DE60121923T2 - Verfahren zur erfassung von analyten, die aus oberflächengebundenen liganden eluiert werden - Google Patents
Verfahren zur erfassung von analyten, die aus oberflächengebundenen liganden eluiert werden Download PDFInfo
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Description
- TECHNISCHES GEBIET
- Diese Erfindung betrifft allgemein Verfahren zum Abfangen von Analyten, welche mit oberflächengebundenen Liganden assoziiert sind, und insbesondere die Verwendung eines festen Abfangmaterials zum Abfangen von Analyten, welche von oberflächengebundenen Liganden eluiert werden.
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Eine Vielzahl analytischer Verfahren wird zur Charakterisierung von Wechselwirkungen zwischen Molekülen verwendet, insbesondere im Rahmen von Nachweisverfahren, welche auf die Detektion biomolekularer Wechselwirkungen gerichtet sind. So sind beispielsweise Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen in vielen Bereichen, umfassend Biologie, Immunologie und Pharmakologie, von grundlegender Bedeutung. In diesem Zusammenhang umfassen viele analytische Verfahren das Anbinden eines „Liganden" (wie beispielsweise eines Antikörpers) an einen festen Träger, gefolgt von einem Inkontaktbringen des Liganden mit einem „Analyten" (wie beispielsweise einem Antigen). Im Anschluss an das Inkontaktbringen von Ligand und Analyt wird eine beliebige, die Wechselwirkung anzeigende Eigenschaft gemessen, wie beispielsweise die Fähigkeit des Liganden, an den Analyten zu binden. Nach Messung der Wechselwirkung wird das Liganden-Analyten-Paar typischerweise mit einer Elutions- und/oder Regenerationslösung gespalten, um den oberflächengebundenen Liganden für weitere analytische Messungen zu regenerieren.
- Der aus dem Liganden-Analyten-Paar freigesetzte Analyt wird jedoch üblicherweise nicht erneut verwendet; vielmehr wird der freigesetzte Analyt zusammen mit der Elutions- und/oder Regenerationslösung entsorgt. Diese Praxis ist unerwünscht, da Wissenschaftler sehr häufig lediglich über beschränkte Mengen des Analyten für analytische Messzwecke verfügen, und da Wissenschaftler sehr häufig die Durchführung weiterer analytischer Messungen, welche auf den Analyten selbst gerichtet sind, wünschen. Demzufolge besteht im Fachgebiet ein Bedürfnis, einen aus einem Liganden-Analyten-Paar freigesetzten Analyten in effektiver Weise anzusammeln, so dass der freigesetzte Analyt für nachfolgende analytische Messungen zugänglich ist.
- Das Bedürfnis, einen freigesetzten Analyten für nachfolgende analytische Messungen in effektiver Weise anzusammeln, kann im Rahmen von Biosensoren veranschaulicht werden, welche sich der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) bedienen, um die Wechselwirkungen zwischen einem Analyten und einem an einen festen Träger gebundenen Liganden zu überwachen. Eine stellvertretende Klasse biosensorischer Apparaturen wird in diesem Zusammenhang von Biacore AB (Uppsala, Schweden) unter dem Handelsnamen BIAcore® (hier nachstehend als „das BIAcore-Messgerät" bezeichnet) vertrieben. Das BIAcore-Messgerät umfasst eine lichtemittierende Diode, einen mit einem dünnen Goldfilm bedeckten Sensorchip, eine integrierte mikrofluidische Kartusche, und einen Photodetektor. Einfallendes Licht aus der Diode wird in dem Goldfilm reflektiert und vom Photodetektor detektiert. Bei einem bestimmten Einfallswinkel („dem SPR-Winkel") baut sich in der Goldschicht eine Oberflächenplasmonenresonanzwelle auf, welche im reflektierten Licht als Intensitätsverlust oder „Dip" detektiert wird. Die theoretischen Grundlagen des BIAcore-Messgeräts wurden in der Literatur vollständig beschrieben (siehe z. B. Jönsson, U. of al., Biotechniques 11: 620–627 (1991)).
- Neben der SPR-Analyse unter Verwendung des BIAcore-Messgeräts nehmen Wissenschaftler nunmehr auch die synergistischen Effekte einer Kopplung der SPR-Technologie mit anderen analytischen Techniken wahr. In diesem Zusammenhang ergänzt die mittels des BIAcore-Messgeräts ermöglichte Echtzeit-Wechselwirkungsanalyse andere bekannte Verfahren zur Untersuchung sowohl biomolekularer Strukturen als auch biomolekularer Funktionen. So wurde SPR vor kurzem beispielsweise mit der Massenspektroskopie (d. h. SPR-MS) gekoppelt, womit eine außerordentlich leistungsfähige, mikropräparative Technik für biomolekulare Untersuchungen bereitgestellt wird (siehe z. B. PCT Internationale Veröffentlichungs-Nr. WO 97/09608). In Verbindung mit SPR-MS wird ein Analyt durch matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI) von dem oberflächengebundenen Liganden für eine nachfolgende analytische Messung mittels Massenspektrometrie freigesetzt.
- So offenbaren beispielsweise US-A-5,955,729 und R. W. Nelson und J. R. Krone, J. Mol. Recognit. 1999; 12: 77–93 eine Echtzeitanalyse der Wechselwirkung zwischen einem Liganden, welcher auf der Oberfläche eines SPR-Sensorchips immobilisiert ist, und einem durch ein Lösungsmittel übertragenen Analyten, woraufhin der Sensorchip von dem SPR-Sensor abgetrennt und durch Aufbringen einer geeigneten Matrixlösung auf die Oberfäche des Chips zum Aufnehmen des abgefangenen Liganden für die MALDI-Massenspektrometrie vorbereitet wird. Nach Trocknung des Lösungsmittels wird der Sensorchip in ein entsprechend konfiguriertes Massenspektrometer eingebracht, um die Identität des Liganden zu bestimmen oder zu bestätigen.
- Eines der Probleme, welches sich aus dem Eluieren des Analyten hinweg von den oberflächengebundenen Liganden für nachfolgende analytische Messungen ergibt, ist jenes, dass beträchtliche Mengen des Analyten infolge unspezifischer Bindung des Analyten an die Wände und andere Komponenten der mikrofluidischen Kartusche verloren gehen können, während die Elutions- und/oder Regenerationslösung durch die mikrofluidische Kartusche strömt. Darüber hinaus muss der Analyt, sobald er von den oberflächengebundenen Liganden hinwegeluiert ist, nach wie vor angesammelt werden, so dass eine ausreichende Menge an Probe für nachfolgende Analysen vorhanden ist. Demzufolge besteht im Fachgebiet ein Bedürfnis hinsichtlich verbesserter Verfahren und mikropräparativer Techniken für ein Ansammeln von Biomolekülen, welche mit oberflächengebundenen Liganden assoziiert sind. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse und stellt weitere, damit in Beziehung stehende Vorteile bereit.
- ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
- In Kürze dargestellt ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Abfangen eines Analyten, welcher mit einem oberflächengebundenen Liganden assoziiert ist, und Ansammeln desselben gerichtet. Das Verfahren umfasst ein Eluieren des Analyten von dem oberflächengebundenen Liganden, indem der oberflächengebundene Ligand mit einem ersten, eine Dissoziation des Analyten von dem oberflächengebundenen Liganden bewirkenden Flüssigkeitsfluss in Kontakt gebracht wird, um innerhalb des ersten Flüssigkeitsflusses einen freien Analyten zu erzeugen. Der freie Analyt wird anschließend mittels eines festen, innerhalb des ersten Flüssigkeitsflusses mitgeführten Abfangmaterials abgefangen, wodurch ein den abgefangenen Analyten enthaltender erster Flüssigkeitsfluss erhalten wird. Die Oberfläche, an welche der oberflächengebundene Ligand gebunden ist, kann entweder eine sensitive Oberfläche, wie beispielsweise eine sensitive Oberfläche eines Biosensors, oder eine nicht-sensitive Oberfläche sein.
- Der abgefangene Analyt wird anschließend, wahlweise mit auf ähnliche Weise abgefangenen Analyten, an einem Ort angesammelt, welcher eine räumliche Entfernung von dem oberflächengebundenen Liganden aufweist. Eine derartige Ansammlung kann beispielsweise dadurch bewirkt werden, dass die abgefangenen Analyten der ersten Flüssigkeit durch eine Trennvorrichtung hindurchgeführt werden, welche ein Hindurchtreten der abgefangenen Analyten verhindert, jedoch ein Hindurchtreten der ersten Flüssigkeit gestattet. Sobald sie angesammelt sind, können die abgefangenen Analyten mit einer zweiten Flüssigkeit in Kontakt gebracht werden, welche den Analyten des abgefangenen Analyten von dem festen Abfangmaterial eluiert, wodurch freier Analyt erhalten wird, welcher anschließend in nachfolgenden analytischen Techniken oder Verfahren verwendet werden kann.
- Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die nachfolgende ausführliche Beschreibung offenkundig. Zu diesem Zweck werden durch die gesamte Anmeldung hindurch verschiedene Literaturstellen zitiert, um bestimmte Aspekte dieser Erfindung weiter zu veranschaulichen.
- AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Wie oben erwähnt, ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Abfangen eines Analyten, welcher mit einem oberflächengebundenen Liganden assoziiert ist, mit einem festen, innerhalb eines ersten Flüssigkeitsflusses mitgeführten Abfangmaterial gerichtet, wobei die Oberfläche, an welche der oberflächengebundene Ligand gebunden ist, eine sensitive oder eine nicht-sensitive Oberfläche ist.
- Es ist ein Verfahren zum Abfangen eines Analyten, welcher mit einem oberflächengebundenen Liganden assoziiert ist, durch Eluieren des Analyten von dem oberflächengebundenen Liganden offenbart, indem der oberflächengebundene Ligand mit einem ersten, eine Dissoziation des Analyten bewirkenden Flüssigkeitsfluss in Kontakt gebracht wird, um innerhalb des ersten Flüssigkeitsflusses einen freien Analyten zu erzeugen. So weist beispielsweise eine Oberfläche, welche zum Abfangen eines solubilisierten Biomoleküls verwendet wurde (z. B. „Echtzeit"-Überwachung biomolekularer Wechselwirkungen zwischen Analyt und Ligand mit einem Biosensor), einen mit ihrem oberflächengebundenen Liganden assoziierten Analyten auf. Der Analyt ist typischerweise durch nicht-kovalente Kräfte (wie beispielsweise elektrostatische Kräfte und Lewis-Säure-Lewis-Base-Kräfte) mit dem Liganden assoziiert (z. B. gebunden). Im Rahmen dieser Erfindung wird das an die Oberfläche gebundene Mittel als „oberflächengebundener Ligand" bezeichnet, während das mit dem oberflächengebundenen Liganden assoziierte Mittel als „Analyt" bezeichnet wird.
- Zu diesem Zweck sind die Begriffe "Ligand" und "Analyt" breit auszulegen, wobei sie eine breite Vielfalt an Molekülen, welche von kleinen Molekülen bis hin zu großen Proteinen reichen, sowie eine Vielzahl von Wechselwirkungspaaren umfassen. Stellvertretende Analyt/Ligand-Wechselwirkungspaare umfassen beispielsweise, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Nachfolgenden (wobei zunächst der Analyt angeführt ist, gefolgt vom korrespondierenden Analyten in Klammern): Antigen (Antigen-spezifischer Antikörper), Antigen-spezifischer Antikörper (Antigen), Hormon (Hormonrezeptor), Hormonrezeptor (Hormon), Polynukleotid (komplementäres Polynukleotid), Avidin/Streptavidin (Biotin), Biotin (Avidin/Streptavidin), Enzym (Enzymsubstrat oder -inhibitor), Enzymsubstrat oder -inhibitor (Enzym), Lektine (spezifisches Carboxyhydrat), spezifisches Carboxyhydrat (Lektine), Lipide (lipidbindende Proteine oder membranassoziierte Proteine), lipidbindende Proteine oder membranassoziierte Proteine (Lipide), Polynukleotide (polynukleotidbindende Proteine), polynukleotidbindende Proteine (Polynukleotide), Rezeptor (Transmitter), Transmitter (Rezeptor), Arzneimittel (Zielstruktur), Zielstruktur (Arzneimittel), sowie allgemeinere Arten von Wechselwirkungen, wie beispielsweise Protein (Protein)-, Protein (Polynukleotid)-, Polynukleotid (Protein)-, DNA (DNA)-, DNA (RNA)- und RNA (DNA)-Wechselwirkungen. Darüber hinaus versteht es sich, dass der Analyt einer einzigen Quelle, einem Gemisch natürlicher Verbindungen, einer Genbibliothek, einer mRNA- oder Protein-darstellenden Genbibliothek, oder einer chemischen Bibliothek beliebiger Art entstammen kann.
- Gemäß der praktischen Anwendung dieser Erfindung wird folglich der Analyt von dem oberflächengebundenen Liganden durch Inkontaktbringen desselben mit einem ersten, eine Dissoziation des Analyten von dem oberflächengebundenen Liganden bewirkenden Flüssigkeitsfluss eluiert. Eine derartige Elution oder Dissoziation des Analyten von dem oberflächengebundenen Liganden kann unter Verwendung einer beliebigen Anzahl von geeigneten Elutionsflüssigkeiten oder Regenerationslösungen (hier als „erste Flüssigkeit" und als „zweite Flüssigkeit" bezeichnet) bewirkt werden. So können beispielsweise wässrige Lösungen als erste und zweite Flüssigkeit verwendet werden, welche mindestens ein saures, basisches, ionisches, organisches, oberflächenaktives oder chelatbildendes Mittel umfassen. Derartige wässrige Lösungen umfassen jene, welche im Zeitschriftenartikel mit dem Titel „Identification and Optimization of Regeneration Conditions for Affinity-Based Biosensor Assays" (Andersson, K. et al., Anal. Chem. 71 (13): 2475–81 (01. Juli 1999)) beschrieben sind.
- Im Allgemeinen, und Berichten in der Literatur zufolge, können verschiedene Klassen von Analyt-Ligand-Systemen unter den nachfolgenden, beispielhaften Bedingungen gespalten werden: (1) Antikörper-Antigen-Wechselwirkungspaare – in variierenden Ausmaßen mit Salzsäure (HCl) unterschiedlicher Konzentrationen (Malmborg et al., Scandinavian Journal of Immunology 35: 643–50, 1992; Ward et al., Biochemistry International 26: 559–65, 1992), oder mit schwächeren Säuren, typischerweise mit Phosphorsäure oder Ameisensäure (Corr et al., Journal of Experimental Medicine 178: 1877-92, 1993; VanCott et al., Journal of Immunological Methods 183: 103–17, 1995), oder mit oberflächenaktiven oder chaotropen Lösungen (Tanchou et al., AIDS Research and Human Retroviruses 10: 983–93, 1994; End et al., Journal of Biological Chemistry 268: 10066–75, 1993); (2) Rezeptor-Transmitter-Wechselwirkungspaare – mit Säuren (Morelock et al., Journal of Medicinal Chemistry 38: 1309–18, 1995), Basen (Lemmon et al., Journal of Biological Chemistry 269: 31653–58, 1994), unter chaotropen Bedingungen und einer hohen Ionenstärke (Stitt et al., Cell 80: 661–70, 1995), oder unter natürlichen Dissoziationsbedingungen (Ma et al., Journal of Biological Chemistry 39: 24430–36, 1994); (3) DNA-Wechselwirkungspaare – unter sehr milden Regenerationsbedingungen unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, EDTA, oder unter natürlichen Dissoziationsbedingungen (Cheskis et al., Molecular Endocrinology 1996; Casasnovas et al., Journal of Biological Chemistry 270: 13216–24, 1995); und (4) Glykoprotein-Wechselwirkungspaare – unter sauren Bedingungen oder unter Verwendung von Zuckerlösungen (Okazaki et al., Journal of Molecular Recognition 8: 95–99, 1995). Die exakten Bedingungen für das Eluieren des Analyten von dem oberflächengebundenen Liganden hängen selbstverständlich vom untersuchten System ab. Derartige Bedingungen können jedoch auf einfache Weise von einem Fachmann bestimmt werden.
- Im Verfahren der vorliegenden Erfindung steht die erste Flüssigkeit in strömendem Kontakt mit dem oberflächengebundenen Liganden (hier als „erster Flüssigkeitsfluss" bezeichnet). Geeignete Vorrichtungen für das Inkontaktbringen des ersten Flüssigkeitsflusses mit dem oberflächengebundenen Analyten sind im Fachgebiet bekannt und werden allgemein als fluidische Zuführsysteme bezeichnet. Ein stellvertretendes fluidisches Zuführsystem stellt die im BIAcore-Messgerät, welches zuvor im Abschnitt zum Hintergrund der Erfindung behandelt wurde, verwendete integrierte mikrofluidische Kartusche dar, wobei diese die Fähigkeit besitzt, eine Flüssigkeit exakt und kontrolliert über eine Oberfläche strömen zu lassen. Solche Zuführsysteme sind im Fachgebiet bekannt, wie in U.S. Patent Nr. 5,313,264 und 5,443,890 beschrieben ist.
- Innerhalb des ersten Flüssigkeitsflusses wird ein festes Abfangmaterial mitgeführt, welches die Fähigkeit besitzt, den vom oberflächengebundenen Liganden eluierten freien Analyten abzufangen. Mit anderen Worten gesagt lässt man das feste Abfangmaterial zusammen mit der ersten Flüssigkeit durch den fluidischen Strömungskanal oder die fluidischen Strömungskanäle strömen, welcher/welche den ersten Flüssigkeitsfluss mit dem oberflächengebundenen Liganden in Kontakt bringt/bringen. Auf diese Weise fängt das feste Abfangmaterial den Analyten, typischerweise mittels Adsorption oder Absorption, in unmittelbarer Nähe des oberflächengebundenen Liganden, von welchem er eluiert wird, ab, wodurch sich die Menge an freiem Analyten, welcher infolge unspezifischer Bindung, wie beispielsweise einer Bindung des freien Analyten an die Wände oder andere Komponenten des Strömungskanals/der Strömungskanäle, verloren geht, verringert. Aufgrund der geringen Größe, welche typischerweise mit fluidischen Strömungskanälen verbunden ist, stellen typischerweise Trennkügelchen mit geringem Durchmesser (z. B. 2 bis 10 Mikrometer) ein beispielhaftes festes Abfangmaterial dar. Darüber hinaus wird das feste Abfangmaterial im Allgemeinen derart ausgewählt, dass es für das untersuchte Analyten-Liganden-System geeignet ist – d. h. das Material sollte von einer Art sein, welche den eluierten Analyten auf einfache Weise abfängt. In diesem Zusammenhang steht eine breite Vielfalt an festen Abfangmaterialien zur Verfügung, welche diese Parameter erfüllen.
- Wie oben erwähnt stellen Trennkügelchen, wie beispielsweise in der Flüssigsäulenadsorptionschromatographie verwendete chromatographische Kügelchen, insbesonders in der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) verwendete chromatographische Kügelchen, beispielhafte feste Trennmaterialien dar. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf chromatographische Kügelchen beschränkt. Vielmehr kann ein beliebiges festes Abfangmaterial, welches an die Abtrennung gelöster Stoffe aus einer Lösung auf Basis physikochemischer Eigenschaften angepasst ist, verwendet werden. Demzufolge umfassen die festen Abfangmaterialien der vorliegenden Erfindung alle chromatographischen Medien, sowie andere feste oder halbfeste Träger mit ähnlichen Eigenschaften (wie beispielsweise auf Polymeren basierende, partikuläre feste Träger). Aus diesem Grund ist der Begriff „festes Abfangmaterial" im Rahmen der vorliegenden Erfindung breit auszulegen, wobei er im Wesentlichen einen beliebigen festen oder halbfesten Träger umfasst, welcher aus einem synthetischen, halbsynthetischen und/oder natürlich vorkommenden organischen Polymer hergestellt ist, wobei ein derartiges Polymer die Fähigkeit besitzt/derartige Polymere die Fähigkeit besitzen, von oberflächengebundenen Liganden freigesetzte Analyten zu adsorbieren; es umfasst ferner verschiedene anorganische Materialien mit ähnlichen Eigenschaften. Bevorzugt weisen die festen Abfangmaterialien der vorliegenden Erfindung jedoch eine kugelförmige Gestalt auf, umfassen ein Kieselgelmaterial mit amorpher Struktur, und sind ein wenig porös. Das feste Abfangmaterial kann auch magnetische Eigenschaften besitzen, wie beispielsweise magnetische Kügelchen (insbesondere für eine nachfolgende Elution über eine Ionisation wie in MALDI von Nutzen). Wie sich dem Fachmann erschließt, können die festen Abfangmaterialien der vorliegenden Erfindung hinsichtlich einer spezifischen Adsorption des freigesetzten Analyten von Interesse darüber hinaus mit einer breiten Vielfalt an chemischen Funktionalitäten derivatisiert sein. Als Beispiel seien in diesem Zusammenhang Kügelchenmaterialien angeführt, welche aus Agarose, Dextran, Hydroxyapatit, Silica, Polyacrylamid, und hydrophilen Polymeren in vernetzter Form hergestellt werden, wobei die Kügelchenmaterialien porös, nicht-porös und/oder dicht sein können.
- Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt das feste Abfangmaterial folglich Trennkügelchen dar, welche innerhalb des ersten Flüssigkeitsflusses mitgeführt werden. In einer Ausführungsform wird eine Vielzahl von Trennkügelchen, welche innerhalb des ersten Flüssigkeitsflusses mitgeführt werden, durch eine oder mehrere Flusszellen eines Biosensors, wie beispielsweise die Flusszellen des BIAcore-Messgerätes, hindurchgepumpt. Bevorzugt wird die Fließgeschwindigkeit so eingestellt, dass der erste Flüssigkeitsfluss laminar ist. Wie sich dem Fachmann erschließt, führt eine laminare Fließgeschwindigkeit dazu, dass sich die innerhalb des strömenden Flüssigkeitsflusses mitgeführten Trennkügelchen tendenziell in der Mitte konzentrieren (d. h. die Kügelchen tendieren im Allgemeinen dazu, in der Mitte des Kanals zu strömen). Dieses Phänomen (auch als hydrodynamische Fokussierung bekannt) ist eine Folge von Scherkräften, welche von der Wand des Kanals auf die strömende Flüssigkeit ausgeübt werden. Die Scherkräfte erzeugen quer durch den Strömungskanal hindurch einen Gradienten bezüglich der Fließgeschwindigkeit; ein strömendes Kügelchen besitzt die Tendenz, in der Mitte zu strömen, um auf beiden Seiten gleichen oder symmetrischen Strömungskräften ausgesetzt zu sein.
- Im Verfahren dieser Erfindung kann die Oberfläche, an welche der oberflächengebundene Ligand gebunden ist, entweder eine sensitive Oberfläche oder eine nicht-sensitive Oberfläche sein. Folglich kann eine sensitive Oberfläche gemäß der vorliegenden Erfindung eine sensitive Oberfläche eines Biosensors sein; eine derartige sensitive Oberfläche umfasst einen festen metallischen Träger (z. B. Gold oder Silber), welcher mit einer dicht gepackten organischen Monoschicht beschichtet ist (wie in U.S. Patent Nr. 5,436,161 offenbart ist). Die sensitive Oberfläche kann ferner eine biokompatible poröse Matrix, wie beispielsweise ein Hydrogel (z. B. ein Polysaccharid, wie beispielsweise Dextran), welches an die als Beschichtung dienende organische Monoschicht gekoppelt ist, um in Verbindung mit einem Biosensor betreibbar zu sein, umfassen.
- Wie sich dem Fachmann erschließt, stellt ein Biosensor eine analytische Vorrichtung zum Analysieren sehr geringer Mengen einer Probenlösung, welche einen Analyten von Interesse enthält, dar, wobei der Analyt mittels einer Detektorvorrichtung analysiert wird, welche ein beliebiges einer Vielzahl von Detektionsverfahren anwenden kann. Derartige Verfahren umfassen typischerweise, sind jedoch nicht beschränkt auf, Massendetektionsverfahren, wie beispielsweise piezoelektrische, optische, thermooptische und mittels akustischen Oberflächenwellen (SAW)-Vorrichtungen durchgeführte Verfahren, sowie elektrochemische Verfahren, wie beispielsweise potentiometrische, konduktometrische, amperometrische und kapazitive Verfahren. Im Hinblick auf optische Detektionsverfahren umfassen stellvertretende Verfahren jene, welche die Oberflächenkonzentration von Massen winkel-, wellenlängen- oder phasenaufgelöst detektieren, wie beispielsweise reflexionsoptische Verfahren, umfassend sowohl interne als auch externe Reflexionsverfahren, beispielsweise Ellipsometrie und Evaneszentwellen-Spektroskopie (EWS), wobei letztere Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Spektroskopie, Brewsterwinkel-Refraktometrie, Grenzwinkel-Refraktometrie, frustrierte Totalreflexion (FTR), Evaneszentwellen-Ellipsometrie, interne Totalstreuungsreflexion (STIR), optische Wellenleitersensoren, auf Evaneszentwellen basierende Bildgebung, wie beispielsweise Grenzwinkel-aufgelöste Bildgebung, Brewsterwinkel-aufgelöste Bildgebung, SPR-Winkel-aufgelöste Bildgebung, und dergleichen umfasst. Ferner können auch photometrische Verfahren, welche beispielsweise auf Evaneszentfluoreszenz (TIRF) und Phosphoreszenz basieren, sowie Wellenleiter-Interferometer verwendet werden. Während bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung nachfolgend im Rahmen des BIAcore-Messgerätes (Biacore AB, Uppsala, Schweden) mit seiner auf SPR basierenden Technologie veranschaulicht sind, versteht es sich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf derartige Systeme beschränkt ist.
- Gemäß dem Verfahren dieser Erfindung werden die abgefangenen Analyten im Anschluss an das Abfangen des freien Analyten durch das feste Abfangmaterial, wodurch die erste Flüssigkeit erzeugt wird, welche den abgefangenen Analyten und in stärkerem Maße typischerweise eine Vielzahl von abgefangenen Analyten enthält, an einem Ort angesammelt, welcher von dem oberflächengebundenen Liganden eine räumliche Entfernung aufweist. Ein derartiges Ansammeln kann beispielsweise unter Verwendung einer Säule (wie beispielsweise eine in der mikropräparativen HPLC verwendete Säule) bewirkt werden, welche das feste Abfangmaterial (z. B. die Trennkügelchen) abfängt, jedoch ein Hindurchtreten der ersten Flüssigkeit gestattet. So kann beispielsweise in der Ausführungsform, in welcher die erste Flüssigkeit in strömendem Kontakt mit dem oberflächengebundenen Liganden steht, eine Säule operativ mit einem Austrittsportal verknüpft sein, um auf diese Weise nach Kontakt mit dem oberflächengebundenen Liganden die strömende erste Flüssigkeit zu erhalten. Die Säule kann auf eine Art und Weise durchsiebt sein, welche ein Abfangen der festen Trennkügelchen bewirkt, jedoch ein Hindurchtreten der ersten Flüssigkeit gestattet. Auf diese Weise sammeln sich die mit dem abgefangenen Analyten versehenen Trennkügelchen innerhalb der Säule an, während die erste Flüssigkeit abfließt.
- Der Schritt des Ansammelns ist jedoch nicht auf Säulen beschränkt; vielmehr kann jede Technik, welche zumindest teilweise eine Abtrennung des festen Abfangmaterials von der ersten Flüssigkeit bewirkt, bei Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Als Beispiel sei in diesem Zusammenhang jede beliebige andere Vorrichtung angeführt, welche zum Ansammeln des festen Abfangmaterials befähigt ist, wie beispielsweise Dekantiervorrichtungen, die ein Absetzen des festen Abfangmaterials gestatten, Zentrifugiervorrichtungen, die eine Abtrennung der ersten Flüssigkeit vom festen Abfangmaterial gestatten, Filtriervorrichtungen, die ein Hindurchtreten der festen Abfangmaterialien verhindern, jedoch das Hindurchtreten der ersten Flüssigkeit gestatten, sowie Vorrichtungen zum Anziehen magnetischer Kügelchen.
- Gemäß einem weiteren Aspekt kann der abgefangene Analyt im Anschluss an das Ansammeln innerhalb der Säule oder anderer der Ansammlung dienender Vorrichtungen mit einer zweiten Flüssigkeit in Kontakt gebracht werden, um auf diese Weise den gebundenen Analyten zu eluieren. Folglich lässt man in einer Ausführungsform eine zweite Flüssigkeit durch die Säule, welche die Vielzahl von abgefangenen Analyten enthält, hindurchtreten, um auf diese Weise den Analyten freizusetzen. Da sich das feste Abfangmaterial innerhalb der Säule ansammelt, liegt der freigesetzte Analyt in dem zweiten Eluenten typischerweise in einer solchen Konzentration vor, welche für weitere analytische Messungen, wie beispielsweise Massenspektroskopie, sowie für andere Anwendungen (z. B. andere analytische Techniken oder Verfahren) von Nutzen ist. Wie die Wahl der ersten Flüssigkeit hängt auch die Wahl der zweiten Flüssigkeit vom untersuchten System ab (d. h. sie ist von der Natur der Kopplungskräfte zwischen dem Analyten und dem festen Abfangmaterial abhängig). Wie im Rahmen der Spaltung von Analyten-Liganden-Paaren obenstehend ausgeführt wurde, können geeignete Elutionsbedingungen für verschiedene Kombinationen von Analyt und festem Abfangmaterial von einem Fachmann auf einfache Weise bestimmt werden.
- Gemäß noch einem weiteren Aspekt kann der abgefangene Analyt im Anschluss an das Ansammeln innerhalb der Säule oder anderer der Ansammlung dienender Vorrichtungen einer matrixunterstützten Laserdesorptions/Ionisations-Flugzeitmassenspektrometrie unterzogen werden. In dieser Ausführungsform kann das feste Abfangmaterial eine äußere Oberfläche aufweisen, welche eine geeignete Matrix umfasst (z. B. Nikotin- oder Sinapinsäure). Wie sich dem Fachmann erschließt, ist ein auf oder in einer derartigen Matrix gefangener Analyt durch Laserbestrahlung im Allgemeinen für eine intakte Desorption empfänglich.
- Die nachfolgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung, und nicht als Beschränkung, angeführt. BEISPIEL 1
Biosensor-Messgerät: BIACORE® 3000 (Biacore AB, Uppsala, Schweden) Sensorchip: CM 5 (Biacore AB, Uppsala, Schweden) Kopplungsreagenz: Amin-Kopplungskit (Biacore AB, Uppsala, Schweden) Abfangmolekül: HIV-Protease Q7K 981126 (bereitgestellt von Uppsala Universität; Dr. Helena Danielsson) Analyt: HIV-Inhibitor Saquvinavir (bereitgestellt von Medivir AB, Schweden) Abfangmedium: RP 2, poröses Umkehrphasenmedium mit 10 Mikrometer Durchmesser (Perseptive Biosystems, CA, U.S.A.) Elutionsflüssigkeit: 2%ige Ameisensäure (hergestellt aus 98–100%iger Ameisensäure; PA Riedel de Haen, Deutschland) Massenspektrometer: Bruker Biflex IIITM (Bruker Daltonics Inc., U.S.A.) - Das abfangende Molekül wird unter Verwendung des vom Messgerätehersteller bereitgestellten Standardprotokolls für Aminkopplungen auf dem Sensorchip immobilisiert, was bei aufeinander folgender Injektion in die Flusszellen 4, 3, 2 des BIACORE 3000 zu etwa 4000 RU pro Flusszelle bezüglich der Grundlinie führt. Anschließend wird Analyt injiziert, wobei die immobilisierte Menge an HIV-Protease in der Lage ist, 30–100 RU an HIV-Inhibitor – entsprechend 50–150 Femtomol Inhibitor pro Flusszelle – abzufangen.
- Der abgefangene Analyt wird unter Verwendung von 4 μl Aufschlämmung einer 2–4%igen Aufschlämmung chromatographischer Kügelchen in 2%iger Ameisensäure gewonnen, welche unter Verwendung des Befehls „MIKRORECOVER" in das BIACORE 3000 injiziert wird. Die Kügelchen werden gemäß Gobom et al., J. Mass. Spectrom. 34: 105–116, 1999, in einer Gelloader-Spitze äquilibriert, und vor der MIKRORECOVER anschließend in etwa 50 μl einer 2%igen Ameisensäure dispergiert. Gewonnene Kügelchen, welche den abgefangenen Analyten enthalten, werden anschließend manuell mit einer Eppendorf-Pipette auf den oberen Teil einer Gelloader-Spitze überführt, welche bereits äquilibriertes RPC-Gel gemäß Gobom et al., siehe oben, enthält. Anschließend wird ein Waschschritt, welcher das Eluieren mit 5% Acetonitril (ACN) in 0.1% Trifluoressigsäure (TFA) umfasst, ausgeführt, wobei der Analyt im Anschluss daran mit 45% ACN/0.1% TFA gesättigt mit α-Cyanozimtsäure gemäß Gobom et al., siehe oben, direkt auf eine MALDI-Prüfspitze eluiert wird. Die Anwesenheit des gewonnenen Analyten wird anschließend mittels MALDI-MS verifiziert, welches auf einem Bruker Biflex III-Massenspektrometer im Reflexionsmodus ausgeführt wird.
- BEISPIEL 2
- Es wird das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren verfolgt, mit Ausnahme dessen, dass als Abfangmaterial Micromer®-M C8, C18 Umkehrphase, magnetische Kügelchen mit 8 μm Durchmesser (Micromod Partikeltechnologie GmbH, Rostock, Deutschland) verwendet werden. Vor der Injektion in das BIACORE 3000 mittels des Befehls MIKRORECOVER werden die chromatographischen, magnetischen Kügelchen in 2%iger Ameisensäure durch Filtrieren unter Anwendung eines diskontinuierlichen Verfahrens äquilibriert. Anschließend wird eine 2–4%ige Aufschlämmung der äquilibrierten Kügelchen in 2%iger Ameisensäure hergestellt, und diese für eine Injektion in das BIACORE 3000 in ein Autosamplergefäß überführt.
Claims (22)
- Verfahren zum Abfangen eines Analyten, welcher mit einem oberflächengebundenen Liganden assoziiert ist, umfassend: Eluieren des Analyten von einem oberflächengebundenen Liganden durch Inkontaktbringen des oberflächengebundenen Liganden mit einem ersten, eine Dissoziation des Analyten von dem oberflächengebundenen Liganden bewirkenden Flüssigkeitsfluss, um einen freien Analyten innerhalb des ersten Flüssigkeitsflusses zu erzeugen; Abfangen des freien Analyten mit einem festen, innerhalb des ersten Flüssigkeitsflusses mitgeführten Abfangmaterial, um einen den abgefangenen Analyten enthaltenden ersten Flüssigkeitsfluss zu erzeugen; und Überführen des abgefangenen Analyten an einen Ort, welcher eine räumliche Entfernung von dem oberflächengebundenen Liganden aufweist, und Ansammeln des Analyten an diesem Ort.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Analyt, welcher mit dem oberflächengebundenen Liganden assoziiert ist, ein Analyt (Ligand)-Wechselwirkungspaar ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigen (Antikörper), Antikörper (Antigen), Hormon (Hormonrezeptor), Hormonrezeptor (Hormon), Polynukleotid (komplementäres Polynukleotid), Avidin/Streptavidin (Biotin), Biotin (Avidin/Streptavidin), Enzym (Enzymsubstrat), Enzym (Enzyminhibitor), Enzymsubstrat (Enzym), Enzyminhibitor (Enzym), Lektine (Carboxyhydrate), Carboxyhydrate (Lektine), Lipid (lipidbindendes Protein), Lipid (membranassoziiertes Protein), lipidbindendes Protein (Lipid), membranassoziiertes Protein (Lipid), Polynukleotid (polynukleotidbindendes Protein), polynukleotidbindendes Protein (Polynukleotid), Rezeptor (Transmitter), Transmitter (Rezeptor), Arzneimittel (Zielstruktur), Zielstruktur (Arzneimittel), Protein (Protein), Protein (Polynukleotid), Polynukleotid (Protein), DNA (DNA), DNA (RNA) und RNA (DNA) ist.
- Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Analyt (Ligand)-Wechselwirkungspaar ein Antigen (Antikörper)-Wechselwirkungspaar ist.
- Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Oberfläche, an welche der oberflächengebundene Ligand gebunden ist, eine sensitive Oberfläche ist.
- Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Oberfläche, an welche der oberflächengebundene Ligand gebunden ist, eine nicht-sensitive Oberfläche ist.
- Verfahren nach Anspruch 4, wobei die sensitive Oberfläche eine sensitive Oberfläche eines auf Affinität basierenden Biosensors ist.
- Verfahren nach Anspruch 6, wobei der auf Affinität basierende Biosensor ein Oberflächenplasmonenresonanz-Biosensor ist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der erste Flüssigkeitsfluss ein laminarer Fluss ist, wenn er mit dem oberflächengebundenen Liganden in Kontakt steht.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der erste Flüssigkeitsfluss eine wässrige Lösung ist, umfassend mindestens ein saures, basisches, ionisches, organisches, oberflächenaktives oder chelatbildendes Mittel.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das feste Abfangmaterial Trennkügelchen sind.
- Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Trennkügelchen aus Agarose, Dextran, Hydroxyapatit, Silica, Polyacrylamid oder hydrophilen Polymeren hergestellt sind.
- Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Trennkügelchen magnetische Eigenschaften besitzen.
- Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, wobei die Trennkügelchen chromatographische Medien umfassen, welche eine kugelförmige Gestalt mit Durchmessern im Bereich von 2 bis 10 Mikrometer besitzen.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Eluieren des Analyten von dem oberflächengebundenen Liganden und das Inkontaktbringen des oberflächengebundenen Liganden mit der ersten Flüssigkeit innerhalb eines Strömungskanals eines Biosensors erfolgt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei eine Vielzahl von Analyten mit einer Vielzahl von oberflächengebundenen Liganden assoziiert ist, wobei das Eluieren der Analyten von den oberflächengebundenen Liganden eine Vielzahl von freien Analyten erzeugt, und wobei das Abfangen des freien Analyten eine Vielzahl von abgefangenen Analyten erzeugt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Ansammeln des Analyten das Hindurchführen des innerhalb des ersten Flüssigkeitsflusses mitgeführten abgefangenen Analyten oder der innerhalb des ersten Flüssigkeitsflusses mitgeführten abgefangenen Analyten durch eine Trennvorrichtung umfasst, welche das Hindurchtreten des festen Abfangmaterials, mit dem der abgefangene Analyt assoziiert ist, verhindert, während sie das Hindurchtreten des ersten Flüssigkeitsflusses gestattet und damit eine Ansammlung des abgefangenen Analyten oder der abgefangenen Analyten bewirkt.
- Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Trennvorrichtung eine Säule umfasst, und wobei der erste Flüssigkeitsfluss, welcher die Vielzahl von abgefangenem Analyten oder von abgefangenen Analyten enthält, durch die Säule hindurchtritt.
- Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei das Eluieren der Vielzahl von freiem Analyten oder von freien Analyten von dem festen Abfangmaterial das Inkontaktbringen des angesammelten und abgefangenen Analyten oder der angesammelten und abgefangenen Analyten mit einer zweiten Flüssigkeit umfasst, welche eine Dissoziation des Analyten oder der Analyten von dem festen Abfangmaterial bewirkt.
- Verfahren nach Anspruch 18, wobei die zweite Flüssigkeit eine wässrige Lösung ist, umfassend mindestens ein saures, basisches, ionisches, organisches, oberflächenaktives oder chelatbildendes Mittel.
- Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Schritt des Eluierens des Analyten oder der Analyten von dem festen Abfangmaterial in einer Säule erfolgt, welche für das Ansammeln des abgefangenen Analyten oder der abgefangenen Analyten verwendet wird.
- Verfahren nach Anspruch 18, 19 oder 20, wobei der mit der zweiten Flüssigkeit eluierte Analyt oder die mit der zweiten Flüssigkeit eluierten Analyten gesammelt werden.
- Verfahren nach Anspruch 21, wobei der gesammelte Analyt oder die gesammelten Analyten einer anschließenden Analyse unterzogen werden.
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| 8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES AB, UPPSALA, SE |
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| 8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Representative=s name: HAMMONDS LLP, LONDON, GB |
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| R082 | Change of representative |
Ref document number: 1264179 Country of ref document: EP Representative=s name: J D REYNOLDS & CO., GB |