DE3114641A1 - Immunosuppresives mittel in einer dosierungseinheit und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents
Immunosuppresives mittel in einer dosierungseinheit und verfahren zu seiner herstellungInfo
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Description
31H641
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die isoelektrische Fokussierung unter Verwendung einer
Säule durchgeführt wird.
3. Mittel nach Anspruch 1f dadurch gekennzeichnet, daß
die isoelektrische Fokussierung unter Einsatz eines körnigen Gels durchgeführt wird.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß das Serum oder die Ascites von einem an einer Krebskrankheit leidenden Patienten gesammelt
worden sind.
5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß das Serum oder die Ascites aus einem Warmblüter gesammelt worden sind, in welche Krebszellen
oder Krebsgewebe transplantiert worden sind.
6. Verfahren zur Herstellung eines Glykoproteins mit einer immunosuppressiven Aktivität, dadurch gekennzeichnet,
daß das Serum oder die Ascites von Menschen oder Warmblütern einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen
werden und die Fraktion bei einem isoelektrischen Punkt zwischen 2,6 und 3,6 gesammelt wird.
130066/0703
31U641
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Glykoproteins mit einer immunosuppressiven
Aktivität aus dem Serum oder den Asciten von Menschen oder Warmblütern sowie das auf diese Weise erhaltene Glykoprotein.
Das charakteristische Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt in der Gewinnung eines Glykoproteins mit einer immunosuppressiven
Aktivität durch isoelektrische Fokussierung von Seren oder Ascites von Menschen oder Warmblütern und
Sammeln der Fraktion bei einem isoelektrischen Punkt zwischen 2,6 und 3,6.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 Das Infrarotabsorptionsspektrum des Glykoproteins, das erfindungsgemäß erhalten worden ist,
Fig. 2 das UV-Absorptionsspektrum des Glykoproteins.
Bisher wurde bei der Diagnose von Krebsen sowie bei der Bestimmung des Ausmaßes des Fortschreitens von Krebskrankheiten
auf dem klinischen Gebiet der Cancerologie das fötale Protein, das in dem Serum eines krebskranken Patienten
auftritt, beispielsweise (X-Fetoprotein und carcinoembryonisches
Antigen (CEA), die Empfindlichkeit des Patienten gegenüber Tuberkulin (PPD) und 2,4-Dinitrochlorbenzol
und das Ausmaß der Blastogenese von Lymphocyten in dem peripheralen Blut des Patienten infolge von
Phytohemagglutinin bestimmt.
Diese Bestimmungen sowie die Testreaktion werden auf der Grundlage einer Beziehung zwischen der Verminderung der
Immunität des krebskrankon Patienten und dem Fortschreiten der Krebskrankheit des Patienten durchgeführt. In den ver-
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-A-
gangenen Jahren erschienen Arbeiten, welche das Vorliegen von Substanzen mit einer immunosuppressiven Aktivität
von Menschen und Warmblütern in den Seren von Menschen und Warmblütern beschrieb. Beispielsweise beschrieben
Cooperband et al. immunoreguläres Ct-Globulin als vorstehend erwähnte Substanz (vgl. "Transplantation Proceedings",
Band 8, Nr. 2 (1976) S. 225 bis 242), während Ishida et al. ein saures Protein als vorstehend erwähnte
Substanz ansahen (XXXV Jährliches Treffen der Japanese Cancer Association, 1976).
Diese Substanzen mit einer immunosuppressiven Aktivität unterdrücken die Zellimmunität und die humorale Immunität
von Menschen und Warmblütern und unterdrücken auf diese Weise eine Transpl antatabstoßung. Daher eignet sich eine
derartige Substanz zur Verhinderung und zur Behandlung einer Abstoßung im Falle von Transplantationen.
Gemäß Ishida et al. wird das saure Protein mit einer immunosuppressiven Aktivität dadurch hergestellt, daß
Seren oder Ascites von Menschen oder Warmblütern einer Anionenaustauscherchromatographie unterzogen werden und
die Fraktion gesammelt wird, die bei einem pH zwischen 2,9 und 3,3 eluiert wird (vgl. die JP-OS 53-44611/1978,
die am 6. November 1980 unter der Nr. 55-43479/1980 veröffentlicht
worden ist). Das von Ishida et al. erwähnte saure Protein wird fraktionell durch Adsorption und
Eluierung der Seren oder Ascites gesammelt. Die Methode ist jedoch mit dem Nachteil behaftet, daß eine relativ
kleine Menge des sauren Proteins mit einer relativ geringen Aktivität bezüglich der Unterdrückung der Immunität
infolge der in der Praxis schwierig durchzuführenden Stufen erhalten wird.
Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein einfacheres Verfahren zur Gewinnung eines Glykoproteins
mit einer hohen Aktivität bezüglich einer Unterdrückung
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der Immunität aus Seren oder Ascites von Menschen oder
Warmblütern in großen Mengen zur Verfügung zu stellen.
Durch die Erfindung wird ein Glykoprotein mit einer hohen immunosuppressiven Aktivität in Menschen oder Warmblütern
sowie ein Verfahren zur Herstellung des Glykoproteins aus Serum oder Ascites von Menschen oder Warmblütern in großen
Mengen geschaffen.
Die Erfindung wird nachfolgend näher erläutert:
Als Ausgangsmaterial zur Durchführung der Erfindung können
beispielsweise Seren oder Ascites von Krebspatienten oder Warmblütern verwendet werden, in welche Krebszellen oder
Krebsgewebe transplantiert worden sind.
Um die Seren oder Ascites einer isoelektrischen Fokussierung unterziehen zu können, werden beispielsweise in dem Falle,
daß die Ascites eines Krebspatienten verwendet werden, diese zentrifugiert oder filtriert, um die darin nicht
gelösten festen Materialien zu entfernen, worauf die gereinigten Ascites in einer Säule einer isoelektrischen
Fokussierung oder einer isoelektrischen Fokussierung mittels eines körnigen Gels bei einem pH zwischen 2,6 und
3,6 unterzogen werden.
Zur Durchführung der isoelektrischen Saulenfokussierung
wird ein amphoterer Träger mit einem pH von 2,5 bis 6,0, wie Ampholine ^ (hergestellt von der LKB Company, Schweden)
in Wasser aufgelöst, worauf die Lösung und eine wäßrige Lösung von Rohrzucker, Ethylenglykol oder Glycerin zur
Herstellung einer Lösung mit einem Dichtegradienten in einem Glasrohr verwendet wird. In einer derartigen Säule werden
die gereinigten Seren oder Ascites einer isoelektrischen Fokussierung bei einer konstanten Energie von 3 bis 20 W
unterzogen, worauf die Fraktion bei einem isoelektrischen Punkt von 2,6 bis 3,6 gesammelt wird.
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Im Falle einer isoelektrischen Fokussierung unter Einsatz eines körnigen Gels wird eine Platte unter Einsatz von
Ampholine und einer Gelsubstanz, wie Sephadex νάν G-75 (hergestellt
von der Pharmacia Company, Schweden) hergestellt, worauf gereinigte Seren oder Ascites nach einer
isoelektrischen Fokussierung·auf der Platte fraktioniert
werden.
Die amphotere Substanz sowie die Substanz zur Herstellung des Dichtegradienten, welche in der gesammelten Fraktion
verblieben sind, werden dadurch entfernt, daß die Fraktion einer Dialyse oder Ultrafiltration zur Reinigung
der Fraktion unterzogen wird.
Die auf diese Weise erhaltene Elektrophoresefraktion wird zur Gewinnung des Glykoproteins gefriergetrocknet.
Das erfindungsgemäß erhaltene Glykoprotein besitzt folgende physikalische Eigenschaften:
1. Aussehen:
Weißes Pulver
2. Löslichkeit:
Löslich in Wasser, einer wäßrigen physiologischen Salzlösung sowie einer
Phosphorsäure-Pufferlösung, unlöslich in Methanol, Ethanol, Propanol,
Butanol, Aceton, Chloroform, Ether und Ethylacetat.
3. Isoelektrischer Punkt:
pH 2,6 bis 3,6 (bestimmt durch isoelektrische Fokussierung in einer
flachen Platte).
4. Farbreaktion:
Positiv gegenüber der Lowry-Folin-Reaktion, dor Ehrlich-Reaktion, der
Buret-Reaktion, der Ninhydrinreaktion sowie der Molisch-Reaktion (Phenolschwefelsäurereaktion)
.
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■"■*- "■■■ ; *:- - - 31U641
— *7 _.
5. Infrarotabsorptionsspektrum: Vgl. Fig. 1, erhalten nach der
KBR-Methode, wobei die Konzentration 0,2 Gew.-% beträgt.
6. UV-Absorptionsspektrum: Vgl. Fig. 2, in reiner wäßriger
Lösung in einer Konzentration von 0,01 %.
Die Aktivität der erfindungsgemäßen Substanz zur Unterdrückung
der Immunität wird nachfolgend erläutert:
Eine Untersuchung der immunosuppressiven Aktivität der erfindungsgemäßen Substanz auf die Unterdrückung einer
Blastogenese von Lymphocyten in menschlichem perhipheralen
Blut und Mäusemilzzellen durch Phytohemagglutinin (PHA) hat ergeben, daß 1,0 mg der erfindungsgemäßen Substanz
in 1 ml einer Unterdrückung von 100 % im ersteren Falle und 90 % im letzteren Falle ergeben, und daß sogar
0,1 mg der erfindungsgemäßen Substanz in 1 ml eine Unterdrückung von 80 % im ersteren Falle und 55 % im letzteren
Falle bedingen.
Eine Untersuchung der verzögerten foot-pad-Reaktion gegenüber Schaferythrocyten in ICR-Mäusen hat ergeben, daß die
intraperitoneale Verabreichung von 100 Mikrogramm pro Tier die Reaktion um ungefähr 50 % unterdrückt im Vergleich
zu einem Vergleichstest, bei dessen Durchführung die erfindungsgemäße Substanz nicht verabreicht worden
ist.
Aus den vorstehend erwähnten Ergebnissen ist zu ersehen, daß die erfindungsgemäße Substanz eine hohe immunosuppressive
Aktivität besitzt.
Daher ist festzustellen, daß sich die erf indungsgemäße Substanz zur Verhinderung und zur Behandlung der immunologischen
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Abstoßung im Falle von chirurgischen Transplantationen eignet.
Um das erfindungsgemäß erhaltene Glykoprotein zur Verhinderung
und zur Behandlung der immunologischen Abstoßung im Falle einer Operation oder Transplantation einzusetzen,
wird dieses durch intraperitoneale Injektion ungefähr 24 h vor der Operation verabreicht, wobei die intraperitoneale
Verabreichung des Glykoproteins auch nach der Operation fortgesetzt wird. Die Dosis beträgt im allgemeinen
20 mg/kg/Tag einmal vor der Operation, wobei die gleiche Menge kontinuierlich 14 Tage nach der Operation verabreicht
wird.
Die akute Toxizität des Glykoproteins wird nach folgendem Test ermittelt:
Eine Reihe wäßriger Lösungen des Glykoproteins wird intraperitoneal
in 15 DKI-Mäuse injiziert, um ihre Mortalität 1 Woche nach der Injektion zu untersuchen. Sogar in.der
höchsten Konzentration, die 1000 mg/kg Körpergewicht entspricht, werden keine Todesfälle bei den behandelten Mäusen
festgestellt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Nachdem man 10 ml des Blutes, das aus einem Patienten mit
einem hepatischen Krebs entnommen worden ist, in der vorliegenden Form 30 bis 60 min stehengelassen hat, wird dieses
Blut mit ungefähr 1500 G 10 min zentrifugiert, wobei
5 ml einer übestehenden Flüssigkeit erhalten werden.
Getrennt werden 2 wäßrige Lösungen von Ampholine (siehe oben) mit einem pH von 2,5 bis 4,0 bzw. 4,0 bis
6,0 zu einer wäßrigen Lösung eines amphoteren Trägers mit einem pH von 2,6 bis 6,0 vermischt (nachfolgend
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■ :Λ-:":~:"Τ":~: . 31Η641
- 9 als Ampholine-Lösung bezeichnet).
Dann werden zwei Arten einer flüssigen Mischung, und zwar eine dichte Flüssigkeit (1) und eine leichte Flüssigkeit
(2) hergestellt, und zwar die Flüssigkeit (1) durch Vermischen von 11 ml der AmpHoline-Lösung mit 137 ml destilliertem
Wasser, das 108 g Rohrzucker enthält, und die Flüssigkeit (2) durch Vermischen von 3,6 ml der Ampholine-Lösung
mit einer Lösung, die hergestellt worden ist durch Auflösen von 5 ml der überstehenden Flüssigkeit der
Probe (des Blutes) in destilliertem Wasser unter Einstellung einer Lösung mit einem Volumen von 211 ml und weiteres
Auflösen von 10,8 g Rohrzucker in der Lösung. Diese zwei Arten einer flüssigen Mischung werden in ein Glasrohr
mit einem Fassungsvermögen von 440 ml (Glassäule für isoelektrische Fokussierung, Typ 8102, hergestellt von der
LKB Company, Schweden) nach einem Vermischen in einem geeichten "Gradientenmischer" eingefüllt. Die isoelektrische
Fokussierung wird bei einer Spannung von 550 V, einem Strom von 9,1 mA gestartet und bei einer konstanten Leistung
von 5 W während 23 h fortgesetzt und bei einer Spannung von 1500 V abgestoppt.
Nachdem die isoelekrische Fokussierung beendet ist wird die Fraktion mit einem pH zwischen 2,6 und 3,6 aus der Glassäule
gesammelt, gegen fließendes Wasser zur Entfernung von Ampholine und Rohrzucker, die noch in der Fraktion verblieben
sind, dialysiert und gefriergetrocknet, wobei das gereinigte Glykoprotein in einer Menge von 5,2 mg/10 ml
der Probe (des Blutes) erhalten wird.
Eine Untersuchung der Unterdrückung einer Blastogenese der Lymphocyten in menschlichem peripheralen Blut sowie
der Milzzellen von Mäusen infolge von PHA ergibt, daß das Ausmaß der Unterdrückung der Blastogenese der Lymphocyten
sowie der Milzzellen jeweils 100 bzw. 90 % in einer Konzentration von 1,0 mg des Glykoproteins/ml und 80 bzw.
55 % in einer Konzentration von 0,1 mg des Glykoproteins/ml
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"-- " ' -:. 31U641
beträgt.
Zur weiteren Untersuchung der Unterdrückung durch das Glykoprotein
wird dieses intraperitoneal in ICR-Mäuse in einer I-Ienge von 100 μg/Tier eingespritzt und die verzögerte Foot-Pad-Reaktion
infolge von Schaferythrocyten ermittelt. Das Ausmaß der Unterdrückung wird zu 49 % ermittelt.
25 ml Ascites, die aus einem menschlichen Patienten, der an Dickdarmkrebs litt, gesammelt,wurden, wurden in einer
KühlZentrifuge mit 10 000 G 30 min zur Gewinnung einer
überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert.
Die auf diese Weise erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde einer isoelektrischen Fokussierung in einer isoelektrischen
Fokussiervorrichtung des Plattentyps (hergestellt von der LKB Company, Schweden) unter Verwendung einer
Platte, hergestellt gemäß Beispiel 1 aus einer Lösung von Ampholine mit einem pH von 2,5 bis 6,0 und Sephadex G-75
bei einer konstanten Leistung von 8 W während 40 h, wohrtai
bei einer Spannung von 300 V und einem Strom von 26,7 mA gestartet wurde, unterzogen. Nachdem die Fokussierung eine
Spannung von 1200 Volt erreicht hat, wird die Fraktion mit einem pH von 2,6 bis 3,6 zusammen mit Sephadex G-75 gesammelt
und mit Wasser zum Auswaschen der Fraktion gewaschen. Die auf diese Weise erhaltene Flüssigkeit wird gegenüber
fließendem Wasser zur Entfernung von Ampholine dialysiert und das Dialysat zur Gewinnung von 24 mg Glykoprotein gefriergetrocknet
.
Eine Untersuchung der immunosuppressiven Aktivität des auf diese Weise erhaltenen Glykoproteins gemäß Beispiel 1 zeigt,
daß das Ausmaß der Unterdrückung einer Blastogenese der Lymphocyten in dem menschlichen peripheralen Blut infolge
PHA 100 % bei einer Konzentration von 1,0 mg des Glyko-
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proteins/ml beträgt.
Es wird eine Reihe von Tiervorsuchen zur Untersuchung der
verhindernden Wirkung des Glykoproteins/ das auf den Krebspatienten
gemäß Beispiel 1 zurückgeht, auf die immunologische Abstoßung im Falle einer chirurgischen Transplantation untersucht.
Mäuse des DKI-Stammes werden zur Durchführung des Experiments
eingesetzt. In 15 dieser Mäuse werden 20 mg/kg des Glykoproteins intraperitoneal vor der Transplantation eines
Hautstückes aus einer C3H/He-Maus injiziert. In andere 15 Mäuse werden 0,2 ml/kg einer wäßrigen physiologischen
Kochsalzlösung intraperitoneal zu Vergleichszwecken ebenfalls vor der Transplantation injiziert.
Nach der Transplantationsoperation wird das Glykoprotein intraperitoneal in einer Dosis von 20 mg/kg/Tag 14 Tage
lang in die Versuchsmäuse injiziert, während die physiologische Kochsalzlösung intraperitoneal in einer Dosis von
0,2 ml/kg/Tag während der gleichen Anzahl von Tagen in die Vergleichsgruppe eingespritzt wurde.
Es wurde keine Abschälung des transplantierten Hautstückes auf den Versuchsmäusen festgestellt, an die das Glykoprotein
während und sogar 2 Wochen nach Beendigung der Verabreichung verabreicht wurde. Andererseits schälte sich auf
allen Tieren der Vergleichsgruppe das transplantierte Hautstück 10 Tage nach der Transplantation ab.
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Claims (1)
1. Immunosuppressives Mittel in einer Dosierungseinheit, gekennzeichnet durch ein Glykoprotein mit einem isoelektrischen
Punkt von 2,6 bis 3,6, das dadurch erhalten worden ist, daß das Serum oder die Ascites von
Menschen oder Warmblütern einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen werden und dann die Fraktion beim
isoelektrischen Punkt zwischen 2,6 und 3,6 gesammelt wird.
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MÜNCHEN BS. SIEBERTSTR. 4 POBB60720 · KABRL: MUtÜOPAT · TEL- (0 0») 4740 O'j T t LtCOFMEH XtHOX 400 TELEX 5-242B5
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|---|---|---|---|
| JP4765580A JPS56145297A (en) | 1980-04-11 | 1980-04-11 | Preparative method of glycoprotein having immunosupressing activity |
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|---|---|---|---|---|
| JPS5344611A (en) * | 1976-10-01 | 1978-04-21 | Koyama Yasuo | Preparation of acidic protein having immune control activity |
| EP0000134A1 (de) * | 1977-06-15 | 1979-01-10 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Glykoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung zur Gewinnung von Antiserum sowie das Antiserum |
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| US4146603A (en) * | 1977-02-18 | 1979-03-27 | Research Corporation | Tumor specific glycoproteins and method for detecting tumorigenic cancers |
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-
1981
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- 1981-04-10 DE DE19813114641 patent/DE3114641A1/de not_active Withdrawn
- 1981-04-10 GB GB8111349A patent/GB2078229B/en not_active Expired
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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| JPS56145297A (en) | 1981-11-11 |
| JPS6346760B2 (de) | 1988-09-19 |
| GB2078229A (en) | 1982-01-06 |
| FR2480122A1 (fr) | 1981-10-16 |
| GB2078229B (en) | 1983-08-10 |
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