DE60112423T2

DE60112423T2 - Verwendung von substituierten distamycin-acryloylderivaten zur behandlung von tumoren die mit erhöhten glutathion-spiegeln zusammenhängen

Info

Publication number: DE60112423T2
Application number: DE60112423T
Authority: DE
Inventors: Cristina Maria GERONI; Paolo Cozzi; Italo Beria
Original assignee: Pharmacia Italia SpA
Current assignee: Nerviano Medical Sciences SRL
Priority date: 2000-05-08
Filing date: 2001-04-19
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2021-04-20
Also published as: EE200200605A; CZ300791B6; EP1280527A2; US20030207794A1; PL201289B1; WO2001085144A3; DK1280527T3; DE60112423D1; EA007506B1; US7030089B2; ZA200208531B; GB0011059D0; ES2244618T3; TWI284643B; HK1054193B; PL365831A1; AU6022701A; HUP0301882A2; MXPA02010962A; IL152388A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von substituierten Acryloyldistamycinderivaten, insbesondere die Verwendung von α-Brom- und α-Chloracryloyldistamycinderivaten, bei der Behandlung von Tumoren, die mit hohen Spiegeln von Glutathion und/oder der Glutathion-S-Transferasen-Familie zusammenhängen.
Im Speziellen betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung eines Menschen, bei dem ein Tumor diagnostiziert wird, der Glutathion/die Glutathion-S-Transferasenfamilie, im Folgenden nur als GSH/GSTs bezeichnet, überexprimiert, mit den oben genannten Acryloyldistamycinderivaten.
GSH spielt eine zentrale Rolle beim Schutz vor Zellverletzung, die durch eine Reihe von toxischen Anfällen verursacht wird. Vorklinische und klinische Studien haben einen Zusammenhang zwischen GSH/GSTs-Überexpression und Krebs oder Krebs-Antwortrate gegenüber Chemotherapie festgestellt. Änderungen des GSH-basierten Entgiftungssystems (bestehend aus GSH und GSH-verwandten Enzymen, GSTs) sind auch mit schwankender Ansprechbarkeit auf mehrere Antineoplastika in Zusammenhang gebracht worden.
Sowohl GSH als auch GSTs sind überall in mehreren menschlichen Geweben vorhanden, wie zum Beispiel Blutzellen, Plasma, Serum, zirkulierenden Stammzellen und pathologischen (Tumor)geweben.
Eine allgemeine Abhandlung über GSH und GSTs ist in Cancer Res. 54: 4313–4320 (1994); Brit. J. Cancer 72(2): 324–326 (1995); DDT 3: 113–121 (1998) zu finden.
GSTs, und vor allem GST-π, sind in großen Mengen in einer Überzahl von Tumorarten vorhanden. Erhöhte Aktivität von GSH/ GSTs im Vergleich zu normalen Geweben ist in mehreren Tumorgeweben gefunden worden, die zum Beispiel Folgendes umfassen: Magen-Darm-Tumore (einschließlich Speiseröhren-, Magen-, Dickdarm-, Leberzellen- und Bauchspeicheldrüsentumoren), Gebärmutter- und Eierstockkrebse, Kopf- und Halskrebs, Lungen- und NSCL-Karzinoma, ebenso wie metastatische Lebertumore, die im Dickdarm, Magen und in der Blase ihren Ursprung haben [Cancer Res. 49: 5225–5229 (1989); Clinical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 27(4.5): 337–386 (1992)].
Um die Wirkung von GSH/GSTs im Hinblick auf Inaktivität und/oder Resistenz von Tumorzellen gegenüber zytotoxischen Mitteln zu bestimmen, wurden zwei grundlegende experimentelle Ansätze verfolgt. Der erste beinhaltete Studien, in denen erhöhte Werte oder Expression und Aktivität von GSH/GSTs mit erhöhten Werten von Arzneimittelresistenz korreliert wurden. Dieser Ansatz schloss auch die Modulation von GSH/GSTs-Aktivität mit Hilfe von GSH-Inhibitoren, wie zum Beispiel BSO (Buthionin-Sulphoximin), um Arzneimittelresistenz zu verhindern oder rückgängig zu machen, ein.
Der zweite Ansatz, der in Transfektionsstudien angewandt wurde, lieferte den direkten funktionalen Beweis, dass GSH/GSTs zu Arzneimittelresistenz führten.
Es gibt Beweise, dass GSH/GSTs eine Hauptrolle für die Resistenz gegenüber Alkylierungsmitteln (z. B. Melphalan, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Ifosfamidsenfen, BCNU) und Platinkomplexen, wie zum Beispiel Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin spielen [Biochem. Pharmacol 35: 3405–3409 (1986)]. In letzter Zeit wurde die Rolle von GSH bei Arzneimittelresistenz mit der Regulierung der Aktivität der Multidrug-Resistenz-Proteine (MRP) in Verbindung gebracht, die Resistenz gegenüber verschiedenen zytotoxischen Stoffen verleihen, einschließlich Anthracyclinen (z. B. Doxorubicin, Idarubicin, Epirubicin und Derivaten davon), Epidophyllotoxinen (z. B. Etoposid und Teniposid), Vincaalkaloiden (z. B. Vinblastin und Vincristin) und Taxanen (z. B. Paclitaxel und Docetaxel) [Eur. J. Cancer 32: 945–957 (1996); Seminars in Oncol. 24(5): 580–591, (1997)].
Es ist jetzt festgestellt worden, dass, anders als andere gut bekannte zytotoxische Distamycinderivate, diejenigen, die einen α-Brom- oder α-Chloracryloylanteil haben, wie unten gemäß dem Ziel der vorliegenden Erfindung ausgeführt, überraschend effektiv bei der Behandlung von Tumoren sind, die GSH/GSTs-System überexprimieren, und von denen daher bekannt ist, dass sie schlecht auf herkömmliche Antitumortherapien ansprechen und/oder Resistenz verursachen, wenn therapeutische zytotoxische Mittel verabreicht werden.
Distamycin A und Analoge davon, im Folgenden bezeichnet als Distamycin und Distamycin-ähnliche Derivate, sind im Fachgebiet als zytotoxische Mittel bekannt, die bei Antitumortherapie nützlich sind. Distamycin A ist eine antibiotische Substanz mit antiviraler und antiprotozoaler Aktivität, die ein Polypyrrolgerüst hat [Nature 203: 1064 (1964); J. Med. Chem. 32: 774–778 (1989)].
Die internationalen Patentanmeldungen WO 90/11277, WO 98/04524, WO 98/21202, WO 99/50265, WO 99/50266 und WO 01/40131, alle im Namen des Anmelders selbst, offenbaren Acryloyldistamycinderivate, worin der Amidinoanteil von Distamycin wahlweise ersetzt wird durch Stickstoff enthaltende Endgruppen, wie zum Beispiel Cyanamidino, N-Methylamidino, Guanidino, Carbamoyl, Amidoxim, Cyano und Ähnliche, und/oder worin das Polypyrrolgerüst von Distamycin oder ein Teil davon ersetzt wird durch verschiedene carbocyclische oder heterocyclische Anteile. D'Alessio et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 4(12), 1467–1472, 1994, offenbart die Synthese und die biologische Bewertung der Antitumor-Aktivität von Distamycin A-Derivaten, die neue Alkylierungsanteile tragen. Geroni et al.: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual, 41 425–426, 2000, bezieht sich auf die Antitumor-Aktivität von PNU-166196, einem neuen vollsynthetischen, nicht kovalenten DNA-Minor-Groove-Binder (MGB), der einen α-Bromacrylanteil aufweist, der mit einem Distamycin-ähnlichen Gerüst verbunden ist, das in einem Guanidinoanteil endet.
Daher ist eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines α-Halogenacryloyldistamycinderivats mit der Formel (I)
worin:
R1 ein Brom- oder Chloratom ist;
R2 eine Gruppe mit der Formel (II) ist,
worin m 0 oder 1 ist; n 4 ist; r 0 ist, sowohl X als auch Y eine CH-Gruppe sind; B gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
worin R₅, R₆ und R₇, identisch oder unterschiedlich, Wasserstoff oder C₁-C₉-Alkyl sind;
oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon;
bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren bei einem Menschen, bei dem ein Tumor diagnostiziert wurde, der GSH/GSTs-System überexprimiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die obigen Verbindungen mit der Formel (I) nützlich zur Behandlung von Tumoren, die GSH/GSTs-System überexprimieren und Magen-Darm-Tumore umfassen, einschließlich Speiseröhren-, Magen-, Dickdarm-, Leberzellen- und Bauchspeicheldrüsentumor, Gebärmutter- und Eierstockkrebse, Kopf- und Halskrebs, Lungen- und NSCL-Karzinoma sowie metastatische Lebertumore, die in den Magen-Darm-, Gebärmutter-, Eierstock- und Lungenkrebsen ihren Ursprung haben.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der Verbindungen mit der Formel (I) bei der Behandlung von Tumoren, welche GSH/GSTs-System als Ergebnis einer vorhergehenden chemotherapeutischen Behandlung überexprimieren, zum Beispiel einer chemotherapeutischen First-Line-Behandlung mit einem zytotoxischen Mittel, wie zum Beispiel Alkylierungsmitteln, Platinderivaten oder Anthracyclinen.
Im Speziellen kann die vorhergehende chemotherapeutische Behandlung Alkylierungsmittel umfassen, zum Beispiel Melphalan, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Ifosfamidsenfe und BCNU; Platinkomplexe, zum Beispiel Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin; Anthracycline, zum Beispiel Doxorubicin, Idarubicin, Epirubicin, Epidophyllotoxine, zum Beispiel Etoposid und Teniposid; Vincaalkaloide, zum Beispiel Vinblastin und Vincristin; Taxane zum Beispiel Paclitaxel und Docetaxel.
Die vorliegende Erfindung schließt in ihrem Schutzumfang die Verwendung aller möglichen Isomere ein, die von den Verbindungen mit Formel (I) abgedeckt sind, sowohl separat als auch in Beimischung betrachtet.
In der vorliegenden Beschreibung verstehen wir, soweit nicht anders angegeben, unter dem Begriff C₁-C₄-Alkylgruppe eine gerade oder verzweigte Gruppe, gewählt aus Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl oder tert-Butyl.
Pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindungen mit der Formel (I) sind diejenigen mit pharmazeutisch verträglichen anorganischen oder organischen Säuren, wie zum Beispiel Salz-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Essig-, Propion-, Bernstein-, Malon-, Citronen-, Wein-, Methansulfon-, p-Toluensulfonsäure und dergleichen.
Ein Beispiel für bevorzugte Verbindungen mit der Formel (I) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren, die GSH/GSTs-System überexprimieren, wahlweise in Form pharmazeutisch verträglicher Salze vorzugsweise mit Salzsäure ist: 1. N-(5-{[(5-{[(5-{[(2-{[Amino(imino)methyl]amino}ethyl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)-4-[(2-bromacryloyl)amino]-1-methyl-1H-pyrrol-2- carboxamidhydrochlorid.
Die obigen Verbindungen mit der Formel (I), entweder speziell als solche oder mit Hilfe der allgemeinen Formel gekennzeichnet, sind bekannt oder werden leicht nach bekannten Verfahren hergestellt, wie zum Beispiel in den oben genannten Internationalen Patentanmeldungen WO 90/11277, WO 98/04524, WO 98/21202, WO 99/50265, WO 99/50266 und WO 01/40181 berichtet.
Pharmakologie
Die Verbindungen mit der Formel (I) gemäß der vorliegenden Erfindung sind hochgradig wirksam bei der Behandlung von Tumoren, die mit hohen Werten von GSH/GSTs zusammenhängen, und werden bei der Behandlung mehrerer Tumore angewandt, die kaum oder gar nicht auf herkömmliche chemotherapeutische Mittel ansprechen.
Die Wirkung von GSH auf die zytotoxische Aktivität der Verbindungen mit der Formel (I) wurde untersucht durch Testen der Verbindungen an einer chemoresistenten Tumorzellen-Sublinie, die Werte von GSH/GSTs aufwies, die höher waren als diejenigen der Stammzelllinie. Das verwendete Modell ist eine Melphalan (L-PAM)-resistente Rattenleukämie (L1210/L-PAM), die einen um das Dreifache erhöhten Wert an GSH (25,8 nmol/10⁶ Zellen) gegenüber der normalen L1210 (7,7 nmol/10⁶ Zellen)-Zelllinie aufweist (Tabelle I).
Die getesteten Verbindungen mit der Formel (I) sind: N-(5-{[(5-{[(5-{[(2-{[Amino(imino)methyl]amino}ethyl)amino] carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl}amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)-4-[(2-bromacryloyl)amino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carboxamidhydrochloridinterner Code PNU 166196; und als Vergleichsverbindungen N-(5-{[(5-{[(5-{[(3-Amino-3-iminopropyl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)-4-[(2-bromacryloyl)amino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carboxamidhydrochlorid interner Code PNU 151807.
Das Distamycinderivat 3-[1-Methyl-4-[1-methyl-4-[1-methyl-4-[1-methyl-4-[N,N-bis(2-chlorethyl)amino]benzencarboxamido] pyrrol-2-carboxamido]pyrrol-2-carboxamido]pyrrol-2-carboxamido] propionamidin, besser bekannt als Tallimustin, und L-PAM wurden als Kontrollen unter denselben experimentellen Bedingungen getestet.
Die in Tabelle I dargestellten Daten zeigen deutlich an, dass die Zytotoxizität der Verbindungen mit der Formel (I) bei L1210/L-PAM-Zellen gegenüber L1210-Zellen um das Dreifache erhöht wurde (PNU 166196 = IC₅₀ 0,49 bzw. 1,62 ng/ml; PNU 151807 = IC₅₀ 0,26 bzw. 0,86 ng/ml). Die Zytotoxizität von Tallimustin war bei den zwei Zelllinien vergleichbar; hingegen war die Zytotoxizität von L-PAM bei L1210/L-PAM-Zellen niedriger als bei L1210-Zellen. Tabelle I

a) Zellen, die mit der Verbindung 48 Stunden inkubiert wurden. Wachstumshemmung ermittelt durch das Zählen überlebender Zellen.

Ein weiterer Beweis für die Relevanz von GSH-Werten für die Zytotoxizität der Verbindungen mit der Formel (I) wurde geliefert durch Bestimmen des Einflusses der Vorbehandlung mit BSO (L-S.R-Buthioninsulphoximin) auf die Empfänglichkeit von menschlichen A2780-Eierstockzellen für ihren zytotoxischen und apoptotischen Effekt.
BSO ist ein hochwirksamer und spezifischer Inhibitor von γ-Glutamylcysteinsynthethase, dem die Geschwindigkeit begrenzenden Schritt in GSH-Biosynthese. Der Abbau von intrazellulärem GSH durch BSO erhöht signifikant die Zytotoxizität vieler Antitumor-Medikamente, vor allem von Alkylierungsmitteln, wie zum Beispiel Melphalan und Chlorambucil, und Platinverbindungen, wie zum Beispiel Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin [Chemico- Biological Interactions 111: 239–254 (1998)].
Wie in der Tabelle II dargestellt, wurden die Zytotoxizität (Prozentsatz der Wachstumshemmung) und der apoptotische Effekt (Prozentsatz von Zellen mit apoptotischer Morphologie) von PNU 166196, als repräsentativer Verbindung mit der Formel (I), bei A2780-Zellen, die mit BSO vorbehandelt wurden, gegenüber Zellen, die nicht mit BSO behandelt wurden, signifikant verringert. Tabelle II

(a) Zellen, die mit der Verbindung 48 Stunden lang inkubiert wurden. Die Wachstumshemmung wurde ermittelt durch das Zählen überlebender Zellen und die Apoptose wurde durch morphologische Untersuchung bewertet.
(b) Zellen, die vor und während PNU 166196-Behandlung 24 Stunden lang BSO ausgesetzt wurden.

PNU 166196 wies eine verringerte Zytotoxizität bei A2780-Zellen auf, die mit BSO vorbehandelt waren, gegenüber den unbehandelten Zellen (38 bzw. 77,5% Wachstumshemmung bei 3000 ng/ml).
Die verringerte Wirksamkeit von PNU 166196 bei Tumorzellen, die mit BSO vorbehandelt waren, wurde auch bestätigt durch Testen des Prozentsatzes an Zellen mit apoptotischer Morphologie +/–BSO (11,5 bzw. 74,5% bei 3000 ng/ml).
Die obigen Ergebnisse unterstützen den Beweis, dass die in vitro-Aktivität von α-Brom- und α-Chlor-Acryloyldistamycin-Derivaten mit der Formel (I) durch die Gegenwart hoher GSH-Werte stark beeinflusst wird, und folglich sind diese Verbindungen besonders nützlich bei der Behandlung von Tumoren, die GSH/GSTs überexprimieren.
Die Verbindungen der Erfindung können über die üblichen Wege verabreicht werden, zum Beispiel parenteral, z. B. durch intravenöse Injektion oder Infusion, intramuskulär, subkutan, topisch oder oral.
Die Dosierung hängt vom Alter, Gewicht und von den Leiden des Patienten und vom Verabreichungsweg ab. Eine geeignete Dosierung zur Verabreichung an erwachsene Menschen kann zum Beispiel von 0,05 bis 100 mg pro Dosis von 1- bis 4mal am Tag variieren.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können eine wirksame Menge einer Verbindung mit der Formel (I) als Wirkstoff enthalten, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Bindemitteln, und werden normalerweise mit herkömmlichen Verfahren hergestellt.
Zum Beispiel können Lösungen zur intravenösen Injektion oder Infusion steriles Wasser als Träger enthalten oder vorzugsweise können sie in Form von sterilen wässerigen isotonischen Salzlösungen vorliegen. Suspensionen oder Lösungen für intramuskuläre Injektionen können gemeinsam mit der aktiven Verbindung einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten, zum Beispiel steriles Wasser, Olivenöl, Ethyloleat, Glycole, z. B. Propylenglycol, und, falls gewünscht, eine geeignete Menge an Lidocainhydrochlorid.
In der Form für topische Anwendung, z. B. Cremes, Lotionen oder Pasten zur Verwendung bei Hautbehandlung, kann der Wirkstoff mit herkömmlichen ölhaltigen oder emulgierenden Bindemitteln gemischt werden.
Die festen oralen Formen, z. B. Tabletten und Kapseln, können zusammen mit der aktiven Verbindung Verdünnungsmittel enthalten, z. B. Lactose, Dextrose, Saccharose, Zellulose, Maisstärke und Kartoffelstärke; Schmiermittel, z. B., Siliziumdioxid, Talk, Stearinsäure, Magnesium- oder Kalziumstearat und/oder Polyethylenglycole; Bindemittel, z. B. Stärken, Akaziengummis, Gelatine, Methylzellulose, Carboxymethylzellulose, Polyvinylpyrrolidon; Zersetzungsmittel, z. B., eine Stärke, Alginsäure, Alginate, Natrium-Stärkeglycolat; aufschäumende Mischungen; Farbstoffe; Süßstoffe; Benetzungsmittel, zum Beispiel Lecithin, Polysorbate, Laurylsulphate und allgemein nicht toxische und pharmakologisch inaktive Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden. Die pharmazeutischen Präparate können auf bekannte Art und Weise hergestellt werden, zum Beispiel durch Mischungs-, Granulierungs-, Tablettierungs-, Überzuckerungs- oder Beschichtungsverfahren.
Weiterhin wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren, die GSH/GSTs-System überexprimieren, bei einem Patienten, der dies benötigt, bereitgestellt, das die Verabreichung einer Zusammensetzung der Erfindung an den Patienten umfasst.
Beispiel 1
Zytotoxische Aktivität der Verbindungen mit der Formel (I) gegen Tumore, die mit hohen GSH-Werten zusammenhängen
Die Verbindungen N-(5-{[(5-{[(5-{[(2-{[Amino(imino)methyl]amino}ethyl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)amino]carbonyl}-1-methyl1H-pyrrol-3-yl)-4-[(2-bromacryloyl)amino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carboxamidhydrochlorid (PNU 166196} und als Vergleichsverbindung N-(5-{[(5-{[(5-{[(3-Amino-3-iminopropyl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)-4-[(2-bromacryloyl)amino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carboxamidhydrochlorid (PNU 151807), jeweils hergestellt wie in WO 98/04254 und WO 90/11277 beschrieben, wurden in sterilem Wasser aufgelöst und sofort für die Experimente verwendet. Die zytotoxische Aktivität wurde bei L1210-Ratten-Lymphozyten-Leukämie-Zelllinie und bei der L-PAM-resistenten Zell-Sublinie L1210/L-PAM bestimmt. Zellen wurden in vitro als stabilisierte Suspensionskulturen gezüchtet. L1210-Zellen wurden in RPMI 1640^®-Medium gehalten, das β-Mercaptoethanol (10 μM) enthielt. L1210/L-PAM-Zellen wurden in RPMI 1640^®-Medium gehalten, das β-Mercaptoethanol (50 μM) enthielt. Alle Kulturmedien (Biowhittaker, UK) wurden mit 10%-igem fetalem Kalbsserum (Biological Industries, Israel) und 2 mM L-Glutamin (Biowhittaker, UK) ergänzt.
Die zytotoxische Aktivität wurde gegen exponentiell wachsende Zellen bestimmt. Platten mit 24 Vertiefungen wurden mit L1210 und L1210/L-PAM-Zellen bei einer Konzentration von 50.000 Zellen/ml beimpft und sofort 48 Stunden lang mit dem Arzneimittel behandelt.
Die Hemmung des Zellwachstums wurde durch das Zählen überlebender Zellen mit einem Coulter-Zähler gemessen. Die antiproliferative Wirkung von Arzneimitteln wurde aus Dosis-Wirkungs-Kurven berechnet und als IC₅₀ (Konzentration, die 50% Zellwachstum in behandelten Kulturen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkulturen hemmt) ausgedrückt.
Alle Experimente wurden zweimal durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in der beigefügten Tabelle I und den Anmerkungen dazu enthalten.
Beispiel 2
Zytotoxizität und apoptotische Wirkung von PNU 166196 auf A2780-Zellen, die mit BSO vorbehandelt wurden
Die Verbindung PNU 166196 (siehe Beispiel 1 oben) wurde in sterilem Wasser aufgelöst und sofort für die Experimente verwendet. BSO wurde in sterilem Wasser aufgelöst und mit einem 0,2 μ-Filter filtriert.
Die zytotoxische Aktivität wurde mit einer A2780-Zelllinie von menschlichen Eierstockkarzinoma bestimmt. Zellen wurden in vitro als Einschichtengewebekulturen in RPMI 1640^®-Medium (Biowhittaker, UK) gezüchtet, das mit 10%-igem fetalem Kalbsserum (Biological Industries, Israel) und 2 mM L-Glutamin (Biowhittaker, UK) ergänzt wurde.
Die zytotoxische Aktivität wurde gegen exponentiell wachsende Zellen ermittelt. Platten mit 6 Vertiefungen wurden mit A2780-Zellen bei einer Konzentration von 100.000 Zellen/ml für 2 ml beimpft und 24 Stunden lang mit dem GSH-Inhibitor BSO inkubiert und schließlich verschiedenen Konzentrationen von PNU 166196 ausgesetzt (unbehandelte Zellen wurden nur mit dem Medium inkubiert).
Nach 24-stündiger Behandlung mit dem Arzneimittel wurde die Zellwachstums-Hemmung für die Einschichten-Zellen bewertet, während die schwimmenden Zellen zur Morphologiebewertung verwendet wurden.
Apoptose wurde durch Fluoreszenzmikroskopie bewertet. Am Ende der Behandlung wurden schwimmende Zellen gesammelt, in PBS gewaschen, in 70% eiskaltem Ethanol gebunden und bei –20°C gelagert bis zur Analyse (max. 5 Tage). Die Zellen wurden dann zentrifugiert und die Pellets wurden mit 50 μg/ml Propidiumjodid, 0,001% Nonidet P40^® und 60 U/ml Rnase gefärbt und bei 37°C im Dunkeln 30 Minuten lang gelagert. Die Zellen wurden zentrifugiert und die Pellets wurden in 50 μM PBS erneut suspendiert. Mindestens 600 Zellen, die nach dem Zufallsprinzip aus 2 unabhängig hergestellten Schmieren ausgewählt wurden, wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop auf Änderungen ihrer Kernmorphologie (Chromatinkondensation und DNA-Fragmentation) untersucht [siehe Int. J. Cancer 65: 491–497 (1996)]. Alle Experimente wurden zweimal durchgeführt.
Ergebnisse sind in der beigefügten Tabelle 2 und den Anmerkungen dazu enthalten.

Claims

Verwendung eines α-Halogenacryloyldistamycinderivats mit der Formel (I)
worin: R₁ ein Brom- oder Chloratom ist; und R₂ eine Gruppe mit der Formel (II) ist;
m 0 oder 1 ist; n 4 ist; r 0 ist; sowohl X als auch Y eine CH-Gruppe sind; B gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
worin R₅, R₆ und R₇, identisch oder unterschiedlich, Wasserstoff oder C₁-C₄-Alkyl sind; oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon; bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren bei einem Menschen, bei dem ein Tumor diagnostiziert wurde, der das GSH/GSTs-System über-exprimiert. worin
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin der Tumor bei einem Menschen, bei dem ein Tumor diagnostiziert wurde, der das GSH/GSTs-System über-exprimiert, gewählt ist aus Magen-Darm-Tumoren, einschließlich Speiseröhren-, Magen-, Dickdarm-, Leberzellen- und Bauchspeicheldrüsen-Tumor, Gebärmutter- und Eierstockkrebsen, Kopf- und Halskrebs, Lungen- und NSCL-Karzinoma und metastatischen Lebertumoren, die in den Magen-Darm-, Gebärmutter-, Eierstock- und Lungenkrebsen ihren Ursprung haben.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die Über-Expression des GSH/GSTs-Systems das Ergebnis einer vorhergehenden vordergründigen chemotherapeutischen Behandlung mit einem zytotoxischen Mittel ist.
Verwendung gemäß Anspruch 3, worin das zytotoxische Mittel gewählt ist aus Alkylierungsmitteln, einschließlich Melphalan, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Ifosfamidsenfen und BCNU; Platinkomplexen, einschließlich Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin; Anthracyclinen, einschließlich Doxorubicin, Idarubicin, Epirubicin; Epidophyllotoxinen, einschließlich Etoposid und Teniposid; Vincaalkaloiden, einschließlich Vinblastin und Vincristin; und Taxanen, einschließlich Paclitaxel und Docetaxel.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das α-Halogenacryloyldistamycinderivat mit der Formel (I) N-(5-{[(5-{[(5-{[(2-{[Amino(imino)methyl]amino}ethyl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)amino]carbonyl}-1-methyl-1H-pyrrol-3-yl)-4-[(2-bromacryloyl)amino]-1-methyl-1H-pyrrol-2-carboxamidhydrochlorid ist.