DE2107461A1 - Verfahren zum Herstellen von alkali schem Dextranase Enzym - Google Patents

Description

Verfahren zum Herstellen von alkalischem Dextranase-Enzym

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines Dextranase-Enzyms, dessen pH-Optimum im alkalischen Bereich liegt (nachstehend als alkalische Dextranase bezeichnet), wobei eine neue Arbeitsweise unter Verwendung eines bisher nicht bekannten Mikroorganismus angewendet wird. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf das in dieser Weise gewonnene alkalische Dextranase-Enzym. , welches eine verbesserte Stabilität und eine erhöhte Aktivität, speziell im alka-

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lischen pH-Bereich, aufweist sowie auch den für dieses Verfahren brauchbaren neuen Mikroorganismus.

Dextranase ist bekanntlich ein Enzym, welches die ot-1,6-Bindung von Dextran zu spalten vermag. Es ist schon über eine grosse Anzahl von Dextranase-produzierenden Organismen berichtet worden, beispielsweise Pilze der Gattung Aspergillus /"vergleiche Science, 115, 43 (1952)3T# der Gattung Penicillium /"vergleiche Svensk. Kern. Tid., 60, 283 (19*8); Acta Chem. Scand., 3, 1 405 (1949); J. Baeteriol., 64, 513 (1952); Japan. J. Agr. Chem. Soc, 28, 552 (195*) und Canad. J. Mierobiol., 3, 239 (1957J7, Spicaria violaceae /"vergleiche J. Bacteriol., 64, 5I3 (1952^7* ^der Gattung Chethomlum /"vergleiche Summary of Congress of Japan. Agr. Chem. Soc, I969, Seite 115_7, Bakterien, wie beispielsweise solche der Gattung Bacteroides /"vergleiche J. Bacteriol., 63, 424 (1952) und ebenda 7I, 373 (1956)_7, Cellvibrio fulva /"vergleiche Aeta Chem. Scand., 2, 803 (1948)_7, Lactobacillus bifidus /"vergleiche Biochem. J., 72, 49 (1959)_7, sowie solche der Gattung Mitpphaga oder dergleichen« Es ist jedoch bisher nichts davon bekannt geworden, dass sich Dextranase auch durch einen Mikroorganismus der Gattung Brevibacterium herstellen lässt, und die aus den bisherigen Veröffentlichungen bekannten Dextranasen sind ausschliesslich solche, die eine hohe Aktivität bei sauren pH-Werten haben und im alkalischen pH-Bereich keine oder nur geringe Aktivität zeigen. In letzter Zeit ist es nun sehr notwendig geworden, Dextranase auch auf dem Gebiet der Zahnchirurgie anzuwenden, und dabei benötigt man dann ein Enzym, das im neutralen bis alkalischen pH-Bereich stabil ist und sein Optimum besitzt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine solche Dextranase mit Stabilität und Optimum im alkalischen Bereich zu schaffen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgeraäß dadurch gelöst, dass ein Mikroorganismus der Art Brevibacterium fuscua var. dextran-

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lyticum NRRL B-3852 in einem Kulturmedium, welches eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, gezüchtet und das dabei produzierte Enzym dann von dem Kulturmedium abgetrennt wird. Es ist dabei vorteilhaft, wenn man ein Kulturmedium einsetzt, welches 0,5 bis 3 % Aethanol enthält und den Mikroorganismus zwei bis sechs Tage lang bei 2k bis 28⁰C züchtet. Die Abtrennung des so gewonnenen Enzyms kann zweckmässig durch Ausfällen, durch Absorption oder Eluieren vorgenommen werden.

Die Anmelderin hat bei ihren Untersuchungen und Forschungen nach Mikroorganismen, die im alkalischen Bereich besonders wirksame Dextranase herzustellen vermöchten, gefunden, dass λ Bakterien, die aus Bodenproben von Kakegawa-shi, Shizuokaken, Japan, stammten, ein Enzym Dextranase produzierten, das stabil ist, eine hohe Aktivität hat, und dessen Optimum im alkalischen pH-Bereich liegt. Es wurde weiterhin gefunden, dass unter Verwendung dieses bisher unbekannten Mikroorganismus ein in industriellem Maßstab vorteilhaft durchführbares Verfahren zur Herstellung dieser alkalischen Dextranase möglich ist.

In den beiliegenden Zeichnungen sind einige der Eigenschaften der erfindungsgemäß hergestellten Dextranase veranschaulicht, und in der nachstehenden Beschreibung wird die Taxonomie der

neuen Mikroorganismen gegeben. In der Zeichnung zeigen: \

Fig. 1 das pH-Optimum der erfindungsgemäßen Dextranase,

Fig. 2 das Optimum der Temperaturkurve der erfindungsgemäßen Dextranase,

Figo 3 die Kurve der pH-Stabilität der erfindungsgemäßen Dextranase, und

Fig. 4 die Kurve der Wärme-Stabilität der erfindungsgemäßen Dextranase.

In der Fig. 1 ist der pH-Wert auf der Abszisse aufgetragen, während die Ordinate die Dextranase-Alctivität in % wider-

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gibt. Man erkennt, dass das WirkungsoptiHrfun der erfindungsgemäßen Dextranase bei einem pH-Wert um etwa 8 liegt. Die Fig, 2, bei der auf der Abszisse die Temperatur in ⁰C und auf der Ordinate die Dextranase-Aktivität in % aufgetragen sind, lässt erkennen, dass Aktivitäten zwischen 75 und 100 % in einem so weiten Temperaturbereich wie zwischen J8 bis etwa 65⁰C erreicht werden können. Auf der Pig. 3* bei welcher auf der Abszisse die Temperatur in ⁰C und auf der Ordinate die wirksame verbliebene Aktivität in % aufgetragen sind, erkennt man, dass die erfindungsgemäße Dextranase bis zu Temperaturen von etwas mehr als 60⁰C praktisch 100 % aktiv bleibt. Auch die pH-Stabilität, die aus Fig. 4 erkennbar ist, reicht über einen relativ weiten pH-Bereich von etwa 5 Ms 10,5. Dabei bleibt die restliche Aktivität, die auf der Ordinate in % gegen die auf der Abszisse angegebenen pH-Werte aufgetragen ist, über diesen relativ breiten pH-Bereich bei mehr als 90 % relativ konstant.

Der erfindungsgemäß verwendete neue Mikroorganismus hat die folgenden bakteriologischen Eigenschaften:

A. Wachsturnsbedingung

1«, Mikroskopische Beobachtung Größe: 0,5 - 0,7 χ 1,2 - 1,5 Micron

Form: kurze Stäbchen, keine Metamorphose, keine

Verzweigung bzw. Fragmentation, Motilität: keine Sporen: keine SporulationJ

2. Kolonie-Gestaltung

Oberfläche: rund, konvex, durchscheinend und feucht Farbe: gelb bis gelblieh-orange pigmentgeformt

J5. Wachstumsbedingungen in verschiedenen Medien Bouillon: gutes Wachstum
Bouillon-Agar-Mediuffli gutes Wachstum Glukos e-Bouillon-Agar-Medium: gutes Wachs tue Gelatine-Medium: Wachstum
Pepton/Wassert Wachstum
Kartoffel-Medium» Wachstum
Lakmusmilchs Wachstum, zunächst saure Bildung und

ORIGINAL INSPECTED

Β· Physiologische Eigenschaften

1. Optimale Wachstumsbedingung pH: 7*0 - 8,0
Temperatur: 25°C

Aerob oder anaerob: aerob

2. Wachstumsbedingung
pH: 5,5 - 10,0
Temperatur: 5 - 37°C
Aerob oder anaerob: aerob

3. Grara-Färbung: positiv

4. Säurefestigkeit:

5. Methylrotreaktion: - | 6· Voges-Proskauer-Reaktion:

7. Indolbildung:

8. Schwefelwasserstoff-Bildung:

9. Ammoniak-Bildung:

10» Nitrat-Reduktion: +

11· Katalase-Reaktion: +

12ο Oxidase-Reaktion:

13. Gelatine- und Kasein-Verflüssigung: +

14. Stärke-Hydrolyse: +

15. Verbrauch von Zitrat:

16. Koagulation von Milch:

17. Verbrauch von Ammoniumsalz

und Harnstoff + |

C· Verbrauch von Kohlenstoff-Quellen Arabinose: - Xylose: + Glukose: + Fruktose: + Laktose: - Saccharose + Raffinose: + Mannitol: + Glycerin: + Stärke: +

Bei der Untersuchung der taxonomischen Situation der Mikroorganismen wurde festgestellt, dass diese, da sie die folgenden gemäö "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology",

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7. Ausgabe, festgestellten taxonomischen Eigenschaften haben* positive Gram-Färbung, kurze Stabellenform, keine Metamorphose, keine Verzweigung, keine Sporulation, aerobes Wachstum, negative anaerobe Fermentation von Glukose, negative aerobe Fermentation von Laktose, anscheinend zu der Gattung Brevibacteriuat gehören.

Ferner hat dieser Stamm hinsichtlich seiner taxonomischen Eigenschaften wie Größe des Bakteriums, keine Mobilität, gelblich-orange Pigmentbildung, Nitrat-Reduktion, Gelatine-Verflüssigung und keine Indolbildung, sehr starke Ähnlichkeit mit Brevibacterium fuscum.

Beim Vergleich der taxonomischen Eigenschaften dieses Brevibacterium fuscum mit den Eigenschaften des Mikroorganismus vom Kulturtyp Brevibacterium fuscum IFO 12127, erhältlich von der Prüfstelle des Fermentation Institute, Osaka, Japan, wurde festgestellt, dass dieser alkalisehe Dextranase-produzierende, Stamm eine Abart des Bakteriums Brevibacterium fuscum ist, denn dieser letztere besitzt keine Dextranase-Produktivität, und ausserdem weist der neue alkalische Dextranase-produzierende Stamm positive Säurebildung auf, während der bekannte Kulturtyp IFO 12127 dabei negativ reagiert.

Hinsichtlich vieler anderer taxonomischen Eigenschaften, wie beispielsweise hinsichtlich der Kennwerte auf vielen Medien und hinsichtlich der physiologischen Eigenschaften, verhalten sich diese beiden Stämme jedoch sehr ähnlich. Demzufolge lassen diese Stämme sich als verschiedene Arten von Brevibacterium fuscum differenziiren, und entsprechend wurde der neue alkalische Dextranase-produzierendeMikrobakterien-Stamm als "Brevibacterium fuscum var. dextranlyticu»" bezeichnet. Er wurde hinterlegt beim Institute for Microbiological Industry and Technology, Agency of Industrial Science ft Technology, Ministry of International Trade & Industry, Japan, und unter der Nummer FERM-P 5*3 der ständigen KuItur-

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Kollektion dort beigegeben. Ferner wurde dieser Stamm beim United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and Development Division; er ist dort unter der HinterlegungsnunHner NRRL B-3852 der ständigen Kultur-Kollektion hinzugefügt worden. ^ hinterlegt

Dieser zuvor beschriebene Stamm Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum NRRL B-3852 ist nur ein Beispiel für einen der beim erfindungsgemäßen Verfahren brauchbaren Mikroorganismen, und die vorliegende Erfindung lässt sich auch unter Verwendung von sonstigen alkalischeziDextranase-pro- d duzierenden Stämmen der Art Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum durchführen.

Bei diesem Bakterium erreicht man hohe Produktivität an alkalischer Dextranase in an sieh bekannter Art, wie dies üblicherweise bei der Herstellung von Antibiotika oder Enzymen geschieht, beispielweise durch selektive Behandlung von Stämmen mittels Ultraviolett-Licht., Röntgenstrahlen oder mutagenen Mitteln, sowie bestimmter Auswahl von für den Stamm geeigneten Medien und Fermentationsbedingungen.

Erfindungsgemäß wird alkalische Dextranase dadurch hergestellt, dass ein geeignetes Nährmedium mit Brevibacterium f fuscum var. dextranlyticum beimpft wird.

Für die Produktion von alkalischer Dextranase erfindungsgemäß brauchbare Nährmedien können als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff beispielsweise enthalten: Glukose, Saccharose, Laktose, Maltose, lösliche Stärke, Stärke, Dextrin, Dextran, Melassen und dergleichen. Als Quelle für assimilierbaren Stickstoff können vorhanden seinj Sojabohnen-Pulver, entfettetes Sojabohnen-Pulver, Pulver von Baumwollsamen, Bepfcon, Fleischextrakt, Hefeextrakt, pulverisierte trockene Hefe, öetreideweiehwasser, Ferma-Medien, Kasein-Hydrolysat,

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Harnstoff, Ammoniumsalz, und dergleichen. Die Medien sollen zweckmässig ferner Salze, wie beispielsweise Phosphate, nämlich Magnesiumphosphat, Kalziumphosphat, Kaliumphosphat, und dergleichen enthalten. Als Promotor für das Wachstum der Mikroorganismen und die Enzym-Produktion können auch zahlreiche organische oder anorganische Materialien, die diesen Zweck erfüllen, dem Medium zugesetzt werden.

Es wurde erfindungsgemäß darüber hinaus festgestellt, dass die Produktion an alkalischer Dextranase sich erhöhen lässt, wenn Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum in einem Medium gezüchtet wird, welches Dextran und einen Alkohol, wie beispielsweise Methanol und/oder Äthanol enthält. Dementsprechend umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren auch eine solche Arbeitsweise für die Herstellung von alkalischer Dextranase, bei der Brevibacterium fuscum var· dextranlyticum in einem Dextran und Alkohol enthaltenden Medium gezüchtet wird.

Grundsätzlich kann man beim erfindungsgemäßen Verfahren als Alkohole niedrige aliphatische Alkohole, wie Methanol und Äthanol, zusetzen. Diese Alkohole sollen in geeigneten Mengen, vorzugsweise zu etwa 0,5 bis 2 Volumprozent dem Medium beigegeben werden. Dextran kann ebenfalls in geeigneter Weise dem beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Medium zugegeben werden, vorteilhaft in einer Menge von etwa 0,5 bis 5 Volumprozent des Mediums.

Die Züchtung des Mikroorganismus kann beim erf indungs gemäß en Verfahren in verschiedener Weise vorgenommen werden, beispielsweise in flüssigen Kulturen oder auf festen Nährböden. Die für industrielle Produktion den besten Profit gebende Art ist ein Kulturverfahren, bei dem in getauchtem Zustand, unter Belüftung, gezüchtet wird.

Bei der Züchtung der für die Herstellung von alkalischer Dextranase nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erforderlichen

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Organismen kann die Temperatur ganz allgemein in demjenigen Bereich gewählt werden« in welchem die alkalische Dextranase produzierenden Mikroorganismen zu wachsen vermögen, und die alkalische Dextranase kann erfindungsgemäß vorteilhaft bei 20 - 3O°C, insbesondere bei 24 - 27⁰C, produziert werden.

Die Züchtungsdauer beträgt im allgemeinen 2-4 Tage, ist jedoch je nach den verwendeten Bedingungen variabel. Naturgemäß sollte die Züchtung beendet werden, nachdem die Kulturbrühe die maximale Wirksamkeit an Produktion von alkalischer Dextranase erreicht hat.

Es 1st unnötig, den pH-Wert des Mediums zu kontrollieren, denn dieser bleibt praktisch stets konstant; es 1st jedoch vorteilhaft, bei der Zubereitung des Mediums den pH-Wert auf 8-9 einzustellen.

Die Isolierung der alkalischen Dextranase aus dem Kulturmedium kann mit üblichen Arbeitsweisen, wie sie für die Abtrennung und Reinigung des Enzyms Dextranase gebräuchlich sind, vorgenommen werden. Wenn mit flüssigen Nährboden gearbeitet worden ist, bedient man sich zweckmässlg der Vakuum-Filtration, des Zentrifugierens oder ähnlicher bekannter Arbeitsweisen, wobei die Nährflüssigkeit zwecks Abtrennung der Myeellen filtriert und ein Filtrat gewonnen wird.

Zu diesen Extrakten oder Filtraten gibt man, nachdem man diese konzentriert hat oder auch nicht, ein lösliches Salz, wie beispielsweise Kochsalz, Ammoniumsulfat oder dergleichen oder auch ein alt Wasser mischbares organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Xthanol, Aceton oder dergleichen zu und fällt daait die alkalische Dextranase aus. Die Ausfällung wird In Wasser gelöst, dann Mittels hautdurchlässiger Membran dialysiert, wobei die nledrlg-nolekulftren Verunreinigungen ent-

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f ernt werden. Alternativ kann man das Piltrat in üblicher Weise der Absorptionschromatographie, der Ionenaustauscher-Chromatographie, der Gel-Filtration oder dergleichen Verfahren unterwerfen, um die niedrig-molekularen Verunreinigungen und die gefärbten Substanzen zu ellminieren. Man kann auch so vorgehen, dass man im Vakuum konzentriert, gefrier trocknet oder in ähnlicher Weise arbeitet, wenn rohe alkalische Dextranase gewonnen werden soll.

Die so erhaltene rohe Lösung oder das rohe Pulver von alkalischer Dextranase lässt sich weiter reinigen, indem man es üblichen Arbeitsweisen, wie sie für die Reinigung von Proteinen oder Enzymen bekannt sind, unterzieht. So kann man beispielsweise eine Absorptions behandlung oder eine Behandlung durch Gel-Filtration vorsehen. Es lässt sich zum Beispiel eine Lösung von roher alkalischer Dextranase dementsprechend durch Gel-Filtration und/oder Absorption mit einem Absorbens, wie beispielsweise CM-Cellulose oder DEAE-Cellulose behandeln, die dann, nachdem man graduell elulert hat, dialysiert wird.

Diese Isolierungs- und Reinigungsverfahren können alternativ oder kombinativ angewendet werden, und man erhält so ein Enzympulver, mit Dextranase-Aktivität.

Die- in dieser Weise gewonnene erfindungsgemäß hergestellte alkalische Dextranase ist extrem stabil und aktiv und hat im Gegensatz zu den bisher bekannten Dextranasen, die i« sauren Bereich wirken, ein pH-Optimum im alkalischen pH-Bereich. Demzufolge lässt sich das erfindungsgemäß hergestellte alkalische Dextranase-Enzym sehr vielseitig verwenden und beispielsweise für die Zahnchirurgie einsetzen, als Zusatz zu Zahnpasta zur Vorbeugung gegen Karies der Zähne benutzen und zur Gewinnung von als Blutersatzmittel dienendem Dextran gebrauchen.

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- ii -

Die gemäß dem nachstehenden Beispiel 5 erhaltene alkalische Dextranase hat die folgenden physico-chemischen Eigenschaften:

(1) Elementaranalyse:

C: 35,9 % H: 4,61 % N: 6,70 %

(2) Molekulargewicht:

etwa 43.000 /"bestimmt mittels Bio-Gel P-30 (einem Produkt der Bio-Rad Laboratories, CaI., Ü.S.A._7

(3) Wirkung:

Enzymatischer Angriff am freien Kettenende (Spaltung vom Exo-Typ);

Willkürliche Spaltung der a-l,6-Glukosid-Bindung in Dextran, bei der schließlich Isomaltose gebildet wird. (Die Dextranase-Aktivität lässt sich bestätigen durch Viskositätsmessungen an einem beimpften Gemisch aus dem erfindungsgemäßen Enzym und Dextran, wobei mit der Zeit eine Zunahme der Viskosität und eine Abnahme der Bildung von reduzierendem Zucker festgestellt wird.).

(4) Substrat-Spezifizität:

Dextran wird versetzt, es besteht keine Aktivität gegenüber Stärke, Dextrin oder einem ähnlichen Polysaccharid mit a-l,4-Bindung.

(5) pH-Optimum: etwa pH 8,0 UntersuchungsmethodeS

a) Aktivität für die Bildung von reduzierendem Zucker:

Präparation: eine Mischung aus einer Enzymlösung 0,5 ml /es wird Enzympulver (50 Einheiten/mg) in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst/ und einer einprozentigen Lösung von Dextran 1 ml in 0,05 Mol Acetatpuffer (pH 5.,O) oder Phosphatpuffer (pH 6,0 - 7,5) oder Tris-Puffer (pH 7,0 - 8,5) oder Boratpuffer (pH 9,0 bis 10,0) zur Einstellung des jeweiligen pH. Es wird bei dem jeweiligen pH 20 Minuten lang bei 37⁰C bebrütet, und dann wird der gebildete reduzierende Zucker nach der Dinitrosalicylsäure-Methode zur Ermittlung der Aktivität bestimmt.

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b) Verflüssigungsaktivitäts

Es werden 5 ml einer einprozentigen Dextran-Lösung in 0,05 Mol Puffer, wie zuvor bei der Methode a beschrieben, in ein Ostwald-Viscosimeter (8,3 Sekunden Fallzeit für destilliertes Wasser bei 37°C) eingegeben und bei 37°C gehalten. Dazu werden 0,3 ml Enzymlösung /% mg/ml Enzyrapulver (50 Einheiten/mg) in destilliertem Wasser_7 gegeben und Jeweils in einem Abstand von einer Minute wird die Fallzeit gemessen und notiert.

Die spezifische Aktivität wird wie folgt berechnet*

t - t Spezifische Aktivität = 2 _f

worin t die Fallzeit und t_Q die Fallzeit des Lösungsmittels bedeuten. Es wird der Wert !/(spezifische Aktivität), das ist

—r r—- , gegen die Zeit aufgetragen,

t - t_o

damit eine Gerade erhalten wird. Die Dextranase-Aktivität ist proportional dieser Geraden, so dass die Aktivität der Dextranase geprüft werden kann.

Die Relation der pH-Aktivität ist in Fig. 1 veranschaulicht.

(6) Temperatur-Optimumϊ

Es werden 0,5 m$ Enzymlösung, in der 1 ag/ml an Enzympulver (30 Einheiten/ml) enthalten waren, in 0,65 Mol Tris-Puffer-Lösung (pH 7*5) und 1 ml einer einprozentigen Dextran-Lösung in 0,05 Mol Tris-Puffer-Lösung (pH 7,5) zusawBengegeben und jew*ils 20 Minuten bei 37°C» bzw. 45°C, bzw* 53°C bzw. 60°C bebrütet. Die Aktivität wird ermittelt durch Bestiuwung des gebildeten reduzierenden Zuckers mittels der Dinitrosalicylsäure-Methode.

Die Temperatur-AktivitSts-Kurve ist in Fig· 2 veranschaulicht; stan erkennt, dass das TeMper&tur-Optiwum der erfindungsgemäßen alkalischen Dextranase bei etwa

53°C liegt,

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C?) pH-Stabilitäts

0,5 ml einer Enzym-Lösung mit 1 mg/ml an Enzym-Pulver (30 Einheiten/mg) in destilliertem Wasser wurde mit 0,5ml einer 0,05 Mol Acetatpuffer-Lösung (pH 5,0) oder Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,0 - 7,5) oder einer Trispuffer-Lösung (pH 7,0 - 8,5) oder einer Boratpuff erLosung (pH 9,0 "- 10,Q) vermischt. Nachdem 24 Stunden lang bei 37°C bebrütet worden war, wurde der pH-Wert jeder der Lösungen mit NaOH oder HCl auf pH 7*5 eingestellt, vnä es wurde durch Zugabe einer 0,05 Mol Trispuffer-Lösung (pH 8,0) auf das Fünffache an Volumen verdünnt. Die verbleibende Enzym-Aktivität der Enzym-Lösung wurde mittels der Dinitrosalicylsäure-Methode untersucht. Die pH-Stafollitäts-Kurve ist in Fig. 4 veranschaulicht und zeigt, dass die verbleibende Aktivität bei pH 4,3 - 11,0 höher als 80 % und bei pH 7 - 9 bei 100 % liegt.

(8) Wärme-Stabilität (Temperatur-Stabilität)ι

Man Hess je 0,5 ml Enzym-Lösungen mit je 1 mg/ml an Enxym-Pulver (30 Einheiten/mg) in destilliertem Wasser bei 4O°C 50°C, 60°C, 63°C, 65°C, 68⁰C bzw. 7O⁰C stehen. Nach IQ Min. wurden die Mischungen abgekühlt, es wurde 1 ml 0,05 Mol Tris-Puffer-Lösung (pH 7,5) mit 1 % Dextran zugegeben, dann 20 Min. bei 37°C bebrütet, und danach wurde die verbliebene Aktivität mittels der Dinitrosalicylsäure-Methode bestimmt.

Die Wärrae-Stabilitäts-Kurve ist in Pig. 3 veranschaulicht; man erkennt, dass die erfindungsgemäße alkalische Dextranase nach 10 Min. bei 70⁰C inaktiv geworden 1st, jedoch unterhalb 57⁰C nicht inaktiviert ist.

(9) Inhibierung durch Metallioneni

Das erfindungsgemäa hergestellte Enzym wird durch Z Hg** und Cu⁺* inhibiert.

1 0 f) 8 3 B / 1 3 7 0

(10) Bestimmung der Wirksamkeit:

Es wurden 0,5 &1 Enzym-Lösung mit 1 ml von 1 % Dextran (Molekulargewicht 5.000.000 bis 20.000.000) in 0,05 Mol Tris-Puffer-Lösung (pH 7*5) vermischt« »actade* 20 Min. lang bei JJ⁰C bebrütet worden war, wurde der reduzierende Zucker mittels der Dinitrosalicylsäure-Methode bestimmt, und dann wurde die Wirksamkeit als 1 Einheit bezeichnet, die entsprechend 1 mg/Std. an Maltose-Bildung bei der Bestimmung des reduzierenden Zuckers sich ergab.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, dass sich die Herstellung an alkalischer Dextranase mittels des neuen Mikroorganismus, Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum NRRL B-3852, erheblich vermehren lässt, wenn man Dextran und Alkohol, wie beispielsweise Methanol und Äthanol, dem Permentationsmedium zusetzt.

In der nachfolgenden Tabelle I ist die Wirkung des Zusatzes an organischem Lösungsmittel zu den Fermentationsmedien für die

Herstellung der alkalischen Dextranase veranschaulicht.

Wie man aus den Daten in dieser Tabelle I erkennt, ist die Produktivität für alkalische Dextranase beachtlich erhöht, wenn Äthanol oder Methanol zugesetzt werden, speziell bei Zugabe von Äthanol. Die Wirkung von Äthanol auf die Dextranase-Produktion ist weiterhin auch noch in Tabelle II veranschaulicht.

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Tabelle I

Organische!? Lösungsmittel	Äthanol	Methanol	2	Aceton	2	Dioxan	Chloroform	2	Methyl- isofoutylketon	2	Kontroll^· probe
ZuBtts	0,5 S	o,5	217	0,5	135	0,5 2	0,5	139	0,5	129	0
(Eiaheit/al)	16$ £48	166	13,2	148	17,1	156 142	142	16,5	134	18,2	143
Mycelial- Wachstum (Trübmegsuiig)	16,7 19,0	14,2	8,2	16,1	8,4	18,6 17,7	16,1	7,8	17,4	8,2	16,0
pH des Mediums	8,2 8,0	8,2	8,2	8,2 8,4	8,4	8,4	8,4

Tabelle II

Äthanol-Konz entration

0,5

Aktivität (einheit/ml) nach 96 Std. Fermentation

170

220

250 270

23O

Verwendetes Medium: Dextran 1 %, Pepton 1 %, KH₂PO^ 0,1$ MgSO^- 7H₂O 0,1 %, MnSO^ · 6H₃O 0,005 %, CaCl₂ 0,002 %, Hefeextrakt 0,05 %, pH 8,5. Äthanol wurde nach Sterilisation des Mediums zugefügt.

Auch der Zusatz von Dextran zu dem Permentationsmedium für die Gewinnung von alkalischer Dextranase erhöht die Enzym-ProduktionJ in der nachfolgenden Tabelle III 1st die Wirkung von Dextran und Pepton veranschaulicht.

Tabelle III

zugesetztes
Dextran

zugesetztes Pepton

Aktivität der alka lischen Dextranase nach 96-stündiger Fermentation (Einheit/ral)

0,5

0,5

if

85 I70 260 250 240

Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration des erfindungsgemäßen Verfahrens, sollen dieses jedoch nicht begrenzen.

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Beispiel 1

50 ml eines wässerigen Mediums ( pH 8,5) mit 2 % Dextran, 2 % Polypepton, 0,05 % Hefeextrakt, 0,1 % KH₃PO₄, 0,1 % K 0,1 % MgSO₄ . 7H₂O, 0,005 % MnSO^ . 6HgO und 0,002 % CaCl₂ wurden in einen 500-ml Erlenmeyer-Kolben eingefüllt, 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert, mit 3 % eines in dem gleichen Medium vor-bebrüteten Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum NRRL B-3852 beimpft und dann unter Hin- und Herschütteln mit 130 Schüttelbewegungen je Minute von 7 cm Ausschlag bei 26 C 60 Stunden lang gezüchtet. Es wurden beim Zusammenfassen der Filtrate von 10 Kolben 450 ml Kulturfiltrat mit 200 Einheiten/ml I an Dextranase erhalten. Das Filtrat wurde bei 40 C unter vermindertem Druck auf 1/5 seines Volumens konzentriert, und dann wurde die Hälfte des Volumens an Aceton dazu gegeben. Der Niederschlag wurde durch Zentriefugieren entfernt und der überstehenden Lösung wurden 15O Vol.-# an Aceton zugegeben. Der fraktioniert bei 33 bis 66 % Aceton-Konzentration dabei erhaltene Niederschlag wurde gesammelt. Der so erhaltene Niederschlag wurde mit Aceton entwässert, und es wurden nach dem Trocknen 240 g Enzympulver gewonnen (Ausbeute 75 %> mittels Aktivität). Die Dextranase-Aktivität dieses Enzympulvers betrug 30 Einheiten/ ml.

Beispiel 2

Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurden 0,5 % Dextran und 0,5 % Stärke in dem wässerigen Nährmedium verwendet. Die gewonnene FermentationsflUssigkeit hatte l40 Einheiten/ml an Dextranase-Aktivität.

Beispiel 3

Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurden dem Medium noch 1 % Kartoffelstärke-Rückstand zugesetzt. Die dabei gewonnene Fermentationsbrühe hatte 250 Einheiten/ml an Dextranas e-Aktivitat _o

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Beispiel 4

20 Liter eines wässerigen Nährmediums (pH 8,5) mit 1 % Dextran, 1 % Kartoffelstärkerückstand, 1 % Polypepton, 0,05 % Hefeextrakt, 0,1 % KH₂PO₄, 0,1 % K₂HPO₄, 0,1 % MgSO₄ . 7HgO, 0,005 % MnSO₄ . und 0,002 % CaCLg wurden in einen 30 Liter Rüttelfermenta-

tionsbehälter eingegeben und 30 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert.

Dann wurde mit 1 Liter Kulturmedium von Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum FERM P-513* in dem gleichen Medium 20 Stunden lang bei 26⁰C gezüchtet, beimpft und unter Rühren mit 300 UpM und Belüften mit 20 Litern / Min. 60 Stunden lang bei 26°C gezüchtet. Nach der Fermentation wurde das Mycelium abzentrifugiert und es wurden 18,2 Liter Kulturbrühe mit einer Dextranase-Aktivität von 220 Einheiten/ml erhalten.

Es wurde weiterhin das Kulturfiltrat unter vermindertem Druck (Verdampfungsgeschwindigkeit 10 1/Std.) konzentriert, und es wurden 3,6 1 an Konzentrat erhalten. Zu diesem Konzentrat wurde Aceton zugegeben und anschließend wurde der bei Acetonkonzentration vpn 33 - 66 % gebildete Niederschlag fraktioniert. Nach Entwässern mit Aceton wurde der Niederschlag im Vakuum getrocknet, und es wurden 96 g an Enzympulver erhalten. Das so erhaltene Enzympulver hatte eine Dextranase-Aktivität von 32 Einheiten/mg.

Beispiel 5

20 Liter an entsprechend dem in Beispiel 4 beschriebenen Fermentationsverfahren erhaltener Fermentationsbrühe wurden zu 200 Liter eines sterilisierten wässerigen Mediums mit 1 % Dextran, 1,1 % Pepton, 0,1 # KH₃PO₄, 0,1 % K₂HPO₄, 0,1 % MgSO₄ . 7H₃O, 0,005 % MnSO₄ . 6H₂O, 0,002 % CaCl₂, 0,05 # Hefeextrakt und 2 % Äthanol, pH 8,5, in einem 250 Liter Edelstahl-Fermentationsbehälter hinzu gegeben; (es wurden 100 ml eines Antischaumbildungsmittels zugesetzt)! dann wurde unter Rühren mit 250 UpM und Belüften mit 50 Liter/Min. 48 Stunden lang bei 30⁰C gezüchtet. Nach zweimaligem Zentrifugieren in einer Zentrifuge vom Sharples-Typ wurden I70 Liter an Kulturbrühe gewonnen.

Die Potenz der Kulturbrühe, die entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Methode ermittelt wurde, betrug 290 Einheiten/ml (Gesamtaktivität 4,93 x 10⁷ Einheiten). Ferner wurde dieses Piltrat unter vermindertem Druck auf 47 Liter konzentriert (Gesamtaktivität 4,82 χ 10' Einheiten, Ausbeute 98 %, 1024 Einheiten/ml). Es wurde zu dem so erhaltenen Konzentrat Aceton bis zu einer 33 #igen Konzentration zugegeben, dann wurde in der Kälte über Nacht stehen gelassen und danach das abgeschiedene Material abzentrifugiert. Zu der klaren überstehenden Lösung wurde Aceton bis zu einer 66 #igen Konzentration hinzu gefügt, es wurde wiederum in der Kälte über Nacht stehen gelassen und danach wurde das abgeschiedene Enzym gewonnen, das (| durch Dekantieren gesammelt wurde. Die so erhaltene Ausfällung wurde mit 5 Liter Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet, und es wurden 737 g an Enzympulver ( 50 Einheiten/mg, Gesamtaktivität 3,65 χ 10' Einheiten, wiedergewonnene Aktivität 74#) erhalten.

Beispiel 6

50 ml eines wässerigen Mediums (pH 8,5} mit 1 % Dextran, 1 % Polypepton, 0,05 % Hefeextrakt, 0,1 % KHgPO^, 0,1 % KgHPO^, 0,1 % MgSO^ . 7H₂O, 0,005 % MnSO₂^ . 6H₃O und 0,002 % CaCIg wurden in einen 500 ml Erlenmeyerkolben eingefüllt und 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. Nachdem das Medium abge- j kühlt war, wurde Äthanol in den in der vorstehenden Tabelle II angegebenen Konzentrationen hinzu gefügt, und es wurde mit Brevtbaeterium fuscum var«, dextranlyticum NRRL B-3852 beimpft. Anschließend wurde 96 Stunden lang bei 26⁰C bebrütet. Wie in der vorstehenden Tabelle II angegeben, war die Aktivität des Mediums entsprechend der Zugabe an Äthanol erhöht.

Beispiel 7

80 g an Bio-Gel P-30 (Produkt der Bio Rad Laboratories, CaI., U.SοA.) wurden nach dem Quellen mit destilliertem Wasser in eine Säule (innerer Durchmesser 3,2 cm) eingefüllt. Darauf wurde

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1 g des wie in Beispiel 1 beschrieben erhaltenen Enzyms, gelöst in 10 ml an destilliertem Wasser, aufgegeben, und es wurde mit destilliertem Wasser eluiert. Das Eluat wurde in je 5 ml Fraktionen fraktioniert gesammelt, es wurde deren jeweilige Dextranase-Aktivität geprüft, wobei gefunden wurde, daß die Dextranase-Aktivität den Fraktionen No. 33 - 42 eigen war. Diese Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet, und es wurden 6j> mg an alkalischem Dextranase-Pulver (Potenz 455 Einheiten/mg, wiedergewonnen 95*5 %) erhalten.

Beispiel 8

Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle von Dextran Kartoffelstärke verwendet. Das gewonnene Kulturfiltrat enthielt alkalische Dextranase (Aktivität 11 Einheiten/ml).

Beispiel 9

Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle von Dextran Maltose verwendet, und das gewonnene Kulturfiltrat enthielt alkalische Dextranase mit einer Aktivität von 10 Einheiten/ml.

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Claims (5)

1. An

   Patentansprüche

   Λ . Verfahren zur Herstellung von alkalischem Dextranase-Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der
   Art Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum NRRL B-3852 in einem eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthaltenden Kulturmedium gezüchtet und das dabei
   gewonnene Enzym von dem Kulturmedium abgetrennt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kulturmedium verwendet wird, welches 0,5 - 3$ an Äthanol enthält. %
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß di

   daß der Mikroorganismus 2 - s Tage lang bei 24- - 28°0 gezüchtet
4. 4-, Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung des gebildeten Enzyms durch Ausfällung,
   Absorption und Eluieren vorgenommen wird.
5. 5. Neues Dextranase-Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein alkaliahes Dextranase-Enzym handelt, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis ^,

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