DE69228325T2

DE69228325T2 - Ligandentest unter verwendung von interferenzmodulation

Info

Publication number: DE69228325T2
Application number: DE69228325T
Authority: DE
Inventors: Keith C. Bedford Ma 01730 Backman; Christiane Salem Ma 01970 Munkholm
Original assignee: Omnigene Inc
Current assignee: Omnigene Inc
Priority date: 1991-05-29
Filing date: 1992-11-24
Publication date: 1999-06-02
Anticipated expiration: 2012-11-25
Also published as: EP0670043A1; US5196350A; DE69228325D1; WO1994012882A1; EP0670043B1; EP0670043A4

Description

Hintergrund der Erfindung

Unter bestimmten Umständen ist es erwünscht, sehr niedrige Konzentrationen bestimmter organischer Verbindungen zu messen. In der Medizin ist es beispielsweise sehr nützlich, die Konzentration einer, üblicherweise in Lösung befindlichen, gegebenen Molekülart zu bestimmen, welche entweder von Natur aus in physiologischen Fluiden (wie z. B. Blut oder Urin) vorliegt, oder welche in das lebende System eingeführt wurde (wie z. B. Medikamente oder Kontaminate). Aufgrund des rasch fortschreitenden Wissensstandes der molekularen Grundlage sowohl normaler als auch krankhafter Zustände lebender Systeme, gibt es einen steigenden Bedarf nach Detektionsverfahren, welche quantitativ, spezifisch für das interessierende Molekül, hoch empfindlich und relativ einfach zu implementieren sind. Zu Beispielen interessierender Moleküle in einem medizinischen und/oder biologischen Zusammenhang zählen, sind aber nicht darauf beschränkt, Medikamente, Sexual- und Adrenalin-Hormone, biologisch aktive Peptide, zirkulierende Hormone und Antigene in Verbindung mit Tumoren oder infektiösen Wirkstoffen. Im Falle von Medikamenten erfordert beispielsweise die sichere und wirksame Anwendung eines speziellen Medikaments, daß dessen Konzentration im Kreislaufsystem innerhalb relativ enger Grenzen gehalten wird, was als der therapeutische Bereich bezeichnet wird.
Ein breiter Ansatz, der zur Detektion des Vorhandenseins einer als Analyt bezeichneten bestimmten Verbindung angewendet wird, ist das Immungssay- oder Immuntest-Verfahren, in welchem die Detektion einer gegebenen, als Ligand bezeichneten, molekularen Spezies durch die Anwendung einer oft als Antiligand oder Rezeptor bezeichneten zweiten molekularen Spezies, welche die erste interessierende Verbindung spezifisch bindet, erreicht wird. Das Vorhandensein des interessierenden Liganden wird detektiert, indem durch Messen oder Interferieren, entweder direkt oder indirekt, der Umfang der Bindung des Liganden mit dem Antiliganden detektiert wird.
Der Ligand kann entweder monoepitop oder polyepitop sein und ist im allgemeinen als ein beliebiges organisches Molekül definiert, für welches ein weiteres Molekül (d. h., der Antiligand) existiert, welches sich aufgrund der Erkennung eines bestimmten Teils des Liganden spezifisch an den Liganden bindet. Zu Beispielen von Liganden zählen makromolekulare Antigene und Hapten (wie z. B. Medikamente). Der Antiligand oder Rezeptor ist üblicherweise ein Antikörper, welcher entweder in der Natur existiert oder künstlich hergestellt werden kann. Der Ligand und der Antiligand bilden zusammen ein Homologes Paar. Durch den ganzen Text hindurch werden die Begriffe Antigen und Antikörper, welche typische Beispiele darstellen, mit den Begriffen Ligand bzw. Antiligand vertauscht angewendet, wobei aber eine derartige Anwendung keinen Verlust an Allgemeinheit darstellt. In einigen Fällen wäre der Antikörper der Ligand und das Antigen der Antiligand, wenn das Vorhandensein des Antikörpers zu detektieren ist.
Die Implementation eines erfolgreichen Immuntests erfordert ein detektierbares Signal, welche auf das Ausmaß der Antigen/Antikörper-Bindung bezogen ist, die bei der Reaktion mit verschiedenen Testreagenzien auftritt. Üblicherweise wird dieses Signal vom einer Markierung geliefert, die abhängig von der Betriebsweise des Immuntests entweder mit dem Liganden oder dem Antiliganden gepaart ist. Jede Markierung, welche ein stabiles einfach detektierbares Signal liefert ist ein akzeptabler Kandidat. Zu physikalischen oder chemischen Effekten, welche detektierbare Signale erzeugen, und für welche geeignete Markierungen existieren, zählen Radioaktivität, Fluoreszenz, Chemolumineszenz, Phosphoreszenz und enzymatische Aktivität, um nur ein paar zu nennen.
In großen Zügen fallen Immuntests in zwei allgemeine Kategorien - heterogene und homogene. Bei heterogenen Tests besteht der Zweck der Markierung einfach in dem Nachweis der Stelle des Moleküls, mit welchem es sich paart - d. h., in dem Nachweis, ob sich das markierte Molekül frei in Lösung befindet oder Teil eines gebundenen Komplexes ist. Heterogene Tests funktionieren im allgemeinen dadurch, daß verbundene Antigen/Antikörper-Komplexe explizit von dem restlichen freien Antigen und/oder Antikörper getrennt werden. Ein Verfahren, welches häufig angewandt wird, besteht darin, daß eines der Elemente eines homologen Paares an einer festen Oberflächen durch eine kovalente Bindung, physikalische Absorption oder irgendwelche andere Mittel angelagert wird. Wenn eine Antigen/Antikörper-Bindung auftritt, bleiben die sich ergebenden verbundenen Komplexe an dieser festen Oberfläche (die aus jedem geeigneten inerten Material, wie z. B. Kunststoff, Papier, Glas, Metall, Polymer, Gel usw. bestehen kann) haften, was die Trennung eines freien Antigens und/oder Antikörper in der umgebenden Lösung durch einen Waschschritt ermöglicht. Eine Variante dieses Verfahrens besteht in der Verwendung kleiner suspendierbarer Partikel (typischerweise 0,05 bis 20 um) für die Bereitstellung der festen Oberfläche, auf welcher entweder das Antigen oder der Antikörper immobilisiert wird. Die Trennung wird durch eine Zentrifugation der Probenlösung, Reagenzien und suspendierbaren Teilchen bei einer geeigneten Drehzahl bewirkt, was zu einer selektiven Sedimentation der Trägerpartikel zusammen mit den verbunden Komplexen führt.
Bei dem homogenen Test, wird das von dem markierten Liganden oder Antiliganden erhaltene Signal in einer bestimmten systematischen, erkennbaren Art modifiziert, oder moduliert, wenn eine Liganden/Antiliganden-Bindung auftritt. Demzufolge ist die Trennung der markierten verbundenen Komplexe von den freien markierten Molekülen nicht mehr erforderlich.
Es gibt eine Anzahl von Möglichkeiten, in welchen Immuntests durchgeführt werden können.
In dem Kompetitivmodus wird dem als Antigen angenommenen Analyten ermöglicht, mit einer bekannten Konzentration eines markierten Antigens (das in Reagenzform in dem Testkit bereitgestellt wird), in eine Bindungskonkurrenz zu einer begrenzten Anzahl von Antikörpermolekülen zu treten, welche an einer festen Matrix anhaften. Nach einer angemessenen Inkuba tionsperiode wird die Reaktionslösung abgewaschen, wobei sie idealerweise genau die markierten Antigen/Antikörper-Komplexe an der Bindeoberfläche haftend zurückläßt, und dadurch eine Quantifizierung des Signals anhand der Markierungen ermöglicht.
In einem weiteren als Sandwich-Modus bezeichneten Verfahren reagiert der wiederum als Antigen angenommene Analyt mit einem Überschuß oberflächenimmobilisierter Antikörpermoleküle. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird dem System ein Überschuß eines mit einer Markierung gepaarten Antikörpers hinzugefügt, um mit einer anderen Bindungsstelle des Antigens zu reagieren. Nachdem dieses Reaktion im wesentlichen zum Abschluß gekommen ist, entfernt ein Waschschritt den ungebunden markierten Antikörper und andere Kontaminationsquellen, was eine Messung des Signals erlaubt, das von Markierungen erzeugt wird, welche an Antigen/Antikörper-Komplexen anhaften.
In noch einem weiteren, als indirekter Modus, bezeichneten Verfahren, wird dem Analyten, der dieses Mal als aus einem spezifischen Antikörper bestehend angenommen wird, ermöglicht sich an ein im Überschuß vorhandenes Antigen zu binden. Die Bindungsoberfläche wird dann gewaschen und eine Reaktion mit dem mit einer Markierung gepaarten Antikörper zugelassen. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird die Oberfläche wieder gewaschen, was den freien markierten Antikörper entfernt und die Messung des Signals aufgrund des gebundenen markierten Antikörpers ermöglicht. Die sich ergebende Signalstärke variiert invers zu der Konzentration des anfänglichen (unbekannten) Antikörpers, da der markierte Antikörper nur diejenigen immobilisierten Antigenmoleküle binden kann, welche noch keinen Komplex mit dem Analyten gebildet haben.
Einer der empfindlichsten bisher entwickelten Immuntests ist der Radioimmuntest (Radioimmunoassay - RIA), bei welchem die Markierung ein Radionuklid, wie z. B. I¹²&sup5; ist, das mit jedem Element des homologen (Bindungs-) Paars gepaart ist.
Fluoreszein stellt möglicherweise eine attraktive Alternative zur Radioaktivität als eine geeignete Markierung für Immuntests dar. Beispielsweise kann Fluoreszein (üblicherweise in der Form eines Fluoreszein-Isothiozyanat oder "FITC") und eine Vielzahl anderer Fluoreszenzfarbstoffmoleküle an die meisten Liganden und Rezeptoren angebunden werden, ohne deren Bindungseigenschaft signifikant zu beeinträchtigen. Fluoreszenzmoleküle haben die Eigenschaften, daß sie Licht über einen bestimmten Bereich von Wellenlängen absorbieren (und nach einer Verzögerung im Bereich von 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup4; s) Licht über einen Bereich längerer Wellenlängen emittieren. Somit kann durch Verwendung einer geeigneten Lichtquelle, eines Detektor und einer Optik einschließlich Anregungs- und Emissionsfiltern die von markierten Molekülen ausgehende Fluoreszenzintensität bestimmt werden.
Die Verwendung eines Enzyms als Markierung hat eine Vielzahl nützlicher Enzymimmuntests (enzyme immunoassy - EIA) mit sich gebracht, wovon der populärste als ELISA bekannt ist. In dem typischen heterogenen Format wird eine Sandwich-Reaktion angewendet, in welcher der hier als Antigen angenommene interessierende Ligand sich an den oberflächenimmobilisierten spezifischen Antikörper und dann an ein Enzym/Antikörper-Paar anbindet. Nach einer geeigneten Inkubation wird jedes übriggebliebene frei Enzympaar durch einen Wasch- oder Zentrifugationsschritt entfernt. Ein geeignetes Substrat für das System wird dann mit der die gebundenen Komplexe enthaltenden Oberfläche in Kontakt gebracht. Das Enzym/Substrat-Paar wird so gewählt, daß es ein Reaktionsprodukt erzeugt, welches ein leicht detektierbares Signal ergibt, wie z. B. eine Farbveränderung oder eine Fluoreszenzemission. Die Verwendung eines Enzyms als Markierung dient dazu, den Beitrag eines einzelnen markierten verbundenen Komplexes zu dem gemessenen Signal wirksam zu verstärken, da viele Substratmoleküle durch ein einzelnes Enzymmolekül umgewandelt werden können.
Wie aus der vorstehenden Hintergrundzusammenfassung zu ersehen ist, beruhen viele Immuntestverfahren auf optischen Verfahren, um spezifische Liganden in einer Probenmatrix zu detektieren, und man ferner kann sagen, daß diese Verfahren im allgemeinen in drei optische Klassen fallen:
1) Verfahren auf der Basis der Molekularabsorption von Licht, welche alle Standardspektroskopieverfahren, wie z. B. Absorption, Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Fluoreszenzpolarisation, zirkularer Dichroismus, Raman- und Infrarotspektroskopie umfassen;
2) Verfahren auf der Basis der Erzeugung von Licht durch eine chemische Reaktion, welche als Chemolumineszenz oder Biolumineszenz bekannt, wenn die Reaktion von einem Enzym katalysiert wird;
3) Verfahren auf der Basis der Änderung der Ausbreitungsrichtung einer Lichtwelle, wie z. B. Refraktometrie, optische Rotationsdispersion und Verfahren auf der Basis von Lichtstreuung.
Bei allen vorgenannten Verfahren wird das Signal gesammelt und von einer Detektionsvorrichtung gemessen, welches das Phänomen bei seinem Auftreten in der Molekularpopulation der Probe überwacht. Die Messung ist eine Funktion der Intensität oder des Maßes der Veränderung, welche innerhalb der Probe auftreten. Obwohl die meisten dieser Verfahren isotrope Signale erzeugen, erzeugen auch die anisotropen Verfahren, wie z. B. die Fluoreszenzpolarisation Signale, welche im Grunde als Intensitäten gemessen werden.
Zur Zeit tauchen optischen Detektionsverfahren auf, welche eine neue und vierte Klasse optischer Verfahren auf der Basis räumlicher Muster umfassen können, welche durch die Interaktion von Strahlung mit dem Liganden oder Antiliganden erzeugt werden. In dieser Klasse optischer Detektionsverfahren wird das optische Signal außerhalb der Probe als ein Muster oder als eine an mehr als einer geometrisch definierten räumlichen Position gemessene Intensität gesammelt. Die nachstehenden Beschreibungen sind für diese neue Klasse optischer Detektionsverfahren repräsentativ.
Nicoli beschreibt in dem U. S. Patent Nr. 4,647,544, erteilt am 3. März 1987 mit dem Titel "Immunoassay Using Optical Interference Detection" die optische Detektion einer Bindungsreaktion zwischen einem Liganden und einem Antiliganden, wobei ein Muster auf einem Substrat durch eine räumliche Anordnung mit mikroskopischen Dimensionen eines auf einem Substrat immobilisierten Antiligandenmaterials erzeugt wird. Nach der Aussetzung an die Probe bindet sich der Ligand an das Substrat, um ein physikalisches Muster auszubilden. Eine Quelle optischer Strahlung wird in einem speziellen Einfallswinkel auf das Muster gerichtet, um ein optisches Interferenzmuster in Übereinstimmung mit der Bindungsreaktion und mit einer starken Streuungsintensität bei einem oder mehreren Braggschen Streuungswinkeln zu erzielen. Ein optischer Detektor ist mit einem Bezug auf das Muster angeordnet und zu dem Braggschen Streuungswinkel ausgerichtet, um die starke Streuungsintensität zu detektieren und ein für die Bindungsreaktion repräsentatives Signal zu erzeugen.
Ein weiteres Patent, "Diffraction Immunoassay and Reagents" EPO 0276968, veröffentlicht am 3. August 1988 beschreibt einen auf einem "Biogitter" basierenden Test, in welchem ein biologisches Beugungsgitter, das aus Linien eines aktiven Bindungsreagens besteht, auf einer Siliziumsubstratoberfläche ausgebildet ist. Nach dem Kontakt der Testoberfläche mit der Probe und der Trennung der Probe von dem Test, wird die Oberfläche beleuchtet und die Bindung des Analyten mit der Oberfläche in einer gleichmäßigen Form erzeugt ein Beugungsmuster. Ein optischer Detektor oder eine Anordnung von Detektoren, die in vorbestimmten Winkeln angeordnet sind, wird zur Messung des gebeugten Lichtes verwendet.
Die PCT-Anmeldung Nr. PCT/GB85/00427 beschreibt die Verwendung fluoreszierend markierter Moleküle, die sich so mit einem Substratmuster verbinden, daß die Fluoreszenzemission in einen engen Winkelkonus konzentriert wird, statt gleichmäßig in alle Richtungen verteilt zu werden.
In jedem dieser Beispiele wird das detektierte Licht durch eine Lichtinteraktion mit Analyten erzeugt, die auf einer Oberfläche in einer geometrischen Art eingefangen wurden, und das detektierbare Signal ist sowohl durch eine Amplitude als auch eine Musterformation gekennzeichnet.
Diese Immuntestverfahren auf der Basis räumlicher optischen Detektion hängen von der von dem Liganden oder Antiliganden ausgebildeten räumlichen Geometrie, welche extrem feine Details und kleine Dimensionen aufweisen muß, ab, wobei eine ausgeklügelte Immobilisierungstechnologie erforderlich ist, welche für viele Liganden und Antiliganden nur schwierig reproduzierbar zu implementieren sein kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion des Vorhandensein eines Liganden in einer Probe, und zur Bestimmung von dessen Konzentration bereit.
Gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein Verfahren zur optischen Detektion des Vorhandenseins eines Liganden in einer Probe bereitgestellt, in welcher der Ligand an ein Testsubstrat gebunden ist und mit einem Antiliganden reagiert, um einen Komplex des Liganden mit dem Antiliganden auf dem Testsubstrat zu erzeugen, wobei die optischen Eigenschaften dieses Komplexes sich von denen des Liganden unterscheiden, mit den Schritten:
a) Ausbilden eines Interferenzmusters durch Projektion von Licht durch Öffnungen in einer Maske, die in dem Lichtpfad angeordnet ist, so daß die von den Öffnungen austretenden gebeugten Strahlen miteinander interferieren, um das Muster zu erzeugen;
b) Stören wenigstens eines, aber nicht aller, derartigen gebeugten Strahlen mittels des Komplexes, welcher in dem Pfad wenigstens eines, aber nicht aller, derartigen gebeugten Strahlen angeordnet ist, und dadurch Verändern des Interferenzmusters; und
c) Beobachten der Veränderung in dem Muster, um das Vorhandensein des Liganden zu ermitteln.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer optischen Anzeige der relativen Konzentration eines Liganden und eines Antiliganden, z. B. eines mit einem Metall markierten Antiliganden, in einer Probe bereit, mit den nachstehenden Schritten:
a) Ausbilden eines Interferenzmusters durch Projektion von Licht durch eine Maske mit N Schlitzen, wobei N ein ganze Zahl größer als Eins ist;
b) Abdecken von N-X Schlitzen mit einem an ein Testsubstrat gebundenen Komplex, wobei der Komplex den Liganden und den Antiliganden enthält, wobei der Komplex zu einer Veränderung in einer optischen Eigenschaft der abgedeckten Schlitze und einer sich daraus ergebenden Veränderung in dem Interferenzmuster führt, und wobei X ein ganze Zahl kleiner als N ist; und
c) Ermitteln der Konzentration durch Messen der Veränderung in der optischen Eigenschaft eines oder mehrerer Punkte auf dem Interferenzmuster vor und nach der Abdeckung der N-X Schlitze;
wobei optional die Punkte in Schritt (c) im wesentlichen alle Punkte innerhalb eines Bereichs von Punkten innerhalb des Interferenzmusters sind.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer optischen Anzeige des Vorhandenseins eines Liganden oder eines Antiliganden in einer Probe bereit, mit den nachstehenden Schritten:
a) Ausbilden eines Interferenzmusters durch Projektion von Licht durch eine Maske mit N Schlitzen, wobei N ein ganze Zahl größer als Eins ist;
b) Abdecken von N-X Schlitzen mit der Probe, wobei die Probe den Liganden und den Antiliganden enthält, wobei die Probe auf einem Testsubstrat angeordnet, und wobei X eine ganze Zahl kleiner als N ist; und
c) Durchführen der Reaktion des Liganden und Antiliganden, um einen Transparenzverlust durch die N-X abgedeckten Schlitze hindurch zu erzeugen, der das Vorhandensein des Liganden oder Antiliganden anzeigt.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Ermitteln der Konzentration eines Liganden in einer Probe bereit, mit den Schritten:
a) Erzeugen eines Interferenzmusters zwischen zwei oder mehr elektromagnetischen Wellen, wie z. B. Lichtwellen, wobei sich die Wellen aus dem Durchtritt eines Strahls elektromagnetischer Energie durch eine Maske ergeben, die für die elektromagnetische Energie transparente Öffnungen enthält;
b) Immobilisieren des Liganden auf einem Testsubstrat;
c) Durchführen der Reaktion des Liganden mit einem Antiliganden, um eine Änderung in der Reaktion des Liganden auf die Wellen zu bewirken;
d) Modulieren des Interferenzmusters durch Anordnen des immobilisierten und ausreagierten Liganden in dem Pfad mindestens einer, aber nicht aller Wellen; und
e) Ermitteln der Ligandenkonzentration anhand der Veränderung in dem Interferenzmuster, wie z. B. unter Anwendung eines Densitometers.
Nach einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung für die Anwendung der vorgenannten Verfahren bereit.
Gemäß einem ersten Vorrichtungsausführungsbeispiel stellt die Erfindung eine Vorrichtung für die Detektion des Vorhandenseins oder der Konzentration eines Liganden auf einem Substrat bereit, mit:
a) einer Lichtquelle, wie z. B. einem Laser, zum Emittieren eines Lichtstrahls;
b) einem Strahlteiler mit einer Maske mit wenigstens zwei Öffnungen, um die Aufspaltung des Lichtstrahls in wenigstens zwei aufgeteilte Lichtstrahlen zu bewirken, welche miteinander interferieren, um ein Interferenzmuster zu bilden;
c) dem Substrat;
d) wenigstens einem auf dem Substrat angeordneten und in dem Pfad wenigstens eines von den aufgeteilten Lichtstrahlen positionierten Liganden, wobei der Ligand zum Modulieren eines der aufgeteilten Strahlen dient, um das Interferenzmuster in einer auf die Konzentration des Liganden auf dem Substrat bezogenen Weise zu verändern; und
e) einer Detektionseinrichtung, wie z. B. einem optoelektronischen Detektor, zum Quantifizieren der von dem(n) Liganden erzeugten Musterveränderung und deshalb zum Ermitteln der Konzentration des Liganden.
Gemäß einem weiteren Vorrichtungsausführungsbeispiel stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung bereit, in welcher die Öffnungen auf dem Testsubstrat ausgebildet sind, auf welchem der Ligand und der Antiligand reagieren.
Die Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Modulation eines Interferenzmusters, das durch die Interferenz zwischen zwei oder mehr Lichtstrahlen aufgrund der Reaktion eines Liganden mit einem Antiliganden in einem Test erzeugt wird, um eine Änderung in den optischen Eigenschaften des Liganden zu bewirken. Diese Änderung in den optischen Eigenschaften wird zur Störung des Interferenzmusters genutzt, indem der ausreagierte Ligand in den Pfad eines oder mehrerer von den das Interferenzmuster erzeugenden Lichtstrahlen angeordnet wird. Die sich ergebende Veränderung in dem Interferenzmuster ist von der Konzentration des Liganden abhängig und kann dazu genutzt werden, das Vorhandensein des Liganden und dessen Konzentration in der untersuchten Probe zu detektieren.
In einem ersten Ausführungsbeispiel wird ein Interferenzmuster erzeugt, indem Licht durch eine Maske projiziert wird, die wenigstens zwei schmale parallele Schlitze aufweist, die eine Breite, welche sehr klein sein kann aber größer als die Wellenlänge der Lichtquelle bleibt, besitzen und durch einen Abstand getrennt sind, der größer als die Schlitzbreite ist. Das Licht wird dadurch in zwei oder mehrere Lichtstrahlen zerlegt, welche interferieren und ein Interferenzmuster ausbilden, welches beispielsweise durch Projektion auf einen Schirm sichtbar gemacht werden kann. Einer oder mehrere von den Schlitzen kann dann blockiert werden, um ein anderes Interferenzmuster zu erzeugen. Eine Testoberfläche mit einem Liganden, welcher nach der Reaktion mit einem Antiliganden die Transparenz der Testoberfläche verändert, wird dann auf oder über einem Schlitz oder Schlitzen angeordnet, was eine Veränderung des Interferenzmusters in ein Muster bewirkt, welches zwischen dem von dem nicht abgedeckten Schlitz erzeugten Standardmuster und dem Standardmuster liegt, das erzeugt wird, wenn der für die Testoberfläche relevante Schlitz bzw. die Schlitze vollständig abgedunkelt werden. Die Veränderung in dem Interferenzmuster im Vergleich zu dem Standard wird gemessen und auf die Konzentration des getesteten Liganden bezogen.
Bevorzugt wird eine Quelle monochromatischen Lichts, wie z. B. ein Laser dazu verwendet, um Licht durch mehrere in einer Folienmaske ausgebildete Schlitzöffnungen zu projizieren. Ein in der Nähe der Folie montiertes Testsubstrat dient zur Versperrung eines oder mehrerer Schlitze.
Eine Linse kann zur Verstärkung des Interferenzmusters verwendet werden, so daß dieses auf einen Schirm projiziert und photographiert werden kann. Die sich ergebenden Photographien werden dann mittels eines Densitometers analysiert, um die Intensität des Lichtes an bestimmten Punkten des Musters vor und nach der Abdeckung des Schlitzes zu ermitteln, um dadurch das Vorhandensein des Liganden und dessen Konzentration in der getesteten Probe zu ermitteln.
Alternativ kann die Intensität des Musters in Echtzeit unter Verwendung einer Pixelanordnung analysiert werden, die von Photodetektoren gebildet wird, um jedem Pixel entsprechende elektrische Signale zu erzeugen und diese Signale in einem Computer zu verarbeiten.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Skizze einer Lichtinterferenz, die von einer Maske mit zwei Schlitzen erzeugt wird, um die Theorie hinter der Erfindung zu veranschaulichen.
Fig. 2 ist eine Skizze, welche in einer Kurve (a) das Beugungsmuster darstellt, wenn nur ein Schlitz (S&sub1;) offen ist, und in Kurve (b) das Interferenzmuster darstellt, wenn beide Schlitz (S&sub1; und S&sub2;) offen sind.
Fig. 3 ist eine schematische Skizze eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung.
Fig. 4 ist ein Flußdiagramm der wichtigen Schritte bei der Formung eines kolloidalen mit Gold markierten Antikörper- (Au-Antikörper)-Komplexes zur Anwendung in der Vorrichtung der Erfindung.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Intensität zweier benachbarter Maxima eines Doppelschlitz-Interferenzmusters, welche die Veränderung darstellt, die durch die Variation der Transmission durch einen Schlitz bewirkt wird.
Fig. 6 sind graphische Darstellungen der Intensität I über der Transmission T für Änderungen in Imax (Kurve ΔImax) von Änderungen in der Transmission (Kurve Δt).
Fig. 7a ist eine graphische Darstellung der Sichtbarkeit V&sub2; des Streifenmusters als Funktion des Prozentsatzes der Transmission (I&sub2;%) durch den zweiten Schlitz S&sub2;.
Fig. 7b ist eine graphische Darstellung von -log V&sub2; · 1000 über Δ% I&sub2;.
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung der Veränderung in Imax und Imin als Funktion einer Änderung in der Transmission I&sub2; durch den Schlitz S&sub2;.
Fig. 9a bis 9d ist ein schematisches Flußdiagramm eines alternativen Ausführungsbeispiels der Erfindung.
Fig. 10 ist eine Darstellung noch eines weiteren alternativen Ausführungsbeispiels.
Fig. 11 ist eine Darstellung eines weiteren alternativen Ausführungsbeispiels, in welchem das Doppelschlitzmuster durch einen virtuellen Schlitz S&sub2; und einen realen Schlitz S&sub1; und einen Spiegel M erzeugt wird.
Fig. 12 ist eine Darstellung eines Ausführungsbeispiel der Erfindung mit einen Fesnelschen Spiegel.
Fig. 13 ist eine Darstellung eines Ausführungsbeispiel der Erfindung mit einen Doppelprisma.
Fig. 14 ist eine Darstellung eines Ausführungsbeispiel der Erfindung mit einer Billetschen Halblinse.
Fig. 15 ist eine Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer Durchflußzelle.
Fig. 16 ist eine Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer alternativen Durchflußzelle.
Fig. 17 ist eine Darstellung, welche ein alternatives Ausführungsbeispiel veranschaulicht, im welchem N Schlitze ausgebildet sind und N-X Schlitze von dem Komplex abgedeckt sind und wobei N = 6 und X = 5 ist.
Fig. 18 ist dieselbe wie Fig. 17 mit der Ausnahme daß N = 6 ist und X = 3 ist.
Fig. 19 ist eine graphische Darstellung der Intensität der Hauptmaxima I&sub0; über der Anzahl von Schlitzen.
Fig. 20a-20b ist ein alternatives Ausführungsbeispiel eines Zwei- oder Mehrschlitz-Ausführungsbeispiels, in welchem das Testsubstrat mit Schlitzen ausgebildet ist.
Fig. 21a ist ein alternatives Ausführungsbeispiel, in welchem die Schlitzöffnung durch eine quadratische Öffnung ersetzt ist.
Fig. 21b ist ein alternatives Ausführungsbeispiel von Fig. 20a, in welchem die Schlitzöffnung eine dreieckige Form aufweist.
Fig. 21c und 21d veranschaulichen die Ausbildung einer Testprobe auf einer diagonalen Hälfte eines quadratischen Schlitzes, um ein Beugungsmuster auf dreieckiger Basis auszubilden.

Beschreibung des bevorzugten Ausführungsbeispiels

A. Hintergrundtheorie

1801 demonstrierte Thomas Young das Phänomen von Interferenzbändern, die durch ein durch zwei identische und eng benachbarte Schlitze scheinendes Licht erzeugt wurden. Eine Skizze der von Young verwendeten optischen Konfiguration ist in Fig. 1 dargestellt. Eine Lichtquelle (S) strahlt auf zwei schmale, parallele Schlitze (S&sub1; und S&sub2;). Jeder Schlitz besitzt eine Breite D, welch sehr klein sein, aber größer als die Wellenlänge des Lichtes bleiben kann. Die Schlitze sind durch einen Abstand (a) getrennt, welcher D überschreitet. Das durch die Schlitze passierende Licht wird gebeugt und tritt in Form von zwei Wellenfronten mit identischer Wellenlänge und Phase in Erscheinung. Die zwei Wellenfronten interferieren und erzeugen ein sichtbares Interferenzmuster auf dem Schirm 20. Das Muster besteht aus einer Reihe heller und dunkler paralleler Bänder, welche typischerweise als Streifen bezeichnet werden.
Die gesamte Lichtamplitude an einem beliebigen gegebenen Punkt in dem Interferenzmuster ist das Ergebnis der Überlagerung der zwei Wellenamplituden von S&sub1; und S&sub2;. Zwei Wellen, die sich konstruktiv addieren, erzeugen einen hellen Streifen, (Maximum), während zwei Wellen, die sich destruktiv addieren, einen dunklen Streifen (Minimum) erzeugen. Der Abstand zwischen zwei benachbarten Maximas wird berechnet durch:
wobei X der Abstand der Schlitze von dem Schirm, λ die Wellenlänge des Lichtes und m eine ganze Zahl ist, die zur Bezeichnung der Position des Streifens verwendet wird. Der auf der Symmetrieachse angeordnete zentrale Streifen wird als das Maximum nullter Ordnung bezeichnet. Das erste Maximum, an beiden Seiten (m = ± 1) wird als Maximum erster Ordnung bezeichnet, und die Maximas setzten sich in beiden Richtungen über die höheren Ordnungen hinweg fort. Die Minimas sind genau in der Mitte zwischen den Maximas angeordnet und sind nur dann vollständig dunkel, wenn die zwei Schlitze gleiche Intensitäten liefern.
Wenn mit der Gleichung 1 gearbeitet wird, werden die Größen X und a beide von dem experimentellen Aufbau bestimmt, und der Wert für Y kann aus dem Streifenmuster gemessen werden, was nur λ als einen unbekannten Wert übrigläßt. Somit kann man diese Gleichung zur Bestimmung der Wellenlänge von Licht benutzen, was ein weiterer historischer Erfolg des ursprünglichen Doppelschlitz-Experimentes war.
Wenn nur einer der zwei Schlitze offen ist, wird ein breite zentrale Beugungsspitze um den offenen Schlitz gemäß Darstellung in Fig. 2 herum zentriert, Kurve a, erhalten. Wenn beide Schlitze offen sind, kombinieren sich die von den einzelnen Schlitzen erzeugten überlappenden Wellenfronten der Beugungsbänder so, daß sie ein Interferenzmuster ausbilden, das innerhalb der Grenzen der Beugungsbänder angeordnet ist, wobei die Interferenzstreifen dort sichtbar sind, wo jedes der Beugungsbänder beobachtet worden wäre.

B. Prinzip des Testverfahrens auf der Basis eines Doppelschlitz-Interferenzmusters

Das Testverfahren der Erfindung beruht auf einem Umwandlungsmechanismus einer Doppelschlitz- oder Mehrschlitz-Interferenzmodulation. Wie zuvor festgestellt, erzeugt der vollständige Verlust der Transmission durch einen Schlitz in einer Doppelschlitz-Interferenzkonfiguration einen Zusammenbruch des Streifenmusters auf das Beugungsband eines Einzel schlitzes. Ein teilweiser Verlust der Transmission erzeugt ein Zwischenmuster, bei dem sich die Amplituden der Interferenzmaxima und -minima auf den Zustand der Hüllkurve eines Beugungsband zu bewegen. Daher kann jedes Verfahren zur Reduzierung der Transparenz eines Schlitzes auf einen Verlust des Streifenmusters bezogen werden.
Eine Möglichkeit diesen Vorgang in ein Testverfahren umzusetzen, besteht darin, einen Komplex bereitzustellen, welcher eine lokalisierte Abdeckung über einem Schlitz erzeugt, welche undurchsichtig genug ist, um die Transmission von Licht durch den Schlitz zu reduzieren. Die Reduzierung des Lichtes durch den Schlitz verringert die Intensität des Lichtes, das für die Interferenz mit Licht zur Verfügung steht, das von dem anderen Schlitz ausgeht, und verringert somit die Ausbildung des sich ergebenden Streifenmusters. In der Praxis wird die Oberflächenabdeckung aufgrund des Komplexes einer vorhersagbaren Änderung des Streifenmusters gleichgesetzt.
Der Komplex für die Erzeugung eines Transmissionsverlustes durch einen Schlitz kann die temporäre oder permanente Anordnung eines beliebigen optisch dichten Moleküls oder Materials, welches eine Streuung oder Absorption der einfallenden Strahlung von einer Quelle bewirkt, auf der Oberfläche des Schlitzes beinhalten. Jedes physikalische Phänomen, das die Strahlungstransmission ändern oder abschwächen kann, kann die Ausbildung von Interferenzstreifen beeinflussen. Daher kann jedes chemische Phänomen, das eines oder mehrere dieser physikalischen Phänomene erzeugt, potentiell von dieser Technologie detektiert wird. Das physikalische Phänomen kann Veränderung in der Reflexion, Absorption, Phase, Brechung oder Polarisation des auf die Testoberfläche auftreffenden Lichtes umfassen. Zu Materialien, welche sich derartig verhalten können, zählen kolloidale mit Gold markierte Moleküle, colorimetrische Markierungen und Pigmente, Bakterien, Polymerpartikel, Zellen, Langmuir-Blodgett-Filme sowie andere Polymerfilme.
Für einen Transmissionsverlust durch Lichtabsorption müssen Materialien verwendet werden, die bei der Frequenz des einfallenden Lichtes absorbieren. Die nachstehende Tabelle 1 listet die Spektralfarbe und die zugehörigen Wellenlängen einer Vielfalt farbiger Verbindungen auf. Beispielsweise würde man bei Verwendung eines HeNe-Lasers, welcher Licht bei einer Wellenlänge von 630 nm emittiert, vorhersagen, daß blaue/ blaugrüne Materialien die Energie absorbieren. Wenn man beispielsweise eine gelbe Verbindung detektieren möchte, würde dann die Laserquelle auf eine solche umgestellt werden, welche in dem Bereich von 430 nm arbeitet.
Ein absorptionsmoduliertes Interferenzsystem kann auch dazu verwendet werden, um mehrere Analyte in einer Probe mittels einer variablen, inkohärenten Quelle, wie z. B. einer Xenon-Lichtbogenlampe, und einem Scan-Monochromator zu detektieren. Da eine Scan-Spektrophotometer ein Absorptionsspektrum als Funktion der Frequenz der einfallenden Strahlung mißt, kann es auch möglich sein, die durch die Transmissionen bei verschiedenen Frequenzen erzeugten Interferenzmuster zu messen. Auf diese Weise könnte man eine Probe analysieren, welche eine Vielfalt von Molekülen mit nicht überlappenden Absorptionsspektren enthält, wobei bei einer mit dem Absorptionsmaximum eines speziellen Moleküls in der Probe übereinstimmenden Strahlungswellenlänge die Verringerung des Interferenzmuster aufgrund der Abschwächung erfolgen würde, die sich aus der Konzentration des Moleküls ergibt. Jedes Molekül in der Probe würde eine Abschwächung der Transmission bei einer diskreten Wellenlänge bewirken, womit auf diese Weise mehrere Analyte in dem Bereich nur eines Schlitzes (S&sub2;) detektiert werden könnten. TABELLE 1 FARBEN VON VERBINDUNGEN, SPEKTRALFARBEN UND WELLENLÄNGEN

C. Bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung der Erfindung

Unter Hinwendung auf Fig. 3 wird nun die Vorrichtung für ein erstes Ausführungsbeispiel der Erfindung in Verbindung damit beschrieben.
Eine Lichtquelle 10 ist auf einer (nicht dargestellten) Schiene einer optischen Bank angrenzende an und in einer Linie mit einer Folienmaske 24 angeordnet, welche ebenfalls auf der Schiene montiert ist. Eine Maske 24 ist mit wenigstens zwei schmalen vertikalen Schlitzen S&sub1; und S&sub2; ausgebildet. Ein Testkomplex ist auf einem Testdia 14 ausgebildet, welches so auf der Maske 24 angeordnet ist, daß es den Schlitz S&sub1; abdeckt.
Ein optisches Filter 12 ist auf der Schiene zwischen der Quelle 10 und der Maske 24 angeordnet. Wenn die Quelle 10 ein Laser ist, der ein hoch intensives monochromatisches Licht emittiert, kann das Filter 12 ein neutrales Dichtefilter sein, das zur Anpassung der Intensität des Lichtes verwendet wird. Wenn die Quelle 10 eine breitbandige mäßig intensive Lichtquelle ist, kann das Filter 12 zum Ausfiltern aller außer der gewünschten Wellenlänge für die Projektion auf die Maske 24 verwendet werden.
Das durch die Schlitze S&sub1; und S&sub2; hindurchtretende Licht wird gebeugt und die sich ergebenden Wellenfronten des gebeugten Lichtes interferieren so, daß sie ein Streifenmuster 22 erzeugen, welches von einer Linse 16 verstärkt und auf den Schirm 20 projiziert wird. Anmerkung: Optional kann eine zweite (nicht dargestellte) Linse auf der Seite der Maske in unmittelbarer Nähe zur Quelle angeordnet sein, um die Verteilung des Musters am Ursprung 0 zu vergrößern. Eine Kamera 18 wird dazu verwendet, um die Abbildung des Musters photographisch aufzuzeichnen. Diese Abbildung kann dann durch Umwandeln des Streifenmusters in Intensitätsgraphen mittels eines Densitometers und Analysieren der Intensitätsgraphen, die mit und ohne von dem Testdia abgedeckten Schlitz erzeugt werden, verarbeitet werden, um die Konzentration des Liganden in der Probe zu bestimmen.
Die Doppelschlitzmaskenkomponente 24 ist ein kritisches Teil in diesem Prozeß und muß von hoher Qualität sein. Bevorzugt wird die Maske mittels eines Laserprozesses aus einer Folie ausgeschnitten. Es wurde mit drei verschiedenen Größen gemäß Darstellung in der nachstehenden Tabelle 2 experimentiert. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, das die dargestellten Dimensionen beliebig aus einem Kontinuum geeigneter Werte ausgewählt sind und lediglich exemplarischer Natur sind statt die Erfindung einzugrenzen. TABELLE 2 ABMESSUNGEN VON LUFTSCHLITZEN
Die Folie #2 erzeugt die intensivsten und schärfsten Streifenmuster in dem üblichen Format. Die Streifentrennung (Y) für diese Folie, angeordnet in einem Abstand X von einem Schirm, werden aus der Gleichung 1 bestimmt und sind in der nachstehenden Tabelle 3 aufgelistet. TABELLE 3 BERECHNETE STREIFENTRENNUNGEN FÜR DIE FOLIE #2 BEI VERSCHIEDENEN ABSTÄNDEN ZWISCHEN DEN SCHLITZEN UND DEM SCHIRM
Die Folienmaske ist auf einem (nicht dargestellten) magnetischen Halter befestigt, welche dann auf einem Magnetstreifen angeordnet wird, welcher auf einer X-Y-Z-Positioniervorrichtung in einer Linie mit der Lichtquelle 10 angeordnet ist. Das Testverfahren erfordert die Positionierung des Testdias über einem Schlitz, und dieses muß so erfolgen, daß der Diarand zwischen den zwei Schlitzen bleibt und keinerlei Beugung des durch den nicht abgedeckten Schlitz hindurchtretenden Lichtes bewirkt.
In einem experimentellen Model wies die Lichtquelle einen HeNe-Laser (Uniphase 2mw) auf, der monochromatisches Licht bei 633 nm erzeugte. Neutraldichtefilter wurden zum Reduzieren der Laserintensität verwendet.
Die Streifenmuster wurden auf einem Film (Polaroidfilm #667, 3000 ASA) aufgezeichnet und anschließend mittels eines Videodensitometers (PFGplus 640-3-U-RT PCVision Plus Frame Grabber mit einem 640 · 480 Display, OPTIMAS - Optical Measu rement & Analysis Software, PVM-1342Q Sony Trinatron 13" Farbmonitor mit Mehrfacheingängen, Logimouse Plus - Logitech Mechanical Mouse, SYS/386-80-color-1 IBM-kompatibler Computer 386 20 MHz mit EGA-Farbmonitor und 80 Megabyte Festplatte unter Verwendung einer Videokamera (815-2000-0000) Cohu Series 4800 High Resolution CCD Monochrome Camera), die auf die beleuchteten Photographien fokussiert war, in Intensitätsgraphen umgewandelt. Zum Erzeugen einer Meßspur wurde der Cursor auf oberhalb eines Streifenmusters oder der Beugungshüllkurve bei einem Einzelschlitz gesetzt, und dann durch die Mitte des Musters gezogen und an der gegenüberliegenden Seite beendet.

D. Testchemie

Ein Flußdiagramm eines ersten Ausführungsbeispiels der Testchemie der Erfindung gefolgt von dem optischen Test ist in Fig. 4a-g zusammengefaßt. In diesem Beispiel ist der Ligand ein Kaninchen-IgG, welcher mit einem Deckglas 14 (Fig. 4a), das mit einem Kaninchen-Anti-IgG beschichtet ist, inkubiert wird, dem eine Inkubation mit einem kolloidalen mit Gold markierten Antiliganden wie z. B. einem Ziegen/Kaninchen- Anti-IgG 40 (Fig. 4b) folgt. Nach einem Silberanreicherungsschritt, in welchem das Goldkolloid als Keim für eine Ausfällung von Silber aus einer Lösung 42 dient, wenn es mit dem markierten Antikörper in Kontakt kommt (Fig. 4c), zeigt das Deckglas eine Abscheidung eines dunkel gefärbten Antikörper/Antigen-Komplexes. Das Einsetzen dieses behandelten Deckglases über einem Schlitz S&sub2; einer Doppelschlitzkonfiguration erzeugt einen Transparenzverlust durch den Schlitz S&sub2; (Fig. 4d), was zu einem Verlust in der Intensität I&sub2; des Lichtes von S&sub2; führt (Fig. 4e) und zu einem beobachtbaren meßbaren Verlust an Interferenzstreifen (Fig. 4f). Dieser Verlust in der Amplitude der Streifen wird dann zu einer Analytkonzentration (Fig. 4g) in dem später in Abschnitt E beschriebenen Quantifizierungsprozeß in Beziehung gesetzt.
Der vorstehenden allgemeinen Beschreibung des Methodologie des Testes folgt nun nach nachstehend das spezifische experimentelle Beispiel:
Die Aufgabe der Immobilisierungschemie ist die kovalente Anbindung des Antiliganden, in diesem Falle eines Proteins, welches selektiv den Zielliganden oder Analyten bindet. Um das Glas für die Immobilisierungschemie vorzubereiten, wird der Deckglas säurebehandelt, um reaktive Silanolgruppen zu erzeugen:
In einem ersten Ausführungsbeispiel wurde dieses wie folgt erreicht: Deckgläser (81 mm²) wurden in ein 1 : 1-Gemisch aus konzentrierter HCl und Methanol eingetaucht, dem mehrere Spülungen mit destilliertem Wasser folgten. Die Deckgläser wurden dann für 30 Minuten in Schwefelwasserstoffsäure getaucht, dem mehrere Spülungen mit destillierten Wasser folgten. Die Deckgläser wurden 30 Minuten in destilliertem H&sub2;O gekocht und dann auf einem leichtsaugenden Papier luftgetrocknet (siehe Bhaia; S. K., Shriver-Lake, L. C., Prior, K. J., Georger, J. H., Calvert, J. M., Bredeborst, R., Ligler, F. S., Analytical Biochemistry 178, 408-413, 1989)
Anschließend läßt man das Glas mit Aminoethylpropyltriethoxysilan (APTES) reagieren, um eine reaktive Aminderivat-Oberfläche zu erzeugen
Insbesondere wurde eine 2%-tige Lösung (v/v) von APTES hergestellt, indem 200 ul APTES in 9,8 ml (über Molekularsieben getrocknetes) Toluol eingemischt wurden (Siehe Weetal, H. H., "Methods of Enzymology". Mosach, K., Ed., Academic Press: New York, 1976, Vol. XLIV, pp 139). Der nächste Schritt ist die Reaktion des Aminderivat-Glases mit Bern steinsäure-Anhydrid, um eine Karboxylsäuregruppe auf der Oberfläche zu erzeugen:
Eine Lösung von 0,20 g (2 mMol) Bernsteinsäure-Anhydrid wurde mit 40 mg (0,33 mMol) 4-Dimetylaminopyridin in 6 ml wasserfreiem Pyridin kombiniert und in Teströhrchen verteilt. Die Aminderivat-Deckgläser wurden in die Röhrchen gelegt, welche dann versiegelt und bei Raumtemperatur über 16 bis 20 Stunden geschüttelt wurden. Die Deckgläser wurden entfernt, mit Pyridin, Methylenchlorid und Ether gespült. Wenn sie gelagert wurden, wurden sie in einen Exsikkator über P&sub2;O&sub5; gelegt. (Siehe Damha, M. J., P. A., Zabarylo, S. V., Nucleic Acid Research, 18 (13), 33813, 1990.) Das Glas ist nun für die Zyanamidchemie bereit, welche mit der Aktivierung der mit Bernsteinsäure behandelten Oberfläche mit 1-Ethyl-3-(Dimethylaminpropyl)Zyanamidhydrochlorid (EDC) beginnt:
Die Prozedur und die Reagenzien waren diejenigen, welche mit dem Zyanamid-Kit für karboxylierte Mikropartikel (Polysciences, Inc., #19539) vorgeschlagen waren. Die karboxylierten Deckgläser wurden für 5 Minuten in Karbonatpuffer getaucht (Flasche #1) und dann für 5 Minuten in Phosphatpuffer (Flasche #2). 0,6 ml Phosphatpuffer wurde in die Teströhrchen mit den vorbereiteten Deckgläsern eingebracht. Eine 2%-ige Zyanamidlösung wurde durch Mischen von 75,0 mg EDC mit 3,75 ml Phosphatpuffer hergestellt. Die 0,6 ml EDC-Lösung wurde tropfenweise jedem der die Deckgläser enthaltenden Teströhrchen hinzugefügt und diese dicht verschlossen. Die Lösungen wurden für 3,5 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Deckgläser wurden dann entfernt und in einem Boratpuffer (Flasche #4) für 5 Minuten gefolgt von zwei oder mehr Spülungen mit Boratpuffer geschüttelt. Die aktivierte Oberfläche läßt man dann mit den zu immobilisierenden Alkylamin- Funktionsgruppen des Proteins (Kaninchen-Anti-IgG) unter Ausbildung einer Amidbindung reagieren:
Für die Proteinreaktion wurde eine 0,05 mg/ml-Lösung eines Kaninchen-Anti-IgG durch Hinzufügen von 73 ul Kaninchen- Anti-IgG (4,1 mg/ml; im Handel von Sigma erhältlich) zu 6 ml Boratpuffer hergestellt, welche dann restlos auf 6 Teströhrchen verteilt wurde. Die Deckgläser wurden eingetaucht, die Teströhrchen verschlossen und sanft über Nacht gerüttelt. Die Deckgläser wurden entfernt und der Flüssigkeitsüberstand für Absorptionsmessungen aufbewahrt. Für die Blockierungsreaktion wurden die Deckgläser dann in Teströhrchen gebracht, die 1 ml 0,1 M Ethanolamin (Flasche #5) enthielten und sanft über 30 Minuten gemischt. Die Deckgläser wurden dann in /ml einer BSA-Lösung (Flasche #6) überführt und sanft über 30 Minuten geschüttelt. Die Deckgläser wurden dann in PBS gespült und in einem Lagerpuffer (Flasche #7) oder in PBS, bei 4 bis 6ºC gelagert.
Das als Antiligand verwendete Protein kann auch auf einem transparenten Kunststoffsubstrat immobilisiert werden, das zuvor mit einem Polymer beschichtet wurde, das Rest-Karboxylatgruppen (Sera-Cot, Seradyn) für eine Zyanamidkopplung enthält.
In der Testprozedur wurde Kaninchen-IgG mit den Deckgläsern mit Kaninchen-Anti-IgG inkubiert, mit PBS gespült, und dann mit goldmarkierten Kaninchen-Anti-IgG und mit dem Silberanreicherungsschritt behandelt.
Insbesondere wurden die Deckgläser zweimal mit PBS gespült. Zur Erleichterung der Handhabung, wurde ein Deckglas in dem äußeren Spalt einer Wegwerfküvette angeordnet und 20 bis 40 ul eines kolloidalen mit Gold (30 nm) markierten Ziegen/Kaninchen-IgG (AuroProbe EM GAR G30, Amersham) auf die Oberfläche pipettiert und für 60 Minuten stehengelassen. Das Deckglas wurde dann in dieselbe Küvette eingebracht und dreimal sorgfältig mit PBS gefolgt von drei Spülungen mit H&sub2;O gespült.
Es folgte ein Silberanreicherungsschritt, welcher ein drastischeres Absinken der Transparenz des Testsubstrats nach der Reaktion erzeugte. In diesem Schritt dient das Gold als Keim für die Ausfällung von Silber aus einer Lösung in Bereich des markierten Antikörpers:
Dieses wurde durch die Verwendung des IntenSe Silver Enhancement Kit (RPN.491, Amersham) erreicht. Es wurde eine Lösung durch Kombination einer gleichen Anzahl von Tropfen von Lösungen A und B erzeugt. Die Anreicherungslösung wurde in Küvetten pipettiert, welche die einzelnen mit Gold markierten Antikörpern behandelten Deckgläser enthielten, und eine Reaktion über 6 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur zugelassen. Die Deckgläser wurden dann mit destillierte, H&sub2;O gespült. Die Reaktion kann zur Steigerung des Effektes wiederholt werden.

E. Testverfahrengemäße Quantifizierung

Es wurden Gleichungen für die Beschreibung der Abhängigkeit der Interferenzstreifen von den von den Schlitzen erzeugten Leuchtintensitäten abgeleitet, und diese Gleichungen können bei diesem Detektionsverfahren für die Quantifizierung des Ergebnisse eines Tests verwendet werden.
Die Gleichung für die Beschreibung einer als Sichtbarkeit (V&sub1;) des Streifenmusters bezeichneten Qualität kann durch die relativen Intensitäten (I&sub1; und I&sub2;) des gemäß Darstellung in Fig. 1 durch die zwei identischen Schlitze (S&sub1; und S&sub2;) hindurchtretenden Quellenlichtes berechnet werden, und kann somit wie folgt berechnet werden:
wobei I&sub1; und I&sub2; die Intensitäten am Punkt P der durch die Schlitze 1 und 2 hindurchtretenden Strahlung sind, wenn diese unabhängig voneinander betrachtet werden, und γ&sub1;&sub2; = 1 eine Koherenzgrenzwert für eine Laserquelle ist.
Die Sichtbarkeit (V&sub2;) kann auch durch die Intensität der Streifen berechnet werden:
wobei Imax und Imin die Intensitäten sind, die einem Maximum und einem benachbarten Minimum in dem Streifensystem entsprechen.
Imax und Imin sind Funktionen der durch die Schlitze S&sub1; und S&sub2; hindurchtretenden Lichtintensitäten:
Imax = I&sub1; + I&sub2; + 2 I&sub1;I&sub2;γ&sub1;&sub2; Gl. (4)
Imin = I&sub1; + I&sub2; - 2 I&sub2;I&sub1;γ&sub1;&sub2; Gl. (5)
Da Imax und Imin durch I&sub1; und I&sub2; bestimmt sind, folgt dann daraus, daß die zwei Sichtbarkeitsgleichungen identische Werte (V&sub1; = V&sub2;) erzeugen sollten.
Wenn die Intensität für I&sub1; konstant gehalten wird, während die Intensität für I&sub2; reduziert wird, kann man die Veränderung in dem Streifenmuster berechnen. Die Tabelle 4 enthält Werte für ein Modellsystem, in welchem der Intensität (I&sub1; und I&sub2;) durch jeden Schlitz jeweils ein Wert 10 zugeordnet ist. Wenn die Intensität durch jeden Schlitz identisch ist existiert der obere Wert 1,0 für V&sub2;; da mit verringerter Intensität I&sub2; sich V&sub2; auf 0,0 verringert. Wenn V&sub2; = 1,0 ist, weist das Streifenmuster die maximale Amplitude Imax und einen vollständigen Verlust der Amplitude bei Imin auf. Wenn sich V&sub2; auf 0,0 zu bewegt, bricht das Streifenmuster auf die Beugungshüllkurve zusammen. TABELLE 4 DIE VERÄNDERUNG IN IMAX UND IMIN ABHÄNGIG VON DEM TRANSMISSIONSVERLUST DURCH EINEN SCHLITZ
Ein Graph zweier benachbarter Streifen ist in Fig. 5 dargestellt. Die mit A bezeichnete Linie beschreibt die Intensitäten von Imax und Imin, die von zwei gleichen unbehinderten Schlitzen erzeugt werden. Die Linien B bis F stellen die Veränderung in den Amplituden dar, wenn die Intensität durch einen Schlitz verringert wird. Bei Imax für die Linie F ist die Intensitätsamplitude nahezu 10, was die Intensität des durch den unbehinderten Schlitz passierenden Lichtes oder I&sub1; ist.
Es ist wichtig, klar zu erkennen, daß die Summierung der zwei Schlitzintensitäten (I&sub1; + I&sub2;) ohne das Phänomen der konstruktiven Interferenz in Fig. 5 einen Wert von 20 ergäbe. Somit beruht die in den Linien A bis C beobachtete Intensität Imax, dort wo die Amplitude größer als 20 ist, auf der kon struktiven Interferenz. Somit stellen die Amplitudenwerte zwischen 20 und 40 einen erhöhten Signalanteil für die Korrelation der Testinformation dar.
Die Intensität von Imax am Punkt P kann ebenfalls aus der Abschwächung von I&sub2; aufgrund einer Veränderung in der Absorption (ΔA = Δ&epsi;bc) der Probe quantifiziert werden. Die bestehenden Formeln, welche die Absorptionsspektroskopie bestimmen, können mit den für die Bewertung der Interferenzphänomene verwendeten Formeln verknüpft werden, da beide Methodologien auf der Transmissionsintensität einer Quelle und der sich ergebenden Intensität aufgrund des Durchtritts der Strahlung durch eine Probe basieren.
Die Transmission T ist als das Verhältnis der Intensitätvon nicht absorbierter Strahlung I zu der Intensität der einfallenden Strahlung I/I&sub0; definiert. Aus dem Beer'schen Gesetz existiert die Beziehung zwischen &epsi;bc und T, wobei &epsi; der Extinktionskoeffizient der absorbierenden Spezies, b die Pfadlänge der Zelle, und c und c die Konzentration der Spezies ist:
In der vorgeschlagenen Konfiguration zum Messen der Interferenzphänomene kann die Transmissionsintensität I&sub2; als ein Verhältnis der Intensität nicht absorbierter Strahlung zu der Intensität einfallender Strahlung I&sub1;/I&sub0; betrachtet werden:
I&sub1; = unmodulierter Strahl = I&sub0; Gl. (7)
I&sub2; = Teststrahl = Ix/I&sub0; Gl. (8)
Aus der Gleichung 6 folgt:
Ix/I&sub0; = 10-&epsi;bc
Ix = I&sub0;10-&epsi;bc Gl. (9)
Ein Einsetzen der vorstehenden Identitäten in die Imax- Gleichung ergibt einen Imax-Ausdruck als Funktion der durch &epsi;bc definierten Absorption für eine bestimmte Spezies:
Imax = I&sub1; + I&sub2; + 2 I&sub1;I&sub2; Gl. (10)
Imax = I&sub0; + 10-&epsi;bc + 2 I&sub0; · 10-&epsi;bc Gl. (13)
Von Interesse ist ein Vergleich der relativen Signaländerung sowohl von ΔT als auch von ΔImax für identische Probenkonzentrationen und Volumina. Die Transmissionswerte für eine Absorptionsreihe (Δ&epsi;bc) gemäß Messung in einem Standardspektrophotometer sind in Tabelle 5 zusammen mit aus der Gleichung 13 berechneten Werten von Imax für dieselbe Reihe dargestellt. Beide Funktionen ΔT und ΔImax sind in Fig. 6 aufgetragen. Für jede gegebene Konzentrationsveränderung weist die ΔImax-Funktion einen größeren dynamischen Bereich als die ΔT- Funktion für die dieselbe Veränderung in &epsi;bc auf. Beispielsweise erzeugt die Konzentrationsveränderung zwischen 0,25 und 0,50 Absorptionseinheiten ein ΔImax von 0,55 Einheiten an Intensitätsveränderung und ein ΔT von 0,23 Einheiten an Intensitätsveränderung. Daher wäre die ΔImax-Funktion mehr als zweimal so empfindlich wie die ΔT-Funktion. Der vergrößerte dynamische Bereich ergibt sich aus dem Umstand, daß die Gleichung 13 zwei Terme enthält, welche sich als Funktion der Absorptionsmodulation verändern. Da die Empfindlichkeit der spektroskopischen Analyse durch die Größe des Absorptionsvermögens sowie des minimalen Absorptionsgrades, welcher mit dem erforderlichen Grad an Sicherheit gemessen werden kann, defi niert ist, würde die ΔImax-Funktion eine größere spektrophotmetrische Empfindlichkeit aufweisen. TABELLE 5 AUS EINER ABSORPTIONSREIHE BERECHNETE IMAX-WERTE

F. Dynamischer Bereich der optischen Detektionsvorrichtung

Der dynamische Bereich eines Signalumwandlungsmechanismus ist als das Maß der Signalveränderung pro Veränderungseinheit in der Konzentration des Analyten zu verstehen:
Dynamischer Bereich = ΔSignal/ΔKonzentration
Mit steigendem Grad der Signaländerung pro Konzentrationsveränderung wird auch die Detektierbarkeit des Signals sowie die Genauigkeit oder Auflösung der Konzentrationsmessung höher.
V&sub2; (Gl. 3) ist in Fig. 7(a) als eine Funktion des Prozentsatzes der Transmission (I&sub2;%) durch den zweiten Schlitz S&sub2; (Tabelle 4) aufgetragen. Bei 100% Transmission durchtreten gleiche Intensitäten zwei identische Schlitze und das Streifenmuster weist die definiertesten Streifen auf, wobei Imax seinen höchsten Wert annimmt und Imin Null ist. Bei 0% tritt ein vollständiger Verlust des Streifenmusters auf und nur die Beugungshüllkurve bleibt bestehen. Dem in Fig. 7(a) dargestellten Graphen kann man beliebig 40 Einheiten auf der Sichtbarkeitsskala zuweisen. Bei dem Testverfahren ist die Veränderung der Transmission durch S&sub2; eine Funktion der Konzentration des an das Deckglas gebundenen Analyten, und daher ist I&sub2;% die Konzentrationskomponente. Der dynamische Bereich ist deshalb:
Dynamischer Bereich = ΔV&sub2;/ΔI&sub2;% Gl. (14)
Anhand des Graphen von Fig. 7a kann sehen, daß diese Beziehung nicht fest ist, sondern sich ziemlich drastisch verändert, wenn ΔI&sub2;% gegen Null geht. Von den 40 Einheiten einer Signalunterteilung erzeugt ein Verlust von 50% Transmission in I&sub2; eine Sichtbarkeitsveränderung von 1,0 auf 0,94 oder 2,5 Einheiten des Signals. Der dynamische Bereich wäre auf diese Weise berechnet 0,05:
Ein Transmissionsverlust in I&sub2; von 50% bis 0% erzeugt eine Sichtbarkeitsveränderung von 0,94 auf 0,0, oder 37,5 Signaleinheiten, und eine Erhöhung des dynamischen Bereichs auf 0,75. Somit kann man sehen, daß der dynamische Bereich deutlich eine Funktion des Maßes des Transmissionsverlustes ist und daß er erheblich ansteigt, wenn sich die Transmission Null annähert. Eine linearere Kurve der Sichtbarkeits-(V&sub2;)- Daten kann durch Auftragen einer Kurve -logV&sub2; · 1000 über Δ%I&sub2; erzeugt werden, welche in Fig. 7b dargestellt ist.
Die Veränderung in der Streifensichtbarkeit ist jedoch nicht die einzige nützliche Funktion zum Berechnen einer dynamischen Antwort. Unter Verwendung des Models und der Werte von Tabelle 4 sind die Veränderung in Imax und Imin als eine Funktion von ΔI&sub2;% in Fig. 8 dargestellt. Dort wo kein Transmissionsverlust auftritt, weist Imax seine höchste Amplitude von 40, und Imin seine niedrigste Amplitude von 0,0 auf. Bei einem vollständigen Transmissionsverlust, erreichen beide Werte identische Werte von 10,0, was die Intensität durch nur einen offenen Schlitz ist. Wenn sich I&sub2;% von 100 auf 50% verändert, ist der dynamische Bereich in Termen von Imax gleich 0,22:
was deutlich größer als der in Termen von V&sub2; berechnet dynamische Bereich gemäß Auftragung in Fig. 7a ist. Die dynamische Antwort von Imin über denselben Bereich ist 0,012. Wenn der Transmissionsverlust ein ΔI&sub2;% von 50% auf 0% erzeugt, nimmt nun der dynamische Bereich in Termen von Imin 0,38 an.
Wiederum werden diese Berechnungen über großen beliebigen Segmenten des Graphen ausgeführt und sind grobe Mittelwerte. Sie zeigen aber nicht an, daß eine Bewertung eines dynamischen Bereichs einer spezifizierten Form der Signalmessung (V oder Imax) zugeordnet sein muß und sorgfältig über den gesamten Prozentsatz des Transmissionsverlustes kalibriert sein muß. Trotzdem zeigen beide Graphen, daß eine sich deutlich verändernde Funktion mit einer Veränderung in Prozent der Transmission I&sub2; korreliert werden, und deren Beitrag zu Streifenmusterwerten anschließend mit der Analytkonzentration korreliert werden kann.
Ein sehr interessanter Aspekt dieses Detektionsverfahrens sollte an diesem Punkt betrachtet werden. In Fig. 8 ist auch die Funktion C aufgetragen, welche den Verlust von I&sub2; bei unabhängiger Beobachtung darstellt. Eine Verringerung von 100 auf 50% Transmission erzeugt nur 5 Einheiten einer Signalver änderung und weist einen dynamischen Bereich von 0,10 auf. Die Veränderung von 50% auf 0% Transmission weist dieselbe Anzahl von Signaleinheiten und somit denselben dynamischen Bereich auf. Somit ist 0,1 der limitierende dynamische Bereich für einen linearen Verlust der Transmissionsmessung und dieses ist beträchtlich weniger als der dynamische Bereich, der von einem Umwandlungsmechanismus auf der Basis einer sich ändernden Amplitude eines Interferenzstreifens gemäß Beschreibung in der vorstehenden Analyse der Graphen in Fig. 7 und 8 erzeugt wird.
Daher ist das Schlitzformat im Prinzip empfindlicher als die einfache optische Dichte. Diese verbesserte Empfindlichkeit ist durch einen Vergleich der relativen Auflösungen der Messungen klar erkennbar. Als Auflösung wird üblicherweise der inverse Wert des dynamischen Bereichs verwendet. Für einen dynamischen Bereich von 0,10, wie er für den linearen Verlust berechnet ist, wäre die Auflösung oder die Anzahl, die mit Sicherheit gemessen werden kann, gleich 10,00. Für einen dynamischen Bereich von 0,22, wie er für die Veränderung von Imax von 100 auf 50% Verlust an Transmission gemessen wird, wäre die Auflösung 4,54, was bedeutet daß die Sicherheit des gemessenen Wertes einer kleineren Anzahl als im vorhergehenden Falle entsprechen würde, und somit genauer wäre. Ein dynamischer Bereich von 0,75 weist eine Auflösung von 1,33 und liefert somit noch mehr Genauigkeit.
Die Empfindlichkeit dieses Testverfahrens ist durch die Anzahl der Zielmoleküle bestimmt, die erforderlich ist, um die Transmission durch S&sub2; so zu behindern, daß eine meßbare Veränderung in dem Streifenmuster erzeugt wird. Einige Faktoren tragen zu der sich letztlich ergebenden Empfindlichkeit bei:
1. Die Größe des Schlitzes.
2. Die Grenzkonzentration des immobilisierten Antiliganden auf dem Deckglas.
3. Die Grenzkonzentration des Analyten und des mit Gold markierten Antikörpers, der mit der Testoberfläche aus der Lösung verbunden ist.
4. Der Beitrag des Silberausfällungsschrittes zu dem Transmissionsverlust.
5. Die Fähigkeit, eine kinetische Messung mit der Silberausfällungsreaktion vorzunehmen.
Ein Analyse der möglichen Empfindlichkeit wurde basierend auf einem Artikel (Bhatia et al. Anal. Biochem. 178, 408,1989), in dem die kovalente Immobilisierung eines Antikörper auf einer Glasoberfläche optimiert wurde, erstellt. Die Konzentrationen eines gebundenen Antikörper sowohl auf einen Deckglas als auch auf optischen Fasersubstraten sind nachstehend dargestellt. VERGLEICH EINER ANTIKÖRPERBINDUNG AN DECKGLAS UND FASER
Für eine Schitzgröße von 5 um · 100 um kann eine Empfindlichkeit von 6 · 10&sup5; Molekülen wie folgt berechnet werden:
Schlitzgröße: 5 um · 100 um = 500 um² = 500 · 10&sup6; nm²
Maximaler auf der Schlitzfläche immobilisierter Antikörper:
x = 0,002 fmol
Antigeneinfang (50%) = 0,001 fmol
= 6 · 10&sup5; Moleküle
Markierter Antikörpereinfang (50%) = 0,0005 fmol
= 3 · 10&sup5; Moleküle
Die Fläche der kolloidalen Goldmarkierung von 30 nm ist:
Fläche = πr²
= 706,5 nm²
Die theoretische Anzahl von Molekülen, die zum Abdecken des gesamten Schlitzes erforderlich ist, kann bestimmt werden durch:
Diese theoretische Behandlung schließt jedoch nicht den Effekt des Silberausfällungsschrittes mit ein, welcher den größten Beitrag in der Veränderung der Intensität des Deckglases zu liefern scheint. Wenn 3 · 10&sup5; Moleküle eines mit Gold markierten Antikörpers 43% des Schlitzes überdecken, sollte eine Reduzierung der Transmission auf 57% die Intensität von Imax um ca. 25% reduzieren (Fig. 8). Die Silberausfällung kann die Empfindlichkeit weit über diesen Schätzwert von 3 · 10&sup5; Molekülen hinaus ausdehnen. In einigen der Experimente wurden war ein nicht mit Gold markierter Antikörper mit dem bloßen Auge auf dem Deckglas bis nach dem Ausfällungsschritt sichtbar, wonach das Deckglas deutlich undurchsichtig wurde.
Das Detektionsverfahren der Erfindung besitzt eine Anzahl erheblicher Vorteile. Die Signalausgabe liegt sowohl in der Form eines Amplitudenparameters als auch einer Musterbildung vor, welche einen größeren Informationsgehalt zur Datenanalyse gegenüber einem System bietet, das nur auf einer Intensitätsmessung basiert. Für das beschriebene auf Interferenz basierende System kann das Signal in der Form des gesamten Interferenzmusters in einem Computerspeicher gespeichert und mit einem Computerstandard verglichen werden, so daß eine mikroskopische Veränderung gegenüber dem Standardmuster, die nur durch eine computerisierte Behandlung möglich ist, eine ausnehmend empfindliche Diagnose liefern kann.
Ein weiterer Vorteil des Umwandlungsverfahrens der Erfindung besteht darin, daß die Amplitudenkomponente in der Form von Imax gegenüber einer Direktmessung der Intensität aufgrund des Beitrags der zwei individuellen Wellenfronten sowie der konstruktiv interferierenden elektromagnetischen Wellen um das Vierfache erhöht ist. Dieses erhöht wiederum, den Informationsgehalt des potentiellen Signals, was den dynamischen Bereich und somit die Empfindlichkeit des Verfahrens erhöhen dürfte. Eine Empfindlichkeit von weniger 10&sup5; Molekülen ist möglich, was der Empfindlichkeit von Isotopen-Verfahren gleicht oder diese überschreitet.
Eine weitere zugrunde liegende Qualität, welche diese Methodologie gegenüber anderen Detektionsverfahren sehr wettbewerbsfähig machen dürfte, ist die Einfachheit ihres optischen Aufbaus und Prinzips sowie die Einfachheit der Testprozedur. Eine solche Einfachheit kann zu Robustheit sowie Wirtschaftlichkeit führen. Ein kompaktes Tischinstrument dürfte einfach herstellbar sein, wobei die Testchemie in einem Wegwerf- Eintauchstab enthalten ist. Zur Verwendung bei mit Gold markierten Reagenzien, erfordert der Eintauchstab Inkubationen mit der Probe, mit dem mit Gold markierten Antikörper und mit Silberanreicherungslösungen, was in 1 bis 2 Stunden erreicht werden könnte. Zur Anwendung bei einer Bakterienzelle, würde eine einfache Inkubation mit der Probe, gefolgt von einer Spülung die Prozedur abschließen. (Es kann möglich sein, daß nur 2 bis 3 gebundene Zellen für eine Veränderung des Streifenmusters ausreichen).
Und letztlich ist dieses ein allgemeines System, welches bei alle klinischen oder umwelttechnischen Proben, die an spezifischen Erkennungsereignissen mitwirken, angewendet werde. Auf Immunchemie und DANN beruhende Tests werden die ersten Entwicklungsbereich sein. Schließlich können andere molekulare Erkennungssysteme, wie z. B. chemische Rezeptoren, Zyklodextrine, oder Ionen-selektive Membranen in analytische Anwendungen mit einbezogen werden. Dieses System könnte auch bei Untersuchungen von Prozessen in der Werkstoffwissenschaft, wie z. B. zur Überwachung des Kistallwachstums, photoinduzierter Polymerisationen und Oberflächenfilmabscheidungen verwendet werden.

G. Alternative Ausführungsformen

Zahlreiche Varianten des vorstehend beschriebenen Grundausführungsbeispiels sind angedacht. Beispielsweise kann die Anzahl und Form der Schlitze variiert werden. Das vorliegende bevorzugte Ausführungsbeispiel ist ein Doppelschlitz, der aus zwei identischen, parallelen Schlitzen ausgebildet ist, wobei aber vorhersagbare Interferenzphänomene auch mit anderen Anzahlen identischer Schlitze erzeugt werden können. Mit mehr als zwei Schlitzen wäre es möglich, einzelne Proben verschiedenen Schlitzen zuzuordnen, oder Testproben in jedem Schlitz könnte auf mehrere Analyte hin mit nur einer Prozedur untersucht werden.
Obwohl die vorstehend beschriebenen Sichtbarkeitsgleichungen nicht für nicht-identische parallele Schlitze abgeleitet sind, kann es möglich sein, daß dieses Verfahren durch nicht-identische Schlitze verbessert wird.
Ferner können Löcher anstelle von Schlitzen zur Ausbildung eines kreisförmigen Interferenzmusters verwendet werden. Beispielsweise erzeugen zwei Stiftlöcher ebenfalls Interferenzstreifen und können mit einer Präzision von etwa 2 um im Durchmesser hergestellt werden, was eine kleinere Gesamtoberfläche als die vorgeschlagene Schlitze ergäbe (und somit die Empfindlichkeit verbesserte). Die Testchemie könnte in Form von Tropfen auf dem Stiftloch ausgeführt werden, und daher nur sehr winzige Probenvolumina erfordern.
Der auf dem Deckglas 50 auftretende Testkomplex könnte auch dazu dienen, zwei Schlitze S&sub1; und S&sub2; aus nur einem Schlitz S&sub0; zu erzeugen, wie es in Fig. 9a bis 9d dargestellt ist. In diesem Falle wird der Antiligand S&sub2; an einer Kante des Deckglases immobilisiert (Fig. 9b). Der Komplex verdunkelt die Kante des Deckglases (Fig. 9c), welche dann über dem Einzelschlitz S&sub0; (Fig. 9a) gemäß Darstellung in Fig. 9d positioniert würde, und dadurch zwei Schlitze S&sub1; und S&sub2; ausbildet.
Die Testchemie könnte so auf einen Glasschlitz 90 konzentriert werden, daß der mit Gold markierte Antikörperkomplex einen Doppelschlitz 92 gemäß Darstellung in Fig. 10 ausbildet.
Es ist gemäß Darstellung in Fig. 11 auch möglich, Doppelschlitz-Interferenzstreifen durch optische Konfigurationen zu erzeugen, die virtuelle Schlitze generieren. Obwohl das Prinzip des Verfahrens dasselbe wie das vorstehend beschriebene wäre, würde die Veränderung der Transmission eine Interferenz mit der den virtuellen Schlitz erzeugenden Geometrie erfordern.
In dieser Anordnung verlaufen Lichtstrahlen aus nur einem Schlitz S&sub1; zu den Schirm 80 über zwei Pfade, wovon einer direkt ist, A-A, und der andere ein indirekter Pfad B-B ist, der durch die Reflexion eines Spiegels M erzeugt wird, der so in der Mittellinie C/L angeordnet ist, daß eine Reflexion erzeugt wird, die von einem Schlitz S&sub2; auszugehen scheint, der äquidistant zu der Mittellinie angeordnet ist. Die Quelle wird daher über zwei Pfade, einen direkten und einen bei einem Glanzwinkel in einem Spiegel reflektierten betrachtet. Die Reflexion dreht die Phase um 180º, aber ansonsten bleiben die Analyse und die Streifen dieselben. Die Reflexionsfläche auf dem Spiegel wäre die Stelle des Testkomplexes, welche ein Auftreten oder einen Verlust an Reflexion bewirken könnte.
Die vorstehende Konfiguration beinhaltet die Verwendung eines Lloydschen Spiegels. Ein Fresnelscher Spiegel kann in Fig. 12 verwendet werden, um zwei virtuelle Schlitze zu erzeugen, welche mit einer Punktquelle S ausgebildet werden, die auf zwei plane Spiegel M&sub1; und M&sub2;, die wechselseitig in einem kleinen Winkel geneigt sind, projiziert wird.
Die zwei sich ergebenden virtuellen Abbildungen S&sub1; und S&sub2; wirken als kohärente Quellen. Die Trennung von S&sub1; und S&sub2; ist definiert als
d = 2b sin α
wobei α der Winkel zwischen den Spiegeln ist. Wiederum würde der Komplex auf einem der Spiegel angeordnet und die sich ergebende Veränderung in der Reflektivität zur Korrelation der Konzentration des Analyten verwendet werden.
Zwei gleiche Prismen bilden, wenn sie Basis an Basis gemäß Darstellung in Fig. 13 mit ihren Brechkanten parallel zueinander angeordnet werden ein Fresnelsches Doppelprisma und teilen eines Lichtkonus aus der Quelle S in zwei überlappende Koni. Die Prismen bilden somit zwei virtuelle Schlitzabbildungen S&sub1; und S&sub2;. Eine sogenannte Billetsche Halblinsenanordnung, gebildet von zwei konvexen Linsen, kann zwei Abbildungen ausbilden, wovon beide gemäß Darstellung in Fig. 14 real sind.
Bei all diesen optischen Anordnungen werden Interferenzstreifen in dem Bereich ausgebildet, der von den von den Quellen S&sub1; und S&sub2; ausgehenden divergierenden Koni definiert wird. Es könnten Testformate entwickelt werden, welche die optische Anordnung verändern und somit die Streifenmuster ändern. Beispielsweise würde die Verwendung des Lloydschen Spiegels (Fig. 11) oder des Fresnelschen Spiegels (Fig. 12) die Anordnung des Testkomplexes in dem Bereich der Reflexion des Spiegels erfordern, welcher den virtuellen Schlitz erzeugt. Wenn die Testchemie zu einem Verlust an Reflektivität auf der Spiegeloberfläche führt, nimmt die Intensität des reflektierten Lichtes ab und das Interferenzmuster wird modu liert. Die Anwendung des Fresnelschen Doppelprismas (Fig. 13) oder der Billetschen Halblinse (Fig. 14) würde die Anordnung des Testkomplexes auf einem der Prismen oder der Linsen in der Weise erfordern, daß die Intensität der gebeugten Strahlung nach der Ausbildung des Testkomplexes nicht mehr gleich der von der anderen optischen Einheit in dem Paar gebeugten Intensität ist.
Gemäß Darstellung in Fig. 15 könnten Reaktionen unter Verwendung einer Mikroausführung einer Transportdurchflußzelle 94 beobachtet werden, welche eine Interferenzabsorption auf einem Schirm 96 aufbaut. In Fig. 15 ist B eine Referenzküvette, A eine Testküvette, und diese sind durch eine Küvettentrennung C getrennt. Die Ablauf der Reaktion erzeugt eine molekulare Population, die entweder in der Durchflußzelle A verbleibt oder an deren Oberfläche eingefangen wird und dadurch das durchgelassene Licht nicht-identisch zu dem die Zelle B passierenden Licht macht.
Eine weitere Konfiguration würde in einer Transportdurchflußzelle 86 gemäß Fig. 16 integrierte Schlitze S&sub1; und S&sub2; aufweisen. Die Zelle 86 ist gegenüber einer Quelle 85 angeordnet. Der Antiligand würde auf S&sub1; immobilisiert werden, und der Aufbau des Antiliganden auf dessen Oberflächen würde das von dem Detektor 87 gesehene Streifenmuster verändern.
Der dynamische Bereich des Detektionssystems kann nicht nur durch die Erhöhung der Anzahl der Schlitze, sondern auch die Erhöhung der Anzahl der durch den Testkomplex abgedeckten Schlitze erhöht werden. Die nachstehende Tabelle 6 stellt dar wie die Intensität der Hauptmaxima als eine Funktion von N² mal der Intensität I&sub0; nur eines Schlitzes ansteigt. TABELLE 6 DIE INTENSITÄT DER HAUPTMAXIMA AUS N SCHLITZEN IST N² · I&sub0;
Fig. 19 ist eine graphische Darstellung der Daten von Tabelle 6. Gemäß Darstellung in Fig. 17 steigt der Intensitätsbereich, wenn das Testdia 100 5 von 6 Schlitzen 104 der Maske 102 abdeckt um 350 Einheiten an; wobei anstelle von 1 von 2 Schlitzen wie folgt: bei 6 Schlitzen I = 360 ist, bei 1 Schlitz I = 10 ist und die Änderung Δ = 350 ist, während in dem Zweischlitzsystem Δ = 30 ist, da wie folgt bei 2 Schlitzen I = 40 ist, bei 1 Schlitz I = 10 ist, und Δ = 40 - 10 oder 30 ist.
Wenn nur 3 Schlitze auf einer Maske mit 6 Schlitzen gemäß Darstellung in Fig. 18 abgedeckt sind, wird das sich ergebende Δ = 270 wie folgt berechnet:
Anmerkung: Die dem Komplex zugeordneten Schlitze müssen nicht nebeneinander liegen.
Das Testsubstrat 60 könnte ebenfalls die Schlitze S&sub1; und S&sub2; (Fig. 20a) enthalten, wobei der Antiligand 62 auf nur einem der Schlitze (d. h., S&sub1;) immobilisiert ist. Die Testreaktion bewirkt, daß der Schlitz S&sub1; weniger transparent wird (Fig. 20b). In diesem Ausführungsbeispiel wird die optische Strahlung durch identisches Schlitzmaterial geführt, was symmetrische Phasen der zwei Wellenfronten bewahrt. Ferner würde jede nicht spezifische Bindung in gleicher Weise in der Bereichen von S&sub1; und S&sub2; auftreten, was wiederum die Symmetrie von I&sub1; und I&sub2; bewahrt, da beide Intensitäten in gleicher Weise von dem kontaminierenden Material verändert würden.
Fig. 21a und 21b veranschaulichen alternative Ausführungsbeispiele, in welchen die Maske oder der Testschlitz 70/70' quadratisch (Fig. 21a) oder dreieckig (Fig. 21b) geformt ist. Ein einzelner quadratischer Schlitz erzeugt ein Interferenzmuster 72 gemäß Darstellung in Fig. 21a. Ebenso erzeugt ein einzelner dreieckig geformter Schlitz 70' das Muster 72' von Fig. 21b.
Durch Immobilisieren des Antiliganden 74 auf einer diagonalen Hälfte eines quadratischen Schlitzes 70 wie in Fig. 21c und Durchführen der Reaktion des Antiliganden mit einem geeigneten Liganden in einem Test, wird der quadratische Schlitz 70 zu einem dreieckigen Schlitz Fig. 21d, und ein auf einem Dreieck basierendes Beugungsmuster 72' tritt in Fig. 21b auf. Ein (nicht dargestellter) Detektor überwacht das Auftreten des neuen Beugungsmusters 72', um das Vorhandensein und die Konzentration des Liganden zu ermitteln.

Äquivalente

Der Fachmann auf diesem Gebiet wird unter Anwendung von nicht mehr als Routineexperimenten viele Äquivalente zu den hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsbeispielen der Erfindung erkennen oder in der Lage sein diese festzustellen.
Diese und alle anderen Äquivalente sollen von den nachstehenden Ansprüchen mit abgedeckt sein. Beispielsweise ist die Erfindung, obwohl sie in Verbindung mit Lichtwellen im sichtbaren Spektrum beschrieben wurde, auf alle elektromagnetischen Wellen über das gesamte Spektrum anwendbar.

Claims

1. Verfahren zur optischen Detektion des Vorhandenseins eines Liganden in einer Probe, in welcher der Ligand an ein Testsubstrat gebunden und mit einem Antiliganden reagiert ist, um einen Komplex des Liganden und des Antiliganden auf dem Testsubstrat zu erzeugen, wobei die optischen Eigenschaften dieses Komplexes sich von denen des Liganden unterscheiden; mit den Schritten:

a) Ausbilden eines Interferenzmusters durch die Projektion von Licht durch Öffnungen in einer Maske, die in dem Lichtpfad angeordnet ist, so daß die von den Öffnungen ausgehenden gebeugten Strahlen miteinander interferieren, um das Muster zu erzeugen;

b) Stören wenigstens eines, aber nicht aller, derartigen gebeugten Strahlen mittels des Komplexes, welcher in dem Pfad wenigstens eines, aber nicht aller, derartigen gebeugten Strahlen angeordnet ist, und dadurch Verändern des Interferenzmusters; und

c) Beobachten der Veränderung in dem Muster, um das Vorhandensein des Liganden zu ermitteln.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei sich die Veränderung in dem Interferenzmuster aus einem von Streuung, Absorption, Phasenänderung, Beugung oder Polarisation des einfallenden Lichtes selektierten Phänomen ergibt, und/oder die Veränderung in dem Muster von der Konzentration des Liganden in dem Test abhängt und das Verfahren den Schritt der Korrelation der Veränderung enthält, um eine derartige Konzentration zu ermitteln.

3. Verfahren zum Erzeugen einer optischen Anzeige der relativen Konzentration eines Liganden und eines Antiliganden, z. B. eines mit einem Metall markierten Antiliganden in einer Probe, mit den nachstehenden Schritten:

a) Ausbilden eines Interferenzmusters durch Projektion von Licht durch eine Maske mit N Schlitzen, wobei N ein ganze Zahl größer als Eins ist;

b) Abdecken von N-X Schlitzen mit einem an ein Testsubstrat gebundenen Komplex, wobei der Komplex den Liganden und den Antiliganden enthält, wobei der Komplex zu einer Veränderung in einer optischen Eigenschaft der abgedeckten Schlitze und einer sich daraus ergebenden Veränderung in dem Interferenzmuster führt, und wobei X ein ganze Zahl kleiner als N ist; und

c) Ermitteln der Konzentration durch Messen der Veränderung der optischen Eigenschaft eines oder mehrerer Punkte auf dem Interferenzmuster vor und nach der Abdeckung der N-X Schlitze;

und wobei optional die Punkte in Schritt (c) im wesentlichen alle Punkte innerhalb eines Bereichs von Punkten innerhalb des Interferenzmusters sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei entweder der Ligand oder Antiligand ein optisch dichtes Molekül ist, welches eine Streuung, Absorption, Phasenveränderung, Beugung oder Polarisationsveränderung des einfallenden Lichtes bewirkt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei N = 6 und X = 5, oder N = 2 und X = 1 ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration durch Ermitteln eines Sichtbarkeitsparameters und durch Vergleichen der ermittelten Sichtbarkeit mit einer Referenzkurve der Sichtbarkeit über der Konzentration gemessen wird.

7. Verfahren zum Erzeugen einer optischen Anzeige des Vorhandenseins eines Liganden oder eines Antiliganden, in einer Probe, mit den nachstehenden Schritten:

a) Ausbilden eines Interferenzmusters durch Projektion von Licht durch eine Maske mit N Sehlitzen, wobei N ein ganze Zahl größer als Eins ist;

b) Abdecken von N-X Schlitzen mit der Probe, wobei die Probe den Liganden und den Antiliganden enthält, wobei die Probe auf einem Testsubstrat angeordnet, und wobei X eine ganze Zahl kleiner als N ist; und

c) Durchführen der Reaktion des Liganden und Antiliganden, um einen Transparenzverlust durch die N-X abgedeckten Schlitze hindurch zu erzeugen, der das Vorhandensein des Liganden oder Antiliganden anzeigt.

8. Verfahren zum Ermitteln der Konzentration eines Liganden in einer Probe, mit den Schritten:

a) Erzeugen eines Interferenzmusters zwischen zwei oder mehr elektromagnetischen Wellen, wie z. B. Lichtwellen, wobei sich die Wellen aus dem Durchtritt eines Strahls elektromagnetischer Energie durch eine Maske hindurch ergeben, die für die elektromagnetische Energie transparente Öffnungen enthält;

b) Immobilisieren des Liganden auf einem Testsubstrat;

c) Reagieren des Liganden mit einem Antiliganden, um eine Änderung der Reaktion des Liganden auf die Wellen zu bewirken;

d) Modulieren des Interferenzmusters durch Anordnen des immobilisierten und ausreagierten Liganden in dem Pfad mindestens einer, aber nicht aller Wellen; und

e) Ermitteln der Ligandenkonzentration anhand der Veränderung des Interferenzmusters, z. B. unter Anwendung eines Densitometers.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Veränderung in dem Interferenzmuster eine Veränderung ist, die sich aus einer Streuung, Absorption, Polarisation oder Beugung ergibt.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei sich die Interferenz aus dem Hindurchtreten der Wellen durch N Schlitze ergibt, die in einer Maske ausgebildet sind, wobei N eine ganze Zahl größer als Eins ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Schlitze quadratisch geformt oder dreieckig geformt sind.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Maske auf dem Testsubstrat ausgebildet ist, auf welchem der Ligand und der Antiligand reagieren.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei X Schlitze von der Testprobe abgedeckt werden und X eine ganze Zahl kleiner als N ist.

14. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Veränderung in dem Interferenzmuster durch Berechnen des Sichtbarkeitsparameters des Musters ermittelt wird und die Konzentration des Liganden durch Vergleichen des Sichtbarkeitsparameters mit einer Referenzkurve der Sichtbarkeit über der Ligandenkonzentration ermittelt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 8, wobei einer oder mehrere von den Schlitzen ein virtueller Schlitz ist, welcher z. B. durch ein Teil aus der Klasse erzeugt wird, die einen Lloydschen Spiegel, Fresnelschen Spiegel, ein Fresnelsches Doppelprisma, oder eine Billetsche Halblinse umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Schlitze transparente Bereiche in einer ansonsten im wesentlichen undurchsichtigen Oberfläche einer Durchflußzelle sind, und wobei der Antiligand an wenigstens einem, aber nicht an allen Schlitzen immobilisiert ist.

17. Vorrichtung zum Detektieren des Vorhandenseins oder der Konzentration eines Liganden auf einem Substrat, mit:

a) einer Lichtquelle, wie z. B. einem Laser, zum Emittieren eines Lichtstrahls;

b) einem Strahlteiler mit einer Maske mit wenigstens zwei Öffnungen, um die Aufspaltung des Lichtstrahls in wenigstens zwei aufgeteilte Lichtstrahlen zu bewirken, welche miteinander interferieren, um ein Interferenzmuster zu bilden;

c) dem Substrat;

d) wenigstens einem auf dem Substrat angeordneten und in dem Pfad wenigstens eines von den Lichtstrahlen positionierten Liganden, wobei der Ligand zum Modulieren eines der aufgeteilten Strahlen dient, um das Interferenzmuster in einer auf die Konzentration des Liganden auf dem Substrat bezogenen Weise zu verändern; und

e) einer Detektionseinrichtung, wie z. B. einem optoelektronischen Detektor, zum Quantifizieren der von dem(n) Liganden erzeugten Musterveränderung und dadurch zum Ermitteln der Konzentration des Liganden.

18. Vorrichtung zum Ermitteln der Konzentration eines Liganden in einem Fluid mittels einer Testmethodologie, wie z. B. eines Immuntests, mit:

a) einem Interferometer zum Erzeugen eines Interferenzmusters, wobei das Interferometer eine Maske mit zwei oder mehr Öffnungen aufweist, wodurch Wellen, wie z. B. Lichtwellen, welche die Öffnungen passieren, gebeugt werden, um ein Interferenzmuster zu erzeugen.

b) wenigstens einem Liganden aus dem Fluid, der auf einem Substrat in dem Pfad einer von den Wellen so angeordnet ist, daß er das Interferenzmuster moduliert;

c) einem Antiliganden, welcher nach der Reaktion mit dem Liganden eine von der Ligandenkonzentration abhängige Veränderung in dem Interferenzmuster bewirkt; und

d) einer Detektoreinrichtung zum Detektieren von Veränderungen in dem Interferenzmuster, die durch die Modula tionen bewirkt werden, und zum Korrelieren der detektierten Veränderungen mit der Ligandenkonzentration.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei sich die Modulation aus der Streuung, Absorption, Polarisation oder Beugung der Lichtwellen ergibt.

20. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei die Öffnungen auf dem Testsubstrat ausgebildet sind, auf welchem der Ligand und der Antiligand reagieren.

21. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei der Ligand aus der Gruppe genommen wird, die Moleküle, Bakterien, Polymerpartikel, Zellen und Filme aufweist.

22. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei der Ligand Licht in einem vorbestimmten Frequenzbereich absorbiert und die Vorrichtung ferner eine Lichtquelle enthält, die einen Strahl von Lichtwellen innerhalb dieses Bereichs erzeugt.