DE2819035A1

DE2819035A1 - Antimikrobielle substanz c-3603 und verfahren zur herstellung derselben

Info

Publication number: DE2819035A1
Application number: DE19782819035
Authority: DE
Inventors: Takefumi Iwanami; Kazuo Joko; Isamu Mitsui; Yukinori Mori; Tsutomu Watanabe; Motozumi Yamadaki
Original assignee: Calpis Food Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Soft Drinks Co Ltd
Priority date: 1977-07-28
Filing date: 1978-04-29
Publication date: 1979-02-15
Also published as: US4209508A; FR2398502A1; JPS562079B2; FR2398502B1; CH640245A5; GB1594803A; DE2819035C2; JPS5424801A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die neue antimikrobiell Substanz C-36o3 und auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanz, die aus der Kultur von Streptococcus mutans C-36o3, FERM-P No. 4128, ATCC No. 31383 erhalten wird. Die neue antimikrobielle Substanz C-36o3 zeigt hohe antimikrobielle Aktivität gegenüber einer Vielzahl von grampositiven Bakterien, insbesondere cariogenen Bakterien in oralen Kavitäten, so daß sie zur Verhinderung von oralen Infektionskrankheiten, insbesondere Zahnkaries, brauchbar ist.

Bei der erfindungsgemäßen neuen antimikrobiellen Substanz C-36o3 und bei dem entsprechenden Herstellungsverfahren liegt die besondere Bedeutung in der Kultivierung einer bestimmten Spezies von genus Streptococcus unter Bildung der antimikrobiellen Substanz C-36o3 in einem Medium und Isolierung dieser antimikrobiellen Substanz C-36o3 aus dem resultierenden Kulturmedium.

Wie sich herausgestellt hat, zeigt die neue antimikrobielle Substanz C-36o3 hohe antimikrobielle Aktivitäten gegen eine Vielzahl von grampositiven Bakterien, insbesondere cariogenen Bakterien in oralen Kavitäten, so daß orale Infektionskrankheiten, insbesondere Zahnkaries, dadurch verhindert werden können.

Solche Mikroorganismen, die die antimikrobielle Substanz C-36o3 bilden, werden durch den Stamm C-36o3 von genus Streptococcus, der neuerdings isoliert worden ist, veranschaulicht,

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Die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes Streptococcus C-36o3 sind folgende (nach Prüfung der durch den Stamm gezeigten Eigenschaften unter Anwendung der Methode, die in der Publikation von Cowan und Steel "Manual for the Identification of Medical Bacteria", 2. Auflage, Cambridge University Press (1974) beschrieben ist):

I. Morphologische Eigenschaften: es handelt sich um einen grampositiven Coccus mit einer Größe von 0,8 bis 1,2 pm; es werden verbundene Gestaltungen durch Verbinden von 2 bis 1o Einheiten gebildet. Sporenbildung, Bewegungsfähigkeit, Säurefestigkeit und Polymorphismus werden nicht beobachtet.

II. Eigenschaften der Kultur, erhalten bei verschiedenen Medien:

1. Mitis Salivarius-Agar (37°C, anaerobe Kultur über 2 Tage): mäßiges Wachstum, rund, vollständig und konvex.

2. Trypticase Soja-Agar (37°C, anaerobe Kultur über 2 Tage): reichliches Wachstum, rund, vollständig, flach und keine Pigmentbildung.

3. Hirn/Herz-Infusions-Agar (37 C, anaerobe Kultur über 2 Tage): reichliches Wachstum, rund,vollständig, flach und keine Pigmentbildung.

4. GAM-Agar (Nissui Seiyaku, Japan) (37 C, anaerobe Kultur über 2 Tage): reichliches Wachstum, rund, vollständig, konvex

und keine Pigmentbildung.

5. Trypticase Soja-Brühe mit 5 % Sucrose (37°C, anaerobe Kultur über 2 Tage): die Kultur wurde unter einer Neigung von 45

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gebildet; danach blieb eine große Menge von einer unlöslichen Substanz (vermutlich ein Polysaccharid) am Boden und entlang dem unteren Teil unter der geneigten Oberfläche des Testzylinders.

III. Physiologische Eigenschaften:

1. Haemolyse: keine

2. Catalaseaktivität: negativ

3. Oxidaseaktivität: negativ

4. Wachstum bei 45°C: negativ

5. Temperaturtoleranz (6o°C während 3o min): negativ

6. Wachstum bei pH 9,6: negativ

7. CO₂~Bedarf: positiv

8. Wachstum auf einem Medium, das 4 % NaCl enthält: negativ

9. Wachstum auf einem Medium, das 4o % Bile enthält: positiv

10. Wachstum auf einem Medium, das 1/4ooo Tellurit enthält: negativ

11. Säure aus Kohlehydraten (Tabelle I):

Tabelle I Kohlehydrate Säureblldung

D-Glucose +

L-Arabinose
Glycerin

Lactose +

Maltose +

Mannit +

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— O —

Raffinose +

Salicin +

D-Sorbit +

Sucrose +

Trehalose +

12. VP-Test (Voges-Proskauer): Positiv

13. Aesculin-Hydrolyse: positiv

14. Lackmus-Milch: Koagulierung, Reduktion des Indikators

15. Gelatine-Hydrolyse: negativ

16. Arginin-Hydrolyse: negativ

17. Hippurat-Hydrolyse: negativ

18. Bile-Löslichkeit: negativ

19. OF-Test (Oxydation oder Fermentation von Glucose): Fermentation.

Bei der Prüfung der vorstehend genannten Eigenschaften gemäß der genannten Literaturstelle "Manual for the Identification of Medical Eacteria" hat sich klar ergeben, daß der Stamn gem?β der Erfindung Streptococcus mutans betrifft. Dementsprechend ist dieser Stamm mit der Bezeichnung Streptococcus mutans C-36o3 belegt worden. Der erfindungsgemäße Stamm ist im "Fermentation Research Institute", Agency of Industrial Science and Technology unter der Nr. FERI-I-P No. 4128 und bei der "American Type Culture Collection¹¹ unter der Nr. ATCC No. 31383 niedergelegt worden. Die erfindungsgemäß geeigneten Mikroorganismen sind beliebige, die antiirikrobielle SubstanzC-36o3 erzeugende Organismen, die zu Streptococcus gehören, d.h. der hier eingesetzte Stairzi ebenso wie beliebige künstliche Mutanten davon.

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Nachstehend wird ein Verfahren zum Kulturieren bzw. Züchten eines Mikroorganismus, beispielsweise des Stammes C-36o3, und ein Verfahren zum Isolieren der antimikrobiellen Substanz C-36o3 aus dem Kulturmedium erläutert.

Als Medium können verschiedene Medien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Mineralien, Vitamine, Aminosäuren etc. enthalten, wie sie üblicherweise zum Züchten von Mikroorganismen eingesetzt werden, in weitem Ausmaß verwendet werden. Als Kohlenstoffquelle können z.B. solche eingesetzt werden, die eine assimilierbare kohlenstoffhaltige Verbindung enthalten, z.B. Glucose, Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose, Melasse-Produkte etc. Als Stickstoffquelle können beispielsweise solche eingesetzt werden, die eine assimilierbare stickstoffhaltige Verbindung enthalten, z.B. Pepton, Fleischextrakt, Säurehydrolysate von Kasein etc. Daneben können Phosphorsäuresalze und Salze von Magnesium, Natrium, Kalium, Calcium, Eisen, Mangan etc. und Vitamine, Aminosäuren, Schutzmittel für die Bildung und oberflächenaktive Mittel verwendet werden, falls erwünscht. Als Mediumwird ein Flüssigkeitsmedium bevorzugt; das Kulturieren kann entweder unter aeroben oder unter anaeroben Bedingungen ausgeführt werden; vorzugsv/eise ist jedoch eine statische Kultur unter aeroben Bedingungen geeignet. Das Anfangs-pH des Mediums hat einen Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 7,o bis 8,o; die Temperatur der Kultur beträgt 2o bis 42°C, vorzugsweise 35 bis 4o°C; eine geeignete Kulturierungsperiode beträgt 14 bis 72 Stunden,

In der so erhaltenen Kulturflüssigkeit befindet sich die

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Hauptmenge der antlmikrobiellen Substanz C-36o3 im Filtrat der Kulturflüssigkeit. Zur Isolierung der antimikrobiellen Substanz C-36o3 aus der Flüssigkeit, woraus die Zellen entfernt worden sind, werden in geeigneter Weise übliche Trennungs- und Reinigungsmethoden, wie sie normalerweise zum Trennen von Proteinen und Antibiotica angewendet werden, eingesetzt, wie nachstehend beispielsweise näher erläutert ist.

Die Zellen werden durch eine Zentrifuge aus der Kulturflüssigkeit entfernt, wodurch man eine überstehende Flüssigkeit erhält. Diese erhaltene überstehende Flüssigkeit wird mit Amnoniumsulfat versetzt und bei niedriger Temperatur stehengelassen. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen; der gewonnene Niederschlag wird in einer kleinen Menge einer Phosphatpufferlösung aufgelöst; dann wird die überstehende Flüssigkeit durch Zentrifugieren erhalten. Die so erhaltene überstehende Lösung wird durch eine CM-Sephadex-Kolonne, gepuffert durch die genannte Pufferlösung, gegeben, so daß darauf die antimikrobielle Substanz adsorbiert wird; dann wird eine Alkalipufferlösung durch die Kolonne gegeben, wodurch die antinikrobielle Substanz eluiert wird. Die erhaltene Lösung wird durch Gelfiltration entsalzt; die entsalzte Lösung wird einer Gefriertrocknung unterworfen; als Ergebnis davon wird die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz als weißes Pulver erhalten.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der Zeichnung näher veranschaulicht; es zeigen:

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Fig. 1 das Ülüaviolett-Absorptionsspektrum der antimikrobiellen Substanz C-36o3;

Fig. 2 das Infrarot-Absorptionsspektrum;

Fig. 3 eine graphische Darstellung zur Veranschaulichung der Relation zwischen der Konzentration der antimikrobiellen Substanz und der Länge der Inhibitionszone bei dem Verfahren.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz C-36o3 sind folgende:

1. Elementaranalyse

i) C: 5o,o1 %, H: 6,19 %, N: 12,84 %, S: o,96 %, 0 (Rest): 3o,oo %

ii) C: 49,8o %, H: 6,3o %, N: 11,41 %, S: 1,18 %, O (Rest): 31,31 %

2. Molekulargewicht

6 ooo bis 1o ooo (bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Platten-Elektrophorese)

3. Zersetzungspunkt 19o bis 195°C

4. Spezifische Drehung

Infolge des hochmolekularen Charakters, d.h. selbst wenn

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- 1ο -

eine wäßrige Lösung in Essigsäure verwendet wird, kann eine hinreichende Konzentration nicht erhalten werden, so daß die Messung unmöglich ist

5. Ültraviolett-Absorptionsspektrum

aufgenommen in wäßriger Lösung in der Darstellung gemäß

1 % Fig. 1 und mit Absorptionsmaxima bei 28o nm (E₁ : 4o)

und 289 nm (E]*_m : 33)

6. Infrarot-Absorptionsspektrum

Das Spektrum, wie in Fig. 2 veranschaulicht, zeigt Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenzahlen (Ausführung in einer KBr-Platte): 329o, 165o, 1535, 124o, 11o5 und 733 cm"¹

7. Lösungsmittefc-Löslichkeit

Leicht löslich in wäßriger Lösung einer Säure (pH 3,o) und praktisch unlöslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, iither, Essigsäureäthylester, Chloroform, η-Hexan und Benzol

8. Farbreaktion

Positive Farbreaktionen mit Ninhydrin, Biuret, Xanthoprotein und Adamkiewicz

9. Isoelektrischer Punkt

pi = 1o,o +o,2 (isoelektrische Separation, bestimmt mit Polyacrylamid-Gel-Platten)

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10. Farbe und Form
Weißes Pulver

11. Aminosäureanalyse

Ein Beispiel des Aminosäureanalysenergebnisses, wobei das p-Toluolsulfonsäure-Hydrolysat analysiert wurde, ist in der nachstehenden Tabelle II veranschaulicht. Die Zahlenwerte zeigen die Ilolprozente jeder Aminosäure zur Gesamtmolkonzentration der Aminosäuren. Das Analysenverfahren entspricht der Angabe von T.Y.Liu und Y.H.Chang in "J.Biol. Chem., 246 (1971), 2842.

	Tabelle	II	Aminosäuren	7,ο
Aminosäuren		Heu.	9,5
Asp.	4,5	Leu	3,9
Thr.	2,2	Tyr.	6,1
Ser.	4,1	Phe.	4,5
GIu.	4,6	Trp.	7,7
Pro.	0	Lys.	O
GIy.	11,5	His.	9,6
AIa.	12,1	Ammoniak	3,3
Cys.	0	Arg.	1oo,o
VaI.	7,ο	insgesamt
Met.	2,4

12. Analyse der Fettsäuren

Das Säurehydrolysat (6 n-HCl, 12o°C, 2o h) wurde mit

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Chloroform/Methanol extrahiert; jedoch wurden Fettsäuren (C₁ bis C^g) durch Gas/Flüssigkeits-Chromatographie nicht ermittelt.

Die Auswertung der vorstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften ergibt, daß die erfindungsgemäße antinikrobielle Substanz C-36o3 vermutlich eine petidhaltige antimikrobielle Substanz ist. Agarverdünnugsproben mit verschiedenen Mikroorganismen ergeben die Inhibitionsspektren gemäß den nachstehenden Tabellen. Tabelle III zeigt das Inhibitionsspektrum der antimirkobiellen Substanz C-36o3 bei Milchsäurebakterien; Tabelle IV zeigt das Inhibitionsspektrun bei Bakterien, Hefe und Schirmelpilzen. Als Test-lledium wird GAM-Agar (Nissui Seiyaku, Japan) für Milchsäurebakterien bzw. Glucose (1 %)-Nähragar bei Bakterien, Hefe und Schimmelpilzen verwendet.

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Tabelle III Indikatorstämme

Streptococcus mutans HS-6 " OMZ-61

¹¹ BHT

" Ingbritt

JC-2

PS-14

PK-1

GS-5

" LH-7

¹¹ 6715

Streptococcus sanguis ATCC 1o557 " ATCC 1o558

Streptococcus salivarius HHT " ATCC 9758

Streptococcus mitis ATCC 12396

Streptococcus bovis IFO (Institute for Fermentation, Osaka, Japan) 12o57

Streptococcus sp.CHT

Streptococcus pyogenes HD (Institute of Medical Science, University of Tokyo, Japan) 7o3

715

Lactobacillus brevis AHU (Faculty of Agriculture, Hokkaido Univ., Japan) 15o9

Leuconostoc mesenteroides IAM (Institute of Applied Microbiology, university of Tokyo, Japan)1151

909807/0657 Minimal-Inhibitionskonzentrationen (mcg/ml)

6,25 > 1oo 12,5 25 5o 5o 1oo > 1oo 25 1oo 6,25 6,25 12,5 12,5 6,25

6,25 6,25

5o

12,5

2911035

Tabelle IV

Indikatorstämme Minimal-Inhlbitions-

konzentrationen (mcg/ml)

Bacillus subtilis ATCC 66 33 6,25

Staphylococcus aureus IAM 3o7 6,25

Escherichia coil >1oo

Proteus vulgaris IFO 3851 >1oo

Pseudomonas fluorescens IAM 12o22 >1oo

Serratia marcescens IFO 3o46 >1oo

Candida utilis IAM 4264 >1oo Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9o8o >1oo

Aspergillus niver ATCC 9642 >1oo

Penicillium glaucum AHU 8287 >1oo

Weiterhin wurden die biochemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz C-36o3 ermittelt; es handelt sich dabei um folgendes. Zur Untersuchung der antimikrobiellen Aktivität der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz zwecks Bestimmung der biochemischen Eigenschaften wurde die Überlagerungsmethode (overlaying method; "An Old Boys ¹S Association of Institute of Medical Science", University of Tokyo, Säikin-gaku Jisshuteiyo; Practical Summary of Microbiology, 5. Auflage, 1974) verwendet. Dabei wurde ein sterilisiertes halbfestes Medium (pH 6,8; Agarkonzentration o,75 %), das 1,o % Pepton, o,5 % Hefeextrakt, 1,o % Natriumacetat und 1,o % Glucose enthielt, mit dem Indiaktorstamm beimpft; dieses Medium wurde

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in sterilisierte Testzylinder pipettiert; nach der Verfestigung des Mediums wurde die wäßrige Lösung der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz mit 1 ml überschichtet bzw. überlagert und 16 Stunden lang bei 37°C bebrütet. Die Länge der Inhibitionszone, die nach der Inkubation erhalten wurde, wurde gemessen; diese Länge wurde als Inhibitionsaktivität definiert. Wie aus Fig. 3 ersichtlich, stehen der Logarithmus der Konzentration der Inhibitionssubstanz und die Länge der Inhibitionszone (Indikatorstanun: Streptococcus mutans HS-6) in proportionaler Relation, so daß durch Messung der Länge der Inhibitionszone die Konzentration der erfindungsgemäßen Inhibitionssubstanz ermittelt werden kann.

1) Wärmestabilität

Selbst wenn die Wärmebehandlung bei 1oo°C 1o Minuten lang bei pH-Werten von 2, 7 und 11 ausgeführt wird, nimmt die Inhibitionsaktivität nicht ab. Ferner ist festzustellen, daß selbst dann, wenn die Wärmebehandlung in einem Autoklaven bei 121°C 1o Minuten lang bei einem pH-Wert von 2 ausgeführt wird, die Inhibitionsaktivität nicht abnimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle V veranschaulicht.

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Tabelle V

Behandlungsmethode

1. pH 2-nicht-wärmebehandelte Inhibitionssubstanz

2. pH 2-1oo C-1 ο min.-wärmebehandelte Inhibitionssubstanz

3. pH 2-121°C-1o min.-wärmebehandelte Inhibitionssubstanz

4. pH 7-nicht-wärmebehandelte Inhibitionssubstanz

5. pH 7-1oo°C-1o min.-wärmebehandelte Inhibitionssubstanz

6. pH 11-nicht-wärmebehandelte Inhibitionssubstanz

7. pH 11-1oo°C-1o min.-wärmebehandelte Inhibitionssubstanz

Inhibitionsaktivität (Indikatorstamm: Streptococcus mutans HS-6) 3,5 mm 3,5 mm 3,5 mm 3,9 mm 3,9 mm 3,7 mm 3,7 mm

Fußnote: Die Inhibitionssubstanzen bei pH 2 und pH 11 werden nach der Wärmebehandlung neutralisiert. Die Konzentration der Inhibitionssubstanz zum Zeitpunkt der Wärmebehandlung beträgt 8o mcg/ml.

2) pH-Stabilität

Die Inhibitionssubstanz ist in Bereich von pHi bis pH 12 stabil. Die Stabilität der Inhibitionsaktivität in wäßrigen Lösungen bei verschiedenen pH-Werten ist in Tabelle VI veranschaulicht.

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Tabelle VI

pH Inhibitionsaktivität

(Indikatorstamm: Streptococcus mutans HS-6)

1 4,1 mm

2 4,1 mm

3 4,ο mm

4 4,ο mm

5 3,9 nm

6 4,ο mm

7 3/9 mm

8 3,9 mm

9 4,o mm

3,8 mm 3,8 mm 4,ο mm

Fußnote: Die Inhibitionssubstanzen, die dem jeweiligen pH (Konzentration 14o mcg/ml) unterworfen wurden, wurden 17 Stunden lang bei 37 C stehengelassen; danach erfolgte Neutralisierung und Verdünnung bis zu einer Konzentration von 8o mcg/ml.

3) Effekt der Enzymbehandlung

Papain, Pronase, Pronase E, Trypsin, oC-Chymotrypsin, Lipase, Phospholipase C und oc-Amyläse wurden unter den Bedingungen, wie in der nachstehenden Tabelle VII angegeben, zugegeben; als

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- 13 -

Ergebnis davon zeigte sich, daß die erfindungsgemäße Inhibitionssubstanz einen gewissen Verlust an Inhibitionsaktivität in den Fällen der 06-chymotrypsin-Behandlung und der Trypsin-Behandlung bei sehr hoher Enzymkonzentration (Enzym 5 ooo meg/ml: Substrat 15o mcg/ml) verursachte.

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Tabelle VII

Enzym

Bedingungen der Enzymbehandlung

O CO CX) O

pH Tempe- Zeit Enzymratur konzentration

Konzentration der Inhibitionssubstanz

(⁰C)

(min.)(mcg/ml) (mcg/ml) Inhibitionsaktivität (Indikatorstamm;

Streptococcus mutans HS-6

Inhibitionssubstanz Inhibitionssubstanz ohne Zugabe v.Enzym mit Zugabe v.Enzym Länge der Verblei- Länge der Verblei-Inhibiti- Lende Ak- Inhibit!- bende Aktionszone tivität onszone vität (mm) (%) (mm) (%)

Papain W-4o
(Amano

Pharmaceutical Co.,Ltd.

7,o 37
7,o 37

7o 7o

1o 000 5oo

I60 I00

I00 I00

Pronase
(CALBIOCHEM)

8,1 25
8,1 25
8,1 25

138o 138o 138o

15o 5o 1o

145 145 145

I00 I00 I00

Pronase E

(Kaken
Chemical
Co.,Ltd.)

8.0 45

8.1 25
8,1 25
8,1 25

7o

138o 138o 138o

5oo

15o

5o

1o

I00 145 145 145

I00 I00 I00 I00

Trypsin£-I

(Sigma
Chemical
Co.)

7,o 37

60 60 60 60

5 000

I00

5o

1o

15o 15o 15o 15o 4,9
4,9
4,9
4,9 ■

I00 I00 I00 I00

5,o

4,4

4,8
4,8
4,8

4,4
4,8
4,8
4,8

4,3
4,9
4,9
4,9

I00 I00

I00 IOO I00

IOO IOO IOO IOO

66 I00 I00 I00

Tabelle VII (Fortsetzung)

O (D OO O

ö cn on

oc-Chymo trypsin	7,8 7,8	co co CS CS	4oo 4oo	2 oo 15o
E-II	7,8	28	4oo	1oo
(Sigma Chemical Co.)	7,8 7,8	28 28	4oo 4 oo	5o 1o
Lipase M-AP-1ο	7,ο	37	6o	5ooo
(Amano Pharmaceu tical Co., Ltd.)	7,ο	37	7o	5oo

Phospholi-

15o 15o 15o 15o 15o

4,9 4,9 4,9 4,9 4,9

1oo
1oo
1oo
1oo
1oo

15o 1oo

4,9

4,4

1oo
1oo

pase C	7,ο	37	7o	5 oo
(Sigma Che mical Co.)	7,ο	37	6o	375
©C-Amylase	7,ο	37	7o	5 oo
(Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.)	7,ο 7,o	25 25	138o 138o	15o 5o
	7,ο	25	138o	1o

1oo 15o

4,4 4,9

1oo
1oo

1oo 145 145 145

4,4 4,8 4,8 4,8

1oo
1oo
1oo
1oo

2,4 2,9 3,1 3,9 3,9

4,9 4,4

4,4 4,9

4,4 4,8 4,8 4,8

17 24 28 49 49

1oo 1oo

1oo 1oo 1oo 1oo

Fußnote: Die verbleibende Aktivität wurde an der prozentualen Aktivität der Inhibitionssubstanz ohne Zugabe von Enzym auf der Basis der Konzentration gemäß Fig.3 gezeigt,

Berichte, worin über Substanzen mitgeteilt wird, die ähnlich der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz C-36o3 sind, sind folgende:

J.R.Tagg et al, "J.Exp.Med.*, 138 (1973), 1168 D.Paul und H.D.Slade , "Infect.Immun", 12 (1975), 1375 T.Yamamoto et al, "Archs oral Biol.", 2o (1975), 389 Katsuyuki Futakami _t Japanische Patentpublikation No. 44296/77.

Die Substanz, über die von J.R.Tagg et al (siehe oben) berichtet wird, wird jedoch unter alkalischen Bedingungen oberhalb pH 11 vollständig inaktiviert; im Gegensatz dazu ergibt sich bei der erfindungsgenäßen antimikrobiellen Substanz C-36o3 kein Verlust an Inhibitionsaktivität. Außerdem ergibt sich. (bei der bekannten Substanz) durch Zugabe von und Behandlung mit Pronase und Trypsin eine vollständige Inaktivierung, während bei der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz C-36o3 kein Verlust an Inhibitionsaktivität durch Pronase entsteht und diese Substanz bemerkenswert widerstandsfähig gegenüber Trypsin ist, wie aus Tabelle VII ersichtlich ist.

Ferner zeigt die Substanz, die in der Veröffentlichung von J.R.Tagg et al berichtet wird, keine Inhibitionsaktivität gegenüber Staphylococcus aureus> während dagegen die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-36o3 entsprechende Inhibitionsaktivität zeigt.

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Die von D.Paul et al berichtete Substanz hat ein

Molekulargewicht oberhalb 2o ooo, während dagegen die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-36o3 ein solches von 6 ooo bis Io ooo hat. Während außerdem die Substanz gemäß D. Paul et al bei einem pH-Wert von 11 vollständig inaktiviert wird, wird die erfindungsgeiräße antinikrobielle Substanz C-36o3 bei diesem pH nicht inaktiviert.

Überdies wird die bekannte Substanz durch Zugabe von und Behandlung mit Pronase,Phospholipase C und Trypsin vollständig inaktiviert, während die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-36o3 durch solche Zugabebehandlungen von Pronase und Phospholipase C nicht inaktiviert wird und gegenüber Trypsin, wie aus Tabelle VII ersichtlich ist, bemerkenswert widerstandsfähig ist.

Unter Bezugnahme auf das Inhibitionsspektrum zeigt fernerhin die von D.Paul et al berichtete Substanz keine Inhibitionsaktivität gegenüber Streptococcus mutans BHT und JC-2 und gegenüber Bacillus subtilis, während die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-36o3 demgegenüber entsprechende Inhibitionsaktivität darbietet.

Die von T. Yamamoto et al berichtete Substanz wird durch Zugabebehandlung von Pronase E vollständig inaktiviert und im Inhibitionsspektrura zeigt sich keine Inhibitionsaktivität gegenüber Streptococcus mitis ATCC 12396 und Streptococcus CKT, während die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-36o3

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durch Zugabebehandlung von Pronase E, wie aus Tabelle VII ersichtlich ist,nicht inaktiviert wird und eine Inhibitionsaktivität gegenüber diesen beiden Stämmen zeigt.

Aus der Beschreibung der japanischen Patentpublikation No. 44 296/77 ist ersichtlich, daß die inhibierende Substanz eine neutrale Substanz gemäß den Daten zu den physikalischen und chemischen Eigenschaften ist? demgegenüber ist die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-36o3 eine basische Substanz mit einem isoelektrischen Punkt von 1o,o + o,2. Außerdem ist (für die bekannte Substanz) beschrieben, daß sie nahezu vollständig durch Zugabebehandlung von Lipase inaktiviert wird; dazu ist ferner angegeben, daß ein Lipid als aktive Stelle der Inhibitionssubstanz enthalten ist; dagegen verursacht die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-36o3 keinen Verlust an Inhibitionsaktivität durch Lipase, wie aus Tabelle VII ersichtlich ist; ferner werden Fettsäuren (C. bis C.g) nicht festgestellt, wie sich an den Resultaten der Analyse der Fettsäuren zeigt. Mit Bezug auf das Inhibitionsspektrum zeigt ein Vergleich zwischen der Inhibitionsaktivität der erflndungsgemäßen antimikrobiellen Substanz C-36o3 und derjenigen gemäß der genannten japanischen Patentpublikation, daß wesentliche Unterschiede in der Inhibitionsaktivität gegenüber streptococcus mutans GS-5, 6715, PK-1, PS-14 und OMZ-61, die als Teststärme eingesetzt werden, bestehen.

Der Vergleich der vorstehenden Daten veranschaulicht, daß die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-36o3 wesentliche

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Unterscheidungen gegenüber den genannten analogen Substanzen aufweist. Ersichtlich ist daher die antimikrobiell Substanz O36o3 gemäß der Erfindung eine neue antimikrobielle Substanz.

Um in vitro den Schutzeffekt gegenüber Zahnkaries bei der erfindungsgemäßen antimirkobiellen Substanz C-36o3 zu ermitteln, wurden Kulturtests zur Prüfung der Bildung von anhaftendem Polysaccharid ausgeführt. So wurden 1o ml flüssiges Medium (pH 6,8), enthaltend 2,ο % Pepton, o,2 % NaCl, o,3 % K₂HPO₄, o,2 % KH₂PO₄, o,1 % K₃CO₃, 0,o12 % MgSO₄ 7·Η₂Ο, o,oo15 % MnSO₄*4-6 H₂O, 1o % Sucrose und verschiedene Mengen der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz C-36o3, mit cariogenen Bakterien oder frischen Zahnproben bzw. Zahnflecken aus einer menschlichen oralen Kavität beimpft; dann wurde ein korrosionsfester Draht mit einem Durchmesser von 0,8 mm ( befestigt durch Einsetzen mithilfe eines Wattebausches) in das Medium eingetaucht. Nach anaerober Kulturierung während eines Tages bei 37°C wird der korrosionsfeste Draht in ein frisches Medium übergeführt, das mit cariogenen Bakterien oder Zahnproben bzw. Zahnflecken beimpft worden ist;die Kulturierung wird wiederholt. Diese Arbeitsvorgänge werden 1o Tage lang wiederholt; dann wird die Menge des unlöslichen Polysaccharids, die am korrosionsfesten Draht anhaftet, bestimmt. Gleichzeitig werden die Wachstumsbedingungen der Mikroorganismen bestimmt, nämlich durch Beobachtung der Trübung der Kulturflüssigkeit mit dem bloßen Auge und pH-Messung. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VIII veranschaulicht.

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Tabelle VIII Wachstumsbedingungen

Polysaccharid

ca co ο» -a

Streptococcus-Stamm Konzentration

oder Zahnfleck bzw. der antimikro- Beobachtung mit pH der Flüssig-(anhaftend am

Zahnprobe biellen Substanz dem bloßen Auge keit nach dem korrosionsfesten

(mcg/ml) Kulturieren Draht)(mg)

Streptococcus salivarius HHT

Zahnfleck bzw. Zahnprobe

2,5 25 5o

2,5 25

5o

4,5
4,6
6,6
6,6

4,2
4,2
4,3
4,3

6,68 4,9o o,o4 o,o3

6,44 7,15 o,94 o,o6

Fußnote: Beobachtung mit dem bloßen Auge; + = reichliches Wachstum

- = kein Wachtsum zu beobachten

Polysaccharidanteile zeigen sich an der Umwandlung in Glucoseanteile unter Anwendung der Phenolschwefelsäuremethode.

CO O OJ

Im Fall von Streptococcus salivarius HHT wurde das Wachstum bei einer Konzentration der Inhibierungssubstanz oberhalb 25 mcg/ml merklich verhindert; die Polysaccharidir.enge, die am korrosionsfesten Draht anhaftete, wurde merklich vermindert, nämlich im Vergleich mit der Kontrollprobe (Konzentration der Inhibierungssubstanz: O mcg/ml). In Fall einer menschlichen Zahnprobe bzw. eines menschlichen Zahnfleckes wurde eine Wachstumsverhinderung selbst bei einer Konzentration der Inhibierungssubstanz oberhalb 25 mcg/ml nicht beobachtet; jedoch wurde die Menge des anhaftenden Polysaccharids mehr als bei der Kontrollprobe erheblich vermindert. Dementsprechend zeigt sich, daß die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-36o3 wesentliche Effekte auf die Verhinderung der Bildung von Polysacchariden ausübt, die als Ursache der Zahnkaries anzusehen sind; die erfindungsgemäße Substanz kann daher in der erwarteten Weise besonders vorteilhaft zur Verhinderung von Zahnkaries eingesetzt werden. Zur Nutzbarmachung solcher Verhindungseffekte und für die medizinische Behandlung von Zahnkaries kann die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-36o3 als wirksame Komponente in Zahnpasten, in Arzneimitteln (die auf Oralkavitäten aufgebracht werden^ in Gurgelwasser, Salben, Kaugummi, Plätzchen oder allgenein in Lebensmitteln etc. verwendet werden. Außerdem hat die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-36o3 ein spezifisches Inhibitionsspektrum, so daß sich verschiedene andere Einsatzzwecke ergeben. Beispielsweise zeigt sich eine starke Inhibitionsaktivität gegenüber Streptococcus pyogenes; demgemäß kann die Substanz zur Verhinderung und zur medizinischen Behandlung von

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akuten rheumatischen fieberhaften Erkrankungen und Scharlacherkrankungen eingesetzt werden, wobei es sich nämlich um infektiöse Erkrankungen handelt, die durch Streptococcus pyogenes verursacht werden.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Beispiele näher veranschaulicht.

Beispiel 1

Streptococcus mutans C-36o3, FERM-P No. 4128 und ATCC No. 31383 wurde in 1oo ml eines flüssigen Mediums (pH 7,7) eingebracht, enthaltend 1,o % Glucose, 2,ο % Pepton, o,5 % KaCl, o,3 % K₃HPO₄, o,2 % KH₂PO₄, o,o1 % MgSO₄*7 H₃O und o,oo2 % MnSO₄* 4-6 H₃O; die statische Kulturierung wurde einen Tag lang bei 37 C unter aeroben Bedingungen ausgeführt. Die resultierende Kulturflüssigkeit wurde in 1o 1 desselben Mediums, wie vorstehend beschrieben, eingeimpft; das Gemisch wurde einer statischen Kulturierung bei 37°C 2o Stunden lang unter aeroben Bedingungen unterworfen. Die so erhaltene Kulturflüssigkeit wurde kontinuierlich bei 2o 000 G zentrifugiert, wobei sich eine überstehende Flüssigkeit ergab. Danach wurde diese überstehende Flüssigkeit mit 3,8 kg Ammoniumsulfat versetzt und eine Nacht lang bei etwa 5°C stehengelassen. Der so gebildete Niederschlag wurde durch kontinuierliches Zentrifugieren bei 2o 000 G gewonnen. Der erhaltene Niederschlag wurde in einer kleinen llenge einer Phosphatpufferlösung (1o Mol, pH 7,o) aufgelöst. Danach wurde die sich ergebende Lösung 1o Minuten lang

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bei 12 ooo G zentrifugiert, um so den Niederschlag zu entfernen. Die auf diese Weise erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Kolonne (5,ο χ 3o cm), gefüllt mit CM-Sephadex C-25, das zuvor mit derselben Pufferlösung gepuffert worden war, gegeben; auf diese Weise wurde die Inhibtionssubstanz darauf adsorbiert; danach wurde dieselbe Pufferlösung weiterhin durch die Kolonne gegeben, um diese eingehend auszuwaschen.

Anschließend wurde nach dem Auswaschen durch Hindurchgeben einer Lösung, eingestellt auf pH 9,5 durch Zugabe von Natriunhydroxyd zur Phosphatpufferlösung (5 x 1o Mol, pH 7,ο), eine Pufferlösung von pH 1o,8, eingestellt in derselben Weise durch Zugabe von Natriumhydroxyd,hindurchgeleitet, um die Inhibitionssubstanz zu eluieren. Die eluierte Lösung wurde durch die Sephadex G-25-Kolonne (5,5 χ 8o cn) zwecks Entionisierung gegeben; die erhaltene Lösung mit der Inhibitionssubstanz wurde gefriergetrocknet, wobei sich etwa 8o ng der weißen gereinigten Inhibitionssubstanz ergaben. Die antinikrobielle Substanz, die auf diese Weise gereinigt worden war, zeigte eine einzelne Eande bei der Polyacrylamid-Gel-Platten-Elektrophorese (Polyacrylamid 15 %, pH 2,3 Gel).

Beispiel 2

Zu 1o 1 der gemäß Beispiel 1 erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurden 4o 1 deionisiertes Wasser gegeben. Die so erhaltene verdünnte überstehende Flüssigkeit wurde durch eine CM-Sephadex C-25-Kolonne (5,ο χ 3o cm) gegeben, die zuvor mit einer Phosphat-

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pufferlösung (1o~ Hol, pH 7,o) gepuffert worden war; so wurde die Inhibitionssubstanz darauf adsorbiert; dieselbe Pufferlösung wurde weiterhin durch die Kolonne hindurchgeleitet, um diese eingehend auszuwaschen.

Im Anschluß daran wurde nach dem Auswaschen durch Hindurchleiten einer Lösung, eingestellt auf pH 8,0 durch Zugabe von Natriumhydroxyd zu einer Phosphatpufferlösung (5 χ 1o Mol,

_2 pH 7,o), eine Phosphatpufferlösung (1o Mol, pH 7,o), enthaltend 3,o % NaCl, hindurchgeleitet, um die Inhibitionssubstanz zu eluieren. Die eluierte Lösung wurde durch die Sephadex G-25-Kolonne (5,5 χ 8o cm) zwecks Deionisierung gegeben; die so erhaltene Lösung der Inhibitionssubstanz wurde gefriergetrocknet, wobei sich etwa 14o mg der weißen gereinigten antimikrobiellen Substanz ergaben.

Die nach dieser Arbeitsweise gereinigte antimikrobiell Substanz zeigte eine einzelne Bande bei der Polyacrylamid-Gel-Platten-Elektrophorese (Polyacrylamid 15 %, pH 2,3 Gel).

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Claims

Dr. D.Thomsen PATE NTANWALTS BÜRO Telefon (089) 530211 - 530212 W. Wein kaUff O Ο 1 O Π 3 B Telegramm Adresse Cable address Telex 5 24303 xpert d PATENTANWÄLTE München: Frankfurt/M.: Dr. rer. nat. D. Thomsen Dipl.-lng. W. Weinkauff (Fuchshohl 71) Dresdner Bank AG, München, Konto 5574 8000 München Kaiser-Ludwig-Platz6 29. April 1978 The Calpis Food Industry Co., Ltd. Tokyo, Japan Antimikrobiell Substanz C-36o3 und Verfahren zur Herstellung derselben Patentansprüche

1) Antimikrobiell Substanz C-36o3 mit folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

1. Molekulargewicht: 6 ooo bis 1o ooo (bestimmt durch

SDS-Polyacrylamid-Gel-Platten-Elektrophorese)

2. Zersetzungspunkt: 19o bis 195°C

3. Ultraviolett-Absorptionsspektrum: aufgenommen in

wäßriger Lösung in der Darstellung gemäß Fig. 1

1 % und mit Absorptionsmaxima bei 28o nm (E₁ : 4o) und

289 nm (E^ : 33)

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4. Infrarot-Absorptionsspektrum: in der Darstellung gen.äß

Fig. 2 gemessen nach der KBr-Pelletmethode und mit Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenzahlen (ausgedrückt in reziproken cn): 329o, 165o, 1535, 124o, 11o5, 733

5. Lösungsmittel-Löslichkeit: leicht löslich in wäßriger

Lösung einer Säure (pH 3,o) und praktisch unlöslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Essigsäureäthylester, Chloroform, η-Hexan und Benzol

6. Farbreaktion: positive Farbreaktionen mit Ninhydrin,

Biuret, Xanthoprotein und Adamkiewicz

7. Isoelektrischer Punkt: pi = 1o,o + o,2 (isoelektrische

Separation, bestimmt mit Polyacrylamid-Gel-Platten)

8. Farbe und Form: weißes Pulver

9. Aminosäureanalyse: durch p-Toluolsulfonsäure-IIydrolyse

ergibt sich Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Lysin, Ammoniak und Arginin, jedoch nicht Prolin, Cystein und Histidin.

2) Verfahren zur Herstellung der antimikrobiellen Substanz C-36o3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine gewisse Spezies von genus Streptococcus unter Erzeugung der antinikrobiellen Substanz C-36o3 in einem Medium kultiviert und die antinikrobielle Substanz C-36o3 aus dem resultierenden Kulturmedium isoliert.

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