JP7739535B1 - 信号処理方法、信号処理装置、及び信号処理システム - Google Patents

Abstract

【課題】フローサイトメトリーにおいてデータのばらつきを簡易な計算で精度よく評価すること。
【解決手段】データ処理装置１２は、光電子増倍管１１ａ～１１ｄの出力を処理し、プロセッサを備える信号処理装置であって、プロセッサは、複数の試験サンプルを対象としたフローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を検出した光電子増倍管１１ａ～１１ｄの出力した強度信号を時系列に取得し、時系列の強度信号のデジタル値ＤＮを基に、強度信号の強度の度数分布を集計してヒストグラムを生成し、ヒストグラムを指数関数を用いてフィッティングさせることにより、度数分布における各ピークのばらつきを表すρ値を計算し、複数の対象サンプルを対象にフローサイトメトリーによって得られた光電子増倍管１１ａ～１１ｄの出力した強度信号を対象にして、ρ値を用いてデータ解析を実行するように構成されている。
【選択図】図３

Description

実施形態の一側面は、信号処理方法、信号処理装置、及び信号処理システムに関する。

従来から、細胞等の試料を対象にレーザ光を利用して計数、選別、及び特性解析する技術としてフローサイトメトリーが知られている。例えば、下記特許文献１には、光源に対して軸方向に配置され、前方散乱成分を感知する第１のセンサと、第１のセンサに対してある角度に置かれ、側方散乱成分及び／又は蛍光成分を感知する第２のセンサとを具備するフローサイトメトリーシステムが開示されている。また、下記非特許文献１には、ＤＮＡ染色試料を用いた細胞周期解析に、蛍光信号のヒストグラムに対してガウス分布を用いてフィッティングを行う技術が開示されている。

特表２０１３－５０４０５１号公報

James V. Watson, et al., "APragmatic Approach to the Analysis of DNA Histograms", Cytometry 8:l-8 (1987)

上述したような従来のフローサイトメトリーにおいては、センサの出力する強度信号値を解析する際には、強度信号値のばらつきにおいて様々な影響因子が存在するために解析のための計算が複雑になりがちである。その結果、強度信号値のばらつきの評価の計算時間が長くなる傾向にあった。一方で、従来のフィッティング技術によれば、強度信号値の分布を適切に評価できない場合がある。

そこで、実施形態の一側面は、かかる課題に鑑みてなされたものであり、フローサイトメトリーにおいてデータのばらつきを簡易な計算で精度よく評価することが可能な信号処理方法、信号処理装置、及び信号処理システムを提供することを課題とする。

実施形態の第一の側面に係る信号処理方法は、フローサイトメータを構成する光検出器の出力を処理する信号処理方法であって、複数の試験サンプルを対象としたフローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を検出した光検出器の出力電流信号を時系列に取得し、時系列の電流信号の値を基に、電流信号の強度の度数分布を集計してヒストグラムを生成し、ヒストグラムを指数関数を用いてフィッティングさせることにより、度数分布における各ピークのばらつきを表すρ値を計算し、複数の対象サンプルを対象にフローサイトメトリーによって得られた光検出器の出力電流信号を対象にして、ρ値を用いてデータ解析を実行する。

あるいは、実施形態の第二の側面に係る信号処理装置は、フローサイトメータを構成する光検出器の出力を処理し、プロセッサを備える信号処理装置であって、プロセッサは、複数の試験サンプルを対象としたフローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を検出した光検出器の出力電流信号を時系列に取得し、時系列の電流信号の値を基に、電流信号の強度の度数分布を集計してヒストグラムを生成し、ヒストグラムを指数関数を用いてフィッティングさせることにより、度数分布における各ピークのばらつきを表すρ値を計算し、複数の対象サンプルを対象にフローサイトメトリーによって得られた光検出器の出力電流信号を対象にして、ρ値を用いてデータ解析を実行するように構成されている。

あるいは、実施形態の第三の側面に係る信号処理システムは、上述した信号処理装置と、光検出器と、信号光を光検出器に導く光学系と、を備える。

上記第一の側面、上記第二の側面、あるいは上記第三の側面によれば、複数の試験サンプルを対象にした際にフローサイトメータの光検出器が出力する電流信号の値を時系列に集計してヒストグラムが生成され、そのヒストグラムが指数関数によってフィッティングされることで、度数分布の各ピークのばらつきを表すρ値が計算され、対象サンプルを対象にした際にフローサイトメータの光検出器が出力する電流信号を対象に、ρ値を用いてデータ解析が実行される。これにより、光検出器の出力値のデータのばらつきを、簡易な計算で精度よく評価することができる。その結果、データ解析の計算コストを低減でき、データ解析の精度も維持できる。

上記第一の側面及び上記第二の側面においては、指数関数は、強度に対応する変数ｘに対して、所定の変数ｘの範囲で指数関数的に上昇し、所定の変数ｘの範囲以外の範囲では零となる関数である、ことが好適である。この場合、光検出器の出力値のデータのばらつきを、より精度よく評価することができる。

また、上記第一の側面及び上記第二の側面においては、指数関数は、式（１）；

［上記式中、Ａは分布の範囲上限、Ｂは分布の範囲下限を定めるパラメータであり、τは分布の時定数を定めるパラメータであり、ｕはステップ関数である。］
で表される関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）である、ことが好適である。この場合、光検出器の出力値のデータのばらつきを、より精度よく評価することができる。

また、上記第一の側面においては、指数関数をフィッティングさせる際には、度数分布における１つのピークの範囲を定めることによりパラメータＡとパラメータＢを決定した後に、関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）を１つのピークにフィッティングさせることによりパラメータτを決定する、ことも好適である。また、上記第二の側面においては、プロセッサは、指数関数をフィッティングさせる際には、度数分布における１つのピークの範囲を定めることによりパラメータＡとパラメータＢを決定した後に、関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）を１つのピークにフィッティングさせることによりパラメータτを決定する、ことも好適である。この場合、光検出器の出力する電流信号の値を基としたヒストグラムに対して指数関数を用いてフィッティングさせる際に、パラメータＡ，Ｂとパラメータτを順番に決定することによって、安定してフィッティングされた指数関数を求めることができる。その結果、度数分布のピークに合ったρ値を安定して計算することができる。

また、上記第一の側面においては、ヒストグラムの各ピークを指数関数でフィッティングした後に、指数関数のピークの幅を近似する複数の近似式から選択して計算することにより、各ピークのρ値を計算する、ことも好適である。また、上記第二の側面においては、プロセッサは、ヒストグラムの各ピークを指数関数でフィッティングした後に、指数関数のピークの幅を近似する複数の近似式から選択して計算することにより、各ピークのρ値を計算する、ことも好適である。この場合、指数関数のピークの幅を近似するために好適な近似式を選択してその幅を計算することができるので、度数分布に含まれる複数のピークに合ったρ値を、簡易な計算で精度よく評価することができる。

また、上記第一の側面においては、ヒストグラムの各ピークを関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）でフィッティングした後に、関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）のピークの幅を近似する複数の近似式から、１つの近似式をパラメータＡ及びパラメータτに応じて選択して計算することにより、各ピークのρ値を計算する、ことも好適である。また、上記第二の側面においては、プロセッサは、ヒストグラムの各ピークを関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）でフィッティングした後に、関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）のピークの幅を近似する複数の近似式から、１つの近似式をパラメータＡ及びパラメータτに応じて選択して計算することにより、各ピークのρ値を計算する、ことも好適である。この場合、指数関数のピークの幅を近似するために好適な近似式を、フィッティングで決定した２つのパラメータＡ，τに応じて選択して、その幅を計算することができるので、度数分布に含まれる複数のピークに合ったρ値を、簡易な計算で精度よく評価することができる。

また、上記第一の側面あるいは上記第二の側面においては、複数の近似式は、式（２）～（４）で表される近似式を含む、

ことも好適である。この場合、指数関数のピークの幅を近似するために好適な近似式を、フィッティングで決定した２つのパラメータＡ，τに応じて、式（２）～（４）の中から選択して、その幅を計算することができるので、度数分布に含まれる複数のピークに合ったρ値を、簡易な計算で精度よく評価することができる。

また、上記第一の側面あるいは上記第二の側面においては、データ解析は、解析対象の集団の境界を画定するゲーティング処理を含む、ことも好適である。この場合、ゲーティング処理の計算コストを低減でき、ゲーティング処理の精度も維持できる。

実施形態の信号処理方法は、［１］「フローサイトメータを構成する光検出器の出力を処理する信号処理方法であって、複数の試験サンプルを対象とした前記フローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を検出した前記光検出器の出力電流信号を時系列に取得し、時系列の前記電流信号の値を基に、前記電流信号の強度の度数分布を集計してヒストグラムを生成し、前記ヒストグラムを指数関数を用いてフィッティングさせることにより、前記度数分布における各ピークのばらつきを表すρ値を計算し、複数の対象サンプルを対象にフローサイトメトリーによって得られた前記光検出器の出力電流信号を対象にして、前記ρ値を用いてデータ解析を実行する、信号処理方法」である。

実施形態の信号処理方法は、［２］「前記指数関数は、前記強度に対応する変数ｘに対して、所定の変数ｘの範囲で指数関数的に上昇し、前記所定の変数ｘの範囲以外の範囲では零となる関数である、上記［１］に記載の信号処理方法」であってもよい。

実施形態の信号処理方法は、［３］「前記指数関数は、式（１）で表される関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）である、上記［２］に記載の信号処理方法」であってもよい。

実施形態の信号処理方法は、［４］「前記指数関数をフィッティングさせる際には、前記度数分布における１つのピークの範囲を定めることによりパラメータＡとパラメータＢを決定した後に、前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）を前記１つのピークにフィッティングさせることによりパラメータτを決定する、上記［３］に記載の信号処理方法」であってもよい。

実施形態の信号処理方法は、［５］「前記ヒストグラムの各ピークを前記指数関数でフィッティングした後に、前記指数関数のピークの幅を近似する複数の近似式から選択して計算することにより、各ピークの前記ρ値を計算する、上記［１］～［４］のいずれかに記載の信号処理方法」であってもよい。

実施形態の信号処理方法は、［６］「前記ヒストグラムの各ピークを前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）でフィッティングした後に、前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）のピークの幅を近似する複数の近似式から、１つの近似式をパラメータＡ及びパラメータτに応じて選択して計算することにより、各ピークの前記ρ値を計算する、上記［３］又は［４］に記載の信号処理方法」であってもよい。

実施形態の信号処理方法は、［７］「前記複数の近似式は、式（２）～（４）で表される近似式を含む、上記［６］に記載の信号処理方法」であってもよい。

実施形態の信号処理方法は、［８］「前記データ解析は、解析対象の集団の境界を画定するゲーティング処理を含む、上記［１］～［７］のいずれかに記載の信号処理方法」であってもよい。

実施形態の信号処理装置は、［９］「フローサイトメータを構成する光検出器の出力を処理し、プロセッサを備える信号処理装置であって、前記プロセッサは、複数の試験サンプルを対象とした前記フローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を検出した前記光検出器の出力電流信号を時系列に取得し、時系列の前記電流信号の値を基に、前記電流信号の強度の度数分布を集計してヒストグラムを生成し、前記ヒストグラムを指数関数を用いてフィッティングさせることにより、前記度数分布における各ピークのばらつきを表すρ値を計算し、複数の対象サンプルを対象にフローサイトメトリーによって得られた前記光検出器の出力電流信号を対象にして、前記ρ値を用いてデータ解析を実行するように構成されている、信号処理装置」である。

実施形態の信号処理装置は、［１０］「前記指数関数は、前記強度に対応する変数ｘに対して、所定の変数ｘの範囲で指数関数的に上昇し、前記所定の変数ｘの範囲以外の範囲では零となる関数である、上記［９］に記載の信号処理装置」であってもよい。

実施形態の信号処理装置は、［１１］「前記指数関数は、式（１）で表される関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）である、上記［１０］に記載の信号処理装置」であってもよい。

実施形態の信号処理装置は、［１２］「前記指数関数をフィッティングさせる際には、前記度数分布における１つのピークの範囲を定めることによりパラメータＡとパラメータＢを決定した後に、前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）を前記１つのピークにフィッティングさせることによりパラメータτを決定する、上記［３］に記載の信号処理方法」であってもよい。

実施形態の信号処理装置は、［１３］「前記プロセッサは、前記ヒストグラムの各ピークを前記指数関数でフィッティングした後に、前記指数関数のピークの幅を近似する複数の近似式から選択して計算することにより、各ピークの前記ρ値を計算する、上記［９］～［１２］のいずれかに記載の信号処理装置」であってもよい。

実施形態の信号処理装置は、［１４］「前記プロセッサは、前記ヒストグラムの各ピークを前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）でフィッティングした後に、前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）のピークの幅を近似する複数の近似式から、１つの近似式をパラメータＡ及びパラメータτに応じて選択して計算することにより、各ピークの前記ρ値を計算する、上記［１１］又は［１２］に記載の信号処理装置」であってもよい。

実施形態の信号処理装置は、［１５］「前記複数の近似式は、式（２）～（４）で表される近似式を含む、上記［１４］に記載の信号処理装置」であってもよい。

実施形態の信号処理装置は、［１６］前記データ解析は、解析対象の集団の境界を画定するゲーティング処理を含む、上記［９］～［１５］のいずれかに記載の信号処理装置」であってもよい。

本発明のいずれかの側面によれば、複数の蛍光成分を対象とした出力信号のばらつきを精度よく評価することができる。

実施形態にかかるフローサイトメータであるフローサイトメータシステム１の概略構成図である。 図１のデータ処理装置１２のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。 データ処理装置１２の機能構成を示すブロック図である。 図３の計算部２０２によって生成されたヒストグラムの一例を示すグラフである。 図５は、計算部２０２が用いるフィッティング関数ｐ_single（ｘ）を表すグラフである。 式（５）で計算されるρ値と式（２）～（４）で計算されるρ値との誤差を表すグラフである。 図３の解析部２０３によるデータ解析において生成および出力されたドットプロットの例を示すグラフである。 図３の解析部２０３によるデータ解析において生成および出力されたドットプロットの例を示すグラフである。 実施形態に係る信号処理方法の手順を示すフローチャートである。 実施形態に係る信号処理方法の手順を示すフローチャートである。 式（５）で計算されるρ値と式（７）～（８）で計算されるρ値との誤差を表すグラフである。

以下、添付図面を参照して、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には、同一符号を用いることとし、重複する説明は省略する。

図１は、実施形態にかかるフローサイトメータ（信号処理システム）であるフローサイトメータシステム１の概略構成図である。フローサイトメータシステム１は、フローサイトメトリーを実施するためのシステムであり、流体システム２、光学システム（光学系）３、及び電子システム（信号処理装置）４によって構成される。

流体システム２は、細胞あるいは粒子等の分析対象物を含むサンプル流体が注入され、サンプル流体に含まれる分析対象物（対象サンプル）を細いチャネル５内に整列させて通過させることが可能なフローセル６を含んで構成される。このフローセル６には、ゲーティングされた分析対象物を電場制御等によってソーティング（分類および振り分け）する機能（図示せず）も設けられている。

光学システム３は、フローセル６内を通過する分析対象物をフローサイトメトリーにより光学的に分析するシステムである。この光学システム３は、レーザ光源７、レンズ８、フィルタ９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄ、ダイクロイックミラー１０ｂ，１０ｃ、光電子増倍管（光検出器）１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄを含んで構成され、フローサイトメトリーによって分析対象物から発生した各種の光を光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄに導光する。レーザ光源７は特定周波数で単一波長帯のレーザ光（励起光）を生成する光源装置であり、レンズ８はレーザ光源７から出射されたレーザ光をフローセル６内のチャネル５に集光する。フィルタ９ａは、レーザ光の照射によってサンプル流体から生じた前方散乱光を透過させる。ダイクロイックミラー１０ｂは、レーザ光の照射によってサンプル流体から生じた側方散乱光を反射し、サンプル流体から生じた蛍光を透過させる。ダイクロイックミラー１０ｃは、ダイクロイックミラー１０ｂを透過した蛍光のうちの第一の波長帯の蛍光を反射し、透過した蛍光のうちの残余の波長帯の蛍光を透過させる。フィルタ９ｂは、ダイクロイックミラー１０ｂによって反射された側方散乱光を透過させ、フィルタ９ｃは、ダイクロイックミラー１０ｃによって反射された第一の波長帯の第一の蛍光を透過させる。フィルタ９ｄは、ダイクロイックミラー１０ｃを透過した蛍光のうち第二の波長帯の第二の蛍光を透過させる。光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄは、それぞれ、前方散乱光、側方散乱光、第一の蛍光、及び第二の蛍光の光軸上に設けられ、前方散乱光、側方散乱光、第一の蛍光、及び第二の蛍光のそれぞれの強度を測定する。

電子システム４は、データ処理装置１２を含んで構成され、光学システム３によって測定された光の強度を解析するための装置である。具体的には、データ処理装置１２は、複数の光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄに電気的に接続され、複数の光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄの各チャネルで検出された強度を示す強度信号を基にヒストグラムあるいはドットプロット（サイトグラムともいう。）等を作成するデータ解析を実行するとともにゲーティング処理を実行する。また、データ処理装置１２は、ゲーティング処理を基に、サンプル流体に含まれる分析対象物を対象にソーティング（分類および振り分け）を実行する。

次に、図２および図３を参照して、データ処理装置１２の構成を説明する。図２は、データ処理装置１２のハードウェア構成の一例を示すブロック図であり、図３は、データ処理装置１２の機能構成を示すブロック図である。

図２に示すように、データ処理装置１２は、物理的には、プロセッサであるＣＰＵ（Central Processing Unit）１０１、記録媒体であるＲＡＭ（Random Access Memory）１０２又はＲＯＭ（Read Only Memory）１０３、通信モジュール１０４、及び入出力モジュール１０６等を含んだコンピュータ等であり、各々は電気的に接続されている。なお、データ処理装置１２は、入出力デバイスとして、ディスプレイ、キーボード、マウス、タッチパネルディスプレイ等を含んでいてもよいし、ハードディスクドライブ、半導体メモリ等のデータ記録装置を含んでいてもよい。また、データ処理装置１２は、複数のコンピュータによって構成されていてもよい。

図３に示すように、データ処理装置１２は、機能的な構成要素として、信号取得部２０１、計算部２０２、及び解析部２０３を備えている。図３に示すデータ処理装置１２の各機能部は、ＣＰＵ１０１及びＲＡＭ１０２等のハードウェア上にプログラムを読み込ませることにより、ＣＰＵ１０１の制御のもとで、通信モジュール１０４、及び入出力モジュール１０６等を動作させるとともに、ＲＡＭ１０２におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。データ処理装置１２のＣＰＵ１０１は、プログラムを実行することによって図３の各機能部を機能させ、後述する信号処理方法に対応する処理を順次実行する。なお、ＣＰＵ１０１は、単体のハードウェアでもよく、ソフトプロセッサのようにＦＰＧＡのようなプログラマブルロジックの中に実装されたものでもよい。ＲＡＭやＲＯＭについても単体のハードウェアでもよく、ＦＰＧＡのようなプログラマブルロジックの中に内蔵されたものでもよい。プログラムの実行に必要な各種データ、及び、プログラムの実行によって生成された各種データは、全て、ＲＯＭ１０３、ＲＡＭ１０２等の内蔵メモリ、又は、ハードディスクドライブなどの記録媒体に格納される。以下、データ処理装置１２の機能的な構成要素の機能について詳細に説明する。

信号取得部２０１は、複数の光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄの各チャネルから出力された強度信号（出力電流信号）を取得する。取得する強度信号は、それぞれの光電子増倍管において、フローサイトメトリーによって生じた前方散乱光、側方散乱光、あるいは、蛍光等の信号光に強度に応じた増倍電子による電流を検出することによって得られたアナログ信号である。信号取得部２０１は、取得した各チャネルの強度信号をデジタル値ＤＮに変換して計算部２０２に出力する。なお、信号取得部２０１のＡ／Ｄ変換の機能は、データ処理装置１２の外付けの回路部によって実現されてもよい。

計算部２０２は、サンプル流体に含まれる複数の試験サンプルをチャネル５内に整列させて通過させた際に信号取得部２０１から出力された各チャネルのデジタル値ＤＮを用いて、各チャネルに入射した光子（ホトン）の集団を規定するためのパラメータを計算する機能を有する。以下、計算部２０２によるパラメータ計算機能の詳細について説明する。

計算部２０２は、信号取得部２０１によって取得された１つのチャネルの時系列のデジタル値ＤＮを基に、強度信号の示す強度の度数分布を集計してヒストグラムを生成する。図４には、計算部２０２によって生成されたヒストグラムの一例を示す。このように計算部２０２によって生成されたヒストグラムにおいては、強度を示すデジタル値ＤＮごとの頻度の分布が表されており、光子の集団を示す複数のピークが現れている。

また、計算部２０２は、生成したヒストグラムに現れた複数のピークのうちのそれぞれのピークを対象に、指数関数であるフィッティング関数を用いてフィッティングする。このとき、計算部２０２は、下記式（１）で示されるフィッティング関数ｐ_single（ｘ）；

を用いてフィッティングする。ここで、上記式（１）中、ｘは強度に対応した変数を示し、Ａは分布の範囲上限、Ｂは分布の範囲下限を定める正のパラメータであり、τは分布の時定数を定める正のパラメータであり、ｕはステップ関数、すなわち、ｘ＜０の場合ｕ（ｘ）＝０となり、ｘ≧０の場合ｕ（ｘ）＝１となる関数を示す。このフィッティング関数ｐ_single（ｘ）は、変数ｘに対してＢ≦ｘ≦Ａの範囲で指数関数的に値が上昇し、その以外の範囲では零の値を持つ関数である。図５は、フィッティング関数ｐ_single（ｘ）を表すグラフである。フィッティング関数ｐ_single（ｘ）は、パラメータＡ，Ｂによってその分布のピークの幅が決まり、パラメータτによってピークの傾き度合いが決まる（τが大きければ緩やかになり、τが小さければ急峻になる。）。

具体的には、計算部２０２は、次のようにしてフィッティングを実行する。まず、計算部２０２は、ヒストグラムにおける１つのピークを選択し、そのピークの幅ＰＷ（図４参照）を決定する。幅ＰＷの決定は、度数分布を基に自動で実行されてもよいし、ディスプレイ等の出力デバイス上に表示された度数分布のグラフを基にしたユーザの入力を介して行われてもよい。次に、計算部２０２は、決定された幅ＰＷを利用してパラメータＡ及びパラメータＢをＰＷに対応した値に決定する。

その後、計算部２０２は、パラメータＡ，Ｂに決定された値が代入されたフィッティング関数ｐ_single（ｘ）を、ヒストグラムにおける上記１つのピークにフィッティングさせて、パラメータτの値を順次変更しながら、そのピークに近似するフィッティング関数ｐ_single（ｘ）を探索する。この際、計算部２０２は、フィッティング関数ｐ_single（ｘ）に対して範囲ＰＷ内のヒストグラムの積分値を掛ける事で、範囲ＰＷ内のヒストグラムと同じ面積でフィッティング関数ｐ_single（ｘ）を扱うことができる。そして、計算部２０２は、ピークに近似するフィッティング関数ｐ_single（ｘ）が探索できた時点のパラメータＡ，Ｂ，τと、フィッティングさせた際のフィッティング関数ｐ_single（ｘ）の強度軸上の位置を記憶する。

さらに、計算部２０２は、ヒストグラムにおける上記１つのピークを対象にしたフィッティング結果を用いて、そのピークのばらつき（幅）を表すρ値、及びそのピークにおける強度の平均値を計算する。ρ値は、ピークにおける平均値に対する標準偏差σの比率である。

本願発明者らは、ρ値の理論値を導出することにより、フィッティング関数ｐ_single（ｘ）によって表されるピークに関するρ値は、下記式（５）；

によって計算されることを見出した。また、本願発明者らは、上記式（５）で計算されるρ値は、下記式（２）～（４）によって表される近似式によっても近似可能であることを見出した。

図６は、上記式（５）で計算されるρ値と上記式（２）～（４）で計算されるρ値との誤差を表すグラフである。このグラフは、２つのパラメータＡ，τの比τ／Ａを変化させた場合の式（５）の値で規格化した各式（２）～（４）の値の変化を示している。本願発明者らにより、式（２）で計算される値は、τ／Ａ≦所定値ＴＨ１（＝０．４～０．６）の範囲で誤差が小さく、式（３）で計算される値は、τ／Ａ≦所定値ＴＨ２（＝０．２～０．３）の範囲で誤差が小さく、式（４）で計算される値は、τ／Ａ≦所定値ＴＨ３（＝０．１～０．２）の範囲で誤差が小さいことが明らかにされた。

上記性質を利用して、計算部２０２は、１つのピークを対象にしたフィッティング結果である２つのパラメータＡ，τの値を基に、τ／Ａ≦所定値ＴＨ３の場合には式（４）を選択して用いてρ値を計算する。一方、計算部２０２は、所定値ＴＨ３＜τ／Ａ≦所定値ＴＨ２の場合には式（３）を選択して用いてρ値を計算する。また、計算部２０２は、所定値ＴＨ２＜τ／Ａ≦所定値ＴＨ１の場合には式（２）を選択して用いてρ値を計算する。それ以外の場合には、計算部２０２は、式（５）を選択して用いてρ値を計算する。加えて、計算部２０２は、１つのピークを対象にしたフィッティング結果を用いて、そのピークにおける平均値（期待値）Ｅを、下記式（６）により計算し、その平均値Ｅにフィッティング時のフィッティング関数ｐ_single（ｘ）の強度軸上の位置を反映することによって、ピークにおける強度の平均値を計算する。

さらに、計算部２０２は、ヒストグラムにおける複数のピークを対象にフィッティングを繰り返し実行し、各ピークに関するρ値および強度の平均値を計算し、それらを記憶する。

再び図３を参照して、解析部２０３は、サンプル流体に含まれる複数の対象サンプルをチャネル５内に整列させて通過させた際に信号取得部２０１から出力された各チャネルのデジタル値ＤＮを用いて、各チャネルに入射した光子（ホトン）の集団を解析するデータ解析を実行する機能を有する。すなわち、解析部２０３は、計算部２０２によって計算されたチャネル毎の強度の平均値及びρ値を基に、データ解析を実行する。具体的には、複数のチャネルのデジタル値ＤＮを基にドットプロットを生成し、それらを入出力デバイスに出力する。また、解析部２０３は、生成したドットプロットを対象に、チャネル毎の強度の平均値及びρ値を用いてゲーティング処理を行い、異なる対象サンプルの集団の境界を画定する。さらに、解析部２０３は、流体システム２を制御することにより、対象サンプルの集団の境界を基に、集団を分類及び振り分けするソーティング処理を実行させることもできる。

図７及び図８は、解析部２０３によるデータ解析において生成および出力されたドットプロットの例を示すグラフである。図７には、抗体Ａに対応する蛍光チャネルの仮想ホトン数と抗体Ｂに対応する蛍光チャネルの仮想ホトン数との関係をプロットしたドットプロットが示され、ゲーティング処理によって画定された境界が実線で示されている。このように、ゲーティング処理により検出対象の全体の分析対象物中の集団の割合が計算及び出力され、抗体Ａ及び抗体Ｂの両方が陰性の集団の割合“３６．６％”、抗体Ｂのみが陽性の集団の割合“３４．７％”、抗体Ａのみが陽性の集団の割合“２７．７％”、抗体Ａ，Ｂの両方が陽性の割合“１．０５％”と出力される。図８には、蛍光色素Ｃｙ５を用いた蛍光チャネルの仮想ホトン数と蛍光色素ＴＲを用いた蛍光チャネルの仮想ホトン数との関係をプロットしたドットプロットが示されている。このように、ゲーティング処理によって集団の境界を画定する際には、集団の仮想ホトン数の平均値を中心とした、その平均値に対応するρ値で決定されるゲート区間の範囲Ｗの境界を自動で画定することができる。ρ値で決定される範囲Ｗは、例えば、（強度の平均値）±３×ρ×（強度の平均値）によって計算される範囲に設定される。

次に、図９及び図１０を参照して、フローサイトメータシステム１を用いた光電子増倍管の出力信号の処理方法の手順を説明する。図９には、フローサイトメータシステム１によるチャネル毎のパラメータ計算の処理を示し、図１０には、サンプル流体を対象としたフローサイトメトリーによる分析処理を示す。

まず、図９を参照して、サンプル流体に含まれる複数の試験サンプルを対象に、データ処理装置１２の信号取得部２０１により、各チャネルの時系列のデジタル値ＤＮが取得される（ステップＳ１０１）。その後、データ処理装置１２の計算部２０２によって、１つのチャネルの時系列のデジタル値ＤＮを基にヒストグラムが生成される（ステップＳ１０２）。そうすると、計算部２０２によって、ヒストグラムの各ピークのフィッティング範囲である幅ＰＷが決定され、これにより各ピークのパラメータＡ，Ｂが決定される（ステップＳ１０３）。

その後、計算部２０２により、各ピークのフィッティング範囲に対してフィッティング関数ｐ_single（ｘ）をフィッティングさせることにより、各ピークのパラメータτが決定される（ステップＳ１０４）。さらに、計算部２０２により、各ピークの２つのパラメータＡ，τを基に比τ／Ａが計算される（ステップＳ１０５）。そして、計算部２０２により、計算した比τ／Ａに応じて、式（２）～（５）の中からρ値を計算する１つの近似式が、ピーク毎に選択される（ステップＳ１０６）。

その後、計算部２０２により、式（６）を用いて計算した各ピークの平均値Ｅを基に各ピークの強度の平均値が計算されるとともに、選択した近似式を用いて各ピークのρ値が計算され、各ピークの強度平均値及びρ値がデータ処理装置１２内に記憶される（ステップＳ１０７）。上記ステップＳ１０２～Ｓ１０７の処理が各チャネルの時系列のデジタル値を対象に繰り返されて（ステップＳ１０８）パラメータ計算の処理が終了する。ただし、上記ステップＳ１０２～Ｓ１０７の処理は、１つのチャネルのみで実行されてもよい。

図１０を参照して、フローサイトメータシステム１において複数の対象サンプルを含むサンプル流体のフローサイトメトリーによる検出が開始されると、それに応じて、データ処理装置１２によって、各チャネルのデジタル値ＤＮのデータが取得される（ステップＳ２０１）。次に、データ処理装置１２において、各チャネルのデジタル値ＤＮを用いて、ドットプロットが生成される（ステップＳ２０２）。

その後、データ処理装置１２によって、生成したドットプロットに対して、計算した各チャネルの強度平均値及びρ値を用いたゲーティング処理が施される（ステップＳ２０３）。そして、データ処理装置１２によって、ゲーティング処理の結果に基づいて、ドットプロットに示されるデータ中の分析対象物の集団（ターゲット集団）の分類分けが行われる（ステップＳ２０４）。

次に、データ処理装置１２においてソーティングが実行されるように設定されている場合（ステップＳ２０５；Ｙｅｓ）には、データ処理装置１２によって、分類分けされたターゲット集団に対してソーティングが行われるように制御される（Ｓ２０６）。一方、データ処理装置１２においてソーティングが実行されないように設定されている場合（ステップＳ２０５；Ｎｏ）には、データ処理装置１２によって、分類分けされたターゲット集団に対して全体に対する割合の計算等のデータ解析処理が行われる（Ｓ２０７）。

以上説明した実施形態に係るフローサイトメータシステム１の作用効果について説明する。

フローサイトメータシステム１においては、複数の試験サンプルを対象にした際に光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄが出力する強度信号のデジタル値ＤＮを時系列に集計してヒストグラムが生成される。また、そのヒストグラムが指数関数によってフィッティングされることで、度数分布の各ピークのばらつきを表すρ値が計算され、複数の対象サンプルを対象にした際に光電子増倍管１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄが出力する強度信号のデジタル値ＤＮを対象に、ρ値を用いてデータ解析が実行される。これにより、光電子増倍管の出力値のデータのばらつきを、簡易な計算で精度よく評価することができる。その結果、データ解析の計算コストを低減でき、データ解析の精度も維持できる。つまり、フローサイトメータシステム１によれば、従来では解析することが困難であった分析対象物の集団を、高精度で扱うことが可能となり、実用的なレベルの計算処理を用いて集団の解析が実現される。例えば、フローサイトメータシステム１によって取得されたρ値を機械学習モデルに入力することによりデータ解析を行うことも可能とされる。

また、フローサイトメータシステム１においては、フィッティングで用いる指数関数として、式（１）で表される関数が用いられている。この場合、光電子増倍管の出力値のデータのばらつきを、より精度よく評価することができる。

また、フローサイトメータシステム１においては、光電子増倍管の出力する強度信号のデジタル値ＤＮを基としたヒストグラムに対して指数関数を用いてフィッティングさせる際に、パラメータＡ，Ｂとパラメータτを順番に決定することによって、安定してフィッティングされた指数関数を求めることができる。その結果、度数分布のピークに合ったρ値を安定して計算することができる。

また、フローサイトメータシステム１においては、関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）のピークの幅を近似するために好適な近似式を、フィッティングで決定した２つのパラメータＡ，τに応じて式（２）～（５）の中から選択して、その幅を計算することができるので、度数分布に含まれる複数のピークに合ったρ値を、簡易な計算で精度よく評価することができる。

また、フローサイトメータシステム１によれば、ゲーティング処理の計算コストを低減でき、ゲーティング処理の精度も維持できる。

以上、本発明の種々の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、各請求項に記載した要旨を変更しない範囲で変形し、又は他のものに適用したものであってもよい。

例えば、ドットプロットにおけるゲーティング処理は、電子システム４による自動設定に限らず、作業者の入力によって設定してもよいし、自動設定されたものを作業者の入力によって調整してもよい。

また、実施形態における光電子増倍管は、他の種類の光検出器に置換されてもよく、例えば、ＡＰＤ（avalanche photodiode）、ＳｉＰＭ(Silicon Photo Multiplier)に置換されてもよい。

また、上記実施形態のデータ処理装置１２の計算部２０２は、上記式（５）で表されるρ値を下記式（７）、（８）によって表される多項式展開による近似式を用いて計算するように機能してもよい。

図１１は、上記式（５）で計算されるρ値と上記式（７）、（８）で計算されるρ値との誤差を表すグラフである。このグラフは、２つのパラメータＡ，τの比τ／Ａを変化させた場合の式（５）の値で規格化した各式（７）、（８）の値の変化を示している。本願発明者らにより、式（８）で計算される値は、τ／Ａ≦所定値ＴＨ４（≒０．５）の範囲で誤差が小さく、式（７）で計算される値は、τ／Ａ≦所定値ＴＨ５（≒０．２）の範囲で誤差が小さいことが明らかにされた。

上記性質を利用して、計算部２０２は、次のように機能してもよい。すなわち、計算部２０２は、１つのピークを対象にしたフィッティング結果である２つのパラメータＡ，τの値を基に、τ／Ａ≦所定値ＴＨ５の場合には式（７）を選択して用いてρ値を計算する。一方、計算部２０２は、所定値ＴＨ５＜τ／Ａ≦所定値ＴＨ４の場合には式（８）を選択して用いてρ値を計算する。それ以外の場合には、計算部２０２は、式（５）を選択して用いてρ値を計算する。

また、上記実施形態のデータ処理装置１２の計算部２０２は、次のように機能してもよい。すなわち、１つのピークを対象にしたフィッティング結果である２つのパラメータＡ，τの値を基に、τ／Ａ≦所定値ＴＨ３の場合には式（４）を選択して用いてρ値を計算する代わりに、下記式（９）、（１０）に示す近似式を用いて平均値Ｅ及び標準偏差√Ｖを計算してもよい。

１…フローサイトメータシステム、２…流体システム、３…光学システム、４…電子システム（信号処理装置）、５…チャネル、６…フローセル、７…レーザ光源、８…レンズ、９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄ…フィルタ、１０ｂ，１０ｃ…ダイクロイックミラー、１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄ…光電子増倍管（光検出器）、１２…データ処理装置、２０１…信号取得部、２０２…計算部、２０３…解析部。

Claims (17)

1. フローサイトメータを構成する光検出器の出力を処理する信号処理方法であって、
   複数の試験サンプルを対象とした前記フローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を検出した前記光検出器の出力電流信号を時系列に取得し、
   時系列の前記電流信号の値を基に、前記電流信号の強度の度数分布を集計してヒストグラムを生成し、
   前記ヒストグラムを指数関数を用いてフィッティングさせることにより、前記度数分布における各ピークのばらつきを表すρ値を計算し、
   複数の対象サンプルを対象にフローサイトメトリーによって得られた前記光検出器の出力電流信号を対象にして、前記ρ値を用いてデータ解析を実行する、
   信号処理方法。
2. 前記指数関数は、前記強度に対応する変数ｘに対して、所定の変数ｘの範囲で指数関数的に上昇し、前記所定の変数ｘの範囲以外の範囲では零となる関数である、
   請求項１に記載の信号処理方法。
3. 前記指数関数は、式（１）；
   
   ［上記式中、Ａは分布の範囲上限、Ｂは分布の範囲下限を定めるパラメータであり、τは分布の時定数を定めるパラメータであり、ｕはステップ関数である。］
   で表される関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）である、
   請求項２に記載の信号処理方法。
4. 前記指数関数をフィッティングさせる際には、前記度数分布における１つのピークの範囲を定めることによりパラメータＡとパラメータＢを決定した後に、前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）を前記１つのピークにフィッティングさせることによりパラメータτを決定する、
   請求項３に記載の信号処理方法。
5. 前記ヒストグラムの各ピークを前記指数関数でフィッティングした後に、前記指数関数のピークの幅を近似する複数の近似式から選択して計算することにより、各ピークの前記ρ値を計算する、
   請求項２に記載の信号処理方法。
6. 前記ヒストグラムの各ピークを前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）でフィッティングした後に、前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）のピークの幅を近似する複数の近似式から、１つの近似式をパラメータＡ及びパラメータτに応じて選択して計算することにより、各ピークの前記ρ値を計算する、
   請求項３又は４に記載の信号処理方法。
7. 前記複数の近似式は、式（２）～（４）で表される近似式を含む、
   
   請求項６に記載の信号処理方法。
8. 前記データ解析は、解析対象の集団の境界を画定するゲーティング処理を含む、
   請求項１～５のいずれか１項に記載の信号処理方法。
9. フローサイトメータを構成する光検出器の出力を処理し、プロセッサを備える信号処理装置であって、
   前記プロセッサは、
   複数の試験サンプルを対象とした前記フローサイトメータを用いたフローサイトメトリーによって生じた信号光を検出した前記光検出器の出力電流信号を時系列に取得し、
   時系列の前記電流信号の値を基に、前記電流信号の強度の度数分布を集計してヒストグラムを生成し、
   前記ヒストグラムを指数関数を用いてフィッティングさせることにより、前記度数分布における各ピークのばらつきを表すρ値を計算し、
   複数の対象サンプルを対象にフローサイトメトリーによって得られた前記光検出器の出力電流信号を対象にして、前記ρ値を用いてデータ解析を実行するように構成されている、
   信号処理装置。
10. 前記指数関数は、前記強度に対応する変数ｘに対して、所定の変数ｘの範囲で指数関数的に上昇し、前記所定の変数ｘの範囲以外の範囲では零となる関数である、
    請求項９に記載の信号処理装置。
11. 前記指数関数は、式（１）；
    
    ［上記式中、Ａは分布の範囲上限、Ｂは分布の範囲下限を定めるパラメータであり、τは分布の時定数を定めるパラメータであり、ｕはステップ関数である。］
    で表される関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）である、
    請求項１０に記載の信号処理装置。
12. 前記プロセッサは、
    前記指数関数をフィッティングさせる際には、前記度数分布における１つのピークの範囲を定めることによりパラメータＡとパラメータＢを決定した後に、前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）を前記１つのピークにフィッティングさせることによりパラメータτを決定する、
    請求項１１に記載の信号処理装置。
13. 前記プロセッサは、
    前記ヒストグラムの各ピークを前記指数関数でフィッティングした後に、前記指数関数のピークの幅を近似する複数の近似式から選択して計算することにより、各ピークの前記ρ値を計算する、
    請求項９に記載の信号処理装置。
14. 前記プロセッサは、
    前記ヒストグラムの各ピークを前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）でフィッティングした後に、前記関数ｐ_{ｓｉｎｇｌｅ}（ｘ）のピークの幅を近似する複数の近似式から、１つの近似式をパラメータＡ及びパラメータτに応じて選択して計算することにより、各ピークの前記ρ値を計算する、
    請求項１１又は１２に記載の信号処理装置。
15. 前記複数の近似式は、式（２）～（４）で表される近似式を含む、
    
    請求項１４に記載の信号処理装置。
16. 前記データ解析は、解析対象の集団の境界を画定するゲーティング処理を含む、
    請求項９～１３のいずれか１項に記載の信号処理装置。
17. 請求項９～１３のいずれか１項に記載の信号処理装置と、
    前記光検出器と、
    前記信号光を前記光検出器に導く光学系と、
    を備える信号処理システム。