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DE19943704C1 - Affinitätssensor zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies und dessen Verwendung - Google Patents

Affinitätssensor zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies und dessen Verwendung

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DE19943704C1
DE19943704C1 DE19943704A DE19943704A DE19943704C1 DE 19943704 C1 DE19943704 C1 DE 19943704C1 DE 19943704 A DE19943704 A DE 19943704A DE 19943704 A DE19943704 A DE 19943704A DE 19943704 C1 DE19943704 C1 DE 19943704C1
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DE
Germany
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nanoparticles
sensor according
affinity sensor
binding
binding surfaces
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DE19943704A
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Wolfgang Fritzsche
Johann Michael Koehler
Joerg Reichert
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Fritzsche Wolfgang Dr De
Institut fuer Physikalische Hochtechnologie eV
Original Assignee
Institut fuer Physikalische Hochtechnologie eV
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Abstract

Dsie Erfindung betrifft einen Affinitätssensor zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies, welcher eine schnelle, quantitative und aufwandsgeringe Detektion der Anwesenheit von biologischen und/oder chemischen Spezies, insbesondere auf Flächen im unteren bis mittleren Mikrometerbereich, ermöglicht. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß der Sensor je nach Ausleseart aus einem optisch transparenten oder teilreflektierenden Substrat (1) besteht, das mit mehreren, voneinander beabstandeten mikrostrukturierten Bindeflächen (2) versehen ist, deren Fläche in Relation zum Durchmesser von Nanopartikeln (3) und oberhalb des lichtoptischen Beugungslimits so groß festgelegt ist, daß die Nanopartikel (3), die mit Kopplungspartnern (4) versehen sind, welche zu den Bindeflächen (2) oder darauf spezifisch gebundener Sequenzen (DNA) eine solche selektive Affinität aufweisen, daß sie eine anhaltende Bindung mit den Bindeflächen (2) oder darauf spezifisch gebundener Sequenzen (DNA) derart eingehen, daß auf einer oder mehreren Bindeflächen (2) eine so große Anzahl von Nanopartikeln (3) unter Ausbildung von Nanopartikelbelegungen (31) anbindbar sind, daß die von der Nanopartikelbelegung (31) eingenommene Fläche bezogen auf die Fläche einer Bindefläche (2) mindestens 0,1% betragen kann, wobei alle Bindeflächen (2) zusammen in einem solchen aktiven Flächenbereich angeordnet sind, daß sie gemeinsam von einem Objektiv eines üblichen lichtoptischen Mikroskops mit einer Apertur zwischen ...

Description

Die Erfindung betrifft einen Affinitätssensor zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies, der insbesondere für Aufgaben der kombinatorischen Chemie, für diagnostische Aufgaben, wie etwa in der Medizin oder zur Entwicklung neuer Wirkstoffe, z. B. für Medikamente oder selektiv wirkende Pflanzenschutzmittel, Verwendung finden soll.
Zur Identifikation biologischer Spezies, Individuen und Krankheiten haben sich Nachweise durch Molekül-Molekül-Wechselwirkung als besonders zweckmäßig erwiesen. Die Messung von Bindungsereignissen auf Biochips erfolgt dabei in der Regel unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern. Diese Methode besitzt jedoch mehrere wesentliche Nachteile:
  • - für die Auslesung sind sehr empfindliche Detektoranordnungen erforderlich, die zudem Anregungs- und Fluoreszenzlicht streng voneinander trennen müssen,
  • - die Quantifizierung ist problematisch, da die Quantenausbeuten der Fluoreszenz sehr stark umgebungsabhängig sind (Tanke, H. J.; Herman B. Fluorescence Microscopy, Springer Verlag (1998)). Deshalb sind quantitative analytische Aussagen oft gar nicht oder nur mit einem sehr hohen Meßaufwand erreichbar (Rost FWD Quantitative Fluorescence Microscopy, Cambridge University Press. (1991), so daß beispielsweise eine Auswertung nur unter Einbeziehung von Messungen an mehreren Chips möglich wird (Hacia, J. G.; Brody, L. C.; Chee, M. S., Fodor, S. C.; Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density olionucleotide arrays and two colour fluorescence analysis, Nature Genetics 14, 441-447 (1996)). Häufig scheitert jedoch selbst ein qualitativer Nachweis.
Die Detektion von Bindungsereignissen insbesondere auf hochintegrierten Biochips mit kleinen Bindeflächen durch Fluoreszenzmessung ist zeitaufwendig und nur mit teuren optischen Einrichtungen für die Auslesung zu bewerkstelligen. Die für quantitative Messungen erforderlichen längeren Expositions- und Akkumulationszeiten bewirken zudem eine photochemische Degradation der Farbstoffe, die das Signal im Verlauf der Messung verschlechtert und die Quantifizierung erschwert. Die Intensität des Fluoreszenzlichtes pro Anregungslichtmenge und Bindeereignis hängt zudem von der spezifischen chemischen Umgebung der zum Markieren verwendeten Chromophore ab. Deshalb treten von Charge zu Charge und von Test zu Test und sogar innerhalb einer Probe erhebliche Abweichungen in den Meßsignalen auf, die die eigentlich erforderliche Quantifizierung der Meßsignale ganz erheblich beeinträchtigen. Ein langsamer photo- und thermochemischer Abbau der Chromophoren führt überdies dazu, daß Meßproben nicht über längere Zeiten lagerfähig sind, d. h. sie können nicht archiviert und etwa zu einem späteren Zeitpunkt für Vergleichsmessungen herangezogen werden.
Bei der Auslesung von Bindeereignissen auf Biochips besteht zusätzlich das Problem, daß für Assays bei einer ausreichend großen Zahl von diskreten mikrostrukturierten Bindeflächen (typischerweise ca. 100-1000 Bindeflächen) oder für SBH-Chips (typischerweise 10000-106 Bindeflächen) die Gesamtfläche aller einzelnen Bindeflächen auf einem Chip nicht zu groß sein darf, um bei der Inkubation mit einer Testlösung nicht zu große Zeiten für die diffusive Ausbreitung von Konzentrationsfronten bzw. die spontane Einstellung von Anlagerungs- und Desorptionsgleichgewichten mit den gekoppelten molekularen Transportschritten zu benötigen.
Kleine Gesamtflächen wären auch für eine parallele optische Auslesung von Vorteil, um nicht mit zu großen Objektivdurchmessern für die Ausleseoptiken arbeiten zu müssen, die die Methode verteuern. Durch eine Verminderung der Gesamtfläche reduziert sich bei Fluoreszenzfarbstoffmarkierung bei gleicher Dichte bindender Gruppen die absolute Zahl die Fluorophoren, was die ohnehin komplizierte Fluoreszenzmessung bei kleinen Stoffmengen auf Festkörperoberflächen weiter erschwert. Deshalb kann bei den etablierten Fluoreszenzverfahren die Auflösungsgrenze der optischen Abbildung (ca. 0.4 . . . 1 µm) bei weitem nicht ausgeschöpft werden. Statt dessen wird überwiegend mit Einzelflächen von 100 µm und mehr gearbeitet (Chee, M. et al.; Accessing Genetic Information with High-Density DNA Arrays, Science 274 (1996), 610-614). Bei dieser Flächengröße erreicht man (für gleich große Zwischenräume) schon bei 100 Bindeflächen einen Flächenbedarf von 4 mm2, was für schnelle Assays wegen der erforderlichen Diffusionszeiten schon erheblich zu hoch ist. Bei 106 Bindeflächen würde die benötigte Gesamtfläche ca. 200 mm.200 mm betragen, was weit oberhalb sinnvoller Dimensionen ist, wenn Biochips serienmäßig eingesetzt und ausgewertet werden sollen.
In US-PS 5,556,756 wird ein Gold-Sol beschrieben, das in analytischen Testkits eingesetzt werden kann. Da die Analytik auf einer Farbänderung der Oberfläche beruht, werden dabei vorzugsweise Partikel zwischen 1 nm und 5 nm eingesetzt. Das dort beschriebene Verfahren hat den Nachteil, daß zum einen relativ große Testflächen benutzt werden müssen und zum anderen permeable Membranen eingesetzt werden müssen, um Spülprozesse durchführen zu können. Diese Lösung ist nicht zur Markierung kleiner Bindeflächen im mittleren und unteren Mikrometerbereich geeignet.
Weiterhin ist es grundsätzlich bekannt, daß funktionalisierte Nanopartikel spezifisch an Biomoleküle angelagert werden können (Nicholl, D., Genetische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg (1995), S. 24-27). Solche Bindeereignisse werden u. a. genutzt, um in der Grundlagenforschung mit Hilfe ultramikroskopischer Techniken wie z. B. Tunnel-, Kraft- und Transmissionselektronenmikroskopie sequenzspezifische Informationen auf der Skala von wenigen bis 1 nm aus auf Festkörperoberflächen immobilisierten biogenen Makromolekülen zu gewinnen. Dabei wird der Umstand genutzt, daß einzelne Partikel an diskrete Regionen eines einzelnen großen Moleküls angelagert werden. Zum Nachweis dieser einzelnen Partikel sind ultramikroskopische Verfahren unerläßlich. Diese sind aber zu aufwendig, d. h. sowohl in der Investition als auch in der Handhabung zu kompliziert und zu teuer, um für Serien- oder Routineanalysen eingesetzt zu werden.
Darüber hinaus ist es bekannt, daß grundsätzlich auch Submikrometerpartikel durch optische Methoden detektiert werden können. In WO 98/57148 A1 werden eine Methode und eine Anordnung beschrieben, bei der die durch die Anlagerung von solch kleinen Partikeln auf einen dünnen Metallfilm verbundene Änderungen des Winkels der Oberflächenplasmonenresonanz festgestellt werden kann. Dieses Verfahren setzt eine aufwendige SPR-Anordnung voraus und ist außerdem auf die Existenz einer, den Lichtdurchtritt hindernden Metallschicht auf einem ansonsten transparenten Substrat angewiesen.
Es besteht ein dringender Bedarf an Affinitätssensoren zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies, die vorstehend genannte Nachteile vermeiden und die für Serien- oder Routineanalysen einsetzbar sind.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Affinitätssensor anzugeben, welcher eine schnelle, quantitative und aufwandsgeringe Detektion der Anwesenheit von biologischen und/oder chemischen Spezies, insbesondere auf Flächen im unteren bis mittleren Mikrometerbereich, ermöglicht.
Die Aufgabe wird durch die Merkmale des ersten Patentanspruchs gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind durch die nachgeordneten Ansprüche erfaßt.
Ein zuverlässiger Nachweis von Bindeereignissen auf Flächen im unteren bis mittleren µm-Bereich gelingt im Rahmen der Erfindung durch die Erzeugung von Nanopartikel-Schichten, die durch Marker gebildet sind, deren Dichte insbesondere durch Absorptions- aber auch durch Reflexions- oder Streulichtmessungen oder durch Plasmonenresonanz­ messungen quantifizierbar ist. Bei sehr kleinen, elektrisch leitfähigen Nanopartikeln kann vorteilhaft die größenspezifische Absorption von Licht herangezogen werden, wodurch unter Einsatz von mehreren monodispersen Gruppen von Nanopartikeln mit unterschiedlichem Durchmesser auch Mehrfachmarkierungen möglich sind. Die selektive Markierung von immobilisierten Biomolekülen hat sich als überraschend unproblematisch erwiesen. Als besonders günstig haben sich Goldpartikel zur Markierung herausgestellt. Bei dem Einsatz von Goldpartikeln ist ein solcher Affinitätssensor auch in einer Vorrichtung zur Bestimmung der Plasmonenresonanz einbindbar. Eine selektive Bindung ist auch bei relativ großen Partikeldurchmessern nachzuweisen, die bereits recht komfortable Streulichtsignale liefern.
Besonders vorteilhaft kann durch die bei vorliegender Erfindung vorgesehene flächenhafte Markierung mit insbesondere metallischen Nanopartikeln die Auslesung von Bindeereignissen auf Biochips erfolgen.
Die Erfindung soll nachstehend anhand schematischer Ausführungs­ beispiele näher erläutert werden. Es zeigen:
Fig. 1 schematisch in Draufsicht einen Affinitätssensor,
Fig. 2 einen Teilbereich des Affinitätssensors nach Fig. 1 in seitlicher Ansicht,
Fig. 3 eine rasterkraftmikroskopische Aufnahme einer Nanopartilel- Schicht, die durch eine Belegung mit 30 nm Goldpartikeln gebildet ist und
Fig. 4 eine lichtmikroskopische Durchlichtaufnahme einer einzelnen Bindefläche nach Fig. 3, die die durch die Nanopartikel- Schicht bewirkte Absorption gegenüber dem sie tragenden Substrat veranschaulicht.
Fig. 1 zeigt beispielhaft einen Affinitätssensor zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies bestehend aus einem optisch transparenten Substrat 1, das mit mehreren, voneinander beabstandeten mikrostrukturierten Bindeflächen 2 versehen ist. Die Art und Ausbildung der Bindeflächen erfolgt je nach Vorgabe der zu ermittelnden Bindeereignisse und ist als solche durch übliches fachgemäßes Handeln realisierbar, weshalb hier dazu keine weiteren Ausführungen erforderlich sind. Die Beabstandung der Bindeflächen 2 erfolgt im Beispiel durch freistrukturierte Bereiche 11 des Substrats 1. Die Bemaßung der Seitenlängen der einzelnen hier quadratisch ausgeführten Bindeflächen 2 erfolgt derart, daß sie oberhalb des lichtoptischen Beugungslimits festgelegt ist; im Beispiel 2 µm, jedenfalls ≧ 0,5 µm. Die Seitenlänge des optisch transparenten Substrats 1 soll im Beispiel 3 mm betragen, wobei der aktive Flächenbereich 22, nämlich die Fläche des Substrats 1, die mit den Bindeflächen 2 versehen ist, lediglich in der Größenordnung von 1 mm2 festgelegt ist, für bestimmte Anwendungen (z. B. eine schnelle Diagnostik) auch Flächen unterhalb 0.01 mm2 problemlos einnehmen kann, wesentlich ist lediglich, daß den einzelnen Bindeflächen 2 eine Fläche gegeben ist, die oberhalb des lichtoptischen Beugungslimits liegt, wobei der durch alle Bindeflächen 2 eingenommene aktive Flächenbereich 22 von gängigen Objektiven mit einer numerischen Apertur zwischen 0,1 . . . . 0,9, vorzugsweise 0,2, lichtoptischer Mikroskope erfaßbar sein soll. Verzichtet man auf diesen durch die Erfindung geschaffenen Vorteil, ist es ebenso möglich teuere Objektive mit einer größeren Apertur einzusetzen, wobei dann auch größere aktive Flächenbereiche 22 zum Einsatz gelangen können.
Fig. 2 zeigt einen Teilbereich des Affinitätssensors nach Fig. 1 in seitlicher Ansicht, wobei gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen wie in Fig. 1 bezeichnet sind. Die im Rahmen der Erfindung eingesetzten Nanopartikel 3 sind mit Kopplungspartnern 4 versehen, welche zu den Bindeflächen 2 oder, wie im Beispiel nach Fig. 2 dargestellt, darauf spezifisch gebundener Sequenzen (DNA) eine hohe selektive Affinität aufweisen. Zur näheren Erläuterung soll folgendes Beispiel dienen:
Oligonukleotide mit bspw. 20 Basenpaaren sind auf den mikrostrukturierten Bereichen des Substrats 1 immobilisiert und bilden so die vorstehend bezeichneten Bindeflächen 2. Der so präparierte Affinitätssensor wird mit einer zu testenden Lösung versetzt, die DNA unbekannter Zusammensetzung enthält. Diese bindet nur auf den Bindeflächen 2, die zu Teilabschnitten der DNA komplementäre Oligonukleotide tragen. Nach dem Abspülen, zwecks Entfernung unspezifisch gebundener DNA, wird die Substratoberfläche einer kolloidalen Lösung die Nanopartikel, im Beispiel bestehend aus Gold mit einem Partikeldurchmesser von 30 nm, enthält, ausgesetzt. Die Oberfläche der Nanopartikel ist mit einem Kopplungspartner 4 versehen, im Beispiel einem Oligonukleotid, dessen Sequenz so beschaffen ist, daß es nicht komplementär zu einem der Bindeflächen 2 auf dem Substrat 1 aber komplementär zu einer konservativen Nukleotidabfolge der zu untersuchenden Targetmoleküle ist, die in allen in Frage kommenden Targetmolekülen (gebundene DNA) gleich vorkommt. Der nach einer Hybridisierung erhaltene Zustand des Affinitätssensors ist im Teilausschnitt in Fig. 2 veranschaulicht.
Nach der Hybridisierung ist im Beispiel eine Dichte von ca. 40 Partikeln/µm2 erhalten worden, wobei im Beispiel den eingesetzten Goldnanopartikeln 3 ein Durchmesser von 30 nm gegeben ist. Bei einer Querschnittsfläche der einzelnen Nanopartikel von ca. 700 nm2 erhält man Nanopartikel-Schichten mit einer Nanopartikelbelegung 31 von ca. 3%, welche im Lichtmikroskop sofort und deutlich sichtbar sind. Diese Strukturen entsprechen den vorstrukturierten Bindeflächen 2.
Die Durchmesserbereiche der Nanopartikel 3 sind in Abhängigkeit vom jeweils auszubildenen Testassay in weiten Grenzen festlegbar. So können die Durchmesser der Nanopartikel in der Größenordnung von 2 . . . 600 nm festgelegt sein. Vorzugsweise ist je nach dem für die Nanopartikel ausgewähltem Material ein Durchmesserbereich von 15 . . . 60 nm gewählt. Bevorzugt kommen im Rahmen der Erfindung metallische Nanopartikel zum Einsatz, da sie in sehr effektiver Weise Licht absorbieren, wodurch schon Nanopartikelbelegungen in der Größenordnung von 0,1% im Lichtmikroskop im Durchlicht detektierbar sind. Damit ist es möglich, auch bei Ausdehnungen der einzelnen Bindeflächen 2 knapp oberhalb der Beugungsgrenze (1 µm . . 10 µm) zu arbeiten. 100 Bindeflächen 2 lassen sich auf diese Weise auf aktiven Flächen 22 von deutlich weniger als 0.1 mm Seitenlänge plazieren, 10000 Bindeflächen 2 auf weniger als 1 mm2. Selbst für höchstintegrierte Affinitätssensoren mit 100000 Bindeflächen 2 erscheint eine Gesamtfläche von weniger als 1 mm2 gut realisierbar. Auf diese Weise sind sehr schnell arbeitende und für kleinste Probenmengen geeignete Assays aufbaubar, so daß für niederintegrierte Assays lediglich Probenmengen bis unter 1 nl und für höher integrierte bis zu ca. 1 µl benötigt werden.
Es liegt im Rahmen der Erfindung, für die vorgesehenen Nanopartikel 3 auch metallhaltige Kompositpartikel im genannten Größenbereich als auch Nanopartikel aus einem Halbleitermaterial, wie z. B. CdSe, InP, als auch beschichtete Nanopartikel, bspw. mit ZnSe, einzusetzen. Auch liegt es im Rahmen der Erfindung, Nanopartikel aus Kunststoff einzusetzen, die bevorzugt Einschlüsse aus einem absorbierenden Farbstoff, Metall oder Halbleitern beinhalten.
Wesentlich bei der Auswahl genannter Nanopartikel 3 bzgl. ihrer materialmäßigen Zusammensetzung und Größe ist lediglich, daß die durch sie gebildeten Nanopartikelbelegungen 31 mit Objektiven üblicher lichtoptischer Mikroskope, zwecks Bestimmung der durch die Nanopartikelbelegung 31 hervorgerufenen optischen Absorption, Reflexion oder Streuung, auch bei den vorstehend beschriebenen niedrigen Dichten der Nanopartikel pro Bindefläche 2 bei Erfassung der gesamten aktiven Fläche 22 detektierbar sind. Ebenso kann die Anordnung der Bindeflächen 2, die genannte Nanopartikelbelegungen 31 aufnehmen, in vorstehend beschriebener Weise auf der Fläche eines Prismas vorgesehen sein, wodurch ein solcher Affinitätssensor einer Vorrichtung zur Erfassung der Plasmonenresonanz zugänglich ist.
Für die Auswahl der als Marker dienenden Nanopartikel 3 gilt, daß deren Größe so gewählt wird, daß sie einerseits auch bei wenigen bindenden Molekülen schon einen sehr effektiven Beitrag zur Signalentstehung leisten, wobei sie nicht zu klein sein dürfen, die andererseits aber, um spezifisch anzukoppeln, nicht zu groß sein dürfen, wobei durch die Ankopplung von mehreren Nanopartikeln 3 an einer einzelnen Bindefläche 2 ein kooperativer Meßeffekt erreicht wird. Bei abnehmender Partikelgröße wird das Meßsignal schlechter, bei zunehmender Partikelgröße geht die Spezifität der Bindung zurück. Ersteres führt zu einer Verringerung des Absolutsignals, letzteres zu einer Anhebung des Hintergrundsignals. Die jeweils konkrete Auswahl der betreffenden Partikel liegt in einem für den Fachmann zumutbaren Rahmen. Für den vorstehend beschriebenen Einsatz. Im beschriebenen Beispiel wurden Au- Partikel mit einem Durchmesserbereich zwischen 15 nm und 60 nm als besonders bevorzugt gefunden.
Zur Verdeutlichung der erzielten Anbindungen zeigt Fig. 3 eine rasterkraftmikroskopische Aufnahme einer Nanopartikelbelegung 31 auf einem 5 . 5 µm großen Fläche, die durch eine Belegung mit 30 nm Goldpartikeln gebildet ist, wobei in Fig. 4 eine lichtmikroskopische Durchlichtaufnahme einer einzelnen Bindefläche, die die durch die Nanopartikelbelegung 31 bewirkte Absorption gegenüber dem sie tragenden Substrat 1 veranschaulicht.
Der vorgeschlagene Affinitätssensor bietet zusammengefaßt gegenüber der nach dem Stand der Technik üblichen Fluoreszenzfarbstoff­ markierung und -auslesung folgende Vorteile:
  • 1. Eine einfache Handhabung des Affinitätssensors ist gewährleistet, da keine giftigen, cancerogenen und umweltschädlichen Farbstoffe zur Markierung zum Einsatz gelangen.
  • 2. Es ist eine Unabhängigkeit des Signals von der chemischen Umgebung gegeben, weshalb der Affinitätssensor für quantitative Messungen verwendet werden kann.
  • 3. Es erfolgen keine stofflichen Veränderungen (Ausbleichen o. ä.) während der Messung. Deshalb kann sogar bei einer scannenden Auslesung des aktiven Flächenbereichs 22 das ganze Assay beleuchtet bleiben, ohne daß Veränderungen in den Meßsignalen eintreten.
  • 4. Kurze Inkubationszeiten sind gewährleistet, da selbst für eine hohe Anzahl einzelner Bindungsflächen der aktive Flächenbereich sehr klein festlegbar ist.
  • 5. Durch den vorgeschlagenen Aufbau des Affinitätssensors ist ein günstiges Signal-Rausch-Verhältniss gegeben, wodurch kurze Meßzeiten realisierbar sind.
  • 6. Durch die Möglichkeit der Ausbildung einer hohen Anzahl einzelner Bindeflächen auf einer sehr kleinen aktiven Fläche 22 ist die Auslesung mittels einfacher mikroskopischer Apparaturen gegeben. Im Gegensatz zum Stand der Technik sind keine Fluoreszenzoptiken und keine großen Objektive erforderlich.
  • 7. Die Affinitätssensoren, die mit den Nanopartikelbelegungen versehen sind weisen eine langfristige Lagerstabilität auf, da die Partikelbelegungen von sich aus keinerlei Veränderungen erfahren, wodurch ihre Archivierung ermöglicht wird, was in der Medizin, insbesondere Gerichtsmedizin, der Umwelttechnik, der Prozeßkontrolltechnik und der Forschung neue Möglichkeiten eröffnet.
  • 8. Durch die Quantifizierbarkeit und Lagerstabilität der Affinitätssensoren ist die Möglichkeit des Aufbaus von Kalibrier- oder sogar Eichnormalen gegeben.
Bedingt durch das mit vorliegender Erfindung realisierbare Größenverhältnis des aktiven Flächenbereichs 22 zu den einzelnen Bindeflächen 2 ist eine hohe Parallelität gewährleistet, so daß der vorgeschlagene Affinitätssensor auch für schnelle Assays und für kleine Probenmengen geeignet ist und bis zu etwa 106 Bindeflächen 22 auf einem Flächenbereich von 1 mm2 aufweisen kann, was vor allem für Tests mit Molekül-Bibliotheken-Chips, wie Biochips, DNA-Chips u. a. erheblich von Vorteil ist. Somit kann der vorgeschlagene Affinitätssensor insbesondere für Aufgaben der kombinatorischen Chemie, für diagnostische Aufgaben in der Medizin, zur Entwicklung neuer Wirkstoffe, zur Entwicklung neuer Arzneiwirkstoffe oder zur Entwicklung selektiv wirkender Pflanzenschutzmittel Verwendung finden.
Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und der Zeichnung dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.

Claims (13)

1. Affinitätssensor zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies bestehend aus einem, je nach Ausleseart optisch transparenten oder teilreflektierenden Substrat (1), das mit mehreren, voneinander beabstandeten mikrostrukturierten Bindeflächen (2) versehen ist, deren Fläche in Relation zum Durchmesser von Nanopartikeln (3) und oberhalb des lichtoptischen Beugungslimits so groß festgelegt ist, daß die Nanopartikel (3), die mit Kopplungspartnern (4) versehen sind, welche zu den Bindeflächen (2) oder darauf spezifisch gebundener Sequenzen (DNA) eine solche selektive Affinität aufweisen, daß sie eine anhaltende Bindung mit den Bindeflächen (2) oder darauf spezifisch gebundener Sequenzen (DNA) derart eingehen, daß auf einer oder mehreren Bindeflächen (2) eine so große Anzahl von Nanopartikeln (3) unter Ausbildung von Nanopartikelbelegungen (31) anbindbar sind, daß die von der Nanopartikelbelegung (31) eingenommene Fläche bezogen auf die Fläche einer Bindefläche (2) mindestens 0,1% betragen kann, wobei alle Bindeflächen (2) zusammen in einem solchen aktiven Flächenbereich (22) angeordnet sind, daß sie gemeinsam von
  • - einem Objektiv eines üblichen lichtoptischen Mikroskops mit einer numerischen Apertur zwischen 0,1 bis 0,9, zwecks Bestimmung der durch die Nanopartikelbelegungen (31) erzeugten optischen Absorption, Reflexion oder Streuung oder
  • - durch eine Vorrichtung zur Bestimmung der Plasmonenresonanz erfaßbar sind.
2. Affinitätssensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der zum Einsatz gelangenden Nanopartikel (3) in der Größenordnung von 2 bis 600 nm festgelegt ist.
3. Affinitätssensor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der zum Einsatz gelangenden Nanopartikel (3) vorzugsweise in der Größenordnung von 15 bis 60 nm festgelegt ist.
4. Affinitätssensor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der zum Einsatz gelangenden Nanopartikel (3) vorzugsweise in der Größenordnung von 2 bis 15 nm festgelegt ist.
5. Affinitätssensor nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Nanopartikel (3) Metalle, insbesondere Gold, eingesetzt sind.
6. Affinitätssensor nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Nanopartikel (3) metallhaltige Kompositpartikel eingesetzt sind.
7. Affinitätssensor nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Nanopartikel (3) solche aus einem Halbleitermaterial, insbesondere CdSe, InP, eingesetzt sind.
8. Affinitätssensor nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Nanopartikel (3) solche aus einem Kunststoff, die bevorzugt Einschlüsse aus einem absorbierenden Farbstoff, Metall oder Halbleitern beinhalten, eingesetzt sind.
9. Affinitätssensor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Nanopartikel (3) mehrerer unterschiedlicher Größenklassen oder unterschiedlicher Zusammensetzung eingesetzt sind, die in verschiedenen Spektralbereichen auslesbar sind.
10. Affinitätssensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Bindeflächen (2) in der Größenordnung von 0,4 µm2 bis 1 mm2 festgelegt sind.
11. Affinitätssensor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Bindeflächen (2) in der Größenordnung von 1 µm2 festgelegt sind.
12. Affinitätssensor nach Anspruch 1 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu 106 einzelne Bindeflächen in der Größenordnung von 1 µm2 auf einem Flächenbereich (22) des transparenten Substrats in der Größenordnung von 1 mm2 vorgesehen sind.
13. Verwendung eines Affinitätssensors nach den vorstehenden Ansprüchen für Aufgaben der kombinatorischen Chemie, für diagnostische Aufgaben in der Medizin, zur Entwicklung neuer Wirkstoffe, zur Entwicklung neuer Arzneiwirkstoffe oder zur Entwicklung selektiv wirkender Pflanzenschutzmittel.
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