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DE2301031A1 - Verfahren zur reinigung eines auf mikroorganismenzellen lytisch wirkenden enzyms - Google Patents

Verfahren zur reinigung eines auf mikroorganismenzellen lytisch wirkenden enzyms

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Publication number
DE2301031A1
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Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
acid
lytic
cells
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE2301031A
Other languages
English (en)
Inventor
Shinzo Nishimura
Kane Yokogawa
Yoshio Yoshimura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dainippon Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Publication of DE2301031A1 publication Critical patent/DE2301031A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
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Description

k. CNUCMnM. WALTER BEIl
Air-TlO !.Όν^νΠίΜΠΚ
OR. ί·...|·. s-;i.-i,c::.7MR-J. WOLHP
DR-IUS. HAI ο C,..:. G til.
023 J2iüfFti2r AM *wyi*-HQCiin u 9. Jan. 1973
Unsere Nr. 18 408
Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Osaka Japan
Verfahren zur Reinigung eines auf Mikroorganismenzellen Iytisch wirkenden Enzyms
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines auf Mikroorganismenzellen lytisch wirkenden Enzyms. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung eines Enzyms, das zur Lyolyse von Zellen von Mikroorganismen, insbesondere von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen, in der Lage ist und das durch Züchtung eines Mikroorganismus des Stammes Streptomyces erhalten wird, und ein gereinigtes auf Mikroorganismenzellen lytisch wirkendes Enzym.
Bei der Suche nach Mikroorganismen in der Natur, die in der Lage sind, ein die Zellen von Mikroorganismen, wie Zahnkaries er-
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«· - ρ —
zeugenden Mikroorganismen, lyolysierendes Enzym zu bilden, wurden einige Mikroorganismen entdeckt, die zum Stamme Streptomyees, wie z.B. S-1-Stamm (Streptomyces diastatochromogenes; ATCC Nr. 21481, FERM-P Nr. 326), H-191-Stamm (Streptomyces farinosus; ÄTCC Nr. 21482, FERM-P Nr. 327), H-4o2-Stamm (Streptomyces griseus var. H-4o2; ATCC Nr. 21483, FERM-P Nr. 328) und B-1829-Stamm „(Streptomyces -globisporus; ATCC Nr. 21553, FERM-P Nr. 596) gehören, wobei ATCC für American Type Culture Collection, U.S.A., und FERM für Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, Japan, steht.
Das auf Mikroorganismenzellen lytisch wirkende Enzym, das durch Züchtung dieser Mikroorganismen erhalten wurde, hat überlegene lytische V/irksamkeit auf Zellen von Mikroorganismen, insbesondere von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen, und ist daher als Mittel zur Verhinderung und Behandlung von Zahnkaries und */eiter zur Verhinderung der Verbreitung von Mikroorganismen in anderen Gebieten wertvoll.
Wenn der Mikroorganismus des Stammes Streptomyces gezüchtet wird, so sind jedoch in dem Produkt neben dem erfindungsgemäßen Enzym einige andere Verunreinigungen, insbesondere Proteasen enthalten. Es wurde gefunden, daß, wenn die Verunreinigungen vom Produkt entfernt wurden, das erfindungsgemäße Enzym größere Verwendungsmöglichkeiten besitzt.
Bei der Suche nach einem Verfahren zur Entfernung der Proteasen vom Kulturprodukt unter Gewinnung eines hochgereinigten Enzyms . wurde gefunden,daß die Proteasen durch herkömmliche Reinigungsverfahren, wie Aussalzen mit Ammoniumsulfate Ausfällen mit Aceton, Dialyse und Ionenaustausch Harz-oder Sephadex Chromatographie, kaum entfernt werden konnten. B^s wurde nun gefunden, daß die Proteasen durch Erniedrigung des pH-Viert es einer wässrigen Lösung, die das erfindungsgemäße Enzym und die Proteasen enthält, mit einer Säure,ohne einen unerwünschten Effekt auf das erfindungsgemäße Enzym auszuüben, inaktiviert
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x — "Χ _
werden können, und daß die so inaktivierten Proteasen dann durch konventionelle Filtration leicht entfernt werden können
Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung eines auf Mikroorganismenzellen lytisch wirkenden Enzyms, eines Verfahrens zur Entfernung von Proteasen von dem das auf Mikroorganismenzellen lytisch wirkende Enzym enthaltenden Produkt, das durch Züchtung eines Mikroorganismus des Stammes Streptomyces erhalten wurde, und die Bereitstellung eines gereinigten auf Mikroorganismenzellen lytisch v/irkendon Enzyms.
Diese und andere Ziele können der vorliegende Beschreibung entnommen werden.
Erfindungsgemäß wird eine wässrige Lösung, die ein auf Mikroorganismenzellen lytisch wirkendes Enzym und Proteasen enthält, die durchZüchtung eines Mikroorganismus des Stammes Streptomyces erhalten werden, zur Erniedrigung des pH-Wertes auf etwa 3,ο bis l,o mit einer Säure versetzt. Die Proteasen werden dabei nahezu inaktiviert } und die erhaltenen Niederschläge werden leicht durch Filtration entfernt.
In dem vorstehend genannten Verfahren wird der pH-Wert vorzugsweise auf etwa 3,0 bis l,o, insbesondere jedoch auf etwa 2,5 bis 1,5 eingestellt. Liegt der pH-Wert über 3,0, so wirddie Protease unzureichend entfernt. Wird jedoch andererseits auf mehr pH l,o angesäuert, so wird das gewünschte,auf Mikroorganismenzellen lytisch wirkende Enzym selbst nachteilig inaktiviert.
Die so erhaltene Lösung kann ohne wesentliche Erniedrigung der zell-lytischen Wirksamkeit lange Zeit aufbewahrt werden, es wird jedoch vorgezogen, das Produkt durch eine konventionelle Methode, z.B. Lyophilysieren,so bald als möglich zu dehydratisieren. Wird jedoch die Lösung in einem stark sauren Zustand lyophilysiert, so wird das erfindungsgemäße Enzym inaktiviert. Es wird
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daher vorgezogen, die Lösung vorher mit einem Alkali zu neutralisieren.
Das heißt,die Lösung wird nach Behandlung mit einer Säure auf einen pH-Wert von etwa 4,ο bis 8,0 reguliert und dann lyophilysiert, wobei das gewünschte reine, auf Mikroorganismenaellen lytisch wirkende Enzym erhalten wird. Die Regulierung des pH-Wertes mit einem Alkali wird durchgeführt in einem Bereich von etwa 4,o bis 8,0, vorzugsweise in einem Bereich von etwa 5>o bis 7jO. Ist der pH-Wert unter 4,o, so wird das erfindungsgemäP>e Enzym bei der Lyophilysation wesentlich inaktiviert. Wiro'andererseits der pH-Wert der Lösung über pH 8,0 alkalisch gemacht, so wird das.erfindungsgemäße Enzym leicht inaktiviert.
Gemäß den vorstehend beschriebenen Behandlungen werden die Proteasen, deren isoelektrischer Punkt in einem sauren Bereich liegt, inaktiviert und gleichzeitig ausgefällt und können daher leicht durch Filtration entfernt werden. Die Filtration kann entweder vor oder nach der Behandlung mit einem Alkali, aber vorzugsweise nach der Behandlung mit einem Alkali und nach Entfernung der Salze durch Dialyse oder dergl. durchgeführt werden. Die Filtration kann in beliebiger konventioneller V/eise, wie z.B. durch Verwendung eines Filterpapiers oder einer Zentrifuge durchgeführt werden.
Die Behandlung mit einer Säure und/oder Alkali kann bei jeder beliebigen Temperatur, bei welcher das erfindungsgemäße Enzym nicht inaktiviert wird>durchgeführt werden. Gewöhnlich wird bei Raumtemperatur oder darunter gearbeitet. Es ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, bei gekühlten Temperaturen zu arbeiten, da hinsichtlich» enzymatischen Aktivität zwischen den Behandlungen bei H 0C und bei Raumtemperatur keine Differenz besteht. Das erfindungsgemäße Enzym wird, wenn es 2o Minuten bei 60 C behandelt wird, inaktiviert. Es wird jedoch nicht inaktiviert ,wenn es bei einer niederen Temperatur als 60 °C eine kürzere Zeitspanne behandelt wird. Es kann daher gegebenenfalls bei einer erhöhten Temperatur (niedriger als 60 C) behandelt
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werden.
Die Proteasen können durch Behandlung mit einer Säure augenblicklich inaktiviert werden. Daher kann die mit einer Säure behandelte Lösung mit einem.Alkali unmittelbar nach der Behandlung mit einer Säure neutralisiert werden. Die Lösung kann jedoch gegebenenfalls ziemlich lange Zeit in saurem Zustand
aufbewahrt werden.
Als Säure kann gemäß der vorliegenden Erfindung eine anorganische Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphors?.!ure,
und eine organische Säure wie Essigsäure,welche die Lösung
auf einen pH-Wert unter etwa 3>o ansäuern kann, verwendet
werden. Salpetersäure kann jedoch nicht verwendet werden, da sie mit einem Protein reagiert und das erfindungsgemäße Enzym inaktiviert.
Als Alkali kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines Alkalimetalls oder eines Erdalkalimetalls ( z.B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbicarbonat oder Calciumhydroxid) oder Ammoniak, welcher, den pH-Wert der Lösung auf etwa 2J,o bis etwa 8,0 einstellen kann, verwendet werden,
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
Bezugsbeispiel:
Der isolierte B-I829-Stamm wurde auf einer Agar-Schrägkultur inokuliert, die ein 1% Glukose, o,2? Pepton, o,l% Hefeextrakt o,1% Fleischextrakt und 1,5? Agar enthielt, und wurde 7 Tage bei 3o C kultiviert. Die erhaltenen Sporen wurden in einem
5oo ml Sakaguchi-Kolben, der 5o ml flüssiges Medium vom pH-Wert 7,5 aus 2% Dextrin, 0,5? Soyabohnenpulver, o,25* Pepton, o,5£ Dinatriumhydrogenphosphat, o,l% Kaliumdihydrogenphosphat, o,13S Magnesiumsulfat und 0,5 Natriumchlorid enthielt, inokuliert und 3 Tage bei 3o °C einer Schüttelkultur unterworfen.
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Die dabei erhaltene Kulturbrühe wurde abfiltriert, wobei JI9,5 ττΛ Enzymlösung erhalten wurde.
Wurde in dem obengenannten Verfahren anstelle des isolierten B-I829 -Stammes der isolierte S-I-, H-191- oder H-.'lo2- Stamm verwendet, so wurde gleichfalls die gewünschte Enzymlösung erhalten.
Die Einheit der lytischen Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Enzyms wurde nach der folgenden Methode bestimmt. o,4 ml einer Suspension von intakten(Zellen oder erhitzten Zellen von der Lyse zu unterwerfenden Mikroorganismen, z.B, von cariogenern Streptococcus (BHT), 2 ml einer auf eine geeignete Konzentration verdünnte!Enzymlösung und 1,6 ml o,o25 m Tris-HCl-Puffer (pH 7so) wurden zu. einem Gesamtvolumen von H ml gemischt. Das Gemisch wurde 5 Minuten bei 37 0C gehaltenem es der zell-lytischen Reaktion zu unterwerfen. Anschließend wurde die optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 600 ΐημ eines photoelektrischen Colorimeters gemessen1und die Einheit der lytischen Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Enzyms wurde gemäß der Gleichung I bestimmt. Als Kontrollprobe wurde anstelle von 2 ml der Enzymlösung 2 ml Wasser verwendet.
Gleichung I
(a - b) - (a -r. c) c - b
Einheit/ml. oder mg =
a = optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 600 m/i bei einer Reaktionszeit von O,
b = optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 600 χημ. nach t Minuten,
c = optische Dichte der Kontroll-Ifsung bei 600 rryu nach t Minuten,
t = Reaktionszeit (Minuten)
ν = Menge (ml oder mg) von tatsächlich verwendeter ursprünglicher Enzymlösung oder verwendetem Enzympulver
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Beispiel 1
Die Kulturbrühe, die durch Züchtung des isolierten B-l829-Stammes mit einem lOO Liter-Fermentor in der gleichen Weise,wie im Bezugsbeispiel beschrieben, erhalten wurde, wurde durch eine' Filterpresse filtriert, wobei 7o Liter Filtrat erhalten wurden. Das Filtrat wurde mit 2,8 kg Amberlite CG 5o (H+-Typ des Ionenaustauscher-Harzes, Rohm and Haas Co., U.S.A.) versetzt. Das Gemisch wurde zur Adsorbtion des Enzyms an dem Harz eine Stunde gerührt. Das Harz wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Das das Enzym adsorbierende Hnrz wurde mit Io Liter o,2 m NapHPO^ versetzt ,und dann wurde das Gemisch mit wässrigem Ammoniak auf pH 7,5 alkalisch gemacht und eine Stunde gerührt, wobei das Enzym eluiert wurde. 12 Liter des Eluats wurden mit festem Ammoniumsulfat versetzt, so daß eine βοί5Sättigung erreicht wurde, und das Gemisch wurde dann über Nacht bei H °C abgestellt. Die erhaltenen Niederschläge wurden durch Filtration abgetrennt und in 1,8 Liter Leitungswasser gelöst, um eine wässrige, die Enzyme enthaltende Lösung zu erhalten. Die wässrige Lösung wurde mit In HCl auf pH 2,ο eingestellt und 3o Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Neutralisation auf pH 6,ο unter Verwendung von In NaOH wurde die Lösung gegen fließendes Wasser dialysiert, wobei 2,3 Liter der Lösung erhalten wurden. Die so erhaltene Lösung wurde lyophilysiert, wobei 6,8 g Enzympulver erhalten wurde.
Beispiele 2-6
Die wässrige, die Enzyme enthaltende Lösung, die in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben,erhalten wurde, wurde mit In HCl auf verschiedene pH-Werte eingestellt. Nach 3o minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch filtriert. Am Filtrat wurde die verbliebene Wirksamkeit des auf Mikroorganismenzellen lytisch wirkenden Enzyms (nachfolgend als verbliebene zell-lytische Wirksamkeit bezeichnet) und die verbliebene Protease-Wirksamkeit gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
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Tabelle 1 Verbliebene
zell-lytische
Wirksamkeit
CO +1 		Verbliebene
Protease-
Wirksamkeit
(%) +2
Beispiel
Nr.		 pH-Wert 100 100
ursprüngl.
Enzymlösung		 - 6,5 ' 95,4
101,3
108,6
97,4
95,1		 89,7
33,6
10,9
. 9,7
12·,0
2
3
4
5
6		 3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
Bemerkungen: +1: Relative zell-lytische Wirksamkeit, wenn
die zell-lytische Wirksamkeit der ursprünglichen Enzymlösung 100 betrug.
+2: Relative Protease-Wirksamkeit, wenn die Protease-Wirksamkeit der ursprünglichen Enzymlösung 100 betrug. Die Protease-Wirksamkeit wurde nach der"Kunitz's casein hydrolysis method"(Kunitζ, M: J. Gen. Physiol., VoI,Seiten 291-310, 1947: crystalline soybean trypsin inhibitor II, General Properties) gemessen.
Beispiele 7-12
Die wässrige, die Enzyme enthaltende Lösung, die in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben,erhalten wurde, wurde mit 1 η HCl auf verschiedene pH-Werte eingestellt. Nach 30-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch mit 1 η NaOH auf pH 6,5 neutralisiert und dann unter Verwendung eines Filterpapiers filtriert. Am Piltrat wurde
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die verbliebene zell-lytische Wirksamkeit und die verbliebene Protease-Wirksamkeit,wie in Beispiel 2-6 beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 aufgeführt.
3,5 Tabelle 2 Verbliebene
Protease-
Wirksamkeit
• 3,0 Verbliebene
zell-lytische
Wirksamkeit
(50		 100
•
Beispiel pH-Wert
Nr. {Behandelt
mit Säure)		 2,5 100 90,0
Ursprüngliche r ν
Enzymlösung y-> 		2,0 97,1 75,0
7 1,5 106,6 20,7
8 1,0 101,3 12,0
9 100,1 9,7
10 91,8 8,3
11 73,5
12
Aus den aus Tabelle 1 und 2 ersichtlichen Ergebnissen kann entnommen werden, daß nur die Proteasen bei pH 3,0 bis 1,0 inaktiviert werden, ohne daß eine Inaktivierung des erfindungsgemäßen Enzyms auftritt.
Beispiele 13 - 19
Die wässrige, die Enzyme enthaltende Lösung, die in der gleichen Weise,wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurde, wurde mit 1 η HCl auf pH 2,0 eingestellt. Das Gemisch wurde unmittelbar oder nachdem es 30, 60 oder 120 Minuten bei Raumtemperatur gestanden hatte, mit In NaOH auf pH 6,5 neutralisiert. Anschließend wurde das Gemisch gegen fließendes
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Wasser dialysiert und filtriert. Das Filtrat wurde dann lyophilysiert, wobei ein Enzympulver erhalten wurde.
Das vorstehend genannte Verfahren wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß nach Einstellung des pH-Wertes mit In HCl das Gemisch bei 4 °C abgestellt wurde. Es wurde Enzympulver erhalten.
An diesen Enzympulvern v.'ur-rlo die verbliebene zell-lytische Wirksamkeit und die verbliebene Protease-Wirksamkeit,wie in den Beispielen 2-6 beschrieben,gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 aufgeführt. Wie diese Ergebnisse zeigen, wurde die verbliebene zell-lytische Wirksamkeit und die Protease-Wirksamkeit nicht beeinträchtigt durch die Temperatur, wenn bei Raumtemperatur oder darunter gearbeitet wurde. Weiterhin wird gezeigt, daß die Abstellzeiten keinen Effekt auf die Wirksamkeiten ausüben und daß eine Erniedrigung der verbliebenen zell-lytischen Wirksamkeit bei 120 Minuten nicht beobachtet wurde.
Beispiel Tempera-Nr. tür
Tabelle 3
Abstellzeit Verbliebene Verbliebene (Minuten) zell-lytische Protease-Wirksamkeit Wirksamkeit CO (55)
Ursprüngl.
Enzymlösung		 Raumtem
peratur		 - 100 100
13 ti 0 93,1 13,2
11 Il 30 97,9 11,9
15 It 60 91,0 9,8
16 4 0C 120 104,1 10,2
17 It 30 110,3 10,0
18 It
4098		 60 108,3 15,6
19 120
19/0986		 103,4 9,5
Beispiele 20 - 32
Die wässrige, die Enzyme enthaltende Lösung, die in der gleichen Weise ,wie in Beispiel 1 beschrieben , hergestellt wurde, wurde mit verschiedenen Säuren auf pH 2,0 eingestellt. Das Gemisch wurde mit verschiedenen alkalischen Verbindungen auf pH 6,5 neutralisiert und unter Verwendung eines Filterpapiers filtriert. Am. Filtrat wurde die verbliebene zell-lytische Wirksamkeit und die verbliebene Protease-Wirksamkeit,wie in den Beispielen 2-6 beschrieben, gemessen, Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4
Beispiel Art Art des Verbliebene Verbliebene
Nr. der Alkalis zell-lytische Protease-
Säure Wirksamkeit Wirksamkeit
Urspüngl.
Enzymlösung
100
100
20 HCl NaOH 93,5 14,1
21 fl KOH 91,4 12,0
22 Il NH11OH 101,3 10,5
2-3 Il Na CO,
2 3		 98,7 9,8
24 H2SO1, NaOH 91,6 15,1
25 Il KOH 96,4 11,3
26 Il NH11OH 102,0 13,0
27 It Na2CO3 100,4 13,0
28 H3PO11 NaOH 92,9 17,5
29 Il KOH 89,1 11,1
30 It NH14OH 91,5 15,0
31 It Na3CO3 92,3 1*·3
32 CH3COOH+ NaOH · 90,1 36,9
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Anmerkung +: Eisessig wurde ohne Verdünnung verwendet.
Wurde der pH-Wert auf pH 2,7 erniedrigt, wurde die Lösung neutralisiert.
Beispiele 33 - 38
Die wässrige, die Enzyme enthaltende Lösung, die in der gleichen Weise^wie in Beispiel 1 beschrieben;» hergestellt wurde, wurde mit In HCl auf verschiedene pH-Werte eingestellt. Daa Gemisch vmrde filtriert und anschließend unmittelbar lyophilysiert, wobei ein Enzympulver erhalten wurde.
Andererseits wurde das Gemisch, dessen pH-Wert mit In HCl, wie vorstehend beschrieben5eingestellt wurde, mit In NaOH auf pH 6,5 neutralisiert und anschließend wurde das Gemisch unmittelbar filtriert und lyophilysiert, wobei Enzympulver erhalten wurde.
Als Kontrolle wurde die wässrige, die Enzyme enthaltende Lösung ohne Behandlung mit Säure oder Alkali lyophilysiert, wobei Enzympulver erhalten wurde.
An diesen Enzympulvemwurde die verbliebene zell-lytische Wirksamkeit und die verbliebene Protease-Wirksamkeit,wie in Beispielen 2-6 beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 aufgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß, wenn die mit Säure behandelte Lösung lyophilysiert wurde, ohne mit Alkali neutralisiert zu werden, die verbliebene zell-lytische Wirksamkeit im Vergleich zu jenen, bei welchen nach Neutralisation lyophilysiert vmrde, erniedrigt wurde.
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Tabelle 5 neutrali
siert		 Verbliebene Verbliebene
Beispiel pH-Wert - ir^sam ei VYXJ. IVu GLIUkV CT J. Iy
(S)
Nr. behandelt
mit Säur,e		 - 100 100
Kontroll
probe		 - - 84,8
63,6		 11,7
11,8
33
y\ 		2,5
2,0.		 6,5 56,1 12,6
35 1,5 6,5 98,5 23,9
36 2,5 6,5 99,2 ' 17,5
37 2,0 90,2 13,7
38 1,5
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Claims (5)

  1. Patentansprüche:
    1; Verfahren zur Reinigung eines auf Mikroorganismenzeller» lytisch wirkenden, mit Proteasen verunreinigten Enzyms, das durch Züchtung eines Mikroorganismus des Stammes Streptomyces erhalten wurde, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-V/ert einer wässrigen, das- auf Mikroorganismenzellen lytisch
    wirkende Enzym und Proteasen enthaltenden Lösung mit einer Säure in einem Bore ich von etwa 350 - 1,0 einstellt und die erhaltenen Niederschläge der Proteasen abfiltriert.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säure Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Essigsäure verwendet.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die wässrige, das auf Mikroorganismenzellen lytisch
    wirkende Enzym und Proteasen enthaltende Lösung vor oder
    nach der Filtration mit einem Alkali auf einen pH-Bereich von etwa 4,0 bis 8,0 neutralisiert.
  4. 1J. Verfahren nach Anspruch 3j 'dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkali Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbicarbonat, Calciumhydroxid oder Ammoniak verwendet.
  5. 5. Hochgereinigtes, auf Mikroorganismenzellen lytisch wirkendes Enzym, erhalten durch Einstellung des pH-Wertes einer wässrigen Lösung, die das auf Mikroorganismenzellen lytisch wirkende Enzym und Proteasen enthält, mit einer Säure auf einen pH-Bereich von etwa 35O bis 1,0, Neutralisation der Lösung mit einem Alkali auf einen pH-Bereich von etv/a M,0 bis 8,0, Abfiltrieren der Niederschläge und anschließende
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    Dehydratisierung der erhaltenen gereinigten Lösung.
    Für
    Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
    (Dr. vH.J. Wolff) Rechtsanwalt
    409819/0986
DE2301031A 1972-10-24 1973-01-10 Verfahren zur reinigung eines auf mikroorganismenzellen lytisch wirkenden enzyms Pending DE2301031A1 (de)

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ID=14436148

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Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2301031A Pending DE2301031A1 (de) 1972-10-24 1973-01-10 Verfahren zur reinigung eines auf mikroorganismenzellen lytisch wirkenden enzyms

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