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DE10040988A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben

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Publication number
DE10040988A1
DE10040988A1 DE10040988A DE10040988A DE10040988A1 DE 10040988 A1 DE10040988 A1 DE 10040988A1 DE 10040988 A DE10040988 A DE 10040988A DE 10040988 A DE10040988 A DE 10040988A DE 10040988 A1 DE10040988 A1 DE 10040988A1
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DE
Germany
Prior art keywords
radiation
unit
red
laser light
polarization
Prior art date
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Ceased
Application number
DE10040988A
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English (en)
Inventor
Rolf Guenther
Leif Brand
Christian Eggeling
Karsten Gall
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evotec OAI AG
Original Assignee
Evotec Biosystems GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Evotec Biosystems GmbH filed Critical Evotec Biosystems GmbH
Priority to DE10040988A priority Critical patent/DE10040988A1/de
Priority to AT01960695T priority patent/ATE399989T1/de
Priority to PCT/EP2001/009680 priority patent/WO2002016911A1/de
Priority to EP01960695A priority patent/EP1311829B1/de
Priority to DE50114075T priority patent/DE50114075D1/de
Priority to US10/380,192 priority patent/US7345759B2/en
Priority to DK01960695T priority patent/DK1311829T3/da
Priority to AU2001282115A priority patent/AU2001282115A1/en
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Abstract

Eine Vorrichtung zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie weist eine Strahlungseinheit (12), eine Probenaufnahme (10), mindestens eine Optikeinheit (30) und eine Detektoreinheit (40) auf. Von der Strahlungseinheit (12) wird elekromagnetische Strahlung unterschiedlicher Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen auf die Probe (10) geleitet. In der Probe (10), die mindestens einen Farbstoffmarker aufweist, werden die Farbstoffmarker zur Abgabe von Lumineszenz angeregt und geben Licht ab. Das abgegebene Licht wird über eine Optikeinheit in Richtung einer Detektoreinheit geleitet. In der Detektoreinheit wird das von den Farbstoffmarkern abgegebene Licht in Detektoren (42, 44, 46, 48) detektiert. Zur Verbesserung der Meßergebnisse erzeugt die Strahlungseinheit (12) gepulste Strahlung, die über eine Steuereinheit (18) derart angesteuert wird, dass die Strahlungsimpulse zueinander zeitlich versetzt auf die Probe (10) abgegeben werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie.
Als Meßverfahren für derartige Proben ist das Screening der Proben bekannt. Beim Screening wird die Wechselwirkung zwischen zwei Biomolekülen in Gegenwart einer Testsubstanz untersucht. Bei den Biomolekülen kann es sich beispielsweise um die Paare Ligand-Rezeptor, Substrat-Enzym, Protein-Protein oder Protein-DNA handeln. Dabei kann ein meßbares Signal entweder von den Biomolekülen selbst erzeugt werden, oder es müssen, wie in den meisten Fällen, Probenmarker an die Biomoleküle gebunden werden. Als Marker werden Stoffe eingesetzt, die Signale auf der Grundlage von Radioaktivität, Lumineszenz oder Absorption erzeugen. Bei der Verwendung von Farbstoffmarkern, die eine Lumineszenz erzeugen, werden die Farbstoffmarker durch elektromagnetische Strahlung, z. B. geeignetes Laserlicht, angeregt, so dass durch die elektromagnetische Strahlung ein Elektron auf ein höheres Energieniveau gehoben wird und der Farbstoffmarker durch Rückkehr des Elektrons auf das ursprüngliche Energieniveau Licht abgibt, d. h. luminesziert. Die Wahrscheinlichkeit der Rückkehr des Elektrons in das ursprüngliche Energieniveau und damit die Lumineszenzemission ist zeitlich exponentiell verteilt. Die mittlere Lebensdauer des angeregten Zustandes wird daher auch als Lumineszenzlebensdauer bezeichnet. Da lumineszierende Marker in den meisten Fällen nur geringfügigen Einfluß auf die Wechselwirkungen der Biomoleküle haben und im Vergleich zu anderen bekannten Markern äußerst empfindlich sind, ist der Einsatz von lumineszierenden Farbstoffmarkern besonders vorteilhaft. Die Informationen über eine Reaktion zwischen den beiden Biomolekülen werden dadurch erhalten, dass die Veränderung des von den Farbstoffmarkern emittierten Lichts in Relation mit der Reaktion der Biomoleküle gesetzt wird.
In einem Beispiel eines Meßverfahrens wird ein Targetmolekül zuerst einem fluoreszierenden Reagenz als lumineszierendem Reagenz ausgesetzt, das die Fähigkeit hat, an das Targetmolekül zu binden. Ändert sich bei der Bindung die Fluoreszenzintensität, so kann sie zur Quantifizierung der Bindung verwendet werden. In einem weiteren Experiment wird das Target sowohl dem fluoreszenzmarkierten Reagenz als auch einer einzelnen Substanz ausgesetzt. Wenn eine Bindung zwischen der Substanz und dem Target entsteht, wird das fluoreszenzmarkierte Reagenz durch die Substanz von dem Target getrennt. Hierdurch ändert sich das Verhältnis von gebundenen zu freien markierten Molekülen. Dies hat wiederum eine Veränderung der Fluoreszenzemission der Probe zur Folge und es kann ermittelt werden, ob und inwieweit sich eine Substanz an ein Target bindet.
Zur Erhöhung der während einer Messung zu erhaltenden Information können mehrere Marker, insbesondere zwei Farbstoffmarker, verwendet werden. In Abhängigkeit von der Anregungsenergie der zwei Farbstoffmarker werden zum Anregen der Farbstoffmarker zwei elektromagnetische Strahlungsquellen, z. B. Laser, unterschiedlicher Wellenlängen eingesetzt. Beispielsweise wird ein roter und ein grüner Farbstoffmarker in Kombination mit einem roten und einem grünen Laser eingesetzt. Bei der Verwendung von roten und grünen Farbstoffmarkern wurde festgestellt, dass die Intensität des von dem roten Farbstoffmarker abgegebenen Lichts bei Verwendung eines roten zusammen mit einem grünen Laser geringer ist als die Intensität des roten Farbstoffmarkers, wenn dieser ausschließlich mit rotem Laserlicht bestrahlt wird. Dieser Intensitätsverlust bringt einen Informationsverlust mit sich und führt zu verfälschten Ergebnissen.
Dieses Phänomen kann auch bei der Verwendung von Farbstoffmarkern anderer Farben festgestellt werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie zu schaffen, mit dem verbesserte Meßergebnisse erzielt werden können. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, eine Verbesserung der Meßergebnisse bei gemeinsam verwendeten roten und grünen Farbstoffmarkern zu erreichen.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch das Verfahren gemäß Patentanspruch 1 bzw. durch die Vorrichtung gemäß Patentanspruch 12.
Die Erfindung beruht u. a. auf der Erkenntnis, dass ein roter Farbstoffmarker, der durch rotes Laserlicht angeregt wurde, von dem grünen Laserlicht zerstört werden kann. Die Zerstörung wird dadurch hervorgerufen, dass ein Elektron des roten Farbstoffmarkers durch das rote Laserlicht auf ein höheres Energieniveau gehoben wird und von dem grünen Laser weiter angeregt wird. Diese Anregung durch den grünen Laser führt zu einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Zerstörung des roten Farbstoffmarkers, z. B. durch Ionisierung. In den meisten Fällen ist diese Zerstörung irreversibel, d. h. der Farbstoffmarker kann nicht mehr zur Lumineszenzemission angeregt werden und ist für die weitere Messung verloren. Somit kommt es zu einer Verschlechterung des Meßsignals. Dies gilt entsprechend auch für Farbstoffmarker anderer Farben.
Erfindungsgemäß kann eine Verbesserung des Meßsignals dadurch erreicht werden, dass die zur Untersuchung von Proben verwendete elektromagnetische Strahlung, wie beispielsweise das Laserlicht, gepulst wird und die elektromagnetische Strahlung mindestens zwei unterschiedliche Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen aufweist, die zueinander zeitlich versetzt abgegeben werden. Die elektromagnetische Strahlung unterschiedlicher Wellenlängenbereiche und/oder unterschiedlicher Polarisationen trifft somit nacheinander auf der Probe auf. So ist z. B. die Gefahr der Zerstörung des Farbstoffmarkers dadurch verringert, dass der Strahlungsimpuls, der den Farbstoffmarker zerstören könnte, erst zu einem Zeitpunkt auftrifft, zu dem das angeregte Elektron sich mit hoher Wahrscheinlichkeit bereits wieder in seinem Ausgangszustand befindet.
Eine Verbesserung der Meßergebnisse kann durch vorstehendes erfindungsgemäßes Verfahren auch dann erreicht werden, wenn nur ein einzelner Farbstoffmarker in der Probe vorhanden ist.
Dieser Farbstoffmarker wird durch die elektromagnetische Strahlung unterschiedlicher Wellenlängenbereiche und/oder unterschiedlicher Polarisationen unterschiedlich angeregt. Beispielsweise können unterschiedliche Polarisationen bei der emittierten Strahlung detektiert werden und damit Rückschlüsse auf die Rotationseigenschaften der Farbstoffmarker gezogen werden.
Unter Farbstoffmarker ist im folgenden sowohl ein der Probe zugeführter Marker als auch ein der Substanz inhärenter Marker zu verstehen, d. h. Substanzen, die lumineszierende Eigenschaften besitzen. Lumineszenz umfaßt insbesondere auch Fluoreszenz und Phosphoreszenz.
Im folgenden wird die Erfindung zunächst anhand der Verwendung elektromagnetischer Strahlung mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen erläutert. Dies erfolgt zum besseren Verständnis anhand des Beispiels eines roten und eines grünen Farbstoffmarkers, die jeweils durch rotes bzw. grünes Laserlicht angeregt werden.
Erfindungsgemäß wird das Laserlicht zur Anregung der Farbstoffmarker, d. h. im erläuterten Beispiel das rote und das grüne Laserlicht, gepulst. Zusätzlich werden die Laserlichtimpulse der einzelnen Wellenlängenbereiche zueinander zeitlich versetzt. Aufgrund des zeitlichen synchronisierten Versatzes der Impulse zueinander trifft zu einem Zeitpunkt stets nur entweder ein roter oder ein grüner Laserlichtimpuls auf die Probe auf. Bereits bei einem äußerst geringen zeitlichen Abstand des grünen Laserlichtimpulses von dem roten Laserlichtimpuls werden erheblich weniger rote Farbstoffmarker zerstört. Dies erhöht die Intensität bzw. die Zählrate des von den Farbstoffmarkern abgegebenen Lichts. Hierdurch können die Meßergebnisse deutlich verbessert werden.
Erfindungsgemäß wird daher bei der Verwendung von roten und grünen Farbstoffmarkern zuerst einer oder mehrere Lichtimpulse des roten Laserlichts und anschließend einer oder mehrere Lichtimpulse des grünen Laserlichts auf die Probe gerichtet. Zwischen dem letzten roten Lichtimpuls und dem ersten grünen Lichtimpuls besteht ein zeitlicher Abstand. Die Zeitspanne ist so gewählt, dass die Anregung der roten Farbstoffmarker im wesentlichen wieder abgeklungen ist, so dass die Elektronen des roten Farbstoffmarkers durch den grünen Laserlichtimpuls nicht aus einem erhöhten Energieniveau weiter angeregt und die roten Farbstoffmarker dabei zerstört werden können.
Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Laserlichtimpuls erst erzeugt, nachdem die Anregung des durch den vorherigen Laserlichtimpuls eines verschiedenen Wellenlängenbereichs angeregten Farbstoffmarkers im wesentlichen abgeklungen ist. Somit wird beispielsweise der grüne Laserlichtimpuls erst auf die Probe geleitet, wenn die Anregung der durch rote Laserlichtimpulse angeregten Farbstoffmarker im wesentlichen abgeklungen ist. Vorzugsweise wird der nächste Laserlichtimpuls erst dann auf die Probe abgegeben, wenn die Anregung des zuvor angeregten Farbstoffmarkers um mindestens 90%, vorzugsweise um mindestens 95%, besonders bevorzugt mindestens um 98%, abgeklungen ist. Hierdurch werden die erzielbaren Meßergebnisse erheblich verbessert.
Der notwendige zeitliche Versatz zweier aufeinanderfolgender Lichtimpulse verschiedener Wellenlängenbereiche ist abhängig von der Lumineszenzlebensdauer des verwendeten Farbstoffmarkers. Für einen Farbstoffmarker mit der Lebensdauer 3 ns beträgt der notwendige zeitliche Versatz mindestens 2 ns, vorzugsweise mindestens 7 ns. Bei der Lebensdauer 1 ns beträgt er mindestens 0,7 ns, vorzugsweise mindestens 2,3 ns. Dabei können Pulse mit unterschiedlichen Intensitäten eingesetzt werden, dies gilt auch für nicht-lumineszente Anregungen. Bei Verwendung eines roten und eines grünen Laserlichts ist der Abstand eines auf einen roten Laserlichtimpuls folgenden grünen Laserlichtimpulses maßgebend, da ein zu früh oder gleichzeitig mit dem roten Laserlichtimpuls abgegebener grüner Laserlichtimpuls zur Zerstörung der roten Farbstoffmarker führen kann. Der Abstand eines auf einen grünen Laserlichtimpuls folgenden roten Laserlichtimpulses ist hingegen unerheblich, da der grüne Farbstoffmarker durch den roten Laserlichtimpuls nicht zerstört wird. Es muß in diesem Fall somit lediglich sichergestellt sein, dass die beiden Impulse nicht gleichzeitig erfolgen.
Die Impulsfrequenz des Laserlichts beträgt für Fluoreszenzanregung vorzugsweise 20-100 MHz, insbesondere 60-80 MHz. Die Impulsfrequenzen der einzelnen Laserlichtbereiche sind hierbei vorzugsweise identisch, so dass die Abstände zwischen aufeinanderfolgenden Laserlichtimpulsen verschiedener Wellenlängenbereiche über die Zeit konstant bleiben.
Die Reihenfolge der auf die Probe abgegebenen Laserlichtimpulse der einzelnen Wellenlängenbereiche ist vorzugsweise repetierend. Bei der Verwendung von beispielsweise drei Lasern mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen wird somit zuerst von dem ersten, dann von dem zweiten, anschließend von dem dritten und sodann wieder von dem ersten usw. Laser ein Lichtimpuls auf die Probe abgegeben. Bei der Verwendung von zwei Lasern, beispielsweise einem roten und einem grünen Laser, werden die Laserlichtimpulse vorzugsweise abwechselnd erzeugt.
Entsprechend den vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung anhand der Verwendung von Laserlicht und der erfindungsgemäß erzeugten Laserlichtimpulse wird der gleiche erfindungsgemäße Effekt bei Verwendung anderer elektromagnetischer Strahlen, wie beispielsweise Licht im sichtbaren oder nicht sichtbaren Wellenlängenbereich, hervorgerufen. Entsprechende Strahlungsimpulse rufen denselben erfinderischen Effekt wie Laserlichtimpulse hervor. Ebenso ist es bei den vorstehend beschriebenen Ausführungen möglich, eine Probe mit nur einem Farbstoffmarker zu verwenden. Dieser eine Farbstoffmarker wird durch Strahlungsimpulse unterschiedlicher Wellenlängenbereiche unterschiedlich angeregt, wobei die emittierte Strahlung in Abhängigkeit des Wellenlängenbereichs der anregenden Strahlung unterschiedlich ist oder sein kann.
Entsprechende Ergebnisse wie bei der Verwendung von unterschiedlichen Wellenlängenbereichen können auch durch unterschiedliche Polarisationen der elektromagnetischen Strahlen erreicht werden. So können beispielsweise anstelle eines roten und grünen Lasers entsprechende Meßergebnisse mit senkrecht und parallel polarisiertem Licht erreicht werden, mit denen ebenfalls Aussagen über den untersuchten Stoff getroffen werden können.
Der Wellenlängenbereich eines verwendeten grünen Laserlichts beträgt vorzugsweise 480-550 nm, besonders bevorzugt 485-535 nm. Der Wellenlängenbereich eines roten Lasers beträgt vorzugsweise 630-690 nm, besonders bevorzugt 635-655 nm. Als mögliche grüne Laserlichtquellen kommen bevorzugt hochwertige Argonionenlaser mit monochromatischer Anregung bei 488 nm, 496 nm, 502 nm, 515 nm, 528 nm oder Nd:YAG-Laser mit monochromatischer Anregung bei 492 nm oder 532 nm in Frage. Rote Laserlichtquellen sind bevorzugt Kryptonlaser mit monochromomatischer Anregung bei 647 nm, sowie rote Laserdioden, die für verschiedene Anregungswellenlängen erhältlich sind.
Häufig angewendete Methoden unter Benutzung von zwei Farbstoffmarkern mit zwei Lasern unterschiedlicher Farbe sind Koinzidenzanalysen, die hier anhand der Fluoreszenz vorgestellt werden. Dabei kann festgestellt werden, inwieweit die Farbstoffmarker gleichzeitig oder getrennt vorkommen, d. h. inwieweit sie an einem gemeinsamen Reagenz oder an zwei getrennten Reagenzien gebunden sind. Dabei wird ausgenutzt, dass im Fall des gleichzeitigen Vorkommens das Fluoreszenzlicht beider Farben immer zur gleichen Zeit detektiert wird, während im Fall des getrennten Vorkommens die Detektion des Fluoreszenzlichts von beiden Farben zeitlich willkürlich verteilt ist. Dies sei wiederum am Beispiel von rot und grün erläutert. Ein spezieller Fall der Koinzidenzanalyse ist die Kreuzkorrelationsanalyse. Hierbei werden die zeitlichen Fluktuationen des Fluoreszenzlichts des einen Farbstoffmarkers, Fgrün(t), auf einem, die des anderen Farbstoffmarkers, Frot(t), auf einem zweiten Detektor registriert. Die Kreuzkorrelationsfunktion, G(tc), wird über diese Fluktuationsspuren berechnet.
Zu einer Kreuzkorrelationsfunktion ungleich Null kommt es nur, wenn die Fluoreszenzlichter der beiden Farbstoffmarker zeitlich verknüpft ("korreliert") sind. Dies ist nur der Fall, wenn sie an einem gemeinsamen Reagenz gebunden sind. Die Amplitude der Kreuzkorrelationsfunktion, G(tc = 0), läßt eine direkte Aussage über die Konzentration, cgrün+rot, dieses zweifach farbmarkierten Reagenzes im Vergleich zu den Konzentrationen, cgrün und crot, der einfach markierten Reagenzien zu (cgrün und crot können dabei durch andere Analyseverfahren bestimmt werden).
Durch die bereits erwähnte Zerstörung des roten Farbstoffmarkers kommt es zu einer ungewollten Verringerung der Konzentrationen, cgrün+rot, des zweifach farbmarkierten Reagenzes (und crot, des rot markierten Reagenzes) und damit zu einer Abnahme der Kreuzkorrelationsamplitude, G(tc = 0). Eine Analysemethode eines biologischen Systems dieser Art durch die Kreuzkorrelation würde in diesem Fall zu verfälschten Ergebnissen führen und die tatsächliche biologische Konzentration des zweifach farbmarkierten Reagenzes, cgrün+rot, unterschätzen. Daher werden erfindungsgemäß der rote und grüne Laserlichtimpuls zueinander zeitlich verschoben. Durch das Verhindern der Zerstörung des roten Farbstoffmarkers wird dieser nachteilige Einfluß auf die Korrelationsamplitude unterbunden und eine unverfälschte Kreuzkorrelations- oder Koinzidenzanalyse erzielt.
Ein weiteres Problem bei Meßmethoden unter Verwendung von zwei Farbstoffmarkern mit zwei Lasern unterschiedlicher Farbe ist das Übersprechen der Lumineszenzsignale der beiden Farbstoffmarker. Dies soll am Beispiel der Fluoreszenz erläutert werden. Die Absorptions- und Emissionsspektren von Fluoreszenzfarbstoffen sind relativ breit, d. h. sie erstrecken sich über einen relativ großen Wellenlängenbereich, und können sich überlappen. Dadurch kann es zu folgenden Problemen kommen, die keine eindeutige Zuordnung des Fluoreszenzlichts zu einem bestimmten Farbstoffmarker oder Anregungslaser zulassen - z. B. können sie zu Verfälschungen in der Kreuzkorrelationsfunktion führen. Sie seien wiederum an dem Beispiel von rot und grün erläutert:
  • a) das Fluoreszenzlicht ödes roten Farbstoffmarkers läßt sich auch (vermindert) durch den grünen Laser anregen - es kommt zu einer Überlagerung zwischen vom grünen und roten Laser angeregten roten Fluoreszenzlicht;
  • b) ein (geringer) Teil des Fluoreszenzlichts des grünen Farbstoffmarkers überlappt mit dem roten Fluoreszenzlicht ("crosstalk") - es kommt zu einer Überlagerung zwischen vom grünen und roten Farbstoffmarker emittierten Fluoreszenzlicht auf dem Detektor für die rote Strahlung;
  • c) das Fluoreszenzlicht des roten Farbstoffmarkers kann nicht nur von dem roten Laser, sondern auch noch über (Resonanz-Energietransfer) von dem von dem grünen Laser angeregten grünen Farbstoffmarker erzeugt werden - ähnlich wie im Fall i) kommt es zu einer Überlagerung zwischen vom roten und indirekt über Energietransfer vom grünen Laser angeregten roten Fluoreszenzlicht.
Es ist Sinn dieser Erfindung, durch die zeitliche Verschiebung der roten und grünen Laserlichtimpulse zueinander dieses Übersprechen der Fluoreszenzsignale zu unterbinden. Das vom grünen und roten Laser angeregte Fluoreszenzlicht läßt sich dann zeitlich trennen und erlaubt eine eindeutige Zuordnung, wie an den drei Problemfällen erläutert werden kann: Nach dem grünen Laserlichtimpuls erfolgt nur die Detektion des Anteils vom grünen Farbstoffmarker ("crosstalk") oder vom direkt oder indirekt über Energietransfer angeregten roten Farbstoffmarker im roten Fluoreszenzlicht. Folgt nach dem Abklingen dieser Fluoreszenz der rote Laserlichtimpuls, so enthält das rote Fluoreszenzlicht nur Anteile von dem direkt durch den roten Laser angeregten roten Farbstoffmarker. Ist wiederum der grüne Laser auf das Abklingen dieser Fluoreszenz zeitlich abgestimmt, so kann das Fluoreszenzlicht eindeutig den Farbstoffmarkern bzw. anregenden Lasern zugeordnet werden. Hierdurch ist z. B. eine unbeeinflußte Kreuzkorrelationsanalyse möglich.
Eine weitere erfindungsgemäße Anwendung der zeitlichen Verschiebung von zwei Laserlichtimpulsen ist die Detektion unterschiedlicher Polarisationen des Lumineszenzlichts - im folgenden nur auf Fluoreszenzlicht bezogen - eines Farbstoffmarkers, mit nur einem Detektor. In üblichen Meßmethoden zur Aufnahme verschiedener Polarisationen des Fluoreszenzlichts wird der Farbstoffmarker mit einem in einer bestimmten Ebene X polarisierten Laser angeregt und der zu X parallele und senkrechte Polarisationsanteil des Fluoreszenzlichts entweder durch den Einsatz eines Polarisations-Strahlteilers gleichzeitig auf zwei verschiedenen Detektoren oder durch den zeitlichen Wechsel der Transmissionsrichtung eines Polarisationsfilters zeitlich getrennt (mehrere Sekunden) auf einem Detektor registriert. Dadurch können Rückschlüsse auf die Rotationseigenschaften der untersuchten Farbstoffmarker gezogen werden. Sinn dieser Erfindung ist es nun, zeitlich getrennte Fluoreszenzsignalpulse (-abklingpulse) unterschiedlicher Polarisation durch zwei zeitlich getrennte, in der Ebene X und in der dazu senkrechten Ebene Y polarisierten Laserpulse, zu erzeugen (dies ist sogar mit nur einem Laser unter Aufspaltung erreichbar). Erfolgt die Detektion auf einem einzigen Detektor mit einem Polarisationsfilter mit konstanter Transmissionsrichtung, so kann eine vergleichbare Detektion der zu der Polarisationsebene des Lasers parallelen und senkrechten Komponente des Fluoreszenzlichts erfolgen: die Transmissionsrichtung des Polarisationsfilters sei dabei die Ebene X; erfolgt der erste Laserlichtimpuls mit einer Polarisation ebenfalls in der Ebene X, so wird darauffolgend der zu der Polarisationsebene des Lasers parallel polarisierte Anteil des Fluoreszenzlichts detektiert; nach Abklingen dieser Fluoreszenz erfolgt der zweite Laserlichtimpuls mit einer Polarisation in der zur Ebene X senkrechten Ebene Y; darauffolgend wird nur der zu der Polarisationsebene des Lasers senkrecht polarisierte Anteil des Fluoreszenzlichtes detektiert; nach dessen Abklingen wird wieder ein Laserlichtimpuls mit Polarisation in der Ebene X eingestrahlt; usw. Diese Detektion der beiden Polarisationsanteile erfolgt dabei nahezu zeitgleich, da die zeitliche Verzögerung der beiden Laserlichtpulse nur auf das Abklingen des Fluoreszenzlichts, welche im Bereich der Fluoreszenzlebensdauer der Farbstoffmarker, üblicherweise zwischen 1-4 ns liegt, begrenzt ist. Diese "zeitgleiche" Detektion der beiden Polarisationen ist damit unter geringem Materialaufwand mit nur einem Detektor und einem Laser erreichbar und so in jeglichen Anwendungen für Fluoreszenz- Anisotropie und -Polarisationsmessungen von großem Interesse.
In ähnlicher Art und Weise kann durch den zeitlichen Versatz von rotem und grünem Laser eine nur um ns zeitversetzte, "zeitgleiche" Detektion von rotem und grünem Lumineszenzsignal auf nur einem Detektor ermöglicht werden.
Durch daß erfindungsgemäße Verfahren ist es somit möglich, eine Zwei-Farben-Kreuzkorrelationsanalyse mit nur einem Detektor durchzuführen.
Zur Erzielung besonders guter Meßergebnisse bei der Verwendung unterschiedlicher Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen wird vorzugsweise ein hochempfindliches konfokales Mikroskop eingesetzt.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird gepulste elektromagnetische Strahlung erzeugt, wobei die Strahlungsimpulse der einzelnen Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen zueinander zeitlich versetzt sind. Eine derartige Vorrichtung weist eine Strahlungseinheit, eine Probenaufnahme, eine Detektoreinheit und mindestens eine Optikeinheit auf.
Die Probenaufnahme dient zur Aufnahme einer chemischen und/oder biologischen Probe, die zur Durchführung von Lumineszenz- Spektroskopie mindestens einen Farbstoffmarker aufweist.
Die Detektoreinheit dient zum Detektieren der von der Probe abgegebenen Strahlung. Mit Hilfe der Optikeinheiten wird die Strahlung von der Strahlungseinheit zur Probenaufnahme und/oder die von der Probe abgegebene Strahlung zur Detektoreinheit geleitet.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann so ausgestaltet sein, dass das Licht von der Strahlungseinheit zur Probenaufnahme und die von der Probe abgegebene Strahlung unter Verwendung derselben Optikeinheit zur Detektoreinheit geleitet wird, wobei sich diese ober- oder unterhalb der Probenaufnahme befinden kann. Es ist ferner möglich, dass die Vorrichtung so ausgestaltet ist, dass das Licht von der Strahlungseinheit durch eine Optikeinheit zur Probenaufnahme geleitet wird, die sich oberhalb der Probenaufnahme befindet und die von der Probe abgegebene Strahlung unter Verwendung einer weiteren Optikeinheit zur Detektoreinheit geleitet wird, die sich unterhalb der Probenaufnahme befindet.
Die erfindungsgemäß ausgestaltete Strahlungseinheit erzeugt Strahlung in mindestens zwei verschiedenen Wellenlängenbereichen und/oder zwei verschiedenen Polarisationen. Vorzugsweise wird eine Lasereinheit als Strahlungseinheit verwendet. Dabei werden zwei oder mehr Laser eingesetzt, die jeweils Laserlicht eines anderen Wellenlängenbereichs und/oder einer anderen Polarisation erzeugen und gepulst sind. Die Laserlichtimpulse der einzelnen Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen sind zueinander zeitlich versetzt. Hierdurch wird, wie vorstehend anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben, ein erheblich besseres Meßergebnis erzielt.
Vorzugsweise weist die Lasereinheit eine Steuereinheit auf, die mit dem einen bzw. mit sämtlichen Lasern verbunden ist. Hierbei kann für jeden einzelnen Laser eine separate Steuereinheit vorgesehen sein, wobei die einzelnen Steuereinheiten über eine gemeinsame Steuerung miteinander verknüpft werden müssen. Vorzugsweise ist eine einzige Steuereinheit wie ein erster Modenkoppler für sämtliche in der Lasereinheit angeordneten Laser vorgesehen. Mit Hilfe dieser einen Steuereinheit wird ein erster Laser gesteuert. Der zweite und jeder weitere Laser ist vorzugsweise mit der einzigen Steuereinheit über ein Triggerkabel verbunden. Aufgrund der Signallaufzeiten, die von der Länge des Triggerkabels abhängig sind, können die Laserlichtimpulse des zweiten und jedes weiteren Lasers automatisch zu denjenigen des ersten Lasers zeitlich versetzt werden. Andere praktische Möglichkeiten, um den zeitlichen Versatz der Laser zu erreichen, sind Weglängenunterschiede der verschiedenen Strahlengänge oder andere elektrische Bauteile zur Veränderung der Signallaufzeiten.
Die Steuereinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann vorzugsweise wie vorstehend anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben ausgebildet sein, so dass beispielsweise ein Laserlichtimpuls erst dann die Probe erreicht, wenn die Anregung des durch den vorherigen Laserlichtimpuls eines verschiedenen Wellenlängenbereichs und/oder einer anderen Polarisation angeregten Farbstoffmarkers im wesentlichen abgeklungen ist. Ferner können durch die Steuereinheit die Reihenfolge der einzelnen Laser sowie die zeitlichen Abstände zwischen den Laserlichtimpulsen gesteuert werden.
Bei einer bevorzugten Weiterbildung der Detektoreinheit weist die Detektoreinheit nur einen mit einer Auswerteeinheit verbundenen Kombinationsdetektor auf. Dieser einzelne Detektor nimmt sämtliche von den einzelnen in der Probe enthaltenen Farbstoffmarkern abgegebenen. Lumineszenz-Lichtimpulse auf. Da die Lumineszenz-Lichtimpulse aufgrund des zeitlichen Versatzes der die Farbstoffmarker anregenden Strahlungsimpulse auch zeitlich versetzt am Detektor ankommen, können die einzelnen detektierten Werte mittels der Auswerteeinheit den entsprechenden Farbstoffmarkern und/oder Polarisationen, von denen sie stammen, zugeordnet werden. Durch die Kombination der Informationen über die Abfolge der Strahlungsimpulse und die Abfolge der Detektorsignale in der Auswerteeinheit ist eine Sortierung in rote und grüne Signale bzw. in parallel und senkrecht polarisierte Signale möglich.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die Detektoreinheit zwei Detektoren auf, wobei ein Detektor zum Detektieren des von den roten Farbstoffmarkern abgegebenen Lichts und der andere zum Detektieren des von den grünen Farbstoffmarkern abgegebenen Lichts vorgesehen ist. Hierdurch ist sichergestellt, dass keine Verfälschung der Ergebnisse aufgrund von Fehlern der Auswerteeinheit stattfindet. Ferner kann die Auswerteeinheit einfacher aufgebaut sein. Bei Vorsehen von drei oder mehr Farbstoffmarkern kann dementsprechend die entsprechende Anzahl von Detektoren vorgesehen werden.
Um zusätzliche Informationen zu erhalten, kann den Detektoren ein polarisierender Strahlteiler vorgeschaltet sein. Ein von einem bestimmten Farbstoffmarker kommender Lichtstrahl wird somit in zwei Strahlen unterschiedlicher Polarisation aufgeteilt. Diesen beiden Strahlen können zusätzliche Informationen, z. B. Rotationseigenschaften, über die Probe entnommen werden. Insbesondere kann jeder dieser Detektoren nach dem o. g. Verfahren verschiedene Farben nacheinander messen. So ist es möglich, mit zwei Detektoren mehr als eine Farbe in beiden Polarisationen zu messen.
Die Vorrichtung ist vorzugsweise als hochgenaues konfokales Mikroskop ausgestaltet. Die Detektionseinheit weist vorzugsweise eine Elektronik auf, mit der z. B. eine Kreuzkorrelationsmessung durchgeführt werden kann.
Beim Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit unterschiedlich polarisierter Strahlung und nur einem Detektor wird die Strahlungseinheit vorzugsweise wie folgt modifiziert:
  • 1. Die Strahlung aus einer einzigen unpolarisierten Strahlungsquelle, wie einem unpolarisierten Laser, wird durch einen Strahlteiler in zwei Strahlen geteilt, die jeweils durch einen Polarisationsfilter unterschiedlich polarisiert und später wieder vereinigt werden. Der zeitliche Versatz der beiden unterschiedlich polarisierten Strahlen wird durch Weglängenunterschiede in den beiden Strahlengängen realisiert.
  • 2. Die Strahlung einer einzigen unpolarisierten Strahlungsquelle, wie einem unpolarisierten Laser, wird durch einen Polarisations-Strahlteiler in zwei Strahlen unterschiedlicher Polarisation getrennt und später wieder vereinigt. Der zeitliche Versatz der beiden unterschiedlich polarisierten Strahlen wird durch Weglängenunterschiede in den beiden Strahlengängen realisiert.
  • 3. Die Erzeugung zweier Strahlungsimpulse unterschiedlicher Polarisation unter dem Einsatz einer einzigen unpolarisierten Strahlungsquelle ist auch durch einen schnellrotierenden Polarisationsfilter in einem ungeteilten Strahlengang erreichbar. Hierbei muß die Rotationsgeschwindigkeit des Polarisationsfilters auf die Impulsfrequenz der Strahlungsquelle abgestimmt sein, so dass die einzelnen Strahlungsimpulse abwechselnd eine unterschiedliche Polarisationsrichtung aufweisen.
  • 4. Zwei polarisierte gepulste Strahlungsquellen gleicher Wellenlängenbereiche aber entgegengesetzter Polarisation werden, wie bereits vorher im Zwei-Farben-Ansatz, so aufeinander abgestimmt bzw. getriggert, dass ihre Pulse zeitversetzt nacheinander die Probe erreichen.
Während alle Ausführungsformen der Vorrichtung den Vorteil haben, dass nur ein einzelner Detektor erforderlich ist, um die unterschiedlich polarisierten Lumineszenzlichtanteile zu registrieren, ist in den Ausführungsformen (1)-(3) sogar eine einzige gepulste Strahlungsquelle ausreichend.
Durch das Einkoppeln zweier zeitlich versetzter Strahlungsimpulse unterschiedlicher Wellenlängenbereiche, z. B. rot und grün, und der Verwendung geeigneter optischer Filter kann Lumineszenzlicht unterschiedlicher Wellenlängenbereiche, z. B. rot und grün, mit nur einem Detektor, wie vorher ausgeführt, nahezu "zeitgleich" separat detektiert werden. Es können somit Verfahren, wie die Koinzidenzanalyse oder die Zwei-Farben-Kreuzkorrelationsmessung, mit einem einzigen Detektor durchgeführt werden. Dies ist nach dem Stand der Technik nicht möglich.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie der erfindungsgemäßen Vorrichtung können insbesondere folgende Meßverfahren durchgeführt werden: Spektrometrie, Mehrphotonenanregung (z. B. im Zwei-Photonen-Betrieb), Laser-Scanning-Anregung, Nahfeldspektroskopie, Raman- und Rayleigh-Streulicht- Anwendungen, FIDA- (fluorescence intensity distribution analysis) Anwendungen, zweidimensionale FIDA-Anwendungen, Koinzidenzanalyse und Fluoreszenz-Lebensdauer-Messungen. Es können auch parallele konfokale Systeme, wie Nipkow-Disks, Line-Scanner oder PMA-Anordnungen verwendet werden. Dabei werden vorzugsweise gated CCDs, CIDs, CMOSs oder mehrere CCDs, CIDs oder CMOSs verwendet, die über Farbteiler oder Polarisatoren unterschiedliche Signalanteile messen.
Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die erfindungsgemäße Vorrichtung sind insbesondere zur pharmazeutischen Wirkstoffsuche (Screening), zur Identifizierung und Charakterisierung von pharmazeutisch relevanten Stoffen und Molekülen, zur Identifizierung von Analyten in diagnostischen Anwendungen, zur Genom-Analyse oder zur Reinigung und Konzentrierung von Substraten geeignet.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Versuchsergebnissen sowie anhand einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 2-4 Diagramme der Fluoreszenzintensitäten einer reinen roten Farbstofflösung, die mit unterschiedlichem Lichtimpulsversatz eines roten und eines grünen Lasers bestrahlt wurde,
Fig. 5-7 Diagramme des Fluoreszenzabfalles in einem roten und einem grünen Detektionskanal bei den anhand der Fig. 2-4 beschriebenen Versuchen und
Fig. 8 ein Diagramm, in dem der Kurvenverlauf bei Kreuzkorrelationsmessungen dargestellt ist.
Die in Fig. 1 dargestellte bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist eine Probenaufnahme 10 auf. Als Probenaufnahme 10 ist schematisch ein einziger Behälter dargestellt, in dem sich die zu untersuchende Probe befindet. Bei der Probenaufnahme handelt es sich beispielsweise um Mikro- oder Nanotiterplatten. Eine als Strahlungseinheit dienende Lasereinheit 12 weist im dargestellten Beispiel einen Argon- Laser 14 auf, der grünes Laserlicht mit einer Wellenlänge von 496 nm erzeugt. Bei einem zweiten Laser 16 handelt es sich um eine rote Laserdiode, die Laserlicht mit einer Wellenlänge von 635 nm erzeugt. Beide Laser 14, 16 werden in einem schnellen gepulsten Modus betrieben. Bei Einsatz der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung zur Durchführung der anhand der Fig. 2-8 beschriebenen Experimente betrug die Impulsfrequenz 73 MHz.
Der Argon-Laser 14 ist über einen Modenkoppler 18 gesteuert, der über ein Kabel 20 mit dem Argon-Laser 14 verbunden ist. Durch den Modenkoppler wird eine exakte Impulsfrequenz erzeugt. Der Modenkoppler 18 ist ferner über ein Triggerkabel 22 mit der roten Laserdiode 16 verbunden. Durch das Vorsehen des Modenkopplers als gemeinsame Triggereinheit ist die Impulsfrequenz der beiden Laser 14, 16 identisch. Aufgrund der Länge des Triggerkabels 22 sind die von den beiden Lasern 14, 16 erzeugten Impulse zueinander zeitlich versetzt. Der zeitliche Versatz tritt aufgrund der Signallaufzeit der Steuersignale von dem Modenkoppler 18 zu dem Laser 16 auf.
Die von den beiden Lasern 14, 16 abgegebenen Lichtstrahlen werden über einen dichroitischen Strahlteiler 24 zusammengeführt, so dass sie einen identischen Strahlengang durchlaufen. Da die Impulse der Laser jedoch zueinander zeitlich versetzt sind, tritt keine Überschneidung der einzelnen Impulse auf. Das von dem dichroitischen Strahlteiler 24 zusammengefaßte Laserlicht wird von einem dichroitischen Spiegel 26 in Richtung der Probenaufnahme 10 gelenkt und durch ein Objektiv 28 in die in der Probenaufnahme 10 befindliche Probe fokussiert.
Das Objektiv 28 sowie der dichroitische Spiegel 26 sind bereits Bestandteile einer Optikeinheit 30. Die Optikeinheit 30 umfaßt ferner eine Tubuslinse 34 sowie eine Lochblende 36. Das von den in der Probe enthaltenen Farbstoffmarkern abgegebene Licht gelangt durch das Objektiv 28, den dichroitischen Spiegel 26 und anschließend durch die Tubuslinse 34, durch die es auf die Lochblende 36 fokussiert wird. Hierbei handelt es sich um einen typischen Aufbau eines konfokalen Mikroskops, bei dem durch die Lochblende 36 Anteile des Lichts ausgeblendet werden.
In dem dargestellten Ausführungsbeispiel der Vorrichtung umfaßt eine Detektoreinheit 40 vier optische Filter 32, vier Detektoren 42, 44, 46, 48 sowie einen polarisierenden Strahlteiler 50 und eine Auswerteeinheit 52. Die durch die Lochblende 36 gelangenden Strahlen werden von dem polarisierenden Strahlteiler 50 in einen Strahl 54 mit parallel polarisiertem Licht und einen Strahl 56 mit senkrecht polarisiertem Licht unterteilt. Der Strahl 54 wird von einem dichroitischen Strahlteiler 58 in zwei Strahlen 60, 62 geteilt, wobei einer der Strahlen das von dem roten Farbstoffmarker abgegebene Licht und der andere Strahl das von dem grünen Farbstoffmarker abgegebene Licht enthält.
Entsprechend wird der anders polarisierte Strahl 56 von einem zweiten dichroitischen Strahlteiler 64 in einen roten und einen grünen Strahl 66, 68 geteilt, die von dem Detektoren 46 bzw. 48 detektiert werden. Durch die optischen Filter 32 werden beispielsweise Randbereiche des abgegebenen Lichts ausgefiltert, die nicht von den Farbstoffmarkern selbst, sondern beispielsweise vom Material der Probenaufnahme 10 herrühren. Die von den Detektoren 42, 44, 46, 48 registrierten Strahlen 60, 62, 66, 68 werden in elektrische Signale umgewandelt und über Leitungen 70, 72, 74, 76 zu der Auswerteeinheit 52, bei der es sich üblicherweise um einen entsprechend an die Vorrichtung angepaßten PC handelt, geleitet. Mittels der Auswerteeinheit erfolgt eine Bestimmung der Art der Reaktion, die in der Probe stattgefunden hat.
Anstatt mit einer Optikeinheit sowohl das Laserlicht auf die Probe zu lenken und das von der Probe abgegebene Licht zur Detektoreinheit zu lenken, können auch zwei Optikeinheiten verwendet werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann so ausgestaltet sein, dass das Licht von der Strahlungseinheit zur Probenaufnahme und die von der Probe abgegebene Strahlung unter Verwendung derselben Optikeinheit zur Detektoreinheit geleitet wird, wobei sich diese ober- oder unterhalb der Probenaufnahme befinden kann. Es ist ferner möglich, dass die Vorrichtung so ausgestaltet ist, dass das Licht von der Strahlungseinheit durch eine Optikeinheit zur Probenaufnahme geleitet wird, die sich oberhalb der Probenaufnahme befindet und die von der Probe abgegebene Strahlung unter Verwendung einer weiteren Optikeinheit zur Detektoreinheit geleitet wird, die sich unterhalb der Probenaufnahme befindet.
Bei den in den Fig. 2-7 dargestellten Messungen wurde stets eine reine rote Farbstofflösung untersucht. Es handelt sich hierbei um den Farbstoff Cyanin 5 (Cy5), der in Wasser mit einer Konzentration von 5 nM gelöst wurde. Die Fluoreszenzlebensdauer von Cy5 in Wasser beträgt 0,7 ns.
In den Fig. 2-4 ist jeweils die Zählrate des Detektors über die Zeit aufgetragen. In allen drei Versuchen wurde die Probe innerhalb der ersten 5 s ausschließlich mit dem roten Laser, im Zeitabschnitt von 5-15 s mit dem roten und dem grünen Laser und zwischen 15-20 s wiederum ausschließlich nur mit dem roten Laser bestrahlt. Die Frequenz der beiden gepulsten Laser betrug in allen drei Messungen 73 MHz.
In der in Fig. 2 dargestellten Messung wurden im Bereich von 5-15 s, in denen sowohl der rote als auch der grüne Laser eingeschaltet waren, kein Impulsversatz der beiden Laser vorgenommen. Die roten und grünen Laserlichtimpulse trafen somit gleichzeitig auf die Probe und auf den roten Farbstoffmarker auf. Aus dem Diagramm (Fig. 2) ist deutlich ersichtlich, dass die Zählrate in dem Bereich von 5-15 s stark zurückgeht. In den Bereichen, in denen der grüne Laser nicht eingeschaltet ist, d. h. in dem Bereich von 0-5 s sowie in dem Bereich von 15-20 s, ist die Zählrate deutlich höher. Hieraus wird der zerstörerische Einfluß des grünen Lasers auf die roten Farbstoffmarker ersichtlich.
Bei der Messung, die anhand von Fig. 3 dargestellt ist, wurde in dem Zeitabschnitt von 5-15 s ein Pulsversatz von 2 ns zwischen dem roten und dem grünen Laser eingestellt. Die Impulse des grünen Lasers erfolgten stets 2 ns nach denen des roten Lasers, wobei die beiden Laserlichtimpulse abwechselnd auf die Probe auftrafen. Wie aus dem Diagramm (Fig. 3) deutlich ersichtlich ist, ist die Zählrate in dem Bereich von 5-15 s deutlich höher als in dem Diagramm der zuerst durchgeführten Messung (Fig. 2). Es hat somit bereits innerhalb eines Zeitversatzes von 2 ns eine gewisse Abklingung der Erregung der roten Farbstoffmarker stattgefunden (bei Cy5 um 94%), so dass eine erheblich geringere Anzahl von roten Farbstoffmarkern durch den grünen Laser zerstört wurde.
Besonders deutlich ist der Effekt des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand von Fig. 4. Bei dieser Messung wurde ein Impulsversatz von 10 ns in dem Bereich von 5-15 s eingestellt. Es ist hierbei aus dem Diagramm keine Abweichung der Zählrate in den einzelnen Bereichen mehr ersichtlich. Es kann somit davon ausgegangen werden, dass bereits nach 10 ns annähernd sämtliche zuvor angeregten roten Farbstoffmarker wieder in ihren Grundzustand zurückgefallen sind.
In den Fig. 5-7 ist die Zählrate eines roten und eines grünen Detektionskanals über eine Zeit abgebildet. Bei den Detektionskanälen handelt es sich um die entsprechenden Detektoren in Verbindung mit der Auswerteeinheit. Fig. 5 entspricht der in Fig. 2, Fig. 6 der in Fig. 3 und Fig. 7 der in Fig. 4 dargestellten Messung. Die durchgezogene Linie zeigt jeweils die durch den roten Laser hervorgerufene Fluoreszenz und die gestrichelte Linie die durch den grünen Laser hervorgerufene Fluoreszenz. Die in den Fig. 5-7 dargestellten Messungen wurden jeweils in dem Zeitraum von 5-15 s (Fig. 2-4) durchgeführt, d. h. in dem Zeitraum, in dem beide Laser angeschaltet waren. Bei Fig. 5 ist zwischen den roten und grünen Laserlichtimpulsen kein Versatz, bei Fig. 6 beträgt der Zeitversatz entsprechend Fig. 3 2 ns und bei Fig. 7 beträgt der Zeitversatz entsprechend Fig. 4 10 ns.
Aus den Fig. 5-7 ergibt sich deutlich die Verschiebung der maximalen Fluoreszenzsignale des roten und des grünen Detektionskanals zueinander aufgrund des Impulsversatzes. Bei einem Impulsversatz von 10 ns können die beiden Detektionskanäle deutlich voneinander getrennt werden. Dies ermöglicht beispielsweise den Einsatz eines einzigen Detektors für beide Farbstoffmarker, da bekannt ist, zu welchem Zeitpunkt Lichtsignale von welchem Farbstoffmarker zu dem Detektor gelangen.
Bei dem anhand von Fig. 8 dargestellten Versuch handelt es sich um eine Messung eines mit Cy5 und Rhodamin-Green markierten doppelsträngigen Oligonukleotids, das bei einer Konzentration von ca. 1 nM in Wasser gelöst ist. Das Oligonukleotid ist 66 Basenpaare lang und macht aufgrund der Entfernung zwischen beiden Farbstoffmarkern einen Energietransfer unmöglich. Es wurde eine Kreuzkorrelationsmessung des roten und grünen Fluoreszenzlichts durchgeführt. Der rote und grüne Laser waren wiederum gepulst und zeitlich verschiebbar. Bei der unteren Kurve handelt es sich um den Verlauf der Kreuzkorrelation bei überlagerten Laserlichtimpulsen, d. h. bei Laserlichtimpulsen ohne zeitlichen Versatz. Bei der oberen Kurve waren die Laserlichtimpulse zueinander zeitlich versetzt. Nach Gl. 2 ergibt die obere Kurve eine Konzentation, cgrün+rot = 1 nM, an doppelt markierten Oligonukleotiden, während die verringerte Amplitude der unteren Kurve zu einer geringeren Konzentration, cgrün+rot = 0,6 nM, führt. Es tritt somit aufgrund des Impulsversatzes keine Photozerstörung auf und die Kreuzkorrelationsanalyse führt zu unverfälschteren Ergebnissen.

Claims (27)

1. Verfahren zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie, bei welchem
die mindestens einen Farbstoffmarker aufweisende Probe mit elektromagnetischer Strahlung mit mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen und/oder Polarisationen bestrahlt wird,
der angeregte Farbstoffmarker Strahlung in einem signifikanten Wellenlängenbereich abgibt und
die abgegebene Strahlung von mindestens einem Detektor detektiert wird,
dadurch gekennzeichnet,
dass die zur Anregung des Farbstoffmarkers verwendete elektromagnetische Strahlung gepulst wird, und
dass die Strahlungsimpulse der einzelnen Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen zueinander zeitlich versetzt auf die Probe treffen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Strahlungsimpuls erst erzeugt wird, nachdem die Anregung des durch den vorherigen Strahlungsimpuls eines verschiedenen Wellenlängenbereichs und/oder einer verschiedenen Polarisation angeregten Farbstoffmarkers im wesentlichen abgeklungen ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der nächste Strahlungsimpuls erst abgegeben wird, wenn die Anregung des zuvor angeregten Farbstoffmarkers um mindestens 90%, vorzugsweise um mindestens 95%, besonders bevorzugt um mindestens 98%, abgeklungen ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlung der einzelnen Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen in repetierender Reihenfolge abgegeben wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Abstand zweier aufeinanderfolgender Strahlungsimpulse verschiedener Wellenlängenbereiche mindestens 2 ns, vorzugsweise mindestens 10 ns und höchstens 20 ns, beträgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe zwei Farbstoffmarker aufweist, wobei jeder Farbstoffmarker jeweils von einem Wellenlängenbereich und/oder einer Polarisation angeregt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass als elektromagnetische Strahlung Laserlicht verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein roter und/oder ein grüner Farbstoffmarker zusammen mit rotem und/oder grünem Laserlicht verwendet wird, wobei das grüne Laserlicht vorzugsweise einen Wellenlängenbereich von 480 bis 550 nm, besonders bevorzugt von 485 bis 535 nm, und das rote Laserlicht einen Wellenlängenbereich von vorzugsweise 630 bis 690 nm, besonders bevorzugt von 635 bis 645 nm, aufweist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung unterschiedlicher Polarisationen der zeitliche Abstand zweier aufeinanderfolgender Strahlungsimpulse höchstens 20 ns, insbesondere höchstens 10 ns, beträgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung mittels Kreuzkorrelation durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops durchgeführt wird.
12. Vorrichtung zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie, mit
einer Strahlungseinheit (12) zur Erzeugung von elektromagnetischer Strahlung in mindestens zwei verschiedenen Wellenlängenbereichen und/oder Polarisationen,
einer Probenaufnahme (10) zur Aufnahme der mindestens einen Farbstoffmarker aufweisenden Probe,
einer mindestens einen Detektor (42-48) aufweisenden Detektoreinheit (40) zum Detektieren der von der Probe abgegebenen Strahlung und
mindestens einer Optikeinheit (30), die die Strahlung von der Strahlungseinheit (12) zur Probenaufnahme (10) und/oder die von der Probe abgegebene Strahlung zur Detektoreinheit (40) leitet,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Strahlungseinheit (12) gepulste Strahlung erzeugt, und
dass die Strahlungsimpulse der einzelnen Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen zueinander zeitlich versetzt sind.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungseinheit zur Erzeugung der Strahlungsimpulse mit einer Steuereinheit (18), vorzugsweise einem Modenkoppler, verbunden ist.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (18) die Strahlungsimpulse derart steuert, dass ein Strahlungsimpuls erst erzeugt wird, nachdem die Anregung des durch den vorherigen Strahlungsimpuls eines verschiedenen Wellenlängenbereichs und/oder einer verschiedenen Polarisation angeregten Farbstoffmarkers im wesentlichen abgeklungen ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (18) die Strahlungseinheit (12) derart steuert, dass der nächste Strahlungsimpuls erst abgegeben wird, wenn die Anregung des zuvor angeregten Farbstoffmarkers um mindestens 90%, vorzugsweise um mindestens 95%, besonders bevorzugt um mindestens 98%; abgeklungen ist.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13-15, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (18) die Strahlungsimpulse derart steuert, dass die Strahlungsimpulse der einzelnen Wellenlängenbereiche und/oder Polarisationen in repetierender Reihenfolge abgegeben werden.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13-16, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (18) die Strahlungsimpulse derart steuert, dass der zeitliche Abstand zweier aufeinanderfolgender Strahlungsimpulse verschiedener Wellenlängenbereiche mindestens 2 ns, vorzugsweise mindestens 10 ns und höchstens 20 ns beträgt.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12-17, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungseinheit (12) mindestens zwei Laser (14, 16) zur Erzeugung verschiedener Wellenlängenbereiche aufweist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungseinheit (12) für sämtliche Laser (14, 16) eine gemeinsame Steuereinheit (18) aufweist.
20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (18) mit den Lasern (14, 16) jeweils über ein Triggerkabel (20, 22) verbunden ist, wobei der zeitliche Versatz der Laserlichtimpulse durch die Länge der Triggerkabel (20, 22) bestimmt ist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18-20, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungseinheit (12) zwei Laser (14, 16) umfaßt, wobei ein Laser (14) rotes und der andere (16) grünes Laserlicht erzeugt und das grüne Laserlicht vorzugsweise in einem Wellenlängenbereich von 480 bis 550 nm, besonders bevorzugt von 485 bis 535 nm, und das rote Laserlicht vorzugsweise in einem Wellenlängenbereich von 630 bis 690 nm, besonders bevorzugt von 635 bis 655 nm, liegt.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12-21, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungseinheit (12) nur eine einzige unpolarisierte gepulste Strahlungsquelle (14) umfaßt, wobei die Strahlungseinheit (12) zusätzlich
  • a) einen Strahlteiler und in jedem erzeugten Strahlengang einen Polarisationsfilter sowie ein Bauteil zur Vereinigung der Strahlengänge aufweist, oder
  • b) einen Polarisations-Strahlteiler zur Erzeugung von zwei Strahlengängen unterschiedlicher Polarisation sowie ein Bauteil zur Vereinigung der Strahlengänge aufweist, oder
  • c) einen schnellrotierenden Polarisationsfilter in einem ungeteilten Strahlengang aufweist.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12-21, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlungseinheit (12) zwei polarisierte gepulste Strahlungsquellen (14, 16) gleicher Wellenlängenbereiche aber entgegengesetzter Polarisation aufweist.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12-23, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektoreinheit (40) nur einen mit einer Auswerteeinheit (52) verbundenen Kombinationsdetektor aufweist, wobei die Auswerteeinheit (52) die von dem mindestens einen Farbstoffmarker abgegebene Strahlung aufgrund des zeitlichen Versatzes getrennt voneinander auswertet.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12-24, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektoreinheit (40) zwei Detektoren (42, 44), einen zum Detektieren des von roten Farbstoffmarkern und einen zum Detektieren des von grünen Farbstoffmarkern abgegebenen Lichts aufweist.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12-25, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektoreinheit (40) einen den Detektoren (42-48) vorgeschalteten polarisierenden Strahlteiler (50) zur Erzeugung von zwei Strahlen (54, 56) unterschiedlicher Polarisation aufweist und jeder Strahl (54, 56) von mindestens einem Detektor (42, 44; 46, 48) detektiert wird.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12-26, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung als konfokales Mikroskop ausgestaltet ist.
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