CH616958A5

CH616958A5 -

Info

Publication number: CH616958A5
Application number: CH801375A
Authority: CH
Inventors: Jun Ichi Shoji; Mikao Mayama; Shinzo Matsuura; Kouichi Matsumoto; Yoshiharu Wakisaka
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1974-06-19
Filing date: 1975-06-19
Publication date: 1980-04-30
Also published as: DE2526250A1; NL7507346A; FR2275223B1; JPS50160490A; US3969501A; GB1492897A; FR2275223A1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums 342-14-1, das antibakterielle Wirkung hat, wobei man einen dieses Antibiotikum produzierenden Bacillusstamm in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert und das Antibiotikum 342-14-1 aus dem Kulturboden isoliert.

Im Zusammenhang mit der Forschung neuer Fermentationsprodukte wurde neulich entdeckt, dass ein zur Species Bacillus brevis gehörender Mikroorganismus, welcher bei der Shionogi Research Laboratory, Shionogi & Co., Ltd., Osaka, Japan, Sammlung unter der Nummer 342-14 registriert wurde, und welcher beim Fermentation Research Institute (eine Tochtergesellschaft der Agentur für industrielle Entwicklung und Technologie, Japan) unter der Nummer FERM-P 2363 hinterlegt wurde, und welcher bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 21. November 1973, unter der Nummer ATCC 21991 hinterlegt wurde, bei Kultivation in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen das neue Antibiotikum 342-14-1 produziert. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Erkenntnis verwirklicht. Dementsprechend ist Hauptziel der vorliegenden Erfindung die Schaffung eines neuen und wertvollen Antibiotikums, welches als Wachstumshemmer grampositiver pathogener Mikroorganismen (einschliesslich resistenter Bakterien) wirksam ist. Diese und andere durch die vorliegende Erfindung erreichbare Ziele werden dem Fach-5 mann auf diesem Gebiet durch die nachfolgende Beschreibung offensichtlich.

Bacillus brevis Nr. 342-14 wurde aus einer in Thailand gesammelten Fleckenprobe isoliert und zeigt die folgenden morphologischen Eigenschaften:

10 I. Morphologische Eigenschaften (während 1-4 Tagen bei 28 °C auf einem IM-Medium kultiviert).

1. Form und Anordnung: Stäbchen mit abgerundeten Ecken, welche einzeln oder in Masse auftreten.

2. Bewegungsfähigkeit: beweglich (aktiv)

3. Flagellen: peritriche Flagellen

4. Grösse : gewöhnlich 0,6-0,7 x2,5-6,0 p,.

5. Irreguläre Formen: nicht beobachtet

6. Sporangien: Endosporen dehnen das Sporangium in begrenzter oder unterbegrenzter Form aus; das Sporangium ist

20 trommelstockartig.

7. Endosporen: gewöhnlich 0,8-1,2 jx, elliptisch. Die Sporen sind leicht färbbar. Die Sporenbildung ist relativ langsam.

8. Gramart: grampositiv

IM-Medium: 0,2% lösliche Stärke, 0,2% Glycerin, 0,25% 25 Pepton, 0,25% Rindfleischextrakt, 0,25% Hefeextrakt, 0,3% Natriumchlorid, 1,0-1,2% Agar. Der pH-Wert des IM-Mediums ist 6,8.

II. Eigenschaften der Kultur

30 A. Agarkolonien (Plattenkulturen im PB-Medium bei 28 °C während 1-7 Tage)

1. Form: kreisförmig

2. Oberfläche: glatt und scheinend (Kolonien während einem Tag kultiviert). Mit dem Altern wird der Glanz trübe.

35 3. Kanten : unversehrt

4. Erhöhung: konvex

5. Konsistenz: butterig

6. Optische Dichte: durchscheinend

B. Agarkolonien (Schrägkulturen auf PB-Medium während 40 1-7 Tagen bei 28 °C)

1. Wachstum: reichlich

2. Form: Filiform

3. Chromogenese der Zelle: nicht chromogen

4. Diffusionsfähiges Pigment: nicht beobachtet

45 5. Oberfläche: glänzig (Kultur nach einem Tag) und trübglänzend (Kultur nach über 2 Tage).

6. Konsistenz: butterig bis leicht viskos

7. Optische Dichte: durchscheinend

C. Flüssiges Medium (Kultur auf GPB-Medium während so 1-7 Tagen bei 28 °C)

1. Wachstum auf der Oberfläche: manchmal Ringe an der Oberfläche im flüssigen Medium

2. Wachstum im Medium: Wachstum mässig und gleichförmig. Langsame Sedimentbildung ss D. Gelatinstab (Kultur während 1 -8 Tagen bei 28 °C auf Gelatine-Hefeextrakt-Medium)

1. Wachstum: mässig

2. Verflüssigung: verflüssigt

E. Lackmusmileh (Kultur während 1-8 Tagen bei 28 °C) 60 1. Lackmus-Reaktion : negativ

2. Peptonisierung: positiv (Kultur nach 4-8 Tagen)

3. Koagulation: nicht beobachtet

PB-Medium: 1% Pepton, 0,5% Rindfleischextrakt, 0,3 % Natriumchlorid, 1,2-1,5% Agar. pH-Wert des Mediums 6,8. es GPB-Medium: PB-Medium + 1% Glukose.

III. Physiologische Eigenschaften

1. Sauerstoffbedarf: aerob (Kultur auf GPYB-Medium

[Agarstab] während 1-4 Tagen bei 28 °C)

2. Wachstumstemperatur: die optimale Wachstumstemperatur liegt bei ungefähr 28 °C

3. pH-Wert für das Wachstum: der pH-Wert für das optimale Wachstum liegt zwischen 6,85 und 8,5 [IR-Medium]

4. Nitratreduktion: negativ

5.0-F-Text: Oxidativer Typ. Säure und Gas wird nicht produziert (GPYB-Meäium + 0,015% BCP)

6. Voges-Proskauer-Reaktion: negativ

7. Indolbildung: negativ

8. Schwefelwasserstoffbildung: negativ (Difco Peton-Eisen-Agar)

9. Stärkehydrolisation: negativ

10. Citratverwendung:kein Wachstum auf Koser und Christensen-Medium

11. Oxidasetest: positiv (PB-Medium)

12. Katalase-Wirksamkeit: positiv (PB-Medium)

13. Tyrosinase-Wirkung: negativ

14. Verwendung von Kohlehydraten (Kulturen während 1-7 Tagen bei 28 °C).

"Synthetisches Medium

Kohlenhydrat Wachstum Gas Säure

Mannit

-: kein Wachstum. Keine Gas- und Wasserbildung "Nährmedium

Kohlenhydrat Wachstum Gas Säure

L-Arabinose

+

D-Xylose

+

-

D-Glukose

+

D-Mannose

+

-

D-Galactose

+

-

D-Fructose

+

-

Sucrose

+

Maltose

+

Lactose

+

•

Trehalose

+

Stärke

+

-

Glycogen

+

-

Inulin

+

-

Glycerin

+

-

Inositol

+

-

Adonitol

+

-

Mannit

+

-

Sorbit

+

-

Salicin

+

-

a-Methylglucosid

+

-

+: gutes Wachstum. Keine Säurebildung. -: weder Gas- noch Säurebildung.

15. Natriumchloridresistenz (Kultur während 1-5 Tagen bei 28 °C auf GPB-Medium): geringes Wachstum bei 5 und 7,5% Natriumchlorid; kein Wachstum bei 10% Natriumchlorid. GPYB-Medium: 1% Glukose, 0,5% Pepton, 0,2% Hefeextrakt, 0,3% Rindfleischextrakt, 0,4% Agar. pH-Wert des Mediums 6,6.

Aus den obenerwähnten Resultaten geht hervor, dass der zu klassifizierende Stamm zum Genus Bacillus gehört. Weitere Vergleiche der morphologischen, kulturellen und physiologischen Eigenschaften mit manchen Bacillus-Species, welche in

616958

Bree, R. S., Murray, E.G.D., & Smith, N. R. (1957), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe: Baltimore, The Williams & Wilkings Company, Gibbs, tôt. & Shapton, D. A., (1968) Identification Methods for Microbiologists: Academic Press, London, New York, Laskin, A. I. & Iechevalier, H. A, (1972) Handbook of Microbiology, Band I: CRC Press, Ohio, und anderer Literatur beschrieben sind, zeigen, dass dieser Stamm in den meisten Eigenschaften dem Bacillus brevis sehr ähnlich ist. Hieraus wird geschlossen, dass der beschriebene Stamm der Species Bacillus brevis angehört, und dieser Mikroorganismus wurde dementsprechend als Bacillus brevis Nr. 342-14 bezeichnet.

Es ist zu beachten, dass das erfindungsgemässe Verfahren nicht auf die Verwendung des Bacillus brevis Nr. 342-14 eingeschränkt ist. Es ist inbesondere erwünscht und beabsichtigt, die Verwendung natürlicher oder künstlicher Mutanten dieses Organismus oder von Varianten, die zum Bacillus brevis gehören, mit einzuschliessen, sofern sie das Antibiotikum 342-14-1 produzieren können. Die künstliche Herstellung von Mutanten kann in herkömmlicher Weise, wie Röntgen- oder Ultraviolett-Bestrahlung, Stickstoffmastarde, 4-Nitrochinolin-N-oxid, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin und andere Mutagene erfolgen.

Gemäss der vorliegenden Erfindung wird das neue Antibiotikum 342-14-1 durch Kultivation des Mikroorganismus hergestellt. So z. B. wird Bacillus brevis Nr. 342-14 in einem wässrigen Nährmedium einer Temperatur von 20-37 °C, vorzugsweise bei 25-35 °C, unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise sub-mers unter aeroben Bedingungen, kultiviert. Die Zusammensetzung des Nährmediums kann über einen weiten Bereich variiert werden. Wesentlich ist, dass eine Kohlenstoff-, Stickstoff-und Spurenelementquelle vorhanden ist. Beispiele geeigneter Kohlenstoffquellen sind Glukose, Maltose, Sucrose, Xylose, Fructose, Galactose, Inosit, Mannit, Glycerin, Dextrin, Stärke, organische Säure, Melasse, Reis, Weizen, Kartoffeln und dergleichen. Für den Fermentationsvorgang geeignete Stickstoffquellen umfassen Fleischextrakt, Pepton, Sojabohnenmehl, Getreidequellflüssigkeit, Malzextrakt, Hefeextrakt, Erdnuss-mehl, Aminozucker, Baumwollsammehl, Casaminsäure, NZ-Amin, Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumchlorid und dergleichen. Beispiele für geeignete Quellen für anorganische Elemente sind Mineralsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Kaliumphosphat und dergleichen. Vor der Einpflanzung des Mikroorganismus kann das Nährmedium auf einen pH-Wert von 5,0-8,5 eingestellt werden, was aber nicht unbedingt erfolgen muss. Der pH-Wert tendiert dazu, während der Fermentation bei ungefähr diesem Niveau zu bleiben, doch können, falls Abweichungen festgestellt werden, Puffer, wie Calciumcarbonat, zugegeben werden, um das Medium bei einem pH-Wert von 5,0-8,5 zu halten. Für den Fall, dass übermässige Schaumbildung beobachtet wird, können vor oder während der Fermentierung Anti-schaummittel,,wie pflanzliche Öle, Malzöl oder Propylenglykol zugesetzt werden. Bei Produktion in grösserem Umfang wird die Fermentation vorzugsweise submers unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die höchsten Ausbeuten an Antibiotikum 342-14-1 werden während 20-100 Stunden, gewöhnlich nach 40 Stunden, der Fermentation erreicht, wobei optimale Bedingungen betreffend Temperatur und Belüftung einzuhalten sind.

Nach Wachstum des Mikroorganismus kann das Antibiotikum 342-14-1 in herkömmlicher Weise vom Kulturboden gewonnen werden. Aus dem Fermentationsboden erhält man die Zelle durch Standardgeräte, wie Filterpresse oder Zentrifuge, worauf das Antibiotikum 342-14-1 von der Zelle durch Lösungsmittelextraktion gewonnen werden kann. Sofern das Antibiotikum 342-14-1 vom Filtrat in kleinen Mengen erhalten wird, wird vorteilhaft eine Lösungsmittelextraktion durchge3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

616958

25

30

führt, um das Antibiotikum vom Filtrat oder vom ganzen Boden, welcher die Zelle enthält, wieder zu gewinnen. Geeignete Extraktionslösungsmittel umfassen Dimethylsulfoxid, wässriges Methanol, wässriges Äthanol, wässriges Butanol, wässriges Aceton und dergleichen. Falls das Antibiotikum aus 5 einer grossen Menge von Boden extrahiert wird, ist ein Adsorptionsverfahren dem direkten Lösungsmittelextraktionsverfahren überlegen. So z. B. kann der ganze Nährboden nach Zusatz eines Adsorptionsmittels, wie «Hyflo Super Cel» (Kieselgur) filtriert werden und der erhaltene Kuchen von Adsorptionsmittel io und Zelle zur Extrahierung des Antibiotikums mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, wäss-rigem Methanol, wässrigem Äthanol, wässrigem Butanol oder wässrigem Aceton, behandelt werden. Der Extrakt kann konzentriert und falls nötig zur Fällung des rohen Wirkstoffes mit 15 einem geeigneten Lösungsmittel versetzt werden.

Der so erhaltene rohe Wirkstoff kann, falls erwünscht,

durch geeignete Operationen, wie Wiederfällung, Chromatographie und dergleichen, weiter gereinigt werden. So z. B. kann die Wiederausfällung erfolgen, indem man das rohe Material in 20 einem organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol, löst, einengt, und dann eine Mischung, bestehend aus Essigester und Äther (1 :1 Volumen/Volumen) zugibt. Bevorzugte chromatographische Adsorptionsmittel sind Silicagel, Kieselsäure und dergleichen.

Das so erhaltene Antibiotikum 342-14-1 kann, falls erforderlich, in ein Säureadditionssalz, Ammoniumsalz oder Metallsalz übergeführt werden, welches eine niedrige Toxizität und eine erwünschte Stabilität aufweist und für pharmazeutische Zwecke geeignet ist. Eine solche Überführung kann in herkömmlicher Weise erfolgen, wie z. B. durch Behandeln des Antibiotikums 342-14-1 in einem geeigneten Lösungsmittel mit einer Säure, Ammoniumchlorid oder einem Hydroxid. Beispiele pharmakologisch annehmbarer Säureadditionssalze sind Hydrochloride,.Hydrobromide, Hydrojodide, Sulfate, Phos- 35 phat, Thiocyanate, Oxalate, Succinate und Nitrate. Beispiele von Metallsalzen sind Natriumsalze, Kaliumsalze, Calcium-salze, Magnesiumsalze, Aluminiumsalze, Eisensalze und dergleichen.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Anti-40 biotikums 342-14-1 sind wie folgt:

342-14-1 (freie Form)

1. Elementaranalyse: C: 54,63%; H: 7,12%; N : 14,81%; O: 23,44% (Ausgleich)

Hydrochlorid von 342-14-1:

C: 50,75 ; H: 6,82 ;N: 13,89 ; Cl: 5,05 ; 0:23,49 (Aus- .

gleich)

2. Schmelzpunkt: Die Verbindung schmilzt und zersetzt sich bei 190-195 °C.

Hydrochlorid von 342-14-1: Die Verbindung schmilzt und zersetzt sich bei 195-200 °C.

3. Molekulargewicht: ungefähr 1450 (abgeschätzt aus der Aminosäureanalyse)

Hydrochlorid von 342-14-1: ungefähr 1550 (abgeschätzt aus der Aminosäureanalyse).

4. Spezifische optische Drehung: Hydrochlorid von 342-14-1:

[a]J)2,0 + 6,1 ± 0,5° (c = 1,036%, in Methanol)

5. Ultraviolettabsorptionsspektrum: Hydrochlorid von 342-14-1: ^|X0H: 274 m|i (E{°^m 36), 283 m\i (El*, 39), 290,5 m|i (El cm 34)

6. Infrarotabsorptionsspektrum: Hydrochlorid von 342-14-1 (bestimmt in Kaliumbromid-Tabletten): Vergleiche Fig. 1

7. Löslichkeit: löslich in verdünnten, sauren oder alkalischen Lösungen. Hydrochlorid von 342-14-1: sehr löslich in Methanol wenig löslich in Äthanol. Unlöslich in Essigester, Aceton und Chloroform.

8. Farbreaktion:

Ninhydrin-Reaktion positiv

Ehrlich-Reaktion positiv

9. Farbe und Form der Verbindung: farbloses Pulver, amphotere Substanz

10. Säurehydrolyse: Asparaginsäure (1,92), Threonin (0,62), Glycin (1,23), Valin (0,12), Isoleucin (0,53), Phenylalanin (0,65), Tryptophan (0,77), 2,4-Diaminobuttersäure (0,30), Ammoniak (0,76). (Die Zahlen in Klammern sind jiMol/mg).

Ein Säurehydrolysat des Antibiotikums 342-14-1 wurde mit Äther extrahiert und der Ätherextrakt methyliert, worauf die im Extrakt erhaltene methylierte Fettsäure durch Gaschromatographie analysiert wurde. Als Resultat konnte der Methylester von Anteisononansäure gefunden werden. Aus diesem Grunde zeigt das Antibiotikum 342-14-1 bei der Säurehydrolyse die Bildung von Anteisononansäure.

11. Verhalten bei Dünnschichtchromatographie

Träger

Lösungsmittel

Rf-Wert

Silicagel GF Chloroform-Äthanol-14% 2,0 wässriger Ammoniak (4:7:2, volumenmässig)

Silicagel GF Chloroform-Äthanol-10% 0,14 Essigsäure

(4:7:2, volumenmässig)

Silicagel GF n-Butanol-Essigsäure-Wasser 0,40 (3:1:1, volumenmässig)

45

Das Auffinden der Verbindung auf der entwickelten Silica-gelplatte wurde bioautographisch unter Verwendung von Sta-phylococcus aureus 209 P, der Ninhydrin-Reaktion und Hitzebehandlung der mit Schwefelsäure besprühten Platte durchgeführt.

Das besagte Chromatogramm von 342-14-1, welches wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, zeigt einen einheitlichen Flecken in jedem der obenerwähnten Lösungsmittelsysteme.

Auf der Basis der obigen physikalischen und chemischen Eigenschaften muss das Antibiotikum 342-14-1 als neues Acyl-peptid betrachtet werden.

Das Antibiotikum 342-14-1 zeigt eine Wirkung gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen. Die in vitro antimikrobiologische Wirksamkeit von 342-14-1 wurde durch die Agarplatte-Verdünnungsmethode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1

Testmikroorganismus minimale hemmende

Konzentration

(mcg/ml)

55

65

Bacillus subtilis PCI 219

6,25

Bacillus anthracis

6,25

Staphylococcus aureus FDA 209P JC-1

3,13

Staphylococcus aureus 80257

6,25

Staphylococcus aureus Smith

6,25

Streptococcus pyogenes C-2Cä

3,13

Diplococcus pneumoniae Typ I

6,25

(Streptococcus pneumoniae)

Escherichia coli NIHJ JC-2

>50

Escherichia coli 80750

>50

Klebsiella pneumoniae

>50

Salmonella typhimurium

>50

Pseudomonas aeruginosa PS-24

>50

616958

Medium: Modifiziertes Muller Hinton Agarmedium.

Aus Tabelle 1 kann gesehen werden, dass das Antibiotikum 342-14-1 hochwirksam ist gegen grampositive Bakterien.

Mit dem Antibiotikum 342-14-1 wurden Studien betreffend die akute Toxizität durchgeführt, wobei eine intraperitoneale 5 LD50 von 400-500 mg/kg gefunden wurde und eine subkutane und orale LD50 von >500 mg/kg ermittelt wurde. Zusätzlich wurde in einem therapeutischen Versuch mit künstlich infizierten Mäusen gefunden, dass das Antibiotikum 342-14-1 hochaktiv ist gegen Stâphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes und 10 Diplococcus pneumoniae (Streptococcus pneumoniae). Die Resultate dieses therapeutischen Experimentes an der Maus mit künstlicher Infektion sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

Testmikroorganismus

ED50 mg/kg x 2

Staphylococcus aureus Smith Streptococcus pyogenes C-203 Diplococcus pneumoniae Typ I (Streptococcus pneumoniae)

0,7 1,2 3,5

25

Antibiotikum: Hydrochlorid von 342-14-1 Maus: ICR ? 119-21 g

Die Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion mit den pathogenen Bakterien infiziert. Nach einer und nach 5 30 Stunden nach der Infektion wurde das Antibiotikum 342-14-1 subkutan verabreicht, und die Überlebenszeit der infizierten Mäuse wurde 7 Tage nach der Infektion überprüft.

Das neue Antibiotikum 342-14-1 ist wertvoll als Arzneimittel und als Mittel in der Veterinärmedizin zur Verhinderung des 35 Wachstums grampositiver pathogener Mikroorganismen. Es ist ebenfalls wertvoll als Desinfektionsmittel.

Das erfindungsgemässe Antibiotikum 342-14-1 und die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze davon können oral, subkutan, intravenös oder topisch Menschen oder Tieren 40 in Form konventioneller pharmazeutischer Formen, wie Injektionen, flüssigen Suspensionen, Emulsionen, Salben oder Tabletten mit geeigneten Trägern, Stabilisierungsmitteln, Emulgiermitteln, Konservierungsmitteln und/oder Netzmitteln, welche einen therapeutisch wirksamen Anteil des Wirkstoffes 45 enthalten, verabreicht werden. So z. B. kann das Antibiotikum 342-14-1 und dessen pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze davon oral, subkutan oder intrayenös Menschen oder Haustieren in einer Dosis von 0,1-100 mg pro kg Körpergewicht verabreicht werden. 50

Beispiel 1

Bacillus brevis Nr. 342-14 (ATCC Nr. 21991) wird in 100 ml eines wässrigen Nährmediums (pH 7,0), bestehend aus 1% Glukose, 0,5% Glycerin, 1,0% Pepton, 0,5% Fleischextrakt und 0,3% Natriumchlorid, welches in einer 500-ml-Schüttelflasche (Saka-guchi-Flasche) ist, eingepflanzt. Die Kultivierung wird während 2 Tagen bei 28 °C unter Schütteln durchgeführt. Der so erhaltene Nährboden wird als Einpflanzungsmittel verwendet.

130 ml eines wässrigen Nährmediums (pH 7,0), bestehend aus 1% Glukose, 0,25% Glycerin, 0,25% Pepton, 1,0% Sojabohnenmehl und 0,3% Natriumchlorid, enthalten in einer 500-ml-Schüttelflasche (Sakaguchi-Flasche), werden sterilisiert und mit dem vorerwähnten Einpflanzungsmittel (5 ml) inokuliert. Die Kultivierung wird während 4 Tagen bei 28 °C unter Schütteln durchgeführt.

2,51 n-Butanol und 2,51 Methanol werden zu ungefähr 51 Kulturboden (enthaltend die Zelle) gegeben, worauf filtriert wird. Das erhaltene Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt, bis es zweiphasig wird. Die eingeengte Lösung wird auf pH-Wert 8,0 eingestellt und zweimal mit 500 ml n-Butanol extrahiert. Die n-Butanol-Extrakte werden dreimal mit 300 ml Wasser, welches auf pH-Wert 2,0 oder 3,0 eingestellt ist, extrahiert. Das Antibiotikum 342-14-1 verbleibt in der Butanolphase. Die Butanolphase wird unter vermindertem Druck eingeengt. Zur eingeengten Lösung wird hierauf Essigester gegeben, worauf man 300 mg rohes Antibiotikum 342-14-1 erhält.

Die rohe Substanz wird auf eine Silicagel GF-Platte (Dicke 750 |x, 100x200 cm) aufgetragen und mit einem Lösungsmittel enthaltend Chloroform, Äthanol und 14% wässriges Ammoniak (4:7:2, volumenmässig) entwickelt. Der Teil der Silicagel-platte, welcher das Antibiotikum 342-14-1 enthält, wird mit einem Lösungsmittel, bestehend aus Methanol und Wasser (1:1, volumenmässig), welches mit verdünnter Salzsäure auf pH-Wert 2,0 eingestellt ist, extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird auf eine Silicagel GF-Platte (Dicke 750 (i, 100x20 cm) aufgetragen und mit einem Lösungsmittel, bestehend aus Chloroform, Äthanol und 1% wässriger Essigsäure (4:7:2, volumenmässig) entwik-kelt. Der Teil der Silicagelplatte, welcher das 342-14-1 enthält, wird mit einem Lösungsmittel, bestehend aus Methanol und Wasser (1:1, volumenmässig), welches mit verdünnter Salzsäure auf pH-Wert 2,0 eingestellt ist, extrahiert. Der Extrakt wird eingeengt und dann zweimal mit n-Butanol (pH 2,0) extrahiert. Der n-Butanol-Extrakt wird mit einer kleinen Menge Wasser, welches mit Natriumbicarbonat auf pH-Wert 7 eingestellt ist, gewaschen und dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Durch Einengen der n-Butanollösung unter vermindertem Druck erhält man ungefähr 100 mg an Antibiotikum 342-14-1 (freie Form) in Form eines farblosen, amorphen Pulvers.

G

1 Blatt Zeichnungen

Claims

616958

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 342-14-1, welches wirksam ist als Wachstumshemmer grampositiver Mikroorganismen, welches ein farbloses, amphoteres Pulver vom Schmelzpunkt 190-195 °C (unter Zersetzung) darstellt; welches die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff im wesentlichen in folgender Verteilung enthält:

Kohlenstoff 54,63%

Wasserstoff 7,12%

Stickstoff 14,81%

Sauerstoff 23,44% (Ausgleich);

welches ein Hydrochlorid mit einer optischen Drehung von [a]f)2'° + 6,1 ± 0,5° (c = 1,036%, in Methanol); welches ein Molekulargewicht von ungefähr 1450 (abgeschätzt von der Aminosäureanalyse) aufweist; welches bei der Hydrolyse die Bildung von Asparaginsäure, Threonim, Glycin, Valin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan, 2,4-Diaminobuttersäure, Ammoniak und Anteisononansäure zeigt; welches ein Hydrochlorid mit Ultraviolettabsorption (in Methanol) bei 274,283 und 290,5 mjj. hat und welches ein Hydrochlorid mit einer Infrarotabsorption gemäss Zeichnung, Fig. 1, hat, dadurch gekennzeichnet, dass man einen das Antibiotikum 342-14-1 bildenden Bacillusstamm in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert und das angehäufte Antibiotikum 342-14-1 aus dem Nährboden isoliert.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung des Mikroorganismus bei einer Temperatur von 20-37 °C durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung des Mikroorganismus unter aeroben oder unter submers aeroben Bedingungen durchgeführt wird.
4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung des Antibiotikums durch Filtrieren des Kulturbodens und Extrahieren von Filtrat und Zelle mittels eines Lösungsmittels durchgeführt wird.
5. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der das Antibiotikum 342-14-1 liefernde Bacillusstamm Bacillus brevis Nr. 342-14, ATCC 21991 ist.
6. Nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 erhaltenes Antibiotikum 342-14-1.

15