AT257837B - Verfahren zur Herstellung von neuen, antibiotisch wirksamen Substanzen - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung von neuen, antibiotisch wirksamen Substanzen 
Die Erfindung betrifft die Herstellung von neuen, antibiotisch wirksamen Substanzen. Diese Antibiotika werden durch Züchtung von neu isolierten Mikroorganismen erzeugt, die der Gattung der thermophilen Actinomyceten angehören. Kulturen der neuen Stämme von thermophilen Actinomyceten sind in der American Type Culture Collection unter den Nummern ATCC 14760, ATCC 14761 und   ATCC 14762   hinterlegt. 



   Zur taxonomischen Kennzeichnung der neuen Mikroorganismenstämme wird angeführt, dass beim Stamm ATCC 14 760 die gebildeten Sporophoren als kurze, bisweilen verzweigte Ketten auftreten. Die Sporophoren sind rund oder oval mit einem Durchmesser von zirka 0,5 bis zirka 0,8   m.   Der Stamm ATCC   14761   unterscheidet sich von den beiden andern Stämmen dadurch, dass er ein Rennin-ähnliches Enzym bilden kann, das Milch koaguliert. Im Gegensatz hiezu bildet der Stamm ATCC   14 762   dieses Enzym nicht und zeigt, verglichen mit dem Stamm ATCC 14760, ein anderes antibiotisches Spektrum.

   Die neuen Mikroorganismenstämme der Art Streptomyces refuineus var. thermotolerans verhalten sich auf verschiedenen Nährböden, inkubiert 8 Tage bei 450 C, wie folgt :
Sucrose-Nitrat-Agar : Mässiges Wachstum, keine Sporenbildung, Farbe der Unterseite hellgelb, geringe Nitratreduktion. 



   Dextrin-Cellulose-Agar : Gutes Wachstum, weisse Sporen, Unterseite unverändert, keine Cellulase.
Glycerin-Asparagin-Agar : Mässiges Wachstum, keine Sporenbildung, Unterseite unverändert oder sehr schwach gelb. 



     Nähr-Agar :   Schwaches Wachstum, geringe Sporenbildung (weiss), Unterseite unverändert. 



   Pepton-Eisen-Agar : Gutes Wachstum, geringe Sporenbildung, Unterseite unverändert, geringe Bildung von Schwefelwasserstoff. 



     Lackmus-Milch-Agar :   Peptonisierung, mässige   Säurebildung (PH   = 6), keine erkennbare Koagulierung. 



   Gelatine-Agar : Lebhaftes Wachstum, weisse Sporen, Unterseite gelb, deutlicher Abbau von Gelatine (17 mm-Zone rings um die Kolonien). 



     Stärke-Agar : Lebhaftes   Wachstum, Sporen und Unterseite weiss, allmähliche Produktion von Amylase   (1-   2 mm - Zone rings um die Kolonien). 



     Kartoffelstückchen :   Kein merkliches Wachstum. 



   Die neuen thermophilen Actinomycetenstämme der Art Streptomyces refuineus var. thermotolerans können nach den üblichen bakteriologischen Verfahren zur Isolierung reiner Kulturen gewonnen werden. 



   Bei Züchtung in dem von Tendler und Burkholder in "Applied Microbiology", 9,   394 - 399   (September 1961) als Medium la beschriebenen Erhaltungsmedium weist das Mycel der Mikroorganismen kurze spiralförmige Sporophoren auf, bei Verwendung des weiter unten beschriebenen Mediums erhält man ein-oder zweisporige Gebilde. Die Färbung der Kolonien verschiebt sich auf der sporulierenden Seite beim Altern von weiss über creme, grau nach schwarz. Auf der Rückseite erfolgt eine Farbverschiebung von gelb, grau nach schwarz. 



   Das Spektrum der Exoenzyme einer Kultur enthält Caseinase, Gelatinase, Amylase und Lipase ; es enthält auch Säure und ruft Peptonisation der Milch hervor. Nitrate werden nicht zu Nitriten reduziert, sowie auch Schwefelwasserstoff in organischem Medium nicht reduziert wird. Es erfolgt nach einigen 

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Subkulturen kein Wachstum in rein synthetischem Medium ohne organische Stickstoffquelle. Hingegen findet gutes Wachstum, jedoch mit verminderter Lebensfähigkeit, auf einem an organischen Stof- fen reichen Medium statt, das zur Züchtung der Actinomyceten diente. 



   Das mit Hilfe der erfindungsgemäss vorgeschlagenen Organismen gewinnbare Antibiotikum ist gegen penicillin- und tetracyclin-resistente Staph. aureus aktiv. Es ist weiter aktiv gegen Mycobacterium smegmatis und in gewissem Ausmass auch gegen B. subtilis und S. lutea. Nicht wirksam ist es gegen Sac. cerivisae, Candida albicans, E. coli, Ps. aeruginosa und A. aerogenes. 



   In der folgenden Tabelle ist angegeben, wie die Organismen bei Verwendung verschiedener Koh- lenstoff-bzw. Stickstoffquellen wachsen, wobei die nach den einzelnen Kohlenstoff- bzw. Stickstoffquellen angegebenen Symbole folgende Bedeutung haben : + = Wachstum ; kein Wachstum ; geringes Wachstum. 



   Tabelle 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> Stickstoffquelle
<tb> Xylose <SEP> + <SEP> Asparagin <SEP> +
<tb> Arabinose <SEP> + <SEP> Glycine <SEP> + <SEP> 
<tb> Rhamnose <SEP> + <SEP> Leucin
<tb> Fructose <SEP> + <SEP> Glutaminsäure <SEP> + <SEP> 
<tb> Galactose <SEP> Tryptophan
<tb> Glucose <SEP> + <SEP> Tyrosin <SEP> + <SEP> 
<tb> Mannose-NaNO
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> NH-Acetate <SEP> 
<tb> Sucrose- <SEP> (MH) <SEP> SO <SEP> 
<tb> Lactose <SEP> - <SEP> Gelatine <SEP> + <SEP> 
<tb> Cellobiose <SEP> Eialbumin <SEP> 
<tb> Raffinose <SEP> Cosaminsäure
<tb> Dextrin
<tb> Inulin
<tb> lösliche <SEP> Stärke <SEP> + <SEP> 
<tb> Glycerin
<tb> Dulcit <SEP> ¯
<tb> Mannit
<tb> Sorbit
<tb> Inosit
<tb> Salicin
<tb> Phenol
<tb> Na-acetate
<tb> Na-citrate
<tb> Na-succinate
<tb> 
 
Die neuen antibiotisch wirksamen Substanzen können dadurch hergestellt werden,

   dass man die Actinomyceten-Stämme   ATCC 14760, ATCC 14761   oder ATCC 14 762 der Art Streptomyces refuineus 

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 var. thermotolerans in einem sterilen, flüssigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und   Stick : toffquelle   enthält, bei einer Temperatur zwischen ungefähr 37 und   560 C   kultiviert und gegebenenfalls das Antibiotikum aus der Gärlösung isoliert. Optimale Wachstumsbedingungen für diese Mikroorganismen liegen bei ungefähr 480 C und in einem pH-Bereich von ungefähr 6, 1 bis 8,4. 



   Ein geeignetes Nährmedium ist z. B. wie folgt zusammengesetzt : 
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Casein <SEP> digeriert <SEP> mit <SEP> Pankreasferment
<tb> (Sheffield <SEP> Chemical <SEP> Co. <SEP> N-Z <SEP> Amine
<tb> Type <SEP> B) <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> Soyaproteinhydrolysat <SEP> (Soytone) <SEP> 0, <SEP> 2%
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0, <SEP> 2%
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 1, <SEP> 00/0
<tb> D-Mannitol <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> MgSO. <SEP> 7 <SEP> HzO <SEP> 0, <SEP> 05%
<tb> Spurenelementlösung <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml/100 <SEP> ml
<tb> 
 Zusammensetzung der Spurenelement-Stammlösung (per   ml) :

     
 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> Fe <SEP> als <SEP> Fe <SEP> (NH <SEP> S04 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> mg
<tb> ZnalsZnSO <SEP> 1,0 <SEP> mg
<tb> Mn <SEP> als <SEP> MnSO <SEP> 0,5 <SEP> mg
<tb> Cu <SEP> als <SEP> CuSO <SEP> 0,08 <SEP> mg
<tb> CoalsCoSO <SEP> 0,1 <SEP> mg
<tb> BalsHBO <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> 
 
Die erhaltenen antibiotisch wirksamen Substanzen können in üblicher Weise, z. B. durch Fällung, isoliert werden. Vorzugsweise können sie nach Filtrieren oder Zentrifugieren der Nährlösung oder nach teilweisem Ausfrieren aus der verbleibenden Flüssigkeit durch Aussalzen,   z. B.   mit Ammoniumsulfat, abgetrennt werden. 



   Die erfindungsgemäss erhältlichen Produkte weisen oncostatische und oncolytische Eigenschaften auf und können deshalb zur Behandlung von Tumoren bei Mensch und Tier eingesetzt werden. 



   Beispiel : Das oben erwähnte Nährmedium wird mit einer Ausgangskultur des Mikroorganismus ATCC   14760   geimpft und während 17 1/2 h bei 480 C bebrütet. Die filtrierte oder zentrifugierte Gärbrühe wird unter ständigem Rühren fast vollständig eingefroren, dann bis zu ungefähr 1/10 des gesamten Volumens aufgetaut, der aufgetaute Anteil durch Dekantierung und Filtrierung abgetrennt und durch Zentrifugation geklärt. Die verbleibende Lösung wird mit ungefähr   30% gem   Ammoniumsulfat behandelt und der entstehende Niederschlag in physiologischer Salzlösung gelöst.

   Durch Variieren der Konzentration und Messung der   antibiotischen Aktivität   gegen Staphylococcus   aureus ATCC 13 680 auf Grund   des Plattentestes mit Filterpapierrondellen kann ein Präparat mit der gewünschten Aktivität hergestellt werden. 



   Ein Präparat, das im   Plattentest   eine Hemmzone von 4 mm zeigt, kann nach Sterilisierung für intramuskuläre oder subkutane Injektionen in einer täglichen Dosis von 2, 0 ml verwendet werden. Zweckmässig verabreicht man diese Dosis erst nach langsamer Steigerung. 



   Ähnliche tumorhemmende Präparate erhält man durch Kultivierung von ATCC 14761 und ATCC 14762 unter den vorstehend gegebenen Bedingungen. Es treten keine toxischen Nebenwirkungen, die einer medizinischen Verwertung der Verbindungen entgegenstehen, zu Tage. 

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   Bei Versuchen mit cancer-infizierten Mäusen wurde die Konzentration eines erfindungsgemäss her- gestellten Wirkstoffes so gewählt, dass die Wirkstoffmenge 50 mg pro kg Körpergewicht betrug. Diese
Wirkstoffmenge reichte aus, um "sarcoma 180", "carcinoma 755" und "Ehrlich ascites" signifikant zu hemmen, wobei keine "leukaemia 1210" auftrat (Bezeichnungen der Tumore gemäss National Institutes i of Health protocols   1 : 301 - 302,   Juni 1962). 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung von neuen antibiotisch wirksamen Substanzen,   d a d u r ch g e k e n n -   
 EMI4.1 
 milierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, bei einer   Temperatur zwischen ungefähr 37 und   560 C kultiviert und gegebenenfalls das Antibioticum aus der Gärlösung isoliert.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mikroorganismen bei einer Temperatur von ungefähr 480 C wachsen lässt.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mikroorganismen bei einem PH von ungefähr 6, 1 bis 8,4 wachsen lässt. EMI4.2