DE102004007005A1

DE102004007005A1 - Massenspektrometrische Häufigkeitsbestimmungen von Proteinen

Info

Publication number: DE102004007005A1
Application number: DE102004007005A
Authority: DE
Inventors: Jochen Franzen; Detlev Suckau
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2004-02-12
Filing date: 2004-02-12
Publication date: 2005-09-08
Also published as: GB2410952A; GB0502577D0; US20050191677A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung der relativen Konzentrationen von Proteinen oder Proteinabkömmlingen in Flüssigkeiten. DOLLAR A Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das mit spezifischen Affinitätsfängern beschichtete Nanopartikel verwendet, um die gewünschten Proteine oder Proteinabkömmlinge aus den Flüssigkeiten zu fischen und zu separieren, um sie nach Elution von den Affinitätsfängern der massenspektrometrischen Häufigkeitsanalyse zuzuführen. Damit kann die relative Konzentration mehrerer Proteine oder mehrerer Modifikations- oder Mutationsformen von Proteinen zueinander mit relativ hoher Messdynamik bestimmt werden.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung der relativen Konzentrationen von Proteinen oder Proteinabkömmlingen in Flüssigkeiten.
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das mit Affinitätsfängern beschichtete Nanopartikel verwendet, um die gewünschten Proteine oder Proteinabkömmlinge aus den Flüssigkeiten zu fischen und zu separieren, um sie nach Elution von den Affinitätsfängern einer massenspektrometrischen Häufigkeitsanalyse zuzuführen. Damit kann die relative Konzentration mehrerer Proteine oder mehrer Modifikations- oder Mutationsformen von Proteinen zueinander mit relativ hoher Messdynamik bestimmt werden.

In der modernen Proteomik ist die Bestimmung der relativen Konzentrationen von verschiedenen Proteinen oder Peptiden (kleine Proteine) zueinander oder die Bestimmung der relativen Konzentrationen von verschiedenen Abkömmlingen desselben Proteins immer mehr in den Brennpunkt des Interesses getreten. Unter verschiedenen Abkömmligen desselben Proteins verstehen wir dabei nicht nur verschiedene posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung oder Glykosylierung, sondern auch durch Mutationen veränderte Formen, die häufig, wenn auch häufig mit verschiedener Häufigkeit, in beiden Allelformen ererbt von Vater und Mutter im selben Individuum vorkommen. Hinzu kommen durch Splice-Variation erzeugte, verschiedenartige Formen des selben Proteins, und auch größere Abbauprodukte (proteolytische Fragmente) eines Proteins. Verschiedene Abbauformen eines Proteins und deren relative Häufigkeit sind von besonderem Interesse, wenn es sich um Produkte mehrerer konkurrierender Abbaupfade handelt, von denen ein Abbaupfad toxische, diagnostisch relevante oder sonst pathogene Formen liefert. Ein bekanntes Beispiel ist der fehlerhafte Abbau einer „Prionen" genannten Proteinmolekülart in Rinderngehirnen, das zu einer Auskristallisation der Abbauprodukte und damit zur „cow madness" BSE führt. Ein ähnliches Phänomen ist bei der Alzheimer-Krankheit zu beobachten.

Die bisher meist angewandte Art der Häufigkeitsbestimmung ist die „Expressionsanalyse", die der Feststellung der relativen Konzentrationen von Proteinen in „kranken" oder „gestressten" Proben relativ zu „gesunden" Proben dient. Sie beruht meist auf der zweidimensionalen Trennung der Proteine durch 2D-Gelelektrophorese mit anschließender Färbung der Proteine. Die Bestimmung der relativen Konzentrationen geschieht dabei entweder photometrisch über die Stärke der Färbung oder über massenspektrometrische Messungen, wobei die letzteren auch eine Identifizierung der Proteine erlauben. Der unbestreitbare und besondere Vorteil der 2D-Gelelektrophorese ist es, Über- und Unterexpressionen von Proteinen zu finden, bei denen solche Reaktionen bisher nicht bekannt waren, aber der beschränkte Konzentrationsbereich lässt diese Art der Expressionsanalyse zunehmend in den Hintergrund treten.

Die Expressionsanalyse über 2D-Elektrophorese, aber auch chromatographische Verfahren, können nur die häufig vorkommenden Proteine messen, wobei sich die Messung in etwa auf die oberen drei bis vier Zehnerpotenzen des gesamten Konzentrationsbereiches an Proteinen (10⁷ bis einige 10¹⁰ Picogramm per Milliliter) bezieht, während der gesamte analytisch interessante Konzentrationsbereich auf mehr als zehn Zehnerpotenzen geschätzt wird. Im Blutplasma befinden sich wichtige Steuerproteine und Signalboten von hohem Interesse nur in den unteren Konzentrationsbereichen; die wichtigen Interleukine, beispielsweise, finden sich in Konzentrationen von etwa einem bis drei Picogramm per Milliliter an der unteren Grenze des analytisch interessanten Bereichs. Bei Molekulargewichten von 10⁴ bis 10⁵ Gramm pro Mol betragen die Konzentrationen der Interleukine etwa 10 bis 100 Attomol pro Milliliter. Die aus Zellen austretenden Abbauprodukte von Zellproteinen, die gerade für diagnostische Zwecke sehr interessant sind, finden sich im Plasma in Konzentrationen von etwa 10² bis 10⁴ Picogramm pro Milliliter (N. L. Anderson und N. G. Anderson, „The human plasma proteome", Mol. Cell Proteomics 1, 845–867 (2002)).

Das Beseitigen der hochkonzentrierten Proteine wie Albumine und Globuline, um die weniger hoch konzentrierten Proteine besser messen zu können, wird allgemein als sehr zweifelhaft angesehen, weil sich viele niederkonzentrierte Proteine als nicht-kovalent gebundene Komplexe an die hochkonzentrierten Proteine anheften und mit diesen beseitigt werden.

Auch zweidimensionale chromatographische oder elektrophoretische Trennverfahren helfen ohne besondere biochemische Maßnahmen nicht, den dynamischen Messbereich wesentlich zu vergrößern. Einen Weg weisen Verfahren, die bestimmte Affinitätsgruppen („affinity tags") wie beispielsweise Biotin derivativ an ausgewählte Proteine anbinden, um sie über immobilisierte Affinitätsfänger aus größeren Flüssigkeitsmengen herausfangen zu können. Aber auch hier können Proteine nicht individuell ausgesucht werden, sondern nur über bestimmte chemische Gruppen, die wiederum zwangsläufig bei mehr oder weniger allen Proteinen vorhanden sind.

Es hat sich daher ein weiteres Verfahren zum Herausfischen von bestimmten, vorher festgelegten Proteinen entwickelt: das Fangen (oder „Fischen") von Proteinen durch fest an Oberflächen gebundene („immobilisierte") Antikörper. Antikörper binden sehr spezifisch ganz bestimmte Proteine, obwohl es auch hier gelegentlich Kreuzreaktionen mit anderen Proteinen gibt. Dieses Verfahren ist für die massenspektrometrische Untersuchung einzelner Proteine im Prinzip bereits seit langem bekannt, aber wegen der früher langwierigen und teueren Herstellung der Antikörper nicht sehr oft angewandt worden. Ein frühes Beispiel dazu ist die Arbeit von Detlev Suckau et al., „Molecular epitope identification by limited proteolysis of an immobilized antigen-antibody complex and mass spectrometric peptide mapping", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990) 9848–9852.

Seit Neuestem ist es auch möglich, die Wirkung der Antikörper, die im Bereich der Molekulargewichte von 150 000 bis 190 000 atomaren Masseneinheiten liegen, durch computermodellierte Peptide im Bereich von nur 20 Aminosäuren (nur etwa 2400 atomaren Masseneinheiten) zu erzielen und damit die teueren Antikörper durch preiswert synthetisierbare Peptide zu ersetzen. Es besteht aber die Gefahr erhöhter Kreuzreaktivität. Es sind auch andere spezifisch wirksame Interaktionspartner bekannt, wie Lektine, Metallchelate zur Phosphatbindung (IMAC), Protein Nucleic Acids (PNAs), Oligonukleotide, Inhibitoren, Rezeptorenm, Liganden und andere.

Für das Fangen einzelner Proteine werden in jüngster Zeit häufig so genannte Chiparrays eingesetzt, die in einzelnen Feldern von 0,01 bis 1 mm² Größe mit verschiedenartigen Antikörpern oder anderen Affinitätsfängern belegt sind. Damit lassen sich beispielsweise ganze Familien von Proteinen wie etwa die Kinasen fischen und in günstigen Fällen in ihrer Häufigkeit zueinander bestimmen. Die Relationen einzelner Kinasen zueinander können charakteristisch sein für bestimmte Krankheiten, in diesem Fall spricht man von „Biomarkern". Die Kinasen liegen in einem niedrigen Konzentrationsbereich.

Es handelt sich hier um das weite Feld der so genannten Chiparrays mit kovalent gebundenen Fängersubstanzmolekülen für den Nachweis affin bindender Biopolymermoleküle. Die auf den Arrayfeldern gebundenen Fängersubstanzmoleküle können DNA-Moleküle („DNA-Chips"), Proteinmoleküle („Proteinchips") oder sonst geartete Moleküle mit spezifisch affiner Bindungsfähigkeit sein. Im Folgenden werden die gesuchten Proteine als „Analytmoleküle", die Fängersubstanzmoleküle auf den Chipfeldern einfach als „Fängermoleküle" oder auch „Sondenmoleküle" bezeichnet. Die spezifisch affine Bindung der Analytmoleküle an den Sondenmolekülen findet aus Lösungen heraus statt, in denen die gesuchten Analytmoleküle vorkommen können, wobei die Lösungen mit der belegten Chipoberfläche in direktem Kontakt stehen müssen.

Diese Chiparrays mit Sondenmolekülen werden ganz allgemein für das Studium der Bindungen (beispielsweise Kreuzreaktionen bei Antikörper-Bindungen), besonders aber für das selektive Einfangen von Analytmolekülen aus Körperflüssigkeiten und damit für die qualitative und, in beschränktem Umfang, quantitative Analyse dieser Analytmoleküle selbst verwendet. In einigen Fällen, beispielsweise für den Nachweis kennzeichnender DNA-Stränge von Infektionserregern, grenzen sich die Analysen auf eine einfache Aussage über Anwesenheit oder Abwesenheit des Infektionserregers ein. Durch die Vielzahl von Sondenfeldern auf den Chiparrays kann eine Probe mit Körperflüssigkeit gleichzeitig auf die Anwesenheits eines oder mehrerer unter sehr vielen verschiedenen Arten von Infektionserregern nachgewiesen werden.

Die Analysenverfahren mit solchen Chiparrays werden auch als „zellenbasierte Assays" bezeichnet (cell-based assays); die Verfahren selbst häufig als „Screening". Die Chiparrays haben allerdings auch starke Nachteile. Da die Felder auf den Arrays sehr klein sind, können sie auch nur beschränkte Mengen an Analytmolekülen binden. Werden sie durch das Fischen bis zur Sättigung belegt, so ist zwar noch eine qualitative Analyse auf die Art des gefangenen Proteins möglich, aber eine quantitative Analyse, also die Feststellung relativer Konzentrationen, geht verloren. Da andererseits aber nur wenige gebundene Analytmoleküle auf einem Chipfeld nur mit größten Schwierigkeiten detektiert werden können, ist der dynamische Messumfang dieses Verfahrens des Fischens mit Chiparrays sehr klein; er beträgt je nach verwendetem Nachweisverfahren nur etwa ein bis drei Zehnerpotenzen.

Ein Vorteil der Chiparrays ist es, dass sie nicht auf massenspektrometrischen Nachweis allein beschränkt sind. Als Stand der Technik haben sich bisher für den Nachweis der Bindung von Analytmolekülen an Sondenmolekülen einige Verfahren eingeführt, die hier nur sehr kurz dargelegt werden.

Ein Nachweis der Bindungen ist beispielsweise durch zusätzlich an die Analytmoleküle angebundene Fluoroszenzfarbstoffe möglich; die dafür geeigneten (patentierten) Fluoreszenzfarbstoffe sind jedoch teuer. Auch ein Anbinden der Fluoreszenzfarbstoffe an die Fängermoleküle ist möglich; der Nachweis erfolgt dann über eine Messung des „Quenchens" oder der Messung einer leichten Frequenzverschiebung des Farbstoffs beim Fangen von Analytmolekülen.

Ein weiteres Verfahren, das zur Zeit in Entwicklung ist, besteht auf der gleichzeitigen Anbindung der Analytmoleküle und größerer Massen, beispielsweise durch Nanopartikel, auf geeigneten Schwingern für einen Nachweis der affinen Bindungen durch akustische Oberflächenwellen (SAW = surface acoustic waves), deren Frequenz belegungsabhängig ist.

Das Verfahren der Plasmonresonanzspektrometrie, das ebenfalls zum Nachweis der affinen Bindungen von Analytmolekülen an Sondenmolekülen verwendet wird, bedarf jeweils etwas größerer Flächen für die flache Reflektion des Lichts, so dass es bisher nicht gelungen ist, für diese Art des Nachweises Arrays mit größeren Anzahlen an Feldern zu produzieren. Die Vorteile liegen darin, auch die Kinetik des Bindevorgangs messen zu können.

Die genannten Nachweisverfahren haben den Vorteil einer etwas größeren Messdynamik, die etwa drei bis vier Zehnerpotenzen an Konzentrationsunterschieden beträgt, aber den Nachteil, dass eine unabhängige Identifizierung der gefangenen Proteine nicht erfolgt. Da es bei allen Antikörperbindungen auch Kreuzreaktionen mit anderen Proteinen gibt, kann man nie sicher sein, das richtige Protein oder einen bestimmten Abkömmling gefangen zu haben. Eine solche unabhängige Identifizierung ist allein der Massenspektrometrie vorbehalten. Noch zwingender wird der Einsatz der Massenspektrometrie, wenn verschiedene Formen eines Proteins, die alle durch den gleichen monoklonalen Antikörper gefangen werden, zueinander ins Verhältnis gesetzt werden sollen. Der Einsatz von polyklonalen Antikörpern, der ebenfalls für analytische Zwecke interessant ist, erzwingt ebenfalls den massenspektrometrischen Nachweis.

Ein massenspektrischer Nachweis der affin gebundenen Analytmoleküle, beispielsweise mit einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) nach Zugabe entsprechender Matrixsubstanzen, ist zwar wegen des dazu benötigten Massenspektrometers ebenfalls recht aufwendig, hat allerdings den Vorteil, eine zusätzliche Bestätigung der Identität der Analytmoleküle durch ihre Masse zu liefern. Diesem unschätzbaren Vorteil steht der Nachteil einer geringeren Messdynamik entgegen, die nur etwa zwei Zehnerpotenzen beträgt. Auf einem großen Array-Feld von einem Quadratmillimeter Fläche kann bei dichter, monomolekularer Belegung nur ein Picomol an Analytmolekülen gefangen werden, im Allgemeinen sogar nur ein Zehntel davon, also etwa 100 Femtomol, da die Belegung aus Gründen genügender sterischer Freiheit für das Fangen weit weniger als eine monomolekulare Schicht betragen muss. Die in der Praxis erzielbare massenspektrometrische Nachweisgrenze für MALDI-Ionisierung liegt aber bei etwa einem Femtomol, woraus sich der Messumfang von etwa zwei Zehnerpotenzen ableitet.

Außerdem ist es schwierig, mit Chiparrays niederkonzentrierte Proteine aus größeren Flüssigkeitsmengen zu fischen. Für die Interleukine, beispielsweise, müssen etwa 10 bis 100 Milliliter Blutplasma für ein Femtomol Interleukin abgefischt werden, eine Aufgabe, die bisher von Chiparrays nicht geleistet werden kann.

Es besteht also Bedarf für ein Verfahren, das einerseits eine unabhängige Identifizierung liefert, andererseits aber einen hohen Messbereich für die Konzentrationsbestimmungen bietet.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu finden, mit dem die Moleküle von mehreren vorbestimmten Analytproteinen oder mehreren Proteinabkömmlingen auch bei sehr niedrigen Konzentrationen aus der Probenflüssigkeit unter Wahrung ihrer relativen Konzentrationen herausgeholt und einer massenspektrometrischen Analyse zugeführt werden können.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung wird durch die charakterisierenden Verfahrensschritte des Anspruchs 1 dargestellt. Günstige Ausführungsformen sind durch die weiteren Ansprüche gegeben.

Es ist der Kerngedanke der Erfindung, für die Messung der Konzentrationsverhältnisse von verschiedenen Proteinen oder verschiedenen Proteinabkömmlingen eines Proteins nicht ein Chiparray zum Fangen der verschiedenen Analytmoleküle einzusetzen, sondern mit Fängermolekülen besetzte Nanopartikel, vorzugsweise hier definiert als Kügelchen im Bereich von 500 bis 1500 Nanometer Durchmesser, aber auch als Partikel beliebiger Formen von 10 bis 10000 Nanometer Größe, und die gefangenen Analytmoleküle nach dem Eluieren einer massenspektrometrischen Messung zum Bestimmen der Konzentrationsverhältnisse zuzuführen. Bei dieser Art des Fangens geht zwar die feld- oder zellenbasierte Unterscheidung verloren, wie sie bei Chiparrays vorliegt und wie man sie für einen substanzblinden Bindungsnachweis durch Fluoreszenz, Plasmonenresonanz oder SAW braucht. Die Massenspektrometrie kann aber verschiedenartige Proteine oder Proteinabkömmlinge, die sich nach Eluieren von den Fängermolekülen in der selben Probe befinden, anhand der verschiedenen Massen getrennt nachweisen und dabei sogar ihre Identität mit hoher Zuverlässigkeit sicherstellen.

Die Nanopartikel haben vorzugsweise Durchmesser von etwas unter einem Mikrometer; diese können dann Suspensionen in Flüssigkeiten bilden, die sich über lange Zeit schwebend erhalten. Ein Milligramm der Nanopartikel hat eine Oberfläche von mehreren Zehn Quadratzentimetern, also eine Fläche, die leicht mehr als tausendmal größer ist als die einer groß gewählten Chiparrayfläche. Es ist darüberhinaus ein unschätzbarer Vorteil der Nanopartikel, durch reines Pipettieren der Suspension in ihrer Menge dem analytischen Problem angepasst werden zu können. Man spricht dabei von einem „skalierbaren" Verfahren. Die Suspensionen können in angepassten Konzentrationen kleineren wie größeren Probenvolumina zugefügt werden. Verwirbelndes Umrühren oder Schwenken führt zu einem extrem guten Kontakt und zu einem relativ schnellen Fangen der Analytmoleküle. Magnetisierbare Nanopartikel von beispielsweise 900 Nanometer Durchmesser können anschließend durch ein inhomogenes Magnetfeld an der Wand des Probengefäßes festgehalten werden, um die Probenflüssigkeit gegen eine Waschflüssigkeit, nach genügendem Waschen gegen eine geringe Menge an Elutionsflüssigkeit auszutauschen. Diese wird der massenspektrometrischen Analyse zugeführt. Die Partikel können aber auch leicht ausfiltriert oder durch Zentrifugieren sedimentiert werden, dann sind auch nichtmagnetisierbare Partikel verwendbar.

Das Verfahren ist automatisch mit einer Aufkonzentration der gewünschten Proteine verbunden, die viele Zehnerpotenzen betragen kann. Beträgt beispielsweise das Probenvolumen 100 Milliliter, und werden die Nanopartikel mit nur zehn Mikrolitern eluiert, so steigt die Konzentration um vier Zehnerpotenzen.

Für das Fangen verschiedenartiger Proteine können Nanopartikel mit verschiedenartigen Belegungen, jeweils spezifisch für ein zu fangendes Protein, in Mischung verwendet werden, aber auch Nanopartikel mit gemischter Belegung. Die Mischungen können leicht dem analytischen Problem angepasst werden.

Für das Fangen verschiedener Proteinabkömnlinge desselben Proteins können entweder monoklonale Antikörper oder polyklonale Antikörper verwendet werden. Auch Mischungen spezifischer Antikörper für verschiedene Formen des Proteins sind einsetzbar. Werden die Proteinabkömmlinge vom selben Antikörper gefangen, so ist die Massenspektrometrie das einzige Nachweissystem, das eingesetzt werden kann. Chiparrays versagen hier völlig. Statt der Antikörper können auch andere, spezifisch affinitätsbindende Moleküle verwendet werden, beispielsweise Peptide mit besonderem Design, das heute computergestützt berechnet werden kann, oder andere spezifisch wirksame Interaktionspartner, wie Lektine, Metallchelate zur Phosphatbindung (IMAC), Protein Nucleic Acids (PNAs), Oligonukleotide, Inhibitoren, Rezeptorenm, Liganden und andere.

Durch die Verwendung einer Mischung von nichtmagnetisierbaren und magnetisierbaren Nanopartikeln, die jeweils mit spezifischen Affinitätsfängermolekülen belegt sind und getrennt von der Probenflüssigkeit separiert und anschließend in verschiedenen Verhältnissen gemischt werden können, lässt sich das Konzentrationsverhältnis an den dynamischen Messbereich des Massenspektrometers anpassen.

Besonders günstige Ausführungsformen

Es werde zunächst ein Verfahren beschrieben, das die Vorteile einer Verwendung der Massenspektrometrie besonders heraushebt: es handelt sich dabei um die Verhältnisbestimmung für verschiedene Abkömmlinge eines einzigen Proteins in einem Lebewesen oder einem Teil eines Lebewesens, wobei die verschiedenen Abkömmlinge gemeinsam mit nur einer Art von Antikörpern oder einer Art anderer Affinitätsfängermoleküle aus einer flüssigen Probe gefischt werden können. Die flüssige Probe kann direkt eine Körperflüssigkeit sein oder sie kann als Zelllysat aus einem Gewebe hergestellt sein. Die Probe kann von Mensch, Tier, Pflanze, Einzellern oder Viren stammen. Das Verhältnis kann charakteristisch für einen bestimmten Krankheits- oder Stresszustand des zugehörigen Lebewesens sein; man spricht dann von einem „Biomarker".
Bei den verschiedenen Abkömmlingen des Proteins kann es, wie bereits oben beschrieben, um verschiedene posttranslationale Modifikationen wie Phosporylierung oder Glykosylierung handeln, aber auch um verschiedenartige genetische Mutationen, die sich in einer Änderung der Aminosäurensequenz im Kettenmolekül darstellt. Auch verschiedene Splice-Varianten werden hier als Abkömmlinge bezeichnet. Solange die Mutation nicht das Bindungsmotiv, das so genannte „Epitop", ändert, werden die mutierten Formen, die so genannten „Mutanten", in gleicher Weise gefangen wie der so genannte „Wildtyp". Entsprechendes gilt für die Modifikationen, die meist keine Veränderung des bindenden Epitops bewirken. Die Unterscheidung, welche Modifikation oder Mutation vorliegt, obliegt dann der sowohl quantifizierenden wie auch hier qualifizierenden massenspektrometrischen Analyse, die für die verschiedenen Modifikationsformen, Mutationsformen oder Splice-Varianten verschiedene Massen misst. (Genauer: es werden in einem Massenspektrometer stets nur verschiedene Verhältnisse von Masse zu Ladung gemessen; da jedoch die hier meist verwendete Ionisierung durch matrixunterstütze Laserdesorption (MALDI) gewöhnlich nur einfach geladene Ionen liefert, wird im Folgenden immer nur von „Masse" gesprochen).
Wir sprechen hier von verschiedenen Abkömmlingen des Proteins im Sinne der Erfindung auch dann, wenn es sich um erste Stufen eines metabolischen Abbaus (Ubiquitinylierung, enzymatischer Abbau) von Proteinen handelt, solange das bindende Epitop noch unversehrt ist. Diese ersten Abbaustufen sind in einigen Fällen sehr interessante Biomarker, da fehlgelei teter Abbau zu dramatisch pathogenen Produkten führen kann, wie man bei BSE oder Alzheimer-Krankheit festgestellt hat.
Um also die Konzentrationsverhältnisse verschiedener Proteinabkömmlinge in einer flüssigen Probe zu messen, wird der Probe eine festgelegte Menge einer Suspension mit Nanopartikeln zupipettiert, wobei die Nanopartikel mit Fängermolekülen belegt sind. Die Nanopartkel sind vorzugsweise magnetisierbar. Es haben sich Suspensionen aus magnetisierbaren Nanokügelchen („magnetic beads") mit 900 Nanometern Durchmesser bereits für andere Anwendungen bestens bewährt; Suspensionen dieser Kügelchen bleiben lange brauchbar. Die Fängermoleküle können beispielsweise monoklonale Antikörper oder Moleküle ähnlicher Spezifität sein. Es ist dabei darauf zu achten, dass die Nanopartikel für keine der zu messenden Proteinabkömmlinge bis zur Sättigung belegt werden.
Die flüssige Probe wird mit der Suspension innig vermengt und in leichter Bewegung gehalten, um alle gelösten Analytmoleküle mit den Fängermolekülen in Berührung zu bringen.
Anschließend werden die Partikelchen von der Flüssigkeit separiert. Magnetisierbare Partikelchen können beispielsweise durch einen starken Permanentmagneten an die Wand des Gefäßes gezogen werden. Das Gefäß sollte zu diesem Zweck nicht allzu ausgedehnt sein, da die Magnetwirkung sich nur über etwa fünf bis zehn Millimeter erstreckt. Auch hier hilft ein vorsichtiges Rühren oder Schwenken, um alle Partikel langsam in den Wirkungsbereich des Magneten zu bringen und so schließlich in Büscheln an der Wand einzufangen. Für Gefäße mit größeren Volumina kommen Formen in Betracht, die in einer Dimension eher dünn sind. Für noch größere Volumina kann ein Zentrifugieren oder ein Filtern angewendet werden. Es können auch die Flüssigkeiten durch einen Schlauch über den Magneten geführt werden.
Die wandverhafteten oder sedimentierten Partikelansammlungen werden dann durch Abgießen oder Pipettieren von der Probenlösung befreit, und es wird eine Waschflüssigkeit zugegeben. Die Partikel werden durch Entfernen des Magneten und durch Umrühren gewaschen. Der Waschvorgang kann erforderlichenfalls mehrmals wiederholt werden. Zuletzt wird der weitgehend flüssigkeitsfreien Partikelansammlung eine Eluierungsflüssigkeit zugegeben, die die Proteine von den Antikörpern oder den andersartigen Fängermolekülen trennt. Solche Eluierungsflüssigkeiten sind in der Regel scharfe, polare organische Lösungsmittel wie Aceton, Acetonitril oder Alkohole. Die Eluierungsflüssigkeiten mit den Proteinen werden dann der massenspektrometrischen Messung zugeführt.
Als Massenspektrometer können sowohl solche mit MALDI-Ionenquellen wie auch mit Elektrosprühionenquellen (ESI) zur Anwendung kommen. Im Falle von MALDI-Massenspektrometern wird das Eluat mit einer geeigneten Matrix versetzt und auf einem Probenträger eingetrocknet. Die feste Probe auf dem Probenträger wird dann in der Ionenquelle des Massenspektrometers mit Laserlichtblitzen beschossen; die entstehenden Ionen werden nach Massen getrennt in einem Ionendetektor nachgewiesen und der Menge nach gemessen. Einem Massenspektrometer mit Elektrosprühionenquelle (ESI) kann das Eluat entweder direkt oder aber nochmals über einen Chromatographen aufgetrennt dem Massenspektrometer zugeführt und gemessen werden. Auch bei einer Ionisierung durch MALDI kann eine chromatographische Trennung vorgeschaltet werden.
Im Falle der Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) können die Partikelchen auch direkt auf eine Probenträgerplatte aufgebracht werden. Sie können dort mit einer Matrixlösung versehen und dann eingetrocknet werden. Die Matrixlösung wirkt dabei wie eine Eluierungslösung, es entstehen Kristalle mit eingeschlossenen Proteinen.
In beiden Fällen (MALDI und ESI) ergeben Messungen der Masse und der Intensität die gewünschten Ausgangswerte für die Identitätssicherung und die Bestimmung des Verhältnisses. Es kann dabei notwendig sein, das Verhältnis mit Kalibrierlösungen bekannter Verhältnisse zu kalibrieren. Die restliche Probenflüssigkeit kann mit einer frischen (oder auch wiedergewonnen) Partikelsuspension auf restliche Proteinmoleküle geprüft werden. Treten hier noch Proteinmoleküle auf, so kann das ein Hinweis auf eine Sättigung im ersten Fangschritt sein. Das Auftreten der Sättigung stört die Bestimmung des Konzentrationsverhältnisses.
Handelt es sich bei den posttranslationalen Modifikationen um Glykosylierungen, so kann massenspektrometrisch eine Längenverteilung der Glykogruppen gemessen werden. Die Längenverteilungen können sehr charakteristisch für den Stresszustand des Lebewesens sein. Man kann jedoch auch die Glykogruppen bis auf die Basisgruppe durch eine Glykosidase abspalten und somit nur ein Verhältnis von glykosylierten zu nichtglykosylierten Proteinen messen.
Eine andere Ausführungsform des Verfahrens bezieht sich auf die Messung der Konzentrationsverhältnisse zweier oder mehrerer verschiedener Proteine, beispielsweise mehrerer Interleukine im Plasma, die über den Belastungszustand eines Körpers durch verschiedenartige Entzündungen Auskunft geben. Dazu werden Gemische von Partikelsuspensionen verwendet, die Partikel mit verschiedenartigen Fängermolekül-Belegungen enthalten. Die verschiedenartigen Belegungen können sich aus verschiedenartigen Partikeln zusammensetzen, die jeweils mit einem Fängermolekültyp belegt sind, sie können aber auch gleichartige Partikel mit Mischbelegungen enthalten. Hat man mehrere Partikelsuspensionen mit reinen Fängermolekül-Belegungen, so kann man sich daraus leicht beliebige Mischungen herstellen.
Das weitere Vorgehen gleicht dem des oben geschilderten Verfahrens: Zugeben der Suspension, Rühren, Abheben der Probenflüssigkeit nach Sammeln der Partikel, Waschen, Eluieren, massenspektrometrische Messung, Bestimmung des Verhältnisses oder der Verhältnisse.
Die Besonderheit bei der Messung von Konzentrationsverhältnissen der diagnostisch sehr interessanten Interleukine besteht darin, dass diese sehr niederkonzentriert im Plasma vor kommen. Es müssen die Interleukine aus etwa 100 Milliliter Plasma herausgefischt werden, um jeweils eine Menge zu bekommen, die die massenspektrometrische Nachweisgrenze überschreitet. Dieses Fischen gelingt überhaupt nur erfolgreich mit dem hier vorgestellten erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Partikelsuspensionen können durch Waschen der Partikel in Eluierungsflüssigkeit wieder reaktiviert werden. Da Antikörper sehr teuer sind, ist eine Wiedergewinnung lohnend.
Sind in dem Eluat Konzentrationsverhältnisse zu messen, die den dynamischen Messbereich des Massenspektrometers übersteigen, so kann ein besonders Verfahren verwendet werden, bei dem magnetisierbare und nichtmagnetisierbare Nanokügelchen gemischt eingesetzt werden. Die beiden Sorten von Nanopartikeln haben verschiedene Belegungen mit Fängermolekülen für verschiedene Sorten von Analytmolekülen. Nach dem Fischen können die magnetisierbaren Partikelchen durch ein Magnetfeld von den nichtmagnetisierbaren Partikelchen getrennt werden, wodurch es möglich wird, das Mischungsverhältnis der Partikelsorten, und damit das Verhältnis der beiden gefangenen Sorten von Analytmolekülen in weitem Umfang so zu ändern, dass die Analytmoleküle beider Sorten, deren Verhältnis gemessen werden soll, in den Messbereich des Massenspektrometers zu bringen.
Ein Beispiel möge das erläutern: Es soll das Konzentrationsverhältnis zweier Proteine α und β in einer Blutplasmalösung bestimmt werden, wobei das Protein α in der Plasmalösung erwartungsgemäß etwa 10000 mal konzentrierter ist als Protein β. Es werden 100 Milliliter der Plasmalösung mit je einem Milliliter einer Suspension A und B versetzt. Die Suspension A enthält nichtmagnetisierbare Partikelchen mit Fängermolekülen für das Protein α, die Suspension B enthält magnetisierbare Kügelchen mit Fängermolekülen für das Protein β. Nach der affinen Bindung der Proteine α und β werden zunächst die magnetisierbaren Kügelchen der Suspension B durch einen starken Magneten absepariert, gewaschen und in einer weiteren Waschflüssigkeit resuspensiert. Die restliche Lösung mit den Partikelchen der Suspension A wird jetzt durch Zentrifugieren von den Partkelchen befreit; diese Partikelchen werden dann in 100 Millitern einer Waschflüssigkeit resuspensiert. Aus dieser Lösung mit den suspensierten Partikelchen A werden nun 10 Mikroliter herauspipettiert und der Waschflüssigkeit mit den Partikelchen B zugegeben. Die Partikelchen werden jetzt gemeinsam auszentrifugiert; die Elution der Proteinen von dieser Partkelmischung sollte nun ein Verhältnis der Proteine α und β in einem Verhältnis von nur noch 1:1 erwarten lassen. Eine Abweichung davon kann für die Bestimmung des originalen Verhältnisses verwendet werden. Das Verhältnis 1:1 kann massenspektrometrisch, möglicherweise nach einer Kalibration, optimal gut gemessen werden.
Es konnen auch die Proteine von den beiden Arten von Nanopartikeln getrennt eluiert werden, und erst die Eluatflüssigkeiten im gewünschten Verhältnis gemischt werden.
Für eine massenspektrometrische Bestimmung der Konzentrationsverhältnisse ist es in aller Regel notwendig, wie oben schon erwähnt, die verschiedenartigen Ionisierungswahrscheinlichkeiten durch eine Kalibrierung mit bekannten Verhältnissen zu bestimmen. Diese Techniken, die beispielsweise auch mit isotopenmarkierten Proteinen durchgeführt werden können, sind aber dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, so dass sich eine eingehende Beschreibung erübrigt.

Claims

Verfahren zur Messung von Konzentrationsverhältnissen verschiedener Proteine oder verschiedener Proteinabkömmlinge eines Proteins in einer Lösung, folgende Schritte umfassend: (a) der Lösung werden Nanopartikel beigegeben, die mit Fängermolekülen für die zu untersuchenden Proteine oder Proteinabkömmlinge belegt sind, worauf sich die Proteine oder Proteinabkömmlinge affin an die Fängermoleküle binden, (b) die Nanopartikel werden von der Lösung separiert, (c) die Proteine oder Proteinabkömmlinge werden von den Nanopartikeln eluiert, (d) das Eluat wird der massenspektrometrischen Messung zugeführt, und (e) aus den Ergebnissen der massenspektrometrischen Messung werden die gesuchten Konzentrationsverhältnisse der Proteine oder Proteinabkömmlinge bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel der Lösung in einer Suspension beigegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Fängermoleküle auf den Nanopartikeln Antikörper oder synthetische spezifisch bindende Moleküle, Lektine, Metallchelate, Protein Nucleic Acids, Oligonukleotide, Inhibitoren, Rezeptoren oder Liganden verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel in Schritt (b) durch Filtrierung, durch Zentrifugieren, Sedimentation oder, im Falle von magnetisierbaren Nanopartikeln, durch die Anwendung eines Magnetfeldes von der Lösung separiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass dem Schritt (b) ein oder mehrere Schritte mit Waschvorgängen für die separierten Nanopartikel folgen.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass für die Bestimmung des Konzentrationsverhältnisses mehrerer Proteine eine Mischung von Nanopartikeln verwendet wird, die jeweils mit Fängermolekülen für eines der Proteine belegt sind.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass für die Bestimmung des Konzentrationsverhältnisses zweier Proteine, die ein sehr großes Konzentrationsverhältnis haben, eine Mischung von nichtmagnetisierbaren und magnetisierbaren Nanopartikeln mit Fängermolekülen für je eines der Proteine verwendet wird, dass die magnetisierbaren und die nichtmagnetisierbaren Nanopartikel getrennt aus der Lösung separiert werden, und dass die beiden Arten der Nanopartikel oder deren Eluate in einem solchen Verhältnis gemischt werden, dass das resultierende Konzentrationsverhältnis der beiden Proteine im dynamischen Messbereich des Massenspektrometers liegt.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere interne Kalibranten für ein oder mehrere Proteine oder Abkömmlinge zugegeben werden, wobei die Kalibranten von den Proteinen oder Abkömmlingen unterscheidbare Massen aufweisen, wobei die Zugabe vor der Bindung an die Nanopartikel oder nach der Elution erfolgen kann.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Eluat vor der massenspektrometrischen Messung einer chromatographischen oder elektrophoretischen Trennung seiner Bestandteile unterzogen wird.