DE2455683A1 - Verfahren zur herstellung von deacetoxycephalosporin c - Google Patents
Verfahren zur herstellung von deacetoxycephalosporin cInfo
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Description
6C00 ίν.·^·ίΐ.; -ΐί-ίί:^ 40
SCHLEiSSHEIMERSTH. 299
SCHLEiSSHEIMERSTH. 299
X-4095
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C. Deacetoxycephalosporin C eignet
sich zur Herstellung von T-Aminodeacetoxycephalosporansäure,
die abgekürzt auch als 7-ADCA bezeichnet wird.
Deacetoxycephalosporin C, das die Strukturformel
OH
■I I
HOOC-CH-(CH0) ,,-C-N
COOH
hat, wird bisher durch Hydrogenolyse von Cephalosporin C hergestellt, wie dies in. US-PS 3 124 576 beschrieben ist.
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Deacetoxycephaiosporin C wird auch als Desacetoxycephalosporin C bezeichnet, womit ζum Ausdruck gebracht wird, daß
die in Stellung 3 des Dihydrothiazinrings von Cephalosporin C befindliche Acetoxymethylgruppe durch eine 3-Methylgruppe
ersetzt ist. Deacetoxycephaiosporin C wird nach dem Cephamnomenclatursystem ferner als 7-{5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-methyl-3-cephera-4-carbonsäure
bezeichnet.
Cephalosporin C, das als erstes endeckte Cephalosporin C
(E. P. Abraham et al., US-PS 3 093 638), wird hergestellt, indem man Cephalosporium acremonium züchtet. Bis vor
kurzem waren die Cephalosporia die einzigen Mikroorganismen, von denen man wußte, daß sie Metaboliten produzieren, die den
Cephalosporinkern aufweisen, nämlich einen mit einem Dihydrothiazinring verschmolzenen ß-Lactamring. Vor kurzem berichteten
R. Nagarajan et al., J. Amer. Chem. Soc, 93, 2308-2310
(1971) jedoch von der Isolierung neuer Cephalosporinverbindungen aus der Fermentationsbrühe zweier Streptomyceten,
nämlich S. lipmanii and S. clavuligerus. Die erstgenannte Streptomycete produziert 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-acetoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure
(7-Methoxycephalosporin C), und die letztgenannte Streptomycete bildet sowohl 7-(5-Amino~5-carboxyvaleramido)-7-raethoxy-3-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure
als auch 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-S-carbamoyloxymethyl-S-cephem^-
carbonsäure.
Deacetoxycephaiosporin C wurde bisher noch nicht durch Züchten einer Streptomycete produziert.
Es wurde nun gefunden, daß S. lipmanii und S. clavuligerus einen weiteren Metaboliten, nämlich Deacetoxycephaiosporin C,
produzieren, der sich von den anderen Metaboliten abtrennen und in hoher Reinheit isolieren läßt.
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Deacetoxycephalosporin C ist eine wichtige Cephalosporinverbindung.
Mit ihr lassen sich beispielsweise die gutbekannten N-Deacylierungreaktionen durchführen, bei denen
die 7-(S-Amino-S-carboxyvaleryl)-Seitenkette unter Bildung
von 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) entfernt
wird. Die N-Deacylierung läßt sich mit Nitrosylchlorid nach
dem in US-PS 3 188 311 beschriebenen Verfahren oder nach dem
bekannten Spaltverfahren mit Phosphorpentachlorid gemäß
ÜS-PS 3 549 628, 3 575 970 und 3 697 515 durchführen. 7-ADCA
ist ein wertvolles Zwischenprodukt, daß sich zur Herstellung einer Reihe von 7-Acylamidodeacetoxycephalosporansäuren,
insbesondere dem Antibioticum Cephalexin, acylieren läßt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin
C besteht nun darin, daß man S. lipmanii NRRL 3584 und S. clavuligerus NRRL 3585 in einem wässrigen
Nährkulturmedium submers unter aeroben Fermentationsbedingungen züchtet. .
Deacetoxycephalosporin C wird zusammen mit den anderen gleichzeitig gebildeten Antibiotica aus der filtrierten.
Fermentationsbrühe entfernt und aus dem erhaltenen Gemisch Chromatographisch abgetrennt. Durch weitere Chromatographie über Cellulose wird das erhaltene Deacetoxycephalosporin
C gereinigt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Deacetoxycephalosporin
C gebildet, indem man eine Streptomycete aus der Gruppe Streptomyces lipmanii NRRL 3584 und Streptomyces clavuligerus
NRRL 3585 züchtet. Das Verfahren wird durchgeführt, indem man einen der obigen Mikroorganismen in einem wässrigen
Nährkulturmedium, das assimiliierbare Quellen für Kohlenstoff
und Stickstoff und ferner anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Fermentationsbedingungen solange
züchtet, bis im Kulturmedium eine wesentliche Menge an
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antibiotischer Aktivität entstanden ist. Außer Deacetoxycephalosporin
C wird auch 7-Methoxycephalosporin C, das man auch als Antibioticum A-I6884 bezeichnet, gleichzeitig
von S. Lipmanii und S. clavuligerus produziert, und zusammen mit Deacetoxycephalosporin C werden ferner 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)^-methoxy-S-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure
und 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4~carbonsäure
gebildet, die beide auch als Antibiotica A-168861 und A-16886II bezeichnet
werden. Deacetoxycephalosporin C wird von beiden Mikroorganismen zwar in geringeren Mengen gebildet als
die anderen erwähnten Cephalosporine, es läßt sich jedoch mühelos von diesen Antibiotica abtrennen und chromatographisch
in reiner Form isolieren, wie dies im folgenden beschrieben wird.
Beide für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Mikroorganismen
wurden aus Bodenproben von Südamerika isoliert. Die Organismen wurden aus den Bodenproben isoliert, indem
man gewisse Mengen der Bodenproben in sterilem destilliertem
Wasser suspendierte und die Suspensionen auf Nähragar aufstrich.
Die so beimpften Nähragarplatten wurden dann mehrere Tage bei etwa 25 bis 35 0C inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit
wurden die Mikroorganismenkolonien mittels einer sterilen Platinöse auf Schrägagar übertragen. Die Agarschrägen wurden
dann inkubiert, um so geeignete Mengen an Inoculum zur Bildung von Deacetoxycephalosporin C zu bekommen.
Bei den für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Stämmen von Mikroorganismen handelt es sich um Actinomyceten,
die nach Verfahren identifiziert wurden, welche zur Charakterisierung von Streptomyces species für das International
Streptomyces Projekt empfohlen wurden (Shirling et al.,
"Methods for Charakterization of Streptomyces Species", Intern. Bull. Systematic Bacteriol., 16, 313-340 /1966/).
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Die taxonomisehen Eigenschaften von S. lipmanii NRRL
3584 und S. clavuligerus NRRL 3585 sind in den folgenden Tabellen und Ausführungen zusammengefaßt» Die Zuordnung
der Farbnamen in diesen Tabellen wurde nach der ISCC-NBS-Methode vorgenommen, wie sie Kelly et al in The ISCC-NBS
Method Of Designating Colors and a Dictionary of Color Names (U.S.Department of Commerce Circ. 553, Washington,
D.C. 1955) beschrieben wurde. Die in Klammer angegebenen
Zahlen beziehen sich auf die Tresner und Backus-Farbtabellen (Tresner et al., "System of Color'Wheels for
Streptomyces Taxonomy," Appl.Microbiol., 11, 335-338 /196,3/* und die Bezeichnungen der Farbreiter sind unterstrichen.
Die Farbblöcke von Maerz und Paul (Maerz et al.,
Dictionary of Color /McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, 1950/) sind in Klammern angegeben. Sofern nichts anderes
gesagt ist, ließ man alle Kulturen 14 Tage bei 30 0C
wachsen.
Die Sporophoren sind gewöhnlich gerade bis gewunden mit gelegentlicher Bildung von Haken. Die Sporen sind kurz,
zylindrisch (0,5 bis 1,5" Λι χ 1,0 bis 2,5 ,u), und
kommen normalerweise in Ketten von 3 bis 10, und gelegentlich von 10 bis 50 vor. Die Sporen sind einer elektronenmikroskopischen
Beobachtung zufolge glatt.
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Tabelle I Kulturcharakteristiken von S. lipmanii NRRL 3584
OO PO Ui
Medium ISP No. 2 (Hefe-Malz-Extrakt-Agar)
ISP No. 3 (Hafermehl-Agar)
ISP No. 4 (anorganische Salze und Soluble-Stärke-Agar)
ISP No. 5 (Glycerin-Asparagin-Agar) Tomatenpaste-Hafermehl-Agar
Emmerson-Agar Bennett-Agar Czapek-Agar
Glucose-Asparagin-Agar Tyrosin-Agar
Nähr-Agar
mäßiges Wachstum, Umkehrdunkelgräulichbraun /8H9/,
Luftmycel fahlgelb (Y) 2db
mäßiges Wachstum, Umkehrdunkelgräulichgelb /13E4/, Luftmycel mäßig weiß (W) 13ba bis fahlgelb (Y) 2db
mäßiges Wachstum, Umkehrbräunlichgrau /JCTJ,
Luftmycel mäßig, fahlgelb (Y) 2db
reichliches Wachstum, Ümkehrhellgelblichbraun /1317/,
Luftmycel reichlich, gräulichgelblichpink (R) 5dc ~
reichliches Wachstum, Umkehrgräulichgelblichbraun /J _
Luftmycel reichlich, gelblichgrau (GY) 2dc
mäßiges Wachstum, Umkehrdunkelgräulichgelblichbraun /8E9/,
Luftmycel und Sporen fehlen
reichliches Wachstum, Umkehrmittelgelblichbraun /JAET/, ·
Luftmycel reichlich, gräulichgelb (R) 3ec
spärliches Wachstum, weiß, spärliches Luftmycel (W) 13ba
reichliches Wachstum, Umkehrgräulichgelb /12D4/, Luft- ,^
mycel reichlich, gelblichgrau (GY) 2dc ^^
mäßiges Wachstum, Ümkehrhellgelblichbraun /12C5/,
Luftmycel reichlich, bräunlichgelb (R) 3ec
mäßiges Wachstum, Umkehr fähige Ib,
kein Luftmycel - 6 -
Tabelle I (Forts.)
Medium
WachstumsCharakteristiken
O CO CO
"ν. O CD
Calciummälat-Agar
Physiologie Wirkung auf Milch
Nitratreduktion Melaninproduktion
Pepton-Eisen-Agar
Trypton-Hefe-Extraktbrühe
Temperaturbedingungen auf Tomatenpaste-Hafermeh1-Agar
Einfluß der pH-Änderung auf die vegetative Farbe
0,05n HCl 0,05n NaOH
Gelatineverflüssigung mäßiges Wachstum, Umkehrschwärζ £5 6Cl/, sehr spärliches
Luftmyeel ~~
Koagulation, Peptonisierung
positiv
positiv
negativ
negativ
negativ
reiches Wachstum und Sporulation bei 26 0C und 20.0C,
leichtes Wachstum bei 37 0C, kein Wachstum bei 43 0C
bräunlichgraues Pigment ^ändert sich nach rot keine Veränderung
100 % .
cn cn co
In Tabelle II sind die Ergebnisse der KohlenstoffutiIisationsversuche
angegeben, die mit S. lipmanii NRRL 3584 durchgeführt wurden. In dieser Tabelle wurden folgende Symbole verwendet:
+ = Wachstum und Utilisation
- = kein Wachstum und keine Utilisation
Tabelle II Kohlenstoffuti!isation für NRRL 3584
Wachsturnsverhalten
L-Arabinose Saccharose D-Xylose
D-Fructose GIycose
Rhamnose Raffinose i-Inosit D-Mannit
Vergleich (kein Kohlenstoff)
S. clavuligerus NRRL 3585 ließ sich schwierig in genus Streptomyces
klassifizieren, da es sich dabei um eine atypische sporophore Morphologie handelt. Die bei der Zellwandanalyse erhaltenen
Werte zeigen jedoch, daß diese Kultur als Species aus Streptomyces genus anzusehen ist. Dieser Organismus wird
daher als neue Species behandelt und mit dem Namen Streptomyces clavuligerus bezeichnet.
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Dieser Organismus bildet in charakteristischer Weise ein "umfangreiches Netzwerk kurzer sympodial-verzweigter
Lufthyphen, die sich eventuell in Sporen teilen. Es werden kurze keilförmige Seitenäste gebildet, die normalerweise
aus je 1 bis 4 Sporen entstehen. Es entstehen keine Substratkonidien. Im Elektronenmikroskop lassen sich
glattwandige Sporen feststellen. Zellwandpräparationen enthalten das L,L-Isomer von Diaminopimelinsäure und Glycin
außer den Hauptbestandteilen Asparaginsäure, Glutaminsäure und Alanin. Die Sporen sind in der Masse grau, und das Primärmycel
ist fahlgelb bis gelbbraun. Es wird kein lösliches Pigment gebildet. Die Kultur verfügt über einen optimalen
Temperaturbereich von 26 bis 30 0C. Bei 37 0C kommt es
zu keinem Wachsen. Morphologisch ähnelt diese Kultur bestimmten Stämmen von Thermomonospora und Micromonospora.
Die Eigenschaften von S. clavuligerus NRRL 3585 sind in den folgenden Tabellen und Ausführungen zusammengefaßt.
Auf einem umfangreichen Luftmycel werden Sporophoren gebildet, und diese bestehen aus einem Netzwerk kurzer syrapodialvernetzter
Hyphen. Normalerweise entspringen 1 bis 4 Sporen an kurzen keulenförmigen Seitenästen, unter Umständen
teilen sich Sporophoren auch in Segmente auf, wodurch sich Ketten von Sporen bilden. Die Sporen haben normalerweise Abmessungen
von 0,34 bis 0,84 ,u χ 0,85 χ 3,3 λ, im Mittel
0,64 yU χ 1,53 /U. Elektronenmikroskopische Untersuchungen
zeigen, daß die Sporen glattwandig sind. Im Substratmycel werden keine Sporen gebildet.
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Medium WachstumsCharakteristiken
ISP No. 2 (Hefe-Malz-Extrakt-Agar)
ISP No. 3 (Hafermehl-Agar)
ISP No. 4 (anorganischer Salz-Stärke-Agar) ISP No. 5 (Glycerin-Asparagin-Agar)
Tomatenpas te-Hafermeh1-Agar
Emerson-Agar Bennett-Agar
Czapek-Agar Glucose-Asparagin-Agar
reichliches Wachstum, ümkehrgräulichgelb /12K3/, Luftmycel reichlich, dunkelgrau (G) 3ih /.21Bl/,
kein lösliches Pigment
mäßiges Wachstum, Umkehr fähige Ib /11CJ[/, Luftmycel
leidlich, weiß (W) b /27A^/, kein lösliches Pigment
reichliches Wachstum, Ümkehrgräulichgelb /12B2/,
Luftmycel mäßig, mittelgrau (GY) 2fe /45l/
kein lösliches Pigment
leidliches Wachstum, Umkehrfahlgelbgrün /l
Luftmycel leidlich, weiß (W) a, kein lösliches Pigment
reichliches Wachstum, Ümkehrgräulichgelb /11E4/, Luftmycel
mäßig, hellgräulicholiv (GN) 1-1/2lg /2TJ/
kein lösliches Pigment
reichliches Wachstum, Umkehr fahlgelb /11C-I-/, Luftmycel
spärlich, kein lösliches Pigment "~
reichliches Wachstum, Umkehrhellgelb /11J2/, Luftmycel
reichlich, dunkelgräulichgrün (GN) 2"4-1/2ih
/23A3_/, kein lösliches Pigment
spärliches Wachstum
mäßiges Wachstum, Umkehrfahlgelbgrün /10B1/, Luftmycel
leidlich, weiß (W) b /27AI/, kein lösliches Pigment
Tabelle III (Forts.)
Medium WachstumsCharakteristiken
cn ο co
Tyrosin-Agar
Nähr-Agar Calciummalat
Wirkung auf Milch
Nitratreduktion
Geiatineverflüssigung
Einfluß der pH-Änderung auf das Wachstum
Melaninproduktion
Pepton-Eisen-Agar und Trypton-Hefeextrakt-Brühe
Temperaturbedingungen
Hauptsächliche Bestandteile der gesamten Zellhydrolysate
mäßiges Wachstum, Umkehrfahlgelb //I0B2/, Luftmycel
mäßig, gelblichgrau (GY) 2dc /10A2/, kein lösliches
Pigment
leidliches Wachstum, Umkehr fahlgelbgrün Z^
mycel spärlich, weiß, kein lösliches Pigment reichliches Wachstum, Umkehrfahlgelbgrün /10BJ1/, Luftmycel
leidlich, weiß (W) a
keine Koagulation, Aufklaren innerhalb von 17 Tagen negativ .
keine *
optimaler pH-Bereich zum Wachsen 5,0 bis 6,0, Wachstum jedoch keine Spoirolation bei pH 7,5 bis 8,5
Wachstum und Sporolation sind bei 26 bis 30 0C gut, bei
37 0C oder darüber kein Wachstum
L,L-Diaminopimelinsäure, Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure,
Alanin und Leucin
In Tabelle IV sind die Ergebnisse der Kohlenstoffutilisation zusammengefaßt, die man bei Versuchen mit S. clavuligerus
NRRL 3585 erhält. In dieser Tabelle werden folgende Symbole verwendet:
+ = Wachstum und Utilisation
- = kein Wachstum, keine utilisation
(+)= mögliche Utilisation
(-)= fragliche Utilisation
Kohlenstoffutilisation für NRRL 3585 Verbindung Wachsturnsverhalten
L-Arabinose
Rhamnose -
Fructose
D-Xylose
Melezitose (-)
Raffinose
Dextrose
Cellobiose
Maltose +
Saccharose -
Cellulose
Inosit (+)
Mannit
Na-Glutamat (+)
Die erfindungsgemäßen Streptomyceten wurden ohne Beschränkung
hinsichtlich ihrer Verfügbarkeit bei der ständigen Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development
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Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of
Agriculture, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt. Streptomyces
lipmanii wurde mit der Kultur-No.*NRRL 3584 und Streptomyces
clavuligerus mit der Kultur-No. NRSL 3585 bezeichnet.
Wie bereits oben erwähnt, wird Deacetoxycephalosporin C von jedem der oben beschriebenen Streptomyceten in einem wässrigen
Nährkulturmedium unter aeroben Bedingungen produziert. Als Kulturmedium läßt sich irgend ein bekanntes Medium verwenden,
da diese Mikroorganismen durch utilisation zahlreicher Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganischer Salze
wachsen und die beschriebenen Metaboliten bilden können. Für
eine großtechnische Fermentation, bei der die Wirtschaftlichkeit der Produktion ein wesentlicher Faktor ist und bei
der maximale Ausbeuten an Antibiotikum und dessen leichte
Isolierbarkeit wichtige Überlegungen darstellen, werden bestimmte Nährquellen bevorzugt. Zu Medien, die sich zur Herstellung
von Deacetoxycephalosporin C eignen, gehören beispielsweise assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Stärke
Glycerin, Melasse oder Dextrin. Als Kohlenstoffquelle wird Glucose bevorzugt. Weitere verwendbare Medien sind Quellen
für assimiliierbaren Stickstoff, wie Sojabohnenmehl, Maismaischefeststoffe,
Hefe, Baumwollsaatmehl, Rinderextrakt, Peptone (Fleisch oder Soja), Casein oder Aminosäuregemische.
Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Sojabohnenmehl oder
Amonosäuregemische. Zu anorganischen Nährsalzen, die den
Kulturmedien zugesetzt werden können, gehören die üblichen Salze, aus denen man Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-,
Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen erhalten kann.
Kleinere Mengen von Elementen, die für ein optimales Wachstum und eine optimale Entwicklung des zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin
C verwendeten Organismus erforderlich sind, können dem Kulturmedium ebenfalls zugegeben werden.
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Solche Spurenelemente kommen normalerweise als Verunreinigungen
in anderen Bestanteilen des Mediums in Mengen vor, die für ein entsprechendes Wachsen der erfindungsgemäß verwendeten
Actinomycete ausreichen.
Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann variiert werden.
Dieser Anfangs-pH-Wert des Mediums sollte zweckmäßigerweise jedoch zwischen 6,5 und 7,2 liegen. Wie bei anderen
Actinomyceten, so steigt auch im vorliegenden Fall der pH-Wert
des Mediums allmählich während der Wachstumsperiode des Organismus, während der das Antibioticum gebildet wird, und
kann hierbei einen Wert von 6,7 bis 7,5 oder darüber erreichen, wobei der End-pH-Wert wenigstens vom ursprünglichen
pH-Wert des. Mediums, den im Medium vorhandenen Puffern und
der jeweiligen Wachsturnszeit für den Organismus abhängt.
Submerse aerobe Kulturbedingungen sind die Bedingungen der
Wahl für die Produktion von Deacetoxycephalosporin C. Zur Herstellung verhältnismäßig kleiner Mengen bedient man sich
einer Schüttelflaschen- und Oberflächenkultur in Flaschen.
Für die Herstellung großer Mengen wird eine submerse aerobe Kultur in sterilen Tanks bevorzugt. Das Medium im sterilen
Tank kann mit einer sporulierten Suspension inokuliert werden. Wegen der bei Verwendung einer sporulierten Suspension
beobachteten Wachstumsverzögerung verwendet man als Inokulum vorzugsweise jedoch die vegetative Form
der Kultur. Auf diese Weise umgeht man die Wachstumsverzögerung und kann die Fermentationsvorrichtungen besser ausnutzen.
Vorzugsweise stellt man daher zuerst ein vegetatives Inokulum des Organismus her, indem man eine verhältnismäßig
kleine Menge des Kulturmediums mit der Sporenform des Organismus inokuliert. Sobald dabei ein junges aktives vegetatives
Inokulum entstanden ist, überträgt man dieses vegetative Inokulum aseptisch auf den großen Tank. Das Medium, in dem
man das vegetative Inokulum produziert, kann entweder gleich
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oder verschieden sein von dem für die großtechnische Produktion
verwendeten Medium.
Die Mikroorganismen, die Deacetoxycephalosporin C produzieren, wachsen über einen breiten Temperaturbereich zwischen etwa
25 und 37 0C. Zu optimaler Produktion scheint es bei Temperaturen
von 26 bis 30 0C zu kommen. Eine maximale Produktion
an Antibiotikum erhält man normalerweise innerhalb von etwa 36 bis 72 Stunden nach Inokulation des Kulturmediums.
Wie bei aeroben submersen Kulturverfahren üblich, wird auch
im vorliegenden Fall sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen.
Für ein ausreichendes Wachsen des Organismus und eine entsprechende Bildung an Antibioticum sollte man hierbei bei
der Tankproduktion mit einem Luftvolumen von 0,2 bis 0,4 Volumina Luft pro Minute pro Volumen Kultur arbeiten. Bevorzugt
arbeitet man bei einem Luftvolumen von 0,40 Volumina Luft pro
Minute und pro "Volumen Kulturmedium.
Die Konzentration antibiotischer Aktivität in dem Kulturmedium
läßt sich während der Fermentationszeit ohne weiteres verfolgen, indem man Proben des Kulturmediums bezüglich ihrer
hemmenden Wirkung gegenüber dem Wachsen von Mikroorganismen untersucht, von denen man weiß, daß sie durch Deacetoxycephalosorin
C inhibiert werden. Die Organismen Sarcina lutea und Salmonella gallinarum erwiesen sich für diesen Zweck als geeignet.
Die untersuchung der Proben kann anhand des bekannten turbidometrischen
Verfahrens oder anhand des üblichen Scheibenplattenverfahrens
durchgeführt werden.
Zu einer maximalen Produktion an antibiotischer Wirksamkeit kommt es im allgemeinen innerhalb von einem bis 3 Tagen nach
Inokulation des Kulturmediums bei einem submersen aeroben
Kulturverfahren oder bei einem Schüttelflaschen-Kulturverfahren.
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Die von beiden Streptomyceten während der Fermentation gebildete antibiotische Aktivität tritt in der antibiotischen
Brühe auf. Die beim erfindungsgeinäflen Verfahren angewandten
Isoliertechniken sind daher so ausgelegt, daß man aus der
Brühe ein Maxiraum des Antibioticums gewinnen kann. Hierzu
werden beispielsweise Mycel und ungelöste Feststoffe aus der Fermentationsbrühe in bekannter Weise entfernt, beispielsweise
durch Filtrieren oder Zentrifugieren, und aus der filtrierten oder zentrifugieren Brühe kann man dann das Gemisch
der entstandenen Antibiotica, beispielsweise durch Extraktion oder Adsorption, gewinnen.
Deacetoxycephalosporin C wird aus der filtrierten Fermentationsbrühe
als Bestandteil des bei der Fermentation produzierten antibiotischen Gemisches gewonnen. Das Deacetoxycephalosporin
C wird dann von den anderen antibiotischen Bestandteilen dieses Gemisches (beispielsweise den oben
erwähnten Antibiotica A-16 8861, A-16 886II und A-16 884)
abgetrennt und als praktisch reine Verbindung säulenchromatographisch
isoliert.
Zur Gewinnung des antibiotischen Gemisches durch Adsorptionstechniken
werden Ionenaustauscherharze bevorzugt. Diese Gewinnung kann jedoch genausogut auch mit Adsorptionsmaterialen
erfolgen, wie Aktivkohle, Silicagel, Aluminiumoxid
oder Cellulose.
Deacetoxycephalosporin C und die oben erwähnten gleichzeitig gebildeten Antibiotica können in der Fermentationsbrühe
in Salzform oder in amphoterer Form (zwitterionischer Form)
vorliegen, und zwar je nach dem End-pH-Wert der Brühe. Das Gemisch der Antibiotica kann beispielsweise durch Adsorptions Chromatographie oder durch Ionenaustauscherchromato-
graphie gewonnen und in die einzelnen Bestandteile aufgetrennt werden, wenn diese in einer der genannten Formen
oder als Gemisch hiervon vorliegen.
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Als Ionenaustauscherharze zur Gewinnung des antibiotischen Gemisches werden Harze vom Typ Polystyrol-quatemäres Ammonium
bevorzugt, die unter den Handelsnamen Amberlit- und ISA-Harze (Röhm und Haas Co., Philadelphia, Pa) und Dowex-Harz
(Dow Chemical Co.), beispielsweise unter IRA-6 8- und Dowex 1-Harze,
vertrieben werden.
Die filtrierte Fermentationsbrühe leitet man.über eine mit
anionischem Harz, wie IRA768, bepackte Säule, und die Antibiotica
werden hiervon dann mit einer wässrigen Lösung von Ammoniumacetat, Natriumacetat oder Ammoniumformiat isoliert.
Die Antibiotica werden in Form des Salzes eluiert, das sich mit dem Kation der zum Eluieren verwendeten Salzlösung
bildet. Vor der Ionenaustauschchromatographie werden die
Antibiotica aus der filtrierten Fermentationsbrühe abgetrennt und teilweise durch Adsorption an Aktivkohle gereinigt.
Im Anschluß an die Gewinnung des Gemisches der Antibiotica, das das Deacetoxycephalosporin C enthält/ aus der Anionenaustauschersäule
können überschüssige anorganische Materialien, wie ein Salzüberschuß aus der Eluiersalzlösung, beispielsweise
Ammoniumformiat, von dem Harzeluat durch Chromatographie des Eluats über Aktivkohle entfernt werden.
Das so gewonnene und gereinigte Gemisch der Antibiotica wird
dann über Silieagel oder Cellulose (mikrokristallin) chromatographiert, wodurch sich die einzelnen antibiotischen
Komponenten des Gemisches auftrennen lassen.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung.züchtet man
S. lipmanii NRRL 3584 in einem wässrigen Nährkulturmedium über eine Zeitspanne von 6 Tagen bei einer Temperatur von etwa 30 0C. Das Mycel und andere unlösliche Stoffe werden
S. lipmanii NRRL 3584 in einem wässrigen Nährkulturmedium über eine Zeitspanne von 6 Tagen bei einer Temperatur von etwa 30 0C. Das Mycel und andere unlösliche Stoffe werden
dann unter Verwendung einer Filterhilfe abfiltriert, und
die filtrierte Brühe schickt man durch eine mit Aktivkohle
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bepackte Säule. Zur Entfernung von Verunreinigungen wird die
Säule mit Wasser gewaschen, und die antibiotische Aktivität eluiert man dann mit wässrigem Aceton von der Säule. Es
wird eine Reihe von Fraktionen aufgefangen, und die wirksamen Fraktionen werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen
werden unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons eingedampft. Das wassrige Konzentrat wird dann über ein
basisches Anionenaustauscherharz vom Typ Polystyrol-quaternäres Ammonium, wie es im Handel unter der Bezeichnung
Amberlit IRA-68-Harz (Röhm und Haas, Philadelphia, Pa) zu
erhalten ist, im Formiat- oder Acetatzyklus chromatographiert.
Die Säule wird mit Wasser gewaschen, worauf man die antibiotische Aktivität mit etwa 0,1 molarer verdünnter
wässriger Formiatlösung eluiert. Es werden mehrere Fraktionen Eluat gesammelt, und die wirksamen Fraktionen werden vereinigt
und über Aktivkohle chromatographisch weiter gereinigt. Das das Antibioticum enthaltende Eluat wird konzentriert
und gefriergetrocknet. Die gefriergetrocknete Präparation löst man in Wasser, und die Lösung wird über SiIicagel
chromatographiert. Zur Eluierung der Säule verwendet man wässriges Acetonitril oder ein anderes geeignetes
Lösungsmittel. Es werden mehrere Fraktionen gesammelt. Die ersten Fraktionen enthalten das Antibioticum A-16 884, nämlich
7-(5-Amino—S-carboxyvaleramido)-V-methoxy-S-acetoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure,
in Form des Ammoniumsalzes. Im Anschluß daran werden Fraktionen aus einem Gemisch aus
A-16 884 und Penicillin N eluiert. Die späteren Fraktionen
enthalten Deacetoxycephalosporin C als Ammoniumsalz.
Die freie Säureform von Deacetoxycephalosporin C läßt sich erhalten, indem man den pH-Wert einer wässrigen
Lösung des Ammoniumsaizes auf den isoelektrischen Punkt
einstellt. Andererseits kann man zur freien Säure auch gelangen, indem man eine wässrige Lösung des Salzes mit
einem sauren Ionenaustauscherharz behandelt und dabei
soviel saures Harz verwendet, daß sich der pH-Wert der
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Lösung auf etwa pH 2,5 einstellt. Das Harz wird dann von der sauren Lösung abfiltriert, und aus dem erhaltenen
Filtrat gelangt man nach Gefriertrocknen zur freien Säure.
Bei einer anderen Ausfuhrungsform der Erfindung kultiviert
man S. clavuligerus NRRL 3585 in wässrigem Nährmedium über eine Zeitspanne von etwa 6 Tagen, worauf man 'das Mycel abfiltriert
und die filtrierte Brühe zuerst über Aktivkohle und dann über einem basischen Anionenaustauscherharζ des
Typs Polystyrol-quaternäres Ammonium, wie es beispielsweise
unter dem Warenzeichen Dowex (Dow Chemical Co., Midland, Mich.) und Amberlit IRA (Röhm und Haas, Philadelphia, Pa)
erhältlich ist, chromatographiert. Die Harze werden vorzugsweise im Formiat- oder Acetatzustand eingesetzt. Das Eluat
aus dem Ionenaustauscherharz wird dann zur Entfernung überschüssiger
anorganischer Stoffe über Aktivkohle, anschließend über Dextran und schließlich über SiIicage1 rechromatographiert.
Die Silicage!säule eluiert man mit wässrigem
Acetonitril, und es werden mehrere Fraktionen aufgefangen. Die biologisch wirksamen Fraktionen werden vereinigt und
eingedampft oder vorzugsweise gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete
Gemisch der antibiotischen Metaboliten enthält eine schwächere Komponente, nämlich Deacetoxycephalosporin
C. Zur Abtrennung dieses Deacetoxycephalosporin C wird das Gemisch zuerst über mikrokristalliner
Cellulose (Avicel) chromatographiert, worauf man die Metaboliten
über Amberlit XAD-4-Harζ voneinander trennt. Das gefriergetrocknete
Gemisch löst man in Wasser, und schickt es dann durch eine mit mikrokristalliner Cellulose bepackte
Säule. Die Säule wird mit einem Gemisch aus Acetonitril:n-Propanol:Wasser
(1:1:0,5 V:V:V) eluiert, und die aktiven Eluatfraktionen werden vereinigt und im Vakuum
eingedampft, worauf man das Konzentrat lyophilisiert. Das
lyophilisierte antibiotische Gemisch wird in Wasser gelöst,
ο 9823/0844
und dann über Amberlit XAD-4-Harz chromatographiert. Die
Säule eluiert man mit Wasser, und es werden mehrere Fraktionen aufgefangen. Die Eluatfraktionen werden durch Papierchromatographie
oder durch einen mikrobiociden Versuch ständig überwacht, und alle Fraktionen, die hiernach lediglich Deacetoxycephalosporin
C enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert. Die ersten Eluatfraktionen enthalten die bekannten
Antibiotica A-16 8861 und 16 886II, nämlich 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramidoJ-T-methoxy-S-carbaraoyloxymethyl-S-cephem-4-carbonsäure
und T-iS-Amino-S-carboxyvaleramidoJ-S-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher
erläutert.
Beispiel 1
Schüttelflaschenproduktion von Deacetoxycephalosporin C
Zur Herstellung einer sporulierten Kultur von Streptomyces lipmanii NRRL 3584 läßt man diesen Organismus auf einem
Nähragar folgender Zusammensetzung wachsen:
Dextrin 10,00 g
Hefeextrakt 1,00 g
hydrolysiertes Casein
(11N-Z Amin-Typ A," Sheffield Chemical Company) 2,00 g
Rinderextrakt 1,00 g
Meeragar (dreimal gewaschen) 20,00 g
deionisiertes Wasser 1 Liter
50982 3/084/;
- '21 -
Der pH-Wert des Mediums wird durch Zusatz von Natriumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt.
Der Schrägagar wird mit Sporen von Streptomyces lipmanii
NRRL 3584 inokuliert und 6 Tage bei 30 0C inkubiert. Der
Schrägagar wird dann mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und sorgfältig abgekratzt, um auf diese Weise die
Sporen und Zellen in Form einer wässrigen Suspension hiervon zu entfernen. Einen ml der erhaltenen Suspension verwendet
man zur Beimpfung entsprechender Mengen mit je 100 ml eines
vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung:
Glucose 15,00 g
Sojabohnenmehl 15,00 g Maisraaisehefeststoffe 5,00 g
Calciuracarbonat 2,00 g
Natriumchlorid 5,00 g
deionisiertes Wasser 1 Liter
Der pH-Wert des vegetativen Mediums wird durch Zusatz von
Natriumhydroxid auf pH 6,7 eingestellt.
Das so erhaltene vegetative Medium schüttelt man 36 Stunden bei 30 0C auf einem Reziprokschüttler, mit einer Geschwindigkeit
von 108 UpM und einem Ausschlag von etwa 15 cm. Das
so hergestellte Medium wird dann als Inokulum für das Produktionsraedium
verwendet.
Aus folgenden Bestandteilen wird ein Produktionsmedium hergestellt:
Sojabohnenmehl 15,00 g
Casein 1,00 g
Natriumnitrat 3,00 g
Glucosesirup (50 % Glucose) 20,00 g Leitungswasser 1 Liter
5 0.9823/0844
* at.
Mengen von jeweils 100 ml des Proäuktionsmediums werden in
500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben, die 30 Minuten bei 120 0C
sterilisiert werden. Nach dem Abkühlen inokuliert man jeden Kolben mit 5 % vegetativem Inpkuluni. Der Fermentationsansatz
wird 72 Stunden bei 30 0C auf einem bei 250 UpM betriebenen
Rotationsschüttler geschüttelt. Während der Fermentation belüftet man das Medium mit steriler Luft
in einer Menge von 0,4 V./V../Minute. Die Isolierung wird praktisch
nach dem im späteren Beispiel 3 beschriebenen Verfahren vorgenommen.
Beispiel, 2
Zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C geht man genauso vor wie bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, wobei
man jedoch ein Produktionsmedium folgender Zusammensetzung verwendet:
Distillers1 solubles (Nadrisol) 5,00 g
Sojabohnenmehl (Nutrisoy 200D) 5,OO g
Erdnußmehl 5,00 g
Proteinmelasse (Blackstrap) 5,00 g
Hafermehl 5,00 g
Glycerin 10,00 g
Leitungswasser 1 Liter
Anstelle eines Rotationsschüttlers verwendet man ferner einen mit 108 Hüben pro Minute betriebenen Reziprokschüttler.
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Beispiel 3
Pilotanlaqenprodüktion von Deacetoxycephalosporin C
Ein 40 Liter fassender Fermenter aus rostfreiem Stahl wird
mit 24 Liter Medium folgender Zusammensetzung beschickt:
Antifoam A (ein von Dow Corning vertriebenes Antischaummittel)
Glucose
Dextrin 700 Sojabohnengrütze
Melasse (Blackstrap) Kaliumbiphosphat Calciumcarbonat kaltes Leitungswasser
Der Ausgangs-pH-Wert liegt bei 6,5 und wird nicht eingestellt.
Das Medium sterilisiert man 30 Minuten bei 120 0C,
und es wird dann abgekühlt und mit 5 % des nach Beispiel 6
hergestellten vegetativen Inokulums beimpft. Sodann fermentiert man den Ansatz 66 Stunden bei 30 0C, wobei man mit
Luft in einer Menge von 0,35 V./V./Min. belüftet und mit einem mechanischen Rührer mit 420 UpM rührt. Der pH-Endwert
beträgt 7,5.
Etwa 60 Liter der oben erhaltenen Brühe werden unter Verwendung
von HyfIo Super-Cel (einer von Johns-ManviHe
Products Corporation vertriebenen Diatomeenerde) filtriert. Das Brühenfiltrat leitet man dann über eine 9,6 χ 150 cm Säule,
die mit Aktivkohle (Pittsburgh CAL. 12 χ 40, Hersteller Pittsburgh Activated Carbon Co.) bepackt ist. Die Säule
wird solange mit Wasser gewaschen, bis der Abstrom farblos
ist, und die an der Kohle adsorbierte Aktivität entfernt man dann, indem man 50-prozentiges wässriges Aceton über
| 0,20 | g |
| 5,00 | g |
| 50,00 | g |
| 25,00 | g |
| 3,00 | g |
| 0,25 | g |
| 2,50 | g |
| auf 25 Liter |
509823/084
die Säule leitet. Die die gewünschte Aktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Entfernung von Aceton
im Vakuum eingeengt, und das Konzeatrat gibt man dann auf eine 5/9 χ 104 cm Säule, die mit lSA-6 8-Harz (Formiatform)(einem
von Röhm und Haas Co. hergestelltem Anionenaustauscherharζ,
das man zur Umwandlung des Harzes in die Formiatform mit Ameisensäure wäscht) bepackt ist. Die Säule wird solange mit Wasser gewaschen,
bis der Abstrom klar und farblos ist, und die auf der Säule befindliche Aktivität wird dann durch Waschen mit
0,1 molarer Ammoniumformiatlösung entfernt. Die aktiven
Fraktionen werden vereinigt und über eine mit Aktivkohle (Pittsburgh CAL. 12 χ 40) gefüllte Säule von 4,3 χ 72 cm geleitet.
Die Säule wird dann mit 6 Säulenvolumina Wasser gewaschen, und die in der Säule befindliche Aktivität eluiert
man schließlich mit 30-prozentigem wässrigem Acetonitril. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zur Entfernung von Acetonitril
im Vakuum eingeengt und schließlich gefriergetrocknet. Hierbei erhält man 25 bis 30 g Feststoffe.
Die gefriergetrocknete Präparation löst man in einem Minimum Wasser, und gibt die erhaltene Lösung dann in eine mit mikrokristalliner
Cellulose (Avicel,Hersteller FMC Corporation) bepackte Säule von 7,2 χ 60 cm, wobei diese Cellulose in
70-prozentigem wässrigem Acetonitril suspendiert ist und man die Säule vor Aufgabe der aktiven Probe mit Acetonitril
wäscht. Nach erfolgter Aufgabe der Probe wird die Säule mit einem Säulenvolumen Acetonitril gewaschen-, worauf
man die auf der Säule befindliche Aktivität mit Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf
etwa 200 ml eingeengt, und aus dem dabei erhaltenen Konzentrat fällt man den darin enthaltenen Wirkstoff durch Zugabe
von 10 Volumina Aceton aus. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Die Ausbeute beträgt 9 bis 12g.
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20 g des oben erhaltenen Materials werden in einer minimalen Wassermenge gelöst, und die erhaltene Lösung gibt man
auf eine Silicagelsäule (7,2 χ 60 cm). Das verwendete SiIicagel
(Sorte 950, Hersteller Davison Chemical) wird vorher mit Wasser, und dann mit Methanol gewaschen und zum Bepacken
der Säule in 70 % Acetonitril suspendiert. Nach Aufgeben der Probe wäscht man die Säule mit einem Säulenvolumen Acetonitril,
worauf die in der Säule befindliche Aktivität mit 70-prozentigem Acetonitril eluiert wird. Es werden mehrere
Fraktionen aufgefangen, und kleine Teilmengen hiervon werden zur Identifizierung des in jeder Fraktion.vorhandenen antibiotischen
Faktors papierchromatographisch untersucht. Das
bekannte Antibioticum A-16 884 (7-Methoxycephalosporin C)
geht zusammen mit den Anfangsfraktionen von der Säule, während
sich das Deacetoxycephalosporin C erst bei den späteren Fraktionen sammeln läßt. Alle Fraktionen, die aufgrund
der papierchromatographischen Analyse nur Deacetoxycephalosporin
C enthalten, werden vereinigt und dann gefriergetrocknet,
Die nach den oben erwähnten Isolier- und Reinigungsverfahren
erhaltene lyophilisierte Präparation ist praktisch reines
Deacetoxycephalosporin C in Form des Ammoniumsalzes.
Beispiel 4
Isolierung von Deacetoxycephalosporin C als Mononatriumsalz
Etwa 60 Liter der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Brühe werden unter Verwendung von Hyflo-Supercel filtriert. Das Brühenfiltrat
schickt man durch eine 9,6 χ 150 cm Säule, die mit
Aktivkohle (Pittsburgh CAL. 12 χ 40) bepackt ist. Die Säule wird solange mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser
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farblos ist, und die in der Säule absorbierte Aktivität entfernt
man dann, indem man durch die Säule 50-prozentiges wässriges Aceton leitet. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt
und zur Entfernung von Aceton im. Vakuum eingeengt,
worauf man das Konzentrat auf eine mit IRA-68 (Acetatform)
bepackte 5,9 χ 104 cm Säule gibt. Die Säule wird solange mit Wasser gewaschen, bis der Abstrom klar und farblos ist, und
die in der Säule befindliche Aktivität wird dann durch Waschen mit 0,1 molarem Natriumacetat entfernt. Die aktiven Fraktionen
werden vereinigt und dann auf eine 4,3 χ 72 cm Säule gegeben,
die mit Pittsburgh CAL. (12 χ 40) Aktivkohle bepackt ist. Die Säule wird mit dem 6-fachen Säulenvolumen Wasser gewaschen,
worauf man die in der Säule befindliche Aktivität mit 30-prozentigem wässrigem Aceton eluiert. Die aktiven
Fraktionen werden vereinigt, zur Entfernung des Acetons im Vakuum eingeengt und schließlich gefriergetrocknet. Die
Ausbeute beträgt 20 bis 30 g. Die Analyse ergibt einen Natriumgehalt
von 2,5 %.
Das hierbei erhaltene rohe antibiotische Gemisch der Natriumsalze wird über mikrokristalliner Cellulose (Avicel)
chromatographiert, worauf man das Mononatriumsalz von Deacetoxycephalosporin
C aus dem Salzgemisch über Silicagel nach dem in Beispiel 3 für die Isolierung des Ammoniumsalzes von Deacetoxycephalosporin
C beschriebenen chromatographischen Trennverfahren abtrennt.
Das auf diese Weise erhaltene Produkt läßt sich chromatographisch von Deacetoxycephalosporin C nicht mehr unterscheiden,
das durch Hydrierung von Cephalosporin C nach dem in US-PS 3 124 576 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
Das erhaltene Produkt verfügt über folgende physikalische Eigenschaften:
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E leinen tar analyse für C14H13N3Og
berechnet: C 44,32; H 4,78; N 11,08; S 8,45
gefunden: C 44,80; H 5,34; N 11,74; S 7,88.
Infrarotabsorptionsspektrxim (Mull) 1755"" cm für das
ß-Lactamcarbonyl. ·
urtraviolettabsorptionsspektrum (H2O)
Λ max 260 ,u (£5800)
Potentiometrische Titration (66-prozentiges DMF):
Anfangs-pH-Wert von 5,0 pKa 4,0, 5,8 und 10,6
Magnetisches KernresonanzSpektrum (D3O): 5,60
(1H, d, J=4,5), 5,14 (1H, d, J=4,5) , 3,98 (1H, m), 3,65
(IH, d, J=18), 3,33 (IH, d, J=18 Hz), 2,55-2,35 (2H, m),
2,06 (3H, s) und 2,15-1,55 S (4H, m). In obigen NMR-Werten
bedeuten s=Singlet, d=Doublet und m=Multiplet.
Beispiel 5 Herstellung von Deacetoxycephalosporin C in Form der freien Säure
Das nach Beispiel 4 hergestellte Mononatriumsalz von Deacetoxycephalosporin C wird in destilliertem Wasser gelöst,
und die so erhaltene Lösung versetzt man unter Rühren in kleinen Mengen mit sulfoniertem Polystyrolharz AG 5OW-X4
(Bio-Rad Laboratories), bis der pH-Wert des Gemisches auf 2,5 eingestellt ist. Sodann wird das Harz abfiltriert und
das erhaltene Filtrat lyophilisiert, wodurch man die freie Säure von Deacetoxycephalosporin C in Form eines trockenen
amorphen Feststoffes erhält.
5 0 9 8 2 3/ 08
-M-
Beispiel 6
NRRL 3585
Zur Herstellung einer sporulierten Kultur von Streptomyces
clavuligerus NRRL 3585 läßt man den Organismus auf einem Nährschrägagar wachsen:
| Dextrin | 10,00 | g |
| Hefeextrakt | 1,00 | g |
| hydrolysiertes Casein ("N-Z Amin-Typ A," Sheffield Chemical Company) |
2,00 | g |
| Rinderextrakt | 1,00 | g |
| Meer-Agar (dreimal ge waschen) |
20,00 | g |
| deionisiertes Wasser | 1 Liter |
Der pH-Wert des Mediums wird durch Zugabe von Natriumhydroxid
auf pH 7,0 eingestellt.
Der Schrägagar wird mit Sporen von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 inokuliert und 4 bis 5 Tage bei 30 0C inkubiert.
Der Schrägagar wird dann mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und schließlich sorgfältig abgekratzt, um so
von ihm die Sporen und Zellen in Form einer wässrigen Suspension zu entfernen. Einen Milliliter der erhaltenen Suspension
verwendet man zum Inokulieren von je 100 ml Mengen eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung:
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Glucose 15,00 g
Sojabohnenmehl 15,00 g Maisschlempefeststoffe 5,00 g
Calciumcarbonat 2,00 g Natriumchlorid 5,00 g
deionisiertes Wasser 1 Liter
Der pH-Wert des vegetativen Mediums wird durch Zusatz von
Natriumhydroxid auf pH 6,7 eingestellt.
Das erhaltene vegetative Medium schüttelt man 24 bis 48 Stunden bei 30 0C auf einem Reziprokschüttler mit einer Geschwindigkeit
mit 108 UpM bei einem Ausschlag von etwa 5 cm. Das so hergestellte Inokulum verwendet man dann
zu der im folgenden beschriebenen Produktion von Deacetoxycephalosporin C. .
In einen 40 Liter fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl
werden 24 Liter eines Mediums folgender Zusammensetzung gegeben:
Antifoam A (ein von Corning Company vertriebenes Antischaummittel) 5,00 g
Stärke ' 1125,0Og
Nadrisol 125,0Og
Sojabohnenmehlgrütze 500,00 g
Glycerin 187,50 g
N-Z Amin A 125,00 g Eisen(II)sulfat-heptahydrat 2,50
kaltes Leitungswasser auf 24 Liter
Den Ausgangs-pH-Wert stellt man mit etwa 20 ml 5n Natriumhydroxid
von pH 5,9 auf pH 6,5 ein. Das Medium wird dann 30 Minuten bei einer Temperatur von 120 0C und einem Druck
■509823/Ö
1,05 bis 1,27 kg/cm2 sterilisiert, abgekühlt und schließlich
mit 5 Volumprozent des vegetativen Inokulums beimpft. Die
Fermentation läßt man 66 Stunden bei 30 0C laufen, wobei
sterile Luft in einer Geschwindigkeit von 35 V./V./Min. zugegeben wird, und man den Ansatz mit einem mechanischen Rührer
bei 420 UpM rührt. Der End-pH-Wert liegt bei 6,3.
Etwa 75 Liter der gesamten Brühe, die man durch Vereinigung
der gesamten Brühen aus drei wie oben beschrieben ausgeführten
Fermentationen erhält, werden unter Verwendung von Hyflo Supercel (einer von Johns-ManviHe Products vertriebenen
Diatomeenerde) in einer Menge von 5 g pro 100 ml filtriert. Das dabei erhaltene Brühenfiltrat wird dann auf
eine 9,5 χ 130 cm Säule gegeben, die mit 8 Liter Aktivkohle (Pittsburgh CAL. 12 χ 40) bepackt ist, wobei die Aufgabegeschwindigkeit
60 ml pro Minute beträgt. Die Säule wird anschließend mit 10 Liter deionisiertem Wasser ( pH 5,2)
gewaschen, worauf man die an der Aktivkohle adsorbierte Aktivität entfernt, indem man auf die Säule 50-prozentiges
wässriges Aceton aufgibt. Die die antibiotische Aktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Entfernung
von Aceton im Vakuum eingeengt, und das dabei erhaltene Konzentrat gibt man auf eine 9,5 χ 140 cm Säule,
die mit Dowex 1-X1 (einem stark basischen Anionenaustauscherharz,
das von Dow Chemical Co. vertrieben wird) in der Formiatform bepackt ist. Die Säule wird dann mit 10 Liter deionisiertem
Wasser gewaschen, worauf man die auf der Säule befindliche Aktivität mit 0,1 molarem Ammoniumformiat entfernt. Die aktiven
Fraktionen werden vereinigt und in einer Geschwindigkeit von 60 ml pro Minute auf eine 9,5 χ 100 cm Säule gegeben,
die mit Aktivkohle (Pittsburgh CAL. 12 χ 40) bepackt ist. Die Säule wird dann mit Wasser gewaschen, worauf
man die auf der Säule befindliche Aktivität mit einem
1:4 Gemisch aus Aceton und Wasser mit einer Geschwindigkeit
von 60 ml pro Minute eluiert. Hierbei erhält man 15 Fraktionen
509823/0844
aus je 2 Liter. Durch anschließende Eluierung mit einem 1:1 Gemisch aus Aceton und Wasser erhält man 18 Fraktionen
mit je einem Liter. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zum Entfernen von Aceton im Vakuum eingeengt und lyophilisiert.
40 g der vereinigten lyophilisierten Präparationen werden
mit 4 Liter Methanol durch 16 Stunden langes Rühren mit einem Magnetrührer extrahiert. Die in Methanol unlöslichen
Stoffe werden abfiltriert, worauf man die in Methanol löslichen
Stoffe mit 5 Volumina Aceton ausfällt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Die Ausbeute
beträgt 20,6 g.
Die dabei erhaltene Präparation löst man in einem Minimum
Wasser, und die erhaltene Lösung gibt man mit einer Geschwindigkeit von 1 ml pro Minute auf eine mit Dextran (Sephadex
G-25) bepackte 5,8 χ 120 cm Säule. Die in der Säule befindliche
Aktivität wird mit deionisiertem Wasser eluiert, und die aktiven Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert.
10 g des oben erhaltenen Materials werden in 256 ml eines Gemisches aus Acetonitril und Wasser (55:45) gelöst,
und die erhaltene Lösung gibt man auf eine 5,5 χ 85 cm Säule, die mit einem in einem Lösungsmittelgemisch aus
Acetonitril und Wasser. (7:3) hergestellten Silicagel bepackt ist. Die Aufgabe erfolgt in einer Geschwindigkeit von 3 ml
pro Minute. Nach Aufgabe der Probe wird die Säule mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser (7:3) mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 5 ml pro Minute eluiert. Die am meisten aktiven Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum zur
Trockne eingedampft und lyophilisiert.
50 g des obigen lyophilisierten antibiotischen Gemisches, das
man durch Vereinigung des Materials aus mehreren in obiger Weise durchgeführten Versuchen herstellt, werden in 80 ml
' 5O9823/08U
Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung adsorbiert man an
mikrokristalline Cellulose (Avicel). Die dabei erhaltene
Mischung wird getrocknet und dann auf eine 7,4 χ 115 cm
Säule gegeben, die mit Avicel in einem Gemisch aus Acetonitril:n-Propanol:Wasser
(1:1:0,5, V:V:V) bepackt ist. Die Säule wird dann mit dem gleichen Lösungsmittelsystem mit
einer Geschwindigkeit von 18 ml pro Minute eluiert. Fraktionen von jeweils 1 Liter Eluat werden gesammelt, und alle
Fraktionen, die aufgrund der Papierchromatographie oder eines mikrobiologischen Versuches Deacetoxycephalosporin C
enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, und das erhaltene Konzentrat wird schließlich
lyophilisiert, wodurch man praktisch reines Deacetoxycephalosporin C in Form des Ammoniumsalzes erhält.
12 g des gefriergetrockneten Produktes werden in folgender Weise weiter gereinigt. Das erhaltene Material wird in 75 ml
Wasser gelöst, und die so erhaltene Lösung gibt man auf eine 3,0 χ 70 cm Säule, die mit einem in Wasser hergestellten
Amberlit XAD-4-Harz bepackt ist. Das auf der Säule befindliche
Produkt wird mit Wasser in einer Geschwindigkeit von 2,5 ml pro Minute eluiert, wobei man eine Reihe von Eluatfraktionen
von jeweils 20 ml auffängt. Die erhaltenen Eluatfraktionen werden ständig papierchromatographisch und mikrobiologisch
untersucht. Diejenigen Fraktionen, die lediglich Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden vereinigt und
lyophilisiert, wodurch man Deacetoxycephalosporin C hoher Reinheit erhält. Die Eigenschaften des dabei erhaltenen
Produktes sind gleich wie diejenigen des gemäß Beispiel 4 erhaltenen Produktes.
5 0 9 8 2 3 / 0 8 A 4
Claims (3)
- il Λ Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C durch Kultivieren eines Mikroorganismus in einem wässrigen Nährkulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen, wobei man solange kultiviert, bis der Mikroorganismus in dem Kulturmedium eine wesentliche Menge antibiotischer Aktivität gebildet hat, und das erhaltene Deacetoxycephalosporin C dann aus dem Kulturmedium isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces lipmanii NRRL 3584 und Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 verwendet.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus S. lipmanii NRRL 3584 verwendet.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus S. clavuligerus NRRL 3585 verwendet.5G9823/08U
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