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WO2015015951A1 - 単一発光粒子検出技術を用いた光学顕微鏡装置、顕微鏡観察法及び顕微鏡観察のためのコンピュータプログラム - Google Patents

単一発光粒子検出技術を用いた光学顕微鏡装置、顕微鏡観察法及び顕微鏡観察のためのコンピュータプログラム Download PDF

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WO2015015951A1
WO2015015951A1 PCT/JP2014/066541 JP2014066541W WO2015015951A1 WO 2015015951 A1 WO2015015951 A1 WO 2015015951A1 JP 2014066541 W JP2014066541 W JP 2014066541W WO 2015015951 A1 WO2015015951 A1 WO 2015015951A1
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WO
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light
observation
area
light emitting
light detection
Prior art date
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PCT/JP2014/066541
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English (en)
French (fr)
Inventor
山口光城
田邊哲也
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Olympus Corp
Original Assignee
Olympus Corp
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    • G02B21/0048—Scanning details, e.g. scanning stages scanning mirrors, e.g. rotating or galvanomirrors, MEMS mirrors

Definitions

  • the present invention relates to atoms, molecules or aggregates thereof in liquid (hereinafter referred to as "particles"), for example, proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates of these.
  • the present invention relates to an optical microscopy technique for detecting or imaging particulate objects such as molecules, viruses and cells, or non-biological particles, and more particularly, an optical system of confocal microscope or multiphoton microscope Optical microscopy using a single light emitting particle detection technology that detects light from a single light emitting particle separately using an optical system that can detect light from a minute area in a solution such as And a computer program for microscopic observation.
  • light-emitting particles are either particles which themselves emit light or particles to which any light-emitting label or light-emitting probe is added.
  • the light emitted from the luminescent particles may be fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light and the like.
  • Recent development of light measurement technology enables optical microscope observation and imaging of microscopic images (detection of the position of an image in two or three dimensions) by detection and measurement of weak light at the fluorescence single molecule level
  • a detection region of light of the microscope in a sample The state in the sample is imaged by detecting light from the light detection area while moving a minute area (hereinafter referred to as “light detection area”) that scans the inside of the sample.
  • light detection area a minute area
  • the applicant of the present application is a novel photometric technique (hereinafter referred to as "scanning molecule counting method") which enables detection of luminescent particles dispersed or dissolved in a liquid. Proposed.
  • an optical system capable of detecting light from a minute area in a solution such as a confocal microscope or a multiphoton microscope is used to move the position of a light detection area, that is, light While scanning the sample solution with the detection area, when the light detection area includes luminescent particles dispersed in the sample solution and randomly moving, the light emitted from the luminescent particles is separately detected, thereby By detecting luminescent particles one by one in the sample solution, it becomes possible to count the luminescent particles and obtain information on the concentration or number density of the luminescent particles in the sample solution.
  • Patent document 1 JP 2005-017642 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-162994 International Publication No. 2011/108369 International Publication No. 2011/108370 International Publication No. 2011/108371 International Publication 2012/050011 International Publication 2012/053355 International Publication No. 2013/031439
  • a region to be observed is two-dimensionally or three-dimensionally scanned by a raster scan method, and detected light intensity values are positional information in the region to be observed In conjunction with, a microscopic image is constructed.
  • the path of reciprocation of the light detection area is displaced in the other direction while reciprocating the light detection area in one direction in the observation target area. An image within the region of interest is formed. Then, when the detected light intensity is weak, scanning of the same area is repeated, and integration of the light intensity is performed.
  • the scanning molecule counting method in which the presence of luminescent particles is detected while moving the light detection region in a liquid by using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope. It is possible to detect weak light from light emitters or light emitting particles whose position changes dynamically in a certain sample.
  • scanning molecular counting techniques may be used to achieve formation of an image of a phosphor or luminescent particle whose position changes dynamically in a thick sample. It is.
  • the main object of the present invention is a microscope device capable of forming an image of a light emitter or light emitting particle whose position changes dynamically in a thick sample using a scanning molecular counting method. , And a computer program for the same.
  • the above-mentioned subject is an optical microscope apparatus which detects light from light emitting particles in a sample liquid to detect light emitting particles using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • the light detection area movement in which the position of the light detection area is continuously moved a plurality of times in the observation small area for each observation small area obtained by dividing the observation target area in the field of view of the microscope into a plurality.
  • the “luminescent particles that move in the sample liquid” may be atoms, molecules or aggregates thereof which can move in any liquid, for example, in a cell or an organelle. It may be light emitting particles, such as a collection.
  • the luminescent particles are typically fluorescent particles, but may be particles that emit light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light, and the like.
  • the "light detection area” of the optical system of a confocal microscope or multiphoton microscope is a minute area where light is detected in those microscopes, and when illumination light is given from an objective lens, the illumination light Corresponds to the region where light is collected (in the case of a confocal microscope, it is determined particularly by the positional relationship between the objective lens and the pinhole).
  • the "observation target area” is a two-dimensional or three-dimensional area in the field of the microscope, which is imaged in the present apparatus, and the "observation small area” virtually corresponds to the "observation target area". It is each of the some area
  • the light detection unit may be configured using a light detector of a type for detecting light from the light detection area by photon counting which counts the number of photons arriving at each predetermined measurement unit time (bin time), In that case, time-series light intensity data becomes time-series photon count data.
  • the term "signal of light emitting particle" refers to a signal representing light from the light emitting particle, unless otherwise specified.
  • the "light detection area” (confocal volume) in the sample liquid as in the laser scanning confocal microscope or multiphoton microscope Position is moved in a predetermined two-dimensional or three-dimensional space, that is, a two-dimensional or three-dimensional space ("observation area") in the sample liquid is scanned by the light detection area, thereby The light emitted from the area is detected.
  • a two-dimensional or three-dimensional space that is, a two-dimensional or three-dimensional space
  • observation area a two-dimensional or three-dimensional space
  • the mode of scanning in the observation target area by the light detection area and the mode of signal processing of the detected light are different from usual.
  • the scanning by the light detection area is continuously performed a plurality of times for each "small observation area” obtained by virtually dividing the "observation area” into a lattice shape or a grid shape.
  • the light from the luminescent particle is detected when the moving light detection area includes the luminescent particle in the liquid (light measurement of scanning molecule counting method).
  • the processing of the time-series light intensity data of the detection light thus obtained, it is present in the area in a manner to detect the presence or absence of the light signal from the light emitting particle for each “observation small area”.
  • the individual detection of the luminescent particles is carried out (individual detection of the luminescent particles by scanning molecular counting), and in the case where the luminescent particles are present, a determination of the position within the area to be observed is made. That is, in the configuration of the present invention, upon microscopic observation, the principle of the scanning molecule counting method is applied to each observation area, and the presence of luminescent particles is detected for each observation area.
  • the weak light from the individual light emitting particles is separately and significantly detected to specify the position of the individual light emitting particles.
  • the time required to scan each observation subregion at a scan speed that allows That is, since the scanning time taken to detect one light emitting particle is shortened, even if the position of the light emitting particle changes with time, the light from the light emitting particle is significant before the position largely changes. It is possible to more reliably achieve multiple times of detection.
  • the position of the light detection region in the sample liquid is not limited to the vicinity of the surface of the sample container (unlike in the microscopic observation with evanescent light), so the thick sample liquid It is possible to detect and identify the presence of light-emitting particles that move in the interior of the inside and away from near the surface of the sample container. It should be understood that, in the configuration of the present invention, the positions of the detected light emitting particles are determined, so that the positions of the light emitting particles in the observation area can be represented as a two-dimensional or three-dimensional image. That is the point.
  • the position of the observation small area in the observation target area can be specified as the position of the light emitting particle.
  • the position of the light emitting particles in the observation small area can be specified as described in the section of the later embodiment.
  • a plurality of continuous movements of the position of the light detection area in each of the observation small areas are performed in one aspect. And may be performed sequentially in at least two directions per observation subregion. For example, scanning in the X direction and scanning in the Y direction in one observation small area may be performed continuously, or scanning in the X direction, scanning in the Y direction, and scanning in the Z direction may be performed continuously. You may In this case, the X- and Y-direction positions or the X-direction and Y-direction and Z-direction positions of the light emitting particles in one observation small area are determined as described in detail in the section of the later embodiment. It will be possible.
  • multiple scans of each observation subregion by the light detection region may be performed continuously in the same direction.
  • integration of the light becomes possible, or information on the movement characteristics or translational diffusion characteristics of the light emitting particles is obtained from positional deviations in multiple scans. It becomes possible to obtain.
  • the same luminescent particle deviates from the observation subregion during scanning at that scan time Less likely, and thus more likely to detect light of the same luminescent particle over multiple scans (a higher probability of detection over multiple scans of light of the same luminescent particle )That's what it means.
  • the dimensions of the above-mentioned observation small area determine the time required for the light detection area to scan the observation small area, and may be specifically determined based on the dimensions of the light detection area.
  • the same luminescent particles may be present during the scan time by the photodetection region. It is preferable to adjust the size of the observation subregion so as not to deviate. Therefore, preferably, in the observation area, the (expected) movement distance of the light emitting particles to be detected in the time for moving the position of the light detection area is smaller than the size of the observation area.
  • the dimensions of the observation subregion are set to
  • the scanning time is shortened if the light detection area can cover the entire observation small area by one movement. Therefore, preferably, the length of one side of the observation small area is set to be substantially equal to the diameter of the light detection area.
  • the light detection region passes through the location of the luminescent particles. At that time, a temporal change in pulse-like light intensity having a bell-shaped profile is captured as a light signal from the light-emitting particle.
  • the intensity of light emitted and detected from light-emitting particles in the light detection area varies with the position of the light-emitting particles in the light detection area, and the light intensity distribution is This is due to the bell-shaped distribution in which the light intensity decreases as the particle position moves from the approximate center to the periphery in the light detection area. Therefore, in order to more reliably capture the light signal from the light emitting particles present in the small observation area, in the time series light intensity data generated from the detected light, a bell shape of the light signal from the light emitting particles is used. It is preferred that a profile appears. On the other hand, luminescent particles may be present at a position offset from the center of the observation small area.
  • the observation small area It is necessary to pass the edge portion of the light detection area throughout the To that end, it is preferable that the leading edge and the trailing edge of the light detection region in the direction of travel pass both sides (or both sides) of the light detection region in the direction of movement of the observation subregion. Therefore, in the present invention described above, further, one movement of the position of the light detection area in each of the observation small areas is determined by the fact that the leading edge of the light detection area in its traveling direction is one of the observation small areas.
  • the aspect of one movement of the position of the light detection area is preferably applied in all directions (X, Y, Z) in which the scan is performed. According to this configuration, the analysis of the bell-shaped profile of the light-emitting particle signal makes it possible to determine the position of the light-emitting particle in the observation small region within the observation small region (see the column of the embodiment described later). .
  • the moving speed of the position at the time of scanning by the light detection area may be appropriately changeable based on the characteristics of the luminescent particle to be observed or the number density or concentration in the sample solution. .
  • the moving speed of the light detection area is increased, the amount of light detected is reduced, so that the moving speed of the light detection area can be appropriately changed so that the detected light amount can be measured accurately or sensitively.
  • the moving speed of the position of the light detection area is set higher than the diffusion moving speed of the luminescent particle (the average moving speed of the particle by the Brownian motion).
  • the moving speed of the light detection area is set higher than the diffusion moving speed of the light emitting particles, and one light emitting particle can be made to correspond to one signal (representing the presence of the light emitting particle).
  • the diffusion moving speed changes depending on the characteristics of the light emitting particles, it is preferable that the moving speed of the light detection region can be appropriately changed according to the characteristics of the light emitting particles (in particular, the diffusion constant) as described above.
  • Movement of the position of the light detection area may be done in any manner.
  • the position of the light detection area may be changed by changing the optical path of the optical system of the microscope by using a galvano mirror adopted in a laser scanning optical microscope, or
  • the position of the sample solution may be moved (for example, by moving the stage of the microscope) to move the relative position in the sample solution of the light detection area.
  • Movement of the objective lens in the direction of the optical axis adjusts the position of the objective lens in the height direction or the position of the stage in the height direction, or converges the beam light (rather than collimated) from the rear end of the objective lens. It can be achieved by a mechanism to make light or diffuse light.
  • the signal processing unit uses the characteristic of the signal of the same light emitting particle obtained by the plurality of times of movement of the light detection area for each observation small area to obtain information on the size of the light emitting particle. It may be configured to make a decision.
  • the characteristic of the signal of the light emitting particle may be an index value representing the translational diffusion property of the light emitting particle or an index value representing the rotational diffusion property of the light emitting particle.
  • each of the individual light emitting particles is determined in a state where the position of the light emitting particles is determined in the observation target region or in a state where the position of the light emitting particles is expressed as an image. It should be understood that information regarding the size of the luminescent particle can be obtained.
  • the luminescent particle detected in the present invention its position in the observation area is determined and can be represented as an image. Therefore, it is possible to express the position of the light emitting particle in a superimposed manner on a microscope image (for example, a transmitted light image, an incident fluorescence image, etc.) of the observation target region generated by an arbitrary method. Therefore, in the apparatus of the present invention, the position of the light emitting particle whose position is determined in the observation area is obtained by plotting in the microscope image of the observation area generated by any method. Plot images may be generated.
  • the position of the luminescent particle can be observed by being superimposed on a microscope image of another observation target area, for example, a microscope image of a cell or a cell organelle.
  • a microscope image of a cell or a cell organelle for example, a microscope image of a cell or a cell organelle.
  • various information can be further added by superposing the microscopic image of the cell or cell organelle and making it possible to refer to the characteristic of the luminescent particle. It is expected to be obtained.
  • the number of signals is counted to count the number of luminescent particles included in the light detection area (counting of particles) or to obtain information on the concentration of luminescent particles. It is possible. Therefore, the signal processing unit in the present invention may be configured to determine the number of light emitting particles in the region to be observed or the concentration of the light emitting particles in the liquid based on the number of light emitting particles detected. Even in such a configuration, it is advantageous that the concentration of the light-emitting particles can be observed together with the microscope image by another method of the region to be observed.
  • an optical microscope for detecting light from a light emitting particle in a sample liquid by using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope to detect the light emitting particle.
  • a computer program wherein the position of a light detection area is continuously moved a plurality of times in the observation small area for each observation small area obtained by dividing the observation target area in the field of view of the microscope into plural parts.
  • the movement of the position of the light detection area in each of the observation subregions may be performed several times continuously in at least two directions and / or continuously in the same direction for each observation subregion. May be performed.
  • the dimensions of the observation subregion may be determined based on the dimensions of the light detection region, and preferably, of the luminescent particles to be detected within the time of moving the position of the light detection region in the observation subregion.
  • the dimensions of the observation subregion may be set such that the movement distance is smaller than the dimensions of the observation subregion.
  • the length of one side of the observation small area is set to be substantially equal to the diameter of the light detection area, and one movement of the position of the light detection area in each of the observation small areas is performed.
  • the moving speed of the position of the light detection area is set higher than the diffusion moving speed of the light emitting particles.
  • the positions of the light emitting particles whose positions are determined in the observation area are plotted in the microscope image of the observation area generated by any method.
  • a procedure for generating an obtained plot image and / or a procedure for determining information on the size of luminescent particles using characteristics of signals of the same luminescent particles obtained by moving a plurality of light detection areas for each observation small area The characteristic of the light emitting particle signal used to determine the information on the size of the light emitting particle may be, for example, an index value representing translational diffusion property of the light emitting particle or It may be a value.
  • the computer program may include a step of determining the number of light emitting particles in the observation area or the concentration of the light emitting particles in the liquid based on the detected number of light emitting particles.
  • an optical microscope observation method of detecting light from a light emitting particle in a sample liquid using a confocal microscope or an optical system of a multiphoton microscope to detect light emitting particles is provided.
  • the movement of the position of the light detection area in each of the observation sub-regions is performed multiple times continuously in at least two directions and / or continuously in the same direction for each observation sub-region May be done.
  • the dimensions of the observation subregion may be determined based on the dimensions of the light detection region, and preferably, of the luminescent particles to be detected within the time of moving the position of the light detection region in the observation subregion.
  • the dimensions of the observation subregion may be set such that the movement distance is smaller than the dimensions of the observation subregion.
  • the length of one side of the observation small area is set to be substantially equal to the diameter of the light detection area, and one movement of the position of the light detection area in each of the observation small areas is performed.
  • the moving speed of the position of the light detection area is set higher than the diffusion moving speed of the light emitting particles.
  • the positions of the light emitting particles whose positions are determined in the observation area are obtained by plotting them on a microscope image of the observation area generated by any method. Determining the information on the size of the light emitting particle using the characteristic of the signal of the same light emitting particle obtained by the process of generating the plotted image and / or the movement of the plurality of light detection areas for each observation small area
  • the characteristic of the light emitting particle signal used to determine the information on the size of the light emitting particle may be included, for example, an index value representing the translational diffusion property of the light emitting particle or an index value representing the rotational diffusion property of the light emitting particle It may be.
  • the above method may also include the step of determining the number of luminescent particles in the region to be observed or the concentration of the luminescent particles in the liquid based on the number of luminescent particles detected.
  • the microscopic observation technique of the present invention described above is typically a particulate biological object such as a biomolecule, such as a protein, a peptide, a nucleic acid, a lipid, a sugar chain, an amino acid or an aggregate thereof, a virus, or a cell.
  • a biomolecule such as a protein, a peptide, a nucleic acid, a lipid, a sugar chain, an amino acid or an aggregate thereof, a virus, or a cell.
  • Non-biological particles eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.
  • the present invention by employing the technique of scanning molecular counting in observation and analysis with a scanning optical microscope, luminescent particles which are present and move inside a thick sample liquid are In comparison, it becomes possible to detect and observe individually with higher accuracy.
  • the distribution of the light emitting particles can be expressed as a two-dimensional or three-dimensional image, and more polygonal microscopy and Analysis is expected to acquire various information and findings that were not previously understood.
  • the presence distribution of luminescent particles can be observed superimposed on microscopic images of cells and organelles, the behavior of any particles in the interior of cells and organelles. Will be used advantageously in experiments such as observing
  • FIG. 1 (A) is a schematic view of the internal structure of an optical microscope apparatus employing a scanning molecule counting method according to the present invention.
  • FIG. 1 (B) is a schematic view of a confocal volume (a region to be observed by a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic view of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection area in the sample (cell).
  • FIG. 1D is a schematic view of a mechanism for moving the position of the light detection area in the sample (cell) by moving the horizontal position of the microplate.
  • FIGS. 4A and 4B are a schematic diagram for explaining the principle of light detection in the scanning molecule counting method to which the present invention is applied, and a schematic diagram of a time change of measured light intensity, respectively.
  • FIG. 3A is a schematic plan view of an observation target area ObR and an observation small area OsR set in the field of view of the microscope.
  • FIG. 3B is a schematic perspective view of a three-dimensional observation target area and a small observation area.
  • FIG. 3C is a schematic perspective view for explaining the movement of the light detection area passing through the observation small area.
  • FIGS. 4A and 4B schematically show examples of the observation small area, the light detection area (upper stage), and the temporal change in light intensity (lower stage) when the observation small area is scanned by the light detection area.
  • FIG. 4A and 4B schematically show examples of the observation small area, the light detection area (upper stage), and the temporal change in light intensity (lower stage) when the observation small area is scanned by the light detection area.
  • FIG. 4C is a schematic plan view showing the positional relationship between the observation small area and the light detection area for explaining the principle of specifying the position (coordinates) of the light emitting particles in the observation small area, and the time change of the light intensity.
  • FIG. 5 is a flowchart representing the procedure for detecting luminescent particles in the microscopy method implemented according to the present invention.
  • 6 (A) and 6 (B) respectively show the case where the luminescent particle traverses the light detection region while performing Brownian movement, and the position of the light detection region in the sample liquid is faster than the diffusion movement speed of the luminescent particle.
  • It is a model figure showing the aspect of movement of particles when luminous particles cross a light detection area by moving.
  • FIG. 6C shows an example of a signal processing process of detection signals in a processing procedure for detecting the presence of luminescent particles from time-series light intensity data (time change of photon count) measured according to a scanning molecule counting method.
  • FIG. 7 shows a measurement example (bar graph) of measured photon count data, a curve (dotted line) obtained by smoothing the data, and a Gaussian function (solid line) fitted in the pulse presence region. In the figure, a signal attached as "noise" is ignored as being a signal due to noise or foreign matter.
  • FIG. 8 is a schematic view (A, D) of a small observation region in the case of detecting the position of light emitting particles according to the microscopy method according to the present invention, time series light intensity data (B, E) obtained, The example of the simulation result of integration data (C, F) is shown.
  • (A) to (C) are cases in which the light detection area is moved in the X direction
  • (D) to (F) are cases in which the light detection area is moved in the Y direction.
  • FIG. 9A is a view schematically showing an example of a scanning pattern by the raster scan method in a conventional laser scanning optical microscope
  • FIG. 9B is a diagram showing a microscope using evanescent light. It is a schematic diagram explaining the observation possible range.
  • a microscope device for realizing the microscope observation technique according to the present invention has a basic configuration in which a microscope observation by laser scanning can be performed as schematically illustrated in FIG. 1 (A). It may be an apparatus combining an optical system of a focusing microscope and a light detector. Referring to the figure, the microscope apparatus 1 includes optical systems 2 to 18 and a computer 20 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the microscope apparatus 1 may be similar to the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser beam (Ex) emitted from the light source 2 is collimated by the collimator 2a to form dichroic light The light is reflected by the mirror 5 and the reflection mirrors (galvano mirrors) 6 and 7 and is incident on the objective lens 8. Above the objective lens 8, typically, a microplate 9 in which a sample container or wells 10 are arrayed is arranged in which 1 to several tens of ⁇ L of sample (solution, cells, etc.) is dispensed. The laser light emitted from the lens 8 is focused in the sample liquid in the sample container or well 10 to form a region of high light intensity (excitation region).
  • the luminescent particle to be observed typically a particle to which a luminescent label such as a fluorescent particle or a fluorescent dye is added, enters the excitation region, the luminescent particle is excited during that time Is released.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is condensed by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter 14. (Here, only the light component of a specific wavelength band is selected.) After being introduced into the multimode fiber 15, reaching the light detector 18, and being converted into a time series electrical signal, the computer 20 is obtained.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate to the focal position of the objective lens 8, as a result, as shown in FIG. Only the light emitted from the focal region of the laser light as schematically shown, ie, from within the excitation region, passes through the pinhole 13 and the light from other than the excitation region is blocked.
  • the focal region of the laser light illustrated in FIG. 1B is a light detection region in the present microscope device having an effective volume of about 1 to 10 fL (typically, the light intensity is at the center of the region).
  • Gauss-like distribution with vertex at the effective volume is the volume of a substantially elliptical sphere bounded by a plane whose light intensity is 1 / e 2 of the central light intensity), which is called a confocal volume .
  • the light detector 18 is preferably an ultra-high light that can be used for photon counting. A sensitive light detector is used. When light is detected by photon counting, the measurement of the light intensity is performed in such a manner that the number of photons arriving at the light detector is measured for each measurement unit time (BIN TIME) sequentially over a predetermined time. To be executed.
  • the data of time-series light intensity is time-series photon count data.
  • a stage position changing device 19 for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on the stage (not shown) of the microscope in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changer 19 may be controlled by the computer 20.
  • a mechanism for scanning the inside of the sample liquid with the light detection area ie, moving the position of the focal area, ie, the light detection area in the sample solution
  • a mechanism for moving the position of the light detection area for example, as schematically illustrated in FIG. 1A, the reflecting mirrors 6 and 7 and the mirror deflectors 16 and 17 for changing the direction of them are exemplified.
  • a galvano mirror device a method of moving an absolute position of a light detection area. In this case, under the control of the computer 20, the orientations of the reflection mirrors 6 and 7 are changed as schematically illustrated in FIG.
  • the galvano mirror device may be structurally the same as that provided in a normal laser scanning microscope, but as will be described in detail later, the movement of the position of the light detection area, ie, The aspect of the scan is different from that of a conventional laser scanning microscope.
  • the horizontal position of the container 10 (microplate 9) into which the sample liquid is injected is moved, for example, into cells in the sample.
  • the stage position changer 19 may be operated to move the relative position of the light detection area (a method of moving the absolute position of the sample liquid).
  • a mechanism may be provided to move the position of the light detection area in the vertical direction.
  • a device for moving the objective lens 8 or the stage up and down may be employed.
  • the vertical movement of the position of the light detection area can also be achieved by converging light or diffusing light instead of collimating the light beam entering and exiting from the rear end of the objective lens. Therefore, a mechanism for moving the position of the light detection area in the vertical direction is configured by arranging an offset lens with a variable focal length and a focus variable deformable mirror (not shown) on the optical path at the rear end of the objective lens. It may be done.
  • the above optical system is used as a multi-photon microscope.
  • the pinhole 13 since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided, and the wavelength of excitation light may be appropriately selected depending on the excitation wavelength of light emitting particles.
  • a plurality of photodetectors 18 may be provided, and when a plurality of light emitting particles of different wavelengths are contained in the sample, light can be separately detected from those by the wavelength.
  • the computer 20 includes a CPU and a memory, and the CPU executes the various arithmetic processing to execute the procedure of the present invention.
  • Each procedure may be configured by hardware. All or part of the processes described in the present embodiment may be executed by the computer 20 using a computer readable storage medium storing a program for realizing the processes. That is, the computer 20 may realize the processing procedure of the present invention by reading a program stored in a storage medium and executing information processing / calculation processing.
  • the computer-readable recording medium may be a magnetic disk, a magneto-optical disk, a CD-ROM, a DVD-ROM, a semiconductor memory or the like, or the above program is distributed to a computer via a communication line. The distributed computer may execute the program.
  • the observation target area ObR in the field of view VF is (virtually) divided into a plurality of observation small areas OsR.
  • a plurality of scans by the light detection areas are performed in the areas (X1, Y1), (X2, Y1),.
  • the X direction is at least once each in at least one of the X direction S1 and the Y direction S2 with reference to at least two different directions, for example, FIGS. 3 (B) and 3 (C).
  • the position of the light detection area may be moved at least once each in S1 and Y directions S2 and Z directions (not shown), and measurement of light intensity from the light detection area may be performed.
  • the plurality of times of scanning moves the position of the light detection area in at least two times in one direction, for example, in the X direction S1 or the Y direction S2, and measurement of light intensity from the light detection area is performed May be done. Then, in the light intensity data from the light detection area obtained in time series in the scanning by the plurality of light detection areas described above, in the manner of the scanning molecule counting method briefly described above, Detection of the signal of the luminescent particle is performed.
  • the movement range of the position of the light detection area is arbitrary within the range in which the influence of the light aberration is acceptable, as in the case of the ordinary laser scanning confocal microscope apparatus.
  • the viewable range as in the case of a microscope apparatus using evanescent light.
  • the time required for scanning with a plurality of light detection areas in each observation small area is much shorter than the raster scanning method of a typical laser scanning confocal microscope apparatus, the light emission moving within the sample It will be possible to achieve more accurate detection and location of particles, for example luminescent particles moving in cells or in organelles.
  • the relationship between the size of the observation small area and the scanning speed is appropriately set. Since the scanning time of the observation small area can be set short and light of the same light emitting particle can be detected at substantially the same position, a significant integration effect is expected. Furthermore, since the detection of luminescent particles follows the principle of scanning molecule counting, statistical calculation processing such as calculation of fluctuation of fluorescence intensity is not performed, and FCS (fluorescence correlation spectroscopy), FIDA (fluorescence intensity distribution analysis), etc. Thus, even if the concentration of particles to be observed is low enough that analysis can not be performed with sufficient accuracy, detection of the presence of particles, and information on concentration or number density can be obtained.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • FIDA fluorescence intensity distribution analysis
  • the size of the observation small area is required for the light detection area to scan the observation small area As the time is determined, it is typically determined based on the size of the light detection area. In this regard, if the size of the observation small area is larger than the size of the light detection area, the entire area of the observation small area can not be covered by one passage of the observation small area by the light detection area. In the light detection area, it is necessary to pass the observation small area again including the part of the observation small area which is not initially included in the light detection area, and the scanning time is extended accordingly .
  • one side thereof is equal to the diameter 2 W of the light detection area as schematically depicted in FIGS. 3C and 4A to 4C. Is set.
  • the shape of the observation small area is preferably a cube, but it may be a rectangular solid long in the scanning direction of the light detection area (in particular, scanning is performed only in one direction) If).
  • the movement range of the light detection area with respect to each observation small area is the advancing direction Sd of the light detection area CV in one scanning as schematically illustrated in FIGS. 4A and 4B.
  • the total amount of light from the region included in the light detection region is measured as one data value, and the light intensity of the luminescent particle detected there is , Increase or decrease depending on the position of the luminescent particle in the light detection area.
  • the light intensity of the light emitting particles in the light detection area is the largest when the light emitting particles are located approximately at the center of the light detection area, and gradually decreases as the light emitting particles move to the edge of the light detection area.
  • the spread of the light intensity distribution of the light emitting particles in the light detection area corresponds to the size of the light detection area, and the numerical aperture of the objective lens, the excitation light incident beam diameter to the objective lens and the pinhole diameter According to the point spread function (PSF) determined from Therefore, when the light detection region passes the position where the light emitting particles are present, the light intensity of the light emitting particles changes like a bell-shaped pulse as described above with reference to FIG.
  • such a time change in pulsed light intensity is detected as a signal of a single luminescent particle. That is, also in the microscopic observation technique of the present invention, as shown in FIG. 4A, in order to detect the signal of one luminescent particle LP with high accuracy, one of the light detection regions is formed on the luminescent particle. Passing from the edge to the other edge makes it possible to obtain a bell-shaped pulse-like time-varying light intensity change LS (the width from one skirt to the other skirt is 2 W in the light detection area). Is preferred. On the other hand, as illustrated in FIG.
  • the movement range of the light detection area with respect to each observation small area is preferably as shown in FIG. 4B, with the leading edge and the trailing edge of the light detection area in the traveling direction It is a range that touches the side. That is, the movement distance of the light detection area is 4 W, which is twice the diameter of the light detection area with respect to one observation small area.
  • (Iii) Determination of Position of Light-Emitting Particle As described above, when the light-emitting particle detection process is performed for each small observation region, the position of the small observation region in the observation target region is known in advance at the time of setting. The position of the luminescent particle detected in each observation subregion is determined by the resolution of the size of the observation subregion. Furthermore, as described above, in the case where detection of the signal of the light-emitting particle in each observation small area is performed by detection of a bell-shaped pulse-like change in light intensity (signal of the light-emitting particle), On the time-series light intensity data, the position (time point) of the peak of the light-emitting particle signal is specified.
  • the position of the light emitting particle signal peak is detected.
  • the position of the luminescent particle in the observation small area can also be specified.
  • the light emission particle signal is detected on the time-series light intensity data when scanning of the light detection area is performed in the X direction.
  • the coordinate of the light emitting particle in the X direction is determined by the deviation ⁇ X of the position of the peak from the central position (or the position of the side) of the observation small area.
  • the center position (or side) of the observation small area is identified.
  • the coordinate of the light emitting particle in the Y direction is determined by the deviation ⁇ Y of the position of the peak).
  • the position of the light emitting particle in the observation target area is determined by the position coordinates of the observation small area and ⁇ X and ⁇ Y. (Although not shown, in the Z direction, the Z-direction coordinates of the light-emitting particles may be determined by the deviation ⁇ Z of the position of the peak from the specific position of the observation subregion.)
  • FIG. 5 shows processing in the present embodiment in the form of a flowchart.
  • the particles to be observed by the microscopic observation technique of the present invention may be any particles as long as they are particles present in any liquid, for example, proteins, peptides, nucleic acids, lipids It may be a biomolecule such as a sugar chain, an amino acid or an aggregate thereof, a virus, a cell, or a metal colloid, or any other non-biological molecule.
  • light emitting labels fluorescent molecules, phosphorescent molecules, chemical / bioluminescent molecules
  • the sample is typically, but not limited to, an aqueous solution, and may be an organic solvent or any other liquid.
  • particles to be observed may be particles that exist in cells or organelles and move (change in position) due to diffusion or other factors. That is, it may be a sample liquid used for microscopic observation of normal cells and organelles.
  • the measurement of light intensity is performed while moving the position of the light detection area in each observation small area in the observation target area.
  • the movement of the position of the light detection area is performed by driving the galvano mirror devices 16 and 17 or the stage position changing device 19.
  • operation processing typically, after injecting a sample into well 10 of microplate 9 and placing it on the stage of the microscope, the user inputs an instruction to start measurement to computer 20.
  • the computer 20 is a program stored in a storage device (not shown) (a procedure for moving the position of the light detection area in the sample, and light from the light detection area while the position of the light detection area is moved.
  • time-series light intensity data irradiation of excitation light and measurement of light intensity in a light detection region in a sample are started.
  • the galvano mirror device 16 or 17 or the stage position changing device 19 drives the galvano mirrors 6 and 7 or the microplate 9 on the stage of the microscope under the control of the processing operation according to the program of the computer 20,
  • the movement of the position of the light detection area is performed, and at the same time, the light detector 18 converts the sequentially detected light into an electrical signal and transmits it to the computer 20.
  • time-series light intensity data is generated and stored from the transmitted signal. Note that, typically, since the light detector 16 is an ultra-sensitive light detector that can detect the arrival of one photon, when light detection is by photon counting, the time-series light intensity data is time-series It may be photon count data.
  • the scanning within the region to be observed by the light detection region is performed for each of the observation regions as described above.
  • the movement of the light detection area is performed at least once in (a) X direction and Y direction, (b) at least once in (X) direction, Y direction and Z direction, for each observation small area.
  • movement of the light detection area may be similarly performed in the adjacent observation small area.
  • the speed of movement of the position of the light detection area during measurement of the light intensity may optionally be a predetermined speed set, for example, experimentally or for the purpose of analysis. Since it is easier to interpret the measurement results if the elapsed time during measurement and the movement distance of the position of the light detection area are in a proportional relationship, it is preferable that the movement speed is basically a constant speed. It is not limited to.
  • the moving speed of the position of the light detection area in order to perform the detection of the light emitting particles individually from the measured light intensity data of time series or the counting of the number of light emitting particles quantitatively and accurately
  • the moving speed is set to a value faster than the random movement of the luminescent particles, ie, the moving speed by the Brownian movement.
  • the particles to be observed by the microscope observation technique of the present invention are particles that can move in the liquid, so the position may move with time due to Brownian motion. Then, when the moving speed of the position of the light detection area is slower than the movement by the Brownian movement of the particles, the particles move randomly within the area as schematically illustrated in FIG. 6 (A).
  • the particles cross the light detection region in a substantially straight line, whereby the top row of FIG. 6 (C) is obtained in time series light intensity data.
  • the profile of change in light intensity corresponding to each light emitting particle becomes bell-shaped (when the light emitting particle passes the light detection region approximately linearly, the profile of change in light intensity is the excitation light
  • the moving speed of the position of the light detection area is the average moving speed by the Brownian movement of the particles (diffusion movement so that the correspondence between the individual light emitting particles and the light intensity can be easily identified). Set faster than speed).
  • the moving speed of the position of the light detection area may be set to 10 mm or more, for example, 15 mm / s.
  • the moving velocity of the position of the light detection region is set variously, and the profile of the change of the light intensity is expected profile (typically, excitation light intensity distribution
  • the preliminary experiment for finding the condition to be substantially the same as in the above may be repeatedly performed to determine the moving speed of the position of the suitable light detection area.
  • the size of the observation subregion is such that in the observation subregion, the (expected) travel distance of the light emitting particles to be detected in the time of moving the position of the light detection region is larger than the size of the observation subregion. It is preferable to be set to be small. However, as described above, one side of the observation small area is preferably set to be approximately equal to the diameter of the light detection area.
  • the scanning speed may be set such that the scanning time does not exceed the size of the observation small area by the movement distance of the luminescent particles due to diffusion.
  • v 8 8D ⁇ k / W (6)
  • the scanning speed is set such that
  • the light intensity value of the time-series light intensity data is used to generate the light emitting particle signal as follows. Detection, counting of luminescent particles, determination of the position of luminescent particles, and various other analyzes (such as concentration calculation) may be performed.
  • a signal whose light intensity does not exceed the threshold value Ith or whose time width ⁇ is not within a predetermined range is determined as a noise or foreign object signal.
  • the intensity A and the width a calculated by fitting the equation (7) to a profile of significant light intensity (profile which can be clearly judged not to be background) is within a predetermined range
  • the light intensity profile is determined to correspond to the passage of one particle through the light detection area, detection of one light emitting particle may be performed.
  • a signal whose intensity A and width a are outside the predetermined range may be determined as a noise or foreign object signal and may be ignored in subsequent analysis and the like.
  • smoothing is performed on light intensity data (FIG. 6C, topmost “detection result (unprocessed)”) )
  • Processing is performed (FIG. 5-step 110, upper middle “smoothing” in FIG. 6 (C)).
  • the light emitted from the light emitting particles is emitted stochastically, and a drop in data value may occur in a minute time, so that such a drop in the data value can be ignored by such a smoothing process.
  • the smoothing process may be performed, for example, by a moving average method until the loss of data values as described above can be ignored. Note that the parameters used when performing the smoothing process, for example, the number of data points averaged at one time in the moving average method, the number of moving averages, etc. It may be set appropriately according to speed) and BIN TIME.
  • the smoothing process is performed.
  • a first derivative of the time of the light intensity data is calculated (step 120).
  • time derivative value of the light intensity data is exemplified by “time derivative” in the lower part of FIG. 6C, since the change of the value at the change point of the signal value becomes large, the time derivative value is referred to By this, it is possible to advantageously determine the start and end points of the significant signal.
  • pulse signals are sequentially detected on the light intensity data (steps 130 to 160). Specifically, first, the time derivative value of light intensity data is sequentially referred to the time derivative value, and the start point and end point of one pulse signal are searched and determined, and the pulse presence area is specified. Step 130). Once one pulse presence area is specified, bell-shaped function fitting is performed on the smoothed light intensity data in the pulse presence area (FIG. 6 (C) lower “bell-shaped function fitting”) Parameters such as intensity Ipeak of pulse peak (maximum value) of bell-shaped function, pulse width (full width at half maximum) Wpeak, and correlation coefficient (of the least squares method) in fitting are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function. Then, whether or not the calculated parameter of the bell-shaped function is within the range assumed for the parameter of the bell-shaped profile drawn by the pulse signal detected when one light-emitting particle passes through the light detection region, That is, it is determined whether the peak intensity of the pulse, the pulse width, and the correlation coefficient are within predetermined ranges, respectively (step 150).
  • the signal determined that the parameter of the calculated bell-shaped function is within the range assumed in the signal corresponding to one luminescent particle is one luminescent particle. It is determined that the light emission particle corresponds to the light emission particle, whereby one light emitting particle is detected.
  • pulse signals whose calculated bell-shaped function parameters were not within the expected range are ignored as noise. It should be noted that counting of the number of signals, ie, counting of luminescent particles may be performed simultaneously with detection of the signal of luminescent particles.
  • the search and determination of pulse signals in the processing of the above steps 130 to 150 may be repeatedly performed over the entire area of the light intensity data of each observation subregion (step 160).
  • the processes of steps 130 to 150 may be performed on each of the time-series light intensity data.
  • the process which detects separately the signal of luminescent particle from light intensity data may be performed not only by said procedure but by arbitrary methods.
  • the light intensity values of the light emitting particle signals may be integrated, and the sum or average value thereof may be used as the light intensity value of the light emitting particle signal.
  • the process of extracting the signal of the same light emitting particle may be performed, for example, in the manner described in Patent Documents 6 to 7.
  • integration of data values along a scanning path may be performed prior to individual detection of light-emitting particle signals on time-series light detection data (step 105).
  • the light intensity value of the light emitting particle obtained in one scan is weak, the light intensity value of the light emitting particle is increased by integration of the data values, thereby An improvement in the accuracy of individual detection of signals is expected.
  • FIG. 8 is a diagram showing a simulation example of processing in the case of performing individual detection of the light emitting particle signal after integration of data values along the scanning path. In FIGS.
  • the light emitting particles LP with the diffusion constant D 1 ⁇ m 2 / sec perform Brownian motion in the 0.4 ⁇ m square observation small region OsR, respectively.
  • the light detection area CV is at a speed of 6.4 mm / sec (amplitude: 0.8 ⁇ m) in the X direction (S1 +, S1- in FIG. 8A) and in the Y direction (S2 +, S2- in FIG. 8D).
  • the upper part of FIG. 8 (B) and the upper part of FIG. 8 (E) are the photon count PC obtained in such scanning. It is an example. In the case of this example, since the number of times of scanning is five and the scanning time is 1.25 msec, the displacement due to diffusion is approximately 0.09 ⁇ m.
  • time-series photon count data PC light intensity data
  • the signal of the same luminescent particle LP will appear repeatedly.
  • the moving direction of the light detection area is reversed. Therefore, as shown in the lower part of FIG. 8B and the lower part of FIG. 8E in the lower part of FIG. Is executed. Thereafter, for the time-series photon count data in the lower part of FIG. 8B and the lower part of FIG.
  • the presence distribution image of the light emitting particles is obtained by superimposing the observation target region ObR on a microscope image obtained by another arbitrary microscope observation method (phase contrast microscopy, differential interference microscopy, epi-illumination fluorescence microscopy, etc.) It may be displayed on twenty displays. Specifically, a plot image obtained by plotting the positions of luminescent particles in a microscope image obtained by any microscopy may be generated.
  • the passing region of the light detection region is further determined by any method. If the total volume of is calculated, the concentration of luminescent particles in the sample can be determined from the volume value and the number of luminescent particles.
  • the total volume of the passing area of the light detection area may be determined, for example, as described in Patent Document 1.
  • the translational diffusion characteristics of the light emitting particles and the size of the light emitting particles are estimated using the generation time point of the light emitting particle signal detected in each observation small area. May be done. The specific process may be performed as described in Patent Document 6. Also, as in the example of FIG. 8, when light intensity integration is performed before detection of the light emitting particle signal, translational diffusion characteristics are estimated by referring to the integrated light emitting particle signal width d. (The larger the diffusion constant, the larger the displacement of the luminescent particles in the scanning time, and the width d of the integrated signal increases.)
  • polarization characteristics or rotational diffusion characteristics for example, polarization degree
  • the rotational diffusion properties are a function of the size of the luminescent particles, which makes it possible to estimate the size of the detected luminescent particles. Therefore, also in the microscope observation technique of the present invention, light from the light detection area is divided into a plurality of polarization components and detected, and the light emission detected in each observation small area using the intensities of those polarization components An estimation of the polarization or rotational diffusion properties of the particles and the size of the luminescent particles may be made. The specific process may be performed as described in Patent Document 7.
  • each characteristic value obtained in each observation small area is displayed as an image representing the concentration of light emitting particles, translational diffusion characteristic, polarization characteristic or rotational diffusion characteristic and / or distribution of size.
  • the characteristics of these light emitting particles may be displayed superimposed on a microscopic image of cells or organelles obtained by any other microscopic observation method. This makes it possible to grasp the characteristics of the luminescent particles present in the cell or organelle in a state where the position in the cell or organelle is specified.
  • a plurality of scans by the light detection area are performed for each observation small area in the observation target area, and individual detection of luminescent particles by the scanning molecule counting method is performed.
  • This enables the formation of an image representing the presence distribution of light-emitting particles whose position changes dynamically in a thick sample.

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Abstract

　走査分子計数法の手法を利用して、厚みのある試料中に於いて動的に位置が変化する発光体又は発光粒子の検出が可能な顕微鏡観察技術が提供される。本発明による光学顕微鏡観察技術に於いては、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて液体中にて運動する発光粒子（ＬＰ）からの光を検出し発光粒子（ＬＰ）を検出する。処理操作に於いて、顕微鏡の観察対象領域（ＯｂＲ）を複数に分割して得られる観察小領域（ＯｓＲ）毎に光検出領域（ＣＶ）の位置を移動させながら、前記光検出領域（ＣＶ）からの光を検出して、前記発光粒子（ＬＰ）からの光の信号を個別に検出し、検出信号に対応する発光粒子（ＬＰ）の観察対象領域（ＯｂＲ）内に於ける位置を決定する。また、前記観察小領域（ＯｓＲ）の各々に於ける前記光検出領域（ＣＶ）の位置の移動は、前記観察小領域（ＯｓＲ）毎に少なくとも二つの方向に連続して及び／又は同一方向に連続して複数回実行されてよい。

Description

単一発光粒子検出技術を用いた光学顕微鏡装置、顕微鏡観察法及び顕微鏡観察のためのコンピュータプログラム
　本発明は、液体中の原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子を検出し又は画像化する光学顕微鏡観察技術に係り、より詳細には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、単一の発光する粒子からの光を個別に検出する単一発光粒子検出技術を用いた光学顕微鏡装置、顕微鏡観察法及び顕微鏡観察のためのコンピュータプログラムに係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
　近年の光計測技術の発展により、蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定による光学顕微鏡観察及び顕微鏡像の画像化（二次元又は三次元に於ける像の位置の特定）が可能となっている。例えば、特許文献１等に於いて記載されている如く、レーザー走査型共焦点顕微鏡と超高感度の光検出器とから構成される顕微鏡装置によれば、試料内にて顕微鏡の光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）を、試料内を走査するように移動しながら、光検出領域からの光を検出することによって、試料内の状態が画像化される。かかる共焦点顕微鏡の光学系の場合、光検出領域の外から発せられる光は遮断され光検出器に到達しないので、蛍光一分子レベル又は一光子レベルの微弱光の検出・測定が可能であり、従って、そのような微弱光による画像化が可能となる。また、蛍光一分子レベルの微弱光による光学顕微鏡観察及び顕微鏡像の画像化の別の手法として、特許文献２等に於いて記載されている如く、エバネッセント光を用いた顕微鏡装置も提案されている。かかるエバネッセント光を用いた顕微鏡装置の場合には、カバーガラスの表面付近の～１００ｎｍ程度の薄い領域にのみ励起光が与えられ、その薄い領域以外からの光放出がなくなることから、顕微鏡像に於ける背景光が大幅に低減され、これにより、蛍光一分子レベル又は一光子レベルの微弱光による像が得られることとなる。
　ところで、本願出願人は、特許文献３～８等に於いて、液体中に分散又は溶解した発光粒子の検出を可能にする新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）を提案した。この走査分子計数法では、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、光検出領域の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。
特開２００５－０１７６４２ 特開２００６－１６２９９４ 国際公開第２０１１／１０８３６９ 国際公開第２０１１／１０８３７０ 国際公開第２０１１／１０８３７１ 国際公開第２０１２／０５００１１ 国際公開第２０１２／０５３３５５ 国際公開第２０１３／０３１４３９
　上記のレーザー走査型共焦点顕微鏡装置の場合、典型的には、ラスタスキャン方式によって、観察対象領域を二次元又は三次元的に走査し、検出された光強度値を観察対象領域内の位置情報と関連させて、顕微鏡像が構成される。ラスタスキャン方式の場合、通常、観察対象領域内にて光検出領域を或る一方の方向に於いて往復動させながら、光検出領域の往復動の経路が他方の方向に変位させられて、観察対象領域内の画像が形成される。そして、検出される光強度が微弱である場合には、同じ領域の走査を繰り返し、光強度の積算が実行される。かかる構成の場合、観察対象領域の走査に要する時間に於いて、観察対象領域内で実質的に静止している発光体又は発光粒子の画像は、明瞭に形成されるが、拡散や輸送など動的な状態にある発光体又は発光粒子については、複数回に亘る観察対象領域の走査の間に発光体又は発光粒子の位置が移動してしまい、有効な積算効果が得られないこととなる。一方、エバネッセント光を用いた顕微鏡装置の場合は、観察対象領域がカバーガラスの表面に限定されてしまうので、厚みのある試料中の発光体又は発光粒子の像を画像化することは困難である。
　ところで、既に触れた如く、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、光検出領域を液体中で移動しながら、発光粒子の存在を検出する走査分子計数法の手法によれば、厚みのある試料中に於いて動的に位置が変化する発光体又は発光粒子からの微弱光を検出することが可能である。従って、顕微鏡観察による画像化に於いて、走査分子計数法の手法を利用すれば、厚みのある試料中に於いて動的に位置が変化する発光体又は発光粒子の画像の形成が達成できそうである。
　かくして、本発明の主な課題は、走査分子計数法の手法を利用して、厚みのある試料中に於いて動的に位置が変化する発光体又は発光粒子の画像の形成が可能な顕微鏡装置、顕微鏡観察法及びそのためのコンピュータプログラムを提供することである。
　本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料液体中の発光粒子からの光を検出して発光粒子を検出する光学顕微鏡装置であって、顕微鏡の視野内に於ける観察対象領域を複数に分割して得られる観察小領域毎に該観察小領域内にて光検出領域の位置を連続して複数回移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、観察小領域の各々に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出し、検出された信号に対応する発光粒子の各々の観察対象領域内に於ける位置を決定する信号処理部とを含む装置によって達成される。
　上記の構成に於いて、「試料液体中にて運動する発光粒子」とは、任意の液体中、例えば、細胞内若しくは細胞小器官内にて運動可能な状態にある原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であってよい。発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。）。「観察対象領域」とは、顕微鏡の視野の内の、本装置に於いて画像化される二次元又は三次元の領域であり、「観察小領域」は、「観察対象領域」を仮想的に格子状に又はグリッド状に分割して得られる複数の領域の各々である。また、光検出部は、所定の計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出する形式の光検出器を用いた構成であってよく、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。
　上記から理解される如く、本発明の基本的な構成に於いては、レーザー走査型の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の如く、試料液体中に於いて「光検出領域」（コンフォーカル・ボリューム）の位置が所定の二次元又は三次元空間内にて移動され、即ち、試料液体内の二次元又は三次元空間（「観察対象領域」）が光検出領域によって走査され、これにより、「観察対象領域」から発せられる光が検出される。しかしながら、本発明の場合には、特に、光検出領域による観察対象領域内の走査の態様と検出された光の信号処理の態様とが通常と異なる。即ち、本発明に於いては、光検出領域による走査が、「観察対象領域」を仮想的に格子状に又はグリッド状に分割して得られる「観察小領域」毎に連続して複数回実行され、移動する光検出領域が液体中の発光粒子を包含したときに発光粒子からの光が検出される（走査分子計数法の光計測）。そして、かくして得られた検出光の時系列光強度データの処理に於いて、「観察小領域」毎に、発光粒子からの光の信号の有無を検出する態様にて、その領域内に存在する発光粒子の個別の検出が行われ（走査分子計数法の発光粒子の個別の検出）、発光粒子が存在している場合には、観察対象領域内での位置の決定が為される。即ち、本発明の構成に於いては、顕微鏡観察の際に、観察小領域毎に走査分子計数法の原理を適用し、観察小領域毎に発光粒子の存在が検出されることとなる。
　かかる構成によれば、観察小領域の寸法が観察対象領域の寸法よりも十分に小さいので、個々の発光粒子からの微弱な光を個別に且つ有意に検出して個々の発光粒子の位置の特定を可能とする走査速度での各観察小領域の走査に要する時間は短くなる。即ち、或る一つの発光粒子の検出にかかる走査時間が短くなるので、発光粒子の位置が時間と共に変化する場合であっても、その位置が大きく変化する前にその発光粒子からの光を有意に複数回検出することを、より確実に達成できることとなる。また、本発明の構成に於いては、試料液体中での光検出領域の位置は、（エバネッセント光による顕微鏡観察法とは異なり、）試料容器の表面付近に限定されないので、厚みのある試料液体中の内部に於いて試料容器の表面付近から離れた場所にて運動する発光粒子であってもその存在の検出及び位置の特定が可能である。理解されるべきことは、本発明の構成に於いては、検出された発光粒子の位置が決定されるので、観察対象領域内の発光粒子の存在位置を二次元又は三次元の画像として表現できるという点である。なお、特定される発光粒子の位置に関して、まず、観察対象領域内に於ける観察小領域の位置が発光粒子の位置として特定可能である。また、或いは、更に、発光粒子の検出の実施の態様によっては、後の実施形態の欄に説明されている如く、観察小領域内での発光粒子の位置が特定可能である。
　上記の構成に於いて、観察小領域の各々に於ける光検出領域の位置の連続した複数回の移動、即ち、光検出領域よる各観察小領域の複数回の走査は、一つの態様に於いて、観察小領域毎に少なくとも二つの方向に連続して実行されてよい。例えば、一つの観察小領域に於けるＸ方向の走査及びＹ方向の走査が連続して実行されるか、或いは、Ｘ方向の走査、Ｙ方向の走査及びＺ方向の走査が連続して実行されてよい。この場合、後の実施形態の欄にて詳細に説明される如く、一つの観察小領域内に於ける発光粒子のＸ方向及びＹ方向の位置又はＸ方向、Ｙ方向及びＺ方向の位置が決定できることとなる。また、光検出領域よる各観察小領域の複数回の走査は、同一の方向に連続して実行されてもよい。この場合、観察小領域内に発光粒子が存在するときには、その光の積算が可能となり、或いは、複数回の走査時に於ける位置のずれから、発光粒子の移動特性又は並進拡散特性についての情報を得ることが可能となる。ここで、理解されるべきことは、複数回の走査は、寸法の小さい観察小領域毎に実行されることから、その走査時間に於いて同一の発光粒子が走査中の観察小領域から逸脱する可能性が低くなり、従って、同一の発光粒子の光を複数回の走査に亘って検出できる可能性が高くなる（同一の発光粒子の光の複数回の走査に亘る検出の成立率が高くなる）ということである。
　上記の観察小領域の寸法は、光検出領域が観察小領域を走査するのに要する時間を決定するので、具体的には、光検出領域の寸法に基づいて決定されてよい。この点に関し、上記に触れた如く、光検出領域による複数回の走査の間に同一の発光粒子の光をより確実に捉えるためには、光検出領域による走査時間中に、同一の発光粒子が逸脱しないように、観察小領域の寸法を調整しておくことが好ましい。従って、好適には、観察小領域に於いて光検出領域の位置を移動させる時間内に於ける検出されるべき発光粒子の（予想される）移動距離が観察小領域の寸法よりも小さくなるように観察小領域の寸法が設定される。
　また、観察小領域内にて光検出領域が或る一方向に移動する際、一回の移動で光検出領域が観察小領域全域を網羅できている方が走査時間の短縮となる。従って、観察小領域の一辺の長さは、光検出領域の直径に略等しくなるよう設定されていることが好ましい。この点に関し、後の実施形態の欄に於いて詳細に説明される如く、走査分子計数法による発光粒子の検出に於いては、典型的には、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過した際に、釣鐘型のプロファイルを有するパルス状の光強度の時間変化が発光粒子から光の信号として捉えられる。かかる釣鐘型のプロファイルは、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度が、光検出領域内に於ける発光粒子の位置によって変化し、その光の強度分布が、発光粒子の位置が光検出領域内の略中心から周縁に向かって移動するにつれて光の強度が低減する釣鐘型の分布であることに起因する。従って、観察小領域内に存在する発光粒子から光の信号をより確実に捉えるためには、検出光から生成される時系列の光強度データに於いて発光粒子からの光の信号の釣鐘型のプロファイルが現れていることが好ましい。一方、発光粒子は、観察小領域の中心からずれた位置に存在し得る。即ち、観察小領域の中心からずれた位置に存在する発光粒子も含めて観察小領域の全域に存在する全ての発光粒子について、それらの信号の釣鐘型のプロファイルを捉えるためには、観察小領域の全域に光検出領域の縁部分を通過させることが必要となる。そのためには、光検出領域の進行方向の前縁及び後縁が観察小領域の、光検出領域の進行方向の両辺（又は両面）を通過することが好ましいこととなる。従って、上記の本発明に於いては、更に、観察小領域の各々に於ける光検出領域の位置の一回の移動は、光検出領域のその進行方向の前縁が観察小領域の一方の縁を通過し、光検出領域のその進行方向の後縁が観察小領域の他方の縁に到達するまで実行されることが好ましい。なお、かかる光検出領域の位置の一回の移動の態様は、好適には、走査が実行される全ての方向（Ｘ、Ｙ、Ｚ）に於いて適用される。かかる構成によれば、発光粒子の信号の釣鐘型のプロファイルの解析から観察小領域内に存在する発光粒子の観察小領域内での位置の決定も可能となる（後述の実施形態の欄参照）。
　上記の構成に於いて、光検出領域による走査の際のその位置の移動速度は、観測対象となる発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、検出される光量が低減するので、検出光量が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。この点に関し、更に好適には、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。既に触れた如く、「走査分子計数法」の手法を採用した本発明の観察技術に於いては、光検出領域が発光粒子を包含したときにその発光粒子からの光を検出して、その発光粒子の存在を検出するところ、発光粒子がブラウン運動によりランダムに移動して、（一回の走査に於いて）光検出領域を複数回出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、その存在を表す信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度は、発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定され、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）信号に対応させられることとなる。なお、拡散移動速度は、発光粒子の特性によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であることが好ましい。
　光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける相対的な位置を移動するようになっていてよい。対物レンズの光軸方向の移動は、対物レンズの高さ方向位置又はステージの高さ方向位置を調節するか、対物レンズの後端から入出するビーム光を（平行光とするのではなく）収斂光又は拡散光にする機構により達成可能である。
　ところで、上記の本発明の顕微鏡観察技術に於いては、走査分子計数法の発光粒子の個別検出の手法が採用されているところ、走査分子計数法に於いては、その光の特性や光の信号の発生時刻等を任意の手法にて検出できるようにすることにより、かかる発光粒子の状態又は特性に関する情報、特に、発光粒子の大きさに関する情報を取得することが可能である（特許文献６－７）。従って、上記の本発明に於いて、信号処理部が観察小領域毎の複数回の光検出領域の移動によって得られた同一の発光粒子の信号の特性を用いて発光粒子の大きさに関する情報を決定するよう構成されていてよい。かかる発光粒子の信号の特性としては、具体的には、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値又は発光粒子の回転拡散特性を表す指標値であってよい。なお、かかる構成に於いて、本発明の場合、観察対象領域内に於いて発光粒子の位置が決定された状態にて、或いは、画像として発光粒子の位置が表現された状態にて、個々の発光粒子の大きさに関する情報が得られるということは、理解されるべきである。
　また、既に述べた如く、本発明にて検出された発光粒子に於いては、観察対象領域内に於けるその位置が決定され、画像として表現可能である。従って、発光粒子の位置を任意の手法にて生成された観察対象領域の顕微鏡画像（例えば、透過光像や落射蛍光像など）に重畳して表現することが可能である。従って、本発明の装置に於いて、観察対象領域内に於ける位置の決定された発光粒子の位置を、任意の手法にて生成された観察対象領域の顕微鏡画像に於いて、プロットして得られるプロット画像が生成されるようになっていてよい。かかる構成によれば、発光粒子の位置を、観察対象領域の別の手法による顕微鏡画像、例えば、細胞や細胞小器官の顕微鏡画像と重ね合わせて観察できる点で有利である。また、その際、発光粒子の大きさやその他の特性が検出可能な場合には、細胞や細胞小器官の顕微鏡画像と重ね合わせて発光粒子の特性を参照可能とすることにより、更に様々な情報が得られることが期待される。
　更にまた、「走査分子計数法」によれば、信号の数を計数して光検出領域に包含された発光粒子の数を計数し（粒子のカウンティング）、或いは、発光粒子の濃度に関する情報を得ることが可能である。従って、本発明に於ける信号処理部は、検出された発光粒子の数に基づいて、観察対象領域中の発光粒子の数又は液体中の発光粒子の濃度を決定するよう構成されていてよい。かかる構成に於いても、発光粒子の濃度が観察対象領域の別の手法による顕微鏡画像と合わせて観察可能である点は有利である。
　上記の本発明の装置による走査分子計数法の手法を採用した顕微鏡観察技術の処理は、汎用のコンピュータを用いても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料液体中の発光粒子からの光を検出して発光粒子を検出するための光学顕微鏡観察用コンピュータプログラムであって、顕微鏡の視野内に於ける観察対象領域を複数に分割して得られる観察小領域毎に該観察小領域内にて光検出領域の位置を連続して複数回移動する手順と、光検出領域からの光を検出する手順と、観察小領域の各々に於いて光検出領域の位置を移動させながら検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出し、検出された信号に対応する発光粒子の各々の前記観察対象領域内に於ける位置を決定する手順とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。
　かかるコンピュータプログラムに於いても、観察小領域の各々に於ける光検出領域の位置の移動は、観察小領域毎に少なくとも二つの方向に連続して及び／又は同一の方向に連続して複数回実行されてよい。観察小領域の寸法は、光検出領域の寸法に基づいて決定されてよく、好適には、観察小領域に於いて光検出領域の位置を移動させる時間内に於ける検出されるべき発光粒子の移動距離が観察小領域の寸法よりも小さくなるように、観察小領域の寸法が設定されてよい。また、実施の態様に於いては、観察小領域の一辺の長さが光検出領域の直径に略等しくなるよう設定され、観察小領域の各々に於ける光検出領域の位置の一回の移動が、光検出領域のその進行方向の前縁が観察小領域の一方の縁を通過し、光検出領域のその進行方向の後縁が観察小領域の他方の縁に到達するまで実行されてよい。なお、好適には、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。
　更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、観察対象領域内に於ける位置の決定された発光粒子の位置を、任意の手法にて生成された観察対象領域の顕微鏡画像に於いて、プロットして得られるプロット画像を生成する手順及び／又は観察小領域毎の複数回の光検出領域の移動によって得られた同一の発光粒子の信号の特性を用いて発光粒子の大きさに関する情報を決定する手順が含まれていてよく、発光粒子の大きさに関する情報の決定に用いられる発光粒子の信号の特性は、例えば、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値又は前記発光粒子の回転拡散特性を表す指標値であってよい。また、上記のコンピュータプログラムは、検出された発光粒子の数に基づいて、観察対象領域中の発光粒子の数又は液体中の発光粒子の濃度を決定する手順を含んでいてよい。
　また更に、上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、走査分子計数法の手法を採用した新規な顕微鏡観察方法が実現される。従って、本発明の更にもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料液体中の発光粒子からの光を検出して発光粒子を検出する光学顕微鏡観察方法であって、顕微鏡の視野内に於ける観察対象領域を複数に分割して得られる観察小領域毎に該観察小領域内にて光検出領域の位置を連続して複数回移動する過程と、光検出領域からの光を検出する過程と、観察小領域の各々に於いて光検出領域の位置を移動させながら検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出し、検出された信号に対応する発光粒子の各々の観察対象領域内に於ける位置を決定する過程とを含む方法が提供される。
　かかる方法に於いても、観察小領域の各々に於ける光検出領域の位置の移動は、観察小領域毎に少なくとも二つの方向に連続して及び／又は同一の方向に連続して複数回実行されてよい。観察小領域の寸法は、光検出領域の寸法に基づいて決定されてよく、好適には、観察小領域に於いて光検出領域の位置を移動させる時間内に於ける検出されるべき発光粒子の移動距離が観察小領域の寸法よりも小さくなるように、観察小領域の寸法が設定されてよい。また、実施の態様に於いては、観察小領域の一辺の長さが光検出領域の直径に略等しくなるよう設定され、観察小領域の各々に於ける光検出領域の位置の一回の移動が、光検出領域のその進行方向の前縁が観察小領域の一方の縁を通過し、光検出領域のその進行方向の後縁が観察小領域の他方の縁に到達するまで実行されてよい。なお、好適には、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。
　更に、上記の方法に於いても、観察対象領域内に於ける位置の決定された発光粒子の位置を、任意の手法にて生成された観察対象領域の顕微鏡画像に於いて、プロットして得られるプロット画像を生成する過程及び／又は観察小領域毎の複数回の光検出領域の移動によって得られた同一の発光粒子の信号の特性を用いて発光粒子の大きさに関する情報を決定する過程が含まれていてよく、発光粒子の大きさに関する情報の決定に用いられる発光粒子の信号の特性は、例えば、発光粒子の並進拡散特性を表す指標値又は前記発光粒子の回転拡散特性を表す指標値であってよい。また、上記の方法は、検出された発光粒子の数に基づいて、観察対象領域中の発光粒子の数又は液体中の発光粒子の濃度を決定する過程を含んでいてよい。
　上記の本発明の顕微鏡観察技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の液体中、例えば、細胞内又は細胞小器官内、での状態の観察、分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の任意の液体中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　かくして、本発明によれば、走査型光学顕微鏡による観察及び解析に於いて、走査分子計数法の手法を採用することによって、厚みのある試料液体の内部に存在し運動する発光粒子を、従前に比して、より精度良く個別に検出し観察することが可能となる。特に、本発明の構成によれば、検出された発光粒子の位置が特定できることから、発光粒子の分布を二次元又は三次元の画像として表現することが可能であり、より多角的な顕微鏡観察及び解析により、従前では把握されなかった種々の情報や知見の取得が期待される。特に、本発明の構成に於いては、発光粒子の存在分布を細胞や細胞小器官の顕微鏡画像に重畳して観察可能であるので、細胞や細胞小器官の内部に於ける任意の粒子の振舞いを個別に観察するといった実験に有利に用いられるであろう。
　本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を採用した光学顕微鏡装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察対象領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料（細胞）内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料（細胞）内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。 図３（Ａ）は、顕微鏡の視野内に於いて設定される観察対象領域ＯｂＲと観察小領域ＯｓＲの模式的な平面図である。図３（Ｂ）は、三次元の観察対象領域と観察小領域の模式的な斜視図である。図３（Ｃ）は、観察小領域を通過する光検出領域の移動の態様を説明する模式的な斜視図である。 図４（Ａ）、（Ｂ）は、観察小領域を光検出領域にて走査した場合の観察小領域と光検出領域（上段）及び光強度の時間変化（下段）の例を模式的に表した図である。図４（Ｃ）は、観察小領域内の発光粒子の位置（座標）を特定する原理を説明する観察小領域と光検出領域の位置関係を示す模式的な平面図と、光強度の時間変化の例を模式的に表した図である。 図５は、本発明に従って実行される顕微鏡観察法に於ける発光粒子の検出処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 図６（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料液体内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図６（Ｃ）は、走査分子計数法に従って計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図７は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。 図８は、本発明による顕微鏡観察法に従って発光粒子の位置の検出を行う場合の観察小領域の模式図（Ａ、Ｄ）、得られる時系列光強度データ（Ｂ、Ｅ）、光強度データの積算データ（Ｃ、Ｆ）のシミュレーション結果の例を示している。（Ａ）～（Ｃ）は、光検出領域をＸ方向に移動した場合であり、（Ｄ）～（Ｆ）は、光検出領域をＹ方向に移動した場合である。 図９（Ａ）は、従来のレーザー走査型光学顕微鏡に於けるラスタスキャン方式による走査パターンの例を模式的に示した図であり、図９（Ｂ）は、エバネッセント光を用いた顕微鏡に於ける観察可能範囲を説明する模式図である。
１…共焦点顕微鏡装置
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７…ガルバノミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料容器）
１１…反射ミラー
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６、１７…ミラー偏向器
１８…光検出器
１９…ステージ位置変更装置
２０…コンピュータ
　以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
顕微鏡装置の構成
　本発明による顕微鏡観察技術を実現する顕微鏡装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、レーザー走査による顕微鏡観察が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、顕微鏡装置１は、光学系２～１８と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ２０とから構成される。顕微鏡装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されたレーザー光（Ｅｘ）が、コリメーター２ａによって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー（ガルバノミラー）６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料（溶液、細胞など）が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料液体中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料中に於いては、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１８に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ２０へ入力され、後に説明される態様にて、発光粒子の信号の検出、発光粒子の位置の決定、その他の光分析の処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本顕微鏡装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１８としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列光強度のデータは、時系列フォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１９が設けられていてよい。ステージ位置変更装置１９の作動は、コンピュータ２０により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の顕微鏡装置の光学系に於いては、試料液体内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ａ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー６、７とそれらの向きを変更するミラー偏向器１６、１７とを含むガルバノミラー装置であってよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。この場合、コンピュータ２０の制御の下、反射ミラー６、７の向きが、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く変更されて光検出領域の位置が移動し、これにより、例えば、細胞内を光検出領域にて走査することが可能となる。なお、ガルバノミラー装置は、構造的には、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているものと同様であってよいが、後に詳細に説明される如く、光検出領域の位置の移動、即ち、走査の態様が通常のレーザー走査型顕微鏡の場合とは異なる。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料液体が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、例えば、試料中の細胞内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１９が作動されてもよい（試料液体の絶対的な位置を移動する方式）。ステージ位置変更装置１９の位置の駆動は、コンピュータ２０の制御により実行される。更に、図示していないが、試料液体に於いて、光検出領域の位置を上下方向に移動させる機構が設けられていてよい。そのような機構としては、具体的には、対物レンズ８又はステージを上下に移動する装置が採用されてよい。また、光検出領域の位置の上下方向の移動は、対物レンズの後端から入出するビーム光を平行光とするのではなく、収斂光又は拡散光にすることによっても、達成可能である。そこで、対物レンズの後端の光路上に、焦点距離が可変のオフセットレンズや焦点可変デフォーマブルミラー（図示せず）を配置することにより、光検出領域の位置を上下方向に移動させる機構が構成されてもよい。
　観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、顕微鏡装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１８も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。また、図示していないが、特許文献７の如く、発光粒子の偏光特性検出のために検出光の偏光成分を分離して光を検出できるように偏光ビームスプリッターが光路上に設けられていてもよい。
　コンピュータ２０は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ２０により実行されてよい。即ち、コンピュータ２０は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。
本発明の顕微鏡観察技術の原理
　「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の顕微鏡観察技術に於いては、端的に述べれば、走査型光学顕微鏡観察に於いて、観察対象領域を複数の観察小領域に分割し、観察小領域毎に走査分子計数法の要領にて観察小領域を複数回走査し、発光粒子の有無及びその位置を決定する。そして、観察対象領域内での発光粒子の位置が決定されることから、発光粒子の存在分布が画像として表現される（画像化される）こととなる。以下、走査分子計数法と本発明の顕微鏡観察技術の原理について説明する。
１.走査分子計数法の原理
　「走査分子計数法」（特許文献３～８）では、基本的には、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０～ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度変化）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、蛍光相関分光分析（ＦＣＳ）、蛍光強度分布分析（ＦＩＤＡ）等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。時系列光強度データから発光粒子の信号を検出する具体的な手法の例は、後述される。
２．本発明の顕微鏡観察技術の原理
（ｉ）概要
　「発明の概要」の欄にて触れた如く、通常のレーザー走査型共焦点顕微鏡装置の場合、観察対象領域ＯｂＲに於ける光検出領域ＣＶの走査は、典型的には、ラスタスキャン方式であり、図９（Ａ）に模式的に描かれている如く、光検出領域ＣＶの位置は、観察対象領域ＯｂＲ全体に亘って順次移動されていく。観察対象領域、即ち、走査領域の位置は、光の収差の影響が許容される範囲で、視野ＶＦ内の任意の位置、光軸方向の高さに設定することが可能である。そして、検出される光強度が微弱である場合など、光強度の積算を行うときには、光検出領域ＣＶが同じ走査経路に沿って繰り返し移動される。しかしながら、この構成の場合、最初の走査に於いて検出された発光粒子の位置が二回目以降の走査時に移動してしまうと、有意な光強度の積算の効果は得られないこととなる。一方、エバネッセント光を用いた顕微鏡装置の場合、微小な光検出領域ＣＶによる走査により光を検出するのではなく、一度に視野又は観察対象領域内の像をカメラ等の光検出器に撮り込むことが可能であり、その場合、カメラ等の光検出器に於いて、連続的に光強度又は光量の積算が可能であるので、位置の変化する発光粒子の像の場合でも有意な光強度の積算の効果が得られる。しかしながら、エバネッセント光を用いた顕微鏡装置の場合、図９（Ｂ）に模式的に描かれている如く、試料に於いて観察可能な範囲は、エバネッセント光の届くカバーガラス表面近傍に限定されてしまう。
　そこで、本発明に於いては、位置の変化する発光粒子を、より広範な範囲にて検出可能とするために、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域の位置が移動する形式の走査型光学顕微鏡装置の構成に於いて、図３（Ａ）又は（Ｂ）に模式的に描かれている如く、視野ＶＦ内の観察対象領域ＯｂＲが複数の観察小領域ＯｓＲに（仮想的に）分割され、観察小領域毎に、例えば、図３（Ｂ）の如く、領域（Ｘ１，Ｙ１）、（Ｘ２，Ｙ１）…のそれぞれに於いて、複数回の光検出領域による走査が実行される。かかる複数回の走査に於いては、互いに異なる少なくとも二つの方向、例えば、図３（Ｂ）、（Ｃ）を参照して、Ｘ方向Ｓ１とＹ方向Ｓ２とにそれぞれ少なくとも一回ずつ、Ｘ方向Ｓ１とＹ方向Ｓ２とＺ方向（図示せず）にそれぞれ少なくとも一回ずつ、光検出領域の位置を移動し、その間の光検出領域からの光強度の計測が実行されてよい。また、かかる複数回の走査は、一つの方向に、例えば、Ｘ方向Ｓ１又はＹ方向Ｓ２に少なくとも２回ずつ光検出領域の位置を移動し、その間の光検出領域からの光強度の計測が実行されてよい。そして、上記の複数回の光検出領域による走査に於いて時系列に得られた光検出領域からの光の強度データに於いて、先に簡単に説明された走査分子計数法の要領にて、発光粒子の信号の検出が行われる。
　上記の本発明による顕微鏡観察技術に於いては、光検出領域の位置の移動範囲は、通常のレーザー走査型共焦点顕微鏡装置の場合と同様に、光の収差の影響が許容される範囲で任意に設定可能であるので、エバネッセント光を用いた顕微鏡装置の場合のような観察可能範囲に於ける制約はない。また、各観察小領域に於ける複数回の光検出領域による走査に要する時間は、通常のレーザー走査型共焦点顕微鏡装置のラスタスキャン方式に比して大幅に短いので、試料内で運動する発光粒子、例えば、細胞内又は細胞小器官内で運動する発光粒子の検出と位置をより精度よく達成できることとなる。特に、発光粒子の放出光が微弱でありそれを有意に検出するために光強度の積算が有効となる場合には、観察小領域の寸法と走査速度との関係を適宜設定することにより、各観察小領域の走査時間を短く設定し、同一の発光粒子の光を略同一の位置にて検出することを可能にすることができるので、有意な積算効果が期待される。更に、発光粒子の検出は、走査分子計数法の原理に従うので、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、ＦＣＳ（蛍光相関分光分析）、ＦＩＤＡ（蛍光強度分布分析）等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料でも、粒子の存在の検出、濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
（ii）観察小領域の寸法と光検出領域の移動範囲の設定
　「発明の概要」の欄にて触れた如く、観察小領域の寸法は、光検出領域が観察小領域を走査するのに要する時間を決定するので、典型的には、光検出領域の寸法に基づいて決定される。この点に関し、もし光検出領域の寸法よりも観察小領域の寸法が大きい場合には、光検出領域による観察小領域の一回の通過で観察小領域の全域が網羅できないこととなり、その場合、光検出領域に、観察小領域のうち、最初に光検出領域に含まれなかった部分を含めて、再度、観察小領域を通過させる必要が生じ、その分、走査時間が延長されることとなる。従って、観察小領域の寸法について、好適には、図３（Ｃ）及び図４（Ａ）～（Ｃ）に模式的に描かれている如く、その一辺が光検出領域の直径２Ｗと等しくなるよう設定される。なお、観察小領域の形状は、好適には、立方体であるが、光検出領域の走査方向に長い直方体であってもよいことは理解されるべきである（特に、一方向にしか走査をしない場合）。
　また、各観察小領域に対する光検出領域の移動範囲は、図４（Ａ）、（Ｂ）に模式的に描かれている如く、一回の走査に於いて、光検出領域ＣＶの進行方向Ｓｄの前縁が観察小領域ＯｓＲの外側からその一辺に接した状態から、光検出領域ＣＶの後縁が観察小領域ＯｓＲの外側からその反対側の辺に接した状態までに設定されるのが好ましい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による計測に於いては、光検出領域に含まれる領域からの光の総量が一つのデータ値として計測されるところ、そこに於いて検出される発光粒子の光強度は、光検出領域内に於ける発光粒子の位置によって増減する。即ち、通常、光検出領域内に於ける発光粒子の光強度は、発光粒子が光検出領域の略中央に位置するときに最も大きく、発光粒子が光検出領域の縁へ移動するにつれて漸減する。かかる光検出領域内に於ける発光粒子の光強度の分布の広がりは、光検出領域の大きさに対応しており、対物レンズの開口数、対物レンズへの励起光入射ビーム径及びピンホール径などから決定される点像分布関数（ＰＳＦ）に従う。従って、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過する際には、図２に関連して既に説明されている如く、発光粒子の光強度は、釣鐘型のパルス状に変化することとなる。走査分子計数法では、かかるパルス状の光強度の時間変化を単一の発光粒子の信号として検出する。即ち、本発明の顕微鏡観察技術に於いても、図４（Ａ）に描かれている如く、一つの発光粒子ＬＰの信号を精度よく検出するためには、発光粒子に光検出領域の一方の縁から他方の縁まで通過させて、釣鐘型のパルス状の光強度の時間変化ＬＳ（一方の裾から他方の裾まで幅は、光検出領域の直径２Ｗとなる。）が得られるようにすることが好ましい。一方、図４（Ｂ）に描かれている如く、観察小領域ＯｓＲの周辺に存在する発光粒子α、βの場合には、図示の如く、光検出領域ＣＶを、その一方の縁が観察小領域ＯｓＲの一辺に接した状態（左側の状態）から、その他方の縁が観察小領域ＯｓＲの他方の一辺に接した状態（右側の状態）まで移動させることにより、それぞれ、釣鐘型のパルス状の光強度の時間変化α、βが検出できることとなる。従って、上記の如く、各観察小領域に対する光検出領域の移動範囲は、好適に、図４（Ｂ）の如く、光検出領域の進行方向の前縁及び後縁がそれぞれ外側から観察小領域の辺に接する範囲となる。即ち、光検出領域の移動距離は、一つの観察小領域に対して光検出領域の直径の２倍の４Ｗとなる。
（iii）発光粒子の位置の決定
　上記の如く、観察小領域毎に発光粒子の検出処理を実行した場合、観察対象領域内での観察小領域の位置は、その設定時に予め分かっているので、各観察小領域内に於いて検出された発光粒子の位置は、観察小領域の寸法の分解能で決定されることとなる。また、更に、既に述べた如く、各観察小領域内に於いて発光粒子の信号の検出を、釣鐘型のパルス状の光強度の時間変化（発光粒子の信号）の検出によって行う場合には、時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号のピークの位置（時点）が特定される。かかる発光粒子の信号のピークの位置に於いて、発光粒子が光検出領域の、進行方向に垂直な方向の中心軸線上に存在することとなるので、発光粒子の信号のピークの位置を検出することによって、観察小領域内に於ける発光粒子の位置も特定できることとなる。具体的には、図４（Ｃ）に模式的に描かれている如く、光検出領域の走査がＸ方向に実行されている際の時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号のピークの位置を特定すると、観察小領域の中心位置（又は辺の位置であってもよい。）からピークの位置のずれΔＸによって、発光粒子のＸ方向の座標が決定される。同様に、光検出領域の走査がＹ方向に実行されている際の時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号のピークの位置を特定すると、観察小領域の中心位置（又は辺の位置であってもよい。）からピークの位置のずれΔＹによって、発光粒子のＹ方向の座標が決定される。そして、観察対象領域内での発光粒子の位置は、観察小領域の位置座標とΔＸ、ΔＹとによって決定されることとなる。（図示はしていないが、Ｚ方向に於いても同様に、観察小領域の特定の位置からピークの位置のずれΔＺによって、発光粒子のＺ方向の座標が決定されてよい。）
顕微鏡観察の処理操作過程
　図１（Ａ）に例示の顕微鏡装置１を用いた本発明に従った顕微鏡観察の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料の調製、（２）試料の光強度の測定処理、及び、（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図５は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
（１）試料の調製
　本発明の顕微鏡観察技術の観測対象物となる粒子は、任意の液体中に存在する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。また、観測対象物となる粒子は、細胞や細胞小器官の中に存在し拡散又はその他の要因で運動する（位置の変化する）粒子であってよい。即ち、通常の細胞や細胞小器官の顕微鏡観察に利用される試料液体であってよい。
（２）試料液体の光強度の測定（図５－ステップ１００）
　本実施形態の顕微鏡観察に於いては、上記の如く、観察対象領域内の各観察小領域に於いて光検出領域の位置を移動しながら、光強度の測定が実行される。光検出領域の位置の移動は、ガルバノミラー装置１６、１７又はステージ位置変更装置１９を駆動して為される。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ２０に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ２０は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、ガルバノミラー装置１６、１７又はステージ位置変更装置１９は、コンピュータ２０のプログラムに従った処理動作の制御下、ガルバノミラー６、７又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１８は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ２０へ送信し、コンピュータ２０では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光検出領域による観察対象領域内の走査は、既に述べた如く、観察小領域毎に実行される。具体的には、例えば、光検出領域の移動は、観察小領域毎に、（ａ）Ｘ方向及びＹ方向に少なくとも一回、（ｂ）Ｘ方向、Ｙ方向及びＺ方向に少なくとも一回、（ｃ）Ｘ方向（又はＹ方向）及びＺ方向に少なくとも一回、或いは、（ｄ）Ｘ方向、Ｙ方向又はＺ方向に少なくとも二回、実行されてよい。そして、一つの観察小領域についての走査が完了すると、隣接する観察小領域にて同様に光検出領域の移動が実行されてよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の顕微鏡観察技術の観測対象粒子は、液体中にて運動可能な粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する場合がある。そして、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図６（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図６（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図６（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが釣鐘型となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
　　（２Ｗ）２＝６Ｄ・Δｔ　　　…（１）
から、
　　Δｔ＝（２Ｗ）２／６Ｄ　　　…（２）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
　　Ｖdif＝２Ｗ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗ　　　…（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
　更に、各観察小領域に於いて、光検出領域の走査を複数回実行する場合、その走査時間内に於いて観察小領域内に存在する発光粒子が観察小領域から逸脱しないようにしなければ、有意な積算効果が得られず、また、後に説明される如く、走査時間内の位置の変化を利用した解析（拡散定数の検出など）を有効に実行できない。従って、観察小領域の寸法は、観察小領域に於いて光検出領域の位置を移動させる時間内に於ける検出されるべき発光粒子の（予想される）移動距離が観察小領域の寸法よりも小さくなるよう設定されることが好ましいこととなる。しかしながら、上記の如く、観察小領域の一辺は、好適には、光検出領域の直径に略等しく設定される。そこで、実際には、発光粒子の拡散による移動距離が観察小領域の寸法を越えない走査時間となるように走査速度が設定されてよい。具体的には、移動速度ｖにて一回の走査距離が４Ｗである経路をｋ回走査したときの光検出領域の走査時間ΔＴは、
　　　ΔＴ＝４Ｗ・ｋ／ｖ　　　…（４）
で与えられる。一方、走査時間ΔＴに於ける拡散による発光粒子の移動距離ｘは、式（１）と同様に、
　　　＜ｘ＞２＝２ＤΔＴ　　　…（５）
にて与えられる。ここで、ｘ２≦Ｗ２の条件が成立すべきであるので、結局、
　　　ｖ≧８Ｄ・ｋ／Ｗ　　　…（６）
が成立するように、走査速度が設定されることが好ましい。
（３）光強度の分析処理
　各観察小領域の走査によって時系列光強度データの生成が為されると、時系列光強度データの光強度値を用いて、下記の如く、発光粒子の信号の検出、発光粒子のカウンティング、発光粒子の位置の決定、その他の各種分析（濃度算出等）が実行されてよい。
（ｉ）発光粒子の信号の個別検出（図５－ステップ１１０～１６０）
　既に触れた如く、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図６（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度データ上での光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、光強度データ上で、適宜設定される閾値Ｉｔｈを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ｉｔｈを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
　　Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２）　　　…（７）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（７）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。一方、強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
　光強度データ上の信号の検出の処理の一つの例に於いては、まず、光強度データ（図６（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図５－ステップ１１０、図６（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、前記の如きデータ値の欠落を無視できるようになるまで、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ　ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。光強度データの時間微分値は、図６（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号が検出される（ステップ１３０～１６０）。具体的には、まず、光強度データの時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図６（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図７左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図７右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。なお、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。
　上記のステップ１３０～１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、各観察小領域の光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。互いに異なる成分の光を別々に検出し、複数の時系列光強度データが生成されている場合には、それぞれの時系列光強度データについて、ステップ１３０～１５０の処理が実行されてよい。なお、光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
（ii）同一発光粒子の信号の積算（図５－ステップ１７０）
　ところで、本実施形態の顕微鏡観察技術に於いては、各観察小領域に於いて、同一の方向に複数回の走査が実行されている場合には、時系列光検出データ上には、同一の発光粒子の信号が反復して出現していることが期待される。その場合、時系列光検出データ上のデータ値又は発光粒子の信号として検出された領域のデータ値を、走査経路に沿って、走査経路上の位置が互いに一致するように積算することにより、発光粒子の信号の精度の向上が期待される。かかる積算の具体的な態様の一つに於いては、上記の如く、各観察小領域に於いて、時系列光検出データ上に於ける発光粒子の信号を個別に検出した後、検出された発光粒子の信号の光強度値を積算し、その総和又は平均値等が発光粒子の信号の光強度値として用いられるようになっていてよい。かかる光強度値の積算の際に、同一の発光粒子の信号を抽出する処理は、例えば、特許文献６～７に記載されている要領にて実行されてよい。
　時系列光検出データの積算の別の態様としては、時系列光検出データ上に於ける発光粒子の信号の個別検出に先立って、走査経路に沿ったデータ値の積算が為されてよい（ステップ１０５）。この場合、特に、一回の走査に於いて得られた発光粒子の光強度値が微弱であるときに、データ値の積算によって、発光粒子の光強度値が増大し、これにより、発光粒子の信号の個別検出の精度の向上が期待される。図８は、走査経路に沿ったデータ値の積算の後に発光粒子の信号の個別検出を実行する場合の処理のシミュレーション例を示した図である。なお、図８（Ａ）、（Ｄ）は、それぞれ、拡散定数Ｄ＝１μｍ２／ｓｅｃの発光粒子ＬＰが０．４μｍ四方の観察小領域ＯｓＲ内にてブラウン運動している状態に於いて、Ｘ方向（図８（Ａ）中のＳ１＋、Ｓ１－）及びＹ方向（図８（Ｄ）中のＳ２＋、Ｓ２－）に光検出領域ＣＶを速度６．４ｍｍ／ｓｅｃにて（振幅０．８μｍ、周波数４ｋＨｚ）反復移動した場合の粒子の動きを模式的に表した図であり、図８（Ｂ）の上段、図８（Ｅ）の上段は、かかる走査に於いて得られるフォトンカウントＰＣの例である。この例の場合、走査回数が５回で走査時間は１．２５ｍ秒となるので、拡散による変位は、０．０９μｍ程度となる。
　図８を参照して、図８（Ｂ）上段、（Ｅ）上段から理解される如く、上記の如く、走査しながら光検出を実行すると、時系列フォトンカウントデータＰＣ（光強度データ）に於いては、同一の発光粒子ＬＰの信号が反復して出現することとなる。しかしながら、図示の例では、それぞれ、偶数回目の走査は、光検出領域の移動方向が逆向きとなる。そこで、データの積算の前には、光検出領域の移動方向が逆向きの期間に対応するデータ領域について、図８（Ｂ）下段、（Ｅ）下段に示されている如く、時間軸の反転が実行される。しかる後、図８（Ｂ）下段、（Ｅ）下段の時系列フォトンカウントデータについて、走査経路上の位置が一致するように、即ち、図８（Ｂ）下段、（Ｅ）下段中の各矢印に対応する領域が互いに重なるように、データ値の積算が実行される。そうすると、図８（Ｃ）、（Ｆ）に例示されている如く、発光粒子ＬＰの信号強度は増大するので、発光粒子の信号の個別検出の精度（信号とノイズを識別する精度）の向上が期待されることとなる。なお、各観察小領域の時系列フォトンカウントデータに於いて、発光粒子の信号検出の精度を向上するための具体的な処理は、特許文献８に記載されている要領にて実行されてよい。
（iii）発光粒子の位置の決定（図５－ステップ１８０）
　既に触れた如く、各観察小領域に於いて発光粒子の信号が検出されると、観察対象領域ＯｂＲ内の各観察小領域ＯｓＲの位置（座標）が既知であるので、観察小領域の寸法の分解能にて発光粒子の位置が決定される。更に、発光粒子の信号のピークの出現位置と観察小領域の特定の位置（中心又は縁など）との距離から発光粒子の位置（座標）がより詳細に決定できることとなる（図４（Ｃ）参照）。かくして、発光粒子の位置が決定されると、その情報を用いて、観察対象領域ＯｂＲ内に於ける発光粒子の存在分布を画像として表現することが可能となる。また、発光粒子の存在分布画像は、観察対象領域ＯｂＲを別の任意の顕微鏡観察法（位相差顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、落射蛍光顕微鏡法など）によって得られた顕微鏡像に重ね合わせてコンピュータ２０のディスプレイに表示されるようになっていてよい。具体的には、任意の顕微鏡観察法によって得られた顕微鏡像に於いて発光粒子の位置をプロットして得られるプロット画像が生成されるようになっていてよい。
（iv）発光粒子濃度の決定
　検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、更に、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料中の発光粒子の濃度が決定可能となる。光検出領域の通過した領域の総体積は、例えば、特許文献１に記載されている要領にて決定されてよい。
（ｖ）発光粒子の大きさの推定
　走査分子計数法に於いて、特許文献６に記載されている如く、同一の発光粒子の信号を複数回検出した場合には、それらの信号の発生時点（ピークの時点）を用いて走査周期に於ける発光粒子の変位が検出され、かかる変位から発光粒子の並進拡散特性（例えば、拡散定数）を見積もることができる。並進拡散特性は、発光粒子の大きさの関数であるから、これにより、検出された発光粒子の大きさの推定が可能となる。そこで、本発明の顕微鏡観察技術に於いても、各観察小領域内にて検出された発光粒子の信号の発生時点を用いて、発光粒子の並進拡散特性及び発光粒子の大きさの推定が為されてよい。具体的な処理は、特許文献６に記載されている要領にて実行されてよい。また、図８の例の如く、発光粒子の信号の検出の前に光強度の積算を行った場合には、積算された発光粒子の信号の幅ｄを参照することにより、並進拡散特性を見積もることが可能である（拡散定数が大きいほど、走査時間内での発光粒子の変位が大きくなり、積算信号の幅ｄは増大する。）。
　また、走査分子計数法に於いては、特許文献７に記載されている如く、検出光の偏光成分を別々に検出することにより、発光粒子の偏光特性又は回転拡散特性（例えば、偏光度）の計測が可能である。特に、回転拡散特性は、発光粒子の大きさの関数であるから、これにより、検出された発光粒子の大きさの推定が可能となる。そこで、本発明の顕微鏡観察技術に於いても、光検出領域からの光を複数の偏光成分に分けて検出し、それらの偏光成分の強度を用いて各観察小領域内にて検出された発光粒子の偏光特性又は回転拡散特性及び発光粒子の大きさの推定が為されてよい。具体的な処理は、特許文献７に記載されている要領にて実行されてよい。
　上記の如く、発光粒子の濃度、並進拡散特性、偏光特性又は回転拡散特性及び／又は大きさが見積もられた場合、それらの値は、発光粒子の存在分布を表す画像に関連して表示されるようになっていてよい。或いは、各観察小領域に於いて得られた各特性値を、発光粒子の濃度、並進拡散特性、偏光特性又は回転拡散特性及び／又は大きさの分布を表す画像として表示するようになっていてよい。また、これらの発光粒子の特性は、別の任意の顕微鏡観察法によって得られた細胞又は細胞小器官などの顕微鏡像に重畳して表示されるようになっていてよい。これにより、細胞又は細胞小器官内に存在する発光粒子の特性を細胞又は細胞小器官内の位置を特定した状態にて把握することが可能となる。
　かくして、上記の本発明の顕微鏡観察技術によれば、観察対象領域内の観察小領域毎に光検出領域による複数回の走査を実行し、走査分子計数法による発光粒子の個別検出を実行することによって、厚みのある試料中に於いて動的に位置が変化する発光粒子の存在分布を表す画像の形成が可能となる。かかる特徴によれば、特に、細胞内又は細胞小器官内に於ける発光粒子の存在位置を個別に検出することが可能となり、細胞又は細胞小器官等の研究等に有利に利用できることが期待される。

Claims (30)

  1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料液体中の発光粒子からの光を検出し発光粒子を検出する光学顕微鏡装置であって、
    　前記顕微鏡の視野内に於ける観察対象領域を複数に分割して得られる観察小領域毎に該観察小領域内にて前記光検出領域の位置を連続して複数回移動する光検出領域移動部と、
    　前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
    　前記観察小領域の各々に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて前記検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出し、前記検出された信号に対応する発光粒子の各々の前記観察対象領域内に於ける位置を決定する信号処理部と
    を含む装置。
  2. 　請求項１の装置であって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に少なくとも二つの方向に連続して実行される装置。
  3. 　請求項1又は２の装置であって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に同一の方向に連続して複数回実行される装置。
  4. 　請求項1乃至３のいずれかの装置であって、前記観察小領域の寸法が前記光検出領域の寸法に基づいて決定される装置。
  5. 　請求項1乃至４のいずれかの装置であって、前記観察小領域に於いて前記光検出領域の位置を移動させる時間内に於ける検出されるべき発光粒子の移動距離が前記観察小領域の寸法よりも小さくなるよう前記観察小領域の寸法が設定される装置。
  6. 　請求項１乃至５のいずれかの装置であって、前記観察小領域の一辺の長さが前記光検出領域の直径に略等しくなるよう設定され、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の一回の移動が、前記光検出領域のその進行方向の前縁が前記観察小領域の一方の縁を通過し、前記光検出領域のその進行方向の後縁が前記観察小領域の他方の縁に到達するまで実行される装置。
  7. 　請求項1乃至６のいずれかの装置であって、前記観察対象領域内に於ける位置の決定された前記発光粒子の位置を、任意の手法にて生成された前記観察対象領域の顕微鏡画像に於いて、プロットして得られるプロット画像を生成する装置。
  8. 　請求項１乃至７のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記観察小領域毎の前記複数回の前記光検出領域の移動によって得られた同一の発光粒子の信号の特性を用いて前記発光粒子の大きさに関する情報を決定する装置。
  9. 　請求項８の装置であって、前記発光粒子の大きさに関する情報の決定に用いられる前記発光粒子の信号の特性が、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値又は前記発光粒子の回転拡散特性を表す指標値である装置。
  10. 　請求項１乃至９のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記観察対象領域中の前記発光粒子の数又は前記液体中の発光粒子の濃度を決定する装置。
  11. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料液体中の発光粒子からの光を検出し発光粒子を検出する光学的顕微鏡観察方法であって、
    　前記顕微鏡の視野内に於ける観察対象領域を複数に分割して得られる観察小領域毎に該観察小領域内にて前記光検出領域の位置を連続して複数回移動する過程と、
    　前記光検出領域からの光を検出する過程と、
    　前記観察小領域の各々に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出し、前記検出された信号に対応する発光粒子の各々の前記観察対象領域内に於ける位置を決定する過程と
    を含む方法。
  12. 　請求項１１の方法であって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に少なくとも二つの方向に連続して実行される方法。
  13. 　請求項１１又は１２の方法であって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に同一の方向に連続して複数回実行される方法。
  14. 　請求項１１乃至１３のいずれかの方法であって、前記観察小領域の寸法が前記光検出領域の寸法に基づいて決定される方法。
  15. 　請求項１１乃至１４のいずれかの方法であって、前記観察小領域に於いて前記光検出領域の位置を移動させる時間内に於ける検出されるべき発光粒子の移動距離が前記観察小領域の寸法よりも小さくなるよう前記観察小領域の寸法が設定される方法。
  16. 　請求項１１乃至１５のいずれかの方法であって、前記観察小領域の一辺の長さが前記光検出領域の直径に略等しくなるよう設定され、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の一回の移動が、前記光検出領域のその進行方向の前縁が前記観察小領域の一方の縁を通過し、前記光検出領域のその進行方向の後縁が前記観察小領域の他方の縁に到達するまで実行される方法。
  17. 　請求項１１乃至１６のいずれかの方法であって、更に、前記観察対象領域内に於ける位置の決定された前記発光粒子の位置を、任意の手法にて生成された前記観察対象領域の顕微鏡画像に於いて、プロットして得られるプロット画像を生成する過程を含む方法。
  18. 　請求項１３及び請求項１３を引用する請求項１４乃至１７のいずれかの方法であって、更に、前記観察小領域毎の前記複数回の前記光検出領域の移動によって得られた同一の発光粒子の信号の特性を用いて前記発光粒子の大きさに関する情報を決定する過程を含む方法。
  19. 　請求項１８の方法であって、前記発光粒子の大きさに関する情報の決定に用いられる前記発光粒子の信号の特性が、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値又は前記発光粒子の回転拡散特性を表す指標値である方法。
  20. 　請求項１１乃至１９のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記観察対象領域中の前記発光粒子の数又は前記液体中の発光粒子の濃度を決定する過程を含む方法。
  21. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料液体中の発光粒子からの光を検出し発光粒子を検出するための光学顕微鏡観察用コンピュータプログラムであって、
    　前記顕微鏡の視野内に於ける観察対象領域を複数に分割して得られる観察小領域毎に該観察小領域内にて前記光検出領域の位置を連続して複数回移動する手順と、
    　前記光検出領域からの光を検出する手順と、
    　前記観察小領域の各々に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの光を表す信号の特徴を有する信号を個別に検出し、前記検出された信号に対応する発光粒子の各々の前記観察対象領域内に於ける位置を決定する手順と
    をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
  22. 　請求項２１のコンピュータプログラムであって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に少なくとも二つの方向に連続して実行されるコンピュータプログラム。
  23. 　請求項２１又は２２のコンピュータプログラムであって、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の移動が前記観察小領域毎に同一の方向に連続して複数回実行されるコンピュータプログラム。
  24. 　請求項２１乃至２３のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記観察小領域の寸法が前記光検出領域の寸法に基づいて決定されるコンピュータプログラム。
  25. 　請求項２１乃至２４のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記観察小領域に於いて前記光検出領域の位置を移動させる時間内に於ける検出されるべき発光粒子の移動距離が前記観察小領域の寸法よりも小さくなるよう前記観察小領域の寸法が設定されるコンピュータプログラム。
  26. 　請求項２１乃至２５のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記観察小領域の一辺の長さが前記光検出領域の直径に略等しくなるよう設定され、前記観察小領域の各々に於ける前記光検出領域の位置の一回の移動が、前記光検出領域のその進行方向の前縁が前記観察小領域の一方の縁を通過し、前記光検出領域のその進行方向の後縁が前記観察小領域の他方の縁に到達するまで実行されるコンピュータプログラム。
  27. 　請求項２１乃至２６のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記観察対象領域内に於ける位置の決定された前記発光粒子の位置を、任意の手法にて生成された前記観察対象領域の顕微鏡画像に於いて、プロットして得られるプロット画像を生成する手順を含むコンピュータプログラム。
  28. 　請求項２３及び請求項２３を引用する請求項２４乃至２７のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記観察小領域毎の前記複数回の前記光検出領域の移動によって得られた同一の発光粒子の信号の特性を用いて前記発光粒子の大きさに関する情報を決定する手順を含むコンピュータプログラム。
  29. 　請求項２８のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の大きさに関する情報の決定に用いられる前記発光粒子の信号の特性が、前記発光粒子の並進拡散特性を表す指標値又は前記発光粒子の回転拡散特性を表す指標値であるコンピュータプログラム。
  30. 　請求項２１乃至２９のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記観察対象領域中の前記発光粒子の数又は前記液体中の発光粒子の濃度を決定する手順を含むコンピュータプログラム。
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