DE69327100T2

DE69327100T2 - Gemisch mit hohem gehalt an cis beta-carotin

Info

Publication number: DE69327100T2
Application number: DE69327100T
Authority: DE
Inventors: Lance Elliott Schlipalius
Original assignee: Betatene Ltd
Current assignee: Betatene Ltd
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1993-06-04
Publication date: 2000-04-13
Anticipated expiration: 2013-06-05
Also published as: EP0643692A4; ATE186905T1; US5612485A; EP0643692B1; JP3547741B2; WO1993024454A1; EP0643692A1; JPH07506837A; DE69327100D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf eine Carotinoidzusammensetzung, die aus einer natürlichen Quelle stammt und eine hohe Konzentration an cis-β-Carotin aufweist, sowie auf ihre Herstellung aus natürlichen Quellen und vorzugsweise auf eine Zusammensetzung mit einem hohen Gehalt an 9-cis-β-Carotin und ihre Herstellung aus natürlichen Quellen.

Hintergrund der Erfindung

In dieser Beschreibung sollen die natürlichen Carotinquellen Früchte, Gemüse und andere Pflanzengewebe sowie tierisches Gewebe umfassen. Eine besonders wichtige kommerzielle Quelle für Carotin sind bestimmte Algentypen.
β-Carotin kommt in mehreren verschiedenen chemischen isomeren Formen vor. Einige davon sind geometrische Isomere, die eine unterschiedliche Orientierung um eine der Doppelbindungen in der konjugierten Doppelbindungsstruktur des Moleküls aufweisen.
Dies kann an mehreren Positionen entlang des konjugierten Gerüsts der Fall sein, so daß eine Vielzahl verschiedener geometrischer Isomere möglich ist. In manchen Fällen können sogar mehr als eine Doppelbindung vorhanden sein, an der ein Wechsel der Orientierung erfolgt.
Das häufigste geometrische Isomer ist das all-trans-Isomer mit der folgenden Struktur, wobei die Hauptkohlenstoffkette des Moleküls in einer trans- (gegenüber) oder geradlinigen Konfiguration vorliegt. all-trans-β-Carotin
Es gibt jedoch auch natürlich vorkommende cis-Formen des b-Carotins, die durch chemische Synthese hergestellt werden oder durch physikalische Vorgänge, wie Einwirkung von Wärme auf die all-trans-Isomere, entstehen können, wobei die Hauptkohlenstoffkette des Moleküls eine geknickte (cis-) oder Seitwärtskonfiguration einnimmt. Natürlich vorkommende cis- Formen von β-Carotin kommen, soweit man weiß, nicht über einen Gewichtsprozentgehalt von ungefähr 30% bis weniger als 50% des Gesamtcarotinoidgehalts hinaus vor.
Mit den verschiedenen geometrischen Isomeren sind unterschiedliche Eigenschaften und mögliche Funktionen verbunden, und deshalb sind relativ konzentrierte Formen der cis-Isomere potentiell von Nutzen.
In natürlichen Produkten, wie Früchten, Gemüse, Algen und anderem pflanzlichem und tierischem Material sind die Carotinoide als Bestandteil der Zellstruktur in kleinen Teilchen im Mikron- oder Submikronbereich in den Zellorganellen stabilisiert, oder auch durch Assoziation mit anderen Molekülen, die die durch die biochemischen Synthesewege des Organismus erzeugten isomeren Formen stabilisieren. Bei der Herstellung konzentrierter Formen dieser Stoffe aus den natürlichen Quellen für gewünschte kommerzielle Produkte kann das natürliche Stabilisationsvermögen der Zellstruktur bei der Extraktion und Konzentrierung der Carotinoide entfernt oder reduziert werden.
Wenn die Carotinoidprodukte konzentriert werden, um ihre β-Carotinkonzentration zu erhöhen und das andere Zellmaterial, das im Produkt nicht erwünscht ist, zu entfernen, haben bestimmte Isomere außerdem eine natürliche Tendenz, auszukristallisieren.
Die Kristallisation ist bei bestimmten Anwendungen ein Problem, da die kristalline Form wegen ihrer relativen Unlöslichkeit für eine effiziente Nutzung bei der Anwendung vielleicht nicht verfügbar ist. Die Kristallisation erfolgt insbesondere bei all-trans-β-Carotin, das daher zum Beispiel für die biologische Verwendung nicht leicht verfügbar ist.
Bei cis-Isomeren besteht andererseits eine viel geringere Wahrscheinlichkeit, daß sie kristallisieren, und folglich sind sie viel besser löslich als die trans-Isomere. Aus diesem Grund ist es für verschiedene Anwendungen häufig wünschenswerter, β-Carotin-haltige Zusammensetzungen mit höheren Konzentrationen an cis-Isomeren zu verwenden. Zum Beispiel ist das 9-cis-Isomer in Ölen viel leichter löslich als die all-trans- Form. Tatsächlich ist es sehr schwierig, das 9-cis-Isomer aus Ölen natürlicher Herkunft zur Kristallisation zu bringen, so daß es schwierig oder teuer ist, es in großem Maßstab zu reinigen.
Im Unterschied zu trans-Isomeren haben cis-Isomere mehrere Anwendungen einschließlich der Verwendung in wasserdispergierbaren Lebensmittelfarbstoffen und in Tablettierpulvern. Die cis-Isomere sind in wasserdispergierbarer Form auch als Emulsionen zum Färben sowie für Getränke geeignet. Sie können auch in Konzentraten in speziellen Vitaminzusätzen für die direkte Einnahme oder als Lebensmittelbestandteil verwendet werden.
In natürlich vorkommenden Produkten ist der Anteil an cis- Isomeren eher gering, aber einer der höchsten Anteile kommt in der halophilen Alge Dunaliella salina vor, bei der normaler weise 30% bis unter 50% des Gesamtcarotinoidgehalts auf die 9- cis-Form entfallen.
Die vorliegende Erfindung betrifft dementsprechend aus natürlichen Quellen stammende Zusammensetzungen mit einem hohen Gehalt an cis-β-Carotin.

Beschreibung der Erfindung

Entsprechend wird in einer Ausführungsform dieser Erfindung eine aus einer natürlichen Quelle stammende Carotinoidzusammensetzung hergestellt, wobei es sich bei wenigstens 50 Gew.-% des Carotinoidgehalts der Zusammensetzung um cis-β-Carotin und vorzugsweise 9-cis-β-Carotin handelt. Typischerweise bildet 9- cis-β-Carotin den überwiegenden Teil des β-Carotingehalts.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegt der bevorzugte Bereich für den Gehalt an cis-β-Carotin zwischen wenigstens 50% und 80% und besonders bevorzugt zwischen 60% und 70%. Ein weiterer bevorzugter Bereich ist 60% bis 85%.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die aus natürlichen Quellen stammende Zusammensetzung mit dem hohen cis-β-Carotingehalt (zum Beispiel durch Konzentration und Reinigung mit physikalischen Methoden) aus einem Produkt mit niedrigeren Konzentrationen des cis-β-Carotins gewonnen und auf eine Konzentration von wenigstens 70% cis-β-Carotin gebracht. Vorzugsweise kann dies durch die Entfernung des größten Teils des all-trans-β-Carotins durch physikalische Verfahren erreicht werden.
Diese Zusammensetzungen mit dem hohen Prozentsatz an cis- Isomer erwiesen sich als gut löslich und sind für physiologische Wirkungen leicht verfügbar. Der Grund dafür ist wahrscheinlich insbesondere in den folgenden Faktoren zu suchen:
(a) cis-Isomere kommen in menschlichen Körpergeweben in erheblichen Mengen vor, und da die Stoffwechselvorgänge in den Geweben erfolgen, ist es möglich, daß die cis-Isomere eine physiologische Funktion ausüben;
(b) cis-Isomere liegen im Blutstrom typischerweise in geringeren Mengen vor, und dort gibt es größere Mengen des all-trans-Isomers; dies läßt vermuten, daß die cis-Isomere möglicherweise schnell in die Gewebe aufgenommen werden; und
(c) cis-Isomere scheinen leicht vom Darm resorbiert werden zu können.
Zum Beispiel würde man für in hohem Prozentsatz vorliegende cis-Isomere eine verbesserte Wirkung bei medizinischen Anwendungen erwarten, zum Beispiel bei der Heilung und Prävention von Krebs, von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und anderer Krankheiten, da sich die cis-Isomere wegen ihrer Löslichkeit wahrscheinlich vorzugsweise in den Geweben anreichern, wobei sie über die trans-Form aus dem Blutstrom entfernt werden.
Die verbesserte Löslichkeit ist auch wahrscheinlich hilfreich bei der Anwendung des in hohem Prozentsatz vorliegenden cis- Isomers bei der topischen Applikation der Zusammensetzung und erleichtert die Zubereitung bei Anwendungen als Lebensmittelfarbstoff. Die cis-Isomere können zur Stabilität von Emulsionen oder Pulvern von β-Carotin für kommerzielle Zwecke beitragen, was zum Teil auf ihre Löslichkeitseigenschaften zurückzuführen ist.
Die Struktur des 9-cis-Isomers von β-Carotin ist wie folgt: 9-cis-β-Carotin
Dieses 9-cis-Isomer von β-Caxotin stammt vorzugsweise aus bestimmten natürlichen Quellen, und zwar Pflanzenprodukten einschließlich Grünem Pfeffer, Aprikosen, Blüten bestimmter Arten der Gattung Acacia, Cucurbitaceen sowie der Alge Dunaliella salina, die von diesen Quellen die höchste Konzentration an 9-cis-Isomer aufweist. Siehe hierzu Ami Ben-Amotz, Amnon Lers und Mordhay Aron: "Stereoisomers of Beta-Carotene and Phytoene in the Alga Dunalielle bardawil", Plant Physiol. (1988) 86, 1286-1291 (Dunalielle bardawil wurde später von Ami Ben-Amotz als natürlich vorkommende Dunalielle salina anerkannt).
Für den Anteil des Gesamtgehalts an cis-Isomeren (vorwiegend des 9-cis-Isomers) im Gesamtcarotinoidgehalt der Alge Dunaliella salina findet man normalerweise bei der Bestimmung durch HPLC (high pressure liquid chromatography; siehe das unten beschriebene Verfahren) und spektrophotometrischen Techniken im Sichtbaren etwa 30 Gew.-% bis unter 50 Gew.-% des Gesamtcarotinoidgehalts.
Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung des Gehalts an 9-cis-Isomeren in der Zusammensetzung auf etwa 70% der Gesamtcarotinoid-Extinktion und besonders bevorzugt auf 80% des Gesamtcarotinoidgehalts. Die übrigen 20% bestehen typischerweise aus all-trans-β-Carotin (zum Beispiel 10%), anderen cis-Formen (zum Beispiel 5%) und anderen Carotinoiden (zum Beispiel 5%).
Das fertige Produkt wird vorzugsweise in einem natürlichen Trägeröl tierischen, pflanzlichen oder mineralischen Ursprungs dispergiert, insbesondere Olivenöl, Maiskeimöl, Sojaöl, etherischen Ölen, Ölen auf Terpenbasis und aus Fischen stammenden Ölen.
Die Zugabe kleiner Mengen öllöslicher Antioxidantien kann für bestimmte Anwendungen des Produkts nützlich sein. Beispiele dafür wären butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, Propylgallat, Ethoxychin und Ascorbylpalmitat plus anderen, als natürliches Antioxidans wirkenden Extrakten, die von Kräutern abgeleitet sind, und vorzugsweise natürlichen Tocopherolen.
Die Antioxidantien können verwendet werden, um zum Schutz der Präparate mit dem hohen Gehalt an cis-β-Carotin vor Oxidation beizutragen, was wichtiger ist, wenn das Produkt eine niedrigere Gesamtkonzentration an β-Carotin hat, zum Beispiel weniger als 5% β-Carotin im Präparat. Auch bei höheren Konzentrationen ist es jedoch wichtig, die β-Carotinpräparate vor Oxidation zu schützen.
Typischerweise wird je nach dem tatsächlich gewählten Antioxidans und der Anwendung eine Konzentration von 0,01% bis 1,0%, vorzugsweise 0,01% bis 0,5%, des reinen aktiven Antioxidans verwendet, da man aus Erfahrung weiß, daß dieser Konzentrationsbereich für einen normalen Schutz der fertigen Zusammensetzung während ihrer Lagerungszeit ausreichend ist.

Beispiele für Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung mit dem hohen Gehalt an cis-Isomer

Das Produkt wird durch eine Reihe physikalischer Operationen hergestellt. Beispiele für Verfahren, die zur Herstellung von Zusammensetzungen mit hohem Gehalt an cis-Isomer und besonders bevorzugt zur Herstellung von Zusammensetzungen mit hohem Gehalt an 9-cis-Isomer verwendet werden, sind unten als Beispiel A und Beispiel B dargelegt.
Beispiel A zeigt ein Verfahren unter Verwendung der Zentrifugation (das auf dem Prinzip der Trennung aufgrund von Dichteunterschieden beruht). Die kristalline Fraktion, die die trans-Kristalle enthält, wird von der öllöslichen Fraktion mit dem cis-Iosmer abgetrennt.
Diese Art der Trennung kann entweder in einer Zentrifuge des Chargentyps, gewöhnlich im kleinen oder Labormaßstab, oder in einer kontinuierlichen Maschine zur Verarbeitung größerer Volumina im technischen Maßstab erfolgen.
Die Dichte der Kristalle des all-trans-Isomers ist größer als die der cis-Isomere (einschließlich des 9-cis-Isomers), wenn sie in Pflanzenölen mit einer Dichte von etwa 0,92 g/cm³ in Lösung sind. Wenn die Temperatur oder der Schmelzpunkt des Trägerpflanzenöls es erlauben, daß das Öl flüssig ist und eine Viskosität hat, die ein Absetzen der all-trans-Kristalle unter Einwirkung der Zentrifugalkraft ermöglicht, wird das all- trans-Isomer durch die Zentrifugation von den cis-Isomeren getrennt. Da sie eine höhere Dichte haben, können die all- trans-Kristalle durch Sedimentation abgetrennt werden und die Maschine in der schweren Fraktion verlassen, während die cis- Isomere in der pflanzenöllöslichen oder leichten Fraktion verbleiben.
Zentrifugen (zum Beispiel eine Alfa Laval, Modellnummer FUVPX 207), deren Trommel sich öffnen läßt, um einen halbfesten schweren Schlamm zu entfernen, können die all-trans-Kristalle in diesem Schlamm konzentrieren und dadurch die Ausbeute der leichten Fraktion mit dem hohen cis-Gehalt erhöhen. Die Fließgeschwindigkeit des Materials durch die Zentrifuge hat auf das Ergebnis große Auswirkungen, so daß diese für die betreffende Maschine optimiert werden muß.
Beispiel B beruht auf der Filtration unter Verwendung einer Korbzentrifuge und eines Filterbeutels, doch wird der Fachmann sich ohne weiteres darüber im klaren sein, daß die Filteroperation mit einer Vielzahl von Filtermaterialien durchgeführt werden kann, einschließlich Filterpresse, Trommelfilter, Filterbetten, Filterpatronensysteme und anspruchsvollere Filter des Membrantyps. Jedes Filtersystem kann verwendet werden, bei dem eine Filtermasse, Papier, Patronenfilter oder eine Zentrifugalfiltration unter Verwendung eines Filters in einer Korbzentrifuge eingesetzt werden.
Die Kristalle von all-trans-β-Carotin werden durch das Filtermaterial zurückgehalten, aber das lösliche cis-Material kann durch das Filter laufen und erhöht so den Anteil an cis- Isomeren im Filtrat, d. h. dem durch das Filtermaterial laufenden Produkt.

Beispiel A

10 g 4%iges natürliches β-Carotin in Sojaöl (kommerziell erhältlich von Betatene Limited und vertrieben unter dem Markennamen "Betatene Limited 4% Natural Beta-Carotene in Soya Bean Oil") wurde in ein Zentrifugengläschen mit einem Durchmesser von 18 mm gegeben und 15 Minuten lang bei 21ºC in einer Clements-2000-Laborzentrifuge mit 2000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.
Am Ende wurde das überstehende Öl (die leichte Fraktion) durch Entnahme mit einer Pasteur-Pipette entnommen, und der Gehalt an cis- und trans-β-Carotin wurde bestimmt. Nach dem Ablaufenlassen des restlichen Überstands von der schweren Fraktion wurde die gleiche Analyse mit der sedimentierten schweren Fraktion durchgeführt.
Die Prozentsätze an cis-β-Carotin (einschließlich 9-cis-β- Carotin) und an all-trans-β-Carotin (mit Hilfe des weiter unten beschriebenen HPLC-Verfahrens bestimmt) waren wie folgt:
Dabei wurden die Kristalle in der schweren Phase oder der Schlammfraktion und das Produkt mit dem hohen cis-Gehalt als leichte Fraktion gewonnen. Der Rückstand enthält andere Carotinoide.
Dasselbe Verfahren kann auch kontinuierlich durchgeführt werden, wobei man eine Zentrifuge verwendet, deren Trommel sich öffnen läßt, um den Schlamm zu entfernen, wie eine Alfa Laval, Modellnummer FUVPX 207. Die Fließgeschwindigkeit des Zustroms zur Zentrifuge, die Einstellung des Abschöpfers zur Gewinnung der leichten Fraktion mit dem hohen cis-Gehalt und die Zeitpunkte der Schlammentfernung müßten für diese Maschine oder für andere, ähnliche Maschinen optimiert werden, worauf sich der Fachmann wohl versteht.

Beispiel B

Eine Kristallsuspension von β-Carotin in Sojaöl, die 21% Gesamtcarotinoid enthielt, wurde filtriert, so daß die Kristalle zurückgehalten wurden und die lösliche Fraktion hindurchlief. Die all-trans-Kristalle können von einer Matrix auf Ölbasis getrennt werden, vorausgesetzt, das Öl ist nicht zu viskos, so daß die Bewegung des Öls durch das Filterbett eingeschränkt ist. Das Ausgangsmaterial ist von der Betatene Limited erhältlich und wird unter dem Markennamen "Betatene Limited 20% Natural Beta-Carotene in Soya Bean Oil" vertrieben.
Diese Operation kann in einer Korbzentrifuge eines Typs wie die Broadbent, Tolhurst für Burton mit einer Trommel von 900 mm Durchmesser oder einer ähnlichen Maschine durchgeführt werden. Die Trommel besteht aus perforiertem Edelstahlblech, und ein Stoffbeutel wird in die Trommel gelegt, dessen Webung Lücken zwischen den Fasern von ungefähr 20 bis 25 um Breite aufweist. Das 20%ige natürliche β-Carotin in Sojaöl wird in den Beutel eingeleitet, und die Kristalle mit dem hohen trans- Gehalt werden auf dem Beutel zurückgehalten, wobei die lösliche Fraktion mit dem hohen cis-Gehalt durch den Beutel und die Perforationen in der Trommel läuft. Im Anfangsstadium kann das Filtrat noch die kleineren Kristalle enthalten, doch wird dies durch Rückführung in die Zentrifuge überwunden. Nach kurzer Zeit wirkt das Kristallbett auf der Innenfläche des Beutels als Hauptfilter, das die kleinen Kristalle entfernt. Die Operation wird fortgesetzt, bis der Strom des Filtrats durch den Beutel zu langsam wird. Das Filtrat wird am Ende des Durchlaufs ebenso wie die zurückgehaltenen Kristalle entnommen und auf β-Carotin sowie hinsichtlich des cis-trans-Isomerenprofils analysiert.
Die Prozentsätze an cis-β-Carotin und all-trans-β-Carotin (mit Hilfe des weiter unten beschriebenen HPLC-Verfahrens bestimmt) waren wie folgt:
Der Rückstand enthält andere Carotinoide.
Beispiel A ist ein tatsächliches Beispiel für ein Verfahren, das im Labormaßstab durchgeführt wurde. Beispiel B wurde im Produktionsmaßstab durchgeführt.
Der Fachmann wird sich auch darüber im klaren sein, daß cis- Isomere unter Verwendung präparativer HPLC in größerem Maßstab abgetrennt werden könnten. Zum Beispiel könnten Dunaliellasalina-Algen, die einen Gehalt an 9-cis-Isomer von unter 50% haben, mit präparativen HPLC-Techniken behandelt werden, um die Isomere zu trennen und ein Produkt des 9-cis-Isomers mit sehr hoher Reinheit (zum Beispiel 80% oder mehr des 9-cis- Isomers) zu erhalten. Diese Trenntechnik beruht auf der variablen Retention verschiedener chemischer Stoffe auf einer festen Phase, wenn die Stoffe in verschiedenen Gemischen flüchtiger organischer Lösungsmittel durch die feste Phase, gewöhnlich in Form von Kugeln in einer Säule, gepumpt werden. Indem man am Ende der Säule Fraktionen auffängt, können die chemischen Stoffe voneinander getrennt werden. Die flüchtigen organischen Lösungsmittel werden von der reinen Chemikalie abgedampft, so daß man das lösungsmittelfreie Produkt erhält.

Beispiel für Isomerenanalyse einer Carotinoidzusammensetzung mit Hilfe der HPLC

Folgendes ist ein Beispiel für ein Standardverfahren zur Durchführung einer Isomerenanalyse einer Carotinoidzusammensetzung mit Hilfe der HPLC zur Bestimmung des prozentualen Gehalts an cis-Isomeren von β-Carotin und all-trans-β-Carotin. Dies war das beim Analysieren der Isomerenprozentsätze in Beispiel A und Beispiel B oben verwendete Verfahren.
Um es kurz zusammenzufassen, eine Probe einer β-carotinhaltigen Zusammensetzung in Öl wird in Cyclohexan gelöst und auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Bevor man die resultierende Lösung in den HPLC-Chromatographen injiziert, sollte die Probe mit einer mobilen Phase verdünnt werden. Die Konzentration an β-Carotin wird bestimmt, indem man die Extinktion bei einer speziellen Wellenlänge unter Verwendung eines bekannten Extinktionskoeffizienten mißt. Der cis- und der trans-Gehalt werden bestimmt, indem man die Isomere durch HPLC voneinander trennt. Dann werden die Prozentsätze an cis- Isomeren und trans-Isomeren als Protenzanteil des Gesamtcarotinoidgehalts bestimmt.

(i) Reagentien und Geräte

Folgendes ist eine Liste der Reagentien und Geräte, die bei der Analyse verwendet werden können.
Spektrophotometer mit 10-mm-Glasküvetten
Analysenwaage
Cyclohexan, analysenrein
100-ml-Meßkolben
50-ml-Meßkolben
2,0-ml-Vollpipetten
Chloroform, analysenrein
HPLC-Chromatograph mit:
isokratischer Pumpe
Injektor für bis zu 50 ul
UV/Vis-Detektor, eingestellt auf 453 nm
Vydac 201TP54, Umkehrphasensäule, 250 mm
Acetonitril, HPLC-Qualität
Methanol, HPLC-Qualität
10-ml-Meßkolben

(ii) Herstellung der mobilen Phase

Bevor die Analyse durchgeführt wird, sollte eine mobile Phase hergestellt werden, indem man 400 g Acetonitril in eine 1000- ml-Vorratsflasche einwiegt, 300 g Methanol hinzufügt und gut mischt. Das resultierende Gemisch sollte auf Raumtemperatur temperiert sein, bevor es in der Analyse verwendet wird.

(iii) Verfahren

Das bei der tatsächlichen Analyse verwendete Verfahren ist unten dargelegt.
Eine Probe β-Carotin in Öl wird genau (auf 0,01 g) auf das Äquivalent von 80 mg β-Carotin in einen 100-ml-Meßkolben eingewogen. Ungefähr 5 ml Chloroform werden hinzugefügt, und es wird gemischt, bis sich die Probe aufgelöst hat. Um sicherzugehen, daß sich die Probe vollständig aufgelöst hat, sollte man sie gegen eine Lichtquelle betrachten. Wenn sich die Probe nicht vollständig aufgelöst hat, sollte man sie ungefähr 5 Minuten lang stehen lassen. Es ist auch möglich, weitere 5 ml Chloroform hinzuzufügen und das Gemisch zum Beispiel unter heißem Leitungswasser zu erwärmen.
Dann wird das Gemisch bis zum Volumen mit Cyclohexan verdünnt und gut durchmischt. Dies ist Lösung A. Dann werden 2 ml Lösung A in einen 50-ml-Meßkolben pipettiert und bis zum Volumen mit Cyclohexan verdünnt, und es wird gut gemischt. Dies ist Lösung B. Dann werden 2 ml Lösung B in einen 50-ml- Meßkolben pipettiert und bis zum Volumen mit Cyclohexan verdünnt, und es wird gut gemischt. Dies ist Lösung C. Dann wird die Extinktion von Lösung C bei 455 nm im Vergleich zu einer Cyclohexan-Blindprobe gemessen (dies ergibt den Gesamt-β- Carotingehalt und nicht das Isomerenverhältnis). Dann wird 1 ml Lösung B in einen 10-ml-Meßkolben pipettiert, bis zum Volumen mit dem Trägerlösungsmittel verdünnt, und es wird gut gemischt. Dies ist Lösung D.

(iv) Standards

Dann wird für Vergleichszwecke ein Standard hergestellt. Der Standard wird hergestellt, um ein Referenzmaterial bekannter Konzentration für die Bestimmung zu erhalten und die Referenz- Retentionszeit ("R. T.") für das all-trans-Isomer zu bestimmen. Der Standard wird nach demselben Verfahren hergestellt, das zur Herstellung der Probe verwendet wurde. Man wiege das Referenzstandardmaterial (Sigma-all-trans-β-Carotin von Sigma Corporate in St. Louis, USA) auf das Äquivalent von 80 mg β- Carotin ab und gehe dann weiter vor wie bei der Probe. Die Konzentration des Standards wird genauso wie die der Probe bestimmt.

(v) Bestimmung

Der Standard und die Probe, die auf diese Weise hergestellt wurden, sind fertig für die Injektion.
Die Fließgeschwindigkeit im HPLC-Chromatograph sollte auf 1,0 ml/min eingestellt sein. Man injiziert 20 ul des Standards in den HPLC-Chromatograph und läßt 25 Minuten lang laufen. Die Konzentration und das Volumen der injizierten Lösung werden aufgeschrieben. Dann werden 20 ul Lösung D in den HPLC- Chromatographen injiziert, und man läßt 25 Minuten lang laufen. Die Konzentration und das Volumen der injizierten Lösung werden aufgeschrieben.
Ein Beispiel für ein typisches Chromatogramm ist auf der nächsten Seite reproduziert.

(vi) Berechnung

I - Berechnung zur Bestimmung der β-Carotinkonzentration

Die Zahlen in Klammern sind typische Werte.
Extinktion von Lösung C bei 455 nm Abs (~ 0,4)
Gewicht der Probe m (~ 0,5 g)
Extinktionskoeffizient E, % 2500 cm1%~1
injizierte Konzentration (mg/1) I (~ 4)
I = Abs · 25 · 10 000/(2500 · 10) = Abs · 10 II - Berechnung zur Bestimmung der cis- und trans-Prozentsätze
Die in der obigen Tabelle verwendeten Retentionszeiten sind die Retentionszeiten, die in dem obigen Chromatogramm gefunden wurden. In dem obigen Chromatogramm wurde für das unbekannte cis-Isomer 1 kein Peak gefunden ("der C1-Peak"). Typischerweise wird dieses Isomer nach einer Retentionszeit von etwa 14 Minuten erscheinen. Die in der obigen Tabelle angegebenen Prozentzahlen sind Näherungswerte.
Die Integrationen der einzelnen Peaks werden als Prozentsatz bestimmt, indem man die Integrationen der einzelnen Peaks durch die Gesamtintegration der Peaks dividiert und das Ergebnis mit 100 multipliziert, was den Prozentsatz des Gesamtcaro tinoids ergibt. Diese Prozentsätze erscheinen unter der Spalte "Conc" in der Tabelle unter dem Beispielchromatogramm.
Alternativ dazu kann auch die folgende Formel verwendet werden, um den Prozentanteil der cis-Isomere am Gesamtcarotinoidgehalt zu berechnen. Für diese Formel wird angenommen, daß man im Chromatogramm einen C1-Peak findet:
cis % = (C1+C2+C3+C4/(Gesamtintegration der Peaks)) · 100%
Die cis-Isomere sind nicht immer vollständig aufgelöst, aber dies beeinflußt nicht ihre Gesamt-cis-Isomer-Extinktion. In dieser Hinsicht ist der C1-Peak nicht immer vollständig aufgelöst oder von den anderen cis-Isomeren getrennt. In diesem Fall kann der C1-Peak bei der Berechnung vernachlässigt werden.
Der Prozentanteil des all-trans-Isomers am Carotinoidgehalt kann ebenfalls berechnet werden, und zwar nach der folgenden Formel:
trans % = (T/(Gesamtintegration der Peaks)) · 100%
Wenn man diese Art von Analyse durchführt, wird empfohlen, Glas zu verwenden, das nur wenig aktinische Strahlung durchläßt, da β-Carotin am Licht langsam zersetzt wird. Dieselbe Analyse sollte außerdem zweimal durchgeführt werden, da die Retentionszeiten stark von der Temperatur abhängen, und die Säule und die Lösungsmittel sollten auf 20ºC gehalten werden.
Dementsprechend stellt die Erfindung eine neue, aus einer natürlichen Quelle stammende Carotinoidzusammensetzung mit einem hohen Gehalt an cis-β-Carotin bereit.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Carotinoidzusammensetzung, die aus einer natürlichen Quelle stammt, wobei es sich bei Wenigstens 50 Gew.-% des Carotinoidgehalts der Zusammensetzung um natürlich vorkommendes cis-β-Carotin handelt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Bilden eines carotinoidhaltigen Präparats aus der natürlichen Quelle, wobei das Präparat unter Verwendung von Dichtedifferenzierungsmethoden so behandelt werden kann, daß in Form von cis-Isomeren vorliegende Carotinoide, die darin enthalten sind, von in Form von trans-Isomeren vorliegenden Carotinoiden getrennt werden; und

(b) Behandeln des Präparats unter Verwendung von Dichtedifferenzierungsmethoden, so daß in Form von cis- Isomeren vorliegende Carotinoide von in Form von trans-Isomeren vorliegenden Carotinoiden, die in dem Präparat enthalten sind, getrennt werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Dichtedifferenzierungsmethoden eine Zentrifugation beinhalten.

3. Verfahren zur Herstellung einer Carotinoidzusammensetzung, die aus einer natürlichen Quelle stammt, wobei es sich bei wenigstens 50 Gew.-% des Carotinoidgehalts der Zusammensetzung um natürlich vorkommendes cis-β-Carotin handelt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Bilden eines carotinoidhaltigen Präparats aus der natürlichen Quelle, wobei das Präparat mit Filtrationsmethoden so behandelt werden kann, daß in Form von cis-Isomeren vorliegende Carotinoide, die darin enthalten sind, von in Form von trans-Isomeren vorliegenden Carotinoiden, die darin enthalten sind, getrennt werden; und

(b) Behandeln des Präparats unter Verwendung der Filtrationsmethoden, so daß in Form von cis-Isomeren vorliegende Carotinoide von in Form von trans-Isomeren vorliegenden Carotinoiden, die in dem Präparat enthalten sind, getrennt werden.

4, Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Filtrationsmethoden eine Filterpresse, ein Trommelfilter, ein Filterbett, ein Filterpatronensystem, ein Membranfilter oder Kombinationen der obigen beinhalten.

5. Carotinoidzusammensetzung, die aus einer natürlichen Quelle stammt, wobei es sich bei wenigstens 50 Gew.-% des Carotinoidgehalts der Zusammensetzung um natürlich vorkommendes cis-β-Carotin handelt und wobei die Zusammensetzung nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 hergestellt ist.

6, Carotinoidzusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei der Gehalt der Zusammensetzung an natürlich vorkommendem cis- β-Carotin zwischen wenigstens 50% und 80% liegt.

7. Carotinoidzusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei der Gehalt der Zusammensetzung an natürlich vorkommendem cis- β-Carotin zwischen 60% und 70% liegt.

8. Carotinoidzusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei der Gehalt der Zusammensetzung an natürlich vorkommendem cis- β-Carotin zwischen 60% und 85% liegt.

9. Carotinoidzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die Zusammensetzung vorwiegend aus natürlich vorkommendem 9-cis-β-Carotin besteht.

10. Carotinoidzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei die Zusammensetzung etwa 70% natürlich vorkommendes 9-cis-β-Carotin umfaßt.

11. Carotinoidzusammensetzung gemäß Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei die Quelle für das 9-cis-β-Carotin aus Pflanzenprodukten einschließlich Aprikosen, Blüten bestimmter Arten der Gattung Acacia, Cucurbitaceen und Dunaliella salina sowie Gemischen davon ausgewählt ist.

12. Carotinoidzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei es sich bei der Quelle für das 9-cis-β-Carotin um Dunaliella salina handelt.

13. Carotinoidzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 12, wobei die Zusammensetzung in einem natürlichen Trägeröl dispergiert ist, das aus Ölen tierischer, pflanzlicher und/oder mineralischer Herkunft ausgewählt ist.

14. Carotinoidzusammensetzung gemäß Anspruch 13, wobei der Ölträger aus Olivenöl, Maiskeimöl, Sojaöl, etherischen Ölen, Ölen auf Terpenbasis, von Fischen abgeleiteten Ölen und Gemischen davon ausgewählt ist.

15. Carotinoidzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 14, wobei die Zusammensetzung weiterhin kleine Mengen öllöslicher Antioxidantien im Bereich von 0,01 bis 1,0 Gew.-% reines Antioxidans umfaßt.

16. Carotinoidzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 14, wobei die Zusammensetzung weiterhin kleine Mengen öllöslicher Antioxidantien im Bereich von 0,01 bis 0,5 Gew.-% reines Antioxidans umfaßt.

17. Carotinoidzusammensetzung gemäß Anspruch 15 oder Anspruch 16, wobei das Antioxidans aus butyliertem Hydroxyanisol, butyliertem Hydroxytoluol, Propylgallat, Ethoxychin und Ascorbylpalmitat plus anderen, als natürliches Antioxidans wirkenden Extrakten, die von Kräutern abgeleitet sein können, und vorzugsweise natürlichen Tocopherolen sowie Gemischen davon ausgewählt ist.

18. Carotinoidzusammensetzung, die mit physikalischen Methoden aus einer natürlichen Quelle abgeleitet ist, wobei es sich bei wenigstens 50 Gew.-% der Carotinoidzusammensetzung um natürlich vorkommendes cis-β-Carotin handelt, wobei die Zusammensetzung auch andere natürlich vorkommende Carotinoide als cis-β-Carotin umfaßt.