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Die
vorliegenden Erfindung betrifft das Gebiet von Testgeräten oder
Testsystemen, umfassend deren Komponenten, zur Verwendung bei der
Detektion eines oder mehrerer Analyten in einer Probe sowie ein
Verfahren für
die Verwendung der Vorrichtung oder der Komponente und Verfahren
zur Detektion eines Analyten unter Verwendung der Vorrichtung. Die
Erfindung trifft insbesondere solche Vorrichtungen und solche Verfahren,
bei denen das Fließen
von Flüssigkeiten
gesteuert wird.
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Hintergrund
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Analytische
und diagnostische Bestimmungen werden häufig an flüssigen Proben durchgeführt, welche
zusätzlich
zu dem Analyten, der von Interesse ist, weiterhin zahllose andere
Komponenten, in Lösung
und/oder in partikularer Form, umfassen, welche oft die Behandlung
der Probe behindern und welche die quantitative oder qualitative
Bestimmungen des Analyten beeinflussen können.
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Zahlreiche
klinische Diagnoseverfahren basieren beispielsweise auf der Detektion
eines Analyten in einer biologischen Probe. Häufig wird eine solche Detektion
in einer verfügbaren
Testvorrichtung erreicht, wodurch eine schnelle und einfache Diagnose
ermöglicht
wird. Eine wichtige Anwendung ist das große Gebiet der Immunologie,
wobei Analyten mit Hilfe von spezifischen Antikörpern detektiert werden, welche
in der Lage sind, sich an die Analyten zu binden und detektierbare
Komplexe zu bilden, normalerweise mit Hilfe von Liganden, welche
die Detektion fördern.
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Beim
Durchführen
eines Tests unter Verwendung einer biologischen Probe von einem
Patienten, insbesondere einer Blutprobe, müssen viele Faktoren beachtet
werden. Vollblut neigt dazu, zu gerinnen, zu reduzieren oder das
gewünschte
Fließen
der Probe in der Testvorrichtung zu verhindern. Rote Blutkörperchen
können das
Fließen
verhindern oder verzögern,
selbst wenn keine Gerinnung auftritt. Weiterhin können rote
Blutkörperchen
das Binden zwischen spezifischen Bindungspaarelementen verhindern.
Rote Blutkörperchen
besitzen außerdem
enzymatische Aktivität,
welche, in Abhängigkeit
von dem verwendeten Test, das produzierte Signal beeinträchtigen
kann.
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Leider
streuen und absorbieren in Vollblut vorhandene rote Blutkörperchen
Licht und behindern dadurch Testmethodiken, welche entweder reflektiertes
oder transmittiertes Licht messen. Auch andere Zellen können spezielle
Bestimmungen beeinträchtigen;
beispielsweise können
Cholesterin Untersuchungen durch in Zellmembranen vorhandenes Cholesterin
beeinflusst werden.
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Weiterhin
nimmt Dickblut ein beträchtliches Volumen
der Probe ein, in manchen Fallen die Hälfte des Volumens. Es ist wichtig
zu beachten, dass dieser Anteil, der auch Hämatokrit genannt wird, zwischen
verschiedenen Individuen und selbst bei demselben Individuum zwischen
verschiedenen Messungen variieren kann. Dies wiederum kann die Genauigkeit
und/oder die Wiederholbarkeit der Bestimmungen beeinflussen.
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Deswegen
umfassen viele Tests einen Schritt des Separierens der roten Blutkörperchen vom
Plasma, wonach der Test am Plasma oder am Serum durchgeführt wird.
Wenn die Separation vor der Gerinnung durchgeführt wird, wird Plasma erhalten.
Wenn die Gerinnung vor der Separation stattgefunden hat, wird Serum
erhalten.
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Die
roten Blutkörperchen
können
vom Plasma durch Zentrifugieren getrennt werden, wozu jedoch ein
relativ großes
Probenvolumen und die Verwendung einer Zentrifuge erforderlich ist.
Dies ist auch zeitaufwändig
und bildet einen weiteren Schritt der Behandlung der Probe, wodurch
Kosten und Komplexität
erhöht
werden, und welches insbesondere dann vermieden werden sollte, wenn
potentiell ansteckende, durch Blut übertragbare Krankheitserreger
beteiligt sind. Weiterhin steigt das Risiko, dass eine Probe durch
Individuen, die diese handhaben, kontami niert wird, sowie das Risiko
einer Kreuzkontamination durch eine parallele Probe oder eines Verwechselns
mit anderen Proben.
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Das
vorstehend mit Bezug auf Vollblutproben und rote Blutkörperchen
Gesagte trifft, mit notwendigen Anpassungen, auch auf andere biologische
Proben zu, in denen Zellen, Zelltrümmer, Fasern oder andere unerwünschte Partikel
die Bestimmung beeinträchtigen
können
und deshalb vorzugsweise vor oder während der Reaktion oder Bestimmung,
die zu der Detektion des Analyten führt, separiert werden sollten.
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Der
gebräuchlichste
Typ einer verfügbaren Testvorrichtung
besteht aus einer Zone oder einem Gebiet zum Aufnehmen der Probe,
einer Reaktionszone, und optional einer Transport- oder Inkubationszone,
welche die Aufnahme und die Reaktionszone verbindet. Diese Testvorrichtungen
sind als Chromatographie-Testvorrichtungen bekannt oder werden einfach
als Streifentests bezeichnet. Diese verwenden ein poröses Material,
welches einen Weg zum Fließen
der Flüssigkeit
definiert, und welches in der Lage ist, kapillares Fließen zu unterstützen, z.
B. ein Filtermaterial. Die Probenaufnahmezone besteht oft aus einem
poröseren
Material, welches in der Lage ist, die Probe zu absorbieren, und,
wenn die Separation von Blutzellen gewünscht ist, wirksam rote Blutkörperchen
abfangen kann. Beispiele solcher Materialien sind faserige Materialien,
wie z. B. Papier, Vlies, Gel oder Gewebe, bestehend z. B. aus Zellulose, Wolle,
Glasfasern, Asbest, synthetischen Fasern, Polymeren oder Mischungen
derselben. Die Transport- oder Inkubationszone besteht gewöhnlich aus den
selben oder ähnlichen
Materialien, häufig
mit einer anderen Porosität
als die Probenaufnahmezone. Gleichermaßen besteht die Reaktionszone,
welche in die Inkubationszone integriert sein kann oder den äußersten
Teil davon bilden kann, in der Regel aus ähnlichen absorbierenden, faserigen
Materialien, oder aus beliebigen vorstehend aufgelisteten Materialien.
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In
einer herkömmlichen
Testvorrichtung oder einem Streifentest ist/sind das/die poröse/n Material/ien
auf einen Träger
montiert, z. B. einen Streifen aus thermo plastischem Material, Papier,
Karton oder dergleichen. Weiterhin kann eine Abdeckung vorgesehen
sein, wobei die Abdeckung zumindest eine Öffnung zum Aufnehmen der Probe
umfasst, und eine Öffnung
oder einen transparenten Bereich zum Lesen des Resultats des Tests.
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Häufig werden
auch Nitrozellulose-Materialien als die Matrix verwendet, die die
Transport- oder Reaktionszone bildet, welche die Aufnahmezone und die
Reaktionszone verbindet. Ein signifikanter Nachteil von Nitrozellulose
ist deren hohe nicht spezifische Bindung von Proteinen und anderer
Biomoleküle. Derzeitige
Teststreifen jedoch behandeln oft einen Überschuss an Probe, wodurch
der Einfluss dieser Bindung reduziert wird. Es ist jedoch wünschenswert, das
Probenvolumen zu minimieren, im Einklang mit der Tendenz, den gesamten
Test zu miniaturisieren, umfassend ein Minimieren der Menge von
Reagenzien, ohne Genauigkeit und Zuverlässigkeit zu beeinträchtigen.
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Stand der Technik
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EP 1 371 984 offenbart eine
Chromatographie-Testvorrichtung und ein Verfahren zum Detektieren
der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe von Vollblut, wobei
ein Wirkstoff zum Separieren der roten Blutkörperchen verwendet wird, um
rote Blutkörperchen
zu aggregieren und dem Plasma oder Serum zu ermöglichen, durch Kapillarwirkung
zu fließen.
Das Trägermaterial
ist exemplarisch als ein Papier (porös), oder Membranen aus Zellulose,
Glaswolle, Stoff, sowohl natürlich
vorkommend als auch synthetisch, sowie als poröses Gel angegeben.
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Obwohl
häufig
benutzt und im Stand der Technik wohl bekannt, sind vorstehende
Trägermaterialien
mit vielen Nachteilen verbunden. Die Struktur der Materialien wird
stets zwischen verschiedenen Chargen, und auch innerhalb des Materials,
Variieren aufgrund der zufälligen
Verteilung der Fasern z. B. in faserigem Material, oder der Kavitäten, z.
B. in einem gelartigen Material. In ähnlicher Weise werden die chemischen
Eigenschaften des Materials, z. B. die Verteilung von Chemikalien,
die dem Material zugegeben werden, notwendiger Weise aus den gleichen Gründen wie
oben variieren.
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WO 03/103835 offenbart
Mikroströmungssysteme,
welche ein Substrat umfassen, und, vorgesehen auf dem Substrat,
zumindest ein Fließweg,
der mit funktionalen Einrichtungen verbunden ist, in welchen flüssige Proben
verschiedenen gewünschten Prozeduren
unterworfen werden können,
wobei der Fließweg
eine Mehrzahl von Mikrostäben
umfasst, die aus dem Substrat hervorstehen.
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die in
WO 03/103835 offenbarten Mikroströmungssysteme
weiter zu entwickeln, und insbesondere, Einrichtungen zum Steuern
oder Regulieren des Fließens
bereit zu stellen, umfassend ein Fördern oder ein Vermindern des
Fließens
flüssiger
Proben, Reagenzien oder anderer Komponenten auf dem Substrat.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt Vorrichtung zur Detektion eines Analyten
in einer flüssigen
Probe bereit, oder eine Komponente einer solchen Vorrichtung, wobei
die Vorrichtung einen Fließpfad
mit zumindest einer Zone zum Aufnehmen der Probe und eine Transport-
oder Inkubationszone umfasst, wobei die Zonen durch einen Bereich
verbunden sind oder einen Bereich umfassen, welcher Vorsprünge im Wesentlichen
senkrecht zu seiner Oberfläche
umfasst, wobei die Vorrichtung weiterhin eine Auffangzone mit einer
Kapazität
zum Aufnehmen und/oder Absorbieren der flüssigen Probe und zum Unterstützen oder Steuern
der Fließgeschwindigkeit
der Probe durch die Transport- oder Inkubationszone umfasst, wobei die
Auffangzone einen Bereich mit Vorsprüngen im Wesentlichen vertikal
zu seiner Oberfläche
umfasst, und wobei die Auffangzone eingerichtet ist, auf einen exter nen
Einfluss zu reagieren, der ihre Kapazität zum Aufnehmen der flüssigen Probe
reguliert.
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Die
Erfindung umfasst auch Ausführungsformen
der Vorrichtung und ein Verfahren, wie sie in der Beschreibung und
den Ansprüchen
dargelegt sind.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die
Erfindung wird in der folgenden Beschreibung, in Beispielen und
in den angefügten Zeichnungen
näher beschrieben.
Darin zeigen
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1 schematisch
einen Querschnitt einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei eine
Einrichtung zum Erhitzen eine Verdunstung einer Flüssigkeit an
einem Ende hervorruft, wodurch der Fluss entlang des Fließweges der
Vorrichtung vorangetrieben wird;
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2 schematisch
eine Draufsicht auf eine erfindungsgemäße Vorrichtung, wobei die Erwärmung in
Zonen durchgeführt
wird, beginnend mit der Zone, die am weitesten ab von dem Punkt
liegt, an dem die Probe zugegeben wird;
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3 schematisch
eine Ausführungsform der
Erfindung, wobei zwei parallele Bestimmungen durchgeführt werden
können,
wobei die Fließgeschwindigkeit
und dadurch die Inkubationszeit individuell in den zwei Fließwegen eingestellt
ist;
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4 schematisch
eine andere Ausführungsform,
wobei Probe, Reagenzien und Puffer nacheinander zugegeben und in
gesteuerter Weise entlang eines Fließwegs transportiert werden
können;
und
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5 verschiedene
Ausführungsformen,
die illustrieren, wie der Übergang
von einem Fließweg
in einen anderen angeordnet sein kann: A) unter Verwendung ei nes
Unterschieds in der Geometrie der Mikrostäbe; B) unter Verwendung eines
Unterschieds in der Höhe
und der Abstände
der Mikrostäbe;
und C) unter Verwendung der Ausgestaltung der Verbindung zwischen
den Fließwegen.
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Beschreibung
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Definitionen
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Bevor
die vorliegende Vorrichtung und das vorliegende Verfahren beschrieben
werden, versteht es sich, dass die Erfindung nicht auf die speziellen Konfigurationen,
Verfahrensschritte und Materialien, die hierin offenbart sind, beschränkt ist,
da solche Konfigurationen, Schritte und Materialien etwas variieren
können.
Es versteht sich ebenso, dass die hierin verwendete Terminologie
allein zum Zwecke des Beschreibens spezieller Ausführungsformen
verwendet wird und nicht als beschränkend beabsichtigt ist, da
der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nur durch die angehängten Ansprüche und Äquivalente davon
beschränkt
sein wird.
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Es
muss ebenso beachtet werden, dass in dieser Beschreibung und den
angehängten
Ansprüchen
verwendete Singularformen "ein", "eine", "eines" und "der", "die", "das" entsprechende Pluralformen
umfassen, wenn nicht der Kontext eindeutig Anderes vorschreibt.
Daher umfasst z. B. ein Bezug auf eine Reaktionsmischung, die "einen monoklonalen Antikörper" umfasst, eine Mischung
von zwei oder mehr Antikörpern.
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Der
Begriff "etwa", wenn er im Zusammenhang
mit numerischen Werten benutzt wird, bezeichnet ein Genauigkeitsintervall,
welches dem Fachmann bekannt und akzeptabel ist. Dieses Intervall kann ±10% oder
vorzugsweise ±5%
betragen.
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Beim
Beschreiben und Beanspruchen der vorliegenden Erfindung wird die
folgende Terminologie gemäß den hierin
dargelegten Definitionen benutzt werden.
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Der
Begriff "Probe" bedeutet hier eine
Menge einer Flüssigkeit,
Lösung
oder Suspension, welche beabsichtigt ist, einer qualitativen oder
quantitativen Bestimmung einer ihrer Eigenschaften unterworfen zu
werden, wie z. B. der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Komponente,
der Konzentration einer Komponente etc. Die Probe kann eine Probe
von einem Organismus sein , wie z. B. einem Säugetier, vorzugsweise einem
Menschen; oder aus der Biosphäre,
wie z. B. eine Wasserprobe oder ein Abfluss; oder aus einem technischen,
chemischen oder biologischen Prozess, wie z. B. einem Herstellungsprozess,
z. B. der Produktion von Medikamenten, Lebensmitteln, Futter, oder
der Reinigung von Trinkwasser oder der Behandlung von Abfallabflüssen. Die
Probe kann einer qualitativen oder quantitativen Bestimmung unterworfen
werden, oder z. B. nach geeigneter Vorbehandlung, wie z. B. Homogenisierung, Schallbehandlung,
Filterung, Sedimentation, Zentrifugieren, Wärmebehandlung etc.
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Typische
Proben im Kontext der vorliegenden Erfindung sind Körperflüssigkeiten,
wie z. B. Blut, Plasma, Serum, Lymphe, Urin, Speichel, Sperma, Magenflüssigkeit,
Auswurf, Tränen
etc.; Umweltflüssigkeiten,
wie z. B. Oberflächenwasser,
Grundwasser, Schlamm etc.; und Prozessflüssigkeiten, wie z. B. Milch,
Molke, Brühe,
Nährlösungen,
Zellkulturnährboden
etc. Die vorliegende Erfindung ist auf alle Proben anwendbar, jedoch
vorzugsweise auf Proben von Körperflüssigkeiten,
und besonders bevorzugt auf Vollblutproben.
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Die
Bestimmung, basierend auf einem Lateralfluss einer Probe und der
Interaktion von Komponenten, die in der Probe anwesend sind, mit
Reagenzien, die in der Vorrichtung anwesend sind, sowie die Bestimmung
einer solchen Interaktion, entweder qualitativ oder quantitativ,
kann jedem Zweck dienen, wie z. B. Diagnose-, Umwelt-, Qualitätskontroll-,
Regulierungs-, Forensik- oder Forschungszwecken. Solche Tests werden
oft als Chromatographietests oder Lateralflusstests ("lateral flow assay"), wie z. B. in Immunchromatographietests,
bezeichnet.
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Beispiele
von Diagnosebestimmungen umfassen, sind aber beschränkt auf,
die Bestimmung von Analyten, auch Marker genannt, die spezifisch für verschiedene
Fehlfunktionen sind, wie z. B. chronische metabolische Fehlfunktionen,
wie z. B. Blutzucker, Blutketone, Uringlukose (Diabetes), Blutcholesterin
(Arteriosklerose, Fettleibigkeit, etc.); Marker für andere
spezifische Krankheiten, z. B. akute Erkrankungen, wie z. B. Herzinfarktmarker
(z. B. Troponin-T), Marker für
Schilddrüsenfunktionen
(z. B. Bestimmung von Schilddrüsen
stimulierenden Hormonen TSH)), Marker für Virusinfektionen (die Verwendung
von Lateralflussimmuntests für
die Detektion von spezifischen viralen Antikörpern); etc.
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Ein
anderes wichtiges Gebiet von Diagnosebestimmungen betrifft Schwangerschaft
und Fertilität,
z. B. Schwangerschaftstests (Bestimmen von u. a. humanem Choriongonadotropin
(hCG)), Ovulationstests (Bestimmung von u. a. luteinisierendem Hormon
(LH)), Fertilitätstests
(Bestimmung u. a. von Follikel stimulierendem Hormon (FSH)) etc.
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Noch
ein anderes, wichtiges Gebiet ist das von Drogentests zur einfachen
und schnellen Detektion von Drogen und Drogenmetaboliten, welche
Drogenmissbrauch anzeigen; wie z. B. die Bestimmung von spezifischen
Drogen und Drogenmetaboliten (z. B. THC) in Urinproben etc.
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Der
Begriff "Analyt" ist als ein Synonym
zu dem Begriff "Marker" verwendet und vorgesehen, eine
beliebige Substanz zu umfassen, die quantitativ oder qualitativ
gemessen wird.
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Die
Begriffe "Zone", "Bereich" und "Gebiet" werden im Zusammenhang
mit dieser Beschreibung, den Beispielen und den Ansprüchen benutzt,
um Teile des Fließwegs
auf dem Substrat zu definieren, entweder in Vorrichtungen nach dem
Stand der Technik oder in einer Vorrichtung gemäß der Erfindung.
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Der
Begriff "Reaktion" wird verwendet,
um eine beliebige Reaktion zu definieren, welche sich zwischen Komponenten
einer Probe und zumindest einem Reagenz oder Reagenzien auf oder
in dem Substrat ereignet, oder zwischen zwei oder mehr Komponenten,
die in der Probe vorhanden sind. Der Begriff "Reaktion" wird insbesondere benutzt, um die Reaktion
zu definieren, die sich zwischen einem Analyten und einem Reagenz
als Teil der qualitativen oder quantitativen Bestimmung des Analyten
ereignet.
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Der
Begriff "Substrat" bedeutet hier den
Träger
oder die Matrix, welcher der Probe zugegeben wird, und auf bzw.
in welchem die Bestimmung durchgeführt wird, oder wo die Reaktion
zwischen Analyt und Reagenz stattfindet.
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Der
Begriff "chemische
Funktionalität" umfasst eine beliebige
chemische Verbindung oder Teil, die notwendig sind zum Durchführen oder
Erleichtern des Tests. Eine Gruppe von chemischen Verbindungen mit
spezieller Relevanz für
die vorliegende Erfindung sind Verbindungen oder Komponenten, die
eine spezifische Affinität
für oder
eine Fähigkeit
zur Bindung oder Interaktion mit einer oder mehreren Komponenten
in der Probe aufweisen. Agenzien zum Separieren roter Blutkörperchen
bilden ein illustratives Beispiel. Solche Agenzien können beliebige
Substanzen sein, die in der Lage sind, rote Blutkörperchen
zu aggregieren oder zu binden.
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Der
Begriff "biologische
Funktionalität" umfasst alle biologischen
Interaktionen zwischen einer Komponente in einer Probe und einem
Reagenz auf oder in dem Substrat, wie z. B. Katalyse, Bindung, Internalisierung,
Aktivierung oder andere biospezifische Interaktionen. Geeignete
Reagenzien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Antikörper, Antikörperfragmente
und Derivate, Einzelkettenantikörper,
Lektine, DNA, Aptamere, etc., umfassend andere Polymere oder Moleküle mit Bindungskapazitäten. Solche
Reagenzien können
durch den Fachmann identifiziert werden, nachdem die Wahl der zu
separierenden Komponente getroffen ist, unter Benutzung von Standardexperimenten,
z. B. Screeningverfahren und chemischen Bibliotheken.
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Der
Begriff "physikalische
Funktionalität" umfasst hier Funktionalitäten, die
in Reaktionen und Interaktionen verschieden von denen, die hauptsächlich chemisch
oder biologisch sind, involviert sind. Beispiele umfassen Durchmesser,
Höhe, Form, Querschnitt,
Oberflächentopographie
und Oberflächenmuster,
die Anzahl von Vorsprüngen
pro Einheitsgebiet, Befeuchtungsverhalten der Oberfläche der
Vorsprünge
oder Kombinationen daraus, und/oder andere Funktionalitäten, die
das Fließen, die
Retention, die Adhäsion
oder die Abstoßung
von Komponenten der Probe beeinflussen.
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Die
Unterscheidungen zwischen chemischen, biologischen und physikalischen
Interaktionen sind nicht immer klar, und es ist möglich, dass eine
Interaktion – wie
z. B. eine Interaktion zwischen einer Komponente in einer Probe
und einem Reagenz auf dem Substrat – chemische, biologische sowie
physikalische Elemente mit einbezieht.
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Die
Begriffe "hydrophil" und "hydrophob", wie in hydrophile
oder hydrophobe Verbindungen, hydrophile oder hydrophobe Interaktionen
etc., haben die normalerweise vom Fachmann verstandene Bedeutung
und entsprechen den Begriffen, die normalerweise in anerkannten
Lehrbüchern
verwendet werden.
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Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung zur Handhabung flüssiger Proben
bereit, wobei die Vorrichtung einen Fließweg mit zumindest einer Zone
zum Aufnehmen der Probe und einer Transport- oder Inkubationszone
umfasst, wobei die Zonen durch einen Bereich verbunden sind oder
einen Bereich umfassen, welcher Vorsprünge im Wesentlichen vertikal
zu seiner Oberfläche
besitzt, wobei die Vorrichtung weiterhin eine Auffangzone mit einer
Kapazität
zum Aufnehmen der flüssigen
Probe und zum Unterstützen
oder Kontrollieren der Fließgeschwindigkeit
der Probe durch die Transport- oder Inkubationszone umfasst, wobei
die Auffang zone einen Bereich umfasst, der Vorsprünge im Wesentlichen
senkrecht zu seiner Oberfläche
besitzt, und wobei die Auffangzone angepasst ist, auf einen externen
Einfluss zu reagieren, der ihre Kapazität zum Aufnehmen der Probe reguliert.
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Die
Vorrichtung gemäß der Erfindung
kann des Weiteren zwei oder mehr Fließwege umfassen, welche jeweils
mit einer Auffangzone verbunden sind, wobei die Vorrichtung angepasst
ist, mehrere Analysen an einer Probe durchzuführen. In diesem Fall umfasst
jeder Fließweg
eine Reaktionszone und individuelle Reagenzien, wie z. B. Konjugate
, Puffer etc. werden zu jedem Fließweg oder jeder Reaktionszone
zugegeben oder darin gespeichert. Eine Vorrichtung gemäß dieser
Ausführungsform
ist vorteilhaft, da diese es ermöglicht,
mehrere Analysen parallel oder im Wesentlichen parallel durchzuführen, beginnend
mit einer Probe, die zu der Vorrichtung zugegeben wird.
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Gemäß einer
Ausführungsform
werden mehrere Reagenzien, Puffer etc. hintereinander einem Fließweg zugegeben.
Dies bedeutet, dass sowohl Probe als auch Reagenz, Puffer, etc.
entlang des Fließwegs
wandern und die Reaktionszone in einer vorbestimmten Reihenfolge
passieren werden. Unter Verwendung der Auffangzone, und insbesondere
einer erwärmten
Auffangzone, kann die Fließgeschwindigkeit
jeder Komponente gesteuert werden. Dies ermöglicht es, z. B. eine Analyse
durchzuführen, welche
eine langsame Vorbehandlung, eine Inkubation einer vorbestimmten
Länge,
gefolgt von einem schnellen Spülen
etc. beinhaltet, um nur ein Beispiel zu nennen.
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Gemäß der Erfindung
wird der externe Einfluss, der die Kapazität der Auffangzone zum Aufnehmen
der flüssigen
Probe reguliert, ausgewählt
aus Erwärmung,
Kühlung,
Bestrahlung mit sichtbarem Licht, Infrarotbestrahlung, Vibration
und dem Anlegen eines elektrischen Stroms.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung ist die Auffangzone in Teilbereiche unterteilt, die geeignet
sind, hintereinander dem externen Einfluss unterworfen zu werden.
Dies ist vorteilhaft z. B. in solchen Fällen, in denen die Probe dazu
tendiert zu koagulieren, zu denaturieren oder in der Auffangzone während der
Erwärmung
einfach zu trocknen. Indem Bereiche der Auffangzone nacheinander
erwärmt werden,
beginnend mit dem fernsten, ist es möglich, die Aspirations- oder
Absorptionskapazität
der Auffangzone zu erhalten.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung betrifft die Bereitstellung einer Einrichtung oder
von Ausgestaltungsmerkmalen, welche eine bevorzugte Fließrichtung
innerhalb der Vorrichtung erzeugen. Eine solche Einrichtung oder
solche Maßnahmen
können vertikale
Vorsprünge
mit verschiedenen Querschnitten in verschiedenen Zonen des Fließweges,
verschiedene Abstände
zwischen Vorsprüngen,
verschiedene chemische oder biochemische Behandlung der Vorsprünge, eine
Differenz in der Höhe
der Fließwege,
wie z. B. das Ausbilden von Stufen oder Schwellen zwischen verschiedenen
Bereichen des Fließwegs
etc., umfassen.
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Die
Richtung des Flusses, z. B. das Verhindern eines unerwünschten
Rückflusses
der Probe, wird ausgewählt
aus einer geeigneten Ausgestaltung des Fließwegs, des Querschnitts der
im Wesentlichen vertikalen Vorsprünge, eines auf zumindest einem
Teil der Fließwege
einwirkenden externen Einflusses ausgewählt aus Erwärmung, Kühlung, Bestrahlung mit sichtbarem
Licht, Infrarotbestrahlung, Vibration und dem Anlegen eines elektrischen
Stromes oder einer Kombination daraus.
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen chemischen oder biochemischen
Test bereit, welcher eine Reaktion zwischen einem Analyten in einer
Probe und einem oder mehrerer Reagenzien beinhaltet, wobei die Probe
einer vorstehend definierten Vorrichtung zugegeben wird. Die Reaktion
zwischen dem Analyten und einem oder mehreren Reagenzien kann eine
beliebige, konventionelle Reaktion sein, die derzeit auf einem festen
Substrat oder in einem Trägermaterial
durchgeführt
wird. Dies beinhaltet auch Tests, bei denen eine Vorrichtung gemäß der Erfindung
für die
Vorbehandlung der Probe verwendet wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenso einen chemischen oder biochemischen
Test bereit, der eine Reaktion zwischen einem Analyten in einer
Probe und einem oder mehreren Reagenzien umfasst, wobei die Reaktion
selbst und/oder das Lesen des Resultats auf einer vorstehend definierten
Vorrichtung durchgeführt
wird.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Handhabung flüssiger Proben
bereit, wobei eine vorstehend definierte Vorrichtung verwendet wird.
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Die
Vorrichtung gemäß der Erfindung
wird vorteilhaft in analytischen Anwendungen verwendet, bei denen
die flüssige
Probe partikuläre
Substanzen umfasst, wie z. B. Zellen, Gewebetrümmer, organische oder anorganische
Substanzen, andere Verunreinigungen etc., welche von dem Hauptteil
der Probe separiert werden sollen. Eine wichtige Anwendung ist diejenige,
wenn die flüssige
Probe Vollblut ist, und in solchen Fällen beinhaltet der laterale
Kapillarfluss das Separieren von roten Blutkörperchen vom Plasma ohne signifikantes
Zerreißen
der Blutkörperchen.
Gemäß einer
Ausführungsform
wird ein solches Separieren im Allgemeinen, und insbesondere das
schonende Separieren von roten Blutkörperchen, in einem Gradienten
von Vorsprüngen
erreicht, wobei die Abstände über die
Länge der
Filterzone von etwa 7 μm
bis etwa 1 μm
abnehmen.
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Gemäß einer
Ausführungsform
bildet die Aufnahmezone ein Becken für Komponenten, die von dem
lateralen Fluss abgetrennt worden sind, z. B. partikulare Substanzen
oder Zellen, welche vom Passieren zwischen den Vorsprüngen abgehalten worden
sind, oder diesen Bereich nur zu einem begrenzten Grad erreichen.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform wandert
die partikulare Substanz mit dem lateralen Fluss. In Anwendungen,
bei denen die flüssige
Probe Vollblut ist, ist es wichtig, das der laterale Kapillarfluss
den Transport von roten Blutkörperchen
ohne signifikantes Zerreißen
der Blutkörperchen
umfasst. Dies wird durch die vorliegende Erfindung durch das Steuern
von einem oder mehrerer Parameter der Vorsprünge erreicht, wie z. B. der
Höhe, dem
Durchmesser und dem gegenseiti gen Abstand sowie durch die chemische
oder biochemische Derivatisierung der Vorsprünge.
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Der
Abstand zwischen den Vorsprüngen kann
abhängig
von der intendierten Verwendung und den Eigenschaften der flüssigen Probe
sowie von den Eigenschaften der zu transportierenden oder zu separierenden
Komponenten variiert werden und liegt vorzugsweise in dem Intervall
zwischen 1 und 100 μm,
besonders bevorzugt in dem Intervall zwischen 1 und 50 μm. Die Distanz
zwischen den Vorsprüngen
kann durch den Fachmann unter Beachtung dessen, für welche
Probe die Vorrichtung vorgesehen ist, der Eigenschaften der Probe
und der Eigenschaften der Komponenten, die zu separieren sind, gewählt werden.
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Die
Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung ist auf einem Kunststoffsubstrat aufgebaut, vorzugsweise
Thermoplastik, oder einem Substrat mit einer oberen Kunststoffschicht.
Diese kann wiederum beschichtet oder derivatisiert sein, z. B. unter Verwendung
von Techniken wie Sputtering, Aufdampfen oder dergleichen, und mit
einer Beschichtung aus Silikon, einem Metall oder einem anderen Material
versehen sein. Die vorliegende Erfindung kann ebenso aus Siliziumsubstraten
hergestellt sein. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
wird dem Substrat eine hydrophile Behandlung oder Beschichtung gegeben,
z. B. indem das Substrat einer oxidativen Behandlung unterzogen
wird, wie z. B. einer Gasplasmabehandlung, einer Beschichtung mit einer
hydrophilen Substanz, wie z. B. Siliziumoxid, hydrophilen Polymeren,
wie z. B. Dextran, Polyethylenglykol, Heparin und Derivaten davon,
Detergenzien, biologische Substanzen, wie z. B. Polymere, etc.
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Demzufolge
sind gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung die Vorsprünge
oder zumindest eine Teilmenge davon mit einer chemischen, biologischen
oder physikalischen Funktionalität
versehen. Die Vorsprünge
können
chemisch reaktive Gruppen auf ihrer Oberfläche besitzen. Die Vorsprünge können auch
Substanzen mit biologischer Affinität besitzen, welche an ihrer
Oberfläche
gebunden sind.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
tragen die Vorsprünge
Strukturen oder Gruppen ausgewählt
aus hydrophilen Gruppen, hydrophoben Gruppen, positiv und/oder negativ
geladenen Gruppen, Siliziumoxide, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Nukleinsäuren und
Makromoleküle,
oder Kombinationen davon.
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Gemäß noch einer
anderen Ausführungsform
besitzen die Vorsprünge
eine physikalische Eigenschaft ausgewählt aus dem Durchmesser eines Vorsprungs,
einer Höhe,
eines gegenseitigen Abstandes, einer Form, einem Querschnitt, einer
Oberflächenbeschichtung,
der Anzahl von Vorsprüngen pro
Einheitsbereich, eines Befeuchtungsverhaltens der Oberfläche der
Vorsprünge
oder einer Kombination daraus, entsprechend der erwünschten
Endnutzung des Substrats.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
sind Partikel vorgesehen, die chemisch oder physikalisch an das
Substrat gebunden sind, oder mechanisch innerhalb eines Bereiches,
der eine Mehrzahl von Vorsprüngen
umfasst, gefangen sind. Die Partikel sind aus kommerziell erhältlichen
Partikeln ausgewählt, sog.
Kügelchen,
und können
einen Kern aus Glas, Metall oder Polymer oder eine Kombination daraus besitzen,
und diese tragen wahlweise auf ihren Oberflächen chemische oder biologische
Teile, wie z. B. polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate
oder Kombinationen daraus.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenso eine Vorrichtung bereit, die
für die
Verwendung in oder zusammen mit einer Vorrichtung zur Detektion
eines Analyten in einer flüssigen
Probe geeignet ist, wobei die Vorrichtung Vorsprünge im Wesentlichen vertikal zu
ihrer Oberfläche
besitzt, wobei die Vorsprünge eine
Höhe, einen
Durchmesser und gegenseitige Abstände derart besitzen, dass die
Vorrichtung in der Lage ist, Komponenten der flüssigen Probe zu separieren,
während
ein lateraler Fluss der flüssigen
Probe erhalten wird. Diese Vorrichtung kann eine oder mehrere der
vorstehend beschriebenen Eigenschaften und Funktionalitäten besitzen,
abhängig
von ihrer beabsichtigten Verwendung.
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Diese
Vorrichtung kann separat, in Verbindung mit oder integriert in eine
Vorrichtung für
die Analyse einer flüssigen
Probe verwendet werden. Diese Vorrichtung kann als ein Vorbehandlungsschritt
in oder vor einer konventionellen Analyse wirken.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zum Durchführen eines
Tests an einer flüssigen
Probe bereit, wobei die Probe einem Substrat mit einer Zone zum
Aufnehmen der Probe zugegeben wird, welche in flüssiger Verbindung mit einer Reaktionszone
und wahlweise einer Transport- oder Inkubationszone steht, welche
die Aufnahme und die Reaktionszone verbinden, wobei das Substrat
ein nicht poröses
Substrat ist, und wobei die Aufnahmezone, die Reaktionszone und
die optionale Transport- oder Inkubationszone aus Bereichen bestehen von
Vorsprüngen
im Wesentlichen senkrecht zu der Oberfläche, und mit einer Höhe, einem
Durchmesser und einem gegenseitigen Abstand derart, dass ein lateraler
Kapillarfluss der flüssigen
Probe in der Zone erreicht wird.
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Gemäß einer
Ausführungsform
des Verfahrens wird nach der Zugabe der Probe ein Filterungsschritt
durchgeführt,
wobei die Filterung in einer Filterzone durch Vorsprünge im Wesentlichen
senkrecht zu der Oberfläche
des Substrats erfolgt, wobei die Vorsprünge eine Höhe, einen Durchmesser und einen
gegenseitigen Abstand besitzen, welche/r einen Gradienten mit Bezug
auf den Durchmesser und/oder dem gegenseitigen Abstand bildet/bilden, so
dass Komponenten der Probe graduell zurückgehalten werden.
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Dieses
Verfahren kann für
alle Anwendungen verwendet werden, bei denen Komponenten einer flüssigen Probe
von dem Hauptteil der Probe separiert werden müssen. Das Verfahren ist jedoch
besonders geeignet für
Anwendungen, bei denen die flüssige
Probe Vollblut ist und der laterale Kapillarfluss das Separieren
von roten Blutkörperchen
vom Plasma ohne signifikantes Zerreißen der Blutkörperchen
beinhaltet.
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Eine
Möglichkeit,
eine schonende Separation von Komponenten der Probe zu erreichen,
besteht darin, die Probe einer Filterzone zu unterwerfen, worin
der Abstand zwischen den Vorsprüngen graduell
abnimmt. In Anwendungen, bei denen der laterale Kapillarfluss die
Separation von roten Blutkörperchen
vom Plasma beinhaltet, ist es wichtig, dass dies ohne ein signifikantes
Zerreißen
der roten Blutkörperchen
geschieht. Um dies zu erreichen, verringert sich in Anwendungen,
die die Separation von roten Blutkörperchen betreffen, der Abstand
vorzugsweise von ca. 7 μm
auf ca. 1 μm über die
Länge der Filterzone.
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Gemäß einer
Ausführungsform
des Verfahrens werden Komponenten, die von dem lateralen Fluss separiert
werden, in einem Becken zurückgehalten,
im Wesentlichen abgehalten davon, in die Filterzone einzutreten.
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Eine
andere Ausführungsform
in Anwendungen, in welchen die flüssige Probe Vollblut ist, ist
ein Verfahren des Ermöglichens
eines lateralen Kapillarflusses, welcher den Transport von roten
Blutkörperchen
ohne signifikantes Zerreißen
beinhaltet. Und falls notwendig, kann ein Fluss von Pufferflüssigkeit verwendet
werden, um die Menge von Zellen in der Reaktionszone zu vermindern,
wodurch der Detektionsschritt gefördert wird.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Durchführen eines Tests an einer flüssigen Probe
bereit, insbesondere einer Probe von Vollblut, wobei die Probe einer
vorstehend beschriebenen Vorrichtung zugegeben wird.
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Die
Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung ersetzt erstaunlicherweise Vorrichtungen nach dem Stand
der Technik, bei denen das Substrat und/oder eine oder mehrere der
Zonen aus porösem Material
gemacht sind, wie z. B. Nitrozellulose, Zellulose, Asbestfasern,
Glasfasern und dergleichen.
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Eine
generelle Ausführungsform
ist schematisch in 1 gezeigt, wobei ein Teil einer
Vorrichtung gezeigt wird, wobei die Oberfläche eines Substrats 2 einen
Fließweg 4 besitzt,
welcher Vorsprünge im
Wesentlichen senkrecht zu der Oberfläche und mit einer Höhe, einem
Durchmesser und gegenseitige Abstände derart umfasst, dass ein
lateraler Kapillarfluss erreicht wird. Eine Reaktionszone 6 ist
auf der Oberfläche
vorgesehen, und es ist erwünscht,
dass die Probe und optional Reagenzien, Puffer derart lateral transportiert
werden, dass diese die Reaktionszone passieren. Es ist ebenso erwünscht, dass
die Geschwindigkeit, mit der die Reagenzien etc. die Reaktionszone
passieren, gesteuert wird. Zu diesem Zweck ist eine Auffangzone 8 mit
Bezug auf die Stelle, an der die Probe zugeführt wird, am distalen Ende des
Substrats vorgesehen. Diese Auffangzone wird dann mittels einer
Heizvorrichtung 10 erwärmt,
um Flüssigkeit
zu verdampfen und die Fließgeschwindigkeit
der Probe zu kontrollieren oder zu erhöhen.
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Eine
andere Ausführungsform
ist in 2 illustriert, wobei ein Teil eines Substrates 3 mit
einem Fließweg 4 und
einer Reaktionszone 6 gezeigt ist. Die Auffangzone jedoch
ist in Zonen 12, 14, 16, und 18 aufgeteilt,
welche konsekutiv erwärmt
werden können,
beginnend mit der fernsten Zone 12.
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Noch
eine andere Ausführungsform
ist in 3 illustriert, wobei eine Probe einer Lokation 20 zugegeben
wird, welche in flüssiger
Verbindung mit zwei Fließwegen 4' und 4'' steht, wobei jeder Fließweg eine
Reaktionszone 6' bzw. 6'' passiert und in einer Auffangzone 22' bzw. 22'' endet. Indem den Auffangzonen 22' und 22'' verschiedene Kapazitäten gegeben
werden, oder indem diese einer Erwärmung unterzogen werden, wird
es möglich,
verschiedene Fließgeschwindigkeiten
in den Fließwegen 4' und 4'' zu erhalten. Dies ist vorteilhaft
in Anwendungen, in denen zwei oder mehr Bestimmungen auf derselben Probe
durchzuführen
sind, und wobei jede Bestimmung ihre eigenen Bedingungen bezügliche Inkubationszeit,
Reaktionszeit, Fließgeschwindigkeit
etc. besitzt. Während 3 lediglich
zwei Fließwege zeigt,
versteht es sich, dass drei, vier oder mehrere parallele Fließwege vorgesehen
sein können.
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4 illustriert
eine Ausführungsform,
in der eine Probe einer Lokation 24 in einem System 28 zugegeben
wird, welches eine flüssige
Verbindung zwischen der Probenzugabe 24, einem Fließweg 4,
einer Reaktionszone 6 und einer Auffangzone 26 bildet,
wobei ein erster Waschpuffer W1, der in
einer anderen Lokation 30 gespeichert ist oder dieser zugegeben
wird, ein Konjugat C, welches in 32 gespeichert ist oder
dort zugegeben wird, und ein zweiter Waschpuffer W2,
der in 34 gespeichert ist oder dort zugegeben wird, nacheinander
in den Fließweg 4 eingeführt werden
können.
Wenn W1, W2 und
C gleichzeitig zugegeben werden, können die Distanzen zwischen 30, 32 und 34 und
dem Fließpfad 4 variiert
werden, um die Zeit zu beeinflussen, die W1,
W2 und C benötigen, um den Fließweg zu
erreichen. Wenn W1, W2 und
C auf der Oberfläche
gespeichert sind, an den Lokationen 30, 32 bzw. 34,
kann die Abgabe dieser Komponenten durch das Vorsehen schmelzbarer
Dichtungen, Erwärmung
oder Abkühlung
der Komponenten oder andere Einrichtungen gesteuert werden, welche
die Zeit, die W1, W2 und
C benötigen,
um den Fließweg
zu erreichen, beeinflussen. Während 30, 32 und 34 in 4 schematisch mit
in etwa derselben Distanz von dem Fließweg 4 und etwa vertikal
dazu gezeigt sind, ist es zu betrachten, dass diese sich in verschiedenen
Distanzen in einem Winkel zu dem Fließweg oder sogar partiell parallel
dazu befinden können.
Zentrifugieren ist als ein Mittel angesehen, um einen oder alle
aus W1, W2 und C
an den Fließweg
abzugeben.
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5A illustriert schematisch eine Ausführungsform,
in der der Übergang
von einem Fließweg 36 in
einen anderen Fließweg 38 dadurch
gekennzeichnet ist, das die im Wesentlichen senkrechten Vorsprünge in diesen
Fließwegen
verschiedene Eigenschaften aufweisen, wobei diese Eigenschaften derart
gewählt
sind, dass die Fließrichtung
gesteuert wird, wobei z. B. eine bevorzugte Fließrichtung erzeugt wird. Verschiedene
Eigenschaften in dieser Hinsicht können ein/e verschiedene/r Querschnitt, Höhe, Orientierung,
Abstand und Oberflächenchemie
der Vorsprünge
sein, oder Kombinationen davon sein.
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5B illustriert schematisch eine andere Ausführungsform,
bei der nicht nur die Eigenschaften der Vorsprünge, sondern auch die Höhen der
Fließwege
verschieden sind, erneut um eine bevorzugte Fließrichtung zu erzeugen.
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Schließlich illustriert 5C schematisch eine Ausführungsform,
bei der die Geometrie der entsprechenden Fließwege 44 und 46 ausgestaltet
wurden ist, um eine bevorzugte Fließrichtung zu erzeugen.
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Die
vorstehenden Ausführungsformen
können
auch kombiniert werden, indem z. B. Merkmale von einer Ausführungsform
genommen und diese in eine andere eingeführt werden.
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Vorteile der Erfindung
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Ein
Vorteil der Vorrichtung gemäß der Erfindung
ist die Möglichkeit,
die Fließgeschwindigkeit
genau zu steuern, einschließlich
der Möglichkeiten,
den Fluss zu stoppen und zu starten. Dies wiederum macht es möglich, simultane
oder sequenzielle Reaktionen durchzuführen, entweder hintereinander oder
parallel, in einer gesteuerten Weise. Es ist ebenso möglich, die
Inkubationszeit verschiedener Reaktionen zu beeinflussen.
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Ein
anderer Vorteil der Vorrichtung ist es, dass aufgrund der offenen,
regelmäßigen Struktur und
der definierten Eigenschaften der Zonen des Kapillarflusses die
Zugabe von Reagenzien zu diesen Zonen oder die Derivatisierung der
Oberfläche
der Vorsprünge
außerordentlich
vereinfacht wird.
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Ein
weiterer Vorteil der Vorrichtung ist die Uniformität der Struktur,
nicht nur innerhalb einer einzigen Vorrichtung, sondern ebenso zwischen
allen produzierten Vorrichtungen. Dies resultiert in einer signifikant
erhöhten
Zuverlässigkeit
und Wiederholbarkeit der Tests, die auf der erfindungsgemäßen Vorrichtung
gebildet werden.
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Ein
wichtiger Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es, dass
der Grad der Separation von Blutkörperchen, von überhaupt
nicht bis vollständig, genau
gesteuert werden kann.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
hat viele Vorteile mit Bezug auf den Herstellungsprozess. Alle Kapillarzonen
können
in einem Schritt gefertigt werden und kein Anbauen von Teilen ist
notwendig. Wahlweise kann eine Abdeckung mit zumindest einer Öffnung zur
Proben Zugabe und eine zum Lesen des Ergebnisses des Tests über dem
Substrat und den Kapillarzonen platziert werden.
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Obgleich
die Erfindung mit Bezug auf ihre bevorzugten Ausführungsformen
beschrieben worden ist, welche die beste Betriebsart darstellen,
die den Erfindern derzeit bekannt ist, versteht es sich, dass verschiedene
Veränderungen
und Modifikationen, die für
den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich wären, durchgeführt werden
können,
ohne von dem Schutzumfang der Erfindung abzurücken, welcher in den hierzu
angeführten
Patentansprüchen dargelegt
ist.