeróbico, estrés salino, toxicidad química, estrés oxidativo y temperaturas cálidas, frías o de congelación. El estrés abiótico puede ser estrés osmótico causado por estrés hídrico (particularmente debido a sequía), estrés salino, estrés oxidativo o estrés iónico. El estrés biótico es generalmente el estrés causado por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos, nemátodos e insectos.

En particular, los métodos de la presente invención se pueden realizar en condiciones sin estrés o en condiciones de sequía leve para obtener plantas que tienen características mejoradas de crecimiento con respecto a las plantas de control. Tal como se informa en Wang et al. (Planta (2003) 218: 1-14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan de manera adversa el crecimiento y la productividad de la planta. Se sabe que el estrés por sequía, salinidad, temperaturas extremas y oxidativo están interconectados y pueden inducir el crecimiento y el daño celular por mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) describe un grado particularmente alto de "intercomunicación" entre estrés por sequía y estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o la salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, lo cual da como resultado la alteración de la homeostasis y la distribución iónica en la célula. El estrés oxidativo, que a menudo acompaña al estrés por temperatura alta o baja, salinidad o sequía, puede causar la desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos tipos de estrés ambiental a menudo activan vías de señalización celular y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas de estrés, la regulación en forma ascendente de antioxidantes, la acumulación de solutos compatibles y la detención del crecimiento. El término condiciones "sin estrés" tal como se usa en la presente son aquellas condiciones ambientales que permiten el óptimo crecimiento de las plantas.

Los expertos en el arte conocen las condiciones normales del suelo y las condiciones climáticas para una determinada ubicación.

La realización de los métodos de la invención produce plantas cultivadas en condiciones sin estrés o en condiciones de sequía leve con características mejoradas de crecimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar las características de crecimiento en plantas cultivadas en condiciones sin estrés o en condiciones de sequía leve, en donde dicho método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención. Además, la realización de los métodos de la invención también produce plantas cultivadas en condiciones severas de sequía con características mejoradas de crecimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar las características de crecimiento en plantas cultivadas en condiciones severas de sequía, en donde dicho método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención.

La realización de los métodos de la invención produce plantas cultivadas en condiciones de estrés salina, con características mejoradas de crecimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar las características de crecimiento en plantas cultivadas en condiciones de estrés salina, en donde dicho método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención. El término estrés por sal o salina no se restringe a la sal común (NaCI), sino que puede ser uno o más de: NaCI, KCI, LiCI, MgCI2, CaCI2, entre otros.

La realización de los métodos de la invención produce plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, particularmente en condiciones de deficiencia de nitrógeno, con características mejoradas de crecimiento con respecto a las plantas de control cultivadas en condiciones comparables, en otras palabras, Las plantas de acuerdo con la invención tienen una mayor eficiencia en la captación de nutrientes. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para mejorar las características de crecimiento en plantas cultivadas en condiciones de deficiencia de nutrientes, en donde dicho método comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención. La deficiencia de nutrientes puede ser el resultado de una falta de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros.

La presente invención abarca plantas o partes de ésta (incluso las semillas) que se pueden obtener mediante los métodos de acuerdo con la presente invención. Las plantas o partes de ésta comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 como se definió anteriormente o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención.

La invención también provee constructos genéticos y vectores para facilitar la introducción y/o expresión en plantas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 o que codifican otra proteína útil en los métodos de la presente invención. Los constructos génicos pueden insertarse en los vectores, que se encuentran disponibles comercialmente, adecuados para la transformación en plantas y adecuado para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La invención también provee el uso de un constructo génico como se define en la presente en los métodos de la invención.

Más específicamente, la presente invención provee un constructo que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 como se definió anteriormente o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención; (b) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente (c) una secuencia de terminación de la transcripción.

Preferentemente el ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 es como se definió anteriormente. Las proteínas útiles en los métodos de la presente invención son tal como se describieron anteriormente y abarcan las proteínas enumeradas en la Tabla G a K y los ortólogos de éstas. El término "secuencia de control" y "secuencias de terminación" son como se definen en la presente.

Las plantas se transforman con un vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. El experto en el arte se encuentra al tanto de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector a fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente células huésped que contienen la secuencia de interés. La secuencia de interés se encuentra ligada operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor).

Ventajosamente, cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, puede ser usado para dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos, pero preferentemente el promotor es de origen vegetal. Un promotor constitutivo es particularmente útil en los métodos. Preferentemente el promotor constitutivo es también un promotor ubicuo. El promotor GOS2 del arroz puede ser útil en plantas monocotiledóneas y un promotor CaMV35S puede ser útil en las plantas dicotiledóneas. En algunos casos, el promotor constitutivo no es preferentemente un promoter constitutivo fuerte (tal como el Promotor CaMV35S) y es menos fuerte que el promotor GOS2 del arroz. Sin embargo, para obtener mayor vigor temprano y/o vigor de germinación, un promotor constitutivo fuerte es también útil. En otros casos, un promoter específico de órgano, un promotor específico de tejido o un promotor específico de célula es más adecuado. Véase la sección "Definiciones" de la presente para las definiciones de los diversos tipos de promotores.

Debe ser claro que la aplicabilidad de la presente invención no se encuentra restringida al ácido nucleico que codifica el polipéptido HUB1 representado por SEQ ID NO: 1 , y que la aplicabilidad de la invención tampoco se encuentra restringida a la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido HUB1 cuando es dirigida por un promotor constitutivo, o cuando es dirigida por un promotor específico de semillas.

En una forma de realización de esta invención, el promotor constitutivo es preferentemente un promotor de mediana intensidad que es más débil que el promotor GOS2 del arroz y el promotor Ca V35S, tal como un promotor de proteína del grupo de alta movilidad (HMGP), preferentemente el promotor es un promotor HMGP del arroz. Con más preferencia el promotor constitutivo está representado por una secuencia de ácidos nucleicos sustancialmente similar a SEQ ID NO: 6, con máxima preferencia el promotor constitutivo es como se representa por SEQ ID NO: 6. Véase la Tabla 2a en la sección "Definiciones" de la presente para otros ejemplos de promotores constitutivos.

De acuerdo con otra forma de realización déla invención, el ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 está ligado operativamente a un promotor específico de semillas. El promotor específico de semillas es preferentemente un promotor WSI18, con mayor preferencia el promotor WSI18 es del arroz, con más preferencia el promotor WSI18 está representado por una secuencia de ácidos nucleicos sustancialmente similar a SEQ ID NO: 7, con máxima preferencia el promotor es como se representa por SEQ ID NO: 7. Se muestran ejemplos de otros promotores específicos de semillas que también se pueden usar para realizar los métodos de la invención en la Tabla 2c en la sección "Definiciones" anterior.

Opcionalmente, se pueden usar una o más secuencias de terminador en el constructo introducido en una planta.

Otros elementos reguladores pueden incluir mejoradores de la transcripción así como también de la traducción. Los expertos en el arte conocen las secuencias que pueden ser adecuadas para utilizar como terminador y mejorador en la realización de la invención. También se puede agregar una secuencia intrón a la región 5' no traducida (UTR) o en la secuencia codificadora para incrementar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección de definiciones. Otras secuencias control (además de las secuencias promotor, mejorador, silenciador, intrón, las regiones 3'UTR y/o 5'UTR) pueden ser elementos estabilizadores de ARN y/o proteínas. El experto en el arte conoce o puede obtener con facilidad dichas secuencias.

Los constructos genéticos de la invención también pueden incluir una secuencia de origen de replicación necesaria para mantener y/o replicar en un tipo de célula específica. Un ejemplo es cuando se requiere mantener un constructo genético en una célula bacteriana como elemento genético episomal (por ejemplo, molécula de plásmido o cósmido). Preferentemente, los orígenes de replicación incluyen, sin limitaciones, f1— ori y colE1.

Para la detección de la transferencia exitosa de las secuencias de ácidos nucleicos usadas en los métodos de la invención y/o la selección de plantas transgénicas que comprenden estos ácidos nucleicos, es ventajoso usar genes marcadores (o genes informadores). En consecuencia, el constructo genético opcionalmente puede comprender un gen marcador seleccionable. Los marcadores seleccionares se describen con mayor detalle en la sección "Definiciones" de la presente. Los genes marcadores se pueden retirar o eliminar de la célula transgénica una vez que ya no son necesarios. Las técnicas para retirar marcadores son conocidas en el arte, las técnicas útiles se describieron anteriormente en la sección de definiciones.

La invención también provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen características modificadas de crecimiento con respecto a las plantas de control, que comprende la introducción y expresión en una planta de cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 tal como se definió anteriormente en la presente o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención.

Más específicamente, la presente invención provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen características modificadas de crecimiento, particularmente mayor rendimiento (semillas), dicho método comprende: (i) introducir y expresar en una planta o célula vegetal un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención; y (ii) cultivar la célula vegetal en condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta.

El ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos capaces de codificar un polipéptido HUB1 como se definió en la presente o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención.

El ácido nucleico puede introducirse directamente en una célula vegetal o en la planta en sí (incluyendo la introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce preferentemente en una planta mediante transformación. El término "transformación" se describe en mayor detalle en la sección "Definiciones" de la presente.

Las células vegetales modificadas genéticamente se pueden regenerar por todos los métodos conocidos por el experto en el arte. Los métodos adecuados se pueden hallar en las publicaciones antes mencionadas de S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Hófgen y Willmitzer.

Generalmente, después de la transformación se seleccionan células vegetales o grupos celulares para determinar la presencia de uno o más marcadores codificados por genes que se expresan en plantas cotransferidos con el gen de interés, tras lo cual el material transformado se regenera en una planta entera. Para seleccionar las plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformación es, como norma, sometido a condiciones selectivas, de manera tal que las plantas transformadas se puedan distinguir de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas de la manera antes descrita se pueden sembrar y, después del período de crecimiento inicial, son sometidas a una selección adecuada por rociado.

Otra posibilidad consiste en cultivar las semillas, si corresponde después de la esterilización, en placas de agar usando un agente de selección adecuado de manera que sólo las semillas transformadas pueden crecer y convertirse en plantas. Alternativamente, las plantas transformadas se analizan para determinar la presencia de un marcador seleccionare tal como los descritos anteriormente.

Después de la transferencia y regeneración de ADN, las plantas posiblemente transformadas se pueden evaluar, por ejemplo, mediante análisis Southern, para determinar la presencia del gen de interés, la cantidad de copias y/o la organización genómica. De manera alternativa o adicional, los niveles de expresión del ADN recién introducido pueden ser monitoreados mediante análisis Northern y/o Western, siendo ambas técnicas conocidas por los expertos en el arte.

Las plantas generadas transformadas pueden ser propagadas por diversos medios, tales como por propagación clonal o técnicas de cultivo clásicas. Por ejemplo, se puede autocruzar una primera generación (o T1) de plantas transformadas y se puede seleccionar una segunda generación (o T2) de transformantes homocigotas, y las plantas T2 luego se pueden propagar adicionalmente por técnicas de cultivo clásicas. Los organismos generados transformados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clónales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el cásete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, una raíz transformada injertada en un acodo no transformado).

La presente invención claramente se extiende a cualquier célula vegetal o planta producida por cualquiera de los métodos descritos en la presente, y a todas las partes de la planta y sus propágulos. La presente invención se extiende también para abarcar la progenie de una célula, tejido, órgano o planta entera primaria transformada o transfectada que ha sido producida por cualquiera de los métodos antes mencionados, en donde el único requisito es que la progenie exhiba las mismas características genotípicas y/o fenotípicas que las producidas por los progenitores en los métodos de acuerdo con la invención.

La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido HUB1 como se definió en la presente con anterioridad o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células vegetales. Las plantas huésped para los ácidos nucleicos o el vector usado en el método de acuerdo con la invención, el cásete de expresión o constructo o vector son, en principio, ventajosamente todas las plantas, las cuales son capaces de sintetizar los polipéptidos usados en el método de la invención.

Los métodos de la invención se pueden aplicar ventajosamente a cualquier planta. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluso forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos. De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, girasol, cañóla, alfalfa, colza, linaza, algodón, tomate, papa y tabaco. Más preferentemente, la planta es una planta monocotiledónea. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar. Con mayor preferencia, la planta es un cereal. Los ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, triticum dicoccum, espelta, sécale, triticum monococcum, íer7, milo y avena.

La invención también se extiende a las partes cosechables de una planta tal como, semillas, frutas, flores, cuyas partes cosechables comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido HUB1 o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención. La invención además se refiere a los productos derivados, preferentemente derivados de forma directa, de una parte cosechabie de dicha planta, tal como pelets secos o en polvo, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

De acuerdo con una característica preferida de la invención, la expresión modulada es expresión aumentada. Los métodos para aumentar la expresión de ácidos nucleicos o genes, o productos génicos, se encuentran bien documentados en el arte y se proveen ejemplos en la sección de definiciones.

Como se mencionó anteriormente, un método preferido para modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención consiste en la introducción y expresión en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención; sin embargo los efectos de llevar a cabo el método, es decir, modificar las características de crecimiento también pueden lograrse utilizando otras técnicas bien conocidas en el arte, incluyendo pero sin limitarse a rotulado de activación de T-ADN, TILLING, recombinación homóloga o mutagénesis. Se provee una descripción de estas técnicas en la sección de definiciones.

La presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos HUB1 u otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención, como se describen en la presente y el uso de estos polipéptidos HUB1 u otras proteínas útiles en los métodos de la presente invención, para modificar cualquiera de las características de crecimiento antes mencionadas en las plantas.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 descriptos en la presente o que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención, o los polipéptidos HUB1 en si mismos u otra proteína útil en los métodos de la presente invención, pueden ser útiles en programas de reproducción en los cuales se identifica un marcador de ADN que puede estar ligado genéticamente a un gen que codifica un polipéptido HUB1 o ligado a un gen que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención. Los ácidos nucleicos/genes, o los polipéptidos HUB1 , en si mismos u otros polipéptidos útiles en los métodos de esta invención pueden usarse para definir un marcador molecular. Este marcador de ADN o proteína puede luego ser usado en programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen características modificadas de crecimiento como se definió en la presente con anterioridad en los métodos de la invención.

Las variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido HUB1 o de un ácido nucleico / gen que codifica otra proteína útil en los métodos de la presente invención también pueden ser útiles en programas de reproducción asistidos por marcador. Tales programas de reproducción a veces requieren la introducción de una variación alélica mediante un tratamiento mutagénico de las plantas, usando por ejemplo, mutagénesis EMS; de manera alternativa, el programa puede comenzar con una colección de las variantes alélicas de las denominadas de origen "natural" causadas de forma no intencionada. Luego tiene lugar la identificación de las variantes alélicas, por ejemplo, mediante PCR. Luego sigue una etapa de selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que generan mayor rendimiento. Generalmente, la selección se lleva a cabo monitoreando el crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión. Se puede monitorear el crecimiento en un invernadero o en el campo. Otras etapas adicionales incluyen cruzar plantas en las cuales la variante alélica superior se identificó con otra planta. Esto podría utilizarse, por ejemplo, para realizar una combinación de características fenotípicas interesantes.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos HUB1 o que codifican otra proteína útil en los métodos de la presente invención, también pueden ser usadas como sondas para mapear genética y físicamente los genes de los cuales son parte, y como marcadores para los rasgos ligados a esos genes. Tal información puede ser útil en la reproducción de plantas a fin de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Tal uso de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido HUB1 o el uso de ácidos nucleicos que codifican otra proteína útil en los métodos de la presente invención, requieren solo una secuencia de ácidos nucleicos de al menos 15 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos que codifican al polipéptido HUB1 o ácidos nucleicos que codifican otra proteína útil en los métodos de la presente invención, pueden usarse como marcadores de polimorfismos de longitus de fragmento de restricción (RFLP). Pueden sondarse Southern blots (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de ADN genómico vegetal digerido por restricción con los ácidos nucleicos que codifican HUB1. Los patrones de banda resultantes luego se pueden someter a análisis genético utilizando programas de computación tales como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1 : 174-181 ) a fin de construir un mapa genético. Además, los ácidos nucleicos se pueden usar para sondear Southern blots que contienen ADN genómico tratado con endonucleasa de restricción de un conjunto de individuos que representan los progenitores y la progenie de una cruza genética definida. Se observa la segregación de los polimorfismos de ADN y se lo utiliza para calcular la posición del ácido nucleico que codifica al polipéptido HUB1 , en el mapa genético obtenido previamente con esta población (Botstein eí al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331 ).

La producción y uso de sondas derivadas de genes vegetales para utilizar en el mapeo genético se describen en Bernatzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Repórter 4: 37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones específicos de cADN utilizando la metodología antes indicada o variaciones de ésta. Por ejemplo, para el mapeo se puede utilizar entrecruzamiento de poblaciones F2, poblaciones retrocruzadas, poblaciones apareadas al azar, líneas isogénicas cercanas y otros conjuntos de individuos. Tales metodologías son conocidas por los expertos en el arte.

También se pueden utilizar las sondas de ácidos nucleicos para el mapeo físico (es decir, la ubicación de secuencias en mapas físicos; ver Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y las referencias allí citadas).

En otra forma de realización, las sondas de ácido nucleico se pueden usar en el mapeo por hibridación directa con fluorescencia in situ (FISH) (Trask (1991 ) Trends Genet. 7:149-154). Aunque los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de grandes clones (entre varios kb y varios cientos de kb; ver Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13-20), las mejoras de la sensibilidad pueden permitir la realización del mapeo FISH con sondas más cortas.

Se pueden llevar a cabo varios métodos de mapeo genético y físico basados en la amplificación de ácido nucleico mediante el uso de los ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 1 1 :95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), unión específica de alelos (Landegren et al. (1988) Science 241 :1077-1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671 ), mapeo de híbridos con radiación (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y mapeo Happy (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estos métodos, se usa la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores que se utilizan en la reacción de amplificación o en las reacciones de extensión de cebadores. El diseño de dichos cebadores es bien conocido por los expertos en el arte. En los métodos que emplean el mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar las diferencias en las secuencias de ADN entre los progenitores del cruzamiento de mapeo, en la región que corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos de la presente. Sin embargo, en general esto no es necesario para los métodos de mapeo.

Los métodos de acuerdo con la presente invención dan como resultado plantas que tienen características modificadas de crecimiento, como se describió en la presente con anterioridad. Estos rasgos también se pueden combinar con otros rasgos ventajosos a nivel económico, tales como otros rasgos mejoradores del rendimiento, tolerancia a otro tipo de estrés biótico y abiótico, rasgos que modifican varias características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

Descripción de las Figuras La presente invención se describirá a continuación con referencia a las siguientes figuras: Figuras 1A -1 B. El panel A representa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, el dominio RING se indica en negrita; el panel B muestra la estrategia de mutagénesis para generar HUBI pm: (i) dominio RING de HUB1 de tipo silvestre con 8 residuos de unión a zinc en donde X es cualquier aminoácido, (ii) estrategia de mutagénesis en la secuencia de gen HUB1 en donde se seleccionaron dos residuos Cis para mutagénesis (itálica & subrayado) en Ser. (iii) dominio RING de HUB1 mutagenizado de HUBI pm con dos residuos de Serina.

La Figura 2 representa un alineamiento múltiple de proteínas HUB1. La parte N-terminal (600 aminoácidos) de CAO22034 no se muestra en el alineamiento.

La Figura 3 muestra un árbol filogenético de proteínas HUB1. El árbol se construyó como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 4 representa el vector binario para la expresión aumentada en Oryza sativa de un ácido nucleico que codifica HUB1 bajo el control del promotor HMGP (pHMGP) del arroz.

Figura 5. Monoubiquitinación mediada por HUB1 de histona H2B (anticuerpo HA) y actividad de autoubiquitinación de HUB1 (anticuerpo HA).

Figura 6. Rosetas de líneas Ler, hub1-1 y OE-HUB1 en condiciones de día corto, día largo y luz continua luego de 21 días de crecimiento.

Figura 7. Mediciones de clorofila a y b a partir de muestras cultivadas in vitro en día corto (SD), día largo (LD) y luz continua (CL). Tanto las muestras de "hub1-1 " como las de "hub1-1 pálida" se cultivaron en las mismas placas.

Figura 8. Imágenes TEM de hojas Ler y hub1-1 cultivadas en SD.

Figura 9. Hipocotilos extractados de plantas Ler, OE-HUB1 y hub1-1 de 21 cultivadas en condiciones de días cortos Figura 10. Mediciones del área de hoja de plántulas Ler, hub1-1 y OE-HUB1 cultivadas in vitro en condiciones de día largo.

Figura 11. Mediciones del área de hoja de plántulas Ler, hub1 -1 y OE-HUB1 cultivadas in vitro en condiciones de día corto.

Figura 12. Estructuras puntiagudas (flechas) en el lado abaxial de hojas hub1 -1 angostas de plantas cultivadas en SD in vitro.

Figura 13. Diagramas de flores Ler de tipo silvestre y hub1-1.

Figura 14. Patrones de expresión específicos de órganos de genes del desarrollo expresados de forma diferente en HUB1.

Figura 15. Vigor de germinación en líneas HUB1 de Arabidopsis. DAV=días después de la vernalización (n=30). OE7a y OE17x5 son líneas que sobreexpresan HUB1 , Ler y hub1 (mutante) son controles.

Figura 16. Tamaño de la célula epidérmica en líneas Ler de tipo silvestre y OE-HUB1 de Arabidopsis presentadas como valores transformados log2.

Figura 17. Mediciones del área de la silicua de líneas Ler de tipo silvestre, mutante hub1-1 y dos líneas que sobreexpresan HUB1 de Arabidopsis.

Figura 18. Silicuas de Ler de tipo silvestre, mutante hub1-1 y líneas que sobreexpresan HUB1.

Figura 19. Mediciones del área de la semilla de Ler de tipo silvestre, mutante hub1-1 y dos líneas que sobreexpresan HUB1.

Figura 20. Rendimiento de semilla (gramos de semillas por planta) para Ler de tipo silvestre, mutante hub1-1 y dos líneas que sobreexpresan HUB1.

Figuras 21A-21 B . El panel A muestra el efecto en el ancho de la hoja de la sobreexpresión de HUB1 y HUBI pm en el fondo (background) del tipo silvestre (Ler); #1247 representa una línea que sobreexpresa HUB1 y #1249 es la línea que sobreexpresa HUBI pm. Ler no transformado sirvió como control. El panel B muestra que el ancho de la hoja madura se ve afectado por la sobreexpresión de HUBI pm en el fondo del mutante hub1 -1. #1248 representa una línea que sobreexpresa WT HUB1 en el fondo de hub1-1 , #1250 representa la línea que sobreexpresa HUBI pm en el fondo de hub1-1. Hub1-1 no transformado sirvió como control. Los números 1 a 1 1 representan los dos cotilos y las hojas 1 a 9 de la roseta.

Figuras 22A-22D . Caracterización fenotípica de las líneas de inserción de T-ADN sl-1 y sl-2 en comparación con Col-0 y el mutante hub1-4. A - Imagen de planta entera de los cuatro genotipos en el momento de floración de WT, sl-1 y sl-2 (28 DAS). B - El análisis del tiempo de floración de las cuatro líneas muestra que hub1-4 florece mucho antes que las otras (también se muestra en A) excepto por una pequeña reducción en sl-2. Por otro lado, la cantidad de hojas de roseta al momento de la floración tiene una tendencia diferente para todas las líneas mutantes ya que se informa una reducción significativa para sl-1, sl-2 y hub1-4. C - El área de la hoja de sl-1 se reduce significativamente para la mayoría de las hojas mientras que en el caso de sl-2, la reducción es mucho menor ya que la reducción fue significativa sólo en unas pocas hojas. Panel superior: las barras en negro son Col-0, las barras en blanco son sl-1; panel inferior: las barras en negro son Col-0, las barras en gris son sl-2. E -El diámetro del tallo de la flor de sl-1 y sl-2 también se reduce en comparación con las plantas de tipo silvestre. Todas las pruebas T de Student se llevaron a cabo con un nivel de significancia de 5% (p = 0,05).

Ejemplos La presente invención se describirá a continuación con referencia a los siguientes ejemplos, que son solamente ilustrativos. Los siguientes ejemplos no pretenden definir completamente o limitar de otro modo el alcance de la invención.

Manipulación de ADN: a menos que se indique de otra manera, las técnicas de ADN recombinante se realizan de acuerdo con protocolos estándar descriptos en (Sambrook (2001 ) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y métodos estándar para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications (UK).

Ejemplo 1: Identificación de secuencias relacionadas con la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 o la proteína de SEQ ID NO: 2 Las secuencias (ADNc de longitud completa, ESTs o genomica) relacionadas con la secuencia utilizada en los métodos de la presente invención fueron identificadas entre aquellas conservadas en la base de datos Entrez Nucleotides en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando herramientas de búsqueda de secuencias en bases de datos, tales como Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). El programa se usa para hallar regiones de similitud local entre secuencias comparando secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos con bases de datos de secuencias y calculando la significancia estadística de las coincidencias. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico utilizado en la presente invención se usó para el algoritmo TBLASTN, con ajustes por defecto y se activó el filtro para ignorar secuencias de baja complejidad. El resultado del análisis se observó por comparación de a pares y se clasificó de acuerdo con el resultado de probabilidad (valor E), donde el resultado refleja la probabilidad de que ocurra un alineamiento particular al azar (cuanto menor es el valor E, más significativo es el acierto). Además de los valores E, también fueron evaluadas las comparaciones por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos idénticos (o aminoácidos) entre dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos) comparadas en una longitud particular. En algunos casos, los parámetros predeterminados pueden ajustarse para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo, se puede aumentar el valor E para mostrar coincidencias menos rigurosas. De este modo, pueden identificarse coincidencias breves, casi exactas.

La Tabla A provee una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionados con la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 y la proteína de SEQ ID NO: 2.

Tabla A: Ejemplos de proteínas HUB1 : En algunos casos, las secuencias relacionadas se ensamblan tentativamente y se revelan públicamente por instituciones de investigación, tales como The Institute for Genomic Research (TIGR). Se puede utilizar la base de datos Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) para identificar dichas secuencias relacionadas, ya sea realizando una búsqueda por palabra clave o utilizando el algoritmo BLAST con la secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de polipéptidos de interés.

Ejemplo 2: Alineamiento de secuencias de polipéptidos HUB1.

El alineamiento de las secuencias de polipéptidos se llevó a cabo utilizando el algoritmo ClustalW 2.0 de alineamiento progresivo (Larkin et al., Bioinformatics 23, 2947-2948, 2007). Los valores predeterminados son para la penalidad por apertura de brecha de 10, para la penalidad por extensión de brecha de 0,1 y la matriz de peso seleccionada es Gonnet (si los polipéptidos están alineados). Se puede llevar a cabo edición manual menor para optimizar en mayor medida el alineamiento. La conservación de secuencia entre polipéptidos HUB1 ocurre esencialmente en el dominio RING del C-terminal de los polipéptidos, en donde el dominio N-terminal usualmente es más variable en composición y longitud de secuencia. Los polipéptidos HUB1 se alinean en la Figura 2.

Se construyó un árbol filogenético de polipéptidos HUB1 (Figura 3) del alineamiento utilizando un algoritmo de agrupamiento de unión cercana como se indica en el programa ClustalW 2.0. Las Figuras proveen los valores bootstrap para 1000 repeticiones.

Ejemplo 3: Cálculo del porcentaje global de identidad entre secuencias de polipéptidos HUB1 Los porcentajes de similitud e identidad global entre secuencias de polipéptidos de longitud completa útil en la realización de los métodos de la invención se determinaron usando uno de los métodos disponibles en el arte, el software MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software hosted by Ledion Bitincka). El software MatGAT genera matrices de similitud/identidad para secuencias de ADN o proteínas sin necesidad de prealineamiento de los datos. El programa lleva a cabo una serie de alineamientos de a pares usando el algoritmo de alineamiento global Myers and Miller (con una penalidad por apertura de brecha de 12, y una penalidad por extensión de brecha de 2), calcula similitud e identidad usando por ejemplo Blosum 62 (para polipéptidos), y luego coloca los resultados en una matriz de distancia. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la línea divisoria y se muestra la identidad de secuencia en la mitad superior de la línea divisoria diagonal.

Los parámetros utilizados en la comparación fueron: Matriz de resultados: Blosum62 Primera brecha: 12 Brecha de extensión: 2 Los resultados del análisis de software se muestran en la Tabla B1 para la similitud e identidad global a través de toda la longitud de las secuencias de polipéptidos. El porcentaje de identidad se brinda por encima de la diagonal y el porcentaje de similitud se da por debajo de la diagonal.

El porcentaje de identidad entre las secuencias de polipéptidos HUB1 útiles en la realización de los métodos de la invención puede ser tan bajo como 18% de identidad de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO: 2 (At2g44950); sin embargo, cuando sólo se comparan los dominios RING, la identidad es más superior (Tabla B2). Deberá tenerse en cuenta, sin embargo, que la levadura BRE1 (CAA98640), el ortólogo funcional de HUB1 (At2g44950) tiene sólo 18,6% de identidad de secuencia con HUB1.

Tabla B1: Resultados MatGAT de identidad y similitud global sobre la longitud completa de las secuencias de polipéptidos HUB1.

Tabla B2: Resultados MatGAT de identidad y similitud sobre los dominios RING de las secuencias de polipéptidos HUB1.

Ejemplo 4: Identificación de dominios comprendidos en secuencias de polipéptidos HUB1 La base de datos Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites (InterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos características usadas comúnmente para búsquedas basadas en texto y secuencias. La base de datos InterPro combina estas bases de datos, que usan diferentes metodologías y diversos grados de información biológica con respecto a proteínas bien caracterizadas para derivar características de proteínas. Las bases de datos que colaboran incluyen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom y Pfam, Smart y TIGRFAMs. Pfam es un gran conjunto de alineamientos de secuencias múltiples y modelos ocultos Markov que cubren muchos dominios y familias de proteínas comunes. Pfam se encuentra en el servidor del Sanger Institute en el Reino Unido. InterPro se encuentra en el European Bioinformatics Institute en el Reino Unido.

Los resultados del escaneo InterPro de las secuencias de polipéptidos representadas por SEQ ID NO: 2 se muestran en la Tabla C.

Tabla C: Resultados del escaneo InterPro (principales números de acceso) de la secuencia de polipéptidos como se representa en SEQ ID NO: 2.

Ejemplo 5: Predicción de topología de las secuencias de polipéptidos HUB1 TargetP 1.1 predice la localización subcelular de proteínas eucariotas. La asignación de localización se basa en la presencia predicha de cualquiera de las pre- secuencias N-terminales: péptido de tránsito de cloroplasto (cTP), péptido de blanco mitocondrial (mTP) o péptido de señal de vía secretora (SP). Los puntajes sobre los que se basa la predicción final no son realmente probabilidades, y no necesariamente suman uno. Sin embargo, la localización con mayor puntaje es la más probable según TargetP, y la relación entre los puntajes (la clase de confiabilidad) pueden ser una indicación de cuán cierta es la predicción. La clase de confiabilidad (reliability class -RC) oscila entre 1 y 5, donde 1 indica la predicción más fuerte. TargetP se encuentra en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca.

Para las secuencias previstas que contienen una presecuencia N-terminal también puede predecirse un sitio potencial de clivaje.

Se seleccionaron varios parámetros, tales como grupo de organismo (planta o no planta), conjunto de corte (ninguno, conjunto predefinido de corto, o conjunto de corte especificados por el usuario), y se calculó la predicción de sitios de clivaje (sí o no).

Los resultados del análisis de TargetP 1 .1 de la secuencia de polipéptidos representada por SEQ ID NO: 2 se muestran en Tabla D. Se seleccionó el grupo de organismos "planta", no se definieron cortes, y se solicitó la longitud prevista del péptido de tránsito. La localización subcelular de la secuencia de polipéptidos representa por SEQ ID NO: 2 puede ser el citoplasma o el núcleo, no se prevé ningún péptido de tránsito. Los experimentos de localización revelaron que HUB1 se encuentra presente en el núcleo (Liu et al., 2007).

Tabla D: Análisis TargetP 1 .1 de la secuencia de polipéptidos como se representa en SEQ ID NO: 2 Se pueden usar muchos otros algoritmos para realizar dichos análisis, incluso: ChloroP 1 ,1 alojado en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca; Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor versión 1.2 alojado en el servidor del Institute for Molecular Bioscience, Universidad de Queensland, Brisbane, Australia; • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2,5 alojado en el servidor de la Universidad de Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá; • TMHMM, alojado en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca • PSORT (URL: psort.org) · PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656-1663, 2003).

Ejemplo 6: Ensayo funcional del polipéptido HUB1 Sobre la base de las homologías de secuencias, se ha identificado previamente HUB1 como un homólogo BRE1 (Hwang et al., 2003; Stone et al., 2005, Fleury et al., 2007). A fin de confirmar la función sugerida como E3 ligasa de monoubiquitinación de H2B, se llevaron a cabo una serie de ensayos de ubiquitinación in vitro con una proteína HUB1 recombinante etiquetada con epítopo. En ese tipo de ensayo, se espera que la ligasa funcional BRE1 E3 ligue una molécula de ubiquitina en histona H2B, causando un aumento correspondiente en el peso molecular de H2B (Zhu et al., Molecular Cell 20, 601-611 , 2005).

Los cADN que codifican HUB1 y el punto mutado de (HUBI pm) se clonaron en vectores de expresión recombinante con etiquetas de epítopo His o GST para permitir la purificación mediante cromatografía por afinidad. La proteína etiquetada con GST se expresó en muchos fragmentos mediante E. coli y la proteína etiquetada con His se precipitó en cuerpos de inclusión. La fracción de proteína insoluble etiquetada con His se purificó y replegó a través de una serie de diálisis con concentraciones de urea en disminución y se unió a perlas NiNTA (Invitrogen) en un tampón de replegamiento. Durante el replegamiento de HUB1 , la proteína formó complejos de alto peso molecular sugiriendo que forma dímeros. Esta información indica que también en las plantas la actividad HUB1 puede depender de la homo- o heterodimerización como se describe para los homólogos Bre1 de humanos (Zhu et al., 2005).

Las proteínas purificadas se sometieron a ensayos de auto-ubiquitinación en ensayos in vitro de (auto)ubiquitinación así como también ensayos de ubiquitinación de histona H2B como se describe en Fleury et al., (2007). En este ensayo, la ligasa HUB1 E3 purificada se combinó con enzimas de activación y conjugación de ubiquitina (E1 y E2, respectivamente) y ubiquitina en un tampón que contenía ATP y se incubó durante 1 hora a 37 °C con agitación. Las reacciones se detuvieron mediante hervor en tampón cargado con SDS y se separaron en 6% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas para hibridización con anticuerpos anti-histona H2B o anti-HA (contra ubiquitina etiquetada con HA). Se detectaron señales de hibridación mediante reactivos ECL (GE Healthcare) y se visualizaron en películas autoradiográficas (Amersham Hyperfilm ECL, GE Healthcare). Tanto las fracciones de proteínas His y GST se activaron de forma enzimática y mediaron la monoubiquitinación de histona ~ H2B en los ensayos de ubiquitinación in vitro (Figura 5).

La monoubiquitinación de histona H2B (17 kDa) mediada por HUB1 y HUBI pm que se vieron como un cambio de H2B por 10 kDa en el blot en gel de proteína (Figura 5, HA-Ab abajo). Esta banda de 27 kDa fue reactiva tanto al anticuerpo específico H2B como al anticuerpo HA que detectó la ubiquitina etiquetada con HA. En ausencia de E1 , E2 o Ub, no se observó ningún cambio en la migración H2B. Se obtuvieron resultados similares en reacciones de ubiquitinación con HUB1 etiquetada con His. Si se analizan en conjunto, estos datos confirmaron que HUB1 es un homólogo funcional de proteínas BRE1 de humanos y levadura. De forma interesante, las mutaciones puntuales (HUBpm) en el dominio RING no abolieron la actividad de monoubiquitinación de H2B de HUB1 .

En los ensayos de monoubiquitinación de histona H2B con HUB1 de longitud total y forma de mutación puntual, se observó la autorregulación de HUB1 como modificaciones de alto peso molecular de la proteína (Figura 5, HA-Ab, arriba). Estas modificaciones fueron reactivas al anticuerpo ubiquitina, lo que sugiere que HUB1 tiene actividad de autopoliubiquitinación. Las mutaciones puntuales en el dominio RING redujeron la actividad de autopoliubiquitinación como se indica por los niveles reducidos de estas modificaciones en los western blots (Figura 5, HA-Ab, arriba). La carga similar de GST-HUB1 se muestra en GST Ab (Figura 5, GST-Ab). Estos datos confirmaron que el dominio RING era necesario para la actividad de autoubiquitinación.

Ejemplo 7: Clonación de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 para la transformación de arroz La secuencia de ácidos nucleicos que codifica HUB1 utilizada en los métodos de la invención se amplificó mediante PCR usando como molde una biblioteca personalizada de cADN de plántulas de Arabidopsis thaliana (en pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Reino Unido). Se realizó PCR usando ADN polimerasa Hifi Taq en condiciones estándar, usando 200 ng de molde en 50 µ? de mezcla PCR. Los cebadores utilizados fueron prm09774 (SEQ ID NO: 3; sentido, codón de inicio en negrita): 5'-ggggacaagtttg tacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgagcacaggcg-3' y prm09775 (SEQ ID NO: 4; inverso, complementario): 5'- ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatatgtagatag gtttaatatcattt-3', que incluye los sitios AttB para la recombinación Gateway. El fragmento amplificado por PCR se purificó también usando métodos estándar. Luego, se realizó la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento de PCR se recombinó in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", pHUB1. El plásmido pDONR201 se obtuvo de Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

El clon de entrada que comprende la SEQ ID NO: 1 se usó luego en una reacción LR con un vector de destino usado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contenía como elementos funcionales dentro de los bordes de T-ADN: un marcador seleccionable vegetal; un cásete de expresión marcador controlable; y un cásete Gateway destinado a la recúmbinación de LR in vivo con la secuencia de ácidos nucleicos de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor HMGP del arroz (SEQ ID NO: 6) para la expresión específica constitutiva se ubicó corriente ascendente con respecto a este cásete Gateway.

Después de la etapa.de recombinación LR, el vector de expresión resultante pHMGP::HUB1 (Figura 4) se transformó en la cepa de Agrobacterium LBA4044 de acuerdo con los métodos bien conocidos en el arte.

De modo similar, otros genes revelados en la invención pueden clonarse utilizando cebadores que comprenden sitios AttB para la recombinación Gateway. Los diseños de dichos cebadores son conocidos por los expertos en el arte.

Ejemplo 8: Transformación de la planta Transformación del arroz El Agrobacterium que contenía el vector de expresión se usó para transformar plantas de Oryza sativa. Se quitaron las cáscaras de las semillas secas maduras del cultivar de arroz japonés Nipponbare. Se llevó a cabo la esterilización incubando durante un minuto en 70% de etanol, seguido por 30 minutos en 0,2% de HgCI2, seguido por 6 lavados de 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles se hicieron germinar luego en un medio que contenía 2,4-D (medio de inducción de callos). Después de incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se extrajeron callos derivados del escutelo, embriogénicos, y se propagaron en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplicaron o propagaron por subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Las piezas de callos embriogénicos fueron subcultivadas en medio fresco 3 días antes del cocultivo (para estimular la actividad de división celular).

La cepa LBA4404 de Agrobacterium que contenía el vector de expresión se usó para el cocultivo. Se inoculó Agrobacterium en un medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28°C. Luego se recogieron las bacterias y se suspendieron en un medio de cocultivo líquido a una densidad (OD600) de aprox. 1. La suspensión se transfirió luego a una placa de Petri y se sumergieron los callos en la suspensión durante 15 minutos. Los tejidos de los callos luego se secaron en un papel de filtro y se transfirieron a un medio de cocultivo solidificado, y se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 25 °C. Los callos cocultívados se cultivaron en un medio que contenía 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28 °C en presencia de un agente de selección. Durante este período, se desarrollaron islas de callos resistentes que crecían rápidamente. Después de transferir este material a un medio de regeneración e incubación a la luz, se liberó el potencial embriogénico y se desarrollaron brotes en las siguientes cuatro a zinco semanas. Se retiraron los brotes de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contenía auxina desde el cual se transfirieron al suelo. Se cultivaron brotes endurecidos en condiciones de alta humedad y días cortos en un invernadero.

Aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes fueron generados para una construcción. Los transformantes primarios fueron transferidos de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero. Después de un análisis de PCR cuantitativo para verificar el número de copias del inserto de T-ADN, sólo se conservaron las plantas transgénicas de copia simple que presentan tolerancia al agente de selección para cosechar la semilla T1. Las semillas se cosecharon luego de tres a zinco meses después del transplante. El método dio transformantes de locus simple en una proporción de más de 50 % (Aldemita y Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hieí et al. 1994).

Transformación de maíz La transformación de maíz (Zea mays) se realiza con una modificación del método descripto por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La transformación es dependiente del genotipo en el maíz y sólo genotipos específicos pueden ser transformados y regenerados. La línea endogámica A188 (Universidad de Minnesota) o los híbridos con A188 como progenitor son buenas fuentes de material dador para la transformación, pero también se pueden usar exitosamente otros genotipos. Las espigas son cosechadas de la planta de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando la longitud del embrión inmaduro es de aprox. 1 a 1 ,2 mm. Los embriones inmaduros son cocultivados con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas son recuperadas a través de organogénesis. Los embriones extraídos son cultivados en un medio de inducción de callos, luego medio de regeneración de maíz, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona, pero se pueden usar varios marcadores de selección). Las placas de Petri son incubadas a la luz a 25 °C durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollan brotes. Los brotes verdes son transferidos de cada embrión al medio de enraizamiento de maíz e incubados a 25 °C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces son transplantados a suelo en el invernadero. Las semillas T1 son producidas de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-ADN.

Transformación de trigo La transformación de trigo se realiza con el método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. El cultivar Bobwhite (disponible de CIMMYT, México) se usa comúnmente en la transformación. Los embriones inmaduros son cocultivados con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan a través de organogénesis. Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones se cultivan in vitro en medio de inducción de callos, luego medio de regeneración, que contiene el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona pero se pueden usar varios marcadores de selección). Las placas de Petri se incuban a la luz a 25 °C durante 2-3 semanas o hasta que se desarrollan brotes. Los brotes verdes son transferidos desde cada embrión al medio de enraizamiento e incubados a 25 °C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíces son transplantados a suelo en el invernadero. Las semillas T1 son producidas de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-ADN.

Transformación de soja La soja es transformada de acuerdo con una modificación del método descrito en la patente U.S. 5.164.310 de Texas A&M. Diversas variedades de soja comercial pueden ser transformadas con este método. El cultivar Jack (disponible de la Illinois Seed foundation) se usa comúnmente para la transformación. Las semillas de soja son esterilizadas para sembrar in vitro. El hipocotilo, la radícula y un cotiledón son extraídos de plántulas de siete días. El epicotilo y el cotiledón restante se cultivan adicionalmente para desarrollar nodulos axilares. Estos nodulos axilares son extraídos e incubados con Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión. Después del tratamiento de cocultivo, los explantes se lavan y se transfieren al medio de selección. Los brotes regenerados son extraídos y colocados en un medio de alargamiento de los brotes. Los brotes no más largos que 1 cm son colocados en medio de enraizamiento hasta que se desarrollan raíces. Los brotes con raíces son transplantados a suelo en el invernadero. Las semillas T1 son producidas de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-ADN.

Transformación de colza/canola Los pecíolos cotiledonarios e hipocotilos de plántulas de 5-6 días se usan como explantes para el cultivo de tejido y se transforman de acuerdo con Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). El cultivar comercial Westar (Agriculture Canadá) es la variedad estándar usada para la transformación, pero también se pueden usar otras variedades. Las semillas de cañóla son esterilizadas en superficie para sembrar in vitro. Los explantes de pecíolos de cotiledones con el cotiledón unido son extraídos de las plántulas in vitro e inoculados con Agrobacterium (que contiene el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante del pecíolo en la suspensión bacteriana. Los explantes son cultivados luego durante 2 días en medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l BAP, 3 % de sacarosa, 0,7 % de Phytagar a 23 °C, 16 hs de luz. Después de dos días de cocultivo con Agrobacterium, los explantes de pecíolos son transferidos a medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l BAP, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días, y luego cultivados en medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración de los brotes. Cuando los brotes tienen 5 - 10 mm de longitud, se cortan y se transfieren a medio de alargamiento de brotes (MSBAP-0.5, que contiene 0,5 mg/l BAP). Los brotes de aprox. 2 cm de longitud son transferidos al medio de enraizamiento (MS0) para la inducción de raíces. Los brotes con raíces son transplantados a suelo en el invernadero. Las semillas T1 son producidas de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-ADN.

Transformación de alfalfa Se transforma un clon regenerador de alfalfa (Medicago sativa) usando el método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847). La regeneración y la transformación de alfalfa dependen del genotipo y por lo tanto se requiere una planta regeneradora. Se han descrito métodos para obtener plantas regeneradoras. Por ejemplo, éstas pueden ser seleccionadas del cultivar Rangelander (Agricultura Canadá) o cualquier otra variedad de alfalfa comercial como describieron Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Alternativamente, la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) ha sido seleccionada para usar en el cultivo de tejidos (Waikeret al., 1978 Am J Bot 65:654-659). Los explantes de pecíolos son cocultivados, durante la noche, con un cultivo de Agrobacteríum tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes son cocultivados durante 3 días en la oscuridad en medio de inducción SH que contiene 288 mg/L de Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4,35 g/L de K2S04 y 100 m de acetosiringinona. Los explantes se lavan en medio Murashige-Skoog de media concentración (Murashige and Skoog, 1962) y se colocan en placas en el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacteríum. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfieren a medio de desarrollo BOÍ2Y que no contiene reguladores del crecimiento, ni antibióticos y 50 g/L de sacarosa. Los embriones somáticos se germinan subsiguientemente en medio Murashige-Skoog de media concentración. Las plántulas con raíces se transplantan a macetas y se cultivan en un invernadero. Las semillas T1 son producidas de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de T-ADN.

Transformación de algodón El algodón se transforma utilizando Agrobacteríum tumefaciens de acuerdo con el método descrito en US 5:159.135. Las semillas de algodón se esterilizan en su superficie en 3% de solución de hipoclorito de sodio durante 20 minutos y se lavan con agua destilada con 500 pg/ml de cefotaxima. Luego se transfieren las semillas al medio SH con 50pg/ml de benomil para su germinación. Se extraen los hipocotilos de las plántulas que tienen de 4 a 6 días, se los corta en trozos de 0,5 cm y se los coloca en 0,8% de agar. Se utiliza una suspensión de Agrobacteríum (aprox. 108 células por mi, diluidas a partir de un cultivo de toda la noche transformado con el gen de interés y marcadores de selección adecuados) para inocular los explantes de hipocotilos. Luego de 3 días a temperatura ambiente y luz, los tejidos se transfieren a un medio sólido (1 ,6 g/l de Gelrite) con sales Murashige and Skoog con vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50:151-158 (1968)), 0,1 mg/l de 2,4-D, 0,1 mg/l de 6-furfurilaminopurina y 750 pg/ml de MgCL2, y con 50 a 100 pg/ml de cefotaxima y 400-500 pg/ml de carbenicilina para eliminar las bacterias residuales. Se aislan las líneas celulares individuales luego de dos a tres meses (con subcultivos cada cuatro a seis semanas) y se cultivan adicionalmente en un medio selectivo para la amplificación de tejido (30°C, fotoperiodo de 16 hs). Posteriormente, los tejidos transformados se cultivan adicionalmente en un medio no selectivo durante 2 a 3 meses para que se generen embriones somáticos. Los embriones de aspecto saludable de al menos 4 mm de longitud se transfieren a tubos con un medio SH en vermiculita fina, suplementado con 0,1 mg/l de ácido indol acético, 6 furfurilaminopurina y ácido giberélico. Los embriones se cultivan a 30°C con un fotoperiodo de 16 hs, y los plantines en la etapa de 2 a 3 hojas se transfieren a macetas con vermiculita y nutrientes. Las plantas se vuelven más resistentes y posteriormente se las transfiere al invernadero para su cultivo adicional.

Ejemplo 9: Procedimiento de evaluación fenotípica para arroz transformado con SEQ ID NO: 1 9.1 Preparación de la evaluación Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes.

Los transformantes primarios fueron transferidos de una cámara de cultivo de tejidos a un invernadero para el cultivo y la cosecha de la semilla T1. Se retuvieron seis eventos, de los cuales la progenie de T1 segregó 3:1 para la presencia/ausencia del transgen. Para cada uno de estos eventos, se seleccionaron aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían el transgen (hetero- y homocigotas) y aproximadamente 10 plántulas T1 que no tenían el transgen (nulicigotas) monitoreando la expresión del marcador visual. Las plantas transgénicas y los nulicigotas correspondientes fueron cultivados lado a lado en posiciones al azar. Las condiciones del invernadero eran de días cortos (12 horas de luz), 28°C a la luz y 22°C en la oscuridad y una humedad relativa de 70%. Las plantas cultivadas en condiciones sin estrés se regaron a intervalos regulares para asegurar que el agua y los nutrientes no fueran limitantes para satisfacer las necesidades de las plantas para completar su crecimiento y desarrollo.

Se evaluaron adicionalmente otros cuatro eventos T1 en la generación T2 siguiendo el mismo procedimiento de evaluación que para la generación T1 pero con más individuos por evento. Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasaron varias veces a través de una cámara de imágenes digitales. En cada punto de tiempo se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde por lo menos 6 ángulos diferentes.

Control de sequía Se cultivaron plantas de semillas T2 en suelo de macetas en condiciones normales hasta que se aproximaron a la etapa de emerger. Luego fueron transferidas a una sección "seca" en donde no se realiza irrigación. Se insertaron sondas de humedad en macetas elegidas al azar para monitorear el contenido de agua del suelo (SWC). Cuando el SWC se encuentra por debajo de ciertos umbrales, las plantas se volvieron a regar automáticamente en forma continua hasta que se alcanza un nivel normal nuevamente. Luego las plantas fueron transferidas de nuevo a condiciones normales. El resto del cultivo (maduración de la planta, cosecha de las semillas) fue igual que para las plantas que no crecen en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registraron como se detalló para el crecimiento en condiciones normales.

Control de eficiencia del uso de nitrógeno Se cultivan plantas de arroz de semillas T2 en suelo de macetas en condiciones normales excepto por la solución de nutrientes. Las macetas son regadas desde el transplante hasta la maduración con una solución de nutrientes específica que contenía un contenido reducido de N nitrógeno (N), usualmente entre 7 y 8 veces menor. El resto del cultivo (maduración de la planta, cosecha de las semillas) es igual que para las plantas que no crecieron con estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalló para el crecimiento en condiciones normales.

Control de estrés salino Se cultivan plantas en un sustrato hecho de fibras de coco y argex (proporción 3 a 1 ). Se usa una solución de nutrientes normal durante las dos primeras semanas luego de transplantar las plántulas al invernadero. Después de las dos primeras semanas, se agregan 25 mM de sal (NaCI) a la solución de nutrientes, hasta que se cultivan las plantas. Luego se miden los parámetros relacionados con el crecimiento y el rendimiento. 9.2 Análisis estadístico: Prueba F Se usó ANOVA (análisis de variantes) de dos factores como un modelo estadístico para la evaluación general de las características fenotípicas de la planta. Se llevó a cabo una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se llevó a cabo para controlar un efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y para verificar un efecto general del gen, también conocido como efecto global del gen. El umbral de significancia para un efecto global del gen verdadero se fijó a un nivel de probabilidad de 5% para la prueba F. Un valor de prueba F significativo indica un efecto del gen, lo que significa que no es sólo la simple presencia o posición del gen la que causa las diferencias del fenotipo.

Debido a que se llevaron a cabo dos experimentos con eventos que se superponen, se realizó un análisis combinado. Esto es útil para controlar los efectos sobre los dos experimentos, y si este es el caso, acumular evidencia de ambos experimentos a fin de aumentar la confianza en la conclusión. El método utilizado fue un enfoque de moleo mixto que toma en cuenta la estructura de niveles múltiples de los datos (es decir, experimento-evento-segregantes). Los valores P se obtuvieron mediante la comparación de una prueba de proporción de probabilidad con las distribuciones chi al cuadrado. 9.3 Parámetros medidos Medición de parámetros relacionados con la biomasa Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, las plantas se pasaron varias veces a través de una cámara de imágenes digitales. En cada punto de tiempo se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde por lo menos 6 ángulos diferentes.

Se determinó el área aérea de la planta (o biomasa del follaje) contando el número total de píxeles en las imágenes digitales de las partes aéreas de las plantas discriminadas del fondo. Este valor se promedió para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm • cuadrados por calibración. Los experimentos muestran que el área aérea de la planta medida de este modo se correlaciona con la biomasa de las partes aéreas de la planta. El área aérea es el área medida en el punto de tiempo en el cual la planta había alcanzado su máxima biomasa de follaje. El vigor temprano es el área aérea de la planta (piantín) tres semanas posteriores a la germinación. El aumento en la biomasa de la raíz se expresa como un aumento en la biomasa total de la raíz (medida como el máximo de biomasa de raíces observada durante el ciclo de vida de una planta); o como un aumento en el índice raíz/brote (medida como la relación entre la masa de la raíz y la masa del brote en el período de crecimiento activo de la raíz y el brote).

Se determinó el vigor temprano contando el número total de píxeles de las partes aéreas de la planta discriminado del fondo. Este valor se promedió para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde diferentes ángulos y se convirtió en un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración. Los resultados son para plantas tres semanas posteriores a ta germinación. El vigor de germinación se mide como la cantidad de semillas que germinan luego de uno, dos o tres días después de la siembra, en comparación con las plantas de control.

Medición de parámetros relacionados con la semilla Las panículas primarias maduras fueron cosechadas, contadas, embolsadas, marcadas con códigos de barras y luego secadas durante tres días en un horno a 37°C. Luego las panículas fueron trilladas y todas las semillas fueron recogidas y contadas. Las cáscaras llenas se separaron de las vacías usando un dispositivo de soplado de aire. Las cáscaras vacías fueron descartadas y la fracción restante se contó nuevamente. Las cáscaras llenas se pesaron en una balanza analítica. Se determinó el número de semillas llenas contando el número de cáscaras llenas que permaneció después del paso de separación. Se midió el rendimiento total de semillas pesando todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta. Se midió el número total de semillas por planta contando el número de cáscaras cosechadas de una planta. El peso de mil granos (TKW) se extrapola a partir de la cantidad de semillas llenas contadas y su peso total. El Indice de Cosecha (Hl) en la presente invención se define como la proporción entre el rendimiento total de semilla y el área aérea (mm2), multiplicado por el factor 106. El número total de flores por panículo como se define en la presente invención es la relación entre el número total de semillas y el número de panículos primarios maduros. La tasa de llenado de semilla como se define en la presente invención es la proporción (expresada como un porcentaje %) de la cantidad de semillas llenas con respecto a la cantidad total de semilla (o ramillete [floreí]).

Ejemplo 10: Resultados de la evaluación fenotípica de las plantas de arroz transgénicas Los resultados de la evaluación de las plantas de arroz transgénicas que expresan un ácido nucleico HUB1 en condiciones sin estrés se presentan a continuación en la Tabla E. Se observó un incremento de más del 5 % para el vigor de emergencia (vigor temprano), peso total de semillas (rendimiento total de semilla), cantidad de semillas llenas y cantidad total de semillas.

Tabla E: Parámetros de crecimiento mejorados en arroz transgénico que expresa HUB1 bajo el control de un promotor de fuerza media (HMGP): Cuando se cultivan en condiciones de estrés, las plantas de arroz transgénicas que expresan HUB1 muestran, en comparación con las plantas de control, un incremento en uno o más de los siguientes parámetros: área por encima del suelo (o biomasa de follaje), vigor temprano, vigor de germinación, biomasa de raíz, cantidad total de semillas, cantidad de semillas llenas, rendimiento total de semillas (peso total de semillas), peso de mil granos, índice de cosecha, cantidad de flores por panículo.

Ejemplo 11: Comparación de la actividad del promotor en el arroz Se transformaron las plantas de arroz con el gen GUS bajo el control del promotor CaMV35S, el promotor GOS2 del arroz, o el promotor HMGP del arroz. La transformación de las plantas fue como se describió anteriormente y se seleccionaron seis eventos de una sola copia (o copia baja) por constructo. Se sembraron sesenta semillas T1 por evento, y se eligieron plántulas transgénicas a través de selección por marcador visual. La integridad del transgén se confirmó adicionalmente mediante qPCR en el terminador. Se tomaron muestras individuales de hoja, tallo y raíz de plántulas de nueve plantas de una semana por evento (muestreo destructivo). Se cultivaron otras nueve plantas transgénicas por evento en el invernadero hasta que se cosecharon semillas T2, para un muestreo en una etapa tardía. Las muestras incluyeron hojas de seis semanas, inflorescencias jóvenes (1-2 días antes de la floración) y semillas T2 maduras. Se cultivaron, se tomaron muestras y se analizaron dos eventos de arroz transgénico 35S-GUS en paralelo con las líneas con el promotor G0S2 y el promotor HMGP, como referencia y control. Las actividades del promotor se determinaron mediante un ensayo GUS cuantitativo estándar; los resultados se muestran en la Tabla F.

Tabla F: Vista general de la actividad de un promotor determinada mediante ensayo GUS cuantitativo. La calificación se basó en el valor promedio de cada constructo (6 eventos, 54 muestras). 1W: plántulas de una semana; 6W: plantas de seis semanas. El sistema de calificación corresponde a la actividad GUS (U/mg proteína soluble total) del siguiente modo: -: <i ; +: 1-10; ++: 10-100; +++: 100-1000; ++++: > 1000.

Ejemplo 12: Material de planta de Arabidopsis, condiciones de crecimiento y manipulación genética Las semillas Ler de Arabidopsis thaliana se obtuvieron del Nottingham Arabidopsis Stock Centre. El mutante hub1-1 se ha descrito previamente como ang4-1 (Berna' et al., 1999). Las plantas se cultivaron en general in vitro en un medio de germinación (Valvekens et al., 1988). Para los experimentos de crecimiento de raíz, se cultivó una sola hilera de cinco plantas en placas cuadradas (BD Falcon) en posición vertical en un medio de germinación que contenía 10 g/L de agar en cultivo de tejido vegetal (Lab M). Las condiciones de la cámara de crecimiento eran de fotoperíodo de 16-h-luz/8-h-oscuridad con luz blanca (tubos de neón blanco-frío; Radium Lampenwerken), radiación activa por fotosíntesis 100 µ??'2 h"1, y 20°C. Se cultivaron las plantas en una mezcla de suelo:vermiculita (3:1 ; v/v) en condiciones de invernadero con una temperatura entre 21 y 30°C, humedad relativa de 50 a 60%, y la irradiancia (luz natural y lámparas fluorescente) entre 100 y 120 µ? M"2 h"1 radiación activa por fotosíntesis en un régimen de 16-h-luz/8-h-oscuridad.

Para obtener líneas de sobreexpresión de HUB1 (OE-HUB1 ), se amplificó el marco de lectura abierto (incluso ATG y codón de detención) de HUB1 (2637 bp) mediante Pfu polimerasa y se clonó en el vector pDONRT22l usando la estrategia de recombinación GATEWAY (Invitrogen) para obtener clones de ENTRADA. El clon de ENTRADA se recombinó con el vector pK7WG2 (Karimi et al., Trends Plant Sci. 7, 193-195, 2002) para obtener un vector de DESTINO con el ORF bajo el control de un promotor 35S. Esta construcción se introdujo en Agrobacterium tumefaciens y posteriormente las plantas Ler se transformaron con la suspensión de Agrobacterium tumefaciens a través de inmersión floral. Las semillas TO se cultivaron en un medio de crecimiento de alta densidad que contenía Canamicina (50 pg/ml), Nistatina (50 pg/ml) y Carbenicilina (250 pg/ml) para seleccionar los transformantes. Estos transformantes T1 se transfirieron al suelo para obtener semillas T2.

Se esterilizaron las semillas Ler de tipo silvestre, muíante hub1-1 y OE-HUB1 y se colocaron en placas en un medio MS con 1 % de agar. Luego de 2 noches de vernalización en la oscuridad 4°C, las placas se colocaron en cámaras de crecimiento a 21 °C, con una humedad relativa de 50-60%, PAR 100-120 pE/m2/hr y un régimen de 16/8 horas de día/noche (condiciones de crecimiento de Día Largo (LD)). Las condiciones de crecimiento de día corto (CD) comprendieron un régimen de 8/16 horas de día/noche.

Ejemplo 13: Análisis de plantas de Arabidopsis Se midió la longitud, el ancho y el área de la brizna de la hoja de mutante hubl-1, línea de sobreexpresión de HUB1 y Ler de tipo silvestre durante un lapso de tiempo de tres semanas después de la siembra. Se tomaron muestras de las hojas jóvenes uno y dos durante este lapso de tiempo aclarando inicialmente la clorofila en 70% de etanol durante la noche. Luego se transfirieron las muestras aclaradas en 100% de ácido láctico para su conservación. Las hojas aclaradas se colocaron en un portaobjetos y se fotografiaron utilizando una videocámara Axiom (ZEISS, USA) instalada en el microscopio Bino-Leica y se llevaron a cabo mediciones de la longitud, el ancho y el área de la brizna con un programa de software ImageJ 1.34. Para análisis estadístico, la comparación de a pares de los datos se llevó a cabo con un programa estadístico online (Uitenbroek, D. G, Binomial. SISA. 1997. www.quantitativeskills.com/sisa/distributions/binomial.htm).

Determinación del tiempo de floración: se observó el inicio de la floración temprana (bolting) visualmente y se expresó en días luego de la vernalización.

Para la determinación de pigmentos fotosintéticos, se cosecharon 50 mg de muestras de hojas a partir de plántulas de 25 días cultivadas in vitro. Las muestras se sumergieron en 2 mi de acetona al 80% fría y se molieron con perlas de vidrio. Se centrifugaron las muestras (5' a 4 C) y se transfirió el sobrenadante a tubos nuevos y se ajustó hasta 5 mi con acetona al 80%. Los pigmentos se extractaron durante la noche a -20C, se centrifugaron y se analizaron en un espectrofotómetro en cubetas de plástico a 3 longitudes de onda (a 663, 646 y 470 nm).

El contenido de clorofila a se calculó de (12,21 *A663)-(2,81 *A646), El contenido de clorofila b de (20,31*?646)-(5,03*?663), El contenido total de carotenoides de (1000*A470)-(1 ,82*chl a)- (85,02*chl b). Para cada caso, el contenido de pigmentos se calculó por 50 mg de peso fresco. Se repitió el experimento dos veces y cada muestra se analizó por triplicado.

Análisis de microensayo: Los brotes apicales de las plántulas de las tres líneas se cosecharon en la etapa de desarrollo 1.02 y el ARN total se extractó mediante RNeasy (Qiagen) de acuerdo con el manual. Las muestras se hibridaron en ensayos Agilent y se normalizaron los datos. Todos los análisis se realizaron con mediciones de intensidad de fluorescencia de frente del logaritmo en base 2. Los datos de expresión se analizaron en dos etapas: 1 ) un análisis "dentro del portaobjetos" destinado a eliminar la variación asociada con las respuestas diferenciales del tinte tomadas como ruido; y 2) un análisis "entre el portaobjetos" destinado a calcular las diferencias promedio entre los genotipos y su error estándar. Para el análisis "dentro del portaobjetos", se aplicó un modelo fijo, lineal y especial de la forma respuesta = µ + spline(intensidad) + residual (1 ) cuando la variable "respuesta" es la proporción log2 de las intensidades fluorescentes del frente (M) medidas en los 37971 lugares de genes. En el modelo (1 ), la tendencia de la tintura fue representada por una curva spline alisada cúbica (sp//ne(intensidad)), implementada en el menú GenStat para el análisis de datos de microensayo. Una vez que se obtuvieron las proporciones log2 adaptadas (M) para cada gen, se calcularon las intensidades adaptadas de señal log2R y log2G. Para el análisis "entre el portaobjetos", se utilizó un análisis de varianza modelo mixto de dos etapas y se llevó a cabo con GenStat. Cada una de las 24 muestras de hibridación se sometió a un modelo de normalización lineal de la forma (los términos aleatorios están subrayados), respuesta = µ + ensayo + residual (2) en donde la variable "respuesta" representa las mediciones de intensidad de fluorescencia corregida de Cy3 y Cy5 transformada con base en log2 de las 37971 etiquetas especificas de genes. El ensayo que modela los efectos de hibridación de cada uno de los 12 microensayos se añadió como término aleatorio.

En una última etapa, se calculó la proporción de genes expresados, de los cuales una gran parte de su variación puede deberse a diferencias genotípicas, es decir, es genético. Los residuales del modelo (2) se analizaron para cada uno de los 37971 genes en forma separada mediante un modelo mixto de la siguiente forma residual = µ + tintura + réplica + genotipo^ + ensayo + error (3) dividiendo la variación específica de gen en tintura fija específica de gen (Cy3 y Cy5), réplica (A y B) y efectos genotípicos, y efectos de manchado aleatorios. El efecto genotípico, genotipog, se refiere a los 3 genotipos Ler, hub1-1 , OE-HUB1. El término del ensayo modela los efectos de cada lugar e iguala el efecto de interacción (Gene.Array). Se asumió que los efectos aleatorios en el modelo eran independientes y estaban distribuidos de manera normal con promedios cero y varianza o,2, donde f = A (ensayo) y E (error).

Se adaptó el modelo mixto lineal (3), y una medición de la variabilidad en los niveles de expresión entre los cuatro genotipos, se calcularon las estadísticas de Wald y se asignó una significancia a cada una de las seis comparaciones de a pares entre los genotipos. Posteriormente se calcularon las tasas de descubrimiento falso (FDR) mediante la modelación de los valores P ajustados como una mezcla de 2 componentes de densidades Uniforme y Beta, implementada en GenStat; se utilizaron las configuraciones de parámetros predeterminados para calcular tt0, la proporción de características que son verdaderamente nulas. Finalmente, se impuso un cambio de 2 veces en la diferencia de expresión genotípica para filtrar adicionalmente los genes que era probable que tuvieran una importante diferencia en términos estadísticos y biológicos en la expresión genotípica. Se realizó un análisis BinGo de los datos para identificar los procesos biológicos representados en exceso y representados de manera insuficiente en las diferentes líneas de expresión errónea HUB1 (Maere et al., Bioinformatics 21 , 3448-3449, 2005).

Ejemplo 14: La sobreexpresión de HUB1 bajo el control del promotor CaMV35S en Arabidopsis da como resultado mejores propiedades de crecimiento Las semillas de líneas que sobreexpresan HUB1 (OE-HUB1 ) mostraron mejor vigor de germinación en comparación con el tipo silvestre (Ler) o las líneas mutantes hub1-1 : el tipo silvestre Ler, el mutante hub1-1 y las semillas OE-HUB1 se esterilizaron y colocaron en placas en medio MS con 1 % agar. Luego de 2 noches de vernalización en la oscuridad a 4°C, las placas se colocaron en cámaras de crecimiento a 21 "C, con una humedad relativa de 50-60%, PAR 100-120 pE/m2/hs y condiciones de 16/8 horas de día/noche. La germinación se monitoreó durante el día y se registraron los signos visibles de la germinación. El efecto promotor del crecimiento de la sobreexpresión ? I HUB1 se observó como mejor vigor de germinación de las plántulas transgénicas en ! comparación con el tipo silvestre o muíante hub1-1. En las plantas de tipo silvestre, la mayoría de las plántulas germinó dos días después de la vernalización (DAV) (Figura ! 15). Para el 50 % de las plántulas OE-HUB1 , la germinación se detectó el primer día ! 5 después de la vernalización y el otro 50% germinó el segundo día. En el muíante hub1 -1 , la germinación se demoró un día y para el 50% de las plánlulas, la ¡ germinación se observó solamenle al tercer día. A fin de analizar los mecanismos subyacentes del vigor de germinación mejorado, se midieron las áreas celulares de las líneas Ler y OE-HUB1 durante el crecimiento juvenil de la hoja. Al comienzo del 10 crecimiento, OE- HUB1 muestra una mejora del crecimiento celular que, sin embargo, es nivelada para cuando las hojas alcanzan su tamaño de madurez (Figura 16). De este modo, el efecto positivo de HUB1 en el crecimiento de Arabidopsis ocurre temprano en el desarrollo.

Además, se investigó si la mutación hub1-1 originaría cambios en el desarrollo 15 de la silicua y la semilla. Para el análisis, se cosecharon silicuas verdes que habían crecido por completo (4 a 8 días después de la fertilización) y se escanearon para el análisis o se fotografiaron para obtener imágenes. Se utilizó el programa de software ImageJ (Image Processing and Analysis in Java, desarrollado en Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA) para calcular el 20 área de las silicuas escaneadas. Se contó la cantidad de silicuas por planta a partir de las plantas completas escaneadas.

Las semillas se cosecharon a partir de las silicuas secas y se escanearon. El área de las semillas se calculó a partir de los escaneos usando el programa ImageJ. El peso de las semillas se determinó envolviendo 200 semillas en papel de aluminio de 25 peso y medida conocidos. El rendimiento de las semillas por planta se sometió a análisis de la prueba t. Se determinó que el área de las silicuas hub1-1 estaba sustancialmente reducida (Figuras 17 y 18). Las silicuas hub1-1 también contenían menos semillas con 50-80% de semillas sin fertilizar, lo cual dio como resultado menor rendimiento total de semillas. Las semillas hub1-1 también eran más pequeñas en 30 tamaño (Figura 19). En consecuencia, el rendimiento total de las semillas de las plantas hub1 -1 se redujo significativamente en comparación con el tipo silvestre Ler (Figura 20). Mientras que en las plantas mutantes hub1-1 , los parámetros de la silicua y las semillas se vieron afectados en gran medida, en las líneas de sobreexpresión de HUB1 , no se observaron efectos significativos en los parámetros de las semillas. Esto 35 se puede deber al hecho de que en las semillas de Arabidopsis, el desarrollo de la semilla no depende del crecimiento celular o que la sobreexpresión bajo el control del promotor 35S CaMV no era óptima. Sin embargo, en las líneas de sobreexpresión de HUB1 , la morfología de las silicuas (frutas) se alteró aumentando el área a lo ancho (Figura 18).

Ejemplo 15: Mutagénesis de HUB1 y caracterización funcional del muíante HUBIpm.

La secuencia codificadora del octámero de cisteínas e histidinas en el dominio RING de HUB1 se mutagenizó por mutagénesis dirigida a sitio mediada por PCR (QuickChange, Stratagene), de manera que Cys1 y Cys2 cambiaron a residuos Ser (Fig. 1 , panel B). Las proteínas recombinantes se clonaron como proteínas de fusión con etiquetas de epítope His y GST, expresados en E. coli y purificados en columnas de afinidad. Las proteínas purificadas se evaluaron para determinar la monoubiquitinación de histona H2B y la actividad de auto-ubiquitinación en un ensayo de (auto)ubiquitinación in vitro como describe Fleury et al. (2007); ver también Ejemplo 6.

Las mutaciones puntuales en el dominio RING redujeron la actividad de autopoliubiquitinación como lo indican los niveles reducidos de estas modificaciones en los western blots (Figura 5, HA-Ab). La carga similar de GST-HUB1 es evidenciada por GST Ab (Figura 5, GST-Ab). Estos datos confirmaron que el dominio RING era necesario para la actividad de autoubiquitinación. De manera inesperada, la monoubiquitinación de histona H2B no se vio afectada por las mutaciones puntuales (Figura 5, HA-Ab). Por otra parte, la presencia del sustrato H2B redujo la actividad de autopoliubiquitinación, lo cual sugirió que en ausencia de sustrato, la proteína HUB1 se puede eliminar mediante la degradación de la proteína. Se supone que las mutaciones puntuales hacen que la proteína se vuelva dominante positiva al reducir la autorregulación y, de este modo, estabilizar la proteína. Sin embargo, en una prueba inicial con tratamiento de inhibidor de proteasoma (MG132), no se observó acumulación de proteína HUB1 , lo cual sugirió que puede no ser- una proteína inestable pero que la poliubiquitinación puede tener una función reguladora alternativa, que aún falta identificar.

El dominio RING participa principalmente en la interacción con la enzima E2, y aparentemente, las mutaciones puntuales generadas en la presente descripción no eliminan esta interacción, o un dominio RING totalmente funcional no es absolutamente necesario para mediar las modificaciones de histona. Otras posibles mutaciones de ubiquitina ligasas E3 y dominios RING incluirían el direccionamiento a aminoácidos adicionales del octámero de cisteínas e histidinas que tienen los dos átomos de zinc. Las posibilidades incluyen reemplazar una o dos cisteínas que tienen un Zn o reemplazar dos o cuatro cisteínas que tienen dos átomos de Zn. Una alteración más grave es la eliminación del dominio completo RING, que crearía un mutante comparable con el mutante hub1-1. Los fenotipos hub1-1 son únicamente fuertes en comparación con los alelos de knockout en el fondo Col-0 (Fleury et al., 2007) y pueden sugerir que el codón de detención temprano frente al dominio RING causa la generación de una proteína truncada con un efecto dominante negativo en la función de la proteína. Se generan anticuerpos para confirmar que la proteína HUB1 es trunca en las líneas hub1-1. Los constructos HUBI pm y HUB1 rotulados con NTAP se generaron para los experimentos de Purificación por Afinidad de Tándem para los estudios de interactoma. El dominio RING de una ubiquitina ligasa E3 usualmente media las interacciones con la enzima E2. Sin embargo, las mutaciones puntuales generadas en el dominio RING de HUB1 no tuvieron ningún efecto en la interactoma. Mientras que el HUB1 de longitud total pudo unir la proteína homóloga HUB2, las mutaciones puntuales abolieron esta actividad de unión.

Para analizar en mayor detalle el rol del dominio RING en HUB1 (cuando funciona en la degradación de la proteína) en relación a la regulación del crecimiento de la planta, los constructos de mutaciones puntuales y de tipo silvestre rotuladas con TAP se transformaron en plantas de Arabidopsis. El análisis de Western blot se utilizó para detectar los niveles proteicos en las plantas y evaluar el impacto del tratamiento del inhibidor de proteasoma en los niveles proteicos Hub1. Generalmente, las mutaciones puntuales en el dominio RING generan formas dominantes negativas de las ligasas E3, que atrapan los sustratos pero no median su ubiquitinación, y por lo tanto, los blancos se estabilizan. Se espera que los fenotipos de las plantas transgénicas de mutantes puntuales sean menos marcados que los de los mutantes nulos, debido solamente al efecto del análisis volumétrico (titration) en los sustratos. Sin embargo, la caracterización molecular de la proteína mutante puntual in vitro sugiere que HUB1 puede estar estabilizado debido a una menor autorregulación, mientras que no se observó reducción en la monoubiquitinación de H2B.

Ejemplo 16: La sobreexpresión de HUBIpm en Arabidopsis transgénica mejora las propiedades de crecimiento de la planta El mutante hub1-1 de Arabidopsis thaliana o el tipo silvestre Ler se transformó con la secuencia codificadora HUB1 o HUBI pm, cada uno bajo el control del promotor CaMV35S, y se cultivó como se describió anteriormente. De manera inesperada se descubrió que la sobreexpresión del mutante HUBI pm sobre el fondo de Ler rio tuvo ningún efecto en el ancho de la hoja, y el ancho aumentado de la hoja es más prominente para HUBI pm que para HUB1 (Fig. 21 A); se observó el mismo efecto sobre el fondo del mutante hub1 -1 , en particular las hojas 3 a 9 del transformante HUBI pm tuvieron mayor ancho de la hoja en comparación con el control o el transformante HUB1 (Fig. 21 B).

Ejemplo 17: La sobreexpresión de la proteína HUBIpm bajo el control de un promotor de mediana intensidad aumenta el rendimiento de las semillas Se transforma Oryza sativa con la secuencia codificadora HUBI pm ligada operativamente a un promotor de mediana intensidad (tal como el promotor HMGP) y se cultiva como se describió anteriormente. Las plantas tienen mejores características de crecimiento, que comprenden uno o más de los siguientes: mayor biomasa, mayor vigor de germinación, mayor vigor temprano, mayor rendimiento de semillas, mayor tolerancia al estrés.

Ejemplo 18: La expresión génica del reloj circadiano es afectada por la expresión modulada de HUB1 Los datos del microensayo de OE-HUB1 sugirieron que el reloj circadiano es deficiente en las líneas de expresión errónea de HUB1. Se detectó que los genes de entrada, tos genes osciladores del reloj y los genes de salida estaban regulados en forma ascendente en la línea de sobreexpresión de HUB1. Para identificar verdaderos genes blanco HUB1 , se registraron genes regulados de manera opuesta entre el mutante hub1-1 y las líneas OE-HUB1 a partir del experimento de microensayo. La tabla G muestra una lista de 43 genes que estaban considerablemente regulados en forma descendente en el mutante hub1-1 y regulados en forma ascendente en la línea OE-HUB1 ; los datos se clasifican de acuerdo con proporciones log2 ascendentes entre hub1-1 y OE-HUB1. De los primeros 43 genes regulados en forma opuesta entre las líneas de sobreexpresión (ascendente) y mutantes (descendente), 18 se regularon diariamente, y 8 de estos genes regulados diariamente formaban parte de los 10 primeros (Tabla G). Entre estos genes, se detectaron componentes osciladores del reloj circadiano, tales como CCA1 , LHY y APRR9. Además, la expresión de la proteína de la familia de la caja F (FKF1 ) / subunidad de la caja F del complejo adagio 3 (AD03) E3 ubiquitina ligase SCF, y ELF4 (respectivamente At1 g68050 y At2g40080, ambos genes de entrada del reloj), los genes osciladores del reloj APRR5 (regulador de pseudo-respuesta 5, At5g24470), APRR3 (regulador de pseudo-respuesta 3, At5g60100), y TOC1 se regularon en forma ascendente en el mutante hub1 -1 , pero en forma descendente en las plantas OE-HUB1. Varios genes de salida del reloj, incluso las proteínas de unión a clorofila A-B (tales como LHCB4.3, At2g40100) se regularon en forma ascendente en plantas OE-HUB1. Si se los analiza en forma conjunta, estos datos confirman que la expresión errónea de HUB1 impacta sobre el reloj circadiano. Para confirmar en mayor medida si la frecuencia o la amplitud del reloj circadiano se ve afectada en las líneas hubl , se realizó un experimento de curso temporal con análisis QPCR de los genes del reloj. Con este fin, se utilizaron plántulas cultivadas in vitro que habían germinado en condiciones de días cortos, y después de 12 a 14 días se las transfirió a condiciones de luz continua. La toma de muestras comenzó luego de 24 hs en luz continua, y las partes sobre el nivel del suelo se cosecharon cada 4 horas durante un período de 48 horas. Se extractó ARN usando RNeasy (Qiagen) seguido de tratamiento con DNasa. Se preparó cADN con First Strand Synthesis Kit (Invitrogen) comenzando con 3 ug de ARN total. Se utilizaron 5 µ? de cADN diluido (20 ng/ul) en cada reacción con SYBR Green y cebadores específicos de genes. Se llevó a cabo QPCR en un Bio Rad iCycler usando técnicas estándar.

Los primeros resultados demostraron que en el mutante hub1-1 , la expresión CCA1 se redujo en amplitud con un cambio en la onda.

Tabla G: Genes regulados en forma opuesta entre hub1-1 con valores log2 negativos y OE-HUB1 (con valores log2 positivos). Los genes se ordenan con proporciones log2 ascendentes entre hub1-1 y OE-HUB1 con una proporción log2 de corte de regulados diariamente. Log2; valores de expresión.

Nombre hub1-1 Ler OEHUB1 Código AGI Diariamente LHCB2 -2J -0J 0J At2g05100 D Glicerofosforil diéster -1 J -0,2 1 ,2 At5g08030 Oxidorreductasa -0,4 1,2 2,5 At2g36690 Prot. expresada -2,8 0,2 0,0 At1g62190 DREB1 C/CBF2 -1 ,2 0,5 1 ,6 At4g25470 Repetición rica en leucina -0,6 1 ,5 1 ,9 At1g51800 Caja B del dedo de Zn -1 ,7 -1 ,7 0,8 At3g21150 Factor de transcripción -2,2 -1 ,9 0,3 At4g18650 D Prot. expresada -1 ,4 1,3 1 ,1 At5g45830 Factor de transcripción -0,1 2,3 2,3 At2g35310 Glicocil transferasa -1 ,6 0,7 0,8 At2g 13680 VSP1 -0,9 1 ,2 1 ,5 At5g24780 D Aminotransferasa -1 ,8 -0,4 0,6 At2g24850 Proteína -2,2 0,0 0,1 AV786179 Citocromo P450 -0,1 1 ,8 2,1 At2g29090 D Proteína de clase TIR -1 ,5 -0,2 0J At1q65390 Proteína rica en hidroxiprolina -2,2 -0,8 0,0 At1g11070 WRKY -0,2 0,7 2,0 At1g80840 SUC5 -0,5 0,9 1.7 At1g71890 Factor de transcripción -1 ,1 0,5 1.1 At4g31680 Prot. de jacalina lectina -1 ,4 0,6 0.8 At5g35940 Transportador ABC -0,1 1 ,3 2,0 At1g 15520 Prot. expresada -1 ,8 -0,4 0,3 At3g28270 D Tipo DREB2A -0,3 0,3 1 ,8 At1g75490 Familia NAM -1 J -1 ,5 0,3 At1g69490 D Proteína del dedo de Zn DOF 0,0 0,2 2,0 At1g69570 D Prot. expresada -0,5 1 ,5 1 ,5 At3g 17890 Caja B del dedo de zinc -1 ,7 -1 ,5 0,3 At3g21890 D Proteína del dedo de Zn DOF -0,2 0,6 1.8 At5g62430 D Desconocido 0,0 1 ,9 2.0 CHR3:00612 7463- 006127522 SAUR/AC1 -1 ,9 -0J 0,1 At4g38850 D Ejemplo 19: Las vías corriente abajo del reloj circadlano son afectadas por la expresión modulada de HUB1 Los genes de salida del reloj circadiano incluyen reguladores de la capacidad de fotosíntesis y desarrollo de los plástidos. Para determinar los fenotipos dependientes de la luz, se cultivaron plantas mutantes hub1-1 , de tipo silvestre Ler y que sobreexpresan HUB1 en tres condiciones diferentes de luz; día largo (LD), día corto (SD) y luz continua (CL) para la caracterización fenotípica (Figura 6). El mutante hub1-1 cultivado en condiciones de luz de día corto plaramente tuvo un color pálido. En condiciones de día largo, el fenotipo de crecimiento hub1-1 fue menos marcado y principalmente como se describe en Fleury et al., (2007). En condiciones LD y CL, las plántulas hub1-1 mostraron solamente en algunos casos falta de pigmentos.

Para confirmar que las plantas mutantes hub1-1 tenían menor capacidad de fotosíntesis, se analizó el contenido de pigmentos de fotosíntesis, principalmente clorofila a y b y el contenido total de carotenoides, en las plantas cultivadas en los tres regímenes de luz. En SD, se redujeron todos los pigmentos (Figura 7). La coloración pálida de la hoja y el contenido reducido de pigmentos predice defectos en las estructuras de los plástidos, y esta hipótesis es avalada por los datos del transcriptoma. Esto se confirmó luego de investigar las características subcelulares principales de los fenotipos dependientes de la luz mediante Microscopio Electrónico de Transmisión. Las primeras imágenes tomadas por TEM muestran estructuras membranales alteradas de tilacoides para los mutantes hub1 -1 (Figura 8). Se redujo la cantidad total de membranas y granas, y hubo más plastoglóbulos en el estroma.

Ejemplo 20: Los fenotipos dependientes de la luz de hub1-1 mejoran en condiciones de día cortos.

Además de la menor capacidad de fotosíntesis, los fenotipos regulados por el reloj circadiano en hub1-1 incluyen menor longitud del hipocotilo, menor crecimiento de la hoja y tiempo de floración temprano. Se compararon estos fenotipos relacionados con el reloj en las líneas de expresión errónea de HUB1 (OE y muíante) con respecto al tipo silvestre Ler. Las plantas se cultivaron en condiciones de días cortos y la longitud de sus hipocotilos se midió después de 21 días de crecimiento. Se redujo la longitud de los hipocotilos de los mutantes Hub1-1 (Figura 9). En las plántulas cultivadas en la oscuridad no se observaron diferencias en la longitud del hipocotilo.

También se sugirió que el desarrollo deficiente del plástido puede afectar la morfología de la hoja. Para comparar los fenotipos de crecimiento en las tres condiciones, se midió el área de la hoja de las plántulas de 21 días cultivas ¡n vitro. Mientras que el crecimiento de los cotiledones del mutante hub1-1 no se ve afectado, el crecimiento en expansión de las hojas verdaderas se ve gravemente reprimido en todas las condiciones (Figuras 6, 10 y 11 ).

Además, se observaron nuevos efectos morfológicos en el mutante hub1 -1 cultivado en condiciones de días cortos. A partir de la hoja tres y cuatro en adelante, algunas hojas sólo desarrollaron estructuras puntiagudas o su vena media sobresalía del lado abaxial de una hoja angosta (Figura 12). Además de las estructuras puntiagudas, los mutantes hub1 -1 mostraron morfologías alteradas en la hoja, tales como menor crecimiento, brizna más angosta de la hoja y patrón alterado del sistema de venas. También se observaron morfologías alteradas en las flores. Las estructuras florales de las plantas mutantes hub1-1 revelaron que los meristemas y órganos florales no estaban y/o estaban en el lugar equivocado (Figura 13).

Asimismo, las plantas mutantes hub1-1 florecen temprano en condiciones SD y también en las otras dos condiciones de crecimiento, en base al inicio de la floración temprana (bolting).

Ejemplo 21: La expresión alterada de los genes del desarrollo se correlaciona con los fenotipos hub1-1 Las plantas mutantes hub1-1 tienen severos fenotipos de hoja con menor crecimiento, patrones alterados del sistema de venas y, ocasionalmente, aparecen venas medias que sobresalen u hojas verdaderas puntiagudas. Los datos del microensayo de las líneas de expresión errónea de HUB1 mostraron alteraciones en varios genes del desarrollo, tales como los genes KNAT, WUS, AP2, CLAVATA (Tabla H). La Figura 14 muestra patrones de expresión de los genes del desarrollo identificados en los microensayos de HUB1 de acuerdo con Genevestigator.

Tabla H: Genes del desarrollo expresados en forma diferente en hub1-1 y el tipo silvestre Ler o las líneas OE-HUB1. Los valores faltantes no eran significativos (p). Los genes se clasificaron de acuerdo con la proporción ascendente entre hub1-1 y el tipo silvestre Ler.

Ejemplo 22: Modulación de los procesos biológicos en hub1-1 en comparación con las plantas de tipo silvestre Ler y HUB1 OE: Se realizó un análisis Bi GO (una herramienta para determinar qué términos de Gene Ontology (GO) están considerablemente representados en exceso en un conjunto de genes) en base a los datos del microensayo (Ejemplo 13) para identificar los procesos biológicos influenciados por la expresión errónea de HUB1 . Las Tablas 11 y 12 muestran una lista de genes que se expresaron de manera diferente en hub1 -1 en comparación con las plantas Ler WT: Tabla 11 : Genes regulados en forma descendente en hub1-1 vs. Ler (SEQ ID NO: 244 a SEQ ID NO: 835) AT1 G01010 AT1G55670 AT2G26760 AT3G 19820 AT4G18480 AT5G24400 AT1G02065 AT1 G56200 AT2G26760 AT3G20070 AT4G18960 AT5G24400 AT1G02800 AT1G56200 AT2G27380 AT3G20070 AT4G19350 AT5G24400 AT1G03120 AT1G56200 AT2G27960 AT3G20070 AT4G19350 AT5G24470 AT1G03130 AT1G57770 AT2G27960 AT3G20440 AT4G19350 AT5G24470 AT1G04110 AT1G58290 AT2G27960 AT3G20440 AT4G 19560 AT5G24470 AT1G05190 AT1G58290 AT2G27970 AT3G20440 AT4G 19560 AT5G24470 AT1G05190 AT1G59940 AT2G28000 AT3G20780 AT4G 19560 AT5G24470 AT1G05190 AT1G59940 AT2G29090 AT3G21640 AT4G20050 AT5G26742 AT1G06570 AT1G60600 AT2G29090 AT3G22200 AT4G20060 AT5G26742 AT1G06820 AT1 G63260 AT2G29090 AT3G22780 AT4G20060 AT5G26742 AT1G07370 AT1G63970 AT2G30950 AT3G22880 AT4G20060 AT5G27720 AT1G07370 AT1 G63970 AT2G30950 AT3G24560 AT4G20910 AT5G27720 AT1G07370 AT1G63970 AT2G32250 AT3G24560 AT4G20910 AT5G27720 AT1G08090 AT1G65470 AT2G32250 AT3G24560 AT4G21270 AT5G35220 AT1G08520 AT1G66330 AT2G32590 AT3G24730 AT4G24150 AT5G35520 AT1G08520 AT1G66650 AT2G33480 AT3G25980 AT4G25080 AT5G35630 AT1G08840 AT1 G67440 AT2G33810 AT3G25980 AT4G25080 AT5G37630 AT1G08840 AT1G67440 AT2G33810 AT3G25980 AT4G25700 AT5G37630 AT1G08840 AT1 G67440 AT2G34420 AT3G27920 AT4G26500 AT5G37630 AT1G09000 . AT1G67740 AT2G34420 AT3G29290 AT4G26500 AT5G37630 AT1 G10470 AT1G68050 AT2G34430 AT3G29290 AT4G26500 AT5G37780 AT1 G 10470 AT1 G68050 AT2G34430 AT3G29290 AT4G27700 AT5G37780 AT1 G10510 AT1G68480 AT2G34650 AT3G33520 AT4G28190 AT5G37890 AT1 G10510 AT1G68900 AT2G34650 AT3G33520 AT4G28190 AT5G39820 AT1 G10510 AT1G68900 AT2G34650 AT3G44560 AT4G28210 AT5G40280 AT1 G11870 AT1G69040 AT2G37680 AT3G44880 AT4G28210 AT5G40600 AT1 G 12770 AT1G69040 AT2G37580 AT3G44880 AT4G28210 AT5G40600 AT1G 12770 AT1G69040 AT2G37860 AT3G47500 AT4G28660 AT5G40600 AT1 G12770 AT1G69440 AT2G37920 AT3G47500 AT4G28980 AT5G41 80 AT1 G13690 AT1G69440 AT2G37920 AT3G48110 AT4G29830 AT5G41480 AT1 G13870 AT1G70210 AT2G37920 AT3G48110 AT4G29830 AT5G41480 AT1 G14150 AT1 G70210 AT2G38280 AT3G48190 AT4G30950 AT5G42190 AT1 G15570 AT1G70210 AT2G38280 AT3G48470 AT4G30950 AT5G42190 AT1 G15570 AT1G71230 AT2G38280 AT3G48470 AT4G31500 AT5G42190 AT1 G 15570 AT1 G71230 AT2G39470 AT3G48470 AT4G31500 AT5G43080 AT1 G 15820 AT1 G71230 AT2G40760 AT3G50210 AT4G31500 AT5G43080 AT1 G 18450 AT1G71230 AT2G41720 AT3G50790 AT4G32810 AT5G43080 AT1 G19050 AT1G71230 AT2G41720 AT3G50790 AT4G33790 AT5G45930 AT1 G20610 AT1G71230 AT2G41720 AT3G50790 AT4G34620 AT5G45930 AT1G20610 AT1G71440 AT2G41980 AT3G51160 AT4G34620 AT5G47110 AT1 G20610 AT1G71440 AT2G43010 AT3G52430 AT4G34620 AT5G47110 AT1 G20930 AT1G71440 AT2G43010 AT3G53130 AT4G35900 AT5G48150 AT1 G20930 AT1G73590 AT2G43280 AT3G54420 AT4G35900 AT5G48150 AT1 G20930 AT1G73590 AT2G43280 AT3G54420 AT4G36920 AT5G48150 AT1G21970 AT1G73590 AT2G45330 AT3G54420 AT4G36920 AT5G48150 AT1 G21970 AT1G73590 AT2G45330 AT3G54720 AT4G36920 AT5G48150 AT1G21970 AT1G73590 AT2G45330 AT3G54720 AT4G37000 AT5G48630 AT1 G22770 AT1G74470 AT2G45480 AT3G54720 AT4G37230 AT5G48630 AT1 G22770 AT1G74470 AT2G46340 AT3G54720 AT4G37230 AT5G48630 AT1G22920 AT1G75350 AT2G46340 AT3G54720 AT4G37580 AT5G48820 AT1 G22920 AT1G75350 AT2G46340 AT3G54720 AT4G37580 AT5G48820 AT1G22920 AT1G75350 AT2G46340 AT3G55330 AT4G37580 AT5G48820 AT1 G22920 AT1G76570 AT2G46340 AT3G58780 AT4G37580 AT5G49030 AT1G22920 AT1G77080 AT2G46340 AT3G59400 AT4G37580 AT5G49555 AT1 G22920 AT1 G77080 AT2G46820 AT3G59400 AT4G37740 AT5G49880 AT1 G23080 AT1G77850 AT2G48120 AT3G60370 AT4G39100 AT5G49880 AT1 G23080 AT1G78630 AT2G48120 AT3G60830 AT4G39100 AT5G49880 AT1G23080 AT1G78630 AT3G02380 AT3G60830 AT4G39100 AT5G50280 AT1G24260 AT1G78630 AT3G02380 AT3G60830 AT4G39100 AT5G50280 AT1G24340 AT1 G80080 AT3G02660 AT3G61470 AT4G39100 AT5G50280 AT1G24340 AT1G80370 AT3G02660 AT3G61470 AT4G39620 AT5G52570 AT1G24340 AT1G80370 AT3G02660 AT3G61780 AT4G39620 AT5G53090 AT1G25580 AT1G80370 AT3G02780 AT3G61780 AT4G39620 AT5G53660 AT1G26310 AT2G01420 AT3G02780 AT3G61780 AT5G01530 AT5G57030 AT1G26310 AT2G04160 AT3G03450 AT4G00180 AT5G02250 AT5G57030 AT1G29410 AT2G04842 AT3G03450 AT4G01 10 AT5G02250 AT5G57030 AT1G30610 AT2G04842 AT3G04630 AT4G02560 AT5G02250 AT5G57050 AT1G30610 AT2G04842 AT3G06350 AT4G02560 AT5G04560 AT5G57050 AT1G30610 AT2G05620 AT3G06350 AT4G02770 AT5G04560 AT5G60540 AT1G32200 AT2G13680 AT3G06350 AT4G03270 AT5G04560 AT5G60540 AT1G32200 AT2G16500 AT3G06430 AT4G03270 AT5G06240 AT5G60540 AT1G32200 AT2G 16500 AT3G06430 AT4G03270 AT5G06240 AT5G61510 AT1G33060 AT2G 16500 AT3G06430 AT4G03280 AT5G06240 AT5G62430 AT1G33280 AT2G 17620 AT3G07390 AT4G04350 AT5G07280 AT5G62430 AT1G42970 AT2G17620 AT3G07430 AT4G04350 AT5G08170 AT5G63050 AT1G43710 AT2G17620 AT3G07430 AT4G04350 AT5G08170 AT5G63050 AT1G43710 AT2G 18020 AT3G07430 AT4G04900 AT5G08170 AT5G63050 AT1G43710 AT2G18020 AT3G07500 AT4G10180 AT5G10140 AT5G63790 AT1G44110 AT2G 18020 AT3G07500 AT4G10180 AT5G10140 AT5G64050 AT1G44110 AT2G20000 AT3G 10390 AT4G10180 AT5G 10330 AT5G64520 AT1 G44110 AT2G20000 AT3G 10390 AT4G10180 AT5G 10330 AT5G65060 AT1G44446 AT2G20000 AT3G 10670 AT4G10180 AT5G 10330 AT5G65060 AT1G44446 AT2G20000 AT3G 10670 AT4G10180 AT5G 10360 AT5G65070 AT1G45474 AT2G20000 AT3G10670 AT4G 10350 AT5G 10360 AT5G65070 AT1G45474 AT2G20000 AT3G 11670 AT4G 12550 AT5G 10360 AT5G65080 AT1G47530 AT2G21710 AT3G 11670 AT4G 12980 AT5G 10480 AT5G65080 AT1G47530 AT2G21710 AT3G 13960 AT4G 13560 AT5G10480 AT5G65930 AT1G48270 AT2G21710 AT3G14110 AT4G 13560 AT5G12990 AT5G66055 AT1G48270 AT2G22840 AT3G14110 AT4G 13560 AT5G16715 AT5G66055 AT1G48270 AT2G22870 AT3G15030 AT4G 15090 AT5G16715 AT5G66055 AT1G48270 AT2G22870 AT3G 15270 AT4G 15090 AT5G16715 AT5G66570 AT1G48380 AT2G22870 AT3G 15270 AT4G 15510 AT5G17710 AT5G66570 AT1G49510 AT2G23430 AT3G16290 AT4G 15560 AT5G17710 AT5G67030 AT1G49510 AT2G23430 AT3G 16290 AT4G 15560 AT5G17710 AT5G67180 AT1 G49510 AT2G23430 AT3G 16290 AT4G16110 AT5G 18700 AT5G67260 AT1 G50250 AT2G23430 AT3G18110 AT4G 16250 AT5G 18700 AT5G67260 AT1G50250 AT2G25660 AT3G18110 AT4G 16250 AT5G18700 AT5G67260 AT1G51190 AT2G25660 AT3G18110 AT4G16280 AT5G22290 AT5G67570 AT1G52230 AT2G25660 AT3G18390 AT4G 16280 AT5G22370 AT5G67570 AT1 G52890 AT2G25840 AT3G18390 AT4G 16750 AT5G22370 AT5G67570 AT1G53230 AT2G26760 AT3G 18390 AT4G 18480 AT5G22370 Los genes en la Tabla 11 participan en la fotosíntesis (Gene Ontology (GO) ID N° 15979), regulación de la fotosíntesis, reacción a la luz (GO ID N" 42548), biosíntesis de la clorofila (GO ID N° 15995), metabolismo de la clorofila (GO ID N° 15994), biosíntesis de los carotenoides (GO ID N° 16117), respuesta a la luz roja o luz roja lejana (GO ID N° 9639), fotosíntesis, cosecha a la luz (GO ID N° 9765), fotomorfogénesis (GO ID N° 9640), regulación del desarrollo (GO ID N° 50793), desarrollo de las semillas (GO ID N° 48316), desarrollo (GO ID N° 7275), ciclo celular (GO ID N° 7049), regulación del ciclo celular (GO ID N° 51726).

Tabla 12: Genes regulados en forma ascendente en hub1-1 vs. Ler (SEQ ID NO: 836 a SEQ ID NO: 961) AT1 G09570 AT1G70140 AT2G25930 AT3G46550 AT4G32880 AT5G20520 AT1G12840 AT1G70140 AT2G25930 AT3G54010 AT4G32880 AT5G20730 AT1 G 12840 AT1G70710 AT2G26710 AT3G54010 AT4G34490 AT5G25810 AT1G13180 AT1G70710 AT2G26890 AT3G54220 AT4G34490 AT5G25810 AT1G13180 AT1 G70940 AT2G34710 AT3G54920 AT4G36380 AT5G26751 AT1 G13980 . AT1G72560 AT2G34710 AT3G54920 AT4G36380 AT5G39510 AT1 G13980 AT1G75080 AT2G34710 AT3G61460 AT4G39400 AT5G49720 AT1G13980 AT1G75750 AT2G38120 AT4G02980 AT4G39400 AT5G49720 AT1G 17060 AT1G75750 AT2G46920 AT4G02980 AT4G39400 AT5G52240 AT1G17060 AT1G75750 . AT3G05840 AT4G 12420 AT4G40060 AT5G52240 AT1G19350 AT1G75780 AT3G13870 AT4G 12420 AT4G40060 AT5G53950 AT1 G19850 AT1G75780 AT3G13870 AT4G 18710 AT5G 16490 AT5G53950 AT1G36Í60 AT1 G76420 AT3G15170 AT4G 18710 AT5G 16490 AT5G62310 AT1 G49040 AT2G06850 AT3G15170 AT4G 18710 ATSG18580 AT5G62310 AT1G49040 AT2G06850 AT3G15170 AT4G23640 AT5G 18580 AT5G64630 AT1G56010 AT2G18790 AT3G 18730 AT4G23640 AT5G19280 AT5G66680 AT1 G56010 AT2G20370 AT3G23050 AT4G30610 AT5G20350 AT5G66680 AT1G62360 AT2G20370 AT3G46550 AT4G32880 AT5G20350 Los genes en la Tabla 12 participan en la regulación del tamaño celular (GO ID N° 8361 ), especificación del eje longitudinal (GO ID N° 9942), especificación del meristema apical del brote principal (GO ID N° 10072), morfogénesis celular (GO ID N° 7148), organización del meristema (GO ID N° 9933), gravitropismo (GO ID N° 9630), respuesta al estímulo de brasinosteroide (GO ID N° 9741 ).

Las Tablas 13 y 14 muestran una lista de genes que se expresaron en forma diferente en hub1 -1 en comparación con las plantas que sobreexpresan HUB1 (HUB1 OE): Tabla 13: Genes regulados en forma descendente en hub1-1 vs. HUB OE (SEQ ID NO: 962 a SEQ ID NO: 1023) Los genes en la Tabla 13 participan en el conjunto de cromatina (GO ID N° 31497), ritmo circadiano (GO ID N° 7623).

Tabla 14: Genes regulados en forma ascendente en hub1-1 vs. HUB OE (SEQ ID NO: 1024 a SEQ ID NO: 1045) Los genes en la Tabla 14 participan en la especificación del patrón (GO ID N° 7389), especificación del meristema apical del brote principal (GO ID N° 10072).

A partir de estos datos se puede concluir claramente que el reloj circadiano está bajo el control de HUB1.

Ejemplo 23: Interactoma de HUB1 Primer experimento: El rol de HUB1 en la monoubiquitinación de la histona H2B sugiere que HUB1 es un homólogo funcional de ligasa E3 Bre1 . Para identificar proteínas que interactúan con HUB1 se utilizó tecnología de purificación por afinidad de tándem (TAP), que permite la rápida purificación de complejos de proteínas en sus condiciones naturales y que se basa en la fusión de etiquetas TAP en la proteína de interés (Puíg et al., Methods. 24(3):218-29, 2001 ).

Debido a que las proteínas RING tienen su dominio funcionalmente importante en el terminal C, se prepara una fusión N-terminal en lugar de la tradicional fusión C-terminal mediante la clonación tanto de la forma de longitud total como de la forma de mutación puntual de HUB1 (HUBI pm, HUBIfl). Los cultivos de células de Arabidopsis se transformaron con los dos constructos y se cultivaron en una balanza de 10 litros, se cosecharon y se purificaron mediante TAP (Van Leene et al., Mol. Cell Proteomics 6, 1226-38, 2007). Los extractos de proteínas se separaron en geles 1-D SDS-PAGE y se aislaron a partir de gel para la identificación de proteínas mediante espectroscopia de masa (Laukens et al., Proteomics. 4, 720-7, 2004, Van Leene et al., 2007). Se usaron dos cortes lo que dio como resultado listas de candidatos interactuantes "confirmados" y "a confirmar" (Tabla I).

Tabla J: Todos los interactuantes HUB1 confirmados y una selección de interactuantes HUB1 a confirmar identificados mediante TAP.

Confirmados Confirmados Código A confirmar Código AGI AGI GCN5 At5q 11340 SEUSS At1g43850 En el conjunto de datos de interactuantes confirmados TAP se encontraban presentes HUB1 y HUB2, confirmando la formación de dímeros entre los homólogos. Adicionalmente, la acetiltransferasa GCN5, las proteínas de unión a ARN y una proteína de dominio KH se identificaron como proteínas que interactúan con HUB1 . La mayoría de estas proteínas se sabe que se localizan en el núcleo o nucléolo. Los constructos GFP de HUB1 también fueron localizados en el núcleo (Liu et al., 2007). Cuando se usó HUBI pm para la purificación TAP no se pudo identificar HUB2 como una proteína interactuante. Estos datos sugieren que se requiere un dominio RING funcional para la dimerización HUB1 y HUB2. En la tabla se enumeran como "a confirmar" una selección de las proteínas que interactuaron solo una vez en los experimentos de purificación TÁP.

GCN5 es una enzima de acetilación de histona involucrada en la defensa, respuesta al estrés, transducción de señal, transcripción, metabolismo, transporte y desarrollo de la flor en donde afecta dos genes clave tales como WUSCHEL (WUS) y AGAMOUS (AG). Se requiere NOP56 en la biogénesis del ribosoma en levadura. Myb es una proteína de unión a ADN con actividad de factor de transcripción involucrada en respuesta al estímulo por ácido abscísico, ácido jasmónico y ácido salicílico. Fibrillarin 2 es una metiltransferasa de ARN y un sustrato potencial de AtPRMTI a y AtPRMTI b, dos proteínas metiltransferasas involucradas entre mH4K3 entre otras modificaciones post-traducción. También se mostraron las interacciones directas con HUB1 para la proteína de unión a ácido nucleico tipo Spen o SEUSS. Se probaron una cantidad de interactuantes confirmados y a confirmar mediante un ensayo de dos híbridos de levadura para verificar si interactuaban directamente con HUB1. La interacción directa con HUB1 se mostró para proteínas tipo Spen, HUB2 y SEUSS.

Otros interactuantes confirmados pueden requerir proteínas intermediarias para la interacción con HUB1.

Segundo experimento: En lugar de usar la etiqueta TAP original, se fusionó en el N-terminal la etiqueta optimizada GS-TAP, desarrollada por Van Leene et al. (Trends in Plant Science 13, 517-520, 2008), a varias proteínas carnada (ver Tabla J). Se transformaron los constructos en células protoplásticas de Arabidopsis thaliana y se confirmó la expresión de las proteínas de fusión mediante análisis Western. Las proteínas etiquetadas se produjeron en cultivos de células en balanza de 5 litros, se extrajeron y los complejos de proteínas se purificaron utilizando el protocolo de Purificación por Afinidad de Tándem descrito por Van Leene et al. (2008). Se eluyeron los complejos ligados, se precipitaron y se los sometió a SDS-PAGE. Se extractaron bandas de proteínas teñidas con Coomassie, se digirieron por tripsina y se analizaron por espectroscopia de masa MALDI-TOF-TOF.

Para cada experimento se llevaron a cabo dos purificaciones independientes (a & b) a partir del mismo cultivo celular que ya se había hecho y, en el caso de HUB1 , se llevaron a cabo dos purificaciones diferentes a fin de tener un mayor apoyo para su red de interacciones. Los resultados de las diferentes purificaciones TAP se enumeran en la Tabla J. Estos datos indican la presencia de un complejo que comprende HUB1 , HUB2, SL y KH. Realmente todos los ensayos TAP llevados a cabo utilizando HUB1 , HUB2 y SL como carnadas permitieron identificar estas tres proteínas junto con KH. Asimismo, los resultados de HUB1 TAP se reforzaron mediante purificación con dos etiquetas TAP.

Tabla K: Lista de proteínas recuperadas por purificación TAP utilizando purificaciones con la etiqueta GS-TAP. (a) y (b) representan purificaciones independientes, el valor de expectancia se basa en la homología entre la secuencia de péptido y la proteína. 14 ubiquitinas tienen distintos números de acceso En ambos experimentos TAP que involucran HUB1 como carnada, su homólogo HUB2 ha sido recuperado así como una proteína que contiene un motivo con homología K (renombrado KH), una molécula no caracterizada con cinco dominios KH que se encuentran involucrados en la unión a ARN. Tipo- Spen (SL) es otra proteína no caracterizada que apareció en las dos repeticiones técnicas del experimento así como en los experimentos hechos con la etiqueta TAP original. Esta proteína también tiene un dominio de unión a ARN (RRM) además de un dominio SPOC en su C-terminal. Se obtuvieron resultados comparables utilizando HUB2 como carnada. La purificación recíproca de HUB1 y HUB2 sugiere la formación de una estructura de tetrámero para controlar la monoubiquitinación de la histona H2B. Se recuperó K3K7 en una repetición técnica de un experimento TAP con HUB1. Esta proteína contiene cinco repeticiones de pentatricopéptido (PPR) que funcionan en la estabilización del ARN desde que el mismo dominio se encuentra presente en el Procesamiento de ARN de Cloroplasto 1 (Crpf), una proteína involucrada en el procesamiento de ARN. TAP que utiliza SL como carnada mostró que tan firme es su asociación con HUB1 , HUB2 y KH. Al combinar los datos del experimento TAP para HUB1 , HUB2 y SL (y KH a continuación) como carnadas podemos concluir que el denominado complejo de centro de tetrámero de monoubiquitinación de la histona H2B compuesto por HUB1-HUB2 contiene al menos dos proteínas adicionales: SL y KH. Ambas proteínas tienen moléculas de unión a ARN. Este tipo de proteínas nunca fueron asociadas hasta el momento con la monoubiquitinación de la histona H2B, sin embargo, el hecho de que este proceso, como las otras marcas epigenéticas, se encuentre estrechamente asociado con ADN y con mARN generado nuevamente, propone que estas proteínas tienen roles esenciales en la monoubiquitinación de la histona H2B en donde la afinidad para el ARN puede conducir a incorporar en el complejo HUB1/HUB2 corriente arriba o información de retroalimentación (por ejemplo, de pequeñas moléculas de ARN). UBC2 permitió desarmar los otros componentes básicos del complejo de ubiquitinación como ubiquitina, representada por 14 números de acceso UBQ diferentes que no pueden distinguirse debido a la alta homología entre ellos, y dos enzimas de activación E1 AtUBAI y AtUBA2.

Tercer experimento: A fin de identificar interactuantes directos de HUB1 , se llevó a cabo un experimento de dos híbridos de levadura. Para cada una de las proteínas seleccionadas, se construyeron fusiones AD y BD cuya expresión se confirmo mediante Western blotting. Cepas KH, SEUSS, HUB2 y HUB1 trunco, mostraron actividad de autoactivación evidenciada por la tinción de azul de las colonias y por lo tanto no se utilizaron como presa en el experimento Y2H para evitar resultados de falsos positivos. Los resultados se resumen en la Tabla K: Tabla L: Matriz con interacciones de a pares. ++, Interacción fuerte; +, interacción leve; -, ninguna interacción; interacción entre las diferentes versiones HUB1 , HUB2 y SEUSS fueron evaluadas en dos experimentos independientes. pDEST22/pDEST32 HUB1 HUB2 no RING SL HUB1 ++ ++ ++ HUB1 no RING ++ ++ - HUB2 ++ ++ - HUB2 no RING - - SL ++ - ++ SEUSS + + - ! La versión de longitud total y la versión truncada de HUB1 y HUB2 de longitud total interactúan in vivo. EL dominio RING pareció influenciar la interacción del ! complejo interactoma HUB1 que fue más evidente en el caso de HUB2 donde la 5 eliminación de este dominio impidió la interacción entre HUB1 y HUB2. La interacción HUB1 más fuerte fue con SL.

Para evaluar la porción de SL que se une a HUB1 , se generaron dos versiones diferentes de la proteína. Los resultados mostraron que solo la parte de la región N- terminal y no la parte C-terminal interactúan como HUB1. SL también mostró actividad 10 de dimerización y ambas regiones de la proteína parecen estar involucradas. HUB1 y la versión trunca de HUB2 mostraron también una interacción leve con SEUSS. Asimismo SEUSS mostró una fuerte interacción con si mismo lo que refleja homodimerización. Se detectó una fuerte interacción entre SEUSS y LUG/RON2, como se informó en estudios previos, lo que intensifica la confiabilidad del ensayo. Ni 15 HUB1 ni HUB2 mostraron tener una interacción detectable con las enzimas que conjugan E2 involucradas en la monoubiquitinación de la histona H2B (UBC1 , UBC2, UBC3) que se encuentran presentes en el genoma de Arabidopsis thaliana, sin embargo es posible que el complejo HUB1/HUB2 dimérico o tetramérico sea esencial para la interacción con uno o más de los polipéptidos UBC. 20 Ejemplo 24: Caracterización fenotípica de plantas mutantes tipo Spen La proteína tipo Spen comprende un motivo de reconocimiento de ARN (RRM) en el medio de la secuencia y un dominio "spen parálogo y ortólogo C-terminal" (SPOC) en la región C-terminal; que es la típica composición de proteínas con 25 extremos separados (Spen).

Las semillas de Arabidopsis thaliana sl-1 (SALK_025388) y sl-2 (GABI_461 F01 ) se obtuvieron de Nottingham Arabidopsis Stock Centre y GABI-Kat respectivamente. Las semillas homocigotas se cultivaron en pellet Jiffy-7 (www.jiffypot.com), se vernalizaron durante toda la noche y subsiguientemente se cultivaron en cámaras en 30 condiciones de día largo como las descritas anteriormente. Al momento de la floración (con una longitud del tallo de la inflorescencia de aproximadamente 0,5 cm), se prepararon series de hojas alineando todas las hojas rosetas en placas de agar al 1 % 1 (n=10). Se fotografiaron y escanearon las hojas para medir el área de la hoja mediante ImageJ 1 ,41. La cantidad de hojas al momento de la floración también se calificaron en la población completa (n=25).

Se cultivaron veinticinco plantas de tipo silvestre (Col-0), hub1-4 (SALK_1225 2) (Fleury et al., 2007) y las dos líneas de T-ADN (sl-1 y sl-2) en suelo para el análisis fenotípico. El momento de floración se redujo de forma leve pero significativa en el caso de sl-2 y se alteró de manera significativa en hub1-4. Por otro lado, sl-1 muestra una reducción consistente de la cantidad de hojas al momento de la floración mientras que el tiempo de este cambio en el desarrollo era comparable con el de Col-0 (Fig. 22A y B). Se cultivaron diez plantas de cada genotipo hasta que el tallo de floración fue de aproximadamente 0,5 mm de alto y luego se analizó para determinar el tamaño de la hoja; una medición que genera un claro indicio del tamaño de la roseta. Los resultados de este análisis mostraron que el área de la mayoría de las hojas (cotiledones incluidos) de plantas sl-1 era significativamente menor que en las de tipo silvestre. Por el contrario, esta reducción, fue más leve en el mutante sl-2 y solo unas pocas hojas fueron significativamente más pequeñas (Fig. 22C). Las quince plantas restantes se cultivaron adicionalmente a fin de analizar las estructuras reproductivas. Se midió el diámetro del tallo de la flor de cada genotipo y se observó una reducción significativa tanto en sl-1 y sl-2 como para hub1-4. Sin embargo, al nivel de los órganos de las flores no se observaron diferencias obvias entre los alelos si y el tipo silvestre. Estas indicaciones sugieren que, a diferencia de FPA (que comprende múltiples dominios RRM, a diferencia de SL), es probable que SL no participe en el desarrollo de la flor como se pudo observar por la ausencia de fenotipos de tiempo de floración y alteración de las estructuras de las flores (Fig. 22). SL no muestra ningún fenotipo de floración, pero las alteraciones mostradas por sus mutantes se restringen al crecimiento. Esto es evidente en la figura 22B donde, a pesar de que el tiempo de floración se encuentra en línea con el de WT, sl-1 produce 1 ,3 hojas menos que Col-0. Asimismo, los rasgos claramente relacionados con el área de la hoja tipo crecimiento y diámetro de tallo de floración se reducen significativamente. Las estructuras de las flores de sl-1 y sl-2 no muestran alteraciones y la producción de silicuas y por lo tanto semillas tampoco se ve alterado en ninguna de las líneas T-ADN. Se ha demostrado en los ejemplos anteriores que SL interactúa directamente con HUB1 , una ligasa E3 involucrada en la monoubiquitinación de la histona H2B que también tiene una función en el crecimiento de la planta (Fleury et al., 2007). De acuerdo con estos datos, por lo tanto proponemos SL como regulador del crecimiento de la planta por su influencia en esta marca epigenética.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para mejorar las características de crecimiento en plantas con respecto a plantas de control, caracterizado porque comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 ligado operativamente a un promotor constitutivo de mediana intensidad, en donde dicho polipéptido HUB1 comprende un dominio RING.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho dominio RING es de un tipo C3HC4

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicha expresión modulada se lleva a cabo mediante la introducción y expresión en una planta un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido HUB1.

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porqué dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 codifica cualquiera de las proteínas enumeradas en la Tabla A o es una porción de dicho ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridarse con dicho ácido nucleico.

5 Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha secuencia de ácidos nucleicos codfica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las proteínas indicadas en la Tabla A.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dichas características mejoradas de crecimiento comprenden una o más de mayor vigor de germinación, mayor vigor temprano y mayor rendimiento, con preferencia mayor biomasa y/o mayor rendimiento de las semillas con respecto a plantas de control.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichas características mejoradas de crecimiento se obtienen en condiciones sin estrés.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichas características mejoradas de crecimiento se obtienen en condiciones de estrés por sequía, estrés por sal o deficiencia de nitrógeno.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, caracterizado porque dicho promotor constitutivo de mediana intensidad es un promotor HMGP, con mayor preferencia un promotor HMGP del arroz.

10. Método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 es de origen vegetal, con preferencia de una planta dicotiledónea, con más preferencia de la familia Brassicaceae, con mayor preferencia del género Arabidopsis, con máxima preferencia de Arabidopsis thaliana.

11. Planta o parte de ésta, incluso semillas, que se pueden obtener por un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque en donde dicha planta o parte de ésta comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido HUB1.

12. Un polipéptido aislado caracterizado porque se selecciona de entre: (i) una secuencia de polipéptidos que codifica una proteína HUB1 tal como se define en la reivindicación 1 o 2, que comprende en su dominio RING una o mas mutaciones que impiden sustancialmente la unión de cofactores en los sitios de unión a Zn y en donde dichas una o mas mutaciones reducen autopoliubiquitinación sin afectar la ubiquitinación del sustrato; (ii) una secuencia de polipéptidos HUB1 representada por SEQ ID NO: 28; (iii) una secuencia de polipéptidos con, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 28, y que comprende un dominio RING, cuyo dominio RING comprende una o mas mutaciones como se definió en (i); (iv) fragmentos funcionales de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dados en (i), (ii), o (¡ii) antes, siempre que el fragmento funcional comprenda un dominio RING, cuyo dominio RING comprenda una o mas mutaciones como se definió en (i).

13. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque se selecciona de: (i) un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido HUB1 como se definió en (i) a (iv) en la reivindicación 12; (ii) un ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones rigurosas con el complemento del ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido HUB1 como se definió en (i) a (iv) de la reivindicación 12; (iii) un ácido nucleico aislado representado por SEQ ID NO: 49.

14. Constructo caracterizado porque comprende: (i) ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 tal como se define en la reivindicación 1 , 2 o 12, o un ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 13; (ii) una o mas secuencias de control de intensidad media capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a); y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de la transcripción.

15. Constructo de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque una de dichas secuencias de control de intensidad media es un promotor constitutivo, con preferencia un promotor HMGP, con máxima preferencia un promotor HMGP del arroz. 5

16. Uso of un constructo de acuerdo con la reivindicación 14 o 15 en un método para preparar plantas con uno o mas de mayor vigor de germinación, mayor vigor temprano, y mayor rendimiento, con respecto a plantas de control.

17. Planta, parte de planta o célula vegetal caracterizada porque están transformada con un constructo de acuerdo con la reivindicación 14 o 15. 10

18. Método para la producción de una planta transgénica con propiedades de crecimiento aumentadas y mejoradas, particularmente mayor vigor de germinación, mayor vigor temprano, y/o mayor rendimiento con respecto a plantas de control, caracterizado porque comprende: (i) introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un 15 polipéptido HUB1 tal como se define en la reivindicación 1 o 2; y (ii) cultivar la célula vegetal en condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta.

19. Planta transgénica con propiedades mejoradas de crecimiento, particularmente mayor vigor de germinación, mayor vigor temprano, y/o mayor rendimiento con 20 respecto a plantas de control, resultando de la expresión modulada de un ácido nucleico caracterizado porque codifica un polipéptido HUB1 tal como se define en la reivindicación 1 o 2, o una célula vegetal transgénica derivada de dicha planta transgénica.

20. Planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 11 , 17 o 19, o su célula 25 vegetal transgénica, caracterizado porque dicha planta es una planta de cultivo o una monocotiledónea o un cereal, como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo escandía, espelta, sécale, einkorn, teff, milo y avena.

21. Partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado porque dichas partes cosechables son con preferencia biomasa de 30 brote y/o semillas.

22. Productos caracterizado porque son derivados de una planta de acuerdo con la reivindicación 20 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 21.

23. Uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 para mejoras las 35 propiedades de crecimiento, particularmente en aumentar vigor de germinación, i aumentar vigor temprano, y/o aumentar el rendimiento con respecto a plantas de control.

24. Método para modificar un fenotipo regulado por la luz en una planta, caracterizado porque comprende expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1.

25. Método de la reivindicación 24, caracterizado porque dicho fenotipo regulado por la luz es uno o más de: (a) reloj circadiano modificado; (b) respuesta de salida modificada del reloj circadiano.

26. Método de la reivindicación 25, caracterizado porque dicha respuesta de salida modificada del reloj circadiano es uno o mas de : (a) capacidad fotosintética modificada; (b) expresión alterada de los genes del desarrollo; (c) desarrollo alterado de la planta.

27. Método de acuerdo a la reivindicación 26, caracterizado porque dicha capacidad fotosintética modificada comprende concentraciones modificadas de pigmentos fotosintéticos y/o estructura modificada de los plástidos.

28. Método de la reivindicación 26, caracterizado porque dichos genes de desarrollo son uno o mas de las secuencias en la lista de la Tabla H o su ortólogo.

29. Método de la reivindicación 26, caracterizado porque dicho desarrollo alterado de la planta comprende arquitectura alterada y/o momento de floración alterada.

30. Método de la reivindicación 29, caracterizado porque dicha arquitectura alterada comprende uno o más de: longitud modificada del hipocotilo, morfología modificada de la hoja y morfología modificada de la flor.

31. Método de acuerdo con la reivindicación 25. caracterizado porque dicho reloj circadiano modificado comprende la expresión modificada de un ácido nucleico que codifica una proteína en la lista de la Tabla G o que codifica un ortólogo de dicha proteína.

32. Método de la reivindicación 31 , caracterizado porque dichos genes están regulados diurnamente.

33. Método para sincronizar la transcripción de genes, caracterizado porque comprende modular la expresión de HUB1.

34. Método de la reivindicación 33, caracterizado porque dichos genes comprenden genes involucrados en la fotosíntesis, el reloj circadiano y/o desarrollo.

35. Uso de HUB1 como un regulador de la transcripción para sincronizar la transcripción de genes

36. Uso de la reivindicación 35, caracterizado porque dichos genes comprenden genes involucrados en la fotosíntesis, el reloj circadiano y/o desarrollo.

37. Método para modificar características de crecimiento en plantas con respecto a plantas de control, caracterizado porque comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una proteína seleccionada de cualquier de las Tablas G a K, o que codifica un ortólogo de dicha proteína, en donde dichas características de crecimiento en plantas comprende mayor rendimiento y/o resistencia aumentada al estrés.

38. Método de la reivindicación 37, caracterizado porque dicha expresión es expresión aumentada.

39. Método de la reivindicación 37, caracterizado porque dicha expresión es expresión disminuida.

40. Método de la reivindicación 37, caracterizado porque dichas características modificadas de crecimiento comprende mayor rendimiento, mayor resistencia al estrés y/o arquitectura modificada.

41. Método de la reivindicación 40, caracterizado porque dicho mayor rendimiento comprende mayor biomasa y/o mayor rendimiento de las semillas.

42. Método de la reivindicación 40, caracterizado porque dicha mayor resistencia al estrés es una o mas de mayor resistencia al estrés por sequía, mayor resistencia al estrés por salinidad, mejor crecimiento en condiciones de deficiencia de nutrientes. RESUMEN DE LA INVENCION Un método para mejorar varias características de crecimiento importantes económicamente en las plantas. Más específicamente, a un método para modificar las características de crecimiento en plantas mediante la modulación de la expresión eri una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HUB1 (Monoubiquitinación de la Histona 1 ) o que codifica otra proteína útil en dichos métodos. Las características modificadas de crecimiento comprenden una modificación de fenotipos regulados por la luz, tales como reloj circadiano modificado y/o respuestas del reloj circadiano, o arquitectura modificada de la planta.