DE60001731T2

DE60001731T2 - Verfahren zur erfassung von fluoreszierenden molekülen oder anderen teilchen mittels erzeugenden funktionen

Info

Publication number: DE60001731T2
Application number: DE60001731T
Authority: DE
Inventors: Kauko Palo; Pete Kask
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1999-04-29
Filing date: 2000-04-29
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2020-04-30
Also published as: DE60001731D1; JP3559525B2; EP1175602B1; WO2000066985A1; AU4559600A; WO2000066985A9; DK1175602T3; EP1175602A1; JP2002543414A; ATE235045T1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Fluoreszenzspektroskopie und insbesondere auf ein Verfahren zur Bestimmung der charakteristischen physikalischen Größen von fluoreszierenden Molekülen oder anderen Teilchen, die in einer Probe vorhanden sind.
Das US-Patent 4,198,571 offenbart ein Rastermikroskop mit einer ersten und einer zweiten Fokussiereinrichtung, die konfokal angeordnet sind, wobei wenigstens eine Fokussiereinrichtung eine Ringform hat, einer Nachweiseinrichtung für kohärente Strahlung, die so angeordnet ist, dass sie Strahlung aus einer Fokussiereinrichtung empfängt, sowie Abtasteinrichtungen zum Abtasten eines Objekts in der Brennebene.
Das US-Patent 5,866,911 offenbart, dass bei abgetasteten optischen Systemen, wie konfokalen Lasermikroskopen, bei denen ein Lichtstrahl auf einen Punkt in einer Probe fokussiert wird, so dass er eine fluoreszierende Spezies oder eine andere anregbare Spezies in dem Punkt anregt, die effektive Größe der Anregung kleiner als die Größe des Punkts gemacht wird, indem man einen Lichtstrahl einer Wellenlänge bereitstellt, die geeignet ist, um die Anregung der anregbaren Spezies zu löschen, wobei man diesen zweiten Strahl in einem Muster mit einem zentralen Intensitätsminimum formt und dieses zentrale Minimum mit dem zentralen Intensitätsmaximum des fokussierten Punkts überlappt, so dass innerhalb des Punkts die Intensität des löschenden Lichts mit dem Abstand von der Mitte des Punkts zunimmt, wodurch vorzugsweise Anregung in den peripheren Teilen des Punkts gelöscht wird, und dadurch die effektive Größe der Anregung reduziert und damit die Auflösung des Systems verbessert wird.
Die primären Daten eines Experiments bei der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS, eine Technik des Standes der Technik) ist eine Sequenz von Photonenzählereignissen, die aus einem mikroskopischen Messvolumen nachgewiesen werden. Ein wesentliches Attribut der Fluoreszenzkorrelationsanalyse ist die Berechnung der Autokorrelationsfunktion zweiter Ordnung des Photonennachweises. Dies ist eine Methode, mit der eine stochastische Funktion (von Photonenzählereignissen) in eine statistische Funktion mit einer erwarteten Form umgewandelt wird, die als Mittel dient, um einige Parameter der Probe abzuschätzen. Die Berechnung der Autokorrelationsfunktion ist jedoch nicht der einzige Weg, um aus der Sequenz der Photonenzählereignisse Informationen über die Probe zu gewinnen. Weitere Ansätze beruhen auf der Momentanalyse und der direkten Analyse der Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse pro gegebenes Zeitintervall (Qian und Elson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 5479-483, 1990; Qian und Elson, Biophys. J. 57: 375-380, 1990).
Die nachgewiesene Intensität der Fluoreszenz, die von einem Teilchen innerhalb einer Probe ausgeht, ist nicht gleichmäßig, sondern hängt von den Koordinaten des Teilchens in Bezug auf den Brennpunkt des optischen Systems ab. Daher sollte eine zuverlässige Interpretation von Messungen die Geometrie des beleuchteten Messvolumens berücksichtigen. Obwohl die Berechnung einer theoretischen Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse für ein glockenförmiges Profil komplexer ist als für ein rechteckiges, hängt die Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse empfindlich von Werten der Konzentration und der spezifischen Helligkeit der fluoreszierenden Spezies ab, und daher können die gemessenen Verteilungen der Zahl der Photonenzählereignisse für eine Probenanalyse verwendet werden. Der Ausdruck "spezifische Helligkeit" bezeichnet die mittlere Zählrate des Detektors von Licht, das von einem Teilchen einer gegebenen Spezies emittiert wird, das sich an einem bestimmten Punkt in der Probe befindet, herkömmlicherweise an dem Punkt, wo der Wert der räumlichen Helligkeitsprofilfunktion gleich eins ist.
Die erste Realisierung dieser Art von Analyse wurde auf der Basis von Momenten der Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse nachgewiesen (Qian und Elson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 5479-483, 1990). Das k-te faktorielle Moment der Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse P(n) ist definiert als
Faktorielle Momente sind wiederum eng mit faktoriellen Kumulanten verknüpft:
oder
(C k / i sind Binomialkoeffizienten, und K_k sind Kumulanten.) Der Grundausdruck, der in der Momentanalyse verwendet wird und für ideale Lösungen hergeleitet ist, setzt die Kumulante k-ter Ordnung in Beziehung zu Konzentrationen (c_i) und spezifischen Helligkeitswerten (q_i):
Hier ist χ_k das k-te Moment des relativen räumlichen Helligkeitsprofils B(r):
Gewöhnlich werden in der FCS die Einheit des Volumens und die Einheit von B so ausgewählt, dass sie χ₁ = χ₂ = 1 ergeben. Nach der Auswahl dieser Konvention sind Konzentrationen in den Gleichungen dimensionslos und drücken die mittlere Anzahl der Teilchen pro Messvolumen aus, und die spezifische Helligkeit einer beliebigen Spezies ist gleich der mittleren Zählrate für ein Teilchen, wenn sich dieses im Brennpunkt befindet, dividiert durch den Zahlenwert von B(0). Der Wert der Konstanten B(0) ist ein Kennwert des optischen Geräts. Er kann aus geschätzten Parametern des räumlichen Intensitätsprofils berechnet werden (siehe unten).
Qian und Elson verwendeten experimentelle Werte der ersten drei Kumulanten, um unbekannte Parameter der Probe zu bestimmen. Die Zahl der Kumulanten, die aus Experimenten zuverlässig bestimmt werden können, beträgt gewöhnlich drei bis vier. Dies setzt eine Grenze für die Anwendbarkeit der Momentanalyse.
Die Idee hinter der sogenannten Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse, die im Einzelnen in der Internationalen Patentanmeldung PCT/EP 97/05619 (Internationale Veröffentlichungsnummer WO 98/16814) beschrieben wurde, ist leicht zu verstehen, wenn man sich einen idealen Fall vorstellt, in dem ein Messvolumen gleichmäßig beleuchtet ist und fast nie mehr als ein einziges Teilchen gleichzeitig beleuchtet ist, ähnlich zu der idealen Situation in Zellsortierern. Unter diesen Umständen springt die Fluoreszenzintensität jedes Mal, wenn ein Teilchen in das Messvolumen eintritt, auf einen Wert, der der Helligkeit eines gegebenen Typs von Teilchen entspricht. Natürlich ist die Wahrscheinlichkeit, dass diese Intensität zu einem beliebigen Zeitpunkt auftritt, gleich dem Produkt aus der Konzentration einer gegebenen Spezies und der Größe des Messvolumens. Eine andere fluoreszierende Spezies, die in der Probenlösung vorhanden sein kann, erzeugt Intensitätssprünge auf einen anderen Wert, der für diese andere Spezies charakteristisch ist. Insgesamt gesehen ist die Verteilung der Lichtintensität in direkter Weise durch die Werte der Konzentration und der spezifischen Helligkeit jeder fluoreszierenden Spezies in der Probenlösung bestimmt.
Nur in dem oben beschriebenen idealen Fall kann angenommen werden, dass die Lichtintensität, die den Detektor von einem Teilchen aus erreicht, als Funktion der Koordinaten des Teilchens über das gesamte Messvolumen konstant und außerhalb gleich Null ist. In erster Näherung wird auch angenommen, dass die Diffusion eines fluoreszierenden Teilchens während des Zählintervalls T vernachlässigbar ist. Unter diesen beiden Annahmen kann die Verteilung der Zahl der Zählereignisse für Photonen, die von einer einzelnen fluoreszierenden Spezies emittiert werden, analytisch als zweidimensionale Poisson-Verteilung ausgedrückt werden: Die Verteilung der Zahl der Teilchen einer gegebenen Spezies innerhalb dieses Volumens ist eine Poisson-Verteilung, während die bedingte Wahrscheinlichkeitsverteilung der Zahl der Photonen bei Annahme einer gegebenen Zahl von Teilchen ebenfalls eine Poisson-Verteilung ist. Die zweidimensionale Poisson-Verteilung hat zwei Parameter: die mittlere Zahl von Teilchen im Messvolumen, c, und die mittlere Zahl von Photonen, die von einem einzelnen Teilchen pro Verweilzeit emittiert werden, qT. Die Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse, n, die einer einzelnen Spezies entsprechen, wird ausgedrückt als:
wobei m die Nummern der Moleküle im Messvolumen durchläuft. Wenn P_l(n) die Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse für eine Spezies i bezeichnet, dann wird die resultierende Verteilung P(n) ausgedrückt als:
Dies bedeutet, dass P(n) als Faltung der Folge von Verteilungen P_i(n) berechnet werden kann.
Wie in der FCS ist das rechteckige Probenprofil ein theoretisches Modell, das in Experimenten kaum angewendet werden kann. Man kann jedoch das Messvolumen in eine große Zahl von Volumenelementen aufteilen und annehmen, dass die Intensität eines Moleküls innerhalb eines jeden solchen Volumenelements konstant ist. Der Beitrag eines Volumenelements zur Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse ist daher eine zweidimensionale Poisson-Verteilung mit den Parametern cdV und qTB(r). (Hier bezeichnet q die Zählrate für ein Molekül in einer ausgewählten Standardposition, wo B = 1 ist, und B(r) ist die räumliche Helligkeitsprofilfunktion der Koordinaten.) Die Gesamtverteilung der Zahl der Photonenzählereignisse kann als Faltungsintegral über zweidimensionale Poisson-Verteilungen ausgedrückt werden. Die Integration ist hier ein eindimensionales und kein dreidimensionales Problem, da das Ergebnis der Integration nicht von den tatsächlichen gegenseitigen Positionen der Volumenelemente abhängt. Bildlich gesehen kann man die dreidimensionale Anordnung der Volumenelemente zu einer eindimensionalen Anordnung umordnen, zum Beispiel in abnehmender Reihenfolge des Wertes von B.
In mehreren ersten Experimenten, die in der Internationalen Patentanmeldung PCT/EP 97/05619 (veröffentlicht als WO 98/16814) beschrieben sind, wurde die Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse tatsächlich unter Verwendung der Faltungstechnik angepasst. Das Probenmodell bestand aus zwanzig räumlichen Abschnitten, die jeweils durch ihr Volumen V_j und ihre Helligkeit B_j charakterisiert waren. Die in dieser Patentanmeldung beschriebene Technik ist jedoch langsam und unbequem in Fällen, die eine hohe Zahl von zu analysierenden Proben beinhalten, wie in der Diagnostik oder Wirkstoffsuche, oder beim Analysieren von Verteilungsfunktionen, die mehr als ein einziges Argument beinhalten.
Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine bequeme und viel schnellere Technik zum Analysieren von Fluktuationen der Fluoreszenzintensität anzugeben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Charakterisierung von fluoreszenten Molekülen oder anderen Teilchen in Proben bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Überwachen von Intensitätsfluktuationen von Fluoreszenz, die von den Molekülen oder anderen Teilchen emittiert wird, in wenigstens einem Messvolumen mit einem ungleichmäßigen räumlichen Helligkeitsprofil durch Messen der Zahl von Photonenzählereignissen in primären Zeitintervallen durch einen einzigen oder mehrere Photonendetektoren;
b) Bestimmen wenigstens einer Verteilung von Zahlen von Photonenzählereignissen, P ^(n), aus den gemessenen Zahlen von Photonenzählereignissen;
c) Bestimmen von physikalischen Größen, die für die Teilchen charakteristisch sind, durch Anpassen der Verteilung der Zahlen von Photonenzählereignissen P ^(n), wobei das Anpassungsverfahren die Berechnung einer theoretischen Verteilungsfunktion der Zahl der Photonenzählereignisse P(n) über ihre erzeugende Funktion, die als
definiert ist, beinhaltet.

Im Folgenden wird zuweilen der Ausdruck "Histogramm" anstelle von "experimentell bestimmte Verteilungsfunktion" oder "experimentell bestimmte Verteilung" verwendet.
Die formale Definition der erzeugenden Funktion einer Verteilung P(n) ist wie folgt:
Was die erzeugende Funktion in der Zählereignis-Verteilungsanalyse attraktiv macht, ist die Additivität ihres Logarithmus: Logarithmen von erzeugenden Funktionen von Verteilungen von Zahlen von Photonenzählereignissen aus unabhängigen Quellen, wie verschiedenen Volumenelementen sowie verschiedenen Spezies, werden für die Berechnung der erzeugenden Funktion der kombinierten Verteilung einfach addiert, da die Transformation (8) Verteilungsfaltungen auf die Produkte der entsprechenden erzeugenden Funktionen abbildet.
Vier besondere Beispiele für die vorliegende Erfindung wurden im Einzelnen entwickelt und werden im folgenden beschrieben:

1. Eindimensionale Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (als FIDA oder 1D-FIDA bezeichnet), bei der eine einzige Verteilungsfunktion von Zahlen von Photonenzählereignissen angepasst wird, was die spezifische Helligkeit eines fluoreszierenden Moleküls oder anderen Teilchens als charakteristische physikalische Größe ergibt;
2. Zweidimensionale Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (2D-FIDA), bei der eine gemeinsame Verteilungsfunktion von Zahlen von Photonenzählereignissen angepasst wird, was zwei spezifische Helligkeitswerte für ein fluoreszierendes Molekül oder anderes Teilchen als charakteristische physikalische Größen ergibt. 2D-FIDA kann in einem Polarisationsmodus oder in einem Spektralmodus angewendet werden, was unten im Einzelnen beschrieben wird;
3. FIMDA (fluorescence intensity multiple distribution analysis), bei der eine Reihe von Verteilungsfunktionen von Zahlen von Photonenzählereignissen mit unterschiedlicher Breite der Zählzeitintervalle angepasst wird, was die spezifische Helligkeit und die Translationsdiffusionszeit als charakteristische physikalische Größen ergibt; und
4. FACID (fluorescence autoconvoluted intensity distribution analysis), bei der eine Reihe von Verteilungsfunktionen von Zahlen von Photonenzählereignissen, die jeweils demselben Zählzeitintervall entsprechen, angepasst wird. Es werden jedoch unterschiedliche Verzögerungszeiten zwischen zwei Teilen eines Zählzeitintervalls verwendet. FACID ergibt ebenfalls die spezifische Helligkeit und die Translationsdiffusionszeit als charakteristische physikalische Größen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform könnte man die fluktuierende Fluoreszenzintensität in aufeinanderfolgenden primären Zeitintervallen mit gleicher Breite messen. Die oben genannten Beispiele, 1D-FIDA, 2D-FIDA, FIMDA und FACID, verwenden diese zweckmäßige Ausführungsform, bei der die verfügbare Information optimal verwendet wird. Es ist jedoch auch möglich, nichtaufeinanderfolgende primäre Zeitintervalle und/oder primäre Zeitintervalle unterschiedlicher Breite zu verwenden. Typische primäre Zeitintervalle haben eine Breite in der Größenordnung einer Mikrosekunde oder von mehreren zehn Mikrosekunden. Die gesamte Datensammelzeit beträgt gewöhnlich mehrere Zehntel Sekunden bis zu mehreren zehn Sekunden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Zahlen der Photonenzählereignisse {n_i}, die in Schritt b) einer Bestimmung eines Histogramms P ^(n) unterliegen, von Zahlen von Photonenzählereignissen in primären Zeitintervallen {N_j} abgeleitet, indem man die Zahlen der Photonenzählereignisse aus primären Zeitintervallen gemäß einer vorbestimmten Regel aufsummiert. 1D-FIDA, 2D-FIDA, FIMDA und FACID verwenden diese Ausführungsform ebenfalls.
Man könnte zum Beispiel daran interessiert sein, Zahlen der Photonenzählereignisse {n_l}, die einer Bestimmung eines Histogramms P ^(n) unterzogen werden, zu wählen, welche gemäß der Regel
aus den Zahlen der Photonenzählereignisse in primären Zeitintervallen {N_j} berechnet werden, wobei M eine ganze Zahl ist, die ausdrückt, um welchen Faktor das Zeitintervall, in dem {n_i} bestimmt wird, länger ist als das primäre Zeitintervall. 1D-FIDA, 2D-FIDA und FIMDA verwenden diese Ausführungsform vorzugsweise.
In einer weiteren Ausführungsform werden die Zahlen der Photonenzählereignisse {n_i} gemäß einer Regel, in der primäre Zeitintervalle durch eine Zeitverzögerung voneinander getrennt sind, aus vorbestimmten primären Zeitintervallen abgeleitet. Insbesondere kann die folgende Regel angewendet werden: n_i =
wobei M und L positive ganze Zahlen sind, {n_i} Zahlen von Photonenzählereignissen sind, die einer Bestimmung eines Histogramms P ^(n) unterzogen werden, und {N_j} die Zahlen der Photonenzählereignisse in primären Zeitintervallen sind. In dieser Formel ist 2M die Zahl der primären Zeitintervalle pro Zählzeitintervall (in dem n_i bestimmt wird), während L die Zahl der ausge lassenen primären Zeitintervalle ist, die eine Verzögerung zwischen zwei Teilen des Zählzeitintervalls bilden. FACID verwendet diese Ausführungsform vorzugsweise.
In einigen Fällen könnte es bevorzugt sein, in Schritt b) nicht nur ein einziges Histogramm P ^(n) zu bestimmen, sondern eine Menge von Histogrammen P ^(n). Diese können gemäß einer Menge von unterschiedlichen Regeln bestimmt werden, wobei die Menge von Histogrammen in Schritt c) gemeinsam angepasst wird. Als Beispiel könnte eine Menge von Histogrammen mit unterschiedlichen Werten für M und/oder L gemeinsam angepasst werden. FIMDA und FACID verwenden diese Ausführungsform.
Typische physikalische Größen, die in Schritt c) gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden könnten, sind die Konzentration, spezifische Helligkeit und/oder der Diffusionskoeffizient von Molekülen oder anderen Teilchen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die erzeugende Funktion unter Verwendung des Ausdrucks G(ξ) = exp[∫dqc(q)∫d³r(e^{(ξ–1)qTB(r)}–1] berechnet, wobei c(q) die Dichte der Teilchen mit der spezifischen Helligkeit q ist, T die Länge des Zählintervalls ist und B(r) das räumliche Helligkeitsprofil als Funktion der Koordinaten ist.
Durch Anwendung der Definition (8) auf Formel (6) mit c → cdV und q → qB(r) kann die Verteilung für eine bestimmte Spezies und ein ausgewähltes Volumenelement dV geschrieben werden als: Gi(ξ;dV) = exp[cidV(e(ξ–1)qiTB(r)–1)]. (9)
Daher kann die erzeugende Funktion der gesamten Verteilung der Zahlen der Photonenzählereignisse in einer geschlossenen Form ausgedrückt werden:
Eine numerische Integration gemäß Gleichung (9) mit anschließender schneller Fourier-Transformation ist das effektivste Mittel zur Berechnung der theoretischen Verteilung P(n), die einer gegebenen Probe entspricht (d.h. gegebenen Konzentrationen und spezifischen Helligkeitswerten der fluoreszierenden Spezies). Wenn man ξ = e^iφ wählt, dann sind die Verteilung P(n) und ihre erzeugende Funktion G(φ) durch die Fourier-Transformation miteinander verknüpft. Daher ist es besonders bevorzugt, bei der Berechnung der theoretischen Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse aus ihrer erzeugenden Funktion das Argument der erzeugenden Funktion in der Form ξ = e^iφ zu wählen und einen schnellen Algorithmus der Fourier-Transformation zu verwenden. 1D-FIDA, 2D-FIDA, FIMDA und FACID verwenden diese Ausführungsform vorzugsweise.
Bei der Berechnung der theoretischen Verteilung P(n) in Schritt c) gemäß der vorliegenden Erfindung könnte das räumliche Helligkeitsprofil durch eine mathematische Beziehung zwischen Volumen und räumlicher Helligkeit modelliert werden. Insbesondere könnte man das räumliche Helligkeitsprofil durch den folgenden Ausdruck modellieren: dV/dx = A₀x(1+a₁x+a₂x²), wobei dV ein Volumenelement bezeichnet, x den Logarithmus der relativen räumlichen Helligkeit bezeichnet, A₀ eine Konstante ist, die die Volumeneinheit auswählt, und a₁ und a₂ empirisch abgeschätzte Parameter der Form der räumlichen Helligkeitsfunktion sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform könnte man das räumliche Helligkeitsprofil durch den folgenden Ausdruck modellieren: dV/dx =
Einige fluoreszente Spezies können eine beträchtlich breite Verteilung der spezifischen Helligkeit haben. Zum Beispiel können Vesikel, die wahrscheinlich eine beträchtlich breite Größenverteilung und eine statistische Zahl von Rezeptoren haben, eine statistische Zahl von markierten Ligandenmolekülen eingeschlossen haben. Um Histogramme von Zahlen von Zählereignissen für Proben, die solche Arten von Spezies enthalten, anzupassen, ist es nützlich, Gleichung (10) in folgender Weise zu modifizieren. Es wird angenommen, dass die Verteilung der Helligkeit von Teilchen q innerhalb einer Spezies mathematisch wie folgt ausgedrückt wird:
Dieser Ausdruck wurde aus Gründen der Zweckmäßigkeit ausgewählt: Alle Momente dieser Verteilung können unter Verwendung der folgenden Formel analytisch berechnet werden:
Es ist ein direkter Weg, die modifizierte erzeugende Funktion einer Verteilung der Zahl von Photonenzählereignissen abzuleiten. Gleichung (9) kann wie folgt umgeschrieben werden:
wobei
Das Integral über q kann analytisch ausgeführt werden:
Die Parameter a_i und b_i sind mit der mittleren Helligkeit q _i und der Breite der Helligkeitsverteilung σ_i ² durch
verknüpft.
Im Bereich der erhaltenen Zahlen der Zählereignisse variiert die Wahrscheinlichkeit, dass man eine bestimmte Zahl von Zählereignissen erhält, gewöhnlich um viele Größenordnungen, siehe zum Beispiel die Verteilung von 1. Folglich hat die Varianz der Zahl der Fälle bei einer gegebenen Zahl von Zählereignissen eine starke Abhängigkeit von der Zahl der Zählereignisse. Um Gewichte für die Kleinste-Quadrate-Anpassung zu bestimmen, kann man annehmen, dass die Lichtintensitäten in allen Zählintervallen voneinander unabhängig sind. Unter dieser Annahme hat man das Problem, M Fälle über Auswahlen verschiedener Zahlen von Zählereignissen n zu verteilen, wobei jedes bestimmte Ergebnis eine gegebene Wahrscheinlichkeit seiner Realisierung P(n) hat. Kovarianzmatrixelemente der Verteilung können wie folgt ausgedrückt werden:
wobei M die Zahl der Zählintervalle pro Experiment ist.
Die Kovarianzmatrix von Gleichung 17 ist singulär. Als Gewichtsmatrix dürfen wir ihre "schwache inverse" Diagonalmatrix verwenden, die wie folgt ausgedrückt wird:
Die Dispersionsmatrix (17) entspricht der Multinomialverteilung von statistischen Realisierungen von Histogrammen. Die Poisson-Verteilung mit der Randbedingung, dass die Gesamtzahl der Zählintervalle M fest ist, führt zur Multinomialverteilung. Dies ist das Prinzip hinter der Verwendung von Poisson-Gewichten, wie sie in Gleichung (18) gegeben sind.
Sei n_k der Erwartungswert der Zahl der Fälle, in denen k Photonen gezählt werden, und sei
ihre Summe. Sei m_k eine statistische Realisierung mit
Wir nehmen an, dass die Realisierungen m₀, m₁, ... einer Poisson-Statistik gehorchen:
wobei wir die Notation
eingeführt haben. Die Wahrscheinlichkeit, dass man insgesamt M Fälle hat, beträgt
Die bedingte Wahrscheinlichkeit, dass man m₀, m₁, ... Fälle hat, wenn es insgesamt M Fälle gibt, beträgt
oder
Dies ist die Multinomialverteilung, wobei wir
eingeführt haben und C_m ₀ _,m1, ...^M Multinomialkoeffizienten sind.
Im Allgemeinen erbringt eine lineare oder linearisierte Kleinste-Quadrate-Anpassung nicht nur die Werte der geschätzten Parameter, sondern auch ihre Kovarianzmatrix, vorausgesetzt, die Gewichte wurden sinnvoll gesetzt. Es kann sich in manchen einfachen Fällen als möglich erweisen, die statistischen Fehler der geschätzten Parameter analytisch auszudrücken (z.B. für das rechteckige Probenprofil und einzelne Spezies), aber bei Anwendungen ist gewöhnlich eine wenigstens zweikomponentige Analyse von Interesse. Daher kann man mit den numerischen Berechnungen statistischer Fehler zufrieden sein. Zusätzlich zu den "theoretischen" Fehlern mit der Annahme nichtkorrelierter Messungen (Gleichung (17)) werden statistische Fehler in manchen Fällen empirisch abgeschätzt, wobei man eine Reihe von etwa hundert FIDA-Experimenten unter identischen Bedingungen durchführt. In der Regel sind empirische Fehler um einen Faktor von drei bis vier größer als theoretische. Empirische Fehler scheinen bei Abtastexperimenten näher an den theoretischen zu liegen. Daher sind wir davon überzeugt, dass der Hauptgrund für die Unterschätzung theoretischer Fehler die Annahme nichtkorrelierter Messungen ist. Tabelle 1 vergleicht statistische Fehler von Parametern, die durch Anpassung eines Histogramms der Zahl von Photonenzählereignissen (FIDA) gemäß der vorliegenden Erfindung und durch die Momentanalyse abgeschätzt wurden. Fehlerwerte werden durch Verarbeitung einer Reihe von simulierten Histogrammen bestimmt. Die vorliegende Erfindung ist in überwältigender Weise besser als die Momentanalyse, wenn die Zahl der geschätzten Parameter größer als drei ist.
Tabelle 1
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet, um eine gemeinsame Verteilung von Zahlen von Photonenzählereignissen anzupassen. 2D-FIDA ist ein Beispiel für diese Ausführungsform. In Experimenten wird die Fluoreszenz aus einem mikroskopischen Volumen mit einer fluktuierenden Zahl von Molekülen unter Verwendung eines optischen Aufbaus (z.B. eines konfokalen Mikroskops) mit zwei Detektoren gemessen. Die zwei Detektoren können ein unterschiedliches polarisationsmäßiges oder spektrales Ansprechverhalten zeigen. In einer Ausführungsform werden Konzentrationen von fluoreszierenden Spezies zusammen mit zwei spezifischen Helligkeitswerten für jede Spezies bestimmt. Wenn die zweidimensionale Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (2D-FIDA) mit einem Polarisationswürfel verwendet wird, ist sie ein Werkzeug, das fluoreszente Spezies mit unterschiedlichen spezifischen Polarisationsverhältnissen voneinander unterscheiden kann. Dies ist ein typisches Beispiel für eine gemeinsame Analyse von zwei physikalischen Eigenschaften von einzelnen Molekülen oder anderen Teilchen, die im Vergleich zu Verfahren, die nur auf eine einzige physikalische Eigenschaft fokussiert sind, eine erheblich verbesserte Zuverlässigkeit gewährt.
Im folgenden wird 2D-FIDA ausführlicher erklärt.
Um die erwartete zweidimensionale Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse auszudrücken, ist es günstig, die folgenden Annahmen zu verwenden: (A) Die Koordinaten der Teilchen sind zufällig und unabhängig voneinander. (B) Der Beitrag eines Teilchens zur Fluoreszenzintensität kann als Produkt einer spezifischen Helligkeit des Teilchens und einer für das optische Gerät charakteristischen räumlichen Helligkeitsprofilsfunktion ausgedrückt werden. (C) Ein kurzes Zählzeitintervall T wird ausgewählt, während dessen sich die Helligkeit von fluoreszierenden Teilchen nicht wesentlich aufgrund von Diffusion ändert.
Zuerst wird eine gemeinsame Verteilung von Zahlen von Zählereignissen für eine einzelne fluoreszierende Spezies und ein einziges kleines offenes Volumenelement dV ausgedrückt. Das Volumenelement ist durch Koordinaten r und eine räumliche Helligkeit B(r) gekennzeichnet, und die fluoreszierende Spezies ist durch ihre spezifischen Helligkeitswerte q₁ und q₂ gekennzeichnet. Mit q₁ und q₂ werden mittlere Photonenzählraten in zwei Detektoren für ein Teilchen bezeichnet, dass sich an einem Punkt befindet, wo B(r) = 1 ist. Eine zweckmäßige Wahl besteht darin, eine Einheit für B wie in der FCS üblich durch die Gleichung χ₁ = χ₂ zu wählen, wobei χ_k = ∫B^k(r)d³r. Wenn das Volumenelement gerade m Teilchen enthält, betragen die erwarteten Zahlen der Photonenzählereignisse pro Zeitintervall T aus dem Volumenelement mg₁TB(r) und mg₂TB(r), während die Verteilung von Zahlen von Photonenzählereignissen beim Teilchen P(n₁,n₂|m) für beide Detektoren unabhängig voneinander eine Poisson-Verteilung ist:
Unter der Annahme (A) ist andererseits die Verteilung der Zahl der Teilchen einer gegebenen Spezies in dem Volumenelement eine Poisson-Verteilung mit dem Mittelwert cdV, wobei c die Konzentration bezeichnet:
Die Gesamtverteilung der Zahl der Photonenzählereignisse aus dem Volumenelement kann unter Verwendung der Gleichungen 22 und 23 ausgedrückt werden
Wie in dem oben beschriebenen eindimensionalen Fall ist eine nützliche Darstellung einer Verteilung von Zahlen von Photonenzählereignissen P(n₁,n₂) ihre erzeugende Funktion, die definiert ist als
Die erzeugende Funktion der durch Gleichung 24 ausgedrückten Verteilung kann geschrieben werden als
Insbesondere wenn man ξ_k = exp(iφ_k) wählt, sind die Verteilung P(n₁,n₂) und ihre erzeugende Funktion G(φ₁,φ₂) durch eine zweidimensionale Fourier-Transformation miteinander verknüpft. Logarithmen von erzeugenden Funktionen von Verteilungen von Zahlen von Photonenzählereignissen aus unabhängigen Quellen, wie verschiedenen Volumenelementen sowie verschiedenen Spezies, werden für die Berechnung der kombinierten Verteilung einfach addiert. Daher kann die erzeugende Funktion der Gesamtverteilung der Zahl der Photonenzählereignisse in geschlossener Form ausgedrückt werden:
In dieser Formel werden ein Beitrag der Hintergrundzählraten, λ₁ von Detektor 1 und λ₂ von Detektor 2, sowie Beiträge von verschiedenen fluoreszierenden Spezies, die durch den Index i bezeichnet werden, integriert. Eine numerische Integration gemäß Gleichung 27 mit anschließender schneller Fourier-Transformation ist ein sehr effizientes Mittel zur Berechnung der theoretischen Verteilung P(n₁,n₂), die einer gegebenen Probe entspricht (d.h. gegebenen Konzentrationen und spezifischen Helligkeitswerten von fluoreszierenden Spezies).
Die räumliche Helligkeitsfunktion wird durch die räumliche Integration auf der rechten Seite von Gleichung 27 berücksichtigt. Die dreidimensionale Integration kann auf eine eindimensionale reduziert werden, indem man die dreidimensionalen Koordinaten r durch eine eindimensionale Variable, eine monotone Funktion der räumlichen Helligkeit B(r), ersetzt. Eine zweckmäßige Wahl der Variablen ist x = |n[B(0)/B(r)]. Ein ausreichend flexibles Modell des räumlichen Helligkeitsprofils wird durch den folgenden Ausdruck vorgelegt:
In dem Intervall der erhaltenen Zahlen von Zählereignissen variiert die Wahrscheinlichkeit, dass man ein bestimmtes Paar von Zahlen von Zählereignissen erhält, gewöhnlich um viele Größenordnungen. Folglich hat die Varianz eines Datenpunkts eines Histogramms ebenfalls eine starke Abhängigkeit von den Zahlen der Zählereignisse. Um Gewichte für die Kleinste-Quadrate-Anpassung zu bestimmen, wird zur Vereinfachung angenommen, dass Koordinaten von Teilchen in allen Zählintervallen zufällig ausgewählt werden. (Dies bedeutet, man ignoriert Korrelationen der Koordinaten in aufeinanderfolgenden Zählintervallen.) Unter dieser Annahme hat man das Problem, M Fälle über Auswahlen verschiedener Paare von Zahlen von Zählereignissen n₁, n₂ zu verteilen, wobei jedes bestimmte Ergebnis eine gegebene Wahrscheinlichkeit seiner Realisierung P(n₁,n₂) hat. Kovarianzmatrixelemente des Histogramms können wie folgt ausgedrückt werden:
wobei M die Zahl der Zählintervalle pro Experiment ist.
Die Kovarianzmatrix von Gleichung 29 ist singulär. Als Gewichtsmatrix dürfen wir ihre "schwache inverse" Diagonalmatrix verwenden, die wie folgt ausgedrückt wird:
Im Allgemeinen erbringt ein linearisierter Kleinste-Quadrate-Anpassungsalgorithmus nicht nur die Werte der geschätzten Parameter, sondern auch ihre Kovarianzmatrix, vorausgesetzt, die Gewichte wurden sinnvoll gesetzt. Zusätzlich zu "theoretischen" Fehlern, der der Annahme unkorrelierter Messungen entsprechen (Gleichung (30)), werden in manchen Fällen statistische Fehler empirisch bestimmt, wobei man eine Reihe von etwa 100 2D-FIDA-Experimenten unter identischen Bedingungen durchführt. In der Regel sind empirische Fehler um einen Faktor von drei bis vier größer als theoretische. Der Hauptgrund für die Unterschätzung theoretischer Fehler ist höchstwahrscheinlich die Annahme unkorrelierter Messungen.
Obwohl die Annahme unkorrelierter Messungen unterschätzte Fehlerwerte ergibt, ist sie eine sehr nützliche theoretische Annäherung, die es ermöglicht, die Genauigkeit der Analyse unter verschiedenen experimentellen Bedingungen sowie von verschiedenen Analyseverfahren miteinander zu vergleichen. Außerdem liefert diese Annäherung ein leichtes Verfahren zur Datensimulation, das im Allgemeinen ein nützliches Werkzeug ist. Ein einfaches und sehr schnelles Verfahren der Datensimulation ist die Berechnung der erwarteten Zahl der Fälle als Funktion der Zahlen der Photonenzählereignisse und die unabhängige Addition von statistischem Poisson-Rauschen zu jeder Zahl von Fällen.
In Tabelle 2 sind theoretische Fehler einer eindimensionalen und zweidimensionalen Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung in zwei ausgewählten Fällen von zwei fluoreszierenden Spezies vorgestellt. In beiden Fällen beträgt das Verhältnis der spezifischen Helligkeitswerte der beiden Spezies drei. Im Falle von 2D-FIDA wird angenommen, dass die spektralen Empfindlichkeiten der beiden Detektoren auf verschiedene Spezies abgestimmt werden. In beiden Fällen werden eine Datensammelzeit von 10 s, ein Zeitfenster von 40 μs und eine Hintergrundzählrate von 1 kHz angenommen. Man beachte, dass die statistischen Fehler der geschätzten Parameter im 2D-FIDA-Beispiel erheblich geringer sind.
Tabelle 2
Die zweidimensionale Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung wird im folgenden mit einer zweidimensionalen Verallgemeinerung der Momentanalyse des Standes der Technik verglichen.
Faktorielle Momente der Verteilung P(n₁,n₂) sind definiert als
Faktorielle Momente sind mit faktoriellen Kumulanten K_kl verknüpft:
C bezeichnet Binomialkoeffizienten. Kumulanten können durch eine einfache Beziehung durch Konzentrationen und spezifische Helligkeitswerte ausgedrückt werden
Wenn die Einheit von B durch die Gleichung χ₁ = χ₂ ausgewählt wird, hat χ₁ die Bedeutung des Probenvolumens, das durch V bezeichnet wird, und Gleichung 33 kann so geschrieben werden:
wobei γ eine Reihe von Konstanten bezeichnet, die das Helligkeitsprofil charakterisieren
Das Prinzip der Momentanalyse besteht darin, Werte einiger Kumulanten aus einem Experiment zu bestimmen und ein Gleichungssystem 33 nach unbekannten Konzentrationen und Helligkeitswerten aufzulösen.
In Tabelle 3 sind statistische Fehler von 2D-FIDA (vorliegende Erfindung) und 2D-MAFID (eine Verallgemeinerung des Standes der Technik, in dem eine eindimensionale Momentanalyse der Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse beschrieben ist) vorgestellt, die bestimmt wurden durch Erzeugen einer Reihe von 30 statistischen Histogrammen von Zahlen von Zählereignissen, welche für identische "Proben" simuliert wurden, woraufhin 2D-FIDA und 2D-MAFID angewendet wurde, und Bestimmen der Varianz der geschätzten Parameter in beiden Fällen. Man beachte die Tendenz, dass die Vorteile von 2D-FIDA im Vergleich zu 2D-MAFID mit der Zahl der zu schätzenden Parameter zunehmen.
Tabelle 3
Fehlerwerte sind aus den gestreuten Ergebnissen der Analyse berechnet, die auf eine Reihe von simulierten Daten angewendet wurde.
In Tabelle 4 ist die relative Abweichung der Mittelwerte (d.h. der systematische Fehler) geschätzter Parameter für 2D-FIDA (vorliegende Erfindung) und 2D-MAFID (eine Verallgemeinerung des Standes der Technik) vorgestellt. In jedem Fall wird der systematische Fehler aus der Analyse einer Reihe von dreißig simulierten statistischen Histogrammen von Zahlen von Zählereignissen bestimmt. Drei Fälle wurden analysiert. Im ersten Fall waren die in Datensimulationen und in der Datenanalyse verwendeten Modelle identisch. Im zweiten Fall wurden die Histogramme der Zahlen der Zählereignisse unter der Annahme simuliert, dass Teilchen der zweiten Spezies nicht äquivalent sind, aber in ihrer individuellen Helligkeit mit einer relativen Halbwertsbreite von 20% verteilt sind. Dieses Phänomen wurde bei der Analyse jedoch absichtlich ignoriert. Selbstverständlich erzeugt die Anwendung eines leicht inadäquaten Modells für die Analyse einen systematischen Fehler bei den geschätzten Parametern. Der dritte Fall ist ähnlich wie der zweite, außer dass die relative Halbwertsbreite der individuellen Helligkeitsverteilung der zweiten Spezies 50% beträgt, was für vesikuläre Präparate ein üblicher Wert ist. Es ist bemerkenswert, dass in den Fällen zwei und drei methodische Abweichungen zu bemerken sind, wenn man gewichtete Restwerte von 2D-FIDA abbildet, aber 2D-FIDA bringt immer noch sinnvolle Ergebnisse. Dies ist eine allgemeine Eigenschaft: 2D-FIDA, das die ursprünglichen Daten direkt anpasst, erfordert ein weniger exaktes Modell als 2D-MAFID, das ein Verfahren ist, welches eine mathematische Transformation der ursprünglichen Daten anpasst.
Tabelle 4
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind konfokale Techniken besonders gut geeignet, um die fluktuierende Intensität der Fluoreszenz zu messen. Sie können auf ein weites Feld von Anwendungen angewendet werden, wie Biomedizin, Diagnostik, Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening, Sortierverfahren, wie Sortieren von Teilchen wie Beads, Vesikeln, Zellen, Bakterien, Viren usw. Die Technik der konjugierten Brennpunkte (konfokale Technik) beruht auf der Verwendung einer Punktlichtquelle, die scharf auf einen beugungsbegrenzten Punkt auf der Probe fokussiert ist. Das emittierte Licht wird durch ein räumliches Filter (Nadelloch) betrachtet, das das Blickfeld so isoliert, dass es genau mit dem beleuchteten Punkt zusammenfällt. So sind die Beleuchtungs- und die Nachweisapertur optisch miteinander konjugiert. Licht, das aus anderen Brennebenen als der der Objektivlinse stammt, wird verworfen, was effektiv eine sehr kleine Feldtiefe ergibt. Daher wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Schritt a) ein konfokales Mikroskop verwendet, um die Intensität der Fluoreszenz zu messen. Um ein hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, ist es nützlich, die Intensität der Fluoreszenz mit Hilfe einer Apparatur zu messen, die folgendes umfasst: eine Strahlungsquelle (12) zur Bereitstellung von anregender Strahlung (14), ein Objektiv (22) zur Fokussierung der anregenden Strahlung (14) in ein Messvolumen (26), einen Detektor (42) zum Nachweis von Emissionsstrahlung (30), die aus dem Messvolumen (26) stammt, und eine undurchsichtige Einrichtung (44), die im Weg (32) der Emissionsstrahlung (30) oder der anregenden Strahlung (14) positioniert ist, um den zentralen Teil der Emissionsstrahlung (30) oder der anregenden Strahlung (14) auszulöschen. Es könnte besonders bevorzugt sein, einen optischen Aufbau zu verwenden, wie er im Einzelnen in 9 beschrieben ist.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt ein Histogramm der Zahl von Zählereignissen, das für eine Lösung des Farbstoffs Tetramethylrhodamin erhalten wurde (a), und Restwertkurven, die verschiedenen Anpassungsverfahren entsprechen (b).
2 zeigt simulierte Histogramme der Zahl der Zählereignisse für einen Fall, der eine Bindungsreaktion eines markierten Liganden an Vesikel modelliert.
3 zeigt theoretische Fehler der geschätzten Parameter c und q einer Lösung von einzelnen Spezies in Abhängigkeit von dem Wert von q.
4 zeigt theoretische Fehler der geschätzten Parameter c und q einer Lösung von einzelnen Spezies in Abhängigkeit von dem Wert von c.
5 zeigt theoretische Fehler der geschätzten Parameter c und q einer Lösung von einzelnen Spezies in Abhängigkeit von dem Wert von T.
6 zeigt theoretische Fehler der geschätzten Parameter c und q eines Gemischs von zwei Spezies in Abhängigkeit von dem Wert von T.
7 zeigt theoretische Fehler der geschätzten Parameter c und q eines Gemischs von zwei Spezies in Abhängigkeit von dem Verhältnis von q₂ zu q₁.
8 zeigt theoretische Fehler der geschätzten Parameter c und q eines Gemischs von zwei Spezies in Abhängigkeit von Konzentrationen.
9 zeigt eine Apparatur, die zur Verwendung bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist.
In 10A sind die berechneten Verteilungen der Zahlen von Photonenzählereignissen P(n) für Fälle aufgetragen, die eine identische mittlere Zahl von Zählereignissen n haben, sich aber durch die Zusammensetzung der Probe unterscheiden.
10B ist eine Graphik der Histogramme der Zahl der Photonenzählereignisse reiner Lösungen von Rhodamin 6G (Rh6G) und Tetramethylrhodamin (TMR) sowie eines Gemischs dieser beiden Farbstoffe.
Die beispielhaften Restwerte für Rh6G sind in 10C gezeigt.
l0D zeigt die Ergebnisse einer ITR-Analyse (inverse Transformation mit Hilfe von linearer Regularisierung und Beschränken der Konzentrationen auf nichtnegative Werte), die auf die Kurven von 10B angewendet wird.
11 zeigt eine ITR-Analyse von hybridisierten (A-C) und mit Restriktionsenzym gespaltenen (D, E) markierten Oligonucleotiden. Die Kurven resultieren aus einer Menge von 20 individuellen 10-s-Messungen, die untereinander Variationen von weniger als 10% zeigen.
12 zeigt die Hybridisierung und Spaltung durch Restriktionsenzym von verschiedenen Kombinationen markierter und unmarkierter Oligonucleotide.
13 ist eine graphische Darstellung eines gemeinsamen Histogramms der Zahl von Photonenzählereignissen, die für eine Lösung von TAMRA gemessen wurde.
14 ist eine graphische Darstellung von gewichteten Restwerten eines gemeinsamen Histogramms von Zahlen von Zählereignissen, die von einem Gemisch von TAMRA (5(6)-Carboxytetramethylrhodamin) und RRX (Rhodaminrot X) erhalten wurden.
15 zeigt gemeinsame Histogramme der Zahlen von Photonenzählereignissen für die "parallele" und die "senkrechte" Polarisationskomponente der Fluoreszenz, die für dieselbe Theophyllinkonzentration von 2 nM, aber verschiedene Antikörperkonzentrationen gemessen wurde.
16 zeigt die Ergebnisse von 2D-FIDA, das auf Daten von Proben mit derselben Theophyllinkonzentration, aber unterschiedlicher Antikörperkonzentration angewendet wurde.
17 zeigt das Prinzip eines zweifarbigen 2D-FIDA-Experiments mit mehrfachen Bindungsstellen pro Vesikel.
18 zeigt gemeinsame Histogramme der Zahlen von Photonenzählereignissen in "grün" und "rot", die unter den Bedingungen eines niedrigen (A) und hohen (B) Grades der Bindung von SMS-14 (Somatostatin-14) an SSTR-2 (Human-Typ-2-Hochaffinitätssomatostatinrezeptor) gemessen wurden.
19 zeigt die Konkurrenzkurve für die Bindungsreaktion von SMS-14 an SSTR-2.
20 zeigt eine Ausführungsform, bei der Zahlen von Photonenzählereignissen {n_i}, die in Schritt b) der Bestimmung eines Histogramms P ^(n) unterzogen werden, aus Zahlen von Photonenzählereignissen in primären Zeitintervallen {N_j} abgeleitet werden, indem man Zahlen von Photonenzählereignissen aus primären Zeitintervallen gemäß einer vorbestimmten Regel aufsummiert.
21 zeigt eine weitere Ausführungsform, bei der Zahlen von Photonenzählereignissen {n_i} gemäß einer Regel aus vorbestimmten primären Zeitintervallen abgeleitet werden, wobei primäre Zeitintervalle durch eine Zeitverzögerung voneinander getrennt sind.
22 zeigt ein schematisches Diagramm der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Moleküls an rezeptortragende Vesikel, wie sie unter Verwendung der vorliegenden Erfindung beobachtet wurde.
23 zeigt die Ligandbindungseigenschaften von TMR-EGF an Membranen, die aus A431-Zellen präpariert wurden.
24 zeigt die Bindung von TMR-EGF an Membranen, die aus HCT-Zellen präpariert wurden.
25 zeigt das pharmakologische Profil des EGF-Rezeptors.
26 zeigt die Ligandbindungseigenschaften von Bodipy FL-CGP 12177.
27 zeigt die Hemmung der Bindung von Bodipy FL-CGP 12177 in Assayvolumina von 40 μl bzw. 1 μl.
28 zeigt die Histogramme für Zahlen von Zählereignissen für eine 0,8 nM Cy5-Lösung, die mit unterschiedlichen Zeitfenstern T aufgenommen wurden.
29 zeigt die Anpassungsergebnisse von simulierten Daten für ein Gemisch von 3 Komponenten. Die simulierten Werte der Helligkeit (in kHz) und Diffusionszeit (in μs) für die Komponenten sind: (30 kHz, 192 μs); (120 kHz, 192 μs); (120 kHz, 64 μs). Die Beiträge zur Gesamtintensität betragen 10,8, 20,4 bzw. 14,4. Die Graphik zeigt die Ergebnisse von FIMDA aus 20 unabhängigen Realisierungen von Simulationen, die jeweils einem Experiment von 60 s Dauer entsprechen.
30 zeigt die Bindung von pTyr-Val-Asn-Val-Lys(Cy5) an SH2. Die durchgezogene Kurve resultiert aus einer hyperbolischen Anpassung, die eine Bindungskonstante von K_D = 1,68 ± 0,27 μM ergibt.
31 zeigt die Messung der Bindungskonstante (K_D) von monoklonalem Antikörper, der auf der Oberfläche der theophyllinspezifischen Hybridomzelllinie HB-8152 exponiert ist.
32 zeigt die IC₅₀-Messung der spezifischen Bindung von Theophyllin-TAMRA an monoklonalen Antikörper, der auf der Oberfläche der Hybridomzelllinie HB-8152 exponiert ist.
33 zeigt die Messung der Affinitätskonstanten von löslichem monoklonalem Antikörper, der aus dem Kulturmedium der theophyllinspezifischen Hybridomzelllinie HB-8152 gereinigt wurde.
Ausführliche Beschreibung der Figuren
1
Es wird jetzt auf 1 Bezug genommen, die ein Histogramm der Zahl von Zählereignissen zeigt, das für eine Lösung des Farbstoffs Tetramethylrhodamin erhalten wurde (a), und Restwertkurven, die der besten Anpassung entsprechen, die mit den unten gezeigten Gleichungen (36), (37) und (38) erhalten wurde (b). Die Konzentration der wässrigen Tetramethylrhodaminlösung betrug etwa 10^–9 M. Die primären Zeitintervalle betrugen 40 μs. Die Datensammelzeit betrug 60 s. Dieses 1D-FIDA-Experiment zeigt die Wichtigkeit der Verwendung eines ausreichend flexiblen Modells für das Helligkeitsprofil. Dies ist auch bei 2D-FIDA, FIMDA und FACID wichtig.
Das am häufigsten verwendete räumliche Profilmodell in FCS ist das dreidimensionale Gauss-Profil mit einem einzigen Formparameter, dem axialen Dimensionsverhältnis in longitudinaler und radialer Richtung. Die Restwertkurve mit den leeren Kreisen zeigt die Anpassungsqualität, die mit dem Gauss-Profil erhalten werden kann. Es gibt große systematische Abweichungen bei den Restwerten. Was ein ausreichend flexibles Modell für die Anpassung von FCS-Daten ist, hat sich für FIDA als ziemlich unflexibles und inadäquates Modell erwiesen.
Ein Modell des Probenprofils, das eine bessere Anpassung des Histogramms P ^(n) ergeben hat, ist das Gauss-Lorentz-Profil (leere Quadrate), aber auch diesem Modell fehlt es noch an Flexibilität. Gemäß Gleichung (8) wird eine bestimmte Funktion der räumlichen Helligkeit B über das Volumen integriert. Mit anderen Worten, es ist eine Beziehung zwischen B und V, die bei FIDA ein gegebenes räumliches Helligkeitsprofil charakterisiert. Zum Beispiel ergibt das Gauss-Profil die Beziehung
wobei x = –|n B. Das Gauss-Lorentz-Profil ergibt die Beziehung
Beide Beziehungen sind ziemlich unflexibel, d.h. sie ergeben keine räumlichen Formparameter, um die theoretisch berechnete Verteilung so anzupassen, dass sie zu den gemessenen Daten passt.
Wenn man ausreichend flexible Modelle sucht, um experimentelle Daten anzupassen, könnte es nützlich sein, die folgende Beziehung anzuwenden:
Hinter Gleichung (38) steckt ein formales und kein physikalisches Modell. Die mit Gleichung (38) erhältliche Anpassungsqualität wird durch die Kurve mit den ausgefüllten Quadraten gezeigt.
2
Es wird jetzt auf 2 Bezug genommen. Simulierte Histogramme der Zahl der Zählereignisse sind für einen Fall gezeigt, der eine Bindungsreaktion eines markierten Liganden an Vesikel modelliert. Die primären Zeitintervalle betrugen 40 μs, die Werte der räumlichen Parameter von Gleichung (38) waren a₁ = –0,4, a₂ = 0,08, die Hintergrundzählrate war b = 1,0 kHz, die Datensammelzeit betrug 4 s. Die Kurve "Ligand" entspricht einer Spezies mit c = 6,0, q = 6,0 kHz/Teilchen, σ_q = 0. Die Kurve "Vesikel" entspricht einer Spezies mit c = 0,05, q = 300,0 kHz/Teilchen, σ_q = 150,0. Die Kurve "Gemisch" entspricht ihrem Gemisch. Konzentrationen und spezifische Helligkeitswerte wurden so ausgewählt, dass sie eine charakteristische Situation beim Wirkstoffscreening modellieren. Bei Anwendung von 1D-FIDA liefert die Anpassung von Kurve (c) die Werte der fünf Parameter, die die gegebene "Probe" charakterisieren, mit statistischen Fehlern, die meistens zwischen 3,5 und 6 Prozent liegen, außer dem Fehler für das σq von Vesikeln, der 13 Prozent beträgt. Wenn das σq von Vesikeln jedoch bei der Anpassung festgehalten wird, liegen alle statistischen Fehler unter 4 Prozent.
Für den schnellsten Datensimulationsalgorithmus kann man für jeden Wert von n unabhängig die erwartete Verteilung berechnen und eine zufällige Poisson-Zahl der Fälle erzeugen. Die Erzeugung einer zufälligen Poisson-Zahl wird wie folgt durchgeführt: Für einen gegebenen Erwartungswert von Fällen E wird eine simulierte Zahl von Fällen 5 durch die folgenden Ungleichungen aus einer routinemäßig erzeugten Zahl R zwischen 0,0 und 1,0 bestimmt:
Als kosmetischer Fehler kann die Gesamtzahl der Fälle
leicht von der vorgegebenen Zahl M abweichen. Ein langsamerer, aber direkter Datensimulationsalgorithmus ist die Erzeugung einer statistischen Konfiguration von Teilchen in Volumenelementen, die zur Fluoreszenz beitragen, wobei die Berechnung der klassischen Lichtintensität der gegebenen Konfiguration von Teilchen entspricht und die Erzeugung einer statistischen Poisson-Zahl dieser Intensität als simulierte Zahl von Photonenzählereignissen entspricht. Dieses Verfahren wird M-mal wiederholt, so dass man ein Histogramm von simulierten Zahlen von Zählereignissen erhält.
3 bis 8
Die 3 bis 8 zeigen theoretische Fehler von 1D-FIDA.
Figuren 3
Es wird jetzt auf 3 Bezug genommen, die die theoretischen Fehler der geschätzten Parameter c und q einer Lösung von einzelnen Spezies in Abhängigkeit von dem Wert von q zeigt. Die folgenden Werte von experimentellen Parametern wurden ausgewählt: c = 1,0; T = 20 μs; a₁ = –0,4; a₂ = 0,08; b = 1,0 kHz; Datensammelzeit 2s.
4
4 zeigt die theoretischen Fehler der geschätzten Parameter c und q einer Lösung von einzelnen Spezies in Abhängigkeit von dem Wert von c. Die folgenden Werte von experimentellen Parametern wurden ausgewählt: q = 60 kHz/ Teilchen; T = 20 μs; a₁ = –0,4; a₂ = 0,08; b = 1,0 kHz; Datensammelzeit 2s.
Figur 5
Es wird jetzt auf 5 Bezug genommen. Gezeigt sind theoretische Fehler der geschätzten Parameter c und q einer Lösung von einzelnen Spezies in Abhängigkeit von dem Wert von T. Die folgenden Werte von experimentellen Parametern wurden ausgewählt: c = 1,0; q = 30,0 kHz/Teilchen (obere Graphiken); q = 60,0 kHz/Teilchen (untere Graphiken); a₁ = –0,4; a₂ = 0,08; b = 1,0 kHz; Datensammelzeit 2s.
6
6 zeigt die theoretischen Fehler der geschätzten Parameter c und q eines Gemischs von zwei Spezies in Abhängigkeit von dem Wert von T. Die folgenden Werte von experimentellen Parametern wurden ausgewählt: c₁ = 0,1; c₂ = 2,0; q₁ = 200,0 kHz/Teilchen; q₂ = 10,0 kHz/Teilchen; a₁ = –0,4; a₂ = 0,08; b = 1,0 kHz; Datensammelzeit 10s. Man beachte, dass der optimale Wert von T für die Bestimmung der Parameter für die hellere Spezies geringer ist als der für die dunklere Spezies.
7
Es wird jetzt auf 7 Bezug genommen, die die theoretischen Fehler der geschätzten Parameter c und q eines Gemischs von zwei Spezies in Abhängigkeit von dem Verhältnis von q₂ zu q₁ zeigt. Die folgenden Werte von experimentellen Parametern wurden ausgewählt: q₁ = 50,0 kHz/Teilchen; c₁ = c₂ = 0,5; a₁ = –0,4; a₂ = 0,08; b = 1,0 kHz; Datensammelzeit 40s.
8
8 zeigt die theoretischen Fehler der geschätzten Parameter c und q eines Gemischs von zwei Spezies in Abhängigkeit von Konzentrationen. Die Konzentrationen wurden synchron geändert, c₁ = c₂. Die folgenden Werte von experimentellen Parametern wurden ausgewählt: q₁ = 75,0 kHz/Teilchen; q₂ = 25,0 kHz/Teilchen; a₁ = –0,4; a₂ = 0,08; b = 1,0 kHz; Datensammelzeit 60s. Man beachte, dass eine optimale Konzentration bei etwa einem Teilchen pro Probenvolumen existiert. Dies ist im Allgemeinen wahr, außer wenn weniger als drei Parameter zu bestimmen sind.
9
Es wird jetzt auf 9 Bezug genommen, die eine Ausführungsform einer Apparatur zeigt, die zur Verwendung bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Die Apparatur 10 umfasst einen Laser 12, der als Lichtquelle dient, um die Probe mit einem Bündel von kohärenter monochromatischer Anregungsstrahlung 14 zu beleuchten. Die Anregungsstrahlung 14 wird durch eine Linse 16 parallel gemacht und erreicht einen dichroitischen Spiegel 20. Der Winkel zwischen der optischen Achse 18 und dem dichroitischen Spiegel 20 beträgt vorzugsweise 45°. Der dichroitische Spiegel 20 reflektiert die Anregungsstrahlung 14 in Richtung auf eine Objektivlinse 22, deren Brennpunkt 24 innerhalb eines Probenvolumens 26 liegt. Das Probenvolumen 26 und die Objektivlinse 22 sind vorzugsweise durch ein transparentes Deckglas 28 voneinander getrennt, zum Beispiel durch den Boden einer kommerziell erhältlichen Mikrotiterplatte, die die Probe enthält. Die Probe enthält vorzugsweise fluoreszenzmarkierte Moleküle oder andere Teilchen. Aufgrund der Anregung durch eine geeignete Anregungsstrahlung 14 emittieren die in der Probe vorhandenen Moleküle oder anderen Teilchen Strahlung 30. Die Emissionsstrahlung 30 tritt durch die Objektivlinse 22 und erreicht den dichroitischen Spiegel 20, der für die Emissionsstrahlung 30 transparent ist. Danach tritt die Emissionsstrahlung durch ein Filter 34 und eine Kollimatorlinse 36 auf der optischen Achse 32. Eine Lochblende 38 befindet sich im Brennpunkt der Kollimatorlinse 36. Emissionsstrahlung 30, die durch die Lochblende 38 tritt, erreicht eine weitere Linse 40 und wird danach durch den Photodetektor 42 nachgewiesen. Innerhalb des Weges der Emissionsstrahlung 30, insbesondere zwischen dem dichroitischen Spiegel 20 und dem Photodetektor 42, wird eine undurchsichtige Einrichtung 44 bereitgestellt, durch die ein zentraler Teil der Emissionsstrahlung 30 nicht hindurchtreten kann. Dieser zentrale Teil der Emissionsstrahlung 30 stammt aus Bereichen auf der optischen Achse 32 vor oder hinter dem Brennpunkt 24 der Anregungsstrahlung 14. Nur Emissionsstrahlung 30, die aus dem Brennpunkt 24 oder seiner direkten Nachbarschaft stammt, tritt durch die Lochblende 38 und erreicht den Photodetektor 42. Anstatt eine undurchsichtige Einrichtung 44 innerhalb des Weges der Emissionsstrahlung 30 zu platzieren, ist auch der Weg der Anregungsstrahlung 14 geeignet, um eine undurchsichtige Einrichtung 44 zu positionieren. Insbesondere kann eine undurchsichtige Einrichtung 44 zwischen dem Laser 12 und dem dichroitischen Spiegel 20 positioniert werden. Die Verwendung einer undurchsichtigen Einrichtung 44, wie sie hier im Einzelnen beschrieben ist, verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis.
10
In 10A sind die berechneten Verteilungen der Zahlen von Photonenzählereignissen P(n) für fünf Fälle mit derselben mittleren Zählrate n = 1,0 gezeigt. Die leeren Symbole entsprechen Lösungen von einzelnen Spezies, aber mit unterschiedlichen Werten für die mittlere Zahl von Zählereignissen pro Teilchen qT. Die durchgezogene Linie ist für ein Gemisch von zwei Spezies berechnet, eine mit qT = 0,5, und die andere mit qT = 8,0. Offensichtlich unterscheiden sich die Kurven erheblich voneinander. Der wichtige Punkt ist, dass 1D-FIDA gemäß der vorliegenden Erfindung die Beiträge der einzelnen Spezies eindeutig voneinander trennen kann.
Es wird jetzt auf 10B Bezug genommen, die die Verteilungen der Zahl der Photonenzählereignisse reiner Lösungen von zwei verschiedenen Farbstoffen, 0,5 nM Rhodamin 6G (Rh6G) und 1,5 nM Tetramethylrhodamin (TMR) sowie eines Gemischs der beiden (0,8 nM TMR, 0,1 nM Rh6G) zeigt. Das Hauptgerät ist ein konfokales Mikroskop (ConfoCor^®; Evotec Biosystems und Carl Zeiss, Deutschland), das routinemäßig für Fluoreszenzkorrelationsstudien verwendet wird. Ein geschwächter (auf etwa 800 μW) Strahl aus einem Argonionenlaser, Wellenlänge 514,5 nm, wird auf einen Punkt mit einem Radius von ungefähr 0,5 μm fokussiert, was die doppelte Größe eines Punkts bei üblichen FCS-Experimenten ist, und führt zu einer Diffusionszeit von ungefähr 200 μs für Rhodamin 6G. Die Anregungsintensität wurde im Allgemeinen unterhalb oder auf einem Niveau gehalten, das durch etwa 15 Prozent Amplitude des Triplettterms der Autokorrelationsfunktion gekennzeichnet ist. Die Fluoreszenzemission wird durch eine Lochblende in der Brennebene des Mikroskops nachgewiesen, wobei man einen Avalanche-Photodiodendetektor SPCM-AQ 131 (EG&G) verwendet. Die Histogramme der Zahl der Photonenzählereignisse wurden bei einer Verweilzeit T = 40 μs gemessen. Die Datensammelzeit betrug 50 s. Diese Histogramme dienen als Eingabedaten für 1D-FIDA. Die Ergebnisse einer mehrkomponentigen Anpassungsanalyse sind unten in Tabelle 5 mit x²-Werten angegeben, die berechnet wurden gemäß:
wobei n_P die Länge des gemessenen Histogramms P ^(n) ist und n_fit die Zahl der Anpassungsparameter ist. In der mehrkomponentigen Analyse passt man das gemessene Histogramm der Zahl der Photonenzählereignisse an, wobei man eine bestimmte Zahl von fluoreszierenden Spezies annimmt, und schätzt unbekannte Werte der Konzentration und spezifischen Helligkeit ab.
Tabelle 5
In allen Fällen wurde die Hintergrundzählrate auf einem Wert von 1,05 kHz festgehalten, gemessen mit entionisiertem Wasser. a₂ und a₃ sind Vornormalisierungswerte, wenn a₁ auf 1,0 festgehalten wird. Die theoretischen statistischen Fehler in Tabelle 5 entsprechen theoretischen Gewichten:
Diese Formel ist unter der einfachen Annahme von N unabhängigen Messungen der Zahl der Photonenzählereignisse abgeleitet. In Wirklichkeit sind aufeinanderfolgende Messungen miteinander korreliert, und daher sind die Fehler der ge schätzten Parameter, die der Anpassungsalgorithmus liefert, gegenüber wirklichen statistischen Fehlern unterschätzt. Wir haben aus einer getrennten Reihe von 30 bis 200 Messungen empirisch bestimmt, dass diese statistischen Fehler um einen Faktor von etwa drei größer als theoretische sind.
Die beispielhaften Restwerte für Rh6G sind in 10C gezeigt.
Am häufigsten wird 1D-FIDA verwendet, wobei man eine gegebene Zahl von fluoreszierenden Spezies annimmt und die beste Anpassung zwischen den gemessenen und theoretischen Verteilungen unter dieser Annahme findet. 1D-FIDA kann jedoch auch angewendet werden, wenn man eine kontinuierliche Verteilung der spezifischen Helligkeit der fluoreszierenden Teilchen annimmt. Dieses Verfahren ist allgemein als inverse Transformation mit Regularisierungen (ITR) bekannt. Die Ergebnisse der ITR-Analyse in 1D-FIDA sind in 10D gezeigt, die die Verteilung der Zahl der Teilchen als Funktion ihrer spezifischen Helligkeit ausdrückt. Eine solche ITR-Analyse erfolgte mit Hilfe von linearer Regularisierung und Beschränken der Konzentrationen auf nichtnegative Werte. ITR ist ein wertvolles Werkzeug, insbesondere für Proben, von denen keine a-priori-Informationen über die Probenzusammensetzung vorliegen, oder wenn die Probenzusammensetzung heterogen ist. Die gestrichelten Linien entsprechen den Lösungen der einzelnen Farbstoffe (Rh6G und TMR), und die durchgezogene Linie entspricht ihrem Gemisch. Die Ordinate gibt die mittlere Zahl von Teilchen innerhalb des konfokalen Volumenelements an (links: einzelne Farbstoffe; rechts: Gemisch). Wegen Einzelheiten zu den Geräten, siehe die Beschreibung von 10B. Das ideale Ergebnis wären einzelne δ-Peaks für die Lösungen einzelner Spezies und zwei δ-Peaks für das Gemisch. In Wirklichkeit wird die Breite der spektralen Peaks, die von ITR ausgegeben werden, nicht nur von der wahren Breite der Verteilung der spezifischen Helligkeitswerte bestimmt, sondern auch von der Genauigkeit der Eingabedaten und der besonderen Realisierung der linearen Regularisierung: Wenn ein breites Spektrum genauso gut zu den experimentellen Daten passt wie ein schmales, dann . bevorzugt ITR einfach das breite.
11
Als weiteres Beispiel wurde 1D-FIDA gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Untersuchung der Hybridisierung von mit 5(6)-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) markierten 40meren entweder mit markierten oder mit unmarkierten komplementären Oligonucleotiden und die anschließende symmetrische Spaltung des DNA-Hybrids durch die Restriktionsendonucleasen HindIII und KpnI angewendet. Die speziellen Oligonucleotide, die in dieser Studie verwendet wurden, waren
Sie wurden in HPLC-reiner Qualität von Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland) bezogen. Alle Messungen wurden auf dem oben beschriebenen FCS-Lesegerät. bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 543/580 nm unter Verwendung eines 4-mW-Helium/Neon-Lasers (Uniphase), der auf ungefähr 300 μW abgeschwächt war, durchgeführt. Es zeigte sich, dass der Wasserhintergrund unter 800 Hz lag. Für die Messungen wurden Probenaliquote auf 1 nM verdünnt, und 20 μl wurden einem Assay in einem 8-Napf-Kammerdeckglas (Nalge Nunc) bei Raumtemperatur unterzogen. Die Hybridisierungsreaktion wurde in 70%igem Formamid durchgeführt, das 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,2 mM NaCl und eine Oligonucleotidkonzentration von 0,5 μM enthielt. Die Denaturierung erfolgte 2 min lang bei 95 °C, und die anschließende Hybridisierung erfolgte 40 min lang bei 55-60 °C im Einklang mit der optimierten Temperatur Tx, die 10-15 Grad unterhalb des Schmelzpunkts Tm liegt (Heating Block, Techne). Tm wurde wie folgt berechnet: Tm = 81,5 + 16,6 (log₁₀[Na⁺] + 0,41 (%G+C) – 600/N (N = 40; %G+C = 42,5). Restriktionsabbauanalysen der Hybrid-DNA wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII und KpnI durchgeführt. Die Restriktionsstelle wurde gewählt, um Fragmente unterschiedlicher Größe zu erhalten. Die Spaltungsreaktionen wurden 1 h lang bei 37 °C in 3,3 mM Tris/Acetat (pH 7,9), 1 mM Magnesiumacetat, 6,6 mM Kaliumacetat und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin durchgeführt. Der Reaktionsverlauf ist durch erhebliche Verschiebungen der Fluoreszenzintensität pro Molekül innerhalb eines Bereichs von einer Größenordnung gekennzeichnet (11A bis E). Es ist wichtig, festzustellen, dass der resultierende doppelte Produktpeak einer einzigen Hybridisierungsspezies entspricht, bei der keine unhybridisierten Spezies nachweisbar sind. Dies konnte leicht in Hybridisierungs/Spaltungs-Experimenten unter Verwendung von markierten/unmarkierten Oligonucleotidkombinationen gezeigt werden, wobei Signale mit unterschiedlicher Helligkeit im Vergleich zu dem doppelt markierten Hybrid erhalten wurden (12A,B). Eine Erklärung für eine solche Doppelpeakstruktur könnten konformatorische Fluktuationen sein, die sich aus Übergängen zwischen zwei Konformationszuständen ergeben. Dieses Verhalten wird unter Verwendung eines Dreizustandsmodells der Konformationsdynamik mit einer polaren, einer unpolaren und einer löschenden Umgebung des Markers beschrieben (Eggeling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1556-1561). Aus den vorliegenden Daten kann geschlossen werden, dass die konformatorischen Fluktuationen erheblich von der DNA-Länge und der Anzahl der Marken abhängen. Die kleinen abgebauten DNA-Fragmente zeigen eine einzige Helligkeit, und das Konzentrationsverhältnis der Edukt-Doppelpeaks verschiebt sich in Richtung auf eine Komponente, wenn Hybride mit einem Marken untersucht werden. Als weiteres Ergebnis zeigen kleine Fragmente eine geringe molekulare Helligkeit, und große Fragmente entsprechen hohen Helligkeitswerten (Q₂ ≈ Q₃, Q₁ ≈ Q₄)
Figur 12
Auf der Grundlage von symmetrischen Spaltstellen für die beiden Enzyme sind DNA-Fragmente gleicher Größe und anschließend sehr ähnlicher molekularer Helligkeit zu erwarten. Die 12A und B zeigen eindeutig, dass ein solches Ergebnis beobachtet wurde und die theoretische Beziehung Q₁ + Q₂ = Q₃ + Q₄ experimentell bestätigt ist. Restriktionsabbauanalysen der Hybrid-DNA wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII und KpnI entweder allein oder in Kombination durchgeführt. Die Restriktionsstellen führen zu symmetrisch gespaltenen Fragmenten (2 × 12mere, 1 × 16mer für doppelten Abbau).
entspricht markierter DNA. Q_01-03 Intensitäten von DNA-Hybriden, Q_i: Intensitäten von Spaltprodukten. Der größte Teil aller Messungen von Spaltprodukten unter Verwendung von einfach und doppelt markierten DNA-Strukturen ermöglicht es, alle beobachteten Intensitäten mit individuellen Strukturen in einer einzigen Messung zu klassifizieren, eine Eigenschaft des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, die bei Verwendung irgendeines anderen bekannten Analyseverfahrens nicht möglich ist.
13 und 14
sEs wird jetzt auf die 13 und 14 Bezug genommen. Als zentraler optischer Bestandteil des Geräts für 2D-FIDA wird ein konfokales Mikroskop verwendet, wie in FCS-Spektrometern (Koppel et al., Biophys. J. 16: 1315-1329, 1976). Für die Anregung von Fluoreszenz wird ein Strahl von einem Ar- oder grünen He/Ne-Laser durch Neutralfilter abgeschwächt, tritt durch einen Strahlaufweiter und wird durch einen dichroitischen Spiegel auf das Mikroskopobjektiv gerichtet. In mehreren Experimenten mit langsam diffundierenden Teilchen wird Strahlabtastung in Kombination mit Probenabtastung als Werkzeug verwendet, das aus der Laserrastermikroskopie bekannt ist. Die Fluoreszenz wird von demselben Objektiv durch den dichroitischen Spiegel hindurch gesammelt und auf eine konfokale Lochblende fokussiert, die dazu dient, das Licht außerhalb des Brennpunkts zurückzuweisen. Die Auflösung in der Längsrichtung wird außerdem verbessert, indem man einen konzentrischen undurchsichtigen Punkt verwendet, der etwa ein Viertel der Öffnung im Fluoreszenzsammelweg des Mikroskops ausschließt (siehe Beschreibung von 9). Das Licht, das durch die Lochblende tritt, wird durch einen Strahlteiler zum Nachweis durch zwei Detektoren geteilt. Je nach dem allgemeinen Typ eines 2D-FIDA-Experiments ist der Strahlteiler entweder ein Polarisationswürfel oder ein dichroitischer Spiegel. Im ersten Fall wird ein übliches spektrales Bandfilter verwendet, während im Falle von zweifarbigem FIDA jeder Detektor einen anderen Bandfilter vor sich aufweist. Die Photonenzähldetektoren sind Silicium-Avalanche-Photodiodenmodule SPCM-AQ-131, EG&G Optoelectronics, Kanada. Die TTL-Pulse aus den Detektoren werden von einem Zweikanalzähler gezählt, der von der Evotec Biosystems AG (Hamburg, Deutschland) als Einsteckkarte für einen Computer konstruiert wurde. Die Verteilungen der Zahlen der Zählereignisse werden während des Lesens von Daten aus dem 32-MB-Onboard-Puffer berechnet, was selbst ein Echtzeitverfahren ist. Durch Zuführen der Detektorausgabewerte zu einem Korrelator können FCS-Messungen parallel mit FIDA-Experimenten durchgeführt werden.
Die Niveaus der Hintergrundzählrate für beide Detektoren werden durch ein getrenntes Experiment mit bidestilliertem Wasser bestimmt. Den Hauptbeitrag zu der nichtfluktuierenden Hintergrundlichtintensität liefert die Raman-Streuung von Wasser.
Der Radius des gemessenen Probenvolumens kann eingestellt werden, indem man einen geeigneten Aufweitungsfaktor für den ursprünglichen Laserstrahl wählt. Ein Radius des Brennstrahls von etwa 0,6 μm wird verwendet und ergibt Diffusionszeiten für einfache organische Farbstoffmoleküle (z.B. TAMRA) von etwa 260 μs, was als lang gilt im Vergleich zu der Verweilzeit von 40 μs von Zählern, so dass die Annäherung einer konstanten molekularen Helligkeit während des Zählintervalls gültig ist. Die Anregungsintensität wird als Kompromiss zwischen einer hohen Zählrate pro Molekül und einer geringen Population des Triplettzustands eingestellt. Die Population des Triplettzustands wurde auf einem Niveau von etwa 15 Prozent gehalten. Höhere Werte der Triplettpopulation könnten das scheinbare räumliche Helligkeitsprofil erheblich verzerren. Die Population des Triplettzustands wurde mit dem Korrelator (ALV-5000, ALV, Langen, Deutschland) während des Aufbaus einer Reihe von Experimenten gemessen.
Für methodologische Testexperimente wurden zwei unterschiedliche Farbstoffe ausgewählt, Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) und Rhodaminrot X (RRX). Diese Farbstoffe haben unterschiedliche Emissionsspektren sowie verschiedene Extinktionskoeffizienten bei der Laserwellenlänge von 543,5 nm. In diesen Experimenten wurde ein Breitband-40/60-Strahlteiler vor den Detektoren verwendet. Das Spektralfilter des "roten" Kanals hat eine zentrale Wellenlänge von 605 nm und ein FWHM von 50 nm, während die entsprechenden Zahlen für den "gelbgrünen" Kanal 575 nm bzw. 30 nm sind. Die Farbstoffe wurden in destilliertem Wasser verdünnt, so dass die mittlere Zahl von Molekülen im Beobachtungsvolumen im Bereich von 0,5 bis 2,0 lag, was Konzentrationen zwischen 0,23 und 0,92 nM entsprach.
Für jedes Experiment wurden etwa 20 μl der Probenlösung auf ein Deckglas gegeben, das die Probe von dem Wasserimmersionsobjektiv (Zeiss C-Apochromat 40 × 1.2 W Korr) abtrennte. Jedes Histogramm wurde 60 Sekunden lang gesammelt. Jeder der Farbstoffe wurde getrennt gemessen, aber auch Gemische der Farbstoffe mit unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen wurden gemessen. Die Parameter, die das räumliche Helligkeitsprofil beschreiben, wurden aus einem Experiment an TAMRA bestimmt und wurden in einer anschließenden Analyse anderer Proben auf den Werten a₁ = –0,405 und a₂ = 0,0772 festgehalten. Gemische wurden gemessen und analysiert, um zu sehen, wie gut das Verfahren Werte von spezifischen Parametern der beiden Spezies wiedergibt.
Als Beispiel zeigt 13 ein Histogramm von Zahlen von Zählereignissen, das für eine reine TAMRA-Lösung gemessen wurde. Werte, die der z-Achse entsprechen, sind die Zahlen von Fällen für ein gegebenes Paar von Zahlen von Zählereignissen n₁ und n₂. Die Anpassung der Verteilung liefert die mittlere Zahl von Teilchen, cV = 1,139 ± 0,005, die spezifische Helligkeit für den "roten" Kanal ist q₁ = 79,4 ± 0,5 kHz und für den "gelbgrünen" Kanal q₂ = 50,9 ± 0,3 kHz. In Tabelle 6 werden Ergebnisse der Analyse von Testexperimenten vorgestellt. Die Proben wurden nicht durch Konzentrationswerte spezifiziert, die aus Verdünnungsfaktoren des Präparats berechnet wurden, da die Adsorption von Farbstoffmolekülen an Glasoberflächen die realen Konzentrationen erheblich beeinflusst. Aus demselben Grund werden Konzentrationswerte von Probe zu Probe nicht gut reproduziert; eine Verschiebung der Konzentrationswerte von Realisierung zu Realisierung ist zuweilen ebenfalls zu beobachten. Spezifische Hellig- keitswerte werden jedoch gut reproduziert. Die vorgelegten Werte der statistischen Fehler sind theoretische Werte, die der Annahme von unkorrelierten Messungen entsprechen, multipliziert mit drei, was ein empirischer Faktor ist.
Außer statistischen Fehlern sind auch Abweichungen von Probe zu Probe in mäßigem Ausmaß zu beobachten.
Tabelle 6
Es ist bemerkenswert, dass Histogramme, die mit Gemischen gemessen wurden, von denjenigen, die mit reinen Farbstoffen gemessen wurden, qualitativ verschieden sind. 14 zeigt gewichtete Restwerte der Anpassung einer Verteilung, die mit einem Gemisch von TAMRA und RRX gemessen wurde. Die obere Graphik entspricht der adäquaten Analyse, wenn angenommen wurde, dass zwei Spezies vorhanden sind; die Restwerte sind ganz zufällig und gleichmäßig gestreut. Die untere Graphik entspricht der Annahme, dass nur eine einzige Spezies vorhanden ist; es gibt in diesem Fall einen erheblichen Unterschied zwischen der gemessenen und der berechneten Verteilung. n₁ ist die Zahl der vom "roten" Detektor erhaltenen Zählereignisse, und n₂ ist die Zahl der vom "gelbgrünen" Detektor erhaltenen Zählereignisse.
Figuren 15 und 16
Bei herkömmlichen Fluoreszenzpolarisationsstudien werden mittlere Intensitäten von zwei Polarisationskomponenten der Fluoreszenz direkt gemessen. Fluktuationen der Intensitäten sind dort nicht von direktem Interesse, sondern sie werden als Quelle für statistische Fehler angesehen. Änderungen in den Fluoreszenzpolarisationswerten einer Probe, die einen fluoreszenzmarkierten Bindungspartner enthält, spiegeln Änderungen im Molekülvolumen wider und liefern somit direkte Informationen über die Gleichgewichtsbindung. Fluoreszenzpolarisationsmessungen können auch in Echtzeit durchgeführt werden, was die kinetische Analyse von Assoziations- und Dissoziationsreaktionen ermöglicht. Eine der am häufigsten verwendeten Fluoreszenzpolarisationsanwendungen ist der kompetitive Immunoassay, der zum Nachweis von therapeutischen Wirkstoffen und illegalen Drogen verwendet wird. Das Verfahren der Fluoreszenzpolarisation wird seit mehr als einem Jahrzehnt für klinische Immunoassays verwendet. Homogenes FPIA (Fluoreszenzpolarisation in Immunoassays) hat wohlakzeptierte Vorteile gegenüber herkömmlichen heterogenen Immunoassays, wie RIA oder ELISA. Es versagt jedoch, wenn Reaktionen mit mehreren Bindungsschritten untersucht werden sollen, da die Trennung von einzeln polarisierten Spezies unmöglich ist. Daher beweisen Ligandbindungskurven nur die allgemeine Abnahme der Polarisation, was bedeutet, dass die mechanistischen Bindungskonstanten nicht bestimmte werden können. Weitere Einschränkungen gelten für das Probenvolumen sowie Masseneinschränkungen.
Bei einer zweidimensionalen Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung kann der volle Informationsgehalt, der gewöhnlich in der Fluoreszenzanisotropie verborgen liegt, genutzt werden, wodurch die oben genannten Einschränkungen überwunden werden. 2D-FIDA bestimmt direkt zwei spezifische Größen für jede fluoreszierende Spezies in einer Messung: die Fluoreszenzintensität pro Molekül und die Anisotropie eines gegebenen Modells. Auf der Grundlage dieser ergänzenden Informationen ist die genaue Beschreibung aller beteiligten Spezies und sogar die Quantifizierung des Bindungsverhaltens möglich. 2D-FIDA-Anisotropie ist ein ideales Werkzeug für die quantitative Beschreibung von Systemen, die mehrere Bindungsschritte, Aggregations- und Multimerisierungsphänomene zeigen.
Im folgenden wird eine Anwendung von 2D-FIDA in seinem Polarisationsmodus beschrieben, wobei eine Wechselwirkung zwischen Theophyllin-Antigen und Anti-Theophyllin-Antikörper untersucht wurde.
Die Theophyllin-Therapie ist seit mehreren Jahren ein Eckstein der Asthmatherapie, und daher gibt es eine starke Nachfrage nach der Bestimmung und Feinabstimmung des Theophyllinspiegels in Serum. Um die Fähigkeiten der vorliegenden Erfindung aufzuzeigen, wurde die Bindung von Theophyllin-Antigenen an Anti-Theophyllin-Antikörper aus einem polyklonalen Anti-Theophyllin-Serum untersucht. Die Antigene wurden mit 5-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) mit und ohne eingebautem Spacer markiert. In der klassischen FP-Analyse zeigten diese Konjugate nach Wechselwirkung mit dem Antikörper niedrige Anisotropiewerte (0,037 bzw. 0,055). Daher bilden sie eine entscheidende Basis für die Veranschaulichung der Empfindlichkeit der vorliegenden Erfindung.
Für die Bindungsexperimente wurden die Stammlösungen des Antikörpers und der Antigene in einem PBS-Puffer mit 0,05% Tween 20 verdünnt. Nach dem Mischen der Verbindungen wurde das Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtempe- ratur inkubiert. Im Einklang mit den spektralen Eigenschaften der Konjugate wurde das System auf der 543-nm-Linie eines He/Ne-Lasers (Uniphase) angeregt. Als zwei Beispiele sind gemessene gemeinsame Histogramme von Zahlen von Photonenzählereignissen und Ergebnisse von 2D-FIDA, das auf Proben mit unterschiedlichen Antikörperverdünnungswerten, aber einer konstanten Ligandenkonzentration von [L] = 2 nM angewendet wurde, in den 15 und 16 gezeigt. Antikörperkonzentrationen sind in willkürlichen Einheiten angegeben, die sich auf effektive Verdünnungen beziehen. Der Wasserhintergrund war in jedem Nachweiskanal unter 1 kHz.
17-19
Bei der zweifarbigen Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung werden zwei Detektoren spektral so abgestimmt, dass sie die Fluoreszenz von zwei Markern mit unterschiedlicher Farbe messen. Bei dem unten beschriebenen Assaytyp sind die Ligandenmoleküle "grün" markiert. Da jedes Vesikel eine hohe Zahl von Rezeptoren trägt, können Vesikel in Proben mit einem niedrigen Bindungsgrad von Vesikeln in Proben mit einem hohen Bindungsgrad durch eine erheblich höhere spezifische Helligkeit in "grün" unterschieden werden. Vesikel sind zusätzlich "rot" gefärbt. Die spezifische Helligkeit von Vesikeln in "rot" wird durch die Bindung von Ligandenmolekülen nicht geändert, aber die Färbung in "rot" ist ein Mittel zur Erhöhung des Kontrasts zwischen freien Ligandenmolekülen (die in "rot" fast unsichtbar sind) und Vesikeln (die im Falle von äußerst geringer Bindung fast dieselbe Helligkeit in "grün" haben können wie freie Ligandenmoleküle). Beiträge von den beiden fluoreszenten Spezies einer einzigen Probe zu der gemessenen zweidimensionalen Verteilung der Zahlen von Photonenzählereignissen sind bei diesem Assaytyp tatsächlich sehr unterschiedlich, und daher ist die Analyse in hohem Maße zuverlässig.
Um die Vorteile einer zweidimensionalen Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung aufzuzeigen, wurde die Bindung von TAMRA-markiertem Somatostatin-14 (SMS14-5TAMRA) an den Human-Typ-2- Hochaffinitätssomatostatinrezeptor SSTR-2 (P. Schoeffter et al., Eur. J. Pharm., 289, 163-173, 1995, als biologisches System gewählt. Der Rezeptor wurde von CCL39hsst2-Zellen exprimiert. Vesikel wurden aus dieser Zelllinie präpariert und mit dem lipophilen Tracer DiCl₈(5) gefärbt. Die Bindungsreaktion wurde in 10 mM HEPES (pH 7,6), 5 mM MgCl₂, 0,01% (w/v) Fluorotensid FC-135, 1,33% DMSO, in Gegenwart von Protease-Inhibitoren durchgeführt. Eine schematische Zeichnung des Prinzips des Assays ist in 17 gezeigt.
Zur Anregung der Fluoreszenz der beiden spektral unterschiedlichen Marken wurden die 532-nm-Linie eines Neodym:YAG-Lasers, der auf 250 μW abgeschwächt war, und die 632-nm-Linie eines He-Ne-Lasers, der auf 25 μW abgeschwächt war, gleichzeitig verwendet. Um die Fehlausrichtung der beiden Laserstrahlen zu minimieren, traten sie beide durch eine einzige optische Faser, bevor sie durch das Mikroskop fokussiert wurden. Außerdem trat der gesammelte Fluoreszenzstrahl durch eine einzige Lochblende, bevor er für die beiden Detektoren aufgespalten wurde. Ein optisches Bandfilter mit der zentralen Wellenlänge 590 nm, FWHM 60 nm, und ein anderes mit der zentralen Wellenlänge 690 nm, FWHM 40 nm, wurden vor den beiden Detektoren verwendet, um die Fluoreszenz von den beiden Markern getrennt zu messen. Da Vesikel langsam diffundierende Teilchen sind, wurde bei diesem Experiment eine Fläche von 0,05 mm² jeder Probe abgetastet, wobei man in der einen Richtung eine wellenförmige Strahlabtastung mit 25 Hz Frequenz und 100 μm Amplitude und in der anderen Richtung eine Probenabtastung von 500 μm pro 8 s Datensammelzeit verwendete.
In 18 werden zwei typische Beispiele für Histogramme von Zahlen von Zählereignissen, die einem hohen und einem niedrigen Grad der Bindung entsprechen, miteinander verglichen. In 18A wurde der vesikelgebundene Ligand (SMS14-5TAMRA) durch die Zugabe einer großen Überschusses an nichtfluoreszierender Konkurrenzsubstanz (SRIF-14, Sigma; 1 μM Konkurrenzsub- stanz, 3 nM Gesamtligand) kompetitiv verdrängt. Es ist deutlich erkennbar, dass das in Abwesenheit der Konkurrenzsubstanz (18B) erhaltene Histogramm in n₂-Richtung stärker ausgedehnt ist als in Anwesenheit der Konkurrenzsub stanz. Die n₂-Richtung stellt die grüne Fluoreszenz des markierten Liganden dar und ist somit ein Maß für die Ligandenbindung.
2D-FIDA gemäß der vorliegenden Erfindung wurde auf jedes der gemessenen Histogramme angewendet. Unter Verwendung eines zweikomponentigen Anpassungsalgorithmus wurden sowohl die Konzentration (Teilchenzahl im konfokalen Volumen) als auch die Fluoreszenzhelligkeitswerte für den freien Liganden und den an Vesikel gebundenen Liganden erhalten. Die Vesikel sind selbst in Anwesenheit von Konkurrenzsubstanz gut von dem freien Liganden getrennt (geringe Bindung). Die Zugabe von Konkurrenzsubstanz führt zu einer Abnahme der grünen Fluoreszenz der Vesikel und einer Zunahme der Konzentration des freien Liganden. Die Tatsache, dass der Ligand nicht vollständig von den Vesikeln dissoziiert, ist auf unspezifische Bindung zurückzuführen, die von der Menge der in dem Assay verwendeten Vesikel abhängt.
Dann wurde die Konkurrenzsubstanz von 1 μM hinunter auf 10 pM titriert (jeweils 10 Messungen), um eine Dosis-Reaktions-Kurve aufzuzeichnen und den EC₅₀-Wert zu bestimmen. Wie in 19 gezeigt ist, führt die 2D-FIDA-Analyse zu einer typischen S-förmigen Konkurrenzkurve mit sehr kleinen Standardabweichungen. Der berechnete EC₅₀-Wert beträgt 0,87 nM, was in guter Übereinstimmung mit EC₅₀-Werten ist, die unter Verwendung anderer Bewertungsverfahren erhalten wurden (Daten nicht gezeigt). Es ist also nicht nur möglich, zwischen hoher und niedriger Bindung zu unterscheiden, sondern es können auch kleine Änderungen im Bindungsgrad mit der 2D-FIDA-Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung aufgelöst werden. Dies ist insbesondere wichtig, wenn man beim Hochdurchsatz-Screening Assayinhibitoren ("Treffer") identifizieren möchte. Insgesamt gesehen ist die 2D-FIDA-Analyse ein gut geeignetes und in hohem Maße zuverlässiges Verfahren für Bindungsassays auf Vesikelbasis und wurde bereits erfolgreich beim Hochdurchsatz-Screening angewendet.
20
Es wird jetzt auf 20 Bezug genommen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden Zahlen von Photonenzählereignissen {n_i}, die in Schritt b) der Bestimmung eines Histogramms P ^(n) unterzogen werden, aus Zahlen von Photonenzählereignissen in primären Zeitintervallen {N_j} abgeleitet, indem man Zahlen von Photonenzählereignissen aus primären Zeitintervallen gemäß einer vorbestimmten Regel aufsummiert. Man könnte zum Beispiel daran interessiert sein, Zahlen der Photonenzählereignisse {n_i}, die einer Bestimmung eines Histogramms P ^(n) unterzogen werden, zu wählen, welche gemäß der Regel n_i
aus den Zahlen der Photonenzählereignisse in primären Zeitintervallen {N_j} berechnet werden, wobei M eine ganze Zahl ist, die ausdrückt, um welchen Faktor das Zeitintervall, in dem {n_i} bestimmt wird, länger ist als das primäre Zeitintervall. Die Linie N zeigt die primären Zeitintervallfenster. Die Linie n_i zeigt die primären Zeitfenster an, die gewählt wurden, um n_i gemäß der Regel zu berechnen. Diese Regel wird angewendet, um eine Reihe von Histogrammen mit unterschiedlicher Länge des Zählzeitintervalls für FIMDA zu erzeugen.
21
21 zeigt eine weitere Ausführungsform, bei der Zahlen von Photonenzählereignissen {n_i} gemäß einer Regel aus vorbestimmten primären Zeitintervallen abgeleitet werden, wobei primäre Zeitintervalle durch eine Zeitverzögerung voneinander getrennt sind. Insbesondere kann die folgende Regel angewendet werden:
wobei M und L positive ganze Zahlen sind, {n_i} Zahlen von Photonenzählereignissen sind, die einer Bestimmung eines Histogramms P ^(n) unterzogen werden, und {N_j} die Zahlen der Photonenzählereignisse in primären Zeitintervallen sind. Diese Regel wird angewendet, um verschiedene Histogramme für FACID zu bestimmen.
22-27
Es wird jetzt auf die 22 bis 27 Bezug genommen. Die Untersuchung der Funktion und Aktivität von Zelloberflächenrezeptoren ist ein zentraler Punkt in allen Disziplinen der modernen Biologie und Pharmakologie. Membranrezeptoren spielen eine Schlüsselrolle bei der Kommunikation innerhalb eines vielzelligen Organismus, da sie extrazelluläre Signale durch die Plasmamembran in die Zelle übermitteln. Zwei wichtige Klassen von Membranrezeptoren sind Wachstumsfaktorrezeptoren und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Wachstumsfaktorrezeptoren gehören zur Familie der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen, die eine wichtige Rolle bei Zelldifferenzierung und -wachstum spielen. Rezeptoren, die zu dieser Klasse gehören, umfassen die Epidermiswachstumsfaktor-Rezeptor-Familie, die Neurotrophin-Rezeptor-Familie und die Insulinrezeptoren (Mc Innes C. & Sykes B.D. Biopolymers, 43, 339-366, 1997; Riese D.J. & Stern D.F., Bioessays 20, 41-48, 1998; Persson N. & Ibanez C.F., Curr. Opin. Neurol. Neurosurg. 6, 11-18, 1993). G-Protein-gekoppaIelte Rezeptoren sind eine Superfamilie von integralen Membranproteinen, die sieben α-helikale Transmembrandomänen enthalten, welche die Transmembran-Signalübermittlung einer Vielzahl von Vorgängen vermitteln, indem sie extrazelluläre Faktoren, wie Neurotransmitter und Hormone, binden (Ji et al., J. Biol. Chem., 273, 17299-17302, 1998; Gether et al., J. Biol. Chem. 273, 17979-17982, 1998; Wess J., FASEB J. 11, 346-354, 1997).
In den meisten Fällen werden Rezeptoren biochemisch und pharmakologisch untersucht, wobei man Radioligand-Bindungsassays verwendet. In diesen Experimenten wird die Bindung von radioaktiv markierten Liganden an Membranfraktionen oder an ganze Zellen gemessen, was häufig die Trennung von gebundenem und freiem Liganden beinhaltet. Unter Verwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Charakterisierung von fluoreszenzmarkierten Molekülen oder Teilchen in Bezug auf ihre molekulare Helligkeit und Konzentration auf der Ebene des einzelnen Moleküls möglich. Im folgenden ist beschrieben, wie dieses Verfahren angewendet werden kann, um Ligand-Akzeptor-Wechselwirkungen zu untersuchen. Gebundener Ligand kann aufgrund der Anhäufung von fluoreszierenden Ligandmolekülen auf rezeptortragenden Vesi keln von ungebundenem Liganden unterschieden werden, was zu einer erhöhten Teilchenhelligkeit im Vergleich zu einzelnen fluoreszierenden Ligandmolekülen führt. Mit der Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (FIDA) gemäß der vorliegenden Erfindung können diese Unterschiede in der molekularen Helligkeit quantifiziert werden, und die absoluten Konzentrationen an freiem und ungebundenem Ligand werden in einer einzigen Messung bestimmt, ohne dass getrennt werden muss. Da sich FIDA einen hochgradig fokussierten Laserstrahl zu Nutze macht, hat das Nachweisvolumen ungefähr die Größe von 1 Femtoliter. Die Probenvolumina können auf 1 μl reduziert werden, was zur Zeit die praktische Grenze der Handhabung von Flüssigkeiten ist; damit werden erhebliche Einsparungen an wertvollem biologischem material und chemischen Verbindungen geboten. Die Ergebnisse zeigen, dass FIDA ein ideales Verfahren für Rezeptor-Ligand-Studien ist, das erhebliche Vorteile für die Forschung und das pharmazeutische Hochdurchsatz-Screening bietet: es ist breit anwendbar, umgeht die Verwendung gefährlicher und teurer radioaktiver Sonden, überwindet die Notwendigkeit von Waschschritten (d.h. die vorliegende Erfindung stellt ein homogenes Assayverfahren bereit) und ermöglicht eine erhebliche Reduktion des Reagentienverbrauchs.
Beide oben beschriebenen Klassen von Rezeptoren spielen eine wichtige Rolle bei einer großen Zahl von Krankheiten wie Krebs, neurodegenerativen Krankheiten, cardiovaskulären Störungen und AIDS und sind daher wichtige Angriffspunkte für Wirkstoffe. Der EGF-Rezeptor (EGFR/ErbB1), eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase von 170 kDa, und der β2-adrenergische Rezeptor, ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, dienten als unsere Modellsysteme.
Die folgende Versuchsvorschrift wurde verwendet:
Materialien. Tetramethylrhodamin-markierter Epidermiswachstumsfaktor (TMR-EGF), unmarkierter Epidermiswachstumsfaktor (EGF) und Bodipy FL-CGP 12177 (Bodipy FL: 4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure; CGP 12177: 4-[3-[(1,1-Dimethylethyl)amino]-2-hydroxypropoxy]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-on-Hydrochlorid) wurden von Molecular Probes (Leiden, Niederlande) bezogen. Humane epidermoide Karzinom-(A431)-Zellen und humane Colonkarzinomtumor-(HCT)-Zellen wurden von der American Type Tissue Culture Collection erhalten. Betacellulin und heparinbindendes EGF (HB-EGF) wurden von R & D Systems und CGP 12177A von RBI (Natick, USA) bezogen.
Verfahren. Zelllinien und Membranpräparate. Wildtyp-Human-β2-adrenergischer-Rezeptor-cDNA wurde in das Plasmid pcDNA3 einkloniert. Das Plasmid wurde in HEK293-Zellen transfiziert, und stabile Klone wurden gusselektiert, wie es beschrieben ist (Gabilondo A.M., Hegler J., Krasel C., Boivin-Jahns V., Hein L., Lohse M.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12285-12290, 1997). Für Membranpräparate wurden ungefähr 2 × 10⁸ Zellen in 2 ml eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM MgSO₄, 0,5 mM EDTA) resuspendiert, der ein Protease-Inhibitor-Cocktail (Complete^TM Mini EDTA-free, Roche Molecular Biochemicals) enthielt. Zellen wurden durch Dounce-Homogenisierung auf Eis lysiert, und unaufgeschlossene Zellen und Zellkerne wurden durch 10 min Zentrifugation mit 900 × g entfernt. Die Überstände wurden vereinigt und 20 min lang mit 100 000 × g zentrifugiert (4 °C). Membransedimente wurden in 0,5 ml Bindungsassaypuffer resuspendiert, und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Bradford-Proteinassays (Biorad) bestimmt. Membranen wurden in Aliquoten in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C aufbewahrt.
Bindungsstudien. Typische Experimente enthielten 50 bis 500 μg/ml Membranprotein, verschiedene Konzentrationen an fluoreszierendem Liganden und Konkurrenzsubstanz in einem Endvolumen von 40 μl (wegen Einzelheiten siehe Figurenlegenden). Bindungsstudien mit dem EGF-Rezeptor (EGFR) wurden in 20 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 0,1% BSA und 0,1% CHAPS durchgeführt. Der Bindungsassaypuffer für den β2-adrenergischen Rezeptor enthielt 75 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 2 mM EDTA, 0,05% BSA und 0,1% CHAPS. Die Messungen wurden in 8-Napf-Glaskammern (Nunc) durchgeführt. Für Experimente mit Probenvolumina von 1 μl wurden Marken-Flüssigkeitsausgabeeinheiten und Probenträger hoher Dichte (Nanocarrier) mit einer Gesamtkapazität von 1,5 μl pro Napf verwendet (Evotec Biosystems AG).
Datenanalyse. Ein konfokales Mikroskop (Confocor, Evotec Biosystems AG und Carl Zeiss Jena, Deutschland) wurde mit einem optischen Aufbau verwendet, der bei P. Kask, K. Palo, D. Ullmann & K. Gall beschrieben ist (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13756-13761, 1999; auf den Inhalt wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen). Die Zahl der Photonenzählereignisse wurde mit einer Verweilzeit von 40 μs und einer Datensammelzeit von 4 bis 8 s pro Napf gemessen. Messungen mit TMR-EGF wurden bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 543/580 nm unter Verwendung eines Helium/Neon-Lasers, der auf ungefähr 300 μW abgeschwächt war, durchgeführt. Messungen mit Bodipy FL-CGP 12177 wurden bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 488/520 nm unter Verwendung eines Argon⁺-Lasers, der auf ungefähr 2 mW abgeschwächt war, durchgeführt. Wie FCS beruht das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auf der statistischen Diffusion von fluoreszierenden Teilchen in das konfokale Volumen und aus diesem heraus (Kask P., Palo K., Ullmann D. & Gall K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13756-13761, 1999; Rigler R., J. Biotechnol. 41, 177-186, 1995). Da die Diffusionszeit von Membranteilchen im Vergleich zu einzelnen Molekülen, wie Proteinen, sehr hoch ist (mittlere Diffusionszeit r = 10-100 ms gegenüber ungefähr 200 μs bis 1 ms für einzelne Moleküle), wurde ein zweidimensionaler Scanning-Ansatz benutzt, um ausreichend große zahlen von fluoreszierenden membranartigen Vesikeln nachweisen zu können. Dies wird unter Verwendung eines Laserstrahloszillators und eines mobilen Probentischs erreicht.
Unter der Annahme der Anwesenheit von zwei verschiedenen fluoreszierenden Spezies innerhalb der Probe, nämlich fluoreszierender Ligand und Vesikel mit fluoreszierendem Ligand, der auf ihrer Oberfläche angehäuft ist, wurde das Histogramm der Zahlen der Photonenzählereignisse mit der mehrkomponentigen Anpassung gemäß P. Kask, K. Palo, D. Ullmann & K. Gall (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13756-13761, 1999; auf den Inhalt wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen) angepasst, um die molekularen Helligkeiten und absoluten Konzentrationen dieser beiden Komponenten zu bestimmen. Die Konzentrationen von gebundenem und freiem Ligand wurden aus diesen Daten abgeleitet. Die Menge des an Vesikel gebundenen Liganden wird entweder in Konzentrationen (nM gebundener Ligand) oder als Bindungsbruchteil (gebundener Ligand, dividiert durch Gesamtligand) angegeben. Scheinbare Affinitäten (K_I) wurden aus der Konzentration berechnet, die eine halbmaximale Verschiebung ergibt (IC₅₀, erhalten durch nichtlineare Kleinste-Quadrate-Kurvenanpassung an ein Bindungsmodell mit einer einzigen Bindungsstelle), wobei die Beziehung K_I = IC₅₀/(1 + (Ligandenkonzentration/K_D)) gemäß Y. Cheng & W.H. Prusoff (Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973) verwendet wurde. Die experimentellen Daten wurden unter Verwendung von Prism 3.0 (Graph Pad Prism, San Diego, USA) analysiert.
Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (FIDA) ermöglicht die Untersuchung von molekularen Wechselwirkungen von fluoreszierenden Molekülen, wenn bei der Bindung eine Änderung der Teilchenhelligkeit erfolgt. Quantitative Daten, die molekulare Wechselwirkungen beschreiben, werden erhalten, da die molekulare Helligkeit jeder fluoreszierenden Spezies in der Probe und ihre jeweiligen absoluten Konzentrationen bestimmt werden. 22 zeigt ein schematisches Diagramm der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Moleküls an rezeptortragende Vesikel, wie es nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beobachtet wurde. Das konfokale Volumen ist durch das zentrale schwarze Quadrat dargestellt. A: In Abwesenheit von Membranen enthält das konfokale Volumen ausschließlich freie fluoreszierende Ligandenmoleküle. Die molekulare Helligkeit des fluoreszierenden Liganden ist eine intrinsische Eigenschaft des Fluorophors und des Moleküls, an das es gebunden ist. B: Eine Helligkeitsverteilung, die für die in A gezeigte Probe erhalten wurde, mit einer typischen molekularen Helligkeit für freien Liganden von 7 kHz. C: Nach der Zugabe von Vesikeln erfolgt die Ligandenbindung, und das konfokale Volumen ist sowohl mit vesikelgebundenem als auch mit freiem Liganden bevölkert. D: Helligkeitsverteilung der in C gezeigten Probe. Die molekulare Helligkeit des ungebundenen Liganden bleibt 7 kHz. Die molekulare Helligkeit von Vesikeln betrug in diesem Fall 98 kHz (14 mal die Helligkeit des freien Liganden, was 14 gebundenen Ligandenmolekülen pro Vesikel entspricht) und hängt von dem Niveau der Rezeptorexpression ab. Typischerweise sind 10 bis 500 Ligandenmoleküle pro Vesikel zu finden. Man beachte: Die Größen sind nicht maßstabsgetreu. Obwohl sich also die Gesamtfluoreszenz bei der Bindung nicht ändert, werden sowohl die molare Konzentration des gebundenen als auch die molare Konzentration des ungebundenen Liganden quantitativ aus einer einzigen Messung bestimmt, ohne dass eine Trennung notwendig ist.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wurde verwendet, um die Wechselwirkung von TMR-markiertem EGF mit seinem Rezeptor, dem EGF-Rezeptor (EGFR/ErbB1), zu charakterisieren. Als Quelle wurden A431-Zellen verwendet, von denen bekannt ist, dass sie EGFR überexprimieren (McCulloch et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 30, 1265-1278, 1998). 23 zeigt die Ligandbindungseigenschaften von TMR-EGF an Membranen, die aus A431-Zellen präpariert wurden. Ligandenkonzentrationen von 0,25 bis 18 mM wurden mit einer rohen Membranfraktion in einer Endkonzentration von 50 μg/ml in einem Gesamtvolumen von 40 μl inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 20 min bei Raumtemperatur wurden Messungen durchgeführt, und die Konzentrationen des freien und des gebundenen Liganden wurden bestimmt. Die Bindung von TMR-markiertem EGF an die Membranen ist sättigungsfähig und kann durch einen Überschuss an unmarkiertem EGF kompetitiv verdrängt werden. Unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 1 μM EGF bestimmt. Die gezeigten Ergebnisse stammen von typischen Experimenten, und die Standardabweichung (SD) ist als Fehlerbalken gezeigt. Die bestimmte Dissoziationskonstante (Kp) von 3,1 ± 0,2 nM steht mit früheren Berichten im Einklang, bei denen fluoreszenzmarkiertes EGF als Konkurrenzsubstanz in Radioliganden-Bindungsassays verwendet wurde (Carraway et al., J. Biol. Chem. 266, 8899-8906, 1991). Ein Expressionsniveau (B_max) von 60 pmol/mg wurde beobachtet, das ungefähr 6 × 10⁶ Bindungsstellen pro Zelle entspricht, was darauf hinweist, dass das Niveau der Expression von EGFR in A431 erheblich hochreguliert ist, was durch frühere Berichte (Mc Culloch et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 30, 1265-1278, 1998) bestätigt wird.
Um aufzuzeigen, dass sich das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auch auf biologische Systeme mit viel geringeren, physiologischeren Expressi onsniveaus anwenden lässt, wurden humane Colonkarzinomtumor-(HCT)-Zellen verwendet. 24 zeigt die Bindung von TMR-EGF an Membranen, die aus HCT-Zellen präpariert wurden. Zunehmende Mengen von rohen Membranen, die aus HCT-Zellen präpariert wurden, wurden in Anwesenheit und Abwesenheit von unmarkiertem EGF mit 2 nM TMR-EGF inkubiert. Die gesamte und die unspezifische Bindung wurden nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt. Gebundener Ligand wird als Bindungsbruchteil (gebundener Ligand, dividiert durch Gesamtligand) ausgedrückt. Aus HCT-Zellen präparierte Membranen binden TMR-EGF, wobei die spezifische Bindung 70 bis 80% der gesamten Bindung betrug. Die Affinität und die Expressionsniveaus wurden an einer Sättigungskurve bestimmt, wie es in 23 für A431-Zellen gezeigt ist (Daten nicht gezeigt). Für das Kp wurden 3 nM gefunden, was sehr ähnlich wie die Affinität des EGF-Rezeptors bei A431-Zellen ist (siehe 23). Für das B_max wurden 400 fmol Protein pro mg Membran gefunden, was ungefähr 10 000 bis 20 000 Bindungsstellen/Zelle entspricht und somit mehr als 100mal geringer ist als bei A431-Zellen. Dieses Experiment zeigt, dass FIDA nicht nur mit rezeptorüberexprimierenden Zelllinien, sondern auch mit Rezeptordichten, die solchen in ihrer natürlichen Umgebung äquivalent sind, verwendet werden kann.
Da der EGF-Rezeptor Bestandteil einer Familie von verwandten Rezeptor-Tyrosin-Kinasen ist, die unterschiedliche Wachstumsfaktoren binden (EGFR/ErbB-1, ErbB-2, Erb-B3 und ErbB-4; Riese et al., Bioessays 20, 41-48, 1998), wurde die Wechselwirkung von TMR-EGF mit HCT-Membranen näher charakterisiert. Die Zahl der Säuger-Polypeptid-Wachstumsfaktoren, die erhebliche Sequenzidentität mit EGF zeigen, hat in den letzten Jahren drastisch zugenommen; dazu gehören Betacellulin und heparinbindendes EGF (HB-EGF). 25 zeigt das pharmakologische Profil des EGF-Rezeptors. Die Affinität von unmarkiertem EGF, Betacellulin und heparinbindendem Epidermiswachstumsfaktor (HB-EGF) wurde durch kompetitive Assays bestimmt, bei denen HCT-Membranen mit TMR-EGF und den angegebenen Konzentrationen der Konkurrenzsubstanz inkubiert werden. Die Bindung wurde nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt und auf die Bindung in Abwesenheit der Konkurrenzsubstanz normalisiert. Die erhaltenen Affinitäten waren 0,35 ± 0,12 nM für EGF, 0,23 ± 0,02 nM für Betacellulin und 1,4 ± 0,3 nM für HB-EGF.
Als weiteres System wurde der β2-adrenergische Rezeptor verwendet, da er ein wohlbekanntes Modellsystem für die große Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ist (Kobilka, Annu. Rev. Neurosci. 1587 – 114, 1992). Fluoreszenzmarkiertes CGP 12177, ein β2-adrenergischer-Rezeptor-Antagonist, wurde als Ligand gewählt (Heithier et al., Biochemistry 33, 9126 bis 9134, 1994). 26 zeigt die Ligandbindungseigenschaften von Bodipy FL-CGP 12177. Steigende Konzentrationen von Bodipy FL-CGP 12177 wurden mit einer rohen Membranfraktion inkubiert, die von HEK-293-Zellen abgeleitet ist, die den humanen β2-adrenergischen Rezeptor exprimieren. Die endgültige Membrankonzentration betrug 130 μg/ml in einem Gesamtvolumen von 40 μl. Unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 1 μM Propanolol bestimmt und von der Gesamtbindung subtrahiert. Die gezeigten Ergebnisse stammen von typischen Experimenten, und die Standardabweichungen (SD) sind als Fehlerbalken gezeigt. Bodipy FL-CGP 12177 band an eine anscheinend homogene Population von Bindungsstellen. Die Bindung des Liganden wurde statistisch am besten angepasst, indem man ein Modell mit einer einzigen Bindungsstelle mit einer mittleren Affinität von 0,7 nM verwendete, was ähnlich wie die Ergebnisse ist, die man erhält, wenn man Standard-Filterbindungsassays (Heithier et al., Biochemistry 33, 9126-9134, 1994) und ein B_max von 4 pmol/mg verwendet. Konkurrenzexperimente mit unmarkiertem CGP 12177 ergaben ein K_I von 0,8 nM, was anzeigt, dass die Bindung des Fluoreszenzmarkers die Affinität zu dem Rezeptor nicht wesentlich beeinflusst.
27 zeigt die Hemmung der Bindung von Bodipy FL-CGP 12177 in Assayvolumina von 40 μl bzw. 1 μl. Unmarkierter Ligand (CGP 12177A) wurde bei den gezeigten Konzentrationen als Konkurrenzsubstanz verwendet. Die Bindung wurde auf 100% bei maximaler Bindung normalisiert. Der Bindungsassay wurde in Probenvolumina von 40 μl und 1 μl durchgeführt. Für Experimente, die Probenvolumina von 1 μl beinhalten, wurden Marken-Flüssigkeitsausgabeeinheiten und Probenträger verwendet (Evotec Biosystems AG). Die für CGP12177 erhaltenen Affinitäten betrugen 0,7 ± 0,1 nM in 40 μl und 0,9 ± 0,1 in 1 μl Assayvolumen. Dieses Experiment unterstreicht die einzigartige Empfindlichkeit von FIDA und bietet eine große Gelegenheit für eine erhebliche Reduktion von Probenvolumina und somit des erforderlichen biologischen Materials für ein Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening.
Die Untersuchung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen ist ein wichtiges Werkzeug für die biologische und pharmakologische Charakterisierung der Membranrezeptorfunktion. Insbesondere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind für pharmazeutische Wirkstoffsuchprogramme von hohem Interesse, da schätzungsweise ungefähr 30 bis 50% aller Wirkstoffe, die heute auf dem Markt sind, auf GPCR wirken (Gudermann et al., J. Mol. Med. 73, 51-63, 1995). Herkömmlicherweise wird der größte Teil der Ligand-Rezeptor-Studien unter Verwendung von radioaktiv markierten Liganden durchgeführt, wobei gebundener von ungebundenem Liganden entweder durch Filtration oder durch Zentrifugation getrennt wird. In den letzten Jahren haben Szintillations-Proximitäts-Assays weit verbreitete Verwendung für Rezeptor-Ligand-Bindungsstudien gefunden. Hier werden Bindungsereignisse durch die Nähe des Radioliganden zu Membranen nachgewiesen, die auf einem Szintillationsmittel enthaltenden Bead immobilisiert sind, so dass nicht abgetrennt zu werden braucht (Hart, Mol. Immunol. 16, 265-267, 1979). Die Nachteile dieser Verfahren sind jedoch die potentiell gefährliche Exposition gegenüber radioaktiven Verbindungen, die begrenzte Lagerhalbwertszeit markierter Liganden und spezielle Anforderungen an die Handhabung und Entsorgung von Reagentien. Daher wurden in den letzten Jahren mehrere Nachweisverfahren auf Fluoreszenzbasis auf Rezeptor-Ligand-Studien angewendet, welche auf dem Nachweis der Gesamtfluoreszenz (Heithier et al., Biochemistry 33, 9126-9134, 1994; Inglese et al., Biochemistry 37, 2372-2377, 1998), der Fluoreszenzlöschung/spektralen Verschiebung (Tairi et al., Biochemistry 37, 15850-15864, 1998), der Fluoreszenzpolarisation (Tairi et al., Biochemistry 37, 15850-15864, 1998) oder der Verwendung von Laser-Scanning-Bildgebung (Zuck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1122-1127, 1999) beruhen.
Auf der Grundlage des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse verwendet werden, um die Wechselwir kung von Liganden mit ihren zugehörigen Rezeptoren quantitativ zu charakterisieren. Da FIDA es ermöglicht, Wechselwirkungen mit Einzelmolekülempfindlichkeit zu untersuchen, bietet es erhebliche Vorteile gegenüber den oben beschriebenen Verfahren. Unter Verwendung von EGF und β2-adrenergischen Rezeptoren als Modellsysteme wurde in den obigen Beispielen gezeigt, dass Affinitäten und Rezeptorexpressionsniveaus in einfacher Weise quantifiziert werden können. Die Ergebnisse zeigen, dass die unter Verwendung von FIDA erhaltenen pharmakologischen Profile denjenigen entsprechen, die man durch klassische Radioligand-Bindungsassays erhält. Es wurde auch gezeigt, dass FIDA verwendet werden kann, um Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen unter Verwendung von Zellen, die Rezeptor auf niedrigem Niveau exprimieren, zu untersuchen. Dies ist für GPCR von besonderer Wichtigkeit, da sie in primären Geweben typischerweise in geringer Dichte vorkommen und eine Überexpression funktioneller Rezeptoren häufig schwierig zu erreichen ist. Da FIDA es ermöglicht, die Erhöhung der Teilchenhelligkeit bei der Bindung von mehreren fluoreszierenden Molekülen an Vesikel zu quantifizieren, brauchen keine Änderungen der Fluoreszenzparameter, wie Fluoreszenzlöschung oder spektrale Verschiebung vorzukommen, so dass dieser Ansatz breit anwendbar ist. Mit FIDA werden molare Konzentrationen sowohl an freiem als auch an gebundenem Liganden in einer einzigen Messung bestimmt, so dass man eine interne Kontrolle dafür erhält, wie viel Gesamtligand in jeder Probe vorhanden ist. Ein erheblicher Vorteil von FIDA unter Verwendung eines konfokalen optischen Aufbaus ist das kleine Nachweisvolumen, das ungefähr die Größe einer Bakterienzelle hat. Die Miniaturisierung des Assayvolumina ist eine Schlüsselstrategie des modernen pharmazeutischen Wirkstoffscreening, da wachsende Zahlen von chemischen Verbindungen gegen eine wachsende Zahl von biologischen Targets durchmustert werden müssen und der Verbrauch an biologischen Reagentien und Chemikalien oder natürlichen Verbindungen daher zu einem größeren Problem wird. FIDA und verwandte, vorzugsweise konfokale Verfahren auf der Grundlage der vorliegenden Erfindung sind daher für diese Zwecke ideal geeignet, da das Probenvolumen auf 1 μl, was die derzeitige Grenze der Handhabung von Flüssigkeiten ist, reduziert werden kann, ohne das Signal-Rausch-Verhältnis zu beeinträchtigen, so dass eine einzigartige Empfindlichkeit geboten wird.
FIDA wurde in unserem Labor erfolgreich angewendet, um mehrere verschiedene Typen von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu untersuchen. Dazu gehören Chemokin-Rezeptoren, Dopamin-Rezeptoren und mehrere Peptidrezeptoren. Diese Assaysysteme beinhalten die Verwendung von kleinen markierten Molekülen (Agonisten oder Antagonisten, wie es in dieser Studie beschrieben ist), Peptiden und Proteinen (Daten nicht gezeigt). Außerdem kann die Technologie erfolgreich angewendet werden, um in einem 1-μl-Format die Bindung von Molekülen an lebende Zellen zu messen. Dies eröffnet die aufregende Gelegenheit, primäre Gewebe direkt beim Hochdurchsatz-Screening zu verwenden. Folglich ist FIDA ein ideales Verfahren für Ligand-Rezeptor-Studien: Es bietet erhebliche Vorteile für die Forschung, das Hochdurchsatz-Screening und für das pharmakologische Profiling, da es die Verwendung von radioaktiven Isotopen und von Trennschritten umgeht, breit anwendbar ist und eine erhebliche Reduktion des Reagentienverbrauchs ermöglicht.
Figuren 28-30
Ein weiteres Beispiel beruhte auf der globalen Analyse einer Menge von Histogrammen von Zahlen von Photonenzählereignissen, die mit mehreren Breiten der Zählzeitintervalle gleichzeitig aufgenommen wurden. Die Zählzeitintervalle können nach dem in 20 beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Diese FIMDA (fluorescence intensity multiple distribution analysis) unterscheidet zwischen fluoreszierenden Spezies auf der Basis von sowohl der spezifischen molekularen Helligkeit als auch der Translationsdiffusionszeit. Die kombinierte Information, die aus einer einzigen Messung gezogen wird, erweitert die Ausgabe effektiv um eine Dimension und durchbricht so die individuellen Grenzen von FCS und FIDA. Das Verfahren kann verbreitet angewendet werden, um molekulare Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Liganden oder Antikörpern und Antigenen, die beide von großer Relevanz in den Biowissenschaften sind, zu messen.
Im folgenden wird eine Modifikation der Theorie von FIDA vorgestellt, die für unsere experimentellen Zwecke eine geeignete Annäherung ist. Bei FIDA ist eine zweckmäßige Darstellung einer Verteilung einer Zahl von Photonenzählereignissen P(n) ihre erzeugende Funktion, die definiert ist als:
Die Theorie von FIDA nimmt an, dass (i) Moleküle während des Zählzeitintervalls unbeweglich sind und dass (ii) der von einem Molekül ausgehende Lichtfluss als Produkt einer räumlichen Helligkeitsfunktion B(r) (dies ist eine Funktion räumlicher Koordinaten des Moleküls, die das Gerät charakterisiert) und einer spezifischen Helligkeit q (die eine bestimmte Molekülspezies charakterisiert) ausgedrückt werden kann. Unter diesen beiden Annahmen ist die Verteilung der Zahl der Zählereignisse für Photonen, die von Molekülen aus einem Volumenelement dV emittiert werden, eine zweidimensionale Poisson-Verteilung, und die entsprechende erzeugende Funktion lautet RP(n)(ξ) = exp[cdV(e(ξ–1)qB(r)Γ–1)], (42) wobei ξ das komplexe Argument der erzeugenden Funktion ist, c die Konzentration der Moleküle ist und T die Breite des Zählzeitintervalls ist. Diese Darstellung ist zweckmäßig, da Beiträge von unabhängigen Quellen, wie verschiedenen Volumenelementen oder Spezies, durch Multiplikation der beitragenden erzeugenden Funktionen miteinander kombiniert werden können. Die erzeugende Funktion von P(n) für eine einzelne Spezies ist RP(n)(ξ) = exp[c(e(ξ–1)qB(r)Γ–1)dV], (43) während die Berücksichtigung mehrerer Spezies einfach folgendes ergibt:
Das Integral auf der rechten Seite von Gleichung 44 wird numerisch berechnet, aber anstelle der dreidimensionalen Integration über räumliche Koordinaten wird eine eindimensionale Integrationskoordinate x = |n[B₀/B(r)] eingeführt. Die Beziehung zwischen der Helligkeit B und der Koordinate x ist daher B(x) = B₀e^-x. Bei FIDA hat es sich als geeignet erwiesen, die Funktion dV/dx, die das Helligkeitsprofil in eindimensionaler Darstellung beschreibt, durch die folgende Formel auszudrücken:
Hier sind a₁ und a₂ empirische Einstellungsparameter, die für eine ausreichende Flexibilität sorgen, um die gemessenen Histogramme mit hoher Präzision anzupassen. Die Wahl der Koeffizienten A₀ und B₀ ist nichts anderes als die Wahl der Einheiten für V und B. Gewöhnlich werden sie aus den folgenden Bedingungen bestimmt: ∫BdV = 1, (46) ∫B2dV = 1. (47)
So weit wurde ein einfache Version der Theorie von FIDA beschrieben. Für die Zwecke von FIMDA muss die Annahme, dass Moleküle während des Zählintervalls unbeweglich sind, aufgegeben werden. Überraschenderweise werden Gleichung 42 sowie die folgenden Gleichungen nicht aufgegeben, aber stattdessen wird die Bedeutung einiger Variablen geändert. x ist immer noch eine Variable, die sich auf das räumliche Helligkeitsprofil bezieht, aber jetzt charakterisiert sie den Weg des Moleküls und nicht seine Position. B ist die räumliche Helligkeit, die über den Weg gemittelt ist und nicht auf einer festen Position des Moleküls bestimmt wurde. V ist nicht das Volumen im Raum, aber dV/dx drückt immer noch die Wahrscheinlichkeit aus, dass ein Molekül einen gegebenen Wert von x hat. Würde man die ursprüngliche Bedeutung von c und q beibehalten, müsste eine Theorie entwickelt werden, die voraussagt, wie A₀, a₁ und a₂ vom Zählzeitintervall T abhängen. Es wurde jedoch ein anderer Ansatz gewählt. Die Normalisierungsbedingungen wurden beibehalten (Gleichungen 46 und 47). Es ist sogar möglich, eine einzige Auswahl der Werte A₀, a₁ und a₂ für eine Menge von verschiedenen Zeitfenstern anzuwenden. Diese Wahl hat zur Folge, dass c in den Gleichungen 42 bis 44 eine scheinbare Konzentration (C_app) ist und q eine scheinbare Helligkeit (q_app) ist, die beide von der Breite des Zählzeitintervalls T abhängen.
Im folgenden wird eine Theorie vorgestellt, die voraussagt, wie C_app und q_app von T abhängen. Der Fall einer einzigen Spezies wird untersucht, und die erste und die zweite faktorielle Kumulante der Verteilung, die Gleichung 43 entspricht, werden berechnet. Die faktoriellen Kumulanten sind definiert als
was folgendes ergibt: K1 = <n> = cappqappT, (49) K2 = <n(n–1)> – <n>2 = cappqapp 2T2, (50) wobei die durch Gleichung 46 und 47 definierten Normalisierungsbedingungen verwendet wurden. (Man beachte, dass die Gleichungen 49 und 50 völlig mit den Formeln von Qian und Elson (Biophys. J. 57: 375-380, 1990) im Einklang stehen, die unter den Annahmen i und ii abgeleitet wurden.) Aus Gleichung 49 kann man schließen, dass capp(T)qapp(T) = <I>, (51) wobei <I> ≡ <n>_T/T die mittlere Zählrate ist, die nicht von der Wahl von T abhängt. Wir fahren fort, indem wir die folgende Beziehung zwischen der zweiten Kumulan- ten der Verteilung der Zahl der Zählereignisse P(n;T) und der Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenzintensität G(t) = <I(0)I(t)> – <I>² einsetzen:
Unter Einführung der Schreibweise
wird aus den Gleichungen 52 und 50 folgendes abgeleitet: capp(T)qapp 2(T) = cq2Γ(T). (54)
Aus den Gleichungen 51 und 54 erhält man qapp(T) = qΓ(T), (55)
Als abschließender Schritt wurden die Ausdrücke für G(t) aus der FCS in die Gleichung 43 eingesetzt. Wenn eine Gauss-Helligkeitsfunktion angewendet wird und der Tripletteinfang ignoriert wird (Aragón und Pecora, J. Chem. Phys. 64: 1791-1803, 1976), so gilt:
wobei σ_r den radialen und σ_Z den longitudinalen Abstand bezeichnet, wobei das Gauss-Profil reduzierte e^l/2-Zeiten hat. Die Integrale in Gleichung 53 ergeben
wobei t = DT/σ_r ² und β = σ_r ²/σ_z ². Aus Gründen, die unten erklärt werden, ist es nützlich, die Terme erster Ordnung in Gleichung 58 zu berechnen:
Aufgrund von theoretischen Betrachtungen sowie von Messungen ist jedoch bekannt, dass einfache physikalische Modelle, wie ein Gauss- oder auch Gauss-Lorentz-Profil, das tatsächliche Helligkeitsprofil nicht genau wiedergeben (Kask et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13746-13761, 1999). Daher wurde Gleichung 59 modifiziert, und ein Anpassungsparameter a wurde eingeführt, der die Terme erster Ordnung in Gleichung 59 erhält:
Durch Anpassen der Terme zweiter Ordnung würde das Gauss-Helligkeitsprofil a = 2/3 entsprechen, aber a wurde stattdessen als empirischer Parameter gewählt, der durch das Anpassungsverfahren bestimmt wird.
Ein weiteres beteiligtes Phänomen ist das der Intensitätsfluktuationen aufgrund des Einfangens von Molekülen in einem angeregten Triplettzustand (Widengren et al., J. Phys. Chem. 99: 13368-13379, 1995). Um eine gute Anpassung zu erhalten, insbesondere bei Werten von T, die mit der Triplett-Lebensdauer (die typischerweise 2 μs beträgt) vergleichbar sind, wird ein zusätzlicher Faktor in G(t) eingeführt:
wobei κ die Singulett-Triplett-Übergangsrate ist und τ die Triplett-Lebensdauer ist. Gleichung 51 ergibt
Im Unterschied zur Diffusion, die nur höhere Kumulanten von Zahlen von Photonenzählereignissen beeinflusst, verschieben Triplettkorrekturen auch die erste Kumulante um den Faktor 1/(1+κτ).
Nachdem diese Ausdrücke für C_appund q_app (einschließlich des Triplettfaktors) abgeleitet wurden, sollten die Datensimulationen und die Experimente ihre Gültigkeit bestätigen.
Die folgende Versuchsvorschrift wurde verwendet.
Versuchsaufbau. Der zentrale optische Teil eines FIMDA-Experiments ist ein konfokales Mikroskop, wie es in der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie verwendet wird (Koppel et al., Biophys. J. 16: 1315-1329, 1976; Rigler et al., Eur. Biophys. J. 22: 169-175, 1993a). Für die Anregung der Fluoreszenz wird ein Strahl aus einem Dauerstrichlaser durch Neutralfilter auf ~800 μW abgeschwächt, tritt durch einen Strahlaufweiter und wird durch einen dichroitischen Spiegel auf das Mikroskopobjektiv gerichtet. Die Fluoreszenz wird durch den dichroitischen Spiegel und ein spektrales Bandpassfilter von demselben Objektiv aufgefangen und auf eine konfokale Lochblende fokussiert, die dazu dient, das Licht außerhalb des Brennpunkts zurückzuweisen. Das Licht, das durch die Lochblende tritt, wird mit einem Silicium-Photonzählmodul (SPCM-AQ-131, EG&G Optoelectronics, Vaudreuil, Kanada) nachgewiesen. Ein elektronischer Zähler, der bei Evotec als Einsteckkarte für einen Computer konstruiert wurde, sammelt die TTL-Pulse aus dem Detektor kontinuierlich und berechnet die Histogramme der Zahlen der Zählereignisse für alle vorgewählten Breiten der Zeitfenster (40, 60, 120, 200, 400, 600, 800, 1200, 1600, 2000 μs) in Echtzeit aus dem 32-MB-Onboard-Puffer. Durch Zuführen der Detektorausgabewerte zu einem Korrelator können FCS-Messungen parallel mit FIMDA-Experimenten durchgeführt werden.
Um den spektralen Bedürfnissen der verschiedenen in dieser Studie verwendeten Fluorophore zu genügen, wurden verschiedene Laser und spektrale Bandpassfilter eingesetzt. Für mit Cy5 (Amersham Phamacia Biotech, Bucks, UK) konjugierte Biomoleküle wurde eine Anordnung aus einer roten Laserdiode (Crystal GmbH, Berlin, Deutschland; 635 nm) und einem Bandfilter mit einer zentralen Wellenlänge von 670 nm (670DF40, Omega Optical, Brattleboro, VI) verwendet. Im Falle von mit TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamin) markierten Molekülen war dies eine Anordnung aus einem frequenzverdoppelten Nd-YAG-Laser (μGreen 4601; Uniphase, San Jose, CA; 532 nm) und einem 590DF60-Filter.
Der fokale Strahlradius wurde auf ~0,75 μm eingestellt, indem man einen geeigneten Expansionsfaktor für den ursprünglichen Laserstrahl wählte, was zu einer mittleren Translationsdiffusionszeit von 360 μs für den freien Farbstoff Cy5 führte. Diese Diffusion kann eindeutig beobachtet werden, wenn man die Zeitfenster von 40 μs auf 2 ms steigert. Wie man in 28 sieht, unterscheiden sich die ausgewählten Histogramme der Zahlen von Zählereignissen einer 0,8 nM Cy5-Lösung beträchtlich. Die Hauptunterschiede zwischen der Form der Verteilungen sind jedoch darauf zurückzuführen, dass die mittlere Zahl der Zählereignisse mit der Länge des Zählzeitintervalls variiert. Die Diffusion von fluoreszierenden Molekülen bewirkt kleine, aber doch signifikante Modifikationen der Form jeder Verteilung.
Die Niveaus der Hintergrundzählrate werden im Allgemeinen in einem getrennten Experiment an bidestilliertem Wasser bestimmt und betragen gewöhnlich 0,5 kHz. Den Hauptbeitrag zu dieser nichtfluktuierenden Hintergrundlichtintensität liefert die Raman-Streuung von Wasser.
Datensimulationen. Anstatt reale Proben herzustellen, die ein Gemisch von Molekülen umfassen, die willkürlich gewählte Parameter (Helligkeitswerte und Diffusionskoeffizienten) ausdrücken, wurden einige Bewertungen des neuen Verfahrens unter Verwendung von simulierten Daten durchgeführt. Mehrere Gruppen von Histogrammen für FIMDA, FIDA und Korrelationsfunktionen für FCS wurden gemäß dem folgenden Algorithmus simuliert. In einem geschlossenen rechteckigen Reservoir wird eine gegebene Zahl von Molekülen anfangs statistisch über eine große Zahl (typischerweise 360 × 360 × 720) von diskreten Raumgitterpunkten verteilt. Jedes Molekül wird einer nachfolgenden Diffusionssimulation unterworfen und springt mit einer Frequenz, die einem gegebenen Diffusionskoeffizienten entspricht, zufällig um eine Gittereinheit entweder in x-, y- oder z-Richtung. Der "Brennpunkt" befindet sich im Zentrum des Reservoirs, und es wird angenommen, dass die Helligkeitsverteilung in allen drei Dimensionen eine Gauss-Verteilung ist. Wenn das Helligkeitsintegral von einem Molekül über eine gegebene Menge von Zeitintervallen berechnet wird, kann das Molekül statistisch eingefangen sowie aus dem angeregten Triplettzustand (wo es dunkel ist) freigesetzt werden. Nun kann man eine Anordnung von Helligkeitsintegralen über Grundzeitintervalle einer gegebenen Breite (z.B. 5 μs) berechnen, die die Entwicklung des Gemischs beschreiben. Die Helligkeitsintegrale werden dann in Zahlen von Photonenzählereignissen umgerechnet, die anschließend berechnet wurden, um Histogramme für FIMDA, FIDA sowie die Korrelationsfunktion für FCS zu berechnen.
Aufgrund der endlichen Größe des Simulationsreservoirs können einige Verzerrungen der Korrelationsfunktion (d.h. Abweichungen von Gleichung 57) erwartet werden. Die Verzerrungen liegen tatsächlich unter dem Niveau des statistischen Rauschens. Daher wurden die Simulationen als adäquates Werkzeug angesehen, um statistische Fehler der extrahierten Parameter abzuschätzen. Zu diesem Zweck wurden mit einer gegebenen Menge von molekularen Parametern typischerweise 30 Realisierungen von Experimenten simuliert, aus denen die Standardabweichungen und Variationskoeffizienten (CV) als Verhältnis von Standardabweichung zu Mittelwert berechnet wurden.
Biochemisches System. Die Grb2-(SH2)-Phosphopeptid-Wechselwirkung. Die neuere Antitumorforschung hat sich auf Tyrosin-Kinase-Wachstumsfaktor-Rezeptoren konzentriert (Levitzki, Eur. J. Biochem. 226: 1-13, 1994; Alessandro et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 213: 167-188, 1996; Furet et al., J. Med. Chem. 41: 3442-3449, 1998). Ein entscheidendes Glied im Signalübermittlungsweg dieses Rezeptors ist die Wechselwirkung seines Phosphotyrosinrests (pTyr) mit der Src-Homologie-2-(SH2)-Domäne des Adapterproteins Grb2 (Wachstumsfaktor-Rezeptor-bindendes Protein 2). Für die Erkennung ist eine minimale Peptidsequenz des Rezeptors (pTyr-Val-Asn) ausreichend (Müller et al., J. Biol. Chem. 271: 16500-16505, 1996; Gram et al., Eur. J. Biochem. 246: 633-637, 1997; Furet et al., J. Med. Chem. 41: 3442-3449, 1998). Der Bindungspartner dieses Peptidmotivs, die SH2-Domäne von Grb2, kann sich unabhängig von Nachbarsequenzen zu einem funktionellen Proteinmodul falten (Booker et al., Nature 358: 684-687, 1992; Overduin et al., Cell 70: 697-704, 1992). Daher haben wir als Modellsystem die nackte SH2-Domäne (14,3 kDa) gewählt, um mit einem fluoreszenzmarkierten Phosphopeptid (pTyr-Val-Asn-Val-Lys(Cy5)) (1387 Da) wechselzuwirken.
Die SH2-Domäne von Grb2 wurde so hergestellt, wie es an anderer Stelle beschrieben ist (Lowenstein et al., Cell 70: 431-442, 1992; Baumann et al., Eur. J. Immunol. 24: 1799-1807, 1994; Müller et al., ). Biol. Chem. 271: 16500-16505, 1996). Das Phosphopeptid wurde unter Verwendung von manueller Fmoc-Festphasenchemie synthetisiert und über einen Lysinrest mit Cy5-NHS markiert. Ein zusätzliches Valin wurde eingeführt, um mögliche Wechselwirkungen des Farbstoffs mit dem Haupterkennungsmotiv pTyr zu minimieren. Die endgültige Verbindung pTyr-Val-Asn-Val-Lys(Cy5) wurde durch Massenspektrometrie (LC/M5 und MALDI/TOF), UV/Vis und Fluoreszenzspektroskopie charakterisiert.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten.
Datensimulationen und Testexperimente. Zuerst wurde eine Reihe von Messungen an einer 1 nM TAMRA-Lösung durchgeführt, wobei Daten parallel für FIMDA und für FCS gesammelt wurden. Diese Reihe von Experimenten mit einer Dauer von jeweils 2 s wurde in Simulationen unter Verwendung von ähnlichen Molekülparametern wiederholt. Der Zweck dieser Experimente bestand darin, zu überprüfen, ob Simulationen ein vertretbares Modell für reale Experimente sind, insbesondere ob Datensimulationen ein vertretbares Mittel sind, um statistische Fehler von geschätzten Parametern vorherzusagen. Die Variationskoeffizienten der Parameter, die aus simulierten Daten extrahiert wurden, fallen tatsächlich mit den Ergebnissen des realen Experiments zusammen, wie in Tabelle 7 zu sehen ist.
Tabelle 7 Vergleich von Variationskoeffizienten geschätzter Parameter aus Reihen von experimentellen und simulierten Histogrammen durch FIMDA und Korrelationsfunktionen durch FCS.
Eine weitere Reihe von Testexperimenten wurde in einer erheblich kürzeren Zeitdomäne wiederholt, mit dem Ziel, FIMDA und FCS in ihrer Fähigkeit zur Abschätzung von Parametern der Triplettkomponente miteinander zu vergleichen. Für diesen Zweck wurde eine Menge von Zählzeitintervallen von 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 und 1024 μs gewählt. Die Dauer dieser Experimente betrug 16 s. Die in Tabelle 8 vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die durch FIMDA abgeschätzten Werte für die Triplettparameter eine ähnliche Abhängigkeit von der Anregungsintensität haben wie die FCS-Ergebnisse.
Tabelle 8 Triplett-Parameter, abgeschätzt aus einer Reihe von Experimenten an einer 1 nM TAMRA-Lösung durch FCS und FIMDA bei zwei verschiedenen Anregungsintensitäten. Anregungswellenlänge 532 nm, Dauer 16s, Zeitfenster 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 und 1024 μs.
Die FIMDA-Ergebnisse haben einen leichten systematischen Fehler und höhere CV-Werte als bei FCS, da die Abschätzung von Triplettparametern bei FIMDA indirekt ist, weil das kürzeste Zeitfenster (2 μs) gleich der Triplettlebensdauer ist. Der Hauptgrund der Triplettkorrektur in dem Modell ist jedoch nicht die Bestimmung der Triplettparameter, sondern die Verbesserung der Qualität der Anpassung und die Entfernung einer Quelle systematischer Fehler bei den Helligkeits- und Diffusionsparametern.
Histogramme für FIMDA für die Dreikomponentenanalyse wurden ebenfalls simuliert. Zwei der Komponenten hatten gleiche Helligkeitswerte (120 kHz), und ein anderes Paar hatte gleiche Diffusionszeiten (192 μs). Aufgrund der größeren Zahl freier Parameter wurde die simulierte Dauer der Experimente auf 60 s erhöht, so dass die Variationen von angepassten Parametern innerhalb vertretbarer Grenzen blieben. Bei diesem Test wurden alle Parameter einer Anpassung unterzogen. Die Ergebnisse sind in 29 als vertikale Balken in einer Ebene mit der Helligkeit und der Diffusionszeit als x-y-Koordinaten dargestellt, und die Ordinate zeigt den Beitrag zur Intensität, d.h. das Produkt aus Konzentration und Helligkeit.
Die drei Komponenten sind deutlich aufgelöst, da die Streuung im Ort der einzelnen Balken viel geringer ist als der Abstand zwischen den Gruppen, die unterschiedlichen Komponenten entsprechen. Man beachte, dass bei FIDA allein die Komponenten mit gleicher Helligkeit nicht aufgelöst werden können, während mit FCS allein die Komponenten mit gleicher Diffusionszeit unaufgelöst bleiben.
Biochemisches System
Die experimentelle Verwendung des neuen Verfahrens soll jetzt durch die Bestimmung der Bindungskonstanten der oben eingeführten Grb2-(SH2)-Phosphopeptid-Wechselwirkung aufgezeigt werden. Aus diesem Grund wurde ein Titrationsexperiment durchgeführt, wobei die Konzentration von pTyr-Val-Asn-Val-Lys(Cy5) konstant auf 0,4 nM gehalten wurde, während SH2 einer Titration unterzogen wurde (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 und 130 μM). Alle Experimente wurden unter identischen Bedingungen durchgeführt, d.h. mit demselben Puffer (sterilfiltriertes Wasser, 50 mM Na-Phosphat-Puffer pH 7,8, 50 mM NaCl und 0,05% Pluronic; T = 20 °C) und einer Datenerfassungszeit von 30 s pro Messung, die 30mal pro Probe wiederholt wurde. Bei jeder einzelnen Messung wurde dieselbe Menge von 10 verschiedenen Zeitfenstern verwendet (40, 60, 120, 200, 400, 600, 800, 1200, 1600, 2000 μs), was zu 10 verschiedenen Histogrammen von Zahlen von Photonenzählereignissen führte, die global angepasst wurden.
Als erster Schritt wurden die Diffusionszeit τ₁ = 407 ± 6 μs und die molekulare Helligkeit q₁ = 31,7 ± 0,3 kHz aus einer Einkomponentenanalyse bestimmt, die auf die reine Konjugatlösung angewendet wurde. Die Zugabe von überschüssigem SH2 (130 μM) zu 0,4 nM Konjugat führte zu einer Probe, bei der der größte Teil des Konjugats an SH2 gebunden war. Der Komplex war sowohl durch eine längere Diffusionszeit als auch eine höhere molekulare Helligkeit als das freie Konjugat charakterisiert. Dieses Gemisch wurde dann mit allen drei Verfahren (FIMDA, FIDA und FCS) analysiert, wobei man je nach Verfahren eine zweikomponentige Anpassung mit festgehaltenem τ₁ und/oder q₁ verwendete. Die Ergebnisse dieses Analyseschritts werden in Tabelle 9 vorgestellt. Man erkennt, dass alle Verfahren ähnliche Werte der Parameter ergeben. Die entsprechenden CV-Werte wurden wiederum durch zwei unabhängige Verfahren bestimmt, d.h. aus der statistischen Analyse der Ergebnisse von 30 Messungen und aus Simulationen. Die beiden Abschätzungen der statistischen Fehler stimmen einigermaßen gut miteinander überein, und die CV-Werte, die verschiedenen Verfahren entsprechen, sind ähnlich, mit der Ausnahme von FIDA, welches aufgrund des geringen (30%) Unterschieds in den Helligkeitswerten der Komponenten Schwierigkeiten aufweist. Der relative Fehler der geschätzten Konzentration des Konjugats ist hoch, da die andere Komponente in dieser Probe dominiert.
Tabelle 9 Vergleich von geschätzten Parametern und ihren Variationskoeffizienten bei hoher Rezeptorkonzentration (130 μM). Eine Reihe von 30 Experimenten mit jeweils 30 s Dauer wurde durch FIMDA, FIDA und FCS bewertet. Die Helligkeit (bei FIMDA und FIDA) und die Diffusionszeit (bei FIMDA und FCS) des freien Konjugats wurden unabhängig bestimmt und bei dieser Analyse auf 31,7 kHz bzw. 407 μs festgesetzt.
Als nächster Schritt der Untersuchungen wurde eine Probe mit 3 μM SH2 analysiert. Diese besondere Konzentration wurde so gewählt, dass man ein Gemisch von ungefähr gleichen Anteilen an Komplex und freiem Konjugat erreichte. Da es ziemlich schwierig ist, Komponenten mit einem Unterschied im Diffusionskoeffizienten von nur einem Faktor 2 und einem noch kleineren Unterschied in der spezifischen Helligkeit aufzulösen, wurden hier auch die Diffusionszeit und die Helligkeit des Komplexes auf die Werte von Tabelle 9 festgesetzt. Mit den festgesetzten Molekülparametern wurden die Konzentrationen mit allen Verfahren zuverlässig aufgelöst. Die Ergebnisse dieses Analyseschritts sind in Tabelle 10 zusammengefasst.
Tabelle 10 Vergleich der geschätzten Konzentrationen bei einer mittleren Rezeptorkonzentration (3 μM). Außer der Helligkeit und Diffusionszeit des freien Konjugats wurden hier auch die Helligkeit und/oder die Diffusionszeit des Komplexes auf die in Tabelle 9 gezeigten Werte festgesetzt.
In derselben Weise wurde die gesamte Reihe von SH2-Konzentrationen angepasst. 30 zeigt den berechneten gebundenen Bruchteil (C_Komplex/(C_Komplex + C_Konjugat)) für FIMDA, wobei die durchgezogene Kurve aus einer hyperbolischen Anpassung resultiert, die eine Bindungskonstante für die SH2-Phosphopeptid-Wechselwirkung von K_D = 1,68 ± 0,27 μM ergab. Vergleichbare Bindungskurven wurden auch durch FCS und FIDA (Daten nicht gezeigt) mit K_D-Werten von 2,26 ± 0,28 μM bzw. 1,70 ± 0,29 μM erhalten.
Die Daten von 30 zeigen, dass FIMDA ein geeignetes Verfahren ist, um die Bildung eines molekularen Komplexes zu überwachen. FCS- und FIDA-Experimente ergaben für diese besondere SH2-Phosphopeptid-Wechselwirkung ähnliche K_D-Werte. In der Literatur wird berichtet, dass die Affinität je nach der Peptidsequenz um mehrere Größenordnungen variiert (Müller et al., J. Biol. Chem. 271: 16500-16505, 1996; Gram et al., Eur. J. Biochem. 246: 633-637, 1997; Furet et al., J. Med. Chem. 41: 3442-3449, 1998). Hohe Affinitäten liegen im Bereich von K_D = 10 bis 100 nM. Mit einem Lysinrest (und daran gebundenem Cy5) in der +4-Position des Phosphopeptids (wobei p-Thr als 0-Position definiert ist und "+" am C-Terminus und "–" am N-Terminus weitergeht) nimmt die Affinität jedoch bis zum mikromolaren Bereich ab. Dieses Ergebnis steht gut im Einklang mit der Wichtigkeit von lipophilen Gruppen, die an "geeignete" Positionen des C-Terminus gebunden sind, was die Bindungskonstante an die SH2-Domäne erhöht (Furet et al., J. Med. Chem. 41: 3442-3449, 1998). Zum Beispiel bildet Val (auf der Position pTyr+3) einen van-der-Waals-Kontakt mit einem großen hydrophoben Bereich auf der SH2-Domäne.
Eines der überraschenden Ergebnisse dieser Studie ist, dass die durch FIMDA abgeschätzte statistische Genauigkeit der Diffusionszeit in jedem der Experimente genauso gut oder noch besser als die durch FCS abgeschätzte ist. Dies ist ein der Intuition widersprechendes Ergebnis, da sich FCS direkt auf die Anpassung einer diffusionsabhängigen Korrelationsfunktion G(t) konzentriert, während die Diffusionszeit in FIMDA nur indirekt geschätzt wird, nämlich durch die Abhängigkeit der scheinbaren Helligkeit von der Breite des Zeitfensters.
Eine weitere Beobachtung in dieser Hinsicht ist, dass die CV-Werte für die Diffusionszeiten im Allgemeinen höher sind als die für die Helligkeitswerte. Dies gilt auch für die theoretischen Simulationen und spiegelt daher einen Effekt wider, der im Messprinzip wurzelt. Das Phänomen kann anhand der verschiedenen Methoden, mit denen diese Größen bestimmt werden, qualitativ erklärt werden. Der Einfachheit halber kann an sich ein Beobachtungsvolumen mit einem konstanten Helligkeitsprofil B(r) im Innern vorstellen. In diesem Fall braucht man nur die mittlere Zählrate eines in das Volumen eintretenden Moleküls zu messen, um seine spezifische Helligkeit zu bestimmen. Dies erfordert den Nachweis vieler Photonen pro gegebenem Zeitintervall, kann aber im Prinzip bei einem einzigen Durchgang erreicht werden. Andererseits muss man zur Abschätzung der Diffusionszeit die mittlere Dauer des diffusionsgetriebenen Durchgangs bestimmen, was unvermeidlich das Mitteln über viele Fälle erfordert, auch wenn vielleicht jedes Mal viele Photonen nachgewiesen werden. Daher kann die spezifische Helligkeit eines Moleküls in einem Experiment von festgelegter Dauer im Prinzip mit höherer Genauigkeit bestimmt werden als seine Diffusionszeit.
Der Vorteil von FIMDA und FIDA gegenüber dem FCS des Standes der Technik besteht darin, dass beide Verfahren echte Konzentrationen von Komponenten in der Probe anstelle der Produkte von Konzentration und dem Quadrat der Helligkeit wie bei FCS liefern. Erst die unabhängige Bestimmung von wenigstens einem der beiden molekularen Helligkeitswerte ermöglicht es FCS, zwei Konzentrationen eindeutig aufzulösen, wie es in den obigen Beispielen geschehen ist. Unerfahrene Anwender von FCS nehmen jedoch häufig stillschweigend eine gleiche molekulare Helligkeit an, wenn sie zwei Komponenten auflösen. Diese Annahme kann Ergebnisse mit erheblichem systematischem Fehler verursachen. Gemäß der vorliegenden Erfindung bringen FIDA und FIMDA dieses Problem in den Brennpunkt der Analyse.
Ein weiterer Vorteil der vorgestellten Ausführungsform ist ihre Vielseitigkeit. Wenn es FCS oder FIDA nicht gelingt, einen bestimmten Ausgabewert in Bezug auf eine biochemische Reaktion nachzuweisen, könnte FIMDA erfolgreich sein. Die biochemische Reaktion ist nicht notwendigerweise auf die Bindung von zwei Komponenten beschränkt, sondern kann jede interessierende chemische Reaktion sein. Aufgrund der Verwendung von nur einem Detektor für die Aufnahme von zwei physikalischen Eigenschaften in einer einzigen Messung ist FIMDA ein sehr effizientes Analyseverfahren, das wertvolle Assayentwicklungszeit spart.
31 bis 33
In einem weiteren Experiment wurde das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung für die schnelle und quantitative Durchmusterung (Screening) von monoklonalen Antikörpern direkt auf Hybridomzelloberflächen angewendet. Ein expandierender Markt für monoklonale Antikörper in der klinischen Diagnostik und als therapeutische Wirkstoffe treibt kontinuierlich das Bedürfnis nach einem schnelleren und quantitativeren Verfahren zum Nachweisen und Isolieren von antigenspezifischen Hybridomen. Zur Zeit ist die effiziente Durchmusterung von Hybridomzellfusionen durch die Tatsache eingeschränkt, dass die Spezifität und Affinität des sezernierten monoklonalen Antikörpers in zeit- und arbeitsintensiven Verfahren bestimmt werden.
Im folgenden wird ein Ansatz auf der Basis der konfokalen Fluoreszenz beschrieben, bei dem diese Parameter in einem homogenen Bindungsassay für Antikörpermoleküle bestimmt wird, die noch nicht in das Kulturmedium freigesetzt wurden, sondern noch physikalisch mit der Oberfläche der erzeugenden Hybridomzelle verknüpft sind. Durch Kombinieren dieses direkten zellulären Bindungsassays mit der Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (FIDA) konnten die Dissoziationskonstanten (K_D) von Theophyllin- und (β-Amyloid-spezifischen monoklonalen Antikörpern direkt auf den Oberflächen der entsprechenden Hybridomzellen bestimmt werden. Dieser hochempfindliche konfokale Screening-Ansatz bietet eine wirksame Technologie, um die Isolierung von antigenspezifischen Klonen unter heterogenen Hybridomzellpopulationen zu beschleunigen.
Obwohl die allgemeine Technik der Herstellung von Hybridomzelllinien gut etabliert ist, sind noch beträchtliche Zeit und Aufwand notwendig, um monospezifische Klone mit einer ausreichenden Affinität zu einem gegebenen Antigen herauszufinden und zu selektieren. Nach der Immunisierung von Mäusen und der Fusion von Splenocyten und einer Mäuse-Myelomzelllinie ist ein größerer begrenzender Schritt der Nachweis und die Isolation von individuellen Hybridomklonen unter der heterogenen Population von meisten nichtfunktionellen Hybridzellen. Im Allgemeinen werden die Zellen, die den interessierenden Antikörper erzeugen, in Weichagar oder durch begrenzte Verdünnung in Mehrnapfplatten kloniert, um Monoklonalität zu gewährleisten. Dann werden die Kulturüberstände der Hybridomklone durch ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) in Bezug auf die Anwesenheit des gewünschten Antikörpers charakterisiert. Bei Verwendung dieser etablierten Antikörperherstellungsverfahren ist eine effektive Durchmusterung großer Zellpopulationen hauptsächlich in zweierlei Weise beschränkt. Erstens sind die angewendeten heterogenen Nachweisassays langwierige mehrstufige Verfahren, die keine genauen Daten zur Affinität (K_D) des hergestellten Antikörpers liefern. Zweitens sind diese Assays ziemlich unempfindlich und erfordern eine relativ hohe Konzentration an Antikörpermolekülen im Kulturüberstand, die von einer einzigen Hybridomzelle nicht erzeugt werden kann. Um also antigenspezifische Hybridklone nachzuweisen und zu isolieren, ist eine zeitraubende Kultivierung der fusionierten Zelllinien erforderlich, was das Screening auf einige hundert Klone beschränkt.
Es wurden alternative Strategien beschrieben, bei denen herkömmliche FACS-Technologie (fluorescence-activated cell sorter) als Mittel für die selektive Klonierung von Hybridomzellen auf der Basis der Oberflächenexpression von Ig angewendet wird. Die Menge der Immunglobuline wird unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Antigens entweder direkt auf der Hybridomoberfläche bestimmt (P. Marder et al., Cytometry 11: 498-505, 1990; E. Meilhoc et al., J. of Immunol. Methods 121: 167-174, 1989), oder die sezernierten Antikörper wurden künstlich auf der Zelle festgehalten (R. Manz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 1921-1925, 1994; J.C. Weaver et al., Nature Medicine 3: 583-585, 1997). In mehreren Untersuchungen konnte das zellgebundene Ig mit der Kapazität der Hybridome zur Sekretion von monoklonalem Antikörper in das Zellkulturmedium korreliert werden (S. Sen et al., Enzyme Microb. Technol. 12: 571-576, 1990). Als Hauptnachteil wurden bei diesen Ansätzen heterogene Assays verwendet, die keine Informationen über die Bindungsaffinität des hergestellten monoklonalen Antikörpers lieferten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine direkte Strategie auf der Basis eines homogenen Immunoassays vorgestellt, wobei konfokale Fluoreszenzmikroskopie angewendet wurde, um die Wechselwirkung von fluoreszenzmarkierten Antigenen mit ihrem komplementären monoklonalen Antikörper direkt auf der Hybridomzelloberfläche zu messen. Im Vergleich zu löslichen Antikörpermolekülen, die in das große Volumen des Kulturmediums sezerniert werden, erzeugt die auf der Oberfläche festgehaltene Antikörperfraktion innerhalb einer kürzeren Zeitspanne eine viel höhere lokale Konzentration auf der Hybridomzelle. Es ist möglich, die Konzentrations- und Helligkeitswerte verschiedener fluoreszenter Spezies, wie einzelner Moleküle und Teilchen (Zellen oder Beads), gleichzeitig zu bestimmen. Nach dem Binden fluoreszenzmarkierter Antigene an Antikörper, die sich auf der Hybridomzelloberfläche befinden, nimmt die Helligkeit des Komplexes mit der Zahl der gebundenen Antigene zu. Dann können die Komplexe genau von freiem Antigen unterschieden werden, und die Konzentrationen von freien und gebundenen Molekülen können quantitativ bestimmt werden. Für eine Modellhybridomzelllinie, die gegen das kleine Hapten Theophyllin gerichtete monoklonale Antikörper erzeugte, wurden die K_D-Werte des oberflächengebundenen Antikörpers bestimmt. Mit parallel durchgeführten Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie-(FCS)-Messungen wurden vergleichbare K_D-Werte für den entsprechenden Antikörper bestimmt, der über Protein-G-Affinitätschromatographie gereinigt wurde.
Material und Verfahren. Ein konfokales Fluoreszenzmikroskop (z.B. das kommerzielle Fluoreszenzkorrelationsspektrometer Confocor, Zeiss und Evotec, Deutschland) sowie Nachweistechnologie für Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (FIDA) wurden verwendet, um die Bindungsreaktion eines theophyllinspezifischen monoklonalen Antikörpers mit seinem zugehörigen Antigen Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin) zu messen.
Hybridomzelllinien. Es hat sich gezeigt, dass die für die beschriebenen Experimente verwendete Hybridomzelllinie stabil monoklonale Antikörper erzeugt, die spezifisch Theophyllin binden (ATCC-Zugangsnummer: HB-8152).
Synthese des Theophyllin-TAMRA-Konjugats. Die kovalente Kopplung von Theophyllin an ein Tetramethylrhodamin-Derivat (TAMRA) wurde an der festen Phase unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt: 11,0 mg N-α(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-γ-(tert-butoxycarbonyl)-L-diaminobutansäure (Fmoc-Dab(Boc)-OH) wurden an 10 mg 4-Methylbenzhydrylamin-Harz (Bela- dung: 0,5 mmol/g) gekoppelt, wobei man Standard-PyBOP-Aktivierung verwendete (26 mg Benzotriazol-l-yltripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphat, 5,5 μl N-Methylmorpholin in 250 μl Dimethylformamid). Nach der Spaltung der Fmoc-Gruppe (250 μl 20%iges Piperidin in Dimethylformamid während 20 min), 6,7 mg 8-(3-Carboxypropyl)theophyllin wurde an die harzgebundene Diaminobutansäure gekoppelt, wobei man PyBOP-Aktivierung verwendete (26 mg Benzotriazol-l-yltripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphat, 5,5 μl N-Methylmorpholin in 125 μl Dimethylformamid/125 μl N-Methylpyrrolidon). Zweimalige Behandlung mit 300 μl 50%iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan während 15 min führte zur Boc-Abspaltung. Nach dem Waschen und Neutralisation mit 0,5 ml 10%igem N-Ethyldiisopropylamin in Dimethylformamid während 10 min wurde eine Lösung von 13,2 mg 5-Carboxytetramethylrhodaminsuccinimidylester (5-TAMRA, SE) in 500 μl Dimethylformamid hinzugefügt, und man ließ die Reaktion über Nacht fortschreiten. Das Reaktionsgemisch wurde ausfiltriert, und das Harz wurde fünfmal mit 100 ml Dichlormethan gewaschen. Das resultierende Theophyllin-Konjugat wurde durch 2,5 Stunden Behandlung mit 250 μl 10%iger Trifluormethansulfonsäure in Trifluoressigsäure von dem Harz abgespalten. Das Harz wurde durch Filtration unter reduziertem Druck entfernt. Zur Ausfällung des Rohprodukts wurde ein 8-10faches Volumen kalter tert-Butylmethylether zu dem Filtrat gegeben. Schließlich wurde das fluoreszierende Theophyllin-TAMRA-Konjugat durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) – Stand der Technik. FCS macht sich Unterschiede in der Translationsdiffusion großer gegenüber kleinen Molekülen zu Nutze und weist wesentliche Änderungen des Molekulargewichts nach einer molekularen Wechselwirkung nach, so dass es zwischen der gebundenen und der ungebundenen Fraktion des Liganden unterscheidet. Jedes Molekül, das durch den beleuchteten konfokalen Brennpunkt diffundiert, verursacht während des gesamten Verlaufs seiner Reise Ausbrüche von Fluoreszenzlichtquanten, was charakteristische Fluktuationen des Gesamtfluoreszenzsignals verursacht. Die Länge jedes Photonenausbruchs entspricht der Zeit, die das Molekül im konfokalen Brennpunkt verbringt. Die emittierten Photonen werden zeitlich aufgelöst durch eine hochempfindliche Einzelphotonnachweis-Vorrichtung aufgezeichnet. Dieses Nachweisverfahren erreicht Einzelmolekülempfindlichkeit, aber die Tatsache, dass Diffusion ein statistischer Vorgang ist, erfordert, dass die Diffusionsereignisse für ein minimales Ensemble von Molekülen gemittelt werden, um statistisch zuverlässige Informationen zu erhalten. Der Nachweis von Diffusionsereignissen ermöglicht die Bestimmung eines Diffusionskoeffizienten, der als Parameter dient, um zwischen verschiedenen fluoreszierenden Spezies in der Lösung zu unterscheiden, zum Beispiel zwischen freiem oder gebundenem Liganden.
Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (FIDA) – eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. FIDA, ein verfahren zur Analyse der Fluoreszenzhelligkeit eines Gemischs von Teilchen in Lösung beruht auf einer ähnlichen optischen und elektronischen Konfiguration, wie sie auch für die FCS-Analyse eingesetzt wird, verwendet jedoch einen anderen Algorithmus für die Analyse. Dieses Verfahren (das eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt) misst das Histogramm von Zahlen von Photonenzählereignissen und bestimmt die Konzentration von fluoreszierenden Teilchen als Funktion der spezifischen Helligkeit, die als mittlere Zählrate pro gegebenes Teilchen ausgedrückt wird. Es kann angewendet werden, um Konzentrationen von verschiedenen fluoreszierenden Spezies in heterogenen Proben zu bestimmen und ist in verschiedenen Gebieten von der Grundlagenforschung bis zu sehr speziellen Anwendungen, z.B. Wirkstoffsuche und Diagnostik, ein wertvolles Werkzeug. Als Beispiel erlaubt es die Unterscheidung zwischen einem fluoreszenzmarkierten Antigen, das frei oder an einen mehrwertigen Rezeptor, z.B. ein zweiwertiges Antikörpermolekül, gebunden ist. Diese Bindungsreaktion kann für einzelne Antikörpermoleküle in Lösung sowie für Antikörpermoleküle, die auf der Oberfläche von Hybridomzellen immobilisiert sind, gemessen werden.
Die Bindungsreaktion von Theophyllin-TAMRA an Antikörpern, die auf der Zelloberfläche der speziellen Hybridomzelllinie HB-8152 festgehalten werden, wurde durch FIDA bestimmt. Als Kontrolle wurden keine zellassoziierten Fluoreszenzsignale nachgewiesen, als eine nichtzugehörige β_1–40-Amyloid-spezifische Hybridomzelllinie PS1-8A1-C6-D6 mit dem Theophyllin-TAMRA-Konjugat inkubiert wurde (31). Die Zellzahl einer konfluenten Hybridomkultur wurde zu 1,6 × 10⁶ pro ml bestimmt, und Aliquote mit ungefähr 0,5 × 10⁶ Hybridomzellen in 100 μl wurden für jedes einzelne Experiment verwendet. Die Zellen wurden 5 Minuten lang in 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Puffer gewaschen, um löslichen Antikörper aus dem Assay zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen 30 Minuten lang in 100 μl PBS inkubiert, das das Theophyllin-TAMRA-Konjugat in unterschiedlichen Konzentrationen enthielt: 0, 0,4, 2, 8, 16, 40, 200, 800 nM. Für jede Messung wurden 50 μl von jeder der Zellsuspensionen in einen Kammerobjektträger (Nunc) pipettiert und in einem ConfoCor unter Verwendung von FIDA analysiert (Wellenlängen: Anregung: 543 nm und Emission: 572 nm). Für jedes einzelne Experiment wurde der Grad der Fluoreszenzmarkierung der Hybridomzellen in vier unabhängigen Messungen bestimmt. Die Dissoziationskonstante (K_D) von HB-8152-Antikörper wurde zu 33,1 nM ± 7,6 nM berechnet. Als Kontrolle wurden für den Hybridomklon PS1-8A1-C6-D6 keine spezifischen Fluoreszenzsignale gemessen.
In einem Konkurrenzexperiment wurde die Spezifität der Theophyllin-TAMRA-Bindung an die Hybridom-HB-8152-Zellen durch steigende Konzentrationen von unmodifiziertem Theophyllin kompetitiv gehemmt. Die Hemmung der Theophyllin-TAMRA-Bindung an die Hybridomzelllinie HB-8152 wurde unter Verwendung derselben Assayvorschrift und FIDA-Analyse, wie sie bei 31 beschrieben sind, gemessen. Die einzige Ausnahme war, dass die Hybridomzellen unter Verwendung einer konstanten Konzentration von Theophyllin-TAMRA (80 nM) in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen von unmarkierter Theophyllin-Konkurrenzsubstanz markiert wurden: 1, 10, 100, 300, 600, 1000, 2000, 5000 nM. Der IC50-Wert wurde zu 250,1 nM ± 25,5 nM berechnet. Als Kontrolle wurde keine Bindung des Theophyllin-TAMRA-Konjugats an den amyloidspezifischen Hybridomklon PS1-8A1-C6-D6 bestimmt (32).
Als Standard wurde die bestimmte Dissoziationskonstante (K_D) des theophyllinspezifischen Antikörpers in einer unabhängigen FCS-Messung bestätigt, wobei man sezernierte Antikörpermoleküle verwendete, die aus dem Hybridom-NB-8152-Kulturmedium gereinigt wurden (33). Daher wurden die sezernierten monoklonalen IgG-Antikörpermoleküle aus dem Hybridom-HB-8152-Kulturmedium unter Verwendung von Protein-G-Affinitätschromatographie gereinigt, und die Konzentration der gereinigten Antikörperlösung wurde spektroskopisch bestimmt.
Der gereinigte Antikörper wurde auf die folgenden Konzentrationen verdünnt: 0, 1, 5, 10, 50, 100, 200, 500 nM in 100 μl PBS-Puffer, der ein fluoreszierendes Theophyllin-TAMRA-Konjugat (1 nM) enthielt. Die Gemische wurden 30 min lang inkubiert, um die Bildung des Antikörper::Theophyllin-TAMRA-Komplexes zu ermöglichen. Aliquote von 30 μl wurden in einen Kammerobjektträger (Nunc) übergeführt und in einem Confocor unter Verwendung von FCS analysiert. Die Dissoziationskonstante (K_D) für das lösliche Antikörpermolekül wurde zu 24,6 nM ± 11,5 nM berechnet, was mit den Ergebnissen vergleichbar ist, die bei den zellulären FIDA-Messungen erhalten wurden.
Die quantitative Bestimmung von sezernierten Biomolekülen, wie z.B. Immunglobulinen, Cytokinen, Wachstumsfaktoren oder Hormonen, ist in Gebieten wie Diagnostik oder Pharmakologie ein wertvolles Werkzeug. Im Allgemeinen werden die Konzentration und pharmakologische Aktivität dieser Moleküle für Moleküle bestimmt, die tatsächlich aus der Zelle in das extrazelluläre Medium freigesetzt wurden. Hier wird ein alternativer Ansatz vorgestellt, bei dem der Anteil des zellgebundenen Antikörpers durch konfokale Mikroskopie und FIDA gemessen wird. Im Vergleich zu herkömmlichem FACS hat diese Technologie gemäß der vorliegenden Erfindung wesentliche Vorteile:
Erstens bringt die konfokale Mikroskopie eine viel größere Empfindlichkeit, indem sie den Nachweis bis herunter zu einzelnen Molekülen erlaubt. Dagegen ist FACS aufgrund der nichtkonfokalen Optik eher unempfindlich und in seinen Anwendungen auf den Nachweis von hell gefärbten Zellen beschränkt.
Zweitens können homogene Bindungsassays eingesetzt werden, so dass eine aviditätsgetriebene Selektion von unerwünschten Hybridomklonen, die IgG- oder IgM-Antikörper mit geringer Affinität erzeugen, ausgeschlossen ist. Außerdem reduzieren Assays auf Lösungsmittelbasis unspezifische Wechselwirkungen, die in heterogenen Festphasenassays beobachtet werden und zur Selektion von falsch positiven Klonen führen.
Drittens: Wenn Hybridomzellen unter Sättigungsbedingungen mit dem fluoreszierenden Antigen markiert werden, gibt der absolute Helligkeitswert der Zellen einen Hinweis auf die Menge der erzeugten Antikörpermoleküle. Da Hybridome nicht immer homogene Kulturen sind, zeigt das Aufrechterhalten einer effizienten Antikörperproduktion somit die anschließende Selektion von "guten" Produzenten an.
Viertens und wahrscheinlich am wichtigsten: Das einwertige fluoreszierende Antigen bindet gemäß der Bindungsaffinität des erzeugten Antikörpers an das Hybridom. Aus der unterschiedlichen Helligkeit fluoreszenzmarkierter Hybridomzellen bei steigenden Antigenkonzentrationen kann der K_D-Wert des Antikörpers berechnet werden. Im Unterschied zu der oben beschriebenen IG-Produktionskapazität wird dieser Parameter nicht durch die häufig beobachteten statistischen Variationen innerhalb einer klonalen Population von Hybridzellen beeinflusst. Daher liefern die von einzelnen Zellen nachgewiesenen Signale bereits ausreichende Informationen, um zwischen Hybridklonen, die Antikörper mit unterschiedlichen Affinitäten erzeugen, zu diskriminieren.
Mit der vorgestellten Technologie sollten seltene Zellen, die Antikörper mit hoher Affinität erzeugen, jetzt zu einem viel früheren Zeitpunkt nachgewiesen werden, so dass ein Überwuchern mit nichtproduzierenden Klonen verhindert wird. Infolgedessen sollte diese Technologie das gesamte zugängliche Antikörperrepertoir, das von Hybridomen erhalten wird, vergrößern und die selektive Isolierung von monospezifischen Hybridklonen aus frisch fusionierten Zelllinien beschleunigen. Eine zusätzliche wichtige therapeutische oder diagnostische Anwendung ist die Isolation von seltenen Ereignissen, wie Stammzellen oder Krebszellen.

Claims

Verfahren zur Charakterisierung von fluoreszenten Molekülen oder anderen Teilchen in Proben, umfassend die folgenden Schritte: a) Überwachen von Intensitätsfluktuationen von Fluoreszenz, die von den Molekülen oder anderen Teilchen emittiert wird, in wenigstens einem Messvolumen mit einem ungleichmäßigen räumlichen Helligkeitsprofil durch Messen der Zahl von Photonenzählereignissen in primären Zeitintervallen durch einen einzigen oder mehrere Photonendetektoren; b) Bestimmen wenigstens einer Verteilung von Zahlen von Photonenzählereignissen, P ^(n), aus den gemessenen Zahlen von Photonenzählereignissen; c) Bestimmen von physikalischen Größen, die für die Teilchen charakteristisch sind, durch Anpassen der experimentell bestimmten Verteilung der Zahlen von Photonenzählereignissen P ^(n), dadurch gekennzeichnet, dass das Anpassungsverfahren die Berechnung einer theoretischen Verteilungsfunktion der Zahl der Photonenzählereignisse P(n) über ihre erzeugende Funktion, die als
definiert ist, beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die primären Zeitintervalle aufeinanderfolgende Intervalle mit gleicher Breite sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Zahlen der Photonenzählereignisse {n_i} in Schritt b), die einer Bestimmung einer Verteilung P ^(n) unterliegen, von Zahlen von Photonenzählereignissen in primären Zeitintervallen {N_j} abgeleitet werden, indem man die Zahlen der Photonenzählereignisse aus primären Zeitintervallen gemäß einer vorbestimmten Regel aufsummiert.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Zahlen der Photonenzählereignisse {n_i} in Schritt b), die einer Bestimmung einer Verteilung P ^(n) unterzogen werden, gemäß der Regel
aus den Zahlen der Photonenzählereignisse in primären Zeitintervallen {N_j} berechnet werden, wobei M eine ganze Zahl ist, die ausdrückt, um welchen Faktor das Zeitintervall, in dem {n_i} bestimmt wird, länger ist als das primäre Zeitintervall.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Zahlen der Photonenzählereignisse {n_i} in Schritt b) gemäß einer Regel, in der primäre Zeitintervalle durch eine Zeitverzögerung voneinander getrennt sind, aus vorbestimmten primären Zeitintervallen berechnet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Zahlen der Photonenzählereignisse {n_i} in Schritt b), die einer Bestimmung einer Verteilung P ^(n) unterliegen, gemäß der Regel
aus den Zahlen von Photonenzählereignissen in primären Zeitintervallen {N_j} berechnet werden, wobei M und L positive ganze Zahlen sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei in Schritt b) eine Menge von Verteilungen P ^(n) gemäß einer Menge von unterschiedlichen Regeln bestimmt wird, wobei die Menge der Verteilungen in Schritt c) gemeinsam angepasst wird.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 6 und 7, wobei in Schritt c) eine Menge von Verteilungen mit unterschiedlichen Werten für M und/oder L gemeinsam angepasst wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei wenigstens einer der physikalischen Größen von Schritt c) um die Konzentration der Teilchen handelt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich bei wenigstens einer der physikalischen Größen von Schritt c) um die spezifische Helligkeit der Teilchen handelt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei wenigstens einer der physikalischen Größen von Schritt c) um den Diffusionskoeffizienten handelt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die erzeugende Funktion berechnet wird unter Verwendung des Ausdrucks G(ξ) = exp[∫dqc(q)∫d³r(e^{(ξ–1)qTB(r)}–1], wobei c(q) die Dichte der Teilchen mit der spezifischen Helligkeit q ist, T die Länge des Zählintervalls ist und B(r) das räumliche Helligkeitsprofil als Funktion der Koordinaten ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Argument der erzeugenden Funktion in der Form ξ = e^-iφ gewählt wird und bei der Berechnung der theoretischen Verteilung der Zahl der Photonenzählereignisse aus ihrer erzeugenden Funktion ein schneller Fourier-Transformations-Algorithmus verwendet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei in Schritt c) bei der Berechnung der theoretischen Verteilung P(n) das räumliche Helligkeitsprofil durch eine mathematische Beziehung zwischen Volumen und räumlicher Helligkeit modelliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei in Schritt c) bei der Berechnung der theoretischen Verteilung P(n) das räumliche Helligkeitsprofil durch den folgenden Ausdruck modelliert wird: dV/dx = A₀x(1+a₁x+a₂x ²), wobei dV ein Volumenelement bezeichnet, x den Logarithmus der relativen räumlichen Helligkeit bezeichnet, A₀ eine Konstante ist, die die Volumeneinheit auswählt, und a₁ und a₂ empirisch abgeschätzte Parameter sind.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei in Schritt c) bei der Berechnung der theoretischen Verteilung P(n) das räumliche Helligkeitsprofil durch den folgenden Ausdruck modelliert wird:
wobei dV ein Volumenelement bezeichnet, x den Logarithmus der relativen räumlichen Helligkeit bezeichnet, A₀ eine Konstante ist, die die Volumeneinheit auswählt, und a₁, a₂ und a₃ empirisch abgeschätzte Parameter sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei in Schritt a) eine Vorrichtung mit konfokaler Optik verwendet wird, um die Fluoreszenzintensität zu überwachen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die fluoreszenten Moleküle oder anderen Teilchen durch Anwendung eines homogenen Fluoreszenzassays charakterisiert werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Verwendung in der Diagnostik, im Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening, bei der Optimierung von Eigenschaften von Molekülen und bei der Identifizierung spezifischer Zell- oder suspendierbarer Trägerpopulationen.
Verwendung einer konfokalen Apparatur zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Apparatur folgendes umfasst: eine Strahlungsquelle (12) zur Bereitstellung von anregender Strahlung (14); ein Objektiv (22) zur Fokussierung der anregenden Strahlung (14) in ein Messvolumen (26); einen Detektor (42) zum Nachweis von Emissionsstrahlung (30), die aus dem Messvolumen (26) stammt; und eine undurchsichtige Einrichtung (44), die im Weg (32) der Emissionsstrahlung (30) oder der anregenden Strahlung (14) positioniert ist, um den zentralen Teil der Emissionsstrahlung (30) oder der anregenden Strahlung (14) auszulöschen.