DE2631695A1

DE2631695A1 - Verfahren zur extraktion von mykotoxinen

Info

Publication number: DE2631695A1
Application number: DE19762631695
Authority: DE
Inventors: Marco Canella; Giancarlo Sodini
Original assignee: SnamProgetti SpA
Current assignee: Eni SpA
Priority date: 1975-07-15
Filing date: 1976-07-14
Publication date: 1977-01-20
Also published as: OA05388A; FR2317885A1; EG12335A; IN144585B; CH627925A5; ES450404A1; CS190543B2; DK167266B1; SU616995A3; CA1085674A; NL178289B; GB1539903A; PT65366A; KE3037A; US4436756A; BE844161A; NL7607878A; PT65366B; HK44380A; JPS593180B2

Description

betreffend:
"Verfahren zur Extraktion von Mykotoxinen"

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Extraktion von Mykotoxinen aus G-e'bäok, Mehl und Proteinkonzentraten pflanzlicher Herkunft.

Die Verunreinigung von Nahrungs- und Futtermitteln durch Mykotoxine kann solche Produkte für den Genuß gefährlich machen, denn die Stoffwechselprodukte der SUngi zeigen ein breites Spektrum von akuten und chronischen Vergiftungswirkungen, darunter cancerogene und teratogene Effekte.

Unter den verschiedenen, aus einigen pathogenen Mikroorganismen isolierten Toxinen haben die 1960 entdeckten Aflatoxine aufgrund ihrer hohen biologischen Aktivität eine besondere Bedeutung. Der toxische Paktor der Aflatoxine wurde aus Kulturen von Aspergillus flavus isoliert; dieser Mikropilz ist unter den für das Verderben von gewissen Körnerfrüchten, wie Erdnuß, Weizen, Mais, Sonnenblume, Raps usw. verantwortlichen Organismen der wichtigste.

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Die Klasse der Aflatoxine bestellt aus einer Vielzahl von Substanzen, die untereinander alle chemisch, ähnlich sind und in gewissen Fällen eine Anzahl von 10 bis 12 erreichen. Vier Verbindungen, die als Ailatoxine B., Bp, G- und G„ bezeichnet werden, sind stets anwesend. Die Metaboliten B. und G. sind Difuran-Cuinarin-Derivate, während Bp und Gp die entsprechenden Dihydroderivate sind. Aflatoxin B. ist die Verbindung, die die höchste Toxizität zeigt und stets den Hauptanteil des Gemisches (eti^a 45 %) darstellt.

Verfahren zum Entzug dieser Verbindungen aus den verdorbenen Produkten bzw. zu ihrer Inaktivierung wurden von verschiedenen Autoren entwickelt, jedoch verringerten all diese Methoden den Nährwert des Mehls.

Demgegenüber betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Entzug der Aflatoxine und sämtlicher Mykotoxine, die eine ähnliche Struktur aufweisen oder irgendwie löslich sind in dem Gemisch aus Lösungsmitteln, das unter für Proteine nicht schädlichen Bedingungen verwendet wird. Somit bewirkt das Verfahren eine intensive Entgiftung von Gebäck, Hehl und Proteinkonzentraten, die ursprünglich in verdorbenem Zustand und daher toxisch waren und ermöglicht ihre Verwendung als menschliche oder tierische Nahrungsmittel.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein organisches Lösungsmittel'mit mindestens einer polaren Gruppe verwendet. Ein solches Lösungsmittel muß mit einer wäßrigen Lösunggesättigt werden, die einen Elektrolyten von Säurenatur, d.h. eine organische oder anorganische Säure oder eines ihrer sauren Salze enthält. Der Elektrolyt erhöht die Löslichkeit der Mykotoxine in der wäßrig-alkoholischen Lösung und erleichtert som it ihre Entfernung.

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Das Extraktionsverfahren wird durchgeführt innerhalb eines Temperaturintervalls von 4°C gegenüber der Temperatur,

welcher die Denaturierung der Proteine "beginnt, wobei das Verhältnis von gelöster Substanz zu Lösungsmittel zwischen 1:2 und 1:5 liegt; man kann auch eine erschöpfende Percolation der Extrahierungslösung bei einem pH von 2,0 bis 6,0 anwenden.

Das Verfahren sei an der Extraktion der Aflatoxine B. und Bp aus einem aus der Ölindustrie stammenden Erdnußine hl näher erläutert. »Selbstverständlich kann jedoch das Verfahren ebensogut mit Vorteil für die Reinigung von anderen Iiehlsorten angewandt werden, die durch Aflatoxine.oder andere Mykotoxine ähnlicher Struktur verunreinigt sind und sich in dem erfindungsgemäß verwendeten Lösungsgemisch lösen, z.B. für solche aus der Klasse der Ocratoxine, die Stoffwechselprodukte von Aspergillus ochraceus und Penicillium viridicatum sind.

In den Beispielen wurden die folgenden Stoffe und Verfahrensweisen angewandt. Ausgangsstoffe: Die Proben von Aflatoxin B^, und B2 stammten von "Galbiochem". Der für die chromatographische Dünnschichtanalyse angewandte Silicagel'träger war ein MN-Silicagel, G-HR von Macherey, Nagel & Go.; als Eluens wurde eine Lösung von 90 Teilen Chloroform und 10 Teilen Aceton verwendet.

•Nor. Butylalkohol und Nor.Hexan stammten von Carlo Erba als RPE-Lösungsmittel (Erba Pure Reagent).

Die Chlorwasserstoffsäure stammte von Merck.

Methoden: Die Dosierung der Aflatoxine B^ und Bp wurde'' durchgeführt gemäß der AOAC-Methode 26.00? - 26.020, 11. Ausgabe (1970) (Association Official Analytical Chemists).

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Der Versuch zur raschen Erkennung der Aflatoxine IL und B₀ wurde durchgeführt gemäß der Methode von L.M. Seitz und H.E. Mohr in Cereal Chemistry, 51 (4), 487 (1974).

Die fluorimetrische Ablesung der für die Aflatoxine B, und B₂ maßgebenden 1'¹I eck en auf der Dünnschicht und die Bewertung der Proben wurde durchgeführt mit einer "Chromato-Vue" unter Verwendung von langwelligen OT-Strahlen (Ultraviolett Products, Inc., San Gabriel, California,USA).

Das Extraktionsmittel für die Mykotoxine war eine Lösung von nor.Butylalkohol mit einem Gehalt an Chlorwasserstoffsäure (0,5.10 normal), pH 2,50, die in einem Volumenverhältnis von 9:1 zugefügt wurde. Dieses Verhältnis, ist kein Grenzwert und kann variiert werden als lunlction des pH-Wertes, bis eine völlige Sättigung des Lösungsmittels durch die wäßrige Lösung, die den Elektrolyt enthält, erreicht ist.

Das aus einer industriellen Einrichtung zur Extraktion von Erdnußöl stammende Erdnußmehl ist pulverisiert mit einer Bühler-Mühle, Sorte 3? und wird dem Lösungsmittelgemisch in einem Verhältnis von 1:15 (Gew./Vol.) innerhalb 15 min bei Raumtemperatur und unter Rühren zugesetzt. Die Suspension wird über einen Büchner-Trichter filtriert (Filterpapier Whatman Fr. J). Die Extraktion wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch mehrere Male wiederholt.

Nach Beendigung der Extraktion wird das Mehl im Stickstoffstrom mindestens 3 h getrocknet, worauf zwecks schneller Erkenntnis der Aflatoxine JEL· und B^ ein Versuch nach der Methode von Seitz und Mohr durchgeführt wird. Die Dosierung der Aflatoxine wird dagegen nach der Methode AOAG 26.001 26.020 durchgeführt.

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Beispiel 1_

Extraktion der Aflatoxine B. und Bp aus einer entölten Probe von Erdnußmehl nach der Methode von Seitz und Mohr.

Anfäng-liche Zusammensetzung γόη Erdnußmehl zur öl extraktion:

Feuchtigkeit 8,4 % Bezogen auf Trockensubstanz:

Proteine 58,7 %

Lipoide weniger als 1 %

Kohfaser 5>1 %

100 g Mehl werden in einen Kolben während 15 min bei Saumtemperatur unter starkem Eiihren mit 1500 ml Lösungsmittelgemisch vermischt. Das Gemisch wird mit Hilfe einer I'ilterpumpe abfiltriert und die Extraktion am Rückstand mit 1%'ü ml frischem Lösungsmittel wiederholt. Diese Behandlung wird mehrfach wiederholt, bis man auf 7 Extraktionsvorgänge kommt. Der schließlich erhaltene liückstand wird dann im ^Stickstoffstrom ]) stunden lang getrocknet.

50 g des vom 'l'oxin befreiten Hehles werden dann nach der Seite-und Mohr-Methode auf Aflatoxine untersucht. Eine identische Menge unbehandeltes Erdnußmehl wird der oben beschriebenen Prozedur unterworfen.

Auf eine Dünnschichtplatte v/erden 25 Mikroliter einer Lösung des ursprünglichen Erdnußmehls, des' behandelten Mehls und von vier Aflatoxinproben, die 10, 20, 30 und 50 Teile Je Billion Aflatoxin B. und B^ enthalten, in einer Lösung von 98 Teilen Benzol und 2 Teilen Acetonitril aufgebracht. Die Herstellung dieser ötandardlösungen wurde durchgeführt durch genaues Auflösen der Aflatoxine B. und

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IL₃, Sorte A, in einer Lösung von Benzol/Acetonitril (98:2), so daß man eine Endkonzentration von etwa 1 Mikrogramm je Milliliter erhielt. Die tatsächliche Konzentration wurde dann bestimmt durch spektrophotcmebrische Methoden gemäß AÜAC 26.Ü1.

Die Platte wird 10 Minuten in Chloroform/Aceton (90:10) eluiert und dann unter UV-Licht mit hoher "Wellenlänge abgelesen.

Wie aus der Untersuchung der Platte hervorging, waren in den Aus gang sp rob en zwei charakteristische .Flecken sichtbar, die mit Si¹ eine blaue JPluoreszens ergaben, was den ütandardlösungen der Aflatoxine B und B.- entspricht. Die Flecken relativ zu der unbehandelten Probe hatten eine Intensität, die wesentlich höher war als diejenige der konzentriertesten btandardlösung, während die Elecken auf der Platte, die dem Extraktionsprozess mit dem Lösungsmittelgemisch unterxrorf en worden waren, eine ii'luoreszens-Intensität auxViesen, die vergleichbar war mit der niedrigsten Konzentration der Standardlösungen, d.h. etwa gleich 10 Teilen je Billion war.

Beispiel 2

Extraktion und Dosierung der Aflatoxine B. und B^ aus einer Probe von Erdnuß/ aus der Ölindustrie gemäß der Methode AOAC 26.001 - 26.020

mehl

100 g Erdnuß/ mit der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 werden in einem Kolben 15 Minuten bei Raumtemperatur unter kräftigem Rühren vermischt mit 1500 ml eines Lösungsgemisches. Die Piltrierung erfolgt über eine Ifilterpumpe und der Rückstand wird nochmals mit 1500 ml frischem Lösungsmittel extrahiert. Diese Behandlung wird mehrfach

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durchgeführt, bis man sieben Extraktionen erreicht hat "und der letzte Rückstand wird ο Stunden im Stickstoffstp?om getrocknet.

50 g des vom Toxin befreiten Hehles der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 werden nach der Methode AOAC 26.001 - 26.020 zur Dosierung von Aflatoxinen behandelt, wobei die letzteren, nachdem sie einmal extrahiert worden sind, in 0,5 ml einer Benzol/Acetonitril-Lösung (98:2) solubilisiert werden. Zum Vergleich wird eine gleiche

.Tnehl
Menge unbehandeltes Erdnuß/ dem oben beschriebenen AOAG-Test unterworfen.

Auf eine Platte, auf der eine 0,3 mm dicke Schicht von MN-Silicagel G-HR abgelagert worden war, wurden die folgenden Proben aufgebracht:

1. Mit Aflatoxinen verunreinip,'te Probe

Abgelagert werden: 5,5 und '/ Mikroliter der Lösung der verunreinigten Erdnußraehlprobe in Beiizol/Acetonitril (98:2) und 5 Hikroliter der BtandardlÖsung von Aflatoxin By,, zusammen mit 5 Mikroliter der verunreinigten Probe.

2. Standardlösungen

Es wurden 3,5 u^-d 7 Mikroliter einer Standardlösung von Aflatoxin B^, 1 Mikrogramm/Hilliliter aufgebracht.

3. Vom üoxin befreite Probe

Es wurden aufgebracht: 5? 10 imd 15 Mikroliter der Lösung

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der Probe des vom Toxin befreiten Erdnußmehls in Benzol/ Acetonitril (98:2) und 5 Mikroliter der Standardlösung von Aflatoxin B.,, zusammen mit 5 Mikroliter der nicht verunreinigten Probe.

Das für die Chromatographie verwendete Eiuens war zusammengesetzt aus Chloroform und Aceton im Verhältnis 90:10 auf die Dauer von 40 Minuten, entsprechend einem !Fortschreiten der Lösungsmittelfront durch 12 crn.

Aus der mit einer UV-Lampe mit langwelligem UV-Licht beobachteten Platte wurden die folgenden Werte erhalten:

1. Probe, verunreinigt durch Aflatoxine

Die entsprechend den 3 Mikroliter der auf das ^tacixe verdünnten ursprünglichen Probe auftretenden blauen ü'luoreszensflecken zeigten eine identisch Intensität und einen identischen Rf-Wert an, wie die 5 Mikroliter der Standardlösung von Aflatoxin IL.

Zur Berechnung der ursprünglich in dem Mehl enthaltenen Menge an Aflatoxin B^, ausgedrückt in Teilen Je Billion, wurde gemäß AOAC 26.020 die folgende Formel angewandt:

S. X. V

Mikrogramm je kg = ·>

X. ¥

worin:

S = Mikroliter B. - ßtandardlösung

Y = Konzentration der B.-Standardlösung

V = Mikroliter verdünnte Probe

X = Mikroliter abgelagerte Probe, die die gleiche lO-uoreszens-Intensität zeigte wie die B.-Standardlösung

W = Gramm Mehlprobe, verwendet für die Analyse

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- 9 Das Resultat ist:

Mikrogramm je kg = = W Teile je Billion

^•^1U (0,47 ppm)

5. Vom (Toxin "befreite Probe

Der den 15 Mikroliter der vom Toxin befreiten Probe entsprechende blaue !''luoreszensfleck hatte die gleiche Intensität und den gleichen Rf-Wert wie derjenige aus den 3 Iiikrolitern Aflatoxin B.-Standardlösung.

Zur Berechnung der 'feile je Billion an Aflatoxin B., das in dem vom Toxin befreiten Erdnußöl noch zurückgeblieben war, wurde die obige i'Ormel angex^andt:

Mikrogramm je kg =10 Teile je Billion oder

¹^- ^|U 0,01 ppm

Der erhaltene V/ert entspricht einem Rückstand an Aflatoxin B^ von 2,5 % des ursprünglichen Wertes.

Auf gleiche V/eise wurden mit den ütandardlösungen von Aflatoxin B_p die Rückstandsmengen von B_? in gereinigtem Mehl ermittelt; sie entsprachen ebenfalls 2,5 -'^:/* der ursprünglichen Menge.

PATENTANSPEUCHE:

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Claims

P A ¹J E M 1» A H a P R Ü CHE

Verfahren zur Extraktion von Mykotoxinen aus Pflanzenmehl, dadurch gekennzeichnet , daii man das betreffende Hehl oder die daraus erhaltenen Produkte mit einem organischen Lösungsmittel behandelt, das mindestens eine polare Gruppe aufweist" und mit einer wäßrigen Lösung eines Elektrolyts vermischt ist.

(2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet , daß man die Behandlung mit einem
Verhältnis von gelöstem Stoff zu Lösungsmittel im Bereich von 1:2 bis 1:50 durchführt.

(3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß in dem Lösungsmittelgemisch der pH-Wert der x^äßrigen Elektrolytlösung 2,0

bis 6,0 beträgt.

(4) Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch g e k e nn ζ e i ch η e t , daß man die Behandlung bei einer Temperatur durchführt, die nicht mehr als 4⁰G von der Denaturierungstemperatui· der Proteine
abweicht.

(5) Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dau man als organisches Lösungsmittel nor.Buty!alkohol verwendet.

(6)

Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,

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-t-

dadurch gekennzeichnet , daß man als Elektrolyt eine anorganische Säure, insbesondere Chlorwasserstoff säure , verx^endet.

(7) Anwendung des Verfahrens nach einein der vorangehenden Ansprüche zur Extraktion von Hykotoxinen aus Erdnußmehl, vorzugsweise aus einem Mehl, das "bei der technischen Extraktion von Erdnußöl anfällt.

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