DE2814038A1

DE2814038A1 - Zur verwendung mit einem radionuklid bestimmtes albuminhaltiges diagnostikum

Info

Publication number: DE2814038A1
Application number: DE19782814038
Authority: DE
Inventors: Warren W Layne; Eugene L Saklad
Original assignee: New England Nuclear Corp
Current assignee: Bristol Myers Squibb Pharma Co
Priority date: 1977-04-01
Filing date: 1978-03-31
Publication date: 1978-10-05
Also published as: FR2385403B1; CA1110542A; GB1594187A; DE2814038C3; DE2814038B2; JPS53127809A; JPS5742611B2; CH642852A5; FR2385403A1; US4094965A

Description

Dipl.-Ing. Dipl.-Chem. Dipl.-Ing.

E. Prinz - Dr. G. Hauser - G. Leiser

Ernsbergerstrasse 19

8 München 60

New England Nuclear Corporation 30. März 1978 549 Albany Street

Boston, Massachusetts 02118 / V.St.A. Unser Zeichen: N 672

Zur Verwendung mit einem Radionuklid bestimmtes albuminhaltiges Diagnostikum

Die Erfindung betrifft Mittel, die sich auf dem Gebiet der Medizin zur Feststellung und Diagnose von Krankheiten, zur Untersuchung und Bewertung von Körperorganen und/oder für andere Zwecke eignen, sowie die mit diesen Mitteln arbeitenden diagnostischen und auswertenden Verfahren. Insbesondere betrifft die Erfindung Mittel, die mit Radionuklidtracern für die radiologische Anzeige verschiedener Gewebearten, einschließlich Blut, Körperorganen wie Herz, Leber und Lunge und anderen Organen markiert werden können.

Die Verwendung von Tracerverbindungen, die innerhalb des Körpers Strahlung abgeben, als medizinisches Mittel ist bereits lange bekannt. Bereits früher wurden solche Stoffe

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zum Testen der Leberfunktion und der Gallendurchgängigkeit sowie für die Analyse der physiologischen Struktur und Funktion z.B. der Nieren verwendet.

Sehr viel Informationen über den Körper kann man durch Verwendung der "Bloodpool"-Mittel genannten Tracerzusammensetzungen erhalten. Solche Mittel sind in der Regel mit einem Radionuklid markiertes Serumalbumin, für gewöhnlich mit einem Radionuklid markiertes menschliches Serumalbumin zum Test in menschlichen Körpern sowie menschliches oder anderes Serumalbumin, z.B. Ochsenserumalbumin, für Tests in anderen Lebewesen. In solchen Reagenzien wird ein Eiweißträger verwendet, der mit einem Radionuklid, z.B. Technetium-99m oder Jod-131, behaftet ist. Diese Mittel können sehr viele Daten liefern, einschließlich über das Blut- und Plasmavolumen, über die regionale Dynamik der Herzgefäße, über die gesamte Dynamik der Herzgefäße, z.B. die Herzleistung, Zirkulationsdauern, Proteinumsatz, Lokalisierung der Plazenta, Feststellung eines Gehirntumors, Herz- und Leberdarsteilung. Zum Beispiel wird das Plasmavolumen unter Verwendung von mit einem Radionuklid markiertem menschlichem Serumalbumin (MSA) durch intravenöse Injektion eines bekannten Volumens mit bekannter Konzentration an markiertem MSA in das Subjekt bestimmt. Das Albumin ist im wesentlichen auf das Plasma in dem Blut begrenzt und die Konzentration des mit dem Radionuklid markierten Albumins in dem Plasma ist eine Funktion des Gesamtplasmavolumens. Durch Entnahme von Blutproben nach kurzen Zeitabständen kann das insgesamt fixierte Volumen auf der Basis der insgesamt injizierten Radioaktivität und der pro Volumeneinheit gemessenen berechnet werden. Man kann auch das gesamte Blut zur Bestimmung des gesamten Blutvolumens mit einem annehmbaren

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Genauigkeitsgrad auszählen. Verwiesen wird auf Physician's Desk Reference for Radiology and Nuclear Medicine, Seite 17 (6. Ausgabe 1976). Dem Patienten wird eine Blut- oder Plasmaprobe entnommen und ausgezählt und das Blut- oder Plasmavolumen ist gleich der ursprünglich injizierten radioaktiven Dosis, dividiert durch die Aktivitätskonzentration in der Probe. Der Test ist ziemlich gut reproduzierbar und gibt Werte für einzelne Individuen, die innerhalb etwa 5 % schwanken. Das Plasmavolumen erhält man durch Entnahme der Probe und Abtrennung des Plasmas von dem Rest des gesamten Bluts vor Bestimmung der Konzentration darin. Das gesamte Blutvolumen erhält man durch Messung der Konzentration ohne Trennung der Blutkomponenten der Probe.

Mit einem Radionuklid markiertes MSA kann auch für andere Bestimmungen verwendet werden. Zum Beispiel läßt sich die Herzleistung in Patienten bestimmen, bei denen Anomalien der Herztätigkeit mit Herkranzgefäßschwächen oder anderen myocardialen Anomalien festgestellt wurden. Durch Injektion beispielsweise eines kleinen Bolus von mit einem Radionuklid markiertem MSA und Überwachung des Eindringens des Bolus und des Austretens der Radioaktivität aus dem Herzen kann die Herzleistung bestimmt werden. Andere wirksamere Methoden, einschließlich einer torgesteuerten Abbildung, sind ebenfalls bekannt. Auch eignen sich "Bloodpool"-Mittel zur Diagnose von Herzbeuteleffusion, zur Feststellung von Nebenschlüssen und anderen intracardialen Anomalien, zur differentiellen Diagnose des Mediastinums (Mittelfells), zur Diagnose von Ventrikel- oder Hauptgefäßaneurysmen und zur Bewertung der Durchgängigkeit von Hauptgefäßen. Sowohl die statische radiologische Darstellung als auch die

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mit einem Radionuklid arbeitende Arteriographie werden angewendet. Die Anwendung dieser Techniken zur Bestimmung von Herzbeuteleffusion, Nebenschlüssen und anderen intracardialen Anomalien, zur Bestimmung der Mediastinummassen, von Aneurysmen, zur Durchgängigkeit von Hauptgefäßen und zur Lokalisierung der Plazenta, insbesondere zur Identifizierung von placenta previa, ist in der vorstehend genannten Literaturstelle auf den Seiten 44 - 46 beschrieben.

Andere ähnliche Stoffe wurden mit gutem Erfolg in anderen Körperteilen verwendet. Zum Beispiel wurde denaturiertes, zu Makroaggregaten zusammengeschlossenes, mit einem Radionuklid markiertes MSA in vorteilhafter Weise für das Studium der Lungendurchblutung verwendet. Markierte Mikrokügelchen aus denaturiertem Albumin wurden für diesen Zweck ebenfalls verwendet.

"Bloodpool"-Mittel wurden auch zur Darstellung der Leber, insbesondere von deren Gefäßraum, verwendet. Auch wurden Mikroaggregate, mit einer Teilchengröße von weniger als 5 jum, vorzugsweise von 0,1 bis 5/um, mit besonderem Vorteil zum Studium der Leber verwendet. Mikroaggregate bildendes Serumalbumin wird zum Unterschied zu Makroaggregate bildendem Albumin, das als MAA bezeichnet wird, als MIA bezeichnet.

Im wesentlichen alle bekannten Anwendungen von MSA litten unter extrem schwierigen Problemen, die in erster Linie durch die mangelnde Stabilität von übliches menschliches Albumin, insbesondere bei einem niedrigen pH-Wert, enthaltenden Produkten verursacht wurden. Ein Beispiel hierfür ist die Herstellung von Stannoionen enthaltenden

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Albuminzusammensetzungen bei den pH-Werten, die erforderlich sind, um Stannoionen in Lösung zu bringen. Standard-MSA ergibt ein Produkt, das trübe wird und rasch aus der Lösung ausfällt. Selbst wenn es kurz nach seiner Herstellung gefriergetrocknet (lyophilisiert) wird, bildet sich innerhalb einer Stunde nach seiner Wiederherstellung eine Trübung. Das ist ein ernsthafter Nachteil, insbesondere wenn das MSA als Teil einer Ausrüstung (Kit) zur Durchführung des vollständigen radiologischen Tests dient, da, wie bekannt, das MSA so instabil ist, daß die gleiche Ausrüstung nicht einmal einen ganzen Tag lang verwendet werden kann, d.h. das MSA bildet Trübungen und es finden sich Niederschläge. Außerdem sind niedrige pH-Werte, z.B. von etwa 3, erforderlich, damit eine hohe Aufnahme des markierten MSA-Komplexes im Blut erfolgt. Außerdem ist die effektive Lebensdauer einiger bekannter MSA-Diagnostika so kurz, da sie in der Regel verwendet werden müssen, bevor sie wirksam getestet werden konnten, daß sie kein Fieber erzeugen und steril sind.

Weitere Probleme und Komplikationen treten bei der Herstellung von radioaktiv markiertem MSA und MIA aufgrund der Schwierigkeit bei der Steuerung der Aggregatbildung auf, so daß man die mit der beabsichtigten diagnostischen Verwendung des Stoffs vereinbare Teilchengröße erzielt. Mikroaggregate bildendes MSA mit einer Teilchengröße in der Regel zwischen 0,1 und 5 Wm wird hauptsächlich zur Darstellung von Leber und Milz verwendet. Makroaggregate bildendes MSA mit einer Teilchengröße von über 5 Aim, vorzugsweise weniger als 100 yum und am besten zwischen 15 und 50· um, ist ein ausgezeichnetes Mittel zur Sichtbarmachung der Lunge. Diese Stoffe sammeln sich selektiv in

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den Organen, die diagnostiziert werden sollen, an,und zwar sammeln sie sich im wesentlichen nur in den Teilen der Organe an, die eine ausreichende Blutzufuhr haben, was eine wirksame Sichtbarmachung von Flächen mit guter und ungehinderter Blutzufuhr ermöglicht. Diese Proteinstoffe lösen sich gegebenenfalls und verhindern somit nicht, daß das Blut die Stellen erreicht, in denen sie längere Zeit fixiert werden.

Eine Aufgabe der Erfindung ist somit die Schaffung einer Methode, durch welche Serumalbumin für eine Verwendung über einen weiten pH-Wert-Bereich stabilisiert werden kann. Eine weitere Aufgabe ist die Schaffung von radiologischen Mitteln, die für eine Verwendung in vivo äußerst geeignet sind und eine maximale Information liefern, wobei gleichzeitig der Körper nur minimalen Strahlungsdosen ausgesetzt wird. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung einer Zusammensetzung, die ein Reduktionsmittel zusammen mit stabilisiertem Serumalbumin enthält, und sich zur Komplexbildung oder Markierung mit Radionukliden für eine radioaktive Abtastung eignet. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung von mit einem Radionuklid markierten Serumalbuminverbindungen oder -komplexen, die bei niedrigen pH-Werten löslich bleiben und in vorteilhafter Weise über längere Zeiträume für eine radioaktive Abtastung verwendbar sind. Weitere Aufgaben der Erfindung umfassen die Schaffung von Ausrüstungen zur Durchführung der vollständigen Testprozedur für radiologische Tests, z.B. zur radiologischen Untersuchung des Blutvolumens, Plasmavolumens, zum Studium von Verdauungsvorgängen und Umsätzen, zur Analyse von Lungenembolie, bronchogenen Karzinomen, Lungenentzündung,

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Lungenemphysemen, chronischer Lungentuberkulose, Lungengefäßobliteration, Neoplasmen, Lungenischämie oder Lungeninfarkt, des Lungenkreislaufs oder anderer Unregelmäßigkeiten, zur Lokalisierung eines Gehirntumors, für die Zisternographie, Studien des Blutflusses, der Dynamik der Herzkranzgefäße, einschließlich der Herzleistung, des Herzblutvolumens, der Zirkulationszeiten, des Proteinumsatzes, zur Lokalisierung der Plazenta, zur Darstellung von Hirn und Herz, Leber, Milz und Knochenmark sowie zur Lokalisierung von Gewächsen oder Abszessen oder für andere Zwecke.

Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung ergeben sich für den Fachmann anhand der folgenden Beschreibung oder bei der Anwendung der Erfindung.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde gefunden, daß Serumalbumin unter Erzielung von während längerer Zeit über einen weiten pH-Wert-Bereich klaren Lösungen dadurch stabilisiert werden kann, daß man die in normalem Serumalbumin enthaltenen Fette und Fettsäuren abtrennt.

Eine Form von normalem menschlichem Serumalbumin, z.B. USP, wird als 25#ige Lösung von menschlichem Albumin in einem mit Natriumcarbonat oder einem anderen Pufferungsmittel gepufferten wäßrigen Verdünnungsmittel geliefert. In typischer Weise kann das Produkt mit geringen Mengen, z.B. etwa 0,02 Mol Natriumcarpylat und kleinen Mengen, z.B. 0,02 Mol Acetyltryptophan stabilisiert sein. Bei normalem menschlichem Serumalbumin sind nicht weniger als

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96 % seines Gesamtproteins Albumin. Normales Serumalbumin enthält jedoch größere Mengen Fettstoffe, d.h. Fette und Fettsäuren. Erfahrungsgemäß enthält handelsübliches Serumalbumin in der Regel wesentlich mehr als 3 Mol Fettstoffe pro Mol Albumin, bezogen auf ein Molekulargewicht von Albumin von 69 000.

Gemäß der Erfindung wird die in Serumalbumin enthaltene Lipoidmenge auf weniger als 3 Mol Lipoid pro Mol Albumin reduziert, vorzugsweise auf weniger als 2 Mol Lipoid pro Mol Albumin und am besten auf weniger als etwa 0,1 Mol Lipoid pro Mol Protein. Die Lipoidkonzentration in dem Albumin soll so weit reduziert werden, daß das Mischungsprodukt aus dem Albumin, dem Reduktionsmittel und dem Radionuklid für mindestens eine Stunde nicht trübe wird, vorzugsweise vier Stunden und am besten acht Stunden bei einem pH-Wert von etwa 3 oder weniger ungetrübt bleibt.

Eine Vielzahl von Methoden kann zur Abtrennung der Lipoide aus dem Serumalbumin Anwendung finden. Die am meisten bevorzugte Methode besteht in der Behandlung von Albuminlösungen mit Holzkohle bei niedrigen ph-Werten, z.B. nach der in "Removal of Fatty Acids from Serum Albumin by Charcoal Treatment", J. Biol. Chem. 212:173 (1967) von R.F. Chen beschriebene!Methode, auf die hiermit Bezug genommen wird. Nach dieser Methode wird die handelsübliche MSA-Lösung auf einen pH-Wert unter 7, vorzugsweise von 0 bis 5 und am besten von 1 bis 2,5 (ein pH-Wert von etwa 1,5 ist annehmbar), angesäuert und die angesäuerte Lösung wird mit Holzkohle behandelt. Der pH-Wert voll zur Abtrennung der Fettsäure, jedoch nicht zur Hydrolyse des Proteins ausreichend niedrig sein. Die Holzkohle wird

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vorzugsweise in einer Menge von 0,1 g pro Gramm Albumin bis zu 10 g Holzkohle pro Gramm Albumin zugesetzt. Ein bevorzugter Zugabebereich beträgt etwa 0,2 g Holzkohle pro Gramm Albumin bis etwa 1,5 g pro Gramm Albumin. Am besten erzielt man die Abtrennung der Fettstoffe bei niedrigen Temperaturen, um die Möglichkeit einer ungünstigen chemischen Reaktion des Proteins in einem sauren Medium zu vermeiden oder auf einem Minimum zu halten. Die Temperatur soll in der Regel -2 bis +30⁰C und vorzugsweise zwischen etwa 0 und 10 C betragen. Die Lösung kann mit der Holzkohle während etwa weniger Minuten bis zu drei oder vier Stunden, je nach dem pH-Wert, der Temperatur und der Albuminkonzentration, kontaktiert werden. In der Regel genügt eine etwa einstündiger Kontakt. Bevorzugt wird das Gemisch während der Kontaktperiode gerührt oder es wird auf andere geeignete Weise ein maximaler Kontakt zwischen dem Protein und der Holzkohle aufrechterhalten. Die Albuminkonzentration in der mit der Holzkohle in Kontakt befindlichen Lösung kann in der Regel zwischen etwa 1 und 25, vorzugsweise zwischen etwa 3 und 10 und am besten zwischen etwa 4 und 6 Gew.% betragen. Eine Vielzahl handelsüblicher Holzkohlensorten sind bei diesem Verfahren verwendbar. Geeignete Materialien sind z.B. von der Atlas Chemical Industries verkaufte Darco M, Norit-Holzkohlen, z.B. von der Caswell-Massey Co. verkaufte Norit A-Kohle und von der West Virginia Pulp and Paper Co. verkaufte Nuchar aktivierte Kohle. Andere geeignete Kohlesorten sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Nach Kontaktierung während der vorstehend besprochenen Zeitdauer werden die Kohle und die daran adsorbierten Fettstoffe von der restlichen Albuminlösung abgetrennt. Dies kann durch

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Zentrifugieren, Filtrieren, Sedimentation oder andere dem Fachmann bekannte Methodei erfolgen. Die bevorzugte Abtrennungsmethode ist die Filtration, insbesondere eins Submikron-Filtration, und zwar in erster Linie deshalb, weil sie eine Albuminlösung ergibt, die nicht nur kohlefrei, sondern auch steril ist und deshalb direkt für die Testverfahren verwendet werden kann. Einige andere Stoffe, z.B. Konservierungsmittel, und eine kleine Menge Albumin können von den Kohleteilchen ebenfalls ab- oder adsorbiert werden; in dem vorstehend beschriebenen Entfettungsverfahren gehen jedoch nur überraschend geringe Mengen an Albumin verloren.

Eine andere Methode zur Entfettung der zu verwendenden Albuminlösung ist die Säureausfällungsmethode, wie sie z.B. von William et al, J. Am. Chem. Soc. 80:1789 (1958) und Foster et al, J. Biol. Chem. 240:2494-2502 (1965) beschrieben wird, worauf hier Bezug.genommen wird. Dabei können konzentrierte Albuminlösungen auf einen pH-Wert von beispielsweise 2,9 angesäuert und zwei bis drei Tage auf diesem pH-Wert gehalten werden, während welcher Zeit die anwesenden Lipoide eine getrennte Phase bilden, die dann z.B. durch Zentrifugieren abgetrennt werden kann. Oder konzentrierte Albuminlösungen können auf niedrigere pH-Werte, z.B. auf einen pH-Wert von 1,0 bis 2,0 angesäuert werden, während welcher Zeit die Abtrennung der Lipoidphase rascher erfolgt, was eine etwas schnellere Abtrennung dieser Lipoidphase von der Albuminlösung gestattet.

Andere Methoden zur Entfettung des Albumins können ebenfalls angewendet werden, einschließlich eines Kontakts mit absorbierenden oder adsorbierenden Säulen; verwiesen wird z.B. auf Schneider et al, Biochim. Biophys. Acta

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221:376 (1970); Lösungsmittelextraktion, siehe z.B. Goodman, Science 125:1296 (1957); biologische Extraktion, siehe z.B. Schneider etal, Biophys. J. 16:417-31 (1976); sowie andere dem Fachmann bekannte Methoden. Obwohl derzeit nicht ganz klar, ist es doch möglich, daß das Ansäuern Änderungen der Molekülstruktur des Albumins hervorruft, welche bei den biologischen Extraktionsmethoden vermieden werden.

Nach Abtrennung der verunreinigenden Lipoide wird das entfettete Albumin vorzugsweise mit einem Reduktionsmittel kombiniert und bildet dann ein Material, das sich leicht mit einem Radionuklik markieren läßt. Bevorzugte Reduktionsmittel sind Quellen für Ferroionen, z.B. Ferroascorbat, sowie Quellen für Stannoionen, z.B. Stannochlorid, wobei die Stannoionen am meisten bevorzugt werden. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, nimmt man doch an, daß, wenn das Radionuklid, das Reduktionsmittel und das Protein gemeinsam in der Lösung zugegen sind, eine Reaktion eintritt, bei welcher das Radionuklik reduziert wird und eine Art der Verbindung mit dem Protein eingeht, die wahrscheinlich ein Radionuklid-Reduktionsmittel-Proteinkomplex, vorzugsweise ein Technetium-Zinn-Albuminkomplex ist. Bei der bevorzugten Ausführungsform werden das Albumin und das Reduktionsmittel in Lösung vorgemischt, die Lösung wird gefriergetrocknet und als Teil der Ausrüstung verwendet. Zum Zeitpunkt der Verwendung wird die Reduktionsmittel-Albuminkombination mit einer Quelle für ein Radionuklid, z.B. Pertechnetationen, wieder hergestellt und das markierte Albumin wird gebildet. Es ist nicht genau bekannt, was sich zwischen dem entfetteten Albumin und dem Reduktionsmittel in Abwesenheit von Technetium während der

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Mischung vor der Lyophilisierung derselben abspielt. Möglicherweise wird das Reduktionsmittel von den ziemlich großen Albuminmolekülen (Molekulargewicht 69 000) sorbiert und während der Lyophilisierung bis zur Kombination mit dem Technetiumion in Lösung in diesem Zustand gehalten.

Die Technetiumquelle sollte wasserlöslich sein, wobei bevorzugte Quellen die Alkali- und Erdalkalimetallpertechnetate sind. Das Technetium wird vorzugsweise in Form von frischem Natriumpertechnetat aus einem sterilen Generator für ^yyTc^m (der von der Firma New England Nuclear Corporation (NEN) gebaut wird) erhalten.

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Jede andere Quelle für pharmakologisch annehmbares Tc

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kann verwendet werden und eine Reihe von Tc Generatoren stehen zur Verfügung.

Die größte verwendbare Menge Reduktionsmittel ist diejenige, bei der noch gerade keine Ausfällung des Reduktionsmittels erfolgt, und die erforderliche Mindestmenge ist diejenige, die zum Binden einer ausreichenden Menge

Tc^m an das Protein zur Erzielung einer größeren Aufnähme durch Plasma, Gewebe oder Organ erforderlich ist. Diese Mengen lassen sich leicht durch Routineversuche für bestimmte Technetium-Reduktionsmittel-Albumingemische bestimmen. Sehr kleine Reduktionsmittelmengen sind für diesen Zweck wirksam; da solche Mittel jedoch leicht oxidiert werden, verlieren Zusammensetzungen mit den extrem kleinen Mengen leicht ihre Wirkung nach einer bestimmten Zeit oder während ihrer Verwendung. Die Mindestmenge Reduktionsmittel soll daher so berechnet werden, daß sie ausreicht, um mindestens 0,1 jag Reduktionsmittel pro ecm des zu injizierenden Diagnostikums zu ergeben. Mit

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zunehmender Reduktionsmittelmenge scheint für jede Kombination aus jeweiligem Reduktionsmittel und Albumin ein Punkt zu existieren, jenseits dessen die Bindung an das Protein nicht mehr zunimmt und sogar bei weiterer Zugabe von Reduktionsmittel abnehmen kann. Ein gewisser Grad an Bindung scheint für selbst sehr hohe Reduktionsmittelmengen erzielt zu werden. Vorteilhaft kann manchmal die natürliche Pulverisierung des Reduktionsmittels durch Oxidation während der Handhabung oder Lagerung sein, indem man Zusammensetzungen herstellt, die mehr als die optimale Reduktionsmittelmenge enthalten, die dann zu der optimalen Menge durch diesen Pulverisierungseffekt vor ihrer Verwendung verringert wird. In der Regel befindet sich das Albumin in großem Überschuß über das Reduktionsmittel. Vorzugsweise soll das Reduktionsmittel in einer Menge von etwa 0,0005 bis 100 % und noch besser in einer Menge von 0,005 bis 1 % des Albumins zugegen sein.

Für eine leichte Feststellung im Körper soll ausreichend Radionuklid, vorzugsweise Technetium-99m, zugegen sein. Die erforderliche Menge scheint im wesentlichen vollständig von dem gewünschten Grad der Radioaktivität abzuhängen, da in Anwesenheit der richtigen Mengen und Verhältnisse von Reduktionsmittel und Albumin der überwiegende Anteil des Technetiums, z.B. 90 bis 95 % oder mehr, an das Albumin gebunden wird.

In dem derzeit bevorzugten System wird eine sterile, kein Fieber erzeugende, lyophilisierte Mischung aus etwa 0,1 mg Stannochlorid-Dihydrat als Reduktionsmittel und etwa 25 mg entfettetem menschlichem Serumalbumin in ein steriles Fläschchen gegeben und die Mischung wird kurz vor ihrer Verwendung vorzugsweise mit 3 bis 7 ecm des Ausstosses eines ^Tc Generators gemischt.

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Die erfindungsgemäßen diagnostischen Zusammensetzungen können auch noch weitere pharmakologisch annehmbare Bestandteile enthalten, die ihre diagnostischen Funktionen nicht

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stören. Zum Beispiel enthält das aus Standard- ⁵Tc Generatoren erhaltene Eluat Natriumsalze, oder es können Salzlösungen zur Verdünnung der Bestandteile auf die richtige Konzentration vor der Lyophilisierung oder zur Verdünnung der radioaktiven diagnostischen Zusammensetzungen auf die für eine Verabreichung richtige Konzentration verwendet werden. Auch können nicht-störende Säuren und Basen, z.B. Salzsäure oder Natriumhydroxyd, zur Einstellung des pH-Werts auf den gewünschten Wert, z.B. vor der Lyophilisierung des Albumin-Stannomaterials verwendet werden. Vorzugsweise enthält das lyophilisierte, aus Reduktionsmittel und Albumin bestehende Gemisch noch kleine Mengen nicht-ionischer oberflächenaktiver Mittel, vorzugsweise die normalerweise festen, nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, z.B. Äthylenoxid /Propylenoxid/ Propylenglycolkondensate, die unter der Handelsmarke Pluronic verkauft werden, insbesondere als Pluronic P68, von der BASF Wyandotte; diese Mittel erleichtern die Wiederherstellung der lyophilisierten Mischung. Aseptische Methoden und sterile, nicht-fiebererzeugende Bestandteile und Behälter sollen jederzeit verwendet werden, was für den Fachmann eine Selbstverständlichkeit ist. Um eine Oxidation der Stannoionen außerhalb der Komplexbildung zu vermeiden, müssen Oxidationsmittel sorgfältig von den Ausgangsmaterialien ferngehalten werden. Aus diesem Grund sollen keine größere Oxidationsmittelmengen enthaltende Quellen für Technetium-99m verwendet werden. Sauerstoff soll auch dadurch ausgeschlossen werden, daß man die verschiedenen zur Herstellung und Lagerung der Bestandteile oder Zwischenprodukte verwendeten Behälter mit einem inerten

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Gas, z.B. Stickstoff, lang genug ausspült. Ein solches inertes Gasspülsystem muß jedoch nicht unbedingt verwendet werden, obwohl es stark bevorzug wird.

Nach dem Mischen kann die das Reduktionsmittel und das entfettete Albumin enthaltende Lösung gegebenenfalls nach üblichen Methoden sterilisiert werden, indem man sie z.B. durch ein biologisches Filter mit einer Porengröße von etwa 0,22 Mikron, vorzugsweise unter einer Stickstoffatmosphäre, schickt. Danach werden Anteile der sterilen Lösungen unter einer StickstoffatmoSphäre in einzelne sterile und nicht-pyrogene Vorratsglasampullen gegossen. Vorzugsweise werden sie dann nach üblichen Gefriertrocknungsmethoden unter aseptischen Bedingungen zur Abtrennung von Wasser lyophilisiert. Dies ergibt einen festen Stanno-Albuminkomplex oder eine Art Mischung, die sich zum Verschicken und Lagern eignet und stabiler ist als der in Lösung befindliche Komplex. Die Ampullen können versiegelt und gelagert werden, bis an der Verwendungsstelle
gebildet wird.

wendungssteile das frische Tc^m-Stanno-Albuminmittel

Obwohl bevorzugt das Stannochlorid und das entfettete Albumin vor dem Mischen mit Technetium miteinander gemischt werden, kann die Reihenfolge der Mischung auch Technetium plus entfettetem Albumin, gefolgt von der Zumischung von Stannochlorid, sein.

Gemäß der Erfindung kann das entfettete Albumin auch vorteilhaft in denaturiertes Albumin (Albuminaggregate) enthaltenden diagnostischen Mitteln einschließlich solchen verwendet werden, die MIA und MAA enthalten. Die Mikro-

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aggregate oder Makroaggregate können aus dem entfetteten Albumin z.B. durch Wärmebehandlung bei 55 bis 100⁰C bei einem pH-Wert zwischen 4 bis 10 erhalten werden, wie dies dem Fachmann geläufig ist. Bei der Herstellung von MAA kann auf eine solche Behandlung eine weitere Wärmebehandlung bei etwa der gleichen Temperatur nach Einstellung des pH-Werts auf etwa den isoelektrischen Punkt von Albumin, z.B. einen pH-Wert von etwa 5 bis 5,5_f erfolgen. Vorzugsweise wird das MAA durch eine einzige Wärmebe-

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handlung bei etwa 55 bis 75 C während zehn Minuten bis zu zwei Stunden oder mehr hergestellt, bis die gewünschte Teilchengröße und Festigkeit zur Erzielung des richtigen biologischen Spielsraums bei der Verwendung erreicht ist. Es wurde gefunden, daß die Verwendung von entfettetem MSA tatsächlich die Ausbeute an erzeugtem MAA wesentlich verbessert, verglichen mit aus uribehandeltem MSA hergestelltem MAA.

Sowohl MIA als auch MAA können in vorteilhafter Weise 10 bis 75 % nicht-denaturiertes Albumin (sowie andere Stoffe) enthalten, was bekanntlich die Erzielung einer Matrix für eine wirksame Lyophilisierung und Wiederherstellung fördert. Gemäß der Erfindung kann das in solchen MIA-und MAA-Materialien verwendete nichtdenaturierte Albumin auch entfettetes Albumin sein.

Bei der Verwendung wird der Technetium-SQm-Stanno-entfettetes Albuminkomplex oder das Gemisch aseptisch in den Blutstrom injiziert. Die bevorzugten Dosen liegen zwischen etwa 1 und 400 uCi/kg Körpergewicht, je nach der Art der durchzuführenden Tests und der Natur des Subjekts, an welchem der Test durchgeführt werden soll. Zum Beispiel

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können für eine statische "Bloodpool"-Darstellung in normalen Erwachsenen (Körpergewicht etwa 70 kg) 3 bis 5 mCi mit Technetium markiertes Albumin intravenös verabreicht werden und die Darstellung kann dann kurz danach begonnen werden. Für die Herzgefäßdarstellung mit einem Radionuklid, torgesteuerte Herzuntersuchungen und die Herz-Ventrikulographie kann die Dosis in der Regel 10 bis 20 mCi betragen, die in einem kleinen Bolus (1 bis 2 ecm) intravenös verabreicht werden. Für eine Plazentalokalisierung beträgt die empfohlene intravenöse Dosis etwa 1 mCi. Für Bestimmungen des Blutvolumens kann eine intravenöse Dosis von etwa 0,2 bis 1 mCi ausreichend sein. Pediatrische Dosen sind in der Regel geringer als die Dosen für Erwachsene und zweckmäßig sollen sie in der Regel nicht 100 bis 200 mCi/kg Körpergewicht für pediatrische Subjekte übersteigen. Solche erhöhten Sicherheitsvorkehrungen brauchen jedoch bei Tieruntersuchungen, z.B. bei Untersuchungen mit Ratten, Mäusen, Hunden usw., nicht ausschlaggebend zu sein. Die vorstehend angegebenen Dosierungen sind Beispiele und höhere oder geringere Mengen können unter bestimmten Umständen verwendet werden, obwohl der Patient bei größeren Dosen einer stärkeren Strahlung ausgesetzt wird.

Im allgemeinen kann die Untersuchung oder der Test unmittelbar nach Verabreichung entweder mit Folgeanzeigevorrichtungen, z.B. Scintillationskameras, oder mit verschiedenartigen Sonden begonnen werden. Für Herzuntersuchungen und dergleichen mag eine Überwachung der Herzstrahlung im wesentlichen unmittelbar nach Einführung des Bolus in den Patienten zweckmäßig sein. Andererseits

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kann für einige Untersuchungen, die einen Blut- oder anderen Ausgleich erfordern, eine Wartezeit zweckmäßig sein, was für den Fachmann auf der Hand liegt.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die im Folgenden beschriebenen Ausführungsformen näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.

Beispiel 1 Entfettung von Albumin Kohlemethode

60 ecm einer handelsüblichen 25%igen Lösung von normalem menschlichem Serumalbumin (Cutter) werden in einem sauberen, nicht-pyrogenen Becher auf 0 bis 10⁰C abgekühlt. Der Becher wird zur Aufrechterhaltung der Temperatur in Eis gepackt. Die MSA-Lösung wird dann durch Zugabe von 319 ecm 0,1 normaler HCL, die ebenfalls auf 0 bis 10⁰C gekühlt ist, auf einen pH-Wert von etwa 2,2 bis 2,5 angesäuert. Diese Zugabe soll unter Rühren erfolgen. Man gibt dann 15,2 g Nuchar-C-190-N-Kohle in den Becher und rührt eine Stunde bei 0 bis 10⁰C. Die mit Lipoid beladene Kohle wird durch ein sauberes, nicht-pyrogenes Filter in einen sauberen, nicht-pyrogenen Behälter aseptisch abfiltriert. Vorzugsweise soll das erhaltene Produkt dann weiter durch Filtration durch mindestens ein sterilisierendes Filter oder eine Membran, z.B. ein Millipore 0,22 um-Filter, weiter sterilisiert werden. Dieses Verfahren ergibt etwa 400 ecm sterile, nicht-pyrogene, entfettete MSA-Lösung.

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Beispiel 2 Entfettung von MSA-Ansäuerungsmethode

10 ecm einer 25 gew.^igen Lösung von normalem menschlichem Serumalbumin (Cutter) werden mit 87 ecm 0,1 normaler HCl auf einen End-pH-Wert von etwa 1,5 angesäuert. Innerhalb etwa 10 Minuten nach der Säurezugabe wird die gesamte Lösung durch ein steriles Filter in zwei sterile 50 ccm-Ampullen durch ein 0,22 /um Millipore-Filter filtriert und die Ampullen werden etwa 16 Stunden bei 0 bis 10⁰C gelagert. Diese Lösungen sind dann ganz trübe geworden mit abgesetzten weißen Teilchen. Deshalb sollen sie zur Abtrennung der ausgefällten Säure durch sterile 0,22 um -Filter erneut filtriert werden. Dabei kann die Verwendung mehrerer Filter erforderlich werden, da die kleinporigen Filter leicht verstopft werden, manchmal bereits nach 8 bis 10 ecm dieser Lösung. Das Filtrat soll nach der zweiten Filtration klar sein und ein auf diese Weise erhaltenes Filtrat blieb mehrere Wochen klar, bis es verbraucht war. Die erhaltene Lösung enthält etwa 24,5 mg Gesamtprotein pro ecm und etwa 1,7 Mol Fettsäure pro Mol MSA.

Beispiel 3 Herstellung von gefriergetrockneten Ausrüstungen (Kits)

1 g Stannochlorid-Dihydrat wird in 1 ecm konzentrierter Salzsäure gelöst. Man verdünnt mit 10 ecm sauerstofffreier Salzlösung. 1 ecm der erhaltenen Lösung wird abgetrennt und mit sauerstofffreier Salzlösung auf 10 ecm verdünnt. In einem getrennten Kolben werden 2 g oberflächenaktives Mittel (Pluronic F68) in 100 ecm sauerstofffreier Salzlösung gelöst.

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Durch eine Analyse des nach der Kohlemethode oder der Ansäuerungsmethode erhaltenen entfetteten MSA wird bestimmt, welches Volumen des entfetteten MSA 25 g Albumin enthält. Die gesamten 10 ecm der zweiten Verdünnung von Stannochlorid werden dann dem Volumen an entfettetem MSA zugesetzt, das 25 g Albumin enthält. Auch wird die gesamte Pluronic F68-Lösung dem Gemisch aus Stannochlorid und entfettetem MSA zugesetzt. Diese Lösung soll unter einem inerten Gas, z.B. Stickstoff, gehalten werden. Das Volumen dieser Mischung wird mit sauerstofffreier Salzlösung auf 1 Liter gebracht und die Mischung wird dann durch eine sterile 0,22 nm-Membran filtriert. Dann werden Proben von 1 ecm in Ampullen gegeben und nach üblichen Methoden gefriergetrocknet. Die Ampullen werden nach der Gefriertrocknung unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten.

Beispiel 4 Herstellung von markiertem Albumin-"Bloodpool"-Mittel

Die gemäß Beispiel 3 hergestellten lyophilisierten Ampullen enthalten alle etwa 25 mg normales menschliches Serumalbumin, 0,1 mg Stannochlorid-Dihydrat und 2 mg Pluronic F68, alles in lyophilisierter Form. Durch antiseptisches Einspritzen von 2 bis 7 ecm des sterilen Eluats aus einem NEN Tc^m-Generator, d.h. einer Lösung von Natriumpertechnetat Tc-99m in isotonischer Salzlösung ohne einen Bakteriostat wird das lyophilisierte Material wieder in den Ausgangszustand zurückgeführt und ergibt das Technetium-99m-Zinn-Albumin. Das Einspritzen soll hinter einem Strahlungsschild erfolgen, da das Eluat aus dem "⁹Tc^m-Generator sowie der

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Technetium-gSto-Zinn-Albuminkomplex oder die Mischung
readioaktiv sind. Die Ampulle wird zur vollständigen
Lösung des lyophilisierten Feststoffs geschwenkt. Wenn
das gesamte Material in Lösung gegangen ist, ist es
gebrauchsfertig.

Die Zusammensetzungen wurden so getestet, daß man auf
die vorstehende Weise hergestelltes lyophilisiertes

QQ πι

Albumin-Zinn mit 5 ecm eines Eluats aus einem NEN Tc Generator wieder herstellte. 0,25 ecm dieser Lösung
wurden in die Schwanzvene erwachsener, 200 bis 300 g
wiegender Ratten injiziert. Die Injektionen wurden etwa eine Stunde nach der Wiederherstellung vorgenommen. Die Ratten wurden etwa 45 Minuten nach der Injektion getötet und ihr Blut gesammelt. Unter der Annahme, daß die normale Blutmenge 5 % des Körpergewichts der Ratte ausmacht (siehe Sharpe et al, Proc. Soc. Exp. Biol. 74:681) (195O)), betrug der Blutaufnahmewert für ein diagnostisches Mittel, das aus nach der Holzkohlemethode entfettetem Albumin gemäß Beispiel 1 hergestellt worden war, 36,5 plus oder minus 3,5 % (Mittel von 30 Tieren, 10 Ampullen). Der in Ratten mit der aus nach der Säureausfällungsmethode von Beispiel 2 entfettetem Albumin hergestellten Zusammensetzung gemessene Blutwert war vergleichbar und betrug 36,7 plus oder minus 3 % (1 Ampulle, 3 Tiere).

Beispiel 5

Verwendung von entfettetem MSA für die Herstellung von
Stanno-MAA-Albumin

463 ecm Wasser mit geringem Sauerstoffgehalt versetzte man unter Mischen mit 44 ecm einer wäßrigen Lösung von ent-

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fettetem MSA (38 mg/ccm, pH 2,5), 0,17 g Stannochlorid, gelöst in 1,25 ecm 12 normaler Salzsäure, 7,9 g Natriumacetat und 1,33 ecm einer wäßrigen Lösung von Polysorbate 80 U.S.P. (50 mg/ccm). Nach vollständiger Auflösung des Natriumacetats wurde die Lösung auf 63 bis 65°C erhitzt und unter Mischen 30 Minuten innerhalb dieses Temperaturbereichs gehalten. Die so gebildeten Aggregate aus Stannoverbindung und denaturiertem Albumin ließ man sich absetzen. Zweimalige Abtrennung der überstehenden Flüssigkeit und erneute Suspendierung in Wasser mit geringem Sauerstoffgehalt ergab eine 92%ige Ausbeute an Makroaggregaten (mittlere Teilchengröße 30 bis 35 wm) relativ zu dem vor der Aggregatbildung in der Lösung enthaltenen Albumin. (Die Ausbeute von ungereinigtem normalem menschlichem Serumalbumin beträgt in typischer Weise 55 bis 70 %).

Ein aus diesen Aggregaten hergestelltes, mit Tc markiertes Präparat ergab eine Aktivitätsverteilung in Rattenlungen von etwa 89 % der injizierten Dosis 15 Minuten nach der Injektion, wobei diese Aktivität auf etwa 2 % nach 24 Stunden absank. Diese Ergebnisse sind für ein zur Darstellung der Lungenperfusion bestimmtes Mittel äußerst günstig.

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Claims

Patentansprüche

1. Mit einem Radionuklid für radioaktive Tests markierbares Material, bestehend aus dem Mischungsprodukt eines Reduktionsmittels mit Serumalbumin, aus welchem die Fettstoffe abgetrennt wurden.

2. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettstoffmenge weniger als etwa 2 Mol pro Mol Albumin beträgt.

3. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäuremenge weniger als etwa 0,1 Mol pro Mol Albumin beträgt.

4. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Reduktionsmittel Stannoionen in Mengen von etwa 0,0005 bis 10 Gew.$> des Albumins verwendet werden.

Dr.Ha/Ma

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5. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Albumin in Form von Makroaggregaten vorliegt.

6. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Albumin in Form von Mikroaggregaten vorliegt.

7. Verfahren zur Herstellung eines zur Komplexbildung mit einem Radionuklid für eine radioaktive Abtastung geeigneten Materials nach einem der vorhergehenden Ansprüche., dadurch gekennzeichnet, daß man aus Serumalbumin Fettstoffe unter Erzeugung von entfettetem Albumin abtrennt und das entfettete Albumin mit einer Quelle für Stannoionen bei einem pH-Wert unterhalb 7 mischt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettstoffe aus dem normalen menschlichen Serumalbumin durch Kontaktierung desselben mit Kohle und Abtrennung der Kohle und der daran sorbierten Fettsäuren aus dem entfetteten Albumin abgetrennt werden,,

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Aggregate aus entfettetem Albumin mit einer Teilchengröße von etwa 0,1 bis 100 um bildet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchengröße der Aggregate etwa 15 bis 50 um beträgt.

11. Diagnostikum für radiologische Tests, bestehend aus dem Mischungsprodukt einer Quelle für Radionuklidionen, einem Reduktionsmittel und einem entfetteten Albumin, wobei das entfettete Albumin soweit gereinigt ist, daß eine wäßrige Lösung dieses Mittels frühestens nach 4 Stunden bei einem pH-Wert von 4 oder darunter trübe wird.

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12. Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Radionuklid Technetium ist.

13. Mittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel eine Stannoverbindung ist.

14. Mittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Stannoionen in einer Menge von 0,0005 bis 0,5 %, bezogen auf das Gewicht des entfetteten Albumins, zugegen sind.

15. Mittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das entfettete Albumin denaturiertes, entfettetes Albumin mit einer Teilchengröße von etwa 0,1 bis 100 um ist.

16. Mittel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das denaturierte, entfettete Albumin in Form von Makroaggregaten mit einer Teilchengröße von etwa 15 bis 50 ju vorliegt.

17. Verfahren zur Herstellung eines radioaktiven Diagnostikums für die radiologische Abtastung, dadurch gekennzeichnet, daß man normales menschliches Serumalbumin entfettet und das entfettete Albumin mit einem Radionuklid und einem Reduktionsmittel mischt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Radionuklid Technetium-99m ist.

19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel eine Stannoverbindung ist.

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20. Ausrüstung zur Bildung einer radioaktiven diagnostischen Zusammensetzung, bestehend aus einem Reduktionsmittel und entfettetem Serumalbumin, verpackt in einem versiegelten, sterilen, kein Fieber erzeugenden Behälter.

21. Ausrüstung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktonsmittel und das entfettete Serumalbumin als gefriergetrocknete Feststoffe vorliegen.

22. Ausrüstung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet} daß das Reduktionsmittel eine Stannoverbindung ist.

23. Verfahren zur Konzentrierung von Technetium-99m in vivo in einem Zielgewebe eines Säugetiers, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Säugetier intravenös eine radioaktive Zusammensetzung, bestehend aus einem Gemisch von Technetium-99m, einem Reduktionsmittel und entfettetem Serumalbumin verabreicht.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung so viel Technetium-99m enthält, das eine Radioaktivität in einer Menge von etwa 1 bis 400 uci pro Kilogramm Körpergewicht ergibt.

25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel eine Stannoverbindung ist.

26. Verfahren zur Herstellung eines radioaktiven diagnostischen Mittels, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reduktionsmittel mit entfettetem Serumalbumin mischt und diese Mischung mit Technetium-99m kombiniert.

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27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung vor Kombination mit Technetium-99m lyophilisiert wird.

28. Verfahren nach Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, daß das Albumin in Form von Mikroaggregaten vorliegt.

29. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Albumin in Form von Makroaggregaten vorliegt.

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