DE2235681A1

DE2235681A1 - Macroaggregate aus albumin, technetium99m und zinn(ii)-ionen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als radioindikatoren bei der untersuchung von organen

Info

Publication number: DE2235681A1
Application number: DE2235681A
Authority: DE
Inventors: Janet Marie Bartlett; Gerald Anthony Bruno; Haney Bruno
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1971-07-20
Filing date: 1972-07-20
Publication date: 1973-02-08
Also published as: BE786566A; CH563776A5; IT1048987B; SE417896B; NL178130B; US3872226A; NL178130C; FR2146437B1; FR2146437A1; CA1011653A; NL7210027A

Description

U.Z,i K 027.-(Vo^lü/kä) ' '<>■■■
Case'164 456 - S / -

E.R. SQUIBB & SONS, INC.* , \
Princeton, New Jersey,_; V-.St:.A.

" Makroaggregate aus Albumin, Tecbnetiumr-99m_: und Zinn(ll)~ ionen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verv/ehdung' als Radioindikatoren bei der Untersuchung von Organen !'

Priorität: 20. Juli 1971> V.St.A.V Nr;. 164 456 ■ ;

; _N\ 2> Juni 1972, V.St.A._:> Nr. ■ \: . ■,;- V^ ^{: : :} -

Die Erfindung betrifft Makroaggregate aus Albumin, Technetium- : 99m und -ZinnCEI^iorien/Verfahreri zu ihrer Herstellung und ihre ' Verwendung als Radioindikatoren zur Untersuchung von Organen,

Die Verwendung von mit radioaktivein Jod' markiertem fiumanserum·- albumin zur Untersuchung verschiedener Körperbereiche ist bekannt. Außerdem ist seit einigen Jahren die Verwendung von ' Tc-99ni als Marker weit"verbreitet. Verschiedene Verfahren^ \ nach denen Albumin mit Hc-^m. anstelle von radioaktivem Jod markiert werden kann, wurden eingeführt oder vorgeschlagen. -r

Auf Grund seiner physikalischen und'chemischen Eigenschaften ist Tc-99m zur klinischen Radioaktivitätsmessung besonders wert-,

voll. Da Tc-99m kein primärer B-Strahler ist und eine kurze "■■... ' 209886/1162

Halbwertszeit von 6 Stunden hat, verursacht eö im Gewebe nur geringe Strahlungsdosen. Die dadurch gegebene Möglichkeit, hohe Aktivitäten zu verabfolgen, verkürzt die erforderliche Me 13-zeit und erlaubt es, ein Organ nach verschiedenen "Gesichtspunkten" zu untersuchen. Seine niedrige y-Strahlenenergie von 140 KeV ermöglicht es, mit,Hilfe eines fokusierenden Kollimators ein virtuelles Bild einer Oberflächenschicht von einigen cm Stärke zu erhalten. Dies ist teils auf verbesserte Auflösung und teils auf Verminderung des Strahlungsbeitrages aus tieferen Schichten durch Selbstabsorption zurückzuführen.

Technetium kann in verschiedenen Formen mit Proteinen komplexiert werden. Die Verwendung von Humanserumalbumin-Makroaggregaten, die komplexgebundenes Tc-99m enthalten, zur Lungenuntersuchung ist bekannt.

In dem Artikel "Aggregated Tc -Labelled Albumin for Lung Scintiscanning", Int. J. Appl. Rad. and Isotopes, Bd. 17 (1966), S. 485 bis 486, beschreiben Gwyther, M. M. and Field, E. 0. ein Verfahren zum Markieren und Aggregieren von Albumin unter Verwendung von erhöhten Mengen an Eisen(III)-chlorid und Ascorbinsäure.

Ein weiteres Verfahren wird von DePaoli, T., Hager, A., und Nicolini, J. 0. in dem Artikel "Albumin Macroaggregates Labelled with Tc"^m", Int. J. Appl. Rad. and Isotopes, Bd. 17 (1966), S. 551 bis 554, angegeben.

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ORlQiNAL INSPECTED

■-. 3 -

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Bei diesem Verfahren wird Tc-99m°4 mit Salzsäure und Ammoniumthiocyanat reduziert. Bei Zugabe der Lösung von reduziertem Technetium zum Humanserumalbumin erhält man einen Proteinniederschlag, der mehr als 95 Prozent des Tc-99m enthalt.

Eine detaillierte Beschreibung von Makroaggregaten findet sich in dem von Bowen, B. M. und -Wood,, D. E* verfaßten Artikel "Preparation of Technetium-99m Human Serum Albumin Macroaggregates", Am. J. of Hospital Pharra., Bd.¹ 26 (1969),' S. 529 bis 534.

Nach den dort gegebenen Ausführungen muß ein brauchbares Makroaggregat folgende Eigenschaften aufv/eisen: -

1. Es ist steril und pyrogenfrei. „ ■

2. Weniger als 5 Prozent der Gesamträdioaktivität ist nicht organisch gebunden. , . -

3. V/eniger als 10 Prozent der Teilchen haben einen Maximaldurchmesser von weniger als 5 u,und keines der. Teilchen ist größer als-100 u. Die mittlere Teilchengröße muß zwischen 10 und 50 u liegen. . . . . .

4. Die spezifische Aktivität.muß so hoch sein, daß die erforder- ^liche Radioaktivitätsdosis in weniger als 1,5 mg Albumin enthalten ist. < . - ■■'■_' -

Alle genannten Verfahren haben den großen-Nachteil, daß zu ihrer Durchführuhg ein besonders geschultes Personal und Spezialeinrichtungen zur Markierung nötig sind. Es wurde versucht, diese Verfahren zu vereinfachen,,.aber noch; immer'sind bei allen be-" kannten Verfahren zahlreiche Misch- und Erwärmungsvorgänge nö-r

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Aufgabe der Erfindung ist es daher, mit Technetium markierte Proteinmakroaggregate zur Verfügung zu stellen, die den vorgenannten Anforderungen genügen und sich einfach herstellen lassen. Die Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung sind dementsprechend Makroaggregate, bestehend aus Technetium-99m, Albumin oder Globulin und Zinn(II)-ionen. -

Der Ausdruck "Makroaggregat" bedeutet eine Teilchengröße von etwa 10 bis 100 u, vorzugsweise etwa 30 bis 50 μ.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Technetium enthaltenden Makroaggregate, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine angesäuerte Albumin- oder Globulinlösung mit einem Zinn(II)-salz, wie Zinn(Il)-chlorid, -jodid oder -bromid, versetzt, den p^-Wert der Reaktionslösung zur Ausfällung der Makroaggregate auf den isoelektrischen Punkt des verwendeten Proteins einstellt und mit einer wäßrigen Lösung von Tc-99ifl versetzt. Vorzugsweise trennt man die Makroaggregate nach ihrer Ausfällung ab, suspendiert sie wieder in einer bestimmten Konzentration in einer zur Injektion geeigneten Lösung, die gegebenenfalls getrocknet werden kann, und versetzt zur Herstellung von radioaktiv markierten Makroaggregaten mit einer wäßrigen Lösung von Tc-99m.

Vorzugsweise wird zur Herstellung der Makroaggregate der Erfindung denaturiertes Humanserumalbumin verwendet.

Unter dem Ausdruck "denaturiertes Albumin" ist Albumin im ersten Denaturierungszustand zu verstehen. Es kann nach bekannten Ver-

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■- - ·■ ' .-.;" ^Γ - Y- ^: - ■'■■ -2215681

fahren hergestellt werden. Ein Verfahren besteht darin, Normalserumalbumin (NSA) zu erhitzen und alkalisch zu machen. Zur Untersuchung des Menschen¹ verwendet man mit Humanserumalbumin hergestellte Makroaggregate,-während bei Tests an Kühen, Hunden oder Ratten die entsprechenden tierischen Albumine verwendet werden. Je nach seiner Menge wird das WSA 15 bis 60 Minuten auf Temperaturen von etwa 55 bis 95⁰G,.vorzugsweise 75 bis 85°C erwärmt. Bei größeren Albuminmengen muß man länger erhitzen ' als bei kleinen Mengen. UnterVerwendung von anorganischen Säuren, wie Schwefelsäure, Salzsäure oder. Salpetersäure, organischen Basen, wie Natriumacetatlösung oder Aeetatpuffer, anorganischen Basen, wie Alkalimetallhydroxide* zyB.'Natriumhydroxid, oder Alkalimetallhydrpgencarbonaten, z.B. NatriuDihydrogen-. carbonat, wird der Pu-Wert des Albumins auf 4,5 bis 6_t vorzugsweise auf 5»3 eingestellt. Dabei wird denaturiertes Albumin ausgefällt. Albumin kann auch durch Einstellen des pu-Wertes auf etwa 8 und anschließendes Umstellen auf den pjj^fert 4,5 . bis 6 mit einer Säure oder^ durch Einstellen des pw^Wertes auf etwa 2 und anschließendes Umstellen auf den-.'pg-Wert 4,5 bis 6

denaturiert vier den.-. "'
mit einer Base/ Die Änderung des ρττ-Wertes ist im allgemeinen \ ■ mit einer Erwärmung verbunden, die die Denaturierung verursacht. .-■ ■ _ ^: . ■ ". .; ■■.,"■·■- -. λ·.' ·■-."■'" ■ . ■ ■; ;^:; ■"■ ""'·..: ;^;k/;

Eine andere Möglichkeit besteht darin, eine Emulsion von Albumin in einem Öl, wie Baumwollsamenöl, zu erhitzen und die gebildeten Makroaggregate, die' als Mikrokugelchen bezeichEiet werden, abzutrennen,nach Größe zu ordnen und zu trocknen.Eine,genaue Vorschrift zur.Herstellung dieser Mikrökugelchen findet^;Ä" sich in; Radiologie Clinics, of North America^ Bd. ¹8 (1969) *'■- '^"^

2 0 3 8 8 6 IA 162. :

-D-

S. 233 und International Journal of Applied Radiation and Isotopes, Bd. 21 (1970), S. 155.

Vorzugsweise verwendet man zur Herstellung der Makroaggregate der Erfindung handelsübliches Humanserumalbumin, das Konservierungsmittel und Antischaummittel enthält. Dieses Material wird in Wasser gelöst und mit einer starken anorganischen Säure, wie Schwefelsäure oder SaIζsäure,auf einen p_H-Wert von etwa 1,00 bis 3,0, vorzugsweise etwa 1,50 bis 2,00 gebracht. Anschließend wird das Reaktionsgeraisch mit einer Lösung eines Zinn(ll)-halogenids in einer Säu::"e, wie Salzsäure, versetzt. Der p_H~Wert dieser Lösung beträgt etwa 1,0 bis 2,0, vorzugsweise etwa 1,1 bis 1,3. Das Verhältnis von Zinn(II)-ionen zu Albumin beträgt etwa 1 : 2 bis 1 : 20. Die besten Ergebnisse erzielt man bei einem Verhältnis von Zinn(II)-ionen zu Albumin von etwa 1:5.

Anschließend wird die Lösung auf den isoelektrischen Punkt von denaturiertem Albumin eingestellt. Der isoelektrische Punkt liegt im Bereich von 4,8 bis 5,8, gewöhnlich bei 5,3. Bei der Einstellung des p_H-Wertes auf den isoelektrischen Punkt entsteht ein teilchenförmiges Material, das als Makroaggregate bezeichnet wird. Zur Verfestigung dieser Makroaggregate wird die Lösung 10 bis 45 Minuten, vorzugsweise 10 bis 20 Minuten auf eine Temperatur von etwa 75 bis 85, vorzugsweise 78 bis 81⁰C erwärmt.

Die so gebildeten Makroaggregate werden anschließend mit destilliertem Y/asser, Kochsalzlösung oder der Lösung eines Reduktionsmittels, wie eines Sulfonsäuresalzes, gewaschen. Anschließend

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werden die Teilchen wieder in einer zur Injektion geeigneten Flüssigkeit, wie Wasser, Kochsalzlösung oder einer Lösung, die ein Reduktionsmittel,"wie Dextrose oder ein Sulfonsäuresalz, enthält, suspendiert. Die Makroaggregate können auch gegebenenfalls getrocknet werden, da dadurch offensichtlich die Stabilität der Zinn(ll)-ionen erhöht wird< Zur Trocknung können bekannte Verfahren verwendet werden. Ein bevorzugt verwendetes Trocknungsverfahren ist die Lyophilisation.

Anstelle von Albumin können zur Herstellung der Makroaggregate der.Erfindung auch andere Proteine, z.B. Globulin, verwendet werden. Geeignet sind beispielsweise α-, ß- oder y-Globuline. Ein besonders bevorzugtes Globulin ist Fibrinogen.

Die so hergestellten Teilchen sind steril und pyrogenfrei. Sie eignen sich deshalb zur Injektion.

Die in Ampullen abgefüllten Makroaggregate werden mit der erforderlichen Menge Tc-99m versetzt, (vgl. US-PS 3 369 121).

Die Dosen werden so gewählt, daß bei einer einzigen inravenösen Injektion pro 70 kg Körpergewicht etwa 1 bis 5, vorzugsweise etwa J5 Millicurie Te-99^ verabreicht werden.

Die gewünschte Technetium-99m-Menge wird in Kochsalzlösung zugegeben. Dabei wird die Technetium-99m-Menge zweckmäßigerweise auf Grund der gewünschten Radioaktivität festgelegt. Eine chemische Bestimmung der Technetiummenge ist unzweckmäßig, da sie je nach der. Aktivität des Generators und des Elutionszustandes variiert. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Lösung der Makroaggregate zu Technetium-99m zu geben. Als Zinn(II)-salz wird im allgemeinen ein Salz einer anorganischen Säure, vorzugsweise einer Halogenwas'serstoff säure verwendet. Bevorzugte

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Salze sind Zinndichlorid, -bromid und -jodid. Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß die Makroaggregate der Erfindung nach Injektion in bestimmten Organen, wie Lunge, Leber, Milz und Knochenmark, angereichert werden.

Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der Makroaggregate der Erfindung als Radioindikatoren zur Untersuchung von Organen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von Albumin-Makroap;Krep;aten.

Reagentien

Humanserumalbumin (HSA) 25 Prozent Benzylalkohol
Propylenglykol
Antischaummittel AF
zur Injektion geeignetes Wasser 0,1n HCl (zur p_H-Einstellung auf 1,75) SnCl₂.2H₂O

0,5m Acetatpuffer (zur p_H«Einstellung

auf 5,1)

Menge

0,4 ml (100mg HSA) 0,9 ml

2.0 ml

etwa 2 Tropfen 75 ml

1.1 ml 100 mg 20 ml.

Humanserumaibumin, Benzylalkohol, Propylenglykol, Antischaummittel und Wasser werden vermischt. Das Gemisch wird mit 0,1n Salzsäure auf den p_H~Wert 1,75 eingestellt, mit Zinndichlorid versetzt und vermischt. Unter Rühren wird der 0,5m Acetatpuffer zugesetzt, wobei sich Makroaggregate bilden. Anschließend wird das Gemisch unter ständigem Rühren 40 Minuten in einem Wasserbad von 80⁰C (_+ 15°C) erwärmt. Sodann wird das Gemisch zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zur weiteren Reinigung v/erden die Makroaggregate mit zu Injektionszwecken

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— y —

geeignetem Wasser vermischt, das Gemisch wird wieder zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die aus denaturiertem Humanserumalbumin bestehenden Makroaggregate werden in 100 ml für Injektionszwecke geeignetem Wasser suspendiert und auf 5⁰C gekühlt,

Beispiele 2 und 3

Angaben zur Herstellung von zwei¹ Präparaten von Albumin-Makroaggregaten .

Jedes Präparat wird auf die radiochemische Bindung und die Menge der injizierten Dosis, die in Lunge und Leber von Ratten zu finden ist, untersucht. Von den Präparaten werden jeweils genau 0,25 ml in die äußere Jugularvene von Ratten injiziert. Jedes Präparat wird an drei. Ratten verabfolgt. 15 Minuten nach ,der Verabfolgung werden die Ratten getötet, und der Anteil der injizierten Dosis in Lunge und Leber wird bestimmt. Zur Bestimmung der radiochemischen Bindung wird die Radioaktivität eines jeden Präparates ausgezählt. Anschließend werden die Präparate zentrifugiert, und die jeweiligen Überstände werden einer Radio-

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Beispiel	ml	Beispiel	3	ml
2	ml
2	ml	1	ml
1	Λ*	-	, 6*
2	,1*	1	,63*
95,	99
2,	O

aktivitätsmessung unterzogen. Der Anteil an radiochemischer Bindung wird folgendermaßen bestimmt:

Gesamtimpulse - Impulse Überstand _ΛηΓ>

% Bindung = * ^K * 100.

Gesamtimpulse

Tabelle I

Suspension von HSA-Makroaggregat (Beispiel 1)

Dikaliumphthalat-Puffer

Tc-99m (aus dem Generator) % der injizierten Dosis in der Rattenlunge % der injizierten Dosis in der Rattenleber

* Durchschnitt von drei Ratten.

Aus diesen Beispielen geht hervor, daß Zinnionen und Tc-99m enthaltende Makroaggregate leicht herzustellen sind und als Radio-Indikatoren zur Lungenuntersuchung geeignet sind.

Beispiel 4 Herstellung von Makroaggregaten

Reagentien Menge

Humanserumalbumin (HSA) 25 Prozent 0,4 ml

(100 mg HSA)

zur Injektion verwendbares Wasser 50 ml

0,1n HCl (zur Einstellung auf den p_H-Wert 2)

2,5 Prozent SnCl₂.2H₂O in jO,1 η HCl 1 ml

1m Acetatpuffer (zur Einstellung des p_H-Wertes auf 5,1 bis 5,2).

Humanseruraalbumin , Wasser und 0,1n HCl werden 20 Minuten bei 79⁰C vermischt (etwa 325 Schwingungen/Min.). Die 2,5prozeritige Zinn(II)-chloridlb'sung wird zugesetzt und der p„-Wert mit etwa

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- li -

30 ml des 1m Acetatpuffers auf 5,1 bis 5,2 gebracht. Anschließend wird das Gemisch wieder 20 Minuten bei 79⁰C gemischt (etwa 325 Schwingungen/Min.)· Sodann wird das Gemisch zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zum Waschen werden die Makroaggregate mit zur Injektion geeignetem V/asser vermischt, das Gemisch wieder zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser Waschvorgang wird wiederholt, und die Makroaggregate werden anschließend in 100 ml zur Injektion geeignetem Wasser suspendiert und kühl gestellt.

Beispiel 5

Tabelle II gibt die gemäß Beispiel 2 und 3 erhaltenen Werte an:

Tabelle II

Suspension von HSA-Makroaggregat (Beispiel 2)

Tc-99m (aus dem Generator) zur Injektion geeignetes Wasser

Prozent der injizierten Dosis in der Rattenlunge

Prozent der injizierten Dosis in der Rattenleber

* Durchschnitt von drei Ratten.

Aus dieser Tabelle läßt sich die Bindungsfähigkeit von Zinnionen enthaltenden Makroaggregaten entnehmen.

Beispiele

0,75g Normalhumanserufflalbumin werden zu einem Gemisch aus 20 ml 0,5 η Salzsäure und 400 ml zur Injektion geeignetem Wasser gegeben, und das Gemisch wird unter.Rühren 30 Minuten auf 80 C erwärmt. Anschließend wird das Gemisch gekühlt und

1	ml
1	ml
8	ml
108	■*
o,	57*

2 0 9 8 8 6/1162

durch ein Sterilisationsfilter mit 7,0 ml einer Iprozentigen Zinn(ll)-lösung und sofort danach mit 100 ml 1 m Acetatpuffer (8,5 g wasserfreies Natriumacetat und 4,0 ml Eisessig mit zur Injektion geeignetem Wasser auf 100 ml aufgefüllt) versetzt. Das Gemisch wird unter Rühren 15 Minuten auf 8O⁰C erwärmt. Beim Unterbrechen des Rührens setzen sich die Aggregate ab. Die Aggregate werden in soviel zur Injektion geeignetem Wasser suspendiert, daß man die durch chemische Analyse bestimmte Konzentration von 0,75 mg/cm erhält. Bezogen auf das berechnete Endvoluraen wird die Menge des Normalhumanserumalbumins so eingestellt, daß man nach dem Zusatz des gewünschten Trägerstoffs eine 0,5prozentige Lösung erhält. Man füllt die Makroaggregate in Ampullen, vorzugsweise Siliconampullen. Der Inhalt dieser Ampullen wird lyophilisiert. Vor dem Verschließen werden die Ampullen mit Stickstoff gespült.

Bei der Verwendung wird eine Tc-99m-Lösung, die je nach ihrer Herkunft eine Radioaktivität von 0,5 bis 200 Millicurie/ml aufweist, zugesetzt. Im allgemeinen werden 1 bis 3 ml Tc-99ro-Lösung mit einer Radioaktivität von 1 bis 10 Millicurie/ml zugesetzt.

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Claims

- 13 Patentansprüche

1. Makroaggregate, bestehend aus Technetiura-99m, Albumin oder Globulin und Zinn(II)-ionen.

2. Makroaggregäte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß die Teilchen einen Durchmesser von etiva 5 bis lOOu aufweisen.

3. Makroaggregate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen die Form von Mikrokügelcheii haben.

r'4.) Verfahren zur Herstellung von Makroaggregaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine angesäuerte Albumin- oder Globulinlösung mit einem Zinn(Il)-salz versetzt, den pjr-Wert der Reaktionslösung zur Ausfällung der Makroaggregate auf den isoelektrischen Punkt des verwendeten.Proteins im allgemeinen auf 4,5 bis 6, einstellt und mit einer wäßrigen Lösung von Tc-99m versetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den p„-Wert mit einer anorganischen Base einstellt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Makroaggregate vor der Zugabe der wäßrigen Te-99m-Lösung trocknet.

7. Verwendung der Makroaggregäte nach Anspruch 1 als Radio-Indikatoren zur Untersuchung von Organen.

8. Radioindikatoren zur Untersuchung von Organen, bestehend aus zumindest einem Makroaggregat nach Anspruch I und üblichon Trägerstoffen.

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