DE2660659C2 - Verfahren zur Herstellung von 7-Methoxycephalosporinderivaten - Google Patents

Description

worin R² eine Imidazolyl-, Pyrazolyl, Triazolyl-, Tetrazolyl- oder Thiadiazolylgruppe darstellt, die durch eine Alkyl- oder Carboxyalkylthiogruppe substituiert sein kann, und M bedeutet ein Wasserstoffatom oder einen kationischen salzbüdenden Rest, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces oganonensis ATCC 31167 in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Nährstoffe mit dem Zusatz eines heterocyclischen Thiols mit der Formel

R²SH,

worin R² die vorstehend genannte Bedeutung hat, oder dessen Salz oder eine Verbindung mit der Formel

R²—S—S—R²,

worin R² die gleiche schon genannte Bedeutung hat, enthält.

30 Proteus hervorgerufen werden, gegen die gewöhnliche Antibiotica nicht wirksam sind, oder die durch die Infektion mit den Bakterien hervorgerufen werden, die nicht empfindlich sind gegen gewöhnliche Cephalosporine, welche keine Methoxygruppe in der 7-Position aufweisen.

Diese Verbindungen werden gewöhnlich hergestellt, indem zuerst die entsprechenden Verbindungen, die eine Acetoxymethylgruppe oder eine Carbamoyloxymethylgruppe in der 3-Position aufweisen, hergestellt werden, und zwar durch ein Fermentationsverfahren, und dann werden diese Verbindungen mit einer heterocyclischen Thiolverbindung umgesetzt.

Die Erfindung hat den Vorteil, daß die Verbindung mit einer heterocyclischen Thiomethylgruppe in der 3-Position direkt durch eine einzige Fermentationsstufe erhalten werden kann. Die so erhaltene Verbindung ist die Verbindung mit der allgemeinen Formel A.

Die Verbindungen der Formel A besitzen selbst ausgezeichnete antimikrobiell Aktivitäten, und weiterhin können die antimikrobiellen Eigenschaften und die antimikrobiellen Spektren der Verbindungen erhöht oder gewechselt werden, indem die Acylgruppen-Seitenkette in der 7-Position, dargestellt durch

Die Erfindung betrifft das durch den Anspruch gekennzeichnete Verfahren.

Als typische Gruppe, die durch R² in der vorstehenden allgemeinen Formel angezeigt wird, werden zur Verdeutlichung genannt: eine Carboxymethylthio-U^-thiadiazol-2-yl-Gruppe, eine i-Methyl-lH-tetrazol-5-yl-Gruppe, eine 5-Methyl-1.3,4-thiadiazol-2-yl-Gruppe oder eine l,3.4-Thiadiazol-2-yl-Gruppe.

Der durch M dargestellte kationische Rest, der das Salz des Cephalosporins bildet, bedeutet einen anorganischen Rest oder einen organischen Rest. Beispiele für den anorganischen Rest sind ein Alkalimetall, wie Natrium, Kalium; ein Alkalierdmetall, wie Calcium. Magnesium, Barium; sowie ein Schwermetall, wie Eisen Kupfer, Zink; Beispiele für den organischen Rest sind basenbildende quHternäre Salze, Aminsalze, z. B. Triethylamin. Diethanolamin, Piperidin, Morpholin.

Einige 7-Metlloxy-3-heterocyclotlliomethylcephalo- so sporine sind in der GB-PS 1321412 (1970) als durch chemische Synthese erhältliche Verbindungen beschrieben, jedoch sind in dieser britischen Patentschrift keine praktischen physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen angegeben. Auch die DE-OS 2304226 offenbart die Herstellung solcher Verbindungen.

Aufgabe dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung dieser Derivate durch Fermentation zur Verfügung zu stellen. tio Cephalosporine besitzen ausgezeichnete antimikrobielle Aktivitäten gegen gram-positive und gram-negative Bakterien, und unter diesen Verbindungen besitzen die Cephalosporinderivatc mit einer Methoxygruppe in der 7-Position und einer heterocyclischen Thiomethylgruppe in der 3-Position ganz ausgezeichnete Wirkung bei der Behandlung von ernsthaften Erkrankungen, die durch die Infektion mit Bakterien, wie Pseudomonas und H,N

HOOC

CH-(CH₂)₃—CO-

mit einer i'nde: :n Acylgruppe. wie z. B. a-Aminophenylacetylgruppe, ot-Carboxyphenylacetylgruppe. oc-Sulfophenylacetylgruppe, a-Hydroxyphenylacetylgruppe. Pyridylthioacetylgruppe, Thiadiazolylthioacetylgruppe, Triazolylacetylgruppe, Cyanomethylthioacetylgruppe, Trifluormethylthioacetylgruppe gewechselt oder ausgetauscht werden. So sind die Verbindungen mit der Formel A ebenfalls als Zwischenprodukte verwendbar, um diese Derivate mit diesen Acylgruppen herzustellen. Zum Beispiel : 7ß-Cyanomethylthioacetamido-7oc-methoxy-3-( 1 methyltetrazol-S-ylthiomethyO-A-'-cephem^-carbonsäure und 7a-Methoxy-3-(l-methyltetrazol)-5-yIthiomethyl)-7ß-(trifluormethylthioacetamido)-A³-cephem-4-carbonsäure.

Die Verbindungen der Formel A besitzen die Eigenschaften wie ein amphoteres Material, denn die Verbindungen haben eine Aminogruppe und zwei Carboxygruppen im Molekül, und dadurch ist die Isolierung und Reinigung der hergestellten Verbindungen mühsam.

In dieser Erfindung wird ein neuer Strmm benutzt, nämlich Streptomyces oganonensis Y-G19Z. der zuvor von den Erfindern aus dem Erdboden bei der Stadt Ogano, Chichibugun, Bezirk Saitama (Japan) isoliert worden ist. Dieser Stamm ist in dem Institut für Mikrobielle Industrie. Zweigstelle für Industrielle Wissenschaft und Technologie. Ministerium für Internationalen Handel und Industrie, Japan, unter einer Hinterlegungs-Nummer FERM-P 2725 und auch in der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville. marryland 20852 (USA) unter ATCC No. 31167 hinterlegt worden. Die mykologischen Eigenschaften des Stammes sind die folgenden:

I. Morphologische Charakteristiken von Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm:

Der Stamm wächst sowohl auf natürlichen wie auch auf synthetischen Medien unter Bildung eines gut verzweigten Substratmycels. während die Bildung von atmosphärischem Mycel nicht ausreichend ist. da die Sporenbildung /u gering ist. Die Sporenketten sind gerade, gehören zum R" (rectus) oder RF~ (Rectiflexiblcs) Typ und tragen 10 his 50 Sporen in jeder Kette. Die Sporen sind

elliptisch, sphärisch oder zylindrisch geformt und weisen ?ine Größe von 0,45 bis 0,60x0,55 bis 0,90 μ auf. Die Sporenoberfläche ist glatt. Es werden weder Flagellaten-Sporen noch Sporangium beobachtet.

II. Kultur-Charakteristika des Stammes S. oganonensis Y-G19Z:

Medium Wachstum Atmosphä- Lösliches

risches Mycel Pigment

Czapek's

Glukose Czapek's

Glukose Aspa^agin-

Glycerin Asparagin-

Anorganisch Salz-Stärke-

Tyrosin-Agar

Eisen und Heteextrakt-Tyrosin- Agar

Nährbodcn-Agar

Bennett's Agar

Calciummalat-Agar Kartoffelstücke

BIut-Agar

Loeffer's Serum Medium

sehr gering spärlich

weiß weiß

gut leidlich

cremegelb gelblichgrau

gut gering

weiß weiß

gut gering

weiß bis weiß bis gelblich-weiß gelbüch-weiß gut gering

gelblich-grau gelblich-grau bis schwach gelblich-braun gut gering

schwach gelb gelblich-grau

gut

schwach gelb bis gelblichbraun gut

schwach gelblichbraun

gut

schwach geblichbraun

mäßig cremefarbig gut

schwach gelblichbraun

gut

olive-grau bis dunkel olive-grau gut

gut

bräunlichweiß bis gelblichgrau

gut, pulverig schwach orange bis schwach braun gut

bräunlichgrau, schwach orange bis schwach rosa kein

gut

gelblichgrau bis schwach bräunlichgrau kein

nein

nein

sehr gering

nein

nein

nein

schwach schwach gelblich-grau sehr gering hell bräunlich-grau

schwach geblich-braun

sehr schwach

kein

kein

bräunlichgrau bis dunkel gelblichbraun

gelblich-grau bis dunkel rötlich-braun

kein

Cellulose-Abbau negativ

Hämolyse positiv Löslichmachung von Calcium-

malat positiv

Ausnutzung von Kohlenstoffverbindungen durch S. oganonensis Y-G19Z:

Kohlenstoffquelle Ausnutzung

Glukose +

Arabinose +

Sukrose -

Xylose +

Inositol —

Mannitol +

Fruktose +

Rhamnose —

Raffinose -

Charakteristische Merkmale für Streptomycc ; oganonensis Y-Gl 9Z-Stamm:

1. Es gehört zu dem nicht-chromogenen Strepioirvces Stamm;

2. Sein atmosphärisches Mycel ist gerade ohne Verzweigung (R oder RF Typ);

3. Sporen sind sphärisch oder elliptisch;

4. Sporenoberfläche ist glatt;

5. Es gibt schwach gelblich-graue bis schwach gelblichbraune Gewächse auf verschiedenen Medien;

6. Die Farbe des sphärischen Mycels ist bräunlichweiß, gelblich-weiß und geblich-grau;

7. Die erzeugte antibiotische Substanz Y-G19Z-D3 gehört zur 7-Methoxycephalosporingruppe.

Bei der Durchforschung bekannter Stämme, die die vorstehenden Eigenschaften aufweisen, können als am nächsten kommende Streptomyceten die folgenden angesehen werden:

Streptomyces globisporus, beschrieben in S. A. Waksman: »The Actinomycetes« 2, 218 (1961) und International Journal of Systematic Bacteriology, 18, (4) 324- -325 (1968).

Wenn man jedoch den bekannten S. globisporus. der in der vorstehenden Literatur beschrieben ist, mit dem Stamm Y-G19Z vergleicht, weicht dieser in den folgenden Eigenschaften, die in der Tabelle angegeben sind, ab:

Tabelle

Eigenschaften: Y-G19Z

S. globisporus

III. Physiologische Eigenschaften von S. oganonensis Y-G19Z-Stamm:

negativ

positiv

positiv, schwach

positiv, schwach

positiv

positiv, schwach

Größe der 0.45-0,60x0,55-0,90 1,2-1,4x8-2,0 Spore (μ) ■ oder 0,9-1,4

kugelförmig kein

Tyrosin-Formation Nitrat-Reduktion Magermilch-Koagulatiun Magermilch-Peptonisation Hydrolyse von Stärke Verflüssigung von Gelatine

Flüssiges

Pigment oder

Glycerin-

Asparagin-

Medium

Rhamnose- negativ

Verwertung

Stärke- stark

Hydrolyse

Magermilch- positiv

Koagulation

Magermilch- schwach

Peptonisation

Produktion positiv

von Cephalo-

sporin-Anti-

biotica

gelblich bis grünlich-gelb

positiv schwach negativ stark

negativ

Aus den in der vorstehenden Tabelle angegebenen Differenzen ergibt sich, daß der in dieser Erfindung benutzte Stamm ein neuer Stamm ist, der sich von den vorstehend genannten bekannten Stämmen unterscheidet.

Da der Y-G19Z-Stamm als ein neuer Stamm durch die vorstehenden Beobachtungsergebnisse bestätigt worden ist, ist er als »Streptomyces oganonensis« bezeichnet worden.

Wie schon bei den Ausführungen über den Streptomyces oganonensis Y-19Z-Stamm ausgeführt wurde, handelt es sich um einen 7-Methoxycephalosporin-Antibiotikum erzeugenden Stamm. Als ähnliche Stämme, die zu den Streptomyceten gehören, sind als Erzeuger von 7-Methoxycephalosporin-Antibiotika die folgenden bekannt:

Streptomyces griseus, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces fimbriatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochei, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces chartreusis und Streptomyces lactamdurans (vgl. Japanische Patent-Offenlegungsschrift 3286/71 und Beigische Patentschrift 7 64160) sowie Streptomyces lipmanii (US-PS 3719 563), Streptomyces clavuligerus (Japanisches Patent 45 594/74). Streptomyces wadayamensis (Japanische Offenlegungsschrift 26488/74). Streptomyces jumonjinensis (Japanische Offenlegungsschrift 42 893/74). Streptomyces heteromorphus und Streptomyces panayensis (Japanische Offenlegungsschrift 53 594/ 75). und Streptomyces chartreusis SF-1623 (Japanische Offenlegungsschrift'en 82291/75 und 121488/75).

Die Herstellung der besprochenen Verbindung A wird ausgeführt, indem man den erwähnten 7-Methoxycephalosporin-Antibiotika produzierenden Stamm kultiviert in einem üblichen Kulturmedium, dem ein Zusatz an heterocyclischer Thiolverbindung zugegeben wurde entsprechend der heterocyclischen Thiogruppe R²—S—. die in die 3-Position eingeführt werden soll.

Beispiele für die heterocyclischen Thiole, die dem Kulturmedium in dieser Erfindung hinzugefügt werden, sind: Imidazolthiol. Pyrazolthiol. Triazolthiol, Tetrazolthiol. Methyltetrazolthiol.Thiadiazolthiol.

Diese heterocyclischen Ringe können eine Alkyl- oder Carboxyalkylthiogruppe tragen.

Diese heterocyclischen Thiole können als ihre Salze verwendet werden. Diese Salze sind anorganische Salze, wie Alkalimetallsalze. Erdalkalimetallsalze. Ammoniumsalze und die Salze mit organischen Basen, wie Triäthylamin. Triäthanolamin. Dicyclohexylamin, Lysin. Arginin. Histidin, basische wasserlösliche Antibiotika, z. B. Kanamycin. Alkaloide, basische Proteine. Die Salze mit hoher Wasserlöslichkeit können selektiv verwendet werden. falls erforderlich, und ferner, wenn die heterocyclischen Thiole eine starke Toxizität zu den Antibiotika erzeugenden Stämmen aufweisen, können die nur spärlich in Wasser löslichen Salze selektiv verwendet werden.

Auch können die Disulfide R²—S—S—R² Verwendung finden.

Die Kultivierung wird nach den üblichen herkömmlichen Methoden zur Züchtung von Mikroorganismen durchgeführt, jedoch wird die submerse Kultur in einem flüssigen Kulturmedium bevorzugt. Es können synthe- μ tische Kulturmedien, halb-synthetische Kulturmedien und natürliche Kulturmedien Verwendung finden. Für die Zusammensetzung des Kulturmediums können Glukose. Sukrose, Mannitol, Glycerin, Dextrin, Stärke und vegetable öle als Kohlenstoffquellen Verwendung finden, und Fleischextrakt, Peptone, Klebermehl, Baumwollsaatmehl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Fischmehl. Kornschlempe. Trockenhefe. Hefeextrakt. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff und andere organische und anorganische Stickstoffquellen können als Stickstoffspender Verwendung finden. Ebenso können, falls erforderlich. Metallsalze, wie Sulfate, Nitrate, Chloride. Carbonate. Phosphate von Natrium, Kalium. Magnesium, Calcium, Zink und Eisen zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden. Weiterhin können, falls erforderlich. Materialien, die die Bildung der Antibiotika begünstigen, oder Entschäumungsmittel, wie Methionin. Cystein, Methyloieat, Lardöi, Siiiconöi, oberflächenaktive Mittel, in geeigneter Weise zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden.

Das vorstehend genannte heterocyclische Thiol, dessen Salz oder dessen Derivat wird gewöhnlich in einer Konzentration von 0,1 - 5 mg/ml, vorzugsweise 0.5-2 mg/ml als heterocyclisches Thiol hinzugefügt. Es kann zu dem Kulturmedium als eine sturzartige Zugabe vor der Kultivierung oder auch in verschiedenen unterteilten Portionen in den Eingangsstufen der Kultivierung zugefügt werden. Es ist im allgemeinen günstig, die Kultivierung unter aeroben Bedingungen durchzuführen. Die Kultivierungstemperatur liegt gewöhnlich zwischen etwa 18°C bis etwa 35⁰C. vorzugsweise um 30 ⁼C. Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn das pH des Kulturmediums auf etwa 5—10. vorzugsweise etwa 6 — 8 gehalten wird. Der Kultivationszeitablauf hängt von der Zusammensetzung und der Temperatur des verwendeten Kulturmediums ab. aber im allgemeinen werden etwa 3 Tage bis etwa 10 Tage benötigt. Das hergestellte Material wird selektiv in dem Medium angereichert, nachdem die Kultivierung beendet ist.

Das hergestellte Antibiotikum kann isoliert und aus der Kulturbrühe nach den üblichen Methoden gewonnen werden, die für das Isolieren von Antibiotika aus dem kultivierten Mycel-Nährboden üblich sind. Das hergestellte Antibiotikum ist hauptsächlich in der Kulturbrühe anwesend. Nach der Abtrennung des Mycels von der Nährbodenlösung durch Zentrifugieren oder Filtrieren wird das hergestellte effektive Material aus dem Filtrat extrahiert; das heißt, das hergestellte Material wird abgetrennt, wieder ausgezogen und gereinigt vom Filtrat. Hierbei werden Vorrichtungen und Verfahren verwendet, die ganz allgemein für die Herstellung von Antibiotika Verwendung finden, wie Methoden, die die Unterschiede der Löslichkeit in einem geeigneten Lösungsmittel ausnutzen, die die Unterschiede der adsorptiven Affinität

uit» aui

Unterschieden der Trennmethoden in zwei flüssigen Phasen beruhen.

Diese Methoden können, falls erforderlich, in einer geeigneten Kombination oder auch wiederholt angewandt werden. Einige praktische Beispiele der erfindungsgemäß hergestellten 7-MethoxycephaIosporin- Verbindungen werden nachfolgend genannt:

I. 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxyrnethylthio-l,3.4-thiadiazol-2-yI)thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure;

OCH,

HOOC-CH-CH₂CH₂Ch₂CONH

NH,

N—N

CH₂-S-I J-S-CH₇COOH

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der hergestellten Verbindung I sind die folgenden:

1. weißes Pulver;

2. Schmelzbeginn bei 156-160 C. Hierbei tritt Braunlarbung ein. und die Zersetzung beginnt ab etwa 170 C;

3. leicht löslich in Wasser, spärlich löslich in Methanol, und sehr spärlich löslich in anderen organischen Lösungsmitteln;

4. umphoteres Material mit positiver Ninhydrin-Reaktion:

5. es besitzt das ultraviolette Absorptionsspektrum gemäß Fig. 1 der beigefügten Zeichnung, wenn es in einer 1/100 M Phosphat-Pufferlösung mit einem pH vuii 6,4 gemessen wird, wobei das Absorptionsmaxi- !5 mum bei 287 ιτιμ liegt;

6. es besitzt das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 2. wenn es in der Kaliumbromid-Tablette gemessen wird. Es ergeben sich Absorptionen bei 3413cm"¹, 2920cm"¹, 1763cm"¹, 1620cm~',20 13i5 cm"¹ und 1380 cm"¹;

7. Bei der Bestimmung des kernmagnetischen Resonanzspektrums unter Verwendung von TMS als äußerem Standard in schwerem Wasser werden folgende Signale erhalten: fi Wert (ppm): 2.35 (4H, Multiplen). 2.96 (2H. Multiplett), 4,00 (3H. Singlett), 3,73-4,33 (2H, Quartett, J = 18 Hz). 4,25 (IH. Multiplen), 4.44 (2H. Singlett), 4.42-4.91 (2H. Quartett. J = 14 Hz), 5,63 (IH. Singlett);

8. Das im derzeitig reinsten Zustand hergestellte Produkt besitzt die folgenden elementar-analytischen Werte: C: 35.95 %. H : 3,87 %. N: 10.85 %. S: 18,33 %:

9. es ergibt ot-Aminoadipinsäurc bei der Hydrolyse mit 6 η Chlorwasserstoffsäure:

10. das Massenspektrum dieser Verbindung ergibt nach einer N-Chloracetylierung der Verbindung und Überführung des Produktes in den Methylester das folgende Fragment mit m/e 392. das heißt (l,3.4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure.

Nachfolgend werden die Ergebnisse von verschiedenen chromatographischen Analysen und Papierelektrophoretischen Untersuchungen der hergestellten Verbindungen I, II, III und IV angegeben.

Die erhaltenen Rf-Werte dieser Verbindungen in der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel" SF) sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben:

—<^ ^N V. S-CH₂COOCH,

40

H "N V-CH₂-S-

COOCH,

Unter Berücksichtigung aller vorstehenden Ergebnisse ist es ersichtlich, daß diese Verbindung eine 7-Methoxycephalosporin-Verbindung ist, denn die Verbindung ergibt eine Absorption bei 1763 cm"¹ (cyclisches Lactam) im Infrarot-Absorptionsspektrum, und die Gegenwart der Signale bei 4,00 ppm (3H, Singlett. 7-OCH₃), 5,63 ppm (lH.singlett.6-CH),3,73-4,33(2H,Quartett,J= 18Hz, 2-CH₂) und 4.42-4.91 (211, Quartett. J = 14 Hz, 3-Seitenkette CH₂) in dem kernmagnetischen Resonanzspektrum. Die Verbindung ergibt a-Aminoadipinsäure bei der Säurehydrolyse, ferner ergibt die Verbindung Absorptionen bei 4,44 ppm (2H, Singlett, CH₂ von —S—CH₂—COOH) im nuklearmagnetischen Resonanzspektrum und außerdem das Fragment von m/e 392 im Massenspektrum des Derivates; aus diesen Gründen ist entschieden worden, daß die Verbindung die vorstehend genannte Struktur hat, in die das heterocyclische Thiol eingeführt worden ist.

I1. 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-( 1 -methyl-1 H-tetrazol-5-yl)-thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure;

III. 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiornethyl-A³-cephem-4-carbonsäure.

IV. 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramidoV7-methoxy-3-

Verbindung I 0,39 0,37

Verbindung II 0.39 0,34

Verbindung III 0.43 0,43

Verbindung IV 0,39 0.38

Cephalosporin C 0.37 0.36

7-Methoxycephalosporin C 0,41 0,36

Cephamycin C 0.37 0,36

0,32 0.31 0.40 0.33 0,31 0.32 0.31

Verwendetes Entwicklungslösemittelsystem (VoIu.. .nverhältnis):

1. I sopropanol: n-Butanol: Essigsäure: Wasser (21:3:7:9).

2. n-Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:2).

3. n-Butanol Essigsäure: Wasser (6:1,5:2.5).

Die Kontrollprobe. Cephamycin C ist 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy- A³-cephem-4-carbonsäure.

Die Rf-Werte, die bei der Papierverteilungschromatographie unter Verwendung von Wattman" Nr. 1 Filterpapier und einem Entwicklungslösungsmittelsystem aus n-Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) bestimmt wurden, lauten:

Rf-Wert

Verbindung 1	0,40
Verbindung 11	0,39
Cephalosporin C	0.36
7-Methoxy-cephalosporin C	0.40
Cephamycin C	0.35

Dann wurden die Verbindungen unter Verwendung einer Hitachi® 635 Hochgeschwindigkeits-Fiüssigkeitschromatographie-Apparatur analysiert und dadurch folgende Resultate erzielt:

Säule: 3 χ 500 mm Säule aus rostfreiem Stahl Kunstharz: Hitachi« 2610 (kationisches Austauschharz)

Entwicklungslösungsmittelsystem: 0,2 M Citratpufferlösung (pH 3,6);
Fließgeschwindigkeit: 0,6 ml/min; Schreibträgergeschwindigkeit: 1,0 cm/min.

Retentionszeit

Verbindung I 5 min 33 see

Verbindung II 6 min 00 see

Verbindung III 9 min 35 see

Cephalosporin C 5 min 18 sec

7-Methoxy-cephalosporin C 5 min 09 see Cephamycine 5 min 18 sec

Die Verbindungen A dieser Erfindung besitzen ausgezeichnete antimikrobielle Aktivitäten; diese werden für die Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen bei Mensch und Tier verwendet. Ferner können sie auch in geeigneter Weise als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer effektiver 7-Methoxycephalosporin-Derivate Ver-

Wendung finden. In solchen Fällen wird es bevorzugt, die Verbindung der Formel A als reines Produkt oder als ein hochkonzentriertes Rohprodukt zu isolieren. Besonders wenn die Substituentengruppe

H₁N

HOOC

CH-(CH₂)J-CONH-

in der 7-Position der Verbindung der Formel A durch eine andere Acylamidgruppe ersetzt wird, verschwinden die amphoteren Eigenschaften und das so modifizierte saure Produkt wird zur Isolierung gut geeignet, und es wird in organischen Lösungsmitteln löslich. Die nachfolgende Reaktion kann ohne Schwierigkeiten durchge- _]5 führt werden. Daher wird die Modifikation der Verbindung der Forme! A wie vorstehend schon erläutert für die Anwendung in der industriellen Praxis bevorzugt.

Beispiel 1

20

Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(S-carboxymethylthio-O.'t-thiadiazol-l-yOthiomethyl-V-methoxy-ij-cephem-4-carbonsäure 1:

Ein Kulturmedium, welches 1 % Stärke. 1 % Glukose, 1,5%Sojabohnenmehl.0.5%Hefeextrakt.0,1 %Dikaliumhydrogenphosphat. 0.05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in eine 500 ml Sakaguchiflasche mit je 100 ml eingefüllt und bei 120⁰C für 20 Minuten sterilisiert. Jede Flasche wurde mit Streptomycesoganonensis Y-G19Z-Slamm beimpft und 48 Stunden bei 30°C kultiviert.

In weiteren Ansätzen wurde das gleiche Kulturmedium in 2000 ml Sakaguchiflaschen mit je 400 ml gefüllt und bei 120⁰C für 20 Minuten sterilisiert. Es wurde mit dem gleichen Stamm in einer Konzentration von 2 — 3% beimpft und 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert, um eine Kultur zu erhalten.

Weiterhin wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7% Stärke. 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin, 0,1 % Casaminosäure, 0,01% Ferrisulfat to und 55 g Natriumhydroxid enthielt, jeweils in zwei 100 Liter Fermentern zusammen mit 10 ml Entschäumungsmittel eingefüllt. Es wurde 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Jedes Medium wurde mit 800 ml der Züchtungskultur beimpft, und dann wurde 24 Stunden bei 3O¹C «5 kultiviert. In wäßriger Natriumhydroxidlösung wurde 5-Mercapto-l ,3,4-thiadiazol-2-thioessigsäure aufgelöst, und die gebildete Lösung wurde bei hohem Druck sterilisiert und zu jedem Fermentor bis zu 0,05% des Impfmaterials zugegeben und dann wurde 90 Stunden kultiviert.

Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und dann mit Filterhilfsmittel vermischt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden miteinander vereinigt, und es wurden 100 Liter Filtratgemisch erhalten. Die Filtrate wurden auf pH 3,0 mit wäßriger Natriumhydroxidlösung eingestellt und durch eine 12 Liter Amberlite* XAD-2 Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wäßrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde gesammelt und eingeengt auf 5,5 Liter. Nach Entfernung der sich gebildeten Verunreinigungen wurde Wasser zu dem Rückstand hinzugefügt, um 10 Liter Lösung zu erhalten. Die so erhaltene Lösung wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wäßriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und dann durch eine 3 Liter Amberlite® lRA-68 (Cl-Typ)-Säule gegeben. Nach Waschen der Säule mit 6 Liter Wasser wurde mit wäßriger Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter Lösung mit antimikrobiellem aktivem Material erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3.0 eingestellt, durch eine ein Liter Amberlite" XAD-2-Säule gegeben, und nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit wäßrigem 50%igem Aceton gewaschen. Es wurde etwa 400 ml wäßrige Lösung mit antimikrobiellem aktivem Material erhalten. Durch Lyopholisicrung der Lösung wurde etwa 18 g Rohprodukt der hergestellten Verbindung I erhalten.

Dann wurde 18 g des rohen Pulvers einer Säuler.-chromatographie unter Verwendung von etwa 800 ml DEAE-Sephadex* A-25 (Essigsäure-Typ) unterworfen. Die Säule war mit einer kleinen Menge 0.5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung gefüllt. Es wurde in die effektiven Komponenten fraktioniert. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt, durch eine 500 ml Amberlite« XAD-2-Säule gegeben, und nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit einer wäßrigen 25%igen Acetonlösung eluiert. Die erhaltenen Eluate wurden zum Trocknen eingedampft.

Dann wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanal: Wasser (7:3 Volumenverhältnis) verwendet, um den erhaltenen Rückstand des Produktes einer Säulenchromatographie unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (AviceF). präpariert mit einem Lösungsmittelgemisch der gleichen, vorstehend angegebenen Zusammensetzung, zu unterwerfen. Die erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel" SF aufgetragen, und mit einem Gemisch aus Isopropanol:n-Buianol: Essigsäure-.Wasser (21:3:7:9 Volumenverhältnis) entwickelt. Dann wurde Pyridinlösung von 0.25 % Ninhydrin aufgesprüht und anschließend erwärmt, um die Färbung zu entwickeln. Dann wurden die Fraktionen mit einem Rf-Wert von 0.39 gesammelt, die Fraktion im Vakuum bei etwa 45-50'C zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel*) unterworfen. Die Füllung war mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol:n-Butanol:Essigsäure:Wasser (21:3:7:9 Volumenverhältnis) präpariert. Die so erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde dann einer Dünnschichtchromatographie mit AviceF SF unter Verwendung des vorstehend genannten Lösungsmittelgemisches unterworfen und unter gleicher Nachbehandlung weiterverarbeitet. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0.39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Produktrückstand wurde mit mikrokristalliner Cellulosesäulenchromatographie unter Verwendune eines Lösungsmittelgemisches aus η Buianol:Essigsäure:Wasser (6:1.5:2.5 im Vnlnmenverhältnis) weitergereinigt. Die gereinigte aktive Fraktion wurde zur Trockne eingedampft und dann in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgenommen. Die Lösung wurde in einer Säule Sephadex* G-10 unter Verwendung von Wasser entwickelt. Die Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität wurden gesammelt und einer Dünnschichtchromatographie, wie schon vorstehend erläutert, unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol:Essigsäure:Wasser (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) unterworfen. Die Fraktionen mit Rf-Werten 0,32 wurden gesammelt, eingeengt und dann einer Lyophilisation unterworfen. Es wurden etwa 80 mg weiße 7-( 5-Amino-5-carboxyvaleramido")-3-( 5-carboxymethylthio-l,3.4-thiadiazol-2-yl)thiornethyl-7-methoxy- A³-cephem-4-carbonsäure erhalten.

Beispiel 2

H er siel lung von 7-(5-Amino-5-earboxyvaleramido)-3-(1 -methyl-1 H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-A'-cephem-4-carbonsäure Il:

Ein Kulturmedium, welches 1 % Stärke. 1 % Glukose. 1.5% Sojabohnenmehl. 0.5% Hefeexlrakl. 0.1% Dikaliumhydrogenpliosphat. 0.05% Magnesiumsulfat und 0.3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakagu.'hi-Flaschen mit jeweils 100 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120 C sterilisiert. Dann wurde jedes Medium mit Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft. Anschließend wurde 48 Stunden bei 30C kultiviert. Dann wurde das schon genannte Kulturmedium in zwei Liter Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml eingefüllt. Nach dein Slci ilisieren für 20 Minuten bei 120 C wurde jedes Medium mit 2 — 3% der vorstehend erhaltenen Kulturbrühe beimpft und anschließend weitere 24 Stunden bei 30"C kultiviert, um einen Impfansatz zu erhalten.

60 Liter eines Kulturmediums, welches 7 % Stärke. 2 % Glut'?!imehl. 2% Sqjabohnenöl. 0.8% Glycerin. 0,1% Casaminosäure. 0.01 % Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, wurde in zwei Liter Fermentern mit jeweils 10 ml Entschäumungsmittel gefüllt. Nach dem Sterilisieren für 30 Minuten bei 120'C wurde jedes Medium mit 8(X) ml des vorstehend hergestellten Impfansatzes versetzt, und anschließend wurde 24 Stunden bei 30 C kultiviert. Dann wurde i-Methyl-5-mercapto-lH-tetrazol in wäßriger Natriumhydroxidlösung aufgelöst. Die Lösung wurde bei hohem Druck sterilisiert und zu der Kulturbrühe hinzugefügt, um deren Konzentration auf 0.05% einzustellen. Das Gemisch wurde 90 Stunden weiter kultiviert.

Nach vollständiger Kultivierung wurde die so gebildete Kulturbrühe auf pH 2.0 eingestellt und dann mit Hilfsmittel zum Filtrieren unter Rühren versetzt, das Gemisch unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die erhaltenen Filtrate wurden vereinigt, und es wurden etwa 100 Liter Filtratgemisch erhalten.

Das Filtrat wurde auf pH 3.0 mit wäßriger Natriumhydroxidlösung eingestellt, durch eine 12 Liter Amberlite' XAD-2-Säule gegeben, und nach dem Waschen der Säule mit 30 Liter Wasser wurde die Säule mit 30 Liter einer wäßrigen 50%igen Acetonlösung eluiert. Das Eluat wurde auf 5,5 Liter eingeengt, und das Konzentrat wurde auf pH 3.5 mit verdünnter wäßriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und durch eine Dreiliter Amberlite' IRA-68 (CI-Typ)-Säule geleitet. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wäßrigen Lösung (pH 7,2). die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, fraktioniert. Es wurden etwa 5 Liier einer Lösung, die ein antimikrobiell aktives Material enthielt, erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine Einliter Amberlite" XAD-2-Säule gegeben, mit Wasser gewaschen und mit einer wäßrigen Lösung von 50%igem Aceton eluiert. Es wurde etwa 400 ml wäßrige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enthielt, gewonnen. Durch Lyophilisierung der Lösung wurde etwa 54 g des rohen Pulvers der hergestellten Verbindung II erhalten. Das rohe Pulver wurde einer Säulenchromatographie mit etwa 800 ml DEAE Sephade?·.*' A-25 (Essigsäure-Typ), gefüllt mit einer kleinen Menge 0.5 M Ammoniumbromid-EssigEäurepufferlösung, unterworfen, um die aktiven Komponenten zu fraktionieren. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt, durch eine 500 ml Amberlite⁸ XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer wäßrigen Lösung von 25%igem Aceton

eluiert. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft.

Der gebildete Rückstand wurde der Säulenchromatographic unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel") unterworfen, gefüllt mit einem Lösungsmittclgemisch aus Isopropanol:Wasser (7:3 Volumenverhältnis) unter Verwendung des Lösungsmittelgemisches mit der vorstehend angegebenen Zusammensetzung. Die erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde gesammelt, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel" SF aufgetragen, mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol:Essigsäure: Wasser (6:1.5:2.5 Volumenverhältnis) entwickelt und eine Lösung von 0.25% Ninhydrin in Pyridin wurde aufgesprüht, und anschließend wurde durch Erwärmen die Anfärbung entwickelt. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0.31 gesammelt. Die Fraktionen wurden unter vern ndertem Druck eingeengt und getrocknet. Der gebildet Riickstand wurde einer Säulenchromatographie mil , ,ikrokristallincr Cellulose (Avicel") unterworfen. Die Fa.. .ng war mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: n-Butanol:Essigsäure:Wasser (21:3:7:9 Volumenverhältnis) präpariert. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromalographie mit Avicel* SF mit dem Lösungsmittelgemisch mit der zuvor genannten gleichen Zusammensetzung unterworfen, wobei die gleiche Prozedur, wie vorstehend angegeben, angewendet wurde. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0.39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft.

Der so gebildete Rückstand wurde einer mikrokristallinen Cellulosesäulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol :Essigsäure: Wasser (6:1.5:2.5 Volumenverhältnis) unterworfen, um die effektive Komponente zu reinigen. Die so gereinigte aktive Fraktion wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Sephedex* G 10-Säule urler Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität wurden gesammelt und einer Dünnschichlchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (6:1.5:2.5 Volumenverhältnis), wie vorstehend angegeben, unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0.31 gesammelt, konzentriert und dann lyophilisiert. Es wurde etwa 60 mg weißes 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-( 1-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomeihyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäu- re erhalten.

Beispiel 3

Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramidö)-7-methoxy-3-(5-methyl-1.3.4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl- A³-cephem-4-carbonsäure III:

Ein Kulturmedium, welches 1 % Stärke. 1 % Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl. 0.5% Hefeextrakt. 0.1% Dikaliumhydrogenphosphat. 0.05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen mit je 100 ml gefüllt und 20 Minuten bei TlO^cC sterilisiert. Jedes Medium wurde dann mit Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft und 48 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Ein weiteres Kulturmedium, wie vorstehend beschrieben, wurde in Zvveiliter Sakaguchiflaschen mit je 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert. Jedes Medium wurde mit der vorstehend kultivierten Brühe mit einer 2-3%igen Konzentration be-

impft und dann 24 Stunden bei 30⁼C kultiviert, wodurch eine Animpfkukur erhalten wurd::.

Separat wurden je 60 Li'er des Kulturmediums, das 7 % Stärke. 2 % Glutenr.shl. 2 % Sojabohnenmehl. 0.8 % Glycerin. 0.1 % Casaminsäure. 0.01 % Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in zwei 100 Liter Fermentern zusammen mit 10 ml Entschäumungsmittel gefüllt. Es wurde 30 Minuten bei 120 ⁰C sterilisiert und mit 800 ml der Animpfungskultur beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30 ⁼C kultiviert. Dann wurde 2-Mercapto-5-methyl- in 1.3.4-thiadiazol in wäßriger Natriumhydroxidlösung gelöst und unter hohem Druck sterilisiert und zu der Kulturbrühe hinzugegeben, so daß die Konzentration davon 0.05 % in der Brühe betrug, worauf 90 Stunden weiter kultiviert wurde. !5

Nach beendeter Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2.0 eingestellt und mit Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert und die Filtrate wurden vereinigt und ergeben etwa 100 Liter Filtratgemisch.

Das Filtrat wurde auf pH 3.0 eingestellt durch Zugabe von wäßriger Natriumhydroxidlösung und dann durch eine 12 Liter Amberlite" XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen. Es wurde mit 30 Liter wäßrigem 50%igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde auf 5.5 Liter eingeengt, und das Konzentrat wurde auf pH 3.5 mit verdünnter wäßriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und durch eine 3 Liter Amberlite' IRA-68 (Cl-Typ) Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen. Es wurde mit einer wäßrigen Lösung (pH 7.2). die 1 M Natriumnitrat und 0.1 M Natriuma':etat enthielt, eluiert. Es wurde etwa 5 Liter eines antimikrobiell aktiven Materials erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3.0 eingestellt und durch eine Einliter·Amberlite- XAD-2-Säule gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit einer wäßrigen Lösung von 50%igem Aceton eluiert. Es wurde etwa 400 ml wäßrige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enthielt, gewonnen. Das Produkt wurde lyophilisiert.

Lnter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:2 Volumenverhältnis) wurde der gebildete Rückstand einer Säulenchromatographie unterworfen unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel*). gefüllt mit dem Lösungsmittelgemisch der vorstehend angegebenen gleichen Zusammensetzung. Dann wurden die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen fraktioniert und tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte von Avicel* SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch Isopropanckn-Butanol:Essigsäure:Wasser (21:3:7:9 im Volumenverhältnis) entwickelt. Eine Pyridinlösung von 0,25% Ninhydrin wurde übergesprüht und unter Erwärmen die Anfärbung entwickelt. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0.43 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockne bei 45-50 C gebracht. Der erhaltene Rückstand wurde der Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (AviceP) unterworfen. Die Säule war präpariert mit einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril: Wasser (7:3 Volumenverhältnis). Die erhaltene antimikrobiell aktive Fraktion wurde einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel* SF. wie bei der vorstehenden Prozedur unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0.43 gesammelt und zur Trockne eingedampft. Es wurde 0.78 g rohes Pulver erhalten.

Das Pulver wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex" G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt.

Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden fraktioniert und einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (4:1:2 Volumenverhältnis), wie vorstehend angegeben, unterworfen. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 wurden gesammelt, eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 82 mg weiße 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3.4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure erhalten.

Beispiel 4

Durch Anwendung des gleichen Verfahrens, wie im Beispiel 1 angegeben, jedoch unter Verwendung einer Lösung von bis(5-Carboxymethylthio-l,3.4-thiadiazol-2-yl)disulfid, hergestellt durch Auflösen des Disulfids in wasserhaltigem Methanol und Sterilisation durch Filtration mittels Milliporefilter in diesem Beispiel anstelle der Lösung von 5-Mercapto-1.3.4-thiadiazol-2-thioessigsäure, hergestellt in Wasser unter Verwendung wäßriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, wurde 23 g Rohpulver der hergestellten Verbindung 1 erhalten. Durch Reinigen des Produktes, wie im Beispiel 1 angernben, wurde etwa 45 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvalerarmdoJ-S-fS-carboxymethylthio-l^^-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure (Verbindung 1) erhalten.

Beispiel 5

Durch Anwendung des gleichen Verfahrens, wie im Beispiel 2 angegeben, jedoch unter Verwendung einer Lösung von bis(l -Methyl-lH-tetrazo!-5-yl)disulfid. hergestellt durch Auflösen des Disulfids in Wasser enthaltendem Methanol und Sterilisation durch Filtration mittels Milliporefilter in diesem Beispiel anstelle einer Lösung von l-Methyl-S-mcrcapto-IH-'ctrazol. hergestellt durch Auflösen des Tetrazols in Wasser unter Verwendung einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, wurde etwa 26 g des roh'en Pulvers der Verbindung II erhalten. Durch Reinigen des Produktes, wie im Beispiel 2 angegeben, wurde etwa 37 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5 - yl)thiomethyl - 7 - methoxy-A'-ccphem -4 -carbonsäure (Verbindung II) erhalten.

Beispiel 6

Durch Anwenden des gleichen Verfahrens wie im Beispiel 3 angegeben, wurde durch Einsetzen einer Lösung von bis(5-Methyl-1.3.4-thiadiazol-2-yl)disulfid. hergestellt durch Auflösen des Disulfids in wasserhaltigen-Methanol, und Sterilisation durch Filtration mittel; Milliporfilter in diesem Beispiel anstelle der Lösung vor 2-Me^aPtO-S-InCIhVl-1.3.4-thiadiazol. hergestellt in Was ser unter Verwendung einer wäßrigen Natriumhydroxid lösung und Sterilisation bei hohem Druck, etwa 19 j rohes Pulver der Verbindung III erhalten. Durch Reini gen des Produktes, wie im Beispiel 3 angegeben, wurdi etwa 50 mg 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-meth oxy - 3 - (5 - methyl -1,3.4 - thiadiazol - 2 - yl) thiomethyl-Δ'¹ cephem-4-carbonsäure (Verbindung III) erhalten.

Beispiel 7

Herstellung von 7-(5-Amino-5-auboxyvalenimido)-"? melhoxy-3-(l.3.4-thiadiazol-2-yl)thiomcthyl-A^J-cephem 4-carbonsäure IV.

Ein Kulturmedium, welches 1 % Stärke, 1 % Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthiek, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen mit je 100 ml gefüllt, 20 Minuten bei 120°C sterilisiert und mit dem Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Siamm beimpft. Anschließend wurde 48 Stunden bei 30 °C kultiviert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde in Zweiliter Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert. Dann wurde mit 2-3 % der Kulturbrühe, die gemäß dem vorstehenden Verfahren hergestellt wurde, angeimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30°C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.

Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, das 7 % !5 Stärke. 2% Glutenmehl. 2% Sojabohnenmehl, 0,8% Glycerin. 0.1 % Casaminosäure, 0.01 % Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid in zwei 100 Liter Fermentern, zusammen mit 10 ml Entschäumungsmittel gefüllt und 30 Minuten bei 120^GC sterilisiert. Dann wurde mit 800 ml der A nimpfkultur beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30 °C kultiviert. Dann wurde eine Lösung von 2-Mercapto-1.3.4-thiadiazol. hergestellt durch Auflösen des Thiadiazols in Wasser unter Verwendung einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung und Sterilisation unter hohem Druck, zu der Kulturbrühe hinzugefügt, so daß die Konzentration des Thiadiazols 0,05% betrug. Der Ansatz wurde dann 90 Stunden weiter kultiviert.

Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2.0 eingestellt und unter Rühren mit Filterhilfsmittel versetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert und die Filtrate wurden vereinigt, wodurch etwa 100 Liter des Filtratgemischs erhalten wurden.

Das Filtrai wurde, auf pH 3.0 eingestellt, durch eine y> 12 Liter Amberlite" XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen. Es wurde mit 30 Liter wäßriger 50%iger Acetonlösung eluiert. Die Eluate wurden bis auf 5.5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 3.5 eingestellt und durch eine 3 Liter Amberlite* IRA-68 (Cl-Typ)-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen. Eluiert wurde mit einer wäßrigen Lösung (von pH 7,2). die 1 M Natriumnitrat und 0.1 M Natriumacelat enthielt. Es wurden etwa 5 Liter einer Lösung, die antimikrobiell aktives, Material enthielt, erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, durch eine Einliter-Amberlite* XAD-2-Säule gegeben und mit Wasser gewaschen. Es wurde mit einer wäßrigen 50%igen Acetonlösung gewaschen. Es wurden etwa 400 ml wäßrige Lösung, die das antimikrobiell aktive Material enthielt, gewonnen. Die Lösung wurde lyophilisiert. Unter Verwendung eines Lösungsrnittelgemischcs aus n-Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:2 Volumenverhältnis) wurde der gebildete Rückstand einer Säulenchromatographie unterworfen unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel") und mit dem Lösungsmittelgemisch der gleichen vorstehenden Zusammensetzung präpariert. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden fraktioniert, tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel" gebracht, entv^ickelt unter Verwendung eines Lösungsmittelgemischs aus Isopropanol :n-Butanol: Essigsäure : Wasser (21 : 3 : 7:9) im Volumenverhältnis. Dann wurde eine Pyridinlösung von 0.25% Ninhydrin aufgesprüht und durch Erwärmen die Anfärhung entwickelt. Hierauf wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert b5 0.39 gesammelt und im Vakuum bei 45 — 50 C zur Trockne eingedampft. Der Produktrückstand wurde einer Säulenchiomatographic mit mikrokristallinerCellulose (Avicel*; unterworfen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril: Wasser (7:3 Volumenverhältnis) präpariert. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden ebenfalls einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel* SF wie in dem vorstehenden Verfahren unterworfen. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt, im Vakuum zur Trockne eingedampft. Es wurde 0.92 g rohes Pulver erhalten.

Das rohe Pulver wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und dann einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Amberlite* CG-50 (H-Typ) mit destilliertem Wasser unterworfen, und die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephedex^? G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobieHe Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven F aktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie un.er Verwendung eines Gemisches aus n-iiutanol: [.^.,!«säure : Wasser (4:1:2 Volumenverhältnis), wie vorsic. _nd beschrieben, unterzogen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0.38 gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Es wurden weiße 7-(5-Amino-5-carbo\v"'ieramido)-7-methoxy-3-(l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-A'-cephem-4-carbonsäure erhalten.

Beispiel 8

a) Ein Kulturmedium, welches 1 ',. Stärke. 1 % Glukose, 1.5% Sojabohnenmehl. 0.5% Hefeextrakt, 0.1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0.05 % Magnesiumsulfat und 0,3 % Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchiflaschen in einer Menge von je 100 ml gefüllt. Jede Flasche wurde 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Jedes Medium wurde mit Streptomyces oganonensis Y-G 19Z-Stamm beimpft und 48 Stunden bei 30 C kultiviert.

Das Kulturmedium wurde außerdem in Zweiliter Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 400 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Der Ansatz wurde mit 2 — 3% der Kulturbrühe, die wie vorstehend hergestellt wurde, beimpft und 24 Stunden bei 30 C kultiviert. Es wurde so eine Animpfkultur erhalten.

Separat 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7% Stärke, 2% Glutenmehl, 2% Sojabohnenmehl, 0.8% Glycerin, 0,1 % Casaminosäure. 0,01 % Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid in zwei 100 Liter Fermentern zusammen mit je 10 ml Antischaummittel versetzt, sterilisiert während 30 Minuten bei 120 C. Es wurde mit 800 ml der Animpfkultur. die gemäß der vorstehenden Vorschrift hergestellt worden war, beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Dann wurde eine Lösung von 5-Mercapto-1-methyl-l H-tetrazol. hergestellt aus einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung und Sterilisation bei hohem Druck, zu der Kulturbrühe so hinzugegeben, daß die Konzentration des Tetrazole 0,05% betrug. Die Kultivierung wurde noch 90 Stunden ausgeführt.

Nachdem die Kultivierung vollständig war. wurde die Kulturbrühe auf pH 2.0 eingestellt und mit Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde mit einer Filterpresse filtriert und die erhaltenen Filtrate wurden vereinigt. Es wurden 100 Liter Filtratgemiseh mit einem Gehalt an 100 meg ml an 7-(5-Amino-5-carhoxyvaleramido)-7-methoxy-3-(l-rnethyl-l H-tetrazolöyl)thiomelhyl-A"¹-cephem-4-carbonsäure erhalten.

b) Das Filtrai wurde auf pH 3.0 eingestellt und durch eine 12 Liter Amberlite^F XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser ucwaschcn und mit 30

Liter wäßrigem 50 %igen Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf 5,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 7,5 unter Verwendung wäßriger Natriumhydroxidlösung eingestellt, und die hergestellte Verbindung wurde isoliert.

Beispiel 9

a) Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l-methyl-l H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-^ncarbonsäure.

Ein Kulturmedium, welches 1 % Stärke, 1 % Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 5(X) ml Sakaguchiflaschen in jeweils einer Menge von )00 ml eingefüllt. Jedes Medium wurde 20 Minvten bei 120°C sterilisiert. Das sterik; Kulturmedium wurde mit dem Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft. Es wurde 48 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Das vorstehend hergestellte Kulturmedium wurde auch in zwei Liter Sakaguchifiaschen in einer Menge von jeweils 400 ml eingefüllt. Nach dem Sterilisieren des Mediums für 20 Minuten bei 120°C wurde das Kulturmedium mit der im vorstehenden Verfahren erhaltenen Kulturbrühe in einer Menge von 2- 3 % beimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30^c'C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.

Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7 % Stärke, 2 % Glutenmehl, 2 % Sojabohneiimehl, 0,8 % Glycerin, 0,1 % Casaminosäure, 0,01 % Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in zweihundert Liter Fermentern zusammen mit je 10 ml Entschäumungsmittel eingefüllt. Jedes Kulturmedium wurde für 30 Minuten bei 120°C sterilisiert. Es wurde mit 800 ml der nach der vorstehenden Arbeitsweise hergestellten Animpfkultur beimpft. Dann wurde zu jedem Fermenter eine Lösung von i-Methyl-5-mercapto-lH-tetrazol, hergestellt durch Auflösen in wäßriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisieren unter hohem Druck, so da3 der Gehalt 0,05% betrug. Dann wurde die Kulturbrühe 90 Stunden weiter kultiviert. Nach beendeter Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Filterhilfsmittel unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde durch eine Filterpresse filtriert, und die Filtrate wurden zu etwa 100 Liter Filtratgemisch vereinigt.

Das Gemisch wurde auf pH 3,0 durch die Zugabe von wäßriger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Dann wurde durch eine 12 Liter-Amberlite® XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen. Es wurde mit 30 Liter wäßrigem 50%igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf 5,5 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 3,5 mit verdünnter wäßriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und durch eine 3 Liter Amberlite® IRA-68 (Cl-Typ) Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit wäßriger Lösung (pH 7,2), die 1 η Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter Lösung, die ein antimikrobiell aktives Material'enthielt, gewonnen. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, und sie wurde durch eine 1 Liter Amberlite® XAD-2-Säule bo gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen. Es wurde mit wäßrigem 50%igem Aceton eluiert.

Es wurde etwa 400 ml wäßrige Lösung mit antimikrobiell aktivem Material erhalten, welches lyophilisiert wurde. Es wurden etwa 54 g rohes Pulver erhalten. Das b5 rohe Pulver wurde einer Säulenchromatographie unterworfen. Es wurden hierzu 800 ml DEAE Sephadex* A-25 (Essigsäure-Typ) verwendet und mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung gefüllt. Es wurden die effektiven Fraktionen isoliert. Die so gesammelten antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden durch eine 500 ml Amberlite® XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit wäßrigem 25%igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde dann im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das getrocknete Produkt'wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol: Wasser (7:3 im Volumenverhältnis) mittels mikrokristalliner Cellulose (Avicel®) unterworfen. Die Säule war mit dem Lösungsmittelgemisch der vorstehend angegebenen Zusammensetzung gefüllt. Die Fraktionen mit antimikrobieller Aktivität wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel* SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) entwickelt.

Eine Pyridinlösung von 0,25 % Ninhydrin wurde aufgesprüht und die Anfärbung wurde durch Erwärmen entwickelt. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 wurden gesammelt, im Vakuum bei 45 — 50⁰C zur Trockene eingedampft und einer Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel*) unterworfen. Die Säule enthielt ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol :n-Butanol:Essigsäure:Wasser (21:3:7:9 im Volumenverhältnis). Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden dann ausgewählt und einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel* SF unterworfen. Hierbei wurde das gleiche vorstehende Verfahren angewendet. Die Fraktionen mit dem Rf-Wcrt 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockene eingedampft.

Das getrocknete Produkt wurde in eine Chromatographiesäule mit mikrokristalliner Cellulose gegeben.

Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (6:1.5:2,5 im Volumenverhältnis) verwendet, um eine Reinigung der effektiven Komponente zu erzielen. Die gereinigten aktiven Fraktionen wurden durch Konzentration getrocknet, in einer kleinen Menge destilliertem Wasser gelöst und in einer Säule mit Sephadex* G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft, und die effektiven Fraktionen wurden augewählt und einer Dünnschichtchromatographie unterworfen, wie dies vorstehend erläutert wurde.

Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure : Wasser (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) verwendet. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,31 wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert. Es wurde etwa 60 mg weiße 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(1-methyl-1 H-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure erhalten.

Beispiel 10

a) Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl- A³-cephem-4-carbonsäure.

Ein Kulturmedium, welches 1 % Stärke, 1 % Glukose. 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt. 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sakaguchifiaschen in einer Menge von jeweils 100 ml eingefüllt. Jedes Medium wurdo 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Das Kulturmedium wurde dann mit dem Strcptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm beimpft. Anschließend wurde 48 Stunden bei 3O⁰C kultiviert.

Das vorstehende Kulturmedium wurde in 2 Liter

Sakaguchiflaschen in einer Menge von jeweils 400 ml eingefüllt und 20 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert.

Dann wurde mit 2—3 % Kulturbrühe, gemäß dem vorstehenden Verfahren erhalten, angeimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30 ⁰C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.

Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7 % Stärke, 2 % Glutenmehl, 2 % Sojabohnenmehl, 0,8 % Glycerin, 0,1% Casaminosäure, 0,01% Ferrisulfat imd 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200 Liter Fermentern zusammen mit 10 ml Entschäumungsmittel gefüllt und 30 Minuten bei 120°C sterilisiert.

Dann wurde mit 800 ml Animpfkultur, hergestellt nach dem vorstehende!: Verfahren, geimpft. Es wurde 24 Stunden bei 30 ⁰C kultiviert. In jeden Fermenter wurde eine Lösung von 2-Mercapto-5-methyl-l,3,4-thiad-azoL hergestellt mit wäßriger Natriumhydroxidlösung und Sterilisieren bei hohem Druck, hinzugegeben, so daß ihr Gehalt 0,05 % der Kulturbrühe betrug. Die Kultivierung wurde 90 Stunden fortgesetzt.

Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kulturbrühe auf pH 2,0 eingestellt. Es wurde Filterhilfsmittel unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt und ergaben etwa 100 Liter Filtratgemisch.

Das Filtrat wurde auf pH 3,0 durch die Zugabe von wäßriger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Die Lösung wurde durch eine 12 Liter Amberlite* XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wäßrigem 50%igem Aceton eluiert. Das Eluat wird konzentriert bis zu 5,5 Liter, auf pH 3.5 mit verdünnter wäßriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und in eine 3 Liter Amberlite* IRA-68 (Cl-Typ) Säule gefüllt. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wäßrigen Lösung (pH 7,2), die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurden etwa 5 Liter einer Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, gewonnen. Die so erhaltene Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt und in eine 1 Liter Amberlite® XAD-2-Säule eingefüllt. Die Säule wurde mit 50 %igem wäßrigen Aceton eluiert. Es wurden etwa 400 ml wäßrige Lösung, die das antimikrobielle Material enthielt, gewonnen. Die Lösung wurde lyophilisiert. Das Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (4:1:2 im "Volumenverhältnis) unter Verwendung von mikrokristalliner Cellulose (Avicel*) und einer Füllung mit dem gleichen LösungsmiUelgemisch, wie vorstehend angegeben, unterworfen. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus Avicel* SF aufgetragen, und es wurde mit einem LösungsmiUelgemisch Isopropanol:n-Butanol:Essigsäure:Wasser (21:3:7:9 im Volumenverhältnis) entwickelt. Mit einer Pyriciinlösung von 0,25% Ninhydrin wurde besprüht, um durch Erwärmen anzufärben. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 gesammelt und zur Trockene unter vermindertem Druck bei 45 — 50°C eingedampft. Das erhaltene Produkt wurde der Säulenchromatographie mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel*), gefüllt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Acetonitril: Wasser (7:3 im Volumenverhältnis) unterworfen. Die erhaltenen antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie auf Avicel* SF, wie bei der vorstehenden Arbeitsweise, unterworfen. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 wurden gesammelt und zur Trockene unter vermindertem Druck eingedampft. Es wurden 0,78 g eines rohen Pulvers erhalten.

Das Produkt wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex* G 10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie, wie vorstehend angegeben, unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) unterworfen. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,43 gesammelt, eingeengt und lyophilisiert. Es wurde 82 mg weiße 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-5-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-A³-cephem-4-carbonsäure erhalten.

Beispiel 11

Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl- 7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure:

Ein Kulturmedium, welches 1 % Stärke, 1 % Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in eine 500 mi Sakaguchiflasche mit jeweils 100 ml gefüllt und 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde dann mit dem StreptomycesoganonensisY-G^Z-Stamm beimpft. Es wurde anschließend 48 Stunden bei 30⁰C kultiviert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde in 2000 ml Sakaguchiflaschen jeweils mit 400 ml gefüllt, und jedes Kulturmedium wurde 20 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert. Dann wurde mit 2-3% der Kulturbrühe, hergestellt nach dem vorstehenden Verfahren, beimpft und anschließend 24 Stunden bei 3O⁰C kultiviert, um eine Animpfkultur zu erhalten.

Separat wurden 60 Liter eines Kulturmediums, welches 7 % Stärke, 2 % Glutenmehl, 2 % Sojabohnenmehl, 0,8 % Glycerin, 0,1% Casaminosäure, 0,01 % Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid enthielt, in 200 Liter Fermentern zusammen mit 10 ml Entschäumungsmittel gefüllt. Jedes Medium wurde 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert und mit 800 ml der Animpfkultur, hergestellt nach dem vorstehenden Vei fahren, geimpft. Anschließend wurde 24 Stunden bei 30 °C kultiviert.

Dann wurde in jeden Fermenter eine Lösung von bis(5-Carboxymethylthio-1,3.4-thiadiazol-2-yl)-disulfid, hergestellt durch Auflösen des Disulfids in wasserhaltigem Methanol, und Sterilisieren durch Filtration unter Verwendung eines Milüpore-Filters, in einer solchen Menge zugefügt, daß der Gehalt 0,05 % in der Kulturbrühe betrug. Die Kultivierung wurde 90 Stunden durchgeführt. Nach beendeter Kultivierung wurde die Kuiturbrühe auf pH 2,0 eingestellt und mit Filterhilfsmittel unter Rühren versetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt. Es wurden etwa 100 Liter eines Filtratgemisches erhalten.

Das Filtrat wurde auf pH 3.0 durch die Zugabe einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung eingestellt. Es wurde die Lösung in eine 12 Liter Amberlite® XAD-2-Säule eingefüllt. Die Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 30 Liter wäßrigem 50%igem Aceton eluiert. Das Eluat wurde bis auf 5.5 Liter eingeengt. Nach Entfernung der gebildeten unlöslichen Anteile wurde Wasser zu dem Konzentrat hinzugefügt, um 10 Liter Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde auf pH 3.5 mit verdünnter wäßriger Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt, durch eine 3 Liter Amberlite^ IRA-68 (Cl-T yp)-

Säule gegeben. Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen und mit einer wäßrigen Lösung (pH 7,2) die 1 M Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt, eluiert. Es wurde etwa 5 Liter Lösung erhalten, die antimikrobiell aktives Material enthielt. Die Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt, in eine 1 Liter Amberlite* XAD-2-Säule gefüllt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit wäßrigem 50%igen Aceton eluiert. Es wurde etwa 400 ml wäßrige Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthielt, erhalten. Durch Lyophilisieren der wäßrigen Lösung wurde etwa 23 g rohes Pulver erhalten. Dann wurde 23 g des rohen Pulvers einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 800 ml DEAE-Sephadex* A-25 (Essigsäure-Typ), gefüllt mit einer kleinen Menge 0,5 M Ammoniumbromid-Essigsäurepufferlösung, unterworfen, um die effektiven Komponenten abzutrennen. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und in eine 500 ml Amberlite® XAD-2-Säule gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen. Es wurde mit wäßrigem 25%igen Aceton eluiert. Das Eluat wurde zur Trockene im Vakuum eingedampft. Das Produkt wurde einer Säulenchromatographie mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol:Wasser (7:3 im Volumenverhältnis) unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel*) unterworfen, wobei das Lösungsmittelgemisch verwendet wurde, das die gleiche Zusammensetzung wie bei der vorstehenden Fraktionierung der antimikrobiell aktiven Fraktionen hatte. Die so erhaltenen Fraktionen wurden tropfenförmig auf eine Dünnschichtplatte aus AviceP SF aufgetragen und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol :n-Butanol: Essigsäure: Wasser (21:3:7:9 im Volumenverhältnis) entwickelt. Dann wurde eine Pyridinlösung von 0.25% Ninhydrin aufgesprüht und die Anfärbung durch Erhitzen entwickelt. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0.39 gesammelt, zur Trockene unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde einer Säulenchromatographie, mit mikrokristalliner Cellulose (Avicel"⁵·) gefüllt, unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol:n-Butanol:Essigsäure:Wasser (21:3:7:9 im Volumenverhältnis) verwendet. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und einer Dünnschichtchromatographie auf einer Avicel® SF Platte unterworfen. Das Lösungsmittelgemisch hatte die gleiche Zusammensetzung wie das vorstehende Gemisch. Es wurde hierbei, wie vorstehend schon beschrieben, verfahren. Die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockene eingedampft.

Das Konzentrat wurde mittels Säulenchromatographie unter Verwendung mikrokristalliner Cellulose und eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (6:1.5:2.5 im Volumenverhältnis) gereinigt. Die gereinigten aktiven Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge destilliertem Wasser aufgenommen und mit einer Säule aus Sephadex® G-10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie, wie vorstehend angegeben, unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol:Essigsäure:Wasser (6:1,5:2,5 im Volumenverhältnis) verwendet. Die Fraktionen mit einem Rf-Wert 0,32 wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisien. Es wurden etwa 45 mg weiße 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-1.3.4-thiadiazoI-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-A³-cephem-4-carbonsäure erhalten.

Beispiel 12

Herstellung von 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-methoxy - 3 - (1,3,4 - thiadiazol - 2 - yl) - thiomethyl - A¹ -c< phem-4-carbonsäure:

Ein Kulturmedium, welches 1 % Stärke. 1 % Glukosi 1,5% Sojabohnenmehl, 0,5% Hefeextrakt. 0,1% D: kaliumhydrogenphospha'i, 0,05% Magnesiumsulfat un 0,3% Natriumchlorid enthielt, wurde in 500 ml Sak guchiflaschen mit jeweils 100 ml gefüllt und 20 Minute bei 12O⁰C sterilisiert. Dann wurde jedes Kulturmediu mit dem Streptomyces oganonensis Y-G19Z-Stamm be impft. Anschließend wurde 48 Stunden bei 30 °C kulti viert. Ein weiteres vorstehendes Kulturmedium wurde 2 Liter Sakaguchiflaschen mit jeweils 400 ml gefüllt un 20 Minuten bei 120"C sterilisiert. Jedes Kulturmcdiur wurde mit der Kulturbrühe beimpft, die vorstehend hei gestellt worden ist. Es wurde 24 Stunden bei 30⁰C kulti viert, um eine Animpfkultur zu erhalten. Separat wurde: 60 Liter Kulturmedium, die 7% Stärke, 2% Glutenmeh 2% Sojabohnenmehl, 0.8% Glycerin, 0.1 % Casamin säure, 0,01 % Ferrisulfat und 55 g Natriumhydroxid en hielt, in 200 Liter Fermentern zusammen mit 10 ml En schäumungsmittel gefüllt und 30 Minuten bei 120 sterilisiert. Jedes Kulturmedium wurde dann mit 800 der Animpfkultur beimpft und anschließend 24 Stunde bei 30⁰C kultiviert. Dann wurde eine Lösung von 2-Me capto-l,3,4-thiadiazol, hergestellt mit wäßriger N triumhydroxidlösung und Sterilisieren bei hohem Druck zu jedem Fermenter in einer solchen Menge gegeben, dal der Gehalt 0,05 % in der Kulturbrühe betrug.

Dann wurde die Kultivierung 90 Stunden fortgesetz

Nach vollständiger Kultivierung wurde die Kultu brühe auf pH 2.0 eingestellt und mit Filterhüfsmitti unter Rühren vermischt. Das Gemisch wurde unter Ver wendung einer Filterpresse filtriert. Die Filtrate wurde vereinigt, und es wurden etwa 100 Liter Filtratgemisc erhalten. Das Filtrat wurde durch Zugabe einer wäß rigen Natriumhydroxidlösung auf pH 3.0 eingestellt un in eine 12-Liter Amberlite* XAD-2-Säule gefüllt. Di Säule wurde mit 30 Liter Wasser gewaschen und mit 31 Liier wäßrigem 50%igen Aceton eluiert. Das EIu wurde auf 5,5 Liter eingeengt, auf pH 3.5 mit verdünnte wäßriger Chlorwasserstoffsäure eingestellt und dann i eine 3-Liter Amberlite® IRA-68 (Cl-Typ) Säule gegeben Die Säule wurde mit 6 Liter Wasser gewaschen. Eluier wurde mit einer wäßrigen Lösung (pH 7.2), die 1 Natriumnitrat und 0,1 M Natriumacetat enthielt. E wurden 5 Liter Lösung, die antimikrobiell aktives Mate rial enthält, gewonnen. Die Lösung wurde auf pH 3,( eingestellt, in eine 1-Liter Amberlite® XAD-2-Säule ge geben. Die Säule wurde mit Wassci gewaschen und rn 50%igem Aceton eluiert. Es wurden etwa 400 ml wäßrig Lösung, die antimikrobiell aktives Material enthiel welches lyophilisiert wurde, erhalten.

Das erhaltene Produkt wurde einer Säulenchromato graphie mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol Essigsäure : Wasser (4 :1 : 2 im Volumenverhältnis) unte Verwendung mikrokristalliner Cellulose (Avicel®) al Füllung unterworfen, wobei das Lösungsmittelgemiscl mit der gleichen vorstehend angegebenen Zusammen setzung Anwendung fand, um die antimikrobiell aktive: Fraktionen auszuwählen.

Die Fraktionen wurden tropfenweise auf eine Dünn schichtplatte aus Avicel® SF aufgetragen, und es wurd mit einem Lösungsmittelgemisch aus Isopropanol:η Butanol:Essigsäure:Wasser (21:3:7:9) entwickelt. Ein Pyridinlösung von 0,25 % Ninhydrin wurde aufgesprühl

und durch Erwärmen wurde angerärbt. Dann wurden die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockene bei 45 — 50 °C eingedampft. Dann wurden die Fraktionen einer Dünnschichtchromatographie mit Avicel® SF in der vorstehend beschriebenen Weise unterworfen, um die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,39 zu sammeln. Die Fraktionen wurden zur Trockene eingedampft, wobei 0,92 rohes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde in einer kleinen Menge von destilliertem Wasser aufgelöst und einer Säulenchromatographie mit destilliertem Wasser unter Verwendung von Amberlite® CG-50 (H-Typ) unterworfen, um die antimikrobiell aktiven Fraktionen auszuwählen. Die Fraktionen wurden dann konzentriert und lyophili-

siert. Das Produkt wurde in einer kleinen Menge aus destilliertem Wasser aufgelöst und in einer Säule aus Sephadex® G-10 unter Verwendung von destilliertem Wasser entwickelt. Die antimikrobielle Aktivität jeder Fraktion wurde geprüft. Die effektiven Fraktionen wurden einer Dünnschichtchromatographie in der schon vorstehend erläuterten Weise unterworfen. Es wurde ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol: Essigsäure: Wasser (4:1:2 im Volumenverhältnis) verwendet, um die Fraktionen mit dem Rf-Wert 0,38 zu sammeln. Die Fraktionen wurden eingeengt und lyophilisiert, und dabei wurden 75 mg weiße 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-T-methoxyO-O^-thiadiazol-Z-yO-thiomethyl-A'-cephem-4-carbonsäure erhalten.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von 7-Methoxycephalosporinderivaten mit der Formal (A) '■>

   OCH₃

   (A)

   HOOC CH-(CH ₂),CONH- —^rSi H₂N^ // 0 COOM

   ¹⁰